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Paulo Augusto Amador Pereira
Estudo das alterações no sistema reprodutor de
camundongos expostos a contaminação ambiental
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Patologia
Orientador: Prof. Dr. Chin An Lin
São Paulo
2008
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Livros Grátis
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Dedicatória
Ao meu Pai e a minha Mãe
Agradeço à:
Prof. Dr. Paulo Saldiva: Pela oportunidade dada, pelo exemplo e por ter
sugerido o tema do trabalho.
Prof. Dr. Chin An Lin: Pela paciência, boa vontade e orientação.
Prof. Olaf Malm: Pela análise de hidrocarbonetos na água.
Prof. Luis Paulo Geraldo: Pela análise de metais na água.
Luiz, meu irmão: Sempre disposto a ajudar e a dar incentivo nas horas de
desânimo.
Ao Colega Alfésio Braga pelas sugestões, boa vontade e colaboração na
análise dos dados.
Á colega Lourdes Martins pela ajuda na análise de dados.
Ana Júlia Lichtenfels: Participou ativamente de toda a fase de trabalho com
os animais. Sua colaboração foi vital, seus conselhos imprescindíveis.
A todos os colegas do Laboratório de Poluição da FMUSP.
Ao Instituto Florestal por ter permitido minha entrada no Parque Estadual e
colaborado em tudo o que precisei.
Aos motoristas da FMUSP que, semanalmente, me levavam ao Parque
Estadual da Serra do Mar
“Uma pessoa inteligente resolve um problema, um sábio o previne”
Albert Einstein
Esta tese obedece:
As recomendações do Serviço de Biblioteca e Documentação da Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo, segundo o Guia de
apresentação de dissertações, teses e monografias, elaborado por Cunha
AC, Freddi MJAL, Crestana MF, Aragão MS, Cardoso SC, Vilhena V. São
Paulo. Serviço de Biblioteca e Documentação, 2004.
As normas de referências bibliográficas adaptadas do International
Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).
Abreviaturas dos títulos dos periódicos da List of Journals Indexed in the
Index Medicus.
Sumário
Lista de Abreviaturas
Lista de Símbolos
Lista de Tabelas
Lista de Figuras
Resumo
Summary
1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 1
1.1 Poluição Ambiental............................................................................ 2
1.2 Poluição do solo e da água ............................................................... 2
1.3 Produtos Químicos Orgânicos .......................................................... 3
1.4 Metais pesados ............................................................................... 11
1.5 Efeitos dos poluentes no Sistema Reprodutor ................................ 17
1.6 Áreas Contaminadas....................................................................... 21
1.7 Poluição ambiental em Cubatão ..................................................... 22
1.8 Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental......................... 25
2. OBJETIVOS............................................................................................. 26
3. METODOS............................................................................................... 28
3.1 Grupos ............................................................................................ 29
3.2 Coleta da Água ............................................................................... 30
3.3 Formação de Casais ....................................................................... 31
3.4 Sacrifício dos animais ..................................................................... 32
3.5 Parâmetros analisados.................................................................... 32
3.6 Análise da Água .............................................................................. 33
3.7 Análise Estatística........................................................................... 37
3.8 Ética ................................................................................................ 38
4. RESULTADOS......................................................................................... 39
4.1 Análise da Presença de Metais na Água......................................... 40
4.2 Análise da Presença de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
(HPA) .............................................................................................. 42
4.3 Peso das Gônadas.......................................................................... 43
4.4 Espermograma................................................................................ 44
4.5 Taxa de gravidez............................................................................. 48
4.6 Proporção de machos na prole (Sex ratio)...................................... 49
4.7 Histologia ........................................................................................ 50
5. DISCUSSÃO............................................................................................ 51
6. CONCLUSÃO .......................................................................................... 64
7. REFERÊNCIAS ....................................................................................... 66
Apêndice...................................................................................................... 74
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ANOVA Análise de Variância
BFA Bisfenol A
BMF Fator de Biomagnificação
CAPPesq Comissão de Análise para Projetos de Pesquisa
CETESB Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental
CLAE Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência
COBEA Código Brasileiro de Experimentação Animal
CONASQ Comissão Nacional de Segurança Química
DES Dietilestilbestrol
DDE Dicloro-difenil-dicloroetileno
DDT Dicloro-difenil-tricloroetano
DNA Ácido desoxirribonucléico
EPA Environmental Protection Agency
HCB Hexaclorobenzeno
HCBD Hexaclorobutadieno
HCH Heptaclor
HE Hematoxilina/Eosina
HPA Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
LPAE Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental
MCL Maximun Contaminant Level
PAS Ácido Periódico de Shiff
PCB Bifenil Policlorado
POP Poluente Orgânico Persistente
RNA Ácido Ribonucléico
LISTA DE SÍMBOLOS
o
C grau Celsius
cm centímetro
g grama
Hg Mercúrio
Kg Kilograma
L Litro
MeHg Metilmercúrio
µg Micrograma
mg Miligrama
ml Mililitro
n número
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Entrada do Parque Estadual da Serra do Mar. ............................24
Figura 2. Aterro de Lixo Químico (Pilões). ..................................................24
Figura 3. Médias das concentrações de espermatozóides. ........................46
Figura 4. Médias da concentração de espermatozóides móveis.................46
Figura 5. Médias da concentração de espermatozóides imóveis................47
Figura 6. Médias do percentual de espermatozóides móveis sobre o
total. .............................................................................................47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentrações dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos .........42
Tabela 2. Análise descritiva do peso dos testículos .....................................43
Tabela 3. Análise descritiva dos parâmetros do espermograma..................45
Tabela 4. Taxa de gravidez ..........................................................................48
Tabela 5. Proporção de machos na prole.....................................................49
Tabela 6. Análise descritiva do número de células de Sertoli ......................50
RESUMO
Pereira PAA. Estudo das alterações no sistema reprodutor de camundongos
expostos à contaminação ambiental [tese]. São Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2008. 73p.
O Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo desenvolve várias linhas de
pesquisa sobre os efeitos da poluição nos organismos vivos. O objetivo
deste trabalho foi estudar as alterações no sistema reprodutor de
camundongos balb-c machos expostos a água de manancial localizado
próximo a depósito de resíduos químicos. Oitenta camundongos balb-c
foram divididos em quatro grupos: Grupo A (controle) recebeu água mineral,
grupo B recebeu água de nascente na região do depósito, grupo C recebeu
água de cidade abastecida por água originada na região do depósito e grupo
D recebeu água de rio que passa ao lado do depósito. A exposição foi do
desmame até a idade adulta. Ao atingir a idade reprodutiva eles foram
acasalados e posteriormente sacrificados. Os parâmetros avaliados foram:
peso das gônadas, espermograma, taxa de gravidez, proporção de machos
na prole e contagem de células de Sertoli. A análise da água do grupo A e C
não mostrou presença de poluentes, a do grupo B mostrou presença de
cádmio nas concentrações de 3,58 ± 0,50 microgramas/L e de 2,92 ± 0,10
microgramas/L, a do grupo D mostrou a presença de hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos, de chumbo nas concentrações de 113 ± 11
microgramas/L e de 221 ± 16 microgramas/L, cádmio nas concentrações de
11,33 ± 0,50 microgramas/L, 12,6 ± 1,2 microgramas/L e 3,78 ± 0,35
microgramas/L e de mercúrio nas concentrações de 4,58 ± 0,92
microgramas/L e 5,3 ± 1,1 microgramas/L. Foram utilizados os testes de
Levene e Kolmogorov-Smirnov para se verificar a homogeneidade das
variâncias e a aderência a curva normal, respectivamente. Para as variáveis
que apresentaram esses dois princípios satisfeitos foram utilizados testes
paramétricos (ANOVA- analise de variância), caso contrario foram utilizados
testes não paramétricos (Teste de Kruskall-Wallis). Quando diferenças foram
observadas foi utilizado o teste de comparações múltiplas de Tukey
(KLEIBAUM). Os resultados mostraram que houve redução significativa da
proporção de machos na prole dos animais do grupo B e uma redução
marginalmente significante nos animais do grupo D. Os outros parâmetros
avaliados não mostraram diferenças entre os grupos. A alteração verificada
na proporção de machos do grupo B não pode ser explicada pela presença
de cádmio na água, pois o grupo D foi exposto a doses muito maiores e não
apresentou a mesma alteração. No presente trabalho não identificamos
diferenças que permitam afirmar que a exposição à água da região do
depósito de lixo químico cause alterações no sistema reprodutivo de
camundongos.
Descritores: 1.Poluição ambiental/efeitos adversos 2.Reprodução 3.Metais
pesados 4.Poluentes orgânicos 5.Camundongos 6.Testículos 7.Razão de
Masculinidade
SUMMARY
Pereira PAA. Study of the Alterations in Reproductive System of Mice
Exposed to Environmental Contamination [thesis]. Sao Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2008. 73p.
The Atmospheric Pollution Laboratory of The Sao Paulo University Medical
College develops research on the effects of environmental pollution in health.
This study investigated the effects on the reproductive system of balb-c mice
exposed to water from a river near a deactivated waste depositary. Eighty
male mice were separated in four groups: Group A (mineral water); Group B
(water from the water treatment station); Group C (water from Cubatao city);
Group D (water from the waste depositary region). They were exposed to
water since they were weaned until they reached sexual maturity. They were
coupled with females in reproductive age and after this mating time they were
sacrificed. The evaluated parameters had been testicle weight, sperm
analysis, pregnancy rate, sex ratio of the offspring and Sertoli cell count. The
analysis of the water did not show presence of pollutants in the group “a” and
group “c” water. Group “b” showed low levels of cadmium, 3,58 ± 0,50 µg/L
and 2,92 ± 0,10µg/L. Group “d” showed the presence of PAH’s and high
levels of lead (113 ± 11 µg/L and 221 ± 16 µg/L), cadmiun (11,33 ± 0,50
µg/L and 12,6 ± 1,2 µg/L) and mercury (4,58 ± 0,92 µg/L and 5,3 ± 1,1 µg/L .
The tests of Levene and Kolmogorov-Smirnov had been used to verify the
homogeneity of the variances and the tack to the normal curve, respectively.
The parametric tests used ANOVA and the non parametric tests used
Kruskall-Wallis test and the test of multiple comparisons of Tukey (Kleibaun).
