( PDF ) Atividade gastroprotetora e antioxidante de extratos e constituintes químicos de Byrsonima sericea dc. e Plectranthus grandis cramer (willensem)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

PATRÍCIA DE ARAÚJO RODRIGUES

ATIVIDADE GASTROPROTETORA E ANTIOXIDANTE DE

EXTRATOS E CONSTITUINTES QUÍMICOS DE BYRSONIMA SERICEA

DC. E PLECTRANTHUS GRANDIS CRAMER (WILLENSEM)

FORTALEZA-CE

2008

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PATRÍCIA DE ARAÚJO RODRIGUES

ATIVIDADE GASTROPROTETORA E ANTIOXIDANTE DE

EXTRATOS E CONSTITUINTES QUÍMICOS DE BYRSONIMA SERICEA

DC. E PLECTRANTHUS GRANDIS CRAMER (WILLENSEM)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará

como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em

Ciências Veterinárias.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,

onívoros, herbívoros e aves.

Orientadora: Profa. Dra.Selene Maia de Morais

Co-orientadora: Profa. Dra. Flávia Almeida Santos

FORTALEZA-CE

2008

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PATRÍCIA DE ARAÚJO RODRIGUES

ATIVIDADE GASTROPROTETORA E ANTIOXIDANTE DE

EXTRATOS E CONSTITUINTES QUÍMICOS DE BYRSONIMA SERICEA

DC. E PLECTRANTHUS GRANDIS CRAMER (WILLENSEM)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da

Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial

para a obtenção do título de Doutor em Ciências

Veterinárias.

Aprovada em: ____/_____/_____

Banca Examinadora

____________________________

Selene Maia de Morais, Profa. Dra.

Orientadora (UECE)

____________________________ _______________________________

Flávia Almeida Santos, Profa. Dra. Sônia Mª Oliveira da Costa, Profa. Dra.

Examinadora (UFC) Examinadora (UECE)

_____________________________ ______________________________

Cláudio Cabral Campello, Prof. Dr. Ednardo Rodrigues Freitas, Prof. Dr.

Examinador (UECE) Examinador (UFC)

Ao Criador, pela força dada nas horas mais difíceis da minha da

vida.

À minha filha Carolina, razão maior dos meus esforços e da

minha vontade de vencer, minha melhor inspiração.

Aos meus pais, Luiz Rodrigues Feijão e Ledir de Araújo

Rodrigues pela ajuda e incentivo constantes aos meus estudos.

Dedico.

“O grande obstáculo ao conhecimento não é a ignorância, mas a

ilusão do conhecimento”.

(Daniel Boorstein).

AGRADECIMENTOS

À Deus, pelo dom da vida, força e coragem a mim concedida durante toda esta

caminhada árdua.

À Profa. Dra. Selene Maia de Morais, pela orientação, apoio e sensibilidade de

compreender minhas dificuldades, e também como exemplo de sabedoria e competência que

me incentivou e estimulou ao longo desta difícil jornada. Meu carinho e reconhecimento.

À Maria José Siqueira Prado, minha querida amiga (quase mãe) dos momentos bons e

ruins, nos quais nesses agradecimentos eu não teria como expressar minha gratidão e amor que

sinto por ela.

À Maria Tereza Batista de Araújo Feijão, pelo imenso carinho dispensado a minha filha,

e pelo espírito de solidariedade que teve comigo nessa longa e dura jornada.

À Profa. Dra. Flávia Almeida Santos, pela co-orientação valiosa, disponibilidade e

acolhimento no Laboratório de Produtos naturais (LPN) que foram essenciais para finalização

deste trabalho. Minha gratidão.

Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao, pelo apoio e valiosas sugestões. Meu muito

obrigado.

À Profa. Dra. Geanne Matos Andrade, que gentilmente cedeu seu laboratório para

realização dos experimentos.

À Profa. Dra. Maria Izabel Florindo Quedes do Lab. de Bioquímica Humana da UECE,

que sempre muito gentil, me disponibilizou seu laboratório para que pudesse dar continuidade

aos experimentos.

Aos amigos que fiz durante o curso, Cícero Temístocles, Michelline Maciel, Suzana,

Nadja e Davi. Especialmente, as minhas grandes amigas, Márcia Maria Mendes Marques

(Márcinha) e Ana Raquel de Araújo Silva (Aninha) companheiras nos momentos de alegria e

descontração, bem como na parceria durante os experimentos e por terem sido pessoas

companheiras fiéis, me apoiando e dando força para seguir em frente.

Em especial à Carolina Sousa Melo, do Dep. de farmacologia da UFC pela sua valiosa

ajuda e dedicação aos meus experimentos, parceira fundamental para execução e finalização

desse trabalho.

A Liza de Araújo Aguiar pela inestimável ajuda no início do curso e nos muitos

experimentos que fizemos juntas. Meu carinho.

Ao Dr. Roberto Lima de Albuquerque e Maria Gorette Vasconcelos Silva da UFC, pelo

fornecimento dos dois compostos isolados, uma das bases para realização deste trabalho.

A todas as professoras e aos bolsistas Lyeghyna, Vanessa, Karine, Denis, Edson,

Harlleys e Leonardo do Laboratório de Química de Produtos Naturais pela ajuda e amizade

demonstrados nestes anos de convívio saudáveis e proveitosos.

A coordenação do PPGCV, e Adriana, secretária, sempre muito paciente comigo bem

como aos professores do curso.

À Universidade Estadual do Ceará, através do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias, pela oportunidade de realização deste curso.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela

concessão da bolsa de estudos.

A todos que contribuíram de forma direta ou indiretamente para que a realização desse

estudo saísse de maneira ordeira e com êxito.

RESUMO

Neste estudo o extrato etanólico das folhas de Byrsonima sericea DC. (BSLE), conhecida como

murici da praia, e dois diterpenos, barbatusina (BB) e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (OHBB),

isolados de Plectranthus grandis, popularmente chamado de boldo grande, foram avaliados em

modelos experimentais de lesão gástrica induzida por etanol. Doses de 500 e 1000 mg/kg, v.o.

não foram tóxicas para BSLE. A dose de 1000 mg/kg de BSLE reduziu o trânsito intestinal

quando comparado com o controle (atropina 1 mg/kg). BSLE nas doses de 125, 250, 500 e

1000 mg/kg, v.o. atenuou significativamente as lesões gástricas induzidas por etanol em 58, 86,

80 e 90% respectivamente. No modelo de indometacina, as doses de 250, 500 e 1000 mg/kg,

v.o. atenuaram as lesões, inibindo em 53, 51 e 53 % respectivamente. BSLE (250 mg/kg) teve

efeito significativo sobre fatores protetores da mucosa gástrica aumentando as concentrações de

muco gástrico, de grupamentos sulfidrílicos não-protéicos (GSH) e da enzima superóxido

desmutase (SOD), diminuiu os níveis de malonaldeído não alterando os níveis de catalase. O

pré-tratamento com o antagonista dos receptores TRPV1 capsazepina, L-NAME e

glibenclamida foi capaz de reverter o efeito gastroprotetor de BSLE. Os resultados do presente

estudo indicam uma ação citoprotetora conferindo efeito gastroprotetor contra injúria gástrica

induzida por etanol e indometacina, demonstrando uma possível participação desse extrato, na

ativação dos receptores vanilódes TRPV1, liberação de óxido nítrico, abertura de canais de

potássio sensíveis a ATP e ação antioxidante. A análise do BSLE por cromatografia líquida de

alta eficiência revelou a presença dos flavonóides rutina, isoquercitrina, camferol-3-O-

rutinosideo e quercetina. Estes compostos apresentam atividade antioxidante relatada na

literatura. A ação gastroprotetora dos diterpenos de P. grandis OHBB e BB foi avaliada nas

doses de 2,5; 5,0 e 10 mg/kg, v.o., OHBB em todas as doses reduziu significativamente as

lesões gástricas (53, 55, e 96% respectivamente) e a BB apenas nas doses de 5,0 e 10 mg/kg (31

e 76 % respectivamente). OHBB (5mg/kg) e BB (10 mg/kg) causaram aumento de forma

significativa os níveis de GSH e diminuiram os níveis de malonaldeído. O pré-tratamento com

capsazepina e L-NAME não foi capaz de reverter o efeito gastroprotetor da OHBB enquanto

que o pré-tratamento com glibenclamida reverteu o efeito gastroprotetor da OHBB.

Adicionalmente, o efeito da BB foi significativamente reduzido em camundongos pré-tratados

com capsazepina e L-NAME. OHBB foi capaz de causar depleção da catalase, enquanto que a

administração de BB não alterou a quantidade desta enzima no tecido gástrico. OHBB

preservou a quantidade da enzima superóxido desmutase e a BB foi capaz de aumentar a

quantidade da mesma no tecido. Os resultados do presente estudo indicam uma ação

citoprotetora e antioxidante da OHBB e BB que devem contribuir para o efeito gastroprotetor

contra injúria gástrica induzida por etanol. Os diterpenos agem por mecanismos distintos,

conforme foi demonstrado nos resultados.

Palavras chaves: Byrsonima sericea. Plectranthus grandis. Barbatusina. 3-β hidroxi-3-

deoxibarbatusina. Gastroproteção. Flavonóides.

ABSTRACT

In this study the leaf ethanol extract of Byrsonima sericea DC. (BSLE), known as murici of the

beach, and two diterpenes, barbatusin (BB) and 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusin, (OHBB),

isolated from Plectranthus grandis, popularly called big boldo, were evaluated in experimental

models of gastric lesions induced by ethanol. Dose of 500 and 1000 mg / kg, p.o. were not

toxic. Dose of 1000 mg / kg of BSLE reduced the intestinal transit compared with the control

(atropine 1 mg / kg), showing an anti effect. BSLE at doses of 125, 250, 500 and 1000 mg / kg,

po significantly attenuated the gastric lesions induced by ethanol in 58, 86, 80 and 90%

respectively. In the model of indomethacin, dose of 250, 500 and 1000 mg / kg, p.o.

significantly attenuated the gastric damage, inhibiting in 53, 51 and 53% respectively. BSLE

(250 mg / kg) had a significant effect on gastric mucosal protective factors, the concentration of

the gastric mucous concentration of non-protein sulfhydryl groups (GSH), and the levels of

malonaldehyde, as well as the activity of enzymes, superoxide dismutase and catalase. The

characterization of the mechanism of action was taken through biological tests in order to

assess the action via the activation of nerve endings sensitive to capsaicin, the role of nitric

oxide and also the participation of potassium channels. The pre-treatment with the TRPV1

receptor antagonist capsazepina, L-NAME and glibenclamide was able to reverse the effect

gastroprotetor of BSLE. The results of this study indicate an action cytoprotectant

gastroprotetor giving effect against gastric injury induced by ethanol and indomethacin,

demonstrating a possible participation of this statement, the activation of TRPV1 receptor

vanilloid, release of nitric oxide, opening of potassium channels and sensitive to ATP action

antioxidant. The analysis of BSLE by high performance liquid chromatography revealed the

presence of flavonoids rutin, isoquercitrin, kaempferol-3-O-rutinoside and quercetin. Dose of

2.5, 5.0 and 10 mg / kg, po, were used to assess OHBB and BB. OHBB (2.5, 5.0 and 10 mg /

kg, po) significantly attenuated the gastric lesions induced by ethanol (53, 55, and 96%

reduction) and BB only at doses of 5.0 and 10 mg / kg , (31, and 76% reduction), respectively.

OHBB (5 mg / kg) and BB (10 mg / kg) were able to significantly reduce the depletion of GSH

and increased levels of malonaldehyde. The pre-treatment capsazepine, and L-NAME were not

able to reverse the effect gastroprotective of OHBB while the pre-treatment with glibenclamide

gastroprotective reversed the effect of OHBB front of lesions induced by ethanol. Additionally,

the effect of BB was significantly reduced in mice pre-treated with capsazepine and L-NAME.

OHBB was capable of causing depletion of catalase, while the administration of BB did not

alter the amount of this enzyme in stomach tissue. OHBB preserved the amount of the enzyme

superoxide dismutase and BB was able to increase the amount of the same fabric. The results of

this study indicate an action cytoprotectant of OHBB and BB gastroprotective giving effect

against gastric injury induced by ethanol. The diterpenes act by different mechanisms, as shown

in the results.

Keywords: Byrsonima sericea. Plectranthus grandis. Barbatusin. 3-β-hydroxy-3-

deoxibarbatusina. Gastroprotection. Flavonoids

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

PÁGINA

FIGURA 1.

Galho com folhas, flores e frutos de B. sericea 17

FIGURA 2.

3-O-galoil-(-)-epicatequina-[4β→8]-3-O-galoil-(+)-

epicatequina-4α-benzil-tio-éter isolado em B. verbascifolia

FIGURA 3.

Flavonóides presentes em B. crassifólia 18

FIGURA 4.

Núcleo dos flavonóides 19

FIGURA 5.

Estruturas químicas: Quercetina; Quercitrina; Rutina 21

FIGURA 6.

Foto exsicata de Plectranthus grandis Cramer (Willense) 22

FIGURA 7.

Estrutura química da barbatusina 23

FIGURA 8.

Estrutura química da 3

-hidroxi-3-deoxobarbatusina

FIGURA 9.

Ciclo GSH-GSSG 33

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AINES Antiinflamatórios não-esteroidais

AMPc Adenosina Monofosfato cíclico

ANOVA Análise de variância

ATP Adenosina trifosfato

CAT Catalase

Íon cálcio

GMPc Guanosina monofosfato cíclica

CG Guanilato ciclase

CEPA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

CGRP Peptídio Relacionado ao Gene da Calcitonina

DMSO Dimetilfulfóxido

DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil

E.P.M. Erro padrão da média

ERRO Espécies reativas de oxigênio

GPx Glutationa peroxidase

GSH Glutationa reduzida

, K

-ATPase Bomba de prótons

HCl Ácido clorídrico

i.p. Intraperitoneal

ATP

Canais de potássio sensíveis a ATP

L-NAME N

-nitro-L-arginina-metilester

MDA Malonaldeído

NAC N-acetilcisteína

NO Óxido nítrico

P Nível de significância

s.c. Sub-cutâneo

SNC Sistema Nervoso Central

SOD Superóxido desmutase

SNE Sistema Nervoso Entérico

TBA Ácido tiobarbitúrico

TCA Ácido tricloroacético

TRPV1 Canal de potencial transiente tipo vanilóide subtipo 1

v.o. Via oral

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 14

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Plantas medicinais

2.2 Potenciais medicinais e constituintes químicos caracterizados das plantas do

gênero Byrsonima

2.2.1 Flavonóides

2.3 Considerações botânicas sobre a espécie Byrsonima sericea DC. e suas

atividade biológicas.

2.4 Potenciais medicinais e constituintes químicos caracterizados das plantas do

gênero Plectranthus

2.4.1 Terpenóides

2.5 Considerações botânicas sobre a espécie Plectranthus grandis (Cramer)

Willense e suas atividade biológicas.

2.6 Fisiologia gástrica

2.7 Mecanismos de proteção do Estômago

2.7.1 Muco / bicarbonato

2.7.2 Fluxo sanguíneo

2.7.3 Prostaglandina

2.7.4 Óxido Nítrico (NO)

2.8 Lesão gástrica

2.9 Noções Gerais Sobre os Parâmetros Envolvidos nos Processos Oxidativos

2.9.1 Radicais livres e estresse Oxidativo

2.9.2 Defesa antioxidante

2.10 Dados epidemiológicos de úlceras gástricas em animais domésticos

3. JUSTIFICATIVA

4. HIPÓTESE

5. OBJETIVOS 39

5.1 Objetivo geral 39

5.2 Objetivos específicos 39

6. CAPÍTULO I

Atividade Antioxidante e Gastro-Protetora de Produtos Naturais em Animais

Experimentais

7. CAPÍTULO II

Gastroprotective effect of Byrsonima sericea DC. leaf extract against ethanol-

induced gastric injury: potential mechanisms

8. CAPÍTULO III

Efeito do extrato etanólico de Byrsonima sericea DC. no sistema gastro-intestinal

e avaliação da toxicidade em camundongos

9. CAPÍTULO IV

Pre-clinical studies of the gastroprotective effect of Barbatusin and 3β-hidroxi-3-

deoxobarbatusin, diterpenes isolated from Plectranthus grandis

, in experimental

models of acute gastric injury and the possible mechanisms

10. CONCLUSÕES 125

11. PERSPECTIVAS 127

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 128

13. ANEXOS 138

1 INTRODUÇÃO

A utilização popular de plantas no combate as doenças é milenar. A comprovação

científica dos efeitos benéficos das plantas tem despertado interesse junto aos pesquisadores,

pois um grande número permanece desconhecido, tanto do ponto de vista químico quanto

farmacológico.

O uso de plantas medicinais como fonte de medicamentos é uma tradição e uma

tendência generalizada na medicina popular brasileira. Esta tendência tem contribuído

significativamente não só para o consumo de plantas medicinais, mas também para o uso de

medicamentos fitoterápicos. Os conhecimentos acumulados ao longo do tempo demostram que

tais produtos podem causar sérios, danos se usados de forma inadequada, e comprovam que a

história do que é “natural” não faz mal, é um mito, e precisa ser olhado de modo diferente.

O Brasil apresenta uma flora bastante rica e diversificada, constituindo uma fonte

potencial de novas substâncias com inúmeras ações farmacológicas. A magnitude da

biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal como a sua complexidade,

estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de plantas, animais e

microrganismos (DIAS, 1996).

A medicina tradicional ainda é o suporte principal de cerca da 75-80% da população

mundial, principalmente, em países subdesenvolvidos. A índia, que mantém uma antiga

tradição em medicina popular tem produzido remédios simples e eficientes usando plantas e

seus compostos derivados. Desta forma, necessita-se de validação por meio de pesquisas

científicas que utilizem modelos adequados de experimentação, para comprovação dos efeitos

farmacológicos através do isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos, para

que se possa obter a formulação de fitoterápicos seguros para uso humano e/ou animal. Sendo

assim, o estudo da dose, concentração e via de administração são essenciais (ZHAN;ZHOU,

2003).

Nos últimos anos, a utilização de plantas no tratamento de doenças, está sendo

revalidada por extensas pesquisas em diferentes espécies de plantas sobre a descoberta de seus

princípios terapêuticos. Nesse contexto, MARINHO et al. (2007), numa pesquisa desenvolvida

no município de Patos-Paraíba, investigaram o conhecimento popular e a utilização de plantas

medicinais no tratamento de doenças nos animais domésticos, e concluíram que o uso das

plantas medicinais na terapêutica veterinária foi ressaltado como uma alternativa de tratamento

viável, segura, de fácil obtenção e baixo custo.

Estudos científicos mostram os potenciais curativos de plantas medicinais no tratamento

de várias doenças acometidas por animais.

No Ceará alguns trabalhos tem demosntrado a atividade anti-helmíntica de plantas em

caprinos (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2008; CAMURÇA-VASCONCELOS et al.,

2007).

Óleos essenciais foram utilizados para tratamentos de gengivites em cães (GIRÃO et al.,

2003).

O uso das plantas medicinais e fitoterápicos ainda é pouco explorado na medicina

veterinária, estes poderiam agir de forma preventiva contra uma série de doenças que afetam

tanto animais de produção, quanto animais utilizados na prática de esportes, principalmente

aqueles submetidos ao estresse provocado pelo confinamento ou práticas de manejos

intensivos, e que apresentam doenças associadas a essa condição.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Plantas medicinais

As plantas medicinais se destacam como grandes fontes de novos recursos terapêuticos,

e é a partir destas que a indústria farmacêutica desenvolve os medicamentos (SCHENKEL et

al., 2001).

O interesse em todo o mundo em torno dos “produtos naturais” vem aumentando

consideravelmente, muito embora os centros menos desenvolvidos sempre apresentassem uma

forte dependência aos medicamentes fitoterápicos. Esta dependência não é somente justificada

pelo fator econômico, mas geralmente à transmissão secular das tradições culturais de cada

comunidade. O Brasil está entre os países com maior biodiversidade vegetal, esta característica

tem colaborado de uma forma expressiva para o consumo não só de plantas medicinais, como

também de medicamentos fitoterápicos.

O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com

mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 espécies

(DIAS, 1996). Mais da metade dessas espécies se encontra nas florestas tropicais, cuja área

corresponde a apenas 7% da superfície da terra (SOEJARTO, 1996). Muitas dessas espécies de

plantas ainda permanecem pouco conhecidas sob qualquer ponto de vista.

Nestas condições, seria de se esperar que o Brasil fosse um país privilegiado, no

entanto, nosso país não tem um desempenho destacado como deveria no mercado mundial de

fitoterápicos, ficando inclusive atrás de países menos desenvolvidos tecnologicamente

(YUNES et al., 2001).

Os grandes centros de pesquisa passaram a isolar e sintetizar as substâncias

responsáveis pelos princípios ativos das plantas medicinais de uso popular, para produzir novos

fármacos. No entanto, é necessário observar que cada planta é constituída de inúmeros

princípios ativos que podem agir em sinergia, ou seja, o resultado do conjunto é muitas vezes

mais potente e com menos efeitos colaterais que cada princípio ativo isolado. Assim, os

tratamentos à base de fitoterápicos têm demonstrado cada vez mais a sua eficácia, mas como

qualquer outro tipo de tratamento, requer antes uma análise correta da doença para que a planta

utilizada tenha realmente a eficiência que se espera (ARCOLINE, 2003).

R = galoil

2.2 Potenciais medicinais e constituintes químicos caracterizados das plantas do gênero

Byrsonima

O gênero Byrsonima está distribuído pela América Tropical, apresentando cerca de 150

espécies e encontrada freqüentemente na zona da mata, em florestas úmidas, no Estado de

Pernambuco, nordeste do Brasil (MABBERLEY, 1993).

No Nordeste brasileiro, ocorrem várias espécies do gênero Byrsonima que são

principalmente conhecidas pela utilização dos seus frutos na alimentação e pelo emprego com

fins medicinais. Espécies deste gênero são comumente empregadas como antiasmáticas, contra

febre e infecção de pele. Já foram isolados do gênero Byrsonima alguns derivados

flavonoídicos e triterpenos classes de substâncias naturais de ocorrência no gênero (MENDES

et al., 1999).

