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Gabriella Di Giunta
Células dendríticas, expressão da forma
induzida da óxido nítrico sintase e padrão de
citocinas nas lesões de pitiríase liquenóide
Tese apresentada a Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para a obtenção do
título de doutor em Ciências
Área de concentração: Patologia
Orientadora: Profa. Dra. Mirian Nacagami Sotto
São Paulo
2008
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
©reprodução autorizada pelo autor
Di Giunta, Gabriella
Células dendríticas, expressão da forma induzida da óxido nítrico sintase e
padrão de citocinas nas lesões de pitiríase liquenóide / Gabriella Di Giunta. --
São Paulo, 2008.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Departamento de Patologia.
Área de concentração: Patologia.
Orientadora: Mirian Nacagami Sotto.
Descritores: 1.Pitiríase liquenóide/fisiopatologia 2.Óxido nítrico
3.Imunoistoquímica 4.Interleucinas/análise
USP/FM/SBD-027/08
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Dedicatória
Ao meu marido Luis Fernando por ser ele tudo o que eu sempre
desejei, pelo seu enorme amor e dedicação a mim e pela
satisfação com conquistas minhas mais do que com as próprias.
Ao meu filho Luis Felipe que dividiu com esta tese a atenção
nestes primeiros e preciosos momentos da sua vida.
Aos meus pais Alice e Giovanni, por terem me ensinado a prezar
a busca pelo conhecimento, e terem me proporcionado uma
criação primorosa baseada no amor sendo esta o reflexo de tudo
o que eu tenho e sou hoje.
Aos meus irmãos Loretta, Valeria, Giovanni e Leonardo, que
tornam a minha família ainda melhor.
Ao meu avô Carmelo que como um apaixonado pela medicina, foi
um grande inspirador.
Aos meus sogros Madi e Ayrton Funchal, por sua genialidade e
por terem me dado ainda mais provas de que o conhecimento e a
cultura são elementos indispensáveis para o crescimento.
Agradecimentos especiais
A minha orientadora Dra Mirian que é o um ideal de orientadora,
de profissional e de pessoa, agradeço pela oportunidade de ter
trabalhado ao seu lado.
A Dra Helena Muller, por ter me iniciado, a duras penas mas com
um brilhantismo único, no campo da Dermatopatologia.
A amiga Claudia pela sua paciência, inteligência e boa disposição
em fazer as mais diversas coisas para que tudo fosse mais fácil
para mim.
A Ana Maria, também uma amiga, que me mostrou o que é ser
competente, caprichosa e comprometida simplesmente pelo
prazer de sê-lo.
A Cristina, Jaqueline e Ivete, pelos maravilhosos cortes das
minhas lâminas, e por terem me ouvido e dado atenção as
minhas angústias.
A Carla e Elaine que foram incansáveis em conseguir algumas
reações “impossíveis”, feitas sempre com um enorme sorriso no
rosto.
A Fernanda, Rose; Rosana, Nayura, pelos conselhos e por terem
me aceitado no seu ambiente de trabalho tão alegre e me
auxiliado sempre com enorme carinho e disposição.
A todos os funcionários da dermatologia que sempre me trataram
como se eu fosse um deles
Aos colegas de trabalho do IDAP e do Hospital Universitário em
Florianópolis, por terem me aceitado e compreendido as minhas
freqüentes ausências durante estes quatro anos.
Epígrafe
As it takes two to make a quarrel,
so it takes two to make a disease,
the microbe and its host.
Charles V. Chapin
Esta tese está de acordo com:
Referências: adaptado de International Committee of Medical
Journals Editours (Vancouver).
Universidade São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de
Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de
dissertações, teses e monografiasda FMUSP. Elaborado por
Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Júlia A.L. Freddi, Maria F.
Crestana, Marinalva de S. Aragão, Suely C. Cardoso, Valéria
Vilhena. São Paulo: Serviço de Biblioteca e Documentação; 2004.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of
Journals Indexed in Index Medicus.
Sumário
Lista de Abrevisturas
Lista de Símbolos
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Anexos
Resumo
Summary
1. Introdução ................................................................................................ 1
1.1 Resposta imune cutânea na Pitiríase liquenóide................................. 5
1.2 Óxido nítrico ........................................................................................ 6
2. Objetivos................................................................................................... 8
3. Revisão da literatura.............................................................................. 11
3.1 Histórico ............................................................................................ 12
3.1.1 Epidemiologia ......................................................................... 13
3.1.2 Quadro Clínico........................................................................ 13
3.1.3 Histopatologia......................................................................... 15
3.1.4 Fisiopatologia e Etiologia........................................................ 17
3.1.5 Tratamento ............................................................................. 23
3.2 Óxido Nítrico...................................................................................... 24
3.2.1 Mecanismo de Ação ............................................................... 26
3.2.2 O Óxido Nítrico e a Pele ......................................................... 26
4. Métodos .................................................................................................. 37
4.1 Seleção da Amostra .......................................................................... 38
4.1.1 Estratificação da Amostra....................................................... 38
4.1.2 Grupo Controle ....................................................................... 39
4.2 Avaliação Histopatológica ................................................................. 40
4.3 Imunoistoquímica .............................................................................. 41
4.3.1 Demonstração das Células Dendríticas CD1A+
(LANGERHANS)..................................................................... 42
4.3.2 Demonstração das Células Dendríticas FXIIIa+ ..................... 43
4.3.3 Demonstração da Expressão de iNOS ................................... 44
4.3.4 Demonstração de TNF alfa..................................................... 45
4.3.5 Demonstração de IL-10, IL-12 e IFN gama............................. 46
4.4 Análise Morfométrica......................................................................... 47
4.5 Análise da Expressão de Citocinas na Epiderme.............................. 48
4.6 Análise Estatística ............................................................................. 48
4.7 Ética .................................................................................................. 50
5. Resultados.............................................................................................. 51
5.1 Caracterização da Amostra............................................................... 52
5.1.1 Dados Clínicos........................................................................ 52
5.1.2 Dados Histopatológicos .......................................................... 57
5.1.3 Células Dendríticas Epidérmicas (CD1a+) ............................. 61
5.1.4 Células Dendríticas Dérmicas (FXIIIa+).................................. 63
5.1.5 Expressão de iNOS ................................................................ 65
5.1.6 Expressão de TNF alfa ........................................................... 71
5.1.7 Expressão de IFN gama ......................................................... 73
5.1.8 Expressão de IL-12................................................................. 76
5.1.9 Expressão de IL-10................................................................. 78
6. Discussão............................................................................................... 81
7. Conclusão............................................................................................... 98
8. Anexos.................................................................................................. 101
9. Referências........................................................................................... 110
Lista de Abreviaturas
PL Pitiríase liquenóide
PLA Pitiríase liquenóide aguda
PLC Pitiríase liquenóide crônica
PLEVA Pitiríase liquenóide e variceliforme aguda
DMHF Doença de Mucha-Habermann forma febril ulcero-necrótica
IL Interleucina
IL-8 Interleucina 8
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
TNF Fator de necrose tumoral
INF Interferon
FXIIIa Fator XIIIa
cél. célula
CD1a “Cluster Differentiation” 1a
CD25 “Cluster Differentiation” 25
CD3 “Cluster Differentiation” 3
CD7 “Cluster Differentiation” 7
CD8+ “Cluster Differentiation” 8
CD4+ “Cluster Differentiation” 4
CD62L Selectina L
TIA-1 Proteína citotóxica de linfócitos TIA-1
CLA “Cutaneous Lymphocyte-associated antigen”
LCCT Linfoma cutâneo de células T
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
iNOS Forma induzida da oxido nítrico sintase
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial
nNOS Óxido nítrico sintase neural
IQH Imunoistoquímica
ISH Hibridização “in situ”
et.al. e colaboradores
Apud Junto à (preposição latina-citação indireta).
LT Linfócito T
Ti Linfócito T inativo
Ta Linfócito T ativado
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
Th Linfócito T auxiliar
LPS Lipopolissacaride
ROS espécimes reativas de oxigênio
RNS espécimes reativas de nitrogênio
UV Raios ultravioleta
UVB Raios ultravioleta B
UVA Raios ultravioleta A
HIV Vírus da imunodeficiência humana
CMV Citomegalovirus
EBV Vírus Epstein-Barr
VVZ Vírus varicela-zoster
VHC Vírus da Hepatite C
FA Fração de área
CL Células de Langerhans
APC Células apresentadoras de antígenos
TCR Receptor de superfície do linfócito T
CL Células de Langerhans
APC Célula apresentadora de antígeno
MxA Proteína de resistência ao myxovirus
PAMPs Padrões moleculares associados à patógenos
LPS Lipopolissacaride
TLR Receptor do tipo “Toll”
GMPc Guanil ciclase monofosfato cíclico
DNA Ácido desoxirribonucléico
NET necrólise epidérmica tóxica
SSJ Síndrome de Stevens-Johnson
NF-κB Fator nuclear kappa B
Bcl2 Proteína Bcl2
HSP 70 Proteína de choque térmico 70
Bax Proteína Bax
p53 Proteína p53
O
2
–
Ânion superóxido
HNOO
-
Peroxinitrito
cp Campo microscópico
m média aritimética
S-NO S-Nitrosotiol
Lista de Símbolos
μm micrômetro
px pixel
% porcentagem
n tamanho da amostra
≤ menor ou igual
<= menor ou igual
χ
2
Qui-quadrado
α Alfa
γ Gama
β Beta
Lista de Figuras
Figura 1 - Teoria dos superantígenos: Possível mecanismo responsável
pela indução de lesões cutâneas na pitiríase liquenóide
aguda 19
Figura 2 - Efeitos pró e anti - apoptóticos do óxido nítrico 28
Figura 3 - Produção de óxido nítrico após radiação ultravioleta 29
Figura 4 - Mecanismos antivirais do óxido nítrico 32
Figura 5 - Efeitos regulatórios do óxido nítrico sobre a proliferação de
linfócitos T 34
Figura 7 - Pitiríase liquenóide aguda (doente correspondente ao caso
sete) 53
Figura 8 - Pitiríase liquenóide crônica (doente correspondente ao
caso 11)
53
Figura 9 - Pitiríase liquenóide aguda 58
Figura 10 - Pitiríase liquenóide crônica
59
Figura 11 - Células dendríticas CD1a+ epidérmicas em lesões de
pitiríase liquenóide aguda e crônica 62
Figura 12 - Distribuição de dendrócitos dérmicos FXIIIa+ em lesão de
pitiríase liquenóide crônica
64
Figura 13 - Expressão de iNOS na epiderme de lesões de pitiríase
liquenóide crônica 67
Figura 14 - Expressão de iNOS na derme nas lesões de pitiríase
liquenóide aguda e crônica 68
Figure 15 - Expressão de iNOS na epiderme e derme nos controles
de pele normal e na reação com omissão do anticorpo
primário 69
Figura 16 - Expressão de TNF alfa na pitiríase liquenóide crônica e
aguda 73
Figura 17 - Expressão de IFN gama na pitiríase liquenóide crônica 74
Figura 18 - Expressão de IL-12 em lesões de pitiríase liquenóide
crônica 77
Figura 19 - Expressão de IL-10 nas lesões de pitiríase liquenóide
crônica 79
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Resumo dos estudos relatando a associação da pitiríase
liquenóide com diferentes agentes infecciosos........................102
Tabela 2 - Resumo dos estudos relatando a detecção de clonalidade
no rearranjo dos genes do TCR em lesões de pitiríase
liquenóide ................................................................................103
Tabela 3 - Subclassificação clinica e histopatológica das formas aguda e
crônica da doença e avaliação de dados clínicos e das
alterações histopatológicas nas biópsias de lesões de
pitiríase liquenóide ....................................................................104
Tabela 4 - Avaliação do número de linfócitos intra-epidérmicos e
análise semi-quantitativa das alterações histopatológicas
da epiderme e derme nas biópsias de lesões de pitiríase
liquenóide ................................................................................105
Tabela 5 - Diagnóstico histopatológico e avaliação quantitativa das
células dendríticas cutâneas, expressão epidérmica e
dérmica de iNOS e dérmica do fator de necrose tumoral
alfa, interferon gama e das interleucina 10 e 12 nas
biopsias de lesões de pitiríase liquenóide................................107
Tabela 6 - Diagnóstico histopatológico e avaliação semi-quantitativa
da expressão das interleucina 10 e 12, interferon gama e
fator de necrose tumoral alfa na epiderme nas biopsias de
lesões de pitiríase liquenóide...................................................108
Lista de Anexos
Anexo A: Tabela 1 - Resumo dos estudos relatando a associação da
pitiríase liquenóide com diferentes agentes infecciosos ............102
Anexo B: Tabela 2 - Resumo dos estudos relatando a detecção de
clonalidade no rearranjo dos genes do TCR em lesões de
pitiríase liquenóide .....................................................................103
Anexo C: Tabela 3 - Subclassificação clinica e histopatológica das
formas aguda e crônica da doença e avaliação de dados
clínicos e das alterações histopatológicas nas biópsias de
lesões de pitiríase liquenóide.....................................................104
Anexo D: Tabela 4 - Avaliação do número de linfócitos intra-
epidérmicos e análise semi-quantitativa das alterações
histopatológicas da epiderme e derme nas biópsias de
lesões de pitiríase liquenóide.....................................................105
Anexo E: Figura 6 - Metodologia computacional utilizada na
determinação da fração de área (FA) ........................................106
Anexo F: Tabela 5 - Diagnóstico histopatológico e avaliação
quantitativa das células dendríticas cutâneas, expressão
epidérmica e dérmica de iNOS e dérmica do fator de
necrose tumoral alfa, interferon gama e das interleucina 10 e
12 nas biopsias de lesões de pitiríase liquenóide ......................107
Anexo G:
Tabela 6 - Diagnóstico histopatológico e avaliação semi-
quantitativa da expressão das interleucina 10 e 12, interferon
gama e fator de necrose tumoral alfa na epiderme nas
biopsias de lesões de pitiríase liquenóide..................................
108
Anexo H: Aprovação pelo comitê de Ética e Pesquisa..............................109
Resumo
Di Giunta G. Células dendríticas, expressão da forma induzida da óxido nítrico
sintase e padrão de citocinas nas lesões de pitiríase liquenóide [tese].São
Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2008. 123p.
INTRODUÇÃO: A Pitiríase liquenoide (PL) é doença cutânea de etiologia
desconhecida. Foi recentemente classificada no grupo das discrasias
linfóides de células T. Excetuando-se os estudos sobre as características
fenotípicas e moleculares dos linfócitos T na PL, trabalhos relativos aos
demais componentes da resposta tecidual cutânea nesta doença são
escassos. MÉTODOS: Biopsias de 34 de pacientes com diagnóstico clínico
e histopatológico de PL foram classificadas de acordo com características
histopatológicas nos grupos de pitiríase liquenóide aguda (PLA) (n = 15) e
crônica (PLC) (n = 19), e submetidas a técnicas imunoistoquímicas para
demonstração de células de Langerhans, dendrócitos dérmicos fator XIIIIa+,
expressão da forma induzida da óxido nítrico sintase (iNOS), fator de
necrose tumoral alfa (TNFα), interferon gama (IFNγ) e interleucinas (IL) 12
e 10. Fez-se a comparação dos resultados obtidos entre os grupos de PLA e
PLC. A expressão de iNOS foi comparada com grupo de pele controle
normal (n = 10). RESULTADOS: A população de células de Langerhans
epidérmicas foi menor no grupo de PLA. O número de dendrócitos dérmicos
fator XIIIa+ não diferiu entre os grupos. Foi observada expressão epidérmica
e dérmica de iNOS em ambos os grupos de PL. Três espécimes do grupo
controle de pele normal apresentaram fraca expressão de iNOS epidérmica
e dérmica. O grupo de lesões de PLA mostrou maior expressão dérmica de
TNFα e IFNγ. A depleção de células de Langerhans epidérmicas foi
acompanhada de maior expressão epidérmica de TNFα e IL-10. Houve
correlação entre a expressão de iNOS e a população de dendrócitos
dérmicos fator XIIIa+. CONCLUSÕES: Na PLA a população de células de
Langerhans é menor que na PLC e se correlacionou com maior expressão
epidérmica de TNFα e IL-10. Não houve diferenças na população de
dendrócitos dérmicos fator XIIIa+ nos dois grupos de lesão. Demonstrou-se,
pela primeira vez, expressão epidérmica e dérmica de iNOS nas lesões de
PL. A expressão de iNOS dérmica correlacionou-se com a população
dendrocítica Fator XIIIa+. Houve correlação entre a expressão de TNFα e de
IFNγ com as alterações inflamatórias da PLA. Houve correlação negativa
entre a expressão dérmica de IL-12 e IL-10 nas lesões da PL. No espectro
da resposta tecidual da PL participam as células dendríticas da pele, em
ambiente de padrão imunológico Th1 predominante, com conseqüente
indução da expressão de iNOS nos sítios de lesão.
Summary
Di Giunta G. Dendritic cells, inducible nitric oxide synthase and citokines
expression in pityriasis lichenoides skin lesions [thesis]. São Paulo:
“Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2008. 123p.
