ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
MICHELE FERNANDES RODRIGUES
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE DE MACRÓFAGOS
ALVEOLARES EM CAMUNDONGOS BALB/c
INFECTADOS COM CEPAS VIRULENTA E
ATENUADA DE Mycobacterium bovis
Juiz de Fora
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA
Michele Fernandes Rodrigues
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE DE MACRÓFAGOS
ALVEOLARES EM CAMUNDONGOS BALB/c
INFECTADOS COM CEPAS VIRULENTA E
ATENUADA DE Mycobacterium bovis
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Saúde – área de concentração
em Saúde Brasileira do Programa de Pós-
Graduação em Saúde da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Juiz de
Fora, como requisito parcial para a obtenção do
título de Mestre em Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Henrique Couto Teixeira
Juiz de Fora
2008
ads:
MICHELE FERNANDES RODRIGUES
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE DE MACRÓFAGOS ALVEOLARES
EM CAMUNDONGOS BALB/c INFECTADOS COM CEPAS
VIRULENTA E ATENUADA DE Mycobacterium bovis
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado em Saúde – área de concentração
em Saúde Brasileira do Programa de Pós-
Graduação em Saúde da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal de Juiz de
Fora, como requisito parcial para a obtenção do
título de Mestre em Saúde.
Aprovada em: 06/08/2008
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Henrique Couto Teixeira
Universidade Federal de Juiz de Fora
Prof. Dr. Anilton César Vasconcelos
Universidade Federal de Minas Gerais
Prof. Dra. Clarice Abramo
Universidade Federal de Juiz de Fora
Algumas pessoas marcam a nossa vida para sempre, umas porque nos vão
ajudando na construção, outras porque nos apresentam projetos de sonho e outras
ainda porque nos desafiam a construí-los. E muitas vezes quando damos conta, já é
tarde para lhes agradecer, por isso dedico este trabalho...
À memória de Michele Mendes Barsante,
que contribuiu de forma imensurável para a realização deste trabalho, e que apesar
do breve tempo de convivência deixou muitos ensinamentos e muitas saudades.
Aos meus pais Edson e Célia
“O filho que encontra no lar uma escola de amor e trabalho, de disciplina e
compreensão, jamais esquecerá as lições ali aprendidas. Além das palavras de
orientação, é muito importante o exemplo da boa conduta. Por mais duros que sejam
os embates da vida, ele saberá sempre escolher e trilhar os melhores caminhos,
agradecendo aos pais, que souberam educá-lo com amor”.
Obrigada por tudo !!!!!!
Ao meu filho João Pedro
que entrou para a minha vida um pouco antes do início deste trabalho e assim
durante nove meses assistiu aulas, participou de experimentos, leu artigos... Espero
que este contato tão prematuro com o maravilhoso mundo da ciência te inspire um
dia a ser um grande investigador.
Ao meu marido Tarcísio
por estar sempre ao meu lado me apoiando e me incentivando, e por todo carinho
e compreensão.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que se faz presente em cada momento de minha vida, como
um exemplo de força, solidariedade, persistência, compreensão e humildade.
Aos meus pais Edson e Célia, que sempre me apoiaram e contribuíram de diversas
formas para tornar possível a realização deste trabalho.
A minha irmã Gisele, que esteve sempre presente e disposta a ajudar no que fosse
necessário, aos meus irmãos Anderson e Egrison e a todos os meus familiares pelos
momentos felizes e palavras de apoio que renovaram minhas forças a cada dia.
Ao meu marido Tarcísio, por todo amor, carinho, compreensão e incentivo. E ao
nosso filho João Pedro que é a maior alegria de nossas vidas.
Ao Prof. Dr. Henrique Couto Teixeira, pela confiança depositada e por todo o apoio
fornecido para realização deste trabalho.
A Profª Dra. Maria Aparecida de Souza, pela alegria, pelo apoio e por estar sempre
presente e disposta a ajudar.
A Profª Dra. Ana Paula, pela amizade, apoio e incentivo.
Ao Prof. Dr. Gustavo P. Amarante-Mendes pelo fornecimento da Anexina.
Ao Caio pela amizade e por sua colaboração fundamental.
À Rachel, Suelen e Luciano Casali pela amizade e apoio.
Aos velhos e novos amigos que conquistei no Laboratório de Imunologia, Alice,
Alíria, Ana Márcia, Ana Maria, Bruno, Carol, Chico, Estael, Fernando, Juliana, Lívia,
Luciano, Márcio, Marina, Michele Branca, Priscila, Sandra e a todas as pessoas que
de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, o meu sincero
agradecimento.
“Sábio é o homem que conhece alguma coisa
sobre tudo; e tudo sobre alguma coisa. O
mais sábio é aquele que estuda como se
fosse viver eternamente, e vive como se fosse
morrer amanhã”.
Anônimo
RESUMO
Mycobacterium bovis é um membro do complexo Mycobacterium tuberculosis, um
grupo de microorganismos com a capacidade de causar tuberculose em humanos. A
característica marcante das micobactérias patogênicas é a sua habilidade para
sobreviver e replicar dentro do fagossomo do macrófago. A apoptose dos
macrófagos infectados pode ser uma alternativa de defesa do hospedeiro, capaz de
eliminar o ambiente de suporte para o crescimento da micobactéria. No presente
trabalho investigamos, in vivo, a influência da virulência e da carga bacteriana na
ocorrência da apoptose de macrófagos durante a fase inicial da infecção pulmonar
experimental por M. bovis. Camundongos BALB/c foram infectados
intratraquealmente com alta ou baixa carga das cepas virulenta (ATCC 19274) e
atenuada (BCG Moreau) de M. bovis. Após 3 e 7 dias de infecção, avaliamos a
freqüência da apoptose dos macrófagos alveolares e sua correlação com o
crescimento da micobactéria e com os níveis in situ das citocinas TNF-α, IL-10 e IL-
12 e da proteína anti-apoptótica Bcl-2. Foi observado um aumento da apoptose de
macrófagos após a infecção com ambas as cepas. Entretanto, a cepa virulenta
induziu menos apoptose do que a cepa atenuada, sendo que, no 3
o
dia houve
redução da apoptose na infecção com alta carga, enquanto que no 7
o
dia uma maior
inibição ocorreu em baixa carga. Essa inibição da apoptose, promovida pela cepa
virulenta, foi associada com o aumento da produção de IL-10, redução da produção
de TNF-α e aumento da expressão de Bcl-2. Observamos ainda uma menor
produção de IL-12 nos pontos de menor apoptose dos macrófagos o que reforça a
hipótese de que a apoptose das células infectadas contribui para o desenvolvimento
de imunidade específica contra o patógeno. Em conjunto esses dados sugerem que
a cepa virulenta de M. bovis é capaz de modular a apoptose em um modo carga-
dependente de acordo com suas necessidades de crescimento intracelular e
disseminação para células adjacentes.
PALAVRAS CHAVES: Apoptose. Macrófagos. M. bovis. TNF-α. IL-10. Bcl-2.
ABSTRACT
Mycobacterium bovis is a member of the Mycobacterium tuberculosis complex, a
group of organisms with the capacity to cause tuberculosis in humans. The hallmark
of pathogenic mycobacteria is their ability to survive and replicate inside macrophage
phagosome. The apoptosis of macrophages infected can be a host defense
alternative capable of removing the environment supporting bacterial growth. In this
work we investigate, in vivo, the influences of virulence and bacterial load on the
apoptosis of macrophages during the initial phase of experimental pulmonary M.
bovis infection. BALB/c mice were infected intratracheally with high or low doses of
the virulent (ATCC19274) and attenuated (BCG Moreau) strains of M. bovis. The
frequency of apoptosis and the growth of mycobacteria in macrophages from lung
tissue, and the in situ levels of the cytokines TNF-α, IL-10 and IL-12 and of the anti-
apoptotic protein Bcl-2 were measured at day 3 and day 7 postinfection. An increase
of macrophage apoptosis was observed after the infection with both strains, but the
virulent strain induced less apoptosis than the attenuated strain. On the 3rd day of
infection there was a reduction of apoptosis in the infection with high dose, whereas
on the 7th day we found more inhibition in the lower dose. This inhibition of apoptosis
was associated with the increased production of IL-10, reduced production of TNF-α
and increases of Bcl-2. In addition, the production of IL-12 was reduced at the points
of lowest apoptosis of macrophages, which suggests that the apoptosis of the
infected cells contributes to the development of specific immune response against
the pathogen. Our results indicate that the virulent strain of M. bovis is able to
modulate apoptosis in a dose dependent fashion in accordance with its necessities
for intracellular growth and dissemination to adjacent cells.
KEY WORDS: Apoptosis. Macrophages. M. bovis.
TNF-α. IL-10. Bcl-2.
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1 Bacilo da tuberculose e esquema representativo da parede celular
de micobactérias do complexo M. tuberculosis ................................
13
Figura 2
Inibição da fusão do fagossomo-lisossomo pelo Mycobacterium
tuberculosis
........................................................................................................
14
Figura 3 Ativação dos macrófagos na imunidade contra micobactérias......... 15
Figura 4 Alterações celulares nos processos de apoptose e necrose ........... 16
Figura 5 Formação dos corpos apoptóticos e sua remoção pelos fagócitos..
17
Figura 6 Vias de indução da apoptose ...........................................................
19
Figura 7 Análise da apoptose por citometria de fluxo.....................................
33
Figura 8 Número de bacilos em macrófagos infectados com baixa ou alta
carga da cepa virulenta de M. bovis 3 e 7 dias após a infecção.......
39
Figura 9
Apoptose induzida pelo M. bovis 3 e 7 dias após a infecção com
baixa ou alta carga das cepas atenuada e virulenta......................... 41
Figura 10
Produção de TNF-α e IL-10 após 3 e 7 dias de infecção com baixa
ou alta carga das cepas atenuada e virulenta de M. bovis...............
49
Figura 11 Expressão de Bcl-2 em macrófagos do pulmão de camundongos
controles e infectados com baixa ou alta carga das cepas
atenuada e virulenta de M. bovis após 3 e 7 dias de infecção.........
45
Figura 12 Produção de IL-12 após 3 e 7 dias de infecção com baixa ou alta
carga das cepas atenuada e virulenta de M. bovis........................... 46
Tabela 1 Porcentagem de macrófagos
infectados com a cepa virulenta de
M. bovis............................................................................................ 37
Tabela 2 Porcentagem de macrófagos infectados com a cepa atenuad
a de
M. bovis............................................................................................
38
LISTA DE ABREVIATURAS
APC Célula apresentadora de antígenos
ATCC American Type Culture Collection
BALB/c Linhagem de camundongos susceptível à infecção pela micobactéria
BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente
BCG Bacilo Calmette-Guérin
BR10R Linhagem de macrófagos derivados da medula óssea de
camundongos (B10A/Bcg
R
)- resistentes a infecção pela micobactéria
BR10S Linhagem de macrófagos derivados da medula óssea de
camundongos (B10A/Bcg
S
)- susceptíveis infecção pela micobactéria
BSA Albumina de soro bovino
C57BL/6 Linhagem de camundongos susceptível à infecção pela micobactéria
DAB Diaminobenzidina
FITC Isotiocianato de fluoresceína
HE Hematoxilina-Eosina
HIV Vírus da imunodeficiência humana
i.t. Intratraqueal
J774 Linhagem de macrófagos
KI Inibidor de calicreína (Kallikrein inhibitor)
MHC Complexo de histocompatibilidade principal
MOI Multiplicidade de infecção
PBS Salina tamponada com fosfato
PMSF Fluoreto de fenilmetil sulfonil
PI Iodeto de propídeo
RPMI Meio líquido para cultura de células
SFB Soro fetal bovino
sTNFR2 Receptor solúvel para o fator de necrose tumoral
TNFR Receptor para o fator de necrose tumoral
TMB Tetrametilbenzidina
ZVAD
-fmk
Pan-inibidor de caspase
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................. 12
1.1
Epidemiologia da Tuberculose .....................................................................
12
1.2
O Complexo Mycobacterium tuberculosis ...................................................
13
1.3
Infecção e resposta do macrófago ...............................................................
14
1.4
Morte celular por apoptose .......................................................................... 16
1.5
Apoptose durante a infecção pela micobactéria .......................................... 20
2.