Byrsonima verbascifolia é utilizada na medicina popular para problemas de estômago e

já foi relatado o isolamento de substâncias como quercetina e 3-O-galoil-(-)-epicatequina-[4β

→8]-3-O-galoil-(+)-epicatequina-4α-benzil-tio-éter (Fig1), isoquercetina, 3-arabinosil-

quercetina, taninos gálicos compostos com conhecidas atividades antioxidantes (BÉJAR;

MALONE, 1993).

Figura 1. 3-O-galoil-(-)-epicatequina-[4β→8]-3-O-galoil-(+)-epicatequina-4α-benzil-

tio-éter isolado em B. verbascifolia

Outra planta do gênero, Byrsonima coccolobifolia, têm comprovada a sua atividade

moluscicida contra Biomphalaria glabrata, e bactericida para Staphylococcus aureus, Bacillus

cereus e Pseudomonas aeruginosa.

OH O

= H

= OH

(+)-catequina

OH O

R = β - D - galactopiranosídeo

R = α - D - arabinopiranosídeo

(-)-epicatequina

= OH

= H

Byrsonima crassa é utilizada no tratamento de infecções cutâneas e disfunções

gastrintestinais. Estudos comprovam a presença de taninos e flavonóides como 3-O-β-D-

arabinopiranosídeo quercetina (VÁZQUEZ et al., 1998; SANNORNIYA et al., 2005).

Há relatos na literatura sobre efeitos antifúngicos, bactericidas e convulsivos de

Byrsonima crassifólia, sendo caracterizada a presença de compostos isolados quercetina, 3-O-

α-D-glicopiranosídeo quercetina, 3-O-β-D-arabinopiranosídeo quercetina, (-)-epicatequina e

(+)-catequina (Fig.2) (RASTRELLI et al., 1997).

Figura 2. Flavonóides presentes em B. crassifólia

2.2.1 Flavonóides

Compostos fitoquímicos que apresentam em sua estrutura um anel aromático com uma

ou mais hidroxilas recebem a denominação de compostos fenólicos e, geralmente apresentam

propriedade antioxidante. Dentre eles desatacam-se os flavonóides, os ácidos fenólicos e o

tocoferol como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural (MELO;GUERRA,

2002).

Flavonóides são compostos formados pela condensação dos ácidos cinâmicos com 3

unidades de malonil-CoA.

A estrutura química de um flavonóide apresenta as unidades C

-C

, sendo dois anéis

benzênicos (C

) ligados pela unidade C

que pode formar um ciclo ou não (Fig.3).

Figura 3. Núcleo dos flavonóides

Trabalhos recentes têm demonstrado que flavonóides encontrados em frutos e vegetais

são importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Encontra-se em

abundância nas angiospermas, tais compostos podem também agir como antioxidantes (MELO;

GUERRA, 2002).

Os flavonóides atuam como antioxidantes primários reagindo com os radicais livres, e

também como quelantes de metais. Flavonas e flavonóis são as duas principais classes de

flavonóides encontradas universalmente na natureza. Os mais comuns flavonóis antioxidantes

são canferol, quercetina e miricetina (HARBORNE; WILLIAMS, 2000).

Os flavonóides são utilizados por botânicos para classificação taxonômica. Eles regulam

o crescimento da planta pela inibição da exocitose da auxina (ácido indol acético), assim como

pela indução da expressão gênica e influenciam outras células em numerosas vias. Flavonóides

inibem o crescimento ou matam muitas cepas bacterianas, inibem importantes enzimas virais

como transcriptase reversa e proteases, bem como destroem alguns protozoários patogênicos.

Todas essas atividades são exercidas com baixa toxicidade em células animais (HAVSTEEN,

2002).

A análise qualitativa e quantitativa de flavonóides comuns em extratos polares de

plantas como, por exemplo, rutina, isoquercitrina, quercetina, catequinas e canferol podem ser

realizadas através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando-se de padrões

destas substâncias. Nesta técnica utiliza-se em geral um detector de ultravioleta.

A rutina, (C) 3-O-rutinosídeo da quercetina, é largamente utilizada em fitoterápicos para

fragilidade capilar prevenindo varizes e derrames de retina. Quercitrina, (B) (3-O-glicosídeo de

quercetina) apresenta atividade antiinflamatória em colite experimental, associada com ação

antioxidante e melhoramento da absorção de água in vivo (SÁNCHEZ et al., 2002). Quercetina,

(A) o principal flavonóide presente em vegetais e frutas, exerce potenciais efeitos

anticarcinogênicos em modelos de animais e culturas de células (SALUCCI, 2002).

A B C

Figura 4: Estruturas químicas de: Quercetina (A); Quercitrina (B); Rutina (C).

Vegetais ricos em compostos fenólicos por serem tradicionalmente consumidos como

alimentos, são considerados seguros, tanto pelos consumidores como pela indústria de

alimentos. Constatação que, no entanto não garante a sua inocuidade, requerendo, portanto

estudos toxicológicos sobre estes compostos fitoquímicos (MELO; GUERRA, 2002).

Atualmente profissionais da área de saúde prescrevem o uso de flavonóides puros para

tratar diversas doenças, devido à sua capacidade, já comprovadas de inibirem enzimas

específicas, estimularem alguns hormônios e neurotransmissores e seqüestrarem radicais livres

(HAVSTEEN, 2002).

Flavonóides também tem resultados positivos no tratamento de doenças gastrícas, mas

esses compostos são pouco estudados em humanos. No entanto estudos mostraram que eles são

capazes de proteger a mucosa gástrica de substâncias necrotizantes e podem ser úteis no

tratamento de úlceras gástricas agudas e crônicas (ZAYACHKIVSKA et al., 2005).

2.3 Considerações botânicas sobre a espécie Byrsonima sericea DC. e suas atividade

biológicas.

Byrsonima sericea da famíla Malpighiaceae, conhecida popularmente como murici da

praia ou murici do brejo, é uma espécie de ampla distribuição geográfica e que ocorre em

ambientes de matas, sendo predominante nas áreas mais ensolaradas. Sua altura média é de 6 a

10 metros. Suas flores são amareladas formando cachos de 1 a 15 centímetros. Seus pequenos

frutos têm gosto ácido, são bacáceos e comestíveis, sendo bastante consumido principalmente

entre as populações de baixa renda. É geralmente encontrada no litoral em uma faixa que se

inicia no Ceará e se estende até o Acre.

Esta planta é utilizada popularmente no tratamento de diabetes e disfunções

gastrointestinas e revelou o melhor poder antioxidante do extrato metanólico das folhas, frente

ao radical livre DPPH entre várias plantas medicinais analisadas por BOSCOLO et al., (2007).

A espécie Byrsonima sericea estudada nesse trabalho apresenta poucos relatos

científicos sobre sua composição química e atividades biológicas (Fig.5).

Figura 5: Galho com

folhas, flores e

frutos de B. sericea.

Fonte: http://www. plantsdatabase.com/pics/Monocromatico_106108

2.4 Potenciais medicinais e constituintes químicos caracterizados das plantas do gênero

Plectranthus

As plantas do gênero Plectranthus têm sido utilizadas pela população principalmente no

tratamento dos distúrbios gástricos. Entretanto outras ações farmacológicas já foram testadas e

comprovadas para a espécie P. barbatus envolvendo compostos isolados de suas folhas, caule e

raízes.

O gênero Plectranthus pertence à família Lamiacea, e abrange 350 espécies distribuídas

nas regiões subtropical e tropical (PASSINHO et al., 2000). Espécies de Plectranthus têm

importância econômica por ser fonte de óleos essenciais e usadas em ornamentação, sendo que

estas espécies são citadas mais freqüentemente para o emprego das suas propriedades

medicinais, nas quais, representa mais de 85% de todas as utilizações (LUKHOBA et al.,

2006).

No Ceará a medicina popular faz uso de 4 espécies de Plectranthus: P. amboinicus

Andr., P. barbatus (Lour) Spreng, P. ornatus e P. grandis. Informações etnofarmacológicas

incluem o uso das folhas de P. barbatus (malva santa, boldo brasileiro), P. grandis (boldo

grande) e P. ornatus (Boldo) para tratamento dos males do fígado e de problemas da digestão.

P. amboinicus (malvarisco) é usado em xaropes caseiros para tratamento da tosse, dor na

garganta e bronquite (MATOS, 2002).

Entre os aspectos farmacológicos estudados e comprovados de P. barbatus (Lour)

Spreng destacam-se: ação hipotensiva, inotrópica positiva, cardiovascular, bronco-dilatadora,

ativação da adelilato ciclase, inibição da agregação de plaquetas, antitumoral, antinociceptivo e

antiinflamatório (COSTA, 2006).

2.4.1 Terpenóides

Os terpenóides formam uma larga família com estruturas bastantes diversas derivadas

das unidades isoprênicas C

. Na sua biossíntese, 3 moléculas de Acetil-CoA formam o ácido

mevalônico

O ácido mevalônico sofre descarboxilação e desidratação para formar isopentenil

pirofosfato que se condensa com dimetilalil pirosfofato para dar origem aos monoterpenos

), sesquiterpenos (15), diterpenos (20) e triterpenos (30) e assim por diante são formados os

outros terpenos.

Os diterpenos são formados pela união de quatro unidades de isopreno e são

encontrados principalmente nas resinas de plantas. Eles se apresentam com estruturas acíclicas

como o fitol, monocíclicas como a vitamina A, bicíclica, esclareol, tricíclica como ácido

abiético que está presente em grandes quantidades na resina de Coníferas e tetracíclico como a

barbatusina (Fig.6).

Estudos mostraram que alguns diterpenos possuem propriedades biológicas importantes

como: atividades espasmolítica e hipotensiva (TANDON et al., 1977), propriedades

cardioativas (BHAT et al., 1977, p. 1669) e atividade antihipertensiva (KELECOM,1983),

dentre outros.

Entre os estudos químicos, merecem destaque aqueles realizados por ZELNIK et al.,

(1977), que analisaram a composição química através do estudo cromatográfico do extrato de

acetona das folhas das folhas de P. barbatus e estabeleceram a estrutura química de três

diterpenos isolados: barbatusina, presente em maior quantidade o 3-β-hidroxi-3-

deoxobarbatusina (Fig.7) e o ciclobutatusina, em menor quantidade.

OAc

OAC

1819

Figura 6: Estrutura da barbatusina

OAc

Figura 7: Estrutura da 3

-hidroxi-3-deoxobarbatusina

2.5 Considerações botânicas sobre a espécie Plectranthus grandis (Cramer) Willense e

suas atividades biológicas.

Plectranthus grandis (Cramer) Willense é popularmente conhecida no Brasil pelas

denominações de boldo-grande ou boldo-da-folha-grande, falsa malva-santa e boldo mexicano.

Dados da literatura P. grandis é um arbusto com até 3 m de altura com folhas maiores

do que 4,7 cm, caule subquadrangular, espesso com pêlos, inflorescência racemosa, racemo

simples, erétil, 26 - 56 cm, pedúnculo rígido, flores com corola maior do que 2,0 cm de

comprimento de coloração azul (Fig.8). Esta espécie é capaz de florescer no Nordeste nas

regiões serranas, litorâneas ou sertão central, no que diferem das outras espécies que necessitam

de clima mais ameno ou temperado como ocorre nas chamadas serras frescas (MATOS, 2002).

Plectrantus grandis, é utilizado largamente pela população no combate a dispepsia.

Embora se utilize popularmente a planta para combater problemas gastrintestinais não existem

dados na literatura científica sobre efeitos farmacológicos de P. grandis. No entanto, essa

espécie possui características morfológicas semelhantes as da Plectranthus barbatus, cujos

extratos são extensivamente estudados no sistema gastrintestinal. As diferenças morfológicas

são pequenas, diferindo principalmente no “amargor” dos talos e folhas da espécie P. grandis

em relação a P. barbatos (MATOS, 2002).

Figura 8: Foto exsicata de Plectranthus grandis Cramer (Willense). Foto gentilmente

fornecida pelo Prof. Francisco José de Abreu Matos

2.6 Fisiologia Gástrica

Anatomicamente, o estômago divide-se em 3 porções: fundo, corpo e antro pilórico;

sendo limitado por 2 sistemas esfincterianos: o esfíncter esofagiano inferior, na parte superior

ou proximal do estômago; e o esfíncter pilórico ou piloro, na parte inferior ou distal do

estômago (HOGBEN et al., 1974).

Funcionalmente, a mucosa gástrica pode ser dividida em duas regiões glandulares: a

mucosa oxíntica e a mucosa antral. A mucosa oxíntica é mais extensa, ocupando o corpo e o

fundo, e é o sítio da secreção de ácido clorídrico. A mucosa oxíntica é formada por glândulas

oxínticas, que são constituídas por células parietais (ou oxínticas), células principais, células

produtoras de somatostatina (células D) e células do tipo enterocromafins (ECL). No colo

glandular, predominam as células produtoras de muco, que protegem a mucosa gástrica da ação

corrosiva das secreções originadas pela glândula (LUCEY;YAMADA, 1989; CHUANG et al.,

1991; SUNDLER et al., 1991). As glândulas da mucosa antral apresentam os mesmos tipos

celulares que as glândulas oxínticas, exceto as células parietais (HOGBEN et al., 1974).

A inervação do estômago compreende fibras extrínsecas e intrínsecas. A inervação

intrínseca é constituída por dois plexos principais, o plexo mioentérico que inerva as camadas

musculares e regula a função motora, e o plexo submucoso que inerva a mucosa e regula a

absorção e as secreções gastrointestinais (SCHUBERT; SHAMBUREK, 1990,). Neurônios de

ambos os plexos recebem aferências do sistema nervoso central através de fibras do sistema

nervoso parassimpático e simpático (inervação extrínseca) e de outros neurônios entéricos,

incluindo neurônios sensoriais e interneurônios. Estes circuitos neuronais regulam as funções

motoras e secretoras do tubo digestivo (COSTA; BROOKES, 1994). A inervação simpática do

trato gastrointestinal é realizada principalmente por fibras pós-ganglionares que inervam

diretamente os vasos sangüíneos e o músculo liso, inibindo a motilidade e a atividade secretora

do sistema gastrointestinal, porém estimula a contração da muscularis mucosae e de alguns

esfíncteres (LONGHURST et al., 1984-a; LONGHURST et al., 1984-b). Em geral, as fibras do

parassimpático terminam nos gânglios do plexo mioentérico. As fibras aferentes do vago

inervam diretamente a célula parietal e realizam sinapses com as células ganglionares do

sistema nervoso entérico (SNE), estimulando a atividade motora e secretora do intestino

(LONGHURST et al., 1984-a; LONGHURST et al., 1984-b).

2.7 Mecanismos de proteção do Estômago

O mecanismo de defesa da mucosa gastrointestinal contra fatores agressores, como o

ácido clorídrico e drogas antiinflamatórias não-esteroidais, consiste principalmente de fatores

funcionais, humorais e neurais. A secreção do muco alcalino, microcirculação da mucosa e

motilidade agem como fatores funcionais, enquanto que prostaglandina e óxido nítrico agem

como fatores humorais e os neurônios sensorais sensíveis à capsaicina agem como fatores

neurais (TSUKIMI; OKABE, 2001; REPETTO; LLESUY, 2002).

2.7.1 Muco / bicarbonato

Fator de proteção da mucosa sendo secretado pelas células mucosas do estômago, atua

como a primeira linha de defesa da mucosa gástrica e a protege de fatores agressores endógenos

e exógenos apresenta-se de forma viscosa, elástica, aderente, como um gel transparente, que

contém 95% de água e 5% de glicoproteínas, recobrindo toda a superfície da mucosa

gastrointestinal. O muco é capaz de agir como antioxidante e reduzir danos na mucosa

promovidos por radicais livres (REPETTO; LLESUY, 2002). O muco também tem um papel

importante na cicatrização das úlceras, acelerando a recuperação da mucosa lesada (MAITY et

al., 2003). Estudo em ratos foi observado uma relação inversa na espessura da camada de muco

e na acidificação intracelular do epitélio gástrico (PHILLIPSON et al., 2002).

O muco gástrico ocorre em 3 formas: a mucina solúvel presente no sucogástrico; o

muco (aderente) insolúvel cobrindo as células da mucosa; e o muco presente nas células

secretoras de muco (MOJZIS et al., 2000).

O bicarbonato é secretado pelas células superficiais do estômago. A proteção da mucosa

do estomago não depende somente do controle da secreção ácida gástrica; precisa juntamente

de uma secreção apropriada de muco e bicarbonato (WALLACE, 2001). A secreção de muco,

como a de bicarbonato, é estimulada por diversos fatores e constituem uma barreira

mucoprotetora (SANIOTO, 1991; KUTCHAI, 1996), que funciona como uma poderosa

proteção da mucosa contra danos induzidos por ácido, pepsina e etanol (WALLACE, 2001).

2.7.2 Fluxo sangüíneo

O suprimento de sangue na mucosa gástrica é um fator importante, determinante para a

integridade da mucosa gástrica. É regulado e modificado por sistemas e fatores metabólicos

locais como prostaglandina, leucotrieno e outros mediadores químicos endógenos na mucosa

(KAWANO; TSUJI, 2000). Um dos papéis do fluxo sanguíneo na mucosa é suprir a mucosa

gástrica com oxigênio, nutrientes e hormônios, além de participar da regulação da saída do

ácido, produção de muco, secreção de bicarbonato, remoção dos produtos e retrodifusão de íons

hidrogênio. Esses eventos contribuem substancialmente para a manutenção fisiológica da

integridade da mucosa (KAWANO; TSUJI, 2000).

2.7.3 Prostaglandina

A prostaglandina produzida pela mucosa gástrica, aumenta na presença de agentes

irritantes, e apresenta um papel citoprotetor importante, inibindo a secreção ácida por reduzir a

produção celular do monofosfato de adenosina (AMP) (BEEJAY; WOLFE, 2000). A enzima

ciclooxigenase (COX) converte o ácido araquidônico em prostaglandina G2 reduzindo este

intermediário a prostaglandina H2 (PGH2). A PGH2 é um metabólito instável que é convertido

em outras espécies de prostaglandinas, incluindo prostaglandina E2, prostaciclina e

tromboxanos (ATAY et al., 2000). Existem pelo menos duas isoformas distintas da COX,

denominadas COX-1 e COX- 2. A COX-1 é expressa constitutivamente na maioria dos tecidos

(PESKAR, 2001) e esta isoforma provavelmente promove a produção de PG protetora da

mucosa gástrica e que possui um papel importante na manutenção da homeostase

(RODRÍGUEZ;TÉLLEZ et al., 2001). Ao contrário, a expressão da COX-2 geralmente é baixa

sob condições basais. O aumento da expressão da COX-2 ocorre em certas condições

patofisiológicas como a inflamação, dano tecidual e transformação maligna (PESKAR, 2001).

A ação protetora das prostaglandinas envolve fluxo sanguíneo, estimulação de muco,

secreção de bicarbonato (HAWKEY, 2000) e aumento da resistência de células epiteliais contra

danos causados por citotoxinas (HAWKEY; RAMPTON, 1985). As funções de vasodilatação e

proteção da mucosa gástrica das prostaglândinas têm sido extensivamente documentadas e

analisadas (GISLASON et al., 1995; WHITTLE; VANE, 1987).

2.7.4 Óxido Nítrico (NO)

Uma variedade de isoformas de óxido nítrico sintase (NOS) tem sido purificada em

diferentes tecidos, e muitas já tiveram seus genes distintos. As isoformas da NOS são

agrupadas em duas categorias, as NOS constitutivas: nNOS (neuronal), e a eNOS (endotelial),

dependente de íons cálcio (Ca

) e calmodulina, que estão envolvidas na sinalização celular, e a

NOS induzível (iNOS), gerada por macrófagos e outras células ativadas por citocinas, cada

uma com capacidade de gerar NO através de mecanismos regulatórios complementares e

distintos. Através dessa via o NO se liga ao grupo heme da guanilato ciclase (GC) que estimula

a enzima a gerar guanosina monofosfato cíclica (GMPc), que por sua vez ativa a proteína

quinase G (PKG), que gera uma corrente de fosforilações conduzindo a funções efetoras

(SHAH et al., 2004). O NO também pode mediar sinalizações independentemente da ativação

da GC, por exemplo, regulando diretamente as funções dos canais iônicos, de enzimas e de

várias outras proteínas (STAMLER et al., 2001).

O óxido nítrico (NO) tem um papel fundamental na perfusão e na regulação vascular

por promover a vasodilatação pela sinalização da célula muscular lisa via GMPc (SHAH et al.,

2004). O principal fluxo sangüíneo para o trato gastrointestinal chega através da veia

mesentérica, e a regulação do fluxo até as arteríolas mesentéricas é um passo importante para a

regulação do fluxo sangüíneo intestinal geral e local (SHAH et al., 2002 p.1688).

A produção constitutiva de NO é importante para manter a barreira protetora da mucosa

gastrointestinal. Esse mecanismo protetor do NO pode ser devido a sua capacidade em

aumentar do fluxo sangüíneo da mucosa e estabilizar a influência dos mastócitos (ALICAN;

KUBES, 1996). Entretanto, o excesso na produção de NO associado com estados inflamatórios

é caracterizado pelo aumento na permeabilidade epitelial e perda da função da barreira de

muco. Assim, os níveis de produção de NO, a isoforma geradora de NO e o estado redox das

células epiteliais podem determinar os efeitos do NO na permeabilidade da mucosa e proteção.

(SHAH et al., 2004).

2.8 Lesão gástrica

As lesões gástricas ocorrem devido a um desequilíbrio entre fatores ofensivos e fatores

defensivos (SAIRAM et al., 2002). O dano é provocado quando a mucosa perde a habilidade de

proteger-se através das secreções de bicarbonato e muco, bem como, de promover uma nova

epitelização (BOOTHE, 1999). A ação tópica de muitos agentes endógenos e exógenos pode

alterar os mecanismos de defesa, aumentando deste modo à permeabilidade da mucosa ao ácido

(TWEDT; MAGNE, 1992). Com o aumento da entrada de ácido, ocorre uma cadeia de eventos,

começando com lesão direta da mucosa e seguindo por destruição da submucosa (LIPTAK et

al., 2001). Os mastócitos na submucosa e lâmina própria degranulam e liberam histamina

quando em contato com o ácido. A histamina liberada estimula a secreção celular parietal de

ácido clorídrico, assim como inflamação local e edema agudo. O ácido pode ainda lesionar

vasos sangüíneos e estimular nervos da parede gástrica, provocando contrações musculares

exacerbadas (TWEDT; MAGNE, 1992).

