( PDF ) Estudo da toxicidade hepática da trans-desidrocrotonina (t-DCTN), um diterpeno obtido da Croton cajucara benth., e de estratégias farmacológicas preventivas em modelos animais

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

ESTUDO DA TOXICIDADE HEPÁTICA DA trans-

DESIDROCROTONINA (t-DCTN), UM DITERPENO OBTIDO DA

Croton cajucara BENTH., E DE ESTRATÉGIAS FARMACOLÓGICAS

PREVENTIVAS EM MODELOS ANIMAIS.

ALANA FONTELES LIMA RABELO

FORTALEZA – CE

2008

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Alana Fonteles Lima Rabelo

ESTUDO DA TOXICIDADE HEPÁTICA DA trans-

DESIDROCROTONINA (t-DCTN), UM DITERPENO OBTIDO DA

Croton cajucara BENTH., E DE ESTRATÉGIAS FARMACOLÓGICAS

PREVENTIVAS EM MODELOS ANIMAIS.

Dissertação submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Farmacologia do Departamento

de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial para a obtenção do

título de Mestre em Farmacologia.

Orientador:

Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao

Fortaleza - CE

2008

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iii

Alana Fonteles Lima Rabelo

Estudo da toxicidade hepática da trans-desidrocrotonina (t-DCTN), um

diterpeno obtido da Croton cajucara Benth, e de estratégias farmacológicas

preventivas em modelos animais.

Esta dissertação foi submetida como parte dos

requisitos necessários à obtenção do grau de

Mestre em Farmacologia, outorgado pela

Universidade Federal do Ceará, e encontra-se à

disposição dos interessados na Biblioteca

setorial da referida Universidade.

A citação de qualquer trecho desta dissertação

é permitida, desde que realizada de acordo com

as normas da ética científica.

Data da aprovação:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao

Universidade Federal do Ceará

Profa. Dra. Adriana da Rocha Tomé

Universidade Estadual do Ceará

Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida Moreira Leal

Universidade Federal do Ceará

"A ciência humana de maneira nenhuma nega a

existência de Deus. Quando considero quantas e

quão maravilhosas coisas o homem compreende,

pesquisa e consegue realizar, então reconheço

claramente que o espírito humano é obra de Deus,

e a mais notável."

(Galileu Galilei)

Aos meus pais, Cláudio Oliveira Lima e

Maria Eronildes Fonteles Lima, pelo amor

incondicional, pela vida que me

proporcionaram e pelo apoio na conquista

dos meus ideais.

Ao meu grande amor, Leirton, por me

acompanhar em todos os momentos, com

amor, paciência e dedicação.

Obrigada por me fazer tão feliz.

Às minhas irmãs, Aline e Alice, por

acreditarem em mim e por se inspirarem com

a minha batalha pelo conhecimento.

AGRADECIMENTOS

Ao prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao, pela orientação científica, ensinamentos,

amizade, incentivo e paciência durante a realização deste trabalho.

À profa. Dra. Flávia Almeida Santos pela colaboração.

À profa. Dra. Maria Aparecida Maciel, pelo fornecimento da Trans-

desidrocrotonina, fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.

À profa. Dra. Adriana Tomé pela colaboração na análise histopatológica.

Aos professores da Pós-graduação do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

UFC, pelos ensinamentos.

Aos amigos Danilo, Iana e Tiago, que me acompanharam desde a graduação até o

mestrado, pelo incentivo e momentos de risadas que compartilhamos juntos nesta trajetória.

Ao ex-doutorando e agora doutor Roberto César pelos conselhos e apoio no início do

mestrado.

Aos pós-graduandos Ana Carla, Caroline Mourão, Cinthya Iamille, Deive

Campos, Otacílio Júnior, em especial a Marjorie Guedes e Silvéria Lira pela amizade

sincera e ajuda na realização dos experimentos.

Aos bolsistas e ex-bolsistas de iniciação científica do Laboratório de Produtos

Naturais (LPN), Aline, Daniel, Lívia, Patrícia, Saulo, Sâmia, Rafaela, Rhandell e Tiago,

pela ajuda nos mutirões em dias de experimentos e pelas conversas animadas que tornavam

estes momentos mais descontraídos.

À minha companheira de estudo, Juliana Lemos, pelas palavras de incentivo.

vii

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC, Alana,

Aura, Chiquinho, Edmilson, Fernando, Íris, Mônica pela presteza e dedicação com que

sempre me atenderam.

Ao CNPq pelo apoio financeiro durante a execução deste trabalho.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

viii

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

xii

Lista de Abreviaturas e Símbolos

xiii

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

xvii

1. INTRODUÇÃO

1.1. Plantas medicinais 1

1.2. Toxidade de Plantas Medicinais 2

1.3. Terpenos 5

1.4. Diterpenos 6

1.5. Croton cajucara Benth 7

1.6. Trans-desidrocrotonina (t-DCTN) 12

1.7. Hepatotoxicidade de drogas hipoglicêmicas e hipolipidêmicas 15

1.8. Mecanismos de hepatotoxicidade de fármacos 17

1.9. EROs e o Estresse Oxidativo 20

1.10. Sistemas de defesa antioxidante 22

1.11. Relevância e justificativa

2. OBJETIVOS

3. MATERIAIS

3.1. Material botânico 27

3.2. Animais experimentais 27

3.3. Drogas e reagentes 28

3.4. Equipamentos 28

4. MÉTODOS

4.1. Isolamento da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) 29

4.2. Efeito de uma única administração de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de

peso) na hepatotoxicidade em camundongos

4.3. Efeito de administrações sucessivas de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de

peso) na toxicidade hepática em camundongos

4.4. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN na toxicidade

aguda induzida por t-DCTN

4.5. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol na toxicidade

aguda induzida por t-DCTN

4.6. Envolvimento do óxido nítrico no pré-condicionamento hepático da t-DCTN

e do etanol

4.7. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) na hepatite tóxica induzida

por t-DCTN

4.8. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os grupos sulfidrilas não

protéicos (NP-SH) hepáticos

4.9. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis hepáticos de

TBARS

4.10. Análise histopatológica 39

4.11. Análise estatística

5. RESULTADOS

5.1. Efeito de uma única administração de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de

peso) na hepatotoxicidade em camundongos

5.2. Efeito de administrações sucessivas de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de

peso) na toxicidade hepática em camundongos

5.3. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN na toxicidade

aguda induzida por t-DCTN

5.4. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol na toxicidade

aguda induzida por t-DCTN

5.5. Envolvimento do óxido nítrico (NO) no pré-condicionamento hepático da t-

DCTN e do etanol

5.6. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) na hepatite tóxica induzida

por t-DCTN

6. DISCUSSÃO

7. CONCLUSÕES

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

RESUMO

ESTUDO DA TOXICIDADE HEPÁTICA DA trans-DESIDROCROTONINA (t-

DCTN), UM DITERPENO OBTIDO DA Croton cajucara BENTH, E DE

ESTRATÉGIAS FARMACOLÓGICAS PREVENTIVAS EM MODELOS ANIMAIS.

Alana Fonteles Lima Rabelo. Orientador: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao. Dissertação

submetida como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia do

programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia.

Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Ceará, 2008.

A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é o principal composto diterpenóide presente no extrato

da casca do caule de Croton cajucara (sacaca). Este diterpeno possui um amplo espectro de

atividades farmacológicas que inclui antiinflamatória, antinociceptiva, e efeitos

hipoglicemiante e hipolipidêmico. Substâncias com esse perfil farmacológico são comumente

associadas a efeitos deletérios sobre o fígado. Tendo em vista que estudos in vitro e in vivo

mostraram uma hepatotoxicidade da t-DCTN, o presente estudo objetivou analisar em maior

profundidade o seu potencial em causar dano hepático e, então, buscar estratégias

farmacológicas para mitigar tal toxicidade. Desta forma, os experimentos iniciais foram

direcionados para observação do dano hepático em camundongos que receberam, por

gavagem, uma única (aguda) ou repetidas (subcrônica) administrações de t-DCTN, em doses

que variam de 10 a 300 mg/kg. A segunda série de experiências foi projetada para avaliar os

efeitos do (i) pré-condicionamento com a menor dose de t-DCTN (10 mg/kg) ou etanol (1

g/kg), e do (ii) pré-tratamento com Vitamina E ou NAC no dano hepático associado a altas

doses de t-DCTN em camundongos. Um possível envolvimento de NO também foi verificado

no efeito pré-condicionante de t-DCTN e/ou Etanol. t-DCTN em doses mais altas (100 e 300

mg/kg, v.o.) causou dano hepático severo, comprovado por aumentos significativos (p

<0,001) nos níveis séricos de ALT e AST e por alterações histopatológicas, quando

administrada isolada ou repetidamente. Em contraste, as doses de 10 e 30 mg/kg não

promoveram alterações significantes, sugerindo que a toxicidade da t-DCTN é dose

dependente. O pré-condicionamento farmacológico com t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) e Etanol (1

g/kg, v.o.) atenuaram significativamente (p <0,001) a hepatotoxicidade associada a alta dose

(100 mg/kg) de t-DCTN, como comprovado pela redução na atividade das transaminases

séricas, como também nas lesões hepáticas. A suplementação em camundongos com L-

arginina, um substrato para geração de NO, preveniu parcialmente o efeito hepatotóxico da t-

DCTN, possivelmente devido a um aumento na microcirculação hepática. Adicionalmente, o

pré-tratamento com Vitamina E, mas não com NAC, reduziu efetivamente os efeitos

hepatotóxicos de t-DCTN, comprovado pela diminuição dos níveis séricos de ALT e AST, de

TBARS hepático e das alterações histológicas. Isto sugere que Vitamina E protege contra o

aumento da peroxidação lipídica hepática promovido por alta dose de t-DCTN.

Paradoxalmente, comparada a outros hepatotoxicantes relatados na literatura, a t-DCTN

aumenta os níveis de glutationa hepática que pode ser uma conseqüência do estresse oxidativo

prolongado. Em conjunto, estes resultados confirmam as observações anteriores sobre o

potencial hepatotóxico da t-DCTN e sugerem que um aumento no estresse oxidativo e na

peroxidação lipídica das membranas dos hepatócitos contribui para o dano hepático desse

diterpeno. A suplementação com Vitamina E, um antioxidante lipossolúvel, ou o pré-

condicionamento com doses menores de t-DCTN ou etanol poderiam ser profilaticamente útil

para superar os efeitos hepatotóxicos de t-DCTN.

Palavras-chave: Croton cajucara, trans-desidrocrotonina, diterpenos, hipoglicemiantes,

hepatotoxicidade.

xii

ABSTRACT

STUDIES ON THE HEPATOTOXICITY OF trans- DEHYDROCROTONIN (t-DCTN),

A DITERPENE ISOLATED FROM Croton cajucara BENTH, AND THE

PHARMACOLOGICAL STRATEGIES FOR PREVENTION IN ANIMAL MODELS.

Alana Fonteles Lima Rabelo. Principal Advisor: Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao.

Dissertation submitted in partial fulfillment to obtain the Master’s Degree in Pharmacology,

Post-Graduate Programme in Pharmacology, Department of Physiology and Pharmacology,

Faculty of Medicine, Federal University of Ceará, 2008.

The trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a major diterpenoid compound present in bark

extracts of Croton cajucara (sacaca) stem. This diterpene possesses a wide spectrum of

pharmacological activity that include anti-inflammatory, antinociceptive, hypoglycemic and

antihyperlipidemic effects. Deleterious effects on liver are not uncommon with substances

having this pharmacological profile. Keeping in view the reported hepatotoxicity of t-DCTN

in vitro and in vivo, the present study was carried out to analyse in greater depth its potential

to cause hepatic damage and then to seek pharmacological strategies to mitigate such a

toxicity. Accordingly, our initial experiments were aimed to observe the hepatic damage in

mice that received the single (acute) or repeated (subchronic) administrations of t-DCTN by

oral gavage, at doses ranging from 10 to 300 mg/kg. The second series of experiments were

designed to evaluate the effects of (i) pre-conditioning with a smaller dose t-DCTN or

ethanol, and (ii) pre-treatments with Vitamin E or NAC on high-dose -associated hepatic

injury in mice. A possible involvement of NO was also verified on the pre-conditioning

effects of t-DCTN and or Ethanol. t-DCTN at higher doses (100 e 300 mg/kg, v.o.) caused

severe hepatic damage as evidenced by significant (p<0,001) increases in the serum levels of

ALT and AST and histopathological alterations, whether administered singly or repeatedly. In

contrast, at the doses of 10 e 30 mg/kg, there were no significant alterations suggesting that

the toxicity is a dose-related one. Pharmacological pre-conditioning with t-DCTN (10 mg/kg,

p.o.) e Ethanol (1 g/kg, p.o.) significantly (p<0,001) attenuated the high-dose t-DCTN (100

mg/kg) -associated hepatotoxicity, as evidenced by reductions in serum enzyme activities as

well as the hepatic lesions. In mice supplemented with L-arginine, the substrate for NO

generation only partially prevented the hepatotoxic effect of t-DCTN most possibly due to an

improved hepatic microcirculation. Additionally, pre-treatment with Vitamin E but not the

NAC effectively reduced hepatotoxic effect of t-DCTN, evidenced by diminished serum

levels of ALT, AST and hepatic TBARS and histological alterations. This suggests that

Vitamine E protects against the increased hepatic lipid peroxidation promoted by high-dose t-

DCTN. Paradoxically, compared to other hepatotoxicants reported in literature, t-DCTN

enhanced the hepatic glutathione levels, which may be a consequence of prolonged oxidative

stress. Taken together, these results confirm the earlier observations on the hepatotoxic

potential of t-DCTN and suggest that an increased oxidative stress and lipid peroxidation of

hepatocyte membranes contributes to hepatic damage. Supplementation with liposoluble

antioxidant Vitamina E, or pré-conditioning with smaller doses of t-DCTN or ethanol might

be useful prophylactically to overcome hepatotoxic effects of t-DCTN.

Key-words: Croton cajucara, trans-dehydrocrotonin, diterpenes, hypoglycemic,

hepatotoxicity

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

Abs Absorbância

ALT Alanina Aminotransferase

ANOVA Análise de variância

AST Aspartato Aminotransferase

CCF Cromatografia de Camada Fina

Concentração letal 50%

DTNB 5,5`- dithil-bis (2-nitrobenzoic acid)

E.P.M. Erro Padrão da Média

EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético sal dissódico

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

et al. ...e colaboradores

GSH Glutation Reduzido

h Hora (s)

i.p. Intraperitonial

L-NAME N

-nitro-L-arginina-metil-éster

M Molar

MDA Malonaldeído

mg Miligrama

mg/kg Miligrama por quilograma

min Minuto (s)

mL Mililitro

mM Milimolar

mm Milímetros

NAC N-acetilcisteína

nm Nanômetro

NO Óxido Nítrico

NP-SH Grupos sulfidrílicos não protéicos

p Nível de significância

PMN Polimorfonucleares

rpm Rotações por minuto

TBA Ácido tiobarbitúrico

xiv

TBARS Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

TCA Ácido tricloroacético

t-DCTN Trans-desidrocrotonina

TNB Ácido trinitrobenzeno sulfônico

TZD Tiazolidinas

U/mL Unidades por mililitro

v.o. Via oral (Gavagem)

vs Versus

X Vezes

α Alfa

β Beta

μg/g Micrograma por grama

% Porcentagem

± Mais ou menos

& E

ºC Graus Celsius

< Menor que

® Marca registrada

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

PÁGINA

FIGURA 1.

Estruturas químicas de alguns dos constituintes isolados do

Croton cajucara Benth

FIGURA 2.

Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN)

FIGURA 3.

Método de obtenção do diterpeno trans-desidrocrotonina (t-

DCTN) a partir dos extratos hexânicos e clorofórmico

FIGURA 4.

Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis hepáticos de Glutationa em camundongos

FIGURA 5.

Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis séricos de ALT e AST

FIGURA 6.

Microfotografias de fígados de camundongos (400x) – dose

única de t-DCTN

FIGURA 7.

Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis hepáticos de Glutationa em camundongos

FIGURA 8.

Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis séricos de ALT e AST

FIGURA 9.

Microfotografias de fígados de camundongos (200x) – doses

repetidas de t-DCTN

FIGURA 10.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN

sobre os níveis hepáticos de glutationa na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN em camundongos

FIGURA 11.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN

sobre os níveis séricos de ALT e AST na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN em camundongos

FIGURA 12.

Microfotografias de fígados de camundongos (200x) – Efeito do

pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN

FIGURA 13.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol

sobre os níveis de glutationa hepática na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN

xvi

FIGURA 14.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol

sobre os níveis séricos de ATL e AST na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN

FIGURA 15.

Microfotografias de fígados de camundongos (200x) – Efeito do

pré-condicionamento com baixas doses de Etanol

FIGURA 16.

Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis hepáticos de

Glutationa na hepatotoxicidade induzida pela t-DCTN em

camundongos

FIGURA 17.

Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis séricos de ALT e

AST toxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos

FIGURA 18.

Microfotografias de fígados de camundongos (200x) –

Envolvimento do Óxido Nítrico no pré-condicionamento com t-

DCTN

FIGURA 19.

Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis

de Glutationa hepática na toxicidade induzida por t-DCTN em

camundongos

FIGURA 20.

Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis

séricos de ALT e AST na hepatite tóxica induzida por t-DCTN

em camundongos

FIGURA 21.

Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis

hepáticos de TBARS

FIGURA 22.

Microfotografias de fígados de camundongos (200x) – Efeito da

Vitamina E e NAC na hepatite tóxica induzida por t-DCTN

xvii

LISTA DE TABELAS

TABELA

PÁGINA

TABELA 1.

Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis hepáticos de Glutationa em camundongos

TABELA 2.

Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis séricos de ALT e AST

TABELA 3.

Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis hepáticos de Glutationa em camundongos

TABELA 4.

Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina

sobre os níveis séricos de ALT e AST

TABELA 5.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN

sobre os níveis hepáticos de glutationa na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN em camundongos

TABELA 6.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN

sobre os níveis séricos de ALT e AST na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN em camundongos

TABELA 7.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol

sobre os níveis de glutationa hepática na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN

TABELA 8.

Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol

sobre os níveis séricos de ATL e AST na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN

TABELA 9.

Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis hepáticos de

Glutationa na hepatotoxicidade induzida pela t-DCTN em

camundongos

TABELA 10.

Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis séricos de ALT e

AST toxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos

TABELA 11.

Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis

de Glutationa hepática na toxicidade induzida por t-DCTN em

camundongos

xviii

TABELA 12.

Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis

séricos de ALT e AST na hepatite tóxica induzida por t-DCTN

em camundongos

TABELA 13.

Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis

hepáticos de TBARS.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Plantas medicinais:

As plantas medicinais consistem em uma estratégia alternativa na procura de novos

agentes terapêuticos, sendo uma das mais antigas armas empregadas para o tratamento das

doenças humanas e muito já se conhece a respeito de seu uso popular. As primeiras descrições

sobre plantas medicinais feitas pelo homem remontam às sagradas escrituras e ao papiro de

Ebers onde, este último, enumera cerca de 100 doenças e descreve um grande número de

drogas de natureza animal e vegetal (PINTO et al., 2002). Com os avanços científicos, esta

prática milenar perdeu espaço para os medicamentos sintéticos, entretanto, o alto custo destes

fármacos e os efeitos colaterais apresentados contribuíram para o ressurgimento de fitoterapia.

Juntos, os países da América Latina possuem grande parte da biodiversidade do

mundo. O Brasil sozinho possui de 20 a 22% de todas as plantas e microorganismos

existentes. Todavia, é estimado que não mais do que 25.000 espécies de plantas foram objetos

de alguma investigação científica (CALIXTO, 2005).

Plantas e seus derivados são as maiores fontes de drogas, movimentando cerca de 30%

do mercado farmacêutico mundial (KIRKPATRICK, 2002). Entre os anos de 1981 e 2002, de

877 novas moléculas introduzidas no mercado, em torno de 49% eram substâncias isoladas de

produtos naturais, semi-sintéticos ou moléculas sintetizadas tomando como modelo estruturas

de origem natural (NEWMAN et al., 2003). Contudo, o potencial dos produtos de origem

natural, como fontes de novas drogas, continua largamente inexplorado uma vez que somente

pequena fração de plantas, animais e microorganismos tem sido investigada fitoquímica e

biologicamente (HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991).

Em termos históricos, a pesquisa com plantas medicinais tomou impulso após o

isolamento da morfina no século XIX. As plantas possibilitaram a descoberta de vários

medicamentos, podemos citar os alcalóides bisindólicos vimblastina e vincristina isolados de

Catharanthus roseus G., a atropina, obtida a partir de Atropa belladona e também a lactona

sesquiterpênica artemisina isolada de Artemísia Annua L., utilizada como antimalárico.

Apesar do enorme desenvolvimento da síntese química, atualmente 25% das drogas prescritas

no mundo são de origem vegetal (BALUNAS et al., 2005).

Na metade do século XX, avanços na síntese química permitiram a entrada maciça de

componentes ativos derivados de plantas medicinais empregadas desde a antiguidade,

utilizadas para tratamento de patologias leves e moderadas (BARREIRO et al., 2004).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 80% da população mundial utiliza

plantas medicinais, em sua maioria nos países em desenvolvimento (GURIB-FAKIM, 2006).

No Brasil, 20% da população são responsáveis por 63% do consumo de medicamentos

alopáticos; os 80% restantes encontram nos produtos de origem natural, especialmente as

plantas medicinais, a única fonte de recursos terapêuticos (FOGLIO et al., 2006).

A utilização de terapias não convencionais parece não estar confinada a uma única

classe social, contudo indivíduos com patologias crônicas representam claramente um grupo.

No Brasil, especialmente na região Nordeste, o uso de plantas medicinais e de preparações

caseiras assume importância fundamental no tratamento das patologias que afetam as

populações de baixa renda, tendo em vista a deficiência da assistência médica, a influência da

transmissão oral dos hábitos culturais e a disponibilidade da flora (MATOS, 1989).

Em geral as plantas medicinais utilizadas possuem pouca ou nenhuma comprovação

científica de suas propriedades farmacológicas. Apesar da crescente importância dos

fitoterápicos, relativamente poucos estudos foram realizados a fim de comprovar sua eficácia

e segurança, sendo que muitas ainda são utilizadas com base somente no conhecimento

popular bem estabelecido (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).

1.2. Toxidade de Plantas Medicinais:

No Brasil, a utilização de plantas, como meio curativo, é uma atividade altamente

difundida e popular, às vezes, empregadas de maneira equivocada e até mesmo malévola,

afinal muitas plantas possuem princípios tóxicos e o seu uso indiscriminado pode causar

sérios problemas (MATOS et al., 2001; LORENZI, 2002).

Infelizmente, a maior parte dos fitoterápicos que são utilizados atualmente por

automedicação ou por prescrição médica não tem o seu perfil tóxico bem conhecido. Por

outro lado, a utilização inadequada de um produto, mesmo de baixa toxicidade, pode induzir

problemas graves desde que existam outros fatores de risco tais como contra-indicações ou

uso concomitante de outros medicamentos. A crença comum de que o uso de produtos

naturais não comporta riscos, favorece o uso inadequado inclusive pela omissão do uso no

momento da consulta médica (CAPASSO et al., 2000).

Em alguns países como na Ásia e África, onde o uso de plantas medicinais é comum,

algumas são utilizadas com cautela devido sua toxicidade para alguns órgãos como fígado,

rins, pele e outros tecidos. É sabido que muitas plantas produzem substâncias que são

potencialmente tóxicas. Riscos particulares de toxicidade são associados com o uso de plantas

concomitante com drogas convencionais. Certas ervas medicinais podem reduzir ou

potencializar a eficácia de um medicamento (CAPASSO et al., 2000).

A toxicidade de plantas medicinais é um problema sério de Saúde Pública. Os efeitos

adversos dos fitomedicamentos, possíveis de adulterações e toxidez, bem como a ação

sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. Diversos fitoterápicos usados no

Brasil têm sido documentados como sendo seguros e eficazes, baseados apenas em estudos

pré-clínicos in vitro e in vivo, realizados em animais. No entanto, esses estudos não garantem

evidências suficientes para assegurar a sua eficácia e segurança em seres humanos

(PIMENTEL et al., 1998). Pesquisas realizadas para avaliação do uso seguro de plantas

medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes, assim como o controle da

comercialização pelos órgãos fiscais (VEIGA-JÚNIOR et al., 2005; TUROLLA;

NASCIMENTO, 2006).

Como exemplo de efeitos tóxicos de substâncias presentes em plantas, pode ser citado

os efeitos hepatotóxicos do apiol, safrol, lignanas e alcalóides pirrolizidínicos; a ação tóxica

renal que pode ser causada por espécies vegetais que contém terpenos e saponinas e alguns

tipos de dermatites causadas por espécies ricas em lactonas sesquiterpênicas e produtos

naturais do tipo furanocumarinas (CAPASSO et al., 2000). Componentes tóxicos ou

antinutricionais, como o ácido oxálico, nitrato e ácido erúcico estão presentes em muitas

plantas de consumo comercial, assim como, diversas substâncias isoladas de plantas

medicinais possuem atividades citotóxica ou genotóxica e mostram relação com a incidência

de tumores (ROMERO-JIMÉNEZ et al., 2005).

Turolla e Nascimento (2006), num levantamento da literatura existente sobre a

toxicidade de dez plantas medicinais comercializadas com maior freqüência na forma de

medicamentos fitoterápicos encontraram poucas informações referentes à toxicidade pré-

clínica sobre maracujá (Passiflora incarnata L., Passifloraceae), ginkgo (Ginkgo biloba L.,

Ginkgoaceae), castanha da índia (Aesculus hippocastanum L., Hippocastanaceae), plantago

(Plantago ovata Forsk, Plantaginaceae), ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer, Araliaceae),

kava-kava (Piper methysticum G. Forstt, Piperaceae), valeriana (Valeriana officinales L.,

Valerianaceae), erva de São João (Hypericum perforatrum L., Hypericaceae), erva de São

Cristóvão (Cimicífuga racemosa (L) Nutt, Ranunculaceae), cáscara sagrada (Rhamnus

purschiana D.C., Rhamnaceae). As monografias da Organização Mundial de Saúde e da

Comissão E contemplam as dez plantas, porém apresentam poucos dados sobre as

informações pesquisadas.

Esses exemplos sinalizam que, quando não há estudos toxicológicos detalhados, a

experiência documentada do uso de longo prazo sem evidências de problemas de segurança

pode ser um indicativo para a avaliação do risco, mas sem constituir uma base para afirmar a

segurança incondicional do uso de determinada planta/fitoterápico. E considerando que

qualquer substância ingerida em excesso é potencialmente prejudicial, nenhum material de

origem vegetal é exceção a esse princípio geral (ELDIN; DUNFORD, 2001).

Entretanto, casos de intoxicação por fitoterápicos não devem ser motivo para que

plantas medicinais sejam banidas do arsenal terapêutico. Ao contrário, devem servir de

estímulo para que os estudos sobre a atividade farmacológica e a toxicidade sejam rotineiros e

uma exigência para o registro de fitoterápicos.

A predição acurada da toxicidade de drogas (naturais ou sintéticas) em humanos

requer, não somente a análise da relação dose-resposta, mas também o claro conhecimento a

respeito dos mecanismos de toxicidade e dos fatores de risco correspondentes (LI, 2004).

1.3. Terpenos:

Os terpenos representam uma classe de produtos naturais amplamente distribuída no

reino vegetal, sendo uma família de compostos quimicamente diversos (DI STASI, 1996).

Possuem uma composição molecular típica, formados por duas ou mais unidades isoprênicas

) (NABETA et al., 1995).

Esses compostos representam a segunda classe com maior número de constituintes

ativos obtidos de plantas, perdendo apenas para os flavanóides. São classificados de acordo

com as unidades de carbonos e as formas de ciclização e estão subdivididos em monoterpenos

(10 unidades de carbono), sesquiterpenos (15 uidades de carbono), diterpenos (20 unidades de

carbono), sesteterpenos (25 unidades de carbono), triterpenos (30 unidades de carbono) e

tetraterpenos (40 unidades de carbono) (DI STASI, 1996).

Muitos terpenos também possuem um interesse comercial, incluindo importantes

atividades farmacológicas, por exemplo, atividade antitumoral (MUJOO et al., 2001),

sedativa (KELECOM, 1983), analgésica (MALHEIROS et al., 2001), cardioprotetora

(TORRES et al., 2000), antioxidante (BARONE et al., 1983), antialérgica (YAMAHARA et

al., 1982; KUBO et al., 1987) e anti-hipertensiva (DUBEY, 1974).

Os monoterpenos estão entre os terpenos mais comuns como o citral, cânfora, linalol,

terpinen-4-ol, cineol, carvacrol entre outros. Eles representam uma classe nova de agentes

potencialmente terapêuticos contra o câncer de mama e ainda são utilizados em várias

preparações farmacêuticas (JIRTLE, 1993; POZZI, 1989).

Os sesquiterpenos originam-se com o aumento do número de carbonos; aumentando o

número de ciclizações e modificações nas moléculas ocasionando uma variedade de

compostos. Alguns compostos antitumorais também são exemplos de sesquiterpenos como,

por exemplo, fenolina, elefantina e vernolepina. Outros sesquiterpenos também possuem

atividade antiúlcera, citotóxica, antiespasmódica e inibitória da síntese de DNA (DI STASI,

1996).

Compostos da subclasse de sesteterpenos são pouco conhecidos e ocorrem em número

muito pequeno na natureza. Possuem pouco interesse farmacológico e são mais comuns em

esponjas marinhas e alguns fungos.

Os triterpenos caracterizam-se por sua abundância e grande número de constituintes

ativos onde estão incluídos metabólitos de grande importância biológica, como o colesterol,

vitamina D, hormônios sexuais e inúmeros esteróides. Inúmeros triterpenos possuem

atividade antiprotozoária, especialmente contra amebíase e malária onde se destacam a

chaparrinona, bruceantina, glaucarubole, bruceínas A, B e C e a quassina. Outros triterpenos

como o ácido oleanólico e seu isômero, o ácido ursólico, possuem atividade antioxidante,

hepatoprotetora, antiinflamatória e antihiperlipidêmica (DI STASI, 1996; LIU, 1994).

Os tetraterpenos representam uma subclasse de metabólitos que inclui a maioria dos

carotenóides, pigmentos essenciais para a fotossíntese. Do ponto de vista farmacológico, são

compostos importantes e extremamente úteis quanto ao seu papel biológico, como é o caso da

vitamina A (DI STASI, 1996).

1.4. Diterpenos:

Os diterpenos constituem uma grande e diversificada classe de metabólitos

secundários que podem ser considerados como resultados de fatores naturais. Possuem

esqueleto básico com 20 átomos de carbono e derivam biogeneticamente do pirofosfato de

geranilgeranila que resulta do encadeamento cabeça-cauda de quatro unidades de isopreno

(TORSSELL, 1983).

Várias propriedades farmacológicas dos diterpenos foram estudadas, dentre elas

podemos citar: antitumoral (ADOLF et al., 1985; ROENGSUMRAN et al. 2002),

antiinflamatória (BRAQUET, 1988; DEMETZOS et al., 2001), antireumática (GU et al.,

1995), antiulcerogênica (SHIRAKABE et al., 1995; HIRUMA-LIMA et al., 2001), antibiótica

(NAKANISHI, 1974). Foram também descritas atividades vasculares tanto de relaxamento

(DUARTE et al., 1992; LAMBERTE et al., 1994; TORRES et al., 2000) como de contração

(BAZAN et al.,1993; MIRANDA et al., 1998).

Dentre os diterpenos biologicamente ativos estudados incluem-se: forscolina, com

atividade hipotensora e um ativador específico e reversível das isoformas particulada e

solúvel da adenilil ciclase (SEAMON et al., 1981; DALY, 1982); ésteres de forbol, isolados

inicialmente de plantas do gênero Cróton que são ativadoras de proteína quinase C e têm sido

largamente utilizados para o estudo das funções biológicas, propriedades e distribuição desta

enzima e na investigação da carcinogênese química (NISHIZUKA, 1986; CHUANG, 1989) e

cleonol com atividades hipotensora, espasmolítica inespecífica, cronotrópica positiva e

vasodilatadora (DUBEY et al., 1974).

Muitos diterpenos isolados de produtos marinhos têm mostrado pronunciados efeitos

cardiovasculares, como por exemplo, respostas inotrópicas positivas, como ativador de canal

de sódio (grayanotoxin I) e resposta vasorelaxantes, como Jatrophone. Três diterpenos,

flexibilide, dihidroflexibilide e sinulariolide, também isolados de produtos naturais marinhos

(S.jiexibilis – coral) produzem respostas vasorelaxante independente do endotélio, resposta

inotrópica positiva e resposta cronotrópica positiva sem produzir toxicidade acentuada

(ACERET et al., 1996).

Os clerodanos são uma classe de diterpenóides bicíclicos cujo nome genérico deriva

da (-)-clerodina, primeiro diterpeno da série dos clerodanos isolado da Clerodendron

infotunatum (BARTON & ELAD, 1956). Variadas atividades biológicas são citadas para

diferentes formas estruturais de clerodanos: antibiótica (ANDERSEN et al., 1983; KHAN et

al., 2001), antiulcerogênica (APPENDIDO et al., 2003), anti-hipertensiva (ODEK-OGUNDE

& RAJAB, 1994), citotóxica (SHEN et al., 2004; SAI et al., 2002), hipoglicemiante

(TASHMUKHAMEDOVA et al., 1992), antiproteolítica e anti-hemorrágica (JANUARIO et

al., 2004), tripanocida (ESPINDOLA et al., 2004), antimalária (MAMBU et al., 2002),

antileishimania (HABTEMARIAM, 2003), antiviral e anti-fúngica (ROGERS et al., 1979).

1.5. Croton cajucara Benth:

A família Euphorbiaceae é uma família de plantas amplamente distribuída em regiões

tropicais e temperadas de todo o mundo possuindo cerca de 300 gêneros e 8000 espécies,

sendo os gêneros com maior número de espécies o Euphorbia e Croton (FARNSWORTH,

1976; WEBSTER, 1967; WILSON, 1976).

O gênero Croton, cujo nome significa “carrapato’, pertence à família Euphorbiaceae,

bubfamília Crotonoideae e tribo Crotoneae. É encontrado principalmente como árvore de

pequeno porte e arbusto, apresentando cerca de 700 espécies, metade destas encontradas no

Brasil. O gênero Croton tem representantes tanto medicinais, quanto tóxicos; uma das

espécies mais conhecidas no Norte do Brasil é o Croton cajucara (ABREU et al., 2001).

O Croton cajucara Benth., conhecido popularmente como “sacaca”, que na língua

Tupi significa “feitiço”, representa um recurso medicinal de grande importância no tratamento

e cura de várias doenças. Possui características de erva daninha e cresce em áreas

abandonadas ou em clareiras abertas em áreas baixas da floresta. É uma árvore de até 6 a 10

metros de altura, encontrada na região amazônica e tendo como centro de dispersão o Estado

do Pará. Possui madeira branco-amarelada com cascas aromáticas, folhas inteiras e simples,

pecioladas, estipuladas, lanceoladas, peninérveas, verdes com lombos divididos em lobos ou

segmentos, inflorescência racemosa com flores de sexo separado, fruto seco, esquizocárpico,

separando-se em 3 cocos, bem como sementes ricas em endosperma (DI STASI, 1989. VAN

DEN BERG, 1982).

No estado do Pará, as folhas e cascas do caule desta planta são utilizadas em forma de

chá ou pílulas, no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, problemas estomacais,

inflamações do fígado, rins, vesícula e no controle de índices elevados de colesterol (VAN

DEN BERG, 1982; DI STASI, 1989; DI STASI et al., 1994; MARTINS, 1989). A sacaca

também é comercializada em farmácias de manipulação e, neste caso, o pó das cascas do

caule é vendido em cápsulas (concentração aproximada de 250 mg). As folhas são

comercializadas em feiras livres da cidade de Belém-PA, para distúrbios do fígado e auxilia

na digestão, principalmente após a ingestão de alimentação rica em gorduras. O pó das folhas

é vendido com indicação hepatoprotetora, para tratamento do diabetes e em dietas de

emagrecimento. Em alguns casos, este pó é comercializado em mistura com o pó do boldo do

Chile (MACIEL et al., 1998., MACIEL et al., 2000; VEIGA JR et al., 2005).