BACKGROUND: Pityriasis lichenoides (PL) is a cutaneous disease of
unknown etiology which has been regarded as an immunologically mediated
reaction. Recently, it was reclassified in the group of Cutaneous Lymphoid T
cell Dyscrasia. There are few reports addressing mainly T cell subsets in PL
tissue reaction. METHODS: Skin biopsies taken from 34 patients with
confirmed diagnosis of PL where classified as pityriasis lichenoides et
varioloformis acuta (PLEVA) (n = 15) and pityriasis lichenoides chronica
(PLC) (n = 19) according to histopathological features. The skin biopsies
where subjected to immunohistochemical technique to demonstrate
Langerhans cells, Factor XIIIa+ dermal dendrocytes, inducible nitric oxide
synthase (iNOS) expression, tumor necrosis factor alfa (TNFα), interferon
gama (IFNγ) and interleukins (IL) 12 and 10. The ensuing results were
compared among the two PL groups. The iNOS results in PL group were also
compared to a normal skin control group (n = 10). RESULTS: In PLEVA
lesions, there was a decrease in Langerhans cells population when
compared to PLC lesions. The factor XIIIa+ dermal dendrocytes number did
not differ among PL groups. There was a strong epidermal and dermal iNOS
expression in both PL groups. A faint iNOS expression was observed in three
specimens of the control group. A higher TNFα and INFγ expression was
observed in PLEVA lesions. The Langerhans cells decrease observed in
those lesions was accompanied by higher TNFα and IL-10 expression. There
was a significant correlation between factor XIIIa+ dermal dendrocytes
population and dermal iNOS expression. CONCLUSIONS: PLEVA lesions
displayed a decrease in Langerhans cells number, accompanied by higher
TNFα and IL-10 expression. There was no difference in the amount of factor
XIIIa+ dermal dendrocytes in PLEVA and PLC lesions. The study
demonstrated, for the first time, the iNOS expression in PL lesions. The
factor XIIIa+ dermal dendrocytes population correlated to dermal iNOS
expression. TNFα and INFγ expression correlated to inflammatory alterations
observed in PLEVA lesions. There was a negative correlation between IL-12
and IL-10 expression in PL lesions. Dendritic cells participate in the PL
spectrum of tissue reaction which is characterized by predominant TH1
cytokines milieu that favors iNOS expression.
1. Introdução
Introdução
2
A Pitiríase liquenóide é uma doença inflamatória cutânea de etiologia
desconhecida. Duas variantes clínico-patológicas espectrais têm sido
descritas, uma forma aguda, caracterizada como pitiríase liquenóide e
variceliforme aguda (PLA) ou doença de Mucha-Habermann, e uma a forma
crônica, denominada pitiríase liquenóide crônica (PLC). A forma aguda (PLA)
incide principalmente nas duas primeiras décadas de vida, caracterizada
clinicamente pela presença de lesões polimórficas, com pápulas
eritematosas evoluindo para vesículas hemáticas, ulceração e necrose,
sendo geralmente autolimitada, cursando ao longo de várias semanas.
A forma crônica (PLC) acomete pacientes mais velhos, sendo caracterizada
por erupção monomórfica liquenóide pápulo-descamativa muitas vezes
evoluindo para lesões cicatriciais hipocrômicas, neste caso as lesões podem
persistir por meses ou anos. Ambas as formas exibem uma tendência a
episódios de recrudescimento (Ersoy-Evans et al., 2007). Uma terceira forma
foi descrita por Degos em 1966, denominada doença de Mucha-Habermann
febril (DMHF), sendo classificada como um subtipo úlcero-necrótico da PLA,
associado à presença de hipertermia e curso clínico muitas vezes
fatal(Degos et al., 1966). Apesar da separação em subtipos, a maioria dos
autores acredita em uma única doença espectral com lesões de ambas as
formas clínicas podendo ser encontradas em um mesmo paciente (Black e
Marks, 1972; Romani et al., 1998; Shieh et al., 2001; Tomasini et al., 2004).
Introdução
3
As lesões de PL caracterizam-se, ao exame histopatológico, por
variável intensidade de alterações epidérmicas representadas por
degeneração vacuolar dos queratinócitos basais, espongiose e exocitose de
linfócitos e hemácias, paraqueratose focal, e apoptose de queratinócitos.
As alterações dérmicas constituem-se por infiltrado inflamatório,
predominantemente superficial, composto por linfócitos e hemácias
extravazadas. Os critérios histopatológicos para a diferenciação entre as
formas espectrais, e que favorecem o diagnóstico da forma aguda da
doença, são a presença de queratinócitos apoptóticos, ausência e/ou
adelgaçamento importante da camada granulosa, presença de envolvimento
do plexo vascular profundo e infiltrado inflamatório em forma de “cunha”
(Romani et al., 1998). Apesar disso, em muitos casos não há
correspondência clínico-patológica em relação ao diagnóstico do subtipo da
PL (Tomasini et al., 2004).
O infiltrado inflamatório na PL é composto principalmente por linfócitos
T, com células T CD8+, predominando na PLA (Muhlbauer et al., 1984), e
linfócitos T CD4+ na PLC (Shieh et al., 2001). Estudos posteriores, com um
maior número de casos e metodologia mais rigorosa sugerem, entretanto, a
presença de um mecanismo citotóxico comum em ambas as formas da
doença. Esta hipótese sugere que como evento primário, ocorra uma
perturbação da homeostase dos queratinócitos, provavelmente em resposta
a um patógeno, com subseqüente ativação de células T citotóxicas efetoras
(Tomasini et al., 2004).
Introdução
4
Apesar do grande número de trabalhos publicados sobre a doença, a
verdadeira natureza da PL ainda é desconhecida. Estudos recentes têm
relatado com variável freqüência a presença de rearranjo monoclonal dos
genes do receptor de células T (TCR) (Dereure et al., 2000; Shieh et al., 2001;
Magro et al., 2002; Weinberg et al., 2002) em ambas as formas de PL. Esses
achados, associados a presença de um evento desencadeante desconhecido,
ao curso clinico crônico e recalcitrante, além da possibilidade de evolução da
lesão para linfoma cutâneo de células T (CTCL), justificam a inclusão da PL
no recém concebido grupo das Discrasias Linfóides de células T (Guitart e
Magro, 2007). Todavia, raros são os relatos de progressão de PL para linfoma
cutâneo de células T (Fortson et al., 1990; Thomson et al., 1999). Estudos
recentes, com casuística expressiva e longo tempo de acompanhamento de
pacientes com PL, não demonstraram nenhum caso de evolução para CTCL
(Gelmetti et al., 1990; Ersoy-Evans et al., 2007; Wahie et al., 2007).
Em contrapartida, outros autores consideram a PL como processo
reativo benigno, possivelmente secundário à resposta imune anormal frente
a diferentes microorganismos. Algumas características como o agrupamento
de casos em determinadas épocas do ano, incidência familiar, a presença de
títulos sorológicos elevados para determinados agentes infecciosos e a
melhora das lesões com tratamento patógeno-específico, corroboram com
esta teoria (Dupont, 1995; Klein et al., 2003; Ersoy-Evans et al., 2007).
Por outro lado, a maior parte destes estudos é limitada, por tratar-se de
relatos de casos isolados com detecção da suposta infecção por técnicas
sorológicas e moleculares, na vigência da erupção cutânea.
Introdução
5
1.1 Resposta imune cutânea na Pitiríase liquenóide
Excetuando-se os estudos sobre as características fenotípicas e
moleculares dos linfócitos T na PL, trabalhos relativos aos demais
componentes da resposta tecidual cutânea nesta doença são escassos.
Alguns autores demonstraram a expressão de HLA-DR nos linfócitos T do
infiltrado dérmico, ductos écrinos e endotélio vascular nas lesões de PLA
(Muhlbauer et al., 1984) e nos queratinócitos em ambas as formas da
doença (Smith et al., 1997; Shieh et al., 2001), sugerindo uma possível
relação com as lesões cutâneas mediadas pelo interferon gama (INF gama)
(Smith et al., 1997). Muhlbauer et al., (1984) relatam uma depleção de
células de Langerhans no centro das lesões de PLA, relacionado este
achado à migração destas células para os linfonodos ou a morte das
mesmas. Além disso, outros estudos demonstraram um aumento
considerável nos níveis do fator de necrose tumoral alfa no sangue periférico
de um paciente com PLA durante a evolução para a forma úlcero-necrótica
(Tsianakas e Hoeger, 2005). A PL é uma doença inflamatória cutânea de
caráter persistente e etiologia desconhecida. Recentemente foi considerada
como processo de discrasia de linfócitos T nas lesões. Entretanto, poucos
trabalhos envolvem o estudo dos elementos celulares da imunidade inata e
perfil de citocinas nas lesões da PL.
Introdução
6
1.2 Óxido nítrico
A participação do óxido nítrico (NO) em diversos processos
fisiológicos e patológicos tem sido intensamente abordada. O óxido nítrico
(NO) é um radical altamente reativo, produzido a partir do aminoácido
L-arginina através da reação catalítica da enzima óxido nítrico sintase
(NOS). Três isoformas foram descritas, sendo que a óxido nítrico sintase
neuronal (nNOS- NOS1) e óxido nítrico sintase endotelial (eNOS- NOS3)
são expressas de forma constitutiva. A terceira isoforma é a forma induzida
da enzima óxido nítrico sintase (iNOS-NOS2), sendo transcrita somente
frente a estímulos imunológicos de citocinas ou a ligação de padrões
moleculares patógeno – associados (PAMPs) como os lipopolissacarídeos
(LPS) da parede bacteriana .
O NO é uma molécula que age como mensageiro, tanto de maneira
autócrina como parácrina estando relacionado a eventos fisiológicos e
atuando como um importante mediador de respostas patológicas na pele
(Bruch-Gerharz et al., 1998a; Cals-Grierson e Ormerod, 2004). Nos últimos
anos, inúmeros trabalhos têm demonstrado o papel fundamental e
pleiotrópico do NO na indução e desenvolvimento de diversos padrões de
resposta imune cutânea, como os estados hiperproliferativos (Bruch-Gerharz
et al., 2003), doenças granulomatosas (Schon et al., 2001; Qadoumi et al.,
2002) doenças auto-imunes (Kuhn et al., 1998; Tsukazaki et al., 2002)
processo de cicatrização de feridas (Lee et al., 2001) e na melanogênese
(Romero-Graillet et al., 1997). Além disso, estímulos externos como radiação
Introdução
7
ultravioleta (UV) (Kuhn et al., 1998; Tsukazaki et al., 2002) e a presença de
agentes infecciosos (Schon et al., 2001; Weller et al., 2001; Lim et al., 2002;
Qadoumi et al., 2002; Diaz et al., 2006) parecem ativar a resposta cutânea
mediada pelo NO.
Em virtude da labilidade da molécula de NO, a identificação de suas
três isoformas tem sido utilizada com o intuito de elucidar o papel deste
mensageiro em diferentes mecanismos celulares. A expressão da isoforma
induzida (iNOS) na pele foi demonstrada nos queratinócitos, células de
Langerhans, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (Kuhn et al.,
1998; Schon et al., 2001; Lim et al., 2002; Qadoumi et al., 2002; Tsukazaki et
al., 2002; Bruch-Gerharz et al., 2003).
Este estudo objetivou avaliar quantitativamente a população de
células dendríticas da pele, a expressão de iNOS e de citocinas pró e anti-
inflamatórias nas lesões das formas aguda e crônica da pitiríase liquenóide,
sendo que a expressão da iNOS foi analisada e comparada também com
controles provenientes de biópsias de pele de indivíduos saudáveis.
2. Objetivos
Objetivos
9
Com o objetivo de contribuir para o entendimento da fisiopatologia
bem como da resposta tecidual na pitiríase liquenóide, pretendemos:
1. Demonstrar e comparar a população de células de Langerhans nas
lesões com características histopatológicas da pitiríase liquenóide
aguda e da pitiríase liquenóide crônica.
2. Demonstrar e comparar a população de células dendríticas
dérmicas Fator XIIIa positivas nas lesões com características
histopatológicas da pitiríase liquenóide aguda e da pitiríase
liquenóide crônica.
3. Demonstrar e comparar a expressão da forma induzida da óxido
nítrico sintase (iNOS) nas lesões com características histopatológicas
da pitiríase liquenóide aguda, da pitiríase liquenóide crônica e no
grupo controle de pele normal.
4. Demonstrar e comparar a expressão de interleucinas pró-
inflamatórias (Interleucina 12, interferon gama e fator de necrose
tumoral alfa) e reguladora (interleucina 10), nas lesões com
características histopatológicas da pitiríase liquenóide aguda e da
pitiríase liquenóide crônica.
Objetivos
10
5. Verificar a existência de correlação entre população de células
dendríticas, expressão de iNOS e interleucinas nas lesões com
características histopatológicas da pitiríase liquenóide aguda e da
pitiríase liquenóide crônica.
3. Revisão da literatura
Revisão da literatura
12
3.1 Histórico
A Pitiríase liquenóide (PL), foi descrita simultaneamente por Neisser
e Jadassohn em 1894, (Jadassohn, 1984; Neisser, 1984) os quais
descreveram, respectivamente, um caso do que hoje consideramos a
forma aguda e crônica da doença. Em 1899, Juliusberg descreveu a forma
crônica da doença utilizando pela primeira vez o termo Pitiríase liquenóide
crônica (PLC) (Juliusberg, 1899). A PL foi incluída no grupo das
parapsoríases, como uma forma em gotas, por Brocq em 1902 (Brocq,
1902). Esta classificação foi utilizada até o ano de 1926, quando a PL foi
então considerada como uma entidade distinta da parapsoríase. Mucha
(1916) identificou, pela primeira vez, a forma aguda da doença, sendo
denominada Pitiríase liquenóide e variceliforme aguda (PLEVA) por
Habermann (1925). Tendo em vista a contribuição dos dois autores para a
descrição desta forma da doença ela também é conhecida como doença de
Mucha-Habermann (Mucha, 1916; Habermann, 1925). Degos et al. (1966)
descrevem uma terceira forma da PL, caracterizada pela presença de
lesões úlcero-necróticas, hipertermia e curso clínico muitas vezes fatal.
Esta variante clínica foi então denominada Doença de Mucha-Habermann
Febril úlcero-necrótica (DMHF).
Revisão da literatura
13
3.1.1 Epidemiologia
A incidência e a prevalência da PL não são conhecidas. Alguns
autores estimaram a incidência da doença em torno de um caso a cada 2000
pessoas (Daoud e Pittelkow, 2003). Não há referências acerca de
predisposição geográfica, étnica ou fatores de risco para a doença (Bowers
e Warshaw, 2006). Alguns autores demonstram um maior número de casos
de PL nos meses de inverno (Ersoy-Evans et al., 2007) A incidência da
doença é maior entre pré-adolescentes e adultos jovens. Apesar de que
alguns estudos apontarem para uma discreta predominância no sexo
masculino (Khachemoune e Blyumin, 2007), revisões com casuísticas
maiores demonstram não haver predominância em relação ao sexo (Magro
et al., 2002; Ersoy-Evans et al., 2007). Foram relatados raros casos de PL
durante a gestação (Brazzini et al., 2001).
3.1.2 Quadro Clínico
A PLA é caracterizada clinicamente por lesões polimórficas, com
pápulas eritematosas que evoluem para vesículas hemáticas, ulceração e
necrose. A PLA geralmente é autolimitada, com curso clínico prolongado,
podendo se estender por várias semanas. (Marks e Black, 1972; Tomasini et
al., 2004). Em contrapartida, a PLC exibe erupção monomórfica, liquenóide,
pápulo-descamativa, curso clínico mais arrastado com persistência das
lesões por meses ou anos (Romani et al., 1998; Ersoy-Evans et al., 2007).
Revisão da literatura
14
Ambas as formas de PL exibem tendência a episódios de recrudescimento
com altas taxas de recorrência principalmente no grupo pediátrico
(Ersoy-Evans et al., 2007; Wahie et al., 2007).
Tanto as lesões da forma aguda quanto as da forma crônica da PL
podem cursar com alterações pigmentares residuais, geralmente máculas
hipocrômicas (Ersoy-Evans et al., 2007). As lesões se distribuem
principalmente na face anterior do tronco, e flexora do segmento proximal
dos membros (Romani et al., 1998). Prurido leve a intenso é descrito pela
maioria dos autores em até 59% dos casos (Ersoy-Evans et al., 2007).
Sintomas sistêmicos leves como mialgia, cefaléia, artralgia, febre baixa e
linfadenopatia, (Romani et al., 1998; Ersoy-Evans et al., 2007) podem
acompanhar a erupção cutânea na forma aguda da doença. Lesões
necróticas, ulceradas, acompanhadas de febre alta associada à leucocitose,
com comprometimento de mucosas, caracterizam a forma ulcero-necrótica
descrita por Degos (Degos et al., 1966).
Clinicamente podem coexistir ou aparecerem durante a evolução do
quadro, em um mesmo paciente, lesões com características próprias das
formas aguda e crônica da PL, muitas vezes com dissociação clínico-
patológica (Tomasini et al., 2004). Estes achados reforçam a teoria de uma
doença única com formas clínicas espectrais (Black e Marks, 1972; Romani
et al., 1998; Shieh et al., 2001; Tomasini et al., 2004; Magro et al., 2007).
Revisão da literatura
15
3.1.3 Histopatologia
Szymanski (1959) faz, pela primeira vez, uma minuciosa descrição
das características histolopatológicas da PL com o objetivo de separá-la
histologicamente do grupo das parapsoríases. O autor descreve a PLA
essencialmente como uma vasculite, com comprometimento epidérmico
secundário. Nos estágios iniciais da doença (evolução de 24 horas) os
achados histológicos assemelham-se aos observados no eritema tóxico,
com as alterações limitadas aos capilares superficiais exibindo discreto
extravazamento de hemácias e infiltrado perivascular linfocitário
(Szymanski, 1959).
Nas fases posteriores da doença, observa-se o início do processo
descamativo associado com a presença de pápulas e vesículas,
destacando-se o comprometimento epidérmico progressivamente mais
exuberante. As alterações epidérmicas são representadas por
paraqueratose focal, acantose e edema intercelular discretos, associadas a
infiltrado linfocitário perivascular de linfócitos, tumefação endotelial e
extravazamento de hemácias. O processo é acompanhado da perda
completa da arquitetura normal da epiderme, que é permeada por intenso
infiltrado de células inflamatórias e hemácias. Estas alterações estão
associadas a um infiltrado inflamatório dérmico exuberante e alterações
vasculares comparáveis às observadas na sífilis, entretanto, sem
plasmócitos. (Szymanski, 1959)
Revisão da literatura
16
Na PLC, as alterações microscópicas são pronunciadamente mais
sutis. A epiderme exibe acantose discreta a moderada, paraqueratose focal,
espongiose com exocitose, por vezes com formação de vesículas intra-
epiteliais. Na derme, os vasos sangüíneos superficiais mostram-se
ectásicos, congestos e envoltos por infiltrado perivascular com predomínio
de linfócitos. A presença de alterações vasculares com diapedese de
hemácias é um achado constante tanto nas fases aguda quanto crônica da
doença (Szymanski, 1959).
