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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Diagnóstico da Anemia Infecciosa Eqüina: análise
comparativa de sistemas comerciais de diagnóstico por
imunodifusão
ANTONIA REGINA SESSA DA SILVA
Seropédica, RJ
Março de 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
Diagnóstico da Anemia Infecciosa Eqüina: análise
comparativa de sistemas comerciais de diagnóstico por
imunodifusão
ANTONIA REGINA SESSA DA SILVA
Sob orientação do professor
Dr. CARLOS MAZUR
e Co-orientação da professora
Dra. MARIA DAS GRAÇAS DANELLI
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências em
Microbiologia Veterinária.
Seropédica, RJ
Março de 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE VETERINÁRIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
VETERINÁRIA
ANTONIA REGINA SESSA DA SILVA
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências no curso de pós-graduação em Microbiologia Veterinária.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM ____/____/____
______________________________________________
Dr. Ana Maria Jansen, Ph. D, IOC-FIOCRUZ
_______________________________________________
Dr.Francisco Benedito Rangel Filho, Ph. D, UFRRJ
_______________________________________________
Dr. Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, UFMG.
Dedicatória
A Deus,
Pelo infinito amor de Pai.
Pelo motivo e razão de nossa existência.
Pela compreensão de nossa pequenez.
Venho neste momento, agradecê-lo pela oportunidade recebida, e
Oferecer esta conquista, que do alto me foi concedida, fruto de meu
Trabalho e recompensa D’aquele que iluminou todos os passos desta
Vitória, lembrando sempre, de todos que contribuiram e permitiram
A concretização de mais uma fase da minha vida.
Muito Obrigado Pai...
Dedicatória
Ao meu filho Celso Junior,
C
uja pureza e clareza de pensamentos
A mim revitaliza a todos os instantes,
Enfim,
Por ser a razão de todos os meus ideais...
Por ser a razão do meu viver...
Aos meus pais,
Ivanildo e Elisa (in memoriam)
Por permitirem a minha existência na plenitude de seu lar,
Que com muito amor, dedicação e esforço,
Ensinaram-me a amar ao próximo e os valores morais,
Que sem os quais, sei que não estaria aqui hoje,
Os retribuo com este momento especial de minha vida.
Ao meu esposo Celso Gomes
Com quem compartilho desta vitória, árdua
e conflitante, que hoje consigo vencer...
A minha sogra Maria do Perpetuo Socorro Gomes e todos os
familiares, que por menor que tenha sido a ajuda nesta
jornada,hoje consigo nestas linhas expressar um pouco do
meu carinho.
Aos meus irmãos,
Ivanildo,Paulo, Graziela, Elis, Antonio, Cristina, e João,
Estes e outros que durante as minhas existências
Puderam comigo conviver e sobre tudo me ensinar a
respeitar as diferenças de nossos pensamentos e ideais....
Obrigado pela oportunidade...
Dedicatória Especial “in memoriam”
A minha querida
avó Antonia,
que, da qual não só herdei o nome,
mas todos os ensinamentos milenares.
Como também a minha querida
mãe LISETTA,
Que apesar da breve jornada entre nós
Foram ambos os exemplos de dedicação e amor;
Ensinando-me a cada dia a trilhar
os caminhos da fé,da esperança e do amor ao próximo,
do desprendimento dos bens materiais
e mais importante ainda, lembrando-me sempre de suas
palavras, que o passado nós não poderíamos mudar,
o hoje, poderá ser melhor que ontem
e o amanhã, melhor ainda poderá ser.
Ofereço esta vitória em sinal de respeito e carinho.
Ao meu
Irmão Francisco Carlos,
Que sempre me apoiou e sinto apoiar
Com seu sorriso infantil e singelo....
Suas palavras de harmonia ....
Seu olhar confortante...
Muitas saudades .....
A todos os meus amigos que se foram,
Desta e de outras existências....
Obrigado....
Um dia nos encontraremos....
E quem sabe compartilharemos
A mesma alegria....
Agradecimentos
Aos meus Orientadores
Prof. Dr. Carlos Mazur
Profª. Dra. Maria das Graças Miranda Danelli.
Pela valorosa orientação, amizade, disponibilidade, oportunidade e
imprescindível colaboração para a concretização deste trabalho,
contribuindo inestimavelmente para a minha formação e enriquecimento
científico e moral, permitindo não só a realização de um sonho,
mas a certeza do início de uma nova e árdua meta profissional a cumprir.
Todo o meu respeito, admiração e amizade
Agradecimentos
Ao Prof. Sieberth do Nascimento Brito, pelo incentivo, calma e inesgotável boa vontade.
À equipe do Laboratório de Viroses Veterinária do Instituto de Veterinária da UFRRJ.
À equipe do Laboratório de Retroviroses do Departamento de Medicina
Veterinária Preventiva da UFMG, em especial aos Professores Rômulo
Cerqueira e Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, a Doutoranda Elizangela
Maiara dos Santos, a bolsista de Iniciação científica Fernanda Gonçalves de
Oliveira.
À amiga Fiscal Federal Agropecuário, Dra. Georgina Lages pelo carinho e
incentivo.
Aos Laboratórios Bruch do Brasil e Idexx pela doação dos kits.
Aos membros da Delegacia Federal de Agricultura no Rio de Janeiro em
especial aos coordenadores do Serviço de Sanidade Animal, aos Fiscais
Federais Agropecuários Dr. Everardo Duarte Machado – Coordenador da
CECAIE- RJ e ao Dr. Luis Carlos – PSA – Seropédica.
A toda equipe do Laboratório de Virologia do LANAGRO/MG, em especial aos
Drs. Áladio Lopes de Jesus (“O Despertar das Ilusões”), Anapolino Macedo de
Oliveira e ao colega Anselmo Rivetti.
Aos professores e funcionários do Curso de Pós-Graduação em Microbiologia
Veterinária, Instituto de Veterinária da UFRuralRJ e colegas de turma pelo
apoio e amizade.
Aos Professores Dra. Gloria Maria Direito e Francisco de Assis Baroni pela
imensa boa vontade, carinho e incentivo.
Aos funcionários do DPPG da UFRRJ em especial a atenção e carinho da
Decano de Pesquisa e Pós–Graduação Professora Áurea Echevarria.
À responsável técnica pelo Laboratório de AIE da PESAGRO – RJ, Dra. Jane
Garcia Pinheiro; Dr. Eduardo Gonçalves A. Batista, responsável técnico pelo
Laboratório de AIE da FUNDENOR – Campos; a Dra. Bianca Eloísa J.
Barbosa, responsável técnico pelo LAVET – Laboratório Vet (Três Rios) e ao
Dr. André Vianna Martins, responsável técnico pelo Laboratório do Posto de
Fomento de Teresópolis, pelo fornecimento dos soros.
A CAPES pelo financiamento deste experimento.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1
2. REVISÃO DE LITERATURA
4
2.1. A Eqüinocultura no Brasil 4
2.2. A Anemia Infecciosa Eqüina. 5
2.3. O Vírus da AIE 7
2.4. Epidemiologia 8
2.4.1. Transmissão 11
2.5. A AIE no Brasil 12
2.6. Aspectos legais do Diagnóstico da AIE 13
2.7. O Diagnóstico laboratorial da AIE 15
2.7.1. A Prova de Coggins 18
2.7.2. Prova de ELISA 19
3. MATERIAL E MÉTODOS
20
3.1. Soros de eqüídeos 20
3.2.2. Sistemas comerciais de diagnóstico da AIE (kits) 20
3.3. Imunodifusão em ágar gel (IDGA) 21
3.4. A Prova de ELISA 22
3.5. ANÁLISES DA REPRODUTIBILIDADE 23
3.5.1. Experimento 1. 23
3.5.2. Experimento 2. 23
3.5.3. Experimento 3. 24
3.6. Análises comparativas da visibilidade das linhas de precipitação 24
3.6.1. Análise da identificação dos kits 24
3.6.2. Caracterização da visibilidade das linhas de precipitação 24
3.8. Titulação dos antígenos A, B e C. 25
4. RESULTADOS
4.1. Prova de ELISA 25
4.2. Análises da reprodutibilidade 25
4.2.1. Experimento 1. 25
4.2.2. Experimento 2. 25
4.2.3. Experimento 3. 26
4.3. Análises comparativas da visibilidade das linhas de precipitação . 26
4.3.1 Análise da identificação do kit 26
4.3.2. Análise da visibilidade das linhas de precipitação 26
4.4. Detecção de reações inespecíficas 26
4.5. Titulação dos antígenos A, B e C 27
5. DISCUSSÃO
43
6. CONCLUSÕES
48
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
49
Anexo 1 64
Lista de Abreviaturas
µL – microlitros
ABCCM – Associação Brasileira dos Criadores do Cavalo Mangalarga
ABCCMM- Associação Brasileira dos Criadores do Cavalo Mangalarga Marchador
AIDS – acquired immunodeficiency syndrome
AIE – Anemia infecciosa eqüina
AM – Amazonas
CECAIE – Comissão Estadual de Controle da AIE
CNAIE – Comissão Nacional de Anemia Infecciosa Eqüina
CNC- Comissão Nacional do Cavalo
CRMV-RJ – Conselho Regional de Medicina Veterinária – Rio de Janeiro
DDSA - Divisão de Defesa Sanitária Animal
DER – Departamento de Estradas e Rodagem
DOU – Diário Oficial da União
EIAV – Equine infectious anemia virus
ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
FAIDS- feline acquired immunodeficiency syndrome
FCD – fixação de complemento direta
FCI – fixação de complemento indireta
FIV – Vírus da imunodeficiência felina
Gp45- glicoproteína 45
Gp90 – glicoproteína 90
GTA – guia de trânsito animal
HI- inibição da hemaglutinação
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDGA – imunodifusão em gel de Agar
IF- imunofluorescência
IgG –
imunoglobulina G
LDAIE – Laboratório de Diagnóstico da Anemia Infecciosa Eqüina
LVV – Laboratório de Virologia Veterinária
MAPA – Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
mg/mL – miligrama por mililitro
mL – mililitro
mm – milímetro
mM – milimolar
MS – Mato Grosso do Sul
MT – Mato Grosso
nm – nanômetros
OIE - Office International des Epizooties
OPD – ortofenilenodiamino
p26 - Proteína 26
PBS - Solução Salina Tamponada (phosphate buffered saline)
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase (polimerase chain reaction)
PIB - Produto Interno Bruto
PSI – Puro Sangue Inglês
RETROLAB – Laboratório de Retroviroses
rgp90 - proteína gp90 recombinante
RNA – ácido ribonucléico
SIV - Vírus da Imunodeficiência dos Símios
SN – Soro Neutralização
VAIE – Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina
VCAE – Vírus da artrite encefalite caprina
RESUMO
O Brasil possui atualmente o segundo maior rebanho de eqüídeos do mundo e a
Eqüideocultura Brasileira desempenha um importante papel no desenvolvimento do
setor de agronegócios. Entre as doenças infecciosas que afetam a eqüinocultura
nacional, a Anemia Infecciosa dos Eqüinos (AIE) tem se mostrado de difícil controle. A
AIE é causada por um retrovírus, apresenta uma distribuição mundial, e é reconhecida
como a mais importante doença dos eqüinos. Entre os sinais clínicos mais comuns, na
fase aguda da doença, encontram-se a anemia seguida de icterícia nas mucosas, edema
ventral, mioglobinúria, caquexia e, principalmente, febre intermitente. Como não há
tratamento, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) determina,
através de mecanismo legais, uma política de exame obrigatório em laboratórios
credenciados, para o transporte e comercialização de eqüídeos no País. O exame é
baseado na prova de Coggins, uma imunodifusão em ágar gel do soro do animal testado
contra antígeno do vírus da AIE. Como a infecção é vitalícia, animais soropositivos são
eutanasiados por Médicos Veterinários do MAPA. Considerando que a precisão dos
resultados é crítica, posto que animais falso positivos podem ser sacrificados
inutilmente, e falso negativos preservados como fonte de infecção, surgiu o interesse de
um análise sistemática da reprodutibilidade dos kits e possíveis fontes de erro no
diagnóstico. Para esta finalidade, soros positivos e negativos, referenciados pela
repetição dos testes de Coggins e ELISA, foram avaliados pela prova de IDGA,
comparativamente com três kits de diferentes fabricantes. Nos experimentos de
reprodutibilidade, observou-se uma grande distinção na qualidade da linha de
precipitação promovida pelos soros positivos nos testes nos diferentes kits. Este
fenômeno pode ser justificado pela utilização das condições técnicas legais,
determinadas por portaria do MAPA, que são distintas das recomendações dos
fabricantes de dois dos kits analisados. Mesmo assim, a avaliação da reprodutibilidade
dos resultados dos kits com os soros referenciados mostrou elevada correlação.
