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Júlio Cezar Zorzetto
Avaliação dos efeitos da inalação crônica de
cocaína crack na espermatogênese de
camundongos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção de título
de Doutor em Ciências
Área de concentração: Patologia
Orientador: Prof. Dr. Paulo Hilário Nascimento Saldiva
São Paulo
2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Zorzetto, Júlio Cezar
Avaliação dos efeitos da inalação crônica de cocaína crack na espermatogênese
de camundongos / Júlio Cezar Zorzetto. -- São Paulo, 2007.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Patologia.
Área de concentração: Patologia.
Orientador: Paulo Hilário Nascimento Saldiva.
Descritores: 1.Cocaína crack/toxicidade 2.Testículo/anatomia & histologia
3.Espermatogênese 4.Camundongos
USP/FM/SBD-109/07
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Dedicatória
A minha esposa Marta
por iluminar meus passos, por me dar idéias e
por participar ativamente de todas as fases da minha vida.
Aos meus filhos Pedro e Luis
por serem o que me faz querer crescer e levá-los comigo.
Agradeço à:
Dr. Paulo Saldiva por ter me acolhido no laboratório de Poluição
Atmosférica Experimental, aceitado e se interessado pela minha idéia
e por sua orientação;
Dra. Heloisa Bueno pela ajuda incondicional, por ter sido
fundamental desde o início até a conclusão deste trabalho, pelo bom
humor nas situações difíceis, pela orientação e acima de tudo pela
amizade;
Adriana Pires, companheira de pós que analisou as lâminas deste
trabalho e que deu total apoio nos momentos decisivos;
Aos professores Maurício Yanomami e Raphael Caio da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas - USP pela análise da cocaína no sangue dos
animais;
Dra. Débora Gonçalves de Carvalho pela análise da concentração de
cocaína no crack usado neste trabalho
Dr. Luis Antonio Cardoso e sua esposa, enfermeira Cristina Peres
Cardoso pelo companheirismo e amizade;
Márcia, Dalva e Eliane, secretárias do laboratório de Poluição que
sempre foram muito solícitas, pacientes e dedicadas;
Dra. Thaís Mauad pelo apoio e todas as sugestões sempre
pertinentes;
Funcionárias da histologia Cássia, Rosely, Kelly, Keyla, Marina, Ady e
Celina, pela paciência e dedicação no preparo das lâminas deste
trabalho;
Angélica Baganha Ferreira, Sandra Regina de Castro Soares e Dolores
Helena do laboratório de poluição pela ajuda no sacrifício dos
animais;
Ana Júlia e Aline Presto Braga pelo apoio na coleta e preparo do
material;
Dr. Décio Divanir Mazeto (Juiz de Direito da Comarca de Marilia), Dr.
Flávio José Rino Guimarães (Delegado DISE Marilia), Dr. Paulo
Roberto de Lara Silva (Del. DISE Marilia), Getúlio Tomoyuki Sato
(Escrivão DISE Marilia), Rosana Deliza e (Perita Criminal Marilia),
Nelma Aparecida Rossini (Perita Criminal Marilia) pela autorização
de entrega do crack para a realização deste estudo;
Agradecimento especiais:
Dr. Luis Carlos da Silva, diretor do Núcleo de Perícias Médico Legal
de Marilia, que foi quem me apresentou ao Dr. Saldiva.
Dr. Neivo Luiz Zorzetto, meu grande incentivador.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Summary
I. INTRODUÇÃO ............................................................................... 1
I.a. Drogas ilícitas ................................................................... 2
I.b. O uso popular da cocaína .................................................. 5
I.c. Cocaína em forma de Crack............................................... 6
I.d. Cocaína Crack: um problema sócio-econômico e de
saúde pública.................................................................. 10
I.e. Intoxicação sistêmica: o testículo como órgão alvo da
cocaína............................................................................ 17
I.f. Histologia do Testículo..................................................... 18
I.g. Espermatogênese ............................................................ 21
I.h. Histopatologia dos testículos ........................................... 26
II. OBJETIVO ................................................................................. 29
III. MÉTODO .................................................................................. 31
III.a. Protocolo experimental.................................................... 32
III.a.1. Animais.............................................................. 32
III.a.2. Material Teste..................................................... 33
III.a.3. Grupos Experimentais........................................ 34
III.a.4. Exposição........................................................... 35
III.a.5. Coleta, fixação e preparo de material biológico .... 42
III.a.6. Parâmetros avaliados em testículo ...................... 43
III.a.7. Análises estatísticas ........................................... 44
IV. RESULTADOS.......................................................................... 45
IV.a. Material teste................................................................. 46
IV.a.1. Concentração de cocaína no material teste :
crack.................................................................. 46
IV.b. Animais .......................................................................... 46
IV.b.1. Peso Animal........................................................ 47
IV.b.2. Concentração Sérica de Cocaína......................... 49
IV.b.3. Peso do testículo................................................. 49
IV.b.4. Túbulos em fase VII............................................ 50
IV.b.5. Células Somáticas .............................................. 52
V. DISCUSSÃO............................................................................... 57
VI. CONCLUSÕES .......................................................................... 78
VII. ANEXOS .................................................................................. 80
VIII. REFERÊNCIAS ....................................................................... 85
Lista de Figuras
Figura 1. Pedras de crack................................................................. 7
Figura 2. Parafernália para consumo do crack.................................. 9
Figura 3. Criança fumando crack. .................................................. 13
Figura 4. Anatomia interna do testículo.......................................... 20
Figura 5. Corte histológico transversal de testículo. ........................ 21
Figura 6. Representação gráfica da espermatogênese...................... 23
Figura 7. Epitélio Seminífero .......................................................... 24
Figura 8. Fases de maturação da espermatogênese de pequenos
roedores.......................................................................................... 25
Figura 9. Porções de crack preparadas para experimentação. ......... 35
Figura 10. Artefato de queima e produção de fumaça de crack....... 37
Figura 11. Câmara de inalação....................................................... 38
Figura 12. Controle de fluxo da fumaça ......................................... 40
Figura 13. Sistema de exposição animal à fumaça de cocaína
crack.............................................................................................. 41
Figura 14. Pesos médios dos animais dos grupos experimentais ao
longo do período de exposição. ....................................................... 48
Figura 15. Número de túbulos em fase VII em testículo dos animais
dos diferentes grupos experimentais............................................... 51
Figura 16. Quantificação de Células de Sertoli em epitélio
seminífero de camundongos dos diferentes grupos experimentais... 52
Figura 17. Quantificação de células de Leydig em região
intertubular de testículo de animais dos diferentes grupos
experimentais................................................................................. 53
Figura 18. Degeneração de espermátides alongadas em Epitélio
germinativo de camundongos expostos ao crack............................. 56
Lista de Tabelas
Tabela 1. Pesos Médios dos animais dos diferentes grupos
experimentais ................................................................................. 47
Tabela 2. Pesos médios de testículos dos animais dos grupos
experimentais................................................................................. 49
Tabela 3. Quantificação de túbulos em fase VII encontrados em
testículos de animais dos diferentes grupos experimentais ............. 50
Tabela 4. Quantificação de células germinativas em epitélio
seminífero de camundongos expostos e não expostos ao crack, em
diferentes períodos de maturação gonadal ...................................... 54
Tabela 5. Quantificação de células germinativas degeneradas em
epitélio seminífero .......................................................................... 55
RESUMO
Zorzetto JC. Avaliação dos efeitos da inalação crônica de cocaína crack
na espermatogênese de camundongos [tese]. São Paulo: Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo; 2007. 89p.
Neste estudo foram investigados os efeitos da inalação crônica de
cocaína crack na espermatogênese de camundongos púberes e
maduros. Camundongos Balb/c machos de duas diferentes idades,
jovem e adulta (n=20), foram expostos à fumaça de 5g de cocaína
crack em uma câmara de inalação, 5 dias por semana, durante 2
meses. Animais controle (n=10) foram mantidos em biotério durante o
período de experimentação. Análises morfométricas quantitativas de
cortes histológicos de testículos foram feitas em microscopia óptica. A
qualidade da espermatogênese foi avaliada durante a fase VII de
maturação do epitélio seminífero, através da quantificação dos tipos
celulares normais e degenerados presentes nos espaços intra e
intertubular (células germinativas, células de Sertoli e células de
Leydig). As diferenças foram consideradas significativas quando
p<0,05. O número de túbulos seminíferos em fase VII por testículo
mostrou significante redução (p=0,023) em animais jovens expostos.
Houve redução significativa observada no número de células de
Sertoli (p=0,000) e espermátides alongadas (p=0,005) de animais
jovens expostos. A degeneração celular é aumentada em todos os
grupos expostos, com maior severidade no grupo jovem (p=0,000). A
inalação de fumaça de cocaína crack induz a alterações na
espermatogênese, sendo sua toxicidade maior em animais jovens
expostos durante a fase de maturação gonadal . Estes achados são de
interesse na saúde pública e mais investigações devem ser feitas
focando efeitos similares em homens.
Descritores: 1.Cocaína crack/toxicidade 2.Testículo/anatomia &
histologia 3.Espermatogênese 4.Camundongos.
SUMMARY
Zorzetto JC. Evaluation of the effects of the chronic inhalation of crack
cocaine on the spermatogenesis of mice [thesis]. São Paulo: “Faculdade
de Medicina, Universidade de São Paulo; 2007. 89p.
In the present study, the effects of chronic inhalation of crack cocaine
on the spermatogenesis of pubertal and mature mice were
investigated. Balb/c mice of two different ages, young and adult
(n=20), were exposed to the smoke of 5g of crack in an inhalation
chamber for 5 days a week during 2 months. Correspondents control
animals (n=10) were kept in animal house during experimentation.
Morphological quantitative analyses of testis were made in optical
microscope. The spermatogenesis was evaluated during phase VII of
maturation of the seminiferous epithelium. The number of
spermatogenesis cell types (germ cells and Sertoli cells), the germ cell
degenerations and the intertubular Leydig cells population was
scored. Differences were considered significant when p<0.05. The
number of tubular phase VII per testis showed significant (p= 0,023)
reduction in young exposed animals. Significant reductions (p=0,000)
were observed in Sertoli cells and spermatids elongated (p=0,005) in
young intoxicated animals. Apoptosis is also increased in all
intoxicated groups being more severe in young groups (p=0,000).
Inhalation of crack cocaine smoke induced spermatogenesis
disruption of chronic exposed mice. Crack toxicity was more severe in
pubertal mice when sexual gonad undergoes maturation. We think
that our findings should be of public health concern and that further
investigations focusing similar effects on human males are
warranted.
Descriptors: 1.Crack cocaine/toxicity 2.Testis/anatomy
3.Spermatogenesis 4.Mice.
I. INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
Introdução
2
I.a. Drogas ilícitas
A Organização Mundial da Saúde define toxicomania ou
toxicofilía como “um estado de intoxicação periódica ou crônica,
nociva ao indivíduo ou à sociedade, produzida pelo repetido consumo
de uma droga natural ou sintética”.
A toxicomania tem como características aumentar a dose,
necessidade de consumir a droga, podendo ainda causar dependência
psíquica e física, sendo a dependência a uma droga definida como o
condicionamento do indivíduo a ela e que quando na falta da mesma
desencadeia a crise ou síndrome de abstinência. Isto faz com que o
usuário busque rapidamente nova dose, aumentando a freqüência e a
quantidade de uso (Moreau, 1996).