OBJETIVOS ...................................................................................................
27
2.1
Objetivo Geral............................................................................................... 27
2.2
Objetivos Específicos ...................................................................................
27
3.
METODOLOGIA ............................................................................................ 28
3.1
Animais .........................................................................................................
28
3.2
Bactérias........................................................................................................
28
3.3
Infecção por via intratraqueal ....................................................................... 29
3.4
Obtenção de células pulmonares .................................................................
30
3.5
Avaliação do crescimento e disseminação da bactéria ................................
31
3.6
Análise da apoptose de macrófagos ............................................................ 32
3.7
Determinação da concentração de citocinas no pulmão ..............................
34
3.8
Detecção imunohistoquímica da proteína anti-apoptótica Bcl-2 .................. 35
3.9
Análise estatística .........................................................................................
36
4.
RESULTADOS................................................................................................
37
4.1
Multiplicação e disseminação da micobactéria em macrófagos alveolares.. 37
4.2
Efeito da alta e baixa carga bacteriana na indução da apoptose de
macrófagos pelas cepas virulenta e atenuada de M. bovis.........................
40
4.3
Produção de TNF-α e IL-10 no pulmão, após infecção com cepas
virulenta e atenuada de M. bovis .................................................................
42
4.4
Aumento de Bcl-2 na infecção com a cepa virulenta de M. bovis ................
44
4.5
Produção de IL-12 após a infecção com a cepa virulenta e atenuada de
M. bovis.........................................................................................................
46
5.
DISCUSSÃO .................................................................................................. 47
6.
CONCLUSÃO................................................................................................. 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................
55
ANEXO ...........................................................................................................
62
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia da Tuberculose
A tuberculose é uma doença de importância mundial e há alguns anos, em
muitos países, foi quase erradicada. No entanto, a ampliação da miséria das
populações desfavorecidas, bem como, a estreita relação da doença com a
pandemia do HIV, facilitaram o recrudescimento da tuberculose em todo o mundo,
contribuindo também para isso o surgimento de cepas multidroga-resistentes (DYE,
2000)
.
A tuberculose é reconhecida como emergência global pela Organização
Mundial de Saúde (OMS) desde 1993, por ser a maior causa de morte de adultos
por doença infecciosa (
LAVOR
, 2008). Estima-se que um terço da população mundial
esteja infectada com a micobactéria causadora da tuberculose. Aproximadamente,
5% desses infectados desenvolvem a doença ativa durante os primeiros anos após
a exposição, o que representa oito milhões de novos casos e três milhões de mortes
a cada ano (ROOK e HERNANDEZ, 1996; RAJA, 2004; KAUFMANN, 2008)
.
O Brasil, segundo a OMS, ocupa o 15º lugar entre os 22 países responsáveis
por 80% do total de casos de tuberculose no mundo (RAVIGLIONE, 2003) e,
segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN/MS),
são registrados, anualmente, 85 mil novos casos no país e cerca de 6 mil óbitos.
13
1.2 O Complexo Mycobacterium tuberculosis
Os bacilos que causam a tuberculose (Fig. 1A) estão agrupados no complexo
Mycobacterium tuberculosis, composto por espécies altamente relacionadas. Este
complexo inclui: M. tuberculosis, principal agente etiológico da tuberculose humana;
M. africanum, causador de tuberculose em humanos na África sub-Saara; M. microti,
causadora de tuberculose em ratos; M. bovis, o qual infecta várias espécies de
mamíferos incluindo o homem; M. bovis BCG, uma variante atenuada do M. bovis e
M. canetti, descendente rara do M. tuberculosis, que causa tuberculose em humanos
(COLE, 2002). Todos os membros do complexo M. tuberculosis apresentam
crescimento lento com um tempo de duplicação de aproximadamente 24 horas. A
lentidão do crescimento parece estar relacionada à absorção mais demorada de
nutrientes, provavelmente devido à complexidade de sua parede celular que
apresenta grande quantidade de lipídeos (BRENNAN, 2003) (Fig. 1B).
B
A
Adaptado de
student.ccbcmd.edu/.../prostruct/u1fig11.html
Figura 1: (A) Micrografia eletrônica de transmissão do bacilo da tuberculose. (B) Esquema representativo
da parede celular de micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. A parede celular desses
bacilos é constituída de grande quantidade de glicolipídeos. A camada de peptideoglicana esta ligada a
arabinogalactanas as quais estão ligadas a ácidos micólicos de alto peso molecular. Esta camada
arabinogalactanas/ácido micólico é ainda coberta com uma camada de polipeptídeos e ácidos micólicos
livres. Outros glicolipídeos incluem lipoarabinomananas e fosfatidilinositol manosideos.
www.wadsworth.org/databank/mycotubr.htm
14
1.3 Infecção e resposta do macrófago
O Mycobacterium tuberculosis, bem como, o Mycobacterium bovis, são
bacilos intracelulares facultativos estritamente aeróbicos, que apresentam uma
predileção pelo tecido pulmonar o qual é ricamente suprimido de oxigênio. O bacilo
entra no organismo principalmente pela via respiratória e a fagocitose da
micobactéria pelos macrófagos alveolares é o primeiro evento na relação patógeno-
hospedeiro (KAUFMANN, 1993; RAJA, 2004). Após a fagocitose, a micobactéria é
retida dentro do vacúolo fagocítico e escapa da resposta imune inibindo a maturação
do fagossomo e evitando sua fusão com o lisossomo (RUSSEL, 2001; KAUFMANN,
2001; WANER e MIZRAHI, 2007; AXELROD et al., 2008) (Fig. 2A). Dessa forma, a
micobactéria sobrevive no interior do fagossomo do macrófago mesmo depois que a
imunidade mediada por células T foi estabelecida. Este ambiente endossomal
protege o bacilo dos mecanismos efetores do hospedeiro e permite sua replicação.
(MCDONOUGH et al., 1993; SCHAIBLE et al., 2003) (Fig. 2B).
Fagossomo
A
B
Figura
2
: (A) Esquema ilustrativo mostrando a inibição da fusão do fagossomo-lisossomo pelo
Mycobacterium tuberculosis, que sobrevive e replica-
se no interior do fagossomo do macrófago.
(B) Micrografia eletrônica mostrando a micobactéria (BCG) contida dentro de um vacúolo circundado
por membrana. Barra 0,2 µm.
Adaptado de fcmfajardo.sld.cu/.../13tuberculosis/anexos.htm
Infection and Immunity, 61: 2763-2773
15
Na tuberculose a resposta do macrófago é muito importante, pois a
micobactéria persiste no interior dessa célula (RUSSEL, 2003). Os macrófagos
infectados promovem o recrutamento de linfócitos T CD4
+
, os quais se diferenciam
em efetores Th1 sob a influência da citocina IL-12 produzida por macrófagos e
células dendríticas (DEMANGEL et al., 2001). Os linfócitos Th1, por sua vez,
promovem a ativação dos macrófagos principalmente através da secreção de IFN-
γ . Os macrófagos ativados dispõem, então, de diversos mecanismos para tentar
controlar e eliminar a bactéria intracelular, incluindo a produção de espécies reativas
de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio (FLYNN e CHAN, 2001) (Fig. 3). A
ativação das células T CD4
+
ocorre aproximadamente 2 a 6 semanas após a
infecção (RAJA, 2004). Portanto, durante os estágios iniciais da infecção, quando a
imunidade específica por células T ainda não foi estabelecida, o controle da
proliferação da micobactéria depende principalmente da resistência natural mediada
por macrófagos (FENTON e VERMEULEN, 1996; MARTINO, 2008). Além dos
mecanismos efetores inatos utilizados por essas células, tem sido demonstrado que
a apoptose dos macrófagos infectados constitui uma estratégia alternativa, que pode
contribuir para a defesa do hospedeiro (MOLLOY et al., 1994; KEANE et al., 2000;
BOCCHINO et al., 2005; LEE et al., 2006).
Figura 3
: Ativação dos macrófagos na imunidade contra micobactérias. A IL-12, produzida por APC’s
estimula a diferenciação das células TCD4
+
naives em célulasT
H
1. Células T
H
1 produzem IFN-γ que
aumenta a atividade microbicida dos macrófagos.
Adaptado do livro Imunologia
Celular e Molecular
16
1.4 Morte celular por apoptose
A apoptose é processo de morte celular geneticamente programado e
altamente controlado. Um dos aspectos marcantes da apoptose, que a distingue da
necrose, é a preservação da integridade da membrana plasmática que evita a
liberação dos constituintes celulares para o meio extracelular (Fig. 4).
Na apoptose ocorre a ativação de proteases endógenas, conhecidas como
caspases. Um dos resultados da ativação dessas cisteíno-proteases é a clivagem de
proteínas estruturais, o que compromete a integridade do citoesqueleto. Ocorre
contração do volume citoplasmático, formam-se projeções (blebs) na membrana
celular e o posicionamento de seus lipídios constituintes é alterado. Em células
viáveis a distribuição de fosfatidilserina se faz primariamente no folheto interno da
membrana plasmática, mas durante o processo de apoptose esse lipídio se expõe
no folheto externo da membrana. O novo posicionamento da fosfatidilserina serve
como sinalizador para que células fagocíticas das proximidades englobem os
Figura 4: Diferentes alterações
celulares nos processos de morte
celular por apoptose e necrose. Na
apoptose ocorre a preservação da
membrana plasmática com
formação dos corpos apoptóticos,
não havendo liberação dos
constituintes celulares. Na necrose
há perda da integridade da
membrana e lise celular com
extravasamento do conteúdo
intracelular e desintegração de
organelas.
17
fragmentos celulares e completem o processo de degradação. Durante a apoptose
ocorrem, também, alterações características no núcleo celular graças à ativação de
endonucleases que degradam o DNA em fragmentos oligonucleossomais. Por fim o
núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana nuclear e as projeções
que se formam no citoplasma separam a célula em fragmentos circundados por
membrana, denominados corpos apoptóticos, que contém partes do núcleo e
organelas intactas e são fagocitados pelos macrófagos teciduais ou células
adjacentes (CREE et al.,1987; PAROLIN e REASON
,
2001; AMARANTE-MENDES,
2003) (Fig. 5).
Figura
5
: Formação dos corpos apoptóticos e sua remoção pelos fagócitos. A ativação de caspases
iniciadoras pela via dos receptores de morte e/ou mitocondrial leva a ativação de caspases executoras
que ativam endonucleases e proteases as quais degradam proteínas nucleares e do citoesqueleto,
resultando em uma cascata de degradação intracelular, incluindo a fragmentação da cromatina nuclear e
o colapso do citoesqueleto. Por fim, ocorre na formação de corpos apoptóticos contendo organelas
intracelulares e outros componentes
citosólicos. Estes corpos apoptóticos expressam novos ligantes para
que sejam reconhecidos e
englobados por células fagocíticas.
Adaptado do livro Pathologic Basis of Disease de Kumar, Abbas e Fausto
18
A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos, através de receptores
específicos localizados na superfície celular, denominados receptores de morte, ou
por estímulos internos de estresse intracelular que resultem em disfunção
mitocondrial. (GREEN, 1998; PAROLIN e REASON
,
2001; AMARANTE-MENDES,
2003). Essas diferentes vias culminam na ativação das caspases que estão
presentes no citosol sob a forma de pró-enzimas inativas, tornando-se ativas após
clivagem proteolítica à altura de resíduos do ácido aspártico (Fig. 6).
Na via de sinalização pelos receptores de morte (via extrínseca) o sinal é
fornecido pela interação entre o ligante e o receptor de morte (GUPTA, 2003).
Grande parte dos receptores de morte pertencem à superfamília de receptores para
o fator de necrose tumoral (TNFR) que inclui diversos receptores, entre eles o
TNFR1 cujo ligante é o TNF-α. Os membros da família TNFR são caracterizados por
apresentar uma porção extracelular rica em cisteína e uma região citoplasmática,
chamada cadeia de morte ("death domain"), essencial para transdução intracelular
do sinal apoptótico e ativação da cascata de caspases (GUPTA, 2003).