O chá das folhas é indicado em academias de ginásticas da cidade de Belém para

diminuição de peso corporal, em dietas de emagrecimento. Porém, inúmeros casos de hepatite

tóxica já foram notificados em hospitais públicos dessa cidade, devido ao uso prolongado

deste chá, em dosagens concentradas. O uso recomendado do pó das cascas é 25 g de pó em

1000 mL de água, administrados 2 vezes ao dia durante 3-4 semanas, ou até que os sintomas

da doença desapareçam. No caso do uso correto do chá das cascas, não se encontra descrito na

literatura, nenhum tipo de efeito colateral (MACIEL et al., 2000).

Apesar do Croton cajucara possuir uma grande representatividade na medicina

tradicional da região Amazônica, até o final da década de 80, apenas uma avaliação

farmacológica havia sido efetuada com está espécie. Neste estudo, CAVALCANTE et al.

(1998), comprovaram a eficácia hipoglicêmica e hipolipidêmica da sacaca, em ratos e em

1995, OLIVEIRA et al. confirmaram o efeito hipolipidêmico em coelhos.

Outras atividades farmacológicas do Croton cajucara já foram evidenciadas, das quais

podemos citar a atividade antinociceptiva dos extratos hexânicos, clorofórmico e metanólico

das folhas (CAMPOS et al., 2002) e o efeito hipolipidêmico, correlacionado com a redução de

índices elevados de colesterol, foi evidenciado do extrato hidroalcóolico das folhas (FARIAS

et al., 1996). Estudos realizados com óleo essencial obtido a partir das cascas da sacaca

demonstraram atividade gastroprotetora como também atividade citotóxica para células V79

(HIRUMA-LIMA et al., 1999b). A atividade anti-leshimanicida foi identificada para o óleo

essencial (DO SOCORRO et al., 2003; BIGHETTI et al., 1999). Também foi verificado que o

extrato hidroalcoólico das folhas não produziu toxicidade em camundongos tratados

oralmente com até 5g/kg (toxicidade aguda).

Estudos fitoquímicos do Croton cajucara revelaram a presença dos principais

constituintes químicos presentes nas folhas, cascas e caule. A presença de óleo essencial nas

folhas do Croton cajucara foi identificada por CAMPBEL et al.(1974) possuindo a seguinte

composição: 66% de linalol, 2,55% de 1-8 cineol e 1,65% de terpenóides. Nos galhos também

se observou a presença de óleo essencial, porém em menor quantidade. Estudos posteriores

identificaram a presença de α-pineno, β-cariofileno, α-humuleno, cadineno e mirceno no óleo

essencial (HIRUMA-LIMA et al., 1996).

Das folhas do Croton cajucara foram isolados e identificados três esteróides (β-

sitosterol, stigmasterol e sisterol-3-O-β-glucoside), dois flavanóides (3,4,7-trimetoxicampferol

e 3,7-dimetoxicampferol) e um diterpeno nor-clerodano (cajucarinolida) (MACIEL et al.,

1998b; MACIEL et al., 2003).

Até o momento, as cascas do caule do Croton cajucara detêm o maior índice de

estudos. O estudo fitoquímico clássico realizado com 6 kg das cascas do caule de árvores com

idades variando entre 4-6 anos, mostrou que esta parte da planta é rica em diterpenos do tipo

clerodano. (MACIEL et al., 2000; ITOKAWA et al., 1990; ICHIHARA et al., 1990; KUBO

et al., 1991; MACIEL et al., 1998).

As cascas do caule do Croton cajucara foram investigadas pela primeira vez em 1979

na Universidade Federa do Pará, onde foi isolado e identificado o primeiro diterpeno

clerodano desta planta. A comparação dos dados espectrais dessa nova substância com os da

crotonina levou a conclusão que se tratava de um derivado deste terpenóide, designado de

desidrocrotonina, tendo sua estrutura química definida e possuindo como fórmula molecular

(HIDEJI et al., 1989; MACIEL et al., 1996; MÜLLER et al., 1986; SIMÕES et al.,

1979).

Outras investigações fitoquímicas com as cascas da sacaca resultaram no isolamento

de mais quatro clerodanos: cajucarina A, cis-cajucarina B, cajucarinolida e iso-cajucarinolida

(ITOKAWA et al., 1990; ICHIHARA et al., 1992; MACIEL et al., 1998). O fracionamento

dos extratos hexânico e metanólico das cascas do caule do Croton cajucara levou ao

isolamento e caracterização dos terpenóides: ácido acetilaleuritólico, trans-desidrocrotonina,

trans-crotonia, cis-cajucarina B, cajucarinolida e cajucarina A, previamente isolados das

cascas do caule desta planta, e dois novos clerodanos: trans-cajucarina B e sacarina (Figura

1) (MACIEL, 1997).

O triterpeno ácido acetilaleuritólico (AAA) também foi isolado das cascas do caule do

Croton cajucara por MÜLLER et al.(1986) e MACIEL et al.(1995). O ácido acetilaleuritólico

(AAA) foi isolado como componente majoritário em árvores com idade de 1

ano. O

triterpeno AAA foi também isolado em 0,08% de rendimento, nas árvores com idade variando

entre 3-6 anos. Experimentos biológicos realizados com o AAA mostraram que este triterpeno

possui atividade antiespasmódica, antiinflamatória e antinociceptiva. Esta substância,

entretanto, mostrou-se inativa em testes que avaliam atividade antitumoral e antiulcerogênica

(MACIEL et al., 2000; MACIEL et al., 1998; PERAZZO et al., 1997; VANDERLINDE et

al., 1997).

FIGURA 1. Estruturas químicas de alguns contituintes isolados do Croton cajucara Benth

(MACIEL, 2002).

Através de hidrogenação catalítica da t-DCTN foi obtido o derivado trans-crotonina

(CTN), o qual possui atividade antiulcerogênica (MACIEL et al., 2000; MACIEL et al., 1998;

ALBINO DE ALMEIDA et al., 2003), ações antiinflamatória e antinociceptiva (PERAZZO et

al., 1997). No entanto, esta substância não demonstrou efeito em testes que avaliam atividades

antitumoral (GRYNBERG et al., 1999) e antiespasmódica (MACIEL et al., 2000; MACIEL

et al., 1998), atividades estas, que foram observadas para a molécula-mãe t-DCTN.

1.6. Trans-desidrocrotonina (t-DCTN):

A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) (Figura 2) é um diterpeno 19-nor-clerodano

obtido da casca do Croton cajucara, sendo o componente majoritário de árvores com idades

variando entre 4-6 anos, com concentração moderada em árvores com 3 anos e não tendo sido

detectada em árvores com idade de 1

ano. Estes dados podem justificar o uso popular do chá

da casca grossa da sacaca, sendo que a casca fina não é utilizada (MACIEL, 1997).

O estudo fitoquímico realizado em todas as partes do Croton cajucara (raiz até

folhas), mostrou que a t-DCTN também está presente nas raízes e caule. Estudos com HPLC

(High Performace Liquid Chromatograph) realizados com o chá das cascas do C. cajucara,

mostraram que a t-DCTN é o constituinte marjoritário tendo concentração mais elevada no

chá obtido com as cascas moídas (MACIEL, 1997). Estes resultados juntamente com os altos

índices de isolamento do clerodano t-DCTN nas cascas desta planta, levaram à realização de

diversos testes farmacológicos com esta substância.

A toxicidade da t-DCTN foi avaliada em camundongos, não sendo observadas

alterações comportamentais nos animais que justifiquem a ação da t-DCTN sobre o sistema

nervoso central. A DL

foi determinada e corresponde a 550 mg/kg, via oral (CARVALHO

et al., 1996).

O 19-nor-clerodano t-DCTN mostrou correlação com grande parte das propriedades

terapêuticas da planta, evidenciando a atividade antiinflamatória e antinociceptiva

correlacionados com as indicações da planta para cura de inflamações (CARVALHO et al.,

1996). No modelo de diabetes induzida por aloxana, a t-DCTN demonstrou atividade

hipoglicêmica comparável àquela produzida pela glibenclamida, não sendo observado o

mesmo efeito em animais normais (FARIAS et al., 1997).

Em ratos diabéticos pelo uso da estreptozotocina (STZ), a t-DCTN demonstrou

atividade antidiabética oral. O efeito hipoglicemiante da t-DCTN é maior quando

administrada uma hora antes da estreptozotocina (efeito preventivo). Quando a t-DCTN foi

administrada 48 horas após a STZ (efeito curativo), os níveis de glicose sangüinea caíram em

torno de 49% (SILVA et al., 2001c).

FIGURA 2. Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN).

Trabalhos demonstraram que a administração oral de trans-desidrocrotonina é efetiva

em reduzir a hiperlipidemia induzida por uma dieta rica em gordura ou por tiloxapol em

camundongos, como também na hipertrigliceremia induzida por etanol e sugere seu uso

benéfico como um agente antiaterogênico (SILVA et al., 2001a; SILVA et al., 2001b).

Entretanto, a t-DCTN não apresentou resultado significativo em modelos de hiperlipidemia

genética com a utilização de animais geneticamente modificados (BIGHETTI et al., 2004).

Evidenciaram-se ainda, para este diterpeno, propriedades biológicas não mencionadas

pelos usuários da planta, tais como a atividade antitumoral e antiestrogênica. A t-DCTN

possui efeitos citotóxicos basais em linhagens de células fibroblásticas V79 e citotoxicidade

seletiva após metabolização em hepatócitos de ratos, como também atividade antitumoral

sobre o tumor de sarcoma 180 injetado em camundongos (DA SILVA MELO et al., 2001;

MACIEL et al., 1996; GRYNBERG et al., 1999; RODRIGUEZ & HAUN, 1999; MELO et

al., 2002; MACIEL et al., 2000).

Investigações adicionais demonstraram que t-DCTN possui atividade antitumoral em

linhagens de células HL60 causando necrose celular devido ao estresse oxidativo evidenciado

pelo aumento dos níveis de GSH, como também para células mononucleares de sangue

periférico humano. Outros trabalhos relataram que a t-DCTN produz apoptose em células

HL60 através da indução de estresse na peroxidação lipídica (FREIRE et al., 2003a; FREIRE

et al., 2003b, ANAZETTI et al., 2003; ANAZETTI et al., 2004).

BRITO et al. (1998) demonstraram que a t-DCTN possui significante atividade

antiulcerogênica, correlacionando com o uso da planta para o tratamento de problemas

estomacais como azia, gastrite e úlcera gástrica. Este efeito provavelmente está relacionado às

ações antisecretória e gastroprotetora por um aumento de prostaglandinas E

(HIRUMA-

LIMA et al., 1999; RODRIGUEZ et al., 2004). Derivados semi-sintéticos da t-DCTN foram

estudados em diferentes modelos animais de úlcera gástrica e demonstraram possuir atividade

gastroprotetora com redução da toxicidade (HIRUMA-LIMA et al., 2002; ALMEIDA et al.,

2003; MELO et al., 2004).

LUNA COSTA et al, em 1999, e MACIEL et al, em 2000, demonstraram as

atividades antiestrogênica e antiespasmódica da t-DCTN em animais experimentais,

respectivamente. Investigações adicionais confirmaram o efeito antimutagênico da t-DCTN,

através de testes citogenéticos do micronúcleo e de aberrações cromossômicas em células de

medula óssea de camundongos, demonstrando que esta não é genotóxica ou citotóxica para

estas células (AGNER et al., 2001; AGNER et al., 1999).

A trans-desidrocrotonina não apresentou toxicidade em animais tratados oralmente

com a dose de 50 mg/kg, por um período de 30 dias, demonstrando em bom perfil de

segurança e eficácia (SILVA, 2000). Entretanto, trabalhos recentes demonstraram que o

tratamento oral com altas doses de t-DCTN (100 mg/kg) por um período de 5 semanas,

aumentou o peso dos fígados com significante redução dos níveis plasmáticos de fosfatase

alcalina e colesterol, como também um aumento dos níveis de γ-glutamil transpeptidase

(RODRIGUEZ et al., 2004).

Portanto, alguns estudos in vitro e in vivo têm apontado um potencial hepatotóxico da

t-DCTN (MELO et al., 2002; CORREA et al., 2005), sugerindo que este composto é dotado

de propriedades tanto citoprotetoras quanto citotóxicas.

Outros derivados da t-DCTN estão sendo obtidos (GARDEN et al., 1999; MARTINS,

2000) para que seja possível o estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação

deste diterpeno bioativo que além de ser o componente majoritário nas cascas do Croton

cajucara, foi o que apresentou a melhor correlação com grande parte das propriedades

terapêuticas da sacaca.

1.7. Hepatotoxicidade de drogas hipoglicêmicas e hipolipidêmicas:

Recentemente, a hepatotoxicidade associada a fitoterápicos está sendo reconhecida

crescentemente devido ao grande uso e a fácil disponibilidade destes. Produtos vegetais como

pulegone, um ketone de monoterpeno, presente no pennyroyal (Mentha pulegeum) e muitas

outras espécies de óleos essenciais; teucrina A, um diterpeno encontrado em germander

(Teuchrium chamaedrys); alcalóides pirrolizidina da espécie Senecio (Asteraceae) e confrei

(Symphytum officinale); e pironas de kava (Piper methysticum) são exemplos típicos que

causam severa hepatotoxicidade (STEDMAN, 2002; SCHULZE et al., 2003; ZHOU et al.,

2007; LÜDE et al., 2008). Eles podem produzir dano hepático promovendo apoptose e/ou

alterando membranas celulares por mecanismos mediadores da bioativação que favorecem a

formação de metabólitos/intermediários reativos, a depleção da glutationa intracelular e/ou

formação de quinona (ZHOU et al., 2007). Muitas plantas sintetizam compostos tóxicos,

podendo induzir hepatotoxicidade, possivelmente agindo como pró-oxidantes, atacando

macromoléculas, inclusive proteína, DNA e lipídios.

Como a Croton cajucara, espécies do gênero Teucrium, de germander (Teucrium

chamaedrys L. e Teucrium canadense L.), são ricas em diterpenos clerodano ou neoclerodano

que podem responder pelo potencial hepatotóxico destas espécies vegetais (LEKEHAL et al.,

1996; SUNDERESAN et al., 2006). Alguns diterpenóides derivados de plantas podem induzir

hepatotoxicidade, mostrando a importância da avaliação destes derivados quanto ao seu

potencial hepatotóxico, para garantir a segurança e qualidade de medicamentos fitoterápicos.

No passado, poucos estudos foram direcionados para investigação do potencial

hepatotóxico da t-DCTN em experimentação animal in vitro e in vivo (MELO et al., 2004;

CORRÉA et al., 2005). Adicionalmente, havia relatos que t-DCTN era destituída de

genotoxicidade e poderia até mesmo induzir um efeito antigenotóxico (AGNER et al., 2001;

POERSCH et al., 2007). Estes achados podem conduzir ao menosprezo dos efeitos

citotóxicos da t-DCTN, que são normalmente aparentes somente em doses altas. Estudos

prévios estabeleceram os efeitos hipoglicêmico e hipolipidêmico da t-DCTN, e validou o seu

uso tradicional no controle da diabete e como um agente dietético emagrecedor (MACIEL et

al., 2000). Os agentes antidiabéticos sintéticos como glitazonas, metformina e acarbose foram

descritos por causarem rara, mas severa hepatotoxicidade, que às vezes resulta em falência

hepática conduzindo à necessidade por transplante de fígado ou, até mesmo à morte (ISLEY,

2003; KUTOH, 2005; HSIAO et al., 2006).

Triglitazona, a primeira droga da classe das tiazolidinas, utilizada no tratamento da

diabetes Tipo 2, foi comercializada em março de 1997 e retirada do mercado americano 36

meses após noventa casos de insuficiência hepática terem sido registrados (CLUXTON et al.,

2005). Troglitazona, uma tiazolidina, foi removida do mercado devido a sua hepatotoxicidade.

Os casos registrados envolvendo novas TZDs de segunda geração, rosiglitazona e

pioglitazona, são poucos em números e menos severos em danos (MARCY et al., 2004).

Estatinas, agentes conhecidos por diminuir o colesterol, têm sido utilizadas por 15

anos e estão dentre as drogas mais comumente prescritas. Estudos animais e ensaios clínicos

têm mostrado sinais de hepatotoxicidade, primariamente por elevação nos níveis da enzima

sérica alanina aminotransferase (ALT). Por esta razão, todas as drogas que diminuem os

níveis de colesterol requerem monitoramento das enzimas hepáticas.

Estas elevações são reversíveis com a descontinuação da terapia, são doses

relacionadas, e são provavelmente, relacionadas à diminuição do colesterol per se. Raros

casos de insuficiência aguda hepática têm sido registrados com todas as drogas que diminuem

os níveis de colesterol. Com lovastatina, a freqüência é de aproximadamente 1/1,14 milhões

de pacientes tratados ao ano. Monitoramento da hepatotoxicidade não tem sido efetivo na

prevenção das doenças hepáticas, devido a sua raridade e fraco valor de predição com relação

às alterações da ALT (TOLMAN, 2003).

1.8. Mecanismos de hepatotoxicidade de fármacos:

Lesões hepáticas induzidas por drogas constituem uma potencial complicação de

qualquer tratamento medicamentoso, uma vez que o fígado é o órgão central de disposição

metabólica de praticamente todas as drogas e xenobióticos (ZIMMERMAN; MADDREY,

1993; FARRELL, 1994).

Muitos xenobióticos são biotransformados e eliminados pelo fígado, principalmente na

forma de conjugados, sem maiores conseqüências. No entanto, alguns são concentrados a

níveis tóxicos, enquanto outros são bioativados a compostos intermediários reativos que

podem lisar o fígado de diversas maneiras (KULKARNI; BYCZKOWSKI, 1994).

Essas lesões resultam do efeito direto da droga e/ou produto de biotransformação

provocando disfunção intracelular pela ruptura da integridade dos diversos sistemas de

membranas dos hepatócitos ou indiretamente através dos danos celulares provocados por

processos imunológicos. Fatores que contribuem para o acúmulo de toxinas nos hepatócitos

incluem alterações genéticas em sistemas enzimáticos que permitem a formação de

metabólitos reativos, competição por outras drogas e depleção de substratos necessários para a

eliminação do metabólito (LEE, 1995).