Segundo Moreau (1996) as principais substâncias utilizadas
pelos usuários de drogas nos dias atuais são:
Maconha: também denominada marijuana, é conhecida na
China e na Índia há 9 mil anos, sendo extraída das folhas da Canabis
sativa. Seu consumo é principalmente em forma de cigarros. Alguns
não a consideram propriamente um tóxico, por não trazer
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
3
dependência, tolerância, nem crises de abstinência. É um excitante
de graves perturbações psíquicas e leva o usuário a associar outro
tipo de droga. A maconha provoca prostração, lassidão, olhos
perdidos a distância, memória afetada, falta de orientação no tempo e
espaço.
Morfina: é um alcalóide derivado do ópio e apresenta-se em
forma de líquido incolor. É um narcótico utilizado sob a forma de
injeção intramuscular. No início do uso da droga o usuário sente-se
eufórico, disposto, loquaz e alegre. Com o passar dos tempos vem o
emagrecimento, envelhecimento precoce, angústia, impotência
sexual, inapetência e vômitos. Passa à uma fase de caquexia, vindo a
falecer quase sempre de tuberculose ou de problemas cardíacos.
Heroína: é um produto sintético (diacetilmorfina). Tem a forma
de pó branc,o e cristalino. Pode ser injetado após a diluição ou ser
misturado ao fumo do cigarro. Os efeitos são semelhantes aos da
morfina, porém, cinco vezes mais potente. Com 30 dias de uso, o
dependente necessita de uma injeção a cada duas horas.
LSD: é uma droga eminentemente alucinógena, um produto
semi-sintético extraído da ergotina do centeio (diatilacina do ácido
lisérgico). Consome-se em tabletes de açúcar ou em fragmento de
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
4
cartolina manchado sutilmente da droga, dissolvido na água e
ingerido. É uma droga de vários poderes alucinógenos conhecidos. O
usuário torna-se deprimido, triste e fadigado. Apresenta perturbações
da percepção do mundo exterior delírios e alucinações.
Anfetaminas (Ecstasy): têm se tornado no momento um grande
problema médico e social. São usadas por todos os toxicômanos que
não dispõem do seu tipo de tóxico. Usam para evitar a sonolência,
para desinibir, para euforizar. Tem a forma de comprimidos, são
ingeridos com água ou bebida alcoólica.
Por fim, a Cocaína: um alcalóide extraído das folhas do arbusto
Erytroxylun coca, nativo dos países andinos. Devido a suas
propriedades estimulantes centrais que abrandam a fome, a sede e
cansaço, os habitantes dessa região há milênios a utilizam em forma
de chá ou mastigando a folha in natura.
Em 1859 Albert Niemann obteve o princípio ativo da planta, de
natureza básica e que contém uma função amina, a cocaína. A
cocaína foi introduzida na prática anestesiológica através de Carl
Holler, em 1884, que conduziu uma série de experimentos que
envolviam a instilação de cocaína na córnea de animais e pacientes,
comprovando sua propriedade anestésica local. Simultaneamente,
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
5
seu colega Sigmund Freud voltava-se para a análise dos efeitos
sistêmicos da droga, sugerindo seu uso no controle de diversas
patologias, inclusive como recurso substituto para o tratamento de
viciados em morfina (Chasin e Salvadori, 1996).
As folhas do Erythroxylun coca, são prensadas juntamente com
ácido sulfúrico e um solvente tipo éter, querosene ou até mesmo
gasolina, que confere a forma básica, uma pasta contendo 90% de
sulfato de cocaína. Numa segunda fase, então, o ácido clorídrico é
adicionado a esta pasta de cocaína, com o objetivo de refinar o
produto e eliminar as impurezas remanescentes do processo anterior,
resultando num pó branco e inodoro, o cloridrato de cocaína, que é
solúvel em água e que se decompõe pelo aquecimento (Chasin e
Salvadori, 1996).
I.b. O uso popular da cocaína
As vias de introdução da droga cocaína por suas características
de absorção são: oral, intranasal, intravenosa e respiratória (ato de
fumar). A absorção da cocaína ocorre a partir de qualquer ponto de
aplicação, porém quando administrada via oral é amplamente
hidrolizada no tubo gastrointestinal tornando-se pouco eficaz. A
utilização da cocaína (pó) por via nasal (aspirar, cheirar) ou pela
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
6
mucosa bucal, vias muito utilizadas popularmente, tem baixa
velocidade de absorção, devido às propriedades vasoconstritoras do
fármaco. A via nasal sob forma de cloridrato (pó) é enviada para o
sangue pela mucosa nasal. Pelo seu alto poder vasoconstritor pode
desenvolver ulcerações nas narinas e perfuração do septo nasal. A via
parenteral utilizada é a endovenosa, pois a intramuscular, devido à
constrição, causaria necrose local (Chasin e Salvadori, 1996).
No entanto, devido ao alto custo do pó de cocaína no comércio
ilícito, a droga é adulterada pelos traficantes, adicionando ainda ao
pó de cocaína, substâncias isomórficas como pó de mármore, giz,
talco, etc. constituíndo-se no produto conhecido como cocaína de rua
(Chasin e Salvadori, 1996). Dizia-se que os usuários de cocaína de
maior poder aquisitivo cheiravam e os pobres injetavam na veia,
aproveitando o máximo do efeito com pequenas quantidades, não
podendo se dar ao luxo de “cheirar o pó”.
I.c. Cocaína em forma de Crack
Em 1984, houve o surgimento no Broux, Estados Unidos, de
um derivado químico álcali, de efeito mais rápido e mais potente que
a apresentação em pó da cocaína. Era a pasta básica de cocaína
(folha de coca + ácido sulfúrico) misturada a bicarbonato de sódio,
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
7
numa proporção de 1:1, utilizando água como veículo para mistura.
Em seguida esta mistura era aquecida deixando-se evaporar a água,
restando uma espécie de sabão de cor que tende do bege ao
amarelado e que endurece em forma de pedras (Figura 1). Essas
pedras, quando aquecidas produzem fumaça inalável a qual durante
o processo de queima, caracteristicamente estalam ou crepitam,
dando origem ao nome “CRACK” (Corradini, 1996).
Figura 1. Pedras de crack.
Figura 1. Forma de apresentação do crack. Cada centímetro cúbico
representa o equivalente a 1g da droga.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
8
O crack é a forma de cocaína básica auto-administrada pelo ato
de fumar. Uma pequena massa, aproximadamente 200 miligramas do
material (Wood et al., 1996) é acondicionada em aparatos do tipo
cachimbo, onde é diretamente queimada com uma chama enquanto o
usuário aspira a fumaça produzida. Quando o aquecimento é aplicado
à droga há rápida mudança do estado sólido para líquido e para vapor.
A base de cocaína possui ponto de fusão a 98ºC e manifesta pressão de
vapor adequada para disponibilizar cocaína acima de 160ºC (Lawrence
et al., 1984). A ignição e a combustão do material podem ocorrer em
temperaturas bem maiores, mas a degradação pirólica é mais comum e
se inicia em torno dos 170ºC. Como o vapor de cocaína percorre um
caminho que muda do quente para o frio, o vapor condensa formando a
fumaça, que é na verdade, a condensação da composição aerossol da
base de cocaína associada aos produtos pirólicos (Wood et al., 1996).
A velocidade de absorção da cocaína inalada (pó) ou fumada
(crack) promove pico de concentração plasmática, com duração e
intensidade de efeitos que podem ser comparados aos da via
intravenosa de administração (Seibel e Toscano Jr, 2001).
O crack é mais barato do que a cocaína, pois não necessita do
refino. Além disso, é 6 vezes mais potente, age rapidamente (5 a 10
segundos) e exige freqüente repetição da dose, dando mais lucro ao
traficante (Corradini, 1996). Para o usuário, oferece “vantagens” por
não deixar marcas externas (flebites), não expor às doenças
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
9
transmitidas pelo uso de seringas (AIDS, hepatite) e ainda pelo baixo
custo, fator principal de seu alto consumo.
As pedras de crack são queimadas e fumadas em cachimbos
especiais (chamados de “maricas”) muitas vezes improvisados de
diversas maneiras, como adaptações em latas, papel de alumínio,
partes de pequenas tubulações hidráulicas ou misturados aos
cigarros de tabaco ou maconha, Figura 2.
Figura 2. Parafernália para consumo do crack.
Figura 2. Cachimbos ou “maricas” como artefatos caseiros e
improvisados para fumar o crack.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
10
I.d. Cocaína Crack: um problema sócio-econômico e de
saúde pública
O problema da utilização de drogas psicotrópicas é tão velho
quanto a própria civilização. Em todo mundo, muitas sociedades e
culturas têm usado drogas para alterar a disposição e o humor, os
pensamentos e os sentimentos (Das, 1993). A cocaína, heroína e a
maconha são as drogas mais utilizadas de modo abusivo e não
aprovado. Desde 1987 o uso de cocaína vem aumentando em todo o
mundo, principalmente na forma de pedra, o crack (Das, 1993; Dunn
et al., 1996; Ferri et al., 1997 apud Ferreira Filho, 2003).
A cocaína crack é hoje a forma mais barata, mais fácil de
obter e consumir, estando em ritmo crescente entre os usuários de
droga, principalmente aqueles de menor poder econômico (Ferreira
Filho, 2003).
Em 1999, nos Estados Unidos, 30 milhões de indivíduos já
havia usado cocaína, sendo que cerca de 6,6 milhões eram usuários
regulares (Li et al., 1999b).
No Brasil, até o início do século XX, não havia relato sobre
abuso e dependência ou uma preocupação maior com o consumo de
cocaína. A substância era vendida em farmácia para alívio de
laringites e tosse (ação anestésica). Na década de 1910-20, começa a
haver grandes preocupações com o uso não médico nas grandes
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
11
cidades como São Paulo e Rio de Janeiro. O país não é um produtor
significativo de cocaína, mas faz parte da rota colombiana do tráfico
para os Estados Unidos e Europa, e, mais recentemente, ingressou
na conexão nigeriana, vindo a droga entrar em grandes quantidades
no país (Carlini et al., 1995 apud Ferreira Filho, 2001)
A maior parte da atenção e esforços para enfrentar o problema
das drogas é dirigida ao combate do tráfico. Pouco se sabe a respeito
do padrão de uso e das características específicas do usuário, o que
dificulta realização de estudos dando ênfase ao problema de saúde
(Ferri et al., 1997 apud Ferreira Filho, 2001).
De maneira geral, os usuários de droga estão escondidos da
sociedade, tanto por usar uma droga ilegal como pela criminalidade
a ela relacionada, ficando, assim, difícil determinar com precisão o
seu número. Eles podem ser encontrados em serviços
especializados no tratamento da dependência química, em
delegacias, cadeias e presídios ou hospitais devido às condições de
saúde conseqüentes ao uso da droga (Haverkos e Lange, 1990 apud
Ferreira Filho, 2003).
Um levantamento realizado pelo Centro Brasileiro de
Informações sobre Drogas Psicotrópicas – CEBRID, do Departamento
de Psicologia da Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP - no
período compreendido entre 1987 e 1993, mostra um aumento
significativo do percentual de estudantes de 1º e 2º graus que
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
12
usaram cocaína, pó ou pedra, pelo menos uma vez na vida, passando
de 0,5% em 1987 para 1,2% em 1993, (Figura 3).