A apoptose pode também ser iniciada por sinais de estresse intracelular que
resultem em disfunção mitocondrial (via intrínseca), tais como lesão do DNA,
estresse oxidativo
e privação de fatores de crescimento. Na presença desses sinais
ocorre translocação de proteínas pró-apoptóticas do citosol para mitocôndria, que
alteram a permeabilização da membrana mitocondrial externa resultando na
liberação do citocromo c, presente no espaço existente entre a membrana
mitocondrial externa e interna. No citosol, o citocromo c associa-se ao fator ativador
da apoptose 1 (APAF-1) e à pró-caspase 9 para formar um complexo conhecido
como apoptossomo que, por sua vez, ativará caspases executoras, tal como a
caspase 3 (HENGARTNER, 2000).
19
Adaptado de Nature 407
,
770
-
776
(October 2000)
1
2
Figura 6: Vias de indução da apoptose. A via extrínseca (1) é desencadeada por membros da super-
família de receptores de morte celular (tal como TNFR1 e Fas). Quando os ligantes específicos (TNF-
α e FasL) se acoplam aos seus receptores, as moléculas individuais do receptor se trimerizam
formando um agregado de cadeias de morte. Este permite que as mesmas se liguem a uma proteína
adaptadora presente no citosol, chamada cadeia de morte associada ao receptor TNF (TRADD) ou ao
Fas (FADD). A ligação do complexo à pró-caspase 8 resulta na ativação dessa enzima por clivagem
proteolítica. A caspase-8 pode então, diretamente ou pela via mitocondrial, ativar a caspase-3
(efetora). A ativação da caspase-8 pode ser bloqueada por um competidor denominado c-FILP que
apresenta homologia estrutural com as caspases porém com o sítio catalítico inativo. A via intrínseca
é ativada por sinais de estresse intracelular que resultem em disfunção mitocondrial (tal como danos
no DNA). Ocorre a ativação de proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 (Bax, Bid) que permitem a
liberação do citocromo c da mitocôndria para o citosol e também de outras proteínas que podem
interferir no processo apoptótico tais como SMAC/Diablo, AIF (Fator indutor de apoptose), IAPs
(Proteínas inibidoras de apoptose). No citosol, o citocromo c associa-se com Apaf-1 (Fator ativador de
apoptose 1) e pró-caspase-9, formando apoptossomo que por sua vez ativará a caspase 3. Ambas as
vias de ativação da cascata de caspases culminam na clivagem de substratos específicos que levam
a morte celular por apoptose.
20
1.5 Apoptose durante a infecção pela micobactéria
A ocorrência da apoptose durante a infecção pela micobactéria foi
inicialmente demonstrada por Molloy et al. (1994), os quais constataram que a
apoptose, mas não a necrose, de monócitos infectados reduzia a viabilidade da
micobactéria, sendo sugerido por Keane et al. (1997) que a apoptose dos
macrófagos poderia favorecer o hospedeiro por privar o patógeno de seu refúgio
intracelular. A apoptose também impede a propagação da micobactéria por
seqüestrar e reter o patógeno dentro dos corpos apoptóticos (FRATAZZI et al.,
1999). Além disso, macrófagos apoptóticos infectados podem ser fagocitados por
macrófagos não infectados que, por sua vez, conseguem eliminar a micobactéria
intracelular considerando que a ingestão dos bacilos contidos nos corpos
apoptóticos resulta em aumento do efeito microbicida (FRATAZZI et al., 1997).
Keane et al. (2000) em estudo in vitro com macrófagos alveolares humanos,
testaram um painel de cepas de Mycobacterium de diferentes virulências e
constataram que cepas virulentas tais como M. tuberculosis H37Rv e M. bovis
selvagem induzem, significativamente, menos apoptose do que as cepas atenuadas
M. tuberculosis H37Ra e M. bovis BCG. Verificaram ainda, que o aumento da
apoptose não foi devido à alta taxa de replicação da micobactéria, pois cepas
virulentas cresceram mais rapidamente do que cepas atenuadas, apesar de
causarem menos apoptose nos macrófagos. Sugeriram, então, que a inibição da
apoptose das células do hospedeiro é um fator de virulência associado à
micobactéria, e que a apoptose dos macrófagos contribui para a imunidade na
tuberculose.
21
A capacidade das cepas virulentas de inibir a apoptose dos macrófagos
alveolares pode, razoavelmente, ser relacionada à preservação de um ambiente
intracelular de suporte para o crescimento da bactéria. Inibindo a apoptose dos
macrófagos, a micobactéria também evita seu aprisionamento nos corpos
apoptóticos, que são submetidos à fagocitose secundária por novas células
mononucleares recrutadas e consequentemente a um processamento microbicida
mais efetivo (FRATAZZI et al., 1997; KEANE et al., 2000).
Zhang et al. (2005),
trabalhando com macrófagos J774 infectados com
M. tuberculosis virulento (H37Rv) e atenuado (H37Ra), também constataram que a
cepa virulenta induziu menos apoptose do que a cepa atenuada. Verificaram ainda,
que bacilos da cepa virulenta foram liberados no sobrenadante da cultura em taxas
maiores do que bacilos da cepa atenuada, sendo este fato simultaneamente
acompanhado por aumento da necrose das células infectadas. Sugeriram então, que
o crescimento mais eficiente dos bacilos da cepa virulenta pode ser melhor
relacionado com a necrose do que com a apoptose, pois a necrose dos macrófagos
infectados não elimina a micobactéria e ainda possibilita sua liberação para o meio
extracelular.
Outro fator que parece influenciar na morte celular dos macrófagos infectados
é a carga bacilar. Lee et al. (2006), avaliando, in vitro, o efeito da alta carga
intracelular de M. tuberculosis na viabilidade dos macrófagos, verificaram que a
apoptose em alto MOI (>25 bacilos/macrófago) difere notadamente da apoptose em
baixo MOI (5-10 bacilos/macrófago), uma vez que é TNF-α independente e
potencialmente induzida pelo M. tuberculosis virulento. Além disso, constataram que
a apoptose em alto MOI, progride rapidamente para necrose e não reduz a
22
viabilidade da micobactéria e, portanto, pode constituir um mecanismo para que a
bactéria escape da célula hospedeira.
Além de seu papel na imunidade inata, a apoptose de macrófagos infectados
também parece contribuir para o desenvolvimento da imunidade específica contra a
micobactéria, através da apresentação de antígenos
.
Conforme já mencionado, após
a infecção do macrófago, a micobactéria inibe a fusão fagolisossomal, sobrevivendo
no interior do fagossomo. Este ambiente, além de proteger o patógeno dos
mecanismos efetores do hospedeiro, afasta seus antígenos das vias de
processamento, o que consequentemente prejudica a ativação de células T
(SCHAIBLE et al., 2003).
Entretanto, Schaible et al. (2003) demonstraram que ao entrar em apoptose,
macrófagos infectados com a micobactéria, liberam corpos apoptóticos contendo
antígenos micobacterianos (proteínas e lipídeos). Essas vesículas apoptóticas são
então fagocitadas por APCs não infectadas, incluindo células dendríticas, e dentro
dessas APCs profissionais os antígenos são processados e subseqüentemente
apresentados via MHC I, possibilitando, através de um mecanismo de apresentação
cruzada, a ativação de células T CD8
+
. Constataram ainda que a inibição da
apoptose dos macrófagos infectados, com o inibidor de caspases (ZVAD-fmk),
reduzia a transferência de antígenos para as células apresentadoras, bem como a
ativação de células T CD8
+
. Sugeriram então, que a apoptose dos macrófagos
infectados constitui uma via alternativa para a ativação de células T CD8
+
contra a
micobactéria intracelular (SHAIBLE et al., 2003).
23
Embora as células T CD8
+
possam contribuir na proteção contra a
micobactéria, são as células T CD4
+
que desempenham papel crítico na imunidade
contra este patógeno, o que é confirmado pela grande susceptibilidade de indivíduos
HIV positivos ao M. tuberculosis (SELWIN et al.,1989).
A diferenciação das células T
CD4
+
para o fenótipo Th1 é essencial para que ocorra essa proteção (FAIRBAN,
2004; RAJA, 2004).
Yrlid et al. (2000) observaram, in vitro, que na infecção com Salmonela
typhimurium, antígenos desta bactéria, derivados de macrófagos infectados que
sofreram apoptose, foram apresentados associados a moléculas MHC-I e MHC-II
após internalização dos macrófagos apoptóticos por células dendríticas. Portanto, é
possível que na infecção com a micobactéria, a apresentação cruzada de antígenos
micobacterianos derivados dos macrófagos apoptóticos, também possa contribuir
para a ativação das células TCD4
+
naives através da apresentação de antígenos via
MHC-II por células dendríticas. Para que células TCD4
+
naives se diferenciem para o
fenótipo Th1, protetor na tuberculose, é necessário, além da apresentação de
antígenos, a estimulação pela citocina IL-12 que é produzida por APC’s.
Alguns estudos têm destacado o papel das citocinas Fator de Necrose
Tumoral α (TNF-α) e Interleucina 10 (IL-10), e das proteínas da família Bcl-2 na
modulação da apoptose durante a infecção pela micobactéria (KLINGLER et al.,
1997; ROJAS et al., 1999; SLY et al., 2003).
As citocinas TNF-α e IL-10 possuem efeitos opostos nas muitas funções dos
macrófagos, inclusive durante a infecção por micobactérias, onde o TNF-α parece
estar associado com a atividade micobactericida do macrófago enquanto a IL-10
atua inibindo as funções dos macrófagos. Em relação a apoptose induzida pela
infecção, tem sido observado que o TNF-α e a IL-10 também apresentam papéis
24
antagônicos (ROJAS et al., 1999). O TNF-α atuaria como promotor da apoptose,
sendo que a sua produção parece ser necessária para a indução da apoptose dos
macrófagos alveolares infectados com a micobactéria (KEANE et al., 1997; SPIRA et
al., 2003). Como anteriormente destacado, a transdução de sinais através do
receptor TNFR1 pode induzir a ativação de caspases, as quais são mediadoras da
apoptose. Além disso, o TNF-α também aumenta a síntese de óxido nítrico (NO) em
diferentes células e esta molécula pode estar associada com a indução de dano ao
DNA e apoptose (MACMICKING et al., 1997; CHAN et al., 2001). A citocina IL-10,
por sua vez, possui efeito anti-apoptótico e parece atuar principalmente na inibição
do TNF-α (BALCEWICZ-SABLINSKA et al.,1999).
Rojas et al. (1999) estudando o efeito da infecção pela micobactéria em
macrófagos resistentes (B10R) e macrófagos susceptíveis (B10S), constataram que
macrófagos resistentes foram mais propensos a sofrer apoptose do que os
susceptíveis, após a infecção com a cepa virulenta. Esta apoptose foi associada com
altos níveis de produção de Óxido Nítrico (NO) pelos macrófagos resistentes.
Verificaram ainda, que macrófagos resistentes produziram mais TNF-α após a
infecção, e que macrófagos susceptíveis produziram mais IL-10. O bloqueio do efeito
do TNF-α com anti-TNF inibiu a apoptose e reduziu a ativação de caspase-1, bem
como, a produção do NO, e ainda, aumentou a expressão de Bcl-2. Já o tratamento
com anti-IL-10 aumentou a apoptose e a ativação da caspase 1 e reduziu a
expressão de Bcl-2.
Essas observações sugerem que alterações no balanço de TNF-α e IL-10
podem influenciar tanto nas funções efetoras e acessórias dos macrófagos como na
indução da apoptose ou sobrevida da célula, influenciando consequentemente na
susceptibilidade do hospedeiro à infecção.
25
Outro mecanismo que pode estar envolvido na modulação da apoptose
durante a infecção com a micobactéria, é a regulação da expressão de proteínas da
família Bcl-2 (KLINGLER et al., 1997; SLY et al., 2003). As proteínas da família Bcl-2
constituem um grupo de reguladores apoptóticos que podem tanto inibir como
promover a apoptose. A regulação exercida por essas proteínas ocorre,
basicamente, a nível mitocondrial, uma vez que a mitocôndria guarda no espaço
intermembranoso elementos, tais como o citocromo c, capazes de deflagrar o
processo apoptótico (ARDJOMANDE-LUCKEN e MARTINOU, 2005).