Results: There were no differences between groups in testicle weight, sperm
analysis, pregnancy rate and Sertoli cell count. There was a significant
reduction in sex-ratio of the offspring in group b. This alteration cannot be
explained by the cadmium levels in group b water. In the present work we
cannot associate the exposition to water from the waste depositary and
reproductive alterations
Descriptors: 1.Pollution 2.Reproduction 3.Metals 4.Organic pollutants
5.Mice 6. Testicle 7.Sex-ratio
1. INTRODUÇÃO
Introdução
2
1.1 Poluição Ambiental
Poluição pode ser considerada a liberação de elementos, radiações,
vibrações, ruídos e substâncias ou elementos contaminantes em um
ambiente prejudicando os ecossistemas ou os seres humanos. Ao longo da
história, a poluição do meio ambiente tem sido um fator que acompanhou o
progresso da civilização. A contaminação do meio ambiente é associada à
capacidade do ser humano em alterar o ambiente que o cerca para a
extração de recursos para o seu proveito. A extração e o processamento de
recursos naturais provocam invariavelmente modificações no meio ambiente
e as conseqüências mais deletérias são as contaminações do solo, água e
ar. A poluição está associada com o aumento da incidência de doenças
crônicas e congênitas (Genuis, 2006)
1.2 Poluição do solo e da água
A conseqüência mais negativa do desenvolvimento industrial e da
agricultura em larga escala no mundo é a produção de resíduos cujo
manuseio e destino se tornou um grande problema uma vez que são
Introdução
3
potencialmente deletérios à saúde humana e aos organismos vivos (Asmus,
2008). Os Estados Unidos produzem 40 milhões de toneladas de lixo tóxico
por ano (Asmus, 2008) devido a sua intensa atividade industrial e agrícola e
pelo fato do registro da produção desses resíduos ser confiável. No Brasil, o
Ministério da Saúde identificou, entre os anos de 2001 e 2004, 15 237 áreas
com solo contaminado sendo 11 458 áreas de depósito de lixo urbano e
3769 de lixo industrial e pesticida (Asmus, 2008) e essas áreas expõem a
população local a riscos (Asmus, 2008), pois podem estar próximas de
comunidades, áreas de mananciais, lençóis freáticos e etc. Os principais
resíduos são os metais pesados (peso atômico acima de 22) e os produtos
químicos orgânicos.
1.3 Produtos Químicos Orgânicos
Este grupo engloba um grande número de substâncias, geralmente
hidrocarbonetos, derivados do petróleo ou do gás natural, associados a uma
ou mais moléculas de cloro (fertilizantes, conservantes, defensivos agrícolas,
produtos de degradação de plásticos e etc.). A produção destas substâncias
atinge valores muito altos, sendo que só a de pesticidas atingiu em 1995 o
total de 2,7 milhões de kg. Geralmente, estas substâncias apresentam
degradação muito lenta no ambiente.
As 12 substâncias mais nocivas ao ser humano foram agregadas em
uma categoria denominada “Poluentes Orgânicos Persistentes” (POPs).
Introdução
4
Uma destas substâncias é o bifenil policlorado (PCBs), que era utilizado
desde 1930 na fabricação de tintas e de fluídos para transformadores e que
devido a sua inércia química se espalhou na biosfera e nos tecidos de
muitas formas de vida. Mesmo após sua utilização ter sido banida
permanecerá por muito tempo no meio ambiente. (Bush, 1974; Carlson, 1973;
Powell, 1996).
O termo “POP” quando foi estabelecido se referia a um grupo de 12
substâncias sendo 9 defensivos agrícolas (Aldrin, Clordano DDT, Dieldrin,
Endrin, Mirex, heptaclor-HCH, hexaclorobenzeno-HCB e toxafeno) e três
produtos de uso industrial (dioxina, furano e bifenil policlorado-PCB).
As nove substâncias do grupo dos defensivos agrícolas foram introduzidas
entre 1920 e 1950, tiveram seu pico de produção entre 1960 e 1970 e em
1990 foram banidas para uso em plantações e combate a cupins na América
do Norte e Europa. Entretanto a produção e comércio no mundo
continuaram. Novas substâncias e produtos foram sendo adicionadas a lista
“POP” com o tempo (Jorgenson, 2001).
As quatro características principais de um POP são:
Estabilidade: Por ter degradação lenta permanece longo período no
ambiente. A meia-vida do Dieldrin pode chegar a 12,5 anos.
Bioacumulação: Por ter grande solubilidade em gordura irá se
acumular nos animais. Pode ser absorvida da água ou dos alimentos.
O Dieldrin, por exemplo, pode se acumular na gordura corpórea, leite
materno, sêmen, fígado e pode passar a barreira placentária.
Introdução
5
Biomagnificação: A substância é absorvida por pequenos organismos
e vai se concentrando progressivamente em direção ao topo da cadeia
alimentar. Pode ser expressa por um fator, o BMF (Fator de Biomagnificação).
Capacidade de se dispersar por longas distâncias (Jorgenson, 2001).
Em 2001, na cidade de Estocolmo foi assinada Convenção
Internacional onde os países signatários, dentre eles o Brasil, se
comprometeram a interromper o uso destas doze substâncias (POPs) e
tratar adequadamente os seus resíduos até a sua eliminação. Em 2005, o
decreto presidencial 5472, promulga o texto da Convenção de Estocolmo
(Brasil, 2005).
As principais substâncias químicas orgânicas citadas pela Agência de
Proteção Ambiental dos Estados Unidos em relação à contaminação da
água para consumo humano, seu nível máximo de contaminação (MCL)
permitido e seu principal potencial de risco são (EPA, 2008):
• Acrylamida: MCL=0mg/L. Atua no sistema nervoso, hematológico e
eleva risco para câncer.
• Alachlor: MCL=0mg/L. Causa problemas nos olhos, fígado rins e
baço. Eleva risco para câncer.
• Atrazina: MCL=0,003mg/L. Danos ao sistema cardiovascular e
problemas reprodutivos.
• Benzeno: MCL=0mg/L. Anemia, plaquetopenia e eleva risco para
câncer.
Introdução
6
• Benzopireno (PAHs): MCL=0mg/L. Infertilidade e aumento do risco
para câncer.
• Carbofuran: MCL=0,04mg/L. Problemas no sistema nervoso,
hematológico e reprodutivo.
• Tetracloreto de carbono: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e
aumento do risco para câncer.
• Clordano: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e no sistema nervoso.
Aumento do risco para câncer.
• Clorobenzeno: MCL=0,1mg/L. Problemas hepáticos e renais.
• 2,4-D: MCL=0,07mg/L. Problemas hepáticos, renais e na supra-
renal.
• Dalapon: MCL=0,2mg/L. Alterações renais.
• 1,2-Dibromo-3-cloropropano(DBCP): MCL=0mg/L. Distúrbios
reprodutivos e aumento do risco para câncer.
• o-Diclorobenzeno: MCL=0,6mg/L. Alterações renais, hepáticas e
circulatórias.
• p-Diclorobenzeno: MCL=0,075mg/L. Alterações hematológicas,
hepáticas e esplênicas.
• 1,2-Dicloroetano: MCL=0mg/L. Eleva risco para câncer.
• 1,1-Dicloroetileno: MCL=0,007mg/L. Problemas hepáticos.
• cis-1,2-Dicloroetileno: MCL=0,07mg/L. Problemas hepáticos.
• trans-1,2-Dicloroetileno: MCL=0,1mg/L. Problemas hepáticos.
• Diclorometano: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e aumento do
risco para câncer.
Introdução
7
• 1,2-Dicloropropano: MCL=0mg/L. Aumento do risco para câncer.
• Di(2-ethylexyl)adipato: MCL=0,4mg/L. Perda de peso, problemas
hepáticos e no sistema reprodutivo.
• Di(2-ethylexyl)phtalato: MCL=0mg/L. Perda de peso, problemas
hepáticos e aumento do risco para câncer.
• Dinoseb: MCL=0,007mg/L. Problemas no sistema reprodutor.
• Dioxina(2,3,,7,8-TCDD): MCL=0mg/L. Problemas no sistema
reprodutor e aumento do risco para câncer.
• Diquat: MCL=0,02mg/L. Causa catarata.
• Endothall: MCL=0,1mg/L. Problemas nos sistema digestório.
• Endrin: MCL=0,002mg/L. Problemas hepáticos.
• Epichlorohydrin: MCL=0mg/L. Aumento do risco para câncer.
• Ethylbenzeno: MCL=0,7mg/L. Problemas hepáticos ou renais.
• Dibromato de etileno: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos, renais e
no sistema reprodutor. Elevação do risco para câncer.
• Glifosato: MCL=0,7mg/L. Problemas renais e no sistema
reprodutor.
• Heptaclor: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e elevação do risco
para câncer.
• Hexaclorobenzeno: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos, renais, no
sistema reprodutor e elevação do risco para câncer.
• Hexaclorociclopentadieno: MCL=0,05mg/L. Problemas renais.
• Lindano: MCL=0,0002mg/L. Problemas renais ou hepáticos.
• Metoxyclor: MCL=0,04mg/L. Problemas reprodutivos.
Introdução
8
• Oxamyl(Vydate): MCL=0,2mg/L. Problemas no sistema nervoso.
• Bifenil policlorado (PCBs): MCL=0mg/L. Deficiência imunológica,
alterações no sistema nervoso e reprodutivo. Aumento do risco
para câncer.
• Pentaclorofenol: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos ou renais.
Aumento do risco para câncer.
• Picloram: MCL=0,5mg/L. Problemas hepáticos.
• Simazine: MCL=0,004mg/L. Problemas hematológicos.
• Estireno: MCL=0,1mg/L. Problemas renais, hepáticos e
circulatórios.
• Tetracloroetileno: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e aumento do
risco para câncer.
• Tolueno: MCL=1mg/L. Problemas no sistema nervoso, fígado e
rins.
• 1,2,4-Triclorobenzeno: MCL=0,07mg/L. Problemas na supra-renal.
• 1,1,1-Tricloroetano: MCL=0,2mg/L. Problemas hepáticos, no
sistema circulatório e nervoso.
• 1,1,2-Tricloroetano: MCL=0,003mg/L. Problemas hepáticos, renais
e imunológicos.
• Tricloroetileno: MCL=0mg/L. Problemas hepáticos e aumento do
risco para câncer.
• Cloreto de vinil. MCL=0mg/L. Aumento do risco para câncer.
• Xyleno: MCL=10mg/L. Problemas no sistema nervoso.
Introdução
9
Um dos mecanismos de ação é a capacidade de atuar como
xenoestrogênios ou disruptores endócrinos. Xenoestrogênios são substâncias
que, uma vez no organismo, tem a capacidade de se ligar aos receptores
estrogênicos e causar efeito por terem estrutura similar ao estrogênio
(Nesaretman e Darbre, 1997).
Os estrogênios são esteróides sexuais que tem diversos efeitos em
vários órgãos e tecidos alvo por todo o organismo. Esta classe de hormônios
geralmente regula crescimento e diferenciação (McLachlan, 1995). Um orgão
alvo é caracterizado pela presença de receptores para esteróides.
Estes receptores são intracelulares, mais precisamente, intranucleares.
Os disruptores ou xenoestrogênios se ligam aos receptores através de
alguns mecanismos (Mueller, 2003).
a) Difusão através da membrana celular
b) Transferência através de membrana nuclear ao núcleo e ligação a
uma proteína receptora
c) Interação do complexo hormônio-receptor ao DNA nuclear
d) Síntese de RNA-mensageiro (m-RNA)
e) Síntese de proteína específica que leva a atividade celular específica
Como todos os esteróides, a estrutura básica dos estrogênios é o
peridrociclopentanofenantreno diferindo apenas no número e posição dos
átomos de carbono no restante da cadeia (18 carbonos para os estrogênios).