Palavras chave: anemia infecciosa eqüina, eqüinos, eqüídeos, lentivirus, retrovirus,
diagnóstico e IDGA.
ABSTRACT
Brazil has currently the second bigger flock of equines of the world and the brazilian
equines breeding plays an important role in the development of the sector of
agribusiness. Among the infectious disease that affect the national equines breeding, the
Equine infectious anemia (EIAV) has been shown of difficult control. The Equine
infectious anemia is caused by a retrovirus, it has a worldwide distribution, and it is
recognized as the most important disease of equines. The most common clinical signals
in the acute phase, are anemia followed of jaundice in the mucosae, ventral oedema,
mioglobinury, caquexy and, mainly, intermittent fever. Once it has no treatment,
Ministry of Agriculture, Cattle and Supplying determines, through legal mechanisms, a
politics of obligatory examination in credentialed laboratories, for the transport and
commercialization of equines in the country. The examination is based on the test of
Coggins, an immunodiffusion in agar gel (IDGA) of the serum of the animal tested
against antigen of the EIAV. As the infection is lifetime, positive animals are
euthanasiated by Veterinarians of the Ministry of Agriculture. Considering that
precision of the results is critical, once that false positives animals could uselessly be
sacrificed, and false negatives will be preserved as infection source, diverse problems
may occur, appeared the interest of a systematic analysis of the reproducibility of kits
and on possible sources of error. For this purpose, positive and negative sera, referred
by the repetition of the tests for Coggins and ELISA, had been evaluated by IDGA
comparatively with three kits of different manufacturers. In the experiments of
reproducibility, it observed a great distinction in the quality of the precipitation line
promoted for the positive sera in the tests. This phenomenon may be justified by the use
of the conditions techniques legal, determined for would carry of the Ministry of
Agriculture that is distinct of the recommendation of the analyzed manufacturers of two
of kits. Exactly thus, the evaluation of the reproducibility of the results of kits with the
referred sera showed high correlation.
Key words: Equine infectious anemia , equines, lentivirus, retrovirus, AGID.
LISTA DE QUADROS
Página
Quadro 1
Relação de animais testados para AIE de
1974 a 2004
10
Quadro 2
Comparação entre os vários testes
sorológicos em Anemia Infecciosa Eqüina
17
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1
Porcentagem de soros positivos e negativos
nos testes de IDGA e ELISA
25
Tabela 2
Reprodutibilidade das leituras de 90 soros
positivos feita pelos técnicos, com o uso dos
diferentes kits.
25
1. INTRODUÇÃO
O Brasil possui atualmente o segundo maior rebanho de eqüídeos do mundo,
com diversas raças nacionais como a Mangalarga, a Mangalarga Marchador, a
Campolina, o Pantaneiro e o Pampa (em formação), entre outras. A Eqüideocultura
Brasileira desempenha um importante papel no desenvolvimento do setor de
agronegócios. Cerca de um milhão e meio de pessoas estão registradas em associações
eqüestres, representando cerca de 700 mil empregos diretos e indiretos (Censo IBGE -
2002). O aquecimento da indústria eqüestre se traduziu em um crescimento médio de
8%, nos últimos dez anos, acima do desenvolvimento do PIB brasileiro, no período.
Diante desses números expressivos, em 1979, foi criada a Comissão Nacional do Cavalo
(CNC), com o intuito de reunir as associações de criadores de todo o País, e com isso
promover uma política que valorize cada vez mais este importante segmento.
Atualmente, o mercado brasileiro do cavalo vem sendo analisado com
interesse crescente. A atração que estes animais exercem movimenta a indústria do
setor, ligada inclusive às suas necessidades inerentes como equipamentos,
medicamentos, suplementos alimentares e recursos humanos no manejo das criações. O
cavalo hoje não é só considerado um animal de serviço, para muitos hoje é fonte de
renda e até mesmo de terapia. Na última década houve um crescimento em todos os
segmentos, desde insumos, até a própria valorização dos animais e o volume de eventos
eqüestres realizados (http//:www.crmvrj.com.br/editorial/II/2004).
A rápida evolução da importância sócio-econômica da Eqüideocultura
Brasileira aumentou o interesse e o investimento em Medicina Eqüina e em suas
principais doenças. A Anemia Infecciosa dos Eqüinos (AIE) é reconhecida como a mais
importante doença dos eqüinos e apresenta uma distribuição mundial. A AIE é uma
doença viral crônica, cosmopolita, que acomete eqüídeos de todas as idades. O vírus da
AIE (VAIE) se replica em macrófagos, monócitos e, após sua multiplicação na porta de
entrada, desenvolve uma viremia associada a células, que leva a generalização da
infecção (OAKS et al., 1998). Entre os sinais clínicos mais comuns, na fase aguda da
doença, encontram-se a anemia seguida de icterícia nas mucosas, edema ventral,
mioglobinúria, caquexia e, principalmente, febre intermitente (LEROUX et al., 2004).
A Comissão Nacional de Anemia Infecciosa Eqüina (CNAIE) foi criada em
1979, no Brasil, visando o combate à AIE, que representa sérias implicações produtivas,
comerciais e políticas, como perda de peso e morte dos animais, prejuízo na capacidade
de trabalho, diminuição do valor de mercado dos animais.
Preocupado com a disseminação desta virose, o Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento (MAPA) instituiu uma política de controle através de
Portaria, normatizando diversos aspectos do diagnóstico e controle da AIE. A Portaria
Ministerial n° 71 de 11/03/74 determina o diagnóstico laboratorial através da prova de
Coggins, detalhando seus aspectos técnicos, normas para credenciamento de técnicos e
laboratórios. Basicamente, a prova de Coggins é uma imunodifusão dupla entre o
antígeno do VAIE e os soros dos animais testados. O exame passou a ser obrigatório
para transporte e comercialização de eqüídeos em todo País e animais positivos devem
ser sacrificados por veterinários do MAPA (MAPA – BDSA -1974)
Os eqüídeocultores do Estado do Rio de Janeiro contam, atualmente, com 29
laboratórios credenciados para realização do diagnóstico da AIE, sendo que deste total
apenas cinco são ligados a órgãos oficiais. Devido ao aumento da importância
econômica dos eqüídeos, a grande maioria dos laboratórios é particular, que estão
distribuídos por diversas regiões do Estado. Na década de 70, apenas o laboratório do
Jóquei Club do Rio de Janeiro realizava este exame (MAPA – BDSA -1974).
O Laboratório de Diagnóstico da Anemia Infecciosa Eqüina do Instituto de
Veterinária da UFRRJ (LDAIE/UFRRJ) iniciou suas atividades em 1987. Em 1999, a
Universidade firmou um convênio com o Departamento de Estradas de Rodagem (DER)
e a Concessionária Nova Dutra, com o objetivo de viabilizar a apreensão de animais
(eqüídeos e bovinos) abandonados às margens das rodovias federais. O convênio
estabeleceu que os animais recolhidos pelo DER seriam encaminhados ao Curral de
Apreensão da UFRRJ, para um posterior resgate por seus proprietários. A liberação dos
eqüídeos ficou vinculada à realização de prova de IDGA, realizada no LDAIE/UFRRJ.
