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Tânia Cristina Lima
Cirrose hepática induzida por tioacetamida: estudo do
modelo por injeção intraperitoneal a longo prazo em ratas
Wistar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres
Orientador:
Prof. Dr. Francisco Javier Hernandez Blazquez
São Paulo
2008
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Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.2038 Lima, Tânia Cristina
FMVZ Cirrose hepática induzida por tioacetamida: estudo do modelo por injeção
intraperitoneal a longo prazo em ratas Wistar / Tânia Cristina Lima. – São Paulo :
T. C. Lima, 2008.
140 f. : il.
Dissertação (mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, 2008.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Javier Hernandez Blazquez.
5
1. Cirrose. 2. Tioacetamida. 3. Fígado. 4. Função hepática. 5. Rato. I. Título.
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FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: LIMA, Tânia Cristina
Título: Cirrose hepática induzida por tioacetamida: estudo do modelo por injeção
intraperitoneal a longo prazo em ratas Wistar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Data:____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________________ Instituição: __________________
Assinatura: ________________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. __________________________________ Instituição: __________________
Assinatura: ________________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. __________________________________ Instituição: __________________
Assinatura: ________________________________ Julgamento: __________________
Aos meus pais,
Jesus Barreira Lima e Ivani Ferreira do Nascimento Lima
pelo amor, incentivo e apoio incondicionais desde sempre;
pela confiança, paciência e pela luta constante para tornar
realidade os meus sonhos, que também são os seus...
Aos meus familiares,
porque sei que também se orgulham de mim e sempre pude contar
com eles
DEDICATÓRIA
Ao meu amor:
Carlos
Namorado, companheiro, parceiro...
Deu-me o seu apoio, o seu carinho e amor.
Foi o maior incentivador e o maior crítico do meu trabalho.
Esteve sempre ao meu lado em cada etapa e em cada detalhe,
do primeiro ao último dia...
Transmitiu-me a sua experiência de vida e de trabalho,
a sua paixão pelos ratos e pela natureza.
Todos os momentos ao seu lado são sempre muito intensos e, por
isso, tão especiais...
Te amo
pelo que você é e do jeito que é
DEDICATÓRIA
Aos animais
Todo o meu respeito e gratidão por essas criaturas de
Deus que colaboram com o desenvolvimento do Homem
DEDICATÓRIA
A Deus,
Que me permitiu chegar até aqui e realizar esse sonho.
Concedeu-me a graça de conhecer pessoas maravilhosas e
sempre foi minha companhia mais constante e fiel.
Fortaleza nos momentos difíceis, acalanto na solidão...
Em sua infinita generosidade, deu-me ainda esta recompensa!
Obrigada, Senhor
por suas dádivas inesgotáveis...
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao Prof. Francisco,
pelo acolhimento, boa vontade e paciência, quando aqui
cheguei, inexperiente e meio perdida...
pelo exemplo de caráter, retidão, seriedade, respeito e
profissionalismo.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
[ Ao Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo, onde concluo este curso de
Pós-Graduação.
[ À Profª Drª Maria Angélica Miglino, coordenadora do curso de Pós-
Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da FMVZ-
USP.
[ Aos professores da Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres da FMVZ-USP.
[ Ao técnico do laboratório de Imuno-Histoquímica da Anatomia, onde este
trabalho foi desenvolvido, Diogo Nader Palermo, pelas instruções
necessárias.
[ Aos funcionários da Anatomia: Maicon Barbosa da Silva, Jaqueline Martins
de Santana, Edinaldo Farias, João do Carmo Freitas, Raimundo Leal de
Sousa, Ronaldo Agostinho da Silva, Sandra Affonso, Tatiana, Fátima, D.
Branca, Rose e Débora.
[ Às funcionárias da Secretaria de Pós-Graduação, Cláudia Lima, Deise Flexa
e Joana Vasconcelos (em especial), pela atenção e ajuda que sempre
prestaram.
[ Às funcionárias da biblioteca da FMVZ-USP, pelo auxílio prestado sempre
que necessário. À Elena, paciente, atenciosa e bem humorada.
[ Ao Departamento de Patologia da FMVZ-USP, pela disponibilização das suas
dependências para a realização dos experimentos.
[ À Profª Drª Maria Lúcia Zaidan Dagli, docente do Departamento de
Patologia, pela valiosa colaboração na avaliação histopatológica do material.
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
[ Ao Dr. Carlos de Paula Portela, pós-doutorando do Departamento de
Patologia, pela orientação na avaliação comportamental e pela imensa
colaboração em todas as etapas deste trabalho.
[ Aos funcionários do Biotério do Departamento de Patologia, Cláudia,
Herculano, Nelsinho, Idalina e Rosiris, pela amizade e pela presteza com que
sempre me ajudaram.
[ Ao Prof. Dr. Fernando Salvador Moreno, docente do Departamento de
Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas
da Universidade de São Paulo, e à Drª Maria Aderuza Horst, pós-
doutoranda desse departamento, pela colaboração na realização da imuno-
histoquímica.
[ Aos funcionários do Setor de Informática, Miro, Antonio, Luis e Rubens.
[ Aos seguranças da FMVZ-USP, que em vários finais de semana e feriados
me abriram a porta do prédio.
[ À empresa Bio Brasil, representante da IDEXX Laboratories Inc., que nos
forneceu o aparelho de análises bioquímicas, e a sua funcionária Tatiana,
pela atenção e prontidão com que nos instruiu na utilização desse aparelho.
[ À FAPESP, pelo apoio financeiro (Processo nº 06/53104-4) e à CAPES.
¾ Aos meus amigos e companheiros de trabalho do laboratório: Gisele, Thiago
(autor da foto da ratinha), Josy, Diogo e Ricardo; Alex (e a saga do
chocolate...), Elizangela (no dilema entre injetar e pegar o rato, trabalhamos
muito bem juntas...) e Paula (passamos juntas os apuros da etapa final...); os
ICs, Cíntia, Rodrigo, Leandro e Ellen (minha IC querida, responsável e
dedicada, “expert” em histopatologia!).
¾ A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres. Em especial Rose e Janaína, sempre tão atenciosas
e pacientes, e Fernanda, sempre divertida com seus comentários
pertinentes, por terem me acolhido bem desde a minha chegada. Perdoem-
me não citar mais nomes, não quero cometer a injustiça de esquecer alguém.
¾ Às minhas amigas de Uberlândia, Roseâmely e Adriana (em memória), que me
trouxeram para São Paulo e me ajudaram muito lá e aqui.
¾ Ao meu orientador de Iniciação Científica na Universidade Federal de
Uberlândia, Zenon Silva, que incentivou a minha vinda para cá.
¾ Aos amigos que deixei no Departamento de Anatomia Humana da
Universidade Federal de Uberlândia, Anivanda, Daniela, Sílvio, Lázaro e o
meu Prof. Gilmar, pessoas muito especiais que sempre me apoiaram e
torceram por mim. Não sei se ainda estão todos por lá.
¾ Aos amigos da faculdade, cuja amizade sobreviveu ao tempo e à distância:
Ana Lúcia, Luiz, Hirla, Priscila, Marcos, Leandro, Henrique e Felipe.
¾ Aos amigos da escola, Luciana, Gilberto e Darlan, pela valiosa amizade que
nos une há mais de 15 anos. Sei que também vibram com as minhas
conquistas.
¾ Aos colegas do VPT, Bruno, Tereza e Cíntia, sempre tão gentis e dispostos a
ajudar. E aos demais, Heidge, Andréia, Domenica, Karin, Ricardo, Luciana
Vismari, Natô, Shirley, Marguith, Jorge, Buga e Lívia, Lílian, Paulo Maiorka,
Dr. João Palermo, Fred e Carol, que me acolheram bem nesse departamento.
AGRADECIMENTOS PESSOAIS
LIMA, T. C. Cirrose hepática induzida por tioacetamida: estudo do modelo por injeção
intraperitoneal a longo prazo em ratas Wistar. [Hepatic cirrhosis induced by
thioacetamide: study of the model of intraperitoneal long term administration in Wistar rats].
2008. 140 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
A baixa sensibilidade dos animais à droga e a função hepática pouco alterada são as principais
dificuldades para o desenvolvimento da cirrose hepática experimental. A proposta deste
trabalho foi aprimorar o modelo de cirrose por injeção intraperitoneal de tioacetamida (TAA)
a fim de reduzir a adaptação dos animais ao fármaco. Foram utilizados 5 grupos de fêmeas de
ratos Wistar: A (200 mg TAA/kg); B (aumento de 20% aos 48 dias); C (aumento de 10% a
cada 24 dias); D (aumento de 15% a cada 24 dias); E (solução salina). Os animais foram
injetados 3 vezes por semana durante 14 semanas. Foram realizadas coletas sanguíneas, por
punção cardíaca, no início, no final do experimento e antes dos aumentos de dose, para
análise dos marcadores de função hepática. A avaliação comportamental foi efetuada pelo
método do labirinto em cruz elevado (LCE). Amostras de fígado foram colhidas e submetidas
ao processamento para microscopia de luz. Os animais tratados com TAA apresentaram
piloereção, icterícia e cromodacriorréia. Os testes do LCE demonstraram estresse e/ou
ansiedade nesses animais. Os fígados cirróticos apresentaram nódulos regenerativos e lesões
hemorrágicas na superfície. O ganho de peso foi semelhante entre os grupos tratados, porém,
inferior ao do grupo E. Os danos de função hepática foram mais acentuados nos grupos em
que houve aumento de dose, entretanto, a mortalidade do grupo D foi elevada (44%). O
tratamento com TAA levou ao desenvolvimento de cirrose com formação de nódulos
regenerativos circundados por septos fibrosos e desarranjo da arquitetura hepática. A
deposição de colágeno foi maior nos grupos B e C. O grupo D apresentou quantidade de
colágeno semelhante a do grupo A. O exame histopatológico demonstrou intensa proliferação
de células ovais e hiperplasia de ductos biliares com produção de muco ácido. Foi observada
presença de hemossiderina, hepatócitos balonizados, lesões nucleares e células inflamatórias.
A administração de TAA provocou ainda o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas,
sugerindo possível efeito carcinogênico dessa substância. Os resultados demonstraram que os
grupos B e C foram os mais eficazes no desenvolvimento da cirrose experimental. O grupo D,
apesar do aumento maior na dose, apresentou resultados similares aos do grupo A (dose
constante) e alta mortalidade, selecionando animais resistentes à droga. Assim, recomenda-se
o modelo de indução do grupo B por apresentar menor mortalidade (5%), menor influência no
aspecto emocional e quadro cirrótico tão grave quanto o dos animais do grupo C.
Palavras-chave: Cirrose. Tioacetamida. Fígado. Função Hepática. Rato.
RESUMO
LIMA, T. C. Hepatic cirrhosis induced by thioacetamide: study of the model of
intraperitoneal long term administration in Wistar rats. [Cirrose hepática induzida por
tioacetamida: estudo do modelo por injeção intraperitoneal a longo prazo em ratas Wistar].
2008. 140 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
The low sensitivity of animals to drugs and the lack of changes in liver function are the main
difficulties for the development of experimental liver cirrhosis. The aim of this study was
improving the model of cirrhosis by intraperitoneal injection of thioacetamide (TAA) to
reduce the animal adaptation to the drug. We used 5 groups of female Wistar rats: A (200 mg
TAA/kg), B (increase of 20% to 48 days), C (increase of 10% every 24 days), D (increase of
15% every 24 days), E (saline). The animals were injected 3 times a week for 14 weeks.
Blood samples were collected by cardiac puncture at the start and at the end of the experiment
as well as before each dose increment, for analysis of markers of liver function. The
behavioral assessment was done by the method of elevated plus-maze. Samples of liver were
collected and processed to light microscopy. The animals treated with TAA showed
piloerection, jaundice and chromodacryorrhea. Behavioral test showed stress and/or anxiety in
these animals. The liver cirrhosis showed regenerative nodules and hemorrhagic lesions on
the surface. Weight gain was similar among the groups treated, however, all of them were
smaller than those of group E. The damage of the liver function was more pronounced in
groups where the dose was increased over the experimental period, however, the mortality of
group D was higher (44%). Treatment with TAA led to the development of cirrhosis with
formation of regenerative nodules surrounded by fibrous septa and hepatic architecture
disruption. The deposition of collagen was higher in groups B and C, whereas group D was
similar to group A. Histopathologic evaluation showed intense proliferation of oval cells and
bile duct hyperplasia, with production of acid mucin. It was observed the presence of
hemosiderin, hepatocyte ballonization, nuclear lesions and inflammatory cells. The
administration of TAA led to the development of neoplastic lesions, suggesting possible
carcinogenic effect of this substance. The results showed that the treatment of groups B and C
were most effective in the development of experimental cirrhosis. Despite that animals of
group D received an increment in their TAA dose, their results seems similar to those of
group A but with high mortality, probably because the treatment selected resistant animals to
the drug. Therefore, it is recommended the model of induction of group B due to the lower
mortality (5%), less influence on the emotional aspect and development of cirrhosis as severe
as that the rats of group C.
Key words: Cirrhosis. Thioacetamide. Liver. Hepatic function. Rat.
ABSTRACT
Figura 1 - Labirinto em Cruz Elevado – equipamento para avaliação
comportamental ...................................................................................
.
060
Figura 2 - Taxa de mortalidade registrada durante o experimento.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
068
Figura 3 - Número de entradas nos braços fechados do Labirinto em Cruz
Elevado durante indução de cirrose. (B): ANOVA seguida por teste
de Tukey-Kramer; (C) e (D): ANOVA seguida por teste de Holm-
Sidak. * P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
069
Figura 4 - Tempo de permanência (s) nos braços abertos do Labirinto em
Cruz Elevado durante indução de cirrose. ANOVA seguida por
teste de Holm-Sidak. * P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
070
Figura 5 - Fígados cirróticos de ratas após 14 semanas de tratamento com
TAA. (a, b) grupo C (aumento de 10% a cada 24 dias) mostrando
nódulos regenerativos na superfície do órgão; (c) grupo D
(aumento de 15% a cada 24 dias), fígado sem nodulação evidente,
porém com pontos esbranquiçados em sua superfície; (d) grupo B
(aumento de 20% aos 48 dias) mostrando lesão hemorrágica, a qual
foi observada em todos os grupos cirróticos. Barra: 1,5 cm (a, b, c),
1,0 cm (d).............................................................................................
.
071
Figura 6 - Índice de ganho de peso dos grupos durante o período
experimental.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
072
Figura 7 - Box Plot dos valores de GGT do grupo A (14 semanas 200 mg/kg). .
.
076
Figura 8 - Box Plot dos valores de GGT do grupo B (aumento de 20% aos 48
dias)......................................................................................................
.
077
LISTA DE FIGURAS
Figura 9 - Box Plot dos valores de GGT do grupo C (aumento de 10% a cada
24 dias).................................................................................................
.
079
Figura 10 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo E (14
semanas solução salina): a) fileiras de hepatócitos separadas por
sinusóides (seta), confluindo para veias centrolobulares (asterisco).
Coloração HE. Barra: 100 µm; b) espaço porta composto pela
tríade portal: ramo da veia porta (asterisco), ramo da artéria
hepática (cabeça de seta) e ducto biliar (seta). Coloração
PAS/Hematoxilina. Barra: 200 µm......................................................
.
087
Figura 11 – Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA:
a) observar o parênquima tecidual dividido por septos (seta) e a
ausência de sinusóides; b) nódulos regenerativos (asterisco)
circundados por septos fibrosos (seta). Coloração HE. Barra: 200
µm........................................................................................................
.
088
Figura 12 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo A (14
semanas 200 mg/kg): a) septos fibrosos delgados (seta)
circundando nódulo regenerativo incompleto (asterisco); b)
arquitetura hepática parcialmente preservada com integridade de
espaços porta (seta). Coloração Picrossírius. Barra: 200 µm ..............
.
088
Figura 13 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo B
(aumento de 20% aos 48 dias): a) septos fibrosos (seta) emitindo
prolongamentos (cabeça de seta); b) nódulos regenerativos
incompletos (asterisco); c) septos fibrosos espessos (seta)
delimitando nódulos regenerativos completos; d) abundante
deposição de colágeno no espaço porta (seta). Coloração
Picrossírius. Barra: 200 µm .................................................................
.
089
Figura 14 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo C
(aumento de 10% a cada 24 dias): a) septos fibrosos largos (seta)
delimitando nódulo completo (asterisco); b) prolongamentos dos
septos fibrosos (seta); c) septos fibrosos formando pontes (seta); d)
espaços porta ampliados (asterisco) unidos por pontes de colágeno
(seta). Coloração Picrossírius. Barra: 200 µm.....................................
.
090
Figura 15 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo D
(aumento de 15% a cada 24 dias): a) septos fibrosos (seta) unindo
espaços porta (cabeça de seta) sem delimitar nódulos; b) nódulos
regenerativos grandes (asterisco); c) septos espessos formando
pontes (seta); d) parênquima hepático pouco desarranjado com
espaços porta (seta) íntegros. Coloração Picrossírius. Barra: 200
µm........................................................................................................
.
091
Figura 16 - Porcentagem da área de colágeno no fígado em cada grupo.
Objetiva de 20x; campo medido = 603126 µm
2
. *P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
093
Figura 17 - Porcentagem da área de colágeno no fígado em cada grupo.
Objetiva de 60x; campo medido = 67014,2 µm
2
. *P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina....................................................................................................
.
094
Figura 18 - Fotomicrografias do tecido hepático: a) animal tratado com TAA;
b) animal controle. Notar as fibras colágenas do parênquima
hepático. Coloração Picrossírius. Barra: 50 µm ..................................
.
095
Figura 19 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA:
a) septos formados por fibras colágenas que caracterizam a fibrose
(seta). Barra: 100 µm; b) presença de células ovais (cabeça de
seta); c) inclusão nuclear (seta). Coloração HE. Barra: 30 µm (b e
c) ..........................................................................................................
.
096
Figura 20 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA:
a) figuras de mitose (seta); b) célula binucleada (seta), observar a
degeneração de um dos núcleos; c) hepatócitos encarcerados por
células ovais (asterisco). Coloração HE. Barra: 50 µm (a e b), 30
µm (c)...................................................................................................
.
098
Figura 21 - Média dos escores para os parâmetros histopatológicos avaliados.
*estatisticamente diferente do grupo A;
#
estatisticamente diferente
do grupo D.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos
48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias...........................................................
.
099
Figura 22 - Porcentagem do número de animais que apresentaram proliferação
de ductos biliares em cada grupo. Grupo A: 14 semanas 200
mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento
de 10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias;
Grupo E: 14 semanas solução salina ...................................................
.
099
Figura 23 - Fotomicrografias do tecido hepático de animal tratado com TAA:
presença de hemossiderina (seta) principalmente ao redor dos
espaços porta. Coloração Azul da Prússia. Barra: 300 µm (a); 200
µm (b)..................................................................................................
.
100
Figura 24 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA:
a) células inflamatórias: neutrófilo (seta), plasmócitos (cabeça de
seta amarela) e linfócitos (cabeça de seta verde); b) hepatócito com
lesão nuclear (seta); c) megalócitos (seta), células inflamatórias:
basófilo (seta azul), linfócito (seta verde), neutrófilo (seta amarela);
d) hepatócitos balonizados (asterisco); e) corpo apoptótico (seta);
f) fotomicrografia e em fluorescência, corpo apoptótico fluoresce
devido à eosina (seta). Coloração HE. Barra: 30 µm (a e b), 50 µm
(c e d), 200 µm (e e f)..........................................................................
.
101
Figura 25 - Fotomicrografias do tecido hepático com marcação para
glicogênio: a) fígado de animal do Grupo E (14 semanas solução
salina), observar menor positividade nas regiões próximas aos
espaços porta (cabeça de seta) do que nas regiões próximas às veias
centrolobulares (seta); b) fígado de animal cirrótico com
parênquima homogeneamente positivo. Coloração
PAS/Hematoxilina. Barra: 300 µm......................................................
.
102
Figura 26 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA
com região de extensa proliferação de ductos biliares (a) e presença
de substância fortemente positiva ao PAS preenchendo o lúmen
dos mesmos (seta) (b). Coloração: HE (a); PAS/Hematoxilina (b).
Barra: 300 µm......................................................................................
.
103
Figura 27 - Fotomicrografias do tecido hepático com proliferação de ductos
biliares antes e após digestão do glicogênio: a) substância
verificada pela positividade ao PAS; b) mucopolissacarídeo
identificado pela resistência à amilase salivar. Coloração
Diastase/PAS/Hematoxilina. Barra: 100 µm.......................................
.
103
Figura 28 - Fotomicrografia do tecido hepático com proliferação de ductos
biliares e mucopolissacarídeo ácido (seta) produzido pelas células
epiteliais desses ductos. Coloração Azul de Alcian/HE. Barra: 100
µm........................................................................................................
.
104
Figura 29 - Fotomicrografias do tecido hepático de animal tratado com TAA:
a) regiões positivas para marcação imuno-histoquímica anti-GST-P
identificando lesões pré-neoplásicas (setas); b) região de transição
entre a lesão e o tecido adjacente. Coloração HE. Barra: 600 µm
(a); 200 µm (b) ....................................................................................
.
105
Figura 30 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA
apresentando lesões pré-neoplásicas ao centro: a) observar células
maiores com citoplasma rarefeito e vários núcleos acidófilos e
disformes (seta). Coloração HE. Barra: 200 µm; b) células pré-
neoplásicas com maior quantidade de glicogênio. Coloração
PAS/Hematoxilina. Barra: 300 µm......................................................
.
105
Tabela 1 - Comparação da média e desvio padrão do índice de ganho de peso
(IGP= Pss / Pi) entre os grupos em cada semana, contada a partir da
semana 0 – início do experimento.
São Paulo, 2008...................................
.
073
Tabela 2 - Média e desvio padrão de índices relativos à massa e volume em todos
os grupos. São Paulo, 2008.......................................................................
.
074
Tabela 3 - Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo A (14 semanas 200 mg TAA/kg). São Paulo, 2008.......
.
075
Tabela 4 - Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo B (aumento de 20% aos 48 dias). São Paulo, 2008 .......
.
077
Tabela 5 - Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo C (aumento de 10% a cada 24 dias). São Paulo, 2008...
.
078
Tabela 6 - Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo D (aumento de 15% a cada 24 dias). São Paulo, 2008 ..
.
080
Tabela 7 - Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo E (14 semanas solução salina). São Paulo, 2008...........
.
081
Tabela 8 - Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática
entre todos os grupos no início do experimento. São Paulo, 2008 .............
.
082
Tabela 9 - Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática
entre os grupos C e D após 24 dias de tratamento com TAA. São Paulo,
2008.........................................................................................................
.
083
Tabela 10 - Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática
entre os grupos B, C e D após 48 dias de tratamento com TAA. São
Paulo, 2008 ..............................................................................................
.
084
Tabela 11 - Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática
entre os grupos C e D após 72 dias de tratamento com TAA. São Paulo,
2008.........................................................................................................
.
085
Tabela 12 - Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática
entre todos os grupos após 14 semanas de tratamento. São Paulo, 2008....
.
086
Tabela 13 - Área ocupada pelo colágeno interlobular no fígado, mensurada em 250
campos de cada grupo tratado e 300 campos no grupo controle (valor de
cada campo: 603126 µm
2
). São Paulo, 2008.............................................
.
092
Tabela 14 - Área ocupada pelo colágeno intralobular no fígado, mensurada em 500
campos de cada grupo tratado e 600 campos do grupo controle (valor do
campo medido: 67014,2 µm
2
). São Paulo, 2008........................................
.
093
Tabela 15 - Comparação da média e desvio padrão dos escores dos parâmetros
histopatológicos dos grupos tratados com TAA. São Paulo, 2008.............
.
097
LISTA DE TABELAS
Quadro 1 - Fórmulas estruturais de compostos do grupo Nitrosamina ......... 048
Quadro 2 - Esquema ilustrativo da metabolização da tioacetamida .............. 051
Quadro 3 - Protocolo de indução do grupo C ................................................ 058
Quadro 4 - Protocolo de indução do grupo D................................................ 058
LISTA DE QUADROS
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................
023
2 OBJETIVOS.........................................................................................................
028
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 029
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................. 029
3 REVISÃO DE LITERATURA ...........................................................................
030
3.1 FÍGADO ................................................................................................................ 031
3.1.1
Anatomia ................................................................................................................
031
3.1.2
Funções ..................................................................................................................
032
3.1.3
Estrutura ................................................................................................................
032
3.1.4
Circulação Hepática..............................................................................................
033
3.1.5
Histologia...............................................................................................................
034
3.2 REGENERAÇÃO HEPÁTICA............................................................................. 036
3.3 PROCESSOS PATOLÓGICOS ............................................................................ 038
3.3.1
Fibrose ...................................................................................................................
039
3.3.2
Cirrose ...................................................................................................................
041
3.3.3
Hepatocarcinoma...................................................................................................
043
3.4 ANÁLISE BIOQUÍMICA DA FUNÇÃO HEPÁTICA........................................ 045
3.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE CIRROSE HEPÁTICA .............................. 048
3.5.1
Dimetilnitrosamina ................................................................................................
048
3.5.2
Tetracloreto de carbono ........................................................................................
049
3.5.3
Tioacetamida..........................................................................................................
050
3.6 AVALIAÇÃO DA EMOCIONALIDADE............................................................ 053
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................
056
4.1 ANIMAIS .............................................................................................................. 057
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ............................................................. 057
4.2.1
Colheita e Processamento de Amostras Sanguíneas .............................................
059
4.2.2
Avaliação Comportamental ...................................................................................
059
4.2.3
Eutanásia ...............................................................................................................
061
4.2.4
Processamento do Fígado......................................................................................
061
4.3 ÍNDICES RELATIVOS......................................................................................... 061
4.4 ANÁLISE BIOQUÍMICA..................................................................................... 062
4.5 MICROSCOPIA DE LUZ E DOCUMENTAÇÃO FOTOGRÁFICA.................. 062
4.5.1
Colorações .............................................................................................................
063
4.5.2
Quantificação de Colágeno ...................................................................................
063
4.5.3
Avaliação Histopatológica.....................................................................................
064
4.5.4
Imuno-histoquímica para Glutationa S-Transferase Forma Placental (GST-P) ..
065
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 066
SUMÁRIO
5 RESULTADOS ....................................................................................................
067
5.1 OBSERVAÇÕES PRELIMINARES..................................................................... 068
5.2 AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL................................................................ 069
5.3 MACROSCOPIA................................................................................................... 071
5.4 GANHO DE PESO................................................................................................ 072
5.5 ÍNDICES RELATIVOS......................................................................................... 074
5.6 FUNÇÃO HEPÁTICA – COMPARAÇÕES INTRAGRUPOS ........................... 075
5.6.1
Grupo A..................................................................................................................