Ferreira Filho et al. (2003) fizeram uma avaliação do perfil
sociodemográfico e de padrões de uso entre dependentes de cocaína
hospitalizados na grande São Paulo/Brasil, entrevistando 440
pacientes, maiores de 18 anos, internados em unidades de serviço de
recuperação do usuário de droga. A pesquisa revelou que 38,4% dos
usuários fumavam crack, ao passo que 1,6% se utilizavam da droga
de forma injetável. Havia uma prevalência de usuários do sexo
masculino, somente 18 (4,1%) eram mulheres. A maioria não tinha
companheiro e pertencia as classes sociais C, D e E (69,8%). A faixa
etária dos pacientes estudados era bastante jovem (85,0% dos
dependentes químicos tinham menos de 35 anos de idade), com
média de 27,5 ± 6,9 anos, mínimo de 18 e máximo de 51 anos. A
faixa etária jovem é comum entre os adictos, por ser um público de
maior exposição e grande penetração das drogas.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
13
Figura 3. Criança fumando crack.
Figura 3. Menino acende pedras de crack em adaptação de cachimbo
feito com frasco de leite fermentado e peça de caneta. Foto publicada
no Jornal Folha de São Paulo, 1992.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
14
Vários autores vêm demonstrando um aumento crescente no
consumo de crack entre os jovens (Dunn et al., 1996; Ferri et al.,
1997; Strang et al., 1990 apud Ferreira Filho, 2003). Nos Estados
Unidos o fenômeno atingiu proporções epidêmicas. Estudos
epidemiológicos do final da década de 80 mostraram que de cada 4
americanos 1 usou cocaína e que no Canadá cerca de 2% dos
estudantes de Ontário e British Columbia entre 13 e 18 anos eram
usuários de crack (Spitz e Rosecan, 1987 e Smart, 1991 apud George
et al., 1996). Atualmente, nos Estados Unidos, cerca de 6 milhões de
pessoas são adictos da cocaína e seu uso vem se espalhando entre os
jovens. Na classe média americana, predomina usuários da
comunidade adolescentes branca (média de 16,5 anos), onde 15%
usou cocaína ou crack de 10 a 50 vezes e 18% são usuários “pesados”
tendo utilizado-se da droga mais de 50 vezes (Schwartz et al., 1991).
Em pesquisa realizada no Estado de São Paulo em 2001,
Ferreira Filho et al. registraram que 45,8% dos usuários disseram
acreditar que é fácil obter cocaína e 36,1% apontaram sobre a
facilidade de se obter o crack. A noção dos danos causados pela
droga também já foi assimilado sendo que 98,8% dos usuários,
envolvidos na pesquisa, reconhecem que há riscos graves no
consumo desta droga. Os dependentes de crack apresentavam baixa
escolaridade, encontravam-se com maior freqüência desempregados,
havia morado nas ruas, usavam maiores quantidade de droga e
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
15
tinham sido presos maior número de vezes do que aqueles que
usavam outras vias de administração da cocaína. Os usuários de
crack apresentam pior condição socioeconômica e maior
envolvimento com a violência e a criminalidade.
Os resultados de Ferreira Filho et al. (2003) sugerem que o uso
de drogas é um grave problema de saúde pública na Grande São
Paulo, mostrado por pacientes internados em hospitais por
dependência a droga cocaína.
Segundo França (2001), os efeitos do crack são os mesmos da
cocaína, pois a droga é a mesma, apenas difere na forma de uso. A
cocaína é capaz de produzir estimulação do sistema nervoso central e
tem propriedades simpaticomimética e anestésica local. Tais
atividades manifestam-se de maneira dose dependente.
As propriedades psicoestimulantes devem-se à influência sobre a
transmissão dopaminérgica, induzindo euforia e sensação de
clarividência, responsáveis pelo uso abusivo e pela farmaco-
dependência. O bloqueio de recaptura de neurotransmissores
adrenérgicos, em neurônios periféricos, contribui para a
hiperatividade simpática com repercussões cárdio-vasculares. A
cocaína tem a capacidade de liberar catecolaminas, particularmente
adrenalina, de reservas teciduais e, também, estimula o efluxo
simpato-adrenal, com influência sobre o sistema renina-angiotensina
(França, 2001).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
16
A cocaína é pirogênica. Três fatores concorrem para elevar a
temperatura: maior atividade muscular, vasoconstrição devido a
estimulação vasomotora central que reduz a perda de calor e, por
último, parece ter a cocaína ação direta sobre o centro termoregulador,
estimulando o aumento de temperatura (França, 2001).
A via fumada (crack) atravessa a membrana alveolar pulmonar
e determina os efeitos comparados aos da via endovenosa. O crack
em sua metabolização produz metilecgonidina que tem atividade
biológica sistêmica. Cook et al. (1985 apud Chasin e Salvadori, 1996)
demonstraram que 50mg de crack fumado em intervalos de 30
segundos e por 5 minutos, induzem a efeitos psicológicos e cardíacos
da mesma magnitude que 20 mg de cocaína por via intravenosa. As
doses de pó para uso intravenoso variam entre 25 e 50 mg, já na
aspiração nasal as doses individuais variam entre 30 e 70 mg.
Há referências de que a média de uso por fármacodependente
seja de 4 a 5 gr por semana. O uso crônico da cocaína crack
desenvolve tolerância, havendo relatos de uso diário que excedem 1g,
considerado letal para individuo adulto (Chasin e Salvadori, 1996).
A dose letal (“overdose”) de cocaína para humanos varia de 1,0 a
5,0g. Ao receber uma overdose, o paciente torna-se rapidamente
excitado, inquieto, ansioso e perturbado. Seus reflexos tornam-se
exacerbados. É comum a cefaléia. O pulso torna-se rápido (taquicardia
e eventual fibrilação ventricular), a respiração torna-se irregular, há
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
17
elevação da temperatura, as pupilas tornam-se dilatadas e ocorre
exoftalmia. Há náuseas, vômitos e dores abdominais. Finalmente, há
delírio, respiração de Cheyne-Stokes, convulsões e inconsciência. A
morte sobrevém devido à parada cardio-respiratória. Entretanto,
conhecem-se efeitos tóxicos com doses menores e há usuários que
suportam doses maiores (França, 2001).
I.e. Intoxicação sistêmica: o testículo como órgão alvo
da cocaína
Os efeitos crônicos do uso recreativo de drogas no sistema
reprodutivo masculino têm se tornado foco de crescente interesse nos
últimos anos.
O testículo humano é sabidamente um órgão alvo de injúrias
conseqüentes da ação de agentes terapêuticos e tóxicos ambientais,
promovendo vários possíveis mecanismos e manifestações de seu
efeito tóxico na espermatogênese (Boeckelheide, 2005). Um exemplo
clássico seria a nicotina, quando inalada (tabagismo) induz
mudanças na função gonadal como a deficiência na maturação do
espermatozóide e redução no potencial de fertilização (Yamamoto et
al., 1998).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
18
Assim como a nicotina, a cocaína é matabolizada por via
hidrolítica e oxidativa (Li et al., 1999a). Estudos experimentais
demonstram uma grande afinidade da droga em tecidos testiculares
(Sweet et al., 1987). De fato, quando cocaína radioativa é injetada
subcutaneamente em ratos, são detectadas em tecidos testiculares
concentrações que excederam àquelas encontradas em tecido
muscular, hepático, cardíaco ou sanguíneo. Apenas as concentrações
de cocaína radioativa encontradas em tecido cerebral foram maiores
àquelas concentradas nos testículos (Mule e Misra, 1977 apud George
et al., 1996).
I.f. Histologia do Testículo
0s testículos se referem às gônadas masculinas. Neles são
constantemente produzidos os gametas X e Y, compreendidos nos
milhões de espermatozóides produzidos diariamente por um
mamífero, como o homem.
Os testículos estão envolvidos por uma grossa cápsula de
tecido conjuntivo denso. Em seu interior existem septos fibrosos que
o dividem em cerca de 250 a 350 compartimentos piramidais
chamados lóbulos dos testículos, sendo cada um destes formado por
1 a 4 túbulos seminíferos (Junqueira e Carneiro, 2004). Os túbulos
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
19
seminíferos formam alças enoveladas que percorrem toda a extensão
axial do testículo, (Figura 4). Sob microscopia ótica, um corte
histológico transversal dessa compacta organização dentro do órgão,
permite a visualização de secções com a nítida representação dos
tipos celulares que congregam estruturas intersticiais e intra -
tubulares (Russel et al., 1990), Figura 5.
Os túbulos seminíferos estão dentro do um tecido conjuntivo
frouxo e rico em vasos sangüíneos e linfáticos, nervos e células de
Leydig (células intersticiais). Os capilares sangüíneos são
fenestrados e permitem a passagem livre de macromoléculas, como
as proteínas do sangue. Há uma imensa rede linfática, o que explica
a semelhança entre a linfa e o fluido intersticial (Junqueira e
Carneiro, 2004). A organização linfática é formada por canais
irregulares ou sinusóides ligados por células endoteliais. Os fluidos
linfáticos penetram através das células do interstício. Os túbulos
seminíferos são circundados pelo endotélio linfático, células miódes
e elementos acelulares, que juntos delimitam a membrana limitante
do túbulo (Russel et al., 1990).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
20
Figura 4. Anatomia interna do testículo.
Figura 4. Estrutura interna do testículo mostrando organização dos
túbulos seminíferos e em detalhe.
O tipo celular mais frequentemente encontrado no interstício
intertubular é a célula de Leydig. Esta célula é, além da
testosterona, fonte de uma variedade de hormônios estrogênicos. A
célula de Leydig possui abundante retículo endoplamático liso e
mitocôndrias com cristas tubulares, ambos contendo enzimas
associadas com a síntese de esteróides. Macrófagos e outras células
derivadas da medula óssea são também comumente vistos no
espaço intersticial (Russel et al., 1990).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
21
Figura 5. Corte histológico transversal de testículo.
Células de Leydig
Capilares
Células de Leydig
Capilares
Figura 5. Detalhe de fotomicrografia de corte histológico de testículo
em coloração Hematoxilina/Eosina (HE), mostrando espaço intertubular
preenchido por células de Leydig e capilares.
Os dois compartimentos, intersticial e tubular, juntos
concorrem para o funcionamento normal da fisiologia do testículo e
de sua principal função, a de produzir gametas masculinos durante o
processo da espermatogênese
(Russel et al., 1990).
I.g. Espermatogênese
Os túbulos seminíferos são revestidos de um epitélio de
maturação e proliferação de células germinativas masculinas,
denominado epitélio seminífero. Este epitélio é responsável pela
espermatogênese, produção de espermatozóides, um processo cíclico
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
22
e contínuo. A partir da membrana basal, que constitui a parede do
túbulo, são produzidas células imaturas, que sofrem subseqüentes
divisões e diferenciações celulares até a efetiva produção do gameta
masculino. Baseado em considerações funcionais, a espermatogênese
pode ser dividida em 3 fases de amadurecimento de células
germinativas: 1. proliferativa, que consiste na formação de
espermatogônias por processo de rápida divisões mitóticas; 2.
meiótica, formação de espermatócitos nos quais o material genético é
recombinado e segregado e; 3. diferenciação, na qual espermátides
redondas se transformam em espermátides alongadas, células
estruturalmente equipadas para alcançar e fertilizar o ovo, os
espermatozóides (Russel et al., 1990), Figura 6.