Animais soronegativos foram liberados para o resgate, enquanto os soropositivos foram
sacrificados, segundos normas do MAPA. Desde então, cerca de 11000 animais
tiveram seus soros examinados pela prova de Coggins nas suas instalações.
Durante o período de atuação do LDAIE/UFRRJ, ocasionalmente, foram
observados problemas na interpretação dos resultados da prova de IDGA (Coggins),
essencialmente, dificuldades na observação correta (leitura) da linha de precipitação do
complexo antígeno-anticorpo. Através de contatos pessoais com outros veterinários
credenciados, também foram assinalados problemas como reações inespecíficas, linhas
duplas ou fracas e diferenças na formação das linhas de precipitação entre kits de
fabricantes distintos. Além destes aspectos, os representantes comerciais nacionais
oferecem produtos oriundos de importação, por vezes, com tecnologias distintas de
produção dos reagentes dos sistemas comerciais (kits) de diagnóstico. Tais fatores
podem interferir na precisão do diagnóstico com conseqüências significativas para o
controle da AIE e questões bioéticas.
Como objetivo, dentro deste contexto, este trabalho pretendeu avaliar os
vários kits comercializados no País, promovendo um estudo comparativo, de acordo
com as normas técnicas preconizadas pelo MAPA para a prova de Coggins.
Especificamente, a análise foi baseada na observação da reprodutibilidade das leituras
dos três técnicos credenciados do LDAIE-UFRRJ, em relação a soros com leituras
referenciadas, considerando também a visibilidade das linhas de precipitação obtidas
pelo uso sistemas comerciais, visando determinar a melhor relação custo benefício, por
animal testado.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. A Eqüideocultura no Brasil
Os primeiros cavalos do Brasil (Equus caballus) foram introduzidos no País
no século XVI, pelos colonizadores portugueses. Derivados das quatro raças então
existentes na Península Ibérica (Marismenho, Garrano, Andaluz e Berbere), os cavalos
foram levados, inicialmente, para Pernambuco e depois Bahia e São Paulo. Do
Nordeste, os eqüinos se disseminaram a partir de Pernambuco e Bahia, acompanhando o
gado, margeando o Rio São Francisco (COSTA, 2002).
Posteriormente, a descoberta de ouro e diamantes trouxe grande afluência de
pessoas e destes animais para Minas Gerais. No sul do País, a venda de animais tornou-
se próspera e crescente. Imensas tropas, constituídas de cavalos, jumentos (Equus
asinus) e muares foram direcionadas para venda aos mineradores e contratadores do
ouro (COSTA, 2002). Tais animais não apresentavam nenhum tipo de padronização, a
preocupação era apenas funcional e aqueles que não se prestavam para sela eram de
imediato destinados à carga. Somente em 1934, foi fundada a primeira associação de
criadores reconhecidamente brasileira, a Associação do Mangalarga, que deu origem a
primeira raça tipicamente nacional, reconhecida pelo Ministério da Agricultura
(<http://www.abccmm.gov.br/historia>).
O controle da AIE é baseado em estratégias inflexíveis, aplicadas a extensas
regiões geográficas, sem levar em consideração as características que diferenciam a
ocorrência da enfermidade em ecossistemas distintos. Estes programas, que
normalmente exigem mobilização de vultuosos recursos econômicos e humanos,
nem
sempre resultam em solução ou alterações significativas do problema. Desta forma,
programas sanitários de combate às enfermidades devem se fundamentar não mais em
modelos funcionais agente-infecção-enfermidade-imunidade, mas em estudos regionais
cujo enfoque social determine tratamento diferenciado, conforme suas características
regionais de ocorrência.. Porém, para que este programa seja executado com êxito,
deverá haver uma enorme interação não somente de órgãos oficiais, veterinários de
campo, criadores e principalmente daqueles que dependem destes animais como fonte
de trabalho e renda (BEVILACQUA, 1993).
2.2. A Anemia Infecciosa Eqüina.
A AIE é uma doença viral crônica, cosmopolita, que acomete eqüídeos de
todas as idades. O vírus da Anemia infecciosa Eqüina (VAIE) replica-se em monócitos
e macrófagos, após sua multiplicação desenvolve uma viremia associada a células, que
leva a generalização da infecção (OAKS et al., 1998). Entre os sinais clínicos mais
comuns, na fase aguda da doença, encontram-se a anemia seguida de icterícia nas
mucosas, edema ventral, mioglobinúria, caquexia e, principalmente, febre intermitente
(LEROUX et al., 2004).
A AIE apresenta, clinicamente, as formas aguda, subaguda crônica e
inaparente ou assintomática (ISSEL & COGGINS, 1979). Na infecção persistente, o
curso crônico e os freqüentes ataques febris sugeriram aos primeiros pesquisadores uma
ausência ou comprometimento da resposta imune, no entanto, vários testes
demonstraram a presença de anticorpos para o VAIE e também da resposta imune
mediada por células (REIS, 1984). Vários estudos estão sendo feitos visando um melhor
entendimento sobre imunidade celular e humoral induzida em animais infectados com o
VAIE, que dependem da replicação nos macrófagos tissulares e da liberação dos virions
na circulação (HAMMOND et al., 2000)
A infecção é vitalícia, apesar dos animais acometidos apresentarem uma
forte resposta imune. A persistência da infecção pode ser compreendida em função da
inserção do material genético no genoma de células hospedeiras (integração). Alguns
animais morrem durante a fase aguda ou crônica da doença. Nos sobreviventes, os
episódios de doença tornam-se menos freqüentes e intensos e, depois de um ano, o
animal entra no estágio de portador assintomático (SELLON et al., 1996c; COOK et al.,
2001; LEROUX et al., 2004).
As infecções pelo VAIE resultam em altos títulos virêmicos dentro de três
semanas após a infecção. Várias evidências sugerem que as respostas celulares e
humorais específicas são necessárias para o término da viremia inicial e a replicação
viral é reduzida a níveis baixos, em animais que evoluem do estágio crônico para
portador inaparente.
A importância da resposta imune no controle da AIE foi demonstrada por
imunossupressão experimental em animais assintomáticos, que levou ao aparecimento
dos episódios da doença várias décadas, após a infecção (KONO et al., 1976). Diversos
estudos sugerem que durante o curso da infecção, o hospedeiro desenvolve uma
resposta imune efetiva e duradoura, capaz de manter a replicação viral abaixo do limiar
para a indução da doença (HAMMOND et al., 2000).
O desaparecimento da viremia inicial plasmática coincide com a emergência
de linfócitos T citotóxicos (CD8+) e anticorpos não neutralizantes, específicos para o
VAIE (McGUIRE et al., 1994; PERRYMAN et al., 1988).
Animais infectados pelo VAIE desenvolvem anticorpos para as
glicoproteínas de superfície (gp90) e transmembrana (gp45), e a principal proteína do
core viral, a p26. Apesar de ser a proteína viral majoritária, a resposta humoral para a
p26 é de 10 a 100 vezes menor do que para a gp90 e gp45 (HAMMOND et al.,2000).
Como previamente descrito para HIV e SIV (simian immunodeficiency
virus), a evolução do gene env favorece o VAIE no escape dos linfócitos T citotóxicos e
dos anticorpos específicos (MEALEY et al., 2003; CARPENTER et al., 1987). Os
anticorpos neutralizantes capazes de bloquear o estrato infectante, usualmente emergem
somente depois de 2 a 3 meses pós-infecção, sugerindo que não são responsáveis pelo
término do episódio agudo inicial. Estudos sobre o VAIE indicam que o papel dos
anticorpos neutralizantes na infecção ainda é incerto. Apesar disso, a recrudescência da
doença está associada com a emergência de variantes que escapam dos anticorpos
neutralizantes, sugerindo que a resposta neutralizante é eficiente no controle da
replicação das variantes virais (LEROUX et al., 1997; LEROUX et al., 2001;
MONTELARO et al., 1984; KONO et al., 1969; 1976)
Estudos detalhados de resposta humoral na evolução de estágio crônico para
portador inaparente descreveram uma evolução gradual durante os primeiros dez meses
após a infecção. Durante este período, anticorpos específicos para o VAIE sofrem
maturação de especificidade e avidez, talvez por mudanças conformacionais que
contribuem para a manutenção da AIE na fase assintomática (HAMMOND et al., 2000).
As lesões anatomopatólogicas causadas pelo VAIE são variáveis,
dependendo do estágio clínico da doença. As lesões associadas a quadros de infecção
ativa incluem linfadenopatia generalizada, hepato-esplenomegalia, anemia, sufusões e
edema. As lesões microscópicas mais comuns incluem a lipidose hepática, necrose
hepatocelular, hemossiderose e infiltrado linfocitario perivascular na maioria dos
tecidos. A necrópsia de cavalos no estágio assintomático da doença geralmente é
inconclusiva (LEROUX et al., 2004).
Não há tratamento ou vacinas disponíveis, atualmente. Recentemente, uma
pesquisa avaliando a eficácia de uma vacina, produzida a partir da utilização de vírus
atenuados, foi reportada (CRAIGO et al., 2002).
2.3. O Vírus da AIE
O VAIE, membro da família Retroviridae, gênero Lentivirus, afeta todos os
membros da família Equidae e está distribuído mundialmente (ISSEL & COGGINS,
1979, CLABOUGH, 1990; COOK et al., 2001). Seu virion, com 80 a 100 nm, é
envelopado e apresenta um capsídeo icosaédrico envolvendo um nucleocapsídeo
helicoidal com duas fitas de RNA linear, de sentido positivo (FENNER et al., 1993;
SUGIURA & NAKAGIMA, 1986; LEROUX et al., 2004). Sua replicação durante os
episódios febris ocorre, predominantemente, nos macrófagos teciduais, principalmente
do baço, fígado, linfonodos, pulmões, rins e na glândula adrenal. No processo
infeccioso, a viremia e a subseqüente disseminação viral por todo o organismo animal
dependem da replicação nos macrófagos tissulares e da liberação dos virions na
circulação. Os altos títulos de viremia estão associados com os sinais clínicos mais
característicos da doença tais como febre, depressão e trombocitopenia (SELLON et al.,
1994; SANTOS, 2006 ).