075
5.6.2
Grupo B..................................................................................................................
076
5.6.3
Grupo C .................................................................................................................
078
5.6.4
Grupo D .................................................................................................................
079
5.6.5
Grupo E..................................................................................................................
080
5.7 FUNÇÃO HEPÁTICA – COMPARAÇÕES INTERGRUPOS............................ 081
5.7.1
Todos os Grupos: início.........................................................................................
082
5.7.2
Grupos C e D: 24 dias ...........................................................................................
083
5.7.3
Grupos B, C e D: 48 dias.......................................................................................
084
5.7.4
Grupos C e D: 72 dias ...........................................................................................
085
5.7.5
Todos os Grupos: última semana do experimento.................................................
086
5.8 MORFOLOGIA..................................................................................................... 087
5.9 QUANTIFICAÇÃO DE COLÁGENO ................................................................. 092
5.10 HISTOPATOLOGIA............................................................................................. 095
5.11 HISTOQUÍMICA .................................................................................................. 102
5.12 IMUNO-HISTOQUÍMICA ................................................................................... 104
6 DISCUSSÃO.........................................................................................................
106
7 CONCLUSÕES....................................................................................................
122
REFERÊNCIAS...................................................................................................
124
ANEXO .................................................................................................................
139
1 INTRODUÇÃO
Tânia C. Lima Introdução -
23
1 INTRODUÇÃO
As doenças hepáticas constituem um dos maiores problemas de saúde de ordem
mundial. Na África e na Ásia, as principais causas são as infecções virais e parasitárias,
destacando-se a hepatite B (HVB), um dos principais patógenos humanos que infecta cerca de
400 milhões de pessoas no mundo. Na Europa e na América, o consumo de álcool e a hepatite
C (HVC) são as maiores causas das doenças hepáticas, juntamente com a esteatohepatite não-
alcoólica (MURIEL; ESCOBAR, 2003; HENDERSON; IREDALE, 2007; SCHUPPAN;
AFDHAL, 2008; ZHANG et al., 2008).
Um quinto de todos os cânceres são causados por uma infecção crônica. O câncer de
fígado é um dos 5 tipos mais comuns de tumores, principalmente em homens, no mundo
inteiro (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008). A mortalidade por hepatocarcinoma
associado à cirrose está se elevando, enquanto que a mortalidade por cirrose não associada ao
hepatocarcinoma vem diminuindo. A incidência desse tipo de câncer em pacientes cirróticos é
de 2-7% (SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
Nos Estados Unidos e na Europa, a cirrose hepática é a causa não-neoplásica mais
comum de morte entre as doenças hepatobiliares e digestivas (PINZANI; ROMBOUTS,
2004). Porém, a prevalência da cirrose na população mundial não é conhecida com exatidão.
Estima-se que, apenas nos Estados Unidos, a cirrose atinja 400 mil pessoas (0,15% da
população). Contudo, este número pode ser muito maior já que em muitos casos a doença
permanece não diagnosticada por extensos períodos, podendo atingir até 1% da população
americana. Números similares são verificados na Europa e números muito maiores são
observados em muitos países da Ásia e África, onde a infecção pelos vírus da hepatite B e C é
comum (SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
No Brasil, a taxa de mortalidade por cirrose hepática é de 13,2 por 100 mil habitantes,
no sexo masculino, e 2,9 no sexo feminino (DATASUS - IDB 2001). O consumo abusivo do
álcool ainda é considerado a principal causa, mas nota-se um aumento na incidência das
hepatites de caráter crônico, contribuindo para os altos índices de mortalidade da cirrose. Em
2005 foram registrados 63.477 novos casos de hepatites virais sendo que a incidência da HVC
foi de 13.261 e da HVB 14.681 casos. Em 1997, o número de casos registrados de HVC foi de
3.135 e de HVB 6.098 (DATASUS). O aumento da incidência de HVC e HVB,
provavelmente, está relacionado a aspectos de comportamento e relacionamento sociais da
população (CHÁVEZ; CAMPANA; HAAS, 2003).
Tânia C. Lima Introdução -
24
Em virtude do grave problema de saúde mundial que a cirrose representa, face aos
vários agentes etiológicos e fatores de risco que contribuem para os altos números
explicitados aqui, muitas pesquisas envolvendo essa doença são realizadas pelo mundo todo.
Esses trabalhos são efetuados com a finalidade de testar substâncias e desenvolver métodos
que possam se converter em tratamentos para essa doença em busca da cura, ou pelo menos o
aumento da sobrevida do paciente sem agravamentos.
Considerações éticas limitam procedimentos em seres humanos, reforçando a
necessidade de modelos animais que reproduzam o quadro patológico da cirrose (LALEMAN
et al., 2006). Neste sentido, os modelos experimentais de cirrose hepática são indispensáveis
para a pesquisa de mecanismos fundamentais e tratamentos associados a esta doença (LI;
BENJAMIN; ALEXANDER, 2002) e a eficiência desses modelos animais é crucial para o
estudo da cirrose hepática (JEONG et al., 2001).
O modelo de cirrose hepática experimental pela administração de tioacetamida (TAA)
é amplamente utilizado para o estudo do desenvolvimento do processo patológico e para a
pesquisa de alternativas para o seu tratamento. Nesse modelo, a fibrose hepática e os nódulos
regenerativos são mais proeminentes e o padrão histológico é mais próximo ao da cirrose
humana. Além disso, a cirrose induzida por TAA leva a uma mortalidade menor em relação a
outras substâncias, por exemplo, o tetracloreto de carbono (JEONG et al., 2001; LI;
BENJAMIN; ALEXANDER, 2002).
As formas de administração mais empregadas são a oral (na água do bebedouro) e a
injeção intraperitoneal. A administração oral de TAA consiste em um método não invasivo e
fácil na indução da cirrose em grande número de animais (LI; BENJAMIN; ALEXANDER,
2002). No entanto, à medida que a cirrose se instala e compromete o fígado do animal, ele
apresenta redução na ingestão de água e alimento, diminuindo a eficiência do tóxico
(MOREIRA et al., 1995; FONTANA et al., 1996; GEORGE et al., 2001). Tal fato pode
justificar a baixa mortalidade registrada por Li, Benjamin e Alexander (2002) uma vez que a
ingestão do tóxico também diminui. Ademais, podem ocorrer falhas e variações no processo
de indução. Como não é possível controlar a dosagem de fármaco administrada por animal,
cada um receberá a quantidade de droga correspondente à água que ingere, havendo grande
variação individual nas lesões resultantes. Assim, a indução de cirrose com TAA, por via oral,
geralmente apresenta resultados heterogêneos durante o desenvolvimento do quadro
patológico, limitando a aplicação desse modelo.
Um aspecto importante quanto a utilização da TAA na indução de cirrose, é que há um
certo grau de variação na sensibilidade hepática entre os animais. Após um determinado
Tânia C. Lima Introdução -
25
período de administração da substância, o animal adquire resistência à droga (LI;
BENJAMIN; ALEXANDER, 2002). Estes autores observaram que alguns animais ganhavam
peso durante o tratamento, contrariando os resultados esperados e indicando que a
sensibilidade hepática à TAA se reduz com o tempo. Desse modo, sugerem que as doses
sejam ajustadas para cada animal de acordo com suas variações de peso, aumentando o
rendimento da indução do quadro cirrótico em maior número de animais e reduzindo
expressivamente a mortalidade dos mesmos. Nesse trabalho, apesar da cirrose instalar-se com
sucesso, apresentando as características morfológicas típicas da doença, os testes de função
hepática não apresentaram alterações significativas em relação ao grupo controle.
A adoção da injeção intraperitoneal de TAA uniformiza a quantidade de toxina que o
animal recebe, diminuindo a variabilidade observada na administração oral. Contudo, os
problemas de indução de cirrose encontrados pelos referidos autores, baixa sensibilidade a
TAA e função hepática inalterada, foram observados em experimento anterior desenvolvido
por este laboratório (GUERRA, 2006). Neste estudo, no qual a injeção intraperitoneal foi
adotada como meio de administração, embora a resposta tenha sido uniforme, registrou-se
recuperação de peso dos animais após a metade do período experimental, indicando adaptação
à droga. Li, Benjamin e Alexander (2002) resolveram este problema aumentando a dose de
TAA oferecida na água ad libitum com resultado satisfatório. No entanto, não há trabalhos
sobre a quantidade de TAA que deve ser administrada intraperitonealmente e seus efeitos
sobre as lesões hepáticas, sorologia e a mortalidade dos animais. Por isso é importante
aprimorar o modelo estudando formas de evitar a adaptação dos animais à TAA.
Assim, com vistas a buscar soluções para os problemas de adaptação, são propostas
alterações do modelo de indução de cirrose hepática utilizado até então. O presente estudo
verifica se modificações nas doses de TAA, ao longo do experimento, evitam a recuperação
de peso dos animais devido à adaptação à droga e se o processo patológico desenvolvido
corresponde a um quadro cirrótico experimentalmente aceitável em seus principais
parâmetros morfológicos e bioquímicos.
A administração parenteral tem a vantagem de assegurar que toda a dose é absorvida
(SHEA; MANSEAU, 1968) sendo mais eficaz no processo de indução da cirrose. A injeção
intraperitoneal permite controle mais rigoroso quanto à dosagem de tóxico administrada por
animal e isto proporciona maior segurança na análise dos efeitos da droga, já que todos os
animais estarão submetidos às mesmas condições.
A principal hipótese de trabalho é que é possível obter um quadro cirrótico mais
intenso, com alteração significante dos marcadores sanguíneos de lesão hepática, por meio de
Tânia C. Lima Introdução -
26
doses intraperitoneais crescentes de TAA, o que permitirá melhor avaliar o efeito de
tratamentos anticirróticos no quadro histopatológico e bioquímico plasmático.
Tânia C. Lima Objetivos -
27
2 OBJETIVOS
Tânia C. Lima Objetivos -
28
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Obter um quadro cirrótico experimental adequado para os estudos dessa doença pela
adaptação do modelo de injeção intraperitoneal.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
9 Verificar se doses crescentes de TAA evitam a adaptação dos animais à droga ao
longo do período experimental, caracterizada pelo ganho de peso;
9 Avaliar o comportamento dos animais frente às diferentes dosagens de TAA em
diferentes estágios da indução da cirrose;
9 Verificar se o aumento progressivo nas doses de TAA provoca os danos de função
hepática com as alterações da bioquímica sanguínea observadas na cirrose não-
experimental;
9 Verificar os efeitos do aumento progressivo das doses de TAA no desenvolvimento do
quadro histopatológico da cirrose.
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
29
3 REVISÃO DE LITERATURA
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
31
3 REVISÃO DE LITERATURA
Neste capítulo serão fornecidas as informações necessárias sobre o assunto abordado
neste trabalho, dando embasamento para a compreensão dos resultados que serão
apresentados e da discussão dos mesmos.
3.1 FÍGADO
Aqui serão apresentados os elementos básicos da organização hepática.
3.1.1 Anatomia
O fígado é o segundo maior órgão do corpo, superado apenas pela pele (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004). Anatomicamente, está localizado na porção superior direita da cavidade
abdominal, logo abaixo do diafragma; apresenta dois lobos principais, direito e esquerdo,
separados pelo ligamento falciforme, o qual prende-o à parede abdominal ventral e à
superfície caudal do diafragma (HERLIHY; MAEBIUS, 2002). São distinguidos outros dois
lobos acessórios, quadrado e caudado (ARIAS et al., 1994), mas há variação quanto ao
número de lobos entre as espécies animais.
Apesar do fígado dos ratos apresentar uma aparência mais lobulada do que o da
espécie humana, há uma correspondência entre os seus lobos e os setores hepáticos do fígado
humano. Ambas as espécies pertencem à Classe Mammalia e, portanto, apresentam
desenvolvimento embriológico semelhante. O fígado do rato possui um lobo direito, um lobo
esquerdo, um lobo médio dividido em porções esquerda e direita e um lobo caudado, também
denominado lobo de Spiegel (KOGURE et al., 1999).
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
32
3.1.2 Funções
A posição ocupada pelo fígado na cavidade abdominal é favorável à captura,
transformação, acúmulo e neutralização de substâncias (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Esse órgão desempenha importantes funções para o organismo, tais como: síntese de várias
substâncias (açúcares, proteínas); secreção de sais e ácidos biliares; armazenamento (lipídios,
vitaminas, glicogênio); biotransformação (substâncias tóxicas, drogas, hormônios) e
metabolismo (lipídios, proteínas, carboidratos) (BANKS, 1992). As funções do fígado ainda
incluem filtragem e armazenamento de sangue, assim como do ferro, e formação dos fatores
de coagulação (GUYTON; HALL, 2002).
No processo de biotransformação, muitos compostos sofrem a ação do fígado que
altera a sua toxicidade, reduz a sua atividade e os elimina. As propriedades detoxificantes do
fígado datam de eras pré-históricas, decorrendo do duelo planta x animal, em que as plantas
sintetizam substâncias de autodefesa e os animais se vêem obrigados a desenvolver enzimas
metabolizantes para que possam se alimentar delas (RAMAIAH; APTE; MEHENDALE,
2001). A função essencial da biotransformação é aumentar a hidrossolubilidade e a
polaridade, tornando o composto menos lipossolúvel e, portanto, incapaz de penetrar a
membrana celular. Todavia, algumas das atividades hepáticas tornam as drogas mais tóxicas
para o organismo. A exposição crônica a substâncias tóxicas geralmente resulta na alteração
da função orgânica, na diminuição do tamanho do órgão e no aumento do tecido conjuntivo
fibroso intra-hepático (BANKS, 1992).
3.1.3 Estrutura
A unidade estrutural básica do fígado é o lóbulo hepático. Em suínos essa estrutura é
bem delimitada sendo separada por tecido conjuntivo. Já em humanos, assim como em ratos,
os lóbulos estão em contato uns com os outros tornando difícil o estabelecimento de limites
entre eles. Os lóbulos hepáticos apresentam um formato geralmente hexagonal e nos vértices
de cada lóbulo são encontrados os espaços porta. Estas regiões possuem um ramo da veia
porta, um ramo da artéria hepática, um ducto biliar e vasos linfáticos, todos envoltos por uma
bainha de tecido conjuntivo. Os hepatócitos estão dispostos em placas celulares que se
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
33
anastomosam livremente e são orientadas radialmente, da periferia para o centro do lóbulo.
Essas placas são separadas por capilares, denominados sinusóides, os quais são revestidos por
uma camada descontínua de células endoteliais compondo um endotélio intensamente
fenestrado. As células endoteliais estão separadas dos hepatócitos por uma lâmina basal
descontínua e por um espaço subendotelial, o espaço de Disse. Nesse espaço estão as
microvilosidades dos hepatócitos, aumentando a superfície de contato celular. As fenestrações
do endotélio hepático permitem que fluidos percolem rapidamente dos sinusóides para o
espaço de Disse. É estabelecido um amplo contato entre o sangue e a membrana dos
hepatócitos facilitando a troca de macromoléculas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A superfície de cada hepatócito está em contato com o sinusóide, através do espaço de
Disse, e com a superfície de outros hepatócitos. A membrana plasmática de hepatócitos
adjacentes delimita o canalículo biliar, o qual possui um pequeno número de microvilos do
hepatócito em seu interior, para a secreção da bile, e constitui a primeira porção do sistema de
ductos biliares. Os canalículos biliares se anastomosam ao longo das placas de hepatócitos em
direção ao espaço porta e, assim, a bile flui na direção contrária do sangue. No espaço porta
estão os ductos biliares, formados por epitélio cubóide, que se fundem gradualmente até
formarem o ducto hepático. Este, por sua vez, conduz a bile até a vesícula biliar
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
3.1.4 Circulação Hepática
O fígado é um órgão atípico por receber sangue de duas vias diferentes. 75% do
sangue que entra no fígado provém da veia porta, que traz os nutrientes da absorção intestinal,
e 25% do suprimento sanguíneo hepático provém da artéria hepática, cuja principal função é
fornecer aos hepatócitos quantidade adequada de oxigênio para que exerçam suas funções
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; LE COUTEUR et al., 2008).
A veia porta entra no fígado e se divide repetidamente enviando ramos aos espaços
porta, os quais se ramificam em vênulas distribuidoras. Estas vênulas correm ao redor dos
lóbulos e emitem pequenos ramos que desembocam nos sinusóides. Os sinusóides, por sua
vez, convergem para o centro do lóbulo onde formam a veia centrolobular. À medida que a
veia centrolobular progride ao longo do lóbulo, ela continua a receber vários sinusóides e seu
diâmetro é aumentado gradualmente. Ao deixar o lóbulo ela funde-se com a veia sublobular,
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
34
de diâmetro maior. As veias sublobulares convergem e se fundem formando as veias
hepáticas que desembocam na veia cava caudal (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
A artéria hepática ramifica-se do mesmo modo que a veia porta desembocando
também nos sinusóides. Assim, há uma mistura de sangue arterial e venoso nesses capilares
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Todo o aporte sanguíneo do fígado chega pelo espaço porta e flui para o centro do
lóbulo. Conseqüentemente, todas as substâncias presentes nesse sangue, sejam elas tóxicas ou
não, atingem primeiro as células periportais fazendo com que haja um “comportamento”
diferente entre essas células e aquelas mais centrais (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Esse
comportamento determina o conceito do ácino hepático, uma unidade funcional do fígado
baseada na dinâmica da circulação hepática. O ácino hepático possui os vasos aferentes, ou
seja, o espaço porta, no centro e a veia centrolobular na extremidade. Dessa forma, é possível
dividir o parênquima acinar em 3 regiões: zona 1, circundando os vasos aferentes (região
periportal); zona 2 (região intermediária); zona 3, ao redor da veia centrolobular (região
pericentral). A morfologia, o tamanho, a ploidia e as funções celulares variam entre as regiões
do ácino (ARIAS et al., 1994).
3.1.5 Histologia
O lóbulo hepático é composto por um tipo de células parenquimais, os hepatócitos, e
vários tipos de células não-parenquimais: células endoteliais, células de Kupffer, células
estreladas, pit cells e células dendríticas (NAKATANI, 2004).
Os hepatócitos são células poliédricas com 20-30 µm de diâmetro, possuem um ou
dois núcleos com um ou dois nucléolos. Retículo endoplasmático tanto liso quanto rugoso é
abundante nos hepatócitos. O retículo endoplasmático rugoso forma agregados dispersos pelo
citoplasma (denominados corpos basofílicos), onde são sintetizadas diversas proteínas. O
retículo endoplasmático liso é difuso e nele acontecem processos importantes, tais como
oxidação, metilação e conjugação de compostos; esses processos são fundamentais para a
inativação ou detoxificação de substâncias. Mitocôndrias e complexos de Golgi também são
numerosos nos hepatócitos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Os hepatócitos sintetizam muitas substâncias de exportação como albumina,
fibrinogênio, α e β globulinas, lipoproteínas e colesterol (BANKS, 1992). Também
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
35
armazenam glicogênio, um depósito de glicose acionado quando a glicemia sanguínea fica
abaixo do nível adequado, que freqüentemente aparece associado ao retículo endoplasmático
liso. Assim, o hepatócito constitui-se na célula que, talvez, seja a mais versátil do organismo.
Ele desempenha funções endócrinas e exócrinas, acumula, detoxifica e transporta diversas
substâncias, além de sintetizar proteínas para si próprio e para exportação. De acordo com a
distância a que se encontram dos espaços porta, os hepatócitos apresentam características
estruturais, histoquímicas e bioquímicas distintas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
As células endoteliais são células especializadas que revestem os sinusóides
hepáticos. Elas são muito delgadas e possuem fenestrações agrupadas em placas. Cerca de 5-
10% da superfície da célula endotelial é perfurada por essas fenestras e estudos sugerem que
elas são mais amplas nos sinusóides periportais e mais numerosas nos sinusóides pericentrais.
As fenestrações permitem a passagem de uma ampla gama de substratos para dentro do
espaço de Disse. A espessura das células endoteliais hepáticas e a ausência de lâmina basal e
colágeno no espaço perissinusoidal, asseguram que barreiras de permeabilidade à difusão de
substâncias entre o sangue e os hepatócitos sejam minimizadas. Contudo, as fenestrações das
células endoteliais não permitem a passagem livre de moléculas grandes (maiores do que 15
nm) e funcionam como uma barreira entre macromoléculas ou leucócitos presentes no lúmen
sinusoidal e os hepatócitos (KNOLLE; GERKEN, 2000). A endocitose também é uma
característica notável dessas células juntamente com a função imunológica que elas
desempenham ao expressarem antígenos importantes para interação com leucócitos (LE
COUTER et al., 2005; 2008).
O fígado também possui macrófagos residentes, responsáveis pela eliminação de
eritrócitos velhos e da hemoglobina, fagocitose de bactérias e secreção de citocinas. Esses
macrófagos são chamados células de Kupffer e constituem cerca de 15% da população
celular do fígado (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). As células de Kupffer se localizam no
lúmen sinusoidal e compõem a maior população de macrófagos residentes do corpo. Junto
com as células endoteliais, elas formam o sitema reticuloendotelial (LE COUTER et al,
2008), constituindo 80-90% dos macrófagos desse sistema (KOLIOS; VALATAS;
KOUROUMALIS, 2006). Essas células localizam-se principalmente na área periportal, uma
posição estratégica para que possam fagocitar e eliminar antígenos ou patógenos que entrem
no fígado pelo sangue venoso portal (KNOLLE; GERKEN, 2000).
As células estreladas hepáticas, também chamadas de células de Ito, células
perissinusoidais ou lipócitos, situam-se dentro do espaço de Disse e envolvem as células
endoteliais com suas extensões citoplasmáticas. Em algumas espécies, há terminações
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
36
nervosas tocando esses processos citoplasmáticos. Elas são escassas, representando menos de
10% das células hepáticas, e localizam-se a distâncias regulares umas das outras (cerca de 40
µm). As células estreladas são produtoras de proteínas da matriz extracelular, importantes
para a manutenção do ambiente perissinusoidal e é sugerido que essas células possam agir no
controle do tônus microvascular, em função do seu posicionamento em torno das células
endoteliais. O armazenamento de vitamina A é a principal função das células estreladas,
embora elas também exerçam papel no controle da regeneração do fígado normal,
expressando fator de crescimento de hepatócito (HGF), entre outros (BURT, 1999;
BEDOSSA; PARADIS, 2003).
Outro tipo celular encontrado no fígado são as pit cells, linfócitos T citotóxicos
residentes que se localizam nos sinusóides e são identificados por inclusões citoplasmáticas
denominadas pits (LE COUTER et al., 2008). Em holandês, esse termo é utilizado para
designar grânulos citoplasmáticos por lembrar “caroços” em uma uva. As pit cells são células
natural killer (NK) específicas do fígado com características morfológicas, funcionais e
imunofenotípicas diferentes das células NK do sangue. A freqüência dessas células no tecido
hepático é de 1 pit cell para 10 células de Kupffer e, assim como estas, as pit cells são mais
numerosas na região periportal do que na região pericentral do lóbulo hepático (LUO et al.,
2000). As pit cells aderem às células endoteliais e às células de Kupffer e migram pela
superfície dessas células estendendo seus pseudópodos bem desenvolvidos (NAKATANI et
al., 2004).
O fígado é um órgão hematopoiético com capacidade regenerativa e que possui
microambientes imunológicos exclusivos. Sob esse aspecto, o fígado possui um grupo
residente de células apresentadoras de antígeno (APCs) profissionais, composto pelas células
endoteliais, células de Kupffer, células estreladas e células dendríticas, que confere
propriedades tolerogênicas ao órgão. Estas últimas localizam-se, estrategicamente, ao redor
das tríades portais (WATANABE et al., 2008).
3.2 REGENERAÇÃO HEPÁTICA
O fígado possui um ritmo lento de renovação celular, mas apresenta uma grande
capacidade de regeneração (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Ele responde a injúrias
teciduais (agentes químicos, biológicos ou hepatectomia parcial) pela entrada de hepatócitos
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
37
quiescentes no ciclo celular (TORRES et al., 1999) e, assim, as células progridem
sincronicamente para restaurar o volume e a função hepática (KATO, 2005). Esta propriedade
do fígado, de regular seu próprio tamanho e crescimento, surge do seu papel central em
funções metabólicas essenciais à vida (ARIAS et al., 1994).
Embora seja denominado regeneração, o processo que ocorre após a retirada de uma
porção do fígado se dá por crescimento compensatório da porção remanescente por
proliferação celular; ocorre um processo de hiperplasia das células quiescentes, visto que os
lobos seccionados não são recuperados (FAUSTO; CAMPBELL; RIEHLE, 2006;
MYRONOVYCH et al., 2008). A proporção do tamanho do fígado em relação à massa
corporal é constante. Nos casos de ressecção hepática, a resposta regenerativa do órgão é
proporcional à massa hepática removida. Em transplantes de fígado de um doador menor para
um maior, ou o contrário, há reestruturação do órgão até atingir a proporção ideal
(MICHALOPOULOS; DEFRANCES, 1997). Isto também acontece na hiperfrofia ou
hiperplasia induzidas por drogas. A retirada do estímulo leva à apoptose de hepatócitos até
que a massa normal seja restaurada (FAUSTO, 2000).
Nos casos de hepatectomia parcial ou injúria leve, há recuperação completa do
parênquima hepático, pois, diferentemente dos casos de injúria crônica com fibrose, a trama
de reticulina do fígado permanece intacta. Quando essa rede é preservada, a proliferação de
células parenquimais e não-parenquimais procede ordenadamente, mantendo a proporção
ideal entre células e matriz extracelular. Como os hepatócitos replicam primeiro, os
componentes da matriz precisam ser sintetizados para manter a arquitetura hepática normal e
prover novas estruturas vasculares (ARIAS et al., 1994).
As células estreladas hepáticas contribuem para a angiogênese tanto no
desenvolvimento do fígado como na regeneração. Após hepatectomia parcial, elas migram ao
longo das células endoteliais para estabelecer conexões vasculares com os hepatócitos e criar
novos sinusóides (FRIEDMAN, 2008a). A regeneração dos hepatócitos inicia-se nas áreas
periportais dos lóbulos, o que faz sentido, principalmente nos casos de injúrias tóxicas, pois é
a região de entrada do sangue que traz as toxinas. As outras células hepáticas iniciam a síntese
de DNA cerca de 24 horas depois dos hepatócitos, o que sugere que hepatócitos proliferantes
proporcionam estímulos mitogênicos a essas células através da produção de fatores de
crescimento e da própria cinética da proliferação celular (MICHALOPOULOS;
DEFRANCES, 1999).
