( PDF ) Correlação da maturação e da morfologia do oócito humano com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Download PDF

ads:

Claudia Guilhermino Petersen Rodrigues da Costa

Correlação da maturação e da morfologia

do oócito humano com as características do

fuso meiótico e da zona pelúcida

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - Área de

Concentração em Obstetrícia e Ginecologia -

Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp , para a

obtenção do título de Doutor

Orientador: Prof. José Gonçalves Franco Júnior

Botucatu

2009

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

Bibliotecária responsável: Selma Maria de Jesus

Costa, Claudia Guilhermino Petersen Rodrigues da.

Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos humanos

com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida / Claudia

Guilhermino Petersen Rodrigues da Costa. – Botucatu : [s.n.], 2009.

Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade

Estadual Paulista, 2009.

Orientador: José Gonçalves Franco Júnior

Assunto CAPES: 40101150

1. Reprodução humana 2. Fertilização 3. Inseminação artificial humana

CDD 613.94

Palavras chave: Birrefringência da zona pelúcida; Dismorfismo; Fertilização;

Fuso meiótico; Maturação oocitária

ads:

Nada como a lua para me fazer sonhar…

Nada como o sol para me iluminar…

Nada como o vento para me acariciar

Nada como o mar para me acalmar..

Nada como a noite para me aconchegar…

Nada como dia para me alegrar…

Nada como o estudo para me orientar…

A ti vida, eu agradeço.

Claudia Petersen

Dedicatórias

Aos meus pais, Álvaro e Gláucia,

Pela demonstração de luta e determinação diante as dificuldades.

Pela demonstração de beleza em cada ato de suas vidas.

Pela oportunidade de meus estudos.

Pelo amor e confiança.

Por me ensinarem a agradecer.

As minhas filhas, Bruna e Letícia.

Pela companhia sempre presente.

Pela festa em seus olhares a cada encontro nosso.

Por serem os “diamantes” de minha vida.

Pela alegria e razão do meu viver.

Aos meus irmãos, Álvaro Jr, Alexandre, Gláucia, Marcelo

e André.

Por tantos momentos gostosos, alegres, saudáveis e inesquecíveis ….

E, especialmente, ao Júnior, pela constante presença.

Aos meus “anjos” da guarda, Vó Minda e tio Geremias.

Nada é mais forte em mim do que a certeza de suas “eternas”

companhias.

Dedicatórias

As minhas cunhadas Beth, Cris e Renata e ao meu cunhado

Tico.

Pelas palavras positivas e animadoras.

A minha querida amiga, Idalga.

Pelos conselhos sinceros e importantes em minha vida.

Pela constante disposição em me auxiliar.

Pela oportunidade de tê-la em meu caminho.

A minha companheira de trabalho há tantos anos, Ana Lucia

Mauri, meu eterno agradecimento pelos momentos de atenção e

gentilezas. São nos momentos de dificuldade é que conhecemos os

verdadeiros amigos. Obrigada pelo apoio profissional e pessoal

durante todo o desenvolvimento desta tese.

Homenagem

Ao Prof. Dr José Gonçalves Franco Jr

Obrigada pela paciência, disponibilidade e demonstração de

confiança, jamais esquecerei de suas atitudes durante tantos anos

de trabalho: honestidade, educação, luta, confiança, perseverança,

gentileza e força interior.

Obrigada pela sua orientação e ensinamentos preciosos para o

meu desenvolver profissional, eu realmente tive um orientador.

Ao professor, minha gratidão…

Agradecimentos

Ao meu orientador Prof Franco Jr, pela oportunidade de

realizar este trabalho, pelo apoio e pela sua grande

disponibilidade.

Ao Dr Ricardo Baruffi pelos anos juntos de trabalho,

especialmente por promover momentos alegres e de otimismo.

Ao Dr João Batista Alcântara Oliveira pelos ensinamentos

de paciência, perseverança e eficicácia.

Aos médicos Dr Eduardo Vila Boas, Dr Jõao Cornicelli e

Dra Paula Contart por ajudarem de maneiras diversas durante o

percorrer deste caminho.

As biomédicas Fabiana Massaro e Liliane Silva,

companheiras de trabalho, pela coleta de dados e atenção no

laboratório.

As enfermeiras Valéria, Juliana e Andreia meus sinceros

agradecimentos pela dedicação e paciência.

As auxiliares de enfermagen Daniela, Vanessa e Elisângela,

pelo bom dia de todo dia.

A Laura Diniz Vagnini pela atenção e eficiência nas

realizações dos procedimentos de maturação citoplasmática.

A Elisângela Vigil, eficaz secretária, pela contribuição na

configuração das figuras e documentação.

Agradecimentos

A todos os funcionários da limpeza, manutenção e segurança

pelo agradável ambiente de trabalho.

Aos funcionários da seção de pós-graduação e da biblioteca da

Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, por serem tão

prestativos e me atenderem com tanta gentileza, especialmente à

Janete, Regina e Meire.

A querida Anice Martins, pela amável ajuda em diferentes

momentos.

A Sra Leda Martins pela correção do português.

Finalmente, as vocês pacientes que buscam a essência da vida, a

reprodução, e nos permitem a oportunidade de trabalhar.

Sumário

CAPÍTULO I

Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona

pelúcida___________________________________________________

LISTA DE TABELAS...............................................................................

LISTA DE FIGURAS ………………………………..............................

ABREVIATURAS ……………………………………............................

RESUMO ……………………………………………..............................

SUMMARY ……………………………………………...........................

1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA ..........................

1.1. Maturação oocitária ........................................................................

1.1.1 Maturação nuclear (MN).......................................................

1.1.2 Maturação citoplasmática (MC)............................................

1.2 Dismorfismo oocitário…………………………………………….

1.3 Fertilização………………………………………………………...

1.3.1 Capacitação, reação acrossômica e a fusão do

espermatozóide ....................................................................

1.3.2 Ativação oócitária ……………………………………………….

1.3.3 Reação cortical…………………………………………………...

1.3.4 Fusão dos pronúcleos ………………………………………......

1.4 Fuso meiótico (FM)……………………………………………….

1.5 Zona Pelúcida (ZP)..........................................................................

2. OBJETIVO ...........................................................................................

3. MATERIAL E MÉTODOS ………….................................................

3.1 População.........................................................................................

3.2 Estimulação Ovariana.......................................................................

3.3 Coleta e Identificação dos Oócitos...................................................

3.3.1 Desnudação oocitária ...........................................................

3.3.2 Classificação da maturidade nuclear....................................

3.4 Maturação Nuclear (Experimento 1 )……………………………

3.4.1 Cultura dos oócitos imaturos…………………………………...

3.5 Maturação Citoplasmática (Experimento 2)………………………

3.5.1 Coloração da cromatina e dos GC........................................

3.6 Dismorfismo Oocitário (Experimento 3)………………………….

3.7 Fertilização Oocitária (Experimento 4)...........................................

3.8 Análise Estatística…………………………………………………

Sumário

4. RESULTADOS .....................................................................................

4.1 Maturação Nuclear...........................................................................

4.1.1 Maturação nuclear versus fuso meiótico ..............................

4.1.2 Maturação nuclear versus características da zona pelúcida.

4.2 Maturação Citoplasmática...............................................................

4.2.1 Maturação citoplasmática versus fuso meiótico...................

4.2.2 Maturação citoplasmática versus características da zona

pelúcida ................................................................................

4.3 Dismorfismo Oocitário...................................................................

4.3.1 Dismorfismo versus fuso meiótico …………………………….

4.3.2 Dismorfismo versus características da zona pelúcida .........

4.4 Fertilização.......................................................................................

4.4.1 Fertilização versus fuso meiótico………………………………

4.4.2 Fertilização versus características da zona pelúcida...........

5. DISCUSSÃO ……….............................................................................

6. CONCLUSÕES …................................................................................

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................

CAPÍTULO II

Relationship between visualization of meiotic spindle in human

oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis ____________________

112

1-ABSTRACT ...........................................................................................

114

2-INTRODUCTION .................................................................................

115

3-MATERIALS AND METHODS .........................................................

117

4-RESULTS ..............................................................................................

125

5-DISCUSSION ........................................................................................

128

6-REFERENCE ........................................................................................

135

ANEXOS ..................................................................................................

148

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Horários de avaliação da maturação nuclear.........................

Tabela 2 -

Características gerais da população que participou do

experimento de maturação nuclear........................................

Tabela 3 -

Correlação da maturação nuclear (VG, MI, MII) com a

birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP).............................

Tabela 4 -

Espessura total da zona pelúcida em oócitos no estágio de

vesícula germinativa (VG), metáfase I (MI) e metáfase II

(MII), durante a maturação nuclear.......................................

Tabela 5 -

Características gerais da população que participou do

experimento de maturação citoplasmática............................

Tabela 6 -

Correlação da maturação citoplasmática (MC) com a

presença ou ausência do fuso meiótico (FM)........................

Tabela 7 -

Correlação da maturação citoplasmática (MC) com a

birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP).............................

Tabela 8 -

Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP) e variação da

espessura da zona pelúcida (VZP) em oócitos com

presença e ausência de maturação citoplasmática (MC).......

Tabela 9 -

Características gerais da população que participou do

experimento de dismorfismo oocitário..................................

Tabela 10 -

Correlação das anomalias intracitoplasmáticas (AIC) com a

presença ou ausência do fuso meiótico (FM)........................

Tabela 11 -

Correlação das anomalias intracitoplasmáticas (AIC) com a

birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP).............................

Tabela 12 -

Espessura total da zona pelúcida (esp-ZP) em oócitos com

presença ou ausência de anomalias intracitoplasmáticas

(AIC)......................................................................................

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Tabela 13 -

Características gerais da população em que a fertilização

foi avaliada............................................................................

Tabela 14 -

Correlação da fertilização com a presença ou ausência do

fuso meiótico (FM)................................................................

Tabela 15 -

Correlação da fertilização com birrefringência da zona

pelúcida (BF-ZP)...................................................................

Tabela 16 -

Espessura da zona pelúcida (esp-ZP) em oócitos com

presença ou ausência de fertilização......................................

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -

Sistema para a desnudação oocitária..............................

Figura 2 -

Oócito imaturo (Prófase I)…………………………….

Figura 3 -

Oócito intermediário (Metáfase I).................................

Figura 4 -

Oócito maduro (Metáfase II)………………………….

Figura 5 -

Sistema de cultura por microgota...............................

Figura 6 –

Microscópio invertido Nikon com sistema de luz

polarizada.......................................................................

Figura 7 –

Filtro circular polarizador……………………………..

Figura 8 –

Objetiva 25 x - OCTAX ……………………………...

Figura 9 –

Cristal líquido …………………………………………

Figura 10 –

Câmera de imagens……………………………………

Figura 11 –

Sistema de imagem - OCTAX Eyeware

...................

Figura 12 –

Platina aquecedora Tokai ……………………………..

Figura 13 –

Oócito em metáfase II com fuso meiótico presente.......

Figura 14 –

Oócito em metáfase II com ausência de fuso meiótico..

Figura 15 -

Programa de avaliação da birrefringência da ZP-

OCTAX EyeWare polarAIDE.......................................

Figura 16 -

Imagem de um oócito com BF-ZP positiva...................

Figura 17 -

Imagem de um oócito com BF-ZP negativa..................

Figura 18 -

Medidas da espessura da zona pelúcida (µm) em

quatro posições (norte,sul,leste e oeste).........................

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 19 –

Oócito em estágio de MII, com maturação

citoplasmática completa (GC dispostos na periferia)....

Figura 20 –

Oócito em estágio de MII, com ausência de maturação

citoplasmática (GC dispostos na periferia e no centro).

Figura 21 -

Microscópio de luz convencional Nikon.......................

Figura 22 –

Oócito em MII com granulações no centro do

citoplasma.......................................................................

Figura 23a –

Oócito em MII com granulações na lateral do

citoplasma.......................................................................

Figura 23b –

Oócito MII com granulações em todo o citoplasma......

Figura 24

a,b –

Oócito em MII com presença de corpos refratários no

citoplasma.......................................................................

Figura 25 –

Oócito em MII com presença de agregados de retículo

endoplasmático...............................................................

Figura 26 a,b –

Oócito com vacúolos no citoplasma...............................

Figura 27 –

Oócito em estágio MII com fertilização normal

presente (presença de 2PN no citoplasma).....................

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

LISTA DE ABREVIATURAS

AEC-

Anomalias extracitoplasmáticas

AIC -

Anomalias intracitoplasmáticas

ATP -

Adenosina trifosfato

BF-ZP -

Birrefringência da zona pelúcida

CP -

Corpúsculo polar

CONEP-

Comissão nacional de ética em pesquisa

EPV -

Espaço perivitelínico

Esp-ZP -

Espessura total da Zona pelúcida

ESO-

Escore de seleção oocitária

FM -

Fuso meiótico

FPM -

Fator de promoção da maturação

FIV -

Fertilização “in vitro”

FSH -

Hormônio folículo estimulante

GC -

Grânulos corticais

HSA -

Soro albumina humana

ICSI -

Injeção intracitoplasmática de espermatozóide

MC -

Maturação citoplasmática

mHTF -

Meio tubário humano modificado

MN -

Maturação nuclear

MI -

Metáfase I

MII -

Metáfase II

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

PBS –

Tampão salino fosfato

PN -

Pronúcleo

RA -

Reprodução Assistida

RE -

Retículo endoplasmático

rhCG-

Hormônio gonadotrófico coriônico recombinante

SB -

Solução de bloqueio

UI –

Unidade internacional

VG -

Vesícula germinativa

VZP -

Variação da espessura da zona pelúcida

ZP -

Zona pelúcida

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

RESUMO

Nas últimas décadas, alguns parâmetros laboratoriais têm sido propostos para

identificar o potencial de saúde oocitária em Reprodução Assistida: 1.

Maturidade nuclear e citoplasmática (pesquisa); 2. Dismorfismo (anomalias

intracitoplasmáticas); 3. Fertilizaçao. Habitualmente, esses parâmetros (exceto a

maturação citoplasmática) são avaliados pelo simples emprego de sistemas de

microscopia de luz convencional. Nos últimos oito anos, foram relatados

diversos estudos em oócitos humanos sobre a birrefringência da zona pelúcida

(BF-ZP), a espessura da ZP, e a visualização do fuso meiótico (FM). Entretanto,

ainda é discutível o poder desses novos parâmetros na seleção de óvulos com o

pontecial de originar embriões com taxas de implantação elevadas, além disso,

seu sistema de visualização e quantificação é complexo e dispendioso. O objetivo

deste estudo foi investigar uma possível correlação entre esses parâmetros

tradicionais com a BF-ZP, espessura da ZP e o FM. Dessa forma, um total de 73

pacientes que participaram do programa de injeção intracitoplasmática de

espermatozóide (ICSI) no Centro de Reprodução Humana “Prof Franco Júnior”

tiveram seus óvulos avaliados quanto a maturação nuclear (n=83), maturação

citoplasmática (n=29), dismorfismo (n=280) e fertilização (n=216) sendo os

resultados correlacionados com a imagem do FM (presença ou ausência), a

intensidade da BF-ZP (positiva ou negativa) e a espessura da ZP. Os dados finais

revelaram uma fraca correlação entre a maturação, o dismorfismo e a fertilização

oocitária com a imagem do FM, a intensidade da BF-ZP, e a espessura da ZP.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Entretanto, esses parâmetros poderiam ser responsáveis por identificar pontos

biológicos diferentes do potencial de qualidade oocitária. Assim sendo, seria uma

medida coerente, a utilização desses parâmetros, em forma conjunta, através de

um escore de qualidade oocitária.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

SUMMARY

During the last decades, three laboratorial parameters have been proposed to

identify the potential of the oocyte quality in ART: 1- Nuclear and cytoplasmic

maturation; 2-Dysmorphims (intracytoplasmic abnormalities); 3 - Fertilization.

These parameters (except the cytoplasmic maturation) are assessed by a simple

system of conventional light microscopy. In the last eight years, numerous

studies about zona pellucida birefringence (BF-ZP), zona pellucida thickness and

meiotic spindle visualization have been reported. However, it is still

controversial the power of these parameters in selecting oocyte with potential to

develop into implantation-competent embryos. Furthermore, the microscopy

system is complex and expensive. The present study aims to evaluate whether

there is any correlation between the classical parameters with BF-ZP, ZP

thickness and spindle image. A total of 73 patients who participated in an ICSI

program had their oocytes evaluated such nuclear maturation (n=83),

cytoplasmic maturation (n=29), dysmorphism (n=280) and fertilization (n=216)

being its results correlated to the spindle image (presence or absence), BF-ZP

intensity (positive or negative) and ZP thickness. The final results showed a low

correlation between maturation, dysmorphism and fertilization compared to

spindle image and ZP characteristics (BF-ZP, ZP thickness). However, these

factors can be responsible to identify specific biological differ from the oocyte

potential. Concluding, the use of these factors in association, as a score (oocyte

quality score), could be the correct evaluation.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

1- INTRODUÇÃO E REVISÃO DA LITERATURA

A identificação de um critério para qualificar o potencial de um oócito

antes da fertilização é uma das áreas investigadas no campo da reprodução

assistida (RA). Basicamente, três parâmetros clássicos laboratoriais têm sido

propostos na literatura para qualificar os oócitos: 1- A avaliação da maturidade

do oócito, ou seja, a classificação do estágio de maturação oocitária (prófase I,

metáfase I e II) (parâmetro direto); 2- A avaliação das características

morfológicas extra (AEC) e intracitoplasmáticas (AIC), tais como: forma, cor,

granularidade e homogeneidade do citoplasma, tamanho e debris do espaço

perivitelínico, vacuolização, inclusões e anomalias do primeiro corpúsculo polar

(CP) e da zona pelúcida (parâmetros direto) 3- A avaliação da capacidade do

oócito fertilizar após inseminação do espermatozóide (parâmetro indireto). Tais

investigações têm sido realizadas através do emprego de microscopia de luz

convencional.

Entretando, com a introdução da microscopia de luz polarizada

foi

possível a visualização “in vivo” da imagem da estrutura multilaminar da zona

pelúcida (ZP)

e do fuso meiótico (FM)

em oócitos de Hamster. Tal fato atraiu

a atenção dos pesquisadores da área de RA para estudar esses novos parâmetros

em oócitos humanos. Nos últimos oito anos, a avaliação da birrefringência da ZP

(BF-ZP) e a visualização do FM em oócitos humanos têm sido propostas como

variável preditiva da qualidade oócitaria

4 - 13

. Contudo, o poder desses novos

parâmetros não invasivos para predizer a qualidade dos óvulos ainda é discutível.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

O presente estudo foi planejado para analisar a correlação entre os três fatores

clássicos: maturação (nuclear e citoplasmática), dismorfismo e a fertilização dos

oócitos humanos com os recentes parâmetros propostos na literatura: a avaliação

da BF-ZP e do FM.