No entanto, o epitélio seminífero não é constituído apenas de
células germinativas, possui um tipo celular somático denominado
célula de Sertoli. As células de Sertoli fomentam o desenvolvimento e
mantém a viabilidade das células germinativas, responsável pelo
transporte de hormônios e nutrientes através de compartimentos
especializados, as barreiras hemato-testiculares. As células de Sertoli
envolvem as células germinativas. formando sítios de ligação entre
células germinativas que servem tanto para manter uma estreita
associação quanto prover suporte físico entre os tipos celulares do
epitélio seminífero (Russel et al., 1990), Figura 7.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
23
Figura 6. Representação gráfica da espermatogênese
Figura 6. Representação do processo de maturação de células
germinativas do testículo.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
24
Figura 7. Epitélio Seminífero
Membrana basal
Célula de Sertoli
Células de Leydig
Espermatogônia
Espermatócitos
Espermátides
Figura 7. Compartimentos inter e intratubulares, limitados pela
membrana basal dos túbulos, com representação dos tipos celulares do
interstício (Cel. Leydig) e do epitélio seminífero (Cél. de Sertoli,
espermatogônias, espermatócitos e espermátides), responsáveis pela
espermatogênese.
A evolução de células germinativas do homem até a formação
de espermatozóide adulto demora entre 69 a 79 dias. O processo da
espermatogênese não ocorre de maneira sincronizada, mas em
pequenas ondas de diferentes fases de maturação em toda a extensão
do túbulo (Russel, 1990). Em pequenos roedores, ratos e
camundongos, a espermatogênese compreende de 12 a 14 fases de
maturação que se completa em 2 meses (Russel, 1990). Sendo assim,
em um corte histológico de testículo pode-se observar secções de
túbulos seminíferos em diferentes fases de maturação epitelial.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
25
Particularmente, a fase VII possui todos os tipos celulares expressos,
com espermatozóides formados e prestes a serem lançados à luz do
túbulo, como produto final da espermatogênese (Figura 8).
Figura 8. Fases de maturação da espermatogênese de pequenos
roedores.
Figura 8. Representação histológica das várias fases de maturação do
epitélio seminífero. O ciclo segue a seqüência das 14 fases
esquematicamente apresentadas “tipo pizza”. Peculiarmente a fase VII
apresenta todos os tipos celulares do epitélio seminífero, incluindo
espermatozóides alinhados em torno do lúmen tubular.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
26
I.h. Histopatologia dos testículos
Se considerarmos todo o processo de espermatogênese, existem
apenas 4 esquemas gerais que podem levar a uma diminuição no
número de espermatozóides produzidos no testículo. Podem ocorrer
separadamente ou em combinação:
1. interrupção do padrão de divisão das células de origem;
2. degeneração e fagocitose de células germinativas;
3. prisão e atraso da espermatogênese;
4. sacrifício das células germinativas (apoptose).
A taxa de divisão das espermatogônias de origem é variável,
dependente do “status” da espermatogênese. A espermatogônia de
origem se divide periodicamente para repopular a elas mesmas e
também para dar origem a células que efetivamente participarão da
espermatogênese. Muitas condições de anormalidade na
espermatogênese levam a um epitélio depletado de células
germinativas, com exceção das espermatogônias. Estas células
residuais são as espermatogônias de origem, geralmente menos
vulneráveis a uma variedade de agentes que afetam o testículo.
Possuem a capacidade de permanecerem, de certa forma,
dormentes sem se diferenciarem ou se dividirem, por um período
relativamente longo. Quando a espermatogênese está se
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
27
recuperando existe uma aceleração na taxa de divisão das células
de origem (Russel et al., 1990).
Quando uma célula espermatogônia se diferencia o processo
até a formação do espermatozóide é irreversível. A única outra opção
desta célula é não seguir seu processo de maturação e degenerar
(Russel et al., 1990).
A degeneração pode ocorrer por morte celular programada ou
apoptose que é um mecanismo conservado evolutivamente e
necessário para o desenvolvimento embrionário e homeostase
tecidual (Reed, 2000), que equilibra a proliferação celular mantendo o
número de células constante nos tecidos (Vermeulen et al., 2003).
A apoptose é caracterizada por mudanças morfológicas que
incluem o encolhimento celular progressivo, com condensação e
fragmentação da cromatina nuclear e formação de vesículas com
eventual fragmentação da célula formando corpos apoptóticos que
são fagocitados sem que haja reação inflamatória, diferentemente da
morte por necrose. A liberação destes corpos dá nome ao mecanismo,
pois do grego significa queda, como as folhas que caem de uma
árvore (Kerr et al., 1972).
Por conta de seus efeitos no testículo, a intoxicação sistêmica
pela cocaína perece ser maior em mamíferos do sexo masculino, onde
menores doses e concentrações no plasma seriam requeridas para
provocar toxicidade (Morishima et al., 1993). A cocaína promove
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Introdução
28
alterações morfológicas em tecidos testiculares de ratos como
constrição de vasos sanguíneos do testículo (Li et al., 1998), depleção
de anti-oxidantes testiculares e indução de degeneração (apoptose) de
células germinativas masculinas (Li et al., 1999c), levando à redução
na produção de espermatozóides (Li et al., 1997a; George et al., 1996).
No entanto, as pesquisas que investigam os efeitos tóxicos da
cocaína na espermatogênese foram realizadas com a droga em pó,
diluída e aplicada via subcutânea, endovenosa ou intraperitonial. Não
existe na literatura estudos utilizando a cocaína crack, droga muito
consumida especialmente pela população jovem, como tóxico
inalatório potencialmente deletério aos tecidos testiculares.
Sendo assim, este estudo visa explorar a via de absorção
inalatória da cocaína através da fumaça de crack, como promotora de
efeitos semelhantes aos encontrados na literatura. Este trabalho
reproduz as condições de exposição dos usuários de forma muito
próxima da realidade nas ruas. Além disso, o uso deste entorpecente
representa um problema de saúde pública com potencial
comprometimento das funções reprodutivas no futuro.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
II. OBJETIVO
OBJETIVO
Objetivo
30
Diante das informações acima citadas, o presente estudo se
propõe a investigar os possíveis efeitos tóxicos da cocaína
inalada sobre a espermatogênese, através da quantificação de
células germinativas produzidas em testículos de camundongos,
jovens e adultos, cronicamente expostos à fumaça de cocaína
crack.
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III. MÉTODO
MÉTODOS
Métodos
32
III.a. Protocolo experimental
III.a.1. Animais
Foram utilizados 60 camundongos machos da linhagem
isogênica Balb/c, em duas diferentes idades:
• 21 dias, representando animais jovens e sexualmente imaturos;
• 60 dias, representando animais adultos e sexualmente maduros.
Os camundongos foram provenientes do Biotério de Criação da
Faculdade de Medicina USP e mantidos no Biotério do Departamento
de Patologia da FMUSP, durante o período experimental, cujas
instalações estão de acordo com as normas do Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals, Intitute of Laboratory Animal Resources,
National Academy of Sciences, Washington, D.C.; 1996 e aos
princípios éticos da legislação brasileira e Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA).
Durante o período experimental, os animais receberam
alimentação comercial balanceada para camundongos e água ad
libitum. Registros periódicos de peso (semanal) e ocorrências de morte
(diário) foram feitos.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
33
III.a.2. Material Teste
A droga cocaína crack foi concedida através de solicitação
oficial ao Delegado Seccional de Marília com fornecimento autorizado
pela 3ª Vara Criminal, Execuções Criminais – Corregedoria dos
Presídios e da Polícia Judiciária – Poder Judiciário da Comarca de
Marília/SP, para exclusivo desenvolvimento deste estudo (Anexo 1).
Foram utilizadas amostras da droga “crack” provenientes da
Delegacia de Investigação sobre Entorpecentes de Marília (D.I.S.E.)
da Polícia Civil de São Paulo – Secretaria dos Negócios da
Segurança Pública. Trata-se de material de uso popular,
apreendido de fonte única, compondo um único lote lacrado (Lacre
nº 0047430) pelo Núcleo de Perícias Médico Legais do Instituto de
Criminalística de Marília – São Paulo, contendo 195,2 g da droga
“in natura”, Anexos 2 e 3.
O material teste foi submetido à análise quanto à porcentagem
de cocaína presente em sua composição pelo Núcleo de Toxicologia
Forense (NTF) do Instituto Médico Legal de São Paulo (IML/SP).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
34
III.a.3. Grupos Experimentais
Todos os animais, 60 machos Balb/c, jovens e adultos, foram
aclimatados às condições de laboratório durante 3 dias antes do
início do ensaio e, posteriormente, divididos ao acaso para a formação
de 4 grupos, 2 expostos e 2 não expostos, a saber:
• Grupo Exposto Jovem: (n=20) camundongos Balb/c, macho
de 21 dias de idade , expostos ao crack.
• Grupo Exposto Adulto: (n=20) camundongos Balb/c, macho
de 60 dias de idade, expostos ao crack.
• Grupos Não Exposto (Controle): representados por 2 grupos
(n=10) de camundongos Balb/c, macho, o primeiro composto
por animais de 21 dias de idade (Jovem) e outro composto por
animais de 60 dias de idade (Adulto), utilizados como controle
negativo, e portanto, mantidos em instalação de biotério sem
sofrer exposição ao crack.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
35
III.a.4. Exposição
Os grupos experimentais de exposição (Jovem e Adulto), foram
submetidos a 5 minutos de exposição à fumaça produzida pela queima
de 5 g de crack, durante 5 dias por semana, por 2 meses. Para tanto,
todo o lote de crack foi pesado e dividido em porções de 5 g, mantido
em recipientes de alumínio (formas de empadas) e coberto por filme
plástico até sua utilização em protocolo de exposição (Figura 9).
Figura 9. Porções de crack preparadas para experimentação.
Figura 9. Recipiente contendo porções 5g de crack.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
36
A fim de simular a uso da droga de forma real, ou seja,
fumada, um modelo de exposição por via inalatória foi
especialmente desenvolvido para o protocolo experimental deste
estudo. Tratou-se de um sistema de exposição de camundongos à
fumaça de crack em câmara de inalação. O sistema foi composto de
3 partes complementares:
1. Artefato de queima e produção de fumaça de crack,
composto de apoio de ferro apoiando o recipiente de alumínio (forma de
empada), contendo 5 g da droga in natura, e sob ela uma chama
produzida por álcool etílico 92,8º INPM em lamparina. O aquecimento
da base do recipiente promoveu o derretimento e queima das pequenas
pedras de crack, produzindo uma fumaça densa pela sublimação dos
compostos voláteis. A fumaça produzida foi represada em funil de
pirex, (Figura 10).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
37
Figura 10. Artefato de queima e produção de fumaça de crack
e
d
b
a
c
Figura 10. Componentes do artefato de queima e produção de fumaça
de crack. a) lamparina; b) pedras de crack em recipiente de alumínio;
c) funil de captura de fumaça; d) mangueira de silicone; e) conector em Y.