Os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, localizam-se principalmente na
membrana mitocondrial e inibem a morte da célula atuando na manutenção da
integridade da mitocôndria e na regulação da permeabilidade de sua membrana a
pequenas moléculas pró-apoptóticas (AMARANTE MENDES e GREEN, 1999).
Já
os membros pró-apoptóticos, são normalmente encontrados no citosol e quando
ativados, translocam-se para a mitocôndria e alteram a permeabilidade de sua
membrana, permitindo o extravasamento das proteínas pró-apoptóticas (PAROLIN e
REASON, 2001; DLUGOSZ et al., 2006).
Estudos recentes têm demonstrado o aumento de expressão da proteína anti-
apoptótica Bcl-2 em macrófagos infectados com cepas virulentas de micobactéria,
bem como, a redução dessa proteína em macrófagos infectados com cepas
atenuadas, sendo que o nível de Bcl-2 nas células infectadas parece estar
diretamente relacionado com a maior virulência da cepa. Por outro lado, tem sido
verificada a redução da proteína pró-apoptótica Bax em macrófagos infectados com
cepas virulenta ou hipervirulenta de M. tuberculosis (MOGGA et al., 2002;
DANELISHVILI et al., 2003; ZHANG et al., 2005; RÍOS-BARRERA et al., 2006).
26
Enfim, os mecanismos envolvidos na modulação da apoptose dos macrófagos
durante a infecção pela micobactéria são complexos, e parecem incluir tanto sinais
de indução como sinais de inibição da apoptose da célula hospedeira. Muitos
investigadores têm focado sua atenção para tentar elucidar essas questões.
Entretanto, a maioria dos estudos avaliando a importância da apoptose dos
macrófagos durante a infecção pela micobactéria foram feitos in vitro (RÍOS-
BARRERA et al., 2006), permanecendo a dúvida de qual a relevância da modulação
da apoptose dos macrófagos para o ciclo de replicação e disseminação da
micobactéria e as conseqüências dessa modulação na resposta imune inata e
adaptativa. Neste trabalho foi avaliado a influência da virulência e da carga
bacteriana na ocorrência e modulação da apoptose dos macrófagos durante a fase
inicial da infecção pulmonar experimental por M. bovis em camundongos, bem como,
a sua contribuição no desenvolvimento da resposta imune específica contra a
micobactéria.
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar, in vivo, a freqüência e a modulação da apoptose dos macrófagos
alveolares, durante a fase inicial da infecção pulmonar experimental pelas cepas
virulenta e atenuada de Mycobacterium bovis.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a influência da virulência da cepa de Mycobacterium bovis e da carga
bacteriana na freqüência da apoptose dos macrófagos.
• Avaliar o papel das citocinas TNF-α, IL-10 e da proteína anti-apoptótica Bcl-2 na
indução/inibição da apoptose dos macrófagos, durante a infecção dos
camundongos com as cepas virulenta e atenuada de M. bovis.
• Avaliar a contribuição da apoptose dos macrófagos para o desenvolvimento da
imunidade especifica contra a micobactéria.
28
3
METODOLOGIA
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem BALB/c, machos, 8-
10 semanas de idade, provenientes do Biotério do Centro de Biologia da
Reprodução (CBR-UFJF). Os animais foram mantidos no setor de experimentação
do Laboratório de Imunologia do ICB-UFJF dentro de microisoladores
acondicionados em estantes ventiladas (Alesco, Monte Mor, SP - Brasil) e
receberam ração e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados de
acordo com os princípios éticos postulados pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal – COBEA e foram aprovados pelo Comitê de Ética de
Experimentação Animal da UFJF, através do protocolo nº 019/2006-CEA.
3.2 Bactérias
Foram utilizadas duas cepas de Mycobacterium bovis de diferentes
virulências: 1) Cepa atenuada: M. bovis Bacilo Calmette-Guérin (BCG) (subcepa
Moreau), gentilmente cedida pela Fundação Ataupho de Paiva e 2) Cepa Virulenta:
M. bovis tipo selvagem (ATCC 19274), gentilmente cedida pelo Instituto Nacional de
Controle de Qualidade em Saúde (INCQS/Fiocruz/RJ). Ambas as cepas foram
cultivadas em meio Lowenstein-Jensen
(
DIFCO Laboratories, Detroit, MI - USA
)
por
21 dias. Após este período, as colônias foram coletadas, agitadas vigorosamente por
5 minutos em tubo contendo pérolas de vidro estéreis e ressuspendidas em PBS
estéril (Phosphate-Buffered Saline). A concentração da suspensão bacteriana foi
ajustada para 1 × 10
5
ou 1 × 10
7
bactérias em 50 µl de PBS usando a escala padrão
29
de McFarland. A viabilidade do inóculo foi determinada através de diluição da
suspensão e plaqueamento em meio Lowenstein-Jensen.
3.3 Infecção por via intratraqueal
Para cada experimento, os camundongos foram divididos em 5 grupos com 6
animais cada. As cepas atenuada e virulenta de M. bovis, foram administradas sob
duas cargas bacterianas 1×10
5
(baixa carga) ou 1×10
7
(alta carga) (BEKKER, et al.,
2000). Animais controles foram inoculados apenas com PBS. Portanto, foram
constituídos os seguintes grupos:
• cepa atenuada/baixa carga
• cepa atenuada/alta carga
• cepa virulenta/baixa carga
• cepa virulenta/alta carga
• controle
Para estabelecimento da infecção pulmonar, a micobactéria foi injetada por
via intratraqueal de acordo com Soares et al. (2003). Os animais foram anestesiados
por via intraperitoneal com 0,2 ml de solução anestésica contendo 0,9% NaCl, 2%
xilazina e 5% ketamina. A traquéia foi exposta através de uma pequena incisão na
pele e um total de 1 x 10
5
ou 1 x 10
7
bacilos em 50 µl de PBS foram injetados
usando uma microsseringa de 50 µl. A incisão na pele foi fechada com linha
cirúrgica e os camundongos foram mantidos em posição vertical até o término do
efeito da anestesia. Animais infectados foram colocados em gaiolas com
microisoladores. Camundongos controles foram submetidos aos mesmos
procedimentos recebendo como inoculo apenas 50 µl de PBS.
30
3.4 Obtenção de células pulmonares
Três animais de cada grupo foram sacrificados no 3º e no 7º dias após a
infecção, por superdose de anestesia (0.9% NaCl, 2% xilazina, 5% ketamina). Os
pulmões foram então perfundidos por infusão de 10 ml de PBS através do ventrículo
direito do coração, a fim de minimizar a contaminação por sangue. Os pulmões
perfundidos foram assepticamente removidos e divididos de acordo com os
diferentes objetivos. O lóbulo esquerdo do pulmão foi colocado em placa de Petri
contendo meio RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% SFB e mantidos no gelo. Logo
após
,
foi cortado em pequenos pedaços com auxilio de um bisturi e incubado a 37ºC
por 40 minutos em 5 ml de RPMI contendo 2,5 mg/ml de colagenase tipo I (Gibco).
Após o período de incubação, a ação da enzima foi interrompida pela adição de 10
ml de RPMI. A suspensão contendo o pulmão digerido foi filtrada através de uma
tela de nylon de 70 µm (BD), sendo então transferido para um tubo plástico cônico
de 50 ml. A suspensão celular foi então lavada e centrifugada a 1200 rpm/min por 10
min. Para lisar as hemácias contaminantes, as células foram ressuspendidas em 1
ml de tampão de lise contendo NH
4
Cl 0,16 M e Tris-HCl 0,17 M pH 7,2 (9:1) e
incubadas à temperatura ambiente por 5 minutos. Logo após, as células foram
lavadas, centrifugadas e ressuspendidas em RPMI e mantidas no gelo. A contagem
de células viáveis do pulmão foi feita pelo método de exclusão por azul de Trypan.
31
3.5 Avaliação do crescimento e disseminação da bactéria
As micobactérias são bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR), o que significa
que durante os procedimentos de coloração pela fucsina, não se deixam descorar
por uma mistura de álcool e ácido clorídrico. Esta propriedade parece ocorrer devido
à firme fixação da fucsina a certos lipídeos da parede. O método para se verificar se
uma bactéria é um BAAR é o de Ziehl-Neelsen. Este método consiste em se tratar o
esfregaço por fucsina e, em seguida por uma mistura de álcool (97%) e ácido
clorídrico (3%). Depois de lavado com água, o esfregaço é corado com azul de
metileno. As bactérias que retêm a fucsina (BAAR) adquirem a cor deste corante
(vermelho), e as demais estruturas celulares se coram pelo azul de metileno.
Como alternativa para mensurar o crescimento e a disseminação da
micobactéria, realizou-se a coloração de Ziehl-Neelsen em lâminas preparadas por
citocentrifugação das células pulmonares obtidas pela digestão enzimática. O
número de macrófagos contendo a micobactéria de um total de 100 macrófagos por
amostra foi registrado e o número de bacilos em cada macrófago infectado foi
pontuado em 1 a 5 bacilos/macrófago, 5 a 10 bacilos/macrófago e >10
bacilos/macrófago. A partir desses dados, a porcentagem de macrófagos infectados
e a porcentagem de macrófagos infectados com os diferentes números de bacilos
por célula foram calculados. A ocorrência de disseminação da bactéria entre o 3º e o
7º dias foi verificada com base na alteração da porcentagem de macrófagos
infectados entre os dois pontos (ZHANG, et al., 1998).
32
3.6 Análise da apoptose de macrófagos
Para avaliar a freqüência da apoptose dos macrófagos no pulmão dos
camundongos infectados e controles, foi utilizada a técnica de detecção com
Anexina-V, que permite identificar as células apoptóticas com base na exposição da
fosfatidilserina. A fosfatidilserina é um aminofosfolipídeo normalmente presente no
folheto interno da membrana plasmática que altera seu posicionamento, sendo
exposto no folheto externo da membrana, logo no início da cascata apoptótica
(MARTIN et al., 1995). A Anexina-V, por sua vez, é uma proteína de 35 kDa com alta
afinidade pela fosfatidilserina. A exposição da fosfatidilserina ocorre tanto nos
estágios iniciais da apoptose como nas células em necrose. O que torna possível a
diferenciação entre esses dois processos é a reação entre o iodeto de propídeo (PI)
e o DNA nuclear, que ocorrerá de acordo com o estado de integridade da membrana
plasmática. O PI é um corante fluorescente que cora DNA e não cruza a membrana
plasmática de células viáveis ou nos estágios iniciais da apoptose, pois nestas
células a integridade da membrana plasmática é mantida. Em células necróticas,
ocorre a perda da integridade da membrana, que se torna permeável, permitindo
assim a entrada do PI e sua reação com o DNA nuclear.
Através do uso do citômetro de fluxo com análise bivariada, é possível avaliar
simultaneamente as diferentes populações de células: aquelas coradas com Anexina
V marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC), que mostra fluorescência verde
e aquelas coradas com iodeto de propídeo (PI), que possuem fluorescência
vermelha. Assim, identificam-se três populações celulares distintas: as células
viáveis (ANEX V
-
/PI
-
), as células apoptóticas (ANEX V
+
/PI
-
) e as células necróticas
(ANEX V
+
/PI
+
).
33
Após 3 e 7 dias de infecção, as células pulmonares obtidas por digestão
enzimática, como anteriormente descrito, foram lavadas com 500 µl de solução
tampão de Anexina (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl
2
, 1,8 mM
CaCl
2
) e posteriormente ressuspendidas em 100 µl de tampão Anexina contendo
Anexina-V
FITC
a uma concentração final de 1:500. A solução foi agitada suavemente
e incubada por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após este período,
foram adicionados em cada tubo, 400µl de solução tampão Anexina e 40 µl
(100µg/ml) de PI. As amostras foram então mantidas no gelo e imediatamente
analisadas em citômetro de fluxo (FacScalibur-BD). Para a população controle,
foram utilizadas células não marcadas (autofluorescência), células marcadas
somente com Anexina-V
FITC
e células marcadas somente com PI. Foram adquiridas
50.000 eventos para a análise.
A população de macrófagos foi selecionada segundo suas características de
tamanho (FSC
=
Foward Scatter) e granulosidade (SSC
=
Side Scatter) (Fig. 7A). Dot
plot Anexina-V e PI desta população foram gerados e a porcentagem de macrófagos
apoptóticos (Anexina V
+
/ PI
-
) foi determinada (Fig. 7B).