Em RA, a seleção dos gametas tem como principal objetivo alcançar

melhores taxas de gestação, sendo tarefa essencial no dia a dia dos

embriologistas. Por outro lado, esta questão também tem particular relevância

quando, por considerações éticas e/ou legais, limita-se o número de óvulos a

serem fertilizados, e, conseqüentemente, o número produzido de embriões

supranumerários. Dessa forma, seria importante identificar os marcadores da

qualidade oócitária para a obtenção de melhores embriões, e, posteriormente,

maiores taxas de implantação embrionária e de gravidez

14,15

. As características

de saúde oocitária são adquiridas durante a foliculogênese, do processo de

crescimento até a maturação folicular; seu estudo identifica uma nova área de

pesquisa em RA: a seleção de gametas.

1.1. MATURAÇÃO OOCITÁRIA

A maturação oocitária é a terceira fase da oogênese, em que várias

mudanças ocorrem dentro do oócito, preparando-o para a ovulação e sua

iminente interação com o espermatozóide. Este é um processo complexo que

envolve eventos nucleares, meióticos e citoplasmáticos. Para que o estágio final

tenha um ótimo desenvolvimento oocitário, antes da ovulação, é necessária uma

sincronização entre a maturação nuclear (MN)e a citoplasmática.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

1.1.1 Maturação nuclear (MN)

Durante o período de crescimento folicular, os oócitos apresentam os

cromossomos difusos, porém envolvidos por uma membrana nuclear intacta,

denominada vesícula germinativa (VG). A célula apresenta-se bloqueada na fase

G2 do ciclo da divisão celular, ou seja, retida na prófase I da primeira divisão

meiótica por um período longo, variando de dias a décadas dependendo da

espécie. A MN envolve o processo de transição da fase G2 para a fase M

(metáfase). Esta transição é caracterizada por vários fenômenos: a condensação

da cromatina, a quebra da membrana nuclear resultando na mistura do

nucleoplasma com o citoplasma, a formação do FM e a segregação dos

cromossomos. Nesta fase, os cromossomos presentes no citoplasma migram para

a periferia ocorrendo a retomada da meiose via extrusão da metade dos

cromossomos para o primeiro CP. O ciclo meiótico é bloqueado, pela segunda

vez, de forma que o oócito, então, apresenta-se na fase de metáfase II (MII)

caracterizada pela presença do primeiro CP.

Apesar da conclusão das mudanças nucleares para a produção de

oócitos em MII, esta não define sua competência e não reflete a maturidade

molecular e estrutural do oócito. Um oócito, que não completou a maturação

citoplasmática (MC), é de pobre qualidade e incapaz de atingir seu

desenvolvimento com pleno sucesso.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

1.1.2 Maturação citoplasmática (MC)

A maturação de um óvulo não envolve apenas a MN, mas uma variedade

de outros processos que ocorrem dentro do citoplasma responsáveis pela

preparação do oócito para sua ativação e uma adequada fertilização. Tais

processos incluem mudanças estruturais e bioquímicas. As mudanças estruturais

do citoplasma são, basicamente, caracterizadas pela reorganização das organelas

citoplasmáticas definidas como o aumento no número e na mudança da

morfologia das mitocôndrias; modificações ultra-estruturais do complexo de

Golgi (acúmulo de ribossomos); alterações no sistema de transporte das

membranas devido à ligação de vesículas (grânulos glicogênicos) na membrana;

estabelecimento da polaridade do oócito responsável pela determinação dos eixos

do embrião.

Em relação aos eventos moleculares, duas proteínas: a ciclina B e a p34

são responsáveis pela progressão da fase G2 para M. Ambas estão associadas e

formam o fator de promoção da maturação (FPM) depois da desfosforilação da

p34. A ativação do FPM desencadeia a quebra da VG do oócito, a condensação

dos cromossomos, e, conseqüentemente, a formação em estágio de MII.

É sabido que uma MC insuficiente é responsável pela falha na formação

do PN masculino, podendo aumentar as anomalias cromossômicas após a

fertilização. Em adição, uma deficiência na MC ou a assincronia da MN e MC

tem sido relacionada com a formação de oócitos morfologicamente anormais,

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

visíveis na convencional microscopia de luz

. Por outro lado, a ocorrência de

anomalias morfológicas (AEC e/ou AIC) nos oócitos é chamada de dismorfismo

oocitário estando associada a defeitos intrínsicos que influenciam negativamente

na competência do oócito

17,18

1.2 DISMORFISMO OOCITÁRIO

O oócito, em estágio de MII, aparentemente normal quanto à

organização AEC e AIC (oócito de “boa qualidade morfológica”) é definido

como o oócito que apresenta: uma forma esférica, um único e intacto CP,

pequeno espaço perivitelínico (EPV), ZP clara, citoplasma transparente com

homogênea coloração e sem inclusões. Entretanto, muitos dos oócitos em MII

exibem um grande número de anomalias que podem ser divididas em dois

grupos: anormalidades AEC, representada por 71 % das anomalias, e as AIC que

incluem 19% destas

As AEC são caracterizadas pela presença de anormalidades na forma

(diferente da esférica), no EPV (tamanho: largo/estreito, grânulos), na ZP

(estrutura: espessa/fina, coloração), e/ou no primeiro CP (fragmentado/

degenerado), enquanto que as AIC são identificadas pela presença de granulações

(homogêneas/heterogêneas) e/ou inclusões (corpos refráteis/vacúolos/agregados

do retículo endoplasmático (RE)) no citoplasma.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Van Blerkom e Henry

demonstraram que 13% dos oócitos não

fertilizados após a fertilização “in vitro” (FIV) apresentaram dismorfismo

oocitário. Posteriormente, quando as células do cúmulus foram retiradas para a

realização da ICSI, 60 a 70% do oócitos tinham anomalias morfológicas.

As prováveis causas do dismorfismo oocitário têm sido associadas com

a estimulação ovariana, o ambiente hormonal em que o gameta é exposto, a

constituição do próprio oócito

e as condições de cultura e nutrição nas quais

esses oócitos são submetidos

Além disso, o dismorfismo oocitário tem sido relacionado às taxas de

fertilização e clivagem, ao desenvolvimento embrionário e à implantação

embrionária

21,22,19,23,24.

Até o momento, diversos trabalhos têm mostrado conflitantes

conclusões com relação ao impacto da morfologia oocitária nos resultados de

RA.

Embora o efeito da AEC ainda seja controverso no que diz respeito às

anomalias associadas com a morfologia do primeiro CP, EPV e ZP, poucos

estudos têm demonstrado que tais anomalias afetam a implantação.

Por outro lado, em relação às AIC, existe um consenso nos estudos

descritos na literatura. A presença de granulações, especialmente na região

central, e a identificação de inclusões (vacúolos e agregados do RE) no

citoplasma parecem estar associadas com fertilização, desenvolvimento e

implantação embrionária.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Segundo Kahraman et al.

, as granulosidades, no centro do citoplasma,

representam um sinal de imaturidade oocitária. Os autores demonstraram que a

transferência de embriões derivados de oócitos com granulações centrais escuras

diminuiria significantemente as taxas de implantação e gravidez. Em adição,

Khalili et al.

afirmaram que a presença de grânulos no citoplasma foi a

principal anormalidade observada em oócitos não fertilizados. Além disso,

vacúolos também podem surgir pela fusão de vesículas pré-existentes derivadas

de RE do complexo de Golgi

. Em prévios trabalhos, observou-se que a

incidência de vacúolos em oócitos no estágio de MII variou de 5.7%

12.4%

. A presença de um ou mais vacúolos no citoplasma diminui

significantemente o número de zigotos após ICSI versus o controle não

afetado

28,27

. Em teoria, largos e/ou múltiplos vacúolos causariam maiores efeitos

no oócito quando comparados com pequenos vacúolos. Van Blerkom

demonstrou que grandes vacúolos deslocam o fuso meiótico de sua posição

podendo resultar em falha de fertilização. O autor ainda reportou que, se a

fertilização for presente em oócitos com grandes vacúolos, os zigotos podem

falhar na primeira divisão ou exibir um padrão anormal de citocinese.

Por outro lado, a presença de agregados de RE no citoplasma também

tem demonstrado prejudicar significantemente a qualidade embrionária, afetando

as taxas de gravidez

. Meriano et al.

observaram que a presença repetitiva

dessas estruturas em ciclos consecutivos é indicativa de baixas taxas de

implantação e gravidez.

Em adição, oócitos em estágio de MII que exibem severa

desorganização citoplasmática têm um pH e conteúdo de ATP menor e uma

aumentada incidência de aneuploidia

33,34

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

1.3 FERTILIZAÇÃO

A fertilização é um complexo processo de interação entre células, que se

inicia pelo reconhecimento e a ligação do espermatozóide ao oócito e termina na

fusão dos PN masculino e feminino. Este fato abrange a capacitação, a reação

acrossômica, a fusão do espermatozóide, a ativação oocitária, a reação cortical, e,

finalmente, a fusão dos pronúcleos (PN).

1.3.1 Capacitação, reação acrossômica e a fusão do espermatozóide

A capacitação parece envolver tanto uma alteração na composição

lipídica e glicoprotéica da membrana plasmática do espermatozóide como um

aumento no seu metabolismo e motilidade. O processo de capacitação depende

de alterações da permeabilidade da membrana ligadas ao transporte dos íons

Ca++. A modulação do íon cálcio é fundamental para os espermatozóides

adquirirem a capacidade de fertilização, tendo esse processo três aspectos

fundamentais: 1 - a presença de ATP capaz de bombear o íon Ca++ para fora da

célula; 2 - o processo de troca de íons Ca++ (exterior) com Na+ para o interior;

3- canais de cálcio que facilitariam a rapidez de fluxo. Uma vez que o

espermatozóide capacitado tenha penetrado na camada de células foliculares,

liga-se à ZP que funciona como uma barreira à fertilização entre espécies. A ZP

de óvulos de mamíferos é composta por três glicoproteínas. Duas delas, ZP2 e

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

ZP3, agrupam-se em filamentos, enquanto a terceira, ZP1, faz a ligação cruzada

dos filamentos formando uma rede tridimencional. Nesta ligação, o

espermatozóide é induzido a sofrer reação acrossômica, na qual o conteúdo do

acrossomo é liberado por exocitose. Tal reação libera proteases e hialuronidase

essenciais para a penetração do espermatozóide através da ZP. Em adição, a

reação acrossômica expõe uma proteína da membrana plasmática do

espermatozóide que medeia a união e a fusão desta membrana à do óvulo.

1.3.2 Ativação oócitária

A ativação oocitária é definida como uma série de eventos morfológicos

e bioquímicos ocorridos após a fusão do espermatozóide e que levarão à divisão

e à diferenciação celular para formar um novo indivíduo. Quando o

espermatozóide funde-se com a membrana plasmática do óvulo, ativa a via de

sinalização celular do inositol-fosfolipídio do óvulo. Esta, por sua vez, causa um

aumento local de íons Ca++ no citosol, que se distribui em ondas por toda a

célula. O aumento dos íons Ca++ no citosol parece ativar o óvulo e iniciar a

reação cortical, onde os grânulos corticais (GC) liberam seu conteúdo por

exocitose.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

1.3.3 Reação cortical

No citoplasma, originado do aparelho de Golgi, detectam-se

numerosas e pequenas partículas, GC, menores que 2µ, os quais, a partir do

cone de fertilização, concentram-se nas proximidades da ZP, passando, então,

a se dissolverem no citoplasma. A exocitose de grânulos citoplasmáticos é um

dos sinais mais precoces de que houve ativação ovular. Acredita-se que a

ligação do espermatozóide à superfície ovular altere a condutância da oolema

a íons cálcio. Com o influxo de cálcio e aumento nas concentrações

intracelulares desse íon, ocorre a exocitose dos GC para o EPV. Por outro

lado, com o influxo de cálcio, teriam início os movimentos cromossômicos

para a anáfase II e a descondensação do núcleo espermático para formar os

PN.

1.3.4 Fusão dos pronúcleos

O óvulo bloqueado na metáfase da segunda divisão meiótica, quando

fecundado, retoma o processo divisional formando o PN oocitário (haplóide) e

eliminando o segundo CP. O núcleo espermático descondensa-se, dando

origem ao PN espermático. A síntese de DNA (duplicação cromossômica)

começa em ambos os PN. Estes se aproximam no centro do citoplasma. As

membranas plasmáticas pronucleares se desintegram e os cromossomos se

misturam finalizando a fase de fertilização.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

O intervalo entre a fusão do espermatozóide com o óvulo e a

observação da primeira clivagem embrionária leva em torno de 12 horas na

espécie humana e varia de espécie para espécie.

Os PN são formações elípticas e simétricas, sendo que a distância

entre os dois varia em função do tempo decorrido desde a fertilização.

Inicialmente, estão afastados e, progressivamente, aproximam-se até a fusão.

O processo de fertilização normal compreende a presença de dois PN: um

feminino e outro masculino; e a presença do primeiro e segundo CP. Mais de

dois PN implica penetração polispérmica ou retenção do segundo CP no oócito.

Apesar do contínuo desenvolvimento das técnicas de RA, o uso da

técnica de ICSI ultrapassa tais eventos. Mesmo assim, a falha da fertilização

ainda ocorre nos oócitos. De fato, após a ICSI, 30% dos oócitos falham em

fertilizar

35,36

, sendo que em 2 a 3 % dos casos pode ocorrer a falha total de

ferilização dos oócitos

1.4 FUSO MEIÓTICO (FM)

O FM, composto de microtúbulos do citoesqueleto, desempenha um

papel principal no sucesso do processo da meiose pelo controle do movimento

cromossômico através dos vários estágios. Diferentes autores sugeriram que a

desorganização do FM leva à disrupção da segregação cromossômica ordenada

resultando em aneuploidia dos zigotos

38,39

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Por outro lado, a morfologia e a cinética do FM são influenciadas por

variáveis, tais como: idade, temperatura e manipulação “in vitro” dos oócitos.

Battaglia et al.

indicaram que a incidência de anormalidade do FM em oócitos

era significativamente maior em mulheres mais idosas. Posteriormente, Volarcik

et al.

confirmaram essa associação estudando o efeito da idade sobre o

processo meiótico de oócitos maturados “in vitro” vindo de ovários não

estimulados. Este efeito sobre o FM correlaciona-se também com a alta

incidência de erros de segregação meiótica observada com o aumento da idade da

mulher.

A temperatura, sem dúvida, é um importante parâmetro que afeta a

integridade do FM durante a manipulação “in vitro”. Os FM em oócitos humanos

são mais sensíveis a flutuações de temperatura quando comparados com outros

animais

42-44

. Os FM desagregados podem resultar de prolongada exposição a

temperaturas baixas

4,45

. Sun et al.

, analisando oócitos maturados “in vitro”,

relataram que fusos em oócitos humanos são também sensíveis a temperaturas

maiores que 37

C. Estes resultados indicam que, quando os oócitos humanos são

manipulados “in vitro”, um controle rigoroso da temperatura a 37

C é essencial

para a manutenção da integridade do FM e posterior desenvolvimento

embrionário adequado.

Variações no comprimento do FM foram relatadas por Wang et al.

. A

idade da mulher

47,48,16

e a exposição a diferentes condições de cultura são fatores

implicados como fontes potenciais para determinar o comprimento do FM. Shen

et al.

relataram que a média do comprimento dos fusos de todos os oócitos são

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

similares em diferentes coortes. Entretanto, Rama Raju et al.

observaram que

os embriões resultantes de oócitos com comprimento do FM >12nm mostraram,

significativamente, mais progressão ao estágio de blastocisto. Também foi

observado que o comprimento do FM diminui com o aumento da idade da

mulher.

1.5 ZONA PELÚCIDA (ZP)

A ZP é um invólucro glicoprotéico que rodeia os oócitos em crescimento

e os maduros, assim como, os embriões pré-implantados dos mamíferos

50-55

. As

glicoproteínas da zona ZP aparentemente são secretadas pelo oócito durante a

foliculogênese, como mostradas em experimentos com camundongos

56,57

. Por

outro lado, há evidência em outras espécies, inclusive em humanos, de que as

células da granulosa também contribuem para a expressão das proteínas da zona

durante a foliculogênese

58-60

. Avaliando o nível ultra-estrutural, a arquitetura

filamentar tridimensional altamente ordenada da ZP foi confirmada por estudos

em oócitos de mamíferos, incluindo oócitos humanos

61,52,63,64

. A ZP dos oócitos

humanos exprime quatro proteínas (ZP1, ZP2, ZP3 e ZP4), que modificam a

conformação depois da extrusão de GC na fertilização, como ocorre em

camundongo

65-67

. Com relação ao nível molecular, a ZP compõe-se de uma

estrutura de rede paracristalina, tridimensional, composta de filamentos

heterodiméricos de proteína ZP2 e proteína ZP3, ligados pela proteína ZP1

68,69,63

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

O significado funcional da distribuição variável e não aleatória das diferentes

proteínas glicosiladas dentro das camadas da zona pelúcida é ainda

desconhecido

59,70

. Outra proteína da ZP humana (ZPB) pode contribuir de modo

ainda desconhecido a interações esperma-oócito espécie-específica na

fertilização humana

. As proteínas da ZP formam uma espessa matriz

extracelular separando fisicamente os oócitos dos mamíferos das células da

granulosa. Entretanto, é essencial que a ZP seja atravessada por projeções

citoplamáticas de arranjo radial transzonal durante o crescimento e maturação do

oócito. Elas provêm às condições para ligação juncional direta, sinalização

célula-célula e a troca de moléculas entre o oócito e o compartimento

somático

72,73

, importantes para o crescimento do oócito

74,75

. Dentro da ZP, as

projeções podem formar uma rede hexagonal junto com as fibrilas da zona, e,

então, contribuem para a organização tridimensional do espaço

extracelular

72,73,76

. A proteína ZP1 é necessária para a integridade estrutural da

zona pelúcida

77,63

. Embora oócitos de rato desprovidos do gene ZP1 ainda

secretem proteínas ZP2 e ZP3, a ZP é mais fina e frouxamente organizada, em

comparação ao padrão normal. O diâmetro dos oócitos de animais homozigóticos

para a ausência do gene da ZP1 é quase a metade dos oócitos advindos de

animais normais

. Isto sugere que a sinalização efetiva das células da granulosa-

oócito deve depender da presença de uma zona funcional e altamente estruturada

e que alterações podem causar subfertilidade. Além disso, redução na expressão

das proteínas da ZP durante o crescimento do oócito pode indicar problemas no

processo de maturação em uma fase crítica da oogênese e folículogênese, quando

oócitos adquirem total competência nuclear e de desenvolvimento. A ZP é

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

também essencial para a fertilização

e o desenvolvimento pré-implantacional

“in vivo”, agindo na ligação táxon-específica do esperma

80-82

, previne

poliespermia

83,84

e protege o embrião do estresse mecânico antes da

implantação

. Dessa forma, defeitos na zona pelúcida estão usualmente

associados com problemas na fertilização ou anormalidades de desenvolvimento.