Uma série de fatores, tais como fator de crescimento epidermal (EGF), fator de
crescimento transformador α (TGF-α), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
38
necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina 6 (IL-6) estão envolvidos no processo regenerativo
(MICHALOPOULOS; DEFRANCES, 1999). Entretanto, os mecanismos envolvidos no
desencadeamento desse processo requerem a ativação de múltiplas vias, as quais não operam
independentemente umas das outras. Os padrões de ativação dessas vias são extremamente
complexos, pois podem envolver modos de operação simultâneos e/ou seqüenciais, ocorrendo
em diferentes células hepáticas e em determinadas fases da regeneração hepática (FAUSTO;
CAMPBELL; RIEHLE, 2006). Esses autores propõem que o circuito essencial requerido para
a regeneração é composto por três tipos de vias: citocinas, fatores de crescimento e processos
metabólicos que relacionam a função hepática com crescimento e proliferação celular. Essas
vias exibiriam componentes intracelulares semelhantes e a perda de um gene em uma delas
não suprimiria a resposta regenerativa.
Um dado interessante acerca dos eventos regenerativos, de acordo com estudos
recentes, é que a extensão e a regulação da regeneração hepática, após hepatectomia parcial,
sofre influência do ritmo circadiano. Nesses estudos, o pico de replicação do DNA ocorreu 36
horas após a cirurgia, indiferentemente do horário em que o procedimento foi realizado,
porém, a entrada em mitose das células cujo DNA foi replicado aconteceu sempre no mesmo
período do dia (FAUSTO; CAMPBELL; RIEHLE, 2006).
Na prática cotidiana, exceto em casos de ressecção hepática para transplantes, a
hepatectomia parcial não é o estímulo regenerativo para o fígado. A regeneração ocorre
sempre que há um déficit funcional do fígado e os exemplos mais comuns são as necroses de
células e tecidos, mas sem remoção de massa hepática. A necrose hepatocitária massiva
observada na falha hepática aguda e a extensa morte celular causada por agentes tóxicos e
biológicos fazem com que hepatócitos quiescentes tornem-se proliferativos e se repliquem, a
fim de restaurar a capacidade funcional do fígado (FAUSTO, 2000). Portanto, as injúrias são
condições básicas para o desencadeamento dos processos regenerativos.
3.3 PROCESSOS PATOLÓGICOS
As doenças que acometem o fígado revestem-se de suma importância para o estudo
desse órgão vital. Neste capítulo serão abordados os processos patológicos que são de
interesse no presente trabalho.
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
39
3.3.1 Fibrose
Quando o fígado sofre uma lesão leve e transitória, as células mortas são rapidamente
substituídas pelo processo de regeneração, mas se a lesão é grave e prolongada, ocorre uma
resposta cicatrizante da qual resulta a fibrose (ALBANIS; FRIEDMAN, 2006).
A fibrose é, portanto, a resposta cicatricial do fígado à maioria das doenças hepáticas
inflamatórias crônicas, como as hepatites B e C, doenças autoimunes ou metabólicas, por
exemplo, a hemocromatose. O resultado final é o acúmulo de matriz extracelular (MEC) e a
substituição do colágeno tipo IV, de baixa densidade, pelo colágeno tipo I de alta densidade,
dentro do espaço de Disse (ALBANIS; FRIEDMAN, 2006).
No fígado sadio, a MEC compreende menos do que 3% da área hepática, onde é
restrita aos tratos portais, veias centrais e paredes dos sinusóides. A coesão mecânica e a
resistência do fígado são as principais funções da MEC, mas ela também é importante em
várias funções biológicas como proliferação, migração e diferenciação celular e expressão
gênica (BEDOSSA; PARADIS, 2003). As moléculas constituintes da MEC são importantes
nas interações entre as células e a matriz e das células entre si. A MEC retém grande
quantidade de água compondo o líquido intersticial, de fundamental importância na
integração de todo o organismo (ANDRADE, 2005).
A maior parte das proteínas da MEC é composta por colágeno. Os tipos I, III, IV e V
são os mais abundantes. O colágeno tipo IV está associado com a laminina, formando a
membrana basal descontínua ao longo dos sinusóides, uma estrutura de baixa densidade,
característica essencial para permitir a difusão entre o sangue e as células hepáticas e manter a
função diferenciada entre células vizinhas. Os outros tipos de colágeno estão confinados
principalmente no espaço porta e na veia central (BEDOSSA; PARADIS, 2003).
A deposição de MEC no espaço de Disse implica no acúmulo de colágeno do tipo I e
III e na constituição de uma estrutura de fibras colágenas que substitui o material constituinte
da membrana basal. Esse processo, associado à perda das fenestrações das células endoteliais,
é chamado “capilarização dos sinusóides” e resulta em prejuízo nas trocas entre o sangue e as
células hepáticas. No fígado fibrótico, embora a fibrose seja o evento principal, ela acontece
associada a mecanismos de distorção arquitetural, regeneração celular e redistribuição
vascular, alterando gravemente a função hepática (BEDOSSA; PARADIS, 2003; BRUCK et
al., 2007).
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
40
As células estreladas são consideradas os componentes principais da fibrose hepática
(BATALLER; BRENNER, 2005), embora possa haver também a ativação de fibroblastos
portais e perivasculares (SCHUPPAN et al., 2003) e o recrutamento de células derivadas da
medula óssea, as quais representam uma fração substancial da população fibrogênica total
(FRIEDMAN, 2008a).
Após injúria, as células estreladas tornam-se ativadas. O processo de ativação é
caracterizado pela perda das gotículas lipídicas ricas em vitamina A, produção de MEC e
expressão de α-actina de músculo liso (α-SMA) (LE COUTER et al., 2008). As células
estreladas diferenciam-se em miofibroblastos capazes de proliferação e fibrogênese, tornam-
se contráteis e, devido a sua localização, podem comprimir os sinusóides aumentando a
resistência portal (ALBANIS; FRIEDMAN, 2006).
A ativação das células estreladas consiste em duas fases: iniciação e perpetuação. A
primeira, também chamada de estágio pré-inflamatório, refere-se a alterações iniciais na
expressão gênica e no fenótipo, que tornarão as células aptas a responder às citocinas e outros
estímulos. A segunda fase resulta dos efeitos desses estímulos sobre a manutenção do
fenótipo ativado e a produção da fibrose. A fase de perpetuação compreende proliferação,
contratilidade, fibrogênese, perda de retinóides, infiltração de células inflamatórias e
degradação de MEC. Neste último caso, ocorre uma substituição da MEC normal por um
tecido cicatricial, com efeitos deletérios para a função celular (FRIEDMAN, no prelo
1
). Essa
ativação é fonte de mediadores, moléculas de matriz, proteases e seus inibidores que juntos
levam à formação da cicatriz hepática. As células estreladas, bem como as células de Kupffer
e as plaquetas, secretam TGF-β, o fator fibrogênico mais potente para as células estreladas
(ALBANIS; FRIEDMAN, 2006).
No fígado normal, a produção de MEC se dá na mesma proporção da sua degradação.
Todavia, na fibrose ocorre um desequilíbrio desse balanço. As metaloproteinases de matriz
(MMPs) são as responsáveis pela quebra da MEC. A regulação dessas proteinases é
complexa, mas essencialmente, elas são ativadas através da clivagem proteolítica e são
inibidas pela ligação a inibidores específicos, denominados inibidores teciduais de
metaloproteinase (TIMPs). A diminuição da atividade das MMPs por redução da sua
expressão gênica ou pelo aumento da atividade dos TIMPs favorece o acúmulo de MEC. As
células estreladas são as maiores fontes de TIMPs do tecido hepático (SCHUPPAN et al.,
2003).
1
FRIEDMAN, S. L. Hepatic Fibrosis – Overview. Toxicology, 10 p. 2008. Article in Press.
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41
A fibrose é considerada um processo patológico progressivo, o qual envolve múltiplos
eventos celulares e moleculares levando à deposição excessiva de MEC. Quando esse
processo é combinado com regeneração e reparo ineficazes, ocorre uma distorção da
arquitetura hepática normal resultando em cirrose (ZHENG, 2005).
3.3.2 Cirrose
A cirrose é um estágio avançado da fibrose hepática que traz todas as suas
complicações acompanhadas ainda pela amplificação da distorção arquitetural e do padrão
vascular do fígado.
Tradicionalmente, a cirrose é considerada um processo irreversível, mas há estudos
sugerindo que a regressão e até mesmo a reversão da cirrose são possíveis (KUMAR; SARIN,
2007; SATO et al., 2008).
A cirrose hepática pode resultar de lesões crônicas diversas: infecções virais, ingestão
de álcool, ataques imunológicos, acúmulo hereditário de metal, parasitoses ou danos tóxicos
(SPIRA et al., 2002). O consumo abusivo de álcool já foi considerado a principal causa da
cirrose, mas atualmente as infecções virais pelo vírus da hepatite B (ZHANG et al., 2008) e da
hepatite C (GARCÍA et al., 2002) tornaram-se a etiologia mais comum dessa doença.
Na clínica veterinária, as injúrias hepáticas crônicas são comuns em cães e podem
culminar em cirrose. As causas dessa doença abrangem inflamações do trato gastrintestinal,
uso prolongado de corticóides, anticonvulsivos e imunoterapia para Corynebacterium parvum
e também infecções virais (adenovírus canino tipo I). O armazenamento de cobre é uma
doença hepática crônica observada com relativa freqüência, especialmente em cães
“Bedlington terrier”, associada a fatores genéticos (FUENTEALBA et al., 1997). Essa doença
hepática é diferente da doença de Wilson descrita em humanos, na qual o defeito na produção
de um carreador de cobre implica na sua deposição em vários órgãos, inclusive o fígado.
Nessa raça de cão, outros órgãos não são afetados e a falha ocorre na excreção biliar do metal
(WATSON, 2004).
Independentemente da espécie e do fator etiológico, o desenvolvimento da doença
compreende uma injúria persistente seguida de regeneração, perda de função hepática
desarranjo arquitetural e fibrose (DÍAZ-GIL et al., 1999). O conteúdo de MEC é até seis
vezes maior do que no fígado normal, sendo o colágeno do tipo I a proteína predominante
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
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(GARCÍA et al., 2002). A proporção total de colágeno pode passar de 2% para até 30% do
total de proteínas do fígado (PINES et al., 1997; SPIRA et al., 2002).
A cirrose hepática é caracterizada pela formação de nódulos regenerativos de
parênquima hepático, circundados por septos fibrosos, e está associada a graves alterações
angio-arquiteturais (PINZANI; ROMBOUTS; COLAGRANDE, 2005). Histologicamente, a
cirrose é determinada por fibrose intensa constituindo septos vascularizados que ligam os
tratos portais uns com os outros e/ou com as veias centrolobulares. Há formação de nódulos
de hepatócitos regenerativos circundados por esses septos, e desprovidos de veia central,
conferindo aspecto rígido ao órgão (DAGLI; HERNANDEZ-BLAZQUEZ, 2007;
SCHUPPAN; AFDHAL, 2008). A hiperplasia de ductos biliares também é freqüentemente
observada (AL BADER et al., 2000; JEONG et al., 2001). Há um processo generalizado de
regeneração do parênquima hepático acompanhado por alterações vasculares, como conexões
artério-venosas, desvios porto-sistêmicos (circulação colateral) e capilarização sinusoidal
(KUMAR; SARIN, 2007).
A cirrose, geralmente, é assintomática e o seu desenvolvimento não é sentido ou
suspeitado até que suas complicações se apresentem. As principais conseqüências clínicas
dessa doença são o prejuízo da função celular, a hipertensão portal e o desenvolvimento de
hepatocarcinoma. Outras complicações como varizes esofágicas, ascite, peritonite bacteriana
e encefalopatia são comuns da cirrose (SCHUPPAN; AFDHAL, 2008), a qual pode levar
também ao desenvolvimento de cardiomiopatia cirrótica (LEE; GLENN; LEE, 2007;
MILANI et al., 2007) e síndrome hepatopulmonar (GAINES; FALLON, 2004; PALMA;
FALLON, 2006; FREIRE et al., 2007).
Nos casos de cirrose assintomática, o diagnóstico pode ocorrer somente na necropsia
ou a sua descoberta pode ser acidental, por alterações enzimáticas ou por uma radiografia.
Entretanto, a biópsia é considerada o procedimento padrão para o diagnóstico da cirrose,
sendo importante na determinação da causa da doença, se esta é desconhecida, ou na sua
confirmação, se os sintomas não são específicos (SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
A compensação da doença hepática implica na preservação da função hepática. Uma
vez que a descompensação ocorra, o transplante de fígado faz-se necessário. As taxas anuais
de descompensação é 4% para a hepatite C e 10% para a hepatite B. A incidência de
hepatocarcinoma é 2-7% ao ano. A descompensação, em qualquer tipo de doença hepática,
leva a uma mortalidade de 85% dos pacientes em 5 anos, caso o transplante não seja realizado
(SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
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3.3.3 Hepatocarcinoma
A carcinogênese, de modo geral, é iniciada por agentes (químicos, físicos, biológicos
ou genéticos) que alteram a estrutura do DNA. Dentre essas alterações são observadas a
formação de adutos (união direta de duas moléculas) de DNA, oxidação das bases e erros no
reparo do DNA que levam a mutações. O desenvolvimento do hepatocarcinoma compreende
3 fases: iniciação, promoção e progressão (PITOT, 2001).
A fase de iniciação é caracterizada por uma alteração celular irreversível e permanente
em células isoladas. A eficiência dessa fase está relacionada com a síntese replicativa de DNA
e a divisão celular, ambas necessárias para a fixação e conseqüente irreversibilidade do estado
iniciado da célula (PITOT; DRAGAN, 1991; PITOT, 2001).
A fase de promoção resulta da replicação clonal de células iniciadas na presença do
agente promotor de origem endógena ou exógena. A principal característica desse estágio é a
sua reversibilidade, a qual pode ser conferida por morte celular, apoptose ou remodelamento
da lesão. A promoção, ao contrário da iniciação, pode ser modulada por fatores ambientais,
como a exposição ao agente promotor, idade do indivíduo, composição e quantidade da dieta
alimentar. Assim, no caso da carcinogênese experimental, a fase de promoção pode ser
regulada pela administração do agente promotor, cuja capacidade iniciante originará um
número finito de células iniciadas. Entretanto, nas causas “naturais” ou nas doenças crônicas,
a presença contínua do agente promotor aumenta o risco de desenvolvimento do câncer, em
função do aumento da taxa de proliferação celular, acentuando a probabilidade de propagação
de um erro genético (PITOT; DRAGAN, 1991; PITOT, 2001).
A fase de progressão é caracterizada pelo desenvolvimento de neoplasias malignas
aneuplóides irreversíveis. As alterações genômicas desse estágio são acompanhadas por
aumentada taxa de crescimento, invasividade, metástase e alterações bioquímicas (PITOT;
DRAGAN, 1991).
O carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos tumores mais comuns no mundo todo,
ocupando a terceira posição entre as causas de mortalidade relacionadas ao câncer. O risco de
desenvolvimento do CHC é aumentado nas doenças hepáticas crônicas, principalmente se a
cirrose já estiver estabelecida (LOWES et al., 1999). A cirrose é um grande fator de risco para
a progressão do CHC, juntamente com as hepatites virais, hereditariedade, diabetes do tipo 2
entre outros (NEWELL et al., 2008; SCHUPPAN; AFDHAL, 2008). A cirrose e as hepatites
crônicas são consideradas pré-neoplasias no CHC (LOW, 2004).
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
44
Algumas lesões são representativas de condições pré-neoplásicas no fígado. Elas
incluem displasia de célula hepática, dividida em alteração de grandes células (caracterizada
por ampliação nuclear e citoplasmática, pleomorfismo nuclear com hipercromasia, nucléolo
proeminente e multinucleação) e alteração de pequenas células (células pequenas com
pleomorfismo nuclear e proporção núcleo/citoplasma aumentada), hiperplasia adenomatóide,
focos de hepatócitos alterados e nódulos de hepatócitos alterados (SU; BANNASCH, 2003;
PARK; RONCALLI, 2006). Estes últimos diferem quanto à área ocupada pelas células
alteradas e o formato esférico, com nítida delimitação do parênquima adjacente, observado
nos nódulos (SILVA-OLIVEIRA, 2007). Na fase de promoção ocorre um aumento na
proliferação focal de hepatócitos iniciados, os chamados focos e nódulos de hepatócitos
alterados, os quais são precursores potenciais para o desenvolvimento de neoplasias, sendo
assim considerados lesões pré-neoplásicas (DRAGAN; PITOT, 1992). A persistência dessas
lesões implica no desenvolvimento do CHC.
As lesões pré-neoplásicas são marcadas pela alteração na expressão de algumas
enzimas que podem ser utilizadas na sua identificação. As células iniciadas apresentam
aumento na expressão de glutationa S-transferase forma placental (GST-P) e γ-
glutamiltranspeptidase (GGT) e diminuição na expressão de glicose-6-fosfatase (DRAGAN;
PITOT, 1992). A GST-P é considerada um marcador seguro para células pré-neoplásicas, pois
apresenta baixa atividade em tecidos normais ou em regeneração (SATOH et al., 1985).
Nesses casos, a concentração de glutationas S-transferases (GSTs) é suficiente para promover
a proteção da célula contra substâncias nocivas provenientes dos alimentos ou subprodutos do
próprio metabolismo. Nos mamíferos, a GST-P contribui para a defesa contra o estresse
oxidativo (SHEEHAN et al., 2001).
As GSTs pertencem a um grupo de enzimas metabolizantes de xenobióticos
(SALINAS; WONG, 1999). O processo de desintoxicação enzimática que envolve as GSTs
apresenta 3 fases principais. A fase I ocorre com a difusão do xenobiótico para dentro da
célula onde se torna substrato para a ação de enzimas do sistema citocromo P-450. Na fase II,
o produto da fase I, de natureza hidrofóbica, é conjugado a um tripeptídeo, a glutationa, numa
reação catalisada pelas GSTs. Na fase III, o conjugado glutationa-xenobiótico, um composto
hidrofílico, é bombeado ativamente para fora da célula. A adição da glutationa impede que o
composto seja difundido para dentro da célula novamente (SHEEHAN et al., 2001).
Os hepatócitos não são as únicas células a sofrerem alterações neoplásicas. Especial
atenção tem sido dada à displasia do epitélio biliar, processo que caracteriza o
colangiocarcinoma, considerado o segundo tumor hepático mais comum (ZEN et al., 2006). A
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
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taxa de sobrevivência dos pacientes com diagnóstico dessa doença não ultrapassa 20%, em 5
anos (YEH et al., 2004). O colangiocarcinoma pode coexistir com o carcinoma hepatocelular
no mesmo fígado, assim como no mesmo tumor e o seu sinal clínico mais evidente é a
icterícia (RIO TINTO et al., 2003).
3.4 ANÁLISE BIOQUÍMICA DA FUNÇÃO HEPÁTICA
A análise bioquímica da função hepática é um método complementar, já que a biópsia
hepática é indicada apenas quando se quer confirmar um diagnóstico quase certo da cirrose. A
cautela em se indicar uma biópsia se dá em virtude da invasividade do procedimento, dos
riscos de complicações cirúrgicas e de erros na colheita do material (material insuficiente ou
amostra não representativa) (MANNING; AFDHAL, 2008). Os obstáculos acerca da biópsia
incluem dor, sangramento, pneumotórax, punção da vesícula biliar ou mesmo de outros
órgãos (CROSS; ANTONIADES; HARRISON, 2008).
A verificação dos níveis plasmáticos de alguns compostos é um método útil para o
reconhecimento das doenças que afetam a funcionalidade do fígado. Como já foi dito
anteriormente, a doença hepática pode ser assintomática ou apresentar sintomas inespecíficos,
como anorexia, perda de peso e fraqueza (LIDA et al., 2005). Dessa forma, os níveis
plasmáticos de algumas substâncias marcadoras de lesão hepática auxiliam no diagnóstico
diferencial direcionando o exame clínico. Os marcadores tradicionalmente utilizados não são
todos específicos da função hepática e alguns deles são empregados como ratificação de um
marcador inespecífico.
A aspartato aminotransferase (AST) é uma enzima que cataboliza aminoácidos
permitindo que entrem no ciclo do ácido cítrico. Essa enzima faz a transaminação do grupo
amino do aspartato para o α-cetoglutarato, formando oxalato. Ela está relacionada com a
integridade dos hepatócitos, porém não é específica do fígado, podendo ser encontrada no
músculo cardíaco, rins, cérebro e células vermelhas do sangue (GIANNINI; TESTA;
SAVARINO, 2005).
A alanina aminotransferase (ALT) catalisa a interconversão do grupamento amino da
alanina para o α-cetoglutarato formando piruvato e, portanto, desempenha importante função
na gliconeogênese e no metabolismo de aminoácidos. A atividade da ALT é observada,
principalmente, no fígado. Também pode ser encontrada em outros locais como músculos,
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
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coração, rins, cérebro e tecido adiposo, mas em fração muito menor (SCHINDHELM et al.,
2006) de tal forma que é considerada um marcador hepato-específico (BANKS, 1992). Por ser
uma enzima citosólica o aumento da sua concentração indica permeabilidade da membrana e,
portanto, morte celular (MURIEL; ESCOBAR, 2003). Assim, o aumento plasmático
concomitante de ALT e de AST confirma a origem hepática da lesão. Apesar da ALT refletir
injúria hepática, a AST tem uma correlação mais forte com a presença de fibrose
(GRIGORESCU, 2006).
Atualmente, tem-se utilizado a proporção AST/ALT como um marcador de maior
sensibilidade e especificidade, em humanos. Pacientes normais apresentam valor de
aproximadamente 0,8 e este valor aumenta em estágio avançado de fibrose (MANNING;
AFDHAL, 2008). Quando essa proporção é maior ou igual a 1, a cirrose pode ser
caracterizada (CHEN et al., 2008). Uma proporção maior que 1,16 apresentou 81% de
sensibilidade e 55% de especificidade em identificar pacientes cirróticos que morreram dentro
de um ano (GRIGORESCU, 2006).
A albumina (ALB) é uma proteína sintetizada no fígado e corresponde à quase metade
da proteína total. A outra metade é composta pelas globulinas. A ALB contribui para o
gradiente de concentração entre o sangue e o fluido extracelular, sendo responsável por cerca
de 70% da pressão osmótica vascular, além de captar e transportar algumas substâncias, por
exemplo, a bilirrubina livre (BANKS, 1992). Essa proteína encontra-se diminuída na cirrose
avançada devido à diminuição da produção hepática (SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
A fosfatase alcalina (ALKP) é uma enzima que transporta metabólitos através das
membranas celulares. Assim como a AST, a ALKP também não é específica do fígado,
podendo ser observada nos ossos, nos intestinos, nos rins, na placenta e nos leucócitos. No
fígado, ela está presente na superfície do epitélio dos ductos biliares e na membrana dos
hepatócitos. A proliferação desses ductos aumenta a síntese e a liberação dessa enzima. Assim
sendo, níveis aumentados de ALKP estão correlacionados ao grau de integridade do tecido
hepático. A meia-vida da ALKP é de 1 semana e isso explica a sua lenta diminuição mesmo
na fase de resolução da cirrose (GIANNINI; TESTA; SAVARINO, 2005).
Outra enzima marcadora de colestase é a gama-glutamiltranspeptidase (GGT). Essa
enzima catalisa o metabolismo da glutationa e dos compostos conjugados a ela (ARIAS et al.,
1994). A GGT faz a transferência do grupo γ-glutamil dos peptídeos para outros aminoácidos.
Ela está presente nos hepatócitos e células do epitélio biliar, mas também é encontrada nos
túbulos renais, pâncreas e intestino. Entretanto, sua utilização como teste de função hepática é
justificada por sua alta sensibilidade em doenças do fígado. A GGT é um marcador de fibrose
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progressiva usado para identificar estágios mais avançados da doença, pois reflete
anormalidades da estrutura e da função hepática. É uma indicadora de colestase mais
específica do que a ALKP e a sua alta concentração plasmática é característica da cirrose. O
mecanismo de alteração da GGT é semelhante ao da ALKP, ou seja, níveis plasmáticos
aumentados de ambas as enzimas indicam origem hepatobiliar da lesão (GIANNINI; TESTA;
SAVARINO, 2005; MANNING; AFDHAL, 2008; SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
A bilirrubina é um produto formado a partir de eritrócitos velhos que são removidos da
circulação por fagocitose. A hemoglobina é quebrada em porção globina e porção heme e seus
componentes são reciclados. Quando esses componentes são separados, a globina é
hidrolisada até os aminoácidos, os quais voltarão à circulação. O ferro, localizado no interior
do grupo heme, é liberado e volta aos estoques teciduais. O resíduo do grupo heme,
denominado biliverdina, é transportado para o fígado onde é reduzido à bilirrubina. A
bilirrubina, inicialmente, é insolúvel (bilirrubina não-conjugada), mas torna-se solúvel pelo
processo de biotransformação, realizado pela enzima glicuronil transferase, ao ser conjugada a
um glicuronato. Esta forma da bilirrubina pode, então, entrar no hepatócito e a sua maior parte
é secretada na bile. Uma pequena parte retorna à circulação, sendo excretada pelo rim na
forma de urobilinogênio (BANKS, 1992; BANCROFT; GAMBLE, 2004). Em condições
patológicas, a concentração plasmática de bilirrubina, tanto livre quanto conjugada, aumenta
caracterizando a icterícia. As causas desse aumento podem ser decorrentes de aumento na
destruição de eritrócitos, obstrução dos ductos biliares ou lesão de hepatócitos, de modo que
mesmo as quantidades habituais de bilirrubina não são excretadas na bile (GUYTON; HALL,
2002). O teste da bilirrubina total (TBIL) compreende a fração conjugada e não-conjugada. É
um teste específico de desordem hepática, visto que seu metabolismo é exclusivamente no
fígado.
O teste da proteína total (TP) avalia a concentração plasmática de proteínas (albumina
+ globulinas). A cirrose é uma condição patológica que provoca a redução dos níveis
plasmáticos de proteínas. A incapacidade do hepatócito de sintetizar as proteínas em
quantidade suficiente resulta na diminuição da pressão osmótica do plasma e formação de
edema associado à afecção (GUYTON; HALL, 2002).
A globulina (GLOB), juntamente com a ALB, compõe a TP plasmática. A fração das
GLOBs compreende as α, β e γ-globulinas. O grupo das γ-globulinas é composto pelas
imunoglobulinas e são sintetizadas nos órgãos do sistema reticuloendotelial. As demais são
sintetizadas pelo fígado e, assim como a ALB, desempenham funções de transporte de
substâncias (BANKS, 1992).