APOPTÓTICAS
A
Figura 7: Análise da apoptose por citometria de fluxo. (A) Dot plot FSC/SSC das células pulmonares. A
região R1 representa a população de macrófagos. (B) Dot plot AnexinaV/PI da região R1 (macrófagos).
B
Células
necróticas
Células
apoptóticas
Células
viáveis
34
3.7 Determinação da concentração de citocinas no pulmão
Para avaliar a correlação entre a apoptose e as citocinas produzidas no
pulmão durante a infecção pelo Mycobacterium bovis, foi realizada a dosagem da
concentração de TNF-α, IL-10 e IL-12p40 no pulmão dos animais infectados e
controles, usando o método de ELISA de acordo com as instruções fornecidas pelo
fabricante (BD OptEIA, CA, USA) e conforme a técnica descrita em Soares et al.
(2003). O lóbulo apical e o lóbulo cardíaco do pulmão foram coletados e
armazenados a -20ºC. Posteriormente, as amostras foram descongeladas e 100 mg
de pulmão de cada animal foram homogeneizados em 1 ml de PBS-Tween 20
(0,05%) contendo antiproteases (0,1 mM PMSF, 0.1 mM cloreto de benzetônio, 10
mM EDTA e 20 KI aprotinina A). As amostras foram então centrifugadas por 10
minutos a 3000 x g e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -20ºC para
posterior detecção das citocinas através da técnica de ELISA de captura, descrita a
seguir.
Placas de ELISA (NUNC) foram sensibilizadas com o anticorpo de captura,
anti-TNF, anti-IL-10 ou anti-IL-12p40, diluídos em tampão fosfato pH 6.5 segundo as
normas do fabricante (BD OptEIA, CA, USA), e incubadas por 18h a 4°C. Após este
período, as placas foram lavadas com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (PBST) e
os sítios inespecíficos foram bloqueados com PBS contendo 10% SFB, por 1 hora.
Novamente, as placas foram lavadas em PBST e as amostras de homogeneizados
de pulmão, diluídas na razão de 1:5, foram adicionadas e incubadas por 18h a 4°C.
Terminada a incubação as placas foram lavadas. Em seguida o complexo detector
formado pelo anticorpo de detecção biotinilado mais o conjugado estreptavidina-
peroxidase foi adicionado e as placas incubadas por mais 1 hora à temperatura
35
ambiente. Após lavagens adicionais, a reação foi revelada pela adição da solução
substrato contendo TMB e peróxido de hidrogênio. A reação foi interrompida com
ácido sulfúrico 1M e a leitura foi realizada em leitor de placas (SPECTRAMAX 190,
Molecular Devices, USA) a 450 nm. As quantidades de citocinas foram calculadas a
partir das curvas-padrão, obtidas pelas diferentes concentrações das citocinas
recombinantes.
3.8 Detecção imunohistoquímica da proteína anti-apoptótica Bcl-2
Para investigar o envolvimento da proteína anti-apoptótica Bcl-2 na
modulação da apoptose dos macrófagos alveolares, durante a infecção pelo
Mycobacterium bovis, foi realizada detecção imunohistoquímica dessa proteína no
pulmão dos animais infectados e controles. O lóbulo diafragmático do pulmão de
cada animal foi fixado em solução de formol tamponado 10% por 24 horas. Após os
procedimentos rotineiros para inclusão em parafina, foram obtidos cortes de 4µm de
espessura, os quais foram capturados em lâminas silanizadas e submetidos ao
procedimento imunohistoquímico pelo método estreptavidina-biotina-peroxidase
conforme descrito nas etapas a seguir: (1) desparafinização e rehidradratação dos
cortes de pulmão; (2) recuperação antigênica em forno de microondas utilizando
tampão citrato 10mM, pH 6,0 por 2 ciclos de 9 minutos (3) bloqueio da peroxidase
endógena com H
2
O
2
3% por 10 minutos; (4) bloqueio de reações inespecificas pela
incubação com PBS/BSA 2% (5) incubação com anticorpo primário policlonal coelho
anti-Bcl-2/camundongo (BD Biosciences Pharmigen) na diluição 1:1000 por 18h a
4ºC em câmara úmida; (6) incubação com anticorpo secundário biotinilado cabra
anti-coelho (BD Biosciences Pharmigen) na diluição 1:200 por 30 minutos; (7)
36
incubação com o complexo estreptavidina-peroxidase por 30 minutos à temperatura
ambiente; (8) revelação utilizando-se o substrato cromógeno diaminobenzidina
(DAB) por 2 a 5 minutos; (9) contracoloração com Hematoxilina de Harris e (10)
desidratação e montagem das lâminas.
Para quantificação dos macrófagos alveolares expressando a proteína anti-
apoptótica Bcl-2, foram analisados cinco campos aleatórios (aumento x400) do
pulmão de cada animal. Considerou-se marcação positiva a coloração distinta em
marrom (coloração com DAB) no citoplasma celular em contraposição ao azul/violeta
da contracoloração (coloração com hematoxilina). Os macrófagos positivos para Bcl-
2 (citoplasma fortemente corado de marrom) e negativos (citoplasma azul) foram
contados manualmente e os dados expressos em porcentagem de macrófagos
positivos para Bcl-2.
3.9 Análise estatística
Os resultados aqui apresentados representam pelo menos dois experimentos
independentes e foram expressos como média ± SEM. As variáveis numéricas foram
avaliadas nos diferentes grupos pelo teste de normalidade de D’Agostino & Pearson
para distribuição gaussiana dos dados. Foi utilizado o teste não paramétrico de
Mann-Whitney para determinação das diferenças significativas entre os grupos de
camundongos, com nível de significância menor que 5% (p<0,05). Para todas as
análises foi utilizado o programa GraphPad Prism 5.00.
37
4 RESULTADOS
4
.1 Multiplicação e disseminação da micobactéria em macrófagos alveolares
Para avaliar a multiplicação e disseminação da micobactéria, as células
pulmonares obtidas por digestão enzimática foram citocentrifugadas e coradas pelo
método de Ziehl-Nielsen, e a porcentagem de macrófagos infectados com diferentes
números de micobactéria foram calculados no 3º e 7º dias após a infecção.
Na infecção com a cepa virulenta observou-se que no 3º dia a porcentagem
de macrófagos infectados foi semelhante tanto na infecção com baixa carga como
na infecção com alta carga (Tabela 1). Em ambas as condições de carga bacteriana,
a maioria dos macrófagos infectados continham menos de 5 bacilos (Fig. 8A).
Entretanto, a porcentagem de macrófagos infectados com mais de 5 ou mais de 10
bacilos foi 5 vezes maior na infecção com alta carga (Fig. 8A).
Tabela 1: Porcentagem de macrófagos infectados
com a cepa virulenta de M. bovis
Tempo de
infecção
Baixa carga Alta carga
3 dias
32 34
7 dias
34 50
No 7º dia de infecção com baixa carga, a porcentagem de macrófagos
infectados não alterou expressivamente, subindo de 32% para 34% (Tabela 1).
Constatou-se ainda que a maioria (84%) dos macrófagos infectados continha de 5 a
10 bacilos (Fig. 8B), indicando que entre o 3º e o 7º dia de infecção com baixa carga
da cepa virulenta houve multiplicação, mas não disseminação da micobactéria para
macrófagos adjacentes. Já na infecção com alta carga, a porcentagem de
38
macrófagos infectados, aumentou de 34% para 50% entre o 3º e o 7º dias de
infecção (Tabela 1). Além disso, foi observado que a maioria (67%) dos macrófagos
infectados continham mais de 10 bacilos e que 29% dos macrófagos apresentavam
menos de 5 bacilos (Fig. 8B), indicando que entre o 3º e o 7º dias de infecção com
alta carga, além da multiplicação ocorreu disseminação da micobactéria para outros
macrófagos.
Na infecção com a cepa atenuada a porcentagem de macrófagos infectados
foi semelhante em ambas as condições de carga bacteriana, tanto no 3º como no 7º
dias de infecção, ficando em torno de 20% (Tabela 2) e a maioria dos macrófagos
infectados continham um único bacilo.
Tabela 2: Porcentagem de macrófagos infectados
com a cepa atenuada de M. bovis
Tempo de
infecção
Baixa carga Alta carga
3 dias
19 20
7 dias
18 21
39
Figura 8: Número de bacilos em macrófagos infectados com baixa ou alta carga da cepa
virulenta de M. bovis 3 (A) e 7 (B) dias após a infecção. Células pulmonares obtidas por digestão
enzimática foram citocentrifugadas e coradas pelo método de Ziehl-Neelsen. Aproximadamente 100
macrófagos por amostra foram contados e o número de bacilos (setas) em cada macrófago infectado
foi pontuado em 1 a 5 bacilos/macrófago (C), 5 a 10 bacilos/macrófago (D) e > 10 bacilos/macrófago
(E). (C, D e E x1000)
C
D
E
0
20
40
60
80
100
1-5
5-10
> 10
A
3º Dia
___________ ___________
Baixa Carga Alta Carga
% macrófagos
0
20
40
60
80
100
B
7º Dia
___________ ___________
Baixa Carga Alta Carga
% macrófagos
40
4.2 Efeito da alta e baixa carga bacteriana na indução da apoptose de
macrófagos pelas cepas virulenta e atenuada de M. bovis.
Para avaliar in vivo a influência da virulência e da carga bacteriana na
freqüência da apoptose dos macrófagos, camundongos foram infectados i.t. com a
cepa virulenta ou com a cepa atenuada de M. bovis, em duas cargas bacterianas
1x10
5
(baixa carga) e 1x10
7
(alta carga). Após 3 e 7 dias de infecção, a porcentagem
de macrófagos alveolares apoptóticos foi determinada por citometria de fluxo.
Observou-se que nos grupos infectados com ambas as cepas de M. bovis ocorreu
um aumento significativo (
p<0,05
) da apoptose dos macrófagos quando comparado
aos controles não infectados, tanto no 3º dia como no 7º dia de infecção com baixa
ou alta carga (Fig. 9).
Ao comparar os grupos infectados, constatou-se que em geral as taxas de
macrófagos apoptóticos foram menores na infecção com a cepa virulenta quando
comparado com a cepa atenuada, exceto no 3º dia de infecção com baixa carga,
onde a cepa virulenta induziu mais apoptose do que a cepa atenuada, 52% e 37%
respectivamente. Entretanto, no 7º dia, a taxa de macrófagos apoptóticos na
infecção com a cepa virulenta reduziu para 25% enquanto que na infecção com a
cepa atenuada aumentou para 56% (Fig. 9).
Analisando o efeito da carga bacilar sobre a apoptose dos macrófagos,
observou-se que no 3º dia de infecção com a cepa virulenta, houve redução da
apoptose na infecção com alta carga e inversamente no 7º dia uma maior inibição foi
observada na infecção com baixa carga. Em conjunto esses resultados sugerem que
a inibição da apoptose promovida pela cepa virulenta é carga-dependente e pode
estar relacionada com seu ciclo de replicação.
41
0
20
40
60
80
100
Alta CargaBaixa Carga
_______ _______
Alta CargaBaixa Carga
_______ _______
_________________ _________________
Controle
3º Dia
7º Dia
*
*
*
*
*
*
*
____
____
____
**
A
cepa atenuada
cepa virulenta
% macrófagos apoptóticos
**
**
55%
61%
25%
52%
37%
3º Dia
7º Dia
Baixa
Carga
Alta
Carga
Cepa
atenuada
Cepa
virulenta
Cepa
virulenta
Anexina
-
V
PI
Cepa
atenuada
56%
64%
40%
B
Figura 9: Apoptose de macrófagos alveolares induzida pelo
M. bovis
3 e 7 dias após a infecção
com baixa ou alta carga das cepas atenuada e virulenta de
M. bovis
. Células pulmonares de
camundongos BALB/c infectados com baixa (10
5
) ou alta (10
7
) carga de micobactéria atenuada (
M.
bovis
BCG) e virulenta (
M.bovis
tipo selvagem) foram obtidas por digestão enzimática e marcadas
com Anexina-V e iodeto de propídeo (PI) para análise através de citometria de fluxo. Macrófagos
foram selecionados com base em suas características de tamanho e granulosidade. Dot plots
Anexina V/PI destas populações de macrófagos foram gerados. Células plotadas no quadrante
inferior esquerdo (Anexina V
-
/PI
-
) são viáveis, no quadrante inferior direito (Anexina V
+
/PI
-
) são
apoptóticas e células no quadrante superior direito (Anexina V
+
/PI
+
) são necróticas. (A) Cada barra
representa a media aritmética ± SEM de 6 camundongos e os resultados são representativos de dois
diferentes experimentos. * infectado
×
controle, ** cepa atenuada
×
cepa virulenta, p<0,05. (B) Dot
plots de amostras representativas são mostrados.