Por exemplo, camundongos desprovidos de genes ZP2 e ZP3 são incapazes de

formar a ZP e são estéreis

85-86

. Até o momento, foram identificados somente uns

poucos marcadores não invasivos para a qualidade dos oócitos baseados em

critérios morfológicos, os quais podem ser acessados em RA pelo uso da

microscopia convencional antes da inseminação

. Com relação a esse aspecto, a

microscopia de luz polarizada (Polscope) foi um grande avanço, desde que se

tornaram possíveis as análises não invasivas dos FM em oócitos humanos

. A

microscopia de luz polarizada usa o princípio de que a luz, passando através de

objetos cristalinos ou paracristalinos, será alterada como no plano ou fase de

vibração. O método pode, então, ser usado para acessar estruturas cristalinas e

paracristalinas quantitativa e qualitativamente. Por exemplo, a magnitude da

birrefringência da luz polarizada é um indicador para densidade, alinhamento ou

espessura de um objeto.

Os primeiros trabalhos sobre o FM forneceram informações extensas

sobre sua função na divisão celular. Entretanto, como a metodologia para

visualização do FM era baseada em processo de fixação do oócito, sua aplicação

rotineira em procedimentos de RA, e em estudos dinâmicos, era frustrada devido

à impossibilidade do emprego deste método em oócitos vivos

87,4,39,21,22,11

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Recentemente, com o uso do microscópio de luz polarizada e um software com

processador para integração de imagens, tem sido possível visualizar o FM, em

oócitos vivos, de forma não invasiva, preservando a viabilidade

celular

87,4,5,88,6,8,89,23,90-92,11

; assim como, as subestruturas da ZP de

mamíferos

2,4,39

.A microscopia de polarização permite a distinção de três camadas

da ZP de oócitos humanos. A camada interna exibe a maior intensidade de

birrefringência

. Em um estudo retrospectivo, Shen et al

observou que a

birrefringência da camada interna da ZP era diferente em ciclos com concepção

comparados com os ciclos sem concepção. Os embriões transferidos nos ciclo

com concepção eram derivados de oócitos com alta/positiva birrefringência da

ZP (BF-ZP). Recentemente, Rama Raju et al

demonstrou uma positiva

correlação entre a BF-ZP e o potencial dos embriões em se desenvolverem até o

estágio de blastocisto. Em adição, Montag et al

tem demonstrado que embriões

provenientes de oócitos com alta BF-ZP tem maior poder de implantação

comparado com aqueles provenientes de oócitos com baixa BF-ZP, sugerindo o

uso da BF-ZP, como critério de seleção oocitária.

Por outro lado, a espessura total da ZP (Esp-ZP) e a aparência das

camadas individuais mudam de acordo com o estágio de maturação do oócito

humano e o desenvolvimento pós-fertilização do embrião

94,93

. A esp- ZP de cada

embrião também tem sido correlacionada, positivamente, com a capacidade do

embrião em desenvolver-se e implantar

São muito poucas e recentes as evidências relatadas na literatura sobre os

parâmetros FM e BF-ZP como preditores da qualidade oocitária.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

2. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho foi analisar a correlação entre os parâmetros

tradicionais de avaliação da qualidade oocitária; a MN e a MC; o dismorfismo

citoplasmático e a fertilização com os recentes parâmetros: imagem do FM e as

características da ZP (BR – ZP, Esp-ZP).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

3. MATERIAL E MÉTODOS

O presente estudo foi realizado no período de abril a dezembro de 2008

no Centro de Reprodução Humana, “Prof. Franco Júnior” – Ribeirão Preto– São

Paulo.

3.1 POPULAÇÃO

Foram incluídas neste estudo, um total de 73 pacientes que participaram

do programa de FIV e/ou injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)

no Centro de Reprodução Humana “Prof Franco Júnior” e que apresentaram os

critérios abaixo descritos.

Critérios de inclusão

- Idade entre 18-39 anos.

- Coleta de ≥ seis oócitos em estágio de metáfase II (MII) nos casos de

pacientes que participaram do procedimento de maturação

oocitária“in vitro”.

- Coleta de ≥ oito oócitos em estágio de MII nos casos de pacientes

que participaram dos experimentos de dismorfismo e fertilização.

Todas as pacientes foram informadas sobre os objetivos dessa pesquisa

de maneira clara e detalhada e assinaram o termo de consentimento preconizado

pelo serviço (Anexo1). O estudo foi analisado e aprovado pela Comissão

Nacional de Ética em Pesquisa- CONEP (Anexo 2).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

3.2 ESTIMULAÇÃO OVARIANA

Todas as pacientes foram submetidas ao mesmo esquema de estimulação

ovariana. Inicialmente, o bloqueio hipofisário foi estabelecido com o uso de um

análogo de GnRH (acetato de nafarelina/ Synarel, Searle, Brasil) na dose de

400µg/dia via nasal, iniciado durante a segunda fase do ciclo menstrual prévio.

Após 14 dias de tratamento com o análogo e estabelecido o bloqueio, foi iniciada

a administração de FSH recombinante (Gonal F®, Serono, Brasil) nas doses de

150 UI a 450 UI, via subcutânea pelo período de 7 dias. No oitavo dia da

estimulação ovariana, começou a monitorização do desenvolvimento folicular

por ultra-sonografia transvaginal, sendo as doses de r-FSH ajustadas de acordo

com a resposta ovariana. Quando, no mínimo três folículos com diâmetro igual

ou superior a 17mm foram observados, a gonadotrofina coriônica humana

recombinante (r-hCG) (Ovidrel®, Serono, Brasil) foi administrada por via

subcutânea na dose de 250µg.

3.3 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DOS OÓCITOS

A coleta dos oócitos foi realizada ambulatorialmente com anestesia do

tipo sedação com propofol (Diprivan, Astrazeneca, Brasil) permanecendo a

paciente em posição de litotomia. Os oócitos foram coletados dos folículos

através de punção aspirativa transvaginal com agulhas de Frydman com 17

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

“gauge” (CCD, França) acopladas em seringas hipodérmica de 10ml (Becton

Dickinson, Brasil) guiada por um transdutor ultra-sonográfico endovaginal, após

36-38 horas da injeção de r-hCG. Logo após a punção aspirativa do folículo, o

fluído folicular obtido foi depositado em placas de Petri de cultura de células

(Corning - USA, referência: 430166) para a identificação dos oócitos através de

estéreo microscópio (Nikon - Japão, referência: SMZ 645) equipado com platina

aquecedora (Tokai Hit Thermo Plate - Japão, referência: U4020WF) na

temperatura de 37ºC. Os oócitos identificados no fluido folicular foram

transferidos para meio P1 (Irvine Scientific - USA, referência: 9910) pré-

equilibrado com 3% de soro albumina humana (HSA) (Irvine Scientific – USA,

referência: 9988) e incubados a 37ºC em mistura gasosa com 5.8% de CO

até o

momento da desnudação.

3.3.1 Desnudação oocitária

Após o período mínimo de uma hora e máximo de três horas, os oócitos

foram transferidos para uma solução de 40 UI de hialuronidase (Irvine

Scientific– USA, referência: 90101) diluída em meio de fluido tubário humano

modificado (mHTF) (Irvine Scientific – USA, referência: 90126) contendo 3%

de HSA (mHTF/10%HSA), por tempo máximo de 1 minuto onde parte da células

da granulosa foram separadas dos oócitos. Logo após este período, os oócitos

foram transferidos para meio mHTF/10%HSA e a remoção total das células do

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

cúmulus e da corona foi realizada através de várias pipetagens utilizando

pipetador flexipet (Cook - USA, referência: K-FRO-1000) e micropipetas de

desnudação de diâmetro de 140 µm (Cook - USA, referência: K-FPIP-1140). Em

seguida, os oócitos foram lavados duas vezes em novo meio mHTF/3%HSA e

classificados quanto a MN.

Todo esse procedimento foi realizado em uma placa de quatro poços

(Nunc - Dinamarca, referência: 176740) na temperatura de 37ºC, no tempo

máximo de 10 minutos (FIG. 1).

Figura 1 – Sistema para a desnudação oocitária

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

3.3.2 Classificação da maturidade nuclear

Os oócitos foram classificados quanto ao grau de maturidade nuclear

utilizando microscopia de luz convencional, por microscópio invertido com

objetiva de aumento de 200 x (Nikon - Japão, referência TE200) conforme

descrição abaixo:

Oócitos imaturos

Oócitos em estágio de prófase I (FIG. 2), que apresentavam as seguintes

características:

• Um largo e esférico núcleo contendo um único e grande nucléolo,

denominado VG, posicionado, geralmente no centro do citoplasma,

algumas vezes apresentando-se na parte periférica em período

anterior a sua quebra

• Ausência do primeiro CP

• Forma esférica irregular

• Citoplasma escuro granuloso

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 2 - Oócito imaturo (Prófase I)

Oócitos intermediários

Oócitos em estágio de metáfase I (FIG. 3). Estes oócitos completaram a

prófase da meiose I, desaparecendo a VG. Durante este estágio, o FM se forma e

os cromossomos paternos e maternos encontram-se alinhados aleatoriamente nos

pólos. Este óvulos são caracterizados pela:

• Ausência de VG

• Ausência do primeiro CP

• Forma esférica regular

• Citoplasma claro com poucas granulações citoplasmáticas

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 3 - Oócito intermediário (Metáfase I)

Oócito maduros

Oócitos em estágio de metáfase II (FIG 4). Estes oócitos apresentam-se no

estágio de meiose II depois da extrusão do primeiro CP.

Os oócitos em metáfase II são caracterizados pela:

• Presença do primeiro CP

• Forma esférica

• Citoplasma claro com granulações homogêneas

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 4 - Oócito maduro (Metáfase II)

Após a classificação da maturidade os oócitos foram transferidos para

meio P1, pré-equilibrado com 3% de HSA, incubados a 37ºC em mistura gasosa

com 5.8% de CO

sendo, posteriormente, utilizados nos seguintes experimentos:

3.4 MATURAÇÃO NUCLEAR (EXPERIMENTO 1 )

Um total de 83 oócitos imaturos recuperados durante a coleta foi

cultivado “in vitro” por período de dois dias até alcançarem a MN completa

(estágio de metáfase II). Durante este período em cultura, ou seja, do dia 0 ao dia

2, os oócitos foram observados em até cinco vezes (Tabela1) para a confirmação

da presença da MN.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Tabela 1 - Horários de avaliação da maturação nuclear

Dia 0 Dia 01 Dia 2

Tempo em cultura 1 hora 6 horas 24 horas 30 horas 48 horas

Dia 0 = dia da coleta, Dia 1= um dia após a coleta , Dia 2 = dois dias após a coleta

3.4.1 Cultura dos oócitos imaturos

Os oócitos imaturos foram cultivados individualmente em sistema de

cultivo por microgotas (FIG. 5) em placa de Petri de cultura 60 x 15 mm

(Corning - USA, referência: 430166). Um total de sete microgotas de 20 µl de

meio de cultura P1 suplementado com 10% de HSA, foi depositado sobre cada

placa de cultura e cobertas com 10 ml de óleo de parafina (Ovoil - Vitrolife –

Suécia, ref: 10029 ) e mantidas em atmosfera de 5.8% de CO2 por um período de

quatro horas em temperatura de 37ºC, para a obtenção da estabilização do

sistema. Após este período, os oócitos imaturos foram transferidos para as

microgotas desta placa e cultivados em incubadora com atmosfera de 5.8% de

CO2 em temperatura de 37ºC por 24 horas. No dia 1 de cultura, ou seja, após 24

horas, os oócitos foram transferidos para nova placa de cultura contendo meio

fresco e mantidos nesta por mais um dia.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 5 - Sistema de cultura por microgota

Durante o procedimento de MN, foram avaliados os seguintes

parâmetros:

A- FM: presença e ausência

B- ZP :

- BF-ZP: presença e ausência

- Esp- ZP

A- FUSO MEIÓTICO

A avaliação da presença ou ausência do FM foi feita em 58 oócitos

maturados “in vitro”, em estágio MII, através de microscópio invertido (Nikon

TE 200-Japão) equipado com objetivas de Hoffman 10 x, 20 x, e 40 x; um

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

sistema de microscopia de luz polarizada (FIG.6), isto é, um filtro circular

polarizador, objetivas 25 x, cristal líquido (OCTAX ICSI Guard

- OCTAX

Microscience GmbH - Alemanha); implementado com uma camera; um software

de sistema de imagem (OCTAX Eyeware

) (FIGS.7-11) e platina aquecedora

(Tokai Hit Thermo Plate - Japão, referência: U4020WF) (FIG 12).

Figura 6 – Microscópio invertido Nikon com sistema de luz polarizada.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 7 – Filtro circular polarizador

Figura 8 – Objetiva 25 x - OCTAX

Filtro verde

Polarizador circular

Condensador

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 9 – Cristal líquido

Figura 10 – Câmera de imagens

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 11 – Sistema de imagem - OCTAX Eyeware

Figura 12 – Platina aquecedora Tokai

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Os oócitos, em MII maturados “in vitro”, foram colocados

individualmente em microgotas de 5µl de meio HTF tamponado contendo 10%

de HSA dispostas sobre placas de vidro especiais para microscopia de luz

polarizada (Fluordish – World Precision – USA) cobertas com óleo de parafina

Ovoil e, previamente, equilibrada para temperatura de 37ºC e pH de 7.3. Antes

da análise do FM, os oócitos foram visualizados em microscopia de luz

convencional e posicionados de forma a apresentarem o primeiro CP na posição

de seis ou 12 horas. Em seguida, os filtros verdes de polarização foram ajustados

paraa avaliação do FM. Imagens individuais foram registradas e arquivadas em

sistema de imagem computadorizada.

Os oócitos com presença do FM, apresentaram uma estrutura em

coloração amarelada posicionados, na maioria das vezes, próximo do primeiro

CP (FIG. 13). Por outro lado, os oócitos, com ausência de FM, não apresentaram

esta estrutura em qualquer região do citoplasma (FIG. 14).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 13 – Oócito em metáfase II com fuso meiótico presente.

Figura 14 – Oócito em metáfase II com ausência de fuso meiótico

O segundo parâmetro avaliado durante a MN foi a ZP.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

B - ZONA PELÚCIDA

1- Birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP)

Durante o processo de maturação “in vitro”, os oócitos foram avaliados

quanto à presença ou não da BF- ZP em todas os seus estágios de maturação

(VG, MI e MII), através do mesmo sistema de microscopia utilizado para a

avaliação do FM, como descrito anteriormente, porém com um programa

(OCTAX EyeWare MX PolarAide - OCTAX Microscience GmbH – Alemanha)

que quantifica, automaticamente, a espessura e a birrefringência da ZP em um

escore positivo ou negativo (FIG. 15).

Figura 15 - Programa de avaliação da birrefringência da ZP- OCTAX EyeWare

polarAIDE.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

A BF-ZP foi considerada positiva quando o escore apresentou um valor

numérico positivo. Neste caso, a imagem da BF-ZP era de cor lilás forte e

uniforme em toda a superfície da ZP (FIG. 16). Por outro lado, a BF-ZP foi

considerada negativa quando o escore mostrou um valor numérico negativo.

Nessa ocasião, a imagem da BF-ZP apresentava-se de cor lilás fraca e/ou não

uniforme em toda a superfície da ZP (FIG. 17).

Figura 16 - Imagem de um oócito com BF-ZP positiva.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 17 - Imagem de um oócito com BF-ZP negativa.

2- Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP)

A medida da Esp-ZP foi calculada através do software “polarAIDE ”. A

média de quatro medidas da ZP referente às posições norte, sul, leste, oeste, foi

calculada conforme esquema abaixo (FIG.18).

Média da espessura total = Esp total-norte + Esp total-sul + Esp total-

leste + Esp total oeste / 4

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 18 - Medidas da espessura da zona pelúcida (µm) em quatro posições

(norte,sul,leste e oeste)

3.5 MATURAÇÃO CITOPLASMÁTICA (EXPERIMENTO 2)

Um total de 29 oócitos cultivados “in vitro”, que atingiu a MN completa,

após o mínimo de 24h e o máximo de 48h em cultura foi analisado quanto à MC

pela técnica de coloração dos GC descrita por Cherr et al.

com algumas

modificações.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

3.5.1 Coloração da cromatina e dos GC

Os 29 oócitos maturados “in vitro” foram transferidos para uma solução

de pronase a 0.5% em tampão salino fosfato (PBS) mantidos a temperatura de

37ºC por, aproximadamente, cinco minutos para a remoção da ZP. Em seguida,

os oócitos sem a ZP foram fixados a 3% de formaldeído em PBS por 30 minutos

a temperatura ambiente e mantidos a 4ºC em solução de bloqueio (SB - 1mg/ml

de soro albunina bovino, 100mM de glicina e 0.2% de azida sódica) por no

mínimo 24 horas e máximo de 5 dias. Para a permeabilização, os oócitos foram

tratados por cinco minutos a temperatura de 38ºC em SB acrescida de 0.1% de

triton X-100. Os oócitos foram incubados em 10µg/ml aglutinina de Lens

culnaris conjugada ao isotiocianato de fluoresceína (FITC-LCA) em SB por 15

minutos; esta lecitina liga-se especificamente, à alpha D-manose presente nos

GC. Logo após esta incubação, os oócitos foram lavados três vezes em SB,

corados com 10µg de Hoechst 33342 em SB por 10 minutos; lavados novamente

em SB, e, em seguida, fixados entre lâminas e lamínulas. Para uma melhor

fixação dos oócitos nas lâminas, estes foram transferidos para solução de PBS de

1 mg/ml polivinilpirrolidona por um minuto antes de serem depositados sobre 2

µl de glicerol dispostos nas lâminas. A MC foi avaliada sob filtro de excitação de

400-600 nm (DAPI) disposto em um microscópio de fluorescência (Olympus –

Japão, referência: BX50).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Os oócitos que apresentaram GC dispostas apenas na periferia foram

considerados como oócitos com presença de MC completa (FIG. 19). Por outro

lado, os oócitos que apresentavam GC no centro do citoplasma, ou no centro e

periferia, foram rotulados como oócitos com ausência de MC (FIG.20).

Figura 19 – Oócito em estágio de MII, com maturação citoplasmática completa

(GC dispostos na periferia)

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 20 – Oócito em estágio de MII, com ausência de maturação

citoplasmática (GC dispostos na periferia e no centro)

Os 29 oócitos em MII, com MC presente ou não, foram avaliados

quanto: ao FM (presença ou ausência); às características da ZP (presença ou não

BF-ZP, esp ZP), conforme descrito anteriromente e em relação a variação da

espessura da ZP (VZP).