Em 1982 Ackerman definiu critérios histopatológicos para distinguir a
PLA da PLC. O grau de necrose de queratinócitos, extravazamento de
hemácias, densidade do infiltrado linfóide e envolvimento do plexo vascular
dérmico profundo formam definidos como parâmetros para distinção das
formas aguda e crônica da PL (Ackerman, 1982).
Romani et al. (1998), ao estudar o quadro clínico e histopatológico de
um grupo de 22 crianças com diagnóstico de PL, definem, a partir dos
critérios propostos anteriormente por Ackerman, as alterações morfológicas
mais significativas na discriminação histopatológica entre as formas aguda e
crônica da doença. Segundo os autores, a PLA caracteriza-se pela presença
de necrose de queratinócitos, adelgaçamento ou desaparecimento da
camada granulosa, presença de infiltrado inflamatório envolvendo o plexo
vascular dérmico profundo e infiltrado em forma de “cunha”. Sendo que, o
extravasamento de hemácias em conjunto com infiltrado inflamatório de
padrão liquenóide se mostram como os critérios menos específicos na
distinção entre as duas formas da doença. (Romani et al., 1998).
Revisão da literatura
17
Estudos imunofenotípicos demonstraram que o infiltrado inflamatório
na PL é constituído principalmente por linfócitos T, com predomínio de
células CD8+ citotóxicas CLA+ (Cutaneous Lymphocyte-associated
antigen)(Tomasini et al., 2004), sendo estas predominantes na resposta
tecidual da PLA (Muhlbauer et al., 1984; Tomasini et al., 2004). Na PLC, a
maior parte dos linfócitos exibe positividade para o CD4 (CD4+) e são
negativos para o CD25 (CD25-) (Shieh et al., 2001).
3.1.4 Fisiopatologia e Etiologia
Em 1972, Black e Marks descrevem o papel do componente
epidérmico, do infiltrado inflamatório dérmico e dos capilares superficiais na
patogênese da PL. Os autores sugerem a existência de uma substância
vasoativa liberada em altas concentrações levando à vasodilatação e
hemorragia na derme papilar. A lesão da epiderme seria secundária a
“invasão” por células inflamatórias (Marks e Black, 1972).
Depósitos imunes de imunoglobulina G (IgG) e da fração C3 do
sistema complemento foram demonstrados na parede dos vasos sangüíneos
da derme superficial e na junção dermo-epidérmica nas lesões de PL, assim
como imunocomplexos circulantes. Com base nestes achados, Clayton e
Haffenden propõem a PL como uma doença secundária à ação de
complexos imunes (Clayton e Haffenden, 1978). Entretanto, estas
observações não puderam ser validadas ou foram subvalorizadas em
estudos posteriores (Muhlbauer et al., 1984).
Mulhbauer et al. (1984) consideram ser o componente citotóxico de
células T CD8+, o responsável pelas alterações epidérmicas e vasculares na
Revisão da literatura
18
PLA. Os autores demonstram existir uma depleção de células de Langerhans
nas lesões cutâneas associado a uma redução da relação T CD4+/ T CD8+ no
sangue periférico dos doentes portadores da forma aguda da doença.
Estes achados reforçariam a idéia de um evento citotóxico secundário à
apresentação antigênica por queratinócitos e/ou células de Langerhans.
Excetuando-se os estudos sobre as características fenotípicas e
moleculares dos linfócitos T na PL, trabalhos relativos aos demais
componentes da resposta tecidual cutânea nesta doença são escassos.
Na PLA os linfócitos T, os ductos sudoríparos écrinos e as células endoteliais
expressam HLA-DR (Muhlbauer et al., 1984). Além disso, queratinócitos tanto
nas lesões de PLA como na PL, também expressam esse antígeno
(Muhlbauer et al., 1984; Smith et al., 1997; Shieh et al., 2001). Este padrão de
expressão de HLA-DR pelos queratinócitos está, em geral, relacionado com
erupções cutâneas mediadas pelo IFN gama (Smith et al., 1997).
Smith et al., (1997) demonstram, em pacientes soropositivos para o
vírus da imunodeficiência adquirida (HIV), uma associação entre a presença
de células T ativadas (CD29+) na epiderme, a expressão de HLA-DR+ nos
queratinócitos e a presença de queratinócitos apoptóticos nas lesões de
PLA. Este padrão imunofenotípico, foi observado nas fases iniciais e/ou
intermediária da doença, onde predomina o padrão de citocinas Th1.
Os autores propõem a teoria de que os queratinócitos HLA-DR+ seriam
capazes de apresentar superantígenos diretamente às células T que
expressam TCR β específicos (Figura 1). Em alguns casos, a exposição
repetida a estes superantígenos levaria à anergia e/ou deleção clonal, o que
poderia estar relacionado à melhora da erupção cutânea (Smith et al., 1997).
Revisão da literatura
19
Figura 1 - Teoria dos Superantigenos. Os queratinócitos expressando
HLA-DR, têm a capacidade de apresentarem superantigenos diretamente a
Linfócitos T não ativados (cél. Ti), após a apresentação estes clones de
Linfócitos T, agora ativados (cél. Ta) expressando TCRβ específicos, são
eliminados por apoptose, tornam-se anérgicos ou podem proliferar fazendo
reação cruzada com auto-antígenos dos queratinócitos induzindo estas
células a apoptose.
Revisão da literatura
20
Muhlbauer et al. (1994), estudando lesões de PLA, observam uma
depleção relativa de células de Langerhans (CL) no centro das biopsias de
lesões tardias. Em lesões precoces, as camadas superiores da epiderme na
mesma região (centro das biopsias) mostram um aumento relativo desta
população em relação às camadas inferiores da epiderme.
Em 2004, Tsianakas e Hoeger, no seguimento clínico de uma criança
com PLA, demonstram que a evolução para a forma úlcero-necrótica foi
acompanhada de um aumento significativo nos níveis séricos de TNF alfa.
Este aumento foi proporcional à intensa necrose de queratinócitos e ao
influxo maciço de células inflamatórias, característicos desta forma da
doença. (Tsianakas e Hoeger, 2005).
As publicações referentes à fisiopatologia da PL se concentram em
duas proposições fisiopatológicas as quais, nos últimos anos, têm se
sobreposto na tentativa de um melhor entendimento da doença. A primeira
considera a PL como uma resposta imune anormal, provavelmente
secundária a um agente infeccioso (Muhlbauer et al., 1984; Dupont, 1995;
Tomasini et al., 2004). Em contrapartida, há evidências contundentes que
justificam a classificação da PL no grupo das discrasias linfóides de células
T (Guitart e Magro, 2007).
Entre as características clínicas e epidemiológicas que sugerem a
relação da PL com um provável agente infeccioso destacam-se o início da
doença em idade precoce, a presença de uma fase aguda eruptiva,
ocorrência de casos familiares, o agrupamento de casos em determinadas
épocas do ano, o aumento de títulos sorológicos para diferentes patógenos
Revisão da literatura
21
na vigência da erupção cutânea e a melhora do quadro clínico após a
supressão de agentes infecciosos (Takahashi e Atsumi, 1993; Dupont,
1995). Além disso, o aumento de linfócitos T CD8+ e diminuição de células
T CD4+ circulantes, observado em alguns casos de PLA, sugerem a
possibilidade de uma infecção viral (Muhlbauer et al., 1984).
A associação da PL com diversos agentes infecciosos têm sido
demonstrada em geral, em estudos com um número de casos pouco
expressivo ou relatos de casos isolados, através da demonstração de títulos
sorológicos de imunoglobulinas M (IgM) específicas, e/ou do isolamento de
patógenos através de técnicas de biologia molecular (Tomasini et al., 2004).
Há relatos de PL associada à infecção pelo vírus da imunodeficiência
humana (HIV) (Smith et al., 1997); Streptococcus β-hemolítico do grupo A
(Takahashi e Atsumi, 1993; English et al., 1995); Toxoplasma gondii
(Rongioletti et al., 1999);
citomegalovírus (CMV) (Tsai et al., 2001); vírus
Epstein–Barr (EBV) (Klein et al., 2003); vírus da Varicela-Zoster (VVZ)
(Boralevi et al., 2003); parvovírus B19 (Tomasini et al., 2004)
e vírus da
hepatite C (VHC) (Zechini et al., 2005) (Anexo A, Tabela 1).
A partir do ano de 2000, com a demonstração de clonalidade de
linfócitos T nas lesões de PLA (Dereure et al., 2000), a PL passa a ser
considerada uma discrasia linfóide cutânea. Magro et al. (2002)
demonstram um fenótipo de células T anormal, com perda da expressão de
CD7 e da selectina CD62L nos linfócitos T presentes nas lesões de PL, à
semelhança do que ocorre em alguns casos de micose fungóide.
Revisão da literatura
22
Diversos autores, cujos estudos estão sumarizados no Anexo B,
Tabela 2, demonstram, por técnicas moleculares distintas, mono e/ou
oligoclonalidade do rearranjo dos genes γ e/ou β do TCR (Dereure et al.,
2000; Shieh et al., 2001; Magro et al., 2002; Weinberg et al., 2002; Magro et
al., 2007). A presença de população oligo ou monoclonal nos infiltrados
linfóides tem sido considerada por muitos autores como marcadores de
malignidade. Entretanto, população linfóide mono ou oligoclonal pode ser
observada na vigência de condições benignas, como infecções virais
(Islam et al., 2001), em pacientes idosos (Schwab et al., 1997) e em doenças
auto-imunes (Oksenberg et al., 1993). Na PLA, os linfócitos mono ou
oligoclonais são linfócitos T CD8+. Especula-se que seriam resultantes de
uma resposta imune individual a determinados fatores patogênicos, em
especial a um possível agente viral (Kadin, 2002).
Apesar da freqüente demonstração de monoclonalidade e/ou restrição
clonal do gene do TCR pelos linfócitos T infiltrantes nas lesões de PL, são
raros os relatos de progressão para linfoma cutâneo de células T (LCCT)
(Fortson et al., 1990; Thomson et al., 1999).Estudos recentes, com
casuística expressiva e longo tempo de seguimento de pacientes com PL,
não observaram nenhum caso de evolução de PL para LCCT (Gelmetti et
al., 1990; Ersoy-Evans et al., 2007; Wahie et al., 2007).
Linfócitos T CD8+ com fenótipo citotóxico (TIA-1+, granzima B+) e
exibindo expressão da molécula associada ao “skin homing”, CLA+
(cutaneous lymphocyte antigen) e de MxA (proteína de resistência ao
myxovirus), uma proteína antiviral e um marcador da expressão de
Revisão da literatura
23
interferons do tipo I, mostram-se em quantidade e distribuição semelhantes
em casos de PL, Linfoma T cutâneo citotóxico e nas lesões cutâneas
causadas pela infecção pelo vírus varicela-zoster. Estas observações
apontam para um possível evento inicial semelhante entre os diferentes
processos patológicos (Wenzel et al., 2005).
Em recente publicação, Guitart e Magro (2007) defendem a criação do
grupo das discrasias linfóides de células T, o qual compreenderia diferentes
dermatoses com características clínicas e fisiopatológicas comuns como: a
presença de curso crônico caracterizado por recaídas após tratamento tópico;
evento desencadeante desconhecido; ausência de evidências de estados de
hipersensibilidade, alergia, doença do colágeno ou processos linfoproliferativos;
ou de alterações cito - morfológicas francas de malignidade; presença de mono
ou oligoclonalidade do infiltrado de linfócitos T e potencial de evolução para
LCCT. A PL seria incluída neste grupo de processos, ao lado de outras
condições como a dermatite de interface hipocromiante, púrpura pigmentosa,
paniculite lobular linfocitária atípica, mucinose folicular idiopática e a
parapsoríase. O termo discrasia foi utilizado com o intuito de caracterizar o
desequilíbrio da resposta de linfócitos T a antígenos, ainda que desconhecidos,
observado na PL e nas demais dermatoses que compõem o grupo.
3.1.5 Tratamento
A literatura relata um grande número de estratégias terapêuticas
utilizadas na PL. Séries pequenas de doentes exibindo respostas variáveis
Revisão da literatura
24
demonstram melhora das lesões com tratamento antibiótico (eritromicina e
tetraciclinas) (Ersoy-Evans et al., 2007). Há relatos do uso de
imunomoduladores tópicos e fototerapia com respostas inconstantes e
recidivas após a interrupção do tratamento (Bowers e Warshaw, 2006).
Recentemente, Pavlotsky e colaboradores reportam o uso de raios
ultravioleta B (UVB) em 29 casos de PL obtendo 93,1% de respostas
completas, com uma taxa de manutenção de 73% após acompanhamento
médio de 36 a 58 meses (Pavlotsky et al., 2006).
3.2 Óxido Nítrico
A primeira descrição da ação do NO na pele foi feita por Heck et. al.,
(1992). A partir daí, numerosos trabalhos têm demonstrado uma variedade
de funções deste mensageiro molecular, tanto como sinalizador ou regulador
de reações fisiológicas e patológicas da pele. O NO é um importante
mediador na resposta a uma variedade de estímulos nocivos externos como,
por exemplo, à radiação ultravioleta (Kuhn et al., 1998; Tsukazaki et al.,
2002). Esta molécula participa ainda dos mecanismos responsáveis pela
imunidade inata e adaptativa contra patógenos (Bogdan, 2001; Weller et al.,
2001; Qadoumi et al., 2002; Diaz et al., 2006), do processo de cicatrização
de feridas (Lee et al., 2001) e da carcinogênese (Bruch-Gerharz et al.,
1998a; Cals-Grierson e Ormerod, 2004).
Revisão da literatura
25
A produção do NO na pele é realizada por diversos elementos
celulares cutâneos através da síntese de proteínas com atividade enzimática,
denominadas oxido nítrico sintases (NOS), as quais utilizam o aminoácido
L-arginina como substrato. A enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e
a óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) fazem parte da família das sintases e
são expressas constitutivamente. Estas duas isoformas estão mais
associadas com os eventos fisiológicos, são dependentes de cálcio e liberam
concentrações baixas, porém contínuas, de NO. A terceira isoforma,
denominada de forma induzida da óxido nítrico sintase (iNOS) é transcrita
pela ação de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF alfa, IL-1 e IFN gama
(Hanafy et al., 2001). A produção de iNOS é também induzida pela ligação de
padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) como
lipopolissacárides (LPS) a um receptor do tipo Toll (TLR)(Kropf et al., 2004;
Vazquez-Torres et al., 2004). A iNOS produz altos níveis de NO,
independentemente da concentração de cálcio (Cals-Grierson e Ormerod,
2004; Vazquez-Torres et al., 2004). A transcrição da iNOS, pode ser inibida
por glicocorticóides, doxifilina e retinóides (Bruch-Gerharz et al., 1998b).
A produção da forma induzida da enzima (iNOS) na pele foi
demonstrada em queratinócitos, células dendríticas, fibroblastos, células
endoteliais e macrófagos (Schon et al., 2001; Giustizieri et al., 2002; Lim et
al., 2002; Qadoumi et al., 2002; Diaz et al., 2006). Entretanto, uma outra via,
não enzimática, pode produzir NO na superfície epidérmica a partir da
redução de nitrito das glândulas sudoríparas sob a ação de bactérias
comensais cutâneas (Weller et al., 1996).
Revisão da literatura
26
3.2.1 Mecanismo de Ação
O NO é molécula simples e altamente difundível, solúvel tanto em meio
aquoso como lipídico (Rowe et al., 1997). As funções do NO como
mensageiro molecular ocorrem através de sua interação com grupos
proteicos, metais de transição e/ou com outros radicais livres. Em baixas
concentrações, como em situações fisiológicas, o NO interage com metais
de transição, em especial com o ferro dos grupamentos heme, induzindo a
produção de GMPc (guanil ciclase monofosfato cíclico) o que resulta na
alteração da expressão de fatores de transcrição. Sob altas concentrações,
o NO age através da produção, de espécies reativas de nitrogênio, por
exemplo, nitrato e peroxinitrito. Estas moléculas agem modificando proteínas
que contém resíduos de cisteína (processo de nitrosilação), e tirosina
(nitratação). Sob certas circunstâncias, esta molécula causa ainda a
desaminação do ácido desoxirribonucléico (DNA) (Hanafy et al., 2001;
Cals-Grierson e Ormerod, 2004).
3.2.2 O Óxido Nítrico e a Pele
3.2.2.1 Óxido Nítrico e Apoptose
O NO pode interferir no ciclo celular tanto induzindo como inibindo a
apoptose (Figura 2) (Kim et al., 1999). Esta ação é dependente de fatores
diversos como tipo celular, presença de outros radicais livres e níveis de
concentração. Baixas concentrações de NO, como as induzidas pela ação
Revisão da literatura
27
da radiação UV inibem a apoptose tanto de queratinócitos quanto de células
dérmicas e do endotélio vascular. Este efeito parece ser mediado pelo GMPc
(guanil ciclase monofosfato cíclico) e por inibição direta das caspases
(Kroncke et al., 1998; Weller, 2003).