2. Câmara de inalação, caixa feita de acrílico incolor transparente
com 45cm de comprimento, 35cm de largura e 13,5cm de altura,
hermeticamente fechada, onde foram instalados simultaneamente os
dois grupos de camundongos expostos, jovem e adulto. Para que os
grupos não se misturassem, foi adaptada uma rede de malha grossa
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
38
disposta de lado a lado, subdividindo a câmara em dois ambientes de
dimensões proporcionais (22,5cm). A fim de que a fumaça produzida
pela queima do crack fosse diretamente conduzida à câmara de
inalação, o funil foi conectado através de mangueiras de silicone
diretamente em um orifício lateral da câmara de inalação (Figura 11).
Figura 11. Câmara de inalação
Figura 11. Câmara de inalação com dois ambientes para exposição
simultânea dos dois grupos de camundongos, (Jovem e Adulto), por 5
minutos/5 dias/semana/2 meses.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
39
3. Controle de fluxo da fumaça, através da criação de pressão
positiva de ar dentro da câmara por meio de bomba de vácuo
conectada, também por mangueiras de silicone, ao orifício de saída de
fumaça, feito na parede lateral oposta àquela de entrada da fumaça na
câmara. A pressão da bomba à vácuo foi controlada por válvula de
vazão e medida em fluxômetro (Figura 12). O fluxo ideal para exposição
foi determinado em 20L/min. O direcionamento da fumaça de crack
produzida para dentro da câmara, então, se deu por pressão negativa
controlada, que permitiu a entrada, total dissipação e posteriormente a
saída da fumaça de crack capturada pelo funil.
A fim de estabelecer também o aporte de oxigênio aos animais
havia também um conector em forma de “Y” na mangueira de entrada
de fumaça para a câmara, permitindo que ar ambiente e fumaça de
crack entrassem na câmara em igual proporção. Esse artifício
também permitiu uma simulação mais real do ato de aspiração de
fumaça de crack.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
40
Figura 12. Controle de fluxo da fumaça
c
a
b
Figura 12. Aparelhos de controle de pressão e fluxo de ar e fumaça no
interior da câmara de inalação. a) bomba de vácuo; b) fluxômetro; c)
válvula controladora de vazão.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
41
Todo o procedimento de exposição conduzido em capela de pressão
negativa de ar, a fim de que o residual de fumaça tóxica produzida fosse
totalmente exaurido para o ambiente externo (Figura 13).
Figura 13. Sistema de exposição animal à fumaça de cocaína crack
Figura 13. Sistema de exposição montado em capela de fluxo ar com
pressão negativa.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
42
Os grupos controle negativos foram formados por animais nas
mesmas condições dos grupos expostos, ou seja, camundongos na
puberdade e adultos, porém não foram expostos ao tóxico durante os
dois meses de suas manutenções.
Durante o período experimental foram medidos os pesos médios
dos animais uma vez por semana. Observações de alterações de
comportamento, bem como, ocorrências de óbitos foram registradas.
III.a.5. Coleta, fixação e preparo de material biológico
Após dois meses de experimentação, os animais foram pesados,
anestesiados e sacrificados para coleta de material biológico, que são:
• Testículos;
• Sangue.
Os dois testículos de cada animal foram retirados e pesados
separadamente. Após microperfurações com agulha de insulina os
testículos foram mantidos 2h em imersão de solução de Bouin e
posteriormente transferidos para solução de álcool 70%. Cada
testículo foi seccionado transversalmente em 3 partes e encaminhados
para confecção de lâminas histológicas de 5µm de espessura. De cada
animal foram feitas, então, 2 lâminas histológicas, uma para cada
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
43
testículo, fixadas em duas colorações específicas: Hematoxilina/Eosina
(HE) e Ácido periódico de Shiff/Alcian Blue (PAS/AB).
A concentração total do crack absorvido pelos animais, foi
determinada através do nível sérico de cocaina no sangue. Para tanto
foi coletado sangue de 10 animais, 1mL de sangue de cada um, logo
após a última exposição, sendo colhidos 10 mL de sangue em tubos
heparinizados. O material hematológico foi encaminhado à Faculdade
de Ciências Farmacêuticas – USP e submetido à análise de
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa.
III.a.6. Parâmetros avaliados em testículo
Foram feitas análises morfométricas quantitativas em
microscopia ótica. Com o auxilio de retículo de pontos como referência
de área analisada e foram medidos os seguintes parâmetros:
• Quantificação de túbulos seminíferos na fase VII em lâminas de
cortes histológicos corados em PAS/AB, nos 3 cortes
transversais de cada testículo/animal, em aumento de 400x;
• Quantificação de células somáticas extratubulares de Leydig
presentes em áreas referência de retículo, em aumento de 200x;
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Métodos
44
• Quantificação de células intratubulares (somática e
germinativas) como sertoli, espermatogônias, espermatócitos,
espermátides arredondadas e espermátides alongadas em um
dos cortes no qual foram analisadas 4 fases VII da
espermatogênese e em cada uma delas dois campos aleatórios,
totalizando 8 leituras por lâmina em aumento de 400x.
III.a.7. Análises estatísticas
Os dados obtidos neste estudo receberam tratamento
estatístico pelas Análises One-Way-ANOVA e Modelo Linear
Multivariado, do programa SPSS V.10. As diferenças foram
consideradas quando p<0,05.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
IV. RESULTADOS
RESULTADOS
Resultados
46
IV.a. Material teste
IV.a.1. Concentração de cocaína no material teste : crack
Uma alíquota do crack, utilizado no protocolo experimental
deste estudo, foi encaminhada para o Núcleo de Toxicologia Forense
(NTF) do Instituto Médico Legal de São Paulo, a fim de detectar e
quantificar a presença de cocaína.
As análises cromatográficas realizadas pela técnica de
cromatografia a gás forneceram resultado POSITIVO para presença de
COCAÍNA, cuja quantificação evidenciou o percentual de 57,66%
desta droga na amostra de crack enviada (Anexo 4).
IV.b. Animais
Durante o período de 2 meses de exposição diária à fumaça de
crack, as medidas de peso dos animais nos diferentes grupos
experimentais apresentaram os seguintes resultados:
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
47
IV.b.1. Peso Animal
Os pesos médios dos grupos animais obtidos através do peso
do grupo/número da amostra e medidos semanalmente durante a
exposição estão discriminados na Tabela 1 e Figura 14. Não foram
encontradas diferenças entre os grupos experimentais neste
parâmetro.
Tabela 1. Pesos Médios dos animais dos diferentes grupos
experimentais
Grupo Peso inicial (g) Peso Final (g)
Controle Adulto
Controle Jovem
Exposto Adulto
Exposto Jovem
21,80
12,10
20,80
11,50
25,90
24,20
23,40
24,50
Tabela 1. Descrição de média de peso inicial e final dos grupos
experimentais. Lembramos que para formação dos grupos jovens
foram utilizados animais recém-desmamados (21 dias de idade) cujo
padrão de peso é em torno de 10-12g. Os dados mostram equivalência
entre os pesos dos grupos experimentais, ao final da experimentação.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
48
Figura 14. Pesos médios dos animais dos grupos experimentais ao
longo do período de exposição.
TEMPO
8ª
sem
a
na
6ª semana
4ª
sem
a
na
3ª semana
2ª
sem
a
na
1ª
sem
a
na
Peso médio (g)
30
20
10
GRUPO
CA
CJ
EA
EJ
Figura 14. O gráfico mostra as curvas dos pesos médios dos animais
dos grupos experimentais, medidos periodicamente (semanal ou
quinzenal) durante o período de estudo. O peso médio atingido pelos
animais do grupo Exposto Jovem durante a 2ª, 4ª e 6ª semana
experimental atinge valores maiores em relação aos obtidos pelos
animais do grupo controle jovem. Os animais do grupo Adulto exposto
ao crack mantiveram pesos médios menores que seu respectivo
controle Adulto não exposto.
Ao final do período experimental de 2 meses, os animais foram
sacrificados e submetidos à necropsia para obtenção dos dados que
deram origem aos seguintes resultados:
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
49
IV.b.2. Concentração Sérica de Cocaína
A amostra de sangue (10 ml) coletada logo após a ultima
exposição animal à inalação de fumaça crack, encaminhada para o
Laboratório de Análises Toxicológicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas – USP, permitiu a detecção de 212,5 ng de
cocaína/mL de sangue ao nível sérico, através da análise de
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa.
IV.b.3. Peso do testículo
Tabela 2. Pesos médios de testículos dos animais dos grupos
experimentais
GRUPO n PESO
MÉDIO
(g)
ERRO
PADRÃO
MÍNIMO
(g)
MÁXIMO
(g)
Controle Adulto
Controle Jovem
Exposto Adulto
Exposto Jovem
10
09
20
18
0,0968
0,0991
0,0880
0,0919
0,0023
0,0019
0,0021
0,0043
0,08
0,09
0,07
0,03
0,11
0,11
0,11
0,11
Tabela 2. Expressos os pesos médios (± Erro Padrão), número amostral (n) e
valores máximos e mínimos de pesos de testículos nos diferentes grupos
experimentais. O peso médio de testículos dos animais Expostos Adultos se
encontram menores com relação ao valor encontrado em seu respectivo grupo
Controle, no entanto não foram encontradas diferenças estatísticas entre os
grupos experimentais no parâmetro peso testicular.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
50
IV.b.4. Túbulos em fase VII
Tabela 3. Quantificação de túbulos em fase VII encontrados em
testículos de animais dos diferentes grupos experimentais
GRUPO n MÉDIA ERRO
PADRÂO
MÍNIMO MÁXIMO
Controle Adulto
Controle Jovem
Tabela 3. Expressas as médias (± Erro Padrão), número amostral (n) e os
valores absolutos mínimos e máximos de túbulos seminíferos em fase
VII de maturação, quantificados em 3 diferentes cortes histológicos de
testículo/animal. O grupo Exposto Jovem apresenta redução do
número de túbulos seminíferos em fase VII quando comparado ao seu
respectivo grupo controle (P=0,023). Os grupos adulto, controle e
exposto, não apresentam diferença significativa entre os valores
encontrados para o mesmo parâmetro.
Exposto Adulto
Exposto Jovem
20
12
30
30
23,316
34,500
17,911
23,911
2,1186
5,2412
1,6247
1,6281
13,7
11,7
3,67
2,00
45,0
75,0
42,3
40,0
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
51
Figura 15. Número de túbulos em fase VII em testículo dos animais
dos diferentes grupos experimentais.
GRUPO
Ex
po
sto
Jo
vem
Ex
pos
to
Adu
lto
Co
ntro
le
Jove
m
C
o
ntrole Adult
o
Túbulos fase VII/testículo (média +- 2 EP)
50
40
30
20
10
Figura 15. Representação gráfica dos valores médios (± Erro Padrão) do
número de túbulos na fase VII encontrados em cortes histológicos de
testículo dos animais nos diferentes grupos experimentais. Pode-se
observar a redução de túbulos nesta fase em ambos grupos expostos
(Adulto e Jovem) em relação aos seus respectivos grupos controles,
com diferença estatística entre os valores médios encontrados entre os
animais dos grupos Jovens (p=0,023).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
52
IV.b.5. Células Somáticas
Figura 16. Quantificação de Células de Sertoli em epitélio seminífero
de camundongos dos diferentes grupos experimentais.
