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SIMONE APARECIDA PROBST CONDÉ
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ROXITROMICINA NA REGRESSÃO DA
HIPERPLASIA GENGIVAL INDUZIDA PELA CICLOSPORINA EM
RATOS
Juiz de Fora
2007
Universidade Federal de Juiz de Fora
Mestrado em Saúde Brasileira
Núcleo Interdisciplinar de Estudos e Pesquisas
em Nefrologia - NIEPEN
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SIMONE APARECIDA PROBST CONDÉ
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ROXITROMICINA NA
REGRESSÃO DA HIPERPLASIA GENGIVAL INDUZIDA
PELA CICLOSPORINA EM RATOS
Orientadores: Marcus Gomes Bastos
Fernando Monteiro Aarestrup
Juiz de Fora
2007
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Saúde Brasileira pela
Universidade Federal de Juiz de Fora, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de
Mestre. Área de concentração: Nefrologia
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Condé, Simone Aparecida Probst
Avaliação do Efeito da Roxitromicina na Regressão
da Hiperplasia Gengival Induzida pela Ciclosporina
em Ratos / Simone Aparecida Probst Conde. Juiz de Fora, 2007
125 f.
Dissertação de Mestrado (Saúde Brasileira -
Programa de Pós-Graduação Saúde Brasileira) -Universidade Federal
de Juiz de Fora
Orientador: Marcus Gomes Bastos
Bibliografia: f.
1. HIPERPLASIA GENGIVAL. 2. ROXITROMICINA.
3. TGF-
2
. I. Universidade Federal Fluminense. II.Título.
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SIMONE APARECIDA PROBST CONDÉ
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ROXITROMICINA NA REGRESSÃO DA
HIPERPLASIA GENGIVAL INDUZIDA PELA CICLOSPORINA EM RATOS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Saúde
Brasileira pela Universidade Federal de Juiz de Fora, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Nefrologia
ORIENTADORES
ENTADO
Prof. Dr.Marcus Gomes Bastos
Departamento de Clínica Médica / Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
Prof. Dr. Fernando Monteiro Aarestrup,
Centro de Biologia da Reprodução, Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental
Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
BANCA EXAMINADORA
Prof. Drª. Neuza Maria Souza Picorelli Assis
Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
Profª. Drª. Aparecida Alves do Nascimento
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro - RJ
Prof. Dr.Marcus Gomes Bastos
Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
Juiz de Fora, ___ de _____________ de 2007
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AGRADECIMENTOS
Às duas pessoas mais importantes para a minha caminhada profissional: aos
mestres Fernando Monteiro Aarestrup e Marcus Gomes Bastos, por sempre
acreditarem em mim, e, principalmente, me fizeram despertar para a pesquisa com
entusiasmo e dedicação. Toda minha gratidão e respeito.
Aos meus pais queridos que contribuíram para minha formação como pessoa, me
mostraram o quê é essencial na vida e serão sempre meu norte.
Ao meu amor Sérgio, pelo companheirismo e, principalmente, pela felicidade de tê-lo
ao meu lado sempre.
Aos amigos, em especial, à Beatriz e à Luciana pela amizade, disposição e toda
ajuda indispensável para realização desse trabalho, assim como a de Ivo durante o
modelo experimental.
Aos familiares, principalmente, aos irmãos que tanto me incentivaram e
compreenderam a ausência.
Enfim, a todos que torceram por mim e que direta ou indiretamente contribuíram
para a conclusão dessa dissertação.
´´´´
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5
SUMÁRIO
1. Introdução .........................................................................................................12
1.1. Hiperlasia Gengival nos Pacientes Transplantados Renais .......................12
1.2. Histofisiologia do Periodonto ......................................................................15
1.3. Características Clínicas e Histológicas da HG ...........................................19
1.4. Fatores Predisponentes ..............................................................................26
1.5. Patogênese da HG .....................................................................................34
1.6. Tratamento da HG ......................................................................................42
2. Objetivos ............................................................................................................47
3. Material e Métodos ............................................................................................48
3.1. Animais de Experimento .............................................................................48
3.2. Experimento: Avaliação do Efeito Terapêutico da Roxitromicina na HG......49
3.3. Análise Macroscópica da HG.......................................................................51
3.4. Análise Histopatológica da HG ....................................................................54
3.5. Estudo Imuno-histoquímico .........................................................................57
3.6. Análise Estatística .......................................................................................59
4. Resultados..........................................................................................................60
4.1. Artigo 1 ........................................................................................................61
4.2. Artigo 2 ........................................................................................................81
4.3. Artigo 3 ........................................................................................................94
5. Comentários Finais........... ................................................................................116
6. Referências Bibliográficas.................................................................................117
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12
5
ABREVIATURAS E SIGLAS
ABTO: Associação Brasileira de Transplante de Órgãos
AMP: ampicilina
AZI: azitromicina
Bcl-2: oncogene
CBR: Centro de Biologia da Reprodução
COX-2: ciclooxigenase 2
CsA: ciclosporina
CTGF: fator de crescimento de tecido conjuntivo
FGF-2: fator de crescimento de fibroblastos 2
HE: hematoxilina e eosina
HG: hiperplasia gengival
HLA-A: antígeno do MHC classe I - A
HLA-B: antígeno do MHC classe I - B
HLA-C: antígeno do MHC classe I - C
HLA-DR1: antígeno do MHC classe II – DR1
HLA-DR2: antígeno do MHC classe II – DR2
IL-1: interleucina 1
IL-1B: interleucina 1B
IL-6: interleucina 6
LPS: lipopolissacarídeos
MAP quinase: proteína quinase ativada por mitógeno
MMG: morfometria da mucosa gengival
MMP: metaloproteinase
MMP-13: metaloproteinase 13
mRNA: RNA mensageiro
g/ml: nanogramas por mililitro
NF-b: fator nuclear appa B
NIF: nifedipina
OP-17: metabólito da ciclosporina
PAB: diaminobenzina
PAP: complexo peroxidade anti-peroxidase
PBS: tampão fosfato
PCR: técnica de reação em cadeia da polimerase
PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas
PDGF-B: fator de crescimento derivado de plaquetas B
ROX: roxitromicina
TGF
1
: fator de crescimento transformador
1
TGF
2
: fator de crescimento transformador
2
TGF
3
: fator de crescimento transformador
3
TNF-: fator de necrose tumoral
UFJF: Universidade Federal de Juiz de Fora
9
12
5
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 – Aspecto geral do periodonto
Figura 02 – Aspecto clínico de paciente transplantada renal que faz uso de
ciclosporina
Figura 03 – Aspecto clínico de paciente transplantado cardíaco que faz uso de
ciclosporina e amilodipina
Fig. 04 – Esquema terapêutico dos animais dividido em semanas
Figura 05 –
Moldagem em silicona de condensação para obtenção de modelo de
gesso para análise morfométrica da região maxilar anterior superior dos ratos
Fig. 06 – Morfometria da mucosa gengival anterior (MMG), utilizando um paquímetro
digital
Fig. 07 – Histomorfometria. Demonstração de contagem de células inflamatórias
(aumento 400x).
Fig. 08 – Histomorfometria. Demonstração de marcação do epitélio e tecido
conjuntivo de animal do grupo 1/ controle negativo - mucosa gengival (aumento
100x).
10
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5
CONDÉ, S.A.P. Avaliação da Roxitromicina na regressão da hiperplasia
gengival induzida pela ciclosporina em ratos. Juiz de Fora (MG), 2007. 125 f.
Dissertação de Mestrado (Programa de Pós-graduação em Saúde) – Faculdade de
Medicina, Universidade Federal de Juiz de Fora
RESUMO
A hiperplasia gengival (HG) é um efeito colateral comum do uso crônico da
ciclosporina (CsA), imunossupressor amplamente usado em pacientes
transplantados para evitar a rejeição de órgãos. Estudos recentes demonstraram
níveis elevados de citocinas específicas no tecido gengival hiperplasiado,
principalmente o TGF-, sugerindo que esse fator de crescimento tenha um papel no
acúmulo da matriz extracelular visto na hiperplasia gengival. O tratamento para essa
complicação, até pouco tempo, era somente cirúrgico. Hoje vários estudos
demonstraram a eficácia da azitromicina, antibiótico macrolídeo, na regressão desse
efeito colateral indesejado causado pelo imunossupressor. No presente estudo, foi
realizado um modelo experimental para avaliação do efeito terapêutico da
roxitromicina na HG. Foram utilizados 32 ratos divididos em quatro grupos, com
indução da HG em cinco semanas e tratamento com a droga na 6ª semana (grupo A
– animais que receberam salina; grupo B – animais que receberam CsA e foram
tratados com salina na 6ª semana; grupo C – animais que receberam CsA e, na 6ª
semana, ampicilina e grupo D – animais que receberam CsA durante 5 semanas e,
na seguinte, foram tratados com roxitromicina). Portanto, neste estudo foi avaliado o
efeito da roxitromicina no tratamento da HG. Adicionalmente, a expressão do fator
de crescimento transformador beta (TGF-
2
) foi investigado, através da técnica de
imunohistoquímica, pelo método do complexo avidina-biotina peroxidase anti-
peroxidase, com a finalidade de melhor compreender a patogênese da HG. Os
resultados demonstraram que a roxitromicina foi efetiva na regressão da hiperplasia
gengival induzida pela ciclosporina em ratos. Houve redução significativa da mucosa
gengival, com redução do número de fibroblastos, das áreas de fibrose e de
infiltrado inflamatório, assim como da expressão do TGF-
2
em ratos tratados com a
roxitromicina quando comparados com os grupos controles. Portanto, os dados
sugerem que a diminuição da expressão do TGF-
2
pode ser um importante
mecanismo de ação pelo qual a roxitromicina inibe a HG.
Palavras-chave: hiperplasia gengival, ciclosporina, roxitromicina, TGF-
2
11
12
5
CONDÉ, S.A.P. Evaluation of roxithromycin effects in the reduction
cyclosporin-induced gingival overgrowth in rats. Juiz de Fora (MG), 2007. 125 f.
Dissertação de Mestrado (Programa de Pós-graduação em Saúde) – Faculdade de
Medicina, Universidade Federal de Juiz de Fora
ABSTRACT
Gingival overgrowth (GO) is a common side effect of the chronic use of
cyclosporine (CsA), an immunosuppressive drug which is widely used to prevent
organ rejection in transplant patients. Recent studies have shown elevated levels of
specific cytokines in hyperplastic gingival tissue, particularly TGF-ß, which suggests
that this growth factor plays a role in the accumulation of extracellular matrix in
gingival hyperplasia. Treatment for this complication, until recently, was only surgical.
Today, several studies have demonstrated the effectiveness of azithromycin, a
macrolide antibiotic, in the regression of this undesirable side effect caused by the
immunosuppressant. In this study, an experimental model for assessing the
therapeutic effect of roxithromycin in GO was created. We used four groups of mice
totaling 32 individuals. GO was induced during five weeks and drug treatment was
given on the 6
th
week as follows: group A – animals received saline; group B –
animals received CsA and were treated with saline on the 6
th
week; group C –
animals received CsA and, on the 6
th
week, ampicilin; and group D – animals
received CsA during 5 weeks and, on the 6
th
week, were treated with roxithromycin.
Therefore, this study evaluated the effect of roxithromycin in the treatment of GH.
Additionally, we investigated the expression of transforming growing factor beta
(TGF-
2
) through an immunohistochemical technique (avidin-biotin-peroxidase-
antiperoxidase complex) in order to better understand the pathogenesis of GO.
Gingival mucosa showed a decrease of thickness with a lower number of fibroblasts,
with reduction of fibrosis areas and decrease of inflammatory infiltrate, and a
significant reduction of TGF-
2
expression in roxithromycin treated rats in comparison
with animals from the control groups. The present data suggest that the down-
regulation of TGF-
2
expression may be an important mechanism of action by which
roxithromycin inhibits GO.
Key-words: gingival overgrowth, cyclosporine, roxithromycin, TGF-
2
12
12
5
1 – INTRODUÇÃO
1.1 –
Hiperplasia gengival em pacientes transplantados
renais
A hiperplasia gengival (HG) é uma condição patológica comum em
pacientes transplantados que fazem uso crônico de medicação imunossupressora,
especificamente a ciclosporina, provocando outros efeitos colaterais, tais como,
nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, neurotoxicidade, hipertensão, hipertricose, entre
outros (RATEITSCHAK-PLUSS et al., 1983; KAHAN, 1989).
A ciclosporina (CsA) é produzida a partir do fungo Tolypocladium inflatum
gams, sendo um polipeptídio cíclico neutro, hidrofóbico, composto por onze
aminoácidos. Atua, especificamente, na supressão da resposta imune mediada por
células. É uma droga imunossupressora largamente usada para prevenir a rejeição
13
12
5
de órgãos transplantados (YOSHIDA, NAGATA, YAMANE, 2005), além de utilizada
no tratamento de diversas doenças auto-imunes, tais como diabetes mellitus, doença
de Behcet, psoríase, esclerose múltipla, líquen plano erosivo, lúpus eritematoso
sistêmico (JAMES, IRWIN, LINDEN, 1996), pênfigo bolhoso, artrite reumatóide,
miastenia gravis, uveítes e diversas glomerulopatias (KAHAN, 1989; DE MATTOS et
al., 1996). A droga sofre biotransformação no fígado, resultando em 14 produtos
metabólicos, sendo que 90% são excretados pelas fezes e 10% eliminados pelos
rins (SEYMOUR, THOMASON, ELLIS, 1996).
O primeiro relato na literatura abordando a indução da HG pela CsA foi
em 1983 (RATEITSCHAK-PLUSS et al., 1983). Estudos subseqüentes indicaram
uma prevalência média de pacientes transplantados dentados, desenvolvendo essa
complicação, em torno de 30%, com uma variação entre 10 a 85% (WYSOCKI et al.,
1983; DALEY, WYSOCKI, DAY, 1986; SEYMOUR, SMITH, ROGERS, 1987;
WONDIMU et al., 1993; ALLMAN et al., 1994). Quando associada a outros
medicamentos, como os anti-hipertensivos bloqueadores de canais de cálcio, essa
prevalência aumenta, assim como a severidade, potencializando o risco. Essas
drogas são freqüentemente usadas para o controle da pressão arterial em
transplantados renais (THOMASON, SEYMOUR, RICE, 1993; BÖKENKAMP et al.,
1994; O´VALLE et al., 1995; MARGIOTTA et al., 1996, RAMALHO et al., 2003). Em
um estudo que avaliou três medicamentos do grupo dos bloqueadores de canais de
cálcio quanto ao risco de desenvolvimento da HG, a nifedipina induzia clinicamente
mais que a amilodpina e o diltiazem (ELLIS, SEYMOUR, STEELE, 1999).
TAVASSOLI et al. (1998) observaram a presença de HG em 29% dos pacientes que
14
12
5
faziam uso de nifedipina (NIF), em graus variados. O´VALLE et al. (1995)
demonstraram uma diferença nos achados morfométricos em pacientes controle,
tratados somente com ciclosporina e tratados com a combinação de CsA e NIF,
sendo esse último mais acentuado. MARGIOTTA et al. (1996) encontraram uma
prevalência de 33,7% no grupo que foi administrado somente ciclosporina e 60% no
grupo em que as drogas foram associadas, sugerindo um efeito sinérgico, pois
ambas as drogas atuam na homeostase dos íons cálcio na célula, embora com
mecanismos diferentes, reduzindo a atividade colagenolítica dos fibroblastos.
