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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS
SÃO JOSÉ DO RIO PRETO - SP
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
THAISE YARA MAGOSSI MASSURA
Anatomia do Aparelho Reprodutor Masculino de
Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus (Anura,
Hylidae) durante o ciclo reprodutivo
ORIENTADOR: PROF. DR. CLASSIUS DE OLIVEIRA
- 2008 -
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista, para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Animal.
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2
“É melhor tentar e falhar,
a preocupar-se e ver a vida passar.
É melhor tentar, ainda que em vão,
a sentar-se nada fazendo até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
do que em dias tristes, em casa me esconder.
Prefiro ser feliz embora louco,
que em conformidade viver.”
Martin Luther King
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Dedico
A Deus pela vida, por me iluminar e me proporcionar tantas
oportunidades.
Aos meus pais Pedro (in memoriam) e Inêz, que me ensinaram à
diferença do bem e do mal e me conduziram sempre pelo caminho do bem. Por
terem me proporcionado o estudo, acreditando ser a Educação o maior
patrimônio que se pode legar.
As minhas irmãs Lara e Yeda pelo apoio, carinho e amor que recebi
durante todo tempo.
4
Agradecimentos
A Deus por toda inspiração concedida, por toda força dada nos momentos
difíceis e por tantas benções derramadas que me fizeram acreditar que quando
desejamos verdadeiramente a realização de um sonho é possível.
Ao Prof. Dr. Classius de Oliveira, pela indispensável orientação, por todos os
ensinamentos, pela dedicação e paciência. Seu apoio foi imprescindível para
realização deste trabalho e, sem dúvida, para o meu aprimoramento
profissional.
A minha família que muitas vezes sem me entender me apoiaram. Minha
gratidão será eterna.
Aos professores que compuseram a banca do Exame de Qualificação: Dra.
Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira e Dra. Ester Tartarotti, pelas críticas,
sugestões e palavras incentivadoras.
Á Lia Raquel pelo coleguismo e amizade demonstrados de forma grandiosa na
confecção da dissertação.
Aos demais colegas do Laboratório Lilian, Rafaela e Rodrigo pela ajuda, pelos
momentos de descontração e apoio.
5
Aos colegas Fausto e Thiago pela ajuda durante as coletas dos animais,
respeito e carinho.
Ao técnico Luiz Roberto Falleiros Júnior pela ajuda, eficiência e dedicação no
laboratório.
Aos amigos do programa de pós-graduação em Biologia Animal pelo
companheirismo em disciplinas, simpósios e viagens.
A Capes pelo apoio financeiro.
“Cada pessoa que passa em nossa vida é única, sempre deixa
um pouco de si e leva um pouco de nós”.
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SUMÁRIO
I – RESUMO...................................................................................................................07
II – ABSTRACT...............................................................................................................09
III – INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................11
IV – OBJETIVOS.............................................................................................................18
V – REFERÊNCIAS.........................................................................................................19
VI – CAPÍTULO 1............................................................................................................24
1. Anatomia do Aparelho Reprodutor Masculino de Dendropsophus minutus e
Dendropsophus nanus (Anura, Hylidae) durante o ciclo reprodutivo
VII – CAPÍTULO 2.............................................................................................................54
2. Análise dos testículos e das células de Leydig durante o ciclo reprodutivo de
Dendropsophus minutus (Anura, Hylidae)
7
RESUMO
Atualmente são conhecidos três grupos de anfíbios: as salamandras (Caudata),
as cobras-cegas (Gymnophiona) e os anuros (Anura). O Brasil é o país com a
maior diversidade de anfíbios do planeta, com mais de 850 espécies de anuros,
das quais 65% são endêmicas. Para anuros há muitos trabalhos que relatam o
comportamento reprodutivo, mas poucos foram desenvolvidos para descrever a
biologia reprodutiva com ênfase em análise morfológica testicular. Neste
estudo, o objetivo geral foi descrever a morfologia testicular de Dendropsophus
minutus e Dendropsophus nanus e, relacionar dados da análise biométrica das
gônadas às condições climáticas do ano, verificando assim se há variação
destas estruturas. Os animais foram coletados mensalmente entre maio de
2006 e abril de 2007, por meio de excursões noturnas no Município de
Palestina–SP, Brasil. Dados de natureza biométrica, como comprimento (cm) e
peso (g) total do indivíduo, comprimento (mm) e peso (g) total das gônadas;
peso (g) do fígado, estômago e intestino, foram obtidos e correlacionados entre
si e com as variáveis climáticas (temperatura do ar, pluviosidade, umidade
relativa do ar e fotoperíodo). Os testículos foram fixados em solução de Bouin e
posteriormente incluídos em historesina de acordo com protocolo de técnicas
histológicas. Testes estatísticos foram empregados para análise e interpretação
dos resultados. Os testículos das espécies em estudo são pequenos,
esbranquiçados, de forma ovalada e se encontram na cavidade abdominal,
localizados na região cranial dos rins. Estatisticamente não houve variação
intra-individual no comprimento e peso dos animais como também não
ocorreram variações na biometria testicular, corpos adiposos, fígado, estômago
8
e intestino. Todos estes parâmetros apresentaram-se correlacionados aos
fatores ambientais. Em relação às células de Leydig houve diferença estatística
tanto na área quanto na quantidade das células ao longo do ciclo reprodutivo.
Os dados obtidos com o estudo contribuem para o conhecimento dos aspectos
relacionados à biologia reprodutiva dos anuros.
9
ABSTRACT
Currently three groups of amphibians are known: the salamanders, the charge-
blind and the anurans. Brazil is the country with the biggest diversity of
amphibians of the planet, with more than 850 species of anurans, of which 65%
are endemic. There are many studies related to anurans reproductive behavior,
but few of them had been developed to describe reproductive biology with
emphasis in morphologic analysis of the testis. In this study the general
objective was to describe the testicular morphology of Dendropsophus minutus
and Dendropsophus nanus and to relate given of the biometric analysis of the
gonads ones to the climatic conditions of the year, thus verifying has some
variation of these structures. The animals had been collected monthly between
May 2006 and April 2007, by means of nocturnal excursions in the City of
Palestine-SP, Brazil. Data of biometric nature, as length (cm) and total weight
(g) of the individual, length (mm) and total weight (g) of the gonads ones; weight
(g) of the liver, stomach and intestine, had been gotten and correlated between
itself and with the climatic variable (temperature of air, rainfall, relative humidity
of air and photoperiod). The testicles had been fixed in solution of Bouin and
later enclosed in historesin in accordance with protocol of histology techniques.
Statistical tests had been used for analysis and interpretation of the results. The
testicles of the species in study are small, whitish, of oval form and if they find in
the abdominal socket, located in the cranial region of the kidneys. Statistical it
did not have individual variation in the length and weight of the animals had as
well as not occurred variations in the biometric to testicular, fatty bodies, liver,
stomach and intestine. All these parameters had been presented correlated to
1
0
the ambient factors. In relation to cells of Leydig it had difference in such a way
statistics in the area how much in the amount of the cells throughout the
reproductive cycle. The data gotten with the study contribute for the knowledge
of the aspects related to the reproductive biology of the anurans.
11
1. INTRODUÇÃO
1.1 Panorama geral dos anfíbios
A classe Amphibia (Gray, 1825) foi o primeiro grupo de vertebrados a
conquistar o ambiente terrestre, há cerca de 350 a 400 milhões de anos, no
período Devoniano e apresenta-se dividida em três subclasses:
Labyrinthodontia, Lepospondyli e Lissamphiba (Linzey, 2001; Pough et al.,
2003). As subclasses Labyrinthodontia, Lepospondyli foram as pioneiras sobre
a face da Terra, tendo se extinguido após 200 milhões de anos (Linzey, 2001).
Os Amphibia ainda existentes, ou Lissamphibia, são tetrápodes com
tegumento úmido e sem escamas. O grupo inclui três linhagens distintas: Anura
(sapos e rãs), Urodela (salamandras) e Gymnophiona (cecílias ou ápodes)
(Pough et al., 1999). De modo geral, os Anura possuem membros pélvicos
alongados, corpo curto e inflexível; os Urodela possuem membros peitorais e
pélvicos de igual tamanho e movem-se por ondulações laterais; já os
Gymnophiona empregam a locomoção em serpentina (Orr, 1986).