288328160176N =
GRUPO
E
x
p
os
to
Jo
v
em
E
x
p
os
to
Ad
u
lto
Con
tr
ol
e
Jo
v
em
Con
tr
ol
e
A
d
ult
o
Cél. de Sertoli/um (média +- 2 EP)
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1,0
,9
Figura 16. Representação gráfica do numero de células de Sertoli
quantificadas em secções de túbulos seminíferos em fase VII de
maturação de animais dos diferentes grupos experimentais. Houve
redução significativa (p=0,000) no número de células de Sertoli por
comprimento de membrana basal (μm) em epitélio germinativo de
animais jovens expostos ao crack, com relação aos animais jovens não
expostos. O grupo exposto adulto apresenta aumento não significativo
de células de Sertoli quando comparado ao grupo controle adulto.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
53
Figura 17. Quantificação de células de Leydig em região intertubular
de testículo de animais dos diferentes grupos experimentais
GRUPO
E
x
p
os
to
J
o
ve
m
E
xpost
o
Adulto
Con
t
role Jovem
Con
tr
ole
Ad
u
lto
Cél. de Leydig/um² (média +- 2 EP)
70
60
50
40
Figura 17. Representação gráfica da quantificação de células de Leydig
presentes em região intertubular por área de testículo (μm²) de
camundongos dos diferentes grupos experimentais. Houve redução
significativa (p=0,023) no número de células de Leydig em testículos de
camundongos adultos expostos ao crak, com relação aos animais
adultos não expostos.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
54
Tabela 4. Quantificação de células germinativas em epitélio seminífero
de camundongos expostos e não expostos ao crack, em
diferentes períodos de maturação gonadal
TIPO CELULAR GRUPO
MÉDIA ERRO
PADRÃO
N SIGNIFICÂNCIA
Espermatogônia
AC
JC
AE
JE
4,47
4,01
4,34
4,05
0,15
0,21
0,12
0,18
20
18
40
34
Espermatócito
AC
JC
AE
JE
6,56
6,39
6,56
6,87
0,19
0,23
0,13
0,19
20
18
40
34
Espermátide
Redonda
AC
JC
AE
JE
19,67
18,17 *
18,11
21,59 *
0,61
0,52
0,41
0,60
20
18
40
34
* p= 0,001
Espermátide
Alongada
AC
JC
AE
JE
9,56
9,88 *
9,88
7,39 *
0,47
0,51
0,38
0,50
20
18
40
34
*p= 0,005
Tabela 4. Tabela descritiva dos valores médios na quantificação dos
diferentes tipos celulares em epitélio seminífero de camundongos
jovens (J) e adultos (A), expostos (E) ou não expostos (C) à inalação de
5g crack, 5 vezes/semana durante 2 meses. * Diferença significativa
entre valores obtidos através de Comparação Multivariada entre os
grupos relacionados (p<0,005). Houve redução significativa na
população de espermátides alongadas e aumento de espermátides
redondas de animais jovens expostos ao crack, com relação aos seus
respectivos animais controle.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
55
Tabela 5. Quantificação de células germinativas degeneradas em
epitélio seminífero
TIPO CELULAR
degenerado
GRUPO
MÉDIA ERRO
PADRÃO
N SIGNIFICÂNCIA
Células
germinativas
(exceto
espermátide
alongada)
AC
JC
AE
JE
0,11*
0,11#
0,17*
0,24#
0,059
0,070
0,042
0,047
20
18
40
34
*# p< 0.05
Espermátide
Alongada
AC
JC
AE
JE
9,66*
5,53#
12,73*
19,47#
0,47
0,51
0,38
0,50
20
18
40
34
*# p<0,05
Tabela 5. Valores médios e erro padrão obtidos através da
quantificação de tipos celulares germinativos degenerados, presentes
em epitélio germinativo de túbulos seminíferos em fase VII de
maturação, de camundongos jovens (J) e adultos (A), expostos (E) ou
não expostos (C) à inalação crack. *# Diferença significativa entre
valores obtidos através de Comparação Multivariada entre os grupos
relacionados (p<0,005). Houve aumento significativo de degeneração
celular de células germinativas, com maior severidade em espermátides
alongadas, os espermatozóides.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Resultados
56
Figura 18. Degeneração de espermátides alongadas em Epitélio
germinativo de camundongos expostos ao crack.
Controle Jovem Exposto Jovem
Controle Adulto Exposto Adulto
Figura 18. Detalhe da degeneração celular de espermátides alongadas
(setas) em epitélio germinativo durante a fase VII de maturação de
túbulos seminíferos, de camundongos jovens e adultos submetidos à
inalação de crack e em seus respectivos controles. Fotomicrografia em
aumento de 1000x (objetiva de imersão) de corte histológico
transversal de testículo em coloração Hematoxilina/Eosina (HE).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
V. DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
Discussão
58
A análise realizada pela técnica de cromatografia a gás na
amostra cocaína crack, enviada ao Núcleo de Toxicologia Forense
(NTF) do Instituto Médico Legal de São Paulo, forneceu resultado
POSITIVO para presença de COCAÍNA, detectando o percentual de
57,66% de cocaína em sua composição (Anexo 4). Assim, o montante
de cocaína crack adquirido foi considerado adequado para utilização
como substância teste do protocolo experimental deste estudo.
A fim de reproduzir em laboratório os efeitos da cocaína crack
na espermatogênese de usuários jovens e adultos, foi idealizado um
sistema de exposição que simulasse, de maneira experimental, as
condições reais de consumo desta droga, ou seja, fumada. Um
sistema basicamente composto de dispositivo de queima de crack,
câmara de inalação e pressão de ar, permitiu a exposição crônica de
camundongos Balb/c machos em duas fases de maturação de
gônadas, jovens de 21 dias de idade (n=20) e adultos de 60 dias de
idade (n=20), à fumaça produzida pela queima de 5g de crack
cocaína, 5 vezes por semana, durante 2 meses. Outros dois grupos de
camundongos, jovens e adultos (n=10), compuseram os controles
negativos do protocolo experimental, mantidos sem contato com a
droga pelo mesmo período.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
59
A toxicidade da cocaína crack inalada foi avaliada nos
camundongos através dos seguintes parâmetros biológicos:
• Nível sérico de cocaína;
• Peso corpóreo animal (g);
• Mortalidade;
• Peso dos testículos (g);
• Qualidade de maturação do epitélio seminífero através da
quantificação de túbulos na fase VII da espermatogênese;
• Quantificação de células somáticas de suporte à
espermatogênese: Células de Leydig e Células de Sertoli;
• Quantificação de células germinativas normais e degeneradas
do epitélio seminífero: células de Sertoli, espermatogônia,
espermatócitos, espermátides redondas e alongadas;
Em 2 meses de exposição, todos os animais foram mantidos em
biotério de manutenção com controle das condições macro-
ambientais (temperatura, umidade e pureza de ar) e micro-
ambientais (densidade de confinamento, higiene, comida e água ad
libitum), portanto sob conforto mínimo para a manutenção da boa
saúde animal experimental.
Durante o período experimental, os grupos expostos, jovem e
adulto, foram avaliados quanto a possibilidade de alteração de peso
corpóreo provocada pela intoxicação de cocaína inalada, com relação
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
60
aos seus respectivos grupos controle sem contato com a droga. Não
foram tomadas medidas de peso animal individual. Dentro de um
mesmo grupo, os animais foram pesados em conjunto e o peso
coletivo foi fracionado pelo número de animais (n). Os valores médios
de peso inicial obtidos para os grupos jovens controle e exposto foram
12,1g e 11,5g, respectivamente, e para os grupos adultos controle e
exposto foram 21,8g e 20,8g, respectivamente. Os grupos
experimentais deste estudo foram constituídos de maneira aleatória e
previamente às exposições, portanto, o fato de grupos destinados à
inalação de cocaina crack (jovem ou adulto) apresentarem peso médio
inicial menor, com relação aos seus respectivos controles, foi mero
acaso. Ainda, a diferença de peso médio ≤ 1g entre os grupos
relacionados, expostos e controle, não os desclassifica como grupos
homogêneos sob esse parâmetro.
No período de 2 meses de exposição, os animais dos grupos
jovem atingiram os pesos médios finais de 24,2g (controle) e 24,5g
(exposto), mostrando equivalência de crescimento e ganho de peso.
Animais dos grupos adulto atingiram 25,9g (controle) e 23,4g
(exposto), mostrando que a diferença de peso médio inicial, medida
previamente à exposição, é mantida, não podendo ser atribuída à
qualquer efeito da exposição, Tabela 1.
No que se refere à alteração de peso pelo uso de cocaína,
relatos epidemiológicos afirmam que, caracteristicamente, a cocaína
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
61
provoca inapetência em seus usuários, com sintoma de
emagrecimento numa intoxicação crônica (Ferreira Filho, 2001;
Seibel e Toscano Jr, 2001).
Neste estudo, quando distribuímos os pesos médios atingidos
pelos grupos experimentais ao longo do tempo (Figura 14), os animais
adultos expostos apresentam curva de crescimento proporcionalmente
abaixo àquela de seu grupo controle durante todo período de
exposição, sem indicação de emagrecimento.
Diversamente, o crescimento ponderal dos animais do grupo
jovem exposto apresenta flutuações diferentes àquelas apresentadas
pelo seu grupo jovem não exposto. Chegam a obter pesos médios
superiores aos valores atingidos pelos animais de seu grupo controle,
em 3 momentos experimentais: 2ª semana (30 dias de idade e início
da puberdade), 4ª semana (45 dias de idade e puberdade) e 6ª
semana ( 60 dias de idade e início da fase adulta), Figura 14.
Todos os grupos experimentais apresentam decréscimo de peso
entre a 4ª e 6ª semana de exposição Figura 14. Este fenômeno se
expressa de maneira mais acentuada em animais do grupo jovem,
que passam pela maturação sexual (puberdade), com maior
severidade no grupo jovem exposto ao crack. Após a 6ª semana,
quando esses animais jovens iniciam a fase adulta, prosseguem com
peso médio crescente até o final da exposição. No entanto, os valores
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
62
de peso médio registrados durante o período experimental não
apresentaram diferença significativa entre os grupos relacionados.
George et al. (1996) observaram efeito de redução de peso
provocado pela cocaína injetada em ratos jovens, expressado apenas
a partir da idade adulta, caracterizada pela completa maturação das
gônadas. Em estudo experimental, os autores constataram
equivalência de peso entre os animais expostos e controle, durante a
fase de puberdade. A partir da idade adulta e completa maturação
sexual, os pesos médios de ratos expostos passam a apresentar
reduções significativas em relação ao grupo não exposto, que se
intensificam até o final do período experimental (5 meses).
A absorção sistêmica da droga pelos camundongos submetidos
à inalação de fumaça de crack foi comprovada. A amostra de sangue
coletada logo após a última exposição animal à inalação de fumaça de
crack, permitiu a detecção de 212,5 ng de cocaína/mL de sangue ao
nível sérico.
A fumaça de crack é um aerossol inalável de base de cocaína.