15
12
5
1.2 – Histofisiologia do periodonto
O conhecimento das características normais do periodonto é de grande
importância para se comparar com os aspectos assumidos do mesmo na hiperplasia
gengival induzida por ciclosporina. Uma vez estabelecidas as diferenças pode-se
compreender melhor os mecanismos pelos quais a droga atua nos tecidos bucais.
O periodonto (peri = em torno de, odonto = dente) compreende os
seguintes tecidos: gengiva, ligamento periodontal, cemento radicular e osso alveolar
(Fig. 01). Esses elementos proporcionam a inserção e a estabilidade necessárias
para que o dente desempenhe suas funções. A mucosa bucal é dividida em: mucosa
mastigatória (gengiva, revestimento do palato duro), mucosa especializada (dorso da
língua) e o restante chamado de mucosa de revestimento. A mucosa gengival
recobre o colo anatômico dos dentes, o cemento supra-alveolar e uma porção do
osso alveolar, limitada apicalmente pela linha muco-gengival e coronariamente pela
crista gengival marginal (TEN CATE, MILLS, SOLOMON, 1971; JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2004).
A gengiva é dividida em livre (marginal e interdentária) e inserida.
Apresenta coloração rósea, ausência de sangramento ou exsudação, consistência
firme e resistência à sondagem no sulco gengival
.
Histologicamente, o tecido
16
12
5
gengival é revestido por epitélio escamoso estratificado, sendo que a mucosa inclui
porções queratinizadas, correspondentes à porção bucal e não-queratinizadas,
correspondentes ao epitélio do sulco e ao epitélio juncional (LINDHE & KARRING,
2005). Entre a gengiva livre marginal e a superfície dentária, existe um espaço
virtual, em forma de “V”, formando o sulco gengival; sua profundidade normal é de
um a dois milímetros nas superfícies vestibular e lingual ou palatina e de um a três
milímetros nas superfícies interproximais. O epitélio de revestimento deste sulco é
mais permeável do que as demais áreas da mucosa gengival, o que facilita as trocas
de substâncias entre os meios interno e externo. A base do sulco gengival é formada
pelo epitélio juncional, responsável pela união do tecido conjuntivo gengival ao dente
e pela separação entre meio interno (periodontal) e externo (bucal). O número de
células do epitélio juncional vai diminuindo à medida que se aproxima da junção
amelo-cementária, formando, na porção mais profunda, a lâmina basal interna
voltada para o dente e a lâmina basal externa voltada para o tecido conjuntivo (TEN
CATE, MILLS, SOLOMON, 1971). O tecido conjuntivo gengival é denso e fibroso,
dividido em camada papilar (subepitelial) e reticular (supraperióstea). É composto
por fibras colágenas que sustentam o epitélio gengival e juncional, organizadas em
feixes cresto-gengival, gengival-dentário, dento-periósteo, circular e transeptal.
O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo frouxo, composto por
fibras colágenas e matriz intercelular, altamente vascularizado e celular,
apresentando vasos linfáticos e nervos. Circunda as raízes dos dentes e une o
cemento ao osso alveolar. São divididos nos seguintes grupos: cresto-alveolar,
horizontal, oblíquo e apical. As células do ligamento periodontal são: fibroblastos,
17
12
5
osteoblastos, osteoclastos, cementoblastos, macrófagos teciduais ocasionais, além
de células epiteliais e nervosas (LINDHE & KARRING, 2005).
O cemento reveste a superfície radicular dos dentes, corresponde a um
tecido calcificado especializado, sem inervação e vascularização. É constituído por
uma porção orgânica composta por fibras colágenas e uma porção mineral, formada
por cristas de hidroxiapatita. Insere as fibras do ligamento periodontal à raiz e
contribui para o processo de reparo após danos à superfície radicular.
O osso alveolar é responsável pela sustentação dentária, diferindo do
tecido ósseo de outras regiões, pois na ausência de dentes sofre reabsorção.
18
12
5
Fig. 01: Aspecto clínico e anatômico do periodonto. gl – gengiva livre; gi – gengiva inserida; mg –
mucosa gengival; e – esmalte; d – dentina; p – polpa; lg – ligamento gengival; tc – tecido conjuntivo; lp
– ligamento periodontal; oa – osso alveolar; c – cemento; jac – junção amelo-cementária; sg – sulco
gengival; ej – epitélio juncional; es – epitélio do sulco gengival; cgm – crista gengival marginal.
19
12
5
1.3 – Características clínicas e histológicas da HG
O surgimento da hiperplasia gengival induzida por ciclosporina ocorre, em
média, três meses após o início da administração do imunossupressor (SEYMOUR,
JACOBS, 1992). Surge na papila interdentária, adquirindo uma aparência lobulada,
aumentando de tamanho e se estendendo para a superfície dentária (NEWELL E
IRWIN, 1997) (Figs. 02 e 03).
20
12
5
Fig. 02 – Paciente transplantado renal há 8 anos e 7 meses, fazendo uso
de ciclosporina e apresentando HG severa.
21
12
5
Fig. 03 – Paciente transplantado cardíaco há 1 ano e 2 meses,
fazendo uso de ciclosporina e amilodipina, apresentando HG
moderada.
22
12
5
A avaliação do grau de HG, em humanos, mais utilizada, é determinada
de acordo com o índice proposto por SEYMOUR, SMITH, TURNBULL (1985),
medindo-se em modelo de gesso superior e inferior anterior à papila interdentária
labial e palatal/lingual entre os caninos superiores e inferiores, avaliando o quanto a
papila invadiu a superfície incisal dos dentes (“score” 0-3) e a espessura da papila
labio-palatal/lingual (“score” 0-2). O índice máximo para cada papila é cinco e se
todas as 20 papilas estiverem envolvidas o “score” é 100, representando uma HG
severa, acometendo os tecidos gengivais labiais, palatais ou linguais superiores e
inferiores dos dentes anteriores.
As características clínicas vão desde um tecido não inflamado, firme e
fibroso até um tecido com aspecto hemorrágico, edematoso e inflamado, chegando a
cobrir a superfície dentária (SPRATT et al., 1999).
A região mais acometida é a superior e anterior, sendo mais severa
próxima aos caninos. Afeta toda a cavidade bucal, incluindo as faces labial, bucal,
palatal, lingual (DALEY & WYSOCKI, 1984; THOMASON et al., 1996; GÓMEZ et al.,
1997), porém é mais pronunciado na superfície labial da gengiva do que nas demais.
(SEYMOUR, THOMASON, ELLIS, 1996). Não tem diferença significativa entre o
grau de desenvolvimento da hiperplasia na maxila e na mandíbula (THOMASON,
SEYMOUR, ELLIS, 1996). O crescimento gengival induzido pela ciclosporina afeta
23
12
5
quase que exclusivamente indivíduos dentados, porém, THOMAS, NEWCOMBE,
OSBORNE (2000) encontraram esse efeito colateral em um paciente edêntulo,
apesar de outros autores sugerirem que áreas com ausência de dentes não são
acometidas pela hiperplasia gengival (WISOCKI et al., 1983; MORISAKI et al.,
1993).
Estudos experimentais em ratos têm demonstrado que a largura buco-
lingual, mésio-distal e vertical da papila dentária encontra-se significativamente
maior no grupo teste (tratado com CsA), quando comparados com o grupo controle
(FU et al., 1995; CHEN et al., 2005). Resultados semelhantes foram encontrados
nas dimensões gengivais das regiões maxilares e mandibulares de ratos expostos a
CsA por duas, quatro e seis semanas. Foi observado também, nesse estudo, a
alteração no posicionamento com a separação dos incisivos centrais nos ratos
tratados com CsA, entretanto os ratos do grupo controle não apresentavam essas
características. Eles sugerem que a presença de diastema deve ser resultado da
expansão do tecido gengival hiperplasiado. Esta condição está presente em
humanos, podendo apresentar o reposicionamento espontâneo dos dentes, após
cirurgia periodontal em pacientes com HG severa induzida pela CsA. (FU et al.,
1996).
A hiperplasia gengival induzida por diversos tipos de drogas, tais como as
anteriormente citadas, é constituída, basicamente, por fibroplasia colágena
associada a hiperplasia epitelial. Há presença de cristas epiteliais invadindo o tecido
conjuntivo subepitelial, sendo esse último altamente vascularizado e com acúmulo
24
12
5
de infiltrado inflamatório. O infiltrado inflamatório é predominantemente mononuclear,
representado por macrófagos, linfócitos e plasmócitos (BOLTCHI, REES,
IACOPINO, 1999).
NIEH et al. (1996) utilizaram 60 ratos Sprague-Dawley divididos em grupo
tratado (CsA) e grupo controle durante seis semanas e demonstraram alterações
histopatológicas tanto na mucosa gengival quanto no osso alveolar. O tecido
fibrovascular neoformado pôde ser observado na segunda semana de administração
da droga na interface dente e gengiva do animal, aumentando progressivamente na
quarta e sexta semanas. Foi observado neoformação vascular, presença de infiltrado
inflamatório mononuclear difusamente distribuído. O alvéolo dentário revelou grande
irregularidade, na superfície óssea, indicando um remodelamento ósseo ativo em
animais tratados com CsA, também observada a partir da segunda semana.
Portanto, os autores sugeriram que os tecidos do periodonto são o tecido alvo para a
ação indutora da proliferação celular exercida por esse imunossupressor.
Segundo FU et al. (1995) que usaram, em seu experimento, dosagens
diferentes de CsA em ratos (3 mg/kg/peso - baixa dose, 10 mg/kg/peso - dose clínica
e 30 mg/kg/peso - alta dose), a mucosa gengival, microscopicamente, apresentou
um tecido conjuntivo fibroso com intensa atividade angiogênica. Ocasionalmente, o
epitélio gengival apresentou microulcerações. A parte mais profunda desse tecido
fibrovascular neoformado invade em direção ao ligamento periodontal, além da
presença de uma hiperplasia leve nos epitélios do sulco gengival e no epitélio da
mucosa gengival. FU et al. (1996) encontraram, diferentemente do anterior, além da
proliferação fibrovascular extensa, uma hiperplasia significante do epitélio
25
12
5
pavimentoso estratificado da mucosa gengival no grupo tratado com ciclosporina.
Um estudo experimental em ratos jovens e adultos de indução da HG com
o uso de CsA apresentou a espessura epitelial significativamente menor nos animais
adultos, entretanto o tecido conjuntivo foi semelhante entre os grupos (SPOLIDORIO
et al., 2003).
MORISAKI et al. (1997) encontraram em seus achados histológicos, um
tecido gengival aumentado em ratos tratados com uma dose de 400g/g/dieta de
CsA, apresentando um epitélio hiperplásico, com acantose e acúmulo de
componentes fibrosos intercelulares, diferentemente dos animais não-tratados do
grupo controle. Relata a presença de leve infiltrado inflamatório, assim como o
aumento do número de vasos sanguíneos em ambos os grupos. Resultados
semelhantes obtidos por PAIK et al. (2004) que encontraram poucas células
inflamatórias em seu modelo experimental em ratos tratados com ciclosporina.
Um tecido fibrovascular aumentado pode ser observado na quarta a sexta
semanas de administração da ciclosporina, incluindo proliferação de vasos
sanguíneos, infiltrado inflamatório difuso e extravasamento de hemácias no estroma
edematoso (NIEH et al.,1996).
As características histopatológicas em humanos apresentam-se
diversificadas, com neoformação vascular (RATEITSCHAK-PLÜSS et al., 1983),
grau variável de aumento do número de fibroblastos e fibras colágenas (WYSOCKI
26
12
5
et al., 1983; TYLDESLEY, ROTTER, 1984), áreas focais de tecido conjuntivo de
aspecto mixomatoso (ROSTOCK, FRY, TURNER, 1986) e infiltrado inflamatório
crônico inespecífico (TRACKMAN & KANTARCI, 2004).
1.4 – Fatores predisponentes
Diversos trabalhos têm sugerido que a hiperplasia gengival induzida por
drogas é de natureza multifatorial (SEYMOUR, THOMASON, ELLIS, 1996;
THOMASON et al., 1996; NISHIKAWA, 1996), portanto idade, sexo, variáveis
farmacocinéticas, predisposição genética, interação medicamentosa, níveis
sanguíneos da droga, condições periodontais inadequadas, duração do tratamento e
dose da droga são fatores que influenciam o desenvolvimento da HG, além de
determinar quais indivíduos estão mais predispostos ao seu aparecimento
(RAMALHO et al., 2003).
SEYMOUR, THOMASON, ELLIS (1996) sugerem que indivíduos jovens
são mais susceptíveis à hiperplasia gengival do que adultos, pois as alterações do
metabolismo andrógeno possam estar ligadas a essa predisposição. Isso pode ser
observado num estudo de SOORYAMOORTHY, GOWER, ELEY (1990) que
demonstram a existência de um fenótipo de fibroblastos típico de pacientes jovens
ou devido a influência de hormônios sexuais. Foi encontrado um aumento da
testosterona biologicamente ativa nesses pacientes. De acordo com DALEY,
WYSOCKI, DAY (1986), indivíduos mais jovens são mais susceptíveis ao
crescimento gengival induzido por drogas. Em outro estudo, essa prevalência foi de
48% em adultos e 30% em crianças (WILSON et al., 1998).
27
12
5
SPOLIDORIO et al. (2003) realizaram um modelo experimental utilizando
140 ratos Wistar de 15, 30, 60 e 90 dias de idade, administrando 10mg/kg CsA e
240 g/g de nifedipina por via subcutânea e no grupo controle solução salina pela
mesma via. Os resultados mostraram que os ratos mais jovens desenvolveram
hiperplasia gengival mais acentuada, porém quando associados o imunossupressor
e o bloqueador de canal de cálcio, os animais adultos apresentaram crescimento
gengival, sugerindo, portanto, que a HG em ratos não depende da idade.
Em modelos experimentais, foi sugerido que machos são mais
susceptíveis à hiperplasia gengival, devido, possivelmente, aos níveis de
progesterona serem menores que os das fêmeas, pois esse hormônio causa um
decréscimo na síntese de glicosaminoglicanas, que se encontra aumentada na HG
(NISHIKAWA et al., 1996).
Em um estudo brasileiro com pacientes transplantados renais, foi
constatado que não houve uma correlação entre o sexo (TORREZAN et al., 2005) e
a idade (O`VALLE et al., 1995; THOMAS, NEWCOMBE, OSBORNE, 2000) com a
hiperplasia gengival.
MARGIOTTA et al. (1996) utilizaram 113 pacientes transplantados renais,
divididos em três grupos recebendo CsA, CsA e NIF e azatioprina (AZA) como grupo
controle, demonstrando uma correlação entre a idade e o sexo. Os autores
sugeriram que crianças e adolescentes apresentam um aumento do metabolismo
28
12
5
dos fibroblastos ou mudanças hormonais comuns nessa faixa etária que explicariam
a freqüência maior de HG entre eles. Entretanto, SPRATT et al. (1999) observaram
uma proporção significativamente maior de homens do que mulheres apresentando
a hiperplasia gengival induzida por CsA, estando também aumentada entre os
jovens.