Várias substâncias tanto naturais quanto artificiais podem ter
afinidade por estes receptores agindo como agonistas ou antagonistas,
Introdução
10
parciais ou não (Crews e MacLachlan, 2006; Sohoni e Sumter,1998).
Todas estas substâncias podem ser chamadas de xenoestrogênios.
Como substâncias naturais podemos citar os fitoestrogênios,
encontrados em diversos vegetais e que tem sido utilizados pela
indústria farmacêutica como tratamento para a Síndrome do Climatério.
Já como substâncias artificiais temos dois grupos: O primeiro é o dos
hormônios sintéticos, criados pela indústria farmacêutica e, o outro
grupo é o dos agentes químicos utilizados nos mais diversos campos da
atividade humana e que por características de sua forma molecular tem
a capacidade de se ligar aos receptores para esteróides (Hall, 2002;
MacLachlan, 1995; Battershill, 1994).
A Síndrome do dietilestilbestrol (DES) representa o modelo clássico
da ação de estrogênios ambientais: O DES é um estrogênio sintético que
foi muito utilizado pelos médicos para prevenir abortamento espontâneo
em gestantes entre 1948 e 1971 quando seu uso foi proibido para este
fim. Durante o período embrionário, as filhas de mulheres que usaram o
DES (mais de um milhão de mulheres entre 1960 e 1970) eram
submetidas a um estímulo estrogênico que normalmente não ocorreria
nesta fase e, durante sua vida adulta apresentaram taxas elevadas de
adenocarcinoma de células claras na vagina, o que normalmente seria
muito raro. Ou seja, a exposição a uma substância com ação hormonal
durante a fase embrionária apresentou conseqüências na vida adulta
(Colborn et al, 1993).
Introdução
11
1.4 Metais pesados
Os metais pesados ocorrem naturalmente nos solos e alguns deles,
tais como cobre (Cu), zinco (Zn) e cobalto (Co), desempenham importante
papel na nutrição de plantas e animais, enquanto outros, como cádmio (Cd),
chumbo (Pb), arsênio (As) e selênio (Se), exercem efeitos deletérios sobre
vários componentes da biosfera. Na maioria das vezes, esses elementos
estão presentes nos solos, em concentrações ou formas que não oferecem
risco para o ambiente. Todavia, nas últimas décadas, atividades
antropogênicas têm elevado, substancialmente, a concentração de alguns
metais em diversos ecossistemas. O acúmulo de metais em solos agrícolas
é um aspecto de grande preocupação quanto à segurança ambiental.
Esses elementos podem expressar seu potencial poluente diretamente nos
organismos do solo, pela disponibilidade às plantas em níveis fitotóxicos,
além da possibilidade de transferência para a cadeia alimentar, por meio das
próprias plantas, ou pela contaminação das águas de superfície e profundas
(Silva, 2007; Fernandes, 2007). O cádmio e o chumbo, nos animais, podem
interferir no metabolismo normal do zinco (Telisman et al, 2000).
Resíduos contendo Cádmio: O cádmio tem mais motilidade em
ambientes aquáticos do que a maioria dos outros metais. É também
bioacumulativo e persistente no meio ambiente (meia-vida t1/2 de 10-30
anos) (Labuska et al, 2000; Queiroz, 2006). É encontrado em água de
superfície ou subterrânea como o íon +2 hidratado, ou como um complexo
iônico com outras substâncias inorgânicas ou orgânicas. Enquanto as
Introdução
12
formas solúveis podem migrar na água, o cádmio, em complexos insolúveis
ou adsorvido a sedimentos, é relativamente imóvel. De forma semelhante, o
cádmio no solo pode existir em forma solúvel em água de solo, ou em
complexos insolúveis com componentes inorgânicos e orgânicos do solo
(Labuska et al, 2000). Além disso, o cádmio é facilmente disponível para a
ingestão em grãos, especialmente o arroz, e vegetais, havendo ainda uma
associação clara entre a concentração de cádmio no solo e as plantas que
crescem naquele solo (Labuska et al, 2000). Quando presente em uma
forma biodisponível, sabe-se que tanto organismos aquáticos quanto
terrestres acumulam o cádmio. Estudos mostram acúmulo em animais
aquáticos em concentrações centenas ou, até mesmo, milhares de vezes
mais altas do que na água. Os fatores de bioconcentração relatados variam
de 113 a 18.000 para invertebrados e de 3 a 2.213 para peixes. Há, também,
relatos de acúmulo de cádmio em gramíneas, culturas alimentares,
minhocas, aves, gado, cavalos, e vida selvagem. As evidências de
biomagnificação são inconclusivas. No entanto, a absorção do cádmio do
solo por culturas alimentares pode resultar em altos níveis de cádmio na
carne de gado e em aves (especialmente no fígado e nos rins). Esse acúmulo
de cádmio na cadeia alimentar tem implicações importantes para a
exposição humana, não importando se ocorre uma biomagnificação
significativa (Labuska et al, 2000). O cádmio não tem função bioquímica ou
nutricional, e é altamente tóxico para plantas e animais (Labuska et al, 2000).
Em humanos e animais, há fortes evidências de que o rim é o principal alvo
da toxicidade do cádmio, após exposição por tempo prolongado. Os danos
Introdução
13
renais incluem proteinúria e decréscimo na taxa de filtração glomerular.
Outros efeitos tóxicos do cádmio, baseados em achados de estudos
toxicológicos ocupacionais, em animais e epidemiológicos, são
sumarizados a seguir: A inalação de altos níveis de fumaça ou poeira de
óxido de cádmio é extremamente irritante para o tecido respiratório, e
exposições agudas a altos níveis podem ser fatais. Em níveis mais baixos,
a inflamação dos pulmões pode causar enfisema e dispnéia. Estudos em
animais confirmaram que a exposição por inalação ao cádmio leva a
problemas respiratórios. Vários estudos epidemiológicos tentaram
determinar uma relação entre exposição ocupacional respiratória ao
cádmio e câncer de pulmão e próstata. Estes estudos, juntamente com
estudos epidemiológicos em animais, fundamentam o papel do cádmio na
carcinogênese (Labuska et al, 2000; IARC, 1998). O cádmio, e certos
compostos de cádmio, são, portanto, listados pela Agência Internacional
de Pesquisa em Câncer como carcinogênicos (Labuska et al, 2000).
O Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos no
seu 8º Relatório Sobre Carcinógenos sugere o cádmio e certos compostos
de cádmio como prováveis candidatos a carcinógenos humanos. A exposição
acentuada via oral pode resultar em sérias irritações no epitélio
gastrointestinal, náusea, vômitos, salivação, dor abdominal, cólica e
diarréia (Labuska et al, 2000 ).
Resíduos contendo Mercúrio: Podem causar envenenamento agudo
ou crônico, sua dose letal varia entre 20 e 30 mg. Após sua absorção pelo
organismo se deposita no fígado, baço, rins e ossos. O íon mercúrio
Introdução
14
corresponde a apenas 2% do mercúrio absorvido pelo Homem, sendo mais
de 90% absorvido através do composto orgânico metil mercúrio. O “Water
Quality Criteria” recomenda, para águas de abastecimento público, um total
de mercúrio que não exceda a dois microgramas por litro (CETESB, 1982).
Devido ao fato de o mercúrio ser o único metal que pode existir como líquido
e vapor em temperatura ambiente, o seu comportamento ambiental difere do
da maioria dos outros elementos tóxicos (Labuska et al, 2000). O mercúrio
pode existir em três estados de valência, Hg (0), Hg (I) e Hg (II). Na atmosfera,
o mercúrio elementar é sem dúvida a forma mais comum e, como vapor, é
responsável pela propagação global do mercúrio. Além disso, em um grau
muito menor, o mercúrio pode estar associado à material particulado, que é
removido por deposição seca ou úmida. As fontes de entrada na atmosfera
podem ser mais significativas em áreas onde outras fontes, como os rios
contaminados, são menos importantes ou não-existentes (Labuska et al, 2000).
No ambiente aquático, o mercúrio é mais comumente encontrado no
estado mercúrico Hg (II), e o seu destino, uma vez que o composto é
lançado, é dominado pela adsorção rápida a material orgânico solúvel e
particulado; seguido pela floculação, precipitação e o acúmulo final no
sedimento de fundo. Devido à força com a qual o mercúrio se liga ao
sedimento, a troca com a coluna de água é geralmente pequena, embora
possa ser acelerada em águas salinas, e na presença de altas
concentrações de sulfetos (condições anóxicas). O acúmulo de mercúrio
proveniente de sedimentos pode, portanto, ser uma rota dominante para a
ingestão por organismos aquáticos e é responsável por concentrações
Introdução
15
relativamente altas em organismos detritívoros, tanto em sistemas de água
doce quanto marinhos (Labuska et al, 2000). O mercúrio inorgânico pode ser
metilado por microorganismos, inerentes aos solos, sedimentos de água
doce e salgada. A forma mais comum de mercúrio orgânico é o
metilmercúrio (MeHg), que é solúvel, móvel, e rápido para penetrar na
cadeia alimentar aquática. A retenção seletiva de MeHg em cada passo da
cadeia alimentar, em relação ao mercúrio inorgânico, é relacionada à sua
alta solubilidade em lipídios, à sua meia-vida biológica longa, e ao aumento
na longevidade dos predadores de topo de cadeia. Como resultado, o MeHg
fornece um dos raros exemplos de biomagnificação metálica em cadeias
alimentares. Por exemplo, concentrações em peixes carnívoros no topo das
cadeias alimentares em água doce e água salgada são biomagnificadas
10.000-100.000 vezes comparando-se às concentrações encontradas em
águas ambientes. A importância dessa bioacumulação é que ela geralmente
é a fonte mais importante de exposição humana não ocupacional ao
mercúrio. O mercúrio é um metal traço extremamente tóxico e não-essencial
que não tem função bioquímica ou nutricional. Os mecanismos biológicos
para a sua remoção são pobres e, conforme mencionado anteriormente, o
mercúrio é o único metal que sabe-se que se biomagnifica, isto é, acumula-
se progressivamente através da cadeia alimentar. A exposição aguda a
níveis elevados de sais de mercúrio, ou a exposição crônica a doses baixas,
é diretamente tóxica ao rim. A exposição ao MeHg também resultou em
danos permanentes ao sistema nervoso central, aos rins e ao feto em
desenvolvimento. Os estudos sobre a toxicidade aquática do mercúrio são
Introdução
16
numerosos, e novamente mostram que o MeHg é muito mais tóxico do que
qualquer uma das formas inorgânicas (Labuska et al, 2000)
Resíduos contendo Chumbo: Quando o chumbo é lançado no meio
ambiente, ele tem um longo tempo de residência comparado à maioria dos
outros poluentes. Como resultado, ele tende a se acumular em solos e
sedimentos, onde, devido à baixa solubilidade, pode permanecer acessível à
cadeia alimentar e ao metabolismo humano por muito tempo. Formas
orgânicas tóxicas estão também presentes no meio ambiente, a partir de
fontes diretas (fabricação, transporte e armazenamento de gasolina com
chumbo e as conseqüentes emissões de exaustão de carro) além da
possível metilação química/biológica de chumbo inorgânico em sedimentos
anaeróbicos (Labuska et al, 2000). A quantidade de chumbo que permanece
em solução em águas de é freqüentemente baixa. Além disso, uma fração
significativa de chumbo insolúvel pode ser incorporada em material
particulado de superfície de escoamentos, ou como íons sorvidos
(absorvidos e adsorvidos) ou cobertura de superfície em sedimento, ou pode
ser transportada como parte de matéria orgânica viva ou não-viva. Plantas e
animais podem acumular chumbo a partir da água, de solos e sedimentos,
sendo as formas orgânicas mais facilmente absorvidas do que as
inorgânicas. O chumbo é um dos metais tóxicos mais presentes entre os
existentes. Ele não tem função nutricional, bioquímica ou fisiológica
conhecida, e visto que não há necessidade biológica demonstrada, e que ele
é tóxico para a maioria dos organismos vivos, a principal preocupação no
momento é em que dose o chumbo pode se tornar tóxico. Os efeitos tóxicos
Introdução
17
do chumbo são os mesmos, independentemente de se ele é ingerido ou
inalad. Esses efeitos incluem distúrbios no sistema nervoso, anemia, doença
cardiovascular, distúrbios no metabolismo ósseo, na função renal e na
reprodução (Labuska et al, 2000).