Em contrapartida, altas concentrações de NO, como aquelas
produzidas pela ação da iNOS, estão associadas com predomínio do efeito
pró-apoptótico desta molécula. Na necrólise epidérmica tóxica (NET) e na
Síndrome de Stevens-Johnson (SSJ) ocorre intensa expressão de iNOS nas
camadas inferiores da epiderme e no infiltrado dérmico superficial, a qual se
associa à presença de necrose e apoptose dos queratinócitos,
características destas dermatoses (Lerner et al., 2000). Lime t al., relatam
ainda intensa expressão de iNOS pelos queratinócitos apoptóticos das
lesões cutâneas agudas de Herpes-zóster (Lim et al., 2002). Além disso, a
aplicação tópica de NO (nitrito acidificado) na pele de indivíduos saudáveis,
ocasiona efeitos citotóxicos com aumento significativo de p53 e apoptose de
queratinócitos induzida por citocinas (Ormerod et al., 1999).
Revisão da literatura
28
Figura 2 - Efeitos pró e antiapoptóticos do óxido nítrico (NO). (A) NO
estimula a apoptose através da inibição do NF-κB e aumento da atividade do
p53 levando a superexpressão da proteína próapoptótica Bax, inibição da
expressão da proteína antiapoptótica Bcl2 e liberação do citrocomo c da
mitocôndria. (B) NO inibe a apoptose através do aumento da expressão das
proteínas Bcl2 e de choque térmico 70 (HSP 70), inibição da caspase 3 e
estimulação da tioredoxina.
Na pele de pacientes com lupus eritematoso há um retardo relativo da
produção de NO após estimulo com radiação ultravioleta (RUV). A expressão
de iNOS, ocorre somente 72 horas após a foto-exposição. Na pele sã, a
expressão máxima da iNOS é observada após 48 horas da exposição a
RUV, com ausência de sua expressão em 72 horas. A produção inadequada
de NO, secundária ao retardo na expressão de iNOS, após a agressão pela
radiação UV levaria à perda do efeito protetor do NO e conseqüente indução
Revisão da literatura
29
da apoptose de queratinócitos, com liberação de DNA e aumento da produção
de auto-anticorpos , característicos do lupus eritematoso. Este retardo na
produção do NO seria responsável pela fotossensibilidade observada nestes
pacientes (Kuhn et al., 1998) (Figura 3).
Figura 3 - Efeitos do NO após a radiação ultravioleta. (A) Efeitos protetores
do NO nos queratinócitos, endotélio e células da derme através da inibição
da apoptose. (B) Retardo da produção de NO após a radiação ultravioleta
em pacientes com lupus eritematoso. Perda do efeito protetor do NO,
ativando a apoptose e liberando DNA com aumento da produção de auto-
anticorpos.
Revisão da literatura
30
3.2.2.2 Óxido Nítrico - Efeitos Antimicrobianos
A produção constitutiva de NO parece ser uma importante linha de
ação na imunidade inata contra patógenos. A iNOS é expressa
constitutivamente em tecidos com função de barreira contra as agressões do
meio externo, como o epitélio do íleo (Hoffman et al., 1997) e dos seios para-
nasais (Guo et al., 1995).
A expressão de iNOS é descrita em uma variedade de doenças
infecciosas cutâneas. Estudos recentes demonstram, por imunoistoquímica,
expressão de iNOS nos granulomas infecciosos de hanseníase tuberculóide
e na reação reversa hansênica (Khanolkar-Young et al., 1998). Na hanseníase
dimorfa, há expressão de iNOS pelos queratinócitos, fibroblastos células
endoteliais, nervos dérmicos e nos granulomas (Schon et al., 2001).
Nas lesões cutâneas da leishmaniose, na forma localizada com
pequeno número de parasitas, ocorre intensa expressão de iNOS em
macrófagos, fibroblastos queratinócitos e nos granulomas (Qadoumi et al.,
2002). Por outro lado, na leishmaniose difusa, onde são encontrados grande
número de parasitas, são observadas raras células expressando iNOS nos
sítios de lesão. Estas observações sugerem um papel importante do NO em
limitar o crescimento do patógeno (Diaz et al., 2006).
Expressão de iNOS também ocorre nos queratinócitos, células
endoteliais e células inflamatórias nas lesões cutâneas de herpes zoster
(Lim et al., 2002).
Revisão da literatura
31
A função antimicrobiana do NO ocorre por toxicidade direta no interior
dos macrófagos através da reação com o ânion superóxido (O
2
–
) e
conseqüente produção de peroxinitrito (HNOO
-
). Por outro lado, a função
mais importante do NO na indução das imunidades inata e adaptativa contra
patógenos parece residir na sua capacidade de interagir reversivelmente
com grupamentos tiol e metais, promovendo a regulação de enzimas e
fatores de transcrição. Essa função como molécula mediadora da
transdução de sinais é responsável, por exemplo, pela inibição da infiltração
linfocitária no local de deposição antigênica, contribuindo para a latência de
processos infecciosos (Fang, 2004).
O NO também é capaz de inibir a cadeia respiratória bacteriana.
A interação do NO com radicais tirosil, limita a síntese e o reparo do DNA
bacteriano. O peroxinitrito reage com as proteínas do capsídeo viral do vírus
Coxsackie inibindo a sua entrada nas células. Além disso, o NO causa a
s-nitrosilação e inibição de proteinases virais e de fatores de transcrição
responsáveis pela replicação viral (Padalko et al., 2004; Mannick, 2006)
(Figura 4).
Revisão da literatura
32
Figura 4 - Mecanismos antivirais do óxido nítrico (NO). O NO reage com o
superóxido para formar peroxinitrito o qual nitrata proteínas do core
expressas na superfície do vírus Coxsackie levando a inibição da entrada do
RNA viral na célula. O NO também faz a S-nitrosilação e inibe as
proteinases virais e fatores de transcrição necessários para a replicação
viral.
NITRATAÇÃO
de proteínas
do core com
inibição da
entrada do
RNA viral
INIBE
a transcrição
de proteínas
necessárias à
replicação
viral
NITROSAÇÃO
de proteinases
virais
Revisão da literatura
33
3.2.2.3 O Óxido Nítrico e o Sistema Imune
O NO regula a função das células imunes através de diversos
mecanismos como a alteração do balanço Th1-Th2 e a regulação do
recrutamento e adesão leucocitária (Mannick, 2006).
Em 1999 van der Veen et al. demonstram que baixas concentrações
de NO inibem igualmente a proliferação de células Th1 e Th2, exibindo
pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade celular e outras atividades da
célula T, como a produção de citocinas (van der Veen et al., 1999).
O NO produzido no interior dos macrófagos se difunde para o
exterior celular onde, na ausência de superóxido (O
2
-
), passa livremente
para o interior dos linfócitos T inibindo a sua proliferação. Em contrapartida,
quando no ambiente extracelular ocorre reação do NO com o radical
superóxido (O
2
-
), há a formação de peroxinitrito (ONOO
-
), o qual é incapaz
de penetrar a membrana celular dos linfócitos T liberando deste modo a
proliferação celular (van der Veen, 2001) (Figura 5). Estes achados
demonstram que o NO desempenha efeitos antagônicos na regulação da
população linfóide T, podendo funcionar tanto como um importante agente
imunossupressivo no controle da resposta inflamatória (van der Veen et al.,
1999; van der Veen, 2001; Mahidhara et al., 2003), quanto como mediador
no desenvolvimento de processos linfo-proliferativos malignos (Mannick et
al., 1997; Mori et al., 1999).
Revisão da literatura
34
Figura 5 - A produção do radical superóxido (O
2
-
)
regula a atividade do óxido
nítrico (NO) sobre a proliferação dos linfócitos T. (A) O NO produzido no
interior dos macrófagos se propaga para o interstício onde, na ausência de
superóxido (O
2
-
), é capaz de se difundir para o interior dos linfócitos T
inibindo a sua proliferação. (B) Por outro lado, na presença de superóxido
(O
2
-
)
o
NO interage no meio extracelular com este radical
produzindo
peroxinitrito (ONOO
-
). O linfócito T é impermeável ao peroxinitrito,
impedindo-o de entrar na célula, liberando assim a sua proliferação.
Revisão da literatura
35
Em resumo, apesar da complexidade e aparente antagonismo das
funções exercidas pelo NO no sistema imune, nos últimos anos os autores
têm aceito que o NO é tóxico em algumas doenças infecciosas e
inflamatórias e auxilia na prevenção da estimulação imune excessiva.
Além disso, pode exibir algum grau de proteção contra doenças auto-imunes
(Shi et al., 2001) e funcionar como uma molécula sinalizadora intra e
intercelular moldando a resposta imune (Bogdan, 2001).
De acordo com os dados da literatura consultada podemos
observar que existem pontos de questionamento quanto à etiopatogenia e
aspectos imunopatológicos da PL. A doença é considerada como resultante
de resposta tecidual a patógeno infeccioso ou de natureza desconhecida e/ou
como discrasia de linfócitos T. Os trabalhos que enfocam a caracterização
dos elementos celulares e de expressão molecular da resposta tecidual da
doença demonstram somente subpopulações de linfócitos T (Muhlbauer et al.,
1984; Shieh et al., 2001); sua natureza citotóxica (Tomasini et al., 2004;
Wenzel et al., 2005); aspectos de clonalidade do receptor de células T
(Dereure et al., 2000; Shieh et al., 2001; Magro et al., 2002; Weinberg et al.,
2002; Tomasini et al., 2004; Magro et al., 2007) ;depleção local de células de
Langerhans (Muhlbauer et al., 1984) e expressão de HLA-DR pelos
queratinócitos sugerindo a presença de TNF alfa e IFN gama nos sítios de
lesão (Muhlbauer et al., 1984; Smith et al., 1997).
O óxido nítrico é mediador envolvido nos mecanismos de resposta
frente a agentes infecciosos e na resposta imunológica inata e adquirida.
Seu envolvimento em processos infecciosos (Khanolkar-Young et al., 1998;
Revisão da literatura
36
Schon et al., 2001; Lim et al., 2002; Qadoumi et al., 2002; Diaz et al., 2006) e
inflamatórios (Kuhn et al., 1998; Ormerod et al., 1999; Lerner et al., 2000) da
pele já foi comprovado. Deste modo, parece-nos interessante demonstrar e
comparar a expressão de iNOS, de elementos celulares da resposta imune
inata e perfil de citocinas nos sítios de lesão das formas aguda e crônica da
pitiríase liquenóide.
4. Métodos
Métodos
38
4.1 Seleção da Amostra
Foram selecionados, dos arquivos do Laboratório de
Dermatopatologia da Divisão de Clínica Dermatológica HC-FMUSP,
espécimes de biópsia de doentes com suspeita clínica e/ou diagnose
histopatológica de pitiríase liquenóide, no período de 1994 a 2006.
Foram consultados os respectivos prontuários médicos para se
verificar a correlação clínico-patológica e características evolutivas
dos doentes. Permaneceram no grupo de estudo 34 casos que
preencheram todas as características (clínicas, histopatológicas e
evolutivas) da doença.
4.1.1 Estratificação da Amostra
Os casos foram classificados nas formas aguda (PLA) e crônica (PLC)
da doença, segundo os critérios histopatológicos definidos por Ackerman
(1982) e modificados por Romani et al., (1998). Esses critérios
compreendem o grau de necrose de queratinócitos, extravazamento de
hemácias, densidade do infiltrado inflamatório linfóide e envolvimento do
plexo vascular na derme profunda. O conjunto de características
Métodos
39
histopatológicas que favorecem a diagnose de PLA é representado pela
necrose de queratinócitos, adelgaçamento ou desaparecimento da camada
granulosa da epiderme, infiltrado inflamatório e forma de cunha que envolve
o plexo vascular dérmico profundo.
Para a classificação da forma de PL foi considerado o padrão
morfológico histopatológico ao invés do clínico uma vez que a proposta era
de uma avaliação “in situ”, e alguns doentes apresentavam simultaneamente
lesões das formas aguda e crônica da doença.
Da análise dos prontuários foram coletadas informações clínicas
sumarizadas no Anexo C,Tabela 3. A amostra foi também estratificada
segundo a idade sendo incluídos no subgrupo pediátrico pacientes com
idade ao diagnóstico igual ou menor que 16 anos, o restante dos
pacientes foi classificado como pertencente ao subgrupo de pacientes
adultos.
4.1.2 Grupo Controle
Como controle de pele sã, para a comparação com a expressão de
iNOS, foram utilizadas 10 amostras de pele normal, provenientes de
cirurgias de mamoplastias e abdominoplastias. Todos os espécimes eram
provenientes de indivíduos do sexo feminino, com média das idades de
38,1 anos.
Métodos
40
4.2 Avaliação Histopatológica
Dos 34 preparados histológicos de pele embebidos em parafina,
foram obtidos cortes histológicos de quatro µm e corados pela hematoxilina-
eosina para a avaliação histopatológica.
A avaliação histopatológica foi feita de maneira cega, por dois
patologistas de acordo com a presença/ ausência/ intensidade de: apoptose
de queratinócitos (A), intensidade da espongiose (B) e da degeneração
vacuolar dos queratinócitos basais (C) intensidade do extravazamento de
hemácias (D), intensidade do infiltrado acometendo o plexo vascular
superficial (E) e o profundo (F).
Os 6 parâmetros (A - F) foram categorizados com o valor (0) nos
casos onde as alterações estavam ausentes ou eram discretas e com o valor
(1) naqueles em que as alterações eram moderadas ou intensas (Anexo D,
Tabela 4).
A estratificação das alterações histológicas em apenas duas
categorias mostrou maior concordância entre os observadores e por isso foi
a forma de avaliação utilizada para a correlação dos dados.
A quantidade de linfócitos intra-epidérmicos foi avaliada através da
determinação da média aritmética de células linfóides no interior da
epiderme por campo microscópico em um aumento de 400x, tendo sido
avaliados 10 campos consecutivos, não coincidentes (Anexo D, Tabela 4).
Métodos
41
4.3 Imunoistoquímica
Cortes histológicos de 4 μm foram colhidos sobre lâminas previamente
preparadas com solução adesiva de 3 amino-propyltriethoxy-silane
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO/USA, código A3648) a 5%, sendo
mantidas em estufa a uma temperatura de 50°C durante 12 h para melhor
aderência dos cortes histológicos.
A seguir os cortes histológicos foram desparafinizados em dois
banhos de xilol a 56ºC durante 30 minutos, e à temperatura ambiente
durante 20 minutos. Posteriormente foram hidratados em seqüência
decrescente de etanol (absoluto, 95% e 70%) e água corrente.
Previamente à incubação com o anticorpo primário, as lâminas foram
submetidas, quando necessário, a tratamento para exposição dos sítios
antigênicos.
Todas as reações realizadas foram visualizadas através do cromógeno
Permanent Red (DAKO, Carpinteria, CA, USA, código K0640) 0,13% acrescido
de 40µl de levamisol (DAKO, Carpinteria, CA, USA, código X3021) para
bloqueio da fosfatase alcalina endógena. A intensidade de cor foi controlada ao
microscópio óptico através dos controles positivos que acompanharam cada
reação. Os cortes histológicos foram então lavados em água corrente por 30
minutos, contracorados levemente com Hematoxilina de Carazzi por 10
segundos. A seguir foram lavados em água corrente, e secos em ar ambiente.
A montagem das lâminas foi feita com resina Permount (FISHER
Scientific, Fair Lawn, NJ/USA, código SP15-100). A presença de precipitado
vermelho indicou positividade para o anticorpo primário.
Métodos
42
Controles negativos seguiram em cada uma das reações, através da
supressão do anticorpo primário durante o procedimento.
Fragmentos de biopsia de leishmaniose cutânea foram utilizados
como controle positivo das reações para a demonstração da expressão de
iNOS e células dendríticas epidérmicas CD1a+ (células de Langerhans).
Fragmentos de biópsia de dermatofibroma foram utilizados como controle
positivo da reação para a identificação dos dendrócitos dérmicos fator XIIIa+.
Biopsias de pele de lesões de psoríase foram utilizadas como controle
positivo das reações para a demonstração de IFN gama, TNF alfa e
interleucina 12. Para o controle positivo de IL-10 foram utilizados fragmentos
de tecido amidaliano.
4.3.1 Demonstração das Células Dendríticas CD1A+ (LANGERHANS).
Para a demonstração das células dendríticas CD1a+ fez-se a
exposição antigênica pelo tratamento dos preparados histológicos com uma
solução composta por 180 mL de ácido cítrico 0,1M (MERCK, São Paulo/SP,
Brazil) e 820 mL de citrato de sódio 0,1M (MERCK, São Paulo/SP, Brasil)
pH 6,0. Após o preparo da solução, as lâminas foram imersas nesta solução
diluída 1:10 em água destilada, e mantidas em banho-maria ajustado para
95-98°C, durante 45 min. Após este período, foram mantidas durante 20 min
à temperatura ambiente e posteriormente lavadas em água destilada. Após a
lavagem das lâminas, estas foram submersas em solução salina tamponada
(PBS) pH 7,4. A seguir ao material foi incubado com o anticorpo primário
Métodos
43
monoclonal anti-CD1a (Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle upon Tyne,
NE, UK, código NCL-CD1a-235), diluído a 1:200, em uma solução comercial
apropriada à diluição de anticorpos - DakoCytomation Antibody Diluent
(Dako, Carpinteria, CA, USA, Código S0809), mantidos em câmara úmida, à
temperatura de 2-8°C, por 12h. A seguir, foram lavadas com solução salina
tamponada (PBS) pH 7,4 por duas vezes, por 5 min cada, à temperatura
ambiente. Após lavagem as lâminas foram incubadas com anticorpo
secundário anti-IgG/IgM (mouse/rabbit) biotinilado (LSAB+, Dako Cytomation,
Carpinteria, CA, USA) pronto para uso em câmara úmida durante 45 min à
temperatura ambiente, seguido de lavagem em tampão PBS, por 2 vezes,
por 5 min cada. Posteriormente, os cortes histológicos foram incubados com
o complexo Streptavidina-Biotina-Fosfatase alcalina (LSAB+, Dako Cytomation,
Carpinteria, CA, USA, código K0689) pronto para uso em câmara úmida
durante 45 min à temperatura ambiente, e novamente lavados em tampão
PBS, por 2 vezes, por 5 min cada.