Sobre os fatores relacionados com a droga, estudos experimentais,
utilizando ratos, demonstraram que o grau de hiperplasia gengival se mostrava mais
acentuado à medida que se aumentavam as doses de ciclosporina, sugerindo um
efeito dose-dependente em ratos (FU, NIEH, WIKESJÖ, 1997; FU et al., 1995). Um
estudo, desenvolvido por MORISAKI et al. (1997), indicou que a severidade de
hiperplasia gengival foi diretamente proporcional aos níveis sanguíneos e à dose
diária da ciclosporina, pois o tratamento com essa droga teve uma incidência de
100% de HG em ratos. Porém, um outro estudo, utilizando cães da raça beagle,
mostrou uma correlação da HG com os níveis sangüíneos, mas não com a dose do
imunossupressor, sugerindo que os ratos são mais susceptíveis à hiperplasia
gengival induzida pela ciclosporina (SEIBEL et al., 1989).
Em humanos, THOMAS, NEWCOMBE, OSBORNE (2000) também
demonstraram que existe uma ligação entre a dose e os níveis sanguíneos da CsA e
a severidade da hiperplasia gengival, diferentemente de outros autores que não
encontraram essa correlação (O´VALLE et al., 1995, SPRATT et al., 1999,
MARGIOTTA et al., 1996, WILSON et al., 1998). Porém estes últimos sugeriram
que os níveis sanguíneos do imunossupressor possam interferir na severidade da
29
12
5
doença. Adicionalmente, DALEY & WYSOCKI (1984) também demonstram que
concentrações plasmáticas de ciclosporina acima de 155ng/ml são suficientes para
induzir o crescimento gengival, enquanto outros indicam que não há influência dos
níveis sanguíneos do imunossupressor (SEYMOUR, SMITH, ROGERS, 1987;
PERNU et al., 1992; CEBECI et al., 1996). Por outro lado, recentemente,
TORREZAN et al. (2005) calcularam a dose de ciclosporina ingerida por unidade do
índice de massa corpórea (mg/U
IMC
) nos pacientes transplantados e observaram não
haver correlação com a HG, apesar das variações de altura e peso.
CEBECI et al. (1996) e THOMAS, NEWCOMBE, OSBORNE (2000) não
encontraram correlação entre o tempo de uso da ciclosporina e a hiperplasia
gengival em transplantados renais. MARGIOTTA et al. (1996) observaram uma fraca
ligação entre a HG e a duração da terapia com a droga. Em relação ao tempo pós-
realização do transplante, SPRATT et al. (1999) demonstraram uma correlação
altamente relevante entre a duração do mesmo e a hiperplasia gengival.
Um estudo demonstrou que 21% dos pacientes com HG usaram a CsA
por menos de um ano e 79% a usaram por mais de um ano. Quando o
imunossupressor estava associado a nifedipina, 23% faziam uso da medicação há
menos de um ano e 76,5% há mais de um ano. Dentre os indivíduos que não
apresentaram esse efeito colateral 42,9% estavam sob tratamento há mais de um
ano e 57,1% tratavam-se havia menos de um ano (TORREZAN et al., 2005).
SPOLIDORIO et al. (2005a) realizaram um estudo para avaliar os efeitos
30
12
5
de um longo período de terapia com CsA no tecido gengival. Utilizaram 80 ratos
machos administrando 10 mg/kg/dia de ciclosporina, por via subcutânea, durante 60,
120, 180 e 240 dias e os resultados sugerem que o tratamento prolongado com o
imunossupressor aumenta a atividade proteolítica dos fibroblastos gengivais,
favorecendo a síntese de matriz extracelular normal.
Vários estudos demonstraram que as condições periodontais exercem um
papel fundamental na intensidade de desenvolvimento da hiperplasia gengival
induzida por drogas. Os parâmetros periodontais utilizados são os índices gengival,
de placa bacteriana, de cálculo dentário, de sangramento gengival e a profundidade
do sulco gengival (O´VALLE et al., 1995; CEBECI et al.,1996; MARGIOTTA et al.,
1996).
Segundo TRACKMAN & KANTARCI (2004), a HG é causada por uma
variedade de fatores etiológicos e é exacerbado pelo acúmulo de placa bacteriana
local. Vários autores sugerem que a placa induz à inflamação, aumentando o
crescimento gengival induzido pela ciclosporina (SEYMOUR, SMITH, 1991; DALEY,
WYSOCKI, DAY, 1986; McGAW, LAM, COATES, 1987; PERNU et al., 1992).
Segundo FU, NIEH, WIKESJÖ (1997) a placa bacteriana é um co-fator para o
desenvolvimento da HG induzida pela ciclosporina, influenciando sua severidade.
Porém, TORREZAN et al. (2005) demonstraram que o índice de placa
bacteriana foi semelhante entre os indivíduos com gengivas normais e aqueles com
alteração, sugerindo uma fraca relação entre ambas, assim como a correlação entre
31
12
5
a ciclosporina e o índice de placa nos indivíduos que não apresentavam HG
(SEYMOUR, SMITH, ROGERS, 1987; PERNU et al., 1992; BÖKENKAMP et al.,
1994).
Muitos autores sugerem que o controle efetivo da placa bacteriana, com
remoção dos irritantes locais, minimiza a HG, além de evitar sua recidiva, uma vez
que a placa desencadeia uma resposta inflamatória, sendo esse um fator de
relevância no desenvolvimento desse efeito indesejável, apesar de não prevenir o
desenvolvimento da mesma (SEYMOUR, SMITH, 1991; PERNU et al., 1992;
SOMACARRERA et al, 1994). No estudo realizado por GÓMEZ et al. (1997), os
pacientes foram instruídos quanto a higienização, com a finalidade de auxiliar no
tratamento. Porém, eles sugeriram que uma higiene bucal deficiente não é capaz de
causar sozinha o crescimento gengival, pois pacientes com excelente higiene bucal
apresentaram uma HG score 3.
Em um estudo, utilizou-se cinco furões, de um ano de idade, tratados
com CsA subcutânea durante 28 dias. Os elementos dentários dos animais foram
envolvidos por fio de seda 3-0, ao nível gengival, a fim de facilitar a retenção de
placa. Foram colhidas amostras do sulco gengival e da mucosa bucal. O tipo de
bactéria predominante foi Cocos no dia zero, no 28º dia, houve uma diminuição do
número destes e aumentou a quantidade de bacilos e espiroquetas na amostra do
sulco. No início do experimento, os gêneros mais comuns das bactérias eram
Pasteurella spp., Moraxella spp., Alcaligenes spp., Corynebacterium spp., Rothia
spp. e não continha anaeróbios. No final do estudo, bacilos gram negativos
anaeróbios facultativos estavam também presentes em grande número no interior
32
12
5
dos sulcos periodontais e os gêneros predominantes eram Pasteurella spp.,
Pseudomonas spp., Proteus spp., constituindo, aproximadamente, 2/3 da flora
cultivada nesses locais. Os bacilos gram positivos diminuíram no 28º dia, nas
amostras obtidas do sulco gengival de animais tratados com CsA., sugerindo que
essas bactérias não têm um papel decisivo na patogênese da doença periodontal de
furões imunossuprimidos e normais. Os autores observaram que a HG estava
presente somente em dentes com ligadura de fio de seda, pois este funciona como
um retentor mecânico, criando possibilidades de mudanças na composição da
microflora, aumentando a quantidade de anaeróbios. Os gêneros mais comuns eram
Eubacterium spp., Fusobacterium spp. e espiroquetas (FISHER et al., 1996).
Os lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede de bactérias gram
negativas induzem a uma resposta imunológica do hospedeiro através da produção
de mediadores inflamatórios, tais como COX-2, TNF-, PDGF, IL-1, IL-6 (HOLT &
BRAMANTI, 1991; KJEKDSEN, HOLMSTRUP, BENDTZEN, 1993). Portanto, essas
bactérias podem aumentar, indiretamente, o processo inflamatório, sugerindo que
essa reação deva ser importante na interação entre a CsA e os fibroblastos
gengivais, promovendo o seu aumento (FU, NIEH, WIKESJÖ, 1997).
Outro fator que poderia influenciar no desenvolvimento da HG é a
predisposição imunogenética individual. Estudos demonstraram uma expressão
aumentada de antígenos HLA-DR1 e HLA-DR2 do Complexo de
Histocompatibilidade Principal (MHC) classe II em pacientes que não respondiam ao
uso da CsA desenvolvendo a hiperplasia gengival e que respondiam,
33
12
5
respectivamente. Os antígenos HLA-A, B e C (MHC classe I) não foram
correlacionados com a doença. Esses resultados sugerem que esses determinantes
antigênicos funcionariam como um marcador de resistência ao início da HG induzida
pela CsA (PERNU et al., 1994; CEBECI et al., 1996). Porém, MARGIOTTA et al.
(1996) não encontraram correlação entre os antígenos HLA (HLA-A, HLA-B e HLA-
DR) com a HG.
34
12
5
1.5 – Patogênese da HG
Os fibroblastos são os principais tipos de célula do tecido conjuntivo e
são responsáveis pela manutenção e renovação da matriz extracelular. Ainda não
está claro se o acúmulo de tecido conjuntivo da hiperplasia gengival induzida por
ciclosporina é devido a um aumento do número de fibroblastos, ou a um aumento da
produção da matriz pelos fibroblastos ou uma diminuição da degradação da matriz
ou uma combinação desses mecanismos (JAMES, IRWIN, LINDEN, 1998). Vários
trabalhos se baseiam nas anormalidades do metabolismo do colágeno associado
com crescimento gengival, outros demonstram o efeito direto da CsA na síntese e no
crescimento do colágeno pelos fibroblastos, porém o mecanismo ainda é
controverso (SCHINCAGLIA et al., 1992; JAMES, IRWIN, LINDEN, 1995; NEWELL
E IRWIN, 1997). Fibroblastos gengivais residentes desempenham um papel
primordial no processo de crescimento da gengiva, por serem responsáveis pela
produção e renovação da matriz extracelular, através de dois mecanismos: seleção
e expansão de subpopulações específicas de fibroblastos no tecido afetado e o
efeito direto da droga na função dessas células (NEWELL E IRWIN, 1997; JAMES,
IRWIN, LINDEN, 1998).
Muitos autores têm investigado os efeitos diretos da CsA no
comportamento do fibroblasto e do colágeno, sugerindo que essa droga
35
12
5
desempenha um papel modulador na atividade fibroblástica, porém isso ainda não
está esclarecido. In vitro, a CsA e seu maior metabólito, a OL-17 podem influenciar
diretamente os fibroblastos gengivais humanos, causando um aumento na
proliferação celular e formação da matriz (JACOBS et al., 1990; ZEBROWSKI,
SINGER, BRUNKA, 1986; BARTOLD, 1996; SCHINCAGLIA et al., 1992). Segundo
NEWEL & IRWIN (1997) a CsA aumenta a secreção de glicosaminoglicanas pelos
fibroblastos, embora o efeito seja dependente da densidade e linhagem celular, pois
o crescimento ocorre em culturas de baixa densidade.
Vários estudos têm mostrado a possível presença de duas subpopulações
distintas de fibroblastos gengivais – as que respondem e as que não respondem à
hiperplasia gengival induzida por drogas (PAGLIARINI et al., 1995; McKEVITT &
IRWIN, 1995). Um estudo que reproduziu a HG induzida pela CsA em 100% dos
ratos tratados, os autores sugerem que essa subpopulações de fibroblastos
gengivais possam não existir nos animais ou que nos tecidos elas devam mudar com
a idade (MORISAKI et al., 1997).
Sabe-se que os fibroblastos apresentam heterogenicidade funcional, em
relação aos aspectos fundamentais do comportamento da célula como potencial
proliferativo, resposta aos fatores de crescimento e biossíntese da matriz, através da
atividade de suas subpopulações (HASSELL & STANEK, 1983; IRWIN, PICARDO,
ELLIS, 1994). A heterogenicidade fenotípica deles tem sido documentada em locais
sadios e doentes de um mesmo tecido, inclusive na mucosa bucal (BRONSON,
1989).
36
12
5
Os fibroblastos gengivais apresentam uma capacidade proliferativa maior,
além de aumentar os níveis de colágeno e diminuir os de colagenase ativa em
relação aos tecidos normais (NEWELL E IRWIN, 1997). PAIK et al. (2004)
demonstraram em seu estudo que o acúmulo de colágeno na hiperplasia gengival
induzida por ciclosporina não é causado pelo aumento de sua síntese, mas pela
diminuição de sua degradação, através do mecanismo de fagocitose, pois esse
imunossupressor não afeta os níveis de transcrição do colágeno tipo I. A reabsorção
tecidual diminuída atua como mecanismo contribuinte para a HG induzida por droga
(THOMASON, SLOAN, SEYMOUR, 1998). A destruição dos componentes da matriz
extracelular ocorre como um resultado da elaboração de proteinases extracelulares,
da atividade reduzida da colagenase MMP e inibição da fagocitose do colágeno e
ação de enzimas lisossomais (THOMASON, SLOAN, SEYMOUR, 1998; ARORA et
al., 2001; TRACKMAN E KANTARCI, 2004).
YOSHIDA, NAGATA, YAMANE (2005) observaram que o tratamento com
200, 400, 800 ng/ml de CsA induziu a um aumento de 23-25% na proliferação de
células da mucosa gengival de ratos, mas não afetou no tamanho das mesmas.
Porém, existem estudos que demonstram a CsA e a NIF inibindo a
produção de matriz extracelular pelos fibroblastos gengivais e/ou proliferação celular
in vitro (McKEVITT E IRWIN, 1995; REDLICH et al., 1997). Entretanto, esses
achados são inconsistentes com aqueles encontrados in vivo, sugerindo que a
regulação direta do metabolismo ou proliferação da matriz extracelular pelos
37
12
5
fibroblastos gengivais por essas drogas não é, provavelmente, o mecanismo
primário responsável pela HG.
BIRRAUX et al. (2006) demonstraram que a CsA exibe uma inibição dose
e tempo dependentes da divisão celular de queratinócitos orais humanos em cultura.
Esses resultados sugerem que a HG não é causada pela elevada taxa de
proliferação de queratinócitos, mas pelo aumento do tempo de vida dessas células
ou devido a alguma alteração na capacidade das células de sofrerem apoptose de
modo balanceado. O fator B nuclear (NF-B) protege os queratinócitos da apoptose
prematura, portanto sensibilidade ou resistência à apoptose de queratinócitos e
outras células pode ser determinado pelos níveis de NF-
B entre outras moléculas,
como por exemplo Bcl-2 (SAITO et al., 2005).
Estudos recentes demonstram níveis elevados anormais de citocinas
específicas no tecido gengival hiperplasiado. Esses achados são de grande
importância e sugerem que substâncias que causam a HG, podem alterar o balanço
normal de citocinas nos tecidos gengivais, encontrando-se aumentadas, tais como:
IL-6, IL-1, PDGF-B, FGF-2, CTGF, TGF- (IACOPINO et al., 1997; JAMES, IRWIN,
LINDEN, 1998; RUHL et al., 2004; YOSHIDA, NAGATA, YAMANE, 2005).