Resíduos contendo Cromo: Altamente tóxicos na forma hexavalente.
A recomendação do “Water Quality Criteria” para águas de abastecimento
público é de no máximo 0,05mg/litro. Dose letal em animais varia entre 50 e
500 mg/kg (CETESB, 1982).
Resíduos contendo molibdênio, vanádio, potássio, níquel, cobre e
manganês: O molibdênio é pouco tóxico ao ser humano. O Vanádio é irritante
do trato respiratório e seu pior efeito ecológico é quando está presente no ar.
O “Water Quality Criteria” recomenda, para águas de abastecimento público,
concentração de no máximo 0,1mg/L (CETESB, 1982).
Nas últimas décadas têm sido discutidos os efeitos destes agentes
químicos nos seres humanos e seu impacto ambiental.
1.5 Efeitos dos poluentes no Sistema Reprodutor
A literatura mostra uma grande quantidade de estudos que investigam
a possibilidade de que a exposição a poluentes possa estar relacionada com
o aumento da ocorrência de distúrbios reprodutivos como redução da
espermatogênese (Dallinga, 2002; Mehta et al, 2003) e da incidência de
tumores em órgãos hormônio sensíveis como mamas, ovário, útero e
Introdução
18
próstata (Davis et al, 1993; Brody et al, 2003; Charlier et al, 2003) tanto em
animais quanto em seres humanos (Skarda, 2002). Outros indicam que a
exposição a estes agentes durante o período embrionário pode causar
alterações da organogênese (Jones, 1995; Fry, 1995; Varnagy, 1996) e na
qualidade do sêmen (Delbés, 2006).
Vários estudos tem sido apresentados indicando que a qualidade e a
quantidade de espermatozóides do sêmen humano está apresentando um
declínio (Adamapoulos et al, 1996; Comhaire et al, 2007) outros não
verificam nenhuma anormalidade (Carlsen, 2005). Muitos ambientalistas e
cientistas consideram a possibilidade da humanidade estar se aproximando
de uma “Crise de Fertilidade”. Vários fatores podem ser indicados como
possíveis causas para a redução da fertilidade masculina, entre eles estão
inclusos os metais e vários agentes químicos utilizados largamente na
indústria e na agricultura, maior exposição a radiações, contaminação do
ambiente por xenoestrogênios e até o aumento da temperatura global
(Sinawat, 2000; Delbés, 2006; Wade et al 2002; Multigner e Oliva, 2002).
Carlson et al (1973) injetaram soluções contendo PCBs em ovos de
galinha durante a embriogênese e observou aumento do numero de mortes
dos embriões e, diminuição da taxa de eclosão dos ovos.
Bush et al (1974) expuseram galinhas a PCBs através da ração e
observou diminuição na porcentagem de ovos eclodidos e aumento no
número de malformações dos filhotes.
Introdução
19
Powell et al (1996) injetaram isômeros de PCB’s em ovos de galinhas
e verificou aumento do número de embriões malformados, redução do peso
de nascimento e grande atividade teratogênica.
Cummings et al (1996) mostraram efeito do 2,3,7,8-
Tetrachlorodibenzeno-p-dioxina como promotor de endometriose em ratos e
camundongos.
Hsieh et al (1998) mostraram que a genisteína, um fitoestrogênio, pode
estimular o crescimento de células de câncer de mama in vivo e in vitro.
Telisman et al (2000) analisando o sêmen de trabalhadores com
níveis séricos de chumbo e cádmio encontraram redução do número e
aumento de alterações morfológicas nos espermatozóides.
Selevan et al (2000) mostraram que homens tem piora da qualidade
do sêmen com redução da motilidade e alteração da forma dos
espermatozóides durante períodos de grande elevação da poluição atmosférica.
Birnbaum e Cummings (2002) afirmam que evidências epidemiológicas
apontam que a prevalência crescente de endometriose está associada à
exposição a organoclorados como a dioxina.
Rajpurkar et al (2002) verificou aumento de apoptose em túbulos
seminíferos de ratos expostos a fumaça de cigarro.
De Rosa et al (2003) mostraram redução da motilidade dos
espermatozóides de homens expostos a poluição do ar.
Ramos et al (2003), expuseram ratas grávidas ao Bisphenol A
(BFA), xenoestrogênio encontrado em plásticos, resína epoxi, selantes de
latas de comida, tubos de pasta de dente e embalagens de leite, e
Introdução
20
encontrou nos filhotes machos, alterações histofuncionais no eixo
hipotálamo-hipófise-gonadal.
Benoff et al (2003) correlacionaram níveis de chumbo no plasma
seminal com piora na qualidade dos espermatozóides.
Long et al (2004) expuseram ratas ao Bisphenol A e encontraram
proliferação do epitélio vaginal.
Rubes et al (2005) observaram aumento da fragmentação do DNA em
homens expostos a poluição do ar em períodos nos quais a poluição
atmosférica estava elevada.
Spano et al (2005) encontraram alteração n cromatina dos
espermatozóides de homens com expostos ao PCB e ao p,p’-DDE, um
metabólito do DDT.
Mohallen et al (2005) encontraram aumento de óbitos fetais e de
falhas da implantação embrionária em ratas expostas à poluição do ar em
São Paulo.
Tiido et al (2006) encontraram redução na proporção entre
espermatozóide Y e X em homens com presença de PCB e DDE no sêmen.
Ahmadnia et al (2007) expuseram ratos a fumaça de cigarro e
encontraram piora da qualidade da espermatogênese.
Benoff et al (2008) mostraram astenospermia em ratos expostos à
altas doses de cádmio.
Genuis (2006) afirma que as principais publicações na área de
Ginecologia e Obstetrícia não dão a importância necessária ao tema que
relaciona exposição a poluentes e a saúde reprodutiva e que deve haver um
esforço para esta situação mude.
Introdução
21
1.6 Áreas Contaminadas
Segundo a Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental –
CETESB, uma área contaminada pode ser definida como área, local ou
terreno onde há comprovadamente poluição ou contaminação causada
pela introdução de quaisquer substâncias ou resíduos que nela tenham
sido depositados, acumulados, armazenados, enterrados ou infiltrados de
forma planejada, acidental ou até mesmo natural. Muitas das áreas
contaminadas são decorrentes de atividades industriais já encerradas,
tornando difícil a identificação de responsabilidades e, mesmo quando o
responsável é identificado técnica e judicialmente, a execução da
exigência de recuperação da área degradada e de ressarcimento por
danos ambientais e à saúde de populações. Enquanto as pendências
judiciais permanecem, o risco de contaminação humana e ambiental
cresce. O levantamento de áreas contaminadas no País com sua
localização e substâncias presentes ainda é muito insipiente com
exceção dos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul
(CONASQ, 2003).
As áreas contaminadas em Países em desenvolvimento geralmente
apresentam diversos poluentes diferentes reunidos (Yanez et al, 2002).
Introdução
22
1.7 Poluição ambiental em Cubatão
No Parque Estadual da Serra do Mar, núcleo de Itutinga-Pilões,
localizada no município de Cubatão, área de reserva ambiental e de
manancial onde funciona uma unidade de captação da SABESP que
abastece a cidade de Cubatão existiu até 1985 um depósito de lixo municipal
que recebia material proveniente do pólo industrial (Lixão de Pilões). Após a
comprovação da contaminação do ambiente este depósito foi desativado e
aterrado. A CETESB comprovou na época a presença de metais (alumínio,
bário, arsênio, cádmio, cobre, chumbo, cromo, ferro, prata, zinco, mercúrio e
manganês) e de organoclorados que são substâncias com ação
xenoestrogênica ou atividade de disruptores endócrinos (CETESB, 1982).
O episódio ficou conhecido como “Caso Rhodia”.
Na década de 60 (1960-1970), a indústria química Clorogil, adquirida
pela Rhodia S.A. em 1976 se instalou na cidade de Cubatão com a
finalidade de produzir agrotóxicos e solventes clorados. A empresa produziu
mensalmente, entre 1966 e 1978, cerca de 82 toneladas de pentaclorofenol
e 215 toneladas de pentaclorofenato de sódio (“Pó da China”), tendo como
subproduto cerca de 600 toneladas de ácido clorídrico. A partir de 1974,
passou a fabricar, também, cerca de 18 mil toneladas por ano de tetracloreto
de carbono e percloroetileno. Em 1978, devido a inúmeras complicações de
ordem trabalhista na área de higiene e segurança do trabalho, a fábrica de
pentaclorofenol foi fechada. Em 1993, a fábrica de tetracloreto de carbono e
de percloroetileno também foi fechada. Durante a atividade, a empresa
Introdução
23
contaminou a sua própria área e depositou os resíduos em locais
inadequados para esse fim, por serem próximos a áreas povoadas e com
possibilidade de contaminação de rios e mangues da região (CONASQ, 2003).
A Rhodia, mantinha depósitos no “lixão” municipal, no Vale dos Pilões
(Lixão de Pilões), na beira do rio Cubatão, na região de Samaritá, em São
Vicente, e no Sítio do Coca em Itanhaém. Estima-se que a empresa tenha
gerado em torno de 20 mil toneladas de resíduos tóxicos, cuja composição
aproximada é de 70% a 80% de hexaclorobenzeno – HCB e 10% a 15% de
hexaclorobutadieno – HCBD. Outras substâncias aparecem em menor
quantidade. Estudos mostraram a presença de níveis elevados de HCB no
solo, nos pescados, no sangue e no leite materno dos moradores, nos
trabalhadores da fábrica e no rio Cubatão (CONASQ, 2003).