A reconstituição epitelial é extremamente importante na manutenção da estrutura e

funcionamento da barreira mucosa. A formação dos radicais livres, citocinas inflamatórias e o

estresse fisiopatológico reduzem a taxa de proliferação celular dificultando o processo de

reconstituição das células gástricas. Por outro lado, o epitélio gástrico é recoberto por um

espesso muco que impede a retrodifusão dos íons H

. O rompimento da barreira mucosa pelo

refluxo de bile, uremia, aspirina e outros antiinflamatórios não hormonais aumentam a

permeabilidade da mucosa e permitem a retrodifusão do íon H

, aumentando a acidose tecidual

(BEEJAY; WOLFE, 2000). Alteração no fluxo sangüíneo da mucosa é outro fator de grande

importância na gênese das injúrias gástricas. O fluxo sangüíneo pode ser severamente alterado

por ação de drogas, como o ácido acetil salicílico, etanol e pela entrada de agentes luminais,

como ácido e pepsina (ROBBINS et al., 1998). A cicatrização das lesões fica comprometida

devido à redução do fluxo sangüíneo na mucosa causada por estes agentes (BOOTHE, 1999).

Estudos experimentais têm demonstrado que a geração de radicais livres está associada

à patogênese de lesões gástricas agudas induzidas por etanol que medeia à injúria no tecido

estimulando a peroxidação dos lipídios, danos na membrana celular através da coagulação de

proteínas, lipídios e ácidos nucléicos. As lesões histopatológicas mais evidenciadas são

congestões, edema, hemorragia, erosão e necrose (AL-SHABANAH et al., 2000; LA CASA et

al., 2000).

2.9 Noções Gerais Sobre os Parâmetros Envolvidos nos Processos Oxidativos

2.9.1 Radicais livres e estresse Oxidativo

Na atmosfera terrestre as moléculas de oxigênio são as maiores promotoras de rações

nas células vivas. Exceto os organismos que são adaptados para viverem na ausência de

oxigênio, todos os animais e vegetais necessitam de oxigênio para obtenção de energia

(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985).

Na classificação periódica dos elementos químicos, o oxigênio pertence à família dos

calcogênios (6A), cujo número atômico é 8 e amassa atômica é 16, possuindo 8 elétrons

distribuídos nas suas camadas eletrônicas.

Grande parte do O

absorvido (95%) pelos organismos aeróbicos é reduzido, formando-

se água na cadeia respiratória, através do transporte de elétrons na membrana das mitocôndrias,

também no retículo endoplasmático, onde o sistema enzimático citocromo, no processo de

fosforilação oxidativa, procede a redução tetravalente do O

pelo sistema citocromo oxidase,

fornecendo 4 elétrons e 4H

para o oxigênio, que diretamente se reduz formando água. Como

uma pequena parte do oxigênio

é reduzido univalentemente, ou seja, a molécula recebe somente

1 elétron, que ocupará um dos orbitais externos, ao mesmo tempo em que o outro continua

desemparelhado, produzindo intermediários altamente reativos, que conhecidos como Espécies

Reativas de oxigênio (EROs) formando a primeira espécie tóxica reativa de oxigênio, o

superóxido (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).

Radicais livres são definidos íons como moléculas que têm elétrons desemparelhados.

Eles são geralmente instáveis e muito reativos (FANG et al., 2002). Um elétron

desemparelhado pode se associar com átomos isolados, como íons metálicos e hidrogênio, ou

ainda com moléculas de açúcar, proteínas, lipídeos e também DNA, resultando em um processo

de relevância biológica (SLATER, 1984; HALLIWELL, 1987).

Espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas em animais, inclusive humanos,

sob condições fisiológicas e patológicas. Exemplos de radicais livres oxigenados são

superóxido, hidroxila, radicais peroxil (RO

), alcoxil (RO) e hidroperoxil (HO

) (GULÇIN et

al., 2003, p. 371). Esses radicais livres oxigenados podem ser convertidos a outras espécies

reativas não radicais, como peróxido de hidrogênio (H

), ácido hipoclorídrico (HOCL), ácido

hipobrômico (HOBr) e peroxinitrito (ONOO

). Assim as EROs incluem espécies radicais e não

radicais (FANG et al., 2002). Por sua larga influência nos sistemas biológicos, as EROs têm

despertado significativo interesse por pesquisadores.

O peróxido de hidrogênio, que embora não seja não muito reativa, é capaz de inativar

enzimas, principalmente por oxidação de grupamento tióis essências. Seu maior poder oxidante

é como gerador do radical hidroxila (HO

•

) e pela interação com o radical superóxido (O

2•

sendo este um potente oxidante, podendo levar a morte qualquer célula, sendo fortemente

potencializada sua toxicidade na presença do ferro (EATON, 1991).

Radicais livres oxigenados são constantemente gerados in vivo para propósitos

fisiológicos como, por exemplo, defesa contra microorganismos patogênicos. Em alguns casos

são produzidos em excesso, quando isso acontece ocorre o estresse oxidativo (GUO et al.,

2003). Algumas situações geradoras de estresse oxidativo incluem: ativação de fagócitos

(neutrófilos, macrófagos, monócitos e eosinófilos) por microorganismos, hiperóxia, alguns

xenóbióticos, radiação ionizante, isquemia e exercício físico extenuante (YU, 1994; PEREIRA

et al., 1994). Esses radicais também estão envolvidos em diversas doenças: tumores, diabetes,

infertilidade, gastrite e causam danos oxidativos no DNA, lipídeos e proteínas (CHEN et al.,

2006).

As EROs como já foi mencionado, são formadas a partir do oxigênio, que ao mesmo

tempo que gera e sustenta a vida, pode por outro lado causar danos irreversíveis. Quando

produzidas em excesso são extremamente tóxicas e quando o organismo encontra dificuldades

em neutralizá-las elas se tornam potencialmente perigosas, podendo causar diversas doenças,

evidenciando o dano oxidativo causado por elas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985;

HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).

Uma das principais conseqüências do extresse oxidativo é a peroxidação lipídica

(MCBRIDE et al., 1988). Ela ocorre em ácidos graxos polinsaturados e é iniciada por um

radical OH° que captura um átomo de hidrogênio de um carbono metileno de cadeia polialquil

do ácido graxo. O oxigênio é mais solúvel em um meio apolar que em meio polar, permitindo

que as membranas biológicas tenham uma elavada concentração de O

na região hidrofóbica

medial, onde este tem potencial para realizar o maior dano aos ácidos graxos polinsaturados

existentes na membrana. Desta forma a membrana plasmática se torna a estrutura mais

susceptível a desestruração provocada pela peroxidação lipídica, fazendo com que ela perca a

forma de mosaico fluido, como a flexibilidade e por fim sua função biológica. Assim, um ácido

graxo com um elétron desemparelhado reage com o O

gerando um radical peroxil, produto

altamente reativo e pode se combinar com outros radicais semelhantes, alterando as proteínas

das membranas O malonaldeído é um dos produtos da peroxidação lipídica que é extremamente

reativo, que pode reagir de forma eventual com o grupo amino das proteínas, fosfolipídeos ou

ácidos nucléicos, provocando alterações estruturais nos constituintes celulares (MCBRIDE et

al., 1988).

Os peróxidos de lipídeos atingem alvos mais distantes de maneira mais fácil por

possuirem poder ação antioxidante maior do que outras espécies primárias de O

2.9.2 Defesa antioxidante

Antioxidantes são quaisquer substâncias que, quando presentes em pequenas

concentrações, comparadas com aqueles substratos oxidáveis, significativamente retardam ou

inibem a oxidação deste substrato e podem agir em diferentes níveis da seqüência oxidativa

(HALLIWEL; GUTTERIDGE, 1985).

O oxigênio é um elemento indispensável à vida, e que ao mesmo tempo pode causar

danos ao organismo (HALLIWEL; GUTTERIDGE, 1985). Os agentes que atuam como

antioxidantes não possuem a capacidade de diferenciar as espécies reativas de oxigênio que tem

um papel fisiológico benéfico, daquelas que causam injúrias no organismo. Por esse motivo,

sua ação em alguns casos, pode provocar danos ao invés de ser vantajosa. Sendo assim a

manutenção das defesas antioxidantes químicas e enzimáticas em equilíbrio dinâmico com a

formação de espécies reativas de oxigênio é de extrema importância para sobrevivência dos

organismos, sendo que, um distúrbio poderá ocasionar uma série de processos patológicos

(BAST et al., 1991).

A peroxidação dos lipídios das membranas celulares é apenas um exemplo de lesão

biológica que pode ser promovida pelos radicais livres, uma vez que todas as biomoléculas são

susceptíveis á oxidação (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). Para vencer o desafio dos

radicais livres, os seres aeróbicos desenvolveram uma bateria de mecanismos de proteção

conhecida como defesas antioxidantes.

Os antioxidantes que representam a defesa dos organismos contra as espécies reativas

de oxigênio (EROs) ,e são divididos os dois tipos principais: os enzimáticos e os não

enzimáticos (YU, 1994).

Alguns nutrientes essências podem atacar diretamente as EROs diminuindo a ação

tóxica, produzidas intra e extracelularmente. Dentre muitos antioxidantes naturais existe a

vitamina E, conhecida também com α tocoferol, que é o maior antioxidante lipossolúvel

presente em todas as membranas celulares, varre os radicais livres formados no citocromo P-

450. Os carotenóides, principalmente o β caroteno, podem funcionar como precursores da

vitamina A, atuam diminuindo a formação de oxigênio singleto in vivo, e remove os já

formados, vitamina C com comprovada ação imunoestimulante e o selênio (HALLIWELL;

GUTTERIDGE, 1989).

Ainda existem uma série de outros antioxidantes não enzimáticos que participam da

defesa contra as EROs nos sistemas biológicos como, a ubiquinona, a ceruloplasmina, o ácido

úrico, a taurina, os flavonóides e outros compostos fenólicos de origem vegetal (SIES,1991).

As enzimas superóxido dismutase, (SOD) glutationa peroxidase (GPx) e catalase (CAT)

representam a principal defesa endógena do organismo quando são expostos as EROs .

É possível que a enzima superóxido dismutase (SOD) tenha efeitos anti-envelhecimento

podendo atuar sobre todos os processos degenerativos, tendo um papel fundamental na defesa

do organismo contra as EROs, atuando na remoção do radical superóxido. Existem diferentes

tipos de SOD, dependendo do metal que atua como cofator em seu sítio catalítico (HENDLER,

1990).

A enzima glutationa peroxidase (GPx) foi descoberta por Mills em 1959, em tecidos de

mamíferos, não existindo em plantas ou bactérias, embora possa ser encontrada em algumas

espécies de algas e fungos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1985).

O substrato para o GPx é o tripeptídeo glutationa, encontrada na maioria dos animais,

plantas, e até em algumas bactérias. A enzima cataliza a oxidação da glutationa reduzida (GSH)

a glutadiona oxidada (GSSG), usando o peróxido de hidrogênio. A manutenção de níveis de

GSH ocorre pela ação da enzima da glutadiona redutase (GSSG-R), (Fig.9) novamente na sua

forma reduzida (COHEN; HOCHSTEIN, 1963; PAGLIA; VALENTINE, 1967).

Figura: 9 Reações enzimáticas: Ciclo GSH-GSSG

SOD

GSH

GSH-Px

GSSG

GSSG-R

NADP NADPH

A GPx tem alta atividade no fígado e eritrócitos, enquanto no cérebro, coração, pulmão

sua atividade é moderada e no músculo bastante reduzida (COHEN; HOCHSTEIN, 1963).

A catalase está presente na maioria das células aeróbicas, sendo que em animais se

encontra principalmente no fígado, rins e eritrócitos. Essa enzima deve proteger as células de

grandes quantidades de H

. A atividade da catalase pode ser inibida por superóxido, azida e

ácido cianídrico (HCN) (EATON,1991).

A manutenção das defesas antioxidantes químicas e enzimáticas em equilíbrio dinâmico

com a formação de espécies reativas de oxigênio é de extrema importância para sobrevivência

dos organismos. Assim, os antioxidantes artificiais como os naturais têm um papel importante

por atuar na inibição de radicais livres. A busca por antioxidantes naturais tem sido

intensificada nos últimos anos, devido a danos hepáticos ocasionados pelos antioxidantes

sintéticos, utilizados para preservar alimentos. Vários óleos essenciais e componentes naturais

não voláteis presentes em diferentes espécies vegetais foram identificados como importantes

agentes antioxidantes (LOLINGER, 1991; WENG; WANG, 2000).

2.10 Dados epidemiológicos de úlceras gástricas em animais

Animais de produção estão sujeitos ao estresse, devido ao sistema de confinamento ao

qual são submetidos como também a outros fatores aliados a esse tipo de criação como:

manejo, sazonalidade, disputa por alimento, alta densidade por m

, além de permanecerem em

condições climáticas desconfortáveis, estando sujeitos a doenças de diversas origens.

Um problema crescente nos sistemas intensivos é a ocorrência de úlceras gástricas,

ocorridas principalmente em suínos, sendo relatada em diversas partes do mundo (LIPTAK et

al., 2002). O estudo desse problema se intensificou nos anos 60, já que está associado ao

crescimento crescente da suinocultura intensivo (BLACHSHAW; KELLY, 1980).

A úlcera gástrica é uma doença comum em suínos criados intensivamente e se

caracteriza, inicialmente por erosão seguida de ulceração da mucosa gástrica e hemorrágica,

podendo haver ruptura da parede estomacal. Acredita-se que fatores ambientais, nutricionais e

de manejo que causam estresse aos animais estejam envolvidos na sua etiologia (MARQUES et

al., 1998). Dentre os fatores que tendem a aumentar sua ocorrência em uma granja destacam-se

o confinamento, a superlotação e o fornecimento de rações com granulometria muito fina

(MARQUES et al., 1998).

Úlcera em ruminantes, principalmente de abomaso ocorre em animais de alta produção

e a impactação em animais que recebem forragem muito seca, principalmente capineiras com

alto teor de lignina. A úlcera de abomaso não é freqüente em animais criados semi-

intensivamente ou extensivamente sendo mais freqüente em animais sujeitos ao estresse

(WHITLOCK, 1999b). BORGES et al., (1996) somente observaram úlcera de abomaso em

bovinos criados intensivamente, concluindo que nesse caso possivelmente o estresse induzido

pela escassez de alimento de boa qualidade possa interferir no processo.

As ulcerações gástricas são muito comuns na espécie eqüina. A domesticação desses

animais pode possivelmente ter provocado substanciais efeitos na sua saúde. Inúmeros fatores

justificam o aparecimento de tais alterações digestivas como parte integrante do processo de

domesticação do cavalo. Considerando que o padrão de secreção ácida no cavalo é contínua

durante 24 horas do dia, o confinamento em baias aliado à dieta alimentar, na maior parte dos

centros hípicos, fazendo com que os animais permaneça boa parte do dia em jejum, permitindo

que o ácido gástrico literalmente “corroa” a mucosa do estômago. Além do mais, diversas

outras circunstâncias promovem a elevação dos níveis de secreção ácida, tornando-se fatores

potencialmente ulcerogênicos. Dentre eles podemos citar o exercício físico, estresse em suas

mais diferentes formas, uso abusivo e indiscriminado de antiinflamatórios não esteroidais face

as constantes lesões e contusões inerentes as suas atividades esportivas.

Na espécie eqüina a úlcera assintomática está presente em cerca de metade da

população, tanto em potros como em animais adultos. Essa porcentagem pode chegar até 93%

na raça Puro Sangue Inglês em treinamento de corrida (MURRAY et al., 1996; MURRAY,

1997).

Os fatores acima mencionados, relacionados tanto aos animais de produção intensiva,

quanto aos animais destinados a práticas esportivas, fazem com que estes diminuam a sua

eficiência na produção e a perda do desenvolvimento atlético, respectivamente. Sendo assim,

pesquisas na busca de aditivos que visam melhorar a sanidade animal, são cada vez mais

intensificadas.

Os aditivos são ferramentas utilizadas para o controle dos prejuízos dos estresses

causados pelo manejo e são adicionados intencionalmente às rações com o objetivo de

conservar, intensificar, ou modificar as suas propriedades químicas sem prejuízo ao seu valor

nutritivo.

Os antioxidantes utilizados nas rações podem atuar no organismo do animal como um

todo, protegendo as mucosas da ação de radicais livres, inclusive o epitélio gástrico e intestinal,

promovendo uma melhoria na absorção dos nutrientes e conseqüentemente um maior ganho de

peso. A descoberta de constituintes oriundos de plantas que possam ser utilizados como

aditivos para rações, agindo como subterapêuticos ou fitoterápicos, é de grande importância

para o crescimento da indústria pecuária tanto no sentido econômico como no sentido da saúde

das pessoas que se alimentam da carne desses animais, evitando assim o uso de medicamentos

sintéticos.

Nesse contexto as plantas medicinais têm surgido como uma alternativa tanto para o

tratamento terapêutico de patologias e/ou aditivos (na forma de subterapêuticos) que

acrescentados às rações tem por objetivo modificar o estado de saúde animal, prevenindo-o

contra uma série de doenças que provocam perdas econômicas ao produtor como também uma

melhora na qualidade de vida animal.

3-JUSTIFICATIVA

A utilização de plantas medicinais no combate a doenças vem desde o início da

civilização, e cresce substancialmente nos últimos anos no Brasil, devido ao baixo custo,

facilidade de acesso e sua compatibilidade cultural, principalmente na região Nordeste

(Nogueira et al., 1996).

O uso de espécies vegetais nas pesquisas envolve investigações da medicina tradicional

e popular, o isolamento, a purificação e a caracterização de princípios ativos, relação estrutura/

atividade, bem como a investigação dos efeitos farmacológicos de extratos de plantas e de seus

compostos químicos se faz necessário quando se deseja a produção de um fitoterápico seguro

para uso em humanos ou animais.

Algumas espécies dos gêneros citados têm sido usadas na medicina popular para

tratamento de diversas doenças, entre elas úlceras gástricas. No entanto, existem poucas

pesquisas científicas que comprovem esta atividade nessas espécies. Evidências clínicas e

experimentais sugerem que o estresse oxidativo apresenta um papel fundamental na etiologia

da úlcera gástrica e compostos antioxidantes podem oferecer citoproteção gástrica (Repetto et

al., 2002).

Investigações químicas de outras espécies de Byrsonima mostram a presença de

flavonóides e proantocianidinas, compostos com atividades antioxidantes comprovadas (Béjar

& Malone, 1993). Um grande número de ações farmacológicas envolvendo compostos isolados

de folhas, caule e raízes de Plectranthus barbatus Andr. já foram testados e cientificamente

comprovados. Alguns dos compostos de Plectranthus barbatus também foram isolados das

folhas e caules de Plectranthus grandis, espécie muito utilizada pela população, e até mesmo

confundida com a P. barbatos, por ser muito parecida morfológicamente.

As duas plantas alvos estudadas nesta tese B. sericea e P. grandis, são usadas

popularmente para desordens gástricas. B. sericea teve sua atividade antioxidante comprovada,

e os constituintes químicos de P. barbatus, que são similares aos da P. grandis, também

revelaram atividades biológicas como antiinflamatóriaa e antitumorais.

Sendo assim, tornam-se necessários maiores estudos das plantas para comprovar a

eficiência de seus extratos e compostos puros na gastroproteção, como em modelos

experimentais de indução de úlceras e mecanismos de ação de seus compostos, que permitam

determinar a dose adequada destes produtos para seu uso seguro. Verificando-se também a

inter-relação entre a atividade antioxidante e gastroprotetora.

4-HIPÓTESE CIENTÍFICA

O extrato etanólica de B. sericea e os compostos barbatusina e 3β-hidroxi-3-

deoxibarbatusina isolados de P. grandis apresentam propriedades antioxidantes e

gastroprotetoras.

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral

Investigar a ação gastroprotetora e as possíveis vias envolvidas no mecanismo de ação

dos compostos barbatusina (BB) e 3β-hidroxi-3-deoxibarbatusina (OHBB) isolados de P.

grandis e do extrato etanólico das folhas de B. sericeae, em modelos experimentais de lesão

gástrica em camundongos bem como, a caracterização dos constituintes químicos responsáveis

pelas ações do extrato em estudo.

5.2 Objetivos específicos

1- Preparar o extrato etanólico das folhas da planta Byrsonima sericeae (BSLE); e

fracionar o extrato bruto em coluna filtrante com solventes em ordem crescente de polaridade;

2-Identificar classes de compostos químicos a partir dos extratos da planta;

3-Avaliar as atividades antioxidantes in vitro das frações, usando o método do radical

livre 1,1-Difenil-dipicril-hidrazil (DPPH), selecionando as que possuírem melhor atividade

antioxidante para o estudo;

4- Avaliar a toxicidade aguda do BSLE;

5- Estudar a atividade gastroprotetora do BSLE e das OHBB e BB em modelos de

lesões gátricas por etanol ou indometacina em camundongos;

6- Avaliar a participação do receptor da capsaicina (TRPV1), óxido nítrico, e canais de

potássio ATP-dependentes no mecanismo gastroprotetor das OHBB e BB e do BSLE no

modelo de úlcera induzida por etanol;

7- Verificar a ação do BSLE, e das OHBB e BB sobre a produção dos grupos

sulfidrílicos não-protéicos (NP-SH) gástricos em camundongos;

8- Avaliar a ação do BSLE e das OHBB e BB no nível de peroxidação lipídica, através

da dosagem de malonildealdeído na mucosa gástrica no modelo de lesão gástrica induzida por

etanol;

9- Avaliar a atividade das enzimas catalase, superóxido desmutase, nos estômagos dos

animais tratados com o BSLE e a OHBB e BB no modelo de lesão gástrica induzida por etanol;

10- Avaliar a influência do BSLE das OHBB e BB através da produção de muco

gástrico em estômagos de camundongos no modelo de lesão gástrica induzida por etanol;

11- Avaliar a influência e do BSLE e as OHBB e BB sobre o trânsito intestinal em

camundongos;

CAPÍTULO 1

Atividade Antioxidante e Gastro-Protetora de Produtos Naturais em Animais

Experimentais

Evaluation of antioxidant activity and gastric protection of natural products in

experimental animals

Periódico: Revista Brasileira de Plantas Medicinais - Aceito para publicação em

20/03/2008.