O VAIE é sorologicamente relacionado com outros lentivírus, incluindo os
Vírus da Artrite-Encefalite Caprina (VCAE), Maedi/Visna dos Ovinos, da
Imunodeficiência Felina (FIV), Imunodeficiência de macacos (SIV) Imunodeficiência
humana (HIV) (FENNER et al., 1993, SUGIURA & NAKAGIMA, 1986). Ao longo
dos anos, o VAIE tem tido um papel especialmente importante em patologia comparada
e em estudos recentes sobre a síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS)
(LEROUX et al., 2004).
O VAIE é único entre os lentivírus, considerando-se que a resposta febril
aguda, associada à viremia, é seguida de ciclo recorrentes da doença e, nos
sobreviventes, por um período assintomático posterior (MONTELARO et al., 1984;
COOK et al., 2001). O papel da variabilidade genética dos lentivírus no
desenvolvimento da doença não está claramente estabelecido. Enquanto infecções como
a do HIV e outros lentivírus, geralmente, resultam em doenças progressivas e longas, a
rápida progressão da infecção por VAIE, em alguns casos, constitui um modelo único
no qual podemos analisar a ligação entre a variação genética e o desenvolvimento dos
sintomas clínicos (LEROUX et al., 1997; ZHANG et al., 1993, SANTOS, 2006).
As propriedades antigênicas do VAIE dependem de numerosos grupos de
antígenos com propriedades diferenciadas. As proteínas internas p26 e p15 induzem a
formação de anticorpos detectáveis pelas técnicas de fixação de complemento,
imunofluorescência e imunodifusão. Estas proteínas são estáveis e são os antígenos
utilizados nos testes diagnósticos. Já as glicoproteínas gp45 e gp90 intervêm na reação
de neutralização viral e são utilizadas nas provas de ELISA (TOMA et al., 1980).
Durante a fase crônica ou assintomática, a viremia normalmente não pode
ser detectada, através de métodos convencionais de isolamento viral. Entretanto,
animais assintomáticos podem ser identificados, usando-se técnicas mais sensíveis,
como a PCR, para detectar a presença de ácidos nucléicos virais no sangue e nos tecidos
(LANGEMEIER et al.,1996; OAKS et al., 1998; HARROLD et al., 2000), ou pela
utilização de testes sorológicos (ISSEL & COGGINS, 1979; MATSUSHITA et al.,
1989, SANTOS, 2006).
2.4.Epidemiologia
De acordo com a Secretaria de Defesa Agropecuária do MAPA, o Estado
Mato Grosso foi a Unidade Federativa que apresentou maior numero de focos de AIE
nos últimos anos. Foi estimado mais de 50% do rebanho do Pantanal esteja infectado e
que desse total, 90% seriam animais de serviço (EMBRAPA, 2004).
O quadro 1., abaixo, apresenta a evolução dos esforços de identificação de
animais positivos pela prova de Coggins, de 1986 a 2004.
A AIE, no Brasil, se apresenta sob duas formas: a que ocorre no âmbito das
entidades hípicas e a que ocorre no campo. A primeira, com já demonstrado, é
perfeitamente controlável, dada à facilidade de acesso ao diagnóstico laboratorial,
manejo adequado dos animais e descarte dos positivos; a segunda, em virtude de
características do meio, sócio-econômicas e políticas, é extremamente difícil de ser
controlada de forma eficiente. Outro fato interessante em observação é que animais de
jóqueis clubes e hípicas foram os prováveis responsáveis pela disseminação da AIE no
campo (CESAR, 1982)
A primeira forma da AIE no Brasil ocorreu no âmbito das entidades hípicas
fechadas. Os estudos da época demonstraram uma prevalência elevada no início do
período para a raça puro sangue inglês (PSI) em Jóquei Clubs e Sociedades Hípicas,
principalmente entre 1973 e 1976. Devido à facilidade de controle da doença nestes
locais, o surto foi rapidamente erradicado nos animais PSI e, conseqüentemente a
doença praticamente desapareceu destas entidades, que hoje recebem, em sua maioria, o
status de entidades controladas. Quanto à segunda forma, a doença no campo, a AIE
estaria disseminada em outras raças e em animais mestiços localizados em fazendas de
criação (DUPONT et al., 1968).
A AIE vem se mantendo no campo ao contrário do que ocorreu nas
entidades hípicas, influenciando o manejo, uma vez que os animais de raça são criados
sob melhores condições e têm como finalidade a reprodução ou exposição, pois em
geral possuem valor zootécnico elevado. Os eqüídeos destinados ao serviço, geralmente
mestiços devido ao sistema de criação, são freqüentemente submetidos a estresse e a
todos os tipos possíveis de veiculação e exposição ao VAIE. Nestes animais, a doença é
extremamente difícil de ser controlada eficientemente. Os animais mestiços, que são
extremamente importantes nas atividades econômicas do homem do campo,
dependendo da região do Estado, têm importância vital, como única forma de transporte
e renda (BELIVACQUA, 1993).
Várias dificuldades impediram até hoje a adoção rigorosa das estratégias de
controle estabelecidas pela CNCAIE. Segundo a legislação brasileira, os animais
positivos devem ser sacrificados sem qualquer indenização. O transporte interestadual
de eqüídeos é problemático, a identificação exata do animal, na maioria das vezes é
falha. O cumprimento da legislação é aceitável entre os criadores e treinadores de
animais de raça e competição. Entretanto, animais de menor valor continuamente são
transportados ou vendidos sem procedimentos de controle a AIE e outras doenças.
Nestes grupos encontramos, com freqüência, uma grande quantidade de animais
infectados, dificuldade relatada em vários países das Américas (CAMPBELL &
NUSBAUM, 1991). Desta forma, animais de serviço dificilmente são sacrificados e
atuam como fontes de infecção no campo (BELIVACQUA, 1993).
Com a falta de vacinas eficazes, o controle da AIE nos eqüídeos se faz com a
identificação, segregação ou sacrifício dos animais infectados. Somente em países como
China e Cuba tem sido executado um programa de vacinação usando amostras
atenuadas do VAIE, que parece proteger os animais apenas contra variantes homólogas
do vírus (MONTELARO et al., 1993). Outros programas de vacinação estão sendo
desenvolvidos, porém sem o respaldo da comunidade cientifica. O desenvolvimento de
uma vacina eficaz contra lentivírus, como VAIE, HIV-1 e HIV2, é o principal desafio
deste século (LEROUX et al., 2004).
Em regiões como o Pantanal Brasileiro, com alta prevalência da doença, o
sacrifício de todos os animais positivos comprometeria significativamente ou mesmo
inviabilizaria a pecuária extensiva, que é a principal atividade econômica na região.
Uma alternativa de controle da AIE, baseada na segregação dos animais positivos, tem
sido adotada em alguns países como nos EUA e proposta como estratégia prática de
prevenção e controle para a região do Pantanal (SILVA et al., 2001).
Quadro 1. Relação de animais testados para AIE de 1974 a 2004
ANO FOCOS
ANIMAIS
TESTADOS
POSITIVOS %
1974
1975
1976
1977
1978
1979
1980
1981
1982
1983
1984
1985
1986
34
146
272
336
330
479
1.058
844
882
863
962
1320
2.206
28.653
46.241
42.257
76.058
96.503
104.508
171.433
141.510
155.787
167.746
199.751
214.860
314.531
333
1.527
2.697
3.499
2.795
3.567
7.365
4.636
3.895
3.577
4.390
5.606
8.845
1,16
3,30
6,38
4,60
2.89
3,41
4,30
3,28
2,50
2,13
2,20
2,61
2,81
1987 2.033 289.870 7.176 2,48
1988 1703 264.462 6.101 2,31
1989 2.153 309.494 7.656 2,47
1990 1.969 270.088 6.032 2,23
1991 1.963 312.747 5.274 1,69
1992 1.482 252.637 4.141 1,63
1993 1.669 238.198 4.055 1,70
1994 1.633 145.880 3.799 2,60
1995 1.562 178.813 4.145 2,32
1996 1.471 186.583 4.322 2,32
1997 1.592 137.226 4.476 3,26
1998 1.621 131.991 3.689 2,79
1999 1.841 156.152 4.037 2,59
2000 1.964 235.739 4.446 1,89
2001 2.334 200.854 4.243 2,11
2002 2.299 220652 3.892 1,76
2003 3.616 340.928 7.513 2,20
2004 3.135 310.346 7.865 2,53
Fonte: MAPA (4˚ Seminário para Habilitação de Médicos Veterinários para o
Diagnóstico da Anemia Infecciosa Eqüina – 2006 p. 23 - 24).
Almeida e colaboradores (2006), em recente estudo sobre a prevalência da
AIE em eqüídeos de serviço no Estado de Minas Gerais, considerando uma amostragem
de 6540 soros oriundos de todas as regiões do estado, após analise realizadas pelas
provas de IDGA e ELISA, obtiveram uma prevalência 3,1% para animais, levando a
concluir que o Estado de Minas Gerais é uma área endêmica para AIE.
2.4.1. Transmissão
A transmissão horizontal da AIE ocorre, principalmente, quando animais
portadores quando apresentam picos de viremia neste momento a transmissão pode
ocorrer por contato sexual ou indireto (FERRAZ, 1990). Contudo, o VAIE é transmitido
entre animais infectados e não infectados, principalmente, pela transferência mecânica
de sangue. . Este processo ocorre comumente durante a alimentação interrompida de
insetos hematófagos, especialmente tabanídeos, e por moscas dos estábulos (Stomoxys
sp) e também por alguns culicóides (GREENBERG, 1973; LEROUX et al., 2004).