O TGF- é um mediador inflamatório multifuncional que regula a
proliferação, diferenciação, morte celular e apoptose assim como ativa diretamente a
expressão do gene para a síntese de componentes da matriz extracelular,
principalmente o colágeno (ROBERTS et al., 1983; BARNARD, LYONS, MOSES,
38
12
5
1990; BORDER et al., 1992; ATTISANO & WRANA, 1996), além de efeitos inibitórios
de degradação da matriz, síntese diminuída de proteases e aumento dos níveis de
substâncias que inibem a protease. Induz ao aumento na expressão de colágenos
tipo I, III, VI, VII e X, fibronectina e proteoglicanas (MASSGUE, 1990). Além disso,
regula fortemente o MMP-13, uma colagenase mais restrita para hidrolisar o
colágeno em fibroblastos gengivais humanos. Portanto, participa diretamente dos
processos de cicatrização e fibrose. Essa citocina está implicada na patogênese de
várias condições fibróticas como: glomerulonefrite, escleroderma, formação de
quelóide, na fibrose renal induzida e não-induzida por drogas e na insuficiência
cardíaca (JAMES, IRWIN, LINDEN, 1998; WRIGHT, CHAPPLE, MATTHEWS, 2001).
A CsA aumenta a produção de TGF- pelas células renais e linfócitos (AHUJA et al.,
1995; PRASHAR et al., 1995). Isso resulta num aumento da síntese e deposição de
matriz extracelular nos glomérulos renais, como demonstrado em estudos com
anticorpos anti-TGF-, que bloqueiam a fibrose e a disfunção renais (SHIHAB et al.,
1996; ISLAM et al., 2001). Portanto, estudos sugerem que a CsA estimula a
produção de TGF- que leva a fibrose renal e nefropatia. Em um estudo com follow-
up de 10 anos, foi observado o desenvolvimento de nefropatia crônica em 40% dos
pacientes que faziam uso de CsA, sendo que 56% deles apresentavam o
crescimento gengival e 25% não. Os autores sugerem, portanto, que os efeitos
tóxicos da CsA na HG e na nefropatia apresentam mecanismos patológicos
semelhantes, existindo uma correlação entre ambos os eventos (BORATYNSKA et
al., 2004). SAITO et al. (1996) através de avaliação imunohistoquímica da expressão
de TGF- em tecido gengival hiperplásico induzido pela nifedipina e fenitoína
também demonstrou um aumento nessa citocina.
39
12
5
Existem três isoformas do TGF- (TGF-
1
, TGF-
2
, TGF-
3
), sendo
mediado por três classes de receptores (I, II, III), sendo que somente o I e o II são
expressos na membrana celular (IHN, 2002). Um estudo, utilizando a técnica de
imuno-histoquímica, demonstrou que todas as suas isoformas e receptores do TGF-
estavam expressos em muitas células dos tecidos gengivais de humanos, sendo
que as marcações para o TGF-
1
e TGF-
2
se mostraram mais fortemente positivos
em tecidos hiperplásicos induzidos pela ciclosporina, quando comparados com o
grupo controle, porém somente no primeiro esse aumento encontrava-se
significante. O TGF-
3
no grupo tratado estava diminuído (WRIGHT, CHAPPLE,
MATTHEWS, 2001). Segundo alguns estudos esse fator de crescimento está
presente nos estágios finais de cicatrização, moderando os efeitos das outras
isoformas e inibindo o processo fibrótico (SHAH, FOREMAN, FERGUSON, 1995).
JAMES, IRWIN, LINDEN (1998) demonstraram através de imuno-
histoquímica a presença e distribuição do TGF-
1
nos tecidos gengivais normais e
hiperplásicos induzidos pela terapia com a CsA, sugerindo que essa citocina tenha
um papel no acúmulo da matriz extracelular visto na hiperplasia gengival. Estudos
com células em cultura têm demonstrado que o TGF- altera a atividade
fibroblástica, incluindo crescimento e metabolismo do colágeno das células
gengivais.
Segundo o estudo realizado por YOSHIDA, NAGATA, YAMANE (2005),
que utilizaram a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em cultura de
40
12
5
fibroblastos gengivais de ratos, observaram que o tratamento com doses de 400 e
800 ng/ml CsA induziu a um aumento de 80 e 129% a expressão de mRNA para o
TGF-
1
, respectivamente.
WRIGHT et al. (2004) observaram que os níveis de TGF-
1
estavam
aumentados no líquido crevicular em pacientes com crescimento gengival que fazem
uso de ciclosporina comparados com o grupo controle que não fazia uso de
medicação. Ao se comparar o efeito de dois imunossupressores, a ciclosporina e o
tacrolimus, nos níveis de TGF-1, pôde-se observar que o primeiro promove um
aumento na saliva significativamente maior que o segundo, sugerindo que as
alterações encontradas nessa complicação possam ser detectadas na saliva
(SPOLIDORIO et al., 2005b).
A ocorrência de formas hereditárias de HG contribui para se estudar o
fenótipo das células do tecido conjuntivo, in vitro, de indivíduos afetados sem a
interferência da ação das drogas, além de possibilitar a identificação de genes
mutados presentes nessa doença. Estudos têm demonstrado que cultura de
fibroblastos gengivais de indivíduos afetados, geralmente, produzem níveis elevados
de TGF-
1
, assim como a expressão de seus receptores, aumentando a produção
da matriz extracelular (TIPTON & DABBOUS, 1998; WRIGHT, CHAPPLE,
MATTHEWS, 2001; COTRIM et al., 2003; TRACKMAN & KANTARCI, 2004).
O TGF-
2
é sintetizado principalmente pelo epitélio, enquanto o TGF-
1
é
pelas células hematopoiéticas e tecido conjuntivo. Essa primeira citocina está
implicada na resposta inflamatória e subseqüente cicatrização durante o processo de
41
12
5
cura em feridas. Um estudo que avaliou o processo de cicatrização de enxertos de
pele foi observado que no terceiro dia de pós-operatório, feridas tratadas com TGF-
2
mostraram um aumento intersticial significativo (SMITH et al., 2000). Segundo
BRAHMATEWARI et al. (2000) o tratamento de lesões com anticorpos contra o fator
de crescimento
2
pode ser uma alternativa útil para reduzir a fibrose. SERPERO et
al. (2006) demonstraram que o TGF-
1
e TGF-
2
estimulam a proliferação de
fibroblastos em pólipos nasais humanos.
42
12
5
1.6 – Tratamento da HG
Estudos demonstram o tacrolimus (FK506) e o sirolimus como drogas
alternativas à CsA na prevenção da rejeição em transplantes de órgãos (JAMES et
al., 2001). A conversão da ciclosporina oral pelo FK506 resultou numa redução do
crescimento gengival (KOHNLE et al., 1999; THORP et al., 2000; SPOLIDORIO et
al., 2006).
O tratamento da HG inclui a remoção de placa bacteriana, mantendo a
higienização adequada, além de procedimentos invasivos como a gengivectomia,
apesar das sucessivas recidivas. WALHSTROM, ZAMORA, TEICHMAN (1995),
utilizaram a azitromicina (AZI) - um antibiótico semi-sintético, derivado do macrolídio
eritromicina - para tratar infecções respiratórias em dois pacientes transplantados
renais que apresentavam HG induzida pela ciclosporina e observaram uma redução
gengival após o uso.
Vários estudos demonstraram a eficácia desse antibiótico na regressão
desse efeito colateral indesejado causado pelo imunossupressor. O tratamento de
cinco dias, com dose de 500mg, é simples, barato, conservador e com rápida
efetividade, evitando a cirurgia gengival. A azitromicina é bem tolerada, mas pode
apresentar efeitos colaterais como diarréia, dor abdominal, náusea e vômito. Age,
43
12
5
mais comumente, contra bactérias gram positivas e negativas, apresenta rápida
absorção oral, não altera os níveis séricos de ciclosporina e os níveis de creatinina
(GÓMEZ et al., 1997; WIRNSBERGER et al., 1998, NASH & ZALTZMAN, 1998;
CITTERIO et al., 2001; KWUN WH, SUH, KWUN KB, 2003; TOKGOZ et al., 2004;
CHAND et al., 2004). CITTERIO et al. (2001) sugerem que o tratamento descrito
acima deva ser repetido a cada 8 a 12 meses, a fim de se evitar recidiva, pois em
seu estudo seis meses após o tratamento, 14% dos pacientes relataram a
recorrência do crescimento gengival e, 17 meses após, essa porcentagem aumentou
para 24%. Segundo GÓMEZ et al. (1997) a terapia com a AZI deve começar o mais
precocemente possível, assim que surgirem os primeiros sinais da hiperplasia.
Alguns autores sugerem que os efeitos do antibiótico compreendem a ação
bactericida, redução da inflamação e da estimulação gengival e supressão da
síntese protéica pelos fibroblastos, inibindo a proliferação de colágeno (GÓMEZ et
al., 1997; NASH & ZALTZMAN, 1998; CITTERIO et al., 2001).
Em um estudo experimental em ratos, PAIK et al. (2004) demonstraram
que parar de administrar CsA ou tratar com AZI resultava na diminuição significativa
da HG induzida pela ciclosporina. Evidências obtidas pela diminuição macroscópica
da largura mésio-distal e vestíbulo-lingual da papila interdental nos animais que
faziam uso de ciclosporina por seis semanas e foram tratados com azitromicina na
sétima semana e pela análise histológica. Seus resultados mostraram que a CsA
diminui a atividade fagocítica dos fibroblastos gengivais, enquanto a AZI aumenta
essa atividade. Demonstraram que esta última não tem efeito na gengiva ou nos
fibroblastos gengivais quando administrada sozinha, mas somente quando se usava
44
12
5
concomitantemente o imunossupressor, sugerindo que haja uma interação entre
ambas as drogas.
Em 1994, WONG, HODGE, LEWIS descreveram quatro casos de
crescimento gengival induzido pela ciclosporina que foram resolvidos com o
tratamento de sete dias com 400mg/dia de metronidazol - um fármaco
antriprotozoário e antibactericida, efetivo, principalmente, contra microorganismos
anaeróbios – desaparecendo a hiperplasia após três a quatro semanas de terapia,
recidivando em dois pacientes após um ano, sendo novamente submetido ao
tratamento.
CHAND et al. (2004) utilizaram o metronidazol além da azitromicina em
pacientes transplantados renais que faziam uso de CsA e desenvolveram a HG.
Sugerem que o metronidazol oferece uma melhora na hiperplasia gengival, embora
os resultados mostrem que a terapia com a AZI é bem superior, tornando-se uma
alternativa terapêutica para essa complicação.
Recentemente, ARGANI et al. (2006) obtiveram resultados significativos
com o uso de um dentifrício contendo azitromicina, duas vezes ao dia, durante
quatro semanas em pacientes transplantados renais que responderam,
satisfatoriamente, com o uso tópico do antibiótico, melhorando todos os parâmetros
periodontais, tais como índice de placa, sangramento à sondagem, profundidade do
sulco e índice de crescimento gengival. A remissão da hiperplasia gengival
continuou até três meses após o término do uso do dentifrício, sugerindo, portanto,
uma alternativa terapêutica eficaz e segura, sem efeitos adversos para o paciente.
45
12
5
Em um estudo utilizando a eritromicina, um antibiótico macrolídeo, em ratos
diabéticos, obteve-se a melhora na lesão renal, pois a droga reduziu a expressão do
gene para TGF-ß, a produção de colágeno tipo IV e a atividade do NF-B nos
tecidos renais (TONE et al., 2005).
Em um estudo piloto realizado no Laboratório de Imunopatologia e Patologia
Experimental do Centro de Biologia da Reprodução (CBR/UFJF), utilizou-se a
roxitromicina – antibiótico macrolídeo, semelhante à azitromicina – para prevenir e
tratar a hiperplasia gengival induzida pela ciclosporina, observando-se uma melhora
clinicamente em ambas, com diferença significativa na prevenção, sugerindo que
esse fármaco é uma opção conservadora, barata e eficaz na solução dessa
complicação.
Foi apresentado no VII Congresso da Associação Brasileira de Transplante de
Órgãos (ABTO) / 2001 um trabalho utilizando a roxitromicina em humanos. Foi
observada uma melhora significativa da HG com o tratamento, representado pela
diminuição da profundidade do sulco gengival. Também foi relatado a diminuição no
sangramento gengival, sendo bem tolerada pelos pacientes. Portanto, o tratamento
de cinco dias com roxitromicina deveria ser considerado uma opção para a HG
induzida pela CsA.
O mecanismo de ação pelo qual a roxitromicina promove a regressão da HG
induzida pela CsA ainda não é completamente entendido, acredita-se na sua ação
46
12
5
imunomoduladora ser mais importante que sua ação antimicrobiana.
Recentemente, YAMABE et al. (2006) sugerem um efeito inibitório na
produção de TGF- pelas células mesangiais humanas com o uso da roxitromicina,
podendo ser eficaz no tratamento da glomeruloesclerose. Nesse estudo o antibiótico
macrolídeo inibiu a ativação da tirosina quinase e MAP quinase pela trombina a
translocação da proteína NF-B p65 induzida pela trombina dentro do núcleo e a
ativação dessa proteína regula a produção do TGF-, sugerindo que a roxitromicina
seja uma alternativa terapêutica para a hiperplasia gengival
47
12
5
2 - OBJETIVOS
2.1 – OBJETIVO GERAIS
Avaliar a roxitromicina no tratamento desse efeito adverso causado pelo
uso do imunossupressor;
2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1 - Realizar uma análise histomorfométrica, verificando os efeitos da
roxitromicina sobre a espessura do epitélio e conjuntivo na HG em ratos.
2 - Avaliar a presença e distribuição do fator de crescimento
transformador beta (TGF-
2
) na indução da HG.
3 – Avaliar a ação da roxitromicina sobre a expressão de TGF-
2
em
ratos.
48
12
5
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Animais de Experimento
Foram utilizados 32 ratos machos, Wistar (procedência do CBR/UFJF),
com seis semanas de vida, com peso variando de 100 a 140 gramas para avaliação
do efeito terapêutico da roxitromicina (ROX) na hiperplasia gengival induzida pela
ciclosporina.
Os ratos ficaram alojados no CBR/UFJF, em gaiolas de polipropileno com
tampas metálicas, medindo 18 x 45 x 30 cm, providas de camas de maravalhas
selecionadas, mas não esterelizadas, mamadeira para água e cocho para ração do
tipo peletizada. Os animais foram pesados, diariamente, para ajuste da dose das
drogas e foram fornecidas água e ração ad libitum. A temperatura da sala é
controlada (22º C ± 2º C), com ventilação natural, no verão e aquecedores no
inverno. A iluminação é mista (luz natural e lâmpadas fluorescentes), sendo as
49
12
5
últimas controladas automaticamente para acenderem às 6h e apagarem às 18h.
3.2 – EXPERIMENTO: Avaliação do efeito terapêutico da
roxitromicina na HG
O experimento continha quatro grupos com oito animais. Os animais
receberam ciclosporina durante cinco semanas com a finalidade de induzir o
crescimento gengival e, somente no início da sexta semana, foram tratados com os
antibióticos descritos a seguir, com o propósito de regredir a possível hiperplasia
gengival instalada. As etapas estão esquematizadas na FIG. 03.