4.3.2 Demonstração das Células Dendríticas FXIIIa+
Para a demonstração de dendrócitos dérmicos FXIIIa+ fez-se a
exposição antigênica com tampão de citrato 0,1M pH 6,0 em banho-maria
ajustado para 95-98°C, durante 45 min da mesma forma descrita
anteriormente para a detecção de células CD1a+ A seguir ao material foi
incubado com o anticorpo primário monoclonal anti-FXIIIa, (Novocastra
Laboratories Ltd, Newcastle upon Tyne, NE, UK, código NCL-FXIIIa) diluído
Métodos
44
a 1:100 em uma solução comercial apropriada à diluição de anticorpos -
DakoCytomation Antibody Diluent (Dako, Carpinteria, CA, USA, Código
S0809), mantidos em câmara úmida, à temperatura de 2-8°C, por 12h.
A seguir, foram lavadas com solução salina tamponada (PBS) pH 7,4 por
duas vezes, por 5 min cada, à temperatura ambiente. Após lavagem, da
mesma forma que o anticorpo anti-CD1a, as lâminas foram incubadas com
anticorpo secundário anti-IgG/IgM (mouse/rabbit) biotinilado (LSAB+, Dako
Cytomation, Carpinteria, CA, USA) pronto para uso em câmara úmida
durante 45 min à temperatura ambiente, seguido de lavagem em tampão
PBS, por 2 vezes, por 5 min cada. Posteriormente, os cortes histológicos
foram incubados com complexo Streptavidina-Biotina-Fosfatase alcalina
(LSAB+, Dako Cytomation, Carpinteria, CA, USA, código K0689) pronto para
uso em câmara úmida durante 45 min à temperatura ambiente, e novamente
lavados em tampão PBS, por 2 vezes, por 5 min cada.
4.3.3 Demonstração da Expressão de iNOS
Para a demonstração da expressão de iNOS os preparados foram
primeiramente submetidos a bloqueio das reações inespecíficas através da
incubação com leite desnatado 10% (Molico, Nestlé®) em água destilada
por 30 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foram então
incubados, sem a necessidade de recuperação antigênica prévia, com o
anticorpo primário anti-iNOS, policlonal obtido em coelho (Calbiochem-
Novabiochem Corp., San Diego, USA, código 482728) na diluição de 1:500
Métodos
45
em PBS 0,01 M pH 7,4 + 1% BSA, em câmara úmida, de 2-8°C durante 12h.
Após a lavagem os preparados foram incubados durante 30 minutos à
temperatura ambiente com o anticorpo secundário anti-IgG/IgM conjugado
com um polímero de fosfatase alcalina (EnVision™ G|2-PA,
Coelho/Camundongo, Dako Carpinteria, California, USA, código 1396).
4.3.4 Demonstração de TNF alfa
Para a demonstração de TNF alfa fez-se a exposição antigênica com
solução de tripsina 0,02% em PBS 0,05 M pH 7,4 durante 10 minutos à
temperatura ambiente. O bloqueio das reações inespecíficas foi feito através
da incubação com leite desnatado 10% (Molico, Nestlé®) em água destilada
por 30 minutos à temperatura ambiente. Na seqüência, foi realizada a
incubação com o anticorpo primário anti-TNF alfa policlonal produzido em
cabra (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, Código N-19 sc-
1350) diluído 1:50 em PBS 0,01M pH 7,4 + soroalbunima bovina (BSA) 1%,
por uma noite a 4ºC. Procedeu-se à lavagem em PBS três vezes, 5 min
cada, seguida de bloqueio com Dual Endogenous Enzyme Block (Dako,
Carpinteria, CA, USA, código S2003,) e lavagem em PBS por 5 minutos.
Após lavagem os cortes histológicos foram incubados com complexo
Streptavidina-Biotina-Fosfatase alcalina (LSAB+, Dako Cytomation,
Carpinteria, CA, USA, código K0689) pronto para uso em câmara úmida
durante 45 min à temperatura ambiente, e novamente lavados em tampão
PBS, por 2 vezes, por 5 min cada.
Métodos
46
4.3.5 Demonstração de IL-10, IL-12 e IFN gama
Para a demonstração das citocinas IL-10, IL-12 e IFN gama fez-se
a exposição antigênica com tampão de citrato 0,1M pH 6,0 em banho-
maria ajustado para 95-98°C, durante 45 min da mesma forma descrita
anteriormente para os anticorpos anti-CD1a e anti-FXIIIa . A seguir ao
material foi incubado com os anticorpos primários monoclonal anti-IL-10
(R&D Systems, código MAB217) diluído a 1:25, para a detecção da IL-10;
monoclonal anti - IL-12 (R&D Systems , código MAB611) diluído1:10
para a detecção de IL-12 e monoclonal anti – INF gama (R&D Systems ,
código MAB 285) diluído 1:20 para a demonstração do INF gama em
solução comercial apropriada à diluição de anticorpos DakoCytomation
Antibody Diluent (Dako, Carpinteria, CA, USA, Código S0809), os
preparados foram mantidos em câmara úmida, à temperatura de 2-8°C,
por 12 a 16 horas. A seguir, foram lavadas com solução salina
tamponada (PBS) pH 7,4 por duas vezes, por 5 min cada, à temperatura
ambiente. Após lavagem os preparados foram incubados com o
complexo Streptavidina-Biotina-Fosfatase alcalina (LSAB+, Dako
Cytomation, Carpinteria, CA, USA) pronto para uso em câmara úmida
durante 45 min à temperatura ambiente, e novamente lavados em
tampão PBS, por 2 vezes, por 5 min cada.
Métodos
47
4.4 Análise Morfométrica
A quantificação da expressão de iNOS na epiderme, das células
dendríticas CD1a+ (Langerhans) na epiderme de dendrócitos dérmicos
FXIIIa+ na derme superficial foi realizada através da determinação da fração
de área (FA) ocupada pela imunomarcação com os anticorpos específicos.
Para isto, imagens digitais foram obtidas utilizando-se o microscópio óptico
Eclipse - 80i (Nikon, Japan), capturadas por câmera digital Nikon modelo
DS-Fi1 (Nikon, Japan) através do software NSI-elements (Nikon, Japan).
As imagens foram analisadas por sistema de assistência a análise de imagens
(CHPTool Cyclops, Brazil) desenvolvido em conjunto com o grupo Cyclops da
Universidade Federal de Santa Catarina. Para a análise da expressão de
iNOS e população de células CD1a+, foram obtidas imagens microscópicas
consecutivas, de 640×480 pixels, com aumento de 200x representativas de
toda a epiderme. Para a análise de dendrócitos dérmicos Fator XIIIa+ foram
tomadas imagens em campos consecutivos da derme papilar, com aumento
de 400x. Campos microscópicos com dobras ou com destruição tecidual
importante foram excluídos da análise. A fração de área foi determinada a
partir da contagem automática de pixels imunomarcados por cada campo de
epiderme (iNOS e células CD1a+) ou de derme superficial (FXIIIa+), ambos
selecionados manualmente pelo usuário do sistema. A partir dos valores de
fração de área obtidos de todos os campos de epiderme para a iNOS e
células de Langerhans, e de derme para as células dendritícas FXIIIa+ foi
calculada a média aritmética ponderada que representou a média de fração
de área de epiderme ou de derme superficial ocupada por expressão de iNOS
e/ou pelas células dendríticas (Anexo E, Figura 6), (Anexo F, Tabela 6).
Métodos
48
A quantificação de células dérmicas que expressaram iNOS e as
diferentes citocinas foi realizada através do cálculo da média aritmética de
células imunomarcadas por campo microscópico de 400x. Para tanto foi
utilizada uma ocular de 10x com gratículo de área conhecida (0,0625 mm
2
)
para o aumento utilizado. Fez-se a contagem de células imunomarcadas em 12
campos randomizados de derme, para cada um dos espécimes (Anexo F,
Tabela 5).
4.5 Análise da Expressão de Citocinas na Epiderme
A expressão das citocinas na epiderme foi feita de maneira cega, por
dois patologistas, através da categorização da intensidade de positividade
das reações imunoistoquímicas em dois grupos: (0) Reação ausente ou
fraca e (1) Reação moderada ou intensa (Anexo G, Tabela 6).
A estratificação em apenas duas categorias foi utilizada por ter mostrado
maior concordância entre os observadores.
4.6 Análise Estatística
Para a realização da análise estatística dos dados e construção dos
respectivos gráficos, foi utilizado o software MINITAB versão 14.
Métodos
49
A análise comparativa dos parâmetros representados por valores
numéricos contínuos entre os grupos de PLA e PLC e/ou entre as categorias
de expressão epidérmica das citocinas estudadas foi realizada através do
teste não paramétrico de Mann-Whitney. Foram comparados por este teste:
• Fração de área epidérmica ocupada por células CD1a+ dos casos
de lesões de PLA e de PLC.
• Fração de área dérmica ocupada por células Fator XIIIa+ dos
casos de lesões de PLA e PLC.
• Expressão de iNOS epidérmica e dérmica dos casos de PL e grupo
controle de pele sã, assim como nas formas aguda e crônica da
doença.
• Expressão dérmica de cada uma das citocinas estudadas (TNF alfa,
IFN gama, IL-12 e IL-10) entre o grupo de lesões de PLA e PLC.
• Expressão de iNOS na epiderme e expressão de IL-12 na
epiderme.
• Fração de área epidérmica ocupada por células CD1a+ e
expressão de IL-10 na epiderme.
A presença de correlação entre dados contínuos foi estabelecida
utilizando-se o coeficiente de correlação não paramétrico de Spearman.
Foram assim analisados:
• Correlação entre a expressão de iNOS na derme e a fração de
área de derme superficial ocupada por células dendríticas FXIIIa +
Métodos
50
nas lesões de PL e nos subgrupos de lesões das formas aguda e
crônica da doença.
• Correlação entre as expressões dérmicas de IFN gama e TNF alfa
nas lesões de PL.
• Correlação entre as expressões dérmica de IL-12 e IL-10 nas
lesões de PL.
A avaliação semi-quantitativa da expressão epidérmica das citocinas
estudadas foi comparada entre as formas aguda e crônica da doença
através do teste do qui-quadrado (χ
2
)
aplicando-se a fórmula corrigida de
Yates (χ
2
corrigido de Yates
).
A diferença entre os grupos foi considerada significativa quando o
valor de p foi menor do que 0,05.
4.7 Ética
Este projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética para
Análise de Projetos de Pesquisa- CAPPesq da diretoria Clínica do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em
sessão de 08.11. 06 sob o protocolo de pesquisa nº 1055/06 (Anexo H).
5. Resultados
Resultados
52
5.1 Caracterização da Amostra
5.1.1 Dados Clínicos
Quando analisada clinicamente a população estudada, observamos
que dos 34 casos selecionados para o estudo sete (20,6%) foram
classificados como a forma aguda da doença (PLA) (Figura 6) e 27 (79,4%)
como a forma crônica da PL (PLC) (Figura 7) (Gráfico 1).
Resultados
53
Figura 7 - Pitiríase liquenóide aguda (doente correspondente ao caso sete).
Pápulas eritemato-purpúricas, distribuídas na face flexora do braço e antebraço.
Figura 8 - Pitiríase liquenóide crônica (doente correspondente ao caso 11).
Lesões papulosas eritêmato-descamativas, algumas crostosas, ao lado de
máculas hipocrômicas no dorso.
Resultados
54
Os gráficos um a oito demonstram a distribuição da amostra de
pacientes segundo a faixa etária, sexo, etnia, característica das lesões
dermatológicas, sintomas associados, número de crises, tratamento utilizado
e duração média do tratamento em meses. O Anexo C, Tabela 3, sumariza
os dados clínicos, diagnóstico histopatológico e subclassificação clínica e
histopatológica das formas espectrais da doença dos casos em estudo.
Resultados
55
Resultados
56
Resultados
57
5.1.2 Dados Histopatológicos
Utilizando-se os critérios histopatológicos propostos por Ackerman
(1982) e Romani et al. (1998), 15 (44,1%) dos pacientes portadores de PL
foram classificados na forma aguda (PLA) e 19 (55,9%) na forma crônica da
doença (PLC). O Anexo D, Tabela 4, sumariza os parâmetros obtidos na
análise morfológica das 34 amostras teciduais estudadas. As Figuras 9 e 10
demonstram os aspectos histopatológicos das lesões de PLA e PLC,
respectivamente.
Resultados
58
Figura 9 - Pitiríase liquenóide aguda. (A e B) Epiderme exibindo extensa
necrose e apoptose de queratinócitos (A) e adelgaçamento da camada
córnea (B) (aumento original x100 (A) e x200 (B)). (C e D) Hemácias
extravazadas na derme papilar com focos de ascensão em direção à
epiderme. Presença de trombo hialino na luz de vaso superficial (D)
(aumento original x200 (C) e x400 (D)). (E e F) Infiltrado inflamatório de
mononucleares disposto ao redor do plexo vascular superficial (E) e
profundo (F) (aumento original x400). Coloração pela Hematoxilina-eosina.
Resultados
59
Figura 10 - Pitiríase liquenóide crônica. (A - D) Epiderme exibindo intensa
exocitose de linfócitos. (A) Infiltrado inflamatório de mononucleares disposto
ao redor de vasos do plexo superficial (aumento original x200). (B) Atrofia da
epiderme com alterações poiquilodérmicas na derme papilar (aumento
original x400). (C) Invasão maciça da epiderme por células linfóides, camada
granulosa mantida, apoptose mínima (aumento original x400).
(D) Espongiose e exocitose de linfócitos com células de Langerhans em íntimo
contato com linfócitos intra-epidérmicos (aumento original x1000). Coloração
pela Hematoxilina-eosina.
É importante ressaltar que não ocorreu correlação clinicopatológica
em 35,3% dos casos, principalmente em função da classificação das lesões
da forma aguda da doença. Tomando-se como referência o diagnóstico
histopatológico, a concordância clinicopatológica para os casos de PLA foi
de apenas 33,33%, e de 89,47% para os casos PLC (Gráfico 9).
Resultados
60
O subgrupo de pacientes na faixa etária pediátrica (idade ao
diagnóstico≤ 16 anos) exibiu maior número de casos da forma aguda da
doença (11/34 casos - 64,7%), já os pacientes adultos mostraram um
predomínio da forma crônica da doença (13/34 casos - 76,5%) (Gráfico 10).
Resultados
61
5.1.3 Células Dendríticas Epidérmicas (CD1a+)
As células dendríticas dérmicas CD1a+ distribuíram-se por entre os
queratinócitos da camada espinhosa da epiderme. Nas biopsias de PLA
estas células ocuparam uma menor fração de área de epiderme quando
comparados com as biopsias de PLC (Figura 11; Gráfico 11). A aparente
rarefação epidérmica de células de Langerhans nas lesões de PLA
(Figura 11A e B) foi mais proeminente na região central do segmento
epidérmico das biopsias, onde se observava maior intensidade de necrose
e/ou apoptose de queratinócitos (Figura 11A). Nos segmentos de epiderme
adjacentes a essas áreas, o número de células CD1a+ foi maior (Figura 11B),
mas não semelhante àquele observado nos casos de PLC (Figura 11C e D).
Um outro aspecto interessante foi a evidente migração de células CD1a+ da
epiderme em direção aos capilares da derme papilar, nos casos de PLC
(Figura 11D).
Resultados
62
Figura 11 - Células dendríticas CD1a+ epidérmicas em lesões de pitiríase
liquenóide aguda e crônica. A e B - Acentuada diminuição do número de
células dendríticas CD1a+ na epiderme nas lesões de PLA. (A) Epiderme da
região central da biopsia (aumento original x400), (B) Epiderme da periferia
da lesão (aumento original x400). C e D População de células dendríticas
CD1a+ na epiderme de lesões de PLC. (C) Células CD1a+ distribuídas por
entre os queratinócitos em toda a espessura da epiderme (aumento original
x400), (D) Migração de células CD1a+ em direção aos capilares da derme
papilar (aumento original x400). (Anticorpo monoclonal anti-CD1a e sistema
de revelação LSAB fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
63
Quando comparadas às frações de área epidérmica ocupada pelas
células dendríticas CD1a+ (células de Langerhans) entre os dois grupos
de PL, verificou-se que esta era menor nos casos de PLA (p=0,015)
(Gráfico 11).
5.1.4 Células Dendríticas Dérmicas (FXIIIa+)
O padrão de expressão do FXIIIa nas células dendríticas dérmicas foi
similar nos dois tipos de PL, não tendo sido observada diferença
estatisticamente significativa entre os mesmos. Em ambos os subgrupos foi
demonstrada a presença destas células, quase que exclusivamente, na
derme adjacente à junção dermo-epidérmica (Figura 12A e B) e ao redor dos
capilares do plexo vascular superficial (Figura 12C). Também foi observado
a presença de raros dendrócitos dérmicos FXIIIa+ distribuídos na derme
profunda, junto ao plexo vascular profundo (Figura 12D).
Resultados
64
Figura 12 - Distribuição de dendrócitos dérmicos FXIIIa+ em lesão de
pitiríase liquenóide crônica. Maior concentração de células FXIIIa+ na derme
superficial junto à junção dermo-epidérmica (A e B) (aumento original x200
(A) e X400 (B)) e ao redor do plexo vascular (C) (aumento original x1000).
(D) Escassa concentração de células FXIIIa+ na derme profunda,
principalmente ao redor dos vasos do plexo profundo (aumento original
x1000). (Anticorpo monoclonal anti-FXIIIa e revelação com sistema de
revelação LSAB fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
65
A fração de área de derme superficial ocupada por células dendríticas
FXIIIa+ mostrou forte correlação positiva com a expressão dérmica de iNOS
nas lesões de PL (r = + 0,641, p<0,001), esta correlação se manteve quando
comparados os subgrupos de lesões da forma aguda (r = + 0,666, p = 0,007)
e crônica (r = + 0,601, p = 0,007) da doença (Gráfico 12).