42
4.3 Produção de TNF-
α
αα
α
e IL-10 no pulmão, após infecção com cepas virulenta e
atenuada de
M. bovis
A fim de avaliar a participação das citocinas TNF-α e IL-10 na
indução/inibição da apoptose durante a infecção pela micobactéria, foi realizada a
dosagem dessas citocinas em homogeneizado do tecido pulmonar. Como mostra a
figura 10A, a produção de TNF-α aumentou significativamente (p<0,05) após a
infecção com as cepas atenuada e virulenta de M. bovis. No 3º dia de infecção com
baixa carga a cepa virulenta induziu significativamente mais TNF-α do que a cepa
atenuada
.
Inversamente, no 7º dia de infecção com baixa carga, a cepa virulenta
induziu significativamente menos TNF-α do que a cepa atenuada.
Em relação a produção de IL-10, observou-se um aumento expressivo na
produção dessa citocina somente na infecção com a cepa virulenta, enquanto que
na infecção com a cepa atenuada o nível de IL-10 permaneceu próximo ao do
controle não infectado (Fig. 10B).
Ao correlacionar a produção de TNF-α e IL-10 (Fig. 10) com as taxas de
apoptose observadas no 3º e 7º dia de infecção (Fig. 9), foi constatado que, na
infecção com a cepa atenuada, ocorreu aumento significativo de TNF-α mas não de
IL-10 e altos índices apoptóticos foram observados. Já na infecção com a cepa
virulenta, embora tenha ocorrido aumento significativo de ambas as citocinas,
observou-se redução dos índices apoptóticos nos pontos onde foram registrados
altos níveis de IL-10 e níveis menores de TNF-α.
43
Figura 10: Produção de TNF-
α
α α
α
(A) e IL-10 (B) após 3 e 7 dias de infecção com baixa ou alta
carga das cepas atenuada e virulenta de
M. bovis
. As citocinas TNF-
α
e IL-10 em homogeneizado
do pulmão de camundongos infectados e controles foram mensuradas pelo método de ELISA. Cada
barra representa a media aritmética ± SEM de 6 camundongos e os resultados são representativos de
dois diferentes experimentos. * infectado
×
controle, ** cepa atenuada
×
cepa virulenta, p < 0,05.
0
1000
2000
3000
cepa atenuada
cepa virulenta
Baixa Carga Alta Carga
Controle
________
__________________
3º Dia
____
________
Baixa Carga Alta Carga
*
*
*
*
*
________ ________
__________________
7º Dia
*
*
____
**
**
A
TNF - pg/ml
0
1000
2000
3000
________ ________ ________ ________
__________________
3º Dia
__________________
7º Dia
____
**
____
**
____
**
____
**
*
*
*
*
Baixa Carga Alta Carga
Baixa Carga Alta Carga
B
IL-10 (pg/ml)
44
4.4 Aumento da expressão de Bcl-2 na infecção com a cepa virulenta de
M.
bovis
A expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em macrófagos, foi avaliada no
pulmão dos animais infectados e controles através de imunohistoquímica, a fim de
investigar a participação dessa proteína na regulação da apoptose induzida pelo
M. bovis. Observou-se que a expressão de Bcl-2 não foi alterada após a infecção
com a cepa atenuada, mas aumentou significativamente na infecção com a cepa
virulenta no 3° dia de infecção com alta carga e no 7º dia de infecção com baixa
carga (Fig. 11). É interessante notar que, na infecção com a cepa virulenta, os níveis
de Bcl-2 foram maiores nos pontos nos quais foram registrados níveis elevados de
IL-10, sugerindo uma possível influência dessa citocina na expressão dessa proteína
anti-apoptótica.
45
Figura 11: Expressão de Bcl-2 em macrófagos do pulmão de camundongos controles e
infectados com baixa ou alta carga das cepas atenuada e virulenta de
M. bovis
após 3 e 7 dias
de infecção. A expressão de Bcl-2 em macrófagos alveolares foi avaliada através de
imunohistoquímica. (A) Cada barra representa a media aritmética ± SEM de 6 camundongos e os
resultados são representativos de dois diferentes experimentos. * p<0,05. Imunohistoquímica para
Bcl-2 em seções representativas do pulmão de camundongos controles (B) e infectados (C e D).
Macrófago negativo (ponta de seta) e macrófagos positivos (seta) para Bcl-2 são facilmente
detectados no tecido pulmonar (X1000).
A
0
20
40
60
80
100
Baixa Carga Alta Carga
_______ _______ _______ _______
________________
3º Dia
________________
7º Dia
Controle
*
*
cepa atenuada
cepa virulenta
Baixa Carga Alta Carga
% positividade de Bcl-2 em macrófagos
B C D
46
4.5 Produção de IL-12 após a infecção com a cepa virulenta e atenuada de
M. bovis
Estudos prévios, in vitro, mostraram que vesículas apoptóticas de macrófagos
infectados com a micobactéria estimulam a produção de IL-12 por células
dendríticas (WINAU et al., 2006). Portanto, a seguir foi realizada a dosagem de IL-
12p40 no pulmão dos camundongos infectados e controles.
A infecção com a cepa atenuada não elevou significativamente os níveis de
IL-12. Entretanto, na infecção com a cepa virulenta registrou-se aumento significativo
na produção dessa citocina, exceto no 7º dia de infecção com baixa carga (Fig. 12).
É interessante notar que na infecção com a cepa virulenta, a produção de IL-12 foi
maior nos pontos onde foram registrados altos índices de apoptose de macrófagos e
menor nos pontos onde os índices apoptóticos foram mais baixos.
0
500
1000
1500
Baixa Carga Alta Carga
_______ _______ _______ _______
________________
3º Dia
________________
7º Dia
cepa atenuada
cepa virulenta
*
*
*
Controle Baixa Carga Alta Carga
IL-12 - pg/ml
Figura 12: Produção de IL-12 após 3 e 7 dias de infecção com baixa ou alta carga das cepas
atenuada e virulenta de
M. bovis
. A citocina IL-12 em homogeneizado do pulmão de camundongos
infectados e controles foi mensurada pelo método de ELISA. Cada barra representa a media
aritmética ± SEM de 6 camundongos e os resultados são representativos de dois diferentes
experimentos. * p < 0,05
47
5
DISCUSSÃO
Neste trabalho foi investigada, in vivo, a influê
ncia da virulência do
Mycobacterium bovis e da carga bacteriana sobre a indução da apoptose de
macrófagos do pulmão e sua correlação com os níveis in situ das citocinas TNF-α,
IL-10 e IL-12 e da proteína anti-apoptótica Bcl-2.
Foi observado um aumento da apoptose de macrófagos no pulmão dos
animais infectados em relação aos controles não infectados, indicando que a
infecção com o M. bovis constitui um estímulo para indução da apoptose dos
macrófagos. Recentes estudos sugerem que este mecanismo de morte celular pode
contribuir na defesa do hospedeiro, uma vez que a apoptose do macrófago infectado
significa a perda do ambiente de proteção e replicação da micobactéria (KEANE et
al., 2000; RIOS-BARRERA et al., 2006). Foi constatado in vitro que a apoptose, mas
não a necrose, de macrófagos infectados reduz a viabilidade da micobactéria e limita
seu o crescimento (MOLOY et al., 1994; ZHANG et al., 2005). Além disso, impede a
disseminação da infecção por seqüestrar e reter o bacilo dentro dos corpos
apoptóticos que são ingeridos por fagócitos não infectados e assim eliminados
(FRATAZZI et al., 1999).
Constatou-se in vivo que a cepa virulenta induziu menos apoptose de
macrófagos do que a cepa atenuada, confirmando a capacidade de inibição da
apoptose dos macrófagos infectados como fator de virulência associado ao
Mycobacterium (KEANE et al., 2000; ZHANG et al., 2005). Adicionalmente, foi
verificado pela primeira vez in vivo que essa modulação da apoptose promovida pela
cepa virulenta foi carga-dependente, visto que, nos diferentes tempos de infecção
48
avaliados ocorreu uma variação das taxas apoptóticas em função da carga
bacteriana.
Diferentes estudos in vitro forneceram evidências de que a carga bacteriana
pode influenciar na apoptose de macrófagos induzida pela micobactéria.
Primeiramente foi relatado que em baixo MOI (5-10 bacilos por macrófago) cepas
virulentas induzem menos apoptose do que cepas atenuadas (KEANE et al., 2000).
Entretanto, posteriormente foi verificado que em alto MOI (> 25 bacilos por
macrófago) a cepa virulenta apresenta igual ou maior citotoxidade do que a cepa
atenuada (LEE et al., 2006). Foi constatado ainda que a apoptose em alto MOI,
diferente da apoptose em baixo MOI, não reduz a viabilidade da micobactéria e
progride rapidamente para necrose, permitindo a liberação e disseminação
extracelular do Mycobacterium virulento no hospedeiro. Lee et al. (2006) sugeriram
então, que uma vez que a infecção dos macrófagos foi estabelecida e o crescimento
intracelular ótimo alcançado, a prioridade do M. tuberculosis virulento deve mudar
para favorecer o crescimento extracelular.
Neste estudo, avaliou-se, in vivo, o efeito de duas cargas de bacilos em dois
tempos de infecção diferentes, o que possibilitou a formulação de hipóteses sobre a
relação entre quantidade de bacilos e a modulação da apoptose de macrófagos.
Os resultados obtidos sugerem que a inibição ou indução da apoptose do
macrófago promovido pela cepa virulenta pode refletir suas necessidades de
crescimento intracelular e saída da célula hospedeira durante a fase de replicação e
disseminação inicial no hospedeiro, sendo essa inibição ou indução da apoptose
estritamente dependente do número de bactérias no interior da célula. Assim, no 3º
dia de infecção com baixa carga, constatou-se que a maioria dos macrófagos
estavam infectados com menos de 5 bacilos e não foi observada inibição da
49
apoptose pela cepa virulenta, possivelmente, porque nesta condição, o número de
bacilos no interior do macrófago ainda era insuficiente para promover o mecanismo
de inibição. Entretanto, neste mesmo dia, na infecção com alta carga, onde a
porcentagem de macrófagos infectados com mais bacilos foi maior, já se observa
uma redução da apoptose dos macrófagos. No 7º dia de infecção com baixa carga
foi observada maior inibição da apoptose e a predominância de macrófagos
infectados com 5 a 10 bacilos, sugerindo que este seria um momento onde estaria
ocorrendo grande replicação da bactéria e portanto a necessidade de prolongar a
viabilidade da célula hospedeira. Em contraste, na infecção com alta carga, a
maioria dos macrófagos infectados continham mais de 10 bacilos, número
provavelmente suficiente para promover a disseminação da bactéria para outros
macrófagos. Neste caso, é possível que os mecanismos de inibição da apoptose,
atuantes quando a carga intracelular ainda é baixa, são cessados, o que explicaria o
aumento das taxas apoptóticas, e conforme demonstrado por Lee et al. (2006) a
ocorrência de necrose secundária favoreceria a saída da bactéria da célula
hospedeira.
Portanto, é provável que durante a fase inicial da infecção pelo M. bovis
virulento, quando a carga bacilar intracelular ainda é baixa, é fundamental para a
micobactéria promover a inibição da apoptose dos macrófagos, pois ao manter a
viabilidade dessas células o patógeno garante o ambiente intracelular para seu
crescimento, que permitirá uma replicação intracelular mais prolongada. Entretanto,
quando a carga bacilar intracelular torna-se suficientemente alta, o que pode ser
atingido após um determinado período de replicação, a prioridade do bacilo passa a
ser a disseminação extracelular. Neste momento, uma morte celular apoptótica com
rápida progressão para necrose serve como um mecanismo de escape da
50
micobactéria, já que na necrose, diferente da apoptose, a integridade da membrana
celular não é mantida.