Existem, basicamente seis tipos de alterações hepáticas que podem ser induzidas pelos

medicamentos e o modo com que várias organelas intracelulares são afetadas define o padrão

da doença (LEE, 2002; JAESCHKE et al., 2002):

1- Alteração da homeostase do cálcio intracelular, produzindo ruptura das fibrilas de

actina na superfície do hepatócito, culminando com a lise celular, em decorrência das reações

de alta energia de enzimas do citocromo P-450.

2- Interrupção do fluxo biliar por substâncias que afetam proteínas de transporte na

membrana canalicular ligando-se à proteína exportadora de sais biliares ou inativando-a. A

ruptura dos filamentos de actina ocorre junto aos canalículos causando colestase, entretanto

produz pouca agressão celular. É o mecanismo mais provável na toxicidade hepática

decorrente do uso de fibratos.

3- Citotoxicidade mediada por anticorpos. Os medicamentos são moléculas

relativamente pequenas e, portanto, é improvável que evoquem resposta imunológica.

Entretanto, a biotransformação que envolve reações de alta energia, pode resultar na formação

de produtos inativos, ou seja, medicamentos covalentemente ligados a enzimas. Estas

moléculas, que são grandes o suficiente para servir como alvos imunológicos podem migrar

para a superfície do hepatócito onde podem induzir a formação de anticorpos.

4- Indução de respostas citolíticas diretas por células T. A resposta secundária das

citocinas a esses processos pode causar inflamação e hepatoxicidade adicional mediada por

neutrófilos.

5- Morte celular programada (apoptose) decorrente da agressão imuno-mediada, com a

destruição de hepatócitos pelas vias do TNF e da Fas. Estas funcionam como gatilho para a

cascata de caspases, que levam à contração das células e fragmentação da cromatina nuclear.

6- Estresse oxidativo ocasionado pela agressão dos fármacos às mitocôndrias, seja por

inativação ou ligação a enzimas respiratórias ou ao DNA mitocondrial, desregulando a

oxidação dos ácidos graxos e a produção de energia celular. Isto resulta no aparecimento de

metabolismo anaeróbico, acidose lática e acúmulo de triglicérides nas células

(esteatohepatite).

Sendo o hepatócito a principal unidade metabólica do fígado, muitas reações adversas

podem resultar na sua morte. A reação mais comum conduzindo a morte celular é a formação

de ligações covalentes entre o metabólito reativo e macromoléculas biológicas. Reações de

oxidação também podem produzir compostos eletrofílicos ou espécies reativas de oxigênio

(tais como o ânion superóxido e outros radicais livres) que reagem com componentes

celulares (RECKNAGEL et al., 1991).

Espécies reativas de oxigênio (ânion radical superóxido, peróxido de hidrogênio e

radical hidroxil) são produzidas continuamente durante o metabolismo aeróbico. O

desequilíbrio entre a formação excessiva de EROs e a defesa antioxidante resulta em vários

processos deletérios para a célula. Pequenas flutuações na concentração destes oxidantes

exercem um papel na sinalização intracelular, enquanto aumentos descontrolados dessas

espécies de oxigênio conduzem a reações em cadeia com proteínas, lipídeos, polissacarídeos e

DNA (DROGE, 2002).

A formação de EROs não é o único evento responsável pela toxicidade de muitos

fármacos contra as células. A alteração do estado redox pela depleção de substâncias

redutoras, a inibição dos seqüestradores de EROs, ou a adição direta de espécies produtoras

de EROs, também contribuem para citotoxicidade dos fármacos.

O balanço redox é regulado por uma quantidade relativa de substâncias oxidantes e

redutoras. Ânion superóxido (O

), radical hidroxila (OH

), peróxido de hidrogênio (H

) e

oxigênio singleto (

) constituem os principais componentes oxidantes endógenos

(KAMATA; HIRATA, 1999; THANNICKAL; FANBURG, 2000). Em condições normais, o

é transformado em peróxido de hidrogênio (H

) pela adição da superóxido dismutase

(SOD). O H

por sua vez é reduzido a H

O pela glutationa redutase, com a utilização de

NADPH. Desta forma, a mitocôndria possui um sistema antioxidante eficiente composto por

GSH, SOD, NADPH, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GRd), além de

vitaminas C e E (KOWALTOWSKI; VERCESI, 1999; GUTTERIDGE; HALLIWELL,

2000).

Além de fornecer mais de 95% de energia utilizada pela célula por meio da

fosforilação oxidativa, a mitocôndria desempenha diferentes funções na regulação de vários

processos celulares, participando da modulação do estado redox celular, da regulação

osmótica, do controle de pH, da sinalização celular, e, sobretudo, da manutenção da

homeostasia do cálcio. Devido a essa diversidade de funções, a mitocôndria é uma organela

alvo de várias situações lesivas e agentes tóxicos, estando envolvidas nos mecanismos de

dano e morte celular (ORRENIUS et al., 1989; GUNTER et al., 1994; WALLACE et al.,

1997). Evidências experimentais indicam que a mitocôndria representa um alvo preferencial e

crítico para a ação de drogas e toxinas (NIEMINEN et al., 1990; BELLOMO et al., 1982;

IMBERTI et al., 1993).

As mitocôndrias são essenciais para a manutenção da vida celular, e exercem um papel

central na regulação da morte celular, constituindo a principal fonte geradora de EROS uma

vez que o sistema de transporte elétrico mitocondrial consome aproximadamente 85% de todo

oxigênio utilizado pela célula e, em contraposição aos outros sistemas oxidantes celulares

(citocromo P450, várias oxidases citosólicas, β-oxidação de ácidos graxos nos peroxissomas,

etc), as mitocôndrias são requeridas para a produção de ATP e estão presentes em elevado

número em praticamente todas as células. Um déficit de energia ocasionado pelo declínio na

função mitocondrial pode comprometer a atividade celular normal (SHIGENAGA; HAGEN;

AMES, 1994).

Os efeitos tóxicos sobre as mitocôndrias podem ocorrer por mecanismos diretos e

indiretos, incluindo a quebra da homeostasia intracelular de íons, inibição enzimática, danos

às membranas celulares e anóxia (RAHN et al., 1991). Quando há alteração na

permeabilidade da membrana mitocondrial (PMM) as células morrem principalmente por

apoptose. Os fatores chave que regulam a PMM incluem a concentração intramitocondrial do

cálcio, o estado redox celular (incluindo níveis de espécies reativas de oxigênio) e a

mobilização dos membros da família Bcl-2.

Alterações nas funções mitocondriais têm um efeito imediato no balanço energético da

célula (ROSSER; GORES, 1995). Diversos mecanismos podem estar envolvidos nesse

processo: (a) inibição direta do metabolismo mitocondrial por inibição do transporte de

elétrons e/ou da fosforilação oxidativa; (b) danos estruturais na mitocôndria devido a

oxidação dos lipídeos de membrana ou devido a intercalação de compostos na membrana

lipídica, conduzindo à alteração do potencial de membrana mitocondrial e conseqüentemente

à dissipação do potencial energético necessário para a síntese de ATP e (c) danos ao DNA

mitocondrial (NIEMINEN et al., 1995).

1.9. EROs e o Estresse Oxidativo:

O estresse oxidativo é um achado freqüente na hepatotoxicidade induzida por

xenobióticos (POLI et al., 1987). Trata-se de um processo mediado pela formação de radicais

livres diversos que resultam da degradação oxidativa dos lipídeos (lipoperoxidação) e de

proteínas presentes nos diversos sistemas de membrana da célula. Outras macromoléculas

(glicídios e ácidos nucléicos) também podem ser afetadas. Esse processo pode ser iniciado por

radicais derivados dos xenobióticos gerados em reações catalisadas pelas isoenzimas do

citocromo P-450 ou ainda pela produção de radicais livres oriundos do oxigênio (O

, H

). Na presença do oxigênio, esse processo é estendido aos lipídeos insaturados e uma

cadeia de reações é estabelecida de modo que os danos às membranas são propagados. A

primeira conseqüência desse processo é a profunda alteração das propriedades físicas e

químicas das membranas, causando perda das suas funções especializadas (ROSS, 1988).

A cadeia transportadora de elétrons parece ser a principal fonte intracelular de espécies

reativas de oxigênio (EROs) e peróxido de hidrogênio (H

). Além de seu papel como

espécie reativa de oxigênio, e, portanto, causador de estresse oxidativo, o H

em excesso

causa oxidação da hemoglobina e, conseqüentemente, diminuição das concentrações de

oxigênio, o que pode acarretar infecções, formação de úlceras e até necrose (WIEACKER et

al., 1980). Na presença de várias drogas ou toxinas, como por exemplo: inibidores da cadeia

transportadora de elétrons, desacopladores da fosforilação oxidativa, compostos quinonoídeos

e metais, a geração de radicais livres de oxigênio pela mitocôndria pode ser aumentada

substancialmente (GERLACH et al., 1995).

O radical aniônico superóxido (O

) parece ser o principal produto da redução

incompleta do oxigênio sob condições fisiológicas e patológicas. Sob a ação da superóxido

dismutase o radical superóxido é transformado em água oxigenada, cuja redução pode se

difundir da mitocôndria e lesar componentes celulares distantes do seu sítio de formação; o

radical hidroxil, devido à sua alta reatividade e conseqüente meia vida muito curta, não possui

a capacidade de difusão. Dessa forma, os efeitos das EROs podem ser maiores na membrana

mitocondrial interna, cujo principal componente da bicamada fosfolipídica é a cardiolipina,

um derivado do fosfatidil glicerol, que possui uma alta relação de ácidos graxos

insaturados/saturados.

A cardiolipina apresenta uma importante função no controle da permeabilidade da

membrana, bem como no estabelecimento do gradiente eletroquímico de prótons. É ainda um

regulador da respiração de estado 3, podendo modular a estrutura secundária de proteínas da

membrana interna da mitocôndria, tais como os transportadores de substratos, NADH

desidrogenase, citocromo bc1, citocromo c oxidase e ATP sintetase (MASSOTTI et al.,

1974). Além disso, a membrana mitocondrial interna possui enzimas contendo ferro e cobre,

as quais podem catalisar a reação de oxidação do superóxido e da água oxigenada e formar

radicais hidroxilas (ZHANG et al., 1990).

As células possuem diversas estratégias para neutralizar os radicais livres de oxigênio

gerados durante as oxidações biológicas prevenindo assim a propagação dos danos. Trata-se

de um sistema complexo que compreende: (a) inativação dos radicais livres de oxigênio por

enzimas específicas (superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase); (b)

neutralização dos radicais eventualmente formados pela ação de substâncias com

propriedades sequestradoras de radicais livres (vitamina E, GSH) e (c) reparo dos lipídios

oxidados (glutaredoxina). A geração de espécies reativas de oxigênio pela mitocôndria é um

processo contínuo e fisiologicamente normal em condições aeróbicas, visto que cerca de 1-2%

do oxigênio reduzido pela mitocôndria é convertido em superóxido (VERCESI, 1993).

1.10. Sistemas de defesa antioxidante:

A mais importante defesa contra as lesões oxidativas induzidas pelas espécies reativas

de oxigênio é a manutenção da homeostase da glutationa (GSH). A glutationa reduzida serve

como substrato para a ação da glutationa peroxidase, na remoção do radical superóxido, e da

glutationa transferase, na formação do ácido mercaptúrico, além de atuar como seqüestrador

de radicais livres. Atua também como reguladora intracelular de grupos sulfidrila de enzimas

glicolíticas e de ATPase-Ca

(BENZI; MORETTI, 1995). A ação da glutationa peroxidase

leva à produção da glutationa dissulfeto ou glutationa oxidada (GSSG), a qual é tóxica para a

célula pela formação de derivados cistenil, especialmente na presença de metais de transição

(JENNER, 1994).

As reações dependentes da glutationa reduzida são de fundamental importância para a

proteção da célula contra o estresse oxidativo, por manter a célula em um ambiente reduzido

sob condições fisiológicas normais. A quebra da homeostase dos compostos de sulfidrilas em

células tratadas com pró-oxidantes provoca enfraquecimento do sistema de translocação do

cálcio, estimulação dos canais de cálcio e inibição do seqüestro de cálcio pelo retículo

endoplasmático e mitocôndria. Isto resulta na incapacidade da célula em manter a

concentração do cálcio intracelular em níveis fisiológicos. Esse aumento intracelular da

concentração do cálcio pode causar a ativação de várias enzimas cálcio-dependentes

(fosfolipases, proteases e endonucleases) relacionadas aos processos de degradação de

macromoléculas, o que pode contribuir para a morte de célula (ORRENIUS; NICOTERA,

1994; VERCESI, 1993; TRUMP; BEREZESKY, 1995).

Em muitas doenças a natureza da espécie radicalar que amplifica a lesão primária não

é conhecida. Desta forma, torna-se difícil o planejamento correto da utilização de fármacos

com propriedades antioxidantes que eliminem diretamente o radical livre, impedindo sua

reação com alvos celulares ou interrompendo as cadeias radicalares e assim, evitando a

propagação das lesões provocadas por esses radicais (SUN, 1990). O emprego adequado

destes fármacos e das estratégias terapêuticas depende de diversos fatores, tais como:

entendimento dos processos dependentes dos radicais livres envolvidos na fisiopatologia de

diversas doenças, identificação das fontes celulares geradoras das espécies radicalares

potencialmente tóxicas, identificação dos compostos que possam atuar como antioxidantes,

bem como a sua distribuição nos tecidos, localização subcelular e mecanismo de ação

(GUTTERIDGE & HALLIWELL, 2000; SUN, 1990).

Neste contexto, os dois principais meios de defesa antioxidantes no organismo podem

ser divididos em dois grupos, enzimáticos e não enzimáticos. Os sistemas enzimáticos

envolvem as enzimas do ciclo redox da glutationa, particularmente a glutationa peroxidase.

Estudos demonstraram também que outras enzimas antioxidantes, como glutationa redutase e

glicose-6-fosfato-dehidrogenase, apresentaram propriedades protetoras similares à glutationa

peroxidase (SENTUERKER, 1993; WELLS et al., 1997). Outros sistemas enzimáticos de

defesa antioxidante operando em conjunto com as enzimas anteriormente citadas incluem a

superóxido dismutase (SOD), dependente de Cu

e Zn

como cofatores, onde ocorre a

dismutação do radical superóxido em peróxido de hidrogênio e oxigênio, bem como a

catalase, que converte peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular nas hemácias

(MEISTER & ANDERSON, 1983).

Muitas das reaçãoes radicalares prejudiciais in vivo são evitadas ou modificadas pela

ação de agentes inividores ou antioxidantes. Por exemplo, no caso de superóxido, a enzima

SOD age como defesa contra esta espécie, enquanto as enzimas catalase e peroxidase atuam

sobre H

Há ainda a proteção não enzimática por pequenas moléculas, dentre as quais as mais

utilizadas estão as vitaminas E (α-tocoferol) e C (ácido L-ascórbico). A vitamina E é o maior

antioxidante lipossolúvel presente em todas as membranas celulares e, portanto, atua na

proteção contra a lipoperoxidação (KAY et al., 1986). Ela pode reagir diretamente com uma

variedade de oxiradicais, como o superóxido, a hidroxila etc., e também com o oxigênio

singleto (MACHLIN & BENDICH, 1987).

A vitamina E foi primeiramente relatada em 1922, nos Estados Unidos, por Evaris e

Bishop, que demonstraram ser liposolúvel e também fator essencial para reprodução normal

em ratos. A purificação deste fator revelou que ele é composto da família dos tocoferóis.

Quatro tocoferóis são conhecidos, porém o alfa-tocoferol é o mais importante biologicamente

e os termos alfa-tocoferol e vitamina E são quase intercambiáveis na literatura (HALLIWELL

& GUTTERIDGE, 1989).

Primeiramente, o alfa-tocoferol inativo reage com o oxigênio singleto protegendo a

membrana contra essa espécie. Durante a sua ação antioxidante (destruindo a cadeia de

lipoperoxidação) nas membranas, o alfa-tocoferol é consumido e convertido em forma de

radical. A vitamina E pode também proteger contra a peroxidação modificando a estrutura da

membrana (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1989).

A vitamina E, localizada perto do citocromo P-450 no fosfolipídeo da membrana,

varre os radicais livres formados no citocromo P-450. A seguir, a vitamina C reduz o radical

tocoferil. Ambos os radicais tocoferil e hidroascorbil não são muito reativos inviabilizando o

processo de lipoperoxidação (MEISTER & ANDERSON, 1983).

Os carotenóides destacam-se também com agentes antioxidantes, dentre os quais a

pró-vitamina A (β-caroteno), pigmento responsável pela cor característica da cenoura, é o

caratenóide mais abundante e de maior atividade. Estudos recentes indicam uma possível

atividade anti-cancerígena do β-caroteno, sendo usado como corante e antioxidante em

alimentos (BURTON & INGOLD, 1984). Especificamente, o β-caroteno exibe uma boa

capacidade de captura de radicais livres somente a pressões parciais normais de oxigênio no

ar, comumente encontrada na maior parte dos tecidos biológicos sob condições fisiológicas

(CARDOSO, 1997).

1.11. Relevância e justificativa:

O Croton cajucara Benth. (sacaca) é uma espécie medicinal amplamente utilizada na

região amazônica no tratamento do diabetes, desordens hepáticas e renal, obesidade e

hipertensão. Estudos farmacológicos comprovaram as propriedades antiinflamatória,

antinociceptiva, antiestrogênica, antiulcerogênica, antitumoral, hipolipidêmica, hipoglicêmica

e citotóxica da trans-desidrocrotonina (t-DCTN), um diterpeno do tipo clerodano isolado da

sacaca e componente majoritário desta planta.

Em virtude de o chá das cascas do caule de sacaca ser muito utilizado em dietas de

emagrecimento e como hipoglicemiante e diante da possibilidade deste componente

majoritário ser o responsável por efeitos hepatotóxicos que podem ser desencadeados em

tratamentos prolongados, há necessidade de se investigar os efeitos tóxicos da t-DCTN sobre

o fígado e determinar novas alternativas terapêuticas que possam diminuir os possíveis efeitos

adversos associados a este diterpeno.