Snyder et al. (1987) com o auxílio de modelos de cachimbo para gerar
fumaça de cocaína semelhante àquela inalada por humanos usuários
de crack, demonstraram que 93,5% do produto da combustão do
crack era constituído de partícula, sendo o restante representado por
vapor. Utilizando um impactador de partículas em cascata
determinaram que a dimensão média das partículas geradas era de
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
63
2,3 μm, pequena o suficiente para garantir a deposição em regiões
alveolares de pulmões de primatas. Já em pequenos roedores, por
serem farejadores obrigatórios e consequentemente possuírem olfato
mais sensível e de maior eficiência de sistema de filtragem de
partículas respiradas (mecanismo de defesa muco-ciliar), 90% desta
distribuição de massa em minúsculas partículas seriam retidas nas
vias aéreas superiores, não atingindo deposição alveolar e absorção
sistêmica. Talvez, devido a esta maior proteção no trato respiratório,
a concentração sérica encontrada no sangue dos camundongos deste
estudo (0,0212 mg/L) tenha sido, no mínimo, 10 vezes menor à
documentada em trabalhos clínicos previamente reportados. Em
estudo de autópsias Virmani et al., detectou níveis sangüíneos de
cocaína variando entre 0,3 e 5,3 mg/L, sugerindo a variabilidade de
sensibilidade individual humana em relação à dose letal.
Com relação ao parâmetro mortalidade deste estudo, as perdas
animais somaram a fuga de 01 animal do grupo Controle Jovem e 02
animais mortos do grupo Exposto Jovem, um aos 25 dias e outro aos
37 dias de experimentação. Os óbitos ocorreram durante sua
permanência em biotério e, devido ao estado adiantado de
decomposição, não houve possibilidade de necropsia e definição de
causa mortis. Não se pode definir dose individual nem mesmo creditar
magnitude tóxica à concentração de cocaína detectada no “pool” de
sangue coletado dos animais dos grupos expostos, deste estudo.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
64
Considerando que nenhum animal morreu durante as 24 horas
seguintes a inalação, pode-se deduzir que a dose diária de 5g cocaína
crack, baseada na dose diária consumida por usuários de crack
(Chasin e Salvadori, 1996), foi sub-letal para os camundongos nas
condições deste protocolo experimental. Ainda, sob observação
empírica, nenhum animal apresentou sinais de inanição, lesões
externas ou alteração de comportamento.
Na verdade, à concentração de cocaína detectada no sangue dos
animais deste estudo, pode-se apenas inferir que a droga absorvida
nos pulmões teve perfusão sistêmica e, consequentemente, possível
ação tóxica em qualquer órgão deste modelo experimental mamífero.
De fato, Mule e Misra (1977) injetando subcutaneamente
cocaína radioativa em ratos, observaram concentrações variadas da
droga em diferentes tecidos e órgãos. Os autores relatam que a
afinidade da cocaína por tecidos cerebrais e testiculares é maior com
relação a qualquer outro tecido do organismo.
Os testículos podem ser afetados por substâncias tóxicas
inaláveis que promovem alterações estruturais morfológicas com
expressões na alteração de volume e massa destes órgãos (Watanabe,
2004). Contudo, neste estudo, a assimilação sistêmica da droga por
via inalatória, não promoveu alterações significativas de peso dos
testículos coletados de camundongos expostos ao crack. Ao final do
experimento, os valores de peso médio e erro padrão obtidos para os
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
65
animais do grupo Jovem, controle (0,0991 ± 0,0019) e exposto
(0,0919 ±0,0043), bem como para os animais do grupo Adulto
controle (0,0968 ± 0,0023) e exposto (0,0880± 0,0021), mostram
equivalência. De forma semelhante, o estudo de George et al. (1996),
relata que a exposição crônica (5 meses) à cocaína injetada em ratos
jovens e adultos, não afeta o peso dos testículos.
Em oposição às observações macroscópicas aqui relatadas,
quando submetemos estes órgãos à análise histológica em microscopia
óptica, nítidas manifestações tóxicas da cocaína crack inalada são
expressadas em tecidos testiculares de camundongos expostos.
O primeiro parâmetro quantificado foi o número de túbulos
seminíferos apresentando epitélio em fase VII de maturação
espermatogênica.
Túbulos em fase VII são reconhecidos por apresentarem em seu
epitélio seminífero características de diferenciação celular específicas
no processo de transformação da espermátide redonda em espermátide
alongada. Não envolve divisão celular. É um fenômeno de alteração
morfológica, onde uma célula germinativa redonda adquire a peculiar
forma do espermatozóide, através do desenvolvimento estrutural do
acrossomo. Quando submetemos cortes histológicos de testículo à
coloração específica PAS, estes acrossômos se destacam em vermelho e
são facilmente reconhecidos. Iniciam-se como um botão nas
espermátides redondas em fases precoces de maturação, até sua
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
66
expressão final de composição da cabeça do espermatozóide ou
espermátide alongada. Diante do campo microscópico óptico, podemos
distinguir túbulos na fase VII por apresentarem espermátides redondas
com núcleos encostados à superfície celular e manifestação crescente
de formação do acrossomo, até envolver parte da membrana
citoplasmática num arco de 120 a 150º.
Assim, os túbulos em fase VII foram identificados e
quantificados nas secções histológicas de testículos coletados de
animais dos diferentes grupos animais deste estudo.
A análise morfométrica quantitativa evidenciou a redução
significativa (p=0,023) dos valores médios (±EP) encontrados para o
número de túbulos na fase VII de maturação por parte dos animais
pertencentes ao grupo Exposto Jovem (23,911 ± 1,6281), quando
comparado ao grupo Controle Jovem (34,500 ± 5,2412). Os animais do
grupo Exposto Adulto também apresentaram valores menores para
número de túbulos em fase VII (17,911 ± 1,6247) com relação ao seu
respectivo controle (23,316 ± 2,1186), porém sem diferença significativa.
As 12 fases que compõe a espermatogênese do camundongo
classificam em estágios o processo de maturação do epitélio
seminífero. Durante a fase VII, estão presentes no epitélio seminífero
todos os tipos celulares participam desse processo, incluindo seu
produto final, os espermatozóides, representados pelo alinhamento de
espermátides alongadas com características cabeças encurvadas e
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
67
separadas do material citoplasmático e caudas projetadas em redor
da luz do túbulo.
A redução no número de túbulos em fase VII de maturação por
secção histológica de testículo, pode ser indicativo de que a maturação
do epitélio seminífero não se procede a contento, com chance
aumentada da existência de porções tubulares imaturas ou atrasadas
e possível comprometimento na produção de espermatozóides.
De fato, a Fase VII da espermatogênese é utilizada como
marcador de avaliação para contagem de células germinativas
(George, 1996). Nela foram feitas as quantificações dos tipos celulares
que compõe o epitélio seminífero, descritas neste estudo.
Os valores médios (±EP) determinados na análise morfológica
quantitativa para número de células germinativas apontam aumento
significativo de espermátides redondas (p=0,001) e depleção de
alongadas (p=0,005), em epitélio seminífero de animais do grupo
jovem exposto à cocaína crack (18,17 ± 0,52 e 9,88± 0,51, redonda e
alongada respectivamente) com relação aos animais jovens não
expostos (21,59 ± 0,60 e 7,39 ± 0,50, redonda e alongada
respectivamente. O grupo adulto exposto não apresenta alteração de
número de espermátides redondas e alongadas, com relação ao
epitélio seminífero de seu grupo controle.
Estes resultados mostram que a cocaína tem efeito deletério no
testículo e corrobora com o estudo experimental de Li et al. (1999a),
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
68
que demonstraram o efeito adverso da cocaína injetada, expressado
na redução de espermátides alongadas e conseqüente prejuízo na
produção de espermatozóides em pequenos roedores.
A diminuição de espermátides alongadas por sua vez, estimula
os espermatócitos a se proliferarem, o que aumenta a quantidade de
espermátides redondas, mas uma falha na espermiogênese atrasa a
diferenciação das espermátides (van der Weyden et al., 2006).
Células somáticas de Sertoli e Leydig também exibiram
alterações quando quantificas pela análise morfométrica. No epitélio
seminífero de camundongos expostos, a população de células de
Sertoli (Figura 16) encontra-se significativamente reduzida no grupo
jovem (p=0,000), apresentando valores médios de 1,060 (± 0,47 EP)
e diferentes do seu respectivo controle jovem (1,416 ± 0,070 EP). Os
animais do grupo adulto expostos ao crack tiveram um aumento não
significativo do mesmo tipo celular (1,526 ± 0,425) com relação aos
obtidos pelos animais adultos controle (1,358 ± 0,059) (Figura 17).
No interstício foi observada a redução significativa (p=0,023) da
quantidade média de células de Leydig presentes em testículos de
camundongos adultos expostos ao crack (57,56 ± 1,44EP), com
relação aos valores determinados para os animais adultos não
expostos (62,22 ± 1,69EP).
Além da função de carreamento das células germinativas em
maturação no epitélio seminífero até o lúmem do túbulo seminífero,
as células de Sertoli são responsáveis pela estreita conexão entre o
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
69
sistema linfático/vascular das regiões intertubulares e o epitélio
germinativo no interior do túbulo. Apropriadamente também
chamadas de células ponte (da terminologia inglesa “bridge cells”),
elas transmitem substâncias nutrientes e/ou sinalizadoras às células
germinativas (Russel et al., 1990). As células de Sertoli exibem
numerosos dispositivos de junção à outras células e elementos
acelulares. Estão ligadas a membrana basal do túbulo, umas às
outras no epitélio seminífero e às células germinativas através de
mecanismos de estreita junção entre membranas celulares,
basicamente os desmossomos e as tight junctions. Assim, promovem
a comunicação célula à célula, desempenhando funções mediadoras e
reguladoras da espermatogênese (Russel et al., 1990).
Muito do desenvolvimento de células germinativas é controlado
via hormonal e mediado ao epitélio seminífero através das células de
Sertoli. As células de Sertoli possuem receptores para o hormônio
folículo estimulante (FSH) e para o hormônio testosterona (T), com
respostas bioquímicas e morfológicas específicas ao estímulo de
ambos hormônios, expressadas no epitélio germinativo. A
testosterona é produzida e secretada pelas células de Leydig,
presentes no interstício testicular, e atua como principal estímulo na
diferenciação de células germinativas. Através da barreira hemato-
testicular formada pelas células de Sertoli, a testosterona difunde-se
para os túbulos seminíferos, onde estimula a espermatogênese. A
produção de testosterona, por sua vez, é regulada por um hormônio
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
70
produzido pela hipófise, o hormônio luteinizante (LH), também
conhecido como hormônio estimulante de células intersticiais (ICSH).
A hipófise ainda contribui na espermatogênese pela liberação do
hormônio folículo estimulante (FSH), com ação direta na produção
de proteína androgênica de ligação (ABP) pelas células de Sertoli. A
ABP se liga à testosterona e sua liberação acredita-se ser controlada
pelo feedback negativo, através da produção de um polipeptídeo
chamado inibina, que é também produzido pelas células de Sertoli
(Stevens e Lowe, 1992).
Sendo assim, a regulação endócrina das gônadas masculinas
poderia ser afetada pela injúria causada em células somáticas
testiculares, com efeitos diretos na maturação do epitélio seminífero.
Os resultados de diminuição de espermátides alongadas em testículo
de animais jovens expostos à cocaína, poderia ser conseqüência da
igual redução das células de suporte da espermatogênese, Sertoli e
Leydig, mediadoras de substâncias sinalizadoras do processo de
maturação do epitélio seminífero.
A cocaína provoca desequilíbrio hormonal em homens,
aumentando a liberação de gonadotrofinas que estimulam a hipófise
a liberar LH e FSH, porém a testosterona sérica permanece inalterada
(Heesch et al., 1996). Em estudo experimental George et al. (1996),
demonstraram que ratos cronicamente submetidos à altas doses de
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
71
cocaína injetada não apresentaram alterações significativas no nível
sérico de testosterona, FSH, e LH.