Atualmente, são conhecidas no mundo, cerca de 6.347 espécies de
anfíbios (Frost et al., 2008) e o Brasil é o país com a maior diversidade do
planeta, com 832 espécies e taxa de endemismo de aproximadamente de 65%
(IUCN, 2008). Apesar de abrigar a maior biodiversidade do planeta,
informações sobre a história natural são pouco conhecidas para a maioria das
espécies de anuros (Vasconcelos e Rossa-Feres, 2005).
Os anfíbios apresentam ciclo de vida complexo e exibem entre os
vertebrados, grande variedade de modos reprodutivos e estratégias
reprodutivas, seja no comportamento de atração sexual, nos tipos e locais de
12
postura e cuidados com as crias (Duellman e Trueb, 1994; Feio et al., 1998;
Pough et al., 1999).
1.2 Os Anuros
A ordem Anura, também conhecida como Salientia, compreende anfíbios
sem cauda e que possui membros posteriores modificados para o salto (Orr,
1986). Apresentam ampla distribuição geográfica e somente não habitam
regiões cujo clima é extremamente adverso às suas adaptações
morfofisiológicas (Duellman e Trueb, 1994).
Como os anuros apresentam pele permeável, a maioria das espécies
apresenta reprodução noturna. As condições físicas do ambiente que mais
interferem na ocorrência e atividade reprodutiva de anuros são a temperatura
do ar e a umidade relativa estritamente relacionada ao índice pluviométrico
(Jim, 1980). Entretanto, o período reprodutivo pode ocorrer também na estação
seca, quando há disponíveis ambientes como corpos d’água permanentes
(Bastos et al., 2003).
Em regiões tropicais, onde a sazonalidade é expressiva, a ocorrência e a
reprodução da maioria das espécies estão associadas à estação chuvosa
(Donnelly e Guyer, 1994; Rossa-Feres e Jim, 1994; Bertoluci e Rodrigues,
2002; Prado et al., 2005).
1.3 A família Hylidae
A família Hylidae (Rafinesque, 1815) atualmente é composta por cerca
de 856 espécies distribuídas em três subfamílias: Hylinae (613 sp.),
Pelodryadinae (185 sp.) e Phyllomedusinae (58 sp.) (Frost et al., 2008). Esta
13
nova classificação foi realizada por Faivovich et al. (2005) em uma revisão
taxonômica e análise filogenética baseada em dados moleculares, o qual
realocou as espécies anteriormente pertencentes ao gênero Hyla em outros
gêneros.
Hylidae está representada por uma grande variedade de espécies que
apresentam ampla distribuição nas regiões tropicais e temperadas (Faivovich et
al., 2005). É composta em sua maioria por espécies de pequeno a médio porte
(17 a 100 mm), podendo alguns alcançar cerca de 140 mm de comprimento
rostro-cloacal (Orr, 1986). São extremamente diversificados quanto a sua
morfologia externa (Rossa-Feres, 1982) e modos reprodutivos (Kwet e Di-
Bernardo, 1999). Como característica principal apresenta discos arredondados
nas pontas dos dedos, que constituem adaptação ao modo de vida arborícola e
escalador (Kwet e Di-Bernardo, 1999).
1.4 As espécies
Dendropsophus minutus (= Hyla minuta) (Peters, 1872) é um anuro com
aproximadamente 2,3 cm de comprimento rostro-cloacal (Santos e Oliveira,
2007). Possui coloração dorsal castanha, castanho-alaranjada ou bege e
usualmente apresenta duas longas estrias longitudinais paralelas e escuras
(Haddad, 1991) (Figura 1).
Dendropsophus minutus apresenta ampla distribuição geográfica na
América do Sul, ocorrendo do norte da América do Sul até o Uruguai e
Missiones na Argentina; e da costa atlântica aos territórios do leste Boliviano
(Lutz, 1958). Possui vocalizações de alta intensidade que permitem a
14
propagação do som a distâncias consideráveis, facilitando a sua localização
(Cardoso e Haddad, 1984).
Dendropsophus nanus (= Hyla nana) (Boulenger, 1889) é um animal de
pequeno porte, medindo aproximadamente 2 cm de comprimento rostro-
cloacal. Apresentam coloração amarelada (Figura 2) e vocalizam praticamente
o ano todo. É um anfíbio de área aberta e que se reproduz em ambientes de
corpos d'água lênticos temporários ou permanentes. Vocalizam sobre
gramíneas e ciperáceas presentes nas margens dos corpos d'água. A
abundância de Dendropsophus nanus está correlacionada com algumas
variáveis climáticas como temperatura da água, temperatura do ar e
pluviosidade (Melo et al., 2007).
1.5 Aspectos reprodutivos
Nos anuros, os testículos são órgãos pares, arredondados, compactos,
de coloração variando do esbranquiçado ao amarelado (Goin e Goin, 1962) e
estão ligados diretamente aos ductos arquinéfricos, que por sua vez abrem-se
na cloaca transportando apenas o esperma, ou então através de túbulos renais
Figura 1
: E
xem
plar macho de
Dendropsophus minutus. (santuario-ra-
bugio.htmlplanet,com/images/hylaminuta)
Figura 2: Exemplar macho de
Dendropsophus nanus.
(www.biodiversidade.cnpm.embrapa.br/Fotos
Espec...)
15
(mesonéfricos) e destes aos ductos arquinéfricos e cloaca, transportando urina
e esperma, mantendo em ambos os casos uma estreita relação com o aparelho
urinário (Romer e Parsons, 1985; Hildebrand, 1995). Os testículos podem
apresentar variações anatômicas de forma e peso de acordo com o período
reprodutivo (Duellman e Trueb, 1994), além de outras alterações
morfofuncionais associadas à sazonalidade da reprodução (Lofts, 1974).
Macroscopicamente, os testículos são constituídos por unidades
aproximadamente esféricas que alojam as células da linhagem germinativa,
denominados de lóculos seminíferos (Oliveira e Vicentini, 1998). Os lóculos
estão imersos em tecido conjuntivo frouxo, contendo vasos sanguíneos e
linfáticos, nervos e as células intersticiais ou de Leydig, produtoras de
hormônios (Lofts, 1974; Junqueira e Carneiro, 1999). As células de Leydig são
implicadas com a síntese de andrógenos, principalmente a testosterona. Os
hormônios secretados por essas células são fundamentais para o controle das
funções reprodutoras masculinas nos vertebrados, atuando na diferenciação e
no funcionamento dos órgãos reprodutores, induzindo o comportamento
reprodutivo característico da espécie e influenciando a produção de
espermatozóides (Rodrigues e Favaretto, 1999).
Limitando externamente o testículo existe uma delgada cápsula
conjuntiva denominada de túnica albugínea, constituída basicamente por fibras
colágenas. Recobrindo esta túnica existe um revestimento peritoneal, o
mesórquio, que não somente fixam os corpos adiposos ao pólo cranial
testicular (Oliveira e Vicentini, 1998), como também permite íntima associação
entre rins e testículos (Santos e Oliveira, 2007). Os corpos adiposos, estruturas
típicas dos anfíbios, são comumente descritos nos anuros como estruturas
16
digitiformes presas à extremidade cranial das gônadas (Oliveira e Vicentini,
1998; Oliveira e Zieri, 2005). Estas estruturas servem como reserva energética
para as gônadas e podem estar muito reduzidas ou extraordinariamente
desenvolvidas refletindo uma alteração anatômica que varia de acordo com o
acúmulo lipídico no tecido adiposo multilocular que os constitui (Fitzpatrick,
1976). Huang et al. (1997) sugerem que a energia acumulada no fígado pode
ser utilizada durante o processo espermiogênese de Duttaphrynus
melanostictus (= Bufo melanostictus), sendo este órgão outra fonte de reserva
energética.
Os anfíbios apresentam ciclo de vida complexo e exibem a maior
variedade de modos reprodutivos que qualquer outro grupo de vertebrados
(Duellman e Trueb, 1994; Pough et al., 1999). Segundo Blaustein et al. (2002)
e Huang et al. (1997) os fatores ambientais como a temperatura do ar,
fotoperíodo e pluviosidade, podem afetar a reprodução das espécies de anuros
por causar alterações nos ciclos reprodutivos.
Prado e Uetanabaro (2000) afirmam que a reprodução dos anuros
ocorre na maior parte em estações chuvosas quando comparadas às estações
secas. Além dos fatores climáticos como a pluviosidade e temperatura, que
exercem fortes influências na atividade reprodutiva, outros fatores como
competição por alimento, predação e a temperatura da água também afetam a
reprodução desses animais por induzir a liberação de hormônios reprodutores
(Pough et al., 2003).