Biberstein & Yan, 1994, relataram um caso de transmissão de AIE que
ocorreu no momento da cópula, de uma fêmea soropositiva com um macho
soronegativo com lesão no pênis, que favoreceu a infecção. Biberstein & Yan, 1994
citam ainda que em potros nascidos soronegativos poderiam se infectar pelo leite das
mães positivas (KNOWLES 1975; BLOOD & RADOSTITS, 1991.).
Um dos principais veículos de transmissão do VAIE são os tabanídeos que
foram amplamente investigados (ISSEL & COGGINS, 1979;FOILD et al.,(1983);
ISSEL et al.,1988; LEROUX et al., 2004). Mais recentemente, Barros, 2001, descreveu
a sazonalidade e a abundância tanto de tabanídeos, como de outras moscas no Brasil,
principalmente, no Pantanal Mato-grossense (EMBRAPA – 1993).
Segundo Shen e colaboradores (1972), os principais meios de transmissão da
AIE são instrumentos infectados, transmissão congênita e por picadas de moscas
hematófagas, atribuindo ao homem a principal fonte de infecção da doença em sua
forma iatrogênica.
O VAIE no aparelho bucal dos tabanídeos permanece infectivo por apenas
quatro horas (ISSEL & FOIL, 1984). A importância destes insetos como vetores do
VAIE é devida, principalmente, às características morfológicas do seu aparelho bucal.
Em função da sua picada extremamente dolorosa, geralmente, o repasto sanguíneo é
interrompido pela reação do animal portador atingido, eventualmente levando o vetor
para outros animais. Outras formas de transmissão podem ocorrer, como pela via
sexual, através do sêmen contaminado, transmamária, transplacentária e fômites, porém
são menos significativas epidemiologicamente (FENNER et al, 1993; ISSEL & FOIL,
1984; LEROUX. et al., 2004).
Há maior probabilidade de transmissão a partir de animais febris, que
favorecerem a propagação epizoótica, porém animais portadores permanecem virêmicos
indefinidamente, atuando como fonte de vírus, em condições de campo. Portanto, os
eqüídeos soropositivos em geral são considerados fonte de infecção (ISSEL & FOIL,
1984; LEROUX et al., 2004).
2.5. A AIE no Brasil
De acordo com Dupont e Dacorso Filho, não há dúvidas que a AIE foi
trazida ao Brasil pela importação de cavalos de corrida, provavelmente, através da
fronteira da Região Sul, de onde se disseminou por todo Território Nacional. Foi
observado um crescimento estatístico de casos em áreas de baixa ocorrência, associado
ao crescimento econômico, surgimento de novos criatórios e a utilização cada vez maior
destes animais, tanto na lida como em atividades de lazer (DUPONT & DACORSO
FILHO, 1968).
A AIE foi diagnosticada pela primeira vez no Brasil em 1968, no então
Estado da Guanabara por Dupont e colaboradores (1968). Na época, o diagnóstico era
baseado, principalmente, em achados de sideroleucócitos (macrófagos contendo
hemossiderina) e pelos desvios de valores de proteínas totais e frações em relação
albumina/globulinas do soro sanguíneo de eqüinos, obtidos através do perfil
eletroforético, dosagem de proteínas séricas totais e frações seroprotéicas. Estes
achados e a presença de depósitos de ferro em órgãos do sistema retículo endotelial
eram atribuídos unicamente à destruição de hemácias provocadas pela ação viral
(HENSON, 1972).
Por outro lado, animais negativos pela imunodifusão podem se apresentar
positivos ao teste de gamaglobulina e de sideroleucócitos. Atualmente, são reconhecidas
doenças como a babesiose, nutaliose e tripanossomíase eqüina que provocam
aparecimento de sideroleucócitos no sangue (HAWKINS et. al., 1976)
No mesmo período a doença foi descrita por Silva e colaboradores (1968)
em animais do Clube Hípico Fluminense e em um animal da cavalaria da Policia Militar
na cidade de Niterói, no Estado do Rio de Janeiro. Guerreiro e colaboradores (1968)
também descreveram o primeiro caso confirmado da AIE no Estado do Rio Grande do
Sul. Em Minas Gerais, a doença foi diagnosticada pela primeira vez por Batista &
Fonseca (1971) em um cavalo PSI no qual foi feita a transferência de infectividade
(sangue) a um cavalo sadio, com a concomitante reprodução da doença (REIS, 1997;
2003; FERRAZ, 1998; HU, 1990).
2.6. Aspectos legais do Diagnóstico da AIE
A prova de imunodifusão (teste de Coggins) foi oficializada no Brasil, pela
Portaria Ministerial n° 71 de 11/03/74, para efeito de diagnóstico da AIE (BOLETIM
DE DEFESA SANITÁRIA ANIMAL, 1974).
Segundo a CNAIE, em cada unidade da federação, o combate à AIE seria
feito através da Comissão Estadual de Controle da Anemia Infecciosa Eqüina
(CECAIE), de acordo com o regimento aprovado pela portaria DNPA n° 29 de
19/05/76, publicada no Diário Oficial da União 103 de 01/06/76 (CESAR, 1982).
O CNAIE estabeleceu que o programa nacional de combate à AIE deveria
considerar a ocorrência diferenciada da doença nas diversas regiões, os variados
sistemas de produção e utilização dos eqüídeos, e, ainda definir e estabelecer áreas
indenes, paraendêmicas, epiendêmicas e endêmicas. As práticas de controle adotadas
foram o diagnóstico e sacrifício obrigatório dos animais positivos no teste de Coggins e
rígido controle da movimentação interna e externa nas áreas geográficas, segundo a
caracterização epidemiológica da AIE (CESAR,1982).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), no tocante
ao controle da AIE, possui uma política bastante eficiente, considerando-se todos os
procedimentos contidos em suas Portarias (Portaria SNAD n°. 92, de 14.11.79.
publicada no DOU de 30/11/79). Esta Portaria determina o sacrifício de animais
soropositivos, que atuam como fonte de infecção, uma vez que a não há tratamento. Em
áreas endêmicas, como alguns estados (MT, MS, AM), foi definida uma política
diferenciada. Animais soropositivos são sacrificados sempre que possível. Entretanto,
onde há carência de recursos, a condição sócio-econômica pode justificar a aplicação do
manejo em segregação destes animais, como em fazendas de criação extensiva de
bovinos(http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/LEGISLACAO/P
UBLICACOES).
A legislação vigente no país, Instrução Normativa n° 45, de junho de 2004,
estabelece o isolamento ou sacrifício do animal portador e determina que as ações de
controle da enfermidade sejam definidas pelas CECAIES, de acordo com as condições
epidemiológicas peculiares de cada estado. Algumas medidas podem ser adotadas no
controle da AIE, dentre elas podemos citar:
• Uso de seringas e agulhas descartáveis individualizado;
• Limpeza de todos os utensílios utilizados nos animais;
• Isolamento dos animais positivos até a realização do sacrifício;
• Sacrifício dos animais positivos à prova de Coggins;
• Submeter ao exame de diagnóstico todo o eqüídeo antes do seu trânsito;
• Realização de exame diagnóstico para AIE para os animais adquiridos em
leilões, feiras ou de outras propriedades.
O trânsito interestadual de eqüídeos somente é permitido quando os animais
estão acompanhados da Guia de Trânsito Animal (GTA). Na emissão de GTA para
eqüídeos com mais de seis meses de idade, é obrigatória a apresentação do exame com
resultado negativo para AIE.
A participação de eqüídeos em leilões, feiras, rodeios, exposições, torneios e
demais concentrações somente é permitida a animais com atestado de exame oficial
com resultado negativo para AIE, que tem validade de 60 dias.
Outro tópico significativo da política ministerial se refere ao credenciamento
dos técnicos e laboratórios. Após a realização de vários seminários e encontros de
especialistas e pesquisadores da AIE, no início dos anos 70, o MAPA passou a adotar
critérios para a realização dos testes laboratoriais, incluindo o credenciamento de
laboratórios e médicos veterinários. Para tanto, foram criados laboratórios de referência
para o diagnóstico da AIE. Com a divulgação da Portaria Ministerial n° 71 de 11/03/74,
(BOLETIM DE DEFESA SANITÁRIA ANIMAL, 1974) o treinamento de técnicos em
conformidade com a Portaria passou a ser exigido aos laboratórios interessados. Na
Região Sudeste, a época pode-se destacar o Laboratório do Jóquei Club do Rio de
Janeiro que, desde a aprovação e padronização da técnica passou a ser considerado
como um laboratório de referência para o diagnóstico e treinamento de técnicos.
O SNDA normatiza através das determinações constantes das Portarias Nº
53 do SNAD de 20 de maio de 1991 e Nº 1 da Divisão de Laboratório Animal (DLA) de
14 de agosto de 1991, que versam sobre o credenciamento e monitoramento de
laboratório de diagnóstico de AIE, dando embasamento a Portaria Nº 84 de Outubro de
1992, esta Portaria, e até hoje tida como a mais completa e elaborada visando o
diagnóstico e controle da AIE no País
(<http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/LEGISLACAO/PUBLI
CACOES>).
Hoje existem vários Laboratórios Nacionais Agropecuários (LANAGROS)
que habilitam médicos veterinários oferecendo cursos teóricos e práticos, sob a forma
de seminários. O curso consiste de parte abordando a AIE, métodos diagnósticos,
imunologia da doença, preparo de soluções, cuidados com vidrarias e equipamentos,
desinfetantes e desinfecção, introdução ao sistema de qualidade a ser implantado em
todos os laboratórios credenciados, técnica de resenha de eqüídeos, legislação da defesa
sanitária animal nos diferentes Estados da Federação. Ao final do curso todos os
candidatos são submetidos a uma prova prática de leitura de dez lâminas de IDGA com
os mais variados resultados. Para o credenciamento, o candidato deve alcançar 100% de
acerto, nas lâminas oferecidas.