2. OBJETIVOS

Uma vez que, muitas atividades já foram comprovadas para a trans-desidrocrotonina

(t-DCTN) e que estudos demonstraram que algumas substâncias hipoglicemiantes e

hipolipidêmicas são associadas a efeitos tóxicos sobre o fígado, este trabalho tem por objetivo

geral avaliar a hepatotoxicidade da t-DCTN em camundongos e desenvolver estratégias

farmacológicas para mitigar este efeito tóxico.

Objetivos específicos:

- Determinar a toxicidade hepática aguda da trans-desidrocrotonina (t-DCTN);

- Determinar a toxicidade hepática de administrações repetidas (subcrônica) da trans-

desidrocrotonina;

- Avaliar o efeito pré-condicionante de baixas doses de t-DCTN na toxicidade hepática aguda

induzida por t-DCTN;

- Avaliar o efeito pré-condicionante de baixas doses de Etanol na toxicidade hepática aguda

induzida por t-DCTN.

- Avaliar o envolvimento do óxido nítrico no efeito pré-condicionante da t-DCTN e do

Etanol;

- Avaliar o efeito da Vitamina E e N-acetilcisteína (NAC) na hepatite tóxica induzida por t-

DCTN.

3. MATERIAIS

3.1. Material botânico:

A t-DCTN foi isolada a partir da casca do caule do Croton cajucara Benth. e

fornecida pela Profª Maria Aparecida Maciel do Departamento de Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. Para utilização nos experimentos, a t-DCTN foi diluída na

concentração de até 3% de Tween 80 em água destilada.

3.2. Animais experimentais:

Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss Webster, adultos, machos,

pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal do Ceará. Os animais foram acondicionados em caixas

de polipropileno, à temperatura variando entre 22-24°C, com ciclos de claro/escuro de 12 em

12 h, recebendo ração padrão (Purina Chow) e água ad libitum. Os protocolos experimentais

utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal – CEPA da

Universidade federal do Ceará.

3.3. Drogas e reagentes:

PRODUTO ORIGEM

Ácido Etilenodiaminotetracético sal dissódico (EDTA)

Proanalysi, Brasil

Ácido tiobarbitúrico Sigma, USA

Ácido tricloroacético P.A. Sigma, USA

Ácido trinitrobenzeno sulfônico – TNB Sigma, USA

Álcool etílico absoluto P.A. Synth, Brasil

D-Arginina Sigma, USA

Cloreto de sódio Vetec, Brasil

Éter etílico Labsyunth, Brasil

Glutation reduzido (GSH) Sigma, USA

L-Arginina Sigma, USA

Metanol absoluto P.A. Quimex, Brasil

N-Acetilcisteína Sigma, USA

Trizma Sigma, USA

Tween 80 Sigma, USA

Vitamina E Aché, Brasil

3.4. Equipamentos:

EQUIPAMENTO ORIGEM

Agitador – aquecedor, modelo 258

Fanen®, Brasil

Espectrofotômetro: modelo DU640B

Beckman®

Espectrofotômetro: modelo B582 Micronal®

Balança analítica: modelo AX-200 Shimadzu, Japão

Balança para animais: modelo MF-6 Filizola, Brasil

Banho-maria, modelo Q-249 QUIMIS®, Brasil

Centrífuga refrigerada, modelo 5417R Eppendorf®

Centrífuga refrigerada, modelo CT 5500 DR CIENTEC®, Brasil

pHmetro Microprocessado QUIMIS®

Brasil

Pipetas automáticas Jencons®

4. MÉTODOS

4.1. Isolamento da trans-desidrocrotonina (t-DCTN):

A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) foi isolada do extrato hexânico das cascas (6 kg)

do Croton cajucara Benth., o qual forneceu, após filtração em gel de sílica, a fração CH

(eluída em diclorometano).

A fração CH

sofreu nova filtração em gel de sílica, tendo sido eluída com hexano -

-MeOH em gradiente crescente de polaridade. Foram coletadas frações de 500 mL,

que sofreram monitoramento por cromatografia de camada delgada – CCD, gerando a reunião

de 6 grupos de frações.

Os grupos de frações 7-21/ 22-25/ 26-29/ 30-33/ 34-41, eluídos em hexano- CH

(5:5 – 0:1) o grupo de frações 42-53, eluídos em CH

-MeOH (9:1 – 0:1), foram

submetidos ao processo de recristalização em hexano-Me

CO. Após as filtrações obteve-se

aproximadamente 32 g de um sólido cristalino correspondente ao diterpeno trans-

desidrocrotonina (t-DCTN), como mostra a figura 3.

t-DCTN – Características

Sólido cristalino

Ponto de fusão: 139 – 140°C

Peso molecular: 314 M

FIGURA 3 . Método de obtenção do diterpeno trans-desidrocrotonina (t-DCTN) a partir

dos extratos hexânicos e clorofórmico.

Extração via Soxlet

Hexano (46 litros)

Extrato hexânico

471,8g

Fração

(CH

)

Filtração em gel de Sílica

(35-70 Mesh) – 900g

Filtração em gel de Sílica

(35-70 Mesh) – 500g

Hexano – CH

– MeOH

(9:1:0 – 0:0:1)

Ordem crescente de

polaridade

Frações 5 e 6

Hexano – CH

(7:3)

Cromatografia de

camada delgada–CCD

Hexano – AcOEt (8:2)

/ MeOH (1:1)

Ausência da DCTN

Reunião de frações eluídas em

hexano – CH

(5:5 – 0:1)

Frações 22-25

(5:5)

Recristalização

Hexano – Me

3,8g de t-DCTN

Frações 26-29

(4:6)

3,3g de t-DCTN

Frações

30-33

(3:7)

3,8g de t-DCTN

Frações

34-41

(2:8-0:1)

Frações

42-53

10g de t-DCTN

Recristalização

hexano – Me

Recristalização

hexano – Me

Recristalização

hexano – Me

Frações 7-21

CCD – hexano – AcOEt (6:4)

/ MeOH (1:1)

0,5g de t-DCTN

Recristalização

hexano – Me

0,5g de t-DCTN

Cromatografia de coluna do líquido –

mãe proveniente de recristalização gel

de sílica 70-230 Mesh hexano –

(8:2 – 0:1)

Casca da Sacaca

6kg

10g de t-DCTN

4.2. Efeito de uma única administração de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de peso) na

hepatotoxicidade em camundongos:

Os animais foram divididos em grupos de 8 e tratados com veículo (3% de Tween 80

em água destilada- 0,1 ml/10g, v.o.- gavagem) ou t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.-

gavagem) administrada em dose única. Os animais que receberam apenas veículo foram

incluídos no estudo como controle normal.

Após o período de 24 horas da administração da t-DCTN, amostras de sangue, de

todos os animais, foram obtidas através do plexo orbital, sob leve anestesia com éter, em

tubos heparinizados para determinação dos níveis de Aspartato Aminotransferase (AST) e

Alanina Aminotransferase (ALT) utilizando kits bioquímicos específicos (Labtest®) e um

espectrofotômetro semi-automático (Micronal®, modelo B582).

Os animais foram então sacrificados e o tecido hepático coletado, pesado e processado

para a dosagem de grupos sulfidrilas não protéicos hepáticos – NP-SH (SEDLACK &

LINDSAY, 1968) e para análise histológica.

4.3. Efeito de administrações sucessivas de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de peso) na

toxicidade hepática em camundongos:

Foram divididos grupos de oito animais cada, os quais foram tratados com veículo

(3% de Tween 80 em água destilada- 0,1 ml/10g, v.o.- gavagem) ou t-DCTN (10, 30, 100 ou

300 mg/kg, v.o.- gavagem) 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes do experimento. Os animais que

receberam apenas veículo foram incluídos no estudo como controle normal.

Após o período de 24 horas da última administração da t-DCTN, foram determinados

os níveis séricos de Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina Aminotransferase (ALT)

utilizando kits bioquímicos específicos (Labtest®) e um espectrofotômetro semi-automático

(Micronal®, modelo B582). Em seguida os animais foram sacrificados, o tecido hepático

coletado, pesado e processado para a dosagem de grupos sulfidrilas não protéicos hepáticos –

NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968) e análise histológica.

4.4. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN:

Grupos de oito animais foram tratados com veículo (3% de Tween 80 em água

destilada- 0,1 ml/10g, v.o.- gavagem) ou t-DCTN (10 mg/kg, v.o.- gavagem) 120, 96, 72, 48 e

24 horas antes do experimento. Outro grupo recebeu pré-tratamento por cinco dias

consecutivos com 10 mg/kg (v.o.) de t-DCTN e 24 h após o último tratamento recebeu uma

dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.). Os animais que receberam apenas veículo foram

incluídos no estudo como controle normal.

Após o período de 24 horas da última administração da t-DCTN, foram coletadas

amostras de sangue de todos os animais e os níveis de Aspartato Aminotransferase (AST) e

Alanina Aminotransferase (ALT) foram analisados utilizando kits bioquímicos específicos

(Labtest®) e um espectrofotômetro semi-automático (Micronal®, modelo B582). Os animais

foram sacrificados e o tecido hepático foi coletado, pesado e processado para a dosagem de

grupos sulfidrilas não protéicos hepáticos – NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968) e para

análise histológica.

4.5. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN:

Os animais foram divididos em grupos (n=8), os quais receberam os seguintes

tratamentos: veículo (3% de Tween 80 em água destilada- 0,1 ml/10g, v.o.- gavagem) ou

etanol (1 g/kg de animal, v.o.- gavagem) 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes do experimento.

Outro grupo recebeu pré-tratamento por 5 dias consecutivos com 1 g/kg de etanol e 24 h após

o último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.- gavagem).

Amostras de sangue de todos os animais foram coletadas após o período de 24 horas

da última administração da t-DCTN, determinando-se os níveis de Aspartato

Aminotransferase (AST) e Alanina Aminotransferase (ALT) utilizando kits bioquímicos

específicos (Labtest®) e um espectrofotômetro semi-automático (Micronal®, modelo B582).

Os animais foram sacrificados e foram realizadas dosagens dos grupos sulfidrilas não

protéicos hepáticos – NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968) e análise histológica.

4.6. Envolvimento do óxido nítrico no pré-condicionamento hepático da t-DCTN e do

etanol:

Os animais foram divididos em grupos de 8 e tratados com veículo (3% de Tween 80

em água destilada- 0,1 ml/10g, v.o.) ou t-DCTN (100 mg/kg, v.o.). Outros grupos receberam

pré-tratamento com L-arginina (600 mg/kg, i.p.) ou D-arginina (400 mg/kg, i.p.) 30 min antes

da administração da t-DCTN.

Após o período de 24 horas da última administração da t-DCTN, foram coletadas

amostras de sangue de todos e os níveis de Aspartato Aminotransferase (AST) e Alanina

Aminotransferase (ALT) foram analisados utilizando kits bioquímicos específicos (Labtest®)

e um espectrofotômetro semi-automático (Micronal®, modelo B582). Os animais foram

sacrificados e tecido hepático foi coletado, pesado e processado para a dosagem de grupos

sulfidrilas não protéicos hepáticos – NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968) e para análise

histológica.

4.7. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) na hepatite tóxica induzida por t-

DCTN:

Os animais foram divididos em grupos de 8 e tratados com veículo (3% de Tween 80

em água destilada- 0,1 ml/10g, v.o.- gavagem) ou t-DCTN (100 mg/kg, v.o.-gavagem).

Outros grupos receberam pré-tratamento com Vitamina E (300 mg/kg, v.o.- gavagem), NAC

(150 mg/kg, i.p.) ou com a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e NAC (150 mg/kg,

i.p.) 1h antes da administração da t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

Após o período de 24 horas da última administração da t-DCTN, foram coletadas

amostras de sangue dos animais e analisados os níveis de Aspartato Aminotransferase (AST)

e Alanina Aminotransferase (ALT) utilizando kits bioquímicos específicos (Labtest®) e um

espectrofotômetro semi-automático (Micronal®, modelo B582). Os animais foram

sacrificados e tecido hepático foi coletado, pesado e processado para a dosagem de grupos

sulfidrilas não protéicos hepáticos – NP-SH (SEDLACK & LINDSAY, 1968), TBARS (Agar

et al.,1999) e para análise histológica.

4.8. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os grupos sulfidrilas não protéicos

(NP-SH) hepáticos:

A quantificação dos grupos sulfidrilas não protéicos (NP-SH) foi realizada segundo o

método de SEDLACK & LINDSAY (1968). O fígado foi removido, pesado e homogeneizado

com EDTA 0,02 M gelado, para preparar um homogenato a 10%. Uma alíquota de 1 ml de

cada amostra foi retirada e adicionado 0,8 ml de água destilada e 0,2 ml de ácido

tricloroacético – TCA 50% em solução aquosa. Os tubos de ensaio contendo a mistura foram

centrifugados a 3000 rpm por 15 minutos. Um volume de 1 ml foi retirado do sobrenadante e

adicionado 2 ml de Tris 0,4 M, pH 8,9 e 0,05 ml de DTNB 0,01M.

A absorbância foi medida dentro de 5 minutos a 412 nm. A concentração de NP-SH

foi calculada através de uma curva de calibração de glutationa reduzida (GSH) e os resultados

expressos em µg de NP-SH/g de tecido.

4.9. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis hepáticos de TBARS:

A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias reativas com o

ácido Tiobarbitúrico (TBARS), um indicador de peroxidação lipídica (AGAR et al.,1999).

Nesta reação, duas moléculas de TBA reagem estequiometricamente com uma molécula de

malondialdeído (MDA) para formar uma solução de cor rosa, que tem absorbância máxima

em pH ácido de 532 a 535 nm.

Após os tratamentos e coleta de sangue, os animais foram sacrificados e seus fígados

foram removidos, pesados e homogeneizados em tampão fosfato 50 mM (pH 7.4), para

preparar um homogenato a 10%. 250 µl do homogenato foram introduzidos em tubos de

ensaio e incubados por 1 h no banho de água a temperatura de 37ºC. Após a incubação, 400 µl

de ácido perclórico 35% foi adicionado, a fim de parar a peroxidação, sob agitação e, em

seguida, centrifugados a 14000 rpm por 10 minutos. Em seguida 600 µl do sobrenadante

foram adicionados a 200 µl de ácido tiobarbitúrico 1,2%. A mistura foi levada ao banho de

água por 30 minutos a uma temperatura variável de 95 - 100ºC. A solução foi então retirada e

colocada para esfriar à temperatura ambiente, após isso foi realizada a leitura da absorbância

no comprimento de 532 nm. Os valores de TBARS foram expressos em termos de

absorbância a 532 nm.

4.10. Análise histopatológica:

Para avaliação das alterações teciduais microscópicas dos fígados, foram realizados

cortes histopatológicos de todos os grupos. O fígado foi fixado em formol tamponado 10%,

incluído em parafina, realizadas secções em micrótomo e corado com hematoxilina-eosina. As

alterações histopatológicas foram examinadas e microfotografadas em microscópio óptico

sendo analisada a arquitetura do tecido, a presença de infiltrado inflamatório, áreas necróticas,

hemorragias, entre outras alterações.

4.11. Análise estatística:

A análise estatística foi realizada através do programa GraphPad Prism 4.0 para

Windows (GraphPad Software).

Os valores experimentais obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média

(E.P.M). Para comparação entre as médias foi utilizada a análise de variância (ANOVA), e a

significância entre os grupos estabelecida pelos testes Student Newman Keuls. As diferenças

foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

5. RESULTADOS

5.1. Efeito de uma única administração de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de peso) na

hepatotoxicidade em camundongos:

Uma única administração da t-DCTN nas concentrações de 10, 30, 100 e 300 mg/kg

aumentou os níveis hepático de glutationa (1401±32,73; 1937±116,5; 2286±95,83 e

1603±141,3 µg/g de tecido, respectivamente) quando comparados ao grupo controle normal

(1299±49,88 µg/g de tecido). Este aumento foi significativo com as doses 30 e 100 mg/kg (p<

0,001) (Tabela 1 e Figura 4).

A t-DCTN administrada nas doses de 100 e 300 mg/kg aumentou significativamente

(p< 0,001) os níveis de ALT e AST séricos (189,0±21,86 e 158,6±17,22; 259,1±19,04 e

197,3±16,56 U/mL, respectivamente) quando comparado com o controle normal (42,86±6,49

e 91,57±5,70 U/mL, respectivamente). Entretanto, nenhum aumento das aminotransferases foi

verificado nas doses de 10 e 30 mg/kg (Tabela 2 e Figura 5).

A análise histológica dos fígados dos animais tratados com veículo (3% de Tween 80)

demonstrou tecido com arquitetura preservada. Já o grupo tratado com altas doses de t-DCTN

(100 e 300 mg/kg), apresentou extensas áreas inflamatórias com presença de células

necróticas e de infiltrado inflamatório com predomínio de polimorfonucleares (PMN). Nos

grupos tratados com t-DCTN nas doses de 10 e 30 mg/kg, os fígados tiveram sua estrutura

preservada, não observando áreas inflamatórias e presença de células necróticas (Figura 6).

TABELA 1. Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis hepáticos de Glutationa em camundongos.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). As dosagens foram analisadas

24 horas após a administração de t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs

controle normal; (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

t-DCTN

---

100

300

1299±49,88

1401±32,73

1937±116,5

2286±95,83

1603±141,3

500

1000

1500

2000

2500

Controle

normal

30 100

300

t-DCTN

mg/kg

NP-SH (

g/g tecido)

FIGURA 4. Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina sobre os níveis

hepáticos de Glutationa em camundongos. Cada coluna representa a média ± erro padrão

da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). As

dosagens foram analisadas 24 horas após a administração de t-DCTN (10, 30, 100 ou 300

mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

TABELA 2. Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis séricos de ALT e AST.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis

séricos de ALT e AST (U/ml) de camundongos (n=8). As transaminases foram analisadas 24

horas após a administração de t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle

normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

ALT

(U/ml)

AST

(U/ml)

Controle normal

t-DCTN

---

100

300

42,86±6,49

49,88±1,30

48,66±3,31

189,0±21,86

259,1±19,04

91,57±5,70

83,30±4,53

99,29±6,00

158,6±17,22

197,3±16,56

100

200

300

ALT

AST

Controle

normal

10 30

100 300

t-DCTN

mg/kg

Transaminases (U/mL)

FIGURA 5. Efeito de uma única administração de trans-desidrocrotonina sobre os níveis

séricos de ALT e AST. Cada coluna representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos

níveis séricos de ALT e AST (U/ml) de camundongos (n=8). As transaminases foram

analisadas 24 horas após a administração de t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

Visto que a dose de 100 mg/kg da t-DCTN apresentou toxicidade hepática, ao

aumentar significativamente (4,5 vezes) o nível sérico de ALT, esta dose foi selecionada para

o estudo das estratégias farmacológicas de prevenção desta hepatotoxicidade.