De modo geral, a reprodução de anuros, está intimamente relacionada
com fatores climáticos, os quais podem ocasionar tanto mudanças na
organização estrutural (tanto macro quanto microscópica) das gônadas, como
17
nos corpos adiposos, fígado, estômago e intestino. Para Dendropsophus
minutus e Dendropsophus nanus poucos trabalhos foram desenvolvidos para
caracterizar a anatomia do aparelho reprodutor durante o ciclo reprodutivo.
Assim, características anatômicas e morfológicas do sistema reprodutor de
Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus foram correlacionadas aos
fatores climáticos, permitindo assim, avaliar o aspecto reprodutivo de ambas as
espécies e ampliar o conhecimento da biologia reprodutiva dos anuros
neotropicais.
18
2. OBJETIVOS
2.1 Geral:
O trabalho proposto descreve a anatomia do aparelho reprodutor
masculino de Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus durante o ciclo
reprodutivo anual, com base em análises anatômicas e histológicas do sistema
reprodutor e, relaciona estes parâmetros às condições ambientais na qual os
animais estavam expostos.
2.2 Específicos:
- Descrever a anatomia das gônadas masculinas de Dendropsophus
nanus e Dendropsophus minutus, com base em de análises
biométricas;
- Descrever a organização morfológica testicular geral para ambas as
espécies;
- Analisar aspectos biométricos do fígado, estômago e intestino;
- Descrever histologicamente as células de Leydig de Dendropsophus
minutus;
- Analisar a quantidade e área das células de Leydig durante o ciclo
reprodutivo de Dendropsophus minutus.
19
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23
24
Capítulo 1
ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR MASCULINO DE
Dendropsophus minutus E Dendropsophus nanus (ANURA, HYLIDAE)
DURANTE O CICLO REPRODUTIVO
THAISE YARA MAGOSSI MASSURA
1
, CLASSIUS DE OLIVEIRA
2
1
Mestranda do Programa de Pós-graduação em Biologia Animal da UNESP -
São José do Rio Preto - São Paulo, Brasil.
2
Departamento de Biologia - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas-
UNESP, São José do Rio Preto -São Paulo, Brasil.
Palavras-chave: ciclo reprodutivo, anatomia, Dendropsophus, Hylidae
Endereço para Correspondência:
Departamento de Biologia - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas -
UNESP.
CEP: 15.040-000, São José do Rio Preto - São Paulo, Brasil.
Fax: (55-17) 3221 – 3990
25
Anatomia do Aparelho Reprodutor Masculino de Dendropsophus minutus
e Dendropsophus nanus (Anura, Hylidae) durante o ciclo reprodutivo
RESUMO
A reprodução é um processo de fundamental importância para a perpetuação
da espécie e para compreensão deste processo reprodutivo, as características
morfofuncionais e a ação do meio ambiente devem ser consideradas em
conjunto. No presente estudo o objetivo foi descrever a morfologia das gônadas
de machos de Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus, e relacionar
dados da análise biométrica das gônadas às condições climáticas do ano,
verificando assim se há alguma variação destas estruturas ao longo do ciclo
reprodutivo anual. Os animais foram coletados mensalmente entre maio de
2006 e abril de 2007, por meio de excursões noturnas no Município de
Palestina – São Paulo, Brasil. Dados de natureza biométrica, como
comprimento (cm) e peso (g) total do indivíduo, comprimento (mm) e peso das
gônadas, peso do fígado, estômago e intestino, foram obtidos e
correlacionados entre si e com as condições climáticas (temperatura do ar,
pluviosidade, umidade relativa do ar e fotoperíodo). Os corpos adiposos foram
descritos quanto a sua arquitetura morfológica e classificados em três
categorias de acordo com seu tamanho relativo. Os testículos de ambas as
espécies são órgãos pequenos, esbranquiçados, de forma ovalada e se
encontram na cavidade abdominal, localizados cranialmente aos rins.
Estatisticamente não há variação intra-individual e também ao longo do ciclo
reprodutivo quanto ao comprimento e peso dos testículos; bem como para os
corpos adiposos, fígado, estômago e intestino. Entretanto, houve correlação de
26
alguns destes parâmetros com as variáveis ambientais. Os dados obtidos
contribuem para o conhecimento dos aspectos relacionados à biologia
reprodutiva dos anuros.
27
ABSTRACT
The reproduction is a process of basic importance and for understanding of this
reproductive process, the morph functionaries characteristics and the action of
the environment must be considered in set. In the present study the aim was to
describe the morphology of gonads of males of Dendropsophus minutus and
Dendropsophus nanus, and to relate data of the biometric analysis of the
gonads ones to the climatic conditions of the year, thus verifying has some
variation of these structures throughout the annual reproductive cycle. The
animals had been collected monthly between May 2006 and April 2007, by
means of nocturnal excursions in the City of Palestine - SP, Brazil. Data of
biometric nature, as length (cm) and total weight (g) of the individual, length
(mm) and weight of the gonads ones, weight of the liver, stomach and intestine,
had been gotten and correlated between itself and with the climatic conditions
(temperature of air, rainfall, relative humidity of air and photoperiod). The fatty
bodies had been described how much its architecture morphologic and
classified in three categories in accordance with its relative size. The testicles of
both the species are small agencies, whitish, of oval form and if they find in the
abdominal socket, located cranially to the kidneys. Statistical it does not have
individual variation and also throughout the reproductive cycle how much to the
length and weight of the testicles; as well as for the fatty bodies, liver, stomach
and intestine. However, it had correlation of some of these parameters with the
ambient variable. The gotten data contribute for the knowledge of the aspects
related to the reproductive biology of the anurans.
28
INTRODUÇÃO
A influência do clima na ocorrência e atividade reprodutiva de anuros de
regiões tropicais é determinada principalmente pela distribuição e volume de
chuva (Duellman e Trueb, 1994). Segundo Blaustein et al. (2002) diversos
fatores ambientais podem afetar a reprodução e interferir na estrutura da
comunidade. Fatores abióticos como temperatura, pluviosidade e fotoperíodo
manifestam alterações nos ciclos reprodutivos de anfíbios (Huang et al., 1997).
Estas variáveis determinam a época favorável do ano e a duração em que os
anuros se mantêm ativos, determinando sua distribuição estacional (Jim, 1980).
Nos anuros, os testículos são órgãos pares, arredondados, compactos,
com coloração variando de esbranquiçada ao amarelado (Goin e Goin, 1962).
Embora o padrão de coloração citado ocorra na maioria das espécies,
Eupemphix nattereri (Leiuperidade) e algumas outras apresentam uma
tonalidade escura no testículo devido à presença de células que contém
intensa pigmentação no citoplasma, denominados melanócitos viscerais
(Oliveira e Zieri, 2005; Franco-Belussi et al., 2008). As gônadas podem
apresentar variações anatômicas de forma e peso de acordo com o período
reprodutivo (Duellman e Trueb, 1994), além de outras alterações
morfofuncionais associadas à sazonalidade da reprodução (Lofts, 1974).
Os corpos adiposos, estruturas típicas dos anfíbios, são constituídos por
uma massa de tecido adiposo. Estes são comumente descritos nos anuros
como estruturas digitiformes presas à extremidade cranial das gônadas
(Oliveira e Vicentini, 1998; Oliveira e Zieri, 2005). Estas estruturas podem estar
muito reduzidas ou muito desenvolvidas, refletindo uma alteração anatômica,
29
que varia de acordo com o acúmulo lipídico no tecido adiposo multilocular e
servem como reserva nutricional para as gônadas (Fitzpatrick, 1976). Huang et
al. (1997) sugerem que a energia acumulada no fígado pode ser usada na
espermiogênese do Duttaphrynus melanostictus, sendo este órgão outra fonte
de reserva nutricional.
Dendropsophus nanus e Dendropsophus minutus possuem ampla
distribuição na região neotropical, vocalizando sobre a vegetação na margem
de corpos d’água temporários ou permanentes. São reconhecidas pela alta
intensidade da propagação do som, o que facilita sua localização no ambiente
(Cardoso e Haddad, 1984).