Atividade Antioxidante e Gastro-Protetora de Produtos Naturais em

Animais Experimentais

Rodrigues, P.A.

; Morais, S.M.

;

Marques, M.M.M.

; Aguiar, L.A.

; Nunes-Pinheiro,

D.C.S.

Universidade Estadual do Ceará - Laboratório de Produtos Naturais, Av. Paranjana 1700, CEP

60.740-903, Itaperi, Fortaleza-Ce;

Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de

Bioquímica e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária.

*Correspondência: [email protected]

RESUMO: Nas condições fisiológicas, durante a redução do oxigênio molecular, espécies

reativas de oxigênio são formadas, para a própria defesa do organismo, no entanto quando em

excesso estes radicais livres devem ser eliminados, pois podem afetar muitas moléculas

biológicas, implicando em várias doenças, tanto no homem como em animais. Assim, o uso de

produtos naturais como antioxidantes e protetores gástricos, sobretudo aqueles de baixa

toxicidade e baixo preço, vem sendo pesquisados e utilizados de forma alternativa com bons

resultados em tratamentos curativos e como aditivos de ração. Dentre várias espécies vegetais

brasileiras com efeitos gastroprotetores comprovados estão a Byrsonima crassa, Plectranthus

barbatus, Plectranthus amboinicus e Campomasia xanthocarpa. Um importante uso das

plantas medicinais ainda pouco explorado é na medicina preventiva veterinária contra uma

série de doenças que afetam tanto animais de produção, devido ao estresse do confinamento e

manejo como animais de uma forma geral. Tendo em vista vários estudos que demonstram os

produtos naturais agindo como antioxidantes e gastroprotetores não tóxicos, esta revisão tem

como objetivo mostrar o papel dos radicais livres relacionados com formação das lesões

gástricas bem como os principais modelos experimentais de avaliação de úlceras e a

importância dos antioxidantes naturais na prevenção dessas lesões, discutindo sobre as

estratégias de defesas do organismo contra a formação de radicais livres.

Palavras-chave: produtos naturais, antioxidantes, gastroprotetor

ABSTRACT: Evaluation of Antioxidant Activity and Gastric Protection of Natural

Products in Experimental Animals. In the physiological conditions, during the reduction of

the molecular oxygen, reactive oxygen species are formed to be used in organism defense,

nevertheless in excess these free radicals must be eliminated because can cause damages in

many biological molecules, related to some diseases, either in man as in animals. Thus, the use

of natural products which present antioxidant and gastric protection, mainly those with low

toxicity and low price, have been studied and used as alternative forms with good results in

healing treatment and as additive in the ration. Byrsonima crassa, Plectranthus barbatus,

Plectranthus amboinicus and Campomasia xanthocarpa are examples of Brazilian medicinal

plants with gastroprotective action. The use of medicinal plants in preventive medicine

veterinary is important nevertheless there are few studies for improving the animal health

preventing against a series of diseases that affect animal of production, submitted to stress

caused by confinement and handling, as well as common animals. In view of several studies

about natural products, acting as antiradical and in gastric protection without toxicity, the

objective of this revision is to show the role of free radicals in the formation of gastric lesions

as well as the main experimental models of ulcer evaluation and the importance of natural

antioxidants in the prevention of these injuries, and discussing the strategies of organism

defenses against the formation of free radicals.

Keywords: natural products, antioxidants, gastric protection

INTRODUÇÃO

A grandeza da biodiversidade brasileira não é conhecida com precisão tal a sua

complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de espécies distintas de

plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal

do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre

350.000 e 550.000 espécies (Dias, 1996).

As plantas medicinais usadas tradicionalmente constituem fontes potenciais de novas

substâncias ativas, no entanto, existe uma necessidade de validação através de pesquisas

científicas que utilizem modelos adequados de experimentação para comprovação dos efeitos

farmacológicos e, em seguida, proceder ao isolamento, purificação e caracterização de

princípios ativos e mecanismo de ação para a formulação de fitoterápicos seguros para uso

humano e/ou animal. O estudo da dose, concentração e via de administração também são

essenciais.

Animais que são mantidos em cativeiros, bem como animais de produção, sofrem um

estresse considerável devido às condições artificializadas a que são submetidos. Outros fatores

como sazonalidade, manejo, localização geográfica e período de abate são fatores geradores de

estresse, sendo assim fonte de influência na prevalência de úlceras gastroesofágicas.

A fitoterapia poderia ser mais amplamente aplicada na medicina veterinária preventiva

ou em conjunto com a medicina convencional. Dentro deste contexto, esta revisão focaliza o

uso de plantas ou compostos químicos derivados de plantas, que possuam comprovada

atividade antioxidante e/ou gastroprotetora com potencial uso veterinário, mostrando sua

viabilidade e reforçando suas vantagens sob o aspecto de cura, e até mesmo financeiras.

1. Radicais Livres - Estresse Oxidativo- Defesa Antioxidante

Radicais livres são definidos como moléculas que têm elétrons desemparelhados na

órbita externa. Eles são geralmente instáveis e muito reativos (Fang et al., 2002). Espécies

reativas de oxigênio (EROs) são produzidas em animais inclusive humanos, sob condições

fisiológicas e patológicas. Radicais livres oxigenados podem ser convertidos a outras espécies

reativas não radicais, como peróxido de hidrogênio (H

), ácido hipoclorídrico (HOCL), ácido

hipobrômico (HOBr) e peroxinitrito (ONOO

/ONOOH). Assim as EROs incluem espécies

radicais e não radicais (Fang et al., 2002). Por sua larga influência nos sistemas biológicos, as

EROs têm despertado o interesse dos pesquisadores, que buscam evitar sua formação.

Radicais livres oxigenados são constantemente gerados in vivo para propósitos

fisiológicos como, por exemplo, defesa contra microorganismos patogênicos. Em alguns casos

são produzidos em excesso, quando isso acontece ocorre o estresse oxidativo. Algumas

situações geradoras de estresse oxidativo incluem: ativação de fagócitos (neutrófilos,

macrófagos, monócitos e eosinófilos) por microorganismos, hiperóxia, alguns xenobióticos,

radiação ionizante, isquemia e exercício físico extenuante (Yu, 1994; Pereira et al., 1994).

Esses radicais também estão envolvidos em diversas doenças: tumores, diabetes, infertilidade,

gastrite e causam danos oxidativos no DNA, lipídeos e proteínas (Chen et al., 2006).

A peroxidação dos lipídios das membranas celulares é apenas um exemplo de lesão que

pode ser promovida pelos radicais livres, uma vez que todas as biomoléculas são susceptíveis a

oxidação (Halliwell & Gutteridge, 1984). Para vencer o desafio dos radicais livres, os seres

aeróbicos desenvolveram mecanismos de proteção conhecidos como defesas antioxidantes, que

podem ser compostos químicos e enzimáticos. No primeiro caso, várias moléculas com

propriedades antioxidantes consumidas na dieta como o α-tocoferol (vitamina E), β-caroteno,

selênio, ácido ascórbico (vitamina C), glutationa reduzida (GSH) diminuem a ação tóxica das

espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas intra e extracelularmente. No segundo caso,

quando são expostos as EROs os organismos sintetizam proteínas (enzimas) antioxidantes

como as superóxido dismutases, catalase e glutationa peroxidase (Yu, 1994).

A manutenção das defesas antioxidantes químicas e enzimáticas em equilíbrio dinâmico

com a formação de espécies reativas de oxigênio é de extrema importância para sobrevivência

dos organismos. Assim os antioxidantes artificiais como os naturais têm um papel importante

por atuarem na inibição dos radicais livres formados. A busca por antioxidantes naturais nos

produtos vegetais tem sido intensificada nos últimos anos, por constituírem fontes naturais

destas substâncias como a vitamina C, E, β-caroteno, fenóis e flavonóides. Vários óleos

essenciais e componentes não voláteis presentes em diferentes espécies vegetais foram

identificados como importantes agentes antioxidantes (Loliger, 1991; Weng & Wang, 2000).

2. Plantas e compostos químicos naturais com atividade antioxidante

O interesse pelos antioxidantes naturais teve início nos anos 80 mediante a

comprovação de danos causados por doses elevadas de antioxidantes sintéticos usados nos

alimentos como BHT (butil-hihroxitolueno), BHA (butil-hidroxianisol) e (t-butil-hidroquinona)

sobre o fígado (Duran & Padilha, 1993).

Phyllanthus niruri, uma planta tipicamente nordestina, comumente conhecida como

quebra-pedra é usada popularmente para eliminação de cálculos nos rins. Estudos

demonstraram que extratos metanólicos e aquosos de folhas e frutos dessa espécie mostraram

inibição da peroxidação lipídica da membrana celular, seqüestrando radicais livres frente ao

DPPH e inibindo espécies reativas de oxigênio in vitro. A atividade antioxidante in vivo dos

extratos foi verificada pela inibição da peroxidação lipídica, induzida pelo tetracloreto de

carbono no fígado dos ratos (Harish & Shivanandappa, 2006).

Alcalóides da planta Aconitum laeve Royle foram isolados e estudados. Tais compostos

demonstraram atividade antioxidante que foi verificada, calculando-se o percentual da atividade

sequestrante de radicais livres frente ao DPPH (Shaheen et al., 2005).

O extrato da casca de Uncaria tomentosa Willd. ex Roem. & Schult. DC. conhecida

como unha-de-gato, planta medicinal muito popular no Peru evidenciou a capacidade de

capturar radicais peroxil e superóxido e quantificação do total de taninos e compostos fenólicos

totais. De acordo com os pesquisadores resultados sugerem que o extrato alcoólico tem alto

potencial medicinal (Pilarski et al., 2005).

A análise da atividade antioxidante do fruto de Schinus terebenthifolius Raddi foi

calculada pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico dos extratos alcoólicos e aquosos. A planta

conhecida popularmente com aroeira do sertão é originária da América do Sul, especialmente

do Brasil, possui um bom poder antioxidante em ambos os extratos, quando comparada aos

poderes antioxidantes do BHT e BHA, antioxidantes sintéticos comumente usados. Esta planta

é conhecida como tendo elevado teor de taninos (Degáspari et al., 2004).

Diferentes componentes químicos são encontrados nas plantas G. inodorum, P.

sarmentosum e M. arvenses como vitamina C, vitamina E, carotenos, xantofilas, taninos e

outros compostos fenólicos, sendo estes relacionados com elevados índices antioxidantes. Os

resultados sugerem que a atividade antioxidante dessas espécies pode ser atribuída à presença

desses compostos químicos, principalmente vitamina E e xantofilas. Essas plantas são

consideradas boas fontes de antioxidantes naturais (Chanwitheesuk et al., 2005).

Compostos fitoquímicos que apresentam em sua estrutura um anel aromático com uma

ou mais hidroxilas recebem a denominação de compostos fenólicos e, geralmente apresentam

propriedade antioxidante. Dentre eles desatacam-se os flavonóides, os ácidos fenólicos e o

tocoferol como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural (Melo & Guerra,

2002).

Os flavonóides atuam como antioxidantes primários reagindo com os radicais livres, e

também como quelantes de metais. Flavonas e flavonóis são as duas principais classes de

flavonóides encontradas universalmente na natureza. Os mais comuns flavonóis antioxidantes

são canferol, quercetina e miricetina (Harborne & Williams, 2000). A figura abaixo mostra as

estruturas de flavonóides antioxidantes.

FIGURA 1. Flavonóides com atividade antioxidante

Os principais componentes químicos presentes nas folhas da alcachofra, Cynara

scolymus, são os ácidos fenólicos, flavonóides e sesquiterpenos. A cinarina (ácido

monocafeioilquínico) é relatada como princípio ativo antioxidante da planta (Noldin et al.,

2003). Vários estudos biológicos com extratos brutos e purificados de alcachofra, realizados

tanto em animais quanto em humanos, demonstraram atividades antioxidantes.

O extrato etanólico das folhas de Nectandra grandiflora, planta existente na mata

Atlântica do Brasil, mostrou atividade antioxidante no teste com o β-caroteno. O fracionamento

do extrato resultou no isolamento de dois flavonóides glicosilados 3-O-β-ramnosilcanferol e 3-

O-β-ramnosilquercetina os quais exibiram atividade seqüestradora de radicais livres frente ao

DDPH, maiores quando comparados aos antioxidantes conhecidos como a rutina e o BHT

(Ribeiro et al., 2005).

Os ácidos fenólicos são importantes agentes antioxidantes encontrados freqüentemente

nas plantas na forma de ésteres, como também podem existir na forma de glicídios livres ou

ligados a proteínas e raramente como ácidos livres. No grupo dos ácidos hidroxibenzóicos

(compostos que possuem grupo carboxílico ligado ao anel aromático) destacam-se

protacateucuíco, vanílico, siríngico, gentísico, salisílico, elágico e gálico (Harborne &

Williams, 2000).

Vegetais ricos em compostos fenólicos por serem tradicionalmente consumidos como

alimentos, são considerados seguros, tanto pelos consumidores como pela indústria de

alimentos. Constatação que, no entanto não garante a sua inocuidade, requerendo, portanto

estudos toxicológicos sobre estes compostos fitoquímicos (Melo & Guerra, 2002).

= OH, R

= H, Quercetina

= O-ramnose, R

= H, Quercitrina

= O-glicose, R

= H, Isoquercitrina

= O-rutinose, R

= H, Rutina

= H, Luteolina

R = OH, Canferol

R = H, Apigenina

3. Lesão gástrica x Gastroproteção

As lesões gástricas ocorrem devido a um desequilíbrio entre fatores ofensivos e fatores

defensivos (Sairam et al., 2002). O dano é provocado quando a mucosa perde a habilidade de

proteger-se através das secreções de bicarbonato e muco, bem como, de promover uma nova

epitelização (Boothe, 1999). A difusão de retorno do ácido luminal para a mucosa é crucial na

patogênese da lesão. A ação tópica de muitos agentes endógenos e exógenos pode alterar os

mecanismos de defesa, aumentando deste modo à permeabilidade da mucosa ao ácido (Twedt

& Magne, 1992). Com o aumento da entrada de ácido, ocorre uma cadeia de eventos,

começando com lesão direta da mucosa e seguindo por destruição da submucosa (Liptak et al.,

2002). Os mastócitos na submucosa e lâmina própria desgranulam e liberam histamina quando

em contato com o ácido. A histamina liberada estimula a secreção celular parietal de ácido

clorídrico, assim como inflamação local e edema agudo. O ácido pode ainda lesionar vasos

sangüíneos e estimular nervos da parede gástrica, provocando contrações musculares

exacerbadas (Twedt & Magne, 1992).

A reconstituição epitelial é extremamente importante na manutenção da estrutura e

funcionamento da barreira mucosa. A formação dos radicais livres, as citocinas inflamatórias e

o estresse fisiopatológico reduzem a taxa de proliferação celular dificultando o processo de

reconstituição das células gástricas. Por outro lado, o epitélio gástrico é recoberto por um

espesso muco que impede a retrodifusão dos íons H

. O rompimento da barreira mucosa pelo

refluxo de bile, uremia, aspirina e outros antiinflamatórios não esteroidais aumentam a

permeabilidade da mucosa e permitem a retrodifusão do íon H

, aumentando a acidose tecidual

(Beejay & Wolfe, 2000). Alteração no fluxo sangüíneo da mucosa é outro fator de grande

importância na gênese das injúrias gástricas. O fluxo sangüíneo pode ser severamente alterado

por ação de drogas, como o ácido acetil salicílico, etanol e pela entrada de agentes luminais,

como ácido e pepsina (Robbins, 1998). A cicatrização das lesões fica comprometida devido à

redução do fluxo sangüíneo na mucosa causada por estes agentes (Boothe, 1999).

Outro fator envolvido na lesão gástrica é o refluxo do conteúdo duodenal que ocorre

levando a exposição da mucosa à pepsina e aos ácidos biliares, destruindo a barreira mucosa e

provocando a formação dos radicais livres que levam a lesão oxidativa da mucosa e

rompimento microvascular pela ativação do fator anti-plaquetário, do fator de necrose tumoral

(α-TNF) e das interleucinas (Beejay & Wolfe, 2000).

Úlceras provocadas por estresse são devido a fatores psicológicos e fisiológicos (Miller,

1987). O estresse induz a peroxidação lipídica a partir do aumento dos níveis de peroxidase

lipídica. A conseqüência desse processo é o aumento da geração de espécies reativas de

oxigênio ocasionando, conseqüentemente, dano oxidativo que é o fator comum na patogenia

clínica de úlcera (Goel, 1991; Sairam et al., 2002).

Espécies reativas de oxigênio EROs têm mostrado exercer um papel crítico no processo

ulcerôgenico (Das et al., 1997). O papel das EROs no desenvolvimento da patogênese da lesão

experimental gástrica aguda induzida por estresse, etanol e drogas anti-inflamatórias não

esteroidais é bem documentada (Das et al., 1997; Isenberg et al., 1995).

Estudos experimentais têm demonstrado que a geração de radicais livres está associada à

patogênese de lesões gástricas agudas induzidas por etanol. Os radicais livres medeiam à injúria

no tecido estimulando a peroxidação dos lipídios, provocando danos na membrana celular

através da coagulação de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos. As lesões histopatológicas mais

evidenciadas são congestões, edema, hemorragia, erosão e necrose (Al-Shabanah et al., 2000;

La Casa et al., 2000). Em condições fisiológicas de equilíbrio, a concentração do íon (H

) no

lúmen é muitas vezes maior do que na lâmina própria, e ocorrem alguns mecanismos que

evitam a difusão da volta do íon para os tecidos ao redor. Um deles é a resistência elétrica da

membrana celular apical e os complexos juncionais da área glandular gástrica própria que são

extremamente altos. A resistência mais o potencial elétrico negativo do lúmen restringem o

movimento passivo do íon H

Outro mecanismo utilizado pelo organismo é secreção de muco pelas células

superficiais e colo gástrico em resposta a Ach (acetilcolina) e estimulação mecânica para

formação de uma camada adjacente á mucosa. Outra maneira são os íons bicarbonato que são

secretados pela superfície epitelial e se tornam retidos no gel mucoso. A barreira epitelial

gástrica composta por fosfolipídeos ativos, lipoproteínas, da membrana celular também

previnem o retorno por difusão do íon H+ (Boothe, 1999).

Outros mecanismos de defesas que previnem e reparam os danos da mucosa gástrica são

os fluxos sanguíneos da mucosa que promovem o fornecimento de nutrientes e oxigênio para as

células, removendo os íons H

que penetram na barreira, por replicação das células epiteliais da

mucosa e a produção de citoprotetores (Boothe, 1999).

A prostaglandina um produto do metabolismo do ácido araquidônico é produzida pela

mucosa gástrica, aumenta na presença de agentes irritantes, e apresenta um papel citoprotetor

importante, inibindo a secreção ácida por reduzir a produção celular do monofosfato de

adenosina (AMP) (Beejay & Wolfe, 2000).

4. Plantas medicinais e compostos químicos com atividade gastroprotetora

Muitas espécies vegetais são utilizadas na medicina popular, principalmente no

Nordeste brasileiro, por apresentar ação antiácida e antiulcerogênica. Porém, o uso e a

comercialização dessas espécies vegetais têm precedido à avaliação farmacológica e

toxicológica (Alkofahi & Atta, 1999).

As atividades antiulcerogênicas de várias plantas vêm sendo estudadas. A espécie

Maytenus truncata Reiss é uma planta nativa da Bahia, conhecida como “espinheira santa”.

Suas folhas são usadas popularmente na forma de chá para tratamento de úlcera gástrica.

Experimentalmente a administração de extratos brutos reduziu a severidade de úlcera gástrica

induzida pelo estresse ao frio em ratos, com resultados mais significativos para o extrato

metanólico (Silva et al., 2005).

Segundo Markman et al., (2004) a Campomasia xanthocarpa, conhecida no Brasil por

“gabiroba”, é usada no tratamento preventivo de doenças gástricas. A administração oral do

extrato hidroalcoólico das folhas (400mg/kg) mostrou ser efetiva na prevenção de úlcera

gástrica, em ratos, não produzindo efeito tóxico em doses superiores a 5 mg/kg.

Resultados experimentais de extrato clorofórmico de Tanacetum larvatum administrado

em ratos na dose de 50mg/kg, mostraram ter um feito promissor no tratamento de doenças

inflamatórias e também efeito gastroprotetor (Petrovic et al., 2003).

Os efeitos adversos de drogas sintéticas usadas nos tratamentos de úlceras têm

estimulado pesquisas que visam ao isolamento de princípios ativos diferentes, obtidos a partir

de plantas medicinais (Alkofahi & Atta, 1999; Gonzalez et al., 2000). A atividade

gastroprotetora das plantas medicinais pode ser atribuída a diversos compostos químicos

isolados de muitas espécies vegetais como flavonóides, esteróides, terpenóides e as saponinas

sendo alguns exemplos de substâncias químicas que apresentam atividade protetora da mucosa

gástrica (Souccar, 2002).

Estudos demonstraram que os alcalóides pirrolizidínicos senecionina, integerrimina,

retrorsina, usaramina e sencifilina extraídos de folhas e de inflorescências de Senecio

brasiliensis, conhecida popularmente no Sul e Sudeste do Brasil por “Flor das almas”,

“Margaridinha” ou Maria-Mole, tiveram efeito significativo no tratamento de doenças

ulcerogênicas em modelo selecionado de úlcera, confirmando assim sua utilização popular no

tratamento de dores no estômago (Toma et al., 2004).

A Byrsonima crassa Niedenzu (Malpigheaceae), planta utilizada na medicina popular

no Brasil para tratar a maior parte de doenças relacionadas ao aparelho digestivo, teve seu

efeito gastrotroprotetor comprovado em modelo experimental de úlcera induzida pela

associação de ácido clorídrico e etanol a partir de extratos hidrometanólico, metanólico e

clorofórmico de suas folhas. Essa planta contém compostos fenólicos como quercetina e

catequina, que podem explicar o efeito ulceratogênico nestes extratos (Sannorniya et al., 2005).

Solução hidro-alcoólica de aroeira do sertão (Astronium urundeuva (Allemão) Engl.)

vem sendo usada pela população nordestina no tratamento de problemas gástricos como úlcera

e gastrite. Estudos de Rao et al. (1987) demonstraram sua ação anti-ulcerogênica.