Outro fato interessante é que a Prefeitura de Cubatão recebeu como
doação da Carbocloro duzentos mil litros de terra contaminada com níveis até
100 vezes superiores ao limite de intervenção estabelecido pela CETESB de
várias substâncias (HCB, pentaclorofenol, tetracloroetileno e 1,2 dicloroetano) e
essa terra foi utilizada no aterro do lixo domiciliar. A Carbocloro soube da
contaminação após a doação e a terra contaminada era originaria de um
terreno que a empresa havia comprado da Rhodia (CONASQ, 2003).
Em relação aos metais, Cubatão ocupa o quarto lugar no ranking
nacional de lançamento de resíduos industriais contendo metais na água,
cerca 24,1 toneladas, perdendo apenas para São Paulo, Volta Redonda e
Rio de Janeiro (CONASQ, 2003).
A área contaminada de pilões ainda é monitorizada pela CETESB e
continua evidenciando a presença de contaminantes (CETESB, 2006).
Introdução
24
Figura 1. Entrada do Parque Estadual da Serra do Mar.
Figura 2. Aterro de Lixo Químico (Pilões).
Introdução
25
Quem visita o local sem conhecimento da existência do aterro de lixo
químico não teria como saber dos perigos de contaminação local se não
fosse pela existência destas placas. A região é área de mata atlântica muito
bonita.
1.8 Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental
O Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental (LPAE) do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo faz estudos sobre a poluição desde a década de 1980.
Inicialmente, os trabalhos eram sobre os efeitos da poluição do ar sobre os
animais de experimentação e posteriormente, os trabalhos foram
desenvolvidos também na área de epidemiologia. Recentemente, o LPAE
também vem desenvolvendo trabalhos na observação de efeitos de
contaminação de outros ambientes como solo e água.
Este estudo foi desenvolvido como um projeto que pretende observar
os efeitos deletérios da contaminação de água por metais pesados e
poluentes orgânicos no estuário do Parque Estadual da Serra do Mar, em
Cubatão, e seus possíveis efeitos em animais de experimentação. O trabalho
foi conduzido no Laboratório de Poluição Atmosférica Experimental do
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo.
2. OBJETIVOS
Objetivos
27
Objetivo Geral
Avaliar o efeito da exposição à água proveniente de meio ambiente
contaminado na fertilidade e no sistema reprodutor masculino de
camundongos.
Objetivos Específicos
a) Avaliar se há influência sobre o peso das gônadas dos machos
b) Avaliar se há alteração no espermograma dos machos
c) Avaliar se ocorre variação da taxa de gravidez do casal
d) Avaliar se ocorrem diferenças na proporção de machos da prole
e) Avaliar alterações histológicas nas gônadas dos machos
3. MÉTODOS
Métodos
29
3.1 Grupos
Oitenta camundongos machos Balb-c divididos, aleatoriamente, em 4
grupos foram criados desde o desmame até a idade reprodutiva. Cada grupo
recebeu água proveniente de um local específico e ficou separado em
gaiolas identificadas com as letras: A, B, C e D.
Grupo A: Água mineral (Crystal
®
); n=20
Grupo B: Água proveniente do ponto de captação da Sabesp no rio
Cubatão que fica no Núcleo Itutinga-Pilões do Parque Estadual da
Serra do Mar e que abastece a cidade de Cubatão; n=18
Grupo C: Água proveniente da rede de abastecimento da Sabesp em
Cubatão (Rua Manoel Jorge 83); n=22
Grupo D: Água proveniente do rio Pilões que passa pelo local do antigo
depósito de resíduos industriais do Núcleo Itutinga-Pilões do
Parque Estadual da Serra do Mar (Lixão de Pilões); n=20
Os animais foram fornecidos pelo Biotério de Criação da Faculdade
de Medicina da USP e mantidos no Biotério do Departamento de Patologia
da Faculdade de Medicina da USP que segue as normas do Guide for the
Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory and Animal
Métodos
30
Resources, National Academy of Sciences, Washington D.C.; 1996 e aos
princípios éticos da legislação brasileira e Código Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA). Foram alimentados com ração própria
para a espécie. A ração e a água eram administradas ad libitum.
3.2 Coleta da Água
A água foi coletada semanalmente e mantida em recipiente de vidro.
O volume de cada coleta foi de 2 litros. Cada grupo tinha seus recipientes de
vidro próprios e identificados.
A água do Grupo A (Mineral) foi transferida diretamente da garrafa na
qual foi adquirida para os recipientes de vidro.
A água do Grupo B (Sabesp) foi coletada na estação de captação de
água da Sabesp no Núcleo Itutinga-Pilões do Parque Estadual da Serra do
Mar antes do ponto de captação da Sabesp através da imersão do recipiente
de vidro em uma profundidade de 50 cm da superfície da água e abertura da
tampa para permitir a entrada da água. Após o recipiente estar repleto ele
era fechado e retirado de dentro do rio.
A água do Grupo C (Rede da Sabesp em Cubatão) foi coletada de
torneira situada na Rua Manoel Jorge 83 em Cubatão. A água era transferida
diretamente da torneira para o recipiente de vidro após desprezarmos os
primeiros 500 ml da vazão da torneira.
Métodos
31
A água do Grupo D (Lixão de Pilões) foi coletada no rio Pilões
próximo ao local do antigo depósito de resíduos industriais do Núcleo
Itutinga-Pilões do Parque Estadual da Serra do Mar através da imersão do
recipiente de vidro em uma profundidade de 50 cm da superfície da água e
abertura da tampa para permitir a entrada da água. Após o recipiente estar
repleto ele era fechado e retirado de dentro do rio.
Os recipientes foram transportados para São Paulo em caixa de
isopor com gelo e transferidos posteriormente para geladeira onde foram
mantidos sob temperatura constante.
Os recipientes de vidro abasteciam os bebedouros das gaiolas onde
os camundongos foram criados. A ingestão de água pelos animais era livre.
3.3 Formação de Casais
Após atingirem a idade reprodutiva, que neste trabalho foi fixada em
três meses de idade, cada camundongo macho foi colocado em uma gaiola
separada e recebeu a companhia de uma fêmea também em idade
reprodutiva proveniente do Biotério de Criação da Faculdade de Medicina da
USP. Os 80 casais formados ficaram separados em gaiolas identificadas de
A1 até A20, B1 até B18, C1 até C22 e D1 até D20.
Cada casal ficou unido por 10 dias para permitir o acasalamento, que
era constatado pela presença do “plug” vaginal, que é o tampão mucoso que
fica visível na vulva do camundongo fêmea após o coito.
Métodos
32
3.4 Sacrifício dos animais
Os machos foram sacrificados após o período de acasalamento e as
fêmeas mantidas em gaiolas individuais para aguardar confirmação da
gestação e nascimento dos filhotes sendo sacrificadas posteriormente.
Os animais foram colocados em uma caixa hermeticamente fechada e pré-
anestesiados com isoflurano (Cristália Produtos Farmacêuticos Ltda.). Após
a constatação de falta de sensibilidade os animais foram sacrificados por
exsanguinação através de laparotomia e secção da aorta abdominal.
3.5 Parâmetros analisados
Peso dos testículos;
Espermograma;
Taxa de gravidez das fêmeas
Proporção entre macho e fêmea da Prole (Sex-ratio)
Histologia das gônadas
3.5.1. Peso dos testículos: Posteriormente ao sacrifício, os testículos
foram retirados e pesados individualmente em balança de precisão.
A presença de alguma discrepância na obtenção desta medida poderia
representar um indicador quantitativo de normalidade desses órgãos ou da
presença de processos patológicos como tumor, edema, inflamação, etc.
(Mantovani & Maranghi, 2005).
Métodos
33
3.5.2. Espermograma: Para a avaliação da concentração dos
espermatozóides utilizamos os espermatozóides presentes na porção caudal
do epidídimo. Os espermatozóides foram então extraídos com o auxílio de
duas agulhas hipodérmicas em 0,5 ml de meio Ham´s F10 (Irvine scientific,
Santa Ana, CA, USA) e mantidos por 10 minutos em banho-maria á 32ºC.
O esperma coletado foi quantificado em uma câmara de contagem do tipo
Makler (Seifa Medical, Israel) e a concentração expressa em 10
6
/ml.
3.5.3. Histologia das gônadas: Após a retirada dos testículos, os
órgãos foram pesados, perfurados com agulha de insulina e fixados em
líquido de Bouin por 2 horas. Posteriormente fixados em álcool 70 e
enviados para corte histológico e fixação em parafina. As lâminas foram
avaliadas através da microscopia óptica, aumento de 400x, coloração HE
(Hematoxilina/eosina) e PAS (Ácido Periódico de Shiff). Os parâmetros
avaliados foram: Contagem de células de Sertoli em 10 cortes transversais
de túbulos seminíferos no mesmo estádio para cada animal sendo que o
estádio escolhido foi o VIII.
3.6 Análise da Água
Uma vez por mês, durante a visita semanal para a coleta da água que
era administrada aos camundongos, foi também coletado 500 ml de água de
cada um dos quatro pontos de coleta para posterior análise. As amostras
provenientes do mesmo local foram reunidas em um mesmo recipiente de vidro.
Métodos
34
3.6.1. Metais:
Um volume em torno de 150 mL de cada amostra foi evaporado até
aproximadamente 100 mL. Adicionou-se 10 mL de HNO
3
concentrado e
procedeu-se a digestão ácida até quase a secagem total da amostra.
Em seguida o resíduo foi filtrado e diluído até o volume de 25 mL.
Houve, portanto, uma concentração de seis vezes nas amostras analisadas.
Para a determinação dos teores de Chumbo e Cádmio utilizou-se o
Espectrômetro de Absorção Atômica com chama, da Perkin Elmer, modelo
AAnalyst 100. No caso do Mercúrio, empregou-se o sistema hidreto metálico
MHS10 acoplado ao espectrômetro.
Limites de Detecção:
Considerando que as amostras foram concentradas seis vezes, os
limites de detecção foram:
- Para Pb – 40x10
-6
g/L ou 40 μg/L.
- Para Cd – 2,5x10
-6
g/L ou 2,5 μg/L.
- Para Hg – 0,1x10
-6
g/L ou 0,1 μg/L.
3.6.2. Poluentes Químicos
Limpeza do Material
Toda vidraria utilizada no experimento foi lavada com detergente
comum em água corrente e posteriormente lavada em banho de imersão de
Detertec - Vetec
®
(neutro a 5%) por aproximadamente 12 horas. Após o
banho a vidraria foi enxaguada em água deionizada e seca em estufa por
aproximadamente 150
o
C ao longo de 12 horas. Antes da análise, foi
previamente limpa com Acetona P.A. e n-Hexano.
Métodos
35
Solventes e reagentes
Os solventes e reagentes utilizados para o experimento foram:
Acetona P.A. Tedia
®
, n-Hexano (Ommisolv.) Tedia
®
, Isooctano (Omnisolv.)
Tedia
®
, Éter dietílico, Acetonitrila (HPLC) Tedia
®
, Água MilliQ, Sílica gel
Merck
®
, Óxido de Alumínio, Sulfito de Sódio, Hidróxido de Sódio, Ácido orto-
Fosfórico Tedia
®
e Cloreto de Sódio Tedia
®
.