Este trabalho descreve a anatomia do aparelho reprodutor de
Dendropsophus nanus e Dendropsophus minutus durante o ciclo reprodutivo
com base em análises biométricas, e as relaciona com as circunstâncias
ambientais na área de estudo. Descreve ainda a organização morfológica geral
dos testículos e corpos adiposos; analisa aspectos biométricos do fígado,
estômago e intestino, traçando uma análise comparativa entre as duas
espécies.
MATERIAIS E MÉTODOS
Trinta e seis exemplares de Dendropsophus minutus (n=3 por mês) e
quinze exemplares de Dendropsophus nanus (n=3 por mês) foram coletados
entre maio 2006 a abril de 2007, por meio de excursões noturnas no município
de Palestina–São Paulo, Brasil. Os animais foram encontrados vocalizando na
30
borda de um açude permanente situado entre pasto e vegetação ripária, na
fazenda Santo Antônio do Turvo (20º 21’ 29,1’’S; 49º 16’ 55,7’’W) (Figura 1).
Figura 1: Local de coleta. Fazenda Santo Antônio do Turvo.
Os animais coletados foram acondicionados em sacos plásticos
umedecidos internamente e transportados ao Laboratório de Anatomia
Comparada do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
(IBILCE/UNESP), em seguida, transferidos para um terrário contendo terra e
água para evitar a desidratação dos animais, além de galhos, folhas e alimento
retirados do meio para simular seu habitat natural. No dia seguinte foram
anestesiados e mortos por saturação em éter etílico. Com uma incisão mediana
ventral a parede corporal foi rebatida e os órgãos reprodutores expostos para
análise e fotodocumentação em microscópio estereoscópico (Leica MZ16).
Dados de natureza biométrica, como comprimento (cm) e peso (g) total
do indivíduo foram registrados com a utilização de um paquímetro de metal
31
com precisão de 0,05 mm e balança analítica de precisão (0,0001 g). Os
testículos foram removidos, pesados (g) e medidos em seu eixo maior (mm)
com os mesmos equipamentos. Além destes dados, outros como o peso (g) do
fígado, estômago e intestino também foram coletados e utilizados para
correlacionar entre si e com as condições climáticas (pluviosidade, temperatura
do ar, umidade relativa do ar e fotoperíodo) registradas na região de estudo.
Os corpos adiposos foram descritos quanto a sua arquitetura anatômica e
classificados em três categorias (Figura 2) utilizando-se como referencial o
tamanho dos testículos aos quais os corpos adiposos homolaterais estão
aderidos (Tabela 1).
Tabela 1: Grau de desenvolvimento dos corpos adiposos.
Grau de Desenvolvimento Descrição
1
Volume nitidamente menor que o testículo.
2
Volume aproximado ao do testículo.
3
Volume acentuadamente maior que o testículo.
Figura 2: Ilustração do desenvolvimento dos corpos adiposos de Dendropsophus minutus: A –
Grau 1; B – Grau 2; C – Grau 3. Corpo adiposo (seta).
A B C
A
B
C
32
Nos meses de maio, junho, julho, agosto, setembro e novembro de 2006
e abril de 2007 não foram capturados exemplares de Dendropsophus nanus,
provavelmente devido às condições ambientais que, de alguma forma,
influenciou na distribuição estacional dos animais. Já a espécie Dendropsophus
minutus foi coletada ao longo de todos os meses de estudo.
Dados meteorológicos mensais como a pluviosidade, a umidade relativa
do ar, a temperatura (ºC) e o fotoperíodo foram conseguidos por meio da
Coordenadoria de Assistência Técnica Integral (CATI), do Instituto Nacional de
Metereologia (INMET) e pelo site http://www.apollo11.com/index.php,
respectivamente, os quais foram empregados para descrever e relacionar as
condições ambientais com a atividade reprodutiva dos animais (Figura 3).
A espécie Dendropsophus minutus foi agrupada e dividida em quatro
grupos de acordo com as estações do ano (primavera, verão, outono e
inverno); Dendropsophus nanus foi colocado em apenas dois grupos
(primavera e verão) devido à ocorrência dos espécimes.
Os animais foram coletados de acordo com a licença do Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA:
02010.0003336/05-53) e o manuseio seguindo os princípios da Comissão de
Ética na Experimentação Animal (CEEA: 001/06).
33
Figura 3: Dados climáticos e sua distribuição de maio de 2006 a abril de 2007. A -
Pluviosidade total (mm), B - Umidade relativa do ar (%), C - Temperatura média (ºC) e D -
Fotoperíodo (minutos).
Fotoperíodo (min)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
mai
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
jan
fev mar
abr
Pluviosidade (mm)
0
100
200
300
400
500
600
700
mai
jun
jul
ago
set out nov
dez
jan
fev
mar
abr
Umidade Relativa do Ar (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Mai
jun
jul
ago
set
out
nov
dez
jan
fev
mar
abr
Temperatura (ºC)
0
5
10
15
20
25
30
mai
jun
jul
ago
set out
nov
dez
jan
fev
mar
abr
34
Análise Estatística:
Foi verificada a existência de valores discrepantes (outliers), e
posteriormente a normalidade foi testada por Shapiro-Wilk, e quando
necessários, foram submetidos à normalização (x + 0,5)
1/2
(Lehner, 1996).
Todos os resultados obtidos foram analisados entre estações do ano
durante o período amostrado. Os dados biométricos foram comparados ao
longo das estações por meio da análise de variância (One-Way-ANOVA) para
os dados paramétricos, ou por KrusKal-Wallis para os não paramétricos, sendo
completados quando necessários, por testes de comparações múltiplas (Tukey
e Dunn, respectivamente). Foram feitas correlações entre os parâmetros
biométricos por meio de testes não paramétricos de Spearman ou teste
paramétrico de Pearson. Dados biométricos das gônadas foram analisados
entre as estações pelo teste Kruskal-Wallis e para cada estação (entre a
gônada direita e esquerda) com base no teste Wilcoxon.
A dependência entre os parâmetros biométricos e climáticos foi
verificada por meio do teste de Regressão Linear Simples. Os exemplares
foram fixados em formol 10% e preservados como material testemunho. Foi
considerado p 0,05 como referência para se atribuir significância estatística,
sendo todas as análises baseadas em Zar (1999).
RESULTADOS
Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus apresentam os
testículos com forma ovalada e coloração branco-leitoso devido a seu conteúdo
35
espermático (Figura 4). As gônadas estão localizadas na cavidade celomática,
em posição ventral aos rins e em sintopia com a face visceral destes (Figura 5).
Na extremidade cranial de cada testículo encontram-se aderidos corpos
adiposos formados por vários prolongamentos digitiformes com coloração
variando do branco ao amarelo. Limitando as gônadas existe uma delgada
cápsula testicular conjuntiva denominada de túnica albugínea e externamente a
esta o mesórquio, um revestimento no qual o corpo adiposo está aderido.
Os testículos de Dendropsophus minutus têm comprimento médio de
1,12 (0,24 mm) e peso médio 0,0003 (0,00 g) e em Dendropsophus nanus os
testículos apresentaram comprimento médio de 1,08 (0,27 mm) e 0,0002 (0,
00 g) de peso. As gônadas de ambas espécies não sofreram variações de peso
e comprimento ao longo do ciclo reprodutivo (Dendropsophus minutus – peso
(H=7,56; p=0,05) e comprimento (F=0,77; p=0,51) do testículo direito – peso
(H=4,43; p=0,21) e comprimento (F=1,45; p=0,24) do testículo esquerdo e
Dendropsophus nanus – peso (H=0,60; p=0,43) e comprimento (F=0,06;
p=0,79) do testículo direito – peso (H=1,11; p=0,29) e comprimento (H=0,03;
p=0,85) do testículo esquerdo.
O teste de Wilcoxon, realizado para comparação entre os antímeros
gonadais, demonstrou que tanto peso quanto o comprimento testicular de
Dendropsophus minutus (z=-0,66; p=0,50/ z=-0,14; p=0,88) e Dendropsophus
nanus (z=-0,71; p=0,47/ z=-0,10; p=0,91) não sofreu variação ao longo do ciclo
anual. O índice gonadossomático realizado para as duas espécies também não
sofreu variação (Dendropsophus minutus – (H=7,11; p=0,06) e Dendropsophus
nanus – (H=1,16; p=0,28).