Desordens do sistema digestivo são tratadas usando várias espécies de Plectranthus.

Algumas espécies são usadas para tratar dor de estômago, náusea, vômitos, diarréia, infecções

da boca e de garganta e também como purgantes, carminativos e como anti-helminticos. As

espécies mais freqüentemente usadas são Plectranthus barbatus e Plectranthus amboinicus

para tratar uma larga variedade de problemas digestivos. Por exemplo, Plectranthus barbatus é

usado para o tratamento de dor de estômago e como um purgante (Lukhoba et al., 2006).

Recentemente foi descrita a inibição da enzima gástrica H

-ATPase pela plectrinona A, um

diterpenóide isolado de Plectranthus barbatus Andrews (Schultz et al., 2006).

Muitas plantas têm demonstrado atividade de proteção gastrointestinal, mas o

mecanismo gastroprotetor envolvido até hoje continua, na maioria das espécies estudadas, uma

incógnita.

5. Modelos de lesão gástrica para a avaliação da atividade gastroprotetora de plantas

Os modelos experimentais de indução de lesões gástricas atuam por diferentes

mecanismos ulceratogênicos e representam o primeiro passo para determinar os possíveis

mecanismos de ação envolvidos na atividade gastroprotetora de substâncias ou plantas

medicinais (Hiruma-Lima et al., 2000).

A atividade anti-úlcera de uma substância desconhecida pode ser determinada em

animais experimentais frente a três modelos agudos: indução de lesões gástricas por

medicamentos (ácido acetilsalicílico ou indometacina), indução de lesões gástricas por estresse,

ou indução de lesões gástricas por etanol. Tais modelos são os mais utilizados porque

representam os agentes etiológicos mais comuns envolvidos na patologia das úlceras gástricas.

No entanto a importância das lesões agudas na espécie humana é pequena comparada às lesões

crônicas rescidivantes. É importante verificar, portanto, a atividade da droga em um modelo

crônico como das lesões gástricas induzidas por ácido acético (Lapa et al., 1999).

6. Produtos naturais com atividade antioxidante x atividade gastroprotetora

Na medicina tradicional, várias plantas e ervas têm sido usadas no tratamento de

desordens gastrointestinais incluindo gastrites e úlceras pépticas (Singh & Majumbar, 1999).

Usnea longíssima empregada no tratamento de úlceras na medicina popular de várias cidades

do mundo é conhecida devido a sua atividade antiulcerogênica e antioxidante. O efeito

antiulcerogênico do extrato aquoso obtido da espécie Usnea longíssima foi investigado usando-

se o modelo de úlcera induzido por indometacina, em ratos, onde se observou efeito protetor

contra úlceras, ao quais seus autores atribuíram ao potencial antioxidante da mesma (Halici et

al., 2005).

Rhizophora mangle é amplamente utilizada na medicina popular do Caribe, devido a

mesma possuir atividades antisépticas, antifúngicas dentre outras. Estudos evidenciaram efeito

gastroprotetor em úlceras experimentais induzida por diclofenaco quando comparado com

inibidor da bomba de prótons (omeprasol). O extrato da planta foi administrado por via oral

(gavage) e depois utlilizado o diclofenaco. O pré-tratamento com o extrato resultou numa

significativa diminuição nas áreas ulceradas. O estudo sugere que Rhizophora mangle induz a

recuperação dos níveis da protaglandina, na qual é depletado pelo diclofenaco. Esses resultados

sugerem que o efeito gastroprotetor da planta nesse modelo de úlcera experimental, aparece

através da dose dependente de prostaglandina e a atividade antioxidante (Berenguer et al.,

2005).

Bafna & Balaraman (2005) atribuíram à substância pepticare, originada de plantas tais como

Glycyrrhiza glabra, Emblica officinalis e Tinospora cordifolia o efeito cicatrizante de úlceras e

as relacionam possivelmente a sua atividade antioxidante.

Segundo Hodek et al., (2002) as propriedades antioxidantes de flavonóides e taninos são

relacionados com suas atividades antiulcerogênicas.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os animais que são mantidos em áreas de altas concentrações demográficas por m

acarretando competição por espaço, alimento e água, além de permanecerem em condições

climáticas desconfortáveis, estão sujeitos a doenças de diversas origens. O uso de plantas como

fitoterápicos em animais de produção sujeitos ao estresse, devido ao sistema intensivo de

criação, poderia acarretar benefícios ainda não explorados.

Os usos de aditivos antioxidantes podem atuar no organismo como um todo, protegendo

as mucosas da ação de radicais livres, inclusive o epitélio gástrico e intestinal protegendo assim

as mucosas, promovendo uma melhoria na absorção dos nutrientes e conseqüentemente um

maior ganho de peso. A descoberta de constituintes oriundas de plantas que possam ser

utilizados como aditivos para rações ou fitoterápicos, é de grande importância para o

crescimento da indústria pecuária tanto no sentido econômico como no sentido de saúde das

pessoas que se alimentam da carne desses animais, evitando assim o uso de medicamentos

sintéticos. Nesse contexto as plantas medicinais têm surgido como uma alternativa tanto para o

tratamento de patologias e/ou aditivos que são adicionados ás rações com o objetivo de

modificar o estado de saúde animal, prevenindo-os contra uma série de doenças que provocam

perdas econômicas ao produtor como também uma melhora na qualidade de vida animal.

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CAPÍTULO 2

Efeito Gastroprotetor do extrato das folhas de Byrsonima sericea DC. contra lesões

gástricas induzidas por etanol: potenciais mecanismos

Gastroprotective effect of Byrsonima sericea DC. leaf extract against ethanol-induced

gastric injury: potential mechanisms

Periódico: Phytomedicine

International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology

Submetido em outubro de 2008

Gastroprotective effect of Byrsonima sericea DC. leaf extract against ethanol-

induced gastric injury: potential mechanisms

P. de A. Rodrigues

, S. M. Morais

a,b*

, C. M. de Souza

, L. A. Aguiar

, D. V. Magalhães

, Í. G.

P. Vieira

, G. M. de Andrade

, V. S. Rao

, F. A. Santos

Pos Graduate Program of Veterinary Sciences, Veterinary Faculty, State University of Ceará,

60740-000, Fortaleza, CE, Brazil

Natural Products Chemistry Laboratory, Technology Center, State University of Ceará,

60740-000, Fortaleza, CE, Brazil

Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal University of

Ceará, P.O. Box-3157, 60430-270, Fortaleza, CE, Brazil

*Corresponding author:

Rua Ana Bilhar N

601, Apto. 400, Meireles, CEP 60160-110, Fortaleza, Ceará, Brazil

Fax: + 55- 85- 3242-2793, E-mail address: [email protected]r

Resumo

Folhas de Byrsonima sericea (Malpighiaceae) são largamente utilizados na medicina popular

contra doenças gástricas. Este estudo investigou atividade do potencial gastroprotetor do

extrato etanólico das folhas de B. sericea (BSLE) com possível mecanismo de ação usando o

modelo de úlcera gástrica induzida por etanol absoluto (0,2 mL / animal, p.o.) em

camundongos. Análises fitoquímicas foram realizadas para identificar os componentes ativos

presentes no extrato. BSLE em doses orais de 125, 250, 500 e 1000 mg / kg atenuaram

significadamente lesões gástricas provocadas pelo etanol, inibindo 53,2, 86,5, 80,8 e 90,2%,

respectivamente. O extrato da planta (250 mg / kg) foi capaz diminuir significativamente o

dano induzido pelo etanol, e restaurar as atividades gástricas da superóxido desmutase (SOD) e

catalase (CAT), diminuir a depleção de muco gástrico e dos grupos sulfidrílicos-não-protéico

(NP-SH/GSH) e impedir o aumento de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

promovidas pelo etanol absoluto, sugerindo um mecanismo antioxidante no efeito

gastroprotetor. O pré-tratamento com o antagonista dos receptoes TRPV1 capsazepina,

bloqueou o efeito gastroprotetor de BSLE. O efeito do BSLE (250 mg / kg)no dano produzido

pelo etanol foi significativamente reduzido em camundongospré-tratados com capsazepina, L-

NAME, ou glibenclamida, os respectivos bloqueadores / potenciais inibidores dos receptores

vaniloide 1 (TRPV1), da óxido nítrico sintetase e ativadores dos canais de potássio dependentes

de ATP. Investigações fitoquímicas do BSLE revelaram a presença de flavonóides, quercetina;

isoquercetrina; rutina e kaempferol 3-O-rutinosideo, substâncias conhecidas pelas suas

propriedades antioxidantes e gastroprotetora. Estes resultados em conjunto permitem concluir

que BSLE oferece gastroproteção, por meio de vários mecanismos, que pode ser útil na

disfunção associada a patologias gástricas.

Palavras chave :Byrsonima sericea; Gastroproteção; Etanol; Antioxidante; Óxido níitrico;

Canais de

ATP

Abstract

Byrsonima sericea (Malpighiaceae) leaves are extensively used in folk medicine against gastric

ailments. This study investigated the B. sericea leaf ethanolic extract (BSLE) for potential

gastroprotective activity with the possible mechanism using the absolute ethanol (0.2

mL/animal, p.o.)-induced gastric mucosal damage in mice as a model system. Phytochemical

analysis was carried out to identify the active constituents present in the extract. BSLE at oral

doses of 125, 250, 500 and 1000 mg/kg markedly attenuated the ethanol-evoked gastric lesions

by 53.2, 86.5, 80.8 and 90.2 %, respectively. The plant extract (250 mg/kg) was able to

significantly restore the ethanol-induced decreases in the activities of gastric superoxide

desmutase (SOD) and catalase (CAT), and diminish the depletion of gastric mucus, non-

protein-sulfhydrils (NP-SH/GSH) and the increase in thiobarbituric acid

eactive species

(TBARS) promoted by absolute ethanol, suggesting an antioxidant mechanism in its

gastroprotective effect. The pretreatment with TRPV1 antagonist capsazepine blocked the

gastroprotective effect of BSLE. The BSLE (250 mg/kg) effect against ethanol damage was

found to be significantly reduced in mice pretreated with capsazepine, L-NAME, or

glibenclamide, the respective blockers/inhibitors of transient receptor potential vanilloid 1

(TRPV1), nitric oxide synthase and K

ATP

channel activation. Phytochemical investigation on

BSLE revealed the major presence of flavonoids, quercetin; isoquercetrin; rutin and kaempferol

3-O-rutinoside, substances well known for their antioxidant and gastroprotective properties.

Taken together, these results allow us to conclude that BSLE affords gastroprotection through

multiple mechanisms, which may be helpful in abrogation of gastric dysfunction associated

pathologies.

Keywords: Byrsonima sericea; Gastroprotection; Ethanol; Antioxidant; Nitric oxide; K

ATP

channels

Introduction

Plants of the genus Byrsonima (Malpighiaceae) are widely distributed to various parts of Brazil

where local people call them as murici. Leaves and trunk bark from various species Byrsonima

are popularly employed in folk medicine to treat fever, gastrointestinal dysfunction (diarrhoea

and gastric ulcer), asthma, skin infections, and snakebites (Mendes et al., 1999; Lira et al.,

2008). While chemical investigations on various Byrsonima species have shown the presence of

several bioactive compounds like flavonoids, triterpenes and tannins (Béjar and Malone,1993;

Geiss et al., 1995; Martinez-Vázquez et al., 1999; Mendes et al., 1999), bioactivity studies

demonstrated the gastroprotective, healing and antidiarrheal activities of B. fagifolia (Lima et

al., 2008), antimutagenic activity of B. basiloba (Lira et al., 2008), mutagenic and

gastroprotective effects of Byrsonima crassa (Sannomiya et al., 2007; Cardoso et al., 2006)

and the antimicrobial activity of Byrsonima crassifolia (Martinez-Vázquez et al., 1999). The

presence of phenolic compounds possibly explains the gastroprotective effect of the extracts of

Byrsonima species.

Byrsonima sericea DC., also popularly known as murici that grows abundantly in the

Northeastern states of Brazil, is traditionally used to treat gastrointestinal dysfunction. An

antioxidant activity of the methanolic extract from B. sericea has recently been described, using

the DPPH assay (Boscolo et al., 2007). To our knowledge there were no scientific studies in

literature on B. sericea extracts in relation to the gastrointestinal activity. Since antioxidants can

afford gastroprotection both in clinical and experimental settings, the present study was aimed

to evaluate the Byrsonima sericea DC. leaf extract (BSLE) for potential gastroprotection and

the underlying mechanism using the ethanol-induced gastric damage in mice as a model

system. In addition, phytochemical analysis of the extract was carried out to identify the

chemical compounds probably responsible for the plant is protective action.

Materials and Methods

Plant material and extract preparation

Byrsonima sericea DC. (Malpighiaceae) leaves were collected from State University of Ceará

campus, Ceará, Brazil, in December of 2006, after its identification by Dr. Afrânio G.

Fernandes, botanist of the Federal University of Ceará. A voucher specimen (39.451) has been

deposited at Herbarium Prisco Bezerra.

Fresh leaves (1.24 kg) were macerated with 70% alcohol at room temperature for 7 days. The

resultant extract was filtered and evaporated to dryness at 40

C in a vacuum rotary evaporator

to yield 153 g of crude ethanolic extract. The concentrated extract was then submitted for

further extraction process using a low pressure silica gel chromatographic column with hexane,

ethyl acetate and ethanol. These solvent solutions on evaporation gave three extracts weighing

1.1, 5.6 and 126.2 g, respectively. Only the ethanolic extract (BSLE) was utilised in the present

work.

Phytochemical analysis

BSLE was analyzed for the presence of phenols, tannins, leucoantocianidins, flavonoids,

steroids, triterpens and alkaloids by qualitative chemical analysis (Matos, 1997).

HPLC analysis

The HPLC system (Waters 2690 Alliance) was connected to a Waters 486 tunable absorbance,

column detector (Waters C18, 3.9 X 150mm X 4um). The analysis was run under isocratic

conditions using the solvent mixture: 80:20 (ACN: H

O, pH 2.8 phosphoric acid); flow rate: 1

mL/min, 20 µL; and temperature: 21

C. Quercetin, quercetin 3-O-glycoside, quercetin 3-O-

rutinoside and kaempferol 3-O-rutinoside, used as standards for comparison, were isolated from

D. gardneriana and characterized by spectroscopic methods. The concentration for the extract

and standards was 1 mg/mL, the injection volume was 30 µL and the eluted was monitored at

350 nm.

Chemicals

Capsaicin, capsazepine, glibenclamide, diazoxide, L-arginine, N

-nitro-L-arginine methyl ester

(L-NAME) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Absolute ethanol was

obtained from Synth (Brazil). Quercetin, quercetin 3-O-glycoside (isoquercetrin), quercetin 3-

O-rutinoside (rutin) and kaempferol 3-O-rutinoside isolated from the flowers and leaves of

Dimofhandra gardneriana, were used as standards. All other chemicals used were of analytical

grade.

Animals

Female Swiss mice (20-25g) obtained from the Central Animal House of this University were

used. Experimental groups consisted of 8 animals per group. They were housed at 24 ± 2

under a 12-h light/12-h dark cycle and had free access to standard pellet diet (Purina chow) and

tap water. The animals were deprived of food for 15 h before experimentation, but had free

access to drinking water. The Institutional Ethics Committee on the Care and Use of Animals

for experimentation approved the experimental protocols, and all experiments were performed

in accordance with the guidelines of National Institute of Health, Bethseda, USA.

Gastric damage induced by ethanol

Groups of mice (n=8), were pre-treated with the vehicle (0.9% saline in a 0.5% of DMSO,

10mL/kg), N-acetylcysteine (NAC) (150 mg/kg, i.p.) or BSLE (125, 250, 500 and 1000 mg/kg,

p.o.) 1 h before the induction of gastric damage by oral administration of absolute ethanol (0.2

mL/animal) (Robert et al., 1979). After 25 min, the animals were sacrificed, the stomachs

excised, opened along the greater curvature, rinsed with saline (0.9%) and the mucosal lesion

area (mm

) was measured by planimetry using a transparent grid (area: 1mm

) placed on the

glandular mucosal surface and was expressed in percentage (%) in relation to total area of

corpus. After evaluating of the lesions induced by ethanol, the glandular parts of the stomachs

were frozen and stored at −70 ◦C for further biochemical analyses.

Estimation of anti-oxidant parameters

Gastric strips were cut into small pieces and then homogenized in ice-cold 50 mM Phosphate

buffer pH 7.4 to give 10% homogenate. The homogenate was then made into aliquots and used

for the assessment of anti-oxidant parameters. The gastric lipid peroxidation was determined by

measuring of thiobarbituric acid

eactive species (TBARS) using the method described by

Ohkawa et al. 1979. Superoxide dismutase (SOD) activity was assessed according to the

method of Beauchamp and Fridovich (1971) through measurement of the enzyme capacity for

photochemical inhibition of nitroblue-tetrazolium (NBT). Catalase (CAT) activity was

measured by the method that employs hydrogen peroxide to generate H

O and O

(Maehly and

Chance, 1954). The protein concentrations were determined by the Bradford (1976).

The non

proteic sulphidrylic groups (NP-SH) were determined according to the method described by

Sedlak and Lindsay, 1968.

Role of TRPV1 channel in the gastroprotective effect of BSLE

Groups of mice (n=8) were pretreated with vehicle (0.9% saline in a 0.5% of DMSO,

10mL/kg), BSLE (250 mg/kg,

p.o.) and capsaicin (0.3 mg/kg, p.o.), alone, or in their

combinations with capsazepine (5 mg/kg, i.p.) prior to the oral administration of 0.2 mL of

ethanol (96%). When given alone, BSLE and capsaicin were administered 1h before ethanol.

Capsazepine was administered 30 min prior to ethanol.

Role of nitric oxide in the gastroprotective effect of BSLE

Mice (n=8) were pretreated with vehicle (0.9% saline in a 0.5% of DMSO, 10 mL/kg), BSLE

(250 mg/kg,

p.o.), L-arginine (400 mg/kg, i.p.) alone, or in their combinations with L-NAME

(20 mg/kg, i.p.) prior to induction of gastric damage with ethanol (0.2 mL of ethanol, 96%).

While BSLE was administered 1h before, L-NAME and L-arginine, were given 30 min prior to

ethanol.

Role of K

ATP

-channels in the gastroprotective effect of BSLE

Mice (n=8) were pretreated with vehicle (0.9% saline in a 0.5% of DMSO, 10 mL/kg), BSLE

(250 mg/kg,

p.o.), diazoxide (3 mg/kg, i.p.) alone, or in their combinations with glibenclamide

(5 mg/kg, i.p.) prior to the oral administration of 0.2 mL of ethanol (96%). BSLE was given 1h

before, whereas diazoxide was administered 30 min prior to ethanol or glibenclamide.

Glibenclamide was administered 30 min before BSLE.

Determination of gastric mucus

The determination of mucus in gastric content was performed according to the methodology

described by Corne et al., 1974. The gastric tissues were transferred to 0.1% Alcian Blue

solution prepared in 16 mM sucrose and 50 mM sodium acetate (pH 5.8) and stained for 2 h at

room temperature. The segments were then rinsed twice with 25 mM sucrose solution for 15

and 45 min, and the dye, together with the gastric mucus with 5 mM magnesium chloride

solution was extracted for 2 h. The extract was then mixed with equal volume of diethyl ether

and centrifuged at 3600 rpm for 10 min. Absorbance was determined at 598 nm. The amount

of mucus was calculated using a standard curve of Alcian Blue.

Statistical analysis

The results are presented as the mean ± S.E.M. of 8 animals per group. Statistical analysis was

carried out using one way analysis of variance (ANOVA) followed by Student Newman Keul´s

post hoc test for multiple comparisons. P-values less than 0.05 (P<0.05) were considered as

indicative of statistical significance.

Results

The qualitative phytochemical analysis of BSLE revealed the presence of flavones, flavonols,

flavanones, xanthones and hydrolizable tannins. The filtered ethanol extract of B. sericea was

injected under the cited conditions (Fig. 1), as well as a mixture of authentic samples of rutin,

isoquercetrin, kaempferol 3-O-rutinoside and quercetin (Fig. 2). The phenolic compounds were

identified by comparing the authentic chromatographic standards obtained from D.

gardneriana. The purity of each identified peak in Fig. 1 was determined by comparing with

the UV spectra available at the HPLC computer library. For 1240 g of fresh leaves, each

flavonoid content was evaluated in relation to a quercetin standard curve: isoquercitrin: 504

mg, quercetin: 12.6 mg, rutin: 25.4 mg and kaempferol 3-O-ritinoside: 254 mg.

The oral administration of BSLE (125, 250, 500 and 1000 mg/kg) exhibited a dose-unrelated

protective effect against ethanol-induced gastric lesions and compared to vehicle group, the

extent of inhibitions for the respective doses employed were 53.2, 86.5, 80.8 and 90.2 %. NAC,

the positive control included for the study also offered significant protection (Table 1).

The animals that received ethanol alone showed a significant decrease in gastric catalase

(CAT), superoxide dismutase (SOD) and NP-SH levels and a significantly elevated TBARS

level (Table 2). Pretreatment with BSLE (250 mg/kg) effectively decreased the ethanol

associated increase in TBARS (67.76 ± 7.5 nmol/g tissue). Almost to a similar extent NAC

(150 mg/kg) also inhibited the increase of TBARS (62.1 ± 6.96 nmol/g tissue) produced by the

ethanol (Table 2). BSLE (250 mg /kg) treated animals showed significantly enhanced activities

of the antioxidant enzymes SOD and CAT.

The NP-SH level seen in gastric mucosa of normal control mice (280.1 ± 12.7 µg/g) was

significantly lowered by ethanol (102.3 ± 10.4 µg/g) treatment (Table 2). At the doses

employed, both BSLE and NAC largely replenished the NPSH depleted by ethanol (239.5 ± 6.5

µg/g).

In mice pretreated with vanilloid antagonist capsazepine, the gastroprotective effect of BSLE

(250 mg/kg) and capsaicin (0.3 mg/kg, p.o.) were significantly reduced (Fig. 4A). These data

indicate that the gastroprotective effect of BSLE is mediated by activation of capsaicin-

sensitive primary afferents.