Variação da espessura da zona pelúcida (VZP)

Para a avaliação da esp-ZP, quatro medidas de sua espessura, em quatro

diferentes posições do oócito (norte , sul , leste, oeste) de cada oócito foram

realizadas (FIG.18 ). O cálculo da VZP, em porcentagem, foi obtido de acordo

com Cohen et al.

através da fórmula:

VZP = EspZP máxima – EspZP média/Esp Zpmédia x 100 (%)

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

3.6 DISMORFISMO OOCITÁRIO (EXPERIMENTO 3)

Um total de 260 oócitos em MII, recuperados durante a coleta, foi

avaliado quanto à presença ou não de AIC, através de microscopia de

convencional luz invertida (Nikon-Japão-referência TE200) equipada com

objetiva Hoffman com aumento de 200 x, câmera e video para arquivo de

imagens (FIG.21). Logo após a desnudação dos oócitos, aqueles que se

apresentaram em estágio de MII foram transferidos para microgotas de 5 µl de

meio HTF tamponado e suplementado com 10% HSA, em placas de Petri de

cultura cobertas com óleo de parafina Ovoil e, previamente, equilibrada para

temperatura de 37ºC e pH de 7.3, fotografados individualmente e avaliados

quanto à presença ou não de AIC.

Figura 21 - Microscópio de luz convencional Nikon

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Os oócitos rotulados com AIC presente foram aqueles que apresentaram,

no mínimo uma das características AIC descritas abaixo:

A- Presença de granulações heterogêneas (granulações escuras no

centro ou em parte isolada do citoplasma) (FIG.22) ou homogêneas

(granulações escuras espalhadas por todo citoplasma) (FIG.23 a e b).

Figura 22 – Oócito em MII com granulações no centro do citoplasma

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 23a – Oócito em MII com granulações na lateral do citoplasma

Figura 23b – Oócito MII com granulações em todo o citoplasma

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

B- Presença de pequenos corpos refratários no citoplasma (FIG. 24 a e b).

Figura 24

a,b – Oócito em MII com presença de corpos refratários no citoplasma

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

C- Presença de agregados de RE (pequenos círculos claros dentro

citoplasma) (FIG. 25).

Figura 25 – Oócito em MII com presença de agregados de retículo

endoplasmático

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

D- Presença de vacúolos no citoplasma (FIG.26 a,b).

Figura 26 a,b – Oócito com vacúolos no citoplasma

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Os 260 oócitos em MII com AIC presente ou não foram avaliados

quanto ao FM (presença ou ausência), e quanto as características da ZP (BF-ZP

positiva ou negativa, esp-ZP), conforme descrito anteriromente.

3.7 FERTILIZAÇÃO OOCITÁRIA (EXPERIMENTO 4)

Um total de 216 oócitos em MII recuperados durante a coleta foi

avaliado quanto a presença ou não de fertilização. Logo após a ICSI, os oócitos

foram transferidos para o sistema de cultura por microgota e cultivado

individualmente por dois dias em microgotas de 20 µl de meio P1 suplementado

com 10% HSA em atmosfera de 5.8% de CO2 e temperatura de 37ºC. No

período de 19 a 25 horas após a ICSI, a avaliação da fertilização foi realizada

através de microscopia de luz invertida equipada com objetiva Hoffman com

aumento de 200 x. Os oócitos foram classificados quanto a fertilização, tendo

por base a presença de PN no citoplasma. Aqueles que apresentavam 2PN foram

caracterizados como fertilização normal presente (FIG.27). Enquanto que os

oócitos que não apresentaram 2PN no citoplasma foram considerados não

fertilizados.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Figura 27 – Oócito em estágio MII com fertilização normal presente (presença

de 2PN no citoplasma).

Os 216 oócitos em MII, fertilizados ou não, foram avaliados quanto ao

FM (presença ou ausência), e quanto às características da ZP (BF-ZP positiva ou

negativa, esp- ZP), conforme descrito anteriromente.

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os testes estatísticos de Qui-quadrado, exato de Fisher, Mann-Whitney,

Kruskal-Wallis e os coeficientes de correlação “phi”, o de contingência de

Pearson e o de V de Cramér foram empregados quando indicados, utilizando-se

os programas: Instat 3 para Macintosh (La Jolla, USA) e/ou StatsDirect

(Cheshire, UK).

ronúcleos

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

4- RESULTADOS

4.1 MATURAÇÃO NUCLEAR

Um total de 38 pacientes coletou 83 oócitos em estágio de VG. As

características gerais deste grupo de pacientes estão dispostas na Tabela 2. Do

total de 83 oócitos que iniciaram a maturação “in vitro”, 58 oócitos atingiram a

MN (estágio MII), ou seja, 69.9% dos oócitos.

Tabela 2 - Características gerais da população que participou do experimento de

maturação nuclear.

Características

Pacientes (n) 38

Idade ( média ± dp) 34.34 ± 4.04

Etiologia:

-Fator masculino

-ESCA

-Endometriose

-Tubo-peritoneal

-Multi causas

36.8%

13%

21.3%

10.5%

18.4%

Nº de oócitos coletados 614

Nº de oócitos MII 414

Nº de oócitos VG 83

4.1.1 Maturação nuclear versus fuso meiótico

Dos 58 oócitos que atingiram a MN, o FM foi visualizado em 30 oócitos

(51.7%), sendo que nos 28 oócitos restantes o FM não foi visualizado em

qualquer região do citoplasma.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

4.1.2 Maturação nuclear versus características da zona pelúcida

a- Birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP ).

Dos 83 oócitos coletados em VG, (88%) apresentaram BF-ZP positiva.

Dos 58 oócitos em VG que alcançaram a maturação “in vitro”, 48 (82.7%)

apresentaram BF-ZP positiva, enquanto que apenas 10 (17.3%) apresentaram BF-

ZP negativa. Ao atingirem o estágio de MI, a BF-ZP apresentou-se positiva em

75.8% dos oócitos, enquanto que 24.2% apresentaram BF-ZP negativa.

Entretanto, no momento em que os oócitos atingiram a MN, isto é, estágio de M

II, 82.7% deles apresentaram BF-ZP positiva e 17.3% BF-ZP negativa. A

correlação entre esses dois parâmetros: MN e a BF-ZP, não foi estatisticamente

significante (p=0.55). Além disso, observou-se que o coeficiente de contigência

de Pearson (0.081) e o V de Cramér (0.081 ) foram muito baixos (Tabela 3).

Tabela 3 - Correlação da maturação nuclear (VG, MI, MII) com a birrefringência

da zona pelúcida (BF-ZP)

BF-ZP

Positiva

BF-ZP

Negativa

VG 48 10

M I 44 14

M II 48 10

Qui-quadrado = 1.17 p=0.55

Coeficiente de contingência de Pearson = 0.081

V de Cramér = 0.081

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

b- Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP ).

A média da esp-ZP dos oócitos não demonstrou alteração significante

(p=0.94) durante a maturação “in vitro”(Tabela 4).

Tabela 4 – Espessura total da zona pelúcida em oócitos no estágio de vesícula

germinativa (VG), metáfase I (MI) e metáfase II (MII), durante a

maturação nuclear.

Espessura da ZP

(µm)

20.22 ± 2.56

20.28 ± 2.86

MII

20.12 ± 2.68

Teste de Kruskal-Wallis = 0.94

4.2 MATURAÇÃO CITOPLASMÁTICA

A MC foi estudada em 16 pacientes do total de 38 que coletaram óvulos

para o experimento de MN. Na Tabela 5, são relatadas as características gerais

dessa população . Um total de 78 oócitos foram fixados para a avaliação da MC.

Entretano, apenas 29 (37.1 %) obtiveram sucesso nesta avaliação. Os 49 óocitos

restantes não participaram dos resultados por problemas técnicos: ruptura do

citoplasma no momento da remoção da ZP ou da fixação do oócito, ou pela

ausência de coloração padrão. Dos 29 oócitos avaliados, 16 (55%) atingiram a

MC completa.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Tabela 5 - Características gerais da população que participou do experimento de

maturação citoplasmática.

Características

Pacientes (n) 16

Idade ( média ± dp) 34.5 ± 4.03

Etiologia:

-Masculino

-ESCA

-Endometriose

-Tubo-peritoneal

-Multi causas

50%

12.5%

6.3%

12.5%

18.7%

Nº de oócitos coletados 211

Nº de oócitos em MII 143

Nº de oócitos que atingiram MN, fixados e estudados 29

4.2.1 . Maturação citoplasmática versus fuso meiótico

De um total de 29 oócitos avaliados, 31% (n=9) demonstraram presença

de MC e de FM, enquanto que 17.2% (n=5) apresentaram FM, porém, ausência

de MC. Por outro lado, 27.6% dos oócitos avaliados (n=8) demonstraram a

ausência de MC e do FM, enquanto que 24.2% (n=7) apresentaram ausência de

FM, porém, presença de MC. Uma correlação baixa entre MC e o FM foi obtida

(coeficiente de “phi”= 0.17 )(Tabela 6).

Tabela 6 - Correlação da maturação citoplasmática (MC) com a presença ou

ausência do fuso meiótico (FM)

Presente

Ausente

Presente

9 7

Ausente

5 8

Teste exato de Fisher p=0.46

Coeficiente de correlação “phi”= 0.17

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

4.2.2 Maturação citoplasmática versus características da zona pelúcida

a- Birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP ).

Um total de 29 oócitos foram avaliados quanto a MC e BF-ZP. A MC

esteve presente em 16 óocitos, sendo que 68.7% destes apresentaram BF-ZP

positiva. Enquanto que dos 13 oócitos que apresentaram ausência de MC, 46.1%

destes a BF-ZP estava positiva. Por outro lado, dos 16 oócitos com MC presente,

31.3% dos oócitos apresentaram BF-ZP negativa, enquanto que dos 13 com

ausência de MC, 53.9% apresentaram BF-ZP negativa. A Tabela 7 mostra uma

baixa correlação da MC com BF-ZP, coeficiente “phi” = 0.22.

Tabela 7 - Correlação da maturação citoplasmática (MC) com a birrefringência

da zona pelúcida (BF-ZP)

BF-ZP

Positiva

BF-ZP

Negativa

Presente

11 5

Ausente

6 7

Teste exato de Fisher p=0.27

Coeficiente de correlação “phi”= 0.22

b- Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP ).

Não houve diferença significativa (p=0.71) na Esp-ZP dos oócitos que

obtiveram MC presente comparados com aqueles com MC ausente (Tabela 8).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

c- Variação da espessura da zona pelúcida (VZP ).

Não houve diferença significantiva (p=0.67) entre a VZP dos oócitos

com MC presente comparados com aqueles com MC ausente (Tabela 8)

Tabela 8 - Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP) e variação da espessura da

zona pelúcida (VZP) em oócitos com presença e ausência de

maturação citoplasmática (MC)

Esp-ZP

(µm)

VZP

(%)

Presente

19.8 ± 3.47 14.5 ± 8.8

Ausente

18.8 ± 1.56 15.5 ± 8.0

Teste de Mann-Whitney

Esp-ZP, p= 0.71; VZP, p=0.67

4.3 DISMORFISMO OOCITÁRIO

Um total de 35 pacientes coletou 280 oócitos em estágio de MII. As

características gerais deste grupo de pacientes estão dispostas na Tabela 9.

Tabela 9 - Características gerais da população que participou do experimento de

dismorfismo oocitário.

Características

Pacientes (n) 35

Idade ( média ± dp) 33.55 ± 4.49

Etiologia:

-Fator masculino

-ESCA

-Endometriose

-Tubo-peritonial

-Multi causas

54%

8.5%

17%

12%

Nº de oócitos coletados 534

Nº de oócitos MII 400

Nº de oócitos MII estudados 280

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

4.3.1 Dismorfismo versus fuso meiótico

Um total de 85 oócitos foi estudado quanto aos parâmetos AIC e FM.

Destes, 36.5% dos oócitos (n=31) mostraram presença de AIC e presença do FM;

enquanto que 23.5% (n=20) apresentaram o FM, porém, ausência de AIC. Por

outro lado, uma pequena parte do oócitos n=10 (11.8%) apresentou ausência de

AIC e do FM, sendo que 28.2% dos oócitos apresentaram ausência de FM e

presença de AIC. A correlação entre o AIC e o FM foi baixa (coeficiente de

“phi”= 0.10). (Tabela 10 ).

Tabela 10 - Correlação das anomalias intracitoplasmáticas (AIC) com a presença

ou ausência do fuso meiótico (FM)

Presente

Ausente

AIC

Presente

31 24

AIC

Ausente

20 10

Teste exato de Fisher p=0.48

Coeficiente de correlação “phi”= 0.10

4.3.2 Dismorfismo versus características da zona pelúcida

a- Birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP ).

Um total de 280 oócitos foi estudado quanto os parâmetros AIC e BF-

ZP. A AIC estava presente em 158 oócitos (56.4%). Destes, 34.2% (n=54)

apresentaram BF-ZP positiva, sendo a maioria deles (65.8%) com BF-ZP

negativa. Por outro lado, de um total de 122 oócitos que não demonstram

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

nemhuma AIC, 42.6% (n=52) apresentaram BF-ZP positiva enquanto que os 70

oócitos restantes (57.4%) apresentaram BF- ZP negativa.

A Tabela 11 mostra uma fraca correlação (coeficiente de “phi”= 0.086)

entre AIC e BF-ZP.

Tabela 11 - Correlação das anomalias intracitoplasmáticas (AIC) com a

birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP)

BF-ZP

Positiva

BF-ZP

Negativa

AIC

Presente

54 104

AIC

Ausente

52 70

Qui quadrado p=0.14

Coeficiente de correlação “phi”= 0.086

b - Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP ).

A esp-ZP não variou com presença ou não de AIC (Tabela 12).

Tabela 12 - Espessura total da zona pelúcida (esp-ZP) em oócitos com presença

ou ausência de anomalias intracitoplasmáticas (AIC)

Esp-ZP

(µm)

AIC

Presente

19.7 ± 2.89

AIC

Ausente

19.0 ± 2.27

Teste de Mann-Whitney = 0.21

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

4.4 FERTILIZAÇÃO

As características gerais do grupo de 35 pacientes em que a fertilização

foi avaliada estão dispostas na Tabela 13.

Tabela 13 - Características gerais da população em que a fertilização foi

avaliada.

Características

Pacientes (n) 35

Idade ( média ± dp) 33.55 ± 4.49

Etiologia:

-Fator masculino

-ESCA

-Endometriose

-Tubo-peritonial

-Multi causas

54%

8.5%

17%

12%

Nº de oócitos coletados 534

Nº de oócitos MII 400

Nº de oócitos MII estudados 216

4.4.1 Fertilização versus fuso meiótico

Um total de 216 oócitos foi avaliado quanto as variáveis fertilização e

FM. A fertilização ocorreu em 68% (n=147) dos oócitos. Do total avaliado,

54.2% apresentaram fertilização e FM presente, enquanto que 24% apresentaram

ausência de fertilização e presença de FM. Por outro lado, 7.8% apresentaram

ausência de fertilização e FM, enquanto que 13.8% apresentaram ausência FM e

fertilização presente. A correlação entre a fertilização e o FM foi muito baixa:

coeficiente “phi”=0.047 (Tabela 14).

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Tabela 14 - Correlação da fertilização com a presença ou ausência do fuso

meiótico (FM)

Presente

Ausente

FERTILIZAÇÃO

Presente

117 30

FERTILIZAÇÃO

Ausente

52 17

Teste exato de Fisher p=0.48

Coeficiente de correlação “phi”= 0.047

4.4.2 Fertilização versus características da zona pelúcida

a- Birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP ).

Um total de 216 oócitos foram avaliados quanto os parâmetros

fertilização e BF-ZP. Um total de 46 (31.3%) oócitos apresentou BF-ZP positiva

entre os 147 oócitos fertilizados, sendo que em 101 (68.7%) a BF-ZP estava

negativa. Entre os oócitos não fertilizados (n=69), em 62% deles a BF-ZP foi

negativa. A BF-ZP estava positiva em apenas 26 oócitos (37.7%), A correlação

entre a fertilização dos oócitos e a presença ou não da BF-ZP foi baixa

(coeficiente “phi” = 0.063)(Tabela 15 ).

Tabela 15 - Correlação da fertilização com birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP)

BF-ZP

Positiva

BF-ZP

Negativa

FERTILIZAÇÃO

Presente

46 101

FERTILIZAÇÃO

Ausente

26 43

Teste exato de Fisher p=0.35

Coeficiente de correlação “phi”= 0.063

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

B - Espessura total da zona pelúcida (Esp-ZP).

A esp-ZP foi estatisticamente semelhante com presença ou não de

fertilização (Tabela 16).

Tabela 16 - Espessura da zona pelúcida (esp-ZP) em oócitos com presença ou

ausência de fertilização

Esp-ZP

(µm)

FERTILIZAÇÃO

Presente

19.8 ± 3.23

FERTILIZAÇÃO

Ausente

20.2 ± 3.03

Teste de Mann-Whitney = 0.49

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

5- DISCUSSÃO

Nos últimos anos, foram descritos dois parâmetros não invasivos de

qualidade oocitária: a birrefringência da ZP e a visualização do FM. Entretanto,

ainda são poucos os trabalhos que analisam suas vantagens e desvantagens,

especialmente, suas correlações com parâmetros clássicos de avaliação oocitária

(maturação, dismorfismo e a fertilização). A incorporação dessas novas

tecnologias em um programa de ICSI produz mudanças importantes nos

procedimentos rotineiros de manuseio dos oócitos, situação que pode provocar

repercussões positivas ou negativas, mas que precisam ser identificadas. Além

disso, essas tecnologias de avaliação oocitária são caras, quando comparadas com

as tradicionais, que dependem apenas do sistema de microscopia já existente em

serviços que habitualmente empregam a técnica de ICSI. Dessa forma, deve ser

sempre analisada a relação custo/benefício de uma nova tecnologia.

A ZP é uma camada glicoprotéica, que é coordenadamente secretada

pelo oócito, durante a foliculogênese como foi demonstrado em

camundongos

56,57.

Contudo, a célula da granulosa do folículo ovariano da mulher

também contribui na produção das proteínas da ZP durante o processo de

foliculogênese

59,60,98

. Com relação ao nível molecular, a ZP consiste de uma

estrutura paracristalina e tridimensional composta de filamentos heterodiméricos

de proteínas chamadas de ZP1, ZP2, ZP3 e ZP4. Do ponto de vista teórico, a

idéia de uma correlação entre a ZP e a qualidade oocitária estaria intimamente

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

ligada a uma perfeita conexão funcional entre as células da granulosa e o oócito

mediada pela ZP. Ao contrário, poderia indicar uma situação de subfertilidade,

quando uma reduzida expressão das proteínas da ZP estivesse presente, fato que

poderia provocar uma insuficiência no processo de maturação oocitária durante a

foliculogênese, por interferir nas comunicações bioquímicas entre as células da

granulosa e o ooplasma

. Gook et al.

, acreditam que as proteínas da ZP

aumentam no citoplasma das células da granulosa e do oócito durante o progredir

do desenvolvimento folicular. Além disso, a presença das proteínas da ZP em

folículos primordiais também foi detectada, confirmando a hipótese de sua

origem com o processo de oogênese.