36
Em relação às variáveis ambientais o comprimento dos testículos de D.
minutus apresentou-se correlacionado à umidade relativa do ar (Figuras 6 e 7)
e ao fotoperíodo (Figuras 8 e 9). Já em D. nanus este mesmo parâmetro
demonstrou associado apenas ao fotoperíodo (Figuras 10 e 11).
Machos de D. minutus tem comprimento médio de 2,26 (0,31cm) e
peso médio total de 0,58 (0,13g) e D. nanus 2,00 (0,12cm) de comprimento
médio e peso médio de 0,41 (0,06g). Com relação a análise biométrica dos
animais, tanto o comprimento quanto o peso não sofreram variações
significativas ao longo do ciclo (D. minutus: F=0,29; p=0,83/ F=1,66; p=0,19 e
D. nanus F=0,15; p=0,70/ F=0,26; p=0,62, respectivamente). O peso e
comprimento dos animais apresentaram correlações positivas ao longo das
estações (D. minutus: r=0,73; p=0,00 e D. nanus: r=0,75; p=0,00).
Em relação aos fatores ambientais, o peso de D. minutus mostrou-se
relacionado com a pluviosidade (Figura 12) e a umidade relativa do ar (Figura
13); já o comprimento do animal está inversamente relacionado com a
temperatura do ar (Figura 14), ou seja, quanto menor a temperatura, maiores
são os animais encontrados em campo. Esta mesma relação climática e
biométrica também foi observada para D. nanus (Figura 15). Entretanto, a
umidade relativa do ar (Figura 16) e o fotoperíodo (Figura 17) estão
diretamente associados ao peso do animal.
Os corpos adiposos, o peso do fígado, estômago e intestino não
manifestaram alterações ao longo do ciclo reprodutivo de Dendropsophus
minutus (H=1,98; p=0,57/ H=6,97; p=0,07/ H=5,23; p=0,15, respectivamente) e
de Dendropsophus nanus (H=2,03; p=0,56/ F=0,06; p=0,79/ H=0,33; p=0,56,
respectivamente). Entretanto, quando analisados uns aos outros, o peso do
37
fígado de D. minutus demonstrou-se correlacionado positivamente com o peso
do estômago e intestino (Figura 18) e com o peso do animal (Figura 19). O
peso corporal do animal também apresentou-se correlacionado com o peso do
estômago e intestino (Figura 20).
Dentre os órgãos analisados, o peso do fígado de D. minutus é o único
que sofre influência de fatores ambientais como a pluviosidade (Figura 21),
umidade relativa do ar (Figura 22) e fotoperíodo (Figura 23). Já em D. nanus o
peso do estômago e intestino está diretamente relacionado ao fotoperíodo
(Figura 24).
DISCUSSÃO
Dendropsophus minutus e Dendropsophus nanus são espécies de
formação aberta, encontradas sobre vegetação herbácea ou gramínea que
cresce junto a margem da água. Em época favorável à reprodução surgem em
grandes quantidades e formam densas concentrações de indivíduos de D.
minutus (Santos, 2006) e D. nanus.
Duellman e Trueb (1994) descrevem os testículos como estruturas
pares, esféricas ou ovais, localizadas numa posição ventral ao nível da metade
anterior dos rins, podendo em algumas espécies serem longos e se
estenderem até a extremidade posterior dos rins. Segundo Goin e Goin (1962)
estas estruturas são compactas e de coloração amarelada, cuja função é a
produção de hormônio e espermatozóides (Hildelbrand, 1995).
Os testículos de Dendropsophus nanus e Dendropsophus minutus
apresentam assimetrias nítidas quanto á sua localização, dispostos
38
ventralmente aos rins em alturas diferentes na cavidade celomática. Os rins se
encontram em posição imediatamente ventral à parede dorsal da cavidade
abdominal e estão intimamente associados aos testículos por meio do
mesentério gonadal ou mesórquio, como relatado também por Santos e
Oliveira (2007).
Os corpos adiposos, estruturas digitiformes, apresentam-se aderidos à
extremidade cranial dos testículos. Este órgão pode ser deslocado em
diferentes alturas, profundidades e orientações de seus eixos longitudinal e
transversal. Esta grande mobilidade ocorre em função dos estados fisiológicos
das vísceras adjacentes e principalmente dos segmentos do tubo digestório, o
que, sem dúvida, alguma é uma característica protetora para o processo
gametogênico (Oliveira, 1996).
Segundo Fitzpatrick (1976) os corpos adiposos podem apresentar-se
muito reduzidos ou extraordinariamente desenvolvidos, refletindo uma
alteração anatômica que varia de acordo com o acúmulo lipídico no tecido
adiposo e servem como reserva nutricional para as gônadas. Em D. minutus e
D. nanus, não apresentaram alterações significativas durante o estudo como
também não manifestou correlação com nenhum fator ambiental. Entretanto, a
coloração variou do esbranquiçado ao amarelado, e esta variação pode estar
relacionada à constituição lipídica.
Outros parâmetros que também não apresentaram variação significativa
ao longo dos meses analisados foram o peso do fígado, estômago/intestino,
comprimento e o peso do animal, sugerindo que pode haver uma relação entre
organização das estruturas analisadas com o biótipo do animal. Como não foi
verificada nenhuma alteração anatômica dos animais (peso e comprimento) e
39
dos órgãos (peso) em estudo, é possível que mesmo na estação seca exista
alimento em campo disponível o suficiente para não ocorrer alterações dessas
estruturas ao longo do ciclo, assim não há a necessidade de fazer uma reserva
energética nos meses que há mais oferta de alimento (estação chuvosa). Outro
fator que deve ter colaborado com essa organização morfológica é o fato que
no local de coleta não há mudanças bruscas dos fatores abióticos e é uma área
com vegetação ripária permanente, o que favorece uma constante de outros
organismos, mantendo a oferta alimentar.
Os testículos de ambas as espécies apresentaram as mesmas
características anatômicas como já descrito para outras espécies de anuros
como Caudiverbera cudiverbera (Hermosilla et al., 1983), Scinax fuscovarius
(Oliveira e Vicentini, 1998), Eupemphix nattereri (Oliveira e Zieri, 2005)
Dendropsophus minutus (Santos e Oliveira, 2007). No decorrer do ciclo
reprodutivo tanto em D. minutus quanto D. nanus os testículos não
manifestaram variações anatômicas de tamanho e peso entre os antímeros, ou
seja, não há variação intra-individual entre os pares gonadais durante o ciclo
reprodutivo. Estes dados corroboram os trabalhos de Santos e Oliveira (2007)
também realizado com D. minutus, como também com as observações feitas
em Rana perezi (Delgado et al., 1989) e Lithobathes catesbeianus (Sasso-Cerri
et al., 2004). Também como relatado para Lithobathes catesbeianus (Sasso-
Cerri et al., 2004) e D. minutus (Santos e Oliveira, 2007) o índice
gonadossomático das espécies estudadas também não apresentou alterações
durante o ciclo reprodutivo. Este fato pode ser considerado uma boa estratégia
reprodutiva, pois a energia economizada pelo animal em não ter que
reorganizar sua estrutura testicular pode ser desviada para outros parâmetros
40
não analisados nesse trabalho que requerem uma demanda de energia como o
canto, o comportamento de corte e outras atividades relacionadas á
reprodução. Uma variação no peso testicular poderia ocasionar uma variação
nos demais órgãos em estudo como o fígado e estômago/intestino (que têm
como função básica armazenamento de glicogênio, metabolismo de lipídios e
armazenamento de alimentos) podendo inferir que exista uma relação
anatômica entre órgãos estudados e que assim como os testículos não variam
durante o ciclo reprodutivo.
Huang et al. (1997) observaram que Duttaphrynus melanostictus, uma
espécie de ciclo reprodutivo contínuo, não apresentam alterações anatômicas
no fígado e dos corpos adiposos durante o ciclo anual. Dendropsophus minutus
também apresenta ciclo reprodutivo contínuo (Santos e Oliveira, 2007) e
também não apresentou variações no fígado e nos corpos adiposos, o que
pode ser um indicativo que animais que possuem ciclo reprodutivo contínuo
não apresentam variações anatômicas dos demais órgãos.