L-NAME (20 mg/kg, i.p.) pretreatment significantly blocked the gastroprotection produced by

BSLE and L-arginine (400 mg/kg, i.p.), suggesting the participation of NO (Fig.4B) on BSLE

gastroprotection. Pretreatment with K

ATP

channel blocker, glibenclamide (5 mg/kg, i.p.), also

significantly reduced the gastroprotection produced by BSLE and diazoxide (3 mg/kg, i.p.)

(Fig. 4C), indicating a role for K

ATP

channels in gastroprotection.

The amount of gastric mucus was significantly (p < 0.01) less in the gastric tissues collected

from ethanol-treated animals, as compared to non-damaged tissues from control. The

pretreatment of animals with BSLE greatly enhanced the gastric mucus, when compared to

animals on ethanol injury (Fig.3).

Discussion

The results show that the leaf extract of B. sericea protects against absolute ethanol-induced

gastric lesions in mice. However, at the doses tested, the protective response was not dose-

related. The reason for this might be due to the complex nature of polyphenolics present, and or

their impaired absorption following oral administration of the extract. Phytochemical analysis

of BSLE indicated the presence of flavonoids and tannins, and the HPLC analysis confirmed

the presence of rutin (quercetin 3-O-rutinoside), isoquercetrin (quercetin 3-O-glucoside),

kaempferol 3-O-rutinoside and quercetin as the main secondary metabolites. Several of these

flavonoids and their structurally related compounds have been shown to inhibit lipid

peroxidation (Katsube et al., 2006; Lambert et al., 1999). The results of this study show that

BSLE at doses of 125, 250, and 500 mg/kg affords pronounced gastroprotection against

ethanol-evoked lesions, largely due to the presence of strong antioxidant flavonoids in the

extract. The gastroprotective and antioxidant effects of quercetin and rutin are well-known (De

la Lastra et al., 1994; La Casa et al., 2000) and there have been many studies, addressing the

antiulcerogenic properties of flavonoids (Gonzalez and Di Stasi, 2002; Kahraman al., 2003).

The role of reactive oxygen species in the pathogenesis of acute ethanol-induced gastric

mucosal lesions and the effects of quercetin have been evaluated in a few studies. It has been

confirmed that quercetin treatment significantly inhibits the gastric erosions induced by ethanol

(Gracioso et al., 2002). Galati et al. (2003) have also described that there is a correlation

between the antioxidant and the antiulcer activity of the flavonoids. It has been firmly

established that oxidative stress and impaired prostaglandin synthesis contribute to gastric

mucosal damage in experimental models of gastric lesions induced by ethanol (Chattopadhyay

et al., 2006). The administration of BSLE (250 mg/kg) to the animals increased the levels of

gastric NP-SH (GSH) and the amount of mucus. Previous studies have shown that oral

administration of the Maytenus ilicifoli leaf extract, rich in flavonoids can increase the mucus

production in ethanol model of gastric damage in mice, which is in agreement with our data

(Baggio et al., 2007). Both gastric mucus and glutathione serve as protective agents against

mucosal injury (Cnubben et al., 2001; Chen et al., 2005). The plant-derived natural antioxidants

are extremely useful to combat the oxidative stress (Repetto and Llesuy, 2002). Antioxidant

enzymes such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), in a preventive way, act as a

first line defense against the reactive oxygen species (ROS). Acute treatment with ethanol

promotes oxidative stress consequently enhancing the lipid peroxidation and malonaldehyde

formation (Peskar et al., 2002). The present study clearly shows that BSLE inhibits lipid

peroxidation and lowers TBARS formation indicating a cytoprotective function. Other studies

have reported that NO is involved in the preservation of mucous membrane integrity in

experimental models of gastric ulceration (Cho, 2001; Kwiecien et al., 2002; Ancha et al.,

2003). In this study, L-arginine (400 mg/kg) and BSLE (250 mg/kg) induced gastroprotection

was reversed by L-NAME, a non-selective NOS inhibitor, suggesting that the gastroprotective

effect of BSLE is mediated, in part, by NO. It is known that potassium channels are involved in

a variety of stomach physiological functions and that gastroprotection can be inhibited by

several agents such as indomethacin, K

ATP

blockers and glibenclamide (Peskar et al., 2002).

Glibenclamide, a blocker of K

ATP

channels, significantly antagonized the protective effect of

BSLE and diazoxide. These results support the hypothesis that K

ATP

channel opening is

involved in the gastroprotective activity of BSLE. Since this protection is also sensitive to

indomethacin, it is suggested that endogen prostaglandins activate the K

ATP

channels and this

mechanism is responsible, in part, for the BSLE gastroprotective action (Campos et al., 2008).

The results of this study indicate that BSLE has a cytoprotective role in the gastroprotection

against gastric damage induced by ethanol, which is presumably mediated, in part, by nitric

oxide release and K

ATP

channel opening. The extract does not seem to be toxic as consecutive

daily oral administrations of BSLE (500 or 1000 mg/kg) over a period of five days to mice did

not produce any signs of overt toxicity. Taken together these findings suggest that the ethanolic

extract of B. sericea is a safe gastroprotectant to obliterate gastric dysfunction associated

pathologies.

Aknowledgements

We are thankful for the financial support of FUNCAP (Ceará State Research Funding) and

CNPq (National Council for Technological and Scientific Development, Brazil).

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Legends to Figures

Fig. 1. HPLC Chromatogram of the ethanolic extract of B. sericea. Column: Waters C18 (150 x

3.9 mm, 4 µm; eluent: water /ACN / fosforic acid / 80:20), Flow-rate: 1mL/min, 20 µl,

Temperature 21

C. Detection: 350nm. 1. unidentified, 2. rutin, 3. isoquercitrin, 4. kaempferol

3-O-rutinoside, 5. quercetin

Fig. 2. HPLC Chromatogram of 4 marker compounds. (2. Rutin; 3. Isoquercitrin; 4.

kaempferol-3-O-rutinoside; 5. quercetin)

Fig. 3. Effect of the B. sericea extract (BSLE) treatment on the amount of mucus after

induction of gastric lesion by ethanol in mice. The results are expressed as mean ± S.E.M.

< 0.01 in comparison to control group (vehicle) (ANOVA followed by Student Newman Keul’s

test).

Fig.4. A. Involvement of TRPV1 channel in the gastroprotective effect of B. sericea extract

(BSLE) against ethanol-induced gastric damage in mice. B. Involvement of nitric oxide in the

gastroprotective effect of B. sericea extract (BSLE) against ethanol-induced gastric damage in

mice. C. Role of K

+ATP

channels in the gastroprotective effect of BSLE against ethanol-induced

gastric damage in mice. The results are expressed as mean ± S.E.M.

p < 0.05 vs control

(vehicle);

p < 0.05 vs BSLE alone;

p < 0.05 vs L-arginine (L-arg) or diazoxide alone

(ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

Fig. 1.

Fig. 2.

Table 1. Effect of B. sericeae extract (BSLE) on gastric damage induced by absolute

ethanol in mice.

Treatment Dose (p.o.) Ethanol lesion area (mm

) % of

inhibition

Control (vehicle) - 21.8 ± 0.4 -

BSLE 125 mg/kg 10.4 ± 1.0

***

58.3

250 mg/kg 3.3 ± 0.6

***

86.5

500 mg/kg 2.7 ± 0.5

***

80.8

1000 mg/kg 2.3 ± 0.1

***

90.2

NAC 150 mg/kg 3.0 ± 0.5

***

86.5

Data are mean ± S.E.M of 8 animals in each group.

***

p < 0.001 vs. Control (vehicle)

(ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

Table 2. Effects of B. sericeae extract (BSLE) on the contents of CAT, SOD, MDA and NP-

SH on gastric damage induced by absolute ethanol in mice.

Treatment CAT

(U/g protein)

SOD

(U/g protein)

TBARS

(nmol/g tissue)

NP-SH

(µg/g tissue)

No lesion 14.2 ± 0.8

1.0 ± 0.2 54.6 ± 6.9 280.1 ± 12.7

Control

(vehicle)

13.6 ± 0.6

0.6 ± 0.2

86.6 ± 17.3

102.3 ± 10.4

BSLE

250 mg/kg

13.1 ± 0.9

1.0 ± 0.1

67.7 ± 7.5

229.1 ± 9.9

NAC

150 mg/kg

15.4 ± 0.4

1.0 ± 0.1

62.1 ± 6.9

239.5 ± 6.5

Data are mean ± S.E.M of 8 animals in each group.

p < 0.05 vs. Control (normal);

p < 0.05

vs. vehicle (ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

No lesion control 250 150

0.000

0.025

0.050

0.075

(vehicle)

BSLE NAC

mg / kg

Alcian Blue (

g / ml of wet

tissue)

Fig. 3.

control 250 3 250 3

BSLE Capsaicin BSLE Capsaicin

Capsazepine

(vehicle)

mg/kg

Gastric lesion area (mm

Control 250 400 250 400

BSLE L-Arg BSLE L-Arg

(vehicle)

L-NAME

mg/kg

Gastric lesion area (mm

)

Control 250 3 250 3

BSLE Diazoxide BSLE Diazoxide

Glibenclamide

(vehicle)

mg/kg

Gastric lesion area (mm

)

Fig. 4.

CAPÍTULO 3

Efeito do extrato etanólico de Byrsonima sericea DC. no sistema gastro-intestinal e

avaliação da toxicidade em camundongos

Effect of Byrsonima sericea DC. ethanol extract in the gastro-intestinal system and

assessment of toxicity in mice

Periódico: Revista Brasileira de Farmacognosia

Submetido em 29 de outubro de 2008

Efeito do extrato etanólico de Byrsonima sericea DC. no sistema gastro-

intestinal e avaliação da toxicidade em camundongos

Patrícia A. Rodrigues,

Selene M. Morais,

1,2

Ana R.A. Silva,

Liza A. Aguiar,

Carolina

M. de Souza,

Flávia A. Santos

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária,

Universidade Estadual do Ceará , Av. Paranjana, 1700, CEP 60740-000, Campus do Itaperi,

Fortaleza-Ceará, Brasil

Departamento de Química,

Laboratório de Química de Produtos Naturais, Universidade

Estadual do Ceará, Av. Paranjana, 1700, CEP 60740-000, Campus do Itaperi, Fortaleza- Ceará,

Brasil

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, Faculdade de

Medicina, Rua Coronel Nunes de Melo, 127, Rodolfo Teófilo, 60430-270, Fortaleza- Ceará,

Brasil

*E-mail: [email protected] ; Tel: + 55- 85-30919838

RESUMO: Byrsonima sericea DC., conhecida como murici da praia, é usada popularmente

para tratar doenças gastro-intestinais. Análises fitoquímicas e antioxidantes foram feitas com os

extratos obtidos através de cromatografia do extrato etanólico bruto das folhas de B. sericea

(EEB), obtendo-se os extratos hexânico (E.H), acetato de etila (E.Ac) e etanólico (E.E). Para

comprovar o uso etnofarmacológico da espécie, foram avaliados a atividade gastroprotetora, o

efeito na motilidade intestinal e a toxicidade do E.E. que apresentou a melhor atividade

antioxidante (90%) e maior rendimento (126,2g). Doses orais de 500 e 1000 mg/kg não

causaram mortalidade, não havendo diferença no peso dos animais, peso relativo dos órgãos e

ASATe ALAT quando comparado ao grupo controle. Doses de 250, 500 e 1000 mg/kg

inibiram as lesões gástricas induzidas por indometacina em 52, 60 e 62 % respectivamente. A

dose de 1000 mg/kg diminuiu a motilidade intestinal nos animais. A análise fitoquímica do E.E.

e E.Ac. mostrou a presença fenóis, taninos, leucoantocianidinas, flavonoídes, esteroídes,

triterpenos e alcalóides. O E.E. de B. sericea não foi tóxico nas doses testadas, apresentou

atividade gastroprotetora e efeito antidiarrêico, confirmando seu uso popular. Estas ações

podem estar relacionadas com a presença de compostos fenólicos contidos no extrato estudado.

Unitermos: Byrsonima sericea DC, Gastroproteção, Toxicidade, Antioxidantes

ABSTRACT: “Effect of Byrsonima sericea DC. ethanol extract in the gastro-intestinal

system and assessment of toxicity in mice”. Byrsonima sericea DC., popularly known as

murici of the the beach, is used to treat gastro-intestinal diseases. In this study it was performed

the phytochemical and antioxidant analysis of extracts obtained by chromatography of crude

ethanol extract from B. sericea (BEE) leaves obtaining hexane extract (EH), ethyl acetate

extract (E.Ac) and ethanol extract (EE). EE showed the higher yield and the best antioxidant

activity (90%). The ethnopharmacological use of B. sericea was evaluated by assaying EE for

gastroprotective activity in stomach ulcer induced by indometacin, intestinal motility and

toxicity. Oral doses of 500 and 1000 mg/kg did not cause mortality, and there was no difference

in animals weight, organs relative weight and ASAT and ALAT, as compared to the control

group. Doses of 250, 500 and 1000 mg/kg inhibited the gastric lesions induced by

indomethacin in 52, 60 and 62% respectively. The dose of 1000 mg/kg decreased intestinal

motility in animals. Phytochemical analysis of E.E e E.Ac showed the presence of phenols,

tannins, leucoanthocianidins, flavonoíds, esteroíds, triterpenes e alkaloids. B. sericea E.E. was

not toxic and showed gastroprotective and antidiarrheal activities, confirming its popular use.

These actions may be related to the presence of phenolic compounds in the studied extract.

Keywords: Byrsonima sericea DC., Gastroprotective, Toxicity, Antioxidants

INTRODUÇÃO

Desde tempos remotos o homem procurou aproveitar os recursos existentes na natureza,

principalmente nos vegetais, embora de modo totalmente intuitivo, baseado em descobertas ao

acaso. Este fato ainda pode ser encontrado entre muitos povos primitivos isolados como

algumas tribos indígenas da América do Sul (Van Den Berg, 1987).

Atualmente o uso de plantas medicinais tornou-se um recurso alternativo de ampla aceitação

pela população e vem crescendo junto à comunidade médica. Das plantas que são utilizadas

com fins terapêuticos, destacam-se as que possuem atividade antioxidante, uma vez que a

oxidação de biomoléculas pode estar envolvida no surgimento de diversas doenças

degenerativas. (Lee et al., 2003). As plantas produzem uma variedade de substâncias utilizadas

no controle do estresse oxidativo, causado pela ação dos raios solares e oxigênio, tais

substâncias podem representar uma fonte de novos compostos com atividade antioxidante

(Morais, 2002). Dentre as doenças geradas pela ação das espécies oxidantes, estão as úlceras

pépticas que afetam um número considerável de pessoas no mundo. As lesões gástricas

ocorrem quando há um desequilíbrio entre os fatores agressores e os fatores protetores da

mucosa (Sairam et al., 2002). As medicações disponíveis hoje em dia para o tratamento das

úlceras desempenham seu efeito por reduzir fatores agressivos ou por estimular fatores

defensivos presentes no tecido. Nesse contexto, as plantas surgem como fonte de compostos

com capacidade tanto de reduzir fatores lesivos como aumentar a resistência da mucosa gástrica

de maneira sinérgica, possibilitando um tratamento mais eficaz (Borreli & Izzo, 2000).

Antioxidantes naturais como os polifenóis e carotenóides estão sendo extensivamente

pesquisados para se estabelecer suas eficiências de absorção no trato gastrointestinal,

biodisponibilidade, mecanismos de ação envolvidos e instruções para o consumo seguro em

humanos (Augusto, 2006).

Byrsonima sericea DC., conhecida popularmente como murici da praia, e algumas outras

espécies do gênero são usadas popularmente para tratar disfunções gástricas, infecções

cutâneas, picadas de cobra e ainda como anti-diarréicos (Amarquaye et al., 1994; Lima et al.,

2008; Sannomya et. al., 2007). Não existem dados científicos publicados que avaliem os efeitos

de B. sericea no sistema gastrintestinal. Tendo em vista o uso etnofarmacológico voltado para

tratamento de enfermidades que possam estar envolvidos a ação de radicais livres, como

úlceras gástricas, tornam-se importantes análises química e farmacológica da espécie. Sendo

assim, este trabalho teve como objetivo determinar a toxicidade aguda, atividade

gastroprotetora, e a motilidade intestinal em camundongos do extrato etanólico (E.E.) das

folhas de B. sericea.

MATERIAL E MÉTODOS

Material Vegetal

Folhas frescas de B. sericea foram coletadas em outubro de 2006 no Campus do Itaperi da

Universidade Estadual do Ceará. A exsicata da planta foi preparada, e depositada no herbário

Prisco Bezerra do Departamento de Biologia da UFC, obtendo o número de registro 39.451.

Preparação dos Extratos

As folhas frescas foram imersas em álcool etílico (70%) por uma semana à temperatura

ambiente para extração de princípios ativos. A solução resultante foi filtrada e o solvente

eliminado em evaporador rotativo para obtenção do extrato etanólico bruto (EEB). Este extrato

foi submetido a uma coluna filtrante misturando-se com sílica gel na proporção de 1:1 e

eluindo-se com solventes orgânicos em ordem de polaridade crescente (hexano, acetato de etila

e etanol). Após evaporação dos solventes foram obtidos os extratos hexânico (E.H.), de acetato

de etila (E.Ac.) e de etanol (E.E.) e seus rendimentos foram calculados.

Análise Fitoquímica

Os extratos foram submetidos a testes fitoquímicos qualitativos para avaliar as classes de

compostos presentes, seguindo a metodologia de Matos (1997). Esses testes são baseados na

adição de reagentes específicos em alíquotas do extrato e observação em mudanças de cor ou

formação de precipitados.

Teste de Atividade Antioxidante in vitro (Método da varredura do radical livre DDPH).

A atividade antioxidante foi determinada através do método do radical estável DPPH. Em um

tubo de ensaio colocaram-se 3,9 mL de solução metanólica 6,5 x 10

-5

M do radical livre DPPH

e, em seguida, adicionou-se 0,1 mL de solução metanólica das amostras das frações (1mg/mL).

As análises foram feitas em triplicata e as absorbâncias lidas em espectrofotômetro a 515 nm

em diferentes tempos (0 a 60 min). Para comparação, utilizou-se a quercetina como padrão na

proporção molar quercetina/amostra de 1:10 (Yepez et al., 2002).

Animais de Experimentação

Foram utilizados camundongos swiss, fêmeas, pesando entre 20-25g, oriundos do Biotério

Central da Universidade Federal do Ceará. Os animais foram mantidos em condições

adequadas de luz e temperatura, recebendo ração e água ad libidum. A manipulação dos

animais obedeceu às normas de manipulação de animais, preconizadas pelo Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal (COBEA).

Avaliação da Atividade tóxica da E.E. em camundongos

Para os ensaios in vivo foi utilizado o E.E. que apresentou melhor atividade antioxidante e um

melhor rendimento em relação aos demais. Os animais foram separados em grupos

experimentais (n=8): onde 2 grupos receberam a E.E nas doses de 500 ou 1000 mg/kg v.o. e um

grupo controle que recebeu veículo (solução fisiológica 0,9%; DMSO 5%) uma vez ao dia por

um período de 5 dias consecutivos. Os animais foram pesados no dia 1 e no dia 5 para

monitoramento do peso. Durante o tratamento os grupos foram observados diariamente,

avaliando-se possíveis mudanças nos parâmetros comportamentais. O sangue foi coletado por

punção, através do plexo retro-orbital, centrifugado (3000 rpm, por 7 minutos) e o soro

separado para a análise dos níveis de ASAT e ALAT, no dia zero antes da primeira dose do

E.E. e no dia 5, último dia do tratamento. Os soros foram analisados no Laboratório de

Hematologia no Hospital Geral de Fortaleza (HGF) em equipamento Konelab, pelo método

cinético U.V. recomendado pela Federação Internacional de Química Clínica (IFCC). Para

determinação do peso relativo dos órgãos, os animais foram sacrificados por deslocamento

cervical, no quinto dia de tratamento e retirado os orgãos (fígado, baço e rim), pesados e feitos

à comparação com o grupo controle (adaptado de Pulla-Reddy & Lokesh, 1996).

Lesão gástrica induzida por indometacina

Animais, em jejum de sólidos de 18 h, (n=8), foram tratados, com E.E. (125, 250, 500 e 1000

mg / kg, v.o.), ou misoprostol (50 µg / kg, v.o.) ou o veículo (0,9% em salina a 0,5% do

DMSO, 10mL/kg). Após uma hora, os animais foram tratados por via oral com indometacina

(50 mg/kg v.o.). Oito horas após a administração da indometacina, os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical, os estômagos retirados e instilados com formalina a 5

% por 15 minutos (Bhargava et al, 1973). Em seguida foram abertos ao longo da grande

curvatura, lavados em salina e inspecionados para atribuições de escores de acordo com Szabo

et al. (1985) de acordo com a seguinte escala: 0 = sem petéquias, hemorragia ou erosão; 1 = 5

petéquias; 2 = até 5 petéquias e hemorragias ou erosão de 1 milímetro profundidade; 3 = até 5

petéquias com hemorragias ou erosão acima de 1 mm. A média de escores atribuídos as úlceras

para cada animal foi calculado e comparado entre os grupos.

Teste da motilidade intestinal em camundongos

Camundongos (n=8), em jejum de sólidos de 18 h, foram pré-tratados, com o E.E. (1000 mg /

kg, v.o), ou atropina (1 mg/kg, i.m.) ou veículo (0,9% em salina a 0,5% do DMSO, 10mL/kg).

Após 1 h, de receberem os tratamentos, os animais receberam 0,5 ml/animal de suspensão de

carvão ativo 10% em solução de goma arábica 5%, v.o. Após 45 min os camundongos foram

sacrificados por deslocamento cervical, sendo realizada a extirpação imediata do intestino

desde o piloro até o início do ceco. Assim, foi feita a medida do comprimento total do intestino

delgado e da distância percorrida pela suspensão de carvão ativo. O resultado foi expresso em

porcentagem do comprimento total do intestino delgado (Stickney & Northup, 1959).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com auxílio do programa Graph Pad Prism 3.0 (USA). Os

resultados foram expressos como a média ± desvio padrão (D.P.). A comparação entre as

médias foi realizada utilizando-se análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student

Newman Keuls, para dados paramétricos, e teste de Kruskall-Wallis seguido do teste de

Dunnett, para dados não paramétricos. As diferenças foram consideradas estatisticamente

significativas quando p<0,05.