5.1.5 Expressão de iNOS
A maioria das biópsias de PL estudada apresentou expressão de
iNOS na epiderme. Esta expressão foi mais acentuada nos queratinócitos
das camadas epidérmicas mais superficiais (Figura 13A-D). Observou-se
expressão de iNOS em toda a espessura da epiderme em apenas três casos
(Figura 13E-F). As células do infiltrado inflamatório, dendrócitos dérmicos e
fibroblastos apresentaram forte expressão de iNOS (Figura 14A). A expressão
de iNOS foi também observada nas células do endotélio vascular, assim
como em outros componentes justavasculares (pericitos e dendrócitos
Resultados
66
dérmicos) (Figura 14B-D). Em apenas uma biópsia (caso 13), houve
expressão de iNOS nas células dos ductos sudoríparos écrinos.
No grupo controle de pele normal observou-se, na maioria das
amostras, ausência de expressão epidérmica de iNOS (Figura 15A).
Foi detectada discreta expressão da proteína nos queratinócitos das
camadas superficiais da epiderme de dois espécimes controles. Na derme,
houve expressão fraca no infiltrado inflamatório superficial e em células
endoteliais, em apenas um caso, nas demais amostras não foi detectada
expressão dérmica de iNOS (Figura 15B) .
Quando as reações foram realizadas, omitindo-se o anticorpo
primário anti-iNOS, não foram observadas marcações não específicas
(Figura 15C e D).
Resultados
67
Figura 13 - Expressão de iNOS na epiderme de lesões de pitiríase
liquenóide crônica. (A–D) Expressão de iNOS nas camadas espinhosa e
granulosa (A e D aumento x200; B e C x400). (E–F) Expressão de iNOS em
toda a espessura da epiderme (aumento original x400 e x1000). (Anticorpo
policlonal anti-iNOS produzido em coelho sistema de revelação EnVision
fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
68
Figura 14 – Expressão de iNOS na derme nas lesões de pitiríase liquenóide
aguda A e F e crônica B - D. (A) Expressão de iNOS nas células do infiltrado
dérmico, dendrócitos e fibroblastos (magnificação original x400). (B – D)
Expressão de iNOS no endotélio vascular e pelos elementos
justavasculares) (aumento original x1000). (E) Expressão de iNOS nos
macrófagos (aumento original x1000). (F) Expressão de iNOS pelas células
dos ductos sudoríparos écrinos (aumento original x1000). (Anticorpo
policlonal anti-iNOS produzido em coelho e sistema de revelação EnVision
fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
69
Figure 15 - Expressão de iNOS na epiderme e derme nos controles de pele
normal e na reação com omissão do anticorpo primário. A e B. Ausência de
expressão na epiderme (A) (aumento original X200) e na derme (B)
(aumento original x400) (Anticorpo policlonal anti-iNOS produzido em coelho
e sistema de revelação EnVision fosfatase alcalina e cromógeno permanent
red).C e D controles negativos (aumento original x400). (Sistema EnVision
fosfatase sem o anticorpo primário e cromógeno permanent red).
Resultados
70
A expressão de iNOS, epidérmica e dérmica, não diferiu quando
comparados os grupos de PLC e PLA. Entretanto, houve diferença
estatisticamente significativa quando comparadas as expressões de iNOS
epidérmica (p=0,0005) e dérmica (p=0,0001) entre os grupos de PL e o
grupo controle de pele normal (Gráfico 13).
.
Resultados
71
5.1.6 Expressão de TNF alfa
5.1.6.1 Expressão de TNF alfa na Epiderme
Os queratinócitos epidérmicos e algumas células de Langerhans
apresentaram expressão citoplasmática de TNF alfa (Figura 15A e B). Este
aspecto foi observado de forma semelhante nas lesões de PLA e PLC, não
tendo sido detectada diferença estatisticamente significante na expressão
epidérmica desta citocina entre estes subgrupos. Em ambas as formas de
PL a expressão epidérmica de TNF alfa foi mais proeminente em áreas de
maior espongiose e exocitose de linfócitos com alguns linfócitos intra-
epidérmicos também expressando TNF alfa (Figura 16B).
Foi detectado em nosso estudo que as lesões cutâneas de PL com
expressão epidérmica de TNF alfa moderada a intensa mostraram uma
menor fração de área de epiderme ocupada por células CD1a+ (p = 0,008)
(Gráfico 14).
Resultados
72
5.1.6.2 Expressão de TNF alfa na Derme
Quando avaliada a expressão do TNF alfa na derme, observou-se
que as células mononucleares do infiltrado inflamatório, dendrócitos
dérmicos, células endoteliais e fibroblastos, de ambos os grupos de PL,
foram positivos para o anticorpo anti-TNF alfa (Figura 16C e D). A expressão
de TNF alfa dérmica foi mais acentuada no grupo de lesões de PLA do que
no de PLC (p = 0,035) (Gráfico 15).
Resultados
73
Figura 16 - Expressão de TNF alfa na pitiríase liquenóide crônica (A e B) e
aguda (C e D). A e B - Expressão de TNF alfa nos queratinócitos, células de
Langerhans e linfócitos intra-epiteliais (A - aumento original x400; B - aumento
original X1000). C e D - Expressão de TNF alfa em macrófagos e
dendrócitos dérmicos (B) e no endotélio vascular (D) (aumento original
x1000). (anticorpo monoclonal anti- TNF alfa com sistema de revelação
LSAB fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
5.1.7 Expressão de IFN gama
5.1.7.1 Expressão de IFN gama na Epiderme
A expressão de IFN gama na epiderme foi observada no citoplasma dos
queratinócitos, de células de Langerhans e de linfócitos intra-epidérmicos
(Figura 17A e B). Esta expressão não se mostrou diferente nas formas
aguda e crônica da doença.
Resultados
74
5.1.7.1 Expressão de IFN gama na Derme
As células inflamatórias mononucleares, dendrócitos dérmicos e
endotélio vascular apresentaram imunomarcação pelo anticorpo anti-IFN
gama (Figura 17C e D). É interessante relatar que a mesma lesão que
apresentou expressão de iNOS nos ductos sudoríparos écrinos (caso 13)
mostrou, na mesma região, expressão também de IFN gama.
Figura 17 - Expressão de IFN gama na pitiríase liquenóide crônica.
A e B - Expressão de IFN gama nos queratinócitos (A e B) e no infiltrado
inflamatório superficial (B) (A – aumento original x400; B – aumento original
x1000). C e D - Expressão de IFN gama em macrófagos, dendrócitos
dérmicos (C) e no endotélio vascular (D) (aumento original x1000).
(anticorpo monoclonal anti- IFN gama com sistema LSAB fosfatase alcalina
e cromógeno permanent red).
Resultados
75
A expressão de IFN gama na derme foi maior no grupo de lesões da
forma aguda da doença (p = 0,005) (Gráfico 16).
No nosso estudo, foi observada uma correlação positiva fraca entre a
expressão dérmica de IFN gama e de TNF alfa nas lesões de PL (r=0,357,
p=0,045) (Gráfico 17).
Resultados
76
5.1.8 Expressão de IL-12
5.1.8.1 Expressão de IL-12 na Epiderme
Na avaliação da expressão da IL-12 na epiderme das lesões de PL,
observou-se imunoreatividade homogênea nos queratinócitos, de toda a
espessura da epiderme, além de expressão nos linfócitos intra-epidérmicos
(Figura 18A). Não houve diferença na expressão epidérmica de IL-12 entre
as lesões da forma aguda e crônica da doença.
Quando realizada uma análise comparativa entre as expressões
epidérmicas de IL-12 e iNOS, observou-se que nas lesões com maior
expressão epidérmica de iNOS havia uma maior expressão epidérmica de
IL-12 (p = 0,005) (Gráfico 18).
Resultados
77
5.1.8.2 Expressão de IL-12 na Derme
As células mononucleares e do infiltrado inflamatório dérmico, assim
como as células endoteliais e elementos celulares justavasculares também
apresentaram imunoreatividade para o anticorpo anti IL-12 (Figura 18B - D).
Novamente a biópsia de pele com expressão de iNOS e IFN gama nas
células dos ductos sudoríparos écrinos também mostrou imunomarcação
para a IL-12. Não houve diferença na expressão de IL-12 na derme das
lesões de PLA e PLC.
Figura 18 - Expressão de IL-12 em lesões de pitiríase liquenóide crônica. A -
Expressão de IL-12, homogênea, pelos queratinócitos de toda a espessura
epidérmica (aumento original x400). B - D – Imunomarcação nas células
mononucleares, dendrócitos dérmicos (B e C), no endotélio vascular e
elementos celulares justa-vasculares (D) com imunomarcação para IL-12
(aumento original x1000). (Anticorpo monoclonal anti-IL-12 e revelação com
sistema LSAB fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
78
5.1.9 Expressão de IL-10
5.1.9.1 Expressão de IL-10 na Epiderme
Observou-se imunomarcação intensa e homogênea dos
queratinócitos de toda a espessura da epiderme para IL-10 (Figura 19A - C).
Esse aspecto foi observado nos dois grupos de PL. Não houve diferença na
expressão epidérmica de IL-10 entre as lesões da forma aguda e crônica da
doença.
Entretanto, as lesões com expressão moderada/intensa de IL-10
epidérmica apresentaram menor população de células dendríticas
CD1a+ na epiderme (aferida pela fração de área epidérmica CD1a+)
(p=0,023) (Gráfico 19).
Resultados
79
5.1.9.2 Expressão de IL-10 na Derme
A expressão de IL-10 na derme foi observada em células
mononucleares e células endoteliais dérmicas (Figura 19C - D). Esse aspecto
foi observado nos espécimes de pele dos dois grupos de PL. Também não
foi observada diferença na expressão de IL-10 na derme entre o subgrupo
de lesões de PLA e PLC.
Figura 19 – Expressão de IL-10 nas lesões de pitiríase liquenóide crônica.
(A – C) Expressão de IL-10 nos queratinócitos (A - aumento original x400;
B - aumento original x1000; C - aumento original x200). (C – D) - Expressão
de IL-10 na derme em células mononucleares, dendrócitos dérmicos e
endotélio vascular (C-aumento original x200; D - aumento original x1000).
(Anticorpo monoclonal primário anti-IL-10 e revelação com sistema LSAB
fosfatase alcalina e cromógeno permanent red).
Resultados
80
Quando comparamos as expressões dérmicas de IL-12 e IL-10 nas
lesões de PL, observamos uma correlação negativa fraca entre a expressão
das duas interleucinas (r= - 0,339, p=0,057) (Gráfico 20).
6. Discussão
Discussão
82
A Pitiríase liquenóide (PL) é uma doença cutânea de etiologia
desconhecida e pouco freqüente. Sua incidência e prevalência não são
conhecidas. Alguns autores estimaram a incidência da doença em
aproximadamente um caso a cada duas mil pessoas (Daoud e Pittelkow,
2003).
O presente estudo compreendeu a análise de 34 pacientes da Divisão
de Clínica Dermatológica do Hospital das Clínicas FMUSP, em um período
de 12 anos, que apresentavam diagnóstico clínico, histopatológico e
evolutivo de pitiríase liquenóide. Esta casuística é semelhante à obtida por
Magro et al. (2002), em um estudo composto por 34 pacientes portadores de
PL, provenientes de dois centros médicos, em um período de 10 anos,
também utilizando os critérios clínicos e histopatológicos para a seleção dos
doentes. Uma revisão recente descreve, em 10 anos, uma casuística de 124
casos de pacientes pediátricos. A aparente discrepância no tamanho da
casuística obtida em nosso estudo, em um período de coleta semelhante,
poderia ser justificada pelo fato de que, no referido estudo, 39% dos casos
foram diagnosticados exclusivamente através do aspecto clínico das lesões
(Ersoy-Evans et al., 2007).
Discussão
83
A idade dos pacientes portadores de PL inclusos neste estudo, no
momento do diagnóstico, apresentou variação de dois a 73 anos, com média
de 21,85 anos e semelhante à casuística descrita por Magro et al. (2002).
Em nossa casuística, metade dos pacientes com diagnóstico de
pitiríase liquenóide (17/34) pertencia ao subgrupo pediátrico (idade ao
diagnóstico ≤ 16 anos). As lesões analisadas deste subgrupo de pacientes,
semelhante ao descrito na literatura, foram na sua maioria, classificadas na
forma aguda da doença (11/17) (Ersoy-Evans et al., 2007).
Encontramos uma ausência de correlação clinicopatológica em 35,3%
dos casos, sendo que esta discordância ocorreu principalmente em função
do diagnóstico da forma aguda da doença, onde a porcentagem de
concordância clinicopatológica foi de apenas 33,3%. Esta importante
discrepância foi relatada anteriormente por Tomasini et al. (2004). Os autores
explicam este achado baseado na subjetividade do diagnóstico tanto clínico
quanto histopatológico das formas da doença e na limitação da análise
histopatológica a apenas uma amostra tecidual a qual possivelmente não
representa o quadro completo e o aspecto evolutivo das lesões cutâneas.
No presente estudo, foram avaliadas apenas as biopsias iniciais dos
pacientes portadores de PL, o que poderia explicar a importante
discordância clinicopatológica observada.
A distinção entre as formas aguda e crônica da pitiríase liquenóide é,
ainda hoje, motivo de controvérsia na literatura. A maioria dos autores
defende a teoria de uma doença espectral (Shieh et al., 2001; Weinberg et
al., 2002; Tomasini et al., 2004; Magro et al., 2007), podendo ocorrer lesões
Discussão
84
simultâneas, de ambas as formas da doença em um mesmo paciente. Assim
como a ocorrência de formas intermediárias e um espectro mais grave
caracterizado pela forma ulcero-necrótica febril descrita por Degos (Degos et
al., 1966).
Embasados no acima exposto, optamos por classificar os casos
inclusos neste estudo de acordo com suas características histopatológicas,
tendo em vista que o objetivo foi a avaliação das células dendríticas, da
expressão de iNOS e do padrão de expressão de citocinas nos sítios de
lesão da PL.
À análise da população de células dendríticas cutâneas observamos
diminuição de células de Langerhans (CD1a+) nas lesões da forma aguda
da PL quando comparadas às da forma crônica da doença, sendo esta
alteração mais evidente na epiderme da porção central das lesões
biopsiadas. Estes mesmos achados foram descritos anteriormente por
Muhlbauer et al. (1994) os quais sugerem que a depleção local das células
de Langerhans (CL) nas lesões de PLA poderia estar relacionada à morte
destas células secundária ao processo de destruição da epiderme e/ou ao
processo de migração das mesmas para a derme.
A PLA exibe o processo inflamatório mais acentuado no espectro de
resposta tecidual da PL. Diminuição da população de CL pode ser
observada nos processos inflamatórios cutâneos de maior intensidade
(Larregina e Falo, 2005). Em modelos experimentais de sensibilização por
contato, a depleção CL previamente à fase de indução aumenta
drasticamente a resposta inflamatória local (Grabbe et al., 1995).
Discussão
85
Uma possível explicação para a diminuição da população epidérmica
de CL observada na PLA seria a morte destas células secundária a intensa
destruição da epiderme que ocorre nesta forma da doença. Entretanto,
mesmo na periferia das lesões onde a necrose epidérmica não foi tão
pronunciada observamos uma diminuição da população de CL em relação
ao grupo de lesões de PLC.
Por outro lado, a diminuição de CL na epiderme dos casos de PLA
poderia refletir a migração destas células para a derme pela ação de citocinas.
No nosso estudo, tanto a expressão epidérmica de TNF alfa quanto de IL-10
se correlacionaram com uma maior depleção de CL da epiderme. Estes
resultados podem ser explicados pela ação de ambas as citocinas na indução
da migração das CL. A IL-10 é uma citocina imunomodulatória que atua sobre
as CL estimulando a sua migração (Niizeki e Streilein, 1997), ao mesmo
tempo em que inibe a sua maturação (Banchereau e Steinman, 1998).
O TNF alfa, ao contrário da IL-10, induz migração e maturação dos
dendrócitos a qual é imprescindível para a eficiência da apresentação
antigênica e ativação de linfócitos T (Bedini et al., 2007).
Com base no exposto, poderíamos sugerir que nas lesões de PL, as
células de Langerhans migram com maior intensidade do microambiente
epidérmico em direção aos linfonodos regionais nas lesões da forma aguda
da doença possivelmente refletindo um maior aporte antigênico e/ou uma
resposta individual mais exuberante a determinados estímulos. No controle
deste processo está de um lado o TNF alfa propiciando uma maior eficiência
da ativação de linfócitos T específicos, secundária a qualidade da
Discussão
86
apresentação antigênica realizada pelas CL maturas. Por outro lado, a IL-10
proporcionaria uma apresentação antigênica inadequada, decorrente da
migração de CL imaturas resultando na indução de tolerância periférica a
estes antígenos podendo ser responsável pela involução das lesões,
observada em parte dos casos de PL.
O outro elemento dendrocítico cutâneo analisado, no presente estudo,
é representado pelas células dendríticas Fator XIIIa+. Estas células
mostraram-se proeminentes e abundantes nas lesões, entretanto sem
diferenças entre os grupos de PLA e PL.
O papel das células dendríticas FXIIIa+, não está ainda totalmente
definido. Estudos recentes apontam para um espectro de função desta
população dendrocítica. Estas células parecem ter variações de sua função
de acordo com o microambiente, podendo adquirir função de célula
apresentadora de antígenos (APC) à semelhança das células de
Langerhans, ou função fagocítica, como os macrófagos (Nestle e Nickoloff,
2007; Zaba et al., 2007).
Especulamos se na PL as células dendríticas dérmicas FXIIIa+
estariam atuando como APC à semelhança do que ocorre na psoríase.