FIGURA 6. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 400x) – dose única de t-

DCTN: (A) animais tratados com veículo (3% de Tween 80 – controle normal); (B) animais

tratados com t-DCTN 10 mg/kg; (C) animais tratados com t-DCTN 30 mg/kg; (D) animais

tratados com t-DCTN 100 mg/kg ; (E) animais tratados com t-DCTN 300 mg/kg (200x).

5.2. Efeito de administrações sucessivas de t-DCTN (10, 30, 100 e 300 mg/kg de peso) na

toxicidade hepática em camundongos:

Administrações repetidas da t-DCTN nas concentrações de 10, 30, 100 e 300 mg/kg

aumentou os níveis hepático de glutationa (1649±57,36; 2263±91,57; 2104±100,5 e

2027±177,1 µg/g tecido, respectivamente) quando comparados ao grupo controle normal

(1408±53,77 µg/g tecido). Este aumento foi significativo com as doses 30, 100 e 300 mg/kg

(p< 0,001) (Tabela 3 e Figura 7).

A t-DCTN administrada nas doses de 100 e 300 mg/kg aumentou significativamente

(p< 0,001) os níveis de ALT e AST séricos (219,7±10,22 e 225,3±9,847; 230,2±3,272 e

212,0±7,658 U/mL, respectivamente) quando comparado com o controle normal

(49,96±2,483 e 90,24±6,739 U/mL, respectivamente). Entretanto, nenhum aumento das

aminotransferases foi verificado nas doses de 10 e 30 mg/kg (Tabela 4 e Figura 8).

A análise histológica dos fígados dos animais tratados com veículo (3% de Tween 80)

demonstrou tecido com arquitetura preservada. Já o grupo tratado com altas doses de t-DCTN

(100 e 300 mg/kg) por 5 dias consecutivos, apresentou extensas áreas inflamatórias com

presença de células necróticas, hemorragia e infiltrado inflamatório com predomínio de

polimorfonucleares (PMN). Nos grupos tratados com t-DCTN nas doses de 10 e 30 mg/kg, os

fígados tiveram sua estrutura preservada, não observando áreas inflamatórias e presença de

células necróticas (Figura 9).

TABELA 3. Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis hepáticos de Glutationa em camundongos.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas

antes das dosagens das amostras.

p<0,001 vs controle normal; (ANOVA e Teste de Student

Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

t-DCTN

---

100

300

1408± 53,77

1649± 57,36

2263± 91,57

2104± 100,5

2027± 177,1

500

1000

1500

2000

2500

Controle

normal

10 30

100 300

t-DCTN

a a

mg/kg

NP-SH (

g/g tecido)

FIGURA 7. Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis hepáticos de Glutationa em camundongos. Cada coluna representa a média ± erro

padrão da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos

(n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.) foram

administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens das amostras.

p<0,001 vs

controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

TABELA 4. Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis séricos de ALT e AST.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis

séricos de ALT e AST (U/ml) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das

dosagens das transaminases.

p<0,001 vs controle normal (ALT);

p<0,001 vs controle

normal(AST) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

ALT

(U/ml)

AST

(U/ml)

Controle normal

t-DCTN

---

100

300

49,96 ± 2,483

56,76 ± 3,600

57,62 ± 2,968

219,7 ± 10,22

230,2 ± 3,272

90,24 ± 6,739

96,91 ± 3,668

93,34 ± 2,294

225,3 ± 9,847

212,0 ± 7,658

100

150

200

250

ALT

AST

Controle

normal

30 100 300

t-DCTN

Transaminases (U/mL)

mg/kg

FIGURA 8. Efeito de administrações sucessivas de trans-desidrocrotonina sobre os

níveis séricos de ALT e AST. Cada coluna representa a média ± erro padrão da média

(E.P.M.) dos níveis séricos de ALT e AST (U/ml) de camundongos (n=8). O veículo (controle

normal) e t-DCTN (10, 30, 100 ou 300 mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24

horas antes das dosagens das transaminases.

p<0,001 vs controle normal (ALT);

p<0,001 vs

controle normal(AST) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

FIGURA 9. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 200x) – doses repetidas

de t-DCTN: (A) animais tratados com veículo (3% de Tween 80 – controle normal); (B)

animais tratados com t-DCTN 10 mg/kg; (C) animais tratados com t-DCTN 30 mg/kg; (D)

animais tratados com t-DCTN 100 mg/kg; (E) animais tratados com t-DCTN 300 mg/kg.

5.3. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN:

A tabela 5 mostra que o tratamento com t-DCTN (100 mg/kg, v.o.) promoveu um

aumento significativo (p<0,001) dos níveis de glutationa hepática (1675±120,5 µg/g de

tecido) quando comparado ao grupo controle normal (Figura 10). Este efeito também foi

observado no grupo que recebeu pré-tratamento com t-DCTN 10 mg/kg por 5 dias

consecutivos, seguida de uma administração de t-DCTN na dose de 100 mg/kg (2144±62,14

µg/g de tecido).

Os níveis séricos das aminotransferases ALT e AST, aumentaram de forma

significativa (p<0,001) no grupo tratado com t-DCTN na dose de 100 mg/kg ( 179,8±8,766 e

206,9±2,336 U/ml, respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal

(42,66±5,701 e 109,6±3,609 U/ml, respectivamente) (Tabela 6 e Figura 11).

O pré-tratamento com baixa dose de t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) por 5 dias consecutivos,

antes da administração da t-DCTN (100 mg/kg), foi capaz de reduzir significativamente

(p<0,001) os níveis de ALT e AST ( 64,96±16,04 e 128,9±14,81 U/ml, respectivamente)

quando comparado com o grupo que recebeu somente t-DCTN em alta dose (100 mg/ kg)

(179,8±8,766 e 206,9±2,336 U/ml, respectivamente).

A análise histológica dos fígados do grupo controle normal mostrou um tecido

hepático preservado, apresentando hepatócitos com a citoarquitetura íntegra. Já o grupo

tratado com t-DCTN, mostrou extensas áreas inflamatórias com presença de células

necróticas. No grupo que recebeu pré-tratamento com t-DCTN (10 mg/kg) por 5 dias

consecutivos, antes da administração de t-DCTN em dose alta (100 mg/kg), observou-se

pequenos pontos de infiltrado inflamatório, no entanto, não foram observadas áreas

hemorrágicas e necróticas (Figura 12).

TABELA 5. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN sobre os níveis

hepáticos de glutationa na toxicidade aguda induzida por t-DCTN em camundongos.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens.

Outro grupo recebeu pré-tratamento por cinco dias consecutivos com 10 mg/kg (v.o.) de t-

DCTN e 24 h após o último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg,

v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vc t-DCTN (100 mg/kg)(ANOVA e Teste de

Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

t-DCTN

---

100

10 + 100

1148 ± 82,69

1382 ± 37,93

1675 ± 120,5

2144 ± 62,14

a,b

500

1000

1500

2000

2500

Controle

normal

100 10 + 100

t-DCTN

mg/kg

a,b

NP-SH (

g/tecido)

FIGURA 10. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN sobre os níveis

hepáticos de glutationa na toxicidade aguda induzida por t-DCTN em camundongos.

Cada coluna representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de

glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10

mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens. Outro grupo

foi pré-tratado por cinco dias consecutivos com 10 mg/kg (v.o.) de t-DCTN e 24 h após o

último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs

controle normal;

p<0,001 vc t-DCTN (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

TABELA 6. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN sobre os níveis

séricos de ALT e AST na toxicidade aguda induzida por t-DCTN em camundongos.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis séricos de ALT e AST de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(10 mg/kg, v.o.) foram administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens das

transaminases. Outro grupo foi pré-tratado por cinco dias consecutivos com 10 mg/kg (v.o.)

de t-DCTN e 24 h após o último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg,

v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN (100 mg/kg)(ANOVA e Teste de

Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

ALT

(U/ml)

AST

(U/ml)

Controle normal

t-DCTN

---

100

10 + 100

42,66 ± 5,701

40,08 ± 2,252

179,8 ± 8,766

64,96 ± 16,04

109,6 ± 3,609

112,6 ± 7,665

206,9 ± 2,336

128,9 ± 14,81

100

150

200

250

ALT

AST

Controle

normal

100 10 + 100

t-DCTN

mg/kg

Transaminases (U/mL)

FIGURA 11. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN sobre os níveis

séricos de ALT e AST na toxicidade aguda induzida por t-DCTN em camundongos. Cada

coluna representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis séricos de ALT e AST

(U/ml) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10mg/kg, v.o.) foram

administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens das aminotransferases.

Outro

grupo recebeu pré-tratamento por cinco dias consecutivos com 10 mg/kg (v.o.) de t-DCTN e

24 h após o último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN (100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student

Newman Keul).

FIGURA 12. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 200x) – Efeito do pré-

condicionamento com baixas doses de t-DCTN: (A) animais tratados com veículo (3% de

Tween 80 – controle normal); (B) animais tratados com t-DCTN 100 mg/kg (único

tratamento); (C) animais tratados com t-DCTN 10 mg/kg ( 5 dias de tratamento); (D) animais

pré-tratados com t-DCTN 10 mg/kg ( 5 dias de tratamento) + t-DCTN 100 mg/kg ( único

tratamento).

5.4. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol na toxicidade aguda

induzida por t-DCTN:

O tratamento com t-DCTN (100 mg/kg, v.o.) promoveu um aumento significativo

(p<0,001) dos níveis de glutationa hepática (1675±120,5 µg/g de tecido) quando comparado

ao grupo controle normal (Tabela 7 e Figura 13). Este efeito também foi observado no grupo

que recebeu pré-tratamento com Etanol 1 g/kg por 5 dias consecutivos, seguida de uma

administração de t-DCTN na dose de 100 mg/kg (1893±110,4 µg/g de tecido).

Os níveis séricos das aminotransferases ALT e AST, aumentaram de forma

significativa (p<0,001) no grupo tratado com t-DCTN na dose de 100 mg/kg ( 167,5±14,39 e

196,8±10,28 U/ml, respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal

(42,66±5,701 e 109,6±3,609 U/ml, respectivamente) (Tabela 8 e Figura 14).

O pré-tratamento com baixa dose de Etanol (1 g/kg, v.o.) por 5 dias consecutivos,

antes da administração da t-DCTN (100 mg/kg), foi capaz de reduzir significativamente

(p<0,001) os níveis de ALT e AST ( 102,4±22,15 e 116±15,73 U/ml, respectivamente)

quando comparado com o grupo que recebeu somente t-DCTN em alta dose (100 mg/ kg)

(167,5±14,39 e 196,8±10,28 U/ml, respectivamente).

A análise histológica dos fígados do grupo controle normal mostrou um tecido

hepático preservado, apresentando hepatócitos com a citoarquitetura íntegra. Já o grupo

tratado com t-DCTN, mostrou extensas áreas inflamatórias com presença de células

necróticas. No grupo que recebeu pré-tratamento com Etanol (1 g/kg) por 5 dias consecutivos,

antes da administração de t-DCTN em dose alta (100 mg/kg), observou-se pequenos pontos

de infiltrado inflamatório, no entanto, não foram observadas áreas hemorrágicas e necróticas

(Figura 15).

TABELA 7. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol sobre os níveis

de glutationa hepática na toxicidade aguda induzida por t-DCTN.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. Outro grupo foi

pré-tratado por cinco dias consecutivos com Etanol (10 g/kg, v.o.) e 24 h após o último

tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle

normal (100 mg/kg)(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

Etanol (g/kg)

t-DCTN (mg/kg)

Etanol + t-DCTN

---

100

1 + 100

1148 ± 82,69

821,6 ± 70,93

1675 ± 120,5

1893 ± 110,4

500

1000

1500

2000

2500

Controle

Normal

100

1g/kg1g/kg

Etanol

t-DCTN (mg/kg)

Etanol

NP-SH (

g/kg tecido)

FIGURA 13. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol sobre os níveis

de glutationa hepática na toxicidade aguda induzida por t-DCTN. Cada coluna representa

a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de

camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram

administrados 24 horas antes das dosagens. Outro grupo foi pré-tratado por cinco dias

consecutivos com Etanol (10 g/kg, v.o.) e 24 h após o último tratamento recebeu uma dose

aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de

Student Newman Keul).

TABELA 8. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol sobre os níveis

séricos de ATL e AST na toxicidade aguda induzida por t-DCTN.

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis séricos de ALT e AST de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. Outro grupo foi pré-

tratado por cinco dias consecutivos com Etanol (10 g/kg, v.o.) e 24 h após o último tratamento

recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,01

vc controle normal;

p<0,001 vc t-DCTN (100 mg/kg); (ANOVA e Teste de Student Newman

Keul).

GRUPOS

DOSE

ALT

(U/ml)

AST

(U/ml)

Controle normal

Etanol (g/kg)

t-DCTN (mg/kg)

Etanol + t-DCTN

---

100

1 + 100

42,66 ± 5,701

60,92 ± 8,609

167,5 ± 14,39

102,4 ± 22,15

b,c

109,6 ± 3,609

109,3 ± 4,795

196,8 ± 10,28

116,0 ± 15,73

100

150

200

250

ALT

AST

Controle

Normal

1g/kg

Etanol

1g/kg

Etanol

100

t-DCTN (mg/kg)

b,c

Transaminases (U/mL)

FIGURA 14. Efeito do pré-condicionamento com baixas doses de Etanol sobre os níveis

séricos de ATL e AST na toxicidade aguda induzida por t-DCTN. Cada coluna representa

a média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis séricos de ALT e AST (U/ml) de

camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10mg/kg, v.o.) foram

administrados 120, 96, 72, 48 e 24 horas antes das dosagens das transaminases.

Outro grupo

recebeu pré-tratamento por cinco dias consecutivos com 10 mg/kg (v.o.) de t-DCTN e 24 h

após o último tratamento recebeu uma dose aguda de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs

controle normal;

p<0,01 vc controle normal;

p<0,001 vc t-DCTN (100 mg/kg); (ANOVA e

Teste de Student Newman Keul).

FIGURA 15. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 200x) – Efeito do pré-

condicionamento com baixas doses de Etanol: (A) animais tratados com veículo (3% de

Tween 80 – controle normal); (B) animais tratados com t-DCTN 100 mg/kg (único

tratamento); (C) animais tratados com Etanol 1 g/kg ( 5 dias de tratamento); (D) animais pré-

tratados com Etanol 1 g/kg ( 5 dias de tratamento) + t-DCTN 100 mg/kg ( único tratamento).

5.5. Envolvimento do óxido nítrico (NO) no pré-condicionamento hepático da t-DCTN e

do etanol:

A tabela 9 mostra que os grupos tratados (t-DCTN; L-arginina + t-DCTN e D-arginina

+ t-DCTN) aumentaram significativamente (p<0,001) os níveis hepáticos de glutationa

(2402±91,15; 2085±103,8 e 2287±84,68 µg/g de tecido, respectivamente) quando comparados

com o grupo controle normal (1313±64,61 µg/g de tecido) (Figura 16).

Os níveis das aminotransferases séricas ALT e AST aumentaram significativamente

(p<0,001) no grupo tratado com t-DCTN 100 mg/kg (241,4±7,638 e 108,7±5,218 U/ml,

respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal (75,16±7,638 e 108,7±5,218

U/ml, respectivamente). Este efeito também pode ser observado no grupo tratado com D-

arginina + t-DCTN (183,8±25,56 e 172,8±14,21 U/ml, respectivamente) (Tabela 10 e Figura

17).

O pré-tratamento com L-arginina (600 mg/kg, i.p.) antes da administração de t-DCTN

(100 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir significativamente (p<0,001) os níveis de ALT e AST

(74,81±10,70 e 111,9±7,350 U/ml, respectivamente) quando comparado com o grupo que

recebeu somente t-DCTN (241,4±7,638 e 108,7±5,218 U/ml, respectivamente).

A análise dos cortes histológicos dos fígados do grupo tratado com t-DCTN (100

mg/kg) demonstrou extensas áreas de infiltrado inflamatório e células necróticas. O grupo que

recebeu pré-tratamento com D-arginina seguida da administração da t-DCTN apresentou

perda da arquitetura do tecido hepático com presença de infiltrado de polimorfonucleares

(PMN) e necrose. Já os grupos controle normal e L-arginina + t-DCTN demonstraram tecido

com arquitetura preservada e ausência de foco inflamatório (Figura 18).

TABELA 9. Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis hepáticos de Glutationa na

hepatotoxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos:

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A L-arginina (600

mg/kg, i.p.) ou D-arginina (400 mg/kg, i.p.) foram administradas 30 min antes da

administração da t-DCTN.

p<0,001 vs controle normal;

p<0,05 vc t-DCTN (100 mg/kg)

(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

t-DCTN

L-Arginina + t-DCTN

D-Arginina + t-DCTN

---

100

600 + 100

400 + 100

1313 ± 64,61

2402 ± 91,15

2085 ± 103,8

a,b

2287 ± 84,68

500

1000

1500

2000

2500

Controle

Normal D-Arg

400 600

L-Arg

100

t-DCTN

mg/kg

NP-SH (

g/g tecido)

a,b

FIGURA 16. Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis hepáticos de Glutationa na

hepatotoxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos. Cada coluna representa a

média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de

camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram

administrados 24 horas antes das dosagens. A L-arginina (600 mg/kg, i.p.) ou D-arginina (400

mg/kg, i.p.) foram administradas 30 min antes da administração da t-DCTN.

p<0,001 vs

controle normal;

p<0,05 vc t-DCTN (100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student Newman

Keul).

TABELA 10. Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis séricos de ALT e AST na

toxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos:

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis séricos de ALT e AST de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A L-arginina (600 mg/kg,

i.p.) ou D-arginina (400 mg/kg, i.p.) foram administradas 30 min antes da administração da t-

DCTN.