Shen et al.

observaram em estudo retrospectivo que a magnitude da

retardância e da espessura da camada interna da ZP foi maior nos oócitos que

resultaram em ciclos com gestação do que naqueles que ocasionaram ciclos sem

concepção. Na mesma linha de pensamento, Montag et al.

observou em um

estudo prospectivo, analisando pacientes submetidas a um programa de ICSI, que

a alta (positiva) birrefringência da ZP estava significativamente ligada a uma

maior taxa de implantação embrionária, gravidez e de nascidos vivos por ciclo.

Ao contrário, Çiray et al.

, não observou diferença significativa entre a média

da retardância da camada interna da ZP em embriões com boa ou pobre

qualidade morfológica (2.2 ± 0.9 nm; 2.3 ± 0.6, respectivamente).

A causa biológica da variação (alta/positiva ou baixa/negativa) da

birrefringência da ZP ainda é uma questão não esclarecida. A alta/positiva

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

birrefringência da camada interna da ZP poderia estar ligada a uma ótima

formação dessa estrutura protéica, e consequentemente, de uma maturação

oocitária perfeita (nuclear + citoplasmática). Além disso, especulou-se, também,

que a integridade da estrutura da ZP poderia refletir, especificamente, uma MC

ideal

Em vista destes fatos, procurou-se através de uma modelo de estudo com

oócitos madurados “in vitro”, identificar qual a correlação entre a magnitude da

birrefringência da ZP (escore positivo ou negativo) e o processo de maturação

oocitário (nuclear e citoplasmática). Contudo, o material usado tem suas

limitações: em primeiro lugar, porque é difícil a obtenção de óvulos em VG - os

esquemas de estimulação ovariana procuram sempre induzir a produção de

óvulos em metáfase II (a taxa de óvulos colhidos em VG no nosso serviço é de

7%); em segundo lugar, em algumas pacientes o número total de óvulos

coletados é reduzido e, tal fato, inviabilizaria seu uso para pesquisa, desde que os

óvulos maturados “in vitro” são fixados para a visualização das granulações

citoplasmáticas; em terceiro lugar, os óvulos coletados por estimulação ovariana

e maturados “in vitro” até o estágio de metáfase II poderiam não apresentar

características citoplasmática idênticas aos obtidos em metáfase II logo a após a

coleta (maturados “in vivo”).

No presente trabalho, um total de aproximadamente 70% dos óvulos em

VG atingiram o estágio de metáfase II com o uso de um meio de cultura simples,

sem suplementação de gonadotrofinas ou esteróides. Em revisão sobre maturação

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

oocitária, Trounson et al.

100

relataram resultados variáveis (taxas de MNde 38%

a 84%) obtidos na maturação “in vitro” de oócitos no estágio de VG, porém,

provenientes de ciclos estimulados. Esses oócitos maturados “in vitro” possuem

menor taxa de fertilização, mas similar qualidade embrionária quando

comparados com oócitos obtidos em metáfase II maturados “in vivo”

101

Por outro lado, a birrefringência da ZP (positiva ou negativa) não se

alterou com o evoluir da MN (VG até metáfase II); além disso, a correlação entre

essas duas variáveis foi muito baixa (Tabela 3). Dessa forma, não se confirmou, a

hipótese de uma possível correlação entre a presença de MC e uma positiva (alta)

birrefringência da ZP (Tabela 7), pelo menos, no que diz respeito a oócitos

maturados “in vitro”. Futuramente, caso se comprove que a birrefringência

positiva da ZP é realmente um fator de seleção da saúde oocitária, e,

consequentemente, embrionária, a hipótese da associação com a MN oocitária

poderia não ser uma explicação biológicamente plausível.

A espessura da ZP também tem sido considerada uma variável ligada ao

prognóstico da saúde ovular e embrionária. Assim sendo, existem evidências, na

literatura, desta associação, como a observação da diminuição das taxas de

implantação embrionária quando se constatava um aumento da espessura da ZP

102

. Entretanto, a variação da espessura da ZP foi o parâmetro que se

correlacionou melhor com o sucesso em FIV

97,103,95,104

. Dessa forma, variações ≥

20% na espessura da ZP em embriões no 3º dia de desenvolvimento estariam

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

associadas com taxas de gestação de 50% contra 17.1% nos casos com variações

da espessura da ZP < 20%

104

Por outro lado, existem evidências de que a espessura total da ZP (TZP)

pode não ser alterada após a fertilização mas uma ZP ≥22 µm poderia influenciar

negativamente nos índices de fertilização

105,94,93

. Na mesma linha de

pensamento,

usando imagens obtidas por um microscópio equipado com um

“PolScope”, observaram uma maior possibilidade (p<0.05) de progressão para

blastocisto (53.1% versus 21.9%), quando a camada interna da ZP do óvulo

(antes do ICSI), possuía de 10-12 mm versus uma medida < 8mm. Contudo, as

camadas externa e média da ZP do oócito não apresentaram valor prognóstico

significativo.

No presente trabalho, a espessura total da ZP não se modificou durante a

MN oocitária de VG até MII (Tabela 4). Além disso, a espessura total (esp-ZP) e

a variação da espessura da ZP (VZP) não foram significativamente diferentes

(p=0.71 e p=0.67, respectivamente) entre os óvulos com MC positiva (esp-ZP =

19,8 ± 3,47 µm; VZP = 14.5 ± 8.8%) ou negativa (esp-ZP = 18,8 ± 1,56 µm;

VZP = 15,5 ± 8%) (Tabela 8). Esses dados sugerem que a esp-ZP parece ser

estável em cultura pelo menos até a comprovação do processo de fertilização. A

VZP não se modificou pelo menos com relação à MC.

O dismorfismo oocitário relacionado com as chamadas alterações AIC

(presença vacúolos, grânulos e corpos refratários), especialmente quando se

repete em ciclos subsequentes é considerado um marcador de insucesso da futura

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

ocorrência de uma gravidez

. Desde que tem sido relatada uma associação

significante entre positiva (alta) birrefringência da ZP com o potencial de

implantação embrionário em ciclos de ICSI

, seria interessante conhecer o grau

de correlação entre esses dois parâmetros. Na Tabela 11, os dados demonstraram

uma correlação fraca entre essas duas variáveis (birrefringência versus

dismorfismo). Assim sendo, essa informação é difícil de ser interpretada porque

as alterações de dismorfismo oocitário comumente são atribuidas a uma

assincronia no processo de maturação oocitário

, raciocínio semelhante ao

empregado para explicar do ponto de vista biológico a ocorrência da negativa

(baixa) birrefringênca oocitária

. Por outro lado, a análise da espessura total da

ZP não variou entre os oócitos com presença ou não de AIC (Tabela 12).

A fertilização oocitária é um parâmetro indireto de qualidade do oócito,

pois o processo está, também, ligado as características dos espermatozóides que

permitiriam sua penetração no oócito e a participação nos eventos bioquímicos e

fisiológicos, tais como: o reconhecimento específico, adesão e fusão dos

gametas. Entretanto, neste trabalho, todos os óvulos foram submetidos à técnica

de ICSI, ficando comprovada, dentro de certos limites, a eficiência da ativação

oocitária pelo reinício da meiose, descondensação do núcleo do espermatozóide,

formação dos PN masculino e feminino

84,106

. Teoricamente, tais processos

deveriam estar ligados a uma correta MC. Acreditando-se na hipótese de que a

ausência de MC estivesse ligada à baixa birrefringência da ZP

, não seria errado

pensar na possibilidade de uma correlação entre essas dois parâmetros

(fertilização e BF-ZP). Entretanto, os dados (Tabela 15) evidenciaram uma

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

correlação fraca (“phi” = 0.063) entre fertilização e birrefringência da ZP. A

espessura da ZP também não foi significativamente diferente entre os oócitos

fertilizados ou não (Tabela 16).

A presença de FM tem sido associada com taxas elevadas de

fertilização

49,92,11,13

. Em alguns casos com embriões de alta qualidade

88,11,13

Petersen et al.

107

mostraram em um estudo de meta-análise uma maior taxa de

fertilização (75.6% versus 61.5%, respectivamente; p<0.0001; OR:1.79, 95%

IC=1.57–2.05) quando o FM foi visualizado (4684 oócitos) versus a ausência da

sua observação (1264 oócitos). Nesse trabalho, apesar da identificação do

fenômeno de heterogeneidade, o cálculo realizado através do efeito ‘random’

confirmou uma maior taxa de fertilização quando o FM era visualizado

(p<0.0001; OR: 2.52, 95% IC=1.65-3.81). Por outro lado, os dados do presente

trabalho identificaram a presença de FM em 51.7% dos oócitos em metáfase II

após MN “in vitro” (VG até metáfase II). Entretanto, essa taxa é inferior aos

valores de 92.7% e 91% relatados por

5,6

, quando observaram oócitos em

metáfase II, logo após a coleta, e com manobras de rotação no oócito, para

facilitar a visualização do FM. Da mesma forma, continuam inferior as taxas

descritas por Cohen et al.

, Rama Raju et al.

e Braga et al.

, que obtiveram

valores menores de visualização (76%, 78% e 74.3%, respectivamente) mesmo

com a aplicação da mesma manobra de rotação. Na Tabela 6, observou-se que foi

idêntica (p=0.46) a frequência da presença ou não de FM na população de

oócitos com evidência ou não de MC. Entretanto o número de oócitos estudados

foi baixo; tal fato, poderia dificultar uma conclusão definitiva (número de oócitos

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

ideal, n=250, poder 80%, alfa=0.05). No momento, a taxa de identificação de FM

em oócitos com MC foi de 56.2% versus 38.4% de FM em oócitos sem MC.

Por outro lado, seria interessante assinalar que não conseguimos identificar na

literatura dados específicos sobre essa associação. A taxa geral de visualização

do FM nos oócitos com ou sem MC foi de 48%. Na Tabela 12, foram analisados

os oócitos em metafáse II quanto à frequência da presença ou não de FM versus o

dismorfismo oocitária. A taxa geral de visualização do FM foi de 60% e não

houve correlação entre FM e dismorfismo. Por outro lado, também não houve

correlação significativa (Tabela 14) entre a fertilização (presente ou ausente) e o

FM (visualizado ou não) mas nesse grupo específico (rotineira avaliação dos

óvulos antes da ICSI) a taxa geral de visualização do FM foi de 78.2%,

semelhante a descrita acima pelos diferentes autores.

Finalmente, os resultados do presente trabalho demonstraram uma

correlação fraca entre os parâmetro tradicionais de avaliação oocitária

(maturação, dismorfismo e fertilização) com as características do FM e da ZP.

Entretanto, a literatura sinaliza isoladamente para uma associação da qualidade

oocitária e subsequente desenvolvimento embrionário com o dismorfismo, a

birrefringência da ZP, a variação do tamanho da ZP e a visualização do FM.

Dessa forma, esses parâmetros poderiam identificar alterações em pontos

diferentes da fisiologia oocitária, fato que explicaria a ausência de correlação,

mas não excluiria o valor de suas informações.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

Nesse momento, a criação de um escore de qualidade oocitária usando

essas variáveis seria uma medida prudente.Em vista dos fatos relatados,

sugerimos a criação de um escore seleção oocitária (ESO) com os parâmetros:

dismorfismo oocitário, birrefringência da ZP, visualização do FM e variação da

espessura da ZP ≥ 20% (pontuação=1 quando o parâmetro analisado indicasse

sua marca de saúde oocitária; pontuação=0 quando estivesse ausente; pontuação

máxima do ESO = 4 pontos).

O ESO seria calculado antes da aplicação da técnica de ICSI, e,

posteriormente, correlacionado com as características morfológicas embrionárias

e as principais variáveis (taxas de implantação, gravidez, etc.) de controle do

sucesso em Reprodução Assistida. Na literatura, não há escore envolvendo

conjuntamente esses parâmetros de identificação da qualidade oocitária.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

6- CONCLUSÕES

- A birrefringência e a espessura da zona pelúcida não variaram com o

progredir da MN “in vitro”.

- A visualização do fuso meiótico, a presença de positiva birrefringência

e a espessura (total e variação) da zona pelúcida não se modificaram

com a MC presente ou não (baseada em dados preliminares)

- A visualização do fuso meiótico, a presença de positiva birrefringência

e a espessura da zona pelúcida não se alteraram com o dismorfismo

intracitoplasmático presente ou não.

- A visualização do fuso meiótico, a presença de positiva birrefringência

e espessura da zona pelúcida não variaram com a fertilização oocitária

presente ou não.

- Uma fraca correlação foi observada entre os parâmetros morfológicos

tradicionais de avaliação oocitária (maturação, dismorfismo e

fertilização) com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida.

- Desde que esses parâmetros podem ser responsáveis por identificar

pontos biológicos diferentes do potencial de qualidade oocitária seria

mais aconselhado sua utilização de forma conjunta através de um

escore de qualidade oocitária.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Oldenbourg R. A new view on polarization microscopy. Nature.

1996;381:811–2

2. Keefe D, Tran P, Pellegrini C, Oldenbourg R. Polarized light microscopy

and digital image processing identify a multilaminar structure of the

hamster zona pellucida. Hum Reprod. 1997;12:1250–52.

3. Silva CS, Kapura K, Odenberg R, Keefe DL. The first polar body does

not predict accurately the location of the metaphase II meiotic spindle in

mammalian oocytes. Fertil Steril. 1999;71:719–21.

4. Wang W, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL. The spindle

observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic

sperm injection in living human oocytes. Fertil Steril. 2001; 75: 348.

5. Cooke S, Tyler JPP, Driscoll GL. Meiotic spindle location and

identification and its effect on embryonic cleavage plane and early

development. Hum Reprod. 2003;18:2397–405.

6. Rienzi L, Ubaldi F, Martinez F, Iacobelli M, Minasi MG, Ferrero S, et al.

Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar

body position and oocyte developmental potential after ICSI. Hum

Reprod. 2003;18:1289–93.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

7. Rienzi L, Ubaldi F, Iacobelli M, Minasi MG, Romano S, Grego E.

Meiotic spindle visualization in living human oocytes. Reprod BioMed

Online. 2005;10:192-98.

8. Cohen Y, Malcov M, Schwartz T, Mey-Raz N, Carmon A, Cohen T, et al.

Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI. Hum Reprod.

2004;19:649–54.

9. Shen Y, Stalf T, Mehnert C, Eichenlaub-Ritter U, Tinneberg HR. High

magnitude of light retardation by the zona pellucida is associated with

conception cycles Hum Reprod. 2005;20:1596-606.

10. Madashi C, Bonetti CS, Braga DPAF, Pasqualotto FF, Iaconelli A, Borges

E. Spindle imaging: a maker for embryo development and implantation.

Fertil Steril. 2008; 90:194-198.

11. Rama Raju GA, Prakash GJ, Krishna KM, Madan K. Meiotic spindle and

zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a

preliminary study using polscope imaging. Reprod BioMed Online.

2007;14:166–74.

12. Montag M. Oocyte zona birefringence intensity is associated with

embryonic implantation potential in ICSI cycles. Reprod BioMed Online.

2008;16:239-44

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

13. Braga DPAF, Figueira RCS, Rodrigues D, Madaschi C, Pasqualotto FF,

Iaconelli A, et al. Prognostic value of meiotic spindle imaging on

fertilization rate and embryo development in in vitro-matured huma

oocytes. Fertil Steril. 2008;90:429-33

14. Zollner U, Zollner KP, Hartl G, Dietl J, Steck T. The use of a detailed

zygote score after IVF/ICSI to obtain good quality blastocysts: the

German experience. Hum Reprod. 2002; 17: 1327–33.

15. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Tews G. Selection based on

morphological assessment of oocytes and embryos at different stages of

preimplantation development: a review. Hum Reprod Update. 2003;

9:251–62.

16. Eichenlaub Ritter U, Schmiady H, Kentenich H, Soewarto D. Recurrent

failure in polar body formation and premature chromosome condensation

in oocytes from a patient: indicators of asynchrony in nuclear and

cytoplasmic maturation. Hum Reprod. 1995;10:2343–9.

17. Van Blerkom J, Henry G. Oocyte dismorphism and aneuploidy in

meiotically mature human oocytes after ovarian stimulation. Hum Reprod.

1992;7:379-90.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

18. Xia P. Intracytoplasmic sperm injection: correlation of oocyte grade base

on polar body, perivitteline space and cytoplasmic inclusions with

fertilization rate and embryo quality. Hum Reprod. 1997;12:1750-5.

19. Balaban B, Urman B. Effect of oocyte morphology on embryo

development and implantation. Reprod BioMed Online. 2006;12:608-15.

20. Balaban B, Urman B, Sertac A, Alatas C, Aksoy S, Mercan R, et al.

Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and

implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod.

1998;13:3431-3.

21. Coticchio G, Sereni E, Serrao L, Mazzone S, Iadarola I, Borini A. What

criteria for the definition of oocyte quality? Ann N Y Acad Sci.

2004;1034:132-44.

22. Borini A, Lagalla C, Cattoli M, Cattoli M, Sereni E, Sciajno R, et al.

Predictive factors for embryo implantation potential. Reprod BioMed

Online. 2005;15:653–68.

23. Chamayou S, Alecci C, Ragolia C, Storaci G, Maglia E, Russo E, et al.

Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical

ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos Reprod BioMed

Online. 2006;13:661–6.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

24. Ebner T, Moser M, Tews G. Is oocyte morphology prognostic of embryo

potential after ICSI? Reprod BioMed Online. 2006;12:517–12.

25. Kahraman S, Yakin K, Domez E, Samli H, Bahçe M, Cengiz G, et al.

Relationship between cytoplasm of oocytes and pregnancy outcome

following intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 2000;15:

2390-3.

26. Khalili M, Mojibian M, Sultan A. Role of oocyte morphology on

fertilization and embryo formation in assisted reproductive techniques.

Midle East Fertil Soc J. 2005;10: 72-7.

27. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Gaiswinkler U, Shebl O, Jesacher

K, et al. Occurrence and developmental consequences of vacuoles

throughout preimplantation development. Fertil Steril. 2005;83:1635-40.

28. De Sutter P, Dozortsev D, Qian C, Dhont M. Oocyte morphology does not

correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic

sperm injection. Hum Reprod. 1996;11:595-7.

29. Alikani M, Palermo G, Adler A, Bertoli M, Black M, Cohen J.

Intracytoplasmic sperm injection in dysmorphic oocytes. Zygote.

1995;3:283-8.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

30. Van Blerkom J. Occurrence and developmental consequences of aberrant

cellular organization in meiotically mature human oocytes after exogenous

ovarian hyperstimulation. Microsc ResTech. 1990;16:324-46.

31. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y, Kubo H. The relationship

between pregnancy outcome endoplasmic reticulum clusters in MII human

oocytes. Hum Reprod. 2004; 19:1591-7.

32. Meriano JS, Alexis J, Visram-Zaver S, Cruz M, Casper RF. Tracking of

oocyte dysmorphisms for ICSI patients may prove relevant to the outcome

in subsequent patient cycles. Hum Reprod. 2001;16:2118-23.

33. Van Blerkom J, Davis PW, Lee J. ATP content of human oocytes and

developmental potential and outcome after in-vitro fertilization and

embryo transfer. Hum Reprod. 1995;10:415-24.