Nestle et al., (1994) demonstraram que, os dendrócitos dérmicos nas lesões
cutâneas de psoríase, são mais eficientes na estimulação de linfócitos T
inativos através da maior produção de IFNγ e IL-2, quando comparados às
células dendríticas provenientes do sangue destes mesmos pacientes ou
com dendrócitos dérmicos de indivíduos sadios. Embora não tenhamos
realizado técnicas de dupla-marcação, observamos células dérmicas, com
Discussão
87
morfologia dendrítica imunomarcadas com os anticorpos anti-iNOS e anti-
TNFalfa, assim como, com anticorpos anti- INFgama, IL-12 e IL-10.
Estes achados, em consonância com o proposto por Nickoloff et al. (1991)
em relação à patogenia da psoríase, sugerem uma possível participação
desta população celular no processo inflamatório nas lesões de PL, através
da produção de citocinas pró-inflamatórias e de NO pela ação da iNOS.
Embora em nosso estudo, em relação aos dendrócitos dérmicos
FXIIIa+, não tenhamos comparado as lesões de PL com controles de pele
normal, observamos que esta população mostrou-se expressiva na derme
papilar tanto nas lesões da forma aguda, quanto da forma crônica da
doença. Como o observado por nós na PL, as células dendríticas dérmicas
FXIIIa+ apresentam-se proeminentes e participantes da resposta tecidual de
outros processos cutâneos mediados por linfócitos T (Deguchi et al., 2002).
Vale ressaltar que as células dendríticas dérmicas FXIIIa+ mostram-se
aumentadas na necrólise epidérmica tóxica, onde a expressão de iNOS
pelos queratinócitos é também observada (Hermanns-Le et al., 1999).
As células dendríticas funcionam como biosensores do microambiente
cutâneo transmitindo informações entre o sistema imune inato e adaptativo.
Devido à sua alta plasticidade desempenham ainda papel importante no
remodelamento tecidual (Larregina e Falo, 2005; Nestle e Nickoloff, 2007).
Com relação à expressão de iNOS, nosso estudo não demonstrou
diferenças entre os subgrupos de lesões de PLA e PLC. Entretanto,
observamos maior expressão epidérmica e dérmica de iNOS nas lesões de
PL quando comparadas ao grupo controle, composto por amostras de pele
Discussão
88
normal. A expressão de iNOS epidérmica no grupo controle foi observada
em apenas dois espécimes e na derme de apenas um. O grupo controle
exibiu média etária pouco superior ao do grupo de PL, o que poderia sugerir
que a expressão de iNOS nas amostras de pele normal foi menor em função
da faixa etária dos indivíduos selecionados. Contrariando esta hipótese,
Ferrini et al. demonstram que o envelhecimento é acompanhado de indução
espontânea da expressão de iNOS tecidual (Ferrini et al., 2001).
A produção de óxido nítrico (NO) tem sido descrita em condições
fisiológicas e patológicas na pele (Bruch Gerhaz et. al., 1998; Cals-Grieson
e Ormerod,2004). Nas últimas décadas o NO foi reconhecido como uma das
mais versáteis moléculas envolvidas no sistema imune. Os efeitos do NO
são pleiotrópicos e muitas vezes antagônicos, sendo dependentes de
variáveis distintas, como a concentração da molécula, microambiente e
célula-alvo, podendo tanto estimular quanto inibir a resposta inflamatória.
Efeitos protetores e tóxicos desta molécula são muitas vezes encontrados
simultaneamente (Bogdan, 2001).
A etiologia da PL é ainda hoje desconhecida. Vários trabalhos
sugerem a participação de agente infeccioso como provável fator etiológico
do processo (English et al, 1995; Smith et al., 1997; Rongioletti et al., 1999;
Tsai et al., 2001; Klein et al., 2003; Boralevi et al., 2003; Tomasini et al.,
2004; Teggi et al., 2005). Nosso estudo demonstrou expressão de iNOS
pelos queratinócitos das lesões de PL. A expressão desta sintase poderia
ser desencadeada pela ligação de algum microorganismo aos receptores de
reconhecimento do tipo Toll (TLR), com conseqüente ativação do mesmo, e
Discussão
89
indução da expressão da iNOS e produção de NO além de citocinas (Kropf
et al., 2004; Vazquez-Torres et al., 2004; Lebre et al., 2007). O NO assim
produzido, poderia mediar a resposta imune inata contra um possível
patógeno envolvido na etiologia da PL. A importância desta molécula na
imunidade inata contra patógenos já está estabelecida na leishmaniose
cutânea (Diaz et al., 2006) e em outras doenças infecciosas (Bogdan, 2001).
É importante ressaltar, que em uma das biopsias analisadas em
nosso estudo foi evidenciada a expressão concomitante de iNOS, IFN gama
e IL-12 nas células dos ductos sudoríparos écrinos. Baseado no acima
exposto, este achado poderia, novamente, sugerir a participação destas
células na imunidade inata contra patógenos. A produção de NO, por via não
enzimática, por bactéria comensais residentes neste microambiente é
importante no desenvolvimento deste tipo de resposta contra diversos
microorganismos (Weller et al., 2001). A detecção da expressão de HLA-DR
pelas células dos ductos sudoríparos écrinos nas lesões de PLA (Muhlbauer
et al., 1984) está de acordo com esta possibilidade.
Favorecendo o possível efeito protetor da expressão da iNOS e sua
atuação na resposta imune inata nas lesões de PL, observamos que, as
lesões com maior expressão de iNOS epidérmica acompanhavam-se de
maior expressão de IL-12. Este fato pode ser explicado pela atuação
desta citocina na indução da NO sintase no microambiente epidérmico
(Diaz et al., 2006). Apesar de não ter havido correlação entre expressão
epidérmica de iNOS e as demais citocinas estudadas, observamos
imunomarcação concomitante de queratinócitos com TNF alfa, IFN gama
Discussão
90
e IL-10, em ambos os grupos de PL. Nas lesões de leishmaniose cutânea
localizada a expressão concomitante de iNOS, IL-12, e IFN gama nos
queratinócitos foi associada a uma resposta imunológica de padrão Th1 e
conseqüente processo de cura das lesões (Diaz et al., 2006). A expressão
de IL-10 na epiderme das lesões de PL poderia fornecer um efeito contra-
regulatório no controle do processo inflamatório. A IL-10 não é expressa
de modo constitutivo na epiderme da pele normal, mas pode ser induzida,
por exemplo, após a exposição à radiação ultravioleta B quando
desempenha papel fundamental nos mecanismos de indução de
imunossupressão (Shen et al., 1999).
Os queratinócitos normalmente não expressam o HLA-DR,
entretanto sua expressão nestas células pode ser induzida pela ação do
IFN gama (Smith et al., 1997). Os queratinócitos ao expressar HLA-DR
podem atuar como células apresentadoras de antígeno e intervir no
processo inflamatório produzindo citocinas, influenciando a função das
células dendríticas e desempenhando papel fundamental no recrutamento
e/ou retenção de células inflamatórias no microambiente epidérmico
(Banerjee et al., 2004). Observamos, no nosso estudo, intensa expressão
de IFN gama na epiderme. Este achado é consistente com a expressão de
HLA-DR pelos queratinócitos descrita nas lesões de PLA (Muhlbauer et al.,
1984). A partir destas considerações, e do exposto anteriormente podemos
supor que nas lesões de PL os queratinócitos atuam como células
participantes do sistema imune podendo ser os iniciadores e/ou
perpetuadores do processo inflamatório.
Discussão
91
Levando-se em conta os efeitos lesivos e citotóxicos do NO (Ormerod
et al., 1999; Lerner et al., 2000; Bogdan, 2001; Lim et al., 2002) poderíamos
esperar uma maior expressão de iNOS nas lesões classificadas como PLA,
já que as mesmas mostram características de citotoxicidade mais expressivas
como a lesão epidérmica e apoptose de queratinócitos. Os resultados obtidos
sugerem que, nas lesões de PL, a presença do NO parece não estar
relacionada às alterações citotóxicas epidérmicas. Diferente do que ocorre
em outras dermatoses como a necrólise epidérmica tóxica, Síndrome de
Stevens-Johnson e nas lesões cutâneas agudas de Herpes-zóster, nas
quais a acentuada expressão epidérmica de iNOS foi relacionada a
proeminente apoptose de queratinócitos característica destes processos
(Lerner et al., 2000; Lim et al., 2002).
A PL é atualmente considerada uma discrasia linfóide, com potencial
para aparecimento e manutenção de clones e oligoclones de linfócitos
(Guitart e Magro, 2007). A expressão dérmica de iNOS, observada nas
lesões de ambas as formas de PL, poderia estar relacionada tanto com o
controle negativo da proliferação dos linfócitos T (Mannick, 2006), como com
os mecanismos de proteção da apoptose dos linfócitos infiltrantes, presente
nos processos linfoproliferativos malignos (Mannick et al., 1997; Zhao et al.,
1998; Mori et al., 1999). A proteção da indução da apoptose pelo NO,
localmente produzido via iNOS, seria um dos fatores envolvidos na
manutenção de oligoclones e clones de linfócitos nos sítios de lesão da PL.
Expressão de iNOS foi também observada de modo intenso no
endotélio vascular nas lesões de PL. O NO produzido pela iNOS, poderia
Discussão
92
representar a substância vasoativa liberada em altas doses nas lesões de PL,
proposta por Black e Marks (1972), justificando a vasodilatação e o
extravasamento de eritrócitos, que são características histopatológicas
frequentemente observadas nas lesões de PL. Esta possibilidade é reforçada
pelo fato de que, durante o processo inflamatório, citocinas modulam a função
endotelial e a indução da expressão de iNOS, contribuindo para a formação
do eritema das lesões cutâneas (Suschek et al., 2004).
A expressão de iNOS por célula endoteliais é observada em outros
processo inflamatórios e infecciosos da pele. A iNOS é expressa pelo
endotélio vascular na dermatite atópica e de contato alérgica (Rowe et al.,
1997), na hanseníase (Schon et al., 2001) nas lesões de Herpes-zoster
(Lim et al., 2002) e na pele de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico
(Belmont et al., 1997). Acredita-se que o NO produzido pela célula endotelial
poderia ter um papel regulatório, no processo inflamatório cutâneo (Belmont
et al., 1997; Rowe et al., 1997). Este efeito é mediado pelo controle da
expressão de moléculas de adesão endotelial (VCAM), intercelular (ICAM) e
E-selectina (Belmont et al., 1997). Os nossos resultados incluem a PL neste
grupo de lesões.
A expressão de iNOS na derme mostrou forte correlação com a
população de células dendríticas dérmicas FXIIIa+. Esta correlação se
manteve em ambas as formas de PL. A capacidade de produção de iNOS
por células dendríticas ainda é controversa. Existem estudos referindo a
incapacidade das células dendríticas em produzir iNOS (Blank et al., 1996).
Entretanto, outros autores demonstraram, através de técnicas de reação em
Discussão
93
cadeia da polimerase, a produção desta sintase por células dendríticas
isoladas da pele (Qureshi et al., 1996).
Diante da variedade de funções biológicas exercidas pelo NO o
significado da associação entre a expressão de iNOS e a população de
células dendríticas dérmicas FXIIIa+ nas lesões de PL é difícil de ser
determinado. Uma das possibilidades está relacionada à função sentinela
desempenhada pelas células dendríticas e mediada pelo NO como
mensageiro molecular, na transmissão de informações ao sistema imune.
A presença de correlação entre células dendríticas FXIIIa+ e expressão de
iNOS na derme superficial nas lesões de PL, se mostra como um forte
indicador do desempenho conjunto desta célula e desta molécula na interface
de comunicação entre a pele e o sistema imune central. Os dendrócitos
dérmicos pela sua localização na derme papilar e ao redor dos vasos,
funcionariam como mediadores de estímulos tanto exógenos, provenientes
da epiderme, quanto endógenos oriundos dos vasos sangüíneos
(Nickoloff et al., 1991).
Uma outra consideração a ser feita baseia-se no papel do NO (Lee et
al., 2001) e das células dendríticas dérmicas Fator XIIIa+ (Nestle e Nickoloff,
2007) no remodelamento tecidual. Entretanto, no nosso estudo, não
encontramos diferenças na intensidade de expressão dérmica de iNOS,
assim como na população de células dendríticas FXIIIA+, entre o grupo de
lesões de PLA e PLC. A PLA caracteriza-se por acentuada destruição
tecidual, seguida de maior intensidade nos processos de remodelação o que
justificaria um aumento nesta população dendrocítica e na expressão
Discussão
94
cutânea de iNOS. Entretanto, a falta de detecção de uma maior expressão
de iNOS na derme das lesões de PLA poderia ser secundária ao tempo de
evolução das lesões biopsiadas, já que foi demonstrado que a expressão de
iNOS é observada nas fases precoces do processo de reparação, com pico
de expressão 24 horas após a lesão (Lee et al., 2001).
Poucos são os trabalhos que envolvem as características da resposta
imune nos sítios de lesão da PL. O consenso da literatura atual é de que se
trata de processo mediado por linfócitos T, com imunofenótipo citotóxico
(Tomasini et al. ,2004; Wenzel et al., 2005). Encontramos somente um
trabalho na literatura que enfoca a população de CL nas lesões de PLA.
Não encontramos qualquer menção à população de dendrócitos dérmicos ou
à participação de citocinas na resposta tecidual cutânea da PL.
A detecção, no nosso estudo, de uma maior expressão de TNF alfa na
derme do grupo de lesões de PLA deve estar associada à maior magnitude da
resposta inflamatória observada neste espectro da PL. O desenvolvimento da
forma hiperaguda úlcero-necrótica da PLA foi relacionado ao aumento dos
níveis séricos de TNF alfa, sendo proporcional ao aparecimento de sinais de
citotoxicidade tecidual (Tsianakas e Hoeger, 2005).
Não houve diferença na expressão epidérmica de IFN gama entre os
grupos de PL. Entretanto, a expressão dérmica de IFN gama foi também
maior no grupo de PLA. Poderíamos relacionar esse resultado à maior
prevalência de linfócitos T citotóxicos CD8+ nesta forma da PL (Muhlbauer et
al., 1984; Tomasini et al., 2004). O recrutamento precoce de células T CD8+
seguido de apoptose dos queratinócitos, nas lesões de dermatite de contato,
Discussão
95
foi relacionado à presença de IFN gama (Akiba et al., 2002). Esta mesma
dinâmica poderia estar envolvida no desenvolvimento das lesões de PLA.
A correlação observada entre as expressões dérmicas de TNF alfa e
IFN gama nas lesões de PL, reforçam a possibilidade de predomínio de
resposta imune celular de padrão Th1 neste processo cutâneo, assim como
a ação sinérgica destas citocinas na indução de produção local de iNOS
(Liew et al., 1990).
Observamos expressão de IL-12 por queratinócitos e células
dendríticas epidérmicas nas duas formas de PL. Poderíamos especular se a
imunomarcação de queratinócitos, observada no material estudado, seria
artefactual. Além dos resultados de controles negativos das reações, as
nossas observações na PL, são embasadas por dados da literatura que
demonstram expressão e produção de IL-12 por queratinócitos em processos
inflamatórios (Yawalkar et al.,2000) e infecciosos (Diaz et al., 2005) da pele.
Como observado na PL, a expressão de IL-12 nos processos cutâneos
caracterizados por espongiose e acentuada exocitose de linfócitos, sugere a
presença de um microambiente inflamatório, composto por linfócitos T,
expressão de moléculas de adesão e co-estimulatórias e, particularmente o
IFN gama propiciando a produção de IL-12 pelos queratinócitos.
Demonstramos ainda a presença de uma correlação negativa entre a
expressão dérmica de IL-12 e IL-10 nas lesões de PL. Este achado é
consistente com a função antagônica, respectivamente pró e antiinflamatória
desempenhada por essas interleucinas. Na psoríase, que assim como a PL
é um processo cutâneo mediado por linfócitos T citotóxicos, a IL-10 participa
Discussão
96
como modulador da resposta imune (Boniface et al., 2005). A IL-10 expressa
na derme nas lesões de PL poderia funcionar como um mecanismo
modulador da resposta inflamatória e/ou monitorar a proliferação de clones
de células T(Magro et al., 2007).
A IL-10 atua também nos processos de reparação e remodelamento
cutâneos (Ohshima e Sato, 1998; Sato et al., 1999). Poderíamos interpretar
a presença de IL-10 sendo como mediadora dos processos de reparação
cutânea observada nas lesões de PL, particularmente na PLA. Apesar disto,
não encontramos maior expressão de IL-10 nos casos com maior destruição
e posterior remodelamento tecidual, observados nesta forma da PL.
Os resultados obtidos, associados aos dados de literatura, configuram
a PL como um processo cutâneo onde atuariam elementos da imunidade
inata, representados pela população de células dendríticas da pele e
produção de NO via expressão de iNOS, e da imunidade específica com
predomínio de citocinas do padrão Th1.
As características histopatológicas de citotoxicidade, como a acentuada
apoptose de queratinócitos e os sinais de agudização do processo
inflamatório observados, principalmente no espectro das lesões de PLA,
podem estar relacionadas à ação do TNF alfa e IFN gama nos sítios de lesão.
Um modelo plausível para explicar a patogênese da PL teria como
evento primário a perturbação da homeostase imune dos queratinócitos com
subseqüente ativação de células T citotóxicas efetoras. A resposta anormal
a partir do estímulo antigênico inicial, com liberação de citocinas pró-
inflamatórias e de NO, via iNOS, não controlada adequadamente pela IL-10,
Discussão
97
seria a responsável pela persistência temporal e/ou recrudescência das
lesões de PL. O NO, produzido via iNOS, propiciaria através de mecanismos
de proteção de apoptose, a manutenção de linfócitos T nos sítios de lesão
favorecendo o desenvolvimento de um ambiente de discrasia linfóide.