A) Animais que receberam 0,2 ml salina estéril (PBS),
administração via subcutânea (pH=7,4), diariamente, por seis
semanas (n=8) – controle negativo;
B) Animais que receberam 10 mg/kg/peso de ciclosporina
diariamente, via subcutânea, por seis semanas, diariamente, via
subcutânea, iniciando somente no início da sexta semana a
administração de PBS (n=8);
C) Animais tratados com 10 mg/kg/peso de ciclosporina
diariamente, via subcutânea, por seis semanas e 50mg/kg/peso
de ampicilina (RITZERFELD, 1979) – antibiótico derivado da
penicilina de espectro ampliado, atua inibindo a síntese da
parede celular bacteriana, sendo utilizado na odontologia para
tratar infecções orodentais (YAGIELA, NEIDLE, DOWD, 2000) -
diariamente, via gavagem gástrica, iniciando a sua
50
12
5
administração na sexta semana (n=8) – controle positivo;
D) Animais que receberam 10 mg/kg/peso de ciclosporina
diariamente, via subcutânea, por seis semanas e foram tratados
com roxitromicina, 40 mg/kg/peso (IANARO et al. 2000; UENO
et al., 2005), por gavagem gástrica, com início de administração
na sexta semana (n=8) – grupo tratado.
Os 32 animais foram divididos em quatro grupos (n=8) e duração total do
experimento em seis semanas.
Fig. 04 – Esquema terapêutico dos animais dividido em semanas
Até a 5ª semana foi administrado somente a ciclosporina e somente na 6ª
semana iniciou-se o tratamento ou com a roxitromicina ou com a ampicilina.
Tempo/semanas
grupos
0
1
2
3
4
5 6
A
–
Salina (0,2ml/dia) –
controle negativo
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS
PBS PBS
B
–
CsA
(10mg/Kg/dia) – controle positivo
CsA
CsA
CsA
CsA
CsA
CsA
CsA
+ PBS
C
–
CsA
+ AMP (14mg/Kg/dia) –
controle
positivo
CsA
CsA
CsA
CsA
CsA CsA
CsA
+ AMP
D
–
CsA
+ ROX (4mg/Kg/dia)
CsA
CsA
CsA
CsA
CsA CsA
CsA
+ ROX
51
12
5
3.3 – Análise macroscópica da HG
A presença de sinais clínicos de HG foi investigada semanalmente e no
final da sexta semana os animais sofreram eutanásia por aprofundamento da
anestesia, utilizando Kensol (10 mg/Kg) + Vetanarcol (90 mg/Kg). Em seguida, foi
realizado uma moldagem com silicona de condensação (Fig. 04), visando a
obtenção de modelo em gesso da região anterior da maxila com a finalidade de se
realizar a morfometria da mucosa gengival anterior (MMG) utilizando um paquímetro
digital (Fig. 05).
52
12
5
Fig. 04 – Moldagem em silicona de condensação para obtenção de modelo de
gesso para análise morfométrica da região maxilar anterior superior dos ratos.
53
12
5
Fig. 05 – Morfometria da mucosa gengival anterior (MMG), utilizando um paquímetro digital
54
12
5
3.4 – Análise histopatológica da HG
As biópsias gengivais foram obtidas da mesma região e foram fixadas em
solução de formol a 10%, em seguida, foram desidratadas gradativamente em
concentrações crescentes de álcool etílico (70% a 100%), diafanizadas em xilol,
embebidas e incluídas em parafina. Os fragmentos incluídos foram submetidos à
microtomia, obtendo-se seções de 4
m de espessura e corado pela técnica da
hematoxilina-eosina. As lâminas foram montadas em lamínulas com Entellan®
(Merck). Os cortes histológicos foram observados no microscópio óptico com
aumento de 50x e 400x. A análise histomorfométrica foi realizada com o objetivo de
se quantificar a área de infiltrado inflamatório, número de fibroblastos, espessura do
epitélio e do tecido conjuntivo por campo em cada amostra de tecido gengival. As
imagens foram capturadas em um aumento de 100x e 400x, utilizando o sistema
digital de captura de imagem (filmadora Samsung, SHC) e o software Axio Vision
(Zeiss, Berlim, Alemanha), em seguida, as imagens foram avaliadas pelo programa
Scion Image® for Windows. Portanto, cada amostra gengival foi submetida à
morfometria a partir da captura de toda a área inflamada, número de fibroblastos e
espessura da lâmina própria calculando a média aritmética dos campos medidos e
expressas em porcentagem.
55
12
5
Fig. 06 – Histomorfometria através do software Axio Vision (Zeiss, Berlim, Alemanha).
Demonstração de contagem de células inflamatórias (aumento 400x).
56
12
5
Fig. 07 – Histomorfometria através do software Axio Vision (Zeiss, Berlim, Alemanha).
Demonstração de marcação do epitélio e tecido conjuntivo de animal do grupo 1/
controle negativo
-
mucosa gengival (aumento 1
00x).
57
12
5
3.6 – Estudo imuno-histoquímico
A presença de TGF-
2
(diluição 1/20 – Santa Cruz/EUA) foram
investigados, através do método do complexo avidina-biotina peroxidase anti-
peroxidase, compreendendo as seguintes etapas:
-
Desparafinização e hidratação dos cortes do material processado para
exame histopatológico;
-
Recuperação antigênica com embebição dos cortes em tampão retrieval
à 94ºC, por 40min.;
-
Bloqueio da peroxidase endógena um banho de 30 minutos em solução
de peróxido de hidrogênio 3% diluído em água destilada;
-
Lavagem em tampão PBS 0,01M/pH 7,4, com três trocas de 5 minutos
cada uma;
-
Incubação com anticorpo primário (TGF-
2
), em câmara úmida a
temperatura ambiente, por uma hora;
-
Lavagem em tampão PBS 0,01M/pH 7,4, com três trocas de 5 minutos
cada uma;
-
Incubação com o anticorpo secundário, em câmara úmida a 37ºC por
trinta minutos;
-
Lavagem em tampão PBS 0,01M/pH 7,4, com três trocas de 5 minutos
cada uma;
-
Incubação com o complexo peroxidase/anti-peroxidase (PAP), da
58
12
5
mesma espécie animal do anticorpo específico, diluído em PBS, em
câmara úmida a 37ºC por trinta minutos;
-
Lavagem em tampão PBS 0,01M/pH 7,4, com três trocas de 5 minutos
cada uma;
-
Incubação em substrato diaminobenzidina (DAB) 60mg%, durante 5
minutos em câmara úmida escurecida;
-
Lavagem em água corrente e destilada por três minutos;
-
Contracoloração com hematoxilina de Harris por 1 minuto e enxágüe em
água corrente e destilada;
-
Desidratação progressiva em etanol 70%, 80%, 90% e 100%;
-
Embebição em xilol, por três vezes;
-
Montadas em lamínulas com Entellan
O controle negativo da reação imunohistoquímica foi efetuado omitindo-se
a incubação com o anticorpo primário em alguns cortes.
59
12
5
3.7 – Análise estatística
Os dados foram expressos pela média e desvio padrão e para análise
estatística foi utilizado o ANOVA e o teste T com nível de significância em p0.05,
além do teste post-hoc de Bonferroni para comparações múltiplas.
O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação
Animal (CEEA) da Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Juiz de
Fora (protocolo nº 039/2005), em reunião realizada em 06/09/2005, de acordo com
os Princípios Éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) e demais normas vigentes.
60
12
5
4 – RESULTADOS
Os resultados serão apresentados a seguir na forma de artigos. O
primeiro artigo foi submetido para a Revista da Associação Brasileira de Odontologia
(Revista ABO Nacional) e trata-se de uma revisão do tema hiperplasia gengival
induzida por drogas, especificamente, a ciclosporina. O segundo artigo foi submetido
para a revista Transplantation Proceedings, referente ao uso da roxitromicina em
quatro pacientes da Fundação Imepen (Instituto Mineiro de Estudos e Pesquisas em
Nefrologia) com HG. O terceiro artigo foi submetido ao Journal of Oral Pathology and
Medicine, abordando os resultados da tese intitulada “Avaliação do Efeito da
Roxitromicina na Regressão da Hiperplasia Gengival Induzida pela Ciclosporina em
Ratos”, abrangendo os aspectos morfométricos e histomorfométricos e a expressão
de TGF-
2
no tecido gengival dos animais com o uso do antibiótico macrolídeo no
tratamento dessa condição adversa.
61
12
5
PAPEL DO TGF-
NA PATOGÊNESE DA HIPERPLASIA GENGIVAL
INDUZIDA PELA CICLOSPORINA E POSSIBILIDADES
TERAPÊUTICAS ATUAIS
TGF-
ROLE IN GINGIVAL OVERGROWTH PATOGENESIS INDUCED
BY CYCLOSPORIN AND ACTUAL THERAPEUTICAL
POSSIBILITIES
Simone Aparecida Probst CONDÉ
1
Fernando Monteiro AARESTRUP
2
Beatriz Julião VIEIRA
3
Ivo Martins MALTA
4
Marcus Gomes BASTOS
5
Trabalho baseado na dissertação de mestrado de Simone Aparecida Probst Conde
pelo Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira pela Universidade Federal de
Juiz de Fora - UFJF
1 Mestranda do Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira/UFJF – e-mail:
simoneprobst@ibest.com.br
2 Chefe do Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental/UFJF – Doutor em
Patologia/UFF
3 Pesquisadora do Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental/UFJF – Doutor em
Patologia/UFF
4 Pesquisador do Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental/UFJF –
Farmacêutico/Bioquímico
5 Responsável pela Disciplina e Serviço de Nefrologia da UFJF; Pesquisador do NIEPEN – UFJF
e Diretor Executivo da Fundação IMEPEN
Endereço para correspondência: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) – Campus
Universitário. Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental - Centro de Biologia
da Reprodução (CBR) - Tel: (32) 3229-3250 Bairro Martelos s/nº Cep: 36036-900. Juiz de
Fora - MG
62
12
5
Resumo
A hiperplasia gengival (HG) é um efeito colateral comum do uso crônico da
ciclosporina (CsA), imunossupressor amplamente usado na prevenção da rejeição
em pacientes transplantados. A prevalência média de HG está em torno de 30%,
com uma variação entre 10 a 85%, devido a diversos fatores de risco que possam
agravá-la como a interação medicamentosa com drogas bloqueadoras de cálcio,
idade, dose da ciclosporina, acúmulo de placa bacteriana, predisposição genética,
entre outros. Estudos recentes demonstraram níveis elevados de citocinas
específicas no tecido gengival hiperplasiado, principalmente o TGF-, sugerindo que
esse fator de crescimento tenha um papel no acúmulo da matriz extracelular visto na
hiperplasia gengival. O tratamento para essa complicação, até pouco tempo, era
somente cirúrgico. Hoje vários estudos demonstraram a eficácia da azitromicina,
antibiótico macrolídeo, na regressão desse efeito colateral indesejado causado pelo
imunossupressor. O presente artigo é uma revisão de literatura sobre a hiperplasia
gengival induzida pela ciclosporina, abrangendo suas características clínicas e
histopatológicas, fatores predisponentes, patogênese e tratamento.
Palavras-chave: crescimento gengival, ciclosporina, transplante
63
12
5
Abstract
Gingival overgrowth (GO) is a common side effect in patients who have been
using a immunossupressor drug cyclosporine (CsA). There are many factors which
have changed the GO prevalence (10-85%), like others drugs associations, plaque
control, age, cyclosporine dose, genetics. Several studies have showed high levels of
cytokines in the gingival overgrowth tissues, mainly TGF-, suggesting that growth
factor has an important role in extracellular matrix accumulated on GO. The
treatment for this complication was surgery, but, today, many studies have been
demonstrated the effectiveness of azithromycin, a macrolide antibiotic, on GO. The
present article is a revision of literature about gingival overgrowth induced by
cyclosporine, clinicals and histopathologics aspects, predisposed factors,
pathogenesis and treatment.
Keywords: gingival overgrowth, cyclosporine, transplant
64
12
5
1 – INTRODUÇÃO
A hiperplasia gengival (HG) é uma condição patológica, comum em
pacientes transplantados, que fazem uso crônico de medicação imunossupressora,
particularmente a ciclosporina. A droga atua na supressão da resposta imune
mediada por células, sendo amplamente usada para prevenir a rejeição de órgãos
transplantados
30
. Provoca outros efeitos colaterais, tais como, nefrotoxicidade,
hepatotoxicidade, neurotoxicidade, hipertensão, hipertricose, entre outros, além de
ser utilizada no tratamento de diversas doenças auto-imunes, tais como diabetes
mellitus, doença de Behcet, psoríase, esclerose múltipla, líquen plano erosivo, lupus
eritematoso sistêmico, pênfigo bolhoso, artrite reumatóide, miastenia gravis, uveítes
e diversas glomerulopatias. Sofre biotransformação no fígado, resultando em 14
produtos
19
.
Estudos subseqüentes indicaram uma prevalência média de pacientes
transplantados dentados, desenvolvendo essa complicação, em torno de 30%, com
uma variação entre 10 a 85%
16,24
. Quando associada a outros medicamentos, como
a nifedipina (NIF) - um bloqueador de canal de cálcio - essa prevalência aumenta,
assim como a severidade, potencializando o risco. Essas drogas são
freqüentemente usadas para o controle da pressão arterial em transplantados
renais. O´VALLE et al. (1995) demonstraram uma diferença nos achados
morfométricos em pacientes controle, tratados somente com ciclosporina e tratados
com a combinação de CsA e NIF, sendo esse último mais acentuado.
O objetivo desse estudo é fazer uma revisão de literatura da hiperplasia
gengival induzida pela ciclosporina, abrangendo suas características clínicas e
histopatológicas, fatores predisponentes, patogênese e tratamento.
65
12
5
2 – REVISÃO DA LITERATURA
-
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E HISTOLÓGICAS DA HG
O surgimento da hiperplasia gengival induzida por ciclosporina ocorre,
em média, três meses após o início da administração do imunossupressor
18
. Surge
na papila interdentária, adquirindo uma aparência lobulada, aumentando de tamanho
e se estendendo para a superfície dentária
14
. A avaliação do grau de HG, mais
utilizada em humanos, é determinada de acordo com o índice proposto por
SEYMOUR et al. (1985), medindo-se no modelo de gesso superior e inferior anterior
à papila interdentária labial e palatal/lingual entre os caninos superiores e inferiores,
avaliando o quanto a papila invadiu a superfície incisal dos dentes (score 0-3) e a
espessura da papila labio-palatal/lingual (score 0-2).
As características clínicas vão desde um tecido não inflamado, firme e
fibroso até um tecido com aspecto hemorrágico, edemaciado e inflamado, chegando
a cobrir a superfície dentária (Fig. 01)
22
. A hiperplasia gengival induzida por diversos
tipos de drogas, é constituída, basicamente, por fibroplasia colágena associada à
hiperplasia epitelial. Há presença de cristas epiteliais invaginando o tecido conjuntivo
subepitelial, sendo esse último altamente vascularizado e com acúmulo de infiltrado
inflamatório, predominantemente mononuclear, representado por macrófagos,
linfócitos e plasmócitos (Fig. 02)
2
.