34. Van Blerkom J. The influence of intrinsic and extrinsic factors on the

developmental potential and chromossomal normality of the human

oocyte. J Soc Gynecol. 1996;3:3-11.

35. Payne D, Flaherty SP, Jeffrey R, Warnes GM, Matheus CD. Successful

treatment of severe male factor infertility in 100 consecutives cycles using

intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1994;9:2051-7.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

100

36. Flaherty SP, Payne D, Swann NJ, Mattews CD. Aetiology of failed and

abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Hum

Reprod. 1995;10:2623-9.

37. Mahutte NG, Arici A. Failed fertilization: is it predictable? Curr Opin

Obstet Gynecol. 2003;15:211-8.

38. Pickering SJ, Johnson MH, Brude PR, Houliston E. Cytoskeletal

organization in fresh aged and spontaneously activated human oocytes.

Hum Reprod. 1988;3:978–89.

39. Eichenlaub-Ritter U, Shen Y, Tinneberg HR. Manipulation of oocyte:

possible damage to spindle apparatus. Reprod BioMed Online.

2002;5:117-24.

40. Battaglia DE, Goodwin P, Klein NA, Soules MR. Fertilization and early

embryology: Influence of maternal age on meiotic spindle assembly

oocytes from naturally cycling women. Hum Reprod. 1996;11:2217-2.

41. Volarcik K, Sheean L, Goldfarb J, Wood L, Abdul-Karim FW, Hunt H.

The meiotic competence of in-vitro matured human oocyte is influenced

by donar age: evidence that folliculogenesis is compromised in the

reproductively aged ovary. Hum Reprod. 1998;13:154- 60.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

101

42. Pickering SJ, Braude PR, Johnson MH, Cant ARM, Currie JRM.

Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of

the meiotic spindle in the human oocyte. Fertil Steril. 1990;54:102-8.

43. Aman RR, Parks JE. Effects of cooling and rewarming on the meiotic

spindle and chromosomes of in vitro matured bovine oocytes. Biol

Reprod. 1994;50:103-10.

44. Almedia PA, Bolton VY. The effect of temperature fluctuations on the

cytoskeletal organization and chromosomal constitution of the human

oocyte. Zygote. 1995;3:357–65

45. Wang W, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL. Rigorous

thermal control during intracytoplasmic sperm injection stabilizes the

meiotic spindle and improves fertilization and pregnancy rates. Fertil

Steril. 2002;77: 1274–6.

46. Sun XF, Wang WH, Keefe DL. Overheating is detrimental to meiotic

spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 2004;12:65–70.

47. Eichenlaub Ritter U, Chandley AC, Gosden R. Alteration to the

microtubular cytoskeleton and increased disorder of chromosome

alignment in spontaneously ovulated mouse oocyte aged in vitro: an

immunofluorescent study. Chromosoma. 1986;94:337–45.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

102

48. Eichenlaub Ritter U, Stah A, Lucian JM. The microtubular cytoskeleton

and chromosomes of unfertilized human oocytes aged in vitro. Hum

Genet. 1988;80:259–64.

49. Shen Y, Stalf T, Mehnert C, De Santis L, Cino I, Tinnerber HR, et al.

Light retardance by human oocyte spindle is positively related to

pronuclear score after ICSI. Reprod BioMed Online. 2006;12:737–51

50. Baranska W, Konwinski M, Kujawa M. Fine structure of the zona

pellucida of unfertilized egg cells and embryos. J Exp Zool.

1975;192:193–202.

51. Bercegeay S, Jean M, Lucas H, Barriere P. Composition of human zona

pellucida as revealed by SDS–PAGE after silver staining. Mol Reprod

Dev. 1995;41:355–9.

52. Green DP. Three-dimensional structure of the zona pellucida. Rev Reprod.

1997;2:147–56.

53. Prasad SV, Skinner SM, Carino C, Wang N, Cartwright J, Dunbar BS.

Structure and function of the proteins of the mammalian Zona pellucida.

Cells Tissues Organs. 2000;166:148–64.

54. Herrler A, Beier HM. Early embryonic coats: morphology, function,

practical applications. An overview. Cells Tissues Organs. 2000;166:

233–46.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

103

55. Carino C, Prasad S, Skinner S, Dunbar B, Chirinos M, Schwoebel E, et al.

Localization of species conserved zona pellucida antigens in mammalian

ovaries. Reprod BioMed Online. 2002;4:116–26.

56. Epifano O, Liang LF, Familari M, Moos Jr MC, Dean J. Coordinate

expression of the three zona pellucida genes during mouse oogenesis.

Development. 1995;121:1947–56.

57. Soyal SM, Amleh A, Dean J. FIGalpha, a germ cell-specific transcription

factor required for ovarian follicle formation. Development. 2000;

127:4645–54.

58. Sinowatz F, Topfer-Petersen E, Kolle S, Palma G. Functional morphology

of the zona pellucida. Anat Histol Embryol. 2001;30:257–63.

59. Bogner K, Hinsch KD, Nayudu P, Konrad L, Cassara C Hinsch E.

Localization and synthesis of zona pellucida proteins in the marmoset

monkey (Callithrix jacchus) ovary. Mol Hum Reprod. 2004;10:481–8.

60. Gook D, Martic M, Borg J, Edgar DH. Identification of zona pellucida

proteins during human folliculogenesis. Hum Reprod. 2004; 19 Supp

1: 140.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

104

61. Familiari G, Nottola SA, Macchiarelli G, Micara G, Aragona C, Motta

PM. Human zona pellucida during in vitro fertilization: an ultrastructural

study using saponin, ruthenium red, and osmium-thiocarbohydrazide. Mol

Reprod Dev. 1992; 32:51–61.

62. Wassarman P, Chen J, Cohen N, Litscher E, Liu C, Qi H, et al. Structure

and function of the mammalian egg zona pellucida. J Exp Zool. 1999;

285:251–8.

63. Wassarman PM, Jovine L, Litscher ES. Mouse zona pellucida genes and

glycoproteins. Cytogenet Genome Res. 2004; 105:228–34.

64. Oehninger S. Biochemical and functional characterization of the human

zona pellucida. Reprod BioMed Online. 2003;7:641–8.

65. Nikas G, Paraschos T, Psychoyos A, Handyside AH. The zona reaction in

human oocytes as seen with scanning electron microscopy. Hum Reprod.

1994;49:2135–8

66. Moos J, Faundes D, Kopf GS, Schultz RM. Composition of the human

zona pellucida and modifications following fertilization. Hum Reprod.

1995;10:2467–71.

67. Chiu PC, Wong BS, Lee CL, Pang RT , Lee KF, Sumitro SB, et al. Native

human zona pellucida glycoproteins:purification and binding properties.

Hum Reprod. 2008;6:1385-93.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

105

68. Wassarman PM. Zona pellucida glycoproteins. Annu Rev Biochem.

1988;57:415–42.

69. Qi H, Williams Z, Wassarman PM. Secretion and assembly of zona

pellucida glycoproteins by growing mouse oocytes microinjected with

epitope-tagged cDNAs for mZP2 and mZP3. Mol Biol Cell. 2002;13:

530–41.

70. Jimenez-Movilla M, Aviles M, Gomez-Torres MJ, Fernandez-Colom PJ,

Castells MT, De Juan J, et al. Carbohydrate analysis of the zona pellucida

and cortical granules of human oocytes by means of ultrastructural

cytochemistry. Hum Reprod. 2004;19:1842–55.

71. Lefievre L, Conner SJ, Salpekar A, Olufowobi O, Ashton P, Pavlovic B,

et al. Four zona pellucida glycoproteins are expressed in the human. Hum

Reprod. 2004;19:1580–6.

72. Albertini DF, Rider V. Patterns of intercellular connectivity in the

mammalian cumulus-oocyte complex. Microsc Res Tech. 1994; 27:

125–33.

73. Motta PM, Makabe S, Naguro T, Correr S. Oocyte follicle cells

association during development of human ovarian follicle. A study by

high resolution scanning and transmission electron microscopy. Arch

Histol Cytol. 1994;57:369–94.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

106

74. Eppig JJ. Intercommunication between mammalian oocytes and

companion somatic cells. BioEssays. 1991;13:569–74.

75. Webb RJ, Bains C, Cruttwell C, Carroll J. Gap-junctional communication

in mouse cumulus-oocyte complexes: implications for the mechanism of

meiotic maturation. Reproduction. 2002; 123:41–52.

76. Albertini DF, Barrett SL. Oocyte–somatic cell communication.

Reproduction. 2003;61(Suppl): 49–54.

77. Greve JM, Wassarman PM. Mouse egg extracellular coat is a matrix of

interconnected filaments possessing a structural repeat. J Mol Biol.

1985;181:253–24.

78. Rankin T, Talbot P, Lee E Dean J. Abnormal zonae pellucida in mice

lacking ZP1 result in early embryonic loss. Development. 1999;126:

3847–55.

79. Burkman LJ, Coddington CC, Franken DR, Kruger TF, Rosenwaks Z,

Hodgen GD. The hemizona assay (HZA): developmet of a diagnostic test

for the binding of human spermatozoa to the human hemizona pellucida to

predict fertilization potential. Fertil Steril 1988; 49:688-97.

80. Tsubamoto H, Hasegawa A, Nakata Y, Naito S, Yamasaki N, Koyama K.

Expression of recombinant human zona pellucida protein 2 and its binding

capacity to spermatozoa. Biol Reprod. 1999;61:1649–54.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

81. Miller DJ, Shi X, Burkin H. Molecular basis of mammalian gamete

binding. Recent Prog Horm Res. 2002;57:37–73.

82. Wassarman PM. Sperm receptors and fertilization in mammals. Mt Sinai J

Med. 2002;69:148–55.

83. Hoodbhoy T, Dean J. Insights into the molecular basis of sperm-egg

recognition in mammals. Reproduction. 2004; 127:417–22.

84. Yanagimachi R. Mammalian fertilization. In: Knobil E, Neill JD, editors.

The physiology of reproduction. New York: Raven Press; 1994. p.

189–317.

85. Liu C, Litscher ES, Mortillo S, Sakai Y, Kinloch RA, Stewart CL, et al.

Targeted disruption of the mZP3 gene results in production of eggs

lacking a zona pellucida and infertility in female mice. Proc Natl Acad Sci

USA. 1996;93:5431–6.

86. Rankin TL, O'Brien M, Lee E, Wigglesworth K, Eppig J, Dean J.

Defective zonae pellucidae in Zp2-null mice disrupt folliculogenesis,

fertility and development. Development. 2001; 128:1119-26.

87. Wang WH, Meng L, Hackett RJ, Keefe DL. Developmental ability of

human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope

before insemination. Hum Reprod. 2001;16:1464–8.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

108

88. Moon JH, Hyun CS, Lee SW, Son W Y, Yoon S Hy, Lim JH.

Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes

using Polscope enables the prediction of embryonic development

competence after ICSI. Hum Reprod. 2003;18:817–20.

89. Konc J, Kanyo K, Cseh S. Visualization and examination of the meiotic

spindle in human oocytes with Polscope. J Assist Reprod Genet.

2004;21:349–53.

90. Madaschi Reis C, Braga DPFA, Rodrigues D, Bonetti TCS, Iaconelli Jr A,

Pasqualoto CV, et al. Embryo development and Octax ICSI guard spindle

image Hum Reprod. 2006; 21Suppl 1:i22-3.

91. Montag M, Schimming T, van der Van H. Spindle imaging in human

oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reprod BioMed Online.

2006;12:442–6.

92. Taylor TH, Gitlin S, Wrigth G, Mitchell-Leef D, Kort HI, Nagy ZP. The

meiotic spindle of human oocytes as viewed under the oosight and its

relationship to chromosomal aneuploidy of subsequent embryo Hum

Reprod. 2006; 21Suppl.1:i23.

93. Pelletier C, Keefe DL, Trimarchi JR. Noninvasive polarized light

microscopy quantitatively distinguishes the multilaminar structure of the

zona pellucida of living human eggs and embryos. Fertil Steril.

2004;81:850–6.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

109

94. Bertrand E, Van den Bergh M, Englert Y. Clinical parameters influencing

human zona pellucida thickness. Fertil Steril. 1996;66:408-11.

95. Gabrielsen A, Lindenberg S, Petersen K. The impact of the zona pellucida

thickness variation of human embryos on pregnancy outcome in relation

to suboptimal embryo development. A prospective randomized controlled

study. Hum Reprod. 2001;16:2166–70.

96. Cherr G, Drobins E, Katz D. Localization of cortical constituents before

and after exocytosis in hamster egg. J Exp Zool. 1998;26:81-93.

97. Cohen J, Inge KL, Suzman M, Wiker SR, Wright G.

Videocinematography of fresh and cryopreserved embryos: a retrospective

analysis of embryonic morphology and implantation. Fertil Steril.

1989;51:820-7.

98. Gook DA, Edgar DH, Borg J, Martic M. Detection of zona pellucida

proteins during human folliculogenesis. Hum Reprod. 2008;23:394-402.

99. Çiray NH. Preliminar study of embryo development following assessment

of male and female gametes. Reprod BioMed Online. 2008;16:875-80.

100. Trounson A, Anderiesz C, Jones G. Maturation of human oocytes in vitro

and their developmental competence. Reproduction. 2001;121:51-75.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

110

101. De Vos A, Van de Velde H, Joris H, Van Steirteghem A. In vitro matured

metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo

quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm

injection. Hum Reprod. 1999; 14:1859-63.

102. Gabrielsen A, Bhatnager PR, Petersen K, Lindenberg S. Influence of zona

pellucida thickness of human embryos on clinical pregnancy outcome

following in vitro fertilization treatment. J Assist Reprod Genet.

2000;17:323-8.

103. Palmstierna M, Murkes D, Csemiczky G, Andersson O, Wramsby H.

Zona pellucida thickness variation and occurrence of visible

mononucleated blastomeres in preembryos are associated with a high

pregnancy rate in IVF treatment. J Assist Reprod Genet. 1998;15:70-5.

104. Sun YP, Xu Y, Cao T, Su YC, Guo YH. Zona pellucida thickness and

clinical pregnancy outcome following in vitro fertilization. Int J Gynaecol

Obstet. 2005;89:258-62.

105. Bertrand E, Van Den Bergh M, Englert Y. Does zona pellucida thickness

influence the fertilization rate? Hum Reprod. 1995;10:1189-93.

106. Ciapa B, Chiri S. Egg activation: upstream of the fertilization calcium

signal. Biol Cell. 2000; 92:215-33.

Capítulo I - Correlação da maturação, dismorfismo e fertilização de oócitos

humanos com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida

111

107. Petersen CG, Oliveira JBA, Mauri A, Massaro AL, Baruffi R, Pontes AG,

et al. Relationship between visualization of meiotic spindle in human

oocytes and ICSI outcome: a meta-analysis. Reprod BioMed Online. In

press 2009.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

112

Relationship between visualization of meiotic spindle in human oocytes

and ICSI outcomes: a meta-analysis

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

113

CG Petersen

1,2

, JBA Oliveira

, AL Mauri

1,2

, FC Massaro

, RLR Baruffi

, A Pontes

, JG

Franco Jr.

1,3,4

Center for Human Reproduction Prof. Franco Junior, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Postgraduate Fellow, Department of Gynecology and Obstetrics, Botucatu Medical

School, São Paulo State University - UNESP, Botucatu, SP, Brazil

Department of Gynecology and Obstetrics, Botucatu Medical School, São Paulo State

University - UNESP, Botucatu, SP, Brazil

Correspondence to:

José Gonçalves Franco Jr.

Center for Human Reproduction Prof. Franco Junior

Av. Prof. João Fiusa, 689 – Zip Code 14025-310

Ribeirão Preto – São Paulo – Brazil

Phone/FAX: 55-16- 3911-1100

E-mail: [email protected].br or [email protected]

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

114

ABSTRACT

The objective of this meta-analysis was to investigate the influence of meiotic

spindle visualization in human oocytes on ICSI outcomes. Search strategies

included on-line surveys of databases. The fixed effect was used for odds ratio.

Ten trials fulfilled the inclusion criteria. According to meta-analysis study, the

results showed statistically significant higher fertilization rate (P<0.0001) when

meiotic spindle was viewed than when it was not. Moreover, percentage of pro-

nuclear stage embryos with good morphology (P=0.003), cleavage rate

(P<0.0001) percentage of day-3 top quality embryos (P=0.003) and percentage

of embryo that reached blastocyst stage (P<0.0001) were statistically

significantly better among embryos derived from oocytes in which meiotic

spindle was viewed compared with those in which meiotic spindle was not

observed. However, these differences were not observed in the clinical pregnancy

or implantation rates. This observation has clinical relevance mainly in countries

where there is a legal limit on the number of oocytes to be fertilized. However,

additional controlled trials are needed to further confirm these results.

Key Words: human oocyte; ICSI; meiotic spindle; meta-analysis

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

115

INTRODUCTION

In assisted reproduction, gamete selection with the aim of achieving

better clinical results is an important task for embryologists. This question has

particular relevance when ethical and/or legal considerations limit embryo

selection after fertilization and, consequently, the formation of supernumerary

embryos. Extracellular oocyte morphological characteristics, such as cumulus

oophorus, polar body, zona pellucida, and intracellular characteristics

(granulations and cytoplasmic inclusions) have been related to fertilization,

cleavage, embryo development and clinical outcomes (Coticchio et al., 2004;

Borini et al., 2005; Balaban and Urman 2006; Chamayou et al., 2006; Ebner et

al., 2006;).

Among the intracellular characteristics, meiotic spindle assessment in

mature oocytes has awakened high interest. The first papers about the meiotic

spindle supply extensive information on cellular division function. However, the

methodology for viewing the spindle, confocal microscopy, was based on

fixation and consequently, its routine application in assisted reproduction

procedures and in spindle dynamic studies were frustrated due to the

impossibility of applying this method in living oocytes (Eichenlaub-Ritter et al.,

2002; Coticchio et al.; 2004; Borini et al., 2005). More recently, with the

appearance of polarized light microscopy and an integrated imaging processor

software, it has been possible to visualize the meiotic spindle in living oocytes by

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

116

a non-invasive method, preserving cell viability (Wang et al., 2001a,b; Cooke et

al., 2003; Moon et al., 2003; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004, Konc et al.,

2004; Chamayou et al 2006; Montag et al., 2006; Shen et al; 2006; Taylor et al.,

2006; Fang et al., 2007; Rama Raju et al., 2007; Varghese et al., 2007; Madaschi

et al., 2008).