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
48
3.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE CIRROSE HEPÁTICA
Os diferentes agentes etiológicos da cirrose agem sob variáveis de tempo, dosagens e
condições ambientais que, experimentalmente, devem ser compensadas a fim de se otimizar
os estudos em laboratório. Os modelos experimentais procuram, de maneira rápida e eficiente,
reproduzir as conseqüências do quadro patológico encontrado na casuística clínica.
Neste capítulo serão apresentadas as substâncias cuja utilização é mais comum na
indução experimental da cirrose: dimetilnitrosamina (DMN), tetracloreto de carbono (CCl
4
) e
tioacetamida (TAA). Alguns trabalhos empregam a ligação de ductos biliares, porém essa
técnica não é muito utilizada, em virtude da invasividade do procedimento e do baixo
rendimento do quadro cirrótico obtido, razão pela qual não será abordada nesta revisão.
3.5.1 Dimetilnitrosamina
O termo “nitrosamina” se refere a vários compostos de diferentes pesos moleculares,
cuja característica estrutural comum é a presença do grupo funcional N–NO. No grupo das
nitrosaminas são encontradas a dimetilnitrosamina (DMN) e a dietilnitrosamina (DEN)
(SANCHES FILHO et al., 2003). As fórmulas estruturais dos compostos estão representadas
no quadro 1 abaixo:
DMN DEN
Quadro 1 – Fórmulas estruturais de compostos do grupo Nitrosamina
H
3
C
NNO
H
3
C
CH
3
CH
2
NNO
CH
3
CH
2
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
49
A DEN é a substância utilizada no modelo do hepatócito resistente para o
desenvolvimento de hepatocarcinogênese experimental (TOLEDO et al., 2003; MORENO et
al., 2007; SILVA-OLIVEIRA, 2007).
A DMN já foi o tóxico de eleição na indução de cirrose experimental. O quadro
cirrótico é bastante semelhante ao do ser humano, com forte correlação entre o quadro
histológico e o funcional. Entretanto, a substância é muito tóxica e pequenas doses podem
causar necrose hepática massiva e morte em várias espécies, pois pode ser absorvida pela
pele, mucosa, intestino e pulmão (MADDEN et al., 1970).
A DMN é uma hepatotoxina, carcinogênica e mutagênica, muito potente. A toxicidade
produzida por esta droga é mediada por seus metabólitos reativos e não pelo composto inicial.
Seu composto ativo inibe a síntese protéica e altera a morfologia ribossomal, resultando em
morte das células. O alvo da DMN é primariamente o fígado, o qual contém as enzimas
necessárias para a sua ativação metabólica (GEORGE et al., 2001).
A DMN sofre a ação do complexo enzimático citocromo P-450 e sua ativação e
degradação produzem formaldeído, metanol e o intermediário alquilante que reage com
ácidos nucléicos e proteínas para formar macromoléculas metiladas (GEORGE et al., 2001).
Embora esses autores tenham recomendado o modelo para o estudo da cirrose hepática
focando a rápida deposição de colágeno, a maioria dos trabalhos se referem à DMN como um
agente causador de fibrose. Esse fato foi evidenciado por trabalho desenvolvido em nosso
laboratório (PEREIRA, 2003). Nesse experimento, o autor afirma que, apesar da função
hepática bastante alterada, a mortalidade é alta e o quadro fibrótico é pouco intenso.
3.5.2 Tetracloreto de carbono
O tetracloreto de carbono (CCl
4
) é uma substância amplamente utilizada na indução de
cirrose ou fibrose hepática. A hepatotoxicidade dessa droga se deve aos radicais livres,
triclorometil (–CCl
3
) e triclorometilperoxil (–OOCCl
3
), formados durante sua metabolização,
a qual é realizada pelas enzimas do sistema citocromo P-450. O segundo radical reage
rapidamente com o O
2
formando um radical extremamente lesivo (CREMONESE et al., 2001;
SIMILE et al., 2001).
Em literatura mais remota, afirmou-se que a cirrose induzida pelo CCl
4
é diferente da
doença desenvolvida por humanos. Algumas características que compõem o quadro cirrótico,
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
50
como atipia celular e as alterações associadas ao desarranjo arquitetural, por exemplo, os
níveis sorológicos das proteínas totais, não foram observadas (QUINN; HIGGINSON, 1965;
OLSSON; REHNSTRÖM, 1966). O CCl
4
causa peroxidação lipídica na membrana celular e
também diminuição das junções intercomunicantes. Supõe-se que essa perda de comunicação
celular pode exercer um efeito protetor ao hepatócito ao desconectar células prejudicadas
(NAKATA et al., 1996).
Outros estudos revelam que a cirrose induzida por CCl
4
é adequada quanto à
morfologia e fisiopatologia (ZIM et al., 2002; NATARAJAN et al., 2006). São relatadas
alterações gordurosas, fibrose centrolobular e alterações bioquímicas. Todavia, são
observados septos fibrosos finos e pouca proliferação ductular com rápida regressão das
lesões, o que dificulta o estudo de tratamentos anticirróticos a longo prazo nesse modelo
(JEONG et al., 2001). A alta mortalidade (até 50%) e a diminuição dos estoques de glicogênio
hepático são outras desvantagens apresentadas por esse método (CREMONESE et al., 2001;
LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002; MURIEL; ESCOBAR, 2003). Também estão
associadas a baixa reprodutibilidade e homogeneidade do quadro cirrótico e pouca
semelhança com a cirrose clínica, resultando em distorção arquitetural ampla, porém não tão
proeminente (LALEMAN et al., 2006).
3.5.3 Tioacetamida
Até 1943, a tioacetamida (TAA) era utilizada como fungicida em lavouras de laranja,
quando foi encontrada contaminando o suco e considerada, desde então, um risco à saúde
pública. Em 1948, descobriu-se que a administração crônica da substância levava à cirrose
hepática e hepatocarcinomas (MUÑOS TORRES et al., 1991; DAVID et al., 2002). Hoje em
dia, a TAA é utilizada nas indústrias do couro, papel e têxtil, e empregada como acelerador na
vulcanização de borracha e estabilizador de combustíveis (WANG et al., 2000).
A TAA requer ativação metabólica para que seu efeito seja tóxico. Os produtos
resultantes da sua biotransformação são S-óxido de tioacetamida e S-dióxido de tioacetamida
(Quadro 2). O efeito citotóxico dessa droga é atribuído ao último metabólito, um composto
instável altamente reativo que se liga covalentemente às macromoléculas teciduais
(CHILAKAPATI et al., 2005).
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
51
Quadro 2 - Esquema ilustrativo da metabolização da tioacetamida
A TAA é ativada pela ação catalítica do complexo microssomal citocromo P-450,
localizado no retículo endoplasmático liso. O sistema enzimático citocromo P-450
compreende várias isoenzimas das quais a CYP2E1 (Cytochrome P4502E1) parece ser a que
está mais envolvida na metabolização da TAA (WANG et al., 2000). Esta isoenzima é a
principal família de citocromos P-450 do fígado dos mamíferos, desempenhando papel crucial
no metabolismo, toxicidade e carcinogênese de xenobióticos (RAMAIAH; APTE;
MEHENDALE, 2001; CARO; CEDERAUM, 2005), além de metabolizar vários outros
compostos de baixo peso molecular (CHILAKAPATI et al., 2005).
A TAA reduz a atividade antioxidante e acentua a peroxidação lipídica no fígado,
estabelecendo uma condição de estresse oxidativo que leva à necrose celular (TÚNEZ et al.,
2005). Os radicais livres gerados por esta via oxidativa, além de causarem peroxidação
lipídica nas membranas, provocam aumentos no cálcio citosólico, inibição da glutationa e
redução dos grupos tiol (–SH), afetando severamente as células da região acinar pericentral e
levando à morte celular. A concentração intracelular de glutationa e os níveis de tióis atuam
sobre o DNA, modulando a síntese e protegendo-o do dano oxidativo (SANZ et al., 1998;
ZARAGOZA et al., 2000). A toxicidade da TAA leva à destruição do parênquima com
rompimento de endomembranas e perda da matriz citoplasmática (MUÑOZ TORRES et al.,
1991).
Os compostos derivados da TAA, aparentemente, são responsáveis pela inativação de
enzimas e de proteínas estruturais. A necrose provocada por esta droga está relacionada a
alterações na concentração citoplasmática do cálcio, o que afeta principalmente mitocôndrias
TAA S-óxido-TAA
S O
H
3
C C
NH
2
S
H
3
C C
NH
2
S O
H
3
C C
NH
2
O
S
H
3
C C O
NH
2
Citocromo P-450
Citocromo
P
-450
S-dióxido-TAA
S-óxido-TAA
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
52
e leva à inibição da respiração celular. A ação da TAA sobre o metabolismo dos ácidos
nucléicos é evidenciada por nucléolos aumentados e pela inibição no transporte de RNA do
núcleo para o citoplasma (FONTANA et al., 1996). Além disso, a TAA altera o ciclo da uréia,
o perfil de aminoácidos circulantes, o metabolismo lipídico e lipoprotéico e a síntese de
ácidos graxos (DAVID et al., 2002).
A cirrose induzida por TAA em ratos leva a uma mortalidade menor (35%) em relação
ao CCl
4
(50%) (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002). A fibrose hepática e os nódulos
regenerativos são mais proeminentes e o padrão histológico é mais próximo ao da cirrose
humana (LALEMAN et al., 2006). Apesar da fibrose induzida com TAA se desenvolver mais
lentamente do que com CCl
4
, o parênquima se torna completamente dividido por septos
fibrosos bem demarcados (SHEA; MANSEAU, 1967). A lenta deposição de colágeno tem
sido apontada como uma desvantagem no uso da TAA em relação ao CCl
4
, com a cirrose, em
geral, se estabelecendo a partir da 10ª semana de tratamento (AL BADER et al., 2000; SPIRA
et al., 2002). Contudo, o desenvolvimento tardio da doença é visto como mais uma das
características da TAA em reproduzir adequadamente o estado crônico da doença hepática
(MASUMI et al., 1999). Geralmente, são necessários anos de exposição ao agente para que a
cirrose se desenvolva no Homem.
A administração crônica dessa hepatotoxina provoca perda de peso, necrose celular,
regeneração de hepatócitos, fibrose progressiva levando a cirrose e proliferação de ductos
biliares (MOREIRA et al., 1995; FONTANA et al., 1996; AL BADER et al., 2000; JEONG et
al., 2001).
A TAA pode ser administrada de diferentes formas: oral (na água ou na ração
ingerida), por intubação intragástrica, ou por injeções subcutâneas ou intraperitoneais
(FONTANA et al., 1996). A administração de TAA através da água do bebedouro consiste em
um método não invasivo, satisfatório e fácil na indução da cirrose em grande número de
animais (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002), mas, à medida que a cirrose instala-se e
compromete o fígado do animal, ele apresenta perda de apetite e redução na ingestão da água
com o fármaco (até 50% menos do que os animais controle), diminuindo a eficiência do
tóxico (MOREIRA et al., 1995; FONTANA et al., 1996; GEORGE et al., 2001). Ademais,
podem ocorrer falhas e variações no processo de indução, visto que não é possível controlar a
dosagem de tóxico que cada animal ingere. Assim, dependendo da quantidade de água
consumida, haverá grande variação individual nas lesões resultantes. Além disso, a
administração de TAA por via intragástrica, assim como ocorre com outras hepatotoxinas,
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
53
geralmente incorre em resultados heterogêneos durante o desenvolvimento do quadro
patológico, limitando a aplicação desses modelos.
Há um certo grau de variação na sensibilidade hepática entre os animais e, após um
determinado período de administração da substância, o animal adquire resistência à droga (LI;
BENJAMIN; ALEXANDER, 2002). Dois fatores contribuem para esta variação de resposta:
o envelhecimento do animal e a redução do citocromo P-450, devida ao dano celular. As
diferenças na atividade do sistema enzimático são dependentes da idade, apresentando
aumento dos 2 aos 12 meses, nos ratos, e diminuindo na senescência (ZARAGOZA et al.,
2000). Estudo com ratos recém desmamados sugere que a resposta menos severa nos filhotes,
em relação aos adultos, se deva à menor expressão das enzimas envolvidas na metabolização
da TAA (SANZ et al., 1998).
Durante tratamento com TAA, por via oral, pesquisadores observaram que alguns
animais ganham peso, contrariando os resultados esperados. Nesse experimento, apesar da
cirrose instalar-se com sucesso, apresentando as características morfológicas típicas da
doença, os testes de função hepática não apresentaram alterações significativas em relação aos
animais controle. A sensibilidade hepática à TAA se reduz com o tempo e, assim, é sugerido
que as doses sejam ajustadas de acordo com as flutuações de peso dos animais. Esse método
resultaria em aumento no rendimento da indução do quadro cirrótico e redução expressiva da
mortalidade. (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002).
3.6 AVALIAÇÃO DA EMOCIONALIDADE
A cirrose constitui-se em uma doença crônica que acarreta importantes transtornos na
esfera psicológica do paciente. Os estados mentais, as interações sociais e os comportamentos
podem ser alterados até mesmo pela simples consciência de uma enfermidade, por exemplo,
uma infecção viral, independentemente da função hepática. De fato, é bem conhecido que
diversos quadros de infecção e inflamação possam exacerbar distúrbios psicológicos pré-
existentes, principalmente após a revelação de um diagnóstico de uma doença crônica
incurável (MARCHESINI et al., 2001). Isto acarreta ao paciente baixa auto-estima e piora
significativa na qualidade de vida, principalmente àqueles que apresentam transtornos
afetivos, como a depressão. Além disso, o estado psicológico tem a capacidade de afetar,
consideravelmente, não só o desenvolvimento das doenças, mas também a adesão e a resposta
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
54
às terapias e tratamentos farmacológicos. Dentre os pacientes com cirrose em estágio
avançado à espera de transplante, a mortalidade é maior entre os depressivos, independente da
doença ou de suas complicações (BIANCHI et al., 2005).
Pessoas portadoras de doenças hepáticas crônicas sofrem de fadiga, ansiedade,
depressão e outros problemas emocionais que afetam a qualidade de vida e o bem estar. Essa
condição é observada mais marcadamente no caso de falha hepática, embora os portadores de
cirrose compensada também sejam acometidos. Dentre os transtornos psicológicos
classificados no DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth
Edition) e que estão mais associados aos distúrbios hepáticos, a depressão é o mais comum
(BIANCHI et al., 2005). A infecção por hepatites e a doença hepática alcoólica têm sua
prevalência na 3ª e 4ª década da vida, período considerado mais produtivo na vida das
pessoas. Pacientes com doença hepática inicial não tem prejuízo da qualidade de vida,
independente da causa da doença. Entre os pacientes com cirrose, aqueles com colestase têm
menor prejuízo da qualidade de vida do que aqueles com doença hepatocelular. Esse prejuízo
aumenta com a severidade da doença (YOUNOSSI et al., 2001).
Em animais, a avaliação comportamental tem sido realizada em experimentos de
administração de agentes alergênicos (PORTELA et al., 2007), tumorais (PALERMO-NETO
et al., 2008), tóxicos (RIGHI; PALERMO-NETO, 2003), entre outros, com excelente
validação dos testes empregados. No que diz respeito à cirrose, são utilizados testes
comportamentais para avaliação dos estados emocionais associados a encefalopatia hepática,
uma decorrência da cirrose (WESIERSKA et al., 2006; MÉNDEZ et al., 2008). No entanto,
ainda são poucos os estudos que tratam do aspecto comportamental da doença hepática,
principalmente no decorrer do seu desenvolvimento e agravamento, e que demonstrem seu
caráter ansiogênico e depressor para os animais.
Existem diversos modelos animais elaborados para a avaliação dos estados emocionais
decorrentes de um estímulo estressor. Um dos métodos de avaliação do estado emocional dos
animais é o teste do labirinto em cruz elevado (LCE), que foi desenvolvido a partir do
trabalho de Montgomery (1955) e, tem sido muito utilizado com ratos (PELLOW; FILE,
1985). Este aparelho é constituído por dois braços abertos (desprotegidos), em posição
perpendicular a dois braços fechados (protegidos). Segundo Pellow et al. (1985), os estados
emocionais decorrentes de estimulações aversivas ou estressantes podem ser avaliados pelos
locais de maior permanência dos ratos no LCE, ou seja, a maior permanência nos braços
abertos indicaria níveis reduzidos de estresse/ansiedade dos animais, ao passo que a
Tânia C. Lima Revisão de Literatura -
55
permanência maior nos braços fechados indicaria o oposto, isto é, animais mais estressados ou
ansiosos.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
Tânia C. Lima Material e Métodos -
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4 MATERIAL E MÉTODOS
O material e os procedimentos empregados na realização deste trabalho seguem
descritos abaixo.
4.1 ANIMAIS
Foram utilizadas 112 fêmeas adultas de ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus) com
2 meses de idade e cerca de 200 g cada, provenientes do Biotério Central do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo
(FMVZ/USP). Elas foram identificadas e separadas nas gaiolas de acordo com seu peso, de
modo que não houvesse variação maior do que 10 g entre os indivíduos da mesma gaiola.
Esses animais permaneceram em gaiolas padrão de polipropileno (41 x 34 x 16 cm), forradas
com serragem (maravalha) e tampadas por grade metálica, em número de 5 ratas por gaiola.
Elas permaneceram em biotério ventilado, com umidade e temperatura controladas (65-70% e
22-26ºC respectivamente) e água e ração fornecidas em regime ad libitum. A iluminação
artificial determina um ciclo claro-escuro de 12 horas, iniciando-se a fase clara às 6:00 horas.
O protocolo experimental nº 892/2006 foi aprovado pela Comissão de Bioética da
FMVZ/USP.
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
As gaiolas foram distribuídas em 5 grupos. A cirrose hepática foi induzida nos animais
de 4 desses grupos, com tioacetamida (Sigma-Aldrich, Alemanha), e 1 constituiu o grupo de
ratas controle, recebendo solução salina 0,9%.
A TAA (solução a 4% diluída em salina 0,9%) foi administrada por via
intraperitoneal, 3 vezes por semana, por 14 semanas, à proporção inicial de 200 mg/kg, numa
dose de 40 mg/mL e 1 mL/kg.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
58
A denominação dos grupos se deu da seguinte maneira:
Grupo A (20 animais) – 200 mg TAA/kg por 14 semanas;
Grupo B (20 animais) – 200 mg TAA/kg nas primeiras 7 semanas (48 dias). A partir
deste período a dose foi aumentada em 20%, passando a 240 mg TAA/kg;
Grupo C (35 animais) – as 14 semanas de indução foram divididas em intervalos de
24 dias com acréscimo de 10% na dosagem ao final de cada intervalo (Quadro 3):
INTERVALO 1 (1 – 24 dias): 200 mg/kg
INTERVALO 2 (25 – 48 dias): aumento 10% (220 mg TAA/kg)
INTERVALO 3 (49 – 72 dias): aumento 10% (242 mg TAA/kg)
INTERVALO 4 (73 – 96 dias): aumento 10% (266,2 mg TAA/kg)
Quadro 3 - Protocolo de indução do grupo C
Grupo D (25 animais) – a indução seguiu o mesmo esquema da divisão em intervalos
adotada no grupo C, porém, as doses de TAA foram aumentadas em 15% ao final de
cada intervalo (Quadro 4):
INTERVALO 1 (1 – 24 dias): 200 mg/kg
INTERVALO 2 (25 – 48 dias): aumento 15% (230 mg TAA/kg)
INTERVALO 3 (49 – 72 dias): aumento 15% (264,5 mg TAA/kg)
INTERVALO 4 (73 – 96 dias): aumento 15% (304,1 mg TAA/kg)
Quadro 4 - Protocolo de indução do grupo D
Grupo E (12 animais) – 1 mL de solução salina 0,9% por 14 semanas (grupo
controle).
Durante a fase de indução da cirrose, os animais foram pesados 2 vezes por semana e
suas características físicas foram observadas.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
59
4.2.1 Colheita e Processamento de Amostras Sanguíneas
O sangue de todos os animais foi colhido no início do experimento para se avaliar o
estado inicial do fígado e, desta maneira, cada animal foi o controle dele próprio. Nos grupos
B, C e D o procedimento foi repetido antes de cada aumento de dose para avaliação dos
efeitos de cada dosagem sobre os marcadores bioquímicos. O sangue de todos os animais foi
colhido novamente no momento da eutanásia.
A colheita das amostras sanguíneas foi efetuada por punção cardíaca. Para a realização
da mesma, procedeu-se a anestesia dos animais com anestésico inalatório Isoflurano
(Cristália, Brasil), em oxigênio 100%, através de um aparelho de ventilação mecânica
(Takaoka 640, Brasil), com auxílio de máscara de tamanho apropriado. A entrada do animal
em anestesia foi verificada pelas freqüências cardíaca e respiratória, pelo grau de relaxamento
muscular e pelos reflexos digitais.
O volume sanguíneo colhido foi de, no máximo, 1 mL utilizando-se agulha 30 x 0,7
mm e seringa de 3 mL, ambas heparinizadas. As amostras permaneceram sobre gelo picado
até o término dos procedimentos quando foram centrifugadas a 6000 rpm por 5 minutos.
O plasma obtido foi armazenado em freezer (-80º C) para posterior análise bioquímica.
4.2.2 Avaliação Comportamental
O teste comportamental avaliou a ansiedade dos animais em diferentes fases da
indução da cirrose com a finalidade de verificar alterações decorrentes da evolução da doença.
Os testes aconteceram na 6a, 10a, 12a e 14a semanas de tratamento. Os animais
utilizados como controle foram avaliados antes da primeira injeção. O grupo D foi avaliado
somente na 14ª semana por não dispor de número suficiente de animais para serem avaliados
em todas as etapas, conseqüência da alta mortalidade registrada nesse grupo.
A avaliação comportamental foi realizada pelo método do Labirinto em Cruz Elevado
(LCE). Este equipamento, feito de madeira, consiste de dois braços fechados, com paredes
laterais de 40 cm de altura, perpendiculares a dois braços abertos de igual tamanho (50 x 10
cm). Os braços são conectados por um quadrado central (10 x 10 cm) em forma de cruz
(Figura 1). O labirinto está elevado 50 cm do solo e é iluminado por duas lâmpadas
Tânia C. Lima Material e Métodos -
60
fluorescentes de 60 watts. Cada animal é colocado individualmente no espaço central do LCE
e observado por 5 minutos para o registro do comportamento. Entre as observações de cada
animal, a arena foi limpa com álcool 5% com vistas a minimizar os odores deixados pelo
animal anterior, o que poderia interferir no comportamento do animal seguinte. Os registros
dos comportamentos no LCE foram realizados sempre no mesmo período do dia,
intercalando-se os animais dos diferentes grupos. Cada animal passou pelo equipamento uma
única vez durante todo o experimento.
Figura 1 - Labirinto em Cruz Elevado – equipamento para avaliação comportamental
O registro dos comportamentos no LCE é feito indiretamente, evitando a interferência
da presença do pesquisador na sala de observação dos animais. O sistema de observação
indireta é costituído por uma câmara instalada no teto da sala de observação, conectada a um
sistema operacional constituído por um monitor (Sony - Triniton®) e um microcomputador,
ambos fora da sala. Para interpretar as imagens observadas durante a realização dos testes
comportamentais, o programa Ethovision® System (Noldus Information Technology®,
Leesburg, Va., EUA) fez a digitalização e o registro do comportamento dos animais.
Pellow (1985) e Lister (1987) validaram esse modelo para estudo dos níveis de
ansiedade e propuseram o registro dos seguintes parâmetros de comportamento:
a. Número de entradas nos braços abertos e nos braços fechados;
b. Tempo de permanência nos braços abertos e nos braços fechados.
Para tanto, considera-se como “entrada” em um dos braços, para efeito de sua
permanência em cada área do labirinto, o ato do animal colocar os quatro membros dentro da
área.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
61
4.2.3 Eutanásia
Ao término do experimento, os animais permaneceram 10 dias em repouso, sendo
apenas pesados. Após este período eles foram sacrificados com dose excessiva de anestésico
(CLOSE et al., 1996, 1997), empregando-se o mesmo procedimento da colheita sanguínea.
4.2.4 Processamento do Fígado
Em cada animal, as vísceras (pulmões, coração e trato digestivo completo) foram
removidas e seu peso foi aferido. O fígado foi separado, pesado e o seu volume foi obtido
suspendendo-o por um fio e mergulhando-o em um béquer com água destilada, sobre uma
balança analítica. O peso adicional é equivalente ao peso em água deslocada, portanto, ao
volume em centímetros cúbicos. Foi aferido também o peso da carcaça.
Foram coletadas amostras de fígado de todos os animais para análise histológica. A
fixação dos fragmentos foi efetuada nos líquidos fixadores Bouin (6 h) e Metacarn (12 h),
para inclusão em paraplast, e em McDowell (tempo indeterminado) para inclusão em
historresina. Em Bouin e Metacarn foram fixados fragmentos da porção direita do lobo médio
e, em McDowell, fragmentos do lobo esquerdo. O restante do fígado foi congelado em
nitrogênio líquido e armazenado em freezer -80°C para análises futuras.
4.3 ÍNDICES RELATIVOS
O peso dos animais foi analisado com base no índice de ganho de peso, considerando-
se o peso do animal em cada semana em relação ao peso inicial:
IGP = Pss / Pi
Onde: IGP = índice de ganho de peso
Pss = peso na semana selecionada
Pi = peso inicial
Tânia C. Lima Material e Métodos -
62
O índice hepato-corporal foi calculado dividindo-se o peso do fígado pelo peso da
carcaça e multiplicando-se o resultado por 100, para obtenção dos valores em porcentagem. O
mesmo foi feito para o índice hepatossomático, no qual dividiu-se o peso do fígado pelo peso
do animal, e para o índice víscero-somático, em que se dividiu o peso das vísceras pelo peso
do animal.
4.4 ANÁLISE BIOQUÍMICA
Sendo dotado de várias atribuições, muitas técnicas foram desenvolvidas no sentido de
avaliar a funcionalidade do fígado. Neste experimento, utilizou-se como marcador bioquímico
a determinação da atividade dos seguintes marcadores sanguíneos de lesão hepática: alanina
aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), albumina (ALB), fosfatase
alcalina (ALKP), gama-glutamiltranspeptidase (GGT), bilirrubina total (TBIL), proteína total
(TP) e globulina (GLOB).
As amostras de plasma foram analisadas pelo analisador bioquímico VetTest®
(IDEXX Laboratories, Inc. Westbrook, ME, EUA). Os valores médios de ALT, AST, ALKP e
GGT são expressos em U/L, enquanto que os valores de ALB, TP e GLOB são expressos em
g/dL e os de TBIL em mg/dL.