Experimental
A extração de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) em
água foi realizada através do processo de extração Liquído-Liquído contendo
a amostra e um solvente orgânico com polaridade intermediária. Para cada
1 (um) Litro de água foram adicionados 200 mL ou 20% do solvente
n-Hexano (ABSOLV.). Depois de adicionado o solvente, cada amostra foi
extraída por processo de agitação, em um funil de separação, ao longo de
dois intervalos de 10 minutos cada.
A fim de evitar uma possível emulsão entre as fases aquosas e
orgânicas, foi adicionado para cada amostra 100 mL de uma mistura com
ação anti-espumante (2,5 gramas de Cloreto de Sódio e 2,0 gramas de ácido
orto-fosfórico (concentrado) dissolvidos em 100 mL de água MilliQ. Após a
extração, a fase orgânica das amostras foi separada e concentrada a 1 mL
utilizando um evaporador rotatório. Os extratos concentrados foram
posteriormente purificados e fracionados por processos cromatográficos.
Cada amostra foi transferida e eluida em uma coluna cromatográfica aberta.
Cada coluna foi preenchida com três gramas de sílica gel, 2 gramas de
Métodos
36
Óxido de Alumínio e 1 grama de Sulfato de Sódio. Os reagentes neste
experimento foram limpos em n-Hexano e acondicionados em temperaturas
específicas, a fim de retirar ou restringir a possível presença de água
adsorvida. Para a primeira eluição, 25 mL de n-Hexano foram eluidos e
posteriormente descartados. A segunda eluição utilizou uma mistura de 30
mL de n-Hexano/Éter Dietílico 9:1 v/v. Ao fim desta etapa, as amostras
foram concentradas em evaporador rotatório até a secura e solubilizados em
0,5 mL de Acetonitrila.
Condições Cromatográficas
As amostras foram analisadas num cromatógrafo líquido de alta
eficiência (CLAE) acoplado a um detector de fluorescência, modelo
Shimadzu (RF-10 AxL) com duas bombas LC-10AT e LC-10AS. Coluna
CLC-ODS: 25 cm; 4,6 mm d.i.; partícula com 5 μm e poro de 120 Å. A fase
móvel é composta por uma mistura de Acetonitrila/Água (80:20 v/v) com
fluxo isocrático de 1.5 mL.min
-1
. O detector foi programado em nove etapas
de comprimento de onda para Excitação/Emissão: 255/325; 253/350;
333/390; 237/462; 280/430; 294/404 300/500 e 300/421. Para analise de
cada amostra, foi injetada uma alíquota de 20 µL. Foram analisados 11
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos neste estudo: Naftaleno (NAF),
Fluoreno (FLUO), Acenaftileno (ACEN), Antraceno (ANTR), Pireno (PIR),
Benzo[a]Antraceno (B[a]A), Benzo[b]Fluoranteno (B[b]F),
Benzo[k]Fluoranteno (B[k]F), Benzo[a]Pireno (B[a]P), Dibenzo[ah]Antraceno
(DB[ah]A) e Indeno[123cd]Pireno (IND[123]P).
Métodos
37
Quantificação
Utilizou-se o software Borwin 1.2 para a integração dos
cromatogramas e cálculo de concentração dos compostos. Para a
identificação dos compostos comparou-se o tempo de retenção de cada um
com o cromatograma de uma solução padrão. A quantificação dos HPAs foi
baseada na curva de calibração de uma solução padrão
3.7 Análise Estatística
Foi feita a análise descritiva de todas as variáveis do estudo.
As variáveis quantitativas foram apresentadas em termos de seus valores de
tendência central e de dispersão. Foi apresentada também a % de gravidez
e a % do sexo masculino (BERQUO).
Foram utilizados os testes de Levene e Kolmogorov-smirnov para se
verificar a homogeneidade das variâncias e a aderência a curva normal,
respectivamente. Para as variáveis que apresentaram esses dois princípios
satisfeitos foram utilizados testes paramétricos (ANOVA- analise de
variância), caso contrario foram utilizados testes não paramétricos (Teste de
Kruskall-Wallis). Quando diferenças foram observadas foi utilizado o teste de
comparações múltiplas de Tukey (KLEIBAUM).
Para se verificar a associação entre duas variáveis qualitativas foi utilizado o
teste de Qui-quadrado (SIEGEL).
Métodos
38
Para se comparar duas proporções foi utilizado o teste de
comparação entre duas proporções (SIEGEL).
O nível de significância foi de 5%.
Pacote estatístico utilizado SPSS 14.0 for Windows.
3.8 Ética
Projeto 0907/07 aprovado pela CAPPesq.
Projeto aprovado pela Comissão Técnico Científica – COTEC, da Secretaria
do Meio Ambiente. Processo SMA nº 43279/2007.
4. RESULTADOS
Resultados
40
4.1 Análise da Presença de Metais na Água
A análise da água para verificar a presença de metais mostrou os
seguintes resultados:
Para o Chumbo (Pb):
- Rede de abastecimento de Cubatão (grupo c): Todas as amostras com
teores abaixo do limite de detecção, ou seja, 40μg/L.
- Água Mineral (grupo a): Todas as amostras com teores abaixo do limite
de detecção, ou seja, 40μg/L.
- Estação de captação da Sabesp (grupo b): Todas as amostras com
teores abaixo do limite de detecção, ou seja, 40μg/L.
- Pilões (grupo d): Para duas amostras foram obtidos os seguintes valores
médios: 113 ± 11μg/L e 221 ± 16μg/L.
Para o Cádmio (Cd):
- Rede de abastecimento de Cubatão (grupo c): Todas as amostras com
teores abaixo do limite de detecção, ou seja, 2,5μg/L.
Resultados
41
- Água Mineral (grupo a): Todas as amostras com teores abaixo do limite
de detecção, ou seja, 2,5 μg/L.
- Estação de captação da Sabesp (grupo b): Foram obtidos os seguintes
valores médios: 3,58 ± 0,50μg/L e 2,92 ± 0,10μg/L.
- Pilões (grupo d): Foram obtidos para 3 amostras os seguintes valores
médios: 11,33 ± 0,50μg/L, 12,6 ± 1,2μg/L e 3,78 ± 0,35μg/L.
Para o Mercúrio (Hg):
- Rede de abastecimento de Cubatão (grupo c): Foram obtidos os
seguintes valores médios: 0,50 ± 0,10μg/L e 0,61 ± 0,12μg/L.
- Água Mineral (grupo a): 0,75 ± 0,15μg/L e 0,67 ± 0,13μg/L.
- Estação de captação da Sabesp (grupo b): Foram obtidos os seguintes
valores médios: 0,52 ± 0,11μg/L e 0,62 ± 0,12μg/L.
- Pilões (grupo d): Foram obtidos para três amostras os seguintes valores
médios: 0,89 ± 0,18μg/L, 5,3 ± 1,1μg/L e 4,58 ± 0,92μg/L.
Resultados
42
4.2 Análise da Presença de Hidrocarbonetos Policíclicos
Aromáticos (HPA)
A tabela 1 mostra as concentrações dos HPAs em cada área
estudada. O grupo d, (Pilões) apresenta o triplo das concentrações
detectadas nos outros grupos.
Tabela 1. Concentrações dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)
nas amostras de água segundo grupo de exposição(ng/L)
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D
Naftaleno
0,01 0,01 0,01 0,04
Acenaftileno
2,57 2,75 2,62 8,06
Fluoreno
42,17 34,79 24,30 131,08
Pireno
1,97 1,50 1,73 20,41
B[a]antraceno
* * * *
B[b]fluoranteno
* * * *
B[k]fluoranteno
* * * *
B[a]pireno
* * 0,37 0,35
DB[ah]antraceno
* * * *
Total HPAs
46,71 39,05 29,02 159,94
*Valores abaixo do limite de detecção do método
Resultados
43
4.3 Peso das Gônadas
Na tabela 2 são apresentados os valores do peso dos testículos em
gramas em termos de medidas de tendência central e dispersão para cada
grupo de exposição. Não houve diferença estatística entre os grupos
estudados através da análise de variância.
Tabela 2. Análise descritiva do peso dos testículos segundo grupo de
exposição
N Média Desvio Padrão Mínimo Máximo
Testículo Direito
Grupo A
20 0,088 0,010 0,073 0,110
Grupo B
18 0,900 0,090 0,078 0,110
Grupo C
22 0,091 0,010 0,074 0,108
Grupo D
20 0,910 0,021 0,018 0,117
Testículo Esquerdo
Grupo A
20 0,089 0,009 0,076 0,106
Grupo B
18 0,088 0,009 0,078 0,108
Grupo C
22 0,091 0,011 0,072 0,110
Grupo D
20 0,910 0,021 0,018 0,111
Resultados
44
4.4 Espermograma
A tabela 3 mostra as medidas de tendência central e dispersão dos
parâmetros medidos no espermograma.
Para a concentração de espermatozóides o grupo d (Pilões)
apresentou a menor média em relação aos outros grupos, embora não tenha
sido encontrada diferença significativa através da análise de variância.
Em relação ao parâmetro mobilidade, houve uma maior média desse
parâmetro nos grupos c e b, respectivamente. Houve uma diferença
significativa entre os grupos a e c através do teste de Tukey.
Em relação ao parâmetro células imóveis o grupo b apresentou uma
menor mediana, tendo sido o único entre os parâmetros apresentados na
tabela 2 a ter um comportamento não paramétrico (teste de levene).
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos através
do teste de Kruskal-Wallis
Em relação ao parâmetro percentual de mobilidade, o grupo a apresentou a
menor média, sendo estatisticamente diferente das médias dos grupos b e c
através do teste de Tukey.
Resultados
45
Tabela 3. Análise descritiva dos parâmetros do espermograma segundo
grupo de exposição
N Média Mediana Desvio Padrão Mínimo Máximo
Concentração
Grupo A
18 15,06 14,45 7,01 3,30 33
Grupo B
18 14,35 16,50 6,10 0 23
Grupo C
22 16,91 15,50 5,39 9 29
Grupo D
20 14,16 13,45 7,98 0 30
Móveis
Grupo A 18
6,55 6 4,70 1 20
Grupo B 20
8,40 10 4,22 0 11
Grupo C 22
9,50 9 4,27 4 18
Grupo D 20
6,89 6 4,24 0 13,30
Imóveis
Grupo A 18
8,51 8,15 3,57 2,30 17
Grupo B 20
5,95 6,50 2,82 0 11
Grupo C 22
7,41 7 2,02 5 12
Grupo D 20
7,29 5,65 4,68 0 17
Percentual de Mobilidade
Grupo A 18
40 43,90 15,22 9,40 60,60
Grupo B 20
51,66 57,15 21,64 0 78,50
Grupo C 22
54,21 56,65 11,31 35,70 72,20
Grupo D 20
46,27 48,45 17,22 0 68,60
As Figuras 2 a 5 mostram os parâmetros investigados no
espermograma em termos de média e intervalos de confiança (95%),
evidenciando uma diferença entre os grupos a e b para mobilidade e entre o
grupo a e b e a e c para o percentual de mobilidade.