Com relação aos fatores climáticos pode-se inferir que estas variáveis
são importantes tanto na morfologia dos órgãos quanto na biometria do animal,
pois quando os parâmetros biométricos foram analisados separadamente ao
longo do ciclo, não apresentaram manifestações em sua estrutura. Segundo
Lofts (1974) e Rastogi et al. (1976), o fotoperíodo e a temperatura são os
principais fatores ambientais controladores de ciclos reprodutivos em anfíbios e
certamente interferem também no desenvolvimento dos anuros. Os dias mais
longos e quentes geralmente são os dias de verão e primavera onde
coincidentemente a pluviosidade é maior e, conseqüentemente, a umidade
também. Nesses meses, como relatado por Wolda (1978), a oferta alimentar é
41
maior e a produção de folhas e brotos parece estar fortemente correlacionada à
pluviosidade coincidindo com a época reprodutiva de grande parte dos animais;
há também um favorecimento de outros organismos que podem ser incluídos
na cadeia alimentar dos animais presentes no local de estudo. Desta forma, a
oferta alimentar pode estar disponibilizando uma maior proporção no
investimento de energia dos animais em estudo.
Para Telfort e Dyson (1990), Silverin e Andrén (1992), os fatores
climáticos especialmente precipitação, umidade relativa e temperatura exercem
forte influência na atividade reprodutiva dos anuros. A temperatura apresentou-
se inversamente correlacionada com o tamanho corporal de D. minutus e D.
nanus, ou seja, quanto menor a temperatura, maior os animais encontrados em
campo. Provavelmente, o fato de ter encontrado animais maiores é que
anfíbios pequenos possuem, proporcionalmente, maior área de superfície que
anfíbios maiores e, portanto os animais menores têm uma maior taxa de perda
de água por evaporação (Duellman e Trueb, 1994), sendo a aparição de
animais maiores em dias mais frios uma característica protetora para os
indivíduos menores. Outro fato a ser destacado também é que a metodologia
empregada para capturar estes animais é feita com base nas vocalizações, é
óbvio considerar animais que apresentam melhor capacidade “física” (maiores
e mais pesados), estão aptos a ganhar uma disputa pelo território e, portanto,
são os que estarão em atividade reprodutiva (vocalizando).
A atividade reprodutiva de anuros em ambientes sazonais está
geralmente associada com o período de umidade em países de clima tropical
(Hoogmoed e Gorzula, 1979; Aichinger, 1987) e, a partir dos resultados,
podemos sugerir que outros aspectos dos animais, como o desenvolvimento e
42
acúmulo energético estão correlacionados com os fatores ambientais. Além
dos fatores ambientais citados, existem outros como a temperatura da água,
pressão por predação e competição por alimento que também podem interferir
na reprodução dos anuros (Prado e Uetanabaro, 2000).
Em uma análise comparativa, concluímos que ambas as espécies
sofrem influência dos fatores abióticos, talvez D. minutus sofra mais influência
por ser uma espécie generalista e de ampla distribuição estacional (Melo et al.,
2007) enquanto que D. nanus só aparece em poucos meses de coleta e sua
abundância está correlacionada com algumas variáveis climáticas como
temperatura da água, do ar e pluviosidade (Melo et al., 2007). De modo geral,
todas as variáveis ambientais, em maior ou menor proporção estão
relacionadas à atividade reprodutiva e ao desenvolvimento dos anfíbios anuros.
43
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FIGURAS
Figura 4
:
Forma, coloração dos testículos de
Dendropsophus minutus
(A e B)
e
Dendropsophus nanus (C). A = B – baço, T – testículo, R – rim; B = * detalhe mesoscópico
de um lóculo seminífero; C = T – testículo, CA – corpo adiposo. Aumento: 37,5x
A
T
B
R
B
*
*
C
T
C A
Figura 5
:
Localização dos testículos de
D. minutus
na cavidade abdominal e sua
sintopia com os demais órgãos. E – estômago; P – pulmão; I – intestino; B – baço; T
– testículo; R – rim; Ip – porção final do intestino repleto de melanócitos
pigmentados. Aumento: 10x
B
T
E
I
R
P
Ip
48
Figura 6: Relação da umidade relativa do ar (%) e comprimento
do testículo direito de D. minutus. Teste de Regressão Linear
Simples (F=8,33; p=0,00).
Figura 7: Relação da umidade relativa do ar (%) e comprimento
do testículo esquerdo de D. minutus. Teste de Regressão
Linear Simples (F=12,83; p=0,00).
Figura 8: Relação do fotoperíodo (min) e comprimento do
testículo direito de D. minutus. Teste de Regressão Linear
Simples (F=9,65; p=0,00).
Figura 9: Relação do fotoperíodo (min) e comprimento do
testículo esquerdo de D. minutus. Teste de Regressão Linear
Simples (F=16,48; p=0,00).
49
Figura 10: Relação do fotoperíodo (min) e peso do testículo
direito de D. nanus. Teste de Regressão Linear Simples
(F=8,11; p=0,01).
Figura 11: Relação do fotoperíodo (min) e peso do testículo
esquerdo de D. nanus. Teste de Regressão Linear Simples
(F=8,13; p=0,01).
Figura 12: Relação da pluviosidade (mm) e peso corporal de D.
minutus. Teste de Regressão Linear Simples (F=16,13; p=0,00).
Figura 13: Relação da umidade relativa do ar (%) e peso de D.
minutus. Teste de Regressão Linear Simples (F=7,99; p=0,00).
50
Figura 14: Relação da temperatura (ºC) e o comprimento de D.
minutus. Teste de Regressão Linear Simples (F=8,33; p=0,00).
Figura 15: Relação da temperatura (ºC) e comprimento de D
nanus. Teste de Regressão Linear Simples (F=8,33; p=0,00).
Figura 16: Relação da umidade relativa do ar (%) e peso de D.
nanus. Teste de Regressão Linear Simples (F=5,01; p=0,04).
Figura 17: Relação do fotoperíodo (min) e peso de D. nanus.
Teste de Regressão Linear Simples (F=6,28; p=0,02).
51
Figura 18: Relação do peso do fígado com o peso do
estômago/intestino de D. minutus. Correlação de Spearmam
(rs=0,49; p=0,00).
Figura 19: Relação do peso do animal e do fígado de D. minutus.
Análise de correlação de Spearmam (rs=0,53; p=0,00).
Figura 20: Relação do peso do animal e do estômago/intestino
de D. minutus. Análise de correlação de Spearmam (rs=0,49;
p=0,00
)
.
Figura 21: Relação da pluviosidade (mm) e peso do fígado de
D. minutus. Teste de Regressão Linear Simples (F=18,62;
p=0,00
)
.
52
Figura 22: Relação da umidade relativa do ar (%) e peso do
fígado de D. minutus. Teste de Regressão Linear Simples
(F=12,55; p= 0,00).
Figura 23: Relação do fotoperíodo (min) e peso do fígado de D.
minutus.
Teste de Regressã
o Linear Simples (F=9,03
;
p=0,00
)
.
Figura 24: Relação do fotoperíodo (min) e peso do estômago e
intestino de D. nanus. Teste de Regressão Linear Simples
(F=4,60; p= 0,04).
53
54
Capítulo 2
ANÁLISE DOS TESTÍCULOS E DAS CÉLULAS DE LEYDIG DURANTE O
CICLO REPRODUTIVO DE Dendropsophus minutus (ANURA, HYLIDAE)
THAISE YARA MAGOSSI MASSURA
1
, CLASSIUS DE OLIVEIRA
2
1
Mestranda do Programa de Pós-graduação em Biologia Animal da UNESP -
São José do Rio Preto - São Paulo, Brasil.
2
Departamento de Biologia - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas-
UNESP, São José do Rio Preto -São Paulo, Brasil.
Palavras-chave: testículos, histologia, células de leydig, Dendropsophus.
Endereço para Correspondência:
Departamento de Biologia - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas -
UNESP.
CEP: 15.040-000, São José do Rio Preto - São Paulo, Brasil.
Fax: (55-17) 3221 - 3990
55
Análise dos testículos e das células de Leydig durante o ciclo
reprodutivo de Dendropsophus minutus (Anura, Hylidae)
RESUMO
As gônadas dos anfíbios anuros são constituídas por unidades esféricas que
se alojam nas células da linhagem germinativa, denominados lóculos
seminíferos. Os lóculos estão imersos em tecido conjuntivo frouxo contendo
vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e as células de Leydig que são
produtoras de hormônios. O objetivo proposto no trabalho foi de realizar uma
descrição histológica do interstício testicular e analisar a área e quantidade
dessas células sazonalmente. Para o presente estudo, os animais foram
coletados de abril de 2004 a março de 2005 na região de São José do Rio
Preto-SP, Brasil. O interstício é formado por fibras de tecido conjuntivo,
fibroblastos e capilares sanguíneos e muitas células de Leydig. Estas células
apresentam o núcleo bem evidente e possui forma ligeiramente alongada ou
ovalada e o citoplasma parece ser muito reduzido. Foi verificado que há
diferença estatística na quantidade e na área das células de Leydig durante o
ciclo reprodutivo.