A região mais acometida é a superior e anterior, sendo mais severa
próximo aos caninos. Afeta toda a cavidade bucal, incluindo as faces labial, bucal,
palatal, lingual
10
, sendo mais pronunciado na superfície labial
19
. O crescimento
gengival induzido pela ciclosporina afeta quase que exclusivamente indivíduos
66
12
5
dentados, porém, THOMAS et al. (2000) encontraram esse efeito colateral em um
paciente edêntulo, apesar de outros autores sugerirem que áreas com ausência de
dentes não são acometidas pela hiperplasia gengival.
67
12
5
–
FATORES PREDISPONENTES
SEYMOUR et al. (1996) sugerem que indivíduos jovens são mais
susceptíveis à hiperplasia gengival do que adultos, pois as alterações do
metabolismo andrógeno possam estar ligadas a essa predisposição. MARGIOTTA et
al. (1996) sugerem que crianças e adolescentes apresentam um aumento do
metabolismo dos fibroblastos ou mudanças hormonais comuns nessa faixa etária
que explicariam a freqüência maior de HG entre eles. Em modelos experimentais, foi
sugerido que machos são mais susceptíveis à hiperplasia gengival, devido,
possivelmente, aos níveis de progesterona serem menores que os das fêmeas, pois
esse hormônio causa um decréscimo na síntese de glicosaminoglicanas, que se
encontra aumentada na HG
15
. SPRATT et al. (1999) observaram uma proporção
significativamente maior de homens do que mulheres apresentando a hiperplasia
gengival induzida por CsA, estando também aumentada entre os jovens.
Entretanto, em um estudo brasileiro com pacientes transplantados
renais, foi constatado que não houve uma correlação entre o sexo
e a idade com a
hiperplasia gengival
16,23
.
Sobre os fatores relacionados com a droga, estudos experimentais,
utilizando ratos, demonstraram que o grau de hiperplasia gengival se mostrava mais
acentuado à medida que se aumentavam as doses de ciclosporina, sugerindo um
efeito dose-dependente em ratos
9
. Em humanos, THOMAS et al. (2000)
demonstraram que existe uma correlação entre a dose e os níveis totais de CsA no
sangue e a severidade da hiperplasia gengival, diferentemente do que foi
encontrado em outros estudos
13,16,22
. Porém estes últimos sugerem que os níveis
sanguíneos do imunossupressor possam interferir na severidade da doença,
68
12
5
enquanto outros indicam que não há influência dos níveis sanguíneos do
imunossupressor
5
.
A HG é causada por uma variedade de fatores etiológicos e é
exacerbado pelo acúmulo de placa bacteriana local. Muitos autores sugerem que o
controle efetivo da placa bacteriana, com remoção dos irritantes locais minimiza a
HG, além de evitar sua recidiva, uma vez que a placa desencadeia uma resposta
inflamatória, sendo esse um fator de relevância no desenvolvimento desse efeito
indesejável, apesar de não prevenir o desenvolvimento da mesma
23
.
Outro fator que poderia influenciar no desenvolvimento da HG é a
predisposição imunogenética individual. Estudos demonstraram uma expressão
aumentada de antígenos HLA-DR1 e HLA-DR2 do MHC classe II em pacientes que
não respondiam ao uso da CsA desenvolvendo a hiperplasia gengival e que
respondiam, respectivamente. Os antígenos HLA-A, B e C não foram
correlacionados com a doença. Esses resultados sugerem que esses determinantes
antigênicos funcionariam como um marcador de resistência ao início da HG induzida
pela CsA
5
.
69
12
5
–
CITOCINAS E PATOGÊNESE DA HG
Há evidências da presença de duas subpopulações distintas de
fibroblastos gengivais – os que respondem e os que não respondem à hiperplasia
gengival induzida por drogas. Fibroblastos gengivais residentes desempenham um
papel primordial no processo de crescimento da gengiva, por serem responsáveis
pela produção e renovação da matriz extracelular, através de dois mecanismos:
seleção e expansão de subpopulações específicas de fibroblastos no tecido afetado
e o efeito direto da droga na função dessas células. Sabe-se que os fibroblastos
apresentam heterogenicidade funcional, em relação aos aspectos fundamentais do
comportamento da célula como potencial proliferativo, resposta aos fatores de
crescimento e biossíntese da matriz, através da atividade de suas subpopulações. A
heterogenicidade fenotípica deles tem sido documentada em locais sadios e doentes
de um mesmo tecido, inclusive na mucosa bucal. Os fibroblastos gengivais
apresentam uma capacidade proliferativa maior, além de aumentar os níveis de
colágeno e diminuir os de colagenase ativa em relação aos tecidos normais. A
destruição dos componentes da matriz extracelular ocorre como um resultado da
elaboração de proteinases extracelulares, da atividade reduzida da colagenase da
matriz metaloproteinase (MMP) e inibição da fagocitose do colágeno e ação de
enzimas lisossomais
14
.
Muitos autores têm investigado os efeitos diretos da CsA no
comportamento do fibroblasto e do colágeno, sugerindo que essa droga
desempenha um papel modulador na atividade fibroblástica, porém ainda não está
esclarecido. Segundo NEWEL & IRWIN (1997) a CsA aumenta a secreção de
glicosaminoglicanas pelos fibroblastos, embora o efeito seja dependente da
70
12
5
densidade e linhagem celular, pois o crescimento ocorre em culturas de baixa
densidade.
Vários estudos demonstram níveis elevados anormais de citocinas
específicas no tecido gengival hiperplasiado, sendo esses achados de grande
importância, pois sugerem que substâncias que causam a HG, podem alterar o
balanço normal de citocinas nos tecidos gengivais, encontrando-se aumentadas, tais
como: IL-6, IL-1, PDGF-B, FGF-2, CTGF, EGF, TGF-
21,30
.
O TGF- é um mediador inflamatório multifuncional que regula a
proliferação, diferenciação, morte celular e apoptose assim como ativa diretamente a
expressão do gene para a síntese de componentes da matriz extracelular,
principalmente o colágeno, além de efeitos inibitórios de degradação da matriz,
síntese diminuída de proteases e aumento dos níveis de substâncias que inibem a
protease. Induz ao aumento na expressão de colágenos tipo I, III, VI, VII e X,
fibronectina e proteoglicanas. Portanto, participa diretamente dos processos de
cicatrização e fibrose. Essa citocina está implicada na patogênese de várias
condições fibróticas como: glomerulonefrite, escleroderma, formação de quelóide, na
fibrose renal induzida e não-induzida por drogas e na insuficiência cardíaca
27
. A
CsA aumenta a produção de TGF- pelas células renais e linfócitos. Isso resulta
num aumento da síntese e deposição de matriz extracelular nos glomérulos renais,
como demonstrado em estudos com anticorpos anti-TGF-, que bloqueiam a fibrose
e a disfunção renais
12
. Portanto, estudos demonstram que a CsA estimula a
produção de TGF- que leva a fibrose renal e nefropatia. Em um estudo com follow-
up de 10 anos, foi observado o desenvolvimento de nefropatia crônica em 40% dos
pacientes que faziam uso de CsA, sendo que 56% deles apresentavam o
71
12
5
crescimento gengival e 25% não. Os autores sugerem, portanto, que os efeitos
tóxicos da CsA na HG e na nefropatia apresentam mecanismos patológicos
semelhantes, existindo uma correlação entre ambos os eventos
3
.
Existem três isoformas do TGF- (TGF-1, TGF-2, TGF-3), sendo
mediado por três classes de receptores (I, II, III), sendo que somente o I e o II são
expressos na membrana celular
11
. Um estudo, utilizando a técnica de imuno-
histoquímica, demonstrou que todas as suas isoformas e receptores do TGF-
estavam expressos em muitas células dos tecidos gengivais de humanos, sendo que
as marcações para o TGF-1 e o receptor I se mostraram mais fortemente positivas
em tecidos hiperplásicos induzidos pela ciclosporina, quando comparados com o
grupo controle
27
.
Segundo o estudo realizado por YOSHIDA et al. (2005), que utilizaram a
técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em cultura de fibroblastos
gengivais de ratos, observaram que o tratamento com doses de 400 e 800 ng/ml
CsA induziu a um aumento de 80 e 129% a expressão de mRNA para o TGF-1,
respectivamente. WRIGHT et al. (2004) observaram que os níveis de TGF-1
estavam aumentados no fluido gengival em pacientes com crescimento gengival que
fazem uso de ciclosporina comparado com o grupo controle que não fazia uso de
medicação. Estudos têm demonstrado que cultura de fibroblastos gengivais de
indivíduos afetados, geralmente, produzem níveis elevados de TGF-1, assim como
a expressão de seus receptores, aumentando a produção da matriz extracelular
7,27
.
Ao se comparar o efeito de dois imunossupressores, a ciclosporina e o tacrolimus,
nos níveis de TGF-1, pôde-se observar que o primeiro promove um aumento na
saliva significativamente maior que o segundo, sugerindo que as alterações
72
12
5
encontradas nessa complicação possam ser detectadas na saliva
21
.
O TGF-
2
está relacionado com a resposta inflamatória e subseqüente
cicatrização durante o processo de cura em feridas. Um estudo que avaliou o
processo de cicatrização de enxertos de pele foi observado que no terceiro dia de
pós-operatório, feridas tratadas com TGF-
2
mostraram um aumento intersticial
significativo
20
. Segundo BRAHMATEWARI et al. (2000) o tratamento de lesões com
anticorpos contra o fator de crescimento
2
pode ser uma alternativa útil para reduzir
a fibrose. SERPERO et al. (2006) demonstraram que o TGF-
1
e TGF-
2
estimulam
a proliferação de fibroblastos em pólipos nasais humanos.
73
12
5
- TRATAMENTO DA HG: conceitos atuais
Estudos demonstram o tacrolimus (FK506) e o sirolimus como drogas
alternativas à CsA na prevenção da rejeição em transplantes de órgãos. A
conversão da ciclosporina oral pelo FK506 resultou numa redução do crescimento
gengival
24
.
O tratamento da HG inclui a remoção de placa bacteriana, mantendo a
higienização adequada, além de procedimentos invasivos como a gengivectomia,
apesar das sucessivas recidivas. Porém, WALHSTROM et al. (1995)
coincidentemente, utilizaram a azitromicina - um antibiótico semi-sintético, derivado
do macrolídio eritromicina - para tratar infecções respiratórias em dois pacientes
transplantados renais que apresentavam HG induzida pela ciclosporina e
observaram uma redução gengival após o uso.
Vários estudos demonstraram a eficácia desse antibiótico na regressão
desse efeito colateral indesejado causado pela CsA. O tratamento de cinco dias,
com dose de 500mg, é simples, barato, conservador e com rápida efetividade,
evitando a cirurgia gengival. A azitromicina é bem tolerada, mas pode apresentar
efeitos colaterais como diarréia, dor abdominal, náusea e vômito, age, mais
comumente, contra bactérias gram positivas e negativas, apresenta rápida absorção
oral, não altera os níveis séricos de ciclosporina e os níveis de creatinina
6,8,10
.
CITTERIO et al. (2001) sugerem que o tratamento descrito acima deva ser repetido
a cada 8 a 12 meses, a fim de se evitar recidiva, pois em seu estudo seis meses
após o tratamento, 14% dos pacientes relataram a recorrência do crescimento
gengival e, 17 meses após, essa porcentagem aumentou para 24%. Segundo
GÓMEZ et al. (1997) a terapia com a azitromicina deve começar o mais
74
12
5
precocemente possível, assim que surgirem os primeiros sinais da hiperplasia.
Alguns autores sugerem que os efeitos do antibiótico compreendem a ação
bactericida, redução da inflamação e da estimulação gengival e supressão da
síntese protéica pelos fibroblastos, inibindo a proliferação de colágeno
8,10
.
Em 1994, WONG et al. descreveram quatro casos de crescimento
gengival induzido pela ciclosporina que foram resolvidos com o tratamento de sete
dias com 400mg/dia de metronidazol - um fármaco antiprotozoário e antibactericida,
efetivo, principalmente, contra microorganismos anaeróbios – desaparecendo a
hiperplasia após três a quatro semanas de terapia, recidivando em dois pacientes
após um ano, os quais foram novamente submetidos ao tratamento.
CHAND et al. (2004) utilizaram o metronidazol além da azitromicina em
pacientes transplantados renais que faziam uso de CsA e desenvolveram a HG.
Sugerem que o metronidazol oferece uma melhora na hiperplasia gengival, embora
os resultados mostrem que a terapia com a azitromicina é bem superior, tornando
uma alternativa terapêutica para essa complicação.
Recentemente, ARGANI et al. (2006) obtiveram resultados significativos
com o uso de um dentifrício contendo azitromicina, duas vezes ao dia, durante 4
semanas em pacientes transplantados renais que responderam, satisfatoriamente,
com o uso tópico do antibiótico, melhorando todos os parâmetros periodontais, tais
como índice de placa, sangramento à sondagem, profundidade do sulco e índice de
crescimento gengival. A remissão da hiperplasia gengival continuou até três meses
após o término do uso do dentifrício, sugerindo, portanto, uma alternativa terapêutica
eficaz e segura, sem efeitos adversos para o paciente.
Apresentamos no VI Congresso de Transplantes em Vitória (2003)
75
12
5
nosso trabalho utilizando a roxitromicina – antibiótico macrolídeo, semelhante à
azitromicina – em um grupo de cinco pacientes transplantados renais com
hiperplasia gengival de moderada a severa, apresentando uma regressão
significativa da mesma com o uso da medicação durante cinco dias. Recentemente,
Yamabe et al. (2006) sugerem um efeito inibitório na produção de TGF- pelas
células mesangiais humanas com o uso da roxitromicina, podendo ser eficaz no
tratamento da glomeruloesclerose.
76
12
5
3 – CONCLUSÃO
De acordo com diversos estudos relacionados ao crescimento gengival
induzido pela ciclosporina, já está comprovado a atuação de diversas citocinas na
indução desse efeito colateral, tais como o TGF-, PDGF-B, IL-6, IL-1, , FGF-2,
CTGF, EGF.
A eficácia da antibioticoterapia (antibióticos macrolídeos) no tratamento clínico
da HG transcende a ação antimicrobiana e, possivelmente, está relacionada a sua
ação imunomoduladora.
77
12
5
Fig. 01
-
A
-
Paciente da Fundação Imepen (Instituto Mineiro de
Estudos e Pesquisa em Nefrologia), do sexo masculino, 64 anos,
transplantado renal há sete anos e oito meses, fazendo uso de
ciclosporina. Notar a presença de tecido hiperplásico gengival
generalizado, higiene bucal precária com sangramento espontâneo,
secreção purulenta e cálculo dentário disseminado.
B - Aspecto histopatológico de gengiva do paciente da Fig. 01,
apresentando hiperplasia do epitelial com hiperqueratose e acantose.
No tecido conjuntivo observamos fibroplasia colágena acentuada.