Resultados
46
0
5
10
15
20
25
A
B
CD
Grupos
0
5
10
15
20
25
A
B
CD
Grupos
Figura 3. Médias e intervalos de confiança das concentrações de
espermatozóides segundo grupo de exposição.
Figura 4. Médias e intervalos de confiança do número de espermatozóides
móveis segundo grupo de exposição.
Média (95% IC)Média (95% IC)
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
2
4
6
8
10
12
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
2
4
6
8
10
12
Resultados
47
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
2
4
6
8
10
12
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
2
4
6
8
10
12
Figura 5. Médias e intervalos de confiança do número de espermatozóides
imóveis segundo grupo de exposição.
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
10
20
30
40
50
60
70
A
B
CD
Grupos
Média +- 95% IC
0
10
20
30
40
50
60
70
Figura 6. Médias e intervalos de confiança do percentual de
espermatozóides móveis sobre o total segundo grupo de exposição.
Resultados
48
4.5 Taxa de gravidez
Em relação ao percentual de gestação não houve diferença
estatisticamente significativa entre os grupos (tabela 4).
Tabela 4. Taxa de gravidez segundo grupo de exposição
N % Gestação
Grupo a 18
40
Grupo b 20
38,9
Grupo c 22
54,5
Grupo d 20
55
Resultados
49
4.6 Proporção de machos na prole (Sex ratio)
A tabela 5 mostra a proporção de machos na prole. Houve um menor
percentual no grupo b, seguido do grupo d. Esses percentuais são diferentes
entre os grupos. O grupo b apresentou uma diferença estatisticamente
significante e o grupo d apresentou diferença marginalmente significante.
Tabela 5. Número de recém-nascidos por sexo e proporção de machos na
prole segundo grupo de exposição
Masculino
(N)
Feninino
(N)
Total Masculino
%
Grupo 1
21 16 37 57
Grupo 2
5 23 28 19
Grupo 3
34 22 56 61
Grupo 4
18 26 44 41
P=0,09 Teste de comparação de proporções.
Resultados
50
4.7 Histologia
A tabela 6 mostra a quantidade de células de Sertoli em termos de
médias e desvios-padrão segundo grupo de exposição. Não houve diferença
significativa entre as médias segundo o grupo de exposição através da
análise de variância.
Tabela 6. Análise descritiva do número de células de Sertoli segundo grupo
de exposição
N Média Desvio Padrão Mínimo Máximo
Grupo A
200 13,02 2,099 8 18
Grupo B
180 12,86 1,819 8 18
Grupo C
220 13,24 1,916 9 18
Grupo D
190 12,96 1,787 10 17
5. DISCUSSÃO
Discussão
52
Estudos epidemiológicos elaborados para investigar a causa de
doenças têm apresentado evidências crescentes de que a exposição a
agentes tóxicos tem contribuído com o aumento da incidência de doenças
crônicas, neoplasias e doenças congênitas (Heindel, 2006). Também existem
evidências de que o período intra-útero e pós-natal precoce seria o mais
sensível aos efeitos dos poluentes que poderiam reprogramar genes
causando o aumento da incidência de doenças na vida adulta (Heindel, 2006).
O período intra-útero seria o mais sensível para exposições a agentes
químicos que piorariam a fertilidade na vida adulta (Delbes, 2006).
A exposição a esses agentes tóxicos, incluindo os disruptores
endócrinos e os metais, frequentemente ocorre através de fontes que não
são previstas pelo indivíduo ou pela comunidade. Tanto a água quanto os
alimentos podem conter uma grande variedade de substâncias tóxicas
(resíduos de pesticidas, agrotóxicos, metais, hormônios, antibióticos e
resíduos industriais). No passado a sociedade não tinha noção dos danos
que certas substâncias poderiam causar ao meio ambiente e a saúde
humana e nem da capacidade de muitos produtos permanecerem no
ambiente por muitas décadas e se concentrarem na cadeia alimentar.
Por isso, muitas substâncias que até já foram proibidas e tiveram seu uso
banido ainda permanecem em determinados ambientes podendo causar
Discussão
53
sérios problemas. Além disso, temos também o uso irresponsável de
produtos químicos por pessoas ou empresas que não cumprem as normas
adequadas de utilização, armazenamento e descarte destas substâncias e
de seus resíduos. Uma mesma empresa que se comporta corretamente em
relação ao meio ambiente em um País onde as regras de manuseio de
substâncias químicas são rígidas e, acima de tudo, cumpridas pode ser
negligente em outro onde esse controle não é tão rigoroso.
As possíveis conseqüências da exposição aguda ou crônica a estas
substâncias em relação ao sistema reprodutivo ainda não estão bem
definidas (Jouannet et al, 2001), embora existam fortes evidências que os
poluentes prejudicam a função reprodutiva. Resultados conflitantes na
literatura podem ser conseqüência da grande variedade de desenhos de
estudos sobre o tema.
A área do aterro do antigo lixão de Pilões é comprovadamente
contaminada com metais pesados, solventes halogenados, solventes
aromáticos e biocidas orgânicos fazendo parte das áreas monitorizadas
constantemente pela CETESB. Essa contaminação atinge solo superficial e
águas subterrâneas (CETESB, 2006).
O fato do aterro situado em Pilões ser uma área contaminada não
significa, obrigatoriamente, que a água dos rios e riachos da região também
seja. Porém, a análise da água mostrou os seguintes resultados:
A análise da água investigou a presença das seguintes substâncias:
Cádmio, Chumbo, Mercúrio e 9 Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos –
HPAs (Naftaleno, Acenaftileno, Fluoreno, Pireno, B[a]antraceno,
B[b]Fluoranteno, B[k]fluoranteno, B[a]pireno, DB[ah]antraceno).
Discussão
54
A água mineral (grupo a) não mostrou presença de cádmio nem de
chumbo. Mostrou presença de mercúrio, mas em concentrações inferiores
ao valor máximo recomendado para água de consumo pela Environmental
Protection Agency (EPA, 2008).
A água da rede de abastecimento na cidade de Cubatão (grupo c)
não mostrou presença de cádmio nem de chumbo. Mostrou presença de
mercúrio, mas em concentrações inferiores ao valor máximo recomendado
para água de consumo pela Environmental Protection Agency.
A água da estação de captação e tratamento da SABESP no rio
Cubatão (grupo b), dentro do Núcleo Itutinga-Pilões, apresentou duas
amostras com presença de cádmio e com a presença de mercúrio, porém
em níveis abaixo do valor máximo recomendado para água de consumo pela
Environmental Protection Agency.
As amostras do rio Pilões (grupo d) mostraram a presença de
chumbo, mercúrio e cádmio em níveis acima do recomendado para água de
consumo pela Environmental Protection Agency. O valor máximo
recomendado para o mercúrio em água para consumo humano é de 2µg/L e
os valores encontrados foram 5,3±1,1 e 4,5±0,92µg/L. Para o cádmio o valor
máximo recomendado é de 5µg/L e os valores encontrados foram 11,33±0,5;
12,6±1,2 e 3,78±0,35µg/L. Para o chumbo, o valor máximo recomendado é
de 0µg/L e os valores encontrados foram 113±11 e 221±16µg/L.
Em relação aos hidrocarbonetos aromáticos, o grupo d apresentou
valores bem superiores aos outros grupos, principalmente em relação ao
Fluoreno e ao Pireno. O principal efeito deletério dos hidrocarbonetos
Discussão
55
aromáticos é elevar o risco para câncer, mas podem, também, ter efeitos no
sistema reprodutor. A amostra de água mineral (grupo a) que foi enviada
para o laboratório fazer a análise de hidrocarbonetos foi perdida
acidentalmente e, substituída por uma amostra de água MilliQ (água pura,
para uso em laboratórios) sendo que os valores observados de
hidrocarbonetos nesta amostra correspondem a contaminação que ocorre
com muita frequência neste tipo de laboratório.
Estes resultados indicam que o ponto de coleta do grupo d, no rio
Pilões, por ser próximo ao aterro do antigo lixão, está tendo a qualidade de
suas águas comprometida com a presença de metais e hidrocarbonetos
aromáticos, expondo o meio ambiente e a população local a possíveis riscos.
As amostras de água dos grupos a, b e c estão dentro dos valores
recomendados para os metais pesquisados e a população de Cubatão, que
consome a mesma água do grupo c está recebendo água de boa qualidade.
As amostras do grupo b e c também podem ser consideradas próprias
padrão em relação aos hidrocarbonetos.
Em relação às medidas de peso dos testículos não foram observadas
diferenças entre os grupos expostos e não expostos aos poluentes.
Na literatura existem trabalhos com resultados semelhantes ao deste estudo.
Wade et al (2002) submeteram ratos macho à exposição crônica a doses
baixas de uma mistura de vários poluentes (cádmio, chumbo, DDT, DDE,
Dieldrin e outros poluentes) e não observaram diferenças entre o peso das
gônadas dos grupos expostos e não expostos. Martinez et al (1997) expondo
camundongos ao Dietilestilbestrol intra-útero não verificou redução do
volume testicular após o nascimento.
Discussão
56
Li et al (2006) expôs codornas a doses altas de 3-metil-4-nitrofenol e
encontrou redução do volume dos testículos. Poon et al (2004) também
observou redução do tamanho das gônadas ao expor ratos macho a um
combinado de poluentes orgânicos. Queiroz e Waissman(2006) afirmaram
que exposição a altas doses de cádmio causa atrofia testicular.
Uma possível explicação para o fato de os animais do grupo d,
exposto a poluentes, não terem apresentado alterações no volume testicular
neste trabalho é que o efeito de redução de volume das gônadas estaria
associado com a exposição a altas doses de poluentes e talvez as doses de
poluentes que os animais deste trabalho receberam não tenham sido
suficientes para causar este efeito. Outra possibilidade é que os poluentes
presentes na água não tenham a capacidade de causar o efeito de redução
de volume testicular.
A análise dos dados do espermograma não mostra diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos no que se refere ao número de
espermatozóides total, ao número de espermatozóides móveis e ao número
de espermatozóides imóveis. Quando se comparou o percentual de
motilidade do grupo a (água mineral) com o do grupo c (rede de
abastecimento em Cubatão) observou-se redução significativa do percentual
de motilidade dos espermatozóides do grupo a (água mineral).
O grupo d (pilões) que recebeu água cuja análise mostrou a presença
de poluentes não apresentou alterações nos valores do espermograma.
Outros trabalhos também mostraram resultados similares. Wade et al (2002)
avaliaram o sêmen de ratos expostos a doses baixas de uma mistura de
Discussão
57
metais e poluentes orgânicos e não encontraram alteração no número,
concentração ou motilidade dos espermatozóides. Mas, estudando a
cromatina, verificaram estar ocorrendo aumento da fragmentação,
mostrando a possibilidade de estar havendo dano ao DNA.