RESULTADOS

Obtenção dos extratos

A partir de 1240g de folhas secas foram obtidas 153g de extrato etanólico bruto que foi

submetido a uma coluna filtrante de sílica gel. Após a eluição com solventes orgânicos seguida

de evaporação destes foram obtidos 1,1g de E.H., 5,6g de E.Ac. e 126,2g de E.E., com

rendimentos de 0,71; 3,66 e 3,66%, respectivamente.

Análise Fitoquímica

Os extratos E.E. e E.Ac mostraram a presença fenóis, taninos, leucoantocianidinas, flavonóides,

esteróides, triterpenos e alcalóides. A presença de ácidos graxos e esteróides foram

determinadas no E.H.

Avaliação das atividades antioxidantes dos extratos de Byrsonima sericea in vitro

Os E.E e E.Ac obtiveram um percentual de varredura (PV) do radical livre DPPH de 90 e 88 %

respectivamente. Ambos os percentuais ficaram próximos ao padrão quercetina 94%. No

entanto a E.H obteve um percentual de 21%.

Avaliação da Toxicidade da E.E em camundongos

Em nenhum dos grupos tratados foram observadas diarréia, vômitos, dificuldades motoras,

morbidez nem mortes durante o tratamento. Os resultados da análise estão apresentados na

tabela 1. A administração do E.E. nas doses testadas não alterou os níveis séricos de ASAT e

ALAT nos animais. O peso corporal dos animais não mostrou diferença significativa quando

comparado ao grupo controle. O peso relativo dos órgãos analisados (rim, baço e fígado)

também não apresentou alteração.

Lesão gástrica induzida por indometacina

As doses de 250, 500 e 1000 mg/kg E.E atenuaram significativamente as lesões gástricas

induzidas por indometacina, inibindo 52, 60 e 62 % respectivamente (Figura 1).

Motilidade intestinal em camundongos

O ensaio do trânsito intestinal reduziu significativamente a motilidade intestinal dos animais

após administração do E.E. (1000 mg/kg), quando comparados com o controle atropina 1mg/kg

(Tabela 2).

DISCUSSÃO

Estudos realizados com outras espécies do gênero Byrsonima (Amarquaye et al., 1994; Rastrelli

et al., 1997; Sannomiya et al., 2004) relataram a presença de compostos fenólicos,

corroborando com os resultados do estudo fitoquímico de B. sericea. Outras plantas do gênero,

como B. crassifolia e B. crassa mostraram também forte presença de taninos e flavonóides ().

Compostos fenólicos são conhecidos por possuírem atividades antioxidantes (Béjar & Malone,

1993). O elevado potencial antioxidante do E.E. de folhas da B. sericea através do ensaio com

DPPH corroborou com os achados de Boscolo e colaboradores (2006).

A administração oral por 5 dias da E.E na dose de 500 e 1000 mg/kg não produziram efeitos

tóxicos em camundongos, não havendo óbito. Neste trabalho, a administração da E.E nas doses

de 500 e 1000 mg/kg não alteraram os níveis séricos das transaminases estudadas. Segundo

Fillipin et al, (2004) quando os níveis de ASAT e ALAT aumentam em uma análise sorológica,

comparados a um grupo controle, tal aumento é indicativo de lesão hepática ocasionada por

xenobióticos ou por hepatite C. Os animais que receberam a E.E nas doses de 500 e 1000

mg/kg não tiveram diferença no peso corporal quando comparados com os animais que

receberam apenas veículo. De acordo com Jahn & Gunzel, (1997) o acompanhamento da massa

corporal do animal é um importante indicador para a avaliação da toxicidade de uma

substância. Também não foram observadas alterações no peso relativo dos órgãos analisados

(rim, baço e fígado). Estudos já realizados em algumas espécies do gênero como B. fagifolia e

B. basiloba (Lira et al, 2008), apresentaram baixa toxicidade na dose de 1000 mg/Kg e as

espécies B. crassa e B. intermedia apresentaram toxicidade na dose de 500 mg/kg, incluindo

morte de 33% dos animais (Higuchi, 2006).

No modelo de lesões gástricas induzidas por indometacina, o E.E. mostrou-se eficaz em

prevenir o dano à mucosa. Galati et al. (2003) descreveram uma correlação entre a atividade

antioxidante e gastroprotetora dos flavonóides. Os antiinflamatórios não esteróidais (AINEs),

como aspirina e indometacina, são conhecidos por induzir úlceras durante o curso da terapia

com anti-inflamatórios, através da inibição da síntese de prostaglandina pela via da

ciclooxigenase (Rainsford, 1987).

Os efeitos importantes das prostaglandinas no estômago

relacionam-se com a defesa da mucosa gástrica, à estimulação da secreção de muco e bicarbonato e

manutenção do fluxo sangüíneo (Hawkey, 2000).

O E.E. em doses mais altas 250, 500 e 1000

mg/kg, parece ter influência sobre um ou mais fatores envolvidos na patologia da úlcera pela

indometacina.

O ensaio do trânsito intestinal em camundongos demonstrou significativa redução da

motilidade intestinal dos animais após a administração do E.E. quando comparado com o

controle. Segundo Parmar & Ghosh, (1981) muitos flavonóides isolados de plantas medicinais

apresentam atividade gastroprotetora, sendo as catequinas e flavonóides com atividade

antiúlcera mais conhecidos e atuam através da inibição da enzima histidina descarboxilase,

podendo justificar a diminuição da motilidade intestinal. Estudos adicionais relatam que da

espécie B. crassifolia, foram isolados compostos voláteis dos frutos, glicolipídeos, triterpenos,

ácidos triterpênicos, catequinas, e flavonóides das folhas (Amarquaye et al., 1994; Rastrelli et

al., 1997) e do tronco proantocianidinas e taninos (Geiss et al., 1995). De acordo com relatos

científicos alguns flavonóides são conhecidos pela sua ação antidiarréica dentre eles estão a

quercetrina, quercetina e ternatina. Essa atividade dos flavonóides foi observada através de

experimentos de diarréia crônica em ratos e na motilidade do trânsito intestinal de

camundongos (Galvez et al., 1993; Galvez et al., 1996; Rao et al., 1997). Nossos resultados

concordam com Figueiredo et al. (2005) que avaliaram a atividade antidiarréica dos extratos

metanólico e hidrometanólico das folhas de B. cinera (Lira et al, 2008), em camundongos nas

doses de 1000 mg/kg, sendo observada uma redução significativa da motilidade intestinal.

Concluindo, a não toxicidade de B. sericea aliada a constatação de atividades protetoras do

sistema gastro-intestinal corroboram o seu uso etnofarmacológico sem relatos de efeitos

colaterais. Estas atividades podem estar relacionadas à presença de seus compostos fenólicos.

No entanto há necessidade de mais estudos relacionados à espécie com o objetivo de isolar e

avaliar a atividade dos seus compostos, bem como analisar os possíveis mecanismos de ação

envolvidos.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo suporte financeiro e a Universidade Estadual do Ceará.

Tabela 1.

Níveis séricos de ASAT e ALAT em U/L, de camundongos tratados com a E.E na dose de 500

e 1000 mg/kg.

ASAT ALAT

Dia 0 Dia 5 Dia 0 Dia 5

Veículo

145 ± 55

118 ± 22

53 ± 10

70 ± 26

500

104 ± 11

118 ± 21

49 ± 10

48 ± 14

1000

111 ± 31

158 ± 52

43 ± 7

64 ± 18

Nas colunas e nas linhas as médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si

(p > 0,05).

Tabela 2.

Peso dos animais em g de camundongos tratados com a E.E na dose de 500 e 1000 mg/kg.

Tratamento Dia 0 Dia 5

Veículo

500

Veículo

1000

25,93 ± 2,06

26,18 ± 1,81

21,23 ± 2,31

19,20 ± 1,99

25,68 ± 1,80

25,48 ± 2,17

20,12 ± 0,35

21,08 ± 0,36

Nas colunas e nas linhas as médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre

si (p > 0,05).

Tabela 3.

Peso relativos dos órgãos em mg/g de camundongos tratados com a E.E na dose de

500 e 1000 mg/kg.

Orgãos

Fígado Rim Baço

Veículo

3,81 ± 0,39

0,62 ± 0,07

500

3,91 ± 0,47

0,58 ± 0,06

Veículo

1000

4,52 ± 0,86

4,59 ± 0,95

0,79 ± 0,18

0,66 ± 0,11

0,44 ± 0,21

0,59 ± 0,16

0,46 ± 0,13

0,37 ± 0,13

Nas colunas e nas linhas as médias seguidas de mesma letra não diferem

estatisticamente entre si (p > 0,05).

Tabela 4.

Porcentagem da distância percorrida pelo carvão ativo no intestino dos camundongos após a

administração da E.E.

Dose Distância percorrida pelo carvão ativo (%) ±

desvio padrão

Atropina

1 mg/kg 47,17 ± 13,31**

E.E

1000 mg/kg 49,41 ± 13,77**

Veículo

10 mL/kg 74,23± 12,25

**Diferente em relação ao grupo veículo de acordo com o teste de Dunnett (P<0,01)

100

Figura 1.

veículo

/kg

125 250 500 1000

mg/kg

***

Indometacina (50mg/kg)

***

E.E

Área de lesão gátrica

(escores)

misoprostol

Efeito da indometacina na gastroproteção da E.E em camundongos.

Os valores

representam a média ± erro padrão da média (E.P.M.) para 8 animais/grupo. Os animais foram

tratados com E.E (125, 250, 500 e 1000 mg/kg, v.o.) ou misoprostol (50 µg/kg, v.o.).

Indometacina (50 mg/kg,v.o.) foi administrada 1 h após os tratamentos com E.E ou

misoprostol. *p<0,05

***

p<0,001 vs veículo (ANOVA e teste de Kruskall-Wallis seguido do

teste de Dunnett).

101

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105

CAPÍTULO 4

Estudos pré-clínicos do efeito gastroprotetor da Barbatusina e 3β-hidroxi-3-

deoxobarbatusina, diterpenos isolados de Plectranthus grandis, em modelos experimentais

de lesão gástrica aguda e dos possíveis mecanismos

Pre-clinical studies of the gastroprotective effect of Barbatusin and 3β-hidroxi-3-

deoxobarbatusin, diterpenes isolated from Plectranthus grandis, in experimental models of

acute gastric injury and the possible mechanisms

Periódico: Journal of Ethnopharmacology

(Artigo em fase de elaboração)

106

Pre-clinical studies of the gastroprotective effect of barbatusin and 3β-hydroxy-3-

deoxobarbatusin, diterpenes isolated from Plectranthus grandis, in experimental models

of acute gastric injury and the possible mechanisms

Patrícia de Araújo Rodrigues

, Selene Maia de Morais

a,b*

, Carolina Melo de Souza

, Ana

Raquel Araújo Silva

, Cláudio Cabral Campello

, Geanne Matos de Andrade

, Maria Gorette

Vasconcelos Silva

, Roberto Lima Albuquerque

, Ednardo Rodrigues Freitas

, Vietla

Satyanarayana Rao

, Flávia Almeida Santos

State University of Ceará,

Pos Graduate Program of Veterinary Sciences, Veterinary Faculty,

60740-000, Fortaleza, CE, Brazil

State University of Ceará, Natural Products Chemistry Laboratory, Technology Center,

60740-000, Fortaleza, CE, Brazil

Federal University of Ceará, Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of

Medicine, P.O. Box-3157, 60430-270, Fortaleza, CE, Brazil

Federal University of Ceará,

Department of Department of Organic Chemistry and Inorganic,

Center of Science, 60021-970, Fortaleza, CE, Brazil

Federal University of Ceará, Department of Zootchenc, Faculty of Agronomy, 60021-970

Fortaleza, CE, Brazil

*Corresponding author:

Rua Ana Bilhar N

601, Apto. 400, Meireles, CEP 60160-110, Fortaleza, Ceará, BrazilFax: +

55- 85- 3242-2793, E-mail address: selene@uece.br

107

Resumo

Plectranthus grandis similarmente ao P. ornatus são utilizadas na medicina popular brasileira

para tratamento de problemas gástricos. Barbatusina (BB) e 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina

(OHBB), diterpenos isolados da espécie P. grandis, foram avaliados em modelo experimental

de lesão gástrica aguda induzida por etanol, nas doses de 2,5; 5,0 e 10 mg/kg (p.o.). OHBB em

todas as concentrações testadas atenuou significativamente as lesões gástricas induzidas por

etanol e BB somente nas doses de 5,0 e 10 mg/kg. Estudos dos mecanismos foram realizados

utilizando-se doses de 5 e 10 mg / kg de OHBB e BB respectivamente. OHBB e BB foram

capazes de diminuir de forma significativa a depleção dos grupos sulfidrilas não-proteicos e o

aumento nos níveis de malonaldeído, associados à administração de etanol. O pré-tratamento

com glibenclamida não foi capaz de reverter o efeito gastroprotetor da OHBB. Adicionalmente,

o efeito da BB foi significativamente reduzido em camundongos pré-tratados com L-NAME e

capsazepina frente às lesões induzidas por etanol. BB aumentou o muco gástrico em

camundongos. A administração de OHBB foi capaz de causar depleção da Catalase (CAT),

enquanto que a administração de BB não alterou a quantidade desta enzima no tecido gástrico.

No entanto o pré-tratamento com OHBB preservou a quantidade da enzima superóxido

desmutase a BB foi capaz de aumentar a quantidade da mesma no tecido. Os resultados do

presente estudo indicam uma ação da gastroprotetora de OHBB e BB justificando o uso popular

da planta. Em geral esses diterpenos agem por mecanismos distintos, conforme foi

demonstrado nos resultados, revelando que diferenças na estrutura dos diterpenos modificam

suas atividades.

Palavras chaves: Plectranthus grandis; Barbatusina; 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina;

Gastroproteção; Canais de potássio; Óxido nítrico

108

Abstract

Plectranthus grandis similarly to P. ornatus are used in Brazilian folk medicine for treatment

of gastric diseases. Barbatusina (BB) and 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusina (OHBB), diterpenes

isolated from P. grandis, were evaluated in experimental model of acute gastric injury induced

by ethanol, at doses of 2.5, 5.0 and 10 mg / kg p.o. OHBB at all concentrations tested

significantly attenuated the gastric lesions induced by ethanol and BB only at doses of 5.0 and

10 mg / kg. Studies of the mechanisms were performed using a dose of 5 and 10 mg/kg OHBB

and BB respectively. OHBB and BB were able to significantly reduce the depletion of non-

protein sulfhydryl groups and the increase in the levels of malonaldehyde associated with the

administration of ethanol. The pre-treatment with glibenclamide was unable to reverse the

effect gastroprotective of OHBB addition, the effect of BB was significantly reduced in mice

pre-treated with L-NAME and capsazepina front of lesions induced by ethanol. BB

significantly attenuated the depletion of gastric mucus in mice. The administration of OHBB

was capable of causing depletion of catalase (CAT), while the administration of BB did not

alter the amount of this enzyme in stomach tissue. However the pre-treatment with OHBB

preserved the amount of the enzyme superoxide dismutase the BB was able to increase the

amount of the same fabric. The results of this study indicate a gastroprotective action for

OHBB and BB which justify the folk medicine use. In general, these diterpenes act by different

mechanisms as shown in the results, revealing that the structural difference in the compounds

modifies its modes of action.

Keywords: Plectranthus grandis; Barbatusin; 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusin; gastroprotective

109

1. Introduction

The family Lamiaceae contains several genera and Plectranthus is a large genus

containing about 300 species found in Tropical Africa, Asia and Australia. Some species of

Plectranthus are difficult to identify because of a lack of well defined morphological criteria to

discriminate not only among species within the genus but also among the closely related

genera. Because of these taxonomic issues, different names have been used for the same

species of Plectranthus and thus it has been difficult to get information about their utilization.

P. vettiveroides is used in India to treat stomach diseases, dyspepsia, nausea and vomiting

(Dash and Kashyap, 1987). P. esculentus and the leaves of P. aegyptiacus are also used to treat

stomach problems (Morris, 1996; Parkia and Cooke, 2003).

Species of the Plectranthus genus have biosynthetic capacity to produce a large number

of secondary metabolites, among them the diterpenes stand out, some with relevant biological

properties already proven (Marques et al., 1997; Buznego and Perez-Saad, 1999; Abdel-Mogib

et al., 2002; Costa & Nascimento, 2003; Hagiwara et al., 2003; Cerqueira et al., 2004; Marques

et al., 2006; Wellsow et al., 2006; Schultz et al., 2006).

Zelnik et al. (1977) studying the chemical composition of P. barbatus leaves found

three diterpenes: barbatusin, o 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusin and ciclobutatusin. Another

compounds as 6β-Hydroxycarnosol, barbatusol (Kelecom, 1983), cariocal (Kelecom et al.

1985), coleonon E, coleon F, plectrinona A (Schultz et al., 2006), plectrinona B (Ruedi, 1986),

identified in P. barbatus, have pharmacological or chemical importance. Agarwal & Parks

(1982) report that P. barbatus extracts have been used in natural medicine in many countries

for treatment of various cardiovascular disorders, respiratory, gastrointestinal and central

nervous system. Fischman et al. (1991) demonstrated that aqueous extract of P. barbatus leaves

110

presents gastric hipossecretora action which decreases the acidity and amount of secretion of

gastric juice.

Despite the widespread medicinal use of P. barbatus and diversity of isolated

compounds, the active constituents accounting for the plant antacid/antiulcer activity and their

mechanism of action are still unknown. P. grandis is popularly used in combating diseases

related to the digestive tract. This species has similar morphological characteristics of P.

barbatus, differing only in the "bitterness" of stems and leaves (Matos, 2000). 3β-hydroxy-3-

deoxobarbatusin and barbatusin were isolated from P. grandis, and to investigate their role in

the folk medicine use of this plant, the gastroprotective activity of these compounds were

investigate, in an experimental model of ethanol-induced gastric injury in mice and additionally

evaluate their possible mechanisms of action.

2. Materials and methods

2.1. Plant Material

Plectranthus grandis (Cramer) Willense. leaves and stalk were collected from Garden

of Medicinal Plants Francisco José de Abreu Matos of the Federal University of Ceará (HPM-

FJAM/UFC), Ceará, Brazil, in September of 2001, identified by Dr. Raymond, M. Harley. A

voucher specimen (28377) has been deposited at Herbarium Prisco Bezerra.

2.2. Extraction and isolation of barbatusin and 3

-hydroxy-3-deoxibarbatusin

The dried leaves of Plectranthus grandis (990 g) were triturated and extracted with

hexane for one week. The obtained solution was evaporated in rotaevaporator being obtained

the hexanic extract and the left leaf material remaining was extracted with ethanol for one

week. After this time the solvent was eliminated and the ethanol extract was submitted to a

111

sílica gel chromatographic column of being eluted with the solvents hexane, chloroform, ethyl

acetate and methanol. The hexanic extract after chlorophyll removal was chromatographied in a

sílica gel column for isolation of barbatusin (1) (1.57 g, m.p = 142-145°C). The cloroform

extract submitted to a column of sílica gel furnished (2) (20 mg, PF = 205-207°C).

2.3. Spectral characterization of compounds (1) and (2)

IR spectra were recorded on Perkin Elmer FTIR spectrum 100 spectrophotometer and

the values are expressed in cm

−1

. NMR spectra were recorded on a Brucker Avance DRX-500

spectrometer in CDCl

2.4. Reagents

Capsaicins, Capsazepine, glibenclamide, diazoxide, L-arginine, Nw-nitro-L-arginine

methyl ester (L-NAME) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Absolute

ethanol was obtained from Synth (Brazil). All other chemicals used were of analytical grade.

2.5. Animals

Female Swiss mice (20-25g) obtained from the Central Animal House of this University

were used. Experimental groups consisted of 8 animals per group. They were housed at 24 ±

C under a 12-h light/12-h dark cycle and had free access to standard pellet diet (Purina chow)

and tap water. The animals were deprived of food for 15 h before experimentation, but had free

access to drinking water. The Institutional Ethics Committee on the Care and Use of Animals

for experimentation approved the experimental protocols, and all experiments were performed

in accordance with the guidelines of National Institute of Health, Bethseda, USA.

112

2.6. Gastric damage induced by ethanol

Groups of mice (n=8), were pre-treated with the vehicle (0.9% saline in a 0.5% of

DMSO, 10mL/kg), N-acetylcysteine (NAC, 150 mg/kg, i.p.) OHBB or BB (2.5, 5, and 10

mg/kg, p.o.) 1h before the induction of gastric damage by oral administration of absolute

ethanol (0.2 mL/animal) (Robert et al., 1979). After 30 min, the animals were sacrificed, the

stomachs excised, opened along the greater curvature, rinsed with saline (0.9%) and the

mucosal lesion area (mm

) was measured by planimetry using a transparent grid (area: 1mm

)

placed on the glandular mucosal surface and was expressed in percentage (%) in relation to

total area of corpus. NAC the positive control used for model ethanol. After evaluating of the

lesions induced by ethanol, the glandular parts of the stomachs were frozen and stored at −70

◦C for further biochemical analyses.

2.7. Determination of gastric mucus

Gastric mucus was measured using the gastric mucosa obtained in the ethanol

experiment. The gastric tissues were immediately transferred to 0.1% Alcian Blue solution

prepared in 16 mM sucrose and 50 mM sodium acetate (pH 5.8) and stained for 2 h at room

temperature. The segments were then rinsed twice with 25 mM sucrose solution for 15 and 45

min, and the dye, together with the gastric mucus with 5 mM magnesium chloride solution was

extracted for 2 h. The extract was then mixed with equal volume of diethyl ether and

centrifuged at 3600 rpm for 10 min. Absorbance was determined at 598 nm. The amount of

mucus was calculated using standard curves of Alcian Blue (6.25-100.0 µg) (Corne et al.,

1974).

2.8. Antioxidant activity

113

Gastric strips were cut into small pieces and then homogenized in ice-cold 50 mM

Phosphate buffer pH 7.4 to give 10% homogenate. The homogenate was then made into

aliquots and used for the assessment of antioxidant parameters.

2.8.1. Detemination of lipid peroxidation

Total thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) were determined according to

the method of Ohkawa et al. 1979. Gastric strips were cut into small pieces and then

homogenized in ice-cold Phosphate buffer (50 mM pH 7.4) to give a 10% homogenate. The

homogenates were transferred to test tubes and incubated in a water bath at 37ºC for 60 min.