56
ABSTRACT
The gonads of the anurans amphibians are constituted by spherical units that
lodge the cells of the germinate ancestry, called seminiferous locules. The
locules are immersed in fabric conjunctive flabby contend sanguineous and
lymphatic vases, nerves and the cells of Leydig that are producing of hormones.
The aim considered in the study was to carry through a histology description of
the interstice season to testicular and to analyze the area and amount of these
cells. For the study the animals had been collected of April of 2004 the March of
2005 in the region of Sao José do Rio Preto-SP, Brazil. The interstice is formed
by staple fibres of fabric conjunctive, sanguineous fibroblasts and capillaries
and many cells of Leydig. These cells present the well evident nucleus and
slightly possess prolongated form or oval and the cytoplasm very seems to be
reduced. It was verified that it has difference statistics in the amount and the
area of the cells of Leydig during the reproductive cycle.
57
INTRODUÇÃO
Em vertebrados os testículos têm duas importantes funções: produção
de hormônio (andrógeno) e produção de espermatozóides (Emerson, 1997).
Duellman e Trueb (1986) e Goin e Goin (1962) descrevem os testículos dos
anuros como estruturas pares, oval com coloração geralmente amarelada; e
estão localizadas em posição ventral aos rins.
As gônadas são constituídas por unidades aproximadamente esféricas
que alojam as células da linhagem germinativa, denominados de lóculos
seminíferos (Oliveira e Vicentini, 1998). As células da linhagem germinativa
estão agrupadas em cistos formados pelos prolongamentos citoplasmáticos
das células de Sertoli e apresentam-se em diversos estádios de diferenciação
celular, caracterizando uma espermatogênese cística para estes animais
(Santos, 2006).
Os lóculos seminíferos estão imersos em tecido conjuntivo frouxo,
contendo vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e as células intersticiais ou de
Leydig (Junqueira e Carneiro, 1999; Lofts, 1974). As células de Leydig estão
relacionadas com a síntese de andrógenos, principalmente a testosterona. Os
hormônios secretados por essas células são fundamentais para o controle das
funções reprodutoras masculinas nos vertebrados, atuando na diferenciação e
no funcionamento dos órgãos reprodutores; induzindo o comportamento
reprodutivo característico da espécie e influenciando a produção de
espermatozóides (Rodrigues e Favaretto, 1999; Duvall et al., 1982). Segundo
Mori e Christensen (1980) as características ultraestruturais mais proeminentes
das células de Leydig é abundância de retículo endoplasmático liso e a
58
presença de numerosas mitocôndrias. A biossíntese da testosterona é
catalisada por enzimas localizadas predominantemente nas membranas do
retículo endoplasmático liso e no citoplasma adjacente, no entanto, uma parte
da biossíntese também ocorre no interior das membranas das mitocôndrias e,
em algumas espécies, gotas de lipídios são comuns nas células de Leydig
(Mori e Christensen, 1980). Limitando externamente o testículo há uma delgada
cápsula testicular conjuntiva denominada de túnica albugínea, constituída
basicamente por fibras colágenas (Oliveira e Vicentini, 1998).
Há vários trabalhos com o interstício em anuros que apresentam o ciclo
reprodutivo potencialmente contínuo como Rana nigromaculata e Rana rugosa
(Ko et al., 1998), Rana perezi (Delgado et al., 1989), e descontínuo como Rana
esculenta (Lofts, 1964) e Rana dybowskii (Ko et al., 1998) relatando os níveis
de testosterona e lipídios durante o ciclo reprodutivo. Entretanto, para anuros
de regiões neotropicais e com ciclo reprodutivo contínuo como Dendropsophus
minutus (Santos, 2006), há uma escassez de trabalhos relacionados a área
intersticial, principalmente no que diz a respeito das células de Leydig. Assim, o
presente estudo tem como objetivo apresentar a arquitetura histológica da área
intersticial dos testículos e analisar quantidade e área das células de Leydig
durante o ciclo reprodutivo anual de Dendropsophus minutus.
MATERIAIS E MÉTODOS
Trinta exemplares de D. minutus foram capturados por meio de coletas
mensais durante o período de abril de 2004 à março 2005 (exceto agosto e
setembro, devido à estivação anual), por meio de visitas noturnas ao campo na
59
região de São José do Rio Preto – São Paulo, Brasil (20º45’47,5”S e
49º19’38,8”W). Os animais coletados foram acondicionados em sacos plásticos
umedecidos internamente com água e transportados ao Laboratório de
Anatomia Comparada do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
(IBILCE/UNESP), em seguida, transferidos para um terrário contendo terra e
água para evitar a desidratação dos animais, além de galhos, folhas e alimento
retirados do meio para simular seu habitat natural. No dia seguinte, foram
anestesiados e mortos por saturação em éter etílico.
Com uma incisão mediana ventral, a parede corporal foi rebatida e os
testículos de D. minutus foram removidos e fixados em solução de Bouin por 24
horas e, depois, desidratados em série crescentes de álcool (Hopwood, 1990).
As amostras testiculares foram incluídas em resina do tipo Methalcrilato glicol
(Historesin Leica®) seccionadas a 2,0 µm e corados com Azul de Toluidina
com bórax (1:1), Hematoxilina/Eosina e Reticulina de Gömori.
Para a análise morfológica, as lâminas montadas foram observadas ao
microscópio Leica (DM4000 B) e as imagens foram capturadas com auxílio de
uma câmara acoplada ao microscópio (Leica DFC280). Em seguida, foram
realizadas análises da arquitetura histológica com base no programa Image
Pró-plus versão 4.5.
Para a análise da área e quantificação celular, o material foi agrupado
em duas estações: fria e seca (que compreende os meses de abril, maio,
junho, julho e agosto) e quente e úmida (outubro, novembro, dezembro, janeiro,
fevereiro e março). No mês de setembro não houve coleta de animais, devido
às condições climáticas que, provavelmente, influenciaram na distribuição
estacional dos indivíduos.
60
Para a análise da área celular foram aleatorizados testículos de cinco
animais por estação (fria/seca e quente/úmida) e de cada gônada obteve-se
cortes histológicos, onde foram analisados em três campos, também aleatórios,
do interstício testicular. De cada campo foram escolhidas aleatoriamente cinco
células de Leydig para a medida da área, totalizando quinze células por animal
e, portanto, um total de setenta e cinco células em cada estação.
Para a análise quantitativa das células de Leydig foram selecionados
testículos de dois animais por mês (ou seja, 10 animais por estação) e em cada
gônada foram feitos cinco cortes mediais e de cada secção foram aleatorizados
cinco campos, totalizando 250 campos para cada estação. As células de
Leydig foram contadas manualmente.
Análise Estatística:
Para a análise estatística, primeiro foi verificada a existência de valores
discrepantes (outliers) e, posteriormente, a normalidade dos dados foi testada
por D’Agostino-Pearson e quando necessários esses dados foram submetidos
à normalização (x + 0,5)
1/2
(Lehner, 1996). Utilizamos o teste t de Student, para
verificar se há variações sazonais referente à quantidade de células de Leydig
e o teste Mann-Whitney para a área celular. Foi considerado p 0,05 como
referência para se atribuir significância estatística, sendo todas as análises
baseadas em Zar (1999).
Os animais foram coletados de acordo com a licença do Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA:
02010.0003336/05-53) e o manuseio seguindo os princípios da Comissão de
Ética na Experimentação Animal (CEEA: 001/06).
61
RESULTADOS
Externamente revestindo o testículo encontra-se uma fina cápsula de
tecido conjuntivo, a túnica albugínea, e por transparência desta, observa-se
que as gônadas apresentam coloração branco-leitosa possivelmente devido ao
conteúdo espermático. Os testículos apresentam-se formados por unidades
circulares ou esféricas, conferindo um aspecto granuloso, que é referente aos
elementos seminíferos (Figura 1).