The meiotic spindle, by controlling chromosomal movements

throughout the different stages of meiosis, plays a key role in the successful

completion of meiosis. Disturbances of meiotic spindles have been suggested as

predisposing oocytes to perturbation of chromosomal segregation and subsequent

aneuploidy, maturation arrest, an increased incidence of cell death and

subsequent lower fertilization rates (Battaglia et al., 1996; Hardarson et al., 2000;

Eichenlaub-Ritter et al., 2002; Cooke et al., 2003; Varghese et al., 2007). In

various studies, oocytes in which the meiotic spindles were visualized have

demonstrated a significant increase in ICSI outcomes such as fertilization rates

(Wang et al., 2001a; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004; Shen et al., 2006;

Taylor et al., 2006; Madaschi et al., 2008; Rama Raju et al., 2007) and embryo

development (Wang et al., 2001a; Cohen et al., 2004; Shen et al., 2006;

Madaschi et al., 2008; Rama Raju et al., 2007). However, other studies have not

confirmed this correlation (Moon et al., 2003; Fang et al., 2007). The present

meta-analysis aimed to investigate the relationship between meiotic spindle

presence in human oocytes and in ICSI in vitro and in vivo outcomes.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

MATERIALS AND METHODS

Criteria for considering studies for this meta-analysis

All published and ongoing controlled trials compare in vitro and clinical

ICSI outcomes between oocytes in which the meiotic spindle was visualized and

those whose meiotic spindle was not seen. Only trials that analysed fresh and in

vivo maturated oocytes were included.

Types of outcome measures

The outcome measures used for this meta-analysis were fertilization

rate, embryo development (percentage of pro-nuclear (PN)-stage embryos with

good morphology, cleavage rate, percentage of day-3 top quality embryos and

percentage of embryos reaching blastocyst stage), implantation rate and clinical

pregnancy rate per transfer.

Identification of studies

Search strategies included online surveys of databases (MEDLINE,

EMBASE, Science Citation Index, Cochrane Controlled Trials Register and

OVID) from 1990 to 2008. There was no language restriction. The following

Medical Subject Headings and text words were used: meiotic spindle, spindle

view, spindle, polarization microscope, polarization light microscopy, PolScope

and ICSI guard

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

118

Search results

Among the 15 potentially relevant studies retrieved from online

databases, a total of ten trials fulfilled the inclusion criteria (Wang et al., 2001a;

Moon et al., 2003; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004; Chamayou et al.,

2006; Shen et al., 2006; Taylor et al., 2006; Fang et al., 2007; Rama Raju et al.,

2007; Madaschi et al., 2008). A typical flow schematic for the selection process

is shown in Figure 1.

Description of the studies included:

All the studies used PolScope except for Madaschi et al. (2008).

Wang et al. (2001a) examined the development of human

oocytes with

or without meiotic spindles, imaged before ICSI. Oocytes were obtained from

stimulated

ovaries of consenting patients undergoing oocyte retrieval for

ICSI.

After imaging and ICSI,

oocytes with or without spindles were cultured

separately for

examination of fertilization and embryo development. A total

1544 oocytes from 136 cycles were examined and inseminated by ICSI. Spindles

were imaged in 82%

of oocytes. After ICSI, more oocytes (P<0.05) with spindles

(69.4%) fertilized normally, forming 2 PN, than oocytes

without spindles

(62.9%). At day 3, more oocytes (P<0.01)

with spindles (66.3%) had developed

to cell stages 4–11 than

oocytes without spindles (55.4%). Significantly more

(P<0.001) oocytes with spindles developed to morula and blastocyst

by day 5

(51.1 versus 30.3%) and day 6 (53.2 versus 29.3%) compared

to oocytes without

spindles.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

119

Moon et al. (2003) investigated the relationship

between the

presence/location of the spindle in metaphase II

(MII) oocytes and developmental

competence of embryos in vitro. The spindles in 626 MII oocytes were examined

and divided into six groups based on the

presence or absence of spindles and the

angle between the

spindle and the first polar body. Meiotic spindles

were imaged

in 523 oocytes (83.5%), while 103 (16.5%) did not

have a visible spindle. The

rate of normal fertilization was

similar in the oocytes with spindles regardless of

spindle position

(82.2% versus 75.7%).

Rienzi et al. (2003) analysed the

relationship between the degree of

meiotic spindle deviation

from the first polar body location and ICSI outcome.

Oocytes were divided into four groups according to the angle

of meiotic spindle

deviation from the polar body position. The angles

of deviation were 0–5°, 6–

45°, 46–90°

and >90° for groups I to IV, respectively. The rate of normal

fertilization was

higher in the oocytes with spindles regardless of spindle position

(74.8% in oocytes with spindle versus 33.3% in oocytes without spindle). The

rates of normal (2 PN) and abnormal (1PN or >2PN)

fertilization did not differ

among groups I, II and III. Nevertheless,

the rate of normal fertilization was

lower among oocytes in

which the meiotic spindle deviation angle was >90°

(50%); this

led to an increased proportion of tripronucleated zygotes that failed to

extrude the second polar body. The meiotic spindle was not detected

in only 9%

of oocytes, and these showed a higher incidence of

fertilization abnormalities

than did oocytes in

which the spindle was detected.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

120

Cohen et al. (2004) aimed to investigate

meiotic spindle assembly in

correlation with time elapsed after

hCG administration, and to determine whether

spindle imaging

may serve to indicate the likelihood of fertilization and embryo

cleavage. Seven hundred and seventy MII oocytes from 103 couples

who were

being treated for male infertility were imaged prior to sperm injection. A spindle

was imaged

in a significantly higher number of oocytes from ≥38h after

hCG

administration compared with those in the <38h

group (78.1–81.5% versus

61.6%; P<0.001). The fertilization

rate in oocytes with a visible spindle was

statistically higher

compared with oocytes in which a spindle could not be

detected (70.4% versus 62.2%; P=0.035). There was no relationship between

spindle imaging and embryo cleavage on day 3.

Chamayou et al. (2006) studied

the validity of oocyte morphological

criteria such as ooplasm texture, perivitelline space (PVS) size, PVS granulation

absence/presence, first polar body shape, and meiotic spindle presence/absence

as predictive factors in clinical ICSI outcomes. No relationship was found

between meiotic spindle presence or absence and clinical pregnancy per transfer

(20.8% versus 17.5%; P>0.05) or implantation rates (11.9% versus 9.7%,

P>0.05) after ICSI.

Shen et al. (2004) aimed this study at improving the non-invasive

strategies for selection of high quality human oocytes prior to ICSI by analysing,

independently at two IVF centres, the optical properties of the spindle apparatus

quantitatively based on the mean magnitude of light retardance by the oocyte

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

121

spindle. In one centre, all MII oocytes were fertilised. Accordingly, all fertilized

oocytes could be analysed for pronuclear score after ICSI. Fertilization occurred

in 91.5% (676 of 739) of the oocytes possessing a spindle versus 73.4% (116 of

158) in the group without a spindle, significantly different from each other

(P<0.001). The fate of 792 fertilised oocytes with (676) and without spindle

(116) was assessed further for development into a high or low PN stage embryo

quality. The proportion of high quality PN-stage embryos was significantly

higher for oocytes possessing a birefringent spindle compared to oocytes without

a spindle (34.2% versus 19.9%; P<0.001).

Taylor et al. (2006) investigated whether meiotic spindle positioning

relative to the polar body and spindle retardance in MII human oocytes

constitutes an effective predictor of aneuploidy. The study was conducted in a

prospective randomised manner involving 26 patients undergoing ICSI with

preimplantation genetic diagnosis (PGD) for aneuploidy screening. When a

spindle was present, 109 out of 126 (86.5%) were fertilised, which was

significantly higher when compared to fertilization of oocytes that did not show a

spindle, 10 out 17 (58.8%; P=0.0099).

Rama Raju et al. (2007) analysed the relationship of meiotic spindle

and zona pellucida characteristics to embryonic development potential. A total of

205 oocytes from 25 patients were examined. A meiotic spindle was visualized in

160 oocytes (78.0%), but could not be found in the remaining 45 oocytes

(22.0%). Significantly more oocytes with visible spindles were fertilised and

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

122

progressed to blastocysts compared with those without visible spindle (82.5%

versus 31.1% P<0.05 and 48.5% versus 14.3% P<0.05, respectively).

Fang et al. (2007) aimed to investigate the relationship between spindle

location and embryonic development of in vivo and in vitro maturated human

oocytes. The spindles of 134 in vivo maturated oocytes were examined at the

time of ICSI. The spindles were visualised in 83.6% (112/134) and not visualised

in 16.4% (22/134) of the oocytes. The normal fertilization rate was similar

between spindle (75.9%, 85/112) and non-spindle-group (63.6%, 14/22 P=0.35).

The cleavage rate was not significantly different between the groups (P>0.05).

The rate of high quality embryos was also not significantly different between the

groups (P>0.05).

Madaschi et al. (2008) examined whether the presence of meiotic

spindles in living human oocytes can be used as a predictive factor associated

with embryo morphology to allow embryo selection before transfer and its

association with IVF outcomes. A total of 1,097 MII oocytes from 157 women

were screened by using the polarisation imaging software module Octax ICSI

Guard

(Octax, Herborn, Germany) at the time of ICSI. The meiotic spindles

were detected in 689 (62.8%, spindle-detected group), and spindles were not

visualised in 408 (32.7%, spindle-non-detected group). The normal fertilization

rate was significantly higher in the spindle-detected group (66.5%) than spindle-

non-detected group (58.6%; P=0.009). Although the percentage of embryos with

good PN morphology had been similar between the two groups (spindle-detected

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

123

group, 11.7%; spindle–non-detected group, 9.3%; P=0.508), the rate of early-

cleaved embryos was significantly higher in the spindle-detected group than in

the spindle–non-detected group (50.9% and 32.6%, respectively; P=0.037).

When only embryos from the spindle-detected group were selected for transfer,

the pregnancy and implantation rates were 44.4% and 23.0%, and when only

embryos from the spindle-non-detected group were transferred, those respective

rates were 18.2% and 8.7% (P=0.029 and P=0.022, respectively).

Statistical analysis

Data management and analysis were conducted using the StatsDirect

statistical software (Cheshire, UK). The fixed effect model was used for odds

ratio (OR). If there was

statistical heterogeneity, an additional analysis

was

performed using the random effects model. Fixed effect effectiveness was

evaluated by the MantelHaenszel method. A confidence interval for the

MantelHaenszel OR in StatsDirect was calculated using the Robins, Breslow and

Greenland variance formula. For random effect, a confidence interval for OR was

calculated using the DerSimonian-Laird formula. A chi-squared test statistic was

used with its associated probability that the pooled OR was equal to 1. The

measure of heterogeneity (non-combinability) was evaluated by Cochran’s Q, the

BreslowDay and I

(Higgins et al., 2003) tests. A non-significant result (i.e. lack

of heterogeneity) indicates that no trial has an OR that is significantly worse or

better than the overall common OR obtained by pooling the data. Since a fixed

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

124

effects model has been employed herein, it is important to acknowledge that

inferences refer only to the particular studies included in the analysis. Meta-

analysis used in this manner is simply a device to pool the information from the

various studies to provide a composite finding, but only for those studies. Since

many of the preceding analyses contained only two or three studies, it was

decided to derive the inferences from a fixed effects model. In the alternative

random effect model, the individual studies are regarded as a random sample

from the (infinite) population of studies. Global inferences would then be

permissible, but the random errors used would need to reflect inter-study

variation (heterogeneity).

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

125

RESULTS

Outcomes

-Fertilization rate (Figure 2)

Nine studies were included (Wang et al., 2001a; Moon et al., 2003;

Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004; Shen et al., 2006; Taylor et al., 2006,

Fang et al., 2007; Rama Raju et al., 2007; Madaschi et al., 2008). The

fertilization rate was statistically significant higher in the group of oocytes in

which meiotic spindle was viewed (75.6%; 3543/4684) than in the group of

oocytes that did not show meiotic spindle (61.5%; 777/1264) (P<0.0001; OR:

1.79, 95% CI 1.57, 2.05). There was heterogeneity in this comparison (Breslow-

Day=63.6, df=8, P<0.0001; Cochran Q=59.7, df=8, P<0.0001; I

=86.6%). Using

the random effect model, pooling of the results also showed a statistically

significantly higher fertilization rate when a meiotic spindle was viewed

(P<0.0001; OR: 2.52, 95% CI 1.65, 3.81).

-Embryo development

PN-stage embryo morphology (Figure 3)

Two studies were included (Shen et al., 2006; Madaschi et al., 2008).

The percentage of embryos with good PN morphology was statistically

significantly higher among embryos derived from oocytes in which meiotic

spindle was viewed (25.1%; 285/1134) than between embryos derived from

oocytes that did not present a meiotic spindle (12.7%; 45/355) (P=0.003; OR:

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

126

1.71; 95% CI 1.20, 2.44). There was no heterogeneity in this comparison

(Breslow-Day=1.64, df=1, P=0.19; Cochran Q=1.64, df=1, P=0.19).

Cleavage rate (Figure 4)

Three studies were included (Wang et al., 2001a; Fang et al., 2007,

Madaschi et al., 2008). The cleavage rate was statistically significantly higher

among embryos derived from oocytes in which meiotic spindle was viewed

(63.1%; 897/1422) compared to embryos derived from oocytes not showing

meiotic spindle (43.9%; 188/428) (P<0.0001; OR: 1.85, 95% CI 1.47, 2.32).

There was no heterogeneity in this comparison (Breslow-Day=1.63, df=2,

P=0.44; Cochran Q=1.63, df=2, P=0.44; I

=0%).

Day 3 embryo-stage quality (Figure 5)

Three studies were included (Wang et al., 2001a; Cohen et al., 2004,

Fang et al., 2007). The percentage of embryos classified on day 3 as top quality

was statistically higher among those derived from oocytes in which meiotic

spindle was viewed (37.3%; 381/1022) than the ones derived from oocytes not

presenting meiotic spindle (28%; 56/200) (P=0.003; OR: 1.70, 95% CI 1.20,

2.42). There was no heterogeneity in this comparison (Breslow-Day=0.13, df=2,

P=0.93; Cochran Q=0.13, df=1, P=0.93; I

=0%).

Number of embryos that reached blastocyst stage (Figure 6)

Two studies were included (Wang et al., 2001a; Rama Raju et al., 2007).

The percentage of embryos that attained the blastocyst stage (on day 5) was

statistically significantly higher among those derived from oocytes in which

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

meiotic spindle was viewed (50.7%; 376/742) compared to the ones from oocytes

that did not show meiotic spindle (28.6%; 38/133) (P<0.0001; OR: 2.61, 95% CI

1.74, 3.91), a comparison without heterogeneity (Breslow-Day=1.14, df=1,

P=0.28; Cochran Q=1.10, df=1, P=0.29).

-Implantation rate (Table 7)

Two studies were included (Chamayou et al., 2006; Madaschi et al.,

2008). The implantation rate was not significantly different between transferred

sets with only embryos derived from oocytes in which meiotic spindle was

viewed (15.4%, 64/415) versus sets containing only embryos from oocytes

showing no meiotic spindle (9.8%, 24/246) (P= 0.11; OR = 1.56, 95% CI 0.94,

2.59). There was no heterogeneity in this comparison (Breslow-Day=1.50, df = 1,

P=0.22; Cochran Q=1.49, df=1, P=0.22).

-Clinical pregnancy rate per transfer (Figure 8)

Two studies were included (Chamayou et al., 2006; Madaschi et al.,

2008). The clinical pregnancy rate per transfer was not significantly different

between sets with only embryos derived from oocytes in which meiotic spindle

was viewed (28.5% 55/193) versus embryo sets derived exclusively from oocytes

presenting no meiotic spindle (17.6%, 21/119) (P = 0.11; OR = 1.65, 95% CI

0.93, 2.93), a comparison without heterogeneity (Breslow-Day=2.42, df = 1,

P=0.12; Cochran Q=2.36, df=1, P=0.12).

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

128

DISCUSSION

As part of the ongoing search for markers that predict higher success

rates in IVF/ICSI cycles

by assessment of oocyte maturation and quality,

it was

suggested that meiotic spindle imaging could contribute valuable information.

Different studies reported that many oocytes that had expelled the first polar

body immediately after oocyte collection also show the meiotic spindle (Wang et

al., 2001a,b; Moon et al., 2003; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004; Konc et

al., 2004; Taylor et al., 2006; Rama Raju et al., 2007; Madaschi et al., 2008). In

most of the cases, the meiotic spindle presence is associated with higher

fertilization rates (Wang et al., 2001a,b; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004;

Shen et al., 2006; Taylor et al., 2006; Rama Raju et al., 2007, Madaschi et al.,

2008), and in some cases, with higher embryo development (Wang et al., 2001a,

Moon et al., 2003, Rama Raju et al., 2007) and pregnancy rates (Madaschi et al.,

2008). In this meta-analysis, significantly higher fertilization was found in 4684

oocytes where a meiotic spindle was viewed compared with 1264 oocytes where

no meiotic spindle was observed (75.6% versus 61.5% respectively; P<0.0001;

OR: 1.79, 95% CI 1.57, 2.05). This result indicates that the presence of a meiotic

spindle predicts a higher fertilization rate. However, the result of the analysis was

impaired due to the heterogeneity observed among some studies (Breslow-

Day=63.6, df=8, P<0.0001; Cochran Q=59.7, df=8, P<0.0001; I

=86.6%). On the

other hand, when the data were pooled using a random

effects model the

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

129

difference in fertilization rate was still

significant (P<0.0001; OR: 2.5, 95% CI

1.65, 3.81).

In addition, better results were observed among embryos derived from

oocytes in which meiotic spindle was viewed than among those from oocytes not

showing a meiotic spindle in the following parameters: cleavage rate (P<0.0001;

OR:1.85, 95%CI 1.47, 2.32), percentage of PN-stage embryos with good

morphology (P=0.003; OR:1.71, 95%CI 1.20, 2.44), percentage of day-3 top

quality embryos (P=0.003; OR:1.70, 95%CI 1.20, 2.42) and percentage of

embryos reaching the blastocyst stage (P<0.0001; OR:2.61, 95%CI 1.74, 3.91).

These outcomes showed a strong relationship between meiotic spindle

identification and better embryo development. However, these differences were

not observed in the implantation rate (P= 0.11; OR = 1.56, 95% CI 0.94, 2.59) or

clinical pregnancy per transfer rate (P = 0.11; OR = 1.65, 95% CI 0.93, 2.93).

The difference in the percentage of oocytes with spindle meiotic

birefringence among the studies (minimum of 62.8% and maximum of 91%) can

be related to a variation in the population or to ovarian stimulation protocols.

Defects in protein complex, low energy supply or disturbances in the signalling

pathway may also be involved in disturbances of spindle structure (Eichenlaub-

Ritter et al 2002). However, as thermal control stabilizes the meiotic spindle, this

difference can be related to the precision of how this temperature control was

performed during oocyte collection, culture or microinjection (Wang et al., 2002,

Cooke et al., 2003, Rienzi et al., 2003). Other environmental changes such as pH

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

130

and culture conditions may also compromise spindle visualisation (Hu et al.,

2001, Roberts et al., 2002).