Para a avaliação desses marcadores foram utilizados 10 animais por grupo.
4.5 MICROSCOPIA DE LUZ E DOCUMENTAÇÃO FOTOGRÁFICA
Para a análise morfológica microscópica, os fragmentos incluídos em paraplast foram
cortados em micrótomo manual, obtendo-se cortes de 5 µm de espessura. Estes cortes foram
distendidos em banho-maria (30-35ºC) e recolhidos em lâminas de vidro.
Após as devidas colorações, as lâminas foram fotografadas em microscópio óptico
(OLYMPUS, BX60) com câmara acoplada (ZEISS, AxioCam HRc) utilizando-se o software
KS400 3.0 (ZEISS, 2000), para a aquisição das imagens.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
63
4.5.1 Colorações
Os cortes de tecido foram desparafinados em xilol e xilol/etanol (1:1), reidratados em
seqüência decrescente de etanol, lavados em água corrente e, então, corados. Após a
coloração, esses cortes passaram por desidratação, na seqüência inversa, sendo retirados do
xilol e montados em resina sintética Permount®. Esses procedimentos foram comuns a todas
as colorações.
O material fixado em Bouin foi corado por Picrossírius (JUNQUEIRA; BIGNOLAS;
BRENTANI, 1979), para evidenciação das fibras colágenas. Antes de passarem pelo corante,
os cortes passaram por tratamento com solução de ácido fosfomolíbdico 2% (1 banho: 15 s).
No material fixado em Metacarn efetuou-se as seguintes colorações (BANCROFT;
GAMBLE, 2002):
a) HE (Hematoxilina de Harris - Eosina): para análise morfológica e histopatológica das
amostras;
b) PAS (Ácido Periódico de Schiff): para observação do glicogênio no tecido hepático;
c) Diastase/PAS (incubação em saliva 1 h em estufa 37ºC) para determinação da
presença de mucopolissacarídeos neutros no interior de ductos biliares e de glicogênio;
d) Azul de Alcian (pH 2,5)/HE: para diferenciação de mucopolissacarídeos ácidos nos
ductos biliares;
e) Azul da Prússia: para identificação de pigmento férrico (TOLOSA et al., 2003).
4.5.2 Quantificação de Colágeno
Nesta etapa foram utilizados os tecidos corados por Picrossírius. O material foi
fotografado no microscópio óptico, já descrito anteriormente, e o mesmo software (KS400
3.0) executou a captura das imagens e a mensuração do colágeno.
Tânia C. Lima Material e Métodos -
64
As imagens foram feitas em aumento de 20x, para quantificação do colágeno
interlobular, e em aumento de 60x, para quantificação do colágeno intralobular. Foram
tomados, aleatoriamente, 10 animais de cada grupo cirrótico e todos os animais do grupo
controle (Grupo E, n=12). Na objetiva de 20x foram fotografados 5 cortes não seriados, sendo
5 campos por corte, de forma a somar 25 campos, de tamanho constante, por animal. Na
objetiva de 60x empregou-se o mesmo procedimento em 10 campos por corte, somando 50
campos por animal.
A imagem de cada campo foi digitalizada e tratada de forma a contrastar as fibras
colágenas da coloração de fundo por limiar de cor. Após esta separação, foi medida a área
ocupada pelas fibras colágenas no campo.
Os valores dos campos de cada animal foram somados e, assim, obteve-se a área
ocupada por colágeno no fígado de cada indivíduo do grupo. A partir desses valores os grupos
foram comparados estatisticamente.
A porcentagem da área ocupada pelo colágeno no fígado em cada grupo, a qual
corresponde à proporção volumétrica do mesmo, foi calculada em função da área do campo
de cada objetiva, da seguinte forma:
ACF x 100
ACC
Onde, ACF: área ocupada por colágeno (soma de todos os campos mensurados no grupo)
ACC: área do campo multiplicada pelo número de campos fotografados no grupo
20x = 603126 µm
2
; 60x = 67014,2 µm
2
4.5.3 Avaliação Histopatológica
Foram examinadas as lâminas coradas por HE. Após um estudo prévio do material,
definiram-se os itens a serem considerados e a avaliação dessas lesões foi realizada em função
do padrão observado no grupo controle. A sua intensidade consistiu em classificação por
cruzes, às quais foram atribuídos escores, conforme a intensidade da lesão:
(+ + +) lesão acentuada (+ +) lesão moderada (+) lesão discreta
(+ + +) = 3 (+ +) = 2 (+) = 1
Tânia C. Lima Material e Métodos -
65
Esses valores passaram por tratamento estatístico, obtendo-se deles a média e o desvio
padrão.
O exame histopatológico avaliou os seguintes parâmetros: nódulos regenerativos,
fibrose, células ovais, inclusões nucleares, figuras de mitose, células binucleadas com lesão
nuclear e hepatócitos encarcerados. O fígado normal freqüentemente apresenta hepatócitos
binucleados e, para avaliação histopatológica, considerou-se as células que apresentaram
inclusão nuclear em um dos seus núcleos. Como hepatócitos encarcerados considerou-se
aqueles que estavam envoltos por células ovais.
A classificação das lesões foi realizada por estudo cego, no qual o observador
desconhecia a que grupo pertencia o material sob análise.
4.5.4 Imuno-histoquímica para Glutationa S-Transferase Forma Placental (GST-P)
As lâminas utilizadas foram previamente tratadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano
(Sigma, EUA), solução a 4% em acetona (1 min), acetona (2 banhos), água destilada (2
banhos). O procedimento foi realizado no material fixado em Metacarn, sendo tomados 2
espécimes de cada grupo.
Os cortes histológicos foram desparafinados em xilol e xilol/etanol (1:1), reidratados
em concentrações decrescentes de etanol (100%, 95%, 70%) e lavados em água destilada. O
bloqueio da peroxidase endógena foi feito com solução de peróxido de hidrogênio 30 volumes
(Merck, Brasil) a 20%, em PBS, por 20 min.
A marcação imuno-histoquímica da GST-P empregou o método da avidina-biotina
(HSU; RAINE; FANGER 1981). Os cortes foram incubados com anticorpo primário
(policlonal) anti-GST-P (MBL, Japão) na diluição de 1:1000, durante 2 h, a temperatura
ambiente. A diluição foi feita em solução contendo soro-albumina a 0,5% (albumina bovina
fração V; Sigma, EUA) em água destilada e PBS.
Após a incubação com o anticorpo primário, incubou-se novamente os cortes, por 30
min, com o anticorpo secundário biotinilado (antiimunoglobulina de coelho; Vector
Laboratories, EUA) na diluição de 1:400. A aplicação do conjugado avidina-biotina-
peroxidase (Vectastain-ABC kit, Vector EUA) diluído em PBS (1:400) decorreu também por
30 min. Posteriormente, foi aplicada sobre os cortes uma solução substrato de peroxidase
preparada imediatamente antes da utilização. Essa solução constitui-se na mistura de peróxido
Tânia C. Lima Material e Métodos -
66
de hidrogênio a 0,02% (Merck, Brasil) com diaminobenzidina (DAB - Sigma, EUA) a 0,1%,
em PBS.
Os cortes foram então lavados em PBS por 5 min, contracorados pela eosina e em
seguida corados pela hematoxilina, desidratados, secos e montados com resina sintética.
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As comparações dos marcadores sanguíneos de lesão hepática foram realizadas
intragrupos, comparando-se a função hepática em diferentes momentos, e intergrupos,
comparando-se a função hepática em relação aos diferentes protocolos de indução.
As análises intragrupos foram comparadas pelo teste t de Student pareado, para os
grupos com 2 amostras e distribuição paramétrica, e teste de Wilcoxon, para 2 amostras
pareadas com distribuição não paramétrica. Foi realizada ANOVA de medidas repetidas
seguida por teste de Tukey-Kramer ou de Holm-Sidak para os grupos com mais de 2 amostras
e distribuição paramétrica, e ANOVA de medidas repetidas seguida por teste de Friedman
para distribuição não paramétrica.
As análises intergrupos foram realizadas pelo teste t de Student (paramétrico) e teste U
de Mann-Whitney (não paramétrico) para comparar os grupos C e D aos 24 dias e aos 72 dias.
ANOVA seguida por teste de Tukey-Kramer ou de Holm-Sidak foi utilizada para as demais
comparações de amostras paramétricas, e ANOVA seguida por teste de Kruskal-Wallis para
amostras não paramétricas.
Foram utilizados os softwares Minitab® Release 14 Statistical Software (State
College, PA - EUA), GraphPad InStat 3 (La Jolla, CA – EUA) e SigmaStat (Jandel Scientific,
CA - EUA) de acordo com os testes adequados a cada comparação e para a conferência dos
mesmos. Os resultados com P < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
Tânia C. Lima Resultados -
67
5 RESULTADOS
Tânia C. Lima Resultados -
68
5 RESULTADOS
Os resultados obtidos nesse experimento encontram-se descritos a seguir.
5.1 OBSERVAÇÕES PRELIMINARES
Durante a indução da cirrose as características físicas dos animais foram observadas.
Os animais tratados com TAA apresentaram queda de pêlo (principalmente o grupo C) e
freqüente secreção porfirinêmica da glândula de Harder, uma secreção avermelhada
observada ao redor dos olhos. Foi observada também piloereção e amarelamento da pelagem,
bem como flacidez da pele, posição álgica e pouca responsividade à manipulação. Além do
que já foi mencionado, um animal do grupo C apresentou petéquias anelares e avermelhadas
na cauda, sensíveis ao toque. No grupo C, e mais acentuadamente no grupo D, alguns animais
apresentaram diarréia. Em contrapartida, os animais do grupo E (controle) eram nitidamente
mais ativos do que os dos outros grupos, em qualquer fase do experimento.
A taxa de mortalidade registrada foi 5% no grupo A, 5% no grupo B, 14,3% no grupo
C, 44% no grupo D e 0 no grupo E (Figura 2).
Taxa de Mortalidade
ABCDE
0
10
20
30
40
50
Grupos
Porcentagem (%)
Figura 2 - Taxa de mortalidade registrada durante o experimento.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10%
a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Tânia C. Lima Resultados -
69
5.2 AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL
Foram verificados o número de entradas e o tempo de permanência em cada área do
LCE, sendo encontradas diferenças referentes aos braços fechados e abertos, respectivamente.
Os grupos tratados com TAA apresentaram menor número de entradas nos braços
fechados do que o grupo E, porém isto não é verificado até a 6ª semana (Figura 3A). As
diferenças surgiram a partir da 10
a
semana de tratamento. Nesta fase, o grupo B apresentou
número de entradas nos braços fechados significativamente menor (22 ± 10) do que o grupo E
(33,8 ± 3,3) (P<0,01) (Figura 3B). Na 12
a
semana, houve diferença dos grupos B (21,3 ± 5,7)
e C (23,6 ± 10,1) em relação ao grupo E (P<0,02) (Figura 3C). No entanto, na 14
a
semana
foram os grupos C (17,7 ± 10,4) e D (18,9 ± 10,1) que apresentaram número de entradas
significativamente menor, não apenas em relação ao grupo E, mas também em relação aos
grupos A (36,8 ± 22,4) e B (33,5 ± 13,3) (P<0,001) (Figura 3D).
Figura 3 - Número de entradas nos braços fechados do Labirinto em Cruz Elevado durante indução de cirrose.
(B): ANOVA seguida por teste de Tukey-Kramer; (C) e (D): ANOVA seguida por teste de Holm-
Sidak. * P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10%
a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
12
a
semana
ABCE
0
10
20
30
40
50
*
(C)
Grupos
N
o
de entradas
14
a
semana
ABCDE
0
25
50
75
*
(D)
Grupos
N
o
de entradas
*
*
6
a
semana
BCE
0
10
20
30
40
50
(A)
Grupos
N
0
de entradas
10
a
semana
BCE
0
10
20
30
40
50
*
(B)
Grupos
N
0
de entradas
Tânia C. Lima Resultados -
70
Quanto ao tempo de permanência na área aberta, do mesmo modo, os grupos tratados
mostraram valores menores do que o grupo E. Neste parâmetro também não se observou
diferença até a 6ª semana de tratamento (Figura 4A). Já na 10
a
semana, o grupo B (48,2 ± 37,7
s) apresentou tempo de permanência significativamente menor do que o grupo E (116,8 ±
40,4 s) (P<0,02) (Figura 4B). Porém esta diferença não perdurou até o final da indução da
cirrose. Na 12
a
semana, o grupo C (40,8 ± 20,5 s) apresentou valores menores do que os
grupos B (113,6 ± 52,3 s) e E (P<0,03) (Figura 4C). Ao final do tratamento com TAA, além
da diferença do grupo C (79,4 ± 31,1 s) em relação ao E, foram observadas diferenças do
grupo D (54,6 ± 33,9 s) em relação aos grupos A (105,4 ± 32,9 s), B (116,4 ± 53,6 s) e E
(P<0,002) (Figura 4D).
Figura 4 - Tempo de permanência (s) nos braços abertos do Labirinto em Cruz Elevado durante indução de
cirrose. ANOVA seguida por teste de Holm-Sidak. * P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
10
a
semana
BCE
0
50
100
150
*
(B)
Grupos
Tempo de permanência (s)
12
a
semana
ABCE
0
50
100
150
*
*
(C)
Grupos
Tempo de permanência (s)
14
a
semana
ABCDE
0
50
100
150
*
*
(D)
Grupos
Tempo de permanência (s)
6
a
semana
BCE
0
50
100
150
(A)
Grupos
Tempo de permanência (s)
Tânia C. Lima Resultados -
71
5.3 MACROSCOPIA
Os fígados coletados de todos os grupos que receberam TAA apresentaram nódulos
regenerativos em sua superfície (Figura 5a, b). O grupo A apresentou a nodulação menos
evidente dentre os grupos tratados, e houve maior ocorrência desses nódulos no lobo caudado.
No grupo D (Figura 5c), assim como no A, não houve alterações macroscópicas expressivas;
os fígados apresentavam superfície relativamente lisa comparados aos dos outros grupos. Já
os grupos B e C, além da aparência mais nodular, apresentaram também pontos
esbranquiçados espalhados pelo órgão e freqüentes lesões hemorrágicas (Figura 5d). Ao se
cortar o fígado para a coleta dos fragmentos, notava-se uma textura granular do órgão.
Figura 5 - Fígados cirróticos de ratas após 14 semanas de tratamento com TAA. (a, b) grupo C (aumento de 10%
a cada 24 dias) mostrando nódulos regenerativos na superfície do órgão; (c) grupo D (aumento de
15% a cada 24 dias), fígado sem nodulação evidente, porém com pontos esbranquiçados em sua
superfície; (d) grupo B (aumento de 20% aos 48 dias) mostrando lesão hemorrágica, a qual foi
observada em todos os grupos cirróticos. Barra: 1,5 cm (a, b, c), 1,0 cm (d)
a
b
c
d
Tânia C. Lima Resultados -
72
5.4 GANHO DE PESO
Na primeira semana após o início do tratamento, os grupos apresentaram pesos muitos
próximos. Entretanto, no decorrer da indução nota-se que os grupos tratados com TAA
mantiveram o IGP (índice de ganho de peso) quase constante ao longo das 14 semanas, ao
passo que o IGP do grupo controle foi crescente durante todo o período (Figura 6).
A média de peso inicial dos animais do grupo controle foi de 206,5g, enquanto que a
média inicial dos grupos tratados com TAA foi de 197,7g. Ao final das 14 semanas, a média
de peso do grupo controle foi de 253,9g e a dos animais com cirrose, de 203,2g.
Ìndice de Ganho de Peso (IGP)
0,8
0,9
1
1,1
1,2
1,3
0
1ª
2
ª
3ª
4ª
5ª
6ª
7
ª
8ª
9
ª
1
0ª
11ª
1
2ª
13
ª
1
4ª
Euta
n
ás
i
a
semanas
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
Figura 6 - Índice de ganho de peso dos grupos durante o período experimental.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução
salina
A análise estatística do IGP foi feita entre todos os grupos na 1ª e na 14ª semana de
tratamento. Nos grupos em que houve aumento de dose, essa análise foi feita na primeira ou
na segunda semana após os aumentos, seguindo o cronograma do experimento, período em
que os animais demonstram maior sensibilidade à droga.
Na 1ª semana de administração de TAA, os grupos A, C e D apresentaram queda
significante do IGP em relação ao grupo E. Nas semanas que sucederam os aumentos de dose,
verificou-se que o IGP do grupo D foi o maior dentre os grupos comparados. Esse grupo foi
Tânia C. Lima Resultados -
73
diferente do grupo C na 4ª e 11ª semanas, após o primeiro e o terceiro aumento de dose.
Também houve diferença do grupo D em relação ao B na 11ª semana, após acréscimo de 20%
na dose deste último, porém ambos foram semelhantes ao grupo C. Na 14ª semana o grupo B
apresentou o menor IGP entre os grupos tratados, porém o teste estatístico apontou diferenças
desse grupo apenas em relação a C e E. Já no grupo A, observou-se tendência de aumento do
IGP a partir da 8ª semana (Tabela 1).
Tabela 1 – Comparação da média e desvio padrão do índice de ganho de peso (IGP= Pss / Pi)
entre os grupos em cada semana, contada a partir da semana 0 – início do
experimento – São Paulo – 2008
Grupos
A (n=19) B (n=19) C (n=30) D (n=14) E (n=12)
Semanas
1
0,95 ± 0,03 a 0,98 ± 0,03 a, b 0,94 ± 0,03 a, c 0,96 ± 0,02 a 1 ± 0,01 b
2
0,97 ± 0,05 0,93 ± 0,03 0,95 ± 0,04 0,98 ± 0,02 1,05 ± 0,02
3
0,96 ± 0,06 0,94 ± 0,04 0,96 ± 0,05 1 ± 0,02 1,09 ± 0,03
4
0,97 ± 0,07 0,96 ± 0,04
0,98 ± 0,05 a 1 ± 0,03 b 1,1 ± 0,03
(+ 10% TAA) (+ 15% TAA)
5
0,98 ± 0,06 0,96 ± 0,05 0,97 ± 0,05 0,98 ± 0,03 1,11 ± 0,03
6
1 ± 0,07 0,96 ± 0,04 0,98 ± 0,04 1 ± 0,03 1,15 ± 0,04
7
0,99 ± 0,06 0,97 ± 0,04 0,98 ± 0,04 1 ± 0,03 1,16 ± 0,04
8
1,01 ± 0,09 0,99 ± 0,04 0,99 ± 0,05 1 ± 0,03 1,18 ± 0,04
9
1,03 ± 0,07
0,97 ± 0,06 a 0,98 ± 0,05 a, b 1,02 ± 0,03 b 1,18 ± 0,06
(+ 20% TAA) (+ 10% TAA) (+ 15% TAA)
10
1,01 ± 0,07 0,92 ± 0,05 1,01 ± 0,05 1,02 ± 0,04 1,2 ± 0,05
11
1,03 ± 0,06 0,97 ± 0,05
1 ± 0,06 a 1,03 ± 0,02 b 1,24 ± 0,07
(+ 10% TAA) (+ 15% TAA)
12
1,01 ± 0,08 1,01 ± 0,04 0,98 ± 0,06 0,99 ± 0,03 1,21 ± 0,05
13
1,01 ± 0,08 0,99 ± 0,04 0,98 ± 0,06 1,03 ± 0,04 1,22 ± 0,06
14
1,04 ± 0,07 a 0,99 ± 0,05 a, b 1,05 ± 0,04 a, c 1,04 ± 0,03 a, b, c 1,23 ± 0,07
As comparações foram feitas apenas entre as médias das linhas destacadas. Nas semanas 4, 9 e 11 foram
comparados somente os grupos que tiveram aumento de dose. As médias da mesma linha seguidas por letras iguais
são estatisticamente iguais. ANOVA seguida por teste de Kruskal-Wallis foi realizada para as comparações nas
semanas 1, 9 e 14; teste t de Student foi realizado para comparar os grupos C e D nas semanas 4 e 11 (P<0,05).
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24
dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Tânia C. Lima Resultados -
74
5.5 ÍNDICES RELATIVOS
O peso médio das carcaças de todos os grupos foi significativamente menor do que o
grupo controle, cuja média foi 26,7% maior do que a dos animais com cirrose hepática.
Verificou-se também diferença entre os grupos B e C, sendo que o grupo B apresentou o
menor peso médio de carcaça entre os grupos tratados.
Quanto ao peso das vísceras, o grupo B apresentou o maior valor em relação a todos
os outros, mas também o grupo C foi diferente do E. O peso do fígado foi semelhante,
estatisticamente, entre os grupos submetidos a aumentos de dose. O mesmo foi verificado
para o volume do fígado e para o índice hepato-corporal. Este índice, e os demais analisados,
foram significativamente maiores nos grupos tratados do que no controle. O grupo B ainda
apresentou valores maiores para os índices hepatossomático e víscero-somático do que os
outros grupos que também receberam TAA (Tabela 2).
Tabela 2 – Média e desvio padrão de índices relativos à massa e volume em todos os grupos – São Paulo –
2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
(n=19) (n=19) (n=30) (n=14) (n=12)
#
Carcaça (g)
165,1± 13,28 a 159,15 ± 11,4 a, b 168,8 ± 11,64 a, c 166,44 ± 6,56 a 208,87 ± 20,08
#
Vísceras (g)
45,78 ± 3,77 a 49,82 ± 4,72 47,18 ± 5,00 a, b 45,27 ± 3,78 a 43,03 ± 4,04 a, c
*Fígado (g)
9,29 ± 1,15 a 10,43 ± 1,13 b 10,14 ± 1,43 a, b 9,91 ± 1,43 a, b 9,07 ± 1,47 a
*Volume
8,58 ± 1,18 a 9,63 ± 1,01 b 9,36 ± 1,32 a, b 9,33 ± 1,34 a, b 8,5 ± 1,34 a
Fígado (cm
3
)
*Índice
5,6 ± 0,9 a 6,6 ± 0,9 b 6,0 ± 0,9 a, b 5,9 ± 1,0 a, b 4,3 ± 0,6
Hepato-corporal (%)
#
Índice
4,2 ± 0,4 a 4,8 ± 0,5 b 4,5 ± 0,5 c 4,4 ± 0,3 a, c 3,5 ± 0,4
Hepatossomático (%)
#
Índice
21,3 ± 2,2 a 23,3 ± 2,4 21,2 ± 2,0 a 21,4 ± 2,3 a 17,0 ± 1,2
Víscero-somático (%)
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais.
#
ANOVA seguida por teste de Holm-Sidak
(P<0,001); *ANOVA seguida por teste de Kruskal-Wallis (P<0,003).
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Tânia C. Lima Resultados -
75
5.6 FUNÇÃO HEPÁTICA – COMPARAÇÕES INTRAGRUPOS
Os marcadores sanguíneos de lesão hepática foram comparados, no mesmo grupo, em
diferentes fases da indução para que fossem avaliadas a evolução da doença e a resposta
funcional do fígado às variações de dose.
5.6.1 Grupo A
Os animais desse grupo tiveram aumentos significantes nos níveis de ALT (40,12%),
ALKP (30,21%) e TP (3,25%) (Tabela 3). Embora não houvesse diferença estatística, foi
observado aumento do nível plasmático de AST e GGT, ambas importantes para a avaliação
da função hepática.
Tabela 3 – Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores
de lesão hepática no grupo A (14 semanas 200 mg TAA/kg) –
São Paulo – 2008
Inicial
(n=10)
Final
(n=10)
ALT
46,6 ± 5,89 65,3 ± 18,76
AST
69,8 ± 9,13 a 83,4 ± 18,97 a
ALB
1,83 ± 0,2 a 2,02 ± 0,19 a
ALKP
114,5 ± 22,58 149,1 ± 45,66
#
GGT
0 ± 0 a 3,5 ± 5,58 a
#
TBIL
0 ± 0 a 0,03 ± 0,06 a
TP
6,15 ± 0,22 6,35 ± 0,14
GLOB
4,3 ± 0,23 a 4,31 ± 0,26 a
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. Teste t
de Student pareado;
#
teste de Wilcoxon (P<0,05).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB:
albumina (g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase
(U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL)
Tânia C. Lima Resultados -
76
Embora o teste estatístico empregado não tenha demonstrado diferença nos valores de
GGT, é conveniente que seja ilustrada a sua distribuição, pois o aparecimento dessa enzima é
fator importante na caracterização do quadro patológico (Figura 7). O gráfico box plot foi
utilizado com a finalidade de representar mostrar a diferença entre os grupos de dados por
constituir-se em uma representação independente da distribuição estatística.
GGT
GGT 0 GGT F
0
5
10
15
Grupo A
U/L
Figura 7 - Box Plot dos valores de GGT do grupo A (14 semanas 200 mg/kg)
5.6.2 Grupo B
Ao final de 7 semanas, os níveis de ALB, GGT e TBIL não apresentaram alteração
significativa (Tabela 4). Entretanto, a GGT, cuja presença não foi registrada antes de se iniciar
o tratamento com TAA, manifestou-se nessa fase do experimento. Os valores dessa enzima
são muito variáveis e sua dispersão foi representada por gráfico de box plot (Figura 8).
Após o aumento de 20% na dosagem TAA, todos os parâmetros tornaram-se
estatisticamente diferentes, exceção feita à GLOB. A GGT apresentou aumentou de 164,8%
em relação aos 48 dias.
No final da indução desse grupo, as enzimas AST e ALKP apresentaram níveis
plasmáticos menores do que aos 48 dias, mas permaneceram significativamente maiores em
relação aos valores iniciais, assim como os outros marcadores de lesão hepática.
Tânia C. Lima Resultados -
77
Tabela 4 – Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de
lesão hepática no grupo B (aumento de 20% aos 48 dias) – São Paulo
– 2008
Inicial
(n=10)
48 dias
(n=10)
Final
(n=10)
ALT
45,2 ± 9,36 60,3 ± 8,08 71,1 ± 13,27
AST
71,2 ± 11,42 137,8 ± 24,81 105 ± 23,47
ALB
1,58 ± 0,18 a 1,64 ± 0,11 a 2,04 ± 0,32
ALKP
126,3 ± 16,46 287,5 ± 56,61 193,3 ± 33,05
#
GGT
0 ± 0 a 5,4 ± 3,16 a 14,3 ± 10,53
#
TBIL
0 ± 0 0 ± 0 0,08 ± 0,13
TP
5,5 ± 0,34 5,89 ± 0,26 6,31 ± 0,21
GLOB
3,93 ± 0,24 4,26 ± 0,20 a 4,27 ± 0,27 a
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA de
medidas repetidas seguida por teste de Tukey-Kramer;
#
ANOVA de medidas repetidas seguida por
teste de Friedman (P<0,05).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina
(g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL:
bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL)
GGT
GGT-0 GGT-48d GGT-F
0
10
20
30
40
Grupo B
U/L
Figura 8 - Box Plot dos valores de GGT do grupo B (aumento de 20% aos 48 dias)
Tânia C. Lima Resultados -
78
5.6.3 Grupo C
Aos 24 dias de tratamento, metade dos marcadores sanguíneos de lesão hepática
avaliados não apresentou alterações significativas (ALT, ALB, GGT e TBIL). Após o
primeiro aumento de dose (48 dias), a ALT apresentou aumento significativo em relação ao
valor inicial. Nesse período foi observada redução significativa de TP em relação aos 24 dias.