Em cultura de células de Sertoli, a cocaína e seus metabólitos
(benzoilecgonina e ecgonina) causam diminuição na secreção de
transferrina e ABP (Zhang e Loughlin, 1996), mostrando que a
diminuição de células da linhagem germinativa pode ser provocada ou
agravada pela queda nos níveis destas proteínas secretadas pela célula
de Sertoli e reconhecidas pelas células de Leydig, prejudicando a
comunicação endócrina testicular.
Investigações detalhadas sobre a toxicidade da cocaína em
testículo também exploram os mecanismos de ação através de vias
como: afinidade molecular pela presença de sítios de ligação à
cocaína em tecidos testiculares (Li et al., 1997b e 2003b) e constrição
de vasos sangüíneos do testículo (Li et al., 1999c).
Os testículos possuem sítios de ligação específicos para
cocaína. O estudo de Li et al. (1997b) demonstrou a presença de
receptores de membrana (sup 3 H) associados à proteínas do sistema
de captação de dopamina, que se ligam a cocaína de maneira
saturada e específica. A cocaína, um potente agente vasoconstritor,
inibe a captura de dopamina nas terminações nervosas pré-
sinápticas, podendo promover a isquemia de vasos sangüíneos em
tecidos testiculares. Em avaliação do fluxo sangüíneo em testículos
de ratos após administração de cocaína subcutânea, Li et al. (1999c)
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
72
demonstraram o prolongado efeito vasoconstritor e isquemia tecidual.
Assim, a isquemia e a reperfusão pós-esquêmica podem ser
mecanismos pelos quais a cocaína compromete a função da barreira
hemato-testicular e promove dano na espermatogênese.
Os mesmos autores ainda exploram um outro mecanismo de
ação lesiva da cocaína no testículo: a depleção de antioxidantes
testiculares e indução de apoptose em células germinativas via
estresse oxidativo (Li et al., 1999b).
A cocaína é rapidamente metabolizada por vias hidrolíticas
gerando reações oxidativas e radicais superóxidos durante sua
metabolização, além de espécies reativas de oxigênio (ROS) na
metabolização e durante a reperfusão da injúria causada (Li et al.,
1999a).
Dentre os possíveis biomecanismos pelo qual a cocaína exerce
citotoxicidade, o dano oxidativo direto através de espécies reativas
de oxigênio e a subsequente peroxidação lipídica parece ser o mais
importante.
Em tecidos testiculares são encontrados um grande número de
substâncias anti-oxidantes como a glutationa redutase e a glutationa
peroxidase, essenciais na função de detoxificação da célula. Estas
enzimas são agentes antioxidantes de proteção da membrana celular
contra ataques de radicais livres, agindo contra a decomposição
peroxidativa. A redução de substâncias antioxidantes celulares
poderia aumentar a injúria peroxidativa testicular.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
73
Defeitos na produção de esperma em homens inférteis estão
associados ao aumento da peroxidação lipídica e prejuízo na função
de enzimas antioxidantes no espermatozóide (Aitken et al., 1989
apud Li et al., 1999b).
Li et al. (1999b) descrevem a redução de glutationa redutase e
glutationa peroxidase em testículo de ratos submetidos à injeção
crônica de cocaína, mostrando que os efeitos adversos da cocaína nos
testículos podem advir de distúrbios funcionais da defesa anti-
oxidativa e conseqüente peroxidação lipídica em tecidos testiculares.
A peroxidação lipídica gera radicais livres mediadores de uma
reação em cadeia que, uma vez iniciada resulta na destruição da
membrana lipídica promovendo citotoxicidade (Rosenblum et al.,
1989 apud Li et al., 1999b). A membrana testicular é rica em
gorduras poli-insaturadas, o que faz dos testículos substratos
primordiais para a injúria peroxidativa (Li et al., 1999b). Sendo
assim, o processo de peroxidação lipídica poderia explicar a
degeneração de células do epitélio seminífero.
No presente estudo, foram detectadas degenerações de células
germinativas em todos os animais expostos à inalação de cocaina
crack. Houve aumento significativo (p≤0,05) de degeneração em todos
tipos celulares germinativos, com maior severidade em espermátides
alongadas, (Tabela 5).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
74
A análise morfométrica quantitativa para células germinativas
apontou que o tipo celular mais sensível à degeneração pela ação da
inalação do crack foi a espermátide alongada, com proporções 80
vezes maiores (até 19,47 cél./µm) com relação ao conjunto de
degerações encontradas em espermatogônias, espermatócitos e
espermátides redondas (até 0,24 cél./µm). Ainda, camundongos
jovens mostraram ser mais susceptíveis ao dano.
Animais expostos jovens apresentaram valores médios de
degenaração de espermátides alongadas (19,47 ± 0,50 EP) e para
demais tipos celulares germinativos (0,24 ± 0,047EP), superiores aos
encontrados em animais adultos expostos (12,73 ± 0,38EP e 0,17 ±
0,042EP, respectivamente). Os valores encontrados para degeneração
celular em tipos celulares germinativos (exceto espermátide alongada)
para os animais dos grupos controle, são equivalentes (0,11 ±
0,059EP e 0,11 ± 0,70EP, adulto e jovem). Interessantemente,
animais adultos controle possuem número de degeneração em
espermátide alongada (9,66 ± 0,47) superior ao encontrado em
camundongos controle jovem (5,53 ± 0,51EP).
O efeito citotóxico da cocaína em células germinativas também
poderia ser explicado através do fenômeno natural de apoptose
celular, potencializado pelo estresse oxidativo.
Li et al. (1999a) descreve que a geração de ROS pela
administração de cocaína, injetada em ratos jovens, possivelmente está
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
75
envolvida na ativação da apoptose de células germinativas. Entretanto,
outros importantes genes e moléculas de ativação apoptótica, como
bcl-2/bax, ligante Fas e p53, estão presentes no testículo.
A indução à apoptose de células germinativas é promovida por
um sistema ativo de programação de morte celular. O testículo possui
naturalmente um sistema ativo de sobrevivência e morte celular que
trabalham juntos na regulação da produção de células germinativas. A
proliferação de células germinativas normalmente é excessiva e um
sistema regulador de apoptose fisiológica otimiza a produção destas
células ao nível sustentável pelo epitélio germinativo. Um sistema
apoptótico deficiente em espermatogônias imaturas pode ocasionar a
super-população destas celulas no epitélio seminífero, ocupando lugar
de células germinativas maduras. A ocorrência excessiva de apoptose
pode resultar na produção insuficiente de células germinativas
maduras. Ambos processos, apoptose deficiente ou excessiva, levam à
redução de produção de espermatozóides (Boekelheide, 2005).
O funcionamento da apoptose depende de uma família de
proteínas, as caspases, que estão inativas sob a forma de
procaspases. Estas são ativadas quando proteínas adaptadoras as
unem e esta proximidade faz com que se clivem mutuamente. O sinal
para esta ativação pode ser extrínseco sendo que ocorre ativação de
receptores de morte presentes na superfície das células o que leva à
ativação das caspases. A ativação intrínseca ocorre quando uma
célula por estresse ou dano celular promove a agregação das
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
76
procaspases e ativação de dentro da célula. Estes dois mecanismos
ocorrem sob a regulação de famílias de proteínas reguladoras, como a
família Bcl-2, que tem membros pró e anti apoptóticos e a família
IAP, inibidora de apoptose (Alberts et al, 2004).
No início da adolescência uma onda apoptótica ocorre nas células
germinativas masculinas, sendo este um evento raro no adulto e que
afeta principalmente as espermatogônias (Rodriguez et al, 1997). Essa
onda espontânea limita as células germinativas que cada célula de
Sertoli pode suportar (Richburg, 2000), assim, há equilíbrio entre
proliferação e morte nos testículos, havendo para isso um sistema pró e
anti-apoptótico. Como há alta taxa proliferativa, a apoptose garante o
número adequado de células germinativas que podem ser
adequadamente mantidas em epitélio seminífero, sendo que o seu
desequilíbrio, tanto a redução quanto o aumento de apoptose, provoca
menor liberação de espermatozóides (Boekelheide, 2005). Um dos
mecanismos que provocam este fenômeno entre as células germinativas
é o desequilíbrio na expressão de proteínas pró-apopticas, como a
proteína bax e anti-apoptóticas como bclxL da família bcl/2, que são
fundamentais para a onda apoptótica (Rodriguez et al., 1997).
Ainda, a cocaína pode induzir apoptose em células testiculares
de animais tratados, pela liberação de citocromo c da mitocôndria
para o citoplasma e pelo aumento na ativação das caspases-3 e 9
(Li et al., 2003a).
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Discussão
77
Fica claro, então, que o uso da cocaína afeta a
espermatogênese com redução de proteínas importantes para a
maturação do espermatozóide, aumento do estresse oxidativo,
alteração do fluxo sangüíneo, alterações morfométricas, diminuição
da população de células da linhagem germinativa e maior quantidade
de células degeneradas e de apoptose.
No entanto, todas as pesquisas sobre os efeitos tóxicos da
cocaína na espermogênese, citadas e relacionadas a este estudo,
foram realizadas com a cocaína em pó diluída e aplicada via
subcutânea, via endovenosa ou via intraperitonial. Não foi
encontrado na literatura nenhum relato utilizando a exposição
biológica à cocaína sob a forma de crack.
Os resultados descritos neste estudo, demonstram que a cocaína
crack inalada promove efeitos deletérios em tecidos testiculares,
semelhantes aos investigados com cocaína via injetada, com principal
expressão na redução de células germinativas. Ainda, que a toxicidade
que inalação crônica de cocaína crack exerce no testículo é mais severa
quando as gônadas masculinas atravessam a puberdade.
A cocaína crack, uma droga barata e fácil de adquirir, é
consumida primordialmente por usuários jovens, incluindo
adolescentes e crianças. Portanto, este estudo experimental incita o
problema de saúde pública de comprometimento da qualidade
reprodutiva desta e de futuras gerações.
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
VI. CONCLUSÕES
CONCLUSÕES
Discussão
79
A partir dos resultados obtidos pela exposição crônica de
camundongos machos, em diferentes estágios de maturação gonadal,
à fumaça de cocaína crack, concluiu-se que:
¾ Houve absorção sistêmica da droga em expostos, comprovada
através da determinação da concentração de cocaína sérica;
¾ Não houve alteração de peso corpóreo e de testículos em
animais expostos;
¾ A cocaína inalada através da fumaça de crack promoveu efeito
tóxico em tecidos testiculares;
¾ A toxicidade da cocaína crack foi caracterizada pela redução de
tipos celulares, somáticos e germinativos, de participação na
espermatogênese;
¾ A citotoxicidade na espermatogênese foi expressada pela
degeneração de células germinativas;
¾ Os efeitos tóxicos promovidos na espematogênese de
camundongos expostos à cocaína crack apresentaram maior
severidade em animais jovens, expostos durante a fase de
maturação de gonadas;
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
VII. ANEXOS
ANEXOS
Anexos
81
ANEXO 1
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Anexos
82
ANEXO 2
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Anexos
83
ANEXO 3
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
Anexos
84
ANEXO 4
Tese de Doutorado Júlio Cezar Zorzetto
VIII. REFERÊNCIAS
REFERÊNCIA
S
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