A participação das citocinas TNF-α e IL-10 na modulação da apoptose
induzida pela micobactéria tem sido demonstrada in vitro (ROJAS et al., 1999;
SPIRA et al., 2003; ARCILA et al., 2007). Neste estudo, observou-se in vivo que a
indução da apoptose dos macrófagos foi associada a maior produção de TNF-α,
enquanto a inibição foi dependente do aumento da produção de IL-10. Foi
constatado que sempre que o aumento da produção de TNF-α foi maior do que o de
IL-10, o que ocorreu principalmente nos grupos infectados com a cepa atenuada,
houve uma maior indução de apoptose. Inversamente quando a produção de IL-10
aumentou e a de TNF-α reduziu, observou-se uma tendência de inibição da
apoptose dos macrófagos. A maior inibição da apoptose, na infecção com a cepa
virulenta, ocorreu justamente no ponto onde foi observado aumento significativo de
IL-10, mas não de TNF-α. Em conjunto esses resultados reforçam a hipótese de
que o balanço na produção de TNF-α e IL-10 influencia a indução ou inibição da
apoptose de macrófagos durante a infecção pela micobactéria (ROJAS et al., 1999),
sendo que o aumento da produção de IL-10 promovido pela cepa virulenta, pode
representar um mecanismo chave para promover a inibição da apoptose dos
macrófagos.
Consistente com os resultados obtidos neste trabalho, Balcewicz-Sablinska et
al. (1998) constataram, in vitro, que a cepa virulenta de M. tuberculosis H37Rv
induziu maior produção de IL-10 do que a cepa atenuada H37Ra e que apesar de
ambas as cepas induzirem níveis comparáveis de TNF-α, a bioatividade do TNF-α
foi reduzida na infecção com H37Rv. Posteriormente, sugeriu que a IL-10 reduz a
apoptose dos macrófagos através da inibição da produção de TNF-α e por induzir a
51
liberação de sTNFR2, o qual leva a inativação do TNF-α (BALCEWICZ-SABLINSKA
et al.
, 1999). Esses autores verificaram ainda que inibição significativa da produção
de TNF-α pela IL-10 produzida endogenamente começou 12 horas após a infecção
dos macrófagos, possivelmente porque a produção de IL-10 inicia-se
aproximadamente 8 horas mais tarde do que a produção de TNF-α.
O efeito anti-apoptótico da IL-10 pode ter sido exercido não só pela inibição e
inativação de TNF-α, mas também pelo aumento da expressão da proteína anti-
apoptótica Bcl-2, pois, conforme observado, o nível de expressão dessa proteína
aumentou na infecção com a cepa virulenta nos pontos onde foi observada maior
produção de IL-10. Em contraste, na infecção com a cepa atenuada, a expressão de
Bcl-2 permaneceu em nível basal semelhante ao observado em relação à produção
de IL-10. O aumento da expressão de Bcl-2 após a infecção com a cepa virulenta de
Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) também foi constatado por outros autores
(MOGGA et al., 2002; ZHANG et al., 2005; RIOS-BARRERA et al., 2006).
Adicionalmente, foi demonstrada que a IL-10 é capaz de aumentar a expressão de
Bcl-2, impedindo a apoptose espontânea de células T (COHEN et al., 1997) e de
células B dos centros germinativos. (LEVY e BROUET, 1994). Além disso, Rojas et
al. (1999) relatou que o tratamento com anti-IL-10 reduziu a expressão de Bcl-2 em
macrófagos resistentes (BR10) infectados com M. tuberculosis virulento.
Além de sua importância na imunidade inata, a apoptose de macrófagos
infectados também parece contribuir para o desenvolvimento da imunidade
específica contra a micobactéria, pois foi demonstrado que ao entrar em apoptose,
macrófagos infectados liberam corpos apoptóticos contendo antígenos
micobacterianos que são fagocitados por células dendríticas não infectadas,
processados e subseqüentemente apresentados via MHC I, possibilitando através
52
de um mecanismo de apresentação cruzada, a ativação de células T CD8
+
(SHAIBLE et al., 2003; WINAU et al., 2005).
No presente trabalho, para avaliar se a apoptose dos macrófagos infectados
também pode contribuir para a ativação de linfócitos T CD4
+
, foi realizada a
dosagem de IL-12p40 no pulmão. Esta citocina é produzida por APC’s quando estão
apresentando antígenos a células T, sendo essencial para a polarização da resposta
de linfócitos T CD4
+
para o perfil T
H
1, protetor contra micobactérias (DEMANGEL et
al., 2001; HICKMAM et al., 2002). Constatou-se que a produção de IL-12 aumentou
significativamente somente na infecção com a cepa virulenta. Além disso, notou-se
que a produção dessa citocina foi menor nos pontos onde os índices de macrófagos
apoptóticos foram mais baixos e maior nos pontos de maior apoptose, sugerindo que
a apoptose dos macrófagos infectados com M. bovis também pode contribuir para a
produção de IL-12,
favorecendo a ativação e desenvolvimento de células Th1.
Recentes estudos têm demonstrado que, em resposta a infecção com o
M. tuberculosis, células dendríticas liberam grandes quantidades de IL-12, enquanto
que em macrófagos a secreção dessa citocina é limitada, sendo sugerido que a IL-
10 é responsável por essa falha na produção de IL-12 por macrófagos (HICKMAM et
al., 2002; POMPEI et al., 2007). Além disso, foi demonstrado que células dendríticas
são as principais APCs responsáveis pela apresentação cruzada de antígenos
associados aos corpos apoptóticos de macrófagos infectados com a micobactéria
(SCHAIBLE et al., 2003; WINAU et al., 2004). Essas células produzem quantidades
significativas de IL-12 quando em contato com essas vesículas apoptóticas, sendo
essa produção diretamente proporcional à quantidade de vesículas disponíveis
(WINAU et al., 2006). Então, com base nos resultados aqui encontrados, pode-se
especular que uma porção significativa da IL-12, detectada no pulmão dos animais
53
infectados com a cepa virulenta de M. bovis, foi produzida por células dendríticas
durante a apresentação cruzada de antígenos derivados de vesículas apoptóticas,
visto que a produção dessa citocina não foi anulada pela IL-10 e foi estimulada pela
ocorrência da apoptose dos macrófagos. Portanto, é possível que a inibição da
apoptose dos macrófagos promovida pela cepa virulenta de M. bovis, reduza a
apresentação cruzada de antígenos e consequentemente a produção de IL-12,
prejudicando a ativação e diferenciação de células T CD4
+
para o perfil Th1.
Consistente com esses resultados, Shaible et al. (2003), ao demonstrar o
papel da apoptose na ativação de células T CD8
+
, observaram in vitro que a inibição
da apoptose dos macrófagos infectados após tratamento com o inibidor de caspases
Zvad-fmk, reduzia a transferência de antígenos para as células apresentadoras, bem
como a ativação de células T CD8
+
.
Na infecção com a cepa atenuada, não foi observado elevação significativa da
produção de IL-12. Outros já haviam descrito que a capacidade para expressar IL-12
em resposta ao BCG é deficiente em camundongos BALB/c quando comparados
com C57Bl/6, embora ambas as cepas exibam fenótipo de susceptibilidade ao BCG
(YOSHIDA et al., 1995).
54
6 CONCLUSÃO
1. A infecção pulmonar com M. bovis constitui um estímulo para a indução da
apoptose de macrófagos alveolares;
2. A cepa virulenta parece dispor de estratégias para modular essa apoptose. Ao
inibir a apoptose ela favorece sua replicação intracelular ao prolongar a
sobrevivência da célula hospedeira. Após um período de replicação e crescimento
intracelular suficiente, essa inibição parece ser cessada e neste cenário a ocorrência
da apoptose pode favorecer a saída da bactéria da célula hospedeira e
disseminação para células adjacentes;
3. O aumento da produção de IL-10 é fundamental para promover a inibição da
apoptose do macrófago. A IL-10 parece atuar inibindo o fator pró-apoptótico TNF-α e
estimulando o fator anti-apoptótico Bcl-2.
4. A redução da produção de IL-12 nos pontos de menor apoptose dos macrófagos
reforça a hipótese de que a apoptose das células infectadas contribui para a
apresentação de antígenos e desenvolvimento de resposta específica frente à
micobactéria.
55
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
AMARANTE-MENDES, G.P., GREEN, D.R. The regulation of apoptotic cell death.
Braz. J. Med. Biol. Res.
, 32:1053-1061, 1999.
AMARANTE-MENDES, G.P. Apoptose: Programa molecular de morte celular.
Einstein
, 1:15-18, 2003.
ARCILA, M.L., SÁNCHEZ, M.D., ORTIZ, B., BARRERA, L.F., GARCIA, L.F., ROJAS,
M. Activation of apoptosis but no necrosis during Mycobacterium tuberculosis
infection correlated with decreased bacterial growth: role of TNF-α, IL-10, caspases
and phospholipase A2.
Cell. Immunol
., 249:80-93, 2007.
ARDJOMANDE-LUCKEN, S., MARTINOU, J. C. Regulation of Bcl-2 proteins and of
the permeability of the outer mitochondrial membrane.
C. R. Biologies
, 328:616-631,
2005.
AXELROD, S., OSCHKINAT, H., ENDERS, J., SCHLEGEL, B., BRINKMANN, V.,
KAUFMANN, S.H.E., HAAS, A. , SCHAIBLE, U. E. Delay of phagosome maturation by a
mycobacterial lipid is reversed by nitric oxide.
Cell. Microbiol.
,
10:1530-1545, 2008.
BALCEWICZ-SABLINSKA, M., KEANE, J., KORNEFELD, H., REMOLD. H.
Pathogenic Mycobacterium tuberculosis evades apoptosis of host macrophages by
release of TNF-R2, resulting in inactivation of TNF-α.
J. Immunol.
, 161:2636:264,
1998.
BALCEWICZ-SABLINSKA, M.K., GAN, H., REMOLD, H.G. Interleukin 10 produced
by macrophages inoculated with Mycobacterium avium attenuates mycobacteria
induced apoptosis by reduction of TNF-α activity.
J. Infect. Dis.
, 180:1230-1237,
1999.
BEKKER, L.G., MOREIRA, A.L., BERGTOLD, A., FREEMAN, S., RYFFEL, B.,
KAPLAN, G. Immunopathologic effects of tumor necrosis factor alpha in murine
mycobacterial infection are dose dependent.
Infect. Immun.
, 68:6954–6961, 2000.
BOCCHINO, M., GALATI, D., SANDUZZI, A., COLIZZI, V., BRUNETTI, E.,
MANCINO, G. Role of mycobacteria-induced monocyte/macrophage apoptosis in the
pathogenesis of human tuberculosis.
Int. J. Tuberc. Lung Dis.
,
9:375-383, 2005.
56
BRENNAN, P.J. Structure, function, and biogenesis of the cell wall of
Mycobacterium tuberculosis.
Tuberculosis
, 83:91-97, 2003.
CHAN, E.D., CHAN, J.S., SCHLUGER, N.M. What is the role of nitric oxide in murine
and human host defense against tuberculosis? Current knowledge.
Am J Respir.
Cell. Mol. Biol.
, 25:606-612, 2001.
COHEN, S.B.A., CRAWLWY, J.B., KAHAN, M.C., FELDMANN, M., FOXWELL. M.J.
Interleukin-10 rescues T cells from apoptotic cell death: association with an
upregulation of Bcl-2.
Immunology
, 92:1-5, 1997.
COLE, S.T., Comparative and functional genomics of the Mycobacterium
tuberculosis complex.
Microbiology
, 148:2919-2928, 2002.
CREE, I. A., NURBHAI, S., MILNE, G. BECK, J. S. Cell death in granulomata: the
role of apoptosis.
J. Clin. Pathol.
, 40:1314-1319, 1987.
DANELISHVILI, L., MCGARVEY, J., LI, Y.J., BERMUDEZ, L.E. Mycobacterium
tuberculosis infection causes different levels of apoptosis and necrosis in human
macrophages and alveolar epithelial cells.