Atualmente, com a divulgação da Instrução Normativa Nº 45, de 15 de
junho de 2004, do MAPA, que em seu conteúdo apresenta a preocupação de
uniformizar o diagnóstico e controle desta doença. (Brasil, 2004), esta depositando no
responsável técnico grande responsabilidade. Todos os médicos veterinários
credenciados são convidados todos os anos a participar de seminários nas diversas
unidades federativas, para
reciclagens.(<http://www.agricultura.gov.br/pls/portal/docs/PAGE/MAPA/LEGISLAÇ
AO/PUBLICACOES>)
2.7. O Diagnóstico laboratorial da AIE
Desde de a sua adaptação por Coggins, o teste de imunodifusão (IDGA)
tornou-se um padrão para o diagnóstico desta doença no mundo todo. O método é
baseado na migração do antígeno comercial e dos anticorpos presentes no soro animal,
em um meio semi sólido (ágar gel), que formam uma linha precipitação visível a vista
desarmada, em caso de identidade. É uma prova qualitativa reconhecida como o método
mais importante no diagnóstico da AIE, por ser de fácil execução e com especificidade
de 95%. A prova detecta anticorpos precipitantes específicos entre 14 e 45 dias após a
infecção (COGGINS et al., 1972). Apesar de considerado como teste específico para o
diagnóstico desta doença, o método não detecta anticorpos para VAIE nos estágios
iniciais da infecção (REIS, 1997). A possibilidade de reação cruzada com a proteína de
matriz de envelope (MA) de outros lentivírus e a resposta intermitente da p26 são
descritas (LANGEMEIER et al., 1996). Em muares e asininos, que por muitas das vezes
apresentam níveis muito baixos de viremia, o teste apresenta uma limitação perigosa,
uma vez que animais negativos ou duvidosos pela imunodifusão podem servir como
fonte de propagação (TOMA, 1980; ISSEL & ADAMS, 1982; PARÉ J. & SIMARD C.
2004).
A IDGA como um grande número de testes sorológicos baseia-se,
principalmente, na detecção de anticorpos para a proteína de core viral p26 que é
conservada. Um dos principais alvos da resposta imune, quase todos os animais
infectados produzem anticorpos específicos para a p26 (REIS, 1997).
Testes diagnósticos mais sensíveis e aplicáveis para o diagnóstico da AIE
ainda são uma prioridade importante na medicina de eqüinos (MONTELARO et al.,
1993). Nesta dissertação, foram citados apenas dois testes que podem ser usados para o
diagnóstico da AIE. Outros testes foram avaliados por diversos autores na tentativa de
comparação de resultados, a fim de se obter um diagnóstico mais rápido e barato, tais
como FAST ELISA, RT-PCR, ELISA C (RADOSTITS et al., 2002; LEW et al., 1993;
SOUTULLO et al., 2001; COOK et al., 2001; MARTIN-RENDON et al., 2002).
Para detecção dos animais soropositivos, o teste recomendado no exterior
pelo World Organisation for Animal Health
– OIE (LEW et al., 1993; SOUTULLO et
al., 2001) e pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento do Brasil é IDGA
para a AIE ou, simplesmente, teste de Coggins (FERRAZ1998).
A prova de ELISA permite detectar a maioria dos cavalos infectados com
resultados negativos pela IDGA (SHANE et al., 1984; Lew et al., 1993). Entre as
vantagens são citadas a utilização em um grande número de amostras em um curto
espaço de tempo e a possibilidade de detecção de animais recentemente infectados,
(MONTELARO et al., 1993; LANGEMEIER et al., 1996). Nos Estados Unidos da
América, foi desenvolvido um ELISA competitivo (CELISA) contra a p26 que foi
aprovado oficialmente para utilização em larga escala. Porém, todo o animal positivo
por ELISA requer confirmação pela IDGA, antes que medidas sanitárias sejam tomadas
(LANGEMEIER et al., 1996).
A evolução da metodologia diagnóstico pode ser observada no quadro 2, a
seguir.
Quadro 2. Comparação entre os vários testes sorológicos em Anemia Infecciosa Eqüina
TESTES Referências básicas
Aparecimento de
anticorpos (dias)
Persistência d
o
Fixação complemento direto KONO & KOBAYASHI, 1966 14 62 di
Fix. Complemento indireto McGUIRE et al., 1971 29 -
Soroneutralização KONO, 1969 45 Todo o
c
Imunofluorescência USHIMI et al , 1970
CRAWFORD et al , 1971
14 ?
IDGA COGGINS & NORCROSS, 1970
NAKAJIMA & USHIMI, 1971
14 Todo o
c
Inibição da hemaglutinação
SENTSUI & KONO (1976) 40 ?
Hemaglutinação indireta SUGIURA & NAKAJIMA (1982) 14 Todo o
c
ELISA SUZUKI et al., 1982.
GIELKENS & TOMA, 1982
REIS, J.K.P. 1997
10 ?
ELISA Competitivo
REIS, J.K.P. 1997 14 ?
SPRIA HORENSTEIN & FEINSTEIN, 1985 ? ?
Adaptade apartir de REIS, 1984
7.1. A Prova de Coggins
Por definição, a prova de Coggins é a técnica imunodifusão radial dupla em
ágar gel (IDGA), para detecção de anticorpos contra o VAIE. Esta é uma prova de
precipitação de complexos antígeno-anticorpo (OUCHTERLONY, 1968), que foi
adaptada por COGGINS & NORCOSS (1970), utilizando antígeno produzido a partir
de triturados de baço e, posteriormente, adaptada para a utilização de antígeno
preparado em cultura de leucócitos de cavalo (NAKAJIMA & USHIMI 1971e 1974).
Desde a década de 70, a prova de Coggins ou, simplesmente, IDGA para
detecção do VAIE (COGGINS, & NORCROSS, 1970), vem sendo utilizada no Brasil e
no mundo, como principal método de diagnóstico. Para realização da prova de Coggins,
antígenos e anticorpos depositados em cavidades do gel de ágar difundem-se
radialmente em velocidades diferentes, dependendo de sua solubilidade e massa
molecular e concentração . Quando os anticorpos em migração entram em contato com
os antígenos específicos (que migram na direção oposta), pode ocorrer uma reação
antígeno-anticorpo. Os complexos formados são insolúveis e se precipitam no gel,
originando linhas visíveis à vista desarmada, que podem ser observadas sob uma fonte
de luz intensa com foco reduzido, contra um fundo escuro, até 48 horas após a execução
do teste. O método, de fácil execução, alta especificidade e baixo custo, vem sendo
utilizado em grande escala, apesar do desenvolvimento de outros métodos diagnósticos
como a prova de ELISA (SUZUKI et al., 1982; SUGIURA et al.,1986; FERRAZ et al.,
1997, SOUTULLO et al., 2001), a imunofluorescência (McGUIRE et al., 1971;
USHIME et al., 1972) e a PCR (STEPHENS et al., 1990, LEROUX, 2004).
A leitura da formação ou não das linhas é feita após 48 horas, de acordo com
as portarias do MAPA. Os soros são considerados positivos quando a linha de
precipitação entre a amostra e o antígeno forma identidade com a linha do soro controle
positivo, unindo-se a essa formando uma linha curva contínua. As amostras são
consideradas negativas quando não há formação de linha de precipitação entre o poço
da amostra e o do antígeno com identidade com a linha do soro controle. A linha de
precipitação formada pelo soro controle positivo, ao invés de curvar-se em sua
extremidade, continua para dentro do poço da amostra testada. (figura)
O IDGA, como outros testes sorológicos, baseia-se na detecção de anticorpo
contra a principal proteína do core viral, a p26. Esta proteína tem sido largamente
utilizada em estudos de AIE por ser altamente conservada, o alvo da resposta imune e
por praticamente todos os animais infectados. Além disso, é a proteína mais abundante
da partícula viral constituindo cerca de 30% da massa protéica total (REIS, 1997).
As maiores restrições da IDGA referem-se à baixa de sensibilidade e o
tempo para a obtenção dos resultados, e a incapacidade em detectar animais infectados
pelo VAIE nos estágios iniciais da infecção (SHEN et al., 1984; LANGEMEIER et al.,
1996), porém é o único método autorizado pelo MAPA para o diagnóstico da AIE, no
Brasil. Devido ao desenvolvimento do setor laboratorial e o crescimento da
eqüideocultura, vários fabricantes vêm oferecendo kits para diagnóstico baseado na
prova de Coggins, porém apenas um kit é de fabricação nacional (Laboratório Bruch)
os outros dois kits, utilizados neste trabalho são importados, mas possuem autorização
de uso pelo MAPA.
2.7.2. A Prova de ELISA
Os testes de IDGA e a ELISA são baseados, primariamente, na detecção de
anticorpos para a proteína de core viral p26, porém já foi demonstrado que os níveis de
anticorpos específicos contra a glicoproteína gp90 da superfície viral são 100 vezes
mais abundantes do que anticorpos específicos contra p26 (MONTELARO et al., 1984
b), sendo também os primeiros a serem detectados no sangue.
Em seu estudo Lew e colaboradores, (1993), fazem uma comparação entre
ELISA, FAST ELISA e o teste de Coggins, onde foram usados soros de animais
positivos e negativos para comparação destes métodos. Segundo os autores, a prova de
ELISA usado com a glicoproteína recombinante 45 (rgp45) gerou resultados bastante
satisfatórios, com uma sensibilidade superior ao teste de Coggins, mas os autores
apresentaram resultados equivocados de positividade. Relatam ainda que, além de seu
custo por exame ser menor, US$ 0,30, contra US$ 3,00 por animal.
A prova de ELISA indireta com a proteína gp90 recombinante (rgp90) tem
sido utilizada em Minas Gerais, no RETROLAB-UFMG, onde foi desenvolvido parte
do presente estudo. Esta prova possui vantagens frente à imunodifusão em ágar gel
(IDGA) (OUCHTERLONY,1968) por detectar os anticorpos para gp90, que são os mais
precoces e abundantes que surgem no sangue dos infectados, diminuindo o número de
resultados falso negativos. O teste ELISA é considerado um método sensível para
detectar anticorpos para o VAIE, possibilitando o teste de muitas amostras ao mesmo
tempo com resultados obtidos dentro de 4
a 5 horas (MARTINS, 2004; REIS,1994).
MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Soros de eqüídeos
Inicialmente, 220 soros de eqüídeos, da coleção do LDAIE-UFRRJ, foram
selecionados para as análises, sendo 110 positivos e 110 negativos para AIE, de acordo
com diagnóstico credenciado original. Todos os soros foram selecionados com base no
volume de, pelo menos, 0,5 mL, e os negativos foram escolhidos ao acaso.
Posteriormente, mais 90 soros positivos foram obtidos de outros laboratórios
credenciados, do Estado do Rio de Janeiro e outros 90 soros negativos do LDAIE-
UFRRJ foram acrescentados, totalizando 400 soros. Todos os soros selecionados foram
submetidos, novamente, à IDGA (Kit Bruch) e à prova de ELISA, para efeito de
confirmação das leituras originais e avaliação desta técnica, no diagnóstico da AIE.
Os soros foram acondicionados em tubos de 1,5 mL do tipo Eppendorf,
identificados e armazenados a -20°C, até o momento de uso.
3.2. Sistemas comerciais de diagnóstico da AIE (kits)
Para as análises comparativas foram empregados três kits de diagnóstico da
AIE por imunodifusão em ágar gel de diferentes fabricantes (Laboratórios IDEXX,
BRUCH e VMRD), autorizados pelo MAPA, e comercializados atualmente no País. Os
kits são compostos de dois reagentes: um frasco de antígeno e outro de soro controle
positivo.
O kit da BRUCH utiliza a proteína de capsídeo p26, purificada de cultura de células
infectadas, a partir de uma amostra apatogênica do vírus da Anemia Infecciosa Eqüina, com
marcação genética identificadora do produto. Com 3,5 mL de antígeno e 10,5 mL de soro
controle positivo, este kit permite a realização de até 420 exames. O kit da VRMD de
fabricação estadunidense utiliza a proteína p26 recombinante, produzida em E.coli. De acordo
com o fabricante, o uso deste antígeno elimina a ocorrência de linhas de precipitação
inespecíficas (3,35 mL de antígeno e 10 mL de soro controle positivo, até 400 testes exames). O
kit da IDEXX, também de fabricação estadunidense, informa apenas que utiliza a proteína p26
altamente purificada (3,9 mL de antígeno e 11,7 mL de soro controle positivo, até 450 testes).
Por questões éticas, os kits foram identificados como A, B e C e mantidos a
4
o
C, até o momento de uso.
3.3. Imunodifusão em ágar gel (IDGA)
A técnica de IDGA foi empregada para as análises dos kits de diagnóstico
testados. A IDGA foi realizada em lâminas comuns de microscopia ótica (25 x 75 mm),
recobertas com 4,5 mL de uma solução fundida de ágar nobre a 1%, em tampão borato,
pH 8,6 (Anexo). Após o resfriamento e gelificação do ágar, sete cavidades em roseta
com 4,0 mm de diâmetro, de acordo com a figura 1., foram feitas com auxílio de um
perfurador apropriado. Na cavidade central, colocou-se 25 µL do antígeno e nas
cavidades periféricas nas posições 2, 4 e 6 colocou-se 25 µL dos soros a serem testados
e 25 µL dos soros controle positivos nas posições 1, 3 e 5. Em seguida, os reagentes são
incubados em câmara úmida, a temperatura ambiente, por 48 horas.
As leituras foram feitas por três técnicos credenciados pelo MAPA,
visualizando-se cuidadosamente a formação das linhas de precipitação.
Figura 1. Esquema da lâmina de exame. A posição central foi reservada para o
antígeno, enquanto os soros testados foram depositados nas posições 2, 4 e 6. As
posições 1, 3 e 5 receberam o soro controle positivo.
3.4. A Prova de ELISA
Para avaliação prática da técnica no diagnóstico da AIE e confirmação dos
resultados das leituras dos soros por IDGA (positividade e negatividade), os 200 soros
positivos e 200 negativos utilizados neste trabalho foram submetidos à prova de ELISA.
Os soros analisados pela prova de ELISA, que obtiveram resultados discrepantes da
avaliação por IDGA, foram reavaliados pela mesma técnica.
A prova de ELISA foi realizada no RETROLAB, UFMG, segundo a
descrição de REIS (1997), em placas de 96 cavidades com fundo plano. Inicialmente,
para sensibilização das placas, a glicoproteína de envelope recombinante rgp90 foi
diluída em tampão carbonato 50 mM (pH 9,6) na concentração de 0,5 µg/cavidade e
incubada por 18 horas a 4 ºC. Em seguida, foi realizada a etapa de bloqueio, onde as
placas foram lavadas por duas vezes com uma solução de lavagem (PBS-Tween a
0,05%,
pH 7,6) e incubadas, por uma hora, com a mesma solução acrescida de leite em
pó desnatado a 5% (200 µL por poço). Para remoção da solução de bloqueio, três
lavagens sucessivas foram feitas com a solução de lavagem. Para a prova, os soros
testes e os controles positivo e negativo foram diluídos 50 vezes na solução PBS-Tween
mais leite em pó a 1%, sendo 100 µL dispensados nas cavidades. Os soros foram
incubados por uma hora, a temperatura ambiente nas placas sensibilizadas. Após a
incubação, as placas foram novamente lavadas com solução de lavagem, por 3 vezes, e
incubadas com solução de conjugado na diluição de 1: 7.500 (IgG de coelho anti IgG
eqüina conjugada com peroxidase) em PBS-Tween mais leite em pó a 1% (100 µL por
poço), por 1 hora a temperatura ambiente.
Após nova lavagem com a solução de lavagem por três vezes, 100 µL do
substrato foi adicionado: uma solução de ortofenilenodiamino (OPD) a 0,5 mg/mL em
10 mL de tampão fosfato-citrato (pH 5,0), adicionada com 20 µL de peróxido de
hidrogênio, por 10 minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida com
40µL de uma solução de ácido sulfúrico a 0,5 N por poço. As leituras da prova foram
realizadas em leitor de ELISA em comprimento de onda de 492nm.
3.5. Análises da reprodutibilidade
Para a análise da reprodutibilidade entre os resultados referenciados e os
resultados das leituras dos soros com os diferentes kits, uma partida de 1 L de ágar
nobre a 1% em tampão borato, pH 8,6, foi feita para confecção das lâminas de exame
por IDGA. Todas as lâminas de exame foram feitas, com as três rosetas padronizadas
perfuradas em cada uma, rigorosamente, dentro dos parâmetros estabelecidos pela
portaria ministerial. A interpretação (leitura) dos testes foi realizada após 48 h de
incubação das lâminas com os reagentes e soros, à temperatura ambiente, em sala
escura, de acordo com a mesma Portaria. Apenas os soros com leituras concordantes
entre as provas de ELISA e da IDGA foram empregados nestes experimentos.
3.5.1. Experimento 1
Para o experimento inicial, 90 soros positivos e 90 soros negativos foram
submetidos à IDGA, com reagentes dos três fabricantes, previamente mencionados.
Para tanto, 60 lâminas de exame foram feitas. Nas três rosetas de cada lâmina foram
testados os mesmos soros nas mesmas posições (2, 4 ou 6), frente aos diferentes kits,
mantendo-se fixa ordenação destes, em relação às rosetas.
Figura 2 – Disposição dos reagentes em lâmina
C – Soro Controle , posições 01,03 e 05 de cada roseta
A, B e C – Antígenos de cada fabricante
Soros teste: posição 2, 4 e 6 (neste experimento: soros 17, 03, 66)
3.5.2. Experimento 2 (cego em relação aos soros e à disposição dos kits)
Com o objetivo de reduzir eventuais vieses, 15 soros positivos e 15
negativos foram dispostos aleatoriamente nas posições 2, 4 e 6 em cada uma das 10
lâminas de exame, em posições distintas das rosetas, que receberam também ao acaso os
reagentes dos kits.
Figura 3 – Disposição dos reagente em lamina
C – Soro Controle , posições 01,03 e 05 de cada roseta (correspondente ao antígeno
utilizado em cada roseta
? – Antígenos de cada fabricante (sorteados) porem correspondentes ao soro controle
Soros teste: posição 2, 4 e 6 (neste experimento: soros aplicados com resultados
desconhecidos e aleatoriamente
3.5.3. Experimento 3 (condições dos fabricantes).
Para este experimento complementar, três soros positivos foram testados por
IDGA, nas condições recomendadas pelos fabricantes. No lugar das lâminas, foi
empregada uma placa de Petri, com 10 cm de diâmetro, e as rosetas para os kits
importados foram feitas com um furador dentro do padrão estadunidense, cujos
reagentes foram aplicados no volume de 50 μL.
Figura 4
3.6. Análises comparativas da visibilidade das linhas de precipitação
Em função da diferença visual das linhas de precipitação observadas nos
exames dos mesmos soros com os diferentes kits, no experimento 1, algumas análises
foram realizadas para consubstanciar esta distinção.
3.6.1. Análise da identificação dos kits
A fim de avaliar a distinção visual das linhas de precipitação formadas os
reagentes dos três fabricantes, no experimento 2, os técnicos, além dos pareceres sobre
os soros, foram solicitados a optar qual dos kits foi utilizado nas rosetas do experimento
2 (cego em relação aos soros e kits). Posteriormente, os registros das opções foram
empregados para se avaliar o percentual de erro dos técnicos neste parâmetro.
3.6.2. Caracterização da visibilidade das linhas de precipitação
Com a finalidade de se obter uma caracterização da visibilidade das linhas de
precipitação, crítica para a leitura, os três técnicos registraram suas impressões sobre a
nitidez e a intensidade do brilho destas, observadas durante a leitura do experimento 1.