After this period, 35% perchloric acid was added. The mixture was centrifuged at 14000 rpm

for 10 min. Thiobarbituric acid at 0.6% was then added to the upper layer. The mixture was

submitted to a water bath at 100ºC for 30 min, after which the absorbance was measured at 532

nm. The standard curve was obtained using several concentrations of MDA solutions,

expressed in nmol/g of wet tissue.

2.8.2. Superoxide dismutase (SOD) activity

SOD gastric activity was assessed according to the method of Beauchamp and Fridovich

(1971) through measurement of the enzyme capacity for photochemical inhibition of nitroblue-

tetrazolium (NBT). Nitroblue tetrazolium was used to intercept O

−

generated enzymatically or

photochemically. The reduction of NBT by O

−

was used as the basis of assays for superoxide

dismutase, which in its presence by inhibiting the reduction of NBT producing formazan, which

is absorbed at 560 nm. Aliquots of tissue homogenates were centrifuged 12000 rpm for 20 min.

In a dark room 50 µL of phosphate buffer or supernatants were added to glass test tubes

containing 1mL of reaction mixture (Phosphate buffer 50 mM, EDTA 100 nM and L-

114

methionine 19.5 mM pH 7.8). Then 150 µL of NBT 750 µM and 300 µL riboflavin 10 µM were

added. After shacking the tubes were exposed to light (15 Watt) for 15min. The absorbance was

measured at 560 nm. The results were expressed in enzyme units, representing the amount of

SOD necessary to inhibit NBT reduction by 50%. The enzymatic activity was expressed as

U/µg of protein.

2.8.3. Determination of CAT activity

CAT activity was measured by the method that employs hydrogen peroxide to generate

O and O

(Maehly and Chance, 1954). The activity was measured by the degree of the

reaction. The supernatant (20 µL) was added to a quartz cuvette containing 980µL de H

800

µM, EDTA 25 µM and tris buffer HCl (50 mM, pH 8.0). The change in absorbance was

monitored at 240 nm over a 6-min period using a spectrophotometer. CAT activity was

expressed as U/µg of protein.

2.8.4. Protein assay

The protein concentrations were determined by the Bradford (1976) method, using

bovine serum albumin as standard.

2.8.5. Determination of non proteic sulphidrylic groups (NP-SH, GSH)

Reduced glutathione (GSH) was determined according to the method described by

Sedlak and Lindsay, 1968. Aliquots (2 mL) of tissue homogenate were mixed with 1.6 mL of

distilled water and 0.4 mL of trichloroacetic acid (TCA) 50% (w/v) in glass tubes and

centrifuged at 3000 rpm for 15 min. The supernatants (2 mL) were then mixed with 4mL of tris

buffer (40 mM, pH 8.9) and 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB 10 mM) was added.

After the lesions had been evaluated shaking the reaction mixture, its absorbance was measured

115

at 412 nm within 5 min of the addition of DTNB against the blank with no homogenate. The

GSH concentration (µg/g of wet tissue) was computed from a standard curve constructed using

different concentrations of standard GSH.

2.9. Role of nitric oxide in the gastroprotective effect of OHBB and BB

To investigate the involvement of endogenous NO in the gastroprotetive effect (Arrieta

et al., 2003) the animals were divided in groups (n=8), 2 groups were pre-treated with L-

NAME (20 mg/kg, s.c.) 1h before the treatments with vehicle (0.9% saline, 10 mL/kg) and/or

OHBB (5.0, mg/kg, p.o.), or BB (10 mg/kg, p.o.). Other 2 groups of animals received L-

arginine (400 mg/kg; i.p.), and one group, after 15 min received L-NAME (20 mg/kg s.c.). All

groups received absolute ethanol (0.2 mL/animal). After 30 min of the ethanol administration,

the animals were sacrificed; stomachs were removed and the area of gastric lesion was

measured.

2.10. Role of K

ATP-

channels in the gastroprotective effect of OHBB and BB

In order to verify a likely activation of ATP-sensitive potassium channels in the

gastroprotective effect, (Peskar et al., 2002) groups of mice (n=8) were pretreated with vehicle

(0.9% saline, 10 mL/kg), and/or OHBB (5.0mg/kg, p.o.), or BB (10 mg/kg, p.o.) or diazoxide

(3 mg/kg, i.p.) alone, or in their combinations with glibenclamide (5 mg/kg, i.p.) prior to the

oral administration of 0.2 mL of ethanol (96%). The mice were given or OHBB (5.0mg/kg,

p.o.), or BB (10 mg/kg, p.o.) 1 h before administering ethanol whereas diazoxide was

administered 30 min prior to ethanol or glibenclamide. Glibenclamide was administered 30 min

before OHBB or BB.

116

2.11. Effects of capsazepine pretreatments on OHBB and BB Gastroprotection

Groups of mice (n = 8) were pretreated with vehicle (0.9% saline, 10 ml/kg), and/or

OHBB (5.0, p.o.), or BB (10 mg/kg, p.o.), and capsaicin (0.3 mg/kg, p.o.), alone, or in their

combinations with capsazepene (5 mg/kg, i.p.) prior to the oral administration of 0.2ml of

ethanol (96%). When given alone, OHBB, or BB, and capsaicin, was administered 1 h before

ethanol. Capsazepene was administered 30 min, prior to ethanol.

2.12. Statistical analysis

The statistics were produced accomplished using the analysis of variance (ANOVA).

When there was a significant difference among the groups, Student-Neewman-Keuls or

Kruskall-Wallis post hoc test was applied for multiple comparisons. The results were expressed

as the mean ± standard deviation, being the differences considered statistically significant when

p < 0.05.

3. Results

3.1. Spectral characterization of compounds (1) and (2)

The

H and

C ressonance magnetic nuclear and infrared spectra of these compounds

were compared with literature data in the previous work of Zelnik et al. (1977). The difference

between the two diterpenes is in carbon 3, in compound 1 there is a ketone group and in 2 there

is an OH group. Compound 1 was characterized as barbatusin and compound 2 as 3β-hydroxy-

3-deoxobarbatusin. The structures of compounds are displayed in Fig 1.

3.2. Effect of OHBB and BB on gastric damage induced by ethanol

The oral administration of OHBB and BB at the tested doses of 2.5, 5 and 10 mg/ kg

exhibited a dose-unrelated against ethanol-induced gastric lesions when compared to vehicle

117

group (Fig. 2A and 2B), the extent of inhibition for respective doses employed (53, 55, 96 % )

and (9, 31, and 76 %) respectively. NAC the positive control include for this study also offered

significant protection of a similar magnitude against ethanol (85% inhibition)-induced gastric

lesion.

3.3. Effect of OHBB and BB on gastric mucus

The amount of gastric mucus was significantly (p < 0.05) less in the gastric tissues

collected from ethanol-treated animals, as compared to non-damaged tissues from control.

There was no difference between the group receiving OHBB with the injured group (Fig.

3A).The pre-treatment of animals with BB (10 mg/kg) greatly enhanced the gastric mucus, (p <

0.01) when compared to animals on ethanol injury (Fig. 3B).

3.4. Effect of OHBB and BB on gastric malonaldehyde, SOD, CAT, and NP-SH

The animals that received ethanol showed a significant increase (p<0.001) in

malonaldehyde levels (101.4 ± 4,72 tissue nmol/g) when compared to the control animals were

given that the vehicle (65.71 ± 4.17

tissue nmol/g). OHBB (5 mg/kg) and BB (10 mg/kg)

decreased the malonaldehyde produced by ethanol (57.43 ± 3.51

tissue nmol/g) and (52.63 ±

7.97 tissue nmol/g) respectively, in a significant way (p < 0.001) (for both). The treatment of

the animals with OHBB (5 mg/kg) decrease the antioxidant enzyme SOD (p < 0.01), however

the pre-treatment with BB increase the amount of SOD in the tissues. The administration of

OHBB (5 mg/kg) was able to cause significant depletion of Catalase (p < 0.001), while the

administration of BB (10 mg/kg) did not alter the amount of this enzyme in gastric tissue.

The NP-SH level seen in gastric mucosa of normal control mice (280.1 ± 12.7 µg/g) was

significantly decreased 102.3 ± 10.4 mg/kg following the administration off ethanol (Table 2).

118

While pretreatment with NAC (150 mg/kg) almost completely replenished the ethanol

depletion of NP-SH (239.5 ± 6.5 mg/kg), OHBB and BB markedly attenuated (p<0,001) the

depletion of gastric mucosal non-protein sulfhydryl of NP-SH (273.0 ± 21.7

and 262.6 ± 27.8

µg/g) respectively. The data are shown in tables 1 and 2.

3.5. Effects of capsazepine, role of nitric oxide and K

ATP-

channels on the gastroprotective

effect of OHBB and BB

The pre-treatment with TRPV1 receptor antagonist capsazepine and L-NAME was

unable to reverse the gastroprotective effect of OHBB in lesions induced by ethanol (Fig. 4a

and 4b). The pre-treatment with glibenclamide was able to reverse (p> 0.05) the

gastroprotective effect of OHBB against lesions induced by ethanol (Fig. 4 C). Additionally,

the effect of BB was significantly reduced (p <0.01) in mice pre-treated with capsazepine (Fig.

5 A) and L-NAME (Fig. 5 B) (p <0001). The pre-treatment with glibenclamide was unable to

reverse the gastroprotective effect of BB against lesions induced by ethanol (Fig. 5 C).

4. Discussion

The literature reveals that plants contain a large diversity of natural products that have

demonstrated antiulcerogenic properties (Lewis and Hanson, 1991). The two diterpenes

isolated from Plectranthus grandis OHBB and BB were tested against acute ulcer models in

animals and demonstrated defence mechanisms to protect stomach mucous. Terpenes or its

derivatives isolated from higher plants have been shown to display antiulcerogenic activity in

vivo (Giordano et al., 1990; Lewis and Hanson, 1991; Matsuda et al., 1998; Rodríguez et al.,

2002). However, its gastroprotective properties seems to act by different and many times

complementary mechanisms, many of them exhibiting as common feature an improvement of

119

the mucosal defensive factors more than effects on the aggressive factors (Giordano et al.,

1990; Lewis and Hanson, 1991; Hiruma-Lima et al., 1999). In the present study, OHBB and

BB significantly protected the gastric mucosa against the injury induced by ethanol. The

formation of gastric lesions in this model may be due to stasis in gastric blood flow which

contributes to the development of the hemorrhage and necrotic aspects of tissue injury (Guth et

al. 1984). The pretreatment of animals with BB (10 mg/kg) greatly enhanced the gastric mucus

(p < 0.01), as compared to animals on ethanol injury. Treatment with ethanol induces

solubilization of mucus constituents in the stomach, and a concomitant fall in the transmucosal

potential difference, increasing the fluxes of Na

and K

into the lumen, pepsin secretion,

lossing of H

ions and histamine content in the lumen (Guth et al. 1984; Szabo 1985).

ROS also have an important role in the pathogenesis of mucosal damage caused by

indomethacin, ethanol and other agents (Elliot and Wallace, 1998). Antioxidant enzymes such

as SOD, CAT, and GSH are the first line of defense against ROS. The administration of ethanol

decreased the levels of SOD and GSH antioxidants and increased the LPO in stomach tissues of

mice in comparison to healthy mice. In contrast to ethanol, doses of OHBB and BB showed

increased levels of SOD and GSH and decreased effect on lipid peroxidation.

The pretreatment with TRPV1 antagonist capsazepine and L-NAME failed to

effectively block the effects of the gastroprotective of OHBB (5 mg/kg) against ethanol

damage. Capsaicin via includes sensory nerve fibers susceptible to capsaicin, which releases

CGRP, and increase the formation of nitric oxide (KAUNITZ & AKIBA, 2004). These nerve

endings and the mediators are involved with the protective mucosal response to luminal acid,

including increasing of the mucosal blood flow and secretion of mucus and bicarbonate.

Furthermore, the OHBB effect was significantly (p<0,01) reduced in mice pretreated with

glibenclamide. In general the authors suggest that regulation of opening and closing K

ATP

120

channels in the stomach can be a defense mechanism of external injuries in the gastric mucous.

In the present work glibenclamide, a blocker of K

ATP

channels significantly antagonized the

protective effect of OHBB and diazoxide.

L-NAME (20 mg/kg s.c.) significantly blocked the gastroprotection produced by BB

and L-arginine (400 mg/kg i.p.), suggesting NO participation in its gastroprotection. It is well

known that NO is involved in the modulation of gastric mucosal integrity and is important in

the regulation of acid and alkaline secretion, mucus secretion and gastric mucosal blood flow

(Chandranath et al., 2002). The pretreatment with TRPV1 antagonist capsazepine failed to

block effectively (p>0,05) the gastroprotective effect of BB (10 mg/kg) against ethanol

damage.

In conclusion, compounds OHBB and BB demonstrated significant anti-ulcer activity

by oral administration. This effect could be related to an increase of gastric-mucosal defensive

mechanisms mediated, in part, by K

+ATP

channel opening for OHBB and by activation of

TRPVl nitric oxide release, for BB. The protective role for OHBB and BB affording

gastroprotection against gastric damage induced by ethanol indicates that these compounds

contribute for the activity of P. grandis and P. barbatus. The different modes of action are

probably related to differences in chemical structures.

Acknowledgements

The authors thank the for the financial support of FUNCAP (Ceará State Research Funding)

and CNPq (National Council for Technological and Scientific Development, Brazil)

121

OAc

OAC

1819

OAc

(1) (1)

Fig. 1. Chemical structure of barbatusin (1) and 3β-hydroxy-3-deoxobarbatusin (2)

122

Table 1.

Effects of alcohol intake alone and after administration of either Barbatusin and OHBB contents of CAT

SOD, MDA and NP-SH and in mouse stomachs.

Treatment Dose CAT

(U/g protein)

SOD (U/g

protein)

MDA (nmol g/g

tissue)

NP-SH (µg/g

tissue)

No lesion - 14.18±0.70

6,95 ± 0,62 65.71 ± 4.17

280.2 ± 12.6

Vehicle 0.2 ml/animal 13.66±0.57

4,94 ± 0,19

101.4 ± 4,72

102.3 ± 7.4

OHBB 5 mg kg-1 8.52 ± 0,99

8,75 ± 0,80

57.43 ± 3.51

273.0 ± 21.7

NAC 150 mg kg-1 16.20±0.86

7,435± 0,81

56.06 ± 5.92

239.5 ± 5.7

Data are mean ± S.E.M of 8 animals in each group.

p < 0.05 vs. Control (no lesion);

p < 0.05 vs. Control

(vehicle) (ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

123

Table 2.

Effects of alcohol intake alone and after administration of either BB and on the contents of CAT SOD,

MDA and NP-SH and in mouse stomachs.

Treatment Dose CAT

(U/g protein)

SOD (U/g

protein)

MDA (nmol g/g

tissue)

NP-SH (µg/g

tissue)

No lesion - 14.18±0.70

6,95 ± 0,62 65.71 ± 4.17 280.2 ± 12.6

vehicle 0.2 ml/animal 13.66±0.57

4,94 ± 0,19 101.4 ± 4,72

102.3 ± 7.5

BB 10 mg kg-1 12.82±1.32

9,12 ± 1,14

52.63 ± 7.97

262.6 ± 27.8

NAC 150 mg kg-1 16.20±0.86

7,435± 0,81 56.06 ± 5.92

239.5 ± 5.7

Data are mean ± S.E.M of 8 animals in each group.

p < 0.05 vs. Control (no lesion);

p < 0.05 vs. Control

(vehicle) (ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

124

Figure. 3

no lesion vehicle 5 150

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100

NAC

mg/kg

OHBB

Alcian Blue (

g/g de

tecido)

Fig. 3 A. Effect of the OHBB treatment on the amount of mucus after induction of gastric

lesion by ethanol in mice. The results are expressed as mean ± S.E.M.

p < 0.05 in comparison

to no lesion group (ANOVA followed by Student Newman Keul’s test).

no lesion vehicle 10 150

0.0 00

0.0 25

0.0 50

0.0 75

0.1 00

N AC

m g /k g

B B

Alcian Blue (

g/g de tcido)

Fig. 3 B. Effect of the BB treatment on the amount of mucus after induction of gastric lesion by

ethanol in mice. The results are expressed as mean ± S.E.M.

p < 0.05 in comparison to no

lesion group;

p < 0.05 in comparison to vehicle control (ANOVA followed by Student

Newman Keul’s test).

125

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130

CONCLUSÕES

Os dados obtidos do extrato etanólico das folhas de B. sericea (BSLE) permitiu tirar as

sequintes conclusões:

 Análises químicas do BSLE por HPLC indicaram a presença como compostos

majoritários dos flavonóides: quercetina (3,3',4',5,7-pentahidroxiflavona), isoquercetina

(quercetina 3-O-glucosideo), rutina (quercetina 3-O-rutinosideo) e Caempferol 3-O-

rutinosideo, sugerindo que estes compostos possam ser os responsáveis pelo efeito

gastroprotetor, visto que eles possuem várias atividades biológicas relatadas.

 BSLE, nas doses testadas não apresentaram toxicidade, nem causaram morte nos

animais;

 BSLE inibiu o trânsito intestinal na dose de 1000 mg/kg, sugerindo um efeito

antidiarrêico do extrato;

 BSLE apresentou atividade gastroprotetora em modelos experimentais de lesões

gástricas agudas induzidas por etanol e indometacina;

 BSLE evitou a depleção dos grupos sulfridrilas não-proteicos, e reduziu a

formação de malonaldeído no modelo de lesão gástrica induzida por etanol, indicando

uma ação antioxidante como parte do seu mecanismo de ação gastroprotetora;

 O estudo do mecanismo citoprotetor do BSLE indica um possível envolvimento,

do receptor TRPV1 nas fibras aferentes sensíveis à capsaicina, óxido nítrico e a

abertura de canais de potássio sensíveis a ATP no modelo de lesão gástrica por etanol;

 O possível efeito gastroprotetor do BSLE pode estar relacionado ao aumento de

fatores protetores da mucosa gástrica, como a ativação de mecanismos antioxidantes,

tanto enzimáticos (CAT e SOD), e com a manutenção de muco;

131

Os principais resultados obtidos dos diterpenos 3β-hidroxi-3-deoxobarbatusina (OHBB) e

barbatusina (BB), isolados da planta Plectranthus grandis mostraram que:

 OHBB e BB apresentaram atividade gastroprotetora em modelos experimentais

de lesão gástrica aguda por etanol;

 OHBB e BB

demonstraram

ação gastroprotetora

possívelmente,

evitando a

depleção dos grupos sulfridrilas não-proteícos e a redução da formação de

malonaldeído no modelo de lesão gástrica induzida por etanol, indicando uma ação

antioxidante como parte do seu mecanismo;

 O provável efeito gastroprotetor do OHBB pode está relacionado como a

ativação da enzima antioxidante SOD;

 O estudo do mecanismo citoprotetor da OHBB indica uma possível

participação, dos canais de K

ATP

no seu efeito protetor;

 A investigação do envolvimento dos receptores vanilóides do tipo TRPV1

presentes nas fibras aferentes sensíveis à capsaicina, e do óxido nítrico, parecem que

não estão envolvidos no mecanismo gastroprotetor da OHBB;

 O possível efeito gastroprotetor do BB pode está relacionado ao aumento de

fatores protetores da mucosa gástrica, mantendo os níveis da catalase e da superóxido

desmutase, evitando a diminuição de muco;

 No modelo de lesão gástrica induzida por etanol, tanto os receptores vanilóides

do tipo TRPV1, bem como o L-NAME, um inibidor não seletivo da NOS, reverteram

de maneira significativa o efeito gastroprotetor da BB, demonstrando um provável

envolvimento nesses mecanismos;

132

 No estudo envolvendo os canais de potássio sensíveis a ATP, a glibenclamida

não conseguiu reverter o efeito gastroprotetor da BB; evidenciando um não

envolvimento desses no efeito da BB.

 Provavelmente as diferenças entre as estruturas químicas dos compostos OHBB

e BB são responsáveis pelos diferentes mecanismos de ação de cada um.

133

PERSPECTIVAS

O extrato etanólico de B. sericea apresentou efeito gastroprotetor através dos

experimentos farmacológicos realizados sem apresentar toxicidade nas doses testadas. A

análise química deste extrato revelou a presença de quatro flavonóides, e, portanto, seria

importante o isolamento de cada um desses compostos para avaliar a relação entre as suas

estruturas químicas e as suas ações antioxidantes na gastroproteção. Desta forma esta planta

seria validada cientificamente, podendo assim ser utilizada como fitoterápico para uso em

animais e humanos após testes clínicos e.

adicionais testes farmacológicos.

Os diterpenos isolados da P. grandis

apresentaram efeitos gastroprotetores significativos.

A continuidade de estudos farmacológicos e clínicos permitirá avaliações adicionais que poderão

levá-los a se tornarem matérias-primas de medicamentos a serem disponíbilizados no mercado nas

formas de fitofármacos.

134

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144

ANEXOS

145

--------------------------- Mensagem Original ----------------------------

Assunto: Submission Confirmation

De: "Phytomedicine" <[email protected]nchen.de>

Data: Ter, Outubro 21, 2008 5:34 pm

Para: [email protected]

--------------------------------------------------------------------------

Dear Selene,

We have received your article "Gastroprotective effect of Byrsonima

sericea DC. leaf extract against ethanol-induced gastric injury: potential

mechanisms" for consideration for publication in Phytomedicine.

Your manuscript will be given a reference number once an editor has been

assigned.

Thank you for submitting your work to this journal.

Kind regards,

Elsevier Editorial System

Phytomedicine

146

Prezado(a) Prof.(a) Dr.(a) Patrícia Rodrigues,

Confirmo recebimento do manuscrito intitulado "Efeito do extrato etanólico de Byrsonima

Sericea DC. No sistema gastro – intestinal e avaliação da toxicidade em camundongos", de

autoria de Patrícia Rodrigues e col., para publicação na REVISTA BRASILEIRA DE

FARMACOGNOSIA. Informo que este trabalho recebeu o número de controle FG 734. De

acordo com as normas da revista, o mesmo foi encaminhado a dois referees. Assim que

tivermos os resultados lhe comunicaremos.

Atenciosamente,

Rita de Cássia Bacelar

Secretária Executiva

REVISTA BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA

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