On the other hand, the time at which oocytes were analysed can also

contribute to whether or not the spindle is visualised. Cohen et al. (2004) showed

that the percentage of oocytes with a visible spindle is higher in cases in which

the spindle evaluation was performed at least 38 hours after the hCG

administration, compared to those whose spindle evaluation was performed

earlier (81.5% vs. 61.6%, respectively). Montag et al. (2006) showed that during

the transition from metaphase I to metaphase II, the spindle completely

disappears for approximately 40–60 min. This fact indicates that the absence of

the spindle at least in some human MII oocytes is more likely an indicator of the

physiological progression through an important developmental stage of meiosis

rather than a cellular disturbance. Thus, the poorer ICSI outcomes among oocytes

not showing a spindle could simply indicate an incorrect timing of ICSI.

Sometimes the spindles became visible only after oocyte rotation,

when

the orientation of microtubules had become favourable

for the visualization.

Therefore, differences in this

technique may be responsible for the high degree of

spindle

absence. By rotating the oocytes with the ICSI micropipette

around the

axis connecting the centre of the oocyte to the

first polar body during the attempts

at spindle visualisation, Cooke et al. (2003) and Rienzi et al. (2003) detected the

spindle in up to 92.7% and 91% of oocytes examined, respectively. However,

Cohen et al. (2004), Rama Raju et al. (2007) and Madaschi et al. (2008) reported

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

131

lower rates of spindle visualization (76%, 78% and 62.8, respectively) despite

rotating the oocytes. On the other hand, some authors have not mentioned

how

many rotations of the oocyte were viewed to

determine presence or absence of a

spindle (Wang et al., 2001a, b, Wang and Keefe 2002, Moon et al., 2003).

Nuclear oocyte maturation is determined by the absence of the germinal

vesicle and the presence of the first polar body. Changes in the maturation

promotion factor activity, c-mos kinases and mitogen-activated protein (MAP)

kinases control cellular mitosis by promoting chromosomal condensation,

germinal vesicle collapse and spindle formation (Eichenlaub-Ritter and Peschke

2002, Cohen et al., 2004). The lower fertilization rate demonstrated in oocytes

without spindle refringence can be attributed to oocyte immaturity. On the other

hand, a considerable number of these oocytes were fertilised (61.5% of all studies

included in this meta-analysis). Plausible explanations for this number include

the occurrence of technical failures during spindle visualisation (inexperienced

biologist, time of oocyte evaluation) or that spindle absence does not prevent

fertilization in all cases. However, according to this meta-analysis, probably the

lack of a meiotic spindle may have a subsequent effect during embryonic

development.

To avoid damaging the spindle during the ICSI procedure, the

embryologists rotated the oocyte by placing a hold pipette based on the first polar

body position. However, the movement of the polar body inside the perivitelline

space (because of possible physical displacement during oocyte denudation)

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

132

and/or migration of the spindle inside the oocyte can alter the relationship

between these two structures, enabling the microinjection to impair the spindle

(Silva et al., 1999; Hardarson et al., 2000; Wang et al., 2001 a,b; Moon et al.,

2003; Rienzi et al., 2003; Cohen et al., 2004; Konc et al., 2004; Taylor et al.,

2006; Rama Raju et al., 2007). Generally, when there is meiotic spindle

visualization, the isolated sperm is injected into the oocyte, taking special care

not to damage this structure. Rienzi et al. (2003) reported a significantly lower

normal fertilization rate and a higher rate of abnormal fertilization with a more

frequent development of three pronuclei in oocytes with higher degree of

deviation from the first polar body (>90°). Fang et al., (2007) reported that the

fertilization rate of in vivo maturated oocytes with spindles beneath or adjacent to

the first polar body (angle of 0–5°) was significantly higher (93.3%) than all

other groups of oocytes with greater deviation from the first polar body (6-45°,

46-90° and >90°). However, Moon et al. (2003) and Rama Raju et al. (2007) did

not show the same results. Taylor et al. (2006) concluded that the deviation angle

of the spindle from the first polar body is not a reliable indicator of embryo

quality or subsequent aneuploidy.

Most studies analyzing meiotic spindle have sought to draw attention to

variables more directly related to laboratory activities. However, some authors

suggest that the meta-analysis should be patient-oriented, i.e. primary outcomes

should be clinical results (e.g. pregnancy rate); all other outcomes should be

listed as secondary outcomes. Fertilization rate, cleavage rate, percentage of PN-

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

133

stage embryos with good morphology, percentage of day-3 top quality embryos

and percentage blastocyst stage embryos are intermediate endpoints, which do

not necessarily predict a better outcome and/or a more advantageous

cost/effectiveness ratio. Despite the tendency in favour of oocytes with meiotic

spindle, this meta-analysis failed to show any statistically significant difference

in the most relevant and clinically significant endpoints in IVF: the clinical

pregnancy rate and implantation rate. This observation can be related to a small

cumulative sample size since only two studies supply data about pregnancy or

implantation rates. Based on the pregnancy rate per transfer obtained in the group

without a visible meiotic spindle (21/119, 17.6%), to detect a difference of 5%

with a power of 80%, around 2000 transfers would be necessary for a definitive

conclusion, i.e. above the total number included here. On the other hand, an

increased number of best quality embryos may exert possible good effects on

cumulative pregnancy rates following the transfer of frozen embryos. Moreover,

one must be aware of the fact that a number of other significant predictors of the

chance of pregnancy achievement exist in an individual patient, including cause

of infertility, chromosomal status of the transferred embryo, as well as the quality

and origin of spermatozoa (Griesinger and Diedrich, 2006). Thus, for a more

consistent conclusion, this meta-analysis guides researchers to wait for the results

of new controlled trials that have more information about clinical parameters.

In conclusion, the result of this meta-analysis indicates that the presence

of a birefringent meiotic spindle in human oocytes can predict better fertilization

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

134

rate and embryo development. Nevertheless, it failed to show any statistically

significant difference in clinically significant endpoints in IVF (pregnancy rate

and implantation rate). This observation has clinical relevance mainly in

countries where there is a legal limit on the number of oocytes that can be

fertilized. Additional prospective studies with a large population will be helpful

in understanding the importance of spindle presence and its characteristics in

laboratory and clinical results.

Acknowledgment

The authors wish to thank the Grupo de Apoio a Pesquisa – UNESP for revising

the English text.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

135

REFERENCE

1. Balaban B, Urman B 2006 Effect of oocyte morphology on embryo

development and implantation. Reproductive BioMedicine Online 12, 608–

615.

2. Battaglia DE, Goodwin P, Klein NA, Soules MR 1996 Fertilization and early

embryology: Influence of maternal age on meiotic spindle assembly oocytes

from naturally cycling women Human Reproduction 11, 2217-2222.

3. Borini A, Lagalla C, Cattoli M, Cattoli M, Sereni E, Sciajno R, Flamigni C,

Coticchio G. 2005 Predictive factors for embryo implantation potential.

Reproductive BioMedicine Online 15, 653–668.

4. Chamayou S, Alecci C, Ragolia C, Storaci G, Maglia E, Russo E,

Guglielmino A 2006 Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not

predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos

Reproductive BioMedicine Online 13, 661–666.

5. Cohen Y, Malcov M, Schwartz T, Mey-Raz N, Carmon A, Cohen T, Lessing

JB, Amit A, Azem F 2004 Spindle imaging: a new marker for optimal timing

of ICSI. Human Reproduction 19, 649–654.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

136

6. Cooke S, Tyler JPP, Driscoll GL 2003 Meiotic spindle location and

identification and its effect on embryonic cleavage plane and early

development. Human Reproduction 18, 2397–2405.

7. Coticchio G, Sereni E, Serrao L, Mazzone S, Iadarola I, Borini A. 2004 What

criteria for the definition of oocyte quality? Annals of the New York Academy

of Sciences. 1034,132-144.

8. Ebner T, Moser M, Tews G 2006 Is oocyte morphology prognostic of embryo

potential after ICSI? Reproductive BioMedicine Online 12, 517–512.

9. Eichenlaub-Ritter U, Shen Y, Tinneberg

H-R 2002 Manipulation of the

oocyte: possible damage to the spindle apparatus Reproductive BioMedicine

Online 5, 117-124

10. Eichenlaub-Ritter U, Peschke M 2002 Expression in in-vivo and in-vitro

growing and maturing oocytes: focus on regulation of expression at the

translational level. Human Reproduction Update 8,21–41

11. Fang C, Mandy T, Li T, Peng WL, Zhou CQ, Zhuang GL, Leong M 2007

Visualization of meiotic spindle and subsequent embryonic development in in

vitro and in vivo matured human oocytes Journal of Assisted Reproduction

and Genetics 24, 547–551.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

12. Griesinger G, Diedrich K 2006 The role of LH in ovarian stimulation:

considerations. Reproductive BioMedicine Online 12, 404–406

13. Hardarson T, Lundin K, Hamberger L. 2000 The position of the metaphase II

spindle cannot be predicted by the location of the first polar body in the

human oocyte. Human Reproduction 15, 1372–1376

14. Higgins JP; Thompson SG; Deeks JJ; Altman DG. 2003 Measuring

inconsistency in meta-analyses. British Medical Journal 327, 557–560.

15. Hu Y, Betzendahl I, Cortvrindt R, Smitz J, Eichenlaub-Ritter U. 2001 Effects

of low O2 and ageing on spindles and chromosomes in mouse oocytes from

pre-antral follicle culture. Human Reproduction 16, 737–748.

16. Konc J, Kanyo K, Cseh S 2004 Visualization and examination of the meiotic

spindle in human oocytes with Polscope. Journal of Assisted Reproduction

and Genetics 21, 349–353.

17. Madaschi C, Bonetti TCS, Braga DPAF, Pasqualotto FF, Iaconelli A, E

Borges 2008 Spindle imaging: a marker for embryo development and

implantation Fertility and Sterility 90, 194-198.

18. Montag M, Schimming T, van der Ven H 2006 Spindle imaging in human

oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine

Online 12, 442–446.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

138

19. Moon JH, Hyun CS, Lee SW, Son W Y, Yoon S Hy, Lim JH. 2003

Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes

using Polscope enables the prediction of embryonic development competence

after ICSI. Human Reproduction 18, 817–820.

20. Rama Raju GA, Prakash GJ, Krishna KM, Madan K 2007 Meiotic spindle

and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a

preliminary study using polscope imaging Reproductive BioMedicine Online

14, 166–174

21. Rienzi L, Ubaldi F, Martinez F, Iacobelli M, Minasi MG, Ferrero S, Tesarik

J, Greco E 2003 Relationship between meiotic spindle location with regard to

the polar body position and oocyte development potential after ICSI. Human

Reproduction 18, 1289–1293.

22. Roberts R, Franks S, Hardy K. 2002 Culture environment modulates

maturation and metabolism of human oocytes. Human Reproduction 17,

2950–2956.

23. Shen Y, Stalf T, Mehnert C, De Santis L, Cino I, Tinneberg H-R, Eichenlaub-

Ritter U 2006 Light retardance by human oocyte spindle is positively related

to pronuclear score after ICSI Reproductive BioMedicine Online 12, 737–751

24. Silva CS, Kapura K, Odenberg R, Keefe DL 1999 The first polar body does

not predict accurately the location of the metaphase II meiotic spindle in

mammalian oocytes. Fertility and Sterility 71, 719–721.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

139

25. Taylor TH, Gitlin S, Wrigth G, Mitchell-Leef D, Kort HI, Nagy ZP 2006 The

meiotic spindle of human oocytes as viewed under the oosight and its

relationship to chromosomal aneuploidy of subsequent embryo Human

Reproduction 21(Suppl.1), i23

26. Varghese AC, Goldberg E, Agarwal A 2007 Current and future perspectives

on intracytoplasmic sperm injection: a critical commentary Reproductive

BioMedicine Online 15, 719–727

27. Wang WH, Meng L, Hackett RJ, Keefe DL 2001a Developmental ability of

human oocytes with or without birefringent spindles imaged by polscope

before insemination. Human Reproduction 16, 1464–1468.

28. Wang W, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL 2001b The spindle

observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm

injection in living human oocytes. Fertility and Sterility 75, 348–353

29. Wang W H, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL 2002 Rigorous

thermal control during intracytoplasmic sperm injection stabilizes the meiotic

spindle and improves fertilization and pregnancy rates. Fertility and Sterility

77, 1274–1277.

30. Wang, W.H., Keefe, D.L. 2002 Prediction of chromosome misalignment

among in vitro matured human oocytes by spindle imaging with the

PolScope. Fertility and Sterility 78, 1077–1081

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

140

Figure 1. QUOROM statement flow diagram illustrating selection of trials

included in the meta-analysis

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

141

Figure 2. Forest plot for fertilization rate.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

142

Figure 3. Forest plot for PN stage morphology. PN. Pro-nucleus.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

143

Figure 4. Forest plot for cleavage rate.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

144

Figure 5. Forest plot for day 3 embryo stage quality.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

145

Figure 6. Forest plot for number of embryos at blastocyst stage.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

146

Figure 7. Forest plot for implantation rate.

Capítulo II –Relationship between visualization of meiotic spindle

in human oocytes and ICSI outcomes: a meta-analysis

Figure 8. Forest plot for clinical pregnancy rate per embryo transfer.

Anexos

148

Anexos

149

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título do estudo: “Correlação da maturação e da morfologia do óvulo humano

com as características do fuso meiótico e da zona pelúcida”

Nome da Voluntária: ________________________________________________

Você em breve será submetida à Fertilização “in vitro” (bebê de proveta)

com transferência de embriões para tratamento de infertilidade. Por isso está

sendo convidada a participar, de um estudo clínico que envolve avaliação dos

seus óvulos coletados no procedimento de fertilização “in vitro”.

A procura de métodos para verificar se um óvulo realmente tem boas

condições antes da fertilização “in vitro” tem sido muito investigada no

tratamento da infertilidade. Duas estratégias são usada na classificação dos

óvulos: 1- a avaliação geral das características dos óvulos utilizando uma

microscópio convencional (amadurecimento, forma, cor, etc); e 2- a avaliação de

estruturas específicas utilizando microscópio especial (luz polarizada). Contudo,

ainda não há uma conclusão definitiva sobre essas avaliações.

Para que você possa decidir se quer participar ou não deste estudo, precisa

conhecer seus benefícios, riscos e implicações.

OBJETIVO DO ESTUDO

Avaliar a correlação do amadurecimento dos óvulos e suas características

avaliadas pelo microscópio convencional e características de áreas específicas

dos óvulos (fuso meiótico e zona pelúcida) avaliadas pele microscópio especial

Os resultados da pesquisa podem indicar mais um método de avaliação da

qualidade dos óvulos, representando benefício para quem necessita de tratamento

de infertilidade com fertilização “in vitro”.

Anexos

150

PROCEDIMENTOS DO ESTUDO

Os óvulos coletados como parte de seu tratamento (fertilização “in

vitro”) são rotineiramente avaliados em relação ao estágio de amadurecimento.

Eles são divididos em 3 categorias: os maduros, chamados de “metáfase II” e os

imaturos que podem ser os chamados “Metáfase I” (sem amadurecimento

completo) e os chamados de “vesícula germinativa” (muito imaturos).

Se você concordar em participar deste estudo, os óvulos maduros serão apenas

analisados nos dois microscópios e logo enviados para a realização dos

procedimentos de fertilização “in vitro”. Os imaturos, que não podem ser

encaminhados para o tratamento, serão analisados nos dois microscópios e depois

deixados em condições artificiais esperando que eles amadureçam. Se

amadurecerem serão novamente avaliados pelos dois microscópios. Os óvulos

amadurecidos em vitro para esse estudo não serão utilizados no seu tratamento

MÉTODOS ALTERNATIVOS

Não há métodos alternativos a esses procedimentos. Conduto você pode

simplesmente não querer que seus óvulos sejam avaliados. É possível que seus

óvulos imaturos sejam amadurecidos no laboratório e depois destinados para o

tratamento. Contudo os resultados (chance de conseguir um bom embrião e de

engravidar) com esses óvulos não são bons. De qualquer forma, apenas se colher

6 ou mais óvulos maduros é que você participará desse estudo

RISCOS

O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não

deste estudo. A coleta dos óvulos faz parte dos procedimentos rotineiros do seu

tratamento, não sendo prevista coleta adicional. Para a coleta de óvulos, que é

parte de seu tratamento regular, é necessária sedação feita pela veia e

Anexos

151

posteriormente os ovários ficam aumentados de tamanho o que pode levar a

algum desconforto na sua barriga. O aumento dos ovários é resultado mais da

estimulação dos ovários pelos hormônios utilizados, necessários para seu

tratamento, e não parte do estudo.

Por outro lado, as avaliações dos óvulos maduros não os prejudicam.

BENEFÍCIOS

Os resultados da pesquisa podem indicar mais um método de avaliação

da qualidade dos óvulos, representando benefício para quem necessita de

tratamento de infertilidade com fertilização “in vitro”.

CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS

Além da equipe de saúde que cuidará de você, seus registros médicos

poderão ser consultados pela equipe de pesquisadores envolvidos. Seu nome não

será revelado ainda que informações de seu registro médico sejam utilizadas para

propósitos educativos ou de publicação, que ocorrerão independentemente dos

resultados obtidos.

TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS

Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de

pesquisa, e que necessite de atendimento médico, ficará a cargo da instituição.

Lembramos que não é esperado nenhum dano para a sua saúde decorrente

diretamente desse estudo

Seu tratamento e acompanhamento médico independem de sua

participação neste estudo.

Anexos

152

CUSTOS (Ressarcimento e indenização)

Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o paciente pela

sua participação no estudo.

BASES DA PARTICIPAÇÃO

É importante que você saiba que a sua participação neste estudo é

completamente voluntária e que você pode recusar-se a participar ou interromper

sua participação a qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos

quais você tem direito. Em caso de você decidir interromper sua participação no

estudo, a equipe assistente deve ser comunicada e a análise dos óvulos relativos

ao estudo será imediatamente interrompida.

GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS

Nós estimulamos a você ou seus familiares a fazer perguntas a qualquer

momento do estudo. Neste caso, por favor, entre em contato com a bióloga.

Claudia Petersen no telefone (16) 3911-1100 ou no endereço Av João Fiusa 689

Ribeirão Preto – São Paulo ou com qualquer médico do Centro de Reprodução

Humana Professor Franco jr.

DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO E ASSINATURA

Li as informações acima e entendi o propósito deste estudo assim como

os benefícios e riscos potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade

de fazer perguntas e todas foram respondidas. Eu, por intermédio deste, dou

livremente meu consentimento para participar neste estudo.

Anexos

153

Entendo que meus óvulos serão submetidos à análise adicional à

necessária a meu tratamento e não receberei compensação monetária por minha

participação neste estudo.

Eu recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento com

todas as páginas adicionais rubricadas.

__________________________________ ____ / _____ / _____

(Assinatura do Paciente) dia mês ano

_______________________________________________________

(Nome do Paciente – letra de forma)

__________________________________ ____ / ____ / _____

(Assinatura de Testemunha, se necessário) dia mês ano

Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste

estudo ao paciente indicado acima

__________________________________________ ____ / ____ / ____

(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano

Anexos

154

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 