Delimitados por tecido conjuntivo, os lóculos seminíferos constituem
unidades morfológicas e apresentam-se constituídos por todos os tipos
celulares da linhagem germinativa (desde espermatogônias primárias a
espermatozóides maduros) (Figura 2).
A área intersticial é formada por fibras de tecido conjuntivo, fibroblastos
e capilares sanguíneos e muitas células de Leydig, as quais estão
uniformemente distribuídas em espaços angulares delimitados pelos lóculos
seminíferos. Estas células apresentam forma ligeiramente alongada ou ovalada
com o núcleo bem evidente e o citoplasma é muito reduzido (Figura 3).
Na análise da quantificação celular, houve diferença estatística entre as
duas estações (t=3,86; p=0,00) (Figura 4). Em relação à área das células de
Leydig também foi verificada diferenças estatísticas entre as estações
analisadas (U=1628,00; p=0,00) (Figura 5).
DISCUSSÃO
62
Histologicamente, os testículos são constituídos por uma rede de
estruturas seminíferas convolutas circundadas externamente pela túnica
albugínea. Entre os elementos seminíferos está presente o tecido intersticial,
com vasos sangüíneos, nervos, células de Leydig e outros elementos do tecido
conjuntivo (Lofts, 1974; Romer e Parsons, 1985; Duellman e Trueb, 1994;
Hildebrand, 1995).
As células de Leydig presentes nos testículos da maioria dos
vertebrados têm como função a secreção de andrógenos. Estes hormônios são
responsáveis pelo desenvolvimento, manutenção e regulação das
características sexuais secundárias e em grande extensão pela
espermatogênese (Smita et al., 2005). Em Dendropsophus minutus as células
de Leydig estão organizadas em espaços angulares, formado devido à
aproximação dos lóculos seminíferos, e se encontram homogeneamente
distribuídas no interstício. Estas células apresentam núcleo evidente e possui
forma ligeiramente alongada ou ovalada e com citoplasma bastante reduzido;
como também relatado em Scinax fuscovarius (Oliveira, 1996).
As gônadas de D. minutus apresentam coloração branco-leitosa
provavelmente devido ao conteúdo espermático. Observações diferentes
ocorrem em Eupemphix nattereri que apresenta células pigmentares presentes
no interstício testicular e confere a estes colorações variando do preto intenso
ao preto mesclado com branco (Oliveira e Zieri, 2005).
No parênquima testicular, as células da linhagem germinativa se
agrupam com células de sustentação, ou de Sertoli, e, assim, constituem cistos
espermatogenéticos ou espermatocistos (Santos e Oliveira, 2008). Cada cisto
agrupa células no mesmo estádio de diferenciação, estabelecendo uma
63
sincronia de desenvolvimento, uma característica comum dos anfíbios (Wake,
1968; Lofts, 1974; Franchi et al., 1982; Ucci, 1982; Cavicchia e Moviglia, 1983;
Rastogi et al., 1988, Báo et al., 1991; Oliveira, 1996).
De acordo com Rodrigues e Favaretto (1999) as células de Leydig estão
relacionadas com a espermatogênese. Para D. minutus as células de Leydig
são maiores e mais numerosas na estação fria e seca do que na quente e
úmida, portanto, o aumento na área e quantidade na estação fria e seca pode
ser um indicativo do início da produção de espermatozóides; já que de acordo
com Santos e Oliveira (2008) nos meses de maio, junho e julho há um aumento
de células em estágio inicial de desenvolvimento. Quando inicia a época
reprodutiva (de outubro a março), há um aumento de espermatozóides (Santos
e Oliveira, 2008) e uma diminuição das células de Leydig, o que sugere que o
conteúdo produzido por estas células podem ter sido utilizados no processo da
espermatogênese. Este fato é reforçado Minucci et al. (1990) quando trabalhou
com Rana esculenta e verificou a existência de comunicações celulares entre
as células de Leydig e o compartimento germinal.
Segundo Sasso-Cerri et al. (2004) a manutenção do peso testicular em
anfíbios que apresentam ciclo reprodutivo contínuo pode ser estar relacionada
com mudanças compensatórias no volume e densidade dos componentes
testiculares durante o ano. Dendropsophus minutus não apresenta variação do
peso e comprimento testicular ao longo do ciclo reprodutivo e também
apresenta ciclo reprodutivo contínuo (Santos, 2006), portanto as variações
ocorridas na quantidade de células de Leydig e espermatozóides devem ser de
forma compensatória ao ponto de não ocorrer mudanças nas estruturas
anatômicas e, ainda, podemos sugerir que dados da biometria das gônadas
64
não podem ser utilizados como parâmetros conclusivos para estudar a
“condição reprodutiva” de anuros de regiões tropicais corroborando com os
dados encontrados por Santos (2006).
65
CONSIDERAÇÕES FINAIS:
Não há alterações no peso e comprimento dos animais e dos
testículos durante o ciclo reprodutivo.
Não foram detectadas variações biométricas significativas entre o
testículo direito e esquerdo das espécies e nem variações no IGS.
O peso do fígado, estômago, intestino e os corpos adiposos quando
analisados separadamente não apresentam variações durante o
ciclo reprodutivo.
O peso de Dendropsophus minutus está associado à pluviosidade e
umidade relativa do ar.
O peso do fígado de Dendropsophus minutus está associado à
pluviosidade, umidade relativa do ar e fotoperíodo.
O tamanho dos testículos de Dendropsophus minutus e o peso
corporal de D. nanus apresentam-se correlacionados à umidade
relativa do ar e fotoperíodo.
O comprimento de D. minutus e D. nanus está inversamente
correlacionado com a temperatura do ar.
O peso dos testículos, do estômago/intestino de D. nanus estão
correlacionados ao fotoperíodo.
Ambas as espécies sofrem influência dos fatores ambientais.Para D.
minutus as células de Leydig são maiores e mais numerosas na
estação fria e seca do que na quente e úmida.
66
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UCCI, A. A. 1982. A fine-structural study of interstitial cell changes in the testes
of Necturus maculosus during a portion of the annual cycle, and possible
evidence for local feedback control by seminiferous epithelium. Amer. J.
Anat., 65(1): 27-38.
ZAR, J. 1999. Biostatistical analyses. Printice Hall, New Jersey, 663p.
WAKE, M. H. 1968. Evolutionary morphology of the caecilian urogenital system.
I. the gonads and the fat bodies. J. Morph., 126(3): 291-331.
70
FIGURAS
A
T
B
R
B
*
*
Figura 1
:
Forma, coloração dos testículos de
Dendropsophus minutus. A = B – baço, T – testículo, R – rim;
B = * detalhe mesoscópico de um lóculo seminífero. Aumento
37,5x
71
Figura 2
: Aspecto geral da arquitetura histológica testicular de
Dendropsophus
minutus. A e B - Reticulina de Gömöri, 400x; C e D - Hematoxilina/eosina,
400x; E e F –Azul de Toluidina com bórax, 400x e 1000x. TI – tecido
intersticial; LS – lóculo seminífero; CL - célula de Leydig; CS – célula de Sertoli;
F – fibroblasto; G – espermatogônia; C – espermatócitos em diferenciação; Es
– espermátides finais;Ez – espermatozóides;cabeça da seta – parede locular.
LS
TI
B
LS
CL
CL
C
CL
CL
F
CL
CS
C
CL
E
C
G
Ez
F
D
F
CL
LS
TI
Es
A
72
Figura 3:
Distribuição das células de Leydig no interstício testicular. Note
que as células de Leydig estão localizadas em espaços angulares formado
pela aproximação dos lóculos seminíferos. Estas células apresentam
núcleo evidente e possui forma ligeiramente alongada ou ovalada e o
citoplasma reduzido. LS: lóculo seminífero; Seta: célula de Leydig; CS:
capilar sanguíneo, aumento 1000X, Azul de Toluidina.
LS
LS
LS
CS
73
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Fria e Seca Quente e Úmida
Quantidade de células de Leydig
*
0
200
400
600
800
1000
Fria e Seca Quente e Úmida
Área celular
*
Figura 4: Média (
erro padrão=10) da quantidade de células de Leydig, quando
comparada entre as estações. Diferença estatística (*), (Teste t Student: t=3,86;
p=0,00).
Figura 5: Média (
erro padrão=5) da área das células de Leydig, quando comparada
entre as estações. Diferença estatística (*), (Teste Mann-Whitney: U=1628,00; p=0,00).
7
4
75
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