Toft et al (2006) comparou o sêmen de homens com altos níveis
séricos de poluentes orgânicos (hexaclorobifenil, clorofenil e DDE) com o de
homens do grupo controle e não observou diferenças na quantidade,
concentração e forma dos espermatozóides. Porém, encontrou redução
importante na motilidade dos espermatozóides do grupo exposto aos
poluentes. Rubes e Jiri (2005) avaliaram homens expostos a poluição do ar
e não encontraram alterações do espermograma. Porém, ao avaliarem a
cromatina também encontraram aumento da fragmentação do DNA.
Weiss et al (2006) não observaram alterações no espermograma de homens
com altos níveis séricos de DDT, DDE, Dieldrin e PCBs. E também não
encontraram níveis elevados destas substâncias no sêmen.
Xia et al (2005) encontraram alterações na forma dos
espermatozóides e aumento da fragmentação do DNA em trabalhadores
expostos ao Carbaril (potente inseticida). Não houve alteração no número,
concentração e motilidade dos espermatozóides.
Os resultados dos estudos associando poluição e espermograma são
controversos, muitos mostram associação e outros não (Joauannet, 2001).
Talvez a forma de exposição, as características e concentração do
poluente justifiquem as variações de resultados na literatura. Pela literatura,
parece que o parâmetro do espermograma mais sensível a ação dos
Discussão
58
poluentes é a motilidade. Outra observação é de que talvez ocorram primeiro
danos intracelulares como o aumento de fragmentação do DNA visto na
avaliação da cromatina.
Neste trabalho, o fato de não ter sido observada nenhuma alteração
nos parâmetros avaliados no sêmen do grupo exposto aos poluentes (Grupo
d) poderia ser explicado pelo fato das concentrações dos poluentes a que os
animais foram expostos não serem suficientes para causar alterações.
Outra possibilidade é que os poluentes encontrados não sejam causadores
de alterações no espermograma. O cádmio, mesmo em concentrações
séricas moderadas em camundongos, é considerado capaz de causar
problemas de fertilidade reduzindo a espermatogênese (Dalton et al, 1996).
Provavelmente, os níveis de cádmio encontrados na água do grupo d
(11,33±0,5 e 12,6±1,2 µg/L) ,assim como os níveis de hidrocarbonetos, não
são suficientes para que eles alcancem concentração sérica que cause
prejuízos ao espermograma.
Em relação à taxa de gravidez, não foi observada diferença entre os
grupos.
Weiss et al (2006) comparou mulheres com níveis séricos elevados
de DDT, DDE e Dieldrin com mulheres do grupo controle sem substâncias
detectáveis no sangue e observou redução na taxa de gravidez nas
mulheres com altos níveis séricos de DDT e DDE. As que tinham níveis
elevados de Dieldrin não mostraram diferenças em comparação ao grupo
controle. Isso reforça a idéia de que o tipo de contaminante é importante
para avaliar a possibilidade de ocorrer determinado efeito.
Discussão
59
Neste estudo não se observaram diferenças entre as taxas de
gravidez. Como as fêmeas só foram expostas às amostras de água
coletadas durante a fase de acasalamento, se ocorresse alteração da taxa
de gravidez provavelmente seria por problemas da fertilidade do macho.
Provavelmente, os elementos presentes nas amostras de água ou suas
concentrações também não foram capazes de alterar este parâmetro.
A análise da proporção de machos na prole mostrou redução
estatisticamente significante no número de machos na prole do grupo b uma
redução com significância marginal no grupo d. A análise da literatura indica
que pode ocorrer alteração na proporção de machos na prole em
decorrência da exposição aos poluentes. Em mamíferos se observa a
redução no número de machos podendo indicar uma maior fragilidade do
espermatozóide portador do cromossomo Y aos efeitos dos poluentes.
Parazzini et al (2005) mostrou que há pouca relação entre poluição e
proporção de machos na prole, comparando casais tabagistas e não
tabagistas.
Lichtenfels et al (2007) encontrou redução na proporção de machos
na prole de camundongos expostos à poluição do ar (material particulado)
quando comparado ao grupo não exposto.
Neste trabalho, o grupo que apresentou alteração em relação à
proporção de machos na prole foi o grupo b, que recebeu água com níveis
detectáveis de cádmio, porém em valores inferiores ao máximo
recomendado pela EPA. O grupo d recebeu água com níveis de cádmio
muito acima dos do grupo b, acima inclusive do valor máximo recomendado
Discussão
60
pela EPA e não apresentou a mesma alteração em relação à proporção de
machos na prole. Se o cádmio fosse o responsável seria esperado uma
alteração mais exuberante no grupo d. Provavelmente, outro fator ou
poluente não pesquisado neste estudo deve ser a causa desta alteração na
prole do grupo b. Talvez o rio Cubatão local onde se localiza a estação de
coleta da Sabesp, origem da água do grupo b, esteja recebendo algum outro
poluente que não tenha sido identificado na análise da água e que não
esteja presente na água do rio Pilões, origem da água do grupo d. Se esta
hipótese corresponder a verdade, indica que o tratamento dado a água pela
Sabesp é eficaz pois a água pós tratamento, enviada para a cidade de
Cubatão e que foi dada ao grupo c não causou alterações na proporção de
machos na prole.
Em relação ao número de células de Sertoli, não foi observada
diferença entre os grupos. As células de Sertoli parecem ser mais
resistentes a injuria do que as outras células dos túbulos, podendo explicar a
não ocorrência de alteração neste trabalho. Talvez os agentes presentes
não sejam capazes de causar alterações ou é uma questão de concentração
das substâncias. Estudos têm associado o cádmio em altas doses a
alterações estruturais, vistas por microscopia eletrônica, nas células de
Sertoli (Queiroz, 2006). Talvez não tenha dado tempo suficiente para
ocorrerem lesões visíveis à microscopia óptica.
Almeida et al (2000) expôs ratos a injeção intravenosa e intra escrotal
de dimetil sulfoxido e não encontrou diferenças em relação ao diâmetro dos
Discussão
61
túbulos, ao número de células do epitélio seminífero e a espermatogênese
quando comparado com o grupo controle.
Ahmadnia et al (2007) verificou redução do número de células de
Sertoli em ratos expostos a fumaça do cigarro em comparação a não
expostos. Avaliações de ultra-estrutura nas células de Sertoli, realizadas por
microscopia eletrônica, mostraram alterações intracelulares e na junção
entre células.
Após a avaliação dos parâmetros escolhidos relacionados ao sistema
reprodutor dos camundongos vemos que só houve uma diferença
marginalmente significante na proporção de machos da prole do grupo d,
que recebeu a água proveniente da região do aterro de Pilões onde existe a
presença de grande quantidade de resíduos químicos. Foi à presença deste
depósito de lixo químico em área de mananciais, onde existe uma pequena
comunidade moradora e que se alimenta de produtos cultivados e de
animais criados naquela região que motivou este estudo. Uma vez que a
exposição a poluentes do ar, do solo e da água tem mostrado, em vários
estudos, efeitos lesivos em diversos órgãos e sistemas do organismo
humano e animal é improvável que os poluentes presentes neste local não
tenham repercussão no sistema reprodutivo. Algumas possibilidades podem
explicar a não ocorrência de alterações significativas:
Os parâmetros escolhidos para o estudo podem, realmente, não se
afetar com a exposição das substâncias presentes na região e por
conseqüência na água coletada. Talvez outros parâmetros não avaliados
tenham se alterado. Muitos estudos têm direcionado sua atenção para
Discussão
62
alterações no DNA das células ou para a ultra-estrutura celular
eventualmente sejam esses os parâmetros a serem considerados.
Outra possibilidade é que a dose da exposição tenha sido insuficiente
para alterar os parâmetros escolhidos. Principalmente no caso dos
poluentes orgânicos ocorre pequena dissolução em água, pois eles são
preferencialmente lipossolúveis o que faz com que tenham a capacidade de
se concentrar em direção ao topo da cadeia alimentar por se acumular na
gordura dos animais. Como os camundongos foram expostos diretamente à
água pode ser que a exposição tenha sido insuficiente. Talvez se a exposição
fosse através de alimentos cultivados na região o resultado fosse diferente.
O desenho do estudo também pode ser a causa, uma vez que
preferencialmente os estudos para avaliar efeitos de “disruptores”
endócrinos devem ser por duas gerações (Mantovani e Maranghi, 2005), e
neste caso, os filhotes da prole deveriam ter sido expostos às amostras de
água até que atingissem a idade adulta e serem submetidos à avaliação dos
parâmetros escolhidos. Não houve neste estudo exposição intra-útero para
os machos avaliados, pois a exposição começou no desmame. Se a fase
intra-útero é a mais sensível para a exposição aos poluentes e seus efeitos
no sistema reprodutor, os próximos trabalhos deverão focalizar sua atenção
neste período.
Outra questão importante levantada neste trabalho é se investigar em
futuros estudos a interação entre diversas substâncias atuando
conjuntamente nos organismos vivos. Exceto em trabalhos de laboratório
onde se seleciona e administra uma única substância ou em casos de
Discussão
63
contaminações ambientais por um único agente, geralmente os ambientes
poluídos e contaminados apresentam dezenas de substâncias, às vezes
centenas. Neste trabalho, identificamos 8 substâncias nocivas na água do rio
Pilões próximo ao aterro químico sendo que a análise da água tinha a
capacidade de identificar só 12 substâncias. Provavelmente, a variedade de
contaminantes no local do aterro é bem maior. Alguns trabalhos destacam a
importância da interação de poluentes com ação de “disruptores” endócrinos
(Kortenkamp e Altenburger, 1998).
Também é crucial que se encontre uma forma eficaz de evitar que a
população seja exposta, inadvertidamente, à poluentes de áreas
contaminadas através de produtos como água e alimentos(carne, peixe,
leite, vegetais e etc.). A fonte da contaminação pode estar muito distante do
indivíduo mas os contaminantes podem chegar até ele por produtos oriundos
da região contaminada.
Outros estudos, tanto experimentais com exposição e agente controlados,
como observacionais em população exposta à contaminação devem ser
realizados para averiguar melhor os efeitos da contaminação do meio
ambiente sobre a função reprodutiva.
6. CONCLUSÃO
Conclusão
65
a) Não houve efeito da exposição à água proveniente de meio ambiente
contaminado sobre o peso das gônadas nos animais de nenhum dos
quatro grupos.
b) Não houve efeito da exposição à água proveniente de meio ambiente
contaminado sobre o espermograma nos animais de nenhum dos quatro
grupos.
c) Não houve efeito da exposição à água proveniente de meio ambiente
contaminado sobre a taxa de gravidez nos animais de nenhum dos
quatro grupos.
d) Houve alteração na proporção de machos na prole do grupo b em
relação aos outros grupos, mas que não está associada aos
contaminantes identificados neste estudo.
e) Não houve efeito da exposição à água proveniente de meio ambiente
contaminado sobre a histologia das gônadas nos animais de nenhum
dos quatro grupos.
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Apêndice
Apêndice
Projeto 0907/07 aprovado pela CAPPesq.
Apêndice
Projeto aprovado pela Comissão Técnico Científica – COTEC, da Secretaria
do Meio Ambiente. Processo SMA nº 43279/2007.
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