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN (100 mg/kg) (ANOVA e Teste de

Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

ALT

(U/ml)

AST

(U/ml)

Controle normal

t-DCTN

L-Arginina + t-DCTN

D-Arginina + t-DCTN

---

100

600 + 100

400 + 100

75,16 ± 7,638

241,4 ± 12,59

74,81 ± 10,70

183,8 ± 25,56

108,7 ± 5,218

201,9 ± 7,916

111,9 ± 7,350

172,8 ± 14,21

100

150

200

250

300

ALT

AST

Controle

Normal

D-Arg

400

600

L-Arg

100

t-DCTN

a a

Transaminases (U/ml)

mg/kg

FIGURA 17. Efeito do Óxido Nítrico (NO) sobre os níveis séricos de ALT e AST na

toxicidade induzida pela t-DCTN em camundongos. Cada coluna representa a média ± erro

padrão da média (E.P.M.) dos níveis séricos de ALT e AST (U/ml) de camundongos (n=8). O

veículo (controle normal) e t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das

dosagens. A L-arginina (600 mg/kg, i.p.) ou D-arginina (400 mg/kg, i.p.) foram administradas

30 min antes da administração da t-DCTN.

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN

(100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

FIGURA 18. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 200x) – Envolvimento

do Óxido Nítrico no pré-condicionamento com t-DCTN e etanol: (A) animais tratados com

veículo (3% de Tween 80 – controle normal); (B) animais tratados com t-DCTN 100 mg/kg;

com L-Arginina 600 mg/kg + t-DCTN 100 mg/kg.

5.6. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) na hepatite tóxica induzida por t-

DCTN:

A tabela 11 mostra que os grupos tratados (t-DCTN; Vitamina E + t-DCTN; NAC + t-

DCTN e NAC + Vitamina E +t-DCTN) aumentaram significativamente (p<0,001) os níveis

hepáticos de glutationa (2473±94,05; 2644±91,88; 2298±84,80 e 2099±126,0 µg/g de tecido,

respectivamente) quando comparados com o grupo controle normal (1409±82,92 µg/g de

tecido) (Figura 19).

Os níveis das aminotransferases séricas ALT e AST aumentaram significativamente

(p<0,001) no grupo tratado com t-DCTN 100 mg/kg (238,2±12,46 e 225,5±22,85 U/ml,

respectivamente) quando comparado ao grupo controle normal (67,07±4,295 e 122,9±10,55

U/ml, respectivamente). Este efeito também pode ser observado no grupo tratado com NAC +

t-DCTN (189,5±19,27 e 194,7±17,09 U/ml, respectivamente) (Tabela 12 e Figura 20).

O pré-tratamento com Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) antes da administração de t-

DCTN (100 mg/kg, v.o.) foi capaz de reduzir significativamente (p<0,001) os níveis de ALT

e AST (83,20±10,59 e 124,9±7,210 U/ml, respectivamente) quando comparado com o grupo

que recebeu somente t-DCTN (238,2±12,46 e 225,5±22,85 U/ml, respectivamente).

Consistente com o níveis séricos de ALT e AST, o pré-tratamento com vitamina E (0,063±

0,006 Abs- 532 nm), mas não com NAC (0,157± 0,010 Abs- 532 nm), causou diminuição

significativa (p<0,001) na formação hepática de TBARS induzida por t-DCTN quando

comparado com o grupo que recebeu somente t-DCTN (0,179± 0,015 Abs- 532 nm) (Tabela

13 e Figura 21). O tratamento combinado de vitamina E + NAC embora tenha mostrado ser

efetivo, não é aditivo em combater as alterações nos parâmetros bioquímicos induzidos por t-

DCTN.

A análise dos cortes histológicos dos fígados do grupo tratado com t-DCTN (100

mg/kg) demonstrou extensas áreas de infiltrado inflamatório e células necróticas. O grupo que

recebeu pré-tratamento somente com N-acetilcisteína seguida da administração da t-DCTN

apresentou perda da arquitetura do tecido hepático com presença de infiltrado de

polimorfonucleares (PMN) e necrose. Já os grupos controle normal, vitamina E + t-DCTN e

NAC + vitamina E + t-DCTN demonstraram tecido com arquitetura preservada e ausência de

foco inflamatório (Figura 22).

TABELA 11. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de

Glutationa hepática na toxicidade induzida por t-DCTN em camundongos:

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de glutationa (NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E

(300 mg/kg, v.o.), NAC (150 mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e

NAC (150 mg/kg, i.p.) foram administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100

mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

NP-SH

(µg/g tecido)

Controle normal

t-DCTN

NAC + t-DCTN

Vitamina E + t-DCTN

NAC + Vitamina E + t-DCTN

---

100

150 + 100

300 + 100

150 + 300 + 100

1409 ± 82,92

2473 ± 94,05

2298 ± 84,80

2644 ± 91,88

2099 ± 126,0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Controle

Normal

NAC

150

NAC

300

Vit-E

100

t-DCTN

mg/kg

NP-SH (

g/kg tecido)

FIGURA 19. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis de

Glutationa hepática na toxicidade induzida por t-DCTN em camundongos. Cada coluna

representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os níveis hepáticos de glutationa

(NP-SH) de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (100 mg/kg, v.o.)

foram administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E (300 mg/kg, v.o.), NAC (150

mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e NAC (150 mg/kg, i.p.) foram

administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle

normal (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

TABELA 12. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis séricos de

ALT e AST na hepatite tóxica induzida por t-DCTN em camundongos:

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis séricos de ALT e AST de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(100 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E (300

mg/kg, v.o.), NAC (150 mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e

NAC (150 mg/kg, i.p.) foram administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100

mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN (100 mg/kg) (ANOVA e

Teste de Student Newman Keul).

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

ALT

(U/mL)

AST

(U/mL)

Controle normal

t-DCTN

NAC + t-DCTN

Vitamina E + t-DCTN

NAC + Vitamina E + t-

DCTN

---

100

150 + 100

300 + 100

150 + 300 +100

67,07 ± 4,295

238,2 ± 12,46

189,5 ± 19,27

83,20 ± 10,59

64,30 ± 2,177

122,9 ± 10,55

225,5 ± 22,85

194,7 ± 17,09

124,9 ± 7,210

122,1 ± 8,132

100

150

200

250

300

ALT

AST

Controle

Normal

150

NAC

150

NAC

Vit-E

100

t-DCTN

300

Transaminases (U/mL)

FIGURA 20. Efeito da Vitamina E e N-Acetilcisteína (NAC) sobre os níveis séricos de

ALT e AST na hepatite tóxica induzida por t-DCTN em camundongos: Cada coluna

representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis séricos de ALT e AST (U/mL)

de camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN (100 mg/kg, v.o.) foram

administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E (300 mg/kg, v.o.), NAC (150

mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e NAC (150 mg/kg, i.p.) foram

administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100 mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle

normal;

p<0,05 vs t-DCTN (100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

TABELA 13. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis hepáticos de

TBARS.

GRUPOS

DOSE

(mg/kg)

TBARS

(Abs – 532 nm)

Controle normal

t-DCTN

NAC + t-DCTN

Vitamina E + t-DCTN

NAC + Vitamina E + t-DCTN

---

100

150 + 100

300 + 100

150 + 300 + 100

0,035± 0,003

0,179± 0,015

0,157± 0,010

0,063± 0,006

0,082 ± 0,004

b,c

Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.) para os

níveis hepáticos de TBARS em camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e t-DCTN

(100 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E (300

mg/kg, v.o.), NAC (150 mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e

NAC (150 mg/kg, i.p.) foram administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100

mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,01 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN

(100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Controle

Normal

NAC

t-DCTN

Vit-E

NAC

b,c

150

300

100

mg/kg

TBARS (Abs - 532 nm)

FIGURA 21. Efeito da trans-desidrocrotonina (t-DCTN) sobre os níveis hepáticos de

TBARS. Cada coluna representa a média ± erro padrão da média (E.P.M.) dos níveis

hepáticos de TBARS (Abs – 532 nm) em camundongos (n=8). O veículo (controle normal) e

t-DCTN (100 mg/kg, v.o.) foram administrados 24 horas antes das dosagens. A Vitamina E

(300 mg/kg, v.o.), NAC (150 mg/kg, i.p.) ou a combinação de Vitamina E (300 mg/kg, v.o.) e

NAC (150 mg/kg, i.p.) foram administrados 1h antes da administração da t-DCTN (100

mg/kg, v.o.).

p<0,001 vs controle normal;

p<0,01 vs controle normal;

p<0,001 vs t-DCTN

(100 mg/kg) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).

FIGURA 22. Microfotografias de fígados de camundongos (H&E 200x) – Efeito da

Vitamina E e NAC na hepatite tóxica induzida por t-DCTN: (A) animais tratados com

veículo (3% de Tween 80 – controle normal); (B) animais tratados com t-DCTN 100 mg/kg;

Vitamina E 300 mg/kg + t-DCTN 100 mg/kg; (E) animais pré-tratados com NAC (150

mg/kg) + Vitamina E 300 mg/kg + t-DCTN 100 mg/kg.

6. DISCUSSÃO

A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico alternativo de

grande aceitação pela população e vem crescendo junto à comunidade médica, desde que

sejam utilizadas plantas cujas atividades biológicas tenham sido investigadas cientificamente,

comprovando sua eficácia e segurança (YUNES; CHECHINEL, 2001).

A área da pesquisa farmacêutica e desenvolvimento de novos fármacos demandam

custos elevados para a produção de novos medicamentos, em contraste, um número

substancial de drogas que alcançam as fases II e III não são utilizados na clínica (DIX, 2004).

A avaliação da segurança destes novos fármacos é um ponto de fundamental importância e se

realizada satisfatoriamente nos ensaios pré-clínicos, pode melhorar a eficiência e diminuir os

custos destas pesquisas (LAPA et al., 2003).

Recentemente, muitas drogas foram retiradas do mercado devido aos ensaios

insuficientes de segurança nos estudos pré-clínicos. Podemos citar como exemplos o

astigmazol, uma droga antialérgica, associada com aumento da mortalidade em homens e

mulheres devido à prolongação do intervalo QT (SCHOUTEN, 1991), a triglitazona

pertencente à classe denominada tiazolidinas, efetivo em controlar a glicemia, mas com sérios

efeitos hepatotóxicos (ISLEY, 2003), além de provocar edema e insuficiência cardíaca

congestiva, particularmente quando combinado com insulina em pacientes portadores de

diabetes tipo 2 (DELEA, 2003) e risco de ataque cardíaco, choque e morte em pacientes que

fazem uso de agentes antiinflamatórios pertencente a classe de drogas inibidoras de COX-2,

como rofecoxib e lumiracoxib (DAVIES & JAMALI, 2004; GOTTLIEB, 2005).

As plantas medicinais são fontes de inúmeras moléculas com potencial terapêutico e

por isso merecem destaque neste contexto da segurança, é comum a crença de que por tratar-

se de uma substância natural seja desprovida de efeitos colaterais, entretanto há vários relatos

na literatura que demonstram o contrário, ou seja, várias espécies podem apresentar efeitos

tóxicos dependo do tempo e da via de utilização (RODRIGUES, 2007). Dentre os inúmeros

efeitos deletérios a saúde, podemos citar a hepatotoxicidade.

Várias espécies podem produzir danos hepáticos, segundo STARASKI et al.(2006) as

drogas e outros agentes químicos contribuem com pelo menos 5% dos casos de icterícia ou

hepatite aguda, além de um pequeno número de casos de doenças crônicas do fígado.

Dentre as espécies vegetais que produzem efeitos hepatotóxicos, podemos citar a

Rhamnus purshiana DC (Cascara sagrada), Chelidoniu majus, espécies do gênero Teucrium,

como o Teucrium polium (golden germander), o Teucrium chamaedrys L (germander) e seu

principal constituinte, teucrin, um diterpeno furanoclerodano e o extrato de Croton cajucara

(sacaca) e seu constituinte bioativo, t-DCTN. Estudos mostram que pessoas que fazem uso

prolongado dos extratos dessas plantas, no tratamento do diabetes mellitus e em dietas de

emagrecimento, sofrem de hepatotoxicidade (STARASKI et al.2006; SOARES, 2004;

PITTLER & ERNST, 2003; KOUZI et al., 1994; LEKEHAL et al., 1996).

Existe um grande interesse sobre os prováveis efeitos hepatotóxicos dos extratos de

Croton cajucara e seu constituinte bioativo, t-DCTN. Estudos com pessoas obesas que fazem

uso desta planta por longos períodos têm demonstrado que estas pessoas sofrem com hepatite

tóxica. Os estudos mostram ainda que a t-DCTN é citotóxica para fibroblastos V79 e tóxica

para hepatócitos de ratos in vitro e que a hepatotoxicidade parece ser uma possível limitação

para seu uso clínico (RODRIGUEZ & HAUN, 1999; MELO et al., 2002). Afora estes dados,

uma atividade antitumoral de t-DCTN também é encontrada na literatura (GRYNBERG et

al.,1999; MELO et al., 2004) e GRAIM et al (2008) demonstrou que o infuso de Croton

cajucara Benth (sacaca) foi capaz de determinar degeneração e necrose hepatocitária,

sugerindo que a hepatotoxicidade à sacaca é dose dependente.

O dano hepático induzido por fármacos pode ser hepatocelular, o que se traduzirá por

aumento das aminotransaminases (ALT e AST), ou colestático, o que levará ao aumento de

bilirrubinas (particularmente da direta), da fosfatase alcalina e da gama-glutaril transferase

(G-GT). Observa-se que a agressão hepática causada pelos hipolipemiantes é principalmente

do tipo hepatocelular, levando, portanto, ao aumento de ALT e/ou AST. Geralmente esse

aumento é assintomático, transitório e cessa após a descontinuação do medicamento (RUSSO

& JACOBSON, 2002).

No presente estudo, a administração de doses mais elevadas de t-DCTN (100 e 300

mg/kg) aumentou significativamente os níveis séricos das aminotransferases (ALT e AST)

demonstrando um efeito hepatotóxico da t-DCTN. Em contraste, a administração em doses

menores (10 e 30 mg/kg) não causou nenhum aumento nestas enzimas, mesmo quando

administradas repetidamente por 5 dias consecutivos, sugerindo que a hepatotoxicidade da t-

DCTN é dose-dependente.

Este efeito tóxico da t-DCTN sobre os hepatócitos foi confirmado com a análise

histológica dos fígados dos camundongos tratados, onde foi verificada necrose multifocal com

infiltrações de células inflamatórias tanto mononucleares como polimorfonucleares.

Muitos dos hipolipemiantes empregados no dia a dia têm potencial hepatotóxico.

Assim, as estatinas, os fibratos, a niacina e as resinas podem produzir alterações hepáticas

(BERTOLAMI, 2005).

No caso das substãncias hipolipemiantes, pouco ainda é conhecido sobre quais os

mecanismos que podem estar envolvidos quando eles determinam hepatotoxicidade. Acredita-

se que, na maioria das vezes em que a agressão hepática ocorre, existe a participação de mais

de um mecanismo. Entre eles o mais importante é o estresse oxidativo ocasionado pela

agressão dos fármacos às mitocôndrias, seja por inativação ou ligação a enzimas respiratórias

ou ao DNA mitocondrial, desregulando a oxidação dos ácidos graxos e a produção de energia

celular. Isto resulta no aparecimento de metabolismo anaeróbico, acidose lática e acúmulo de

triglicérides nas células (esteatohepatite) (LEE, 2002; JAESCHKE et al., 2002).

Qualquer tipo de lesão hepática pode causar elevações significativas nas

concentrações de aminotransferases AST e ALT (PRATT, 2002). A lesão hepática aguda

pode ser de origem citotóxica ou colestática. A lesão citotóxica assemelha-se à hepatite aguda

e é caracterizada por lesão dos hepatócitos com proeminentes elevações das aminotransferases

(PIÑEIRO-CARRERO; PIÑEIRO, 2004).

Logo, as aminotransferases (AST e ALT) são indicadores sensíveis de lesão hepática e

constituem ferramentas úteis no reconhecimento de doenças hepatocelulares agudas, como é o

caso da hepatite tóxica. A AST é encontrada no fígado, miocárdio, músculo esquelético, rins,

cérebro, pâncreas, pulmões, leucócitos e eritrócitos, em ordem decrescente de concentração.

A ALT é encontrada principalmente no fígado. As aminotransferases estão normalmente

presentes no soro em baixas concentrações e são liberadas do fígado em maiores quantidades

quando há lesão da membrana celular do hepatócito, resultando em permeabilidade

aumentada (PIÑEIRO-CARRERO; PIÑEIRO, 2004; PROVAN; KRENTZ, 2002).

Tendo em vista que a utilização da t-DCTN é bastante difundida devido os seus efeitos

benéficos como antiinflamatório, gastroprotetor, hipoglicêmico e hipolipidêmico, buscamos

estabelecer estratégias farmacológicas com o intuito de amenizar os efeitos hepatotóxicos da

exposição prolongada a altas doses da t-DCTN. Desta forma, neste estudo investigamos os

efeitos do pré-condicionamento com baixas doses da t-DCTN (10 mg/kg, v.o., por 5 dias

consecutivos) ou etanol (1 g/kg, v.o., por 5 dias consecutivos) na prevenção da

hepatotoxicidade induzida por alta dose de t-DCTN (100 mg/kg, v.o.) em camundongos.

Comumente, em toxicologia, quando se compara os efeitos tóxicos e benéficos de

substâncias utilizando-se baixas doses, entra em pauta o conceito de “hormesis”. Hormesis

tem sido definida como um fenômeno de dose-resposta caracterizado por respostas

estimulatórias quando se utiliza baixas doses e uma resposta inibitória com o uso de altas

doses. Este fenômeno parece ser uma resposta primária adaptativa ao estresse, que

desencadeia reparo celular e sistemas de manutenção (CALABRESE & BALDWIN, 2003;

CALABRESI, 2004).

Um exemplo de um efeito adverso que é necessário para a indução de um efeito

benéfico é consumo de ácidos graxos poliinsaturados. Dietas com altos níveis desses ácidos

conhecidamente protegem contra lesões neoplásicas nos estágios iniciais da carcinogênese de

cólon induzida quimicamente (DOMMELS et al., 2003).

O precondicionamento isquêmico ou farmacológico é uma ferramenta que pode ser

utilizada em toxicologia clínica e experimental para avaliar o potencial terapêutico e tóxico de

substâncias em estudo. A utilização prévia de drogas com o intuito de gerar possíveis efeitos

protetores é relativamente recente em farmacologia, porém de valor significativo em ambiente

pré-clínico.