78
12
5
4 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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81
12
5
ROXITHROMYCIN REDUCES CYCLOSPORINE-INDUCED GINGIVAL
HYPERPLASIA IN RENAL TRANSPLANT PATIENTS
Abstract
Gingival overgrowth (GO) is a common side effect of the chronic use of cyclosporine
(CsA), an immunosuppressive drug which is widely used to prevent rejection in transplant
patients. The average prevalence of GO is around 30%, with variation between 10% and
85% due to diverse aggravating risk factors such as drug interaction with calcium channel
blockers, age, dose of cyclosporine, accumulation of bacterial plaque, and genetic
predisposition. Recent studies have demonstrated elevated levels of specific cytokines in
hyperplastic gingival tissue, particularly TGF-ß, which suggests that this growth factor plays a
role in the accumulation of the extracellular matrix. Treatment for this complication, until
recently, was only surgical. Nowadays, several studies have been conducted to determine
the effect of antibiotic treatment on the regression of gingival overgrowth. In the present
study we used roxithromycin, a macrolide antibiotic which has presented inhibitory effect on
TGF-ß production by inflammatory cells. The results suggest that roxithromycin (ROX) may
be an important therapeutic tool used to reduce cyclosporine-induced gingival overgrowth.
Key words: gingival overgrowth, cyclosporine, transplant.
Simone Aparecida Probst CONDÉ
1
Fernando Monteiro AARESTRUP
2
Beatriz Julião VIEIRA
3
Ivo Martins MALTA
4
Luciana Valente BORGES
5
Marcus Gomes BASTOS
6
1 Post-graduate Program in Brazilian Health, Federal University of Juiz de Fora/UFJF.
2 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora.
PhD in Pathology from Fluminense Federal University/UFF
3 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora.
PhD in Pathology from Fluminense Federal University/UFF.
4 Pharmacista/Biochemist
5 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora
- UFJF; Ph.D. in Pathology from the Universidade Federal Fluminense - UFF - Niterói (RJ), Brazil
6 Department of Nefrology, NIEPEN Institute, IMEPEN Foundation, Federal University of Juiz de
Fora/UFJF.
Correspondence: S.A.P. Condé, Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira/UFJF,
Campus da UFJF, bairro Martelos, 36036-900, Juiz de Fora, MG, Brazil. E-mail:
simoneprobst@ibest.com.br
82
12
5
INTRODUCTION
Cyclosporine (CsA) is a hydrophobic neutral cyclic polypeptide composed of
eleven amino acids and made from the fungus Tolypocladium inflatum gams. It
specifically acts in suppressing the immune response mediated by T cells. It goes
through biotransformation in the liver, resulting in 14 metabolic products, of which
90% is excreted in feces and 10% eliminated by the kidneys.
Gingival overgrowth is one of the side effects caused by the chronic use of
cyclosporine (CsA), which is employed to prevent rejection of transplanted organs
and to treat several autoimmune diseases, such as diabetes mellitus, Behcet's
disease, psoriasis, multiple sclerosis, erosive lichen planus, systemic lupus
erythematosus, bullous pemphigoid, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, uveitis,
and various glomerulopathies
1, 2
.
An immunohistochemical study has suggested that TGF-ß expression is
increased in gingival overgrowth induced by the drugs nifedipine and phenytoin
compared with control tissue
3
. Studies have shown that TGF-ß is a multifunctional
inflammatory mediator. It has a relation with the regulating cell proliferation and
differentiation as well as directly activating gene expression for the synthesis of
extracellular matrix components including collagenous proteins
4
.
GO treatment includes removing bacterial plaque, maintaining adequate oral
hygiene, and also includes invasive procedures, such as gingivectomy. Nevertheless,
that condition frequently relapses. Nowadays, the diary treatment with 300mg of
azithromycin (AZI) for five days is simple, cheap, conservative, quickly effective, and
avoids gingival surgery. It acts mostly against gram-positive and negative bacteria,
83
12
5
has quick oral absorption, does not alter serum levels of cyclosporine or levels of
creatinine. Azithromycin is well tolerated, but can produce side effects, such as
diarrhea, abdominal pain, nausea and vomiting
5, 6, 7
.
Yamabe et al
8
suggested that the use of roxithromycin has an inhibitory effect
on the production of TGF- by human mesangial cells, and can be efficient in the
treatment of glomerulosclerosis. The mechanisms that roxithromycin inhibited TGF-
production are not clear, but in this study the drug did not inhibit the activation of
tyrosine kinase and MAP kinase by thrombin. ROX suppressed the thrombin-induced
translocation of NF-B p65 protein into the nucleus. It is suggested that the activation
of NF-B regulates TGF- production, thus ROX inhibited TGF- production via the
inhibition of NF-b, therefore in this study we used roxithromycin as an alternative
therapeutic agent in the treatment of gingival overgrowth.
84
12
5
PATIENTS AND METHODS
Four renal transplant patients (3 men, 1 woman) were recruited from the
NIEPEN (Interdisciplinary Nucleus for Study, Research, and Extension of the Federal
University of Juiz de Fora). All the patients had used cyclosporine and developed a
moderate to severe gingival overgrowth. The demographic data (Table 1) were
evaluated before and after the treatment as well as gingival overgrowth was
diagnosed on the basis of measurements of sulcus and it was confirmed as positive
when the probing depth 4 mm, without exhibiting loss of periodontal attachment
(pseudopockets)
9
. A millimeter probe measured gingival sulci on the vestibular,
lingual, mesial and distal teeth surfaces. Sulcus depths are represented graphically in
Fig. 01-04. The patients were treated with 300 mg of roxithromycin for 5 days.
Statistical analysis considered the evaluation before and after the treatment,
comparing the same teeth surface. The Wilcoxon test was used to determine the
mean sulcus depth, comparing the values.
85
12
5
RESULTS
Demographics characteristics are on the Table 1. At the beginning of therapy
moderate to severe gingival overgrowth was present in all patients and abundant
bleeding when brushing tooth, during in the first exam. Three patients (75%) had
presented gingival sensibility and two patients (50%) had been submitted to
gingivectomy. Five days of roxythromycin treatment reduced the depth of all gingival
sulci (vestibular, lingual, mesial and distal) in all patients (Fig. 05-A,B). Gingival
bleeding decreased as well as pain.
86
12
5
Table 1 – Demographic Characteristics of Renal Transplant Patients
Sex (male/female) 3/1
Age (year) 55.75 ± 9.53
Time since transplant (month) 46.50 ± 31,12
Immunosuppressive drugs
Cyclosporine + Prednisone
Cyclosporine + Azathioprine
Cyclosporine + Prednisone + Azathioprine
1
2
1
Anti-hypertensive drugs
Nifedipine
2
87
12
5
Fig. 1-4: Probing depth (vestibular – 1; lingual – 2; mesial – 3; distal – 4) in renal
transplant patients before (exam 1) and after (exam 2) the roxithromycin treatment.
Note that all the patients and all the faces measurements reduced.
Vestibular
EXAM
2
1
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Patients
1
3
2
4
Gingival sulcus measurements (mm)
Mesial
EXAM
2
1
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Patients
1
3
2
4
Gingival sulcus measurements (mm)
Distal
EXAM
2
1
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
Patients
1
3
2
4
Gingival sulcus measurements (mm)
Lingual
EXAM
2
1
Gingival s
ulcus measurements (mm)
6
5
4
3
2
1
Patients
1
3
2
4
88
12
5
Fig. 02 - A – Patient from the Imepen Foundation, female, 47 years old, underwent
renal transplant one year and six months ago, treated with cyclosporine. Edematous
and erythematous gingiva. Highlighted, gingival hyperplasia in the upper and lower
canine region, before 5-day treatment with roxithromycin. B - Patient after 5-day
treatment with roxithromycin. Note the regression of GH in the highlighted region;
volume and gingival coloring are normal.
89
12
5
DISCUSSION
As reported in the literature, GO appears on the interdental papilla,
developing a lobulated appearance, growing in size and spreading to the dental
surface
10
. Clinical characteristics range from non-inflamed, firm, fibrous tissue to
tissue with a hemorrhagic, edematous and inflamed aspect, which goes so far as to
cover the dental crown
11
. Clinically gingival hyperplasia begins at the interdental
papillae, more commonly in anterior than in posterior region, and frequently on labial
than on lingual surfaces and it is most severe near the canines
5
. Similar
characteristics were observed in our patients. In the present study, we observed that
the treatment of roxithromycin by five days decrease gingival overgrowth in renal
transplanted patients.
Various studies have shown the effectiveness of azithromycin in the
regression of gingival overgrowth caused by the immunosuppressant, with a five-day
treatment with a 500 mg dose. Citterio et al
6
suggested that the treatment described
above should be repeated every 8 to 12 months, in order to avoid relapse, since, in
his study, 14% of the patients reported recurrence of gingival growth six months after
the treatment, and this percentage grew to 24% 17 months after the treatment.
According to Gómez et al
5
therapy with AZI should start as soon as possible, the first
signs of hyperplasia arise. Some authors suggest that effects of the antibiotic include
bacterial action, reduction of inflammation and gingival stimulation, and suppression
of protein synthesis by fibroblasts, inhibiting the proliferation of collagen
5, 6
.
Recently, Argani et al
20
obtained significant results with the use of a dentifrice
that contained azithromycin two times a day, for 4 weeks on renal transplant patients,
90
12
5
who responded satisfactorily to the topical use of the antibiotic, since there was
improvement in all of the periodontal parameters, such as plaque index, bleeding
during catheterization, depth of the sulcus, and rate of gingival growth. Remission of
gingival hyperplasia continued until three months after the dentifrice stopped being
used, suggesting, therefore, a safe and effective therapeutic alternative, with no
negative side effects. However the continuous use of this dentifrice contained
antibiotic is not recommended, because it changes the oral microflora, predisposing
the development of opportunistic infections.
There is evidence that CsA plays a role in modulating in fibroblastic activity;
however, this has not yet been elucidated. Various studies have demonstrated
abnormally elevated levels of specific cytokines in hyperplastic gingival tissue. These
findings are of great importance and suggest that the substances that cause GO can
alter the normal balance of cytokines in gingival tissues, enhances levels of
cytokines. These substances include: IL-6, IL-1, PDGF-B, FGF-
2
, CTGF, TGF-
2, 14
.
Wrigth et al
15
observed elevated levels of TGF-
1
in crevicular fluid in patients with
gingival overgrowth who used cyclosporine, in comparison with the control group
which did not use medication.
The transforming- growth factor (TGF-ß) is a multifunctional inflammatory
mediator that regulates the proliferation, differentiation, death of cells and apoptosis.
It also directly activates gene expression for synthesis of components of the
extracellular matrix, especially collagen, besides the inhibitory effects of matrix
degradation, reduced synthesis of proteases and increase in the levels of protease
inhibitors
16
. It induces an increase in the expression of collagens types I, III, VI, VII
and X, fibronectin and proteoglycans. In addition to this, it strongly regulates MMP-
91
12
5
13, a more restricted collagenase to hydrolyze the collagen in human gingival
fibroblasts
17
. It has several anti-inflammatory properties and it exerts its anti-
inflammatory actions via inhibiting mitogenesis and citokine reponses of glomerular
cells and suppressing function of infiltrating cells. This cytokine is implied in the
pathogenesis of various fibrotic conditions, such as: glomerulonephritis, scleroderma,
keloid formation in drug-induced and non-drug-induced renal fibrosis and in cardiac
insufficiency (heart failure)
15
.
Recently, it was reported that erythromycin ameliorates renal injury in strepto-
induced diabetic rats and erythromycin reduced TGF-ß gene expression, type IV
collagen production and NF-B activity in renal tissues
18
. It is possible that
roxithromycin inhibited TGF-ß production via the inhibition of NF-B activation
8
.
Therefore, due to the evidence in the literature, it is possible that TGF- has
an important role in cyclosporine-induced gingival overgrowth. In the present study
we observed that roxithromycin treatment reduced gingival overgrowth in renal
transplant patients, but the mechanism of action was not completely understood.
However, the inhibition of TGF- by macrolide antibiotic in culture human mesangial
cells was demonstrated
8
. It is possible that the effect of roxythromycin on gingival
overgrowth in renal transplant patients may be modulated by the inhibition of TGF-
production in gingival tissues, but further studies must be performed to investigate
this hypotesis.
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DOWN-REGULATION OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR–2
EXPRESSION IS ASSOCIATED WITH THE REDUCTION OF
94
12
5
CYCLOSPORIN-INDUCED GINGIVAL OVERGROWTH IN RATS
TREATED WITH ROXITHROMYCIN
Simone Aparecida Probst CONDÉ
1
,
Marcus Gomes BASTOS
2
, Beatriz Julião
VIEIRA
3
, Ivo Martins MALTA
4
, Luciana Valente BORGES
5
, Fernando Monteiro
AARESTRUP
6
1 Post-graduate Program in Brazilian Health, Federal University of Juiz de Fora/UFJF.
2 Department of Nefrology, NIEPEN Institute, IMEPEN Foundation, Federal University of Juiz de
Fora/UFJF.
3 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora.
PhD in Pathology from Fluminense Federal University/UFF.
4 Pharmacista/Biochemist
5 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora
- UFJF; Ph.D. in Pathology from the Universidade Federal Fluminense - UFF - Niterói (RJ), Brazil
6 Laboratory of Immunopathology and Experimental Pathology, Federal University of Juiz de Fora
- UFJF; Ph.D. in Pathology from the Universidade Federal Fluminense - UFF - Niterói (RJ), Brazil
Correspondence: S.A.P. Condé, Programa de Pós-graduação em Saúde Brasileira/UFJF,
Campus da UFJF, bairro Martelos, 36036-900, Juiz de Fora, MG, Brazil. E-mail:
simoneprobst@ibest.com.br
Abstract
BACKGROUND: Gingival overgrowth (GO) is a
common side effect of the
chronic use of cyclosporine (CsA), an immunosuppressant widely used to
prevent rejection in transplant patients. Recent studies have reported elevated
levels of specific cytokines in hyperplastic gingival tissue, particularly TGF-ß,
suggesting that this growth factor plays a role in the accumulation of
extracellular matrix materials. The effectiveness of azithromycin, a macrolide
antibiotic, in the regression of this undesirable side effect has also been
demonstrated. METHODS: In this study, we created an experimental model for
assessing the therapeutic effect of roxithromycin in GO and the expression of
transforming growth factor beta (TGF-2) through immunohistochemistry. We
used four groups of mice totaling 32 individuals. GO was induced during five
weeks and drug treatment was given on the 6
th
week as follows: group 1
received saline; group 2 received CsA and was treated with saline on the 6
th
week; group 3 received CsA and, on the 6
th
week, ampicilin; and group 4
received CsA during 5 weeks and, on the 6
th
week, was treated with
roxithromycin. RESULTS: The results demonstrated that roxithromycin
treatment was effective in reducing cyclosporine–induced GO in rats. Both
epithelial and connective tissue showed a decrease in thickness and a
significant reduction in TGF-2 expression, with a lower number of fibroblasts,
reduction in fibrotic areas and decrease in inflammatory infiltrate.
CONCLUSION: The present data suggest that the down-regulation of TGF-2
expression may be an important mechanism of action by which roxithromycin
inhibits GO.
Keywords: cyclosporine; gingival overgrowth; roxithromycin; TGF-2.
95
12
5
INTRODUCTION
Cyclosporine (CsA) has been widely used to prevent organ transplant rejection
and to treat various immunodiseases (DALEY & WYSOCKI, 1984). It selectively
suppresses helper T-cell function and modulates the network of inflammatory
cytokines. However, CsA is associated with several adverse side effects, such as
nephrotoxicity, hepatotoxicity, hirsutism and gingival overgrowth (GO)
(RATEITSCHAK-PLUSS et al., 1983; KAHAN, 1989; SEYMOUR et al., 1992).