7. Conclusão
Conclusão
99
O presente estudo nos permitiu as seguintes conclusões:
1. A população de células de Langerhans mostrou-se diminuída nas
lesões com características histopatológicas de pitiríase liquenóide
aguda, quando comparadas as de pitiríase liquenóide crônica.
Esta depleção correlacionou-se com a maior expressão
epidérmica de interleucina 10 e fator de necrose tumoral alfa.
2. Os dendrócitos dérmicos Fator XIIIa+ mostraram-se numerosos e
proeminentes na resposta tecidual da pitiríase liquenóide,
entretanto, sem diferenças significativas entre as lesões com
características histopatológicas das forma aguda e crônica da
doença.
3. Observou-se expressão de iNOS epidérmica e dérmica
semelhante nas lesões com características histopatológicas da
pitiríase liquenóide aguda e da pitiríase liquenóide crônica.
A expressão de iNOS foi maior na pitiríase liquenóide quando
comparada ao grupo de pele normal controle.
4. Detectamos correlação positiva entre a população de dendrócitos
dérmicos fator XIIIa+ e a expressão de iNOS na derme.
Conclusão
100
5. Houve maior expressão de TNF alfa e IFN gama na derme das
lesões com características histopatológicas de pitiríase liquenóide
aguda quando comparadas às de pitiríase liquenóide crônica, as
quais se correlacionaram com a maior intensidade de alterações
inflamatórias observadas nesta forma da doença.
6. Obsevamos correlação positiva entre a expressão, na derme, do
fator de necrose tumoral alfa e de interferon gama nas lesões de
pitiríase liquenóide.
7. Houve correlação negativa entre a expressão dérmica das
interleucinas 12 e 10 nas lesões de pitiríase liquenóide.
8. Anexos
Anexos
102
Anexo A
Tabela 1 - Resumo dos estudos relatando a associação da pitiríase
liquenóide com diferentes agentes infecciosos
Autor Ano Casos Subtipo Detecção
Agente
Takahashi e
Atsumi
1993 1 PLC
cultura
Streptococcus
β
-hemolítico e
Staphylococcus
áureos
English et al.
1995 2 (casal) PLEVA
cultura
Streptococcus
β
-hemolítico
Smith et al.
1997 5 PLEVA
Não referida
HIV
Rongioletti et al.
1999 1 PLEVA
Sorologia
Toxoplasma
gondii
Tsai et al.
2001 1 FMHD
Sorol., IHC,
PCR, ISH
CMV
Boralevi et al.
2003 8/13
2-PLEVA
6-PLC
PCR VVZ
Klein et al.
2003 1 PLC
Sorologia
EBV
Tomasini et al.
2004 9/30 PLEVA
PCR
PVB19
Zechini et al.
2005 1 PLC
Sorologia, PCR
VHC
PLEVA – pitiríase liquenóide aguda, PLC– pitiríase liquenóide crônica, Sorol. – sorologia,
IHC – imunoistoquímica, ISH – hibridização “in situ”, PCR – reação em cadeia pela
polimerase, HIV – vírus da imunodeficiência humana, CMV – citomegalovírus, VZV – vírus
da Varicela-Zoster, EBV – vírus Epstein–Barr, PVB19 – parvovírus B19, VHC – vírus da
hepatite C.
Anexos
103
Anexo B
Tabela 2 - Resumo dos estudos relatando a detecção de clonalidade no
rearranjo dos genes do TCR em lesões de pitiríase liquenóide
Autor Ano Casos Subtipo Detecção Resultado
Dereure et al.
2000 20 PLEVA
PCR +
heteroduplex
Gene TCR γ
13/20 (65%)
Shieh et al.
2001 6 PLC
PCR + DGGE
Gene TCR γ
3/6
(50%)
Weinberg et al.
2002 27
14 PLEVA
13 PLC
PCR + DGGE
Gene TCR γ
8/14 PLEVA
1/13 PLC
Clone CD8
Magro et al.
2002 35
7 PLEVA
28 PLC
PCR + SSCP
Gene TCR γ
25/27
Clone CD4
Tomasini et al.
2004 40
36 PLEVA
4 PLC
PCR multi +
DGGEhigh
Gene TCR γ
3/30(10%)
Magro et al.
2007 46 PL
PCR multi+
eletroforese em gel
high
Gene TCR β
15/46(24 com
restrição)
PLEVA – pitiríase liquenóide aguda, PLC – pitiríase liquenóide crônica, PCR mult – Reação
em cadeia pela polimerase multiplex, SSCP – polimorfismo de conformação de fita simples,
DGGE – eletroforese em gel com gradiente de desnaturação, DGGE high – eletroforese em
gel de alta resolução com gradiente de desnaturação, gene TCR γ – gene da cadeia gama
do TCR, gene TCR β – gene da cadeia beta do TCR, CD4 – “Cluster differentiation “4,
CD8 – “Cluster differentiation “8.
Anexos
104
Anexo C
Tabela 3 - Subclassificação clinica e histopatológica das formas aguda e
crônica da doença e avaliação de dados clínicos e das
alterações histopatológicas nas biópsias de lesões de pitiríase
liquenóide
CASO
Dx.
clinico
Dx.
Histop.
Localização
das lesões
sintomas
Nº
crises
Ex.
dermatológico
Histopatogico
(dermatite)
1 PLC PLC T+M A 1 PED E+V
2 PLC PLEVA T+M A 0 PED V
3 PLC PLEVA UP A 0 PED E+V
4 PLC PLC T+M A 0 PED E+V
5 PLC PLC UP A 0 PH V
6 PLC PLC UP P 0 PED E+V
7 PLEVA PLC T+M A 0 PE+ CH E+V
8 PLC PLC T+M A 0 PED E+V
9 PLC PEVA UP P 1 PEC V
10 PLC PLC T+M P 0 PED E+V
11 PLC PLC T+M P 0 PEC E+L
12 PLC PLEVA U P 0 PED V+L
13 PLEVA PLEVA T+M P 0 PEP E+V
14 PLC PLC T+M A 0 PEP V+L
15 PLC PLC T+M A 0 PEA L
16 PLC PLC U P 1 PEP V
17 PLC PLEVA T+M P 1 PED E+L
18 PLC PLC T+M A 0 PED V+L
19 PLEVA PLC T+M A 0 PED+necrose V
20 PLEVA PLEVA U P 0 PEP V
21 PLC PLC U P 0 PEA E+V
22 PLC PLC T+M A 1 PED V
23 PLEVA PLEVA U P 0 PEC V
24 PLC PLC T+M P 0 PH V
25 PLC PLEVA T+M A 0 PE+ CH E+V
26 PLC PLEVA U P 0 PED E+V
27 PLC PLEVA U P 0 PED+necrose E+V
28 PLC PLC T+M P 0 PE + CH V
29 PLC PLC T+M A 0 PED V
30 PLEVA PLEVA T+M A 1 PEP E+V
31 PLC PLEVA T+M A 0 PED E+V
32 PLC PLC U P 0 PEA V+L
33 PLEVA PLEVA T+M P 0 PEC E+V
34 PLC PLEVA T+M A 0 PEA E+V
Dx – diagnóstico; Ex – exame; PED - Pápulas eritemato-descamativas; PH - Pápulas
hiperqueratósicas; PE - Pápulas eritematosas; PEC - Pápulas eritemato-crostosas; PEP -
Papulas eritemato purpúricas; PEA - Papulas eritemato acastanhadas; CH - crosta hemática;
E – espongiótica; V - vacuolar de interface; L – liquenóide; P – prurido; A – assintomático;
T+M - tronco e MMSS; U – universal; UP - universal poupando a face; Nº crises – Quantidade
de episódios de recrudescimento da erupção (0) único (1) mais que 1. Faixa de dados
tachados em cinza - grupo de pacientes na faixa etária pediátrica (≤ 16 anos).
Anexos
105
Anexo D
Tabela 4 - Avaliação do número de linfócitos intra-epidérmicos e análise
semi-quantitativa das alterações histopatológicas da epiderme e
derme nas biópsias de lesões de pitiríase liquenóide
PLEVA – pitiríase liquenóde aguda; PLC – pitiríase liquenóde crônica; Dx Histop. –
Diagnóstico histopatológico; Linf. EP – linfócitos intra-epidérmicos; Apop QT –
apoptose de queratinócitos; Espong. – espongiose; Deg. Vacuolar – degeneração
vacuolar dos queratinócitos basais; Hemácias Extravaz. – hemácias extravazadas
na derme; Infiltr. Superf. – infiltrado inflamatório comprometendo o plexo vascular
superficial; Infiltr. Prof. - infiltrado inflamatório comprometendo o plexo vascular
profundo; (0) ausente/discreta; (1) moderada/intensa; (m céls/cp) média aritmética
do número de células por campo microscópico de 400x. Faixa de dados tachados
em cinza representa o grupo de pacientes na faixa etária pediátrica (≥ 16 anos).
CASO Dx Histop.
Linf. EP
(m céls/cp)
Apop
QT
Espong.
Deg.
vacuolar
Hemácias
Extravaz.
Infiltr.
Superf.
Infiltr.
Prof.
1
PLC 7,25 1 0 0 1 1 1
2
PLEVA 28,75 1 1 1 1 1 1
3
PLEVA 17,75 1 1 1 1 1 1
4
PLC 13 1 1 1 0 1 0
5
PLC 8,25 0 0 0 1 1 0
6
PLC 4 0 0 0 0 0 0
7
PLC 3 0 1 0 1 1 0
8
PLC 4 0 1 0 0 1 0
9
PLEVA 37,5 1 1 1 1 1 0
10
PLC 33 0 0 0 0 1 0
11
PLC 3,5 0 1 0 1 1 0
12
PLEVA 33 0 1 0 0 1 0
13
PLEVA 16 0 1 1 1 1 1
14
PLC 14,75 0 1 0 1 1 0
15
PLC 1,5 1 0 1 0 1 0
16
PLC 4,5 0 0 0 0 1 0
17
PLEVA 30,5 0 1 1 1 1 0
18
PLC 64 1 1 0 0 1 0
19
PLC 8 0 0 0 0 0 0
20
PLEVA 13,75 1 1 1 1 1 0
21
PLC 11 0 0 0 0 1 0
22
PLC 14,25 0 0 0 0 0 0
23
PLEVA 65,75 1 1 1 1 1 1
24
PLC 39,5 1 1 0 1 1 1
25
PLEVA 28,5 1 1 1 1 1 1
26
PLEVA 45,5 0 1 1 0 1 0
27
PLEVA 61,25 1 0 0 0 1 0
28
PLC 11,5 0 0 0 0 0 0
29
PLC 28,25 0 1 1 0 1 1
30
PLEVA 9 1 0 1 1 1 1
31
PLEVA 39,25 1 0 1 1 1 1
32
PLC 25 1 0 1 0 1 0
33
PLEVA 27 1 0 0 1 1 1
34
PLEVA 46,25 1 1 1 1 1 1
Anexos
106
Anexo E
Figura 6 - Metodologia computacional utilizada na determinação da fração
de área (FA)
Figura 6 – Determinação da fração de área (FA). A – Captura da imagem
a ser analisada e seleção manual de pontos representativos da
positividade da reação. B e C – Determinação computacional do espaço
elipsoidal a partir da distância de Mahalanobis dentro do cubo RGB
ocupado pelos tons selecionados. D - Seleção manual da área de
interesse (epiderme). E - Determinação computacional da área ocupada por
pixels referentes à positividade da reação e da área total do polígono de
interesse (epiderme). E - Cálculo da fração de área ocupada pela positividade
da reação (pontos marcados) em cada caso a partir da média ponderada
das análises de cada campo.
Anexos
107
Anexo F
Tabela 5 - Diagnóstico histopatológico e avaliação quantitativa das células
dendríticas cutâneas, expressão epidérmica e dérmica de iNOS
e dérmica do fator de necrose tumoral alfa, interferon gama e
das interleucina 10 e 12 nas biopsias de lesões de pitiríase
liquenóide
CASO
Dx.
histopatol.
FA-CD1a
EP
FA-FXIIIa
EP
FA-iNOS
EP
iNOS
derme
*
TNF-a
derme
*
IFN-g
derme
*
IL-12
derme
*
IL-10
derme
*
1 PLC 0,029 0,002 0,069 11,25 NA 48,25 34,88 4,75
2 PLEVA 0,002 0,004 0,177 15,75 15,13 37,00 3,75 103,75
3 PLEVA 0,015 0,010 0,157 1,25 NA 27,75 9,75 13,25
4 PLC 0,005 0,011 0,127 4,00 12,75 12,50 23,38 15,25
5 PLC 0,010 0,023 0,345 5,25 10,00 12,75 25,00 18,50
6 PLC 0,030 0,021 0,389 10,50 13,50 8,63 1,00 27,25
7 PLC 0,016 0,008 0,031 1,50 5,38 10,50 0,75 NA
8 PLC 0,034 0,004 0,151 2,25 6,50 16,63 13,75 23,25
9 PLEVA 0,016 0,002 0,359 5,25 18,25 24,00 30,25 0,75
10 PLC 0,009 0,003 0,417 2,50 4,00 15,13 13,00 8,75
11 PLC 0,073 0,027 0,053 6,75 38,50 75,38 36,63 17,00
12 PLEVA 0,016 0,008 0,149 2,75 25,38 87,00 11,38 NA
13 PLEVA 0,020 0,009 0,323 2,75 12,25 2,38 21,00 17,25
14 PLC 0,010 0,001 0,205 0,50 12,50 1,63 10,50 22,75
15 PLC 0,055 0,055 0,654 8,25 26,96 9,75 54,00 2,00
16 PLC 0,027 0,008 0,181 1,25 20,88 2,13 23,38 2,00
17 PLEVA 0,040 0,006 0,175 0,50 47,00 4,63 8,75 36,00
18 PLC 0,053 0,008 0,336 6,25 19,88 33,38 0,00 72,75
19 PLC 0,040 0,004 0,098 14,75 25,38 0,88 4,88 40,25
20 PLEVA 0,002 0,017 0,188 0,50 10,50 14,13 9,25 70,75
21 PLC 0,018 0,005 0,080 3,25 11,63 12,88 11,50 4,00
22 PLC 0,103 0,008 0,173 1,50 4,13 4,00 3,75 7,00
23 PLEVA 0,001 0,001 0,043 0,00 39,25 22,50 1,88 8,50
24 PLC 0,018 0,009 0,205 2,75 20,75 12,63 5,25 41,25
25 PLEVA 0,032 0,024 0,236 9,50 20,38 38,00 8,50 12,75
26 PLEVA 0,030 0,010 0,107 3,25 15,25 15,88 5,38 11,75
27 PLEVA 0,001 0,008 0,275 0,50 7,50 29,38 10,00 25,75
28 PLC 0,064 0,008 0,365 1,75 3,38 14,00 15,50 16,25
29 PLC 0,097 0,081 0,395 17,00 4,13 0,38 6,50 66,25
30 PLEVA 0,037 0,010 0,280 14,00 23,25 26,75 6,00 3,75
31 PLEVA 0,012 0,026 0,308 20,25 32,88 34,25 24,75 62,00
32 PLC 0,030 0,007 0,066 3,25 29,13 26,38 10,13 15,75
33 PLEVA 0,027 0,019 0,152 1,50 30,63 24,50 4,50 51,00
34 PLEVA 0,009 0,012 0,192 1,75 35,25 36,75 37,25 55,25
PLEVA – pitiríase liquenóide aguda; PLC – pitiríase liquenóide crônica; Dx Histop. –
Diagnóstico histopatológico; EP – epiderme; FA – fração de área; IFN-g – interferon gama;
TNF- a – fator de necrose tumoral alfa; * - média de células que expressam a citocina por
campo; NA – não avaliado. Faixa de dados tachados em cinza - grupo de pacientes na faixa
etária pediátrica (≤ 16 anos).
Anexos
108
Anexo G
Tabela 6 - Diagnóstico histopatológico e avaliação semi-quantitativa da
expressão das interleucina 10 e 12, interferon gama e fator de
necrose tumoral alfa na epiderme nas biopsias de lesões de
pitiríase liquenóide
CASO
Diagnóstico
histopatológico
IL-10 EP IL-12 EP TNF alfa EP IFN gama EP
1
PLC 0 1 1 0
2
PLEVA 1 1 0 0
3
PLEVA 1 0 NA 0
4
PLC 1 1 1 0
5
PLC 1 1 0 0
6
PLC 1 0 1 0
7
PLC NA 0 0 0
8
PLC 0 0 0 0
9
PLEVA 0 1 0 1
10
PLC 1 1 1 0
11
PLC 1 0 0 0
12
PLEVA NA 0 0 0
13
PLEVA 1 1 0 0
14
PLC 1 1 1 1
15
PLC 0 1 0 0
16
PLC 0 1 0 0
17
PLEVA 1 1 0 0
18
PLC 1 0 0 0
19
PLC 0 0 0 0
20
PLEVA 1 0 0 0
21
PLC 0 0 0 0
22
PLC 0 0 0 0
23
PLEVA 0 0 1 0
24
PLC 1 0 0 0
25
PLEVA 0 0 0 0
26
PLEVA 0 0 1 0
27
PLEVA 1 1 1 1
28
PLC 1 1 0 1
29
PLC 0 1 0 0
30
PLEVA 0 0 0 1
31
PLEVA 1 0 1 0
32
PLC 1 0 1 1
33
PLEVA 0 0 1 0
34
PLEVA 1 1 1 1
PLEVA – pitiríase liquenóde aguda; PLC – pitiríase liquenóde crônica; EP - epiderme IFN –
interferon; TNF – fator de necrose tumoral; (0) ausente/discreta; (1) moderada/intensa.
Faixa de dados tachados em cinza representa o grupo de pacientes na faixa etária
pediátrica (≥ 16 anos).
Anexos
109
Anexo H - Aprovação pelo comitê de Ética e Pesquisa
9. Referências
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