3.7. Detecção de reações inespecíficas.
Como outro parâmetro de qualidade do kit, durante a leitura dos
experimentos de IDGA, procurou-se registrar fenômenos indesejados como reações
inespecíficas, formação de linhas duplas e linhas espessas.
3.8. Titulação dos antígenos A, B e C.
Para uma avaliação da concentração dos antígenos dos diferentes kits,
diluições seriadas destes reagentes, em tampão borato, foram feitas na base 2 (1:2, 1:4,
1:8 e 1:16). A titulação dos antígenos A, B e C foi avaliada por IDGA, colocando-se o
25µL do soro de cada kit no poço central e 25µL das diluições dos antígenos nos
periféricos. Após 48h, as leituras foram realizadas.
Figura
4. RESULTADOS
4.1. Prova de ELISA
Os resultados da análise, pela prova de ELISA, dos 400 soros testados
podem ser observados na tabela 1. Em relação aos soros positivos a concordância foi de
90,5% e em relação aos negativos de 89,5%. A concordância entre o total de resultados
da ELISA e da IDGA foi de 90%..
Tabela 1. Porcentagem de soros positivos e negativos nos testes de IDGA e ELISA
ELISA
IDGA
positivos indeterminados negativos
Total
Positivos
181 4 15 200
Negativos
18 3 179 200
4.2. Análises da reprodutibilidade
4.2.1. Experimento I
A tabela 2. apresenta os percentuais de reprodutibilidade das leituras
procedidas pelos três técnicos, com uso dos três kits (A, B e C) apenas para os soros
positivos, uma vez que houve 100% de reprodutibilidade, em relação aos soros
negativos. Os técnicos 1 e 2 fizeram leituras com 100% de reprodutibilidade (soros
positivos), enquanto o técnico 3 optou por recomendar a repetição do exame em 22,3 %
(60/270) das leituras. Deste total, suas dúvidas foram em 10% (9/90) dos soros testados
com o kit A, 19% (17/90) dos soros testados com o kit B e 38% (34/90) dos soros
testados com o kit C.
Tabela 2. Reprodutibilidade das leituras de 90 soros positivos feita pelos técnicos, com
o uso dos diferentes kits.
Kit
Técnico
A B C
1 100% 100% 100%
2 100% 100% 100%
3 90% 81% 62%
4.2.2. Experimento 2 (cego em relação aos soros e à disposição dos kits)
A reprodutibilidade das leituras deste experimento, com o uso dos diferentes
kits, baseada na leitura dos três técnicos, foi de 100%.
4.2.3. Experimento 3 (nas condições dos fabricantes)
De acordo com a avaliação dos três técnicos, a utilização dos kits, de acordo
com a recomendação dos fabricantes, possibilitou leituras claras e equivalentes entre os
kits, diferentemente do que foi observado no experimento 1.
4.3. Análises comparativas da visibilidade das linhas de precipitação
4.3.1. Análise da identificação do kit
Durante a leitura do experimento 2 (cego em relação aos kits e soros). O
técnico 1 acertou o kit utilizado em 93,3% (28/30) das suas opções. O técnico 2 acertou
o kit utilizado em 66,7 % (20/30) das suas opções. O técnico 3 acertou o kit utilizado
em 70,0% (21/30) das suas opções.
4.3.2. Análise da visibilidade das linhas de precipitação
De acordo com o parecer unânime dos três técnicos, no experimento 1, todas
as leituras proporcionadas pelo kit A apresentaram melhor visibilidade. Com grande
intensidade de brilho e nitidez (definição), as linhas de precipitação promovidas entre os
soros positivos usados nas análises e o antígeno do kit A possibilitaram as leituras mais
claras e seguras. Já a qualidade das leituras das linhas de precipitação dos kits B e C
foram francamente inferiores em função da pouca intensidade do brilho e nitidez das
mesmas. As leituras mais difíceis e duvidosas foram obtidas com o kit C.
4.4. Detecção de reações inespecíficas
Durante a realização dos experimentos (IDGA) foram observadas linhas de
precipitação duplas, uma com identidade (contínua com a linha do controle positivo) e
outra inespecífica (com esporões), em três exames com soros positivos, com reagentes
do kit A. Nestes casos, as leituras foram consideradas positivas. De forma que, como
foram feitas 105 reações com o kit A, houve 2,85 % de reações inespecíficas, embora
com linhas específicas simultaneamente.
4.5. Titulação dos antígenos A, B e C.
Após 48h de incubação, foi observada a formação de linha de precipitação
eqüidistante no poço do antígeno não diluído em todos os conjuntos. Na diluição 1:2 foi
observada o início da formação da linha de precipitação na roseta dos kits A e B (menos
intensa), e na roseta do kit C de forma quase imperceptível. Através das observações
acima, pode-se concluir que o antígeno do kit A está mais concentrado que do B, que
por sua vez é o menos concentrado.
5. DISCUSSÃO
A AIE é uma doença de considerável importância para a Eqüídeocultura
Mundial e a prevalência de, aproximadamente, 2% entre os animais examinados no
Brasil e no LDAIE/UFRRJ não expressa a sua real significância. Reconhecidamente,
retroviroses atingem, muitas vezes, elevadas prevalências nas populações hospedeiras,
rivalizadas apenas pelas herpesviroses. Este aspecto pode ser compreendido a luz da
sua estratégia de escape das defesas dos hospedeiros, baseada em três pilares: sua alta
mutagenicidade, capacidade de integração no genoma celular e infecção do sistema
retículo endotelial, como macrófagos e linfócitos. Contudo, a prevalência observada de
2% se refere apenas aos animais examinados. Devido à notificação obrigatória da AIE e
a política de teste e sacrifício determinada pelo MAPA, sem direito à indenização,
proprietários e criadores têm restrições ao exame, a não ser quando imposto pela lei.
Ainda sim, em propriedades pantaneiras a prevalência pode atingir até 50% dos
rebanhos (Brasil, 2001), que neste caso sofrem uma política diferenciada. A partir de
contatos com práticos de campo, observou-se que, apesar das recomendações, mesmo
em casos de suspeita da infecção, muitos optam pela não realização do exame, evitando
as sanções legais. A eutanásia é preconizada diante da inexistência atual comprovada de
vacinas eficientes e da vitaliciedade da infecção.
Apesar destes aspectos, a política atual do MAPA é fundamentada no
diagnóstico sorológico, obtido pela aplicação da prova de Coggins, que corresponde ao
método mais amplamente utilizado no mundo, devido à sua simplicidade e baixo custo,
apesar de técnicas mais modernas e eficientes terem sido desenvolvidas e aperfeiçoadas.
Implantado no âmbito do Instituto de Veterinária da UFRRJ, o LDAIE vem,
há décadas, no escopo das portarias ministeriais, aplicando a política de controle da
AIE, já tendo examinado milhares de animais. Apesar da especificidade da prova de
Coggins, diversos problemas foram observados que podem prejudicar a precisão do
diagnóstico, entre os quais variabilidades entre os kits (marcas) utilizadas, ao longo dos
anos. Mesmo credenciando os kits, o MAPA não exerce o controle da qualidade destes,
deixando aos técnicos às suas próprias avaliações.
Considerando que a precisão dos resultados é crítica, posto que animais falso
positivos podem ser sacrificados inutilmente e falso negativos preservados como fonte
de infecção, diversos problemas podem ocorrer. Resultados errôneos podem ser
gerados, por exemplo, devido a: falhas na identificação dos soros; respingos durante a
pipetagem do soro controle positivo nas cavidades dos soros testados; a falha da troca
das ponteiras; deposição dos soros nas cavidades incorretas; câmara úmida mal vedada,
facilitando o ressecamento da lâmina e inviabilizando a leitura. Outros fatores também
podem gerar problemas como a solução de ágar fora dos padrões; concentração alterada
dos reagentes utilizados; presença de água residual nos orifícios; fonte de luz indireta
inadequada; falta de energia elétrica afetando a refrigeração dos kits e problemas de
acuidade visual do técnico. Estes motivos que podem levar a inviabilização do exame,
ocasionando perda de tempo e despesas extras. Somado a estas possíveis fontes de
erros, as reações podem ser, ainda, influenciadas por uma variedade de condições físico-
químicas, dentre elas a concentração eletrolítica do tampão, pH, alterações bruscas de
temperatura durante a incubação, levando a formação de artefatos de técnicas
indesejáveis para o teste. Altos níveis de lipídeos e protídeos nos reagentes podendo
afetar a formação e observação da linha de precipitação, principalmente, em relação aos
soros fracamente positivos.
Entretanto diversos destes fatores podem ser minimizados pelo procedimento
cuidadoso dos técnicos, mas, correntemente, não cabe a estes o controle de qualidade
dos reagentes dos kits. Por este motivo, este trabalho se concentrou neste aspecto,
centralizando-se especificamente na reprodutibilidade dos kits, em relação a soros
positivos e negativos referenciados e na visibilidade das linhas de precipitação obtidas.
Para esta finalidade, 200 soros positivos e 200 negativos para AIE, pela
utilização da IDGA, nos exames credenciados originais, foram selecionados.
Preliminarmente, para confirmação das leituras originais por IDGA, realizadas no
LDAIE-UFRRJ, os 400 soros foram submetidos à prova de ELISA. Aqueles que
acusaram resultados diferentes dos originais foram mais uma vez testados por ELISA.
Os soros que permaneceram com resultados discrepantes, após esta reavaliação foram
retirados dos experimentos seguintes.
Após esta etapa, estes soros com leituras confirmadas foram examinados
com os três kits escolhidos, concomitantemente, em três rosetas das mesmas lâminas de
exame para apreciação de três técnicos credenciados pelo MAPA.. O experimento
inicial (experimento 1), surpreendentemente, apresentou diferenças marcantes, quanto à
intensidade das linhas de precipitação produzidas pelos soros positivos e os três
antígenos utilizados, embora não tenham sido detectados problemas quanto à leitura