Até aos 72 dias (após o segundo aumento de dose) esses valores ainda se mantêm; há de se
notar aumento considerável da ALKP. Porém, ao final do período experimental, observa-se a
redução dos níveis plasmáticos de alguns marcadores (ALT, AST, ALKP) com AST
apresentando valor próximo ao inicial. Os valores de ALB e TBIL não apresentaram diferença
significante ao longo da indução (Tabela 5).
A distribuição dos valores de GGT é mostrada na figura 9.
Tabela 5 – Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática no
grupo C (aumento de 10% a cada 24 dias) – São Paulo – 2008
Inicial
(n=10)
24 dias
(n=10)
48 dias
(n=10)
72 dias
(n=10)
Final
(n=10)
#
ALT
48,2 ± 5,8 a 61,7 ± 11,56 a, b 86 ± 33,91 b 87 ± 53,08 b 73,3 ± 15,25 b
AST
95,4 ± 19,05 a 156,3 ± 52,22 b 160,4 ± 55,16 b 189 ± 79,55 b 97,9 ± 14,44 a
#
ALB
1,8 ± 0,41 a 1,9 ± 0,24 a 1,49 ± 0,16 a, b 1,63 ± 0,14 a, b 2 ± 0,25 a
ALKP
126,7 ± 19,8 235,7 ± 35,6 a 232 ± 73,41 a 349 ± 85,87 179,1 ± 26,35
GGT
0 ± 0 a 1,5 ± 2,27 a 6 ± 6,66 a, b 9,1 ± 5,82 b 18,8 ± 17,26 b
#
TBIL
0 ± 0 a 0,05 ± 0,07 a 0,03 ± 0,09 a 0,09 ± 0,14 a 0,02 ± 0,06 a
TP
5,9 ± 0,33 a 6,18 ± 0,34 5,43 ± 0,45 5,81 ± 0,19 a 6,45 ± 0,25
GLOB
4,07 ± 0,35 a 4,28 ± 0,22 b 3,95 ± 0,43 a 4,28 ± 0,17 a, b 4,47 ± 0,24 b
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA de medidas repetidas
seguida por teste de Holm-Sidak;
#
ANOVA de medidas repetidas seguida por teste de Friedman (P<0,001).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina (g/dL); ALKP:
fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína
total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL)
Tânia C. Lima Resultados -
79
GGT
GGT-0 GGT-24d GGT-48d GGT-72d GGT-F
0
20
40
60
Grupo C
U
/
L
Figura 9 - Box Plot dos valores de GGT do grupo C (aumento de 10% a cada 24 dias)
5.6.4 Grupo D
Aos 24 dias de tratamento, apenas AST, TP e GLOB sofreram alterações
significativas. Entretanto, após o primeiro aumento de dose (48 dias) apenas TBIL manteve
valor semelhante ao inicial. Em relação aos 24 dias, a ALB apresentou aumento significativo.
Depois do segundo aumento de dose (72 dias), houve uma redução do nível plasmático
de ALB, mas os demais parâmetros permaneceram significativamente alterados quando
comparados às análises anteriores.
Ao final do experimento, alguns marcadores (ALT, AST e ALKP) apresentaram
reduções significativas. Outros (TBIL, TP e GLOB), e inclusive ALKP, retornaram a valores
semelhantes aos iniciais. Nesse período, a ALB mostrou-se aumentada novamente (Tabela 6).
Tânia C. Lima Resultados -
80
Tabela 6 – Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática no grupo D (aumento de 15% a cada 24 dias) – São Paulo – 2008
Inicial
(n=10)
24 dias
(n=10)
48 dias
(n=10)
72 dias
(n=10)
Final
(n=10)
ALT
47,1 ± 8,6 a 60,4 ± 9,45 a, b 71,9 ± 14,85 b 115,5 ± 33,91 75,9 ± 16,01 b
AST
67 ± 12,7 120,8 ± 17,9 a 141,5 ± 28 a, b 172,4 ± 52,9 b 106,8 ± 28,1 a
ALB
1,76 ± 0,22 a 1,65 ± 0,28 a 2,2 ± 0,24 b 1,75 ± 0,21 a 2,27 ± 0,2 b
#
ALKP
156,9 ± 23,6 a 175,5 ± 31,2 a 179,7 ± 25,6 a, b 209,7 ± 43,3 142,4 ± 30,2 a, c
*GGT
0,2 ± 0,63 a 0,7 ± 1,63 a, b 7,5 ± 1,84 b, c 15,4 ± 7,35 c 10,3 ± 11,49 b, c
*TBIL
0,01 ± 0,03 a 0,01 ± 0,03 a 0,03 ± 0,04 a 0,32 ± 0,31 b 0,12 ± 0,07 a, b
#
TP
5,94 ± 0,17 a 5,65 ± 0,33 b 5,6 ± 0,36 b 5,08 ± 0,25 5,9 ± 0,13 a
GLOB
4,15 ± 0,23 a 4 ± 0,35 b 3,41 ± 0,18 b 3,32 ± 0,23 3,66 ± 0,19 a
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA de medidas
repetidas seguida por teste de Tukey-Kramer;
#
ANOVA de medidas repetidas seguida por teste de Holm-
Sidak; * ANOVA de medidas repetidas seguida por teste de Friedman (P≤0,001).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina (g/dL);
ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina total
(mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL)
5.6.5 Grupo E
Os níveis de ALT, AST e GGT mantiveram-se estáveis durante todo o experimento.
Os demais marcadores sanguíneos de lesão hepática apresentaram valores significativamente
diferentes ao final do experimento, com decréscimo em ALKP e GLOB (Tabela 7).
Tânia C. Lima Resultados -
81
Tabela 7 – Média e desvio padrão dos índices sanguíneos dos marcadores
de lesão hepática no grupo E (14 semanas solução salina) –
São Paulo – 2008
Inicial
(n=10)
Final
(n=10)
#
ALT
64,3 ± 10,24 a 69 ± 17,46 a
#
AST
110 ± 24,01 a 121,6 ± 64,41 a
ALB
1,5 ± 0,16 2,79 ± 0,24
ALKP
185,5 ± 22,99 78,1 ± 6,64
GGT
0 ± 0 0 ± 0
TBIL
0 ± 0 0,16 ± 0,13
TP
5,91 ± 0,22 6,46 ± 0,32
GLOB
4,38 ± 0,16 3,66 ± 0,19
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. Teste t
de Student pareado;
#
teste de Wilcoxon (P<0,01).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB:
albumina (g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase
(U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL)
5.7 FUNÇÃO HEPÁTICA – COMPARAÇÕES INTERGRUPOS
Os marcadores sanguíneos de lesão hepática foram comparados entre os grupos no
mesmo estágio da indução para que fossem avaliados os efeitos das diferentes dosagens de
TAA sobre a função hepática.
Tânia C. Lima Resultados -
82
5.7.1 Todos os Grupos: início
No início do experimento, os grupos que receberiam TAA apresentavam valores
bastante homogêneos, com poucas diferenças significantes.
O grupo E apresentou valores altos de ALT, AST e ALKP, comparado aos outros
grupos (Tabela 8). Contudo, esses valores estavam dentro de limites aceitáveis, considerando-
se os valores de referência (Anexo A).
Tabela 8 – Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática entre todos os
grupos no início do experimento – São Paulo – 2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
(n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10)
ALT
46,6 ± 5,89 a 45,2 ± 9,36 a 48,2 ± 5,8 a 47,1 ± 8,64 a 64,3 ± 10,24
AST
69,8 ± 9,13 a 71,2 ± 11,42 a 95,4 ± 19,05 b 67 ± 12,66 a 110 ± 24,01 b
#
ALB
1,83 ± 0,2 a 1,58 ± 0,18 a, b 1,8 ± 0,41 a, b 1,76 ± 0,22 a, b 1,5 ± 0,16 b
ALKP
114,5 ± 22,58 a 126,3 ± 16,46 a 126,7 ± 19,8 a 156,9 ± 23,6 185,5 ± 22,99
#
GGT
0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,2 ± 0,63 a 0 ± 0 a
#
TBIL
0 ± 0 a 0 ± 0 a 0 ± 0 a 0,01 ± 0,03 a 0 ± 0 a
TP
6,15 ± 0,22 a 5,5 ± 0,34 5,9 ± 0,33 a 5,94 ± 0,17 a 5,91 ± 0,22 a
#
GLOB
4,3 ± 0,23 a 3,93 ± 0,24 b 4,07 ± 0,35 a, b 4,15 ± 0,23 a, b 4,38 ± 0,16 a
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida por teste de Tukey-
Kramer;
#
ANOVA seguida por teste de Kruskal-Wallis (P<0,05).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina (g/dL); ALKP: fosfatase
alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL);
GLOB: globulina (g/dL).
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias;
Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Tânia C. Lima Resultados -
83
5.7.2 Grupos C e D: 24 dias
Embora diferenças significantes tenham sido observadas apenas nos níveis
plasmáticos de ALB, ALKP, TP e GLOB, o grupo C apresentou todos os marcadores
sanguíneos de lesão hepática aumentados, em relação ao grupo D, submetido ao mesmo
tratamento – 24 dias 200 mg/kg (Tabela 9).
Tabela 9 – Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática entre os grupos C e D após 24 dias de tratamento com
TAA – São Paulo – 2008
Grupo C
(n=10)
Grupo D
(n=10)
ALT
61,7 ± 11,56 a 60,4 ± 9,45 a
AST
156,3 ± 52,22 a 120,8 ± 17,96 a
ALB
1,9 ± 0,24 1,65 ± 0,28
ALKP
235,7 ± 35,6 175,5 ± 31,2
#
GGT
1,5 ± 2,27 a 0,7 ± 1,63 a
#
TBIL
0,05 ± 0,07 a 0,01 ± 0,03 a
TP
6,18 ± 0,34 5,65 ± 0,33
GLOB
4,28 ± 0,22 4 ± 0,35
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. Teste t de
Student;
#
teste U de Mann-Whitney (P<0,05) .
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB:
albumina (g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L);
TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL).
Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias
Tânia C. Lima Resultados -
84
5.7.3 Grupos B, C e D: 48 dias
Neste período, correspondente à metade do experimento, o grupo C, após o seu
primeiro aumento de dose (10%) apresentou apenas 2 marcadores significativamente
alterados (ALT e TP) em relação ao grupo B que ainda não passou por aumento de dose. O
grupo D, cujo aumento foi de 15%, apresentou alterações significativas em ALB, GLOB e
ALKP, esta última consideravelmente menor do que no grupo B.
Entre os grupos C e D, foram observadas diferenças significativas em ALB e GLOB
(Tabela 10).
Tabela 10 – Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão
hepática entre os grupos B, C e D após 48 dias de tratamento com
TAA – São Paulo – 2008
Grupo B
(n=10)
Grupo C
(n=10)
Grupo D
(n=10)
ALT
60,3 ± 8,08 a 86 ± 33,91 b 71,9 ± 14,85 a, b
AST
137,8 ± 24,81 a 160,4 ± 55,16 a 141,5 ± 28,04 a
ALB
1,64 ± 0,11 a 1,49 ± 0,16 a 2,2 ± 0,24
#
ALKP
287,5 ± 56,61 a 232 ± 73,41 a, b 179,7 ± 25,58 b
#
GGT
5,4 ± 3,16 a 6 ± 6,66 a 7,5 ± 1,84 a
#
TBIL
0 ± 0 a 0,03 ± 0,09 a 0,03 ± 0,04 a
TP
5,89 ± 0,26 a 5,43 ± 0,45 b 5,6 ± 0,36 a, b
GLOB
4,26 ± 0,20 a 3,95 ± 0,43 a 3,41 ± 0,18
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida
por teste de Tukey-Kramer;
#
ANOVA seguida por teste de Kruskal-Wallis (P<0,05).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina
(g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina
total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB: globulina (g/dL).
Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D:
aumento de 15% a cada 24 dias
Tânia C. Lima Resultados -
85
5.7.4 Grupos C e D: 72 dias
Após o segundo aumento na dose dos grupos C (10%) e D (15%), o grupo C
apresentou níveis plasmáticos de ALKP, TP e GLOB significativamente maiores do que o
grupo D. Este grupo, por sua vez, apresentou os valores de ALT e GGT maiores do que o
grupo C (Tabela 11).
Tabela 11 – Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de
lesão hepática entre os grupos C e D após 72 dias de
tratamento com TAA – São Paulo – 2008
Grupo C
(n=10)
Grupo D
(n=10)
#
ALT
87 ± 53,08
115,5 ± 33,91
AST
189 ± 79,55 a 172,4 ± 52,96 a
ALB
1,63 ± 0,14 a 1,75 ± 0,21 a
#
ALKP
349 ± 85,87 209,7 ± 43,32
GGT
9,1 ± 5,82 15,4 ± 7,35
#
TBIL
0,09 ± 0,14 0,32 ± 0,31
TP
5,81 ± 0,19 5,08 ± 0,25
GLOB
4,28 ± 0,17 3,32 ± 0,23
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais.
Teste t de Student;
#
teste U de Mann-Whitney (P<0,05).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L);
ALB: albumina (g/dL); ALKP: fosfatase alcalina (U/L); GGT: gama-
glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total
(g/dL); GLOB: globulina (g/dL).
Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias
Tânia C. Lima Resultados -
86
5.7.5 Todos os Grupos: última semana do experimento
Ao final do experimento, os grupos que desenvolveram cirrose hepática apresentaram
marcadores sanguíneos com valores semelhantes entre si. Apenas no grupo D observou-se
diferença significante em ALB, TP e GLOB. Os níveis plasmáticos de GGT foram
significativamente maiores nos grupos em que houve aumento na dose de TAA (Tabela 12).
ALB, ALKP e GGT apresentaram diferenças significantes nos grupos tratados em
relação ao grupo E (controle).
Tabela 12 – Comparações dos índices sanguíneos dos marcadores de lesão hepática entre todos os
grupos após 14 semanas de tratamento – São Paulo – 2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
(n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=10)
ALT
65,3 ± 18,76 a 71,1 ± 13,27 a 73,3 ± 15,25 a 75,9 ± 16,01 a 69 ± 17,46 a
AST
83,4 ± 18,97 a 105 ± 23,47 a 97,9 ± 14,44 a 106,8 ± 28,07 a 102,6 ± 24,41 a
#
ALB
2,02 ± 0,19 a 2,04 ± 0,32 a 2 ± 0,25 a 2,27 ± 0,2 2,79 ± 0,24
ALKP
149,1 ± 45,66 a 193,3 ± 33,05 a 179,1 ± 26,35 a 142,4 ± 30,23 a 78,1 ± 6,64
GGT
3,5 ± 5,58 a 14,3 ± 10,53 a, b 18,8 ± 17,26 a, b 10,3 ± 11,49 a, b 0 ± 0
TBIL
0,03 ± 0,06 a 0,08 ± 0,13 a 0,02 ± 0,06 a, b 0,12 ± 0,07 a 0,16 ± 0,13 a, c
TP
6,35 ± 0,14 a 6,31 ± 0,21 a 6,45 ± 0,25 a 5,9 ± 0,13 6,46 ± 0,32 a
#
GLOB
4,31 ± 0,26 a 4,27 ± 0,27 a 4,47 ± 0,24 a 3,66 ± 0,19 b 3,66 ± 0,19 b
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida por teste de Kruskal-
Wallis (P<0,05);
#
ANOVA seguida por teste de Holm-Sidak (P<0,001).
ALT: alanina aminotransferase (U/L); AST: aspartato aminotransferase (U/L); ALB: albumina (g/dL); ALKP: fosfatase
alcalina (U/L); GGT: gama-glutamiltranspeptidase (U/L); TBIL: bilirrubina total (mg/dL); TP: proteína total (g/dL); GLOB:
globulina (g/dL).
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada 24 dias; Grupo
D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Tânia C. Lima Resultados -
87
5.8 MORFOLOGIA
O grupo E (controle) apresentou a morfologia típica do tecido hepático: lóbulos
formados por hepatócitos dispostos em fileiras orientadas radialmente e separadas por
sinusóides confluindo para uma veia central. Os espaços porta puderam ser facilmente
identificados contendo os vasos que compõem a tríade portal (vênula, arteríola e ducto biliar)
(Figura 10).
Figura 10 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo E (14 semanas solução salina): a) fileiras
de hepatócitos separadas por sinusóides (seta), confluindo para veias centrolobulares (asterisco).
Coloração HE. Barra: 100 µm; b) espaço porta composto pela tríade portal: ramo da veia porta
(asterisco), ramo da artéria hepática (cabeça de seta) e ducto biliar (seta). Coloração
PAS/Hematoxilina. Barra: 200 µm
Conforme esperado, nos grupos tratados com TAA não foi observada essa mesma
arquitetura: em todos os grupos experimentais o parênquima apresentou-se dividido por
septos de tecido conjuntivo formando os nódulos característicos da cirrose. Os hepatócitos
não formavam fileiras, mas se dispunham como uma massa celular homogênea não
apresentando o aspecto esponjoso do fígado sadio. Os sinusóides não eram tão evidentes
como no grupo controle, apresentando-se comprimidos pelos hepatócitos em regeneração e
pelo tecido fibroso depositado (Figura 11). Veias centrolobulares tampouco foram observadas
no interior da maioria desses nódulos.
a
b
*
*
*
Tânia C. Lima Resultados -
88
Figura 11 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA: a) observar o parênquima
tecidual dividido por septos (seta) e a ausência de sinusóides; b) nódulos regenerativos (asterisco)
circundados por septos fibrosos (seta). Coloração HE. Barra: 200 µm
O quadro cirrótico não se desenvolveu do mesmo modo em todos os grupos. No grupo
A, a deposição de colágeno se deu na forma de septos fibrosos delgados que uniam os espaços
porta. Os nódulos regenerativos eram grandes e, em sua maioria, incompletos. A arquitetura
hepática não estava totalmente desarranjada sendo possível, ainda, identificar espaços porta
pelo parênquima em estrutura lobular semelhante àquela observada no grupo controle.
Entretanto, veias centrolobulares estavam ausentes (Figura 12).
Figura 12 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo A (14 semanas 200 mg/kg): a) septos
fibrosos delgados (seta) circundando nódulo regenerativo incompleto (asterisco); b) arquitetura
hepática parcialmente preservada com integridade de espaços porta (seta). Coloração Picrossírius.
Barra: 200 µm
*
a
b
*
a
b
*
Tânia C. Lima Resultados -
89
O grupo B apresentou espessos septos unindo espaços porta e veias centrolobulares e
emitindo prolongamentos pelo parênquima. Os septos fibrosos formaram nódulos ora
incompletos ora bem delimitados. No espaço porta foi observada grande quantidade de
colágeno. A estrutura lobular do tecido hepático não pôde ser identificada (Figura 13).
Figura 13 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo B (aumento de 20% aos 48 dias): a) septos
fibrosos (seta) emitindo prolongamentos (cabeça de seta); b) nódulos regenerativos incompletos
(asterisco); c) septos fibrosos espessos (seta) delimitando nódulos regenerativos completos; d)
abundante deposição de colágeno no espaço porta (seta). Coloração Picrossírius. Barra: 200 µm
a
b
c
d
*
*
Tânia C. Lima Resultados -
90
Septos muito largos, circundando lóbulos inteiros, foram observados no grupo C. Os
nódulos regenerativos eram quase sempre completos e bem definidos, embora também tenha
sido observada a presença de prolongamentos dos septos permeando o parênquima tecidual.
Os espaços porta tornaram-se ampliados pela intensa deposição de colágeno, o qual formou
grandes pontes unindo-os uns aos outros. A arquitetura hepática foi completamente distorcida
(Figura 14).
Figura 14 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo C (aumento de 10% a cada 24 dias): a)
septos fibrosos largos (seta) delimitando nódulo completo (asterisco); b) prolongamentos dos septos
fibrosos (seta); c) septos fibrosos formando pontes (seta); d) espaços porta ampliados (asterisco)
unidos por pontes de colágeno (seta). Coloração Picrossírius. Barra: 200 µm
a
b
c
d
*
*
*
*
Tânia C. Lima Resultados -
91
O grupo D apresentou longos septos que se insinuavam pelo tecido, mas nem sempre
delimitavam nódulos. Esses septos eram, por vezes, tão espessos que formavam pontes entre
espaços porta, assim como no grupo C, no entanto, dividindo amplas áreas livres de colágeno.
Nesse grupo, a estrutura lobular também não pôde ser reconhecida, embora tenha sido
possível encontrar espaços porta íntegros pelo parênquima (Figura 15).
Figura 15 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais do Grupo D (aumento de 15% a cada 24 dias): a)
septos fibrosos (seta) unindo espaços porta (cabeça de seta) sem delimitar nódulos; b) nódulos
regenerativos grandes (asterisco); c) septos espessos formando pontes (seta); d) parênquima
hepático pouco desarranjado com espaços porta (seta) íntegros. Coloração Picrossírius. Barra: 200
µm
a
b
c
d
*
*
Tânia C. Lima Resultados -
92
5.9 QUANTIFICAÇÃO DE COLÁGENO
O colágeno foi mensurado nas objetivas de 20x e de 60x para quantificação das fibras
interlobulares e intralobulares, respectivamente.
A quantidade de colágeno interlobular hepático foi significativamente maior em todos
os grupos tratados em relação ao grupo E. Dentre esses grupos, houve diferença do grupo A
em relação a B e C sendo a área maior nestes últimos. O grupo D não apresentou diferença em
relação aos demais grupos com cirrose (Tabela 13).
Tabela 13 - Área ocupada pelo colágeno interlobular no fígado, mensurada em 250 campos de cada
grupo tratado e 300 campos no grupo controle (valor de cada campo: 603126 µm
2
). São
Paulo, 2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
(n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=12)
Área
10,00 a 14,61 b 15,23 b 11,36 a, b 1,96
em µm
2
. 10
6
Porcentagem
6,64 9,69 10,1 7,53 1,08
da área total*
#
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida por teste
de Tukey-Kramer (P<0,05). *área total dos grupos tratados (250 campos)=150,8 . 10
6
µm
2
;
#
área total do
grupo controle (300 campos)=180,9 . 10
6
µm
2
.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a cada
24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
De fato e, conforme ilustrado na figura 16, a porcentagem de aumento de colágeno nos
grupos com cirrose superou em mais de 500% os valores encontrados no grupo controle. Mais
precisamente, esses aumentos foram: 510% (Grupo A); 745% (Grupo B); 777% (Grupo C);
579% (Grupo D), superiores à área de colágeno verificada no fígado dos animais não tratados.
Tânia C. Lima Resultados -
93
Figura 16 - Porcentagem da área de colágeno no fígado em cada grupo. Objetiva de 20x; campo medido =
603126 µm
2
. *P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
Quanto ao colágeno intralobular, foram verificados resultados inversos ao do colágeno
interlobular hepático. Os grupos tratados com TAA apresentaram quantidade
significativamente menor do que o grupo E. Entre esses grupos, houve diferença estatística
nos valores do grupo D em relação aos outros, este apresentando área maior (Tabela 14).
Tabela 14 – Área ocupada pelo colágeno intralobular no fígado, mensurada em 500 campos de cada
grupo tratado e 600 campos do grupo controle (valor do campo medido: 67014,2 µm
2
) –
São Paulo – 2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D Grupo E
(n=10) (n=10) (n=10) (n=10) (n=12)
Área
2,25 a 2,3 a 1,98 a 3,53 b 10,04 c
em µm
2
. 10
4
Porcentagem
0,067 0,069 0,059 0,105 0,25
da área total*
#
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida por teste
de Kruskal-Wallis (P<0,01). *área total dos grupos tratados (500 campos)=3350,7 . 10
4
µm
2
;
#
área total do
grupo controle (600 campos)=4020,9 . 10
4
µm
2
.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a
cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
ABCDE
0
5
10
15
*
*
Grupos
Colágeno (%)
Tânia C. Lima Resultados -
94
De acordo com o ilustrado na figura 17, os grupos tratados tiveram áreas de colágeno
intersticial mais de 60% inferiores aos valores encontrados no grupo controle. Mais
precisamente, os valores foram: 77,9% (Grupo A); 77,34% (Grupo B); 80,6% (Grupo C);
65,1% (Grupo D), inferiores à área de colágeno intralobular verificada no fígado dos animais
não tratados.
Figura 17 - Porcentagem da área de colágeno no fígado em cada grupo. Objetiva de 60x; campo medido =
67014,2 µm
2
. *P<0,05.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
A diferença entre os grupos tratados com TAA e o grupo controle é claramente
verificada pelo ilustrado na figura 18. No grupo controle as fibras estão dispersas pelo
parênquima, dispostas ao longo dos sinusóides, compondo a estrutura de sustentação do
fígado.
ABCDE
0.0
0.1
0.2
0.3
*
*
Grupos
Colágeno (%)
Tânia C. Lima Resultados -
95
Figura 18 - Fotomicrografias do tecido hepático: a) animal tratado com TAA; b) animal controle. Notar as fibras
colágenas do parênquima hepático. Coloração Picrossírius. Barra: 50 µm
5.10 HISTOPATOLOGIA
O exame histopatológico abrangeu 7 parâmetros. Foi avaliada a presença de nódulos
regenerativos, fibrose, células ovais, inclusão nuclear, figuras de mitose, células binucleadas e
hepatócitos encarcerados. Foram observadas diferenças estatísticas em 3 deles, os quais estão
ilustrados na figura 19: fibrose (Figura 19a), células ovais (Figura 19b) e inclusão nuclear
(Figura 19c).
a
b
Tânia C. Lima Resultados -
96
Figura 19 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA: a) septos formados por fibras
colágenas que caracterizam a fibrose (seta). Barra: 100 µm; b) presença de células ovais (cabeça de
seta); c) inclusão nuclear (seta). Coloração HE. Barra: 30 µm (b e c)
a
b
c
Tânia C. Lima Resultados -
97
A quantificação dos 7 parâmetros avaliados está especificada na tabela 15, onde pode-
se observar que a intensidade da fibrose foi estatisticamente maior nos grupo B e C do que
nos grupos A e D. A concentração de células ovais foi menor no grupo D do que nos demais
grupos tratados e as inclusões nucleares foram observadas em quantidade maior nos grupos B
e C do que em A e D, embora não tenha sido observada diferença estatística do grupo C em
relação ao grupo D.