Um exemplo de precondicionamento farmacológico foi demonstrado por Xu et al

(2006) que comprovaram o efeito protetor da concanavalina A quando utilizada em baixas

doses em modelo de precondicionamento em camundongos. É sabido que a dose de 3 μg/g de

concanavalina A não causa efeitos tóxicos. Por outro lado, a dose de 15 μg/g demonstra

severa infiltração de células inflamatórias, macrófagos, células T, aumento das transaminases

e citocinas pró-inflamatórias (IL-4, IL-12 e TNF-α). O pré-tratamento dos camundongos com

a dose de 3 μg/g 12 horas antes da dose de 15 μg/g provocou diminuição sérica de citocinas e

transaminases e redução da necrose hepática induzida por concanavalina A.

Alguns trabalhos demonstram um efeito protetor do precondicionamento isquêmico

(PI) em modelo de isquemia e reperfusão (I/R) em fígado de suínos. Shimoda et al (2007)

mostraram que animais que passavam por episódios de 10 min de isquemia e 10 min de

reperfusão seguidos por um período maior de I/R (15 min/5min, respectivamente)

apresentaram prevenção dos danos hepáticos (diminuição de necrose, diminuição dos níveis

de AST, TNF-α e NO

/NO

). Tais resultados sugerem que o PI tem um potencial clínico no

curso pós-operatório de paciente que passam por hepatectomia (SHIMODA, et al. 2007).

Os resultados do presente estudo mostraram que o pré-tratamento por cinco dias com

pequenas doses de t-DCTN (10 mg/kg) ou Etanol (1 g/kg) foi capaz de promover um pré-

condicionamento nos animais expostos a altas doses da t-DCTN. Isto foi verificado pela

diminuição significativa dos níveis séricos de ALT e AST, quando comparado com o grupo

tratado somente com t-DCTN (100 mg/kg). Corroborando com estes resultados, a análise

histológica do tecido hepático mostrou uma diminuição significativa no infiltrado

inflamatório e na área necrosada, indicando que o pré-condicionamento farmacológico com

pequenas doses de t-DCTN ou Etanol é uma estratégia útil na prevenção da hepatotoxicidade

associada a altas doses de t-DCTN.

Porém, os mecanismos por trás desta proteção não foram esclarecidos. Estudos

anteriores indicaram que a indução da heme oxigenase-1 (HO-1) tem um papel protetor contra

o dano hepático por isquemia-reperfusão e sugerem que o precondicionamento com

doxorubicina ou sinvastatina pode ser clinicamente útil (ITO et al., 2000; LAI et al., 2008).

HO-1 é a enzima que controla a taxa de biossíntese e degradação da heme e, em um estudo

bastante recente, não foi observada mudança alguma no nível da HO-1 no tecido hepático de

ratos alimentados com etanol (ZHENG et al., 2008). Por esta razão, não fizemos nenhuma

tentativa para analisar o papel da HO-1 no hepatoproteção oferecida pelo precondicionamento

com etanol.

A administração de etanol em baixa concentração (200 mL/L) foi demonstrada por

oferecer gastroproteção adaptável em ratos contra o dano gástrico induzido por uma

concentração mais alta (800 mL/L), que poderia ser atenuado através da administração de

NG-nitro-L-arginine metil ester (L-NAME), um inibidor da NO sintase (NOS) (KO et al.,

2004). Por analogia, nós verificamos no presente estudo se uma baixa dose de etanol (1 g/kg)

ou t-DCTN (10 mg/kg) poderia amenizar o dano hepático associado a altas doses de t-DCTN

(100 mg/kg). Os resultados demonstraram uma evidente hepatoproteção pela administração de

baixas doses de etanol ou t-DCTN.

Na tentativa de elucidar o mecanismo envolvido no pré-condicionamento com t-

DCTN ou Etanol foi avaliado o papel do NO (óxido nítrico) nesta hepatoproteção. Assim, os

animais foram pré-tratados com L-arginina ou D-arginina antes da indução da hepatite tóxica

pela t-DCTN (100 mg/kg).

A L-arginina é o aminoácido precursor essencial na produção do NO. A síntese do NO

resulta da oxidação de um dos dois nitrogênios guanidinos da L-arginina, que é convertida em

L-citrulina pela enzima NO-sintase (NOS) (MARIETA, 1993; MONCADA et al.,1991).

Os resultados obtidos mostraram que a suplementação com L-arginina foi capaz de

prevenir os efeitos hepatotóxicos de t-DCTN, que se deve parcialmente à produção de NO e

ao aumento da microcirculação. No entanto, o mesmo não pode ser verificado com a

suplementação com D-arginina, já que a forma dextrógira da arginina não tem efeito na

produção de NO.

A presença de NO em baixas concentrações está associada aos efeitos benéficos no

TGI, enquanto o NO em altas concentrações pode induzir a formação de radicais derivados do

nitrogênio, que são altamente citotóxicos (WALLACE & MILLER et al., 2000; JOSHI et al.,

1999). Este achado pode explicar em parte o efeito hepatoprotetor de baixas doses da t-DCTN

ou etanol, e o efeito hepatótoxico destes, quando administrados em doses mais altas,

sugerindo o envolvimento do NO neste efeito. Porém, outros estudos são necessários para

estabelecer o mecanismo molecular da suplementação de L-arginina no dano hepático

induzido por t-DCTN.

Os dados obtidos neste estudo claramente mostram o potencial hepatotóxico da t-

DCTN como comprovado pela elevada atividade das transaminases AST e ALT no soro e

observações histológicas que fortalecem os resultados encontrados. Estes resultados

confirmam estudos anteriormente relatados em relação a sua alta-dose associada ao dano

hepático (RODRIGUEZ et al., 2004). Porém, seu mecanismo de ação tóxica permanece

inexplicado.

Alguns dos derivados de plantas ou compostos sintéticos podem induzir

hepatotoxicidade agindo como pró-oxidantes. A atividade pró-oxidante pode ser um fator

contribuinte para a hepatotoxicidade de agentes hipoglicemiantes como troglitazona

(TAFAZOLI et al., 2005).

Alterações das funções hepáticas e renais em decorrência da ação tóxica de

xenobióticos podem estar associadas à lipoperoxidação tecidual (WEIJL et al., 1997;

NAZIROGLU et al., 2004). A peroxidação lipídica interfere nas funções biológicas, por

provocar alterações em organelas celulares, incluindo os peroxissomas (DE DUVE, 1969),

lisossomas (DE DUVE; WATTIAUX, 1966), retículo endoplasmático (WILLS, 1971), e

mitocôndrias (NOHL; HEGNER, 1978). Hemoproteínas e complexos não heme de ferro,

cobre e manganês são constituintes das membranas celulares que podem formar radicais livres

provocando oxidação de ácidos graxos, mudanças na fluidez e permeabilidade da membrana,

resultando em alterações celulares (MIQUEI, 1989).

A formação de radicais reativos de oxigênio é causa mais provável da

hepatotoxicidade de fármacos. A remoção ineficaz dos radicais livres formados durante o

estresse oxidativo pode alterar a composição lipídica das membranas celulares via

peroxidação lipídica e induzir depleção de antioxidantes celulares que resultam em danos a

membranas hepáticas e outras células (CONKLIN, 2004).

Os fosfolipídios de membrana estão entre as moléculas orgânicas mais instáveis,

devido ao seu elevado conteúdo de ácidos graxos poliinsaturados (VLADIMIROV et al.,

1981). A peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados resulta na formação de radicais peroxil

e alcoxil. Estes produtos primários da peroxidação lipídica, que são altamente reativos e tem

curta duração, sofrem reações formando produtos secundários da peroxidação lipídica que

incluem uma variedade de aldeídos, como malondialdeído (MDA), 4-HNE (4-hidroxinonenal)

e acroleína. Os aldeídos são mais estáveis do que os produtos primários e podem se difundir

através da célula, lesando os componentes da membrana e interferindo nas funções celulares.

Devido às suas características eletrofílicas, os aldeídos se ligam aos grupos nucleofílicos dos

aminoácidos como cisteína, lisina, histidina, serina e tirosina, os quais são componentes

críticos dos sítios ativos de enzimas ou são necessários para a manutenção da estrutura

terciária das proteínas. A ligação destes aldeídos a proteínas resulta na inibição enzimática e

na alteração da estrutura dos receptores celulares, constituindo um evento chave da

citotoxicidade de hepatotoxicantes (CONKLIN, 2004).

Proteínas com grupamentos sulfidrílicos são muito sensíveis à oxidação por espécies

reativas de oxigênio e parte dos grupos sulfidrílicos são oxidados na presença das espécies

reativas de oxigênio. A modificação da estrutura dessas proteínas pelo estresse oxidativo

geralmente é acompanhada do enfraquecimento de várias funções mitocondriais e quebra da

homeostase intracelular do cálcio. Esses grupamentos são importantes para a atividade

biológica de muitas enzimas, entre elas as ATPases e desempenham importante função na

transição da permeabilidade mitocondrial (TPM), responsável por disfunção mitocondrial

irreversível.

A resposta ao estresse oxidativo pode ser descrita como o fenômeno pelo qual a célula

responde a alterações no seu estado redox. Por estarem continuamente expostos a espécies

reativas de oxigênio (EROs), os organismos diversos, desde bactérias a humanos têm

desenvolvido mecanismos de manutenção da homeostase redox celular (RODRIGUES-

POUSADA, et al., 2005). O conjunto de defesas mitocondriais contra o estresse oxidativo

inclui moléculas antioxidantes de baixo peso molecular e enzimas como: GSH, NADPH,

superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GRd), além

das vitaminas C e E (LIU; KEHRER, 1996).

Normalmente, o ânio superóxido (O

) é transformado em peróxido de hidrogênio

) pela ação da superóxido dismutase (SOD). O H

é reduzido a H

O pela glutationa

peroxidase, consumindo glutationa reduzida (GSH), a qual é mantida neste estado pela

glutationa redutase, que utiliza NADPH (KOWALTOWSKI et al., 2001; GUTTERIDGE;

HALLIWELL, 2000; SHAN; AW; JONES, 1990).

A glutationa é um tripeptídeo que contém um grupamento sulfidrílico capaz de ligar-

se a compostos eletrofílicos diretamente ou através de reações catalisadas pela glutationa

transferase produzindo conjugados com o ácido mercaptúrico. A glutationa também pode

servir de substrato na eliminação de peróxidos resultantes da dismutação do radical

superóxido, reação catalisada pelas diferentes formas da glutationa peroxidase (GOLDSTEIN;

SCHELLMANN, 1994).

A NADPH é considerada uma fonte primária de equivalentes redutores para o sistema

glutationa. Em muitos tecidos animais, a NADPH necessária para que ocorra a redução da

GSSG é fornecida pela via das pentoses-fosfato, pela oxidação do malato em piruvato, por

atividade da enzima extramitocondrial malato desidrogenase, ou pela conversão do isocitrato

em α-cetoglutarato, através da ação da isocitrato desidrogenase citoplasmática (SCHAFER;

BUETTNER, 2001). Logo, a NADPH é um constituinte fundamental do sistema de defesa

antioxidante mitocondrial, e um estresse oxidativo prolongado pode levar à produção e ao

consumo permanente de NADPH, resultando em conseqüências incompatíveis com a

sobrevivência da célula (MOTA et al., 2004).

t-DCTN e seus metabólitos podem alterar o equilíbrio redox para um estado mais

oxidado no fígado, no qual age de forma pró-oxidante, reduzindo as defesas antioxidantes das

células e criando um estresse oxidativo, um processo danoso que pode ser um importante

mediador do dano da estrutura celular, inclusive lipídios, membranas, proteínas e DNA

(VALKO et al., 2007). Os antioxidantes interagem com os radicais livres, neutralizando-os,

protegendo o corpo contra os efeitos destrutivos destes radicais e prevenindo o dano celular

(FLORA, 2007). Então, uma combinação com propriedades antioxidantes pode

terapeuticamente melhorar a progressão da peroxidação lipídica e o dano hepatocelular

induzidos por hepatotoxicantes.

Vitamina E e N-acetilcisteína (NAC) são antioxidantes clinicamente úteis que

protegem o corpo contra estresse oxidativo. É sabido que a deficiência de vitamina E aumenta

a peroxidação lipídica no tecido hepático e sua suplementação altera a oxidação lipídica in

vivo (DUTHIE et al., 2005). GSH faz um papel importante aliviando o dano tissular induzido

pela formação de radicais livres (HUSAIN et al., 2001; MOLINA et al., 2003) e sua

deficiência está associada com numerosas condições patológicas.

A administração de NAC, um precursor da cisteína, aumenta os níveis intracelulares

de GSH. NAC, melhor conhecido por sua utilização em estudos da toxicidade do

acetaminofeno, é um seguro e bem-tolerado antídoto para deficiência de cisteína/GSH

(ATKURI et al., 2007). Também estudos sugerem uma interação entre GSH e vitamina E

protegendo contra peroxidação lipídica (MILCHAK & DOUGLAS BRICKER, 2002). Assim,

este estudo investigou os efeitos do pré-tratamento com vitamina E e NAC no dano hepático

associado a uma alta-dose (100 mg/kg) de t-DCTN, através da análise da glutationa e TBARS

hepáticos e transaminases séricas (AST e ALT), e usando uma aproximação histológica.

A administração de t-DCTN (100 mg/kg) aumentou significativamente a GSH

hepática e os níveis séricos de AST e ALT, e quando foram co-administrados NAC e t-

DCTN, as atividades de AST e ALT não foram significativamente diferentes dos valores

obtidos só com t-DCTN. Recentemente, foram relacionados mecanismos potenciais que estão

por trás da hepatotoxicidade de pironas de kava e diterpenóides de germander para a depleção

intracelular de glutationa e/ou formação de quinona. (ZHOU et al., 2007; LÜDE et al., 2008).

Como o germander, a sacaca (Croton cajucara) também é usada tradicionalmente como um

adjuvante a suplementos dietéticos emagrecedores. De forma interessante, ao contrário de

germander, t-DCTN aumenta a glutationa celular possivelmente devido a uma resposta ao

estresse oxidativo.

O tratamento com t-DCTN comprovou alterações morfológicas em histologia do

fígado. Os animais do grupo controle não mostraram nenhuma anormalidade na

citoarquitetura do parênquima hepático. A co-administração de NAC com t-DCTN mostrou

nenhum sinal de alteração e o padrão morfológico era semelhante ao grupo tratado somente

com t-DCTN. Análises bioquímicas e histológicas mostram que o tratamento com NAC não

melhora o efeito hepatotóxico da t-DCTN. Em contraste, a hepatotoxicidade de t-DCTN é

significativamente reduzida através do tratamento com vitamina E, como comprovada pela

diminuição dos níveis séricos de ALT e AST, de TBARS hepático e redução da gravidade das

alterações histológicas, sugerindo que a vitamina E combate o estresse oxidativo (BANSAL et

al., 2005; ARAKAWA & ITO, 2007).

A redução, mediada pela vitamina E, nos níveis de AST, ALT e TBARS para os

valores normais respectivos pode ser uma indicação de estabilização da membrana

plasmática, assim como, de reparo do dano ao tecido hepático causado pela t-DCTN. Os

resultados encontrados estão de acordo com os estudos de Gokcimen et al. (2007) nos quais

relataram danos hepatocelulares que poderiam ser protegidos eficazmente através da

administração de vitamina E, mas não de NAC.

A medida de TBARS (Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) é usada para

avaliar a lipoperoxidação, ou seja, quando os lipídios sofrem ação dos radicais livres. TBARS

reflete a quantidade de malonaldeído (MDA) formado, um produto final da peroxidação dos

ácidos graxos da membrana (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2001).

Logo, a investigação presente mostrou que uma dose alta de t-DCTN pode aumentar o

estresse oxidativo, como comprovado por um aumento nas atividades de ALT e AST e

formação aumentada de TBARS no fígado, uma indicação de peroxidação lipídica. O

aumento na GSH hepático poderia ser uma causa de defesa do hospedeiro contra o estresse

oxidativo contínuo. Desde que vitamina E protegeu fígado contra a peroxidação lipídica e

restabeleceu o TBARS, AST e ALT para níveis quase normais, a peroxidação lipídica pode

ser a causa principal do dano hepatocelular em camundongos tratados com t-DCTN. A

vitamina E pode ser usada como medida profilática para combater o dano hepático associado

com o uso de alta dose de t-DCTN.

7. CONCLUSÕES

v A trans-desidrocrotonina apresentou toxicidade hepática quando administrada em

altas doses (100 e 300 mg/kg, v.o.), demonstrada por um aumento nas atividades de

ALT e AST e nas lesões hepáticas.

v Doses menores de t-DCTN (10 e 30 mg/kg, v.o.) não elevaram os níveis das

transaminases séricas, mesmo quando administradas sucessivamente, evidenciando

que a toxidade hepática associada a t-DCTN é dependente da dose.

v O pré-condicionamento com baixas doses de t-DCTN (10 mg/kg, v.o.) ou etanol

(1g/kg, v.o.) foi capaz de previnir contra a hepatite tóxica induzida por altas doses de

t-DCTN. Isto foi confirmado pela diminuição nos níveis das transaminases (ALT e

AST) e nas lesões do fígado observadas histologicamente.

v A L-arginina, um aminoácido essencial na produção de NO, foi capaz de amenizar os

efeitos tóxicos induzidos por t-DCTN, possivelmente devido a um aumento na

microcirculação hepática, porém outros estudos são necessários para estabelecer o

mecanismo molecular da suplementação com L-arginina na lesão hepática.

v A toxicidade de uma alta dose de t-DCTN provavelmente está relacionada a um

estresse oxidativo, como comprovado por um aumento nas atividades de ALT e AST e

formação aumentada de TBARS no fígado, uma indicação de peroxidação lipídica. A

vitamina E, um antioxidante lipossolúvel, restabeleceu o TBARS, AST e ALT para

níveis quase normais, sugerindo que a peroxidação lipídica pode ser a causa principal

do dano hepatocelular em camundongos tratados com t-DCTN.

v A suplementação com vitamina E ou o pré-condicionamento com baixas doses de t-

DCTN ou de etanol poderiam ser uma medida profilática útil para combater a

hepatotoxicidade associada a altas doses de t-DCTN.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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