The average prevalence of dentate transplant patients who develop
cyclosporine induced GO is around 30%, with variation between 10 and 85%
(WYSOCKI, 1983; DALEY, 1986; SEYMOUR, 1987; WONDIMU, 1993; ALLMAN,
1994). When associated with other medication, such as calcium channel blocker
antihypertensives, this prevalence increases, as does the gravity of the complication,
and, consequently, the risk (THOMASON, 1993; BÖKENKAMP, 1994; O´VALLE,
1995; MARGIOTTA, 1996).
Fibrosis, a common finding in GO, is the result of a variety of biochemical
signals from many cell types including inflammatory cells and fibroblasts, which
stimulate fibroblast proliferation and extracellular matrix production. The transforming
growth factor beta (TGF- ) is a multifunctional family of cytokines present in this
pathway. There are three mammalian isoforms of TGF- (TGF-1, TGF-2 and TGF-
3), which are structurally identical (IHN, 2002). Increased TGF-1
levels have been
associated in cyclosporin-induced renal fibrosis. Elevated gingival TGF-1
and TGF-
2
expression has been observed by immunohistochemical studies (SAITO et al.,
1996; WRIGTH et al., 2001). TGF-2 is an immunosuppressive cytokine modulated
96
12
5
by cyclosporine that plays a central role during the formation of fibrosis and
inflammatory reaction (SMITH et al., 2000; SAIKA et al., 2006; MAIER et al., 2006).
Recently, it was demonstrated that roxithromycin has an inhibitory effect on
the production of TGF- by human mesangial cells, and may be efficient in the
treatment of glomerulosclerosis (YAMABE et al. 2006). Therefore, this macrolide
antibiotic may be a therapeutic alternative in the treatment of gingival overgrowth.
In
the present study we investigated the effect of roxithromycin on GO in rats treated
with cyclosporine. Our findings indicate that roxithromycin reduces
GO and down-
regulates TGF-2 expression in gingival tissues.
97
12
5
MATERIAL AND METHODS
Thirty-two 6-week-old male Wistar rats (Rattus novergicus albinun), weighing
100 to 150 mg were randomly selected and divided equally into four groups of eight
animals each. The control rats (group 1) were daily injected subcutaneously with
saline. The experimental rats (group 2) were treated with CsA injected
subcutaneously in a daily dose of 10 mg/kg for six weeks and, at the beginning of the
6
th
week, they were injected subcutaneously with saline. Group 3 was similar to group
2, but in the last week it was treated with 50 mg/kg ampicillin (an antibiotic widely
used in periodontal infections) via gastric feeding. In group 4, the animals received
CsA daily for 6 weeks and in the last week they were treated with 40mg/kg
roxithromycin by gastric feeding. The rats were weighed weekly and the dosage was
adjusted accordingly. Diet and drinking water were given ad libitum during the
experiment.
Macroscopy analysis
At the end of the experimental period, all the animals were sacrificed by
means of an overdose of anesthesia. To investigate gingival alterations over time,
stone models were made from silicone impressions of the maxillary anterior region.
The buccal-lingual width and mesio-distal width of the anterior segment of the maxilla
were measured using a digital caliper.
98
12
5
Histopathology and histomorphometry
All gingival samples obtained were fixed in 10% buffered formalin (pH 7) for at
least 24 hours. After fixation, the samples were gradually dehydrated in increasing
concentrations of ethanol (70% to 100%), cleared in xylene, soaked and embedded
in paraffin, according to routine histological methods.
The paraffin-embedded fragments were cut with an “820” Spence microtome
and 4 µm thick sections were obtained. The histological slides were kept in an
incubator to dry, and then the sections were stained with hematoxylin and eosin for
histological analysis. Histomorphometry was performed using images captured and
evaluated by a computerized Axion Vision (Zeiss, Berlin, Germany) image capture
system. Images were captured from four randomly chosen microscopic fields for
each histological slide, using the digital camera (400X and 100X magnification) of an
Axiostar Plus microscope (Zeiss, Berlin, Germany).
The images were stored and submitted to a count of inflammatory cells and of
all fibroblast–like cells. Linear measurements were made to obtain the higher
diameter of epithelial and gingival connective tissue, using digital marking.
Immunohistochemistry
Paraffin sections (4 m of thick) of formalin-fixed tissue were obtained at varying
depths from each tissue block. The presence of TGF-2 enzyme in the gingival
samples was investigated in paraffin sections by using the avidin-biotin-peroxidase
complex procedure (ABC) with an additional step for antigen retrieval with a retrieval
solution (Dakopatts, Copenhagen, Denmark). In brief, the sections were incubated with
99
12
5
polyclonal rabbit anti-TGF-2 antibody diluted 1/20 and incubated for one hour at room
temperature (Santa Cruz, Santa Cruz, USA) followed by a goat anti-rabbit IgG
biotinylated antibody (Dakopatts, Copenhagen, Denmark). Controls for the ABC
procedure were performed by replacing anti-TGF-2 antibody with normal rabbit serum,
or by omitting the anti-TGF-2 antibody. The sections were analyzed via light
microscopy, and photomicrographs were taken with an Axiostar Zeiss microscope
(Zeiss, Germany). The number of the TGF-2 immunoreactive cells by microscopic
field (400 X magnification) was counted in connective tissue.
Statistical analysis
Data were expressed as means and standard deviation. ANOVA was used for
statistical evaluation. The gingival mucosa width, the number of inflammatory cells, all
fibroblast–like cells and TGF-2 immunoreactive cells were compared between groups
by using the Student’s t-test. The significance level adopted was p < 0.05.
100
12
5
RESULTS
All cyclosporine treated rats presented GO that was evident in all gingival
localizations. Graphic 1 shows macroscopic measurements of the buccal-lingual
width and mesio-distal width. The macroscopic analysis revealed a significant
reduction of the buccal-lingual width and mesio-distal width in the roxithromycin
treated rats (group 4) when compared with group 2 and group 3 (graphic 1). The
histopathological analysis revealed that GO was a result of the enlargement of
epithelial and connective tissues (figures 1A, 1B, 1C, 1D). No fibrotic areas were
observed in gingival samples from group 1 (negative control group). Extensive
fibrosis is a common finding in gingival samples from groups 2 and 3, however a few
number of fibrotic areas were observed in gingival tissue of roxithromycin treated rats
(figures 2A, 2B, 2C, 2D). Diameter measurements of the epithelial and connective
tissues were obtained (graphic 2). The measurements observed in roxithromycin
treated rats (group 4) were statistically lower than those observed in the GO positive
control groups (group 2 and group 3). The histomorphometric analysis also
demonstrated that the animals treated with roxithromycin presented a lower number
of fibroblasts per microscopic field (graphic 3).The identification of fibroblasts, based
on morphological criteria, was made by two different researchers. Finally, a lower
number of inflammatory cells was observed in gingival samples obtained from
roxithromycin treated group when compared with group 2 and group 3 (graphic 4).
Cytoplasmatic staining for TGF-2 was detected in most cell types of the
connective tissue. TGF-2 was expressed within connective tissue by inflammatory
cells, fibroblasts and endothelial cells (figures 3A, 3B, and 3C). Most of the fibroblasts
101
12
5
and endothelial cells were TGF-2 positive and showed a variable staining pattern,
usually weakly or darkly positive. Immunohistochemical analysis showed a lower
number of TGF-2 positive cells (graphic 5) – recognized morphologically as
fibroblasts, endothelial cells and inflammatory cells in the connective tissue samples
from roxithromycin treated rats when compared with GO positive controls rats (group
2, and group 3). No significant differences were detected when compared to the
number of TGF-2 positive cells in gingival samples obtained from group 1 and group
4 (graphic 5).
102
12
5
GROUPS
G4G3G2G1
Macroscopic measures means
4,4
4,2
4,0
3,8
3,6
3,4
Mesio-distal
Buccal-lingual
Graphic 01 – Macroscopic measurements of bucco-lingual and mesio-
distal maxillary regions. Results expressed as mean (p<0.05).
*
*
*
*
*
*
*
*
GROUP 1 - SALINE (negative control)
GROUP 2 - CsA + saline (positive control)
GROUP 3 - CsA + AMP (positive control)
GROUP 4 - CsA + ROX (treated group)
103
12
5
A
B
C
D
Fig. 01 – Gingival mucosa measurement (m) in the region with greater epithelial
and connective tissue thickness. A – D: Smaller thickness of gingival mucosa
(groups 1 and 4). B – C: Greater thickness of gingival mucosa (groups 2 and 3). In
detail: difference in the fibrotic areas in groups 3 and 4.
x – fibrosis. Original magnification 100x.
104
12
5
Fig. 02. A: Normal connective tissue in group 1 (negative control); B-
C: Extensive fibrosis in groups 2 and 3 (positive controls); D: Few
areas with fibrosis in group 4 (treated group). Original magnification
400x.
A B
C D
105
12
5
GROUPS
G4G3G2G1
Gingival mucosa mean
300
200
100
0
Gingival mucosa
Epitellium width
Conjuntive tiss widh
*
Graphic 02
–
Measurements of gingival mucosa
(epithelium and lamina propria). Results expressed as
mean (p<0.05).
*
*
GROUP 1 - SALINE (negative control)
GROUP 2 - CsA + saline (positive control)
GROUP 3 - CsA + AMP (positive control)
GROUP 4 - CsA + ROX (treated group)
106
12
5
1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
*
*
*
n° of fibroblasts
GROUPS
GROUP 1 - SALINE (negative control)
GROUP 2 - CsA + saline (positive control)
GROUP 3 - CsA + AMP (positive control)
GROUP 4 - CsA + ROX (treated group)
Graphic 03 – Number of fibroblasts per microscopic field. Results
expressed as mean ± SD (p<0.05).
107
12
5
Graphic 04 – Number of inflammatory cell per microscopic field. Results
expressed as mean ± SD (p<0.05).
108
12
5
Fig. 3. A-B: Elevated expression of TGF-
2
in cells of connective tissue
(groups 2 and 3); C: Light TGF-
2
stained cells in group 4. Red arrows -
negative staining cells. Blue arrows: positive staining cells. Original
magnification 400x.
A
B
C
109
12
5
1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
*
*
nº of TGF-B2 positive cells
GROUPS
GROUP 1 - SALINE (control negative)
GROUP 2 - CsA + SALINE (control positive)
GROUP 3 - CsA + AMP (control positive)
GROUP 4 - CsA + ROX (treated group)
Graphic 05 - Number of positive staining cell of TGF-
2 in connective tissue
per microscopic field. Results expressed as mean ± SD (p < 0.05).
*
110
12
5
DISCUSSION
Cyclosporine (CsA) is a hydrophobic neutral cyclic polypeptide composed of
eleven amino acids and made from the fungus Tolypocladium inflatuns gams. It
specifically acts in suppressing the immune response mediated by T cells. It goes
through biotransformation in the liver, resulting in 14 metabolic products, of which
90% is excreted in feces and 10% eliminated by the kidneys (SEYMOUR,
THOMASON, ELLIS, 1996).
Gingival overgrowth is one of the side effects caused by the chronic use of
cyclosporine (CsA), which is employed to prevent rejection of transplanted organs
and to treat several autoimmune diseases, such as diabetes mellitus, Behcet's
disease, psoriasis, multiple sclerosis, erosive lichen planus, systemic lupus
erythematosus, bullous pemphigoid, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, uveitis,
and various glomerulopathies (KAHAN, 1989; DE MATTOS, 1996; YOSHIDA, 2005).
GO treatment includes removing bacterial plaque, maintaining adequate oral
hygiene, and also includes invasive procedures, such as gingivectomy. Treatment for
this complication, until recently, was only surgical. Nowadays, several studies have
been conducted to determine the effect of antibiotic treatment on the regression of
gingival overgrowth. In 1995, Wahlstrom, Zamora and Teichmann coincidentally used
azithromycin – a semi synthetic antibiotic, derived from the macrolide erythromycin –
to treat respiratory infections in two renal transplant patients who had cyclosporine-
induced GO. They observed gingival reduction after using it. The daily treatment with
300 mg for five days is simple, cheap, conservative, quickly effective, and avoids
gingival surgery. It acts mostly against gram-positive and negative bacteria, has quick
111
12
5
oral absorption, does not alter serum levels of cyclosporine or levels of creatinine.
Azithromycin is well tolerated, but can produce side effects, such as diarrhea,
abdominal pain, nausea and vomiting (GÓMEZ, 1997; WIRNSBERGER et al., 1998;
CITTERIO, 2001; KWUN, 2003; TOKGOZ, 2004; CHAND, 2004).
Several studies have demonstrated elevated levels of specific cytokines in
hyperplastic gingival tissue, especially TGF-, which suggests that this growth factor
plays a role in the accumulation of the extracellular matrix (JAMES, IRWIN, LINDEN,
1998; RUHL et al., 2004; YOSHIDA, NAGATA, YAMANE, 2005). Recently, we used
roxithromycin in four renal transplanted patients (in press) and the results suggest
that roxithromycin may be an important therapeutic tool used to reduce cyclosporine-
induced GO.
Yamabe et al. (2006) suggested that the use of roxithromycin has an inhibitory
effect on the production of TGF- by human mesangial cells, and can be efficient in
the treatment of glomerulosclerosis. The mechanisms that roxithromycin inhibited
TGF- production are not clear, but in this study the drug did not inhibit the activation
of tyrosine kinase and MAP kinase by thrombin. Roxithromycin suppressed the
thrombin-induced translocation of NF-B p65 protein into the nucleus. It is suggested
that the activation of NF-B regulates TGF- production, thus ROX inhibited TGF-
production via the inhibition of NF-B.
An immunohistochemical study has suggested that TGF-ß expression is
increased in gingival overgrowth induced by the drugs nifedipine and phenytoin
compared with control tissue (SAITO, 1996). Studies have shown that TGF-ß is a
multifunctional inflammatory mediator. It has a role in regulating cell proliferation and
differentiation as well as in directly activating gene expression for the synthesis of
112
12
5
extracellular matrix components including collagenous proteins (ROBERTS, 1983;
BARNARD, 1990).
In the present study, the results demonstrated that roxithromycin treatment
was effective to reduce cyclosporine–induced GO in rats. Both epithelial and
connective tissues showed a decrease in thickness in roxithromycin treated rats in
comparison with animals from the control groups. In addition, the significant reduction
in TGF-2 expression in roxithromycin treated rats was associated with a lower
number of fibroblasts, with reduction of fibrotic areas and decrease in inflammatory
infiltrate. Taken together, our data suggest that the down-regulation of TGF-2
expression may be an important mechanism of action by which roxithromycin inhibits
GO.
113
12
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5 – COMENTÁRIOS FINAIS
O trabalho entitulado “Avaliação da roxitromicina na regressão da
hiperplasia gengival induzida pela ciclosporina em ratos”, referente a dissertação de
mestrado supra-citado, foi aprovado para apresentação na 24ª Reunião da
Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica que acontecerá entre os dias 02 a
04 de setembro de 2007, na cidade de Atibaia, no estado de São Paulo.
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6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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