Tabela 15 – Comparação da média e desvio padrão dos escores dos parâmetros
histopatológicos dos grupos tratados com TAA – São Paulo – 2008
Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D
Nódulos
1,93 ± 0,73 a 2,58 ± 0,51 a 2,4 ± 0,73 a 2,09 ± 0,7 a
regenerativos
Fibrose
2,14 ± 0,66 a 2,67 ± 0,49 b 2,59 ± 0,59 b 2,09 ± 0,7 a
Células
2,21 ± 0,7 a, b 2,67 ± 0,49 b 2,59 ± 0,59 b 2,0 ± 0,77 a
ovais
Inclusão
1,57 ± 0,85 a 2,83 ± 0,39 b 2,5 ± 0,6 b, c 1,82 ± 0,75 a, c
nuclear
Figuras de
2,0 ± 0,68 a 2,08 ± 0,67 a 1,9 ± 0,61 a 2,18 ± 0,75 a
mitose
Células
2,0 ± 0,68 a 1,58 ± 0,67 a 1,64 ± 0,58 a 2,0 ± 0,63 a
binucleadas
Hepatócito
2,0 ± 0,88 a 2,42 ± 0,67 a 2,23 ± 0,75 a 2,0 ± 0,77 a
encarcerado
As médias da mesma linha seguidas por letras iguais são estatisticamente iguais. ANOVA seguida
por teste de Kruskal-Wallis (P<0,05).
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de 10% a
cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias
A análise estatística não revelou diferenças entre os grupos na quantidade de nódulos
regenerativos (P=0,067) e tampouco quanto à presença de figuras mitóticas (Figura 20a),
células binucleadas (Figura 20b) ou hepatócitos encarcerados (Figura 20c). Todavia, tanto
nódulos regenerativos quanto hepatócitos encarcerados tiveram valores maiores nos grupos B
e C, o que foi observado na maioria dos parâmetros. Além disso, verifica-se pela figura 21
que o grupo B apresentou os maiores escores em 5 dos 7 parâmetros avaliados.
Tânia C. Lima Resultados -
98
Figura 20 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA: a) figuras de mitose (seta); b)
célula binucleada (seta), observar a degeneração de um dos núcleos; c) hepatócitos encarcerados por
células ovais (asterisco). Coloração HE. Barra: 50 µm (a e b), 30 µm (c)
c
b
a
*
*
*
Tânia C. Lima Resultados -
99
Avaliação Histopatológica
1
2
3
nod reg fibrose cels ovais inclusão fig mit. cels binucl. hep enc.
Parâmetros
Escore médio
A B C D
Figura 21 - Média dos escores para os parâmetros histopatológicos avaliados. *estatisticamente diferente do
grupo A;
#
estatisticamente diferente do grupo D.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias
Outras lesões puderam ser identificadas e, embora não tenham aparecido em
quantidade expressiva, são aspectos importantes na caracterização do quadro cirrótico.
A proliferação de ductos biliares foi uma lesão recorrente nos grupos tratados
aparecendo em 15,8% dos animais do grupo A, 21,05% do grupo B, 26,7% do grupo C e
14,3% do grupo D (Figura 22).
Proliferação de ductos biliares
ABCDE
0
10
20
30
Grupos
Porcentagem
Figura 22 - Porcentagem do número de animais que apresentaram proliferação de ductos biliares em cada grupo.
Grupo A: 14 semanas 200 mg/kg; Grupo B: aumento de 20% aos 48 dias; Grupo C: aumento de
10% a cada 24 dias; Grupo D: aumento de 15% a cada 24 dias; Grupo E: 14 semanas solução salina
* *
# #
*
*
#
Tânia C. Lima Resultados -
100
A presença de hemossiderina ao longo dos septos fibrosos também foi uma
característica considerável nos animais com cirrose (Figura 23a, b). A deposição desse
pigmento ocorreu ao redor dos espaços porta e a sua identificação foi realizada pela coloração
Azul da Prússia, a qual é específica para íons férricos (Fe
3+
).
Figura 23 - Fotomicrografias do tecido hepático de animal tratado com TAA: presença de hemossiderina (seta)
principalmente ao redor dos espaços porta. Coloração Azul da Prússia. Barra: 300 µm (a); 200 µm
(b)
Nos animais tratados com TAA também pôde ser observada a presença de células
inflamatórias tais como linfócitos, neutrófilos e plasmócitos, sendo que as primeiras foram as
mais abundantes. Essas células eram escassas e de difícil identificação em meio à grande
quantidade de células ovais (Figura 24a). Vale ressaltar também o aparecimento de lesões
nucleares (Figura 24b), megalocitose (Figura 24c), balonização (Figura 24d) e corpos
apoptóticos (Figura 24e, Figura 24f).
a
b
Tânia C. Lima Resultados -
101
Figura 24 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA: a) células inflamatórias:
neutrófilo (seta), plasmócitos (cabeça de seta amarela) e linfócitos (cabeça de seta verde); b)
hepatócito com lesão nuclear (seta); c) megalócitos (seta), células inflamatórias: basófilo (seta
azul), linfócito (seta verde), neutrófilo (seta amarela); d) hepatócitos balonizados (asterisco); e)
corpo apoptótico (seta); f) fotomicrografia e em fluorescência, corpo apoptótico fluoresce devido à
eosina (seta). Coloração HE. Barra: 30 µm (a e b), 50 µm (c e d), 200 µm (e e f)
*
*
*
a
b
c
d
e
f
Tânia C. Lima Resultados -
102
5.11 HISTOQUÍMICA
A reação PAS evidencia a presença de polissacarídeos e esta técnica permitiu-nos
observar o glicogênio armazenado nos hepatócitos.
Nos animais do grupo E foi verificada menor positividade ao PAS, nas áreas
periportais (zona 1 do ácino hepático). O glicogênio encontrou-se concentrado nas áreas
centrolobulares (zona 3 do ácino hepático) (Figura 25a).
Por outro lado, os animais dos grupos com cirrose hepática apresentaram intensa
positividade ao PAS e o glicogênio apresentou-se distribuído uniformemente pelo tecido
(Figura 25b).
Figura 25 - Fotomicrografias do tecido hepático com marcação para glicogênio: a) fígado de animal do Grupo E
(14 semanas solução salina), observar menor positividade nas regiões próximas aos espaços porta
(cabeça de seta) do que nas regiões próximas às veias centrolobulares (seta); b) fígado de animal
cirrótico com parênquima homogeneamente positivo. Coloração PAS/Hematoxilina. Barra: 300 µm
Em áreas de extensa proliferação de ductos biliares (Figura 26a) observou-se a
presença de uma substância intensamente positiva ao PAS, que preenchia a luz destes canais
(Figura 26b).
a
b
Tânia C. Lima Resultados -
103
Figura 26 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA com região de extensa
proliferação de ductos biliares (a) e presença de substância fortemente positiva ao PAS
preenchendo o lúmen dos mesmos (seta) (b). Coloração: HE (a); PAS/Hematoxilina (b). Barra:
300 µm
Nesses mesmos exemplares foi realizada a técnica da diastase associada ao PAS. Após
a digestão do glicogênio pela amilase salivar, a substância permaneceu positiva ao PAS
indicando tratar-se de um mucopolissacarídeo (Figura 27a, b).
Figura 27 - Fotomicrografias do tecido hepático com proliferação de ductos biliares antes e após digestão do
glicogênio: a) substância verificada pela positividade ao PAS; b) mucopolissacarídeo identificado
pela resistência à amilase salivar. Coloração Diastase/PAS/Hematoxilina. Barra: 100 µm
a
b
a
b
Tânia C. Lima Resultados -
104
Todavia, o PAS marca tanto mucopolissacarídeos ácidos quanto neutros e para
diferenciar o tipo dessa substância foi empregada a técnica histoquímica de coloração pelo
Azul de Alcian (pH 2,5). Por meio desta reação identificou-se que essa substância era um
mucopolissacarídeo ácido (Figura 28).
Figura 28 - Fotomicrografia do tecido hepático com proliferação de ductos biliares e mucopolissacarídeo ácido
(seta) produzido pelas células epiteliais desses ductos. Coloração Azul de Alcian/HE. Barra: 100 µm
5.12 IMUNO-HISTOQUÍMICA
Todos os grupos tratados com TAA apresentaram áreas positivas à marcação anti-
GST-P. Estas áreas, que representam lesões pré-neoplásicas, correspondem aos pontos
esbranquiçados observados macroscopicamente (Figura 5c).
As lesões identificadas apresentaram-se com formato circular, circundadas (Figura
29a) ou não por septos fibrosos (Figura 29b). Elas foram mais freqüentes nos grupos C e D,
com duas ou mais lesões por corte, nos exemplares examinados.
Tânia C. Lima Resultados -
105
Figura 29 - Fotomicrografias do tecido hepático de animal tratado com TAA: a) regiões positivas para marcação
imuno-histoquímica anti-GST-P identificando lesões pré-neoplásicas (setas); b) região de transição
entre a lesão e o tecido adjacente. Coloração HE. Barra: 600 µm (a); 200 µm (b)
Em HE, as células que compõem essas áreas são discretamente maiores e
intumescidas, apresentam citoplasma rarefeito e núcleos não íntegros, fortemente acidófilos,
aparecem em maior quantidade (Figura 30a). Em PAS, essas células armazenam grande
quantidade de glicogênio (Figura 30b).
Figura 30 - Fotomicrografias do tecido hepático de animais tratados com TAA apresentando lesões pré-
neoplásicas ao centro: a) observar células maiores com citoplasma rarefeito e vários núcleos
acidófilos e disformes (seta). Coloração HE. Barra: 200 µm; b) células pré-neoplásicas com maior
quantidade de glicogênio. Coloração PAS/Hematoxilina. Barra: 300 µm
a
b
a
b
Tânia C. Lima Discussão -
106
6 DISCUSSÃO
Tânia C. Lima Discussão -
107
5 DISCUSSÃO
Reprodutibilidade e homogeneidade são essenciais para o desenvolvimento de um
modelo de cirrose hepática experimental. A baixa sensibilidade dos animais à TAA, indicada
pela recuperação do peso após certo período de administração, e a função hepática pouco
alterada, devido a adaptação ao tóxico, são as principais desvantagens do modelo. Os
experimentos realizados na tentativa de compensar esses problemas sugerem aumentos na
dosagem do tóxico em função do peso do animal, porém utilizam a via oral para
administração (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002; LALEMAN et al., 2006). O modelo
de indução de cirrose que foi adotado neste trabalho consistiu de aumentos progressivos nas
doses de TAA, através de injeções intraperitoneais, buscando garantir o controle na
administração da droga, a uniformidade e a eficiência dos resultados, na morfologia e na
função hepática.
Durante a fase de indução, os grupos tratados com TAA apresentaram fraqueza,
amarelamento da pelagem, queda de pêlos, piloereção e secreção porfirinêmica. Estas
características são fortes indicadoras de estresse dos animais, causado em decorrência da
injúria hepática instalada. O amarelamento da pelagem, assim como no caso da pele da
espécie humana, está associado à icterícia causada pela cirrose quando acomete o sistema
biliar. A secreção porfirinêmica é uma secreção avermelhada ou castanha, proveniente da
excessiva secreção de porfirinas pela glândula de Harder, que se acumula nos olhos e no nariz
do animal. Sua manifestação, conhecida como cromodacriorréia, ocorre em situações de
estresse induzido por dor ou doença e é relatada em quadros de inflamação. A presença dessa
secreção tem sido utilizada como indicador de doenças crônicas em animais de laboratório
(BRISTOW; YOUNG, 1994; HARPER et al., 2001).
Macroscopicamente, a cirrose hepática foi desenvolvida em todos os grupos que
receberam TAA. Dentre eles, fígados com nodulação mais evidente foram observados com
maior freqüência nos grupos B e C. Em todos os grupos tratados, o lobo caudado foi o mais
afetado apresentando-se com muitos nódulos de diferentes tamanhos. No diagnóstico da
cirrose hepática humana por imagens, este lobo aparece ampliado, embora sejam observadas
também hipertrofia do lobo esquerdo e atrofia do lobo direito (SCHUPPAN; AFDHAL,
2008).
As lesões hemorrágicas presentes nos fígados não demonstraram nenhum padrão de
distribuição. Foram observadas lesões de várias dimensões e em vários locais do órgão. Elas
Tânia C. Lima Discussão -
108
são similares ao que se descreve como hemangioma hepático, um tumor benigno dos vasos
sanguíneos. No caso da cirrose, o processo de reparo tecidual inclui angiogênese
(FRIEDMAN, 2008a) e capilarização dos sinusóides (BRUCK et al., 2007), o que poderia
levar a uma displasia desses vasos. Porém, a explicação mais plausível para o aparecimento
dessas lesões é um possível aumento da pressão desses capilares, em conseqüência da
hipertensão portal, uma das principais características da cirrose. O aumento da resistência
vascular intrahepática é documentado na cirrose induzida por TAA (LALEMAN et al., 2006).
O acúmulo de colágeno, principalmente em torno da veia centrolobular, impede a dilatação do
vaso, prejudicando a circulação sangüínea e o retorno venoso adequado. Isto, possivelmente,
dificulta e retarda a circulação venosa em algumas regiões do fígado.
Além das lesões hemorrágicas, pontos esbranquiçados também foram observados na
superfície dos fígados cirróticos. Esses pontos são semelhantes às lesões macroscópicas
descritas como lesões pré-neoplásicas em forma de nódulos de hepatócitos, em modelo de
hepatocarcinogênese (KUROIWA-TRZMIELINA, 2007) e como colangiocarcinoma (YEH et
al., 2004). No presente estudo, tanto lesões pré-neoplásicas como displasia de ductos biliares
foram observadas no exame histopatológico, todavia não foi feita uma investigação mais
acurada para se determinar a natureza das lesões macroscópicas.
Na análise do índice de ganho de peso (IGP) dos grupos, verificou-se que aqueles que
receberam TAA mantiveram valores semelhantes, sempre abaixo do IGP do grupo controle,
mostrando que a droga exerceu um efeito negativo sobre o ganho de peso dos animais.
Entretanto, o grupo A apresentou aumento do IGP a partir da sétima semana, o que já foi
relatado por outros pesquisadores (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002; GUERRA, 2006),
revelando a adaptação dos animais à dosagem contínua de TAA.
O grupo D (aumento de 15% a cada 24 dias) apresentou IGP maior, ao longo da
indução, do que os grupos B (aumento de 20% aos 48 dias) e C (aumento de 10% a cada 24
dias). Contudo, no grupo D, a porcentagem de óbitos foi de 44%, considerada muito alta em
relação aos demais. Este resultado sugere que o aumento de 15% elimina os animais mais
sensíveis à droga e apenas os que são resistentes sobrevivem ao tratamento elevando a média
do IGP, o que não é desejável neste modelo. No grupo C, mesmo os animais sensíveis tendem
a sobreviver, apresentando mortalidade de 14,3%, e proporcionando maior rendimento no
processo de indução do quadro cirrótico. Ainda assim, a mortalidade no grupo C foi maior do
que no grupo B (5%). Isto pode ser explicado pelo fato de que alguns animais mais sensíveis à
droga também foram eliminados no grupo C, pois os aumentos na dosagem acontecem em
intervalos relativamente curtos e a injúria constante pode levar a morte por falha hepática.
Tânia C. Lima Discussão -
109
Após a última semana da fase de indução, o IGP dos grupos tratados com TAA
aumentou consideravelmente. No dia da eutanásia, todos os grupos apresentaram pesos
próximos ao do grupo controle. Isto mostra que, de fato, os animais se recuperam rapidamente
depois de cessada a administração do tóxico (LI; BENJAMIN; ALEXANDER, 2002).
Os parâmetros relativos ao peso e volume do fígado foram estatísticamente diferentes
no grupo B em relação aos grupos A e controle, mas não o foi em relação aos grupos C e D,
os quais também passaram por aumento de dose. Assim, percebe-se que os eventos
decorrentes do processo patológico (fibrose, regeneração ou proliferação celular) que ocorrem
sob dose constante de TAA não são suficientes para causar alterações de massa e volume do
órgão. Em relação ao peso da carcaça, todos os grupos tratados com TAA foram diferentes do
grupo controle, conforme observado também pelo IGP. Esses valores demonstram que,
conforme o esperado, os animais sadios ganham peso com maior facilidade do que aqueles
que têm o fígado cirrótico e, portanto, funcionalmente afetado. O menor ganho de peso,
provavelmente, está relacionado à deficiência na metabolização e utilização dos nutrientes
(FONTANA et al., 1996). Quanto ao peso das vísceras, o grupo B apresentou o maior valor
entre todos os outros e, juntamente com o grupo C, foram estatisticamente diferentes do grupo
controle. O incremento no peso das vísceras pode ser devido ao aumento da massa hepática
observada nos grupos tratados. A maior proporção do fígado nos animais com cirrose
relaciona-se com o desenvolvimento de processos inflamatórios decorrentes da droga
administrada. O estresse hepatocelular induzido por hepatotoxinas leva a ativação dos
macrófagos residentes no fígado e à liberação de quimiocinas (RAMADORI; SAILE, 2004).
Além disso, os hepatócitos em regeneração, a proliferação dos miofibroblastos, a deposição
de matriz extracelular, a proliferação de células ovais e de ductos biliares, são todos fatores
que juntos contribuem para o aumento da proporção hepática.
Quanto à análise bioquímica da função hepática, as transaminases ALT e AST
encontram-se aumentadas em caso de enfermidades hepáticas, sendo que a ALT é mais
específica do que a AST, a qual pode ser decorrente de injúria em outros órgãos. GGT e
ALKP são enzimas que indicam lesão do sistema biliar; como a ALKP é encontrada também
em outros órgãos, a GGT serve como prova complementar (KAPLOWITZ; EBERLE;
YAMADA, 1982). A ALB e a GLOB, que juntas compõem a TP encontram-se reduzidas em
caso de lesão hepática devido ao aumento da permeabilidade capilar e à diminuição da
produção hepática (BANKS, 1992; SCHUPPAN; AFDHAL, 2008).
Nos resultados da bioquímica sanguínea, o grupo A (dose constante) apresentou
aumentos significativos nos níveis plasmáticos de ALT, ALKP, GGT e TP; apesar de não
Tânia C. Lima Discussão -
110
significantes, a AST e a ALB também apresentaram níveis aumentados. Esses resultados
indicam que a dose constante provoca morte de hepatócitos e acomete o sistema biliar.
Todavia, o aumento da TP, decorrente do incremento na fração de ALB, mostra que a síntese
protéica não foi prejudicada. Nesse modelo de indução, é provável que o processo de reparo
tecidual, ou seja, a regeneração celular, compense a agressão provocada pelo agente
hepatotóxico e permite que algumas funções básicas ainda sejam mantidas.
No grupo B, o período de 48 dias de administração de TAA causou aumento nos
valores de todos os marcadores avaliados, exceto TBIL, que permaneceu constante, e ALB,
que apresentou discreto aumento. Nesse grupo, o aumento de TP foi devido ao aumento no
nível plasmático de GLOB. Infelizmente, não é possível saber se houve aumento de α, β ou γ-
globulinas. Sabe-se que há aumento de α-GLOB na doença hepática associada a infecções
(OLSSON; REHNSTRÖM, 1966) e de γ-GLOB, por estar envolvida na resposta imune. No
presente estudo, o aumento de GLOB pode ser influenciado pelo processo inflamatório
decorrente da injúria hepática. Ao final da indução, após o aumento de 20% na dose de TAA,
todos os marcadores apresentaram-se aumentados em relação ao início do experimento e
somente a GLOB permaneceu constante, quando comparada ao período anterior ao aumento
de dose (primeiros 48 dias). O aumento da TP, no final da indução da cirrose, se deu em
função do aumento da ALB, assim como no grupo A, sugerindo restauração dessa função
hepática. A GGT apresentou um aumento de 164%, indicando grave lesão do sistema biliar.
Alguns marcadores, apesar de aumentados em relação ao início, tiveram seus valores
reduzidos em relação aos 48 dias de indução. Este fato será discutido posteriormente.
O grupo C foi avaliado em 5 momentos, ao longo do experimento. Após 24 dias de
indução, houve aumento significativo de AST, ALKP e TP. Nesta fase mais inicial da
indução, pode-se verificar que o sistema biliar é o primeiro a manifestar sinais de lesão com
significativo aumento de AKLP e discreto aumento de GGT e TBIL. Como a AST não é
hepato-específica e a ALT não aumentou significativamente, é de se supor que o fígado
responde ativamente nessa fase, regenerando com eficiência. Aos 48 dias, após o primeiro
aumento de dose, a TP diminui, com redução dos seus dois componentes (ALB e GLOB). Isto
mostra que o aumento de 10% na dose de TAA prejudica a síntese protéica no fígado, pois se
constitui num reforço ainda na fase aguda da injúria. Esta perda de função, provavelmente, se
deu pela morte de hepatócitos, fato evidenciado pelo aumento de ALT. Aos 72 dias, após o
segundo aumento de 10%, é observado um forte aumento de ALKP acompanhado por
pequenos incrementos nos valores de GGT e TBIL, refletindo uma injúria progressiva ao
Tânia C. Lima Discussão -
111
sistema biliar. No grupo C, assim como no B, o final da indução é marcado pela redução do
nível plasmático de alguns marcadores.
Os animais do grupo D, desde o início, não apresentaram a maioria das alterações
esperadas para o tratamento. Aos 24 dias, apenas a AST e a TP apresentaram alterações
típicas de doença hepática. Após o primeiro aumento de 15% (48 dias), os marcadores
tornaram-se diferentes dos valores iniciais, mas permaneceram similares aos verificados nos
24 dias. A avaliação bioquímica foi mais satisfatória após o segundo aumento de dose (72
dias) com alterações significativas e típicas do quadro cirrótico. Ao final da indução, também
esse grupo apresentou uma reversão dos valores bioquímicos, observada inclusive na GGT,
sendo o único grupo a apresentar redução desse marcador. Como já foi dito quando
abordamos o IGP dos animais ao longo do experimento, provavelmente o aumento de 15%
tenha selecionado os animais mais resistentes do grupo. A função hepática pouco alterada até
a metade do período experimental talvez se deva ao fato de que apenas esses animais
resistentes foram analisados, já que os testes foram realizados somente com animais que
permaneceram até o final do experimento e que foram submetidos às 5 coletas sanguíneas
para fazer o acompanhamento.
No grupo E (controle), alguns marcadores foram diferentes nos valores iniciais e
finais. A ALKP e a GLOB apresentaram níveis plasmáticos significativamente maiores no
início do experimento do que ao final. Considerando-se que a ALKP não é hepato-específica e
que não foi registrada a presença de GGT nos animais desse grupo, poderia estar ocorrendo
algum processo inflamatório nestes animais, de origem não hepática. Essa hipótese é
assumida em razão do simultâneo aumento de GLOB, tendo em vista que a classe γ dessas
proteínas participam da resposta imune, e que a ALKP pode ser encontrada também nos
leucócitos (GIANNINI; TESTA; SAVARINO, 2005). No final do experimento, a ALKP foi
reduzida em mais de 50% e a GLOB também sofreu significativa redução. Entretanto, os
níveis plasmáticos de TP aumentaram devido a um incremento de 86% da ALB o que, neste
caso, representa uma evidência de bom funcionamento hepático. Esses resultados vêm afirmar
que as condições ambientais a que todos os animais estiveram submetidos – alimentação,
tratamento, manipulação e aclimatação – são adequadas para manutenção do fígado sadio.
No início do período experimental, todos os grupos apresentaram valores dos
marcadores sanguíneos de lesão hepática relativamente homogêneos, indicando o estado
saudável dos animais utilizados no experimento, no que se refere ao funcionamento adequado
do fígado.
Tânia C. Lima Discussão -
112
A análise bioquímica dos grupos C e D, aos 24 dias, revelou que o grupo D, de fato,
respondeu menos à injúria hepática, reafirmando a resistência desses animais ao tóxico. Aos
48 dias, ao compararmos os grupos B, C e D, verifica-se que o aumento de 10% do grupo C
causou um dano hepático mais uniforme do que a dose constante do grupo B e do que o
aumento de 15% do grupo D, com transaminases mais elevadas e diminuição da TP. Os
animais que sobreviveram aos aumentos de 15% apresentaram lesão hepática mais acentuada
aos 72 dias (após o segundo aumento de dose) com alterações significativas dos marcadores
mais específicos de lesão hepática do que aqueles com aumento de 10%.
Ao término do experimento, observamos uma redução nos níveis plasmáticos das
transaminases, de tal forma que não apresentaram diferença em relação ao grupo controle.
Porém, ALKP e GGT ainda permaneceram diferentes. De acordo com esses resultados, a
cirrose desenvolvida afeta sobremaneira o sistema biliar, visto que todos os grupos
apresentaram esses parâmetros aumentados. A lesão biliar causada pela TAA mostrou-se
estável e dependente da dose, pois os níveis de GGT foram menores sob dose constante e
maiores sob aumento progressivo de 10%. Embora dependente da dose, a GGT não foi maior
no grupo D devido à resistência dos animais, fato já comentado. De modo geral, os índices
sanguíneos dos marcadores de lesão hepática foram muito similares entre os grupos B e C,
neste período.
Ainda sobre o quadro bioquímico, e conforme já chamada atenção, nos grupos em que
mais de duas coletas sanguíneas foram realizadas, foi possível observar que alguns parâmetros
retornaram a valores próximos aos iniciais, no final do experimento, fazendo com que os
grupos não apresentassem diferenças marcantes. Tal fato pode ser explicado pelo período de
repouso (10 dias) a que os animais foram submetidos antes da eutanásia, em que foi cessada a
administração da droga. A análise do IGP também revela a rápida recuperação dos animais.
Esta reversão dos marcadores sanguíneos de lesão hepática confirma que os efeitos de
hepatotoxinas podem ser minimizados suspendendo a administração da droga (LI;
BENJAMIN; ALEXANDER, 2002), provavelmente por cessar a morte de hepatócitos. No
entanto, o período de repouso é necessário porque, nos experimentos em que se testam
substâncias que podem alterar ou reduzir o quadro cirrótico, deve haver um prazo mínimo
para que o animal elimine de seu organismo os resquícios da substância que causa a cirrose e
não haja influência dos efeitos agudos da droga.
Embora o quadro bioquímico tenha apresentado evidências de recuperação da função
hepática, o estudo morfológico revelou o desenvolvimento de um estágio avançado de cirrose.
Os grupos tratados com TAA apresentaram desarranjo da arquitetura lobular hepática com o
Tânia C. Lima Discussão -
113
desenvolvimento de septos fibrosos e nódulos regenerativos, proliferação de células ovais e de
ductos biliares. A cirrose desenvolveu-se mais intensamente nos grupos B e C. Ao que parece,
as doses de TAA administradas nesses grupos proporcionam uma injúria continuada que age
como estímulo ao processo regenerativo e de reparo tecidual, levando ao maior acúmulo de
tecido cicatricial.
A proporção volumétrica do colágeno interlobular hepático dos grupos tratados com
TAA foi pelo menos 500% superior à do grupo controle. Este resultado sugere que mesmo o
grupo A, no qual a cirrose é mais branda, é um modelo suficientemente satisfatório para
trabalhos em que a fibrose seja o principal alvo de estudo. As maiores quantidades de
colágeno foram observadas nos grupos B e C. O grupo D não apresentou diferença estatística
em relação a nenhum dos grupos tratados, mas o seu valor foi bastante próximo ao do grupo
A. Como já inferido, o aumento maior na dosagem de TAA desse grupo provocou a morte dos
animais mais sensíveis e somente os mais resistentes sobreviveram até o final do experimento,
não apresentando bom desenvolvimento do quadro patológico.
Na proporção de colágeno intralobular, observou-se que os animais dos grupos
tratados com TAA apresentaram valores muito menores do que os do grupo controle. De fato,
nos animais submetidos ao modelo de cirrose não foram observadas fibras colágenas
espalhadas pelo parênquima, ao longo dos sinusóides, como no grupo controle. A pequena
quantidade de fibras presente nos animais com cirrose encontrava-se, muitas vezes,
organizada em pequenos e delgados septos ou como vasos sanguíneos muito pequenos. De
modo geral, havia pouco colágeno permeando a densa massa celular que comprimia os
sinusóides. Uma possível explicação para esse fato seria que o parênquima que compõem os
nódulos regenerativos é formado por hepatócitos provenientes do processo de regeneração e
pobre em outros tipos celulares que, mesmo presentes, não seriam capazes de desempenhar
suas funções com a mesma eficiência, dado o estado funcional prejudicado do órgão. A
regeneração ocorre nas células parenquimais, num processo de hiperplasia compensatória, que
restitui o mesmo tipo de tecido lesado (DAGLI; HERNANDEZ-BLAZQUEZ, 2007). Nesse
processo, haveria uma restauração da massa hepática, em busca do funcionamento adequado
do fígado, mais rápida ou urgente do que a reconstrução do arcabouço estrutural do órgão,
composto pelas fibras de sustentação. Dentre os grupos tratados, o grupo D apresentou uma
proporção maior de colágeno intralobular, mostrando a reestruturação mais eficiente do
fígado nesse grupo, apesar do maior aumento de dose.
A cirrose desenvolvida com o modelo empregado neste estudo foi caracterizada por
grave acometimento do sistema biliar, já verificado pela análise bioquímica dos marcadores
Tânia C. Lima Discussão -
114
de lesão hepática. Níveis elevados de GGT foram observados desde o princípio da indução. É
bem documentado que a administração de TAA por 14 semanas, via oral, promove intensa
proliferação de ductos biliares e colangiocarcinoma (AL BADER et al., 2000). O tratamento
prolongado com esta droga leva à displasia do epitélio biliar com produção de mucinas
similarmente ao que é observado em colangiocarcinomas humanos (YEH et al., 2004; ZEN et
al., 2006). A produção de mucinas pelo epitélio biliar pode estar relacionada ao fato de que as
células epiteliais detêm fenótipos gástrico e intestinal (AISHIMA et al., 2008), destacando o
padrão glandular de organização dessas estruturas (RIO TINTO et al., 2003). No presente
estudo, grandes áreas de proliferação de ductos contendo mucopolissacarídeos ácidos,
correspondem às características descritas para colangiocarcinomas, que geralmente
acompanham a cirrose, e apontam para o potencial carcinogênico da TAA.
Outro fato que vem confirmar o estágio avançado do quadro cirrótico e a ação
carcinogênica da droga, alcançados por esse modelo de indução, é o aparecimento de lesões
pré-neoplásicas. Essas lesões foram identificadas pela imuno-histoquímica anti-GST-P
(glutationa S-transferase forma placental). A GST-P, assim como a GGT, tem sua expressão
aumentada em focos e nódulos de hepatócitos, em modelos de hepatocarcinogênese (WOOD;
KORKOLA; ARCHER, 2002). Cabe lembrar que a GST-P é considerada um marcador para
células pré-neoplásicas, pois apresenta baixa atividade em tecidos normais ou em regeneração
(SATOH et al., 1985). Nesses casos, a concentração de GSTs é suficiente para promover a
proteção da célula contra substâncias nocivas provenientes dos alimentos ou subprodutos do
próprio metabolismo. Todavia, essas enzimas encontram-se aumentadas frente à injúria
hepática, participando da fase II do processo de detoxificação (SHEEHAN et al., 2001).
Sabe-se que a TAA é ativada pela ação catalítica do sistema enzimático citocromo P-
450, que faz a oxidação dos compostos. O estímulo constante provocado por essa substância,
aliado à toxicidade dos seus metabólitos ativados na fase I, leva a modificações bioquímicas e
moleculares nas células. Essas modificações, que incluem dano ao DNA e possíveis
mutações, quando irreversíveis promovem a iniciação de algumas células (PITOT, 2001). A
neoplasia começa a se desenvolver quando da ocorrência de um ciclo de proliferação celular,
o qual fixará a mutação (FARBER; SARMA, 1987). A segunda etapa da carcinogênese – a
promoção – é caracterizada pela proliferação seletiva de hepatócitos já iniciados,
considerados pré-neoplásicos, frente à manutenção do estímulo. Assim, as lesões pré-
neoplásicas apresentam expressão alterada de GST-P no citosol, região celular onde é
sintetizada (FERNANDEZ-CHECA; KAPLOWITZ, 2005). A TAA provoca o aumento da
atividade da GST-P, devido à ação citotóxica dos seus metabólitos, em modelo de
Tânia C. Lima Discussão -
115
administração a longo prazo. A administração de determinados carcinogênicos, a curto prazo,
não é capaz de induzir a atividade dessa enzima (SATOH et al., 1985).
A presença de GST-P, identificada pela imuno-histoquímica, representa que a TAA
pode ter um efeito carcinogênico por provocar a iniciação de hepatócitos. A sua administração
a longo prazo contribui para a fase de promoção da hepatocarcinogênese, perpetuando as
lesões. A fase final – progressão – não foi observada neste estudo, dado que as lesões não
apresentaram característica invasiva ou de crescimento autônomo.
Em diversos processos patológicos, a degradação de glicogênio é deprimida,
resultando em acúmulos intracelulares anormais (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). As
lesões pré-neoplásicas apresentaram grande acúmulo de glicogênio quando coradas por PAS.
A degradação prejudicada é observada pela distribuição homogênea desse polissacarídeo nos
fígados cirróticos, ao passo que no órgão sadio há maior acúmulo em torno da veia
centrolobular. Isto, talvez, se deva ao fato de que as alterações vasculares prejudiquem a
circulação do sangue pelo fígado e, conseqüentemente, a captação do glicogênio armazenado.
Outro aspecto importante relacionado à extensa proliferação ductular e às lesões pré-
neoplásicas observadas nas amostras, é a grande quantidade de células ovais presentes nos
animais com cirrose, tanto nas áreas de proliferação de ductos quanto ao longo dos septos
fibrosos. Particularmente quando a cirrose está presente, há uma íntima associação entre a
proliferação de células ovais e o aumento do risco de desenvolvimento de hepatocarcinoma
(LOWES et al., 1999). Em humanos, em casos de hepatites crônicas, o número de células
ovais está diretamente relacionado ao grau da doença e pode indicar o futuro desenvolvimento
de carcinoma hepatocelular (TSAMANDAS et al., 2007).
As células ovais podem formar estruturas ductulares (LOWES et al., 1999). Estas
células têm similaridades com os hepatócitos e com as células dos ductos biliares e aparecem
quando a regeneração de hepatócitos maduros é suprimida. As células ovais proliferam à
medida que a fibrose avança. Durante o estabelecimento da cirrose, a replicação dos
hepatócitos maduros é prejudicada e isto leva à ativação das células ovais (TSAMANDAS et
al., 2007). Desse modo, os hepatócitos podem não responder adequada ou suficientemente ao
processo de regeneração que se estabelece face à injúria aplicada ao órgão, e a ativação das
células ovais seria um evento auxiliar na manutenção e regeneração do tecido hepático. Foi
verificado que as células ovais estão associadas ao tecido fibroso do fígado, proliferando ao
longo dos septos que circundam os nódulos regenerativos. Esta observação é pertinente dado
que as células ovais se desenvolvem nas áreas periportais e os septos se constituem em
extensões dessas áreas.
Tânia C. Lima Discussão -
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Em modelos animais, a proliferação de células ovais está associada à presença de
células inflamatórias no fígado. Quando colocadas em cultura, as células ovais de animais
submetidos a modelos de cirrose se deterioram rapidamente, sugerindo que fatores exógenos
sejam fundamentais para sua manutenção. Assim, citocinas ou outros fatores produzidos pelas
células associadas a fibrogênese, como as células estreladas e células de Kupffer, podem ser
responsáveis por estimular a proliferação e a migração de células ovais (TSAMANDAS et al.,
2007). Esta explicação é plausível neste estudo, visto que células inflamatórias puderam ser
vistas entre as células ovais, embora em quantidade muito pequena. Conquanto a maioria dos
estudos que envolvem algum grau de fibrose sempre descreva a infiltração de células
inflamatórias como característica marcante, esse evento não é indispensável: doenças
metabólicas, como a hemocromatose, são notáveis pela ausência de infiltrado inflamatório,
ainda que possam culminar em cirrose e risco de carcinoma hepatocelular (FRIEDMAN,
2008a).
Nas observações realizadas, as células ovais foram encontradas aprisionando
hepatócitos individuais, em regiões de necrose em saca bocado, e isto se deu com tal
freqüência que lhe permitiu ser incorporado aos parâmetros histopatológicos avaliados, ao
qual convencionou-se chamar de hepatócito encarcerado. A presença das células ovais foi
significativamente maior nos grupos B e C, assim como a proliferação de ductos biliares e a
ocorrência dos hepatócitos encarcerados, embora nos dois últimos não tenha havido diferença
estatística.
As outras lesões identificadas, porém menos significativas, também merecem
destaque. As figuras de mitose apareceram em quantidades similares em todos os grupos
tratados, denotando a constante tentativa de recuperação do tecido hepático,
independentemente do grau da injúria. As figuras mitóticas eram, aparentemente, normais e
não foram relacionadas a eventos carcinogênicos. A ocorrência de lesões nucleares indica
degeneração do material genético e, aliadas a megalocitose, balonização e apoptose de
hepatócitos, demonstram “sofrimento” celular em virtude da agressão química.
A ocorrência de megalocitose está relacionada com a presença de hepatócitos com
núcleos poliplóides. Estas células são caracterizadas pelo seu tamanho maior, que é
proporcional à ploidia (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). O processo de poliploidização dos
hepatócitos é considerado um mecanismo de adaptação evolutiva que reflete um grau de
diferenciação irreversível da célula hepática. Esse mecanismo é adotado a fim de diminuir o
alto risco de dano genômico a que o hepatócito está exposto (TORRES et al., 1999). Segundo
estudos, no fígado do rato adulto normal, apenas 19,6% dos hepatócitos são diplóides (2n). A
Tânia C. Lima Discussão -
117
maioria das células (75,1%) são tetraplóides (4n) e uma pequena parcela (5,3%) é constituída
por células octaplóides (8n). Estas últimas apresentam um estado de diferenciação terminal
sendo, por conseguinte, senescentes (GANDILLET et al., 2003).
Portanto, a existência de tipos celulares poliplóides no fígado normal não é um evento
raro. No fígado cirrótico, entretanto, essa presença torna-se mais marcante por se destacar
contra o fundo de células diplóides, que aparecem em maior quantidade. Segundo Torres et al.
(1999), no processo de regeneração há uma expansão da população de células diplóides, o que
é lógico considerando-se que a ploidia maior significa maior estado de conservação da célula.
Assim, hepatócitos com núcleos pequenos passam a ser a maioria no fígado em regeneração.
As células grandes observadas, e classificadas como megalocitose, provavelmente são
hepatócitos octaplóides que não participam da regeneração. Dessa forma, a indentificação de
megalocitose é um indício do processo regenerativo em resposta à injúria infligida.
A presença de hemossiderina foi notável em todos os animais dos grupos tratados com
TAA. A deposição deste pigmento ocorre pela sobrecarga de ferro decorrente da sua absorção
intestinal ou da destruição excessiva de hemácias. Normalmente o ferro é acumulado em
proteínas (ferritina), mas, nos casos citados, as moléculas de ferritina tornam-se saturadas e
formam depósitos granulares de hemossiderina. Neste estudo, a quebra de hemácias é a
condição mais provável, visto que lesões hemorrágicas foram observadas macroscopicamente
no fígado de vários animais.
O acúmulo de ferro no fígado tem sido descrito no citoplasma de células de Kupffer,
em cães acometidos por hepatite e carcinoma hepatocelular, principalmente nas áreas
periportais (FUENTEALBA et al., 1997; SCHULTHEISS et al., 2002). A deposição de
hemossiderina pode ser observada também em hepatócitos, células endoteliais da zona 1 e no
tecido conjuntivo do espaço porta, além das células de Kupffer (SOUBASIS et al., 2006). Nas
observações realizadas, foi verificado o acúmulo de ferro mais concentrado na região
periportal, além de ser verificado também ao longo dos septos de tecido conjuntivo, o que é
esperado considerando-se que esses septos são expansões das regiões portais.
As inclusões nucleares foram consideradas entre os parâmetros histopatológicos por
aparecerem em grande quantidade nos animais submetidos ao tratamento com TAA.
Entretanto, mesmo no grupo controle foram observados os núcleos supercorados pela eosina e
de formato irregular. A ocorrência dessas inclusões não foi encontrada na literatura e sua
natureza permanece desconhecida.
No presente estudo, as análises dos testes comportamentais dos animais injetados com
TAA revelaram que o modelo de cirrose induzida foi capaz de modificar o estado emocional
Tânia C. Lima Discussão -
118
dos animais. De acordo com os resultados obtidos, o tratamento com TAA reduziu o número
de entradas nos braços fechados e o tempo de permanência nos braços abertos do labirinto em
cruz elevado (LCE), a partir da 10
a
semana de tratamento, em relação aos valores obtidos nos
animais não tratados.
O teste comportamental utilizado foi desenvolvido a partir dos trabalhos de
Montgomery (1955) e, tem sido muito utilizado com ratos (PELLOW; FILE, 1985). O LCE é
um dos vários métodos existentes para avaliação do estado emocional, no qual o animal é
colocado no centro do cruzamento das duas plataformas e permanece livre para locomover-se
por elas, por um período de cinco minutos. É importante ressaltar a diferença destas
plataformas: enquanto uma delas é desprotegida, a outra é protegida por paredes laterais.
Assim, quando o animal se locomove pela plataforma protegida, toca as paredes laterais com
suas vibrissas, o que se supõe proporcionar-lhe proteção.
Embora exista nos roedores uma tendência natural por escolher a plataforma protegida
(drive interno, relacionado à segurança), esses animais, sob condições normais (não
estressados), locomovem-se também pela plataforma desprotegida, devido a outro drive
interno e oposto, relacionado a sua curiosidade natural. Segundo Pellow et al. (1985), os
estados emocionais decorrentes de estimulações aversivas ou estressantes podem ser
avaliados pelos locais de maior permanência dos ratos no LCE, ou seja, a menor permanência
nos braços abertos indicaria níveis aumentados de estresse dos animais (FILE; LISTER,
1984).
Assim sendo, o teste é um paradigma comportamental que representa um excelente
método de avaliação do estado emocional. No caso dos resultados obtidos, verificou-se que os
animais tratados com TAA apresentaram menor freqüência de entradas nos braços fechados e
permaneceram por tempo menor nos braços abertos, indicando a sua preferência pela área
protegida, uma vez que exploraram menos a área aberta. Estes resultados permitem sugerir
que o drive interno da segurança estivesse predominando, o que indica o estado de estresse
nos animais devido à doença (LISTER, 1987; HOGG, 1996).
Entretanto, em outros estudos envolvendo cirrose por administração de TAA, não
foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos dados obtidos no LCE
(MÉNDEZ et al., 2008). Uma vez que esses autores adicionaram TAA na água ingerida por
ratos machos e que o aumento na concentração da toxina não obedeceu aos esquemas de
aumento propostos no presente trabalho, as diferenças encontradas podem ser explicadas pela
diferente metodologia empregada nos estudos.
Tânia C. Lima Discussão -
119
Ainda assim, as diferenças comportamentais decorrentes da cirrose induzida por TAA
são compatíveis com as descritas para estresse psicológico seguido de reação anafilática
(PORTELA et al., 2007), para estresse induzido por estimulação elétrica nas patas
(PORTELA et al., 2001, 2002), entre outros estímulos estressores imunológicos (FLESHNER
et al., 1995) e de causa toxicológica (RIGHI; PALERMO-NETO, 2003). Este último trabalho,
o qual também verifica administração de toxinas, apresenta resultados de maior estresse ou
ansiedade dos animais do que os que são apresentados aqui. Porém, a toxina estudada por
esses autores (um piretróide) possui efeitos mais específicos sobre o sistema nervoso, o que
pode justificar essa diferença, aliado ao fato de que trabalharam com animais machos.
Ademais, analisando-se os resultados encontrados entre os diferentes grupos,
verificou-se que o aumento na dosagem de TAA é um agravante no comportamento dos
animais. Na 6ª semana, apesar de não haver diferença estatística entre os grupos, o grupo C
apresentou menor tempo de permanência nos braços abertos, após ser submetido ao primeiro
aumento de dose. Já na 10ª semana, após o aumento de 20% na dose do grupo B e o segundo
aumento do grupo C, o grupo B apresentou os menores valores dos parâmetros
comportamentais avaliados, indicando que o aumento abrupto da dosagem piorou seu estado
emocional. O agravamento repentino da injúria, possivelmente, provoque dores e um
profundo mal estar nos animais, uma vez que posição álgica, baixa responsividade à
manipulação e cromodacriorréia foram registradas.
Entretanto, na 12ª semana observa-se uma recuperação do grupo B com o aumento no
tempo de permanência nos braços abertos, mostrando que os animais recobram a sua
atividade e o seu comportamento de exploração do ambiente. Neste período, o grupo C passou
pelo terceiro aumento de dose e seu tempo de permanência nos braços abertos é
significativamente reduzido. Esta característica de maior estresse, provavelmente, ocorra pelo
mesmo motivo de mal estar causado pelo reforço da injúria ao fígado já comprometido. Na
14ª semana, o grupo B se mantém estável, ao passo que os grupos C e D apresentam menor
tempo de permanência nos braços abertos e menor número de entradas nos braços fechados.
Isto leva a crer que os aumentos progressivos na dosagem de TAA mantêm a injúria constante
e estável ao longo da indução, refletida pela piora do aspecto emocional, impedindo a
adaptação dos animais à droga. A condição de estresse do animal ocorre em função do seu
estado de saúde comprometido pela cirrose hepática.
O grupo B, todavia, não respondeu da mesma forma apresentando melhora do estado
emocional, ao final do experimento, mesmo com o quadro cirrótico estabelecido, conforme
comprovado pelo exame histopatológico. O grupo D, novamente, mostrou-se controverso ao
Tânia C. Lima Discussão -
120
apresentar-se como o mais estressado na última semana de indução, porém com cirrose menos
grave do que os grupos B e C. Este fato sugere que a droga possua efeitos extrahepáticos e
que a cirrose não tenha sido o único fator a influenciar o aspecto comportamental neste
experimento.
No grupo D, era esperado que o quadro cirrótico desenvolvido fosse mais acentuado
do que nos outros grupos. Contudo, o que se observou foram valores de ganho de peso e
bioquímica sanguínea bastante próximos aos dos grupos B e C, com elevada mortalidade e
cirrose macroscópica pouco evidente. Por essas observações, considera-se que, em função da
alta taxa de mortalidade no grupo, dos custos e do tempo despendido na execução do
experimento, os resultados não compensam a adoção deste modelo.
O fato desse grupo ter contrariado as expectativas acerca do desenvolvimento da
cirrose, apresentando resistência à TAA, suscita algumas ponderações que possam explicar
esse fenômeno.
Estudos sugerem que a ativação metabólica da TAA não é dose-dependente devido à
saturação nas etapas de biotransformação dessa toxina, o que ocorre em doses a partir de 300
mg/kg. Além disso, a segunda etapa, a qual forma o composto que reage com as moléculas
teciduais (S-dióxido-TAA), corresponde à etapa menos eficiente da bioativação. Assim, a
injúria não seria mais grave em doses maiores porque somente uma parte do composto
sofreria metabolização, sendo o restante eliminado na urina na forma de TAA ou S-óxido-
TAA (CHILAKAPATI et al., 2005). No presente trabalho, em que o terceiro aumento de dose
atingiu a proporção de 304,1 mg/kg, supõe-se que a saturação tenha sido atingida moderando
a toxicidade e permitindo a sobrevida dos animais que resistiram até essa etapa. Dessa
maneira, como a bioativação não foi proporcional à dose, o rendimento do quadro cirrótico
não foi superior aos outros grupos que passaram por aumentos de dose menores.
Há também a possibilidade de que outros fatores influenciem o desenvolvimento da
cirrose. Experimento com ratos da linhagem Sprague-Dawley e com ratos mutantes Nagase
analbuminêmicos mostra que este último não desenvolve cirrose hepática (DAVID et al.,
2002). Neste caso os pesquisadores não acreditam que o efeito protetor seja devido à ausência
de albumina nesses animais, porque não obtiveram sucesso mesmo com co-administração
dessa proteína. Eles associam a hiperlipidemia e a hipercolesterolemia como fatores de
resistência à toxicidade causada pela TAA, por terem demonstrado que a suplementação de
colesterol na dieta influencia na prevenção de necrose e inflamação (MOREIRA et al., 1995)
e porque os animais Nagase apresentavam níveis mais elevados de triglicérides. No presente
estudo, não foi realizada mensuração de lipídios, mas Guerra (2006) mostrou que os seus
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121
animais controle apresentaram níveis de triglicérides de 72 mg/dL, normais para humanos.
Pode-se questionar que os animais utilizados nos dois experimentos são de linhagens
diferentes, já que Guerra trabalhou com ratos Wistar. Entretanto, os níveis de triglicérides
normais para fêmeas desta linhagem é de 0,33 ± 0,13 mmol/L (GALAS, 2008), o qual
corresponde a 29,37 mg/dL. Mesmo que fossem considerados os valores para machos, 0,51
mmol/L (45,39 mg/dL), esses animais ainda apresentariam lipidemia maior do que o valor
considerado normal para a espécie. Diante desses resultados, talvez os ratos Wistar utilizados
neste estudo apresentem níveis lipídicos mais elevados, influenciando a susceptibilidade à
injúria hepática causada pela TAA.
Contudo, o fator “resistência”, visto neste trabalho como o principal obstáculo na
obtenção do quadro cirrótico desejável, compreende uma série de outras implicações muito
mais complexas. O mecanismo de resistência é muito estudado na carcinogênese, em terapias
anticâncer, pois as células tumorais apresentam grande capacidade de adquirir resistência às
drogas. Uma das formas é o aumento da atividade de detoxificação pelas enzimas
metabolizantes como a glutationa S-transferase e o citocromo P-450. Como já foi dito, a
subfamília de citocromo P-450 CYP2E1 é responsável pela bioativação da TAA. Porém, a
detoxificação é realizada pela subfamília CYP3A4, aliada à glicoproteína-P (PgP), uma
proteína de membrana que transporta as substâncias para fora da célula (MEIJERMAN;
BEIJNEN; SCHELLENS, 2008). É sabido também que drogas que são inativadas no fígado
podem induzir um aumento no retículo endoplasmático liso do hepatócito (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004). Assim, há um aumento na produção de proteínas que aumentarão a
capacidade de detoxificação do órgão. Dessa forma, são vários os fatores que podem ter
resultado na resistência dos animais à TAA e que influenciam o desenvolvimento do quadro
cirrótico nos modelos de indução.
Conquanto esses fatores resultem em frustrações acerca do desempenho metodológico
e dos resultados almejados, eles refletem a potencialidade e a diversidade de estratégias que
um organismo vivo utiliza para se proteger. Esse conjunto de eventos possibilita a
perpetuação da vida e, assim, merecem um olhar de admiração do pesquisador.
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7 CONCLUSÕES
Tânia C. Lima Conclusões -
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7 CONCLUSÕES
Frente aos resultados obtidos, conclui-se que:
? Os aumentos de dose dos grupos B (20% aos 48 dias) e C (10% a cada 24 dias) são
mais eficazes em evitar a recuperação e o ganho de peso dos animais;
? O aumento de dose do grupo D (15% a cada 24 dias) é excessivo, provocando alta
mortalidade e baixo rendimento do quadro patológico;
? Aumentos progressivos na dosagem de TAA afetam mais o estado emocional dos
animais no decorrer da indução da cirrose;
? Cessada a administração da TAA, o fígado tende a se recuperar funcionalmente, mas a
morfologia permanece adequada nos parâmetros que definem a cirrose;
? O tratamento com TAA, independentemente da dosagem, produz lesões pré-
neoplásicas tendo um possível efeito carcinogênico sobre os hepatócitos e sobre o
sistema biliar.
Em uma visão geral, percebe-se que os resultados obtidos com os animais dos grupos
B e C foram muito semelhantes durante todo o experimento e nenhuma diferença marcante foi
observada entre eles. Entretanto, salienta-se o fato de que o grupo B apresentou menor
mortalidade e quadro emocional de menor ansiedade ou estresse. Além disso, foi um método
de indução mais simples, visto que apenas um aumento de dose foi suficiente para se obter os
mesmos resultados do aumento progressivo de 10%.
Portanto, considerando-se a metodologia experimental e os resultados obtidos,
recomenda-se iniciar o tratamento com TAA em dose inicial padronizada de 200 mg TAA/kg
e, após um período inicial de tratamento, aumentá-la em 20%, mantendo-se esta dose até o
final do experimento.
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Tânia C. Lima Anexo -
139
ANEXO
Tânia C. Lima Anexo -
140
ANEXO A – VALORES DE REFERÊNCIA DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
FORNECIDOS PELO ANALISADOR BIOQUÍMICO VetTest® PARA
RATOS
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