Cell. Microbiol.
, 5:649-660, 2003.
DELAMARE, L., HOLCOMBE, H., MELLMAN, I. Presentation of exogenous antigens
on major histocompatibility complex (MHC) class I and MHC class II molecules is
differentially regulated during dendritic cell maturation.
J. Exp. Med
., 198:111-122,
2003.
DEMANGEL, C., PALENDIRA, U., FENG, C. G., HEATH, A. W., BEAN, A. G. D.,
BRITTON, W. J. Stimulation of Dendritic cells via CD40 enhances immune responses
to Mycobacterium tuberculosis infection.
Infect. Immun
., 69:2456-2461, 2001.
DLUGOSZ, P.J., BILLEN, L.P., ANNIS, M.G., ZHU, W., ZHANG, Z., LIN, J., LEBER,
B., ANDREWS, D.W. Bcl-2 changes conformation to inhibit Bax oligomerization.
EMBO J.
, 25:2287-2296, 2006.
DYE, C. Tuberculosis 2000-2010: control, but not elimination.
Int. J. Tubercu Lung
Dis.
, 4:146-152, 2000.
FAIRBAIRN, I.P. Macrophages apoptosis in host immunity to mycobacterial
infections.
Biochem. Soc. Trans.
, 32:496-197, 2004.
57
FENTON, M.J., VERMEULEN, M.W. Immunopathology of tuberculosis: roles of
macrophages and monocytes.
Infect. Immun.
, 64:683-691, 1996.
FLYNN, J. L., CHAN, J. Immunology of tuberculosis.
Annu. Rev. Immunol.
, 19:93-
129, 2001.
FRATAZZI, C., ARBEIT, R.D., CARINI, C., REMOLD, H.G. Programmed cell death of
Mycobacterium avium serovar 4-infected human macrophages prevents the
mycobacteria from spreading and induces mycobacterial growth inhibition by freshly
added, uninfected macrophages.
J. Immunol.
, 158:4320-4327, 1997.
FRATAZZI, C., ARBEIT, R.D., CARINI, C., BALCEWICZ-SABLINSKA, M.K., KEANE,
J., KORNFELD, H., REMOLD, H.G. Macrophage apoptosis in mycobacterial
infections.
J. Leukoc. Biol.
, 66:763-764, 1999.
FULTON, A.S., MARTIN, T.D., REDLINE, R.W., BOOM, W.H. Pulmonary immune
responses during primary Mycobacterium bovis - Calmette-Guerin bacillus infection
in C57Bl/6 mice.
Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol
., 22:333-343, 2000.
GREEN, D.R., REED, J.C. Mitochondria and apoptosis.
Science
, 281:1309-1312,
1998.
GUPTA, S. Molecular signaling in death receptor and mitochondrial pathways of
apoptosis (Review).
Inter. J. Oncol.
, 22:15-23, 2003.
HENGARTNER, M. O. The biochemistry of apoptosis.
Nature
, 407: 770-777, 2000.
HICKMAN, S.P., CHAN, J., SALGAME, P. Mycobacterium tuberculosis induces
differential cytokine production from dendritic cells and macrophages with divergent
effects on naive T cell polarization.
J. Immunol
., 168:4636-4642, 2002.
KAUFMANN, S.H.E. Immunity to intracellular bacteria.
Annu. Rev. Immunol.
,
11:129-163, 1993.
KAUFMANN, S. H. E. How can immunology contribute to the control of tuberculosis?
Nat. Rev. Immunol
., 1:20-30, 2001.
KAUFMANN, S.H.E. Tuberculosis: Deadly combination.
Nature
, 453:295-296, 2008.
58
KEANE, J., BALCEWICZ-SABLINSKA, M.K., REMOLD, H.G., CHUPP, G.L., MEEK,
B.B., FENTON, M.J., KORNFELD, H. Infection by Mycobacterium tuberculosis
promotes human alveolar macrophage apoptosis.
Infect. Immun.
, 65:298-304, 1997.
KEANE, J., REMOLD, H.G., KORNFELD, H. Virulent Mycobacterium tuberculosis
strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages.
J. Immunol.
, 164:2016-
2020, 2000.
KLINGLER, K., TCHOU-WONG, K., BRANDLI, O., ASTON, O., KIM, R., CHI, C.,
ROM, W. Effects of mycobacteria on regulation of apoptosis in mononuclear
phagocytes.
Infect. Immun.
, 65:5272-5278, 1997.
LAVOR, A. Tuberculose: Ainda uma doença negligenciada.
RADIS
,
69: 18-20, 2008.
LEE, J., REMOLD, H.G., IEONG, M.H., KORNFELD, H. Macrophage apoptosis in
response to high intracellular burden of Mycobacterium tuberculosis is mediated by a
novel caspase-independent pathway.
J. Immunol.
, 176:4267-4274, 2006.
LEVY, Y., BROUET, J.C. Interleukin-10 prevents spontaneous death of germinal
center B cells by induction of the bcl-2 protein.
J. Clin. Invest
., 93:424-428, 1994.
MACMICKING, J.D., NORTH, R.J., LACOURSE, R., MUDGETT, J.S., SHAH, S.K.,
NATHAN, C.F. Identification of nitric oxide synthase as a protected locus against
tuberculosis.
Proc. Natl. Acad. Sci.
, 94:5243-5248, 1997.
MARTIN, S. J., REUTELINGSPERGER, C. P. M., McGAHON, A. J., RADER, J. A.,
SCHIE, R. C. A. A., LaFACE, D. M., GREEN, D. R. Early redistribution of plasma
membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the
initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl.
J. Exp. Med
.,
182:1545-1556, 1995.
MARTINO, A. Mycobacteria and innate cells: critical encounter for immunogenicity.
J. Biosci
., 33:137-144, 2008.
MCDONOUGH, K.A., KRESS, Y., BLOOM, B.R. Pathogenesis of Tuberculosis:
Interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages.
Infect. Immun
.,
61:2763-2773, 1993.
59
MOGGA, S.J., MUSTAFA, T., SVILAND, L., NILSEN, R. Increased Bcl-2 and
reduced Bax expression in infected macrophages in slowly progressive primary
murine Mycobacterium tuberculosis infection.
Scand. J. Immunol.
, 56:383-391,
2002.
MOLLOY, A., LAOCHUMROONVORAPONG, P., KAPLAN, G. Apoptosis, but not
necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus
Calmette-Guérin.
J. Exp. Med.
, 180:1499-1509, 1994.
PAROLIN, M.B., REASON, I.J.M. Apoptose como mecanismo de lesão nas doenças
hepatobiliares.
Arq. Gastroenterol.
, 38:138-144, 2001.
POMPEI, L., JANG, S., ZAMLYNNY, B., RAVIKUMAR, S., MCBRIDE, A., HICKMAN,
S. P., SALGAME, P. Disparity in IL-12 release in dendritic cells and macrophages in
response to Mycobacterium tuberculosis is due to use of distinct TLRs.
J. Immunol
.,
178:5192-5199, 2007.
RAJA, A. Immunology of tuberculosis.
Indian J. Med.
Res.
, 120:213-232, 2004.
RAVIGLIONE, M.C. The TB epidemic from 1992 to 2002.
Tuberculosis
, 83:4-14,
2003.
RÍOS-BARRERA, A.V.R., CAMPOS, V.P., AGUILAR, D.L., LASCURAIN, R.L.,
MERAZ, M.A.R., MORENO, J., FIGUEROA, V.G., HERNANDEZ-PANDO, R.
Macrophage and T lymphocyte apoptosis during experimental pulmonary
tuberculosis: their relationship to mycobacterial virulence.
Eur. J. Immunol.
, 36:345-
353, 2006.
ROJAS, M., OLIVIER, M., GROS, P., BARRERA, L. F., GARCÍA, L.F. TNF-α and IL-
10 modulate the induction of apoptosis by virulent Mycobacterium tuberculosis in
murine macrophages.
J. Immunol.
, 162:6122-6131, 1999.
ROOK, G.A.W., HERNADEZ-PANDO, R. The pathogenesis of tuberculosis.
Annu
Rev Microbiol.
, 50:259-284, 1996.
RUSSELL D.G. Mycobacterium tuberculosis: here today, and here tomorrow.
Nat.
Rev.
Molec. Cell. Biol.
, 2:1-9, 2001.
RUSSELL, D.G. Phagosomes, fatty acids and tuberculosis.
Nat. Cell Biol
., 5:776-
778, 2003.
60
SCHAIBLE, U.E., WINAU, F., SIELING, P.A., FISCHER, K., COLLINS, H.L.,
HAGENS, K., MODLIN, R.L., BRINKMANN, V., KAUFMANN, S.H.E. Apoptosis
facilitates antigen presentation to T lymphocytes through MHC-I and CD1 in
tuberculosis.
Nat. Med.
, 9:1039-1046, 2003.
SELWIN, P.A., HARTEL, D., LEWIS, V. A., SCHOENBAUM, E.E., VERMUND, S.H.,
KLEIN, R.S., WALKER, A.T., FRIEDLAND, G.H. A prospective study of risk of
tuberculosis among intravenous drug users with human immunodeficiency virus
infection.
N. Engl. J. Med.
, 320:545-550, 1989.
SLY, L.M., HINGLEY-WILSON, S.M., REINER, N.E., MCMASTER, W.R. Survival of
Mycobacterium tuberculosis in host macrophages involves resistance to apoptosis
dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1.
J. Immunol.
,
170:430-437, 2003.
SOARES, A.C., SOUZA, D.G., PINHO, V., VIEIRA, A.T. , BARSANTE, M.M.,
NICOLI, J. R., TEIXEIRA, M. Impaired host defense to Klebsiella pneumoniae
infection in mice treated with the PDE4 inhibitor rolipram.
Brit. J. Pharmacol.
,
140:855-862, 2003.
SPIRA, A., CARROL, J.D., LIU, G., AZIZ, Z., SHAH, V., KORNFELD, H., KEANE, J.
Apoptosis genes in human alveolar macrophages infected with virulent or attenuated
Mycobacterium tuberculosis. A pivotal role for Tumor Necrosis Factor.
Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol
., 29:545-551, 2003.
WARNER, D.F. e MIZRAHI, V. The survival Kit of Mycobacterium tuberculosis.
Nature Medice,
13:282-284, 2007.
WINAU, F., KAUFMANN, S.H.E., SCHAIBLE, U.E. Apoptosis paves the detour path
for CD8 T cell activation against intracellular bacteria.
Cell. Microbiol.
, 6:599-607,
2004.
WINAU, F., HEGASY, G., KAUFMANN, S.H.E., SCHAIBLE, U.E. No life without
death – apoptosis as prerequisite for T cell activation.
Apoptosis
, 10:707-715, 2005.
WINAU, F., WEBER, S., SAD, S., DIEGO, J., HOOPS, S.L., BREIDEN, B.,
SANDHOFF, K., BRINKMANN, V., KAUFMANN, S.H.E., SCHAIBLE, U.E. Apoptotic
vesicles crossprime CD8 T cells and protect against tuberculosis.
Immunity
, 24:105-
117, 2006.
61
YRLID, U., WICK, M.J. Salmonella-induced apoptosis of infected macrophages
results in presentation of a bacteria-encoded antigen after uptake by bystander
dendritic cells.
J. Exp. Med
., 191:613-624, 2000.
YOSHIDA, A., KOIDE, Y., UCHIJIMA, U., YOSHIDA, T. O. Dissection of strain
difference protective immunity against Mycobacterium bovis Calmette-Guerin bacillus
(BCG). Macrophages regulate the susceptibility through cytokine network and the
induction of nitric oxide synthase.
J. Immunol
., 155:2057-2066, 1995.
ZHANG, J., JIANG, R., TAKAYAMA, H., TANAKA Y. Survival of Virulent
Mycobacterium tuberculosis involves preventing apoptosis induced by Bcl-2
upregulation and release resulting from necrosis in J774 macrophages.
Microbiol.
Immunol.
, 49:845-852, 2005.
ZHANG, M., GONG, J., LIN, Y., BARNES, P.F. Growth of virulent and avirulent
Mycobacterium tuberculosis strains in human macrophages.
Infect. Immun.
, 66:794-
799, 1998.
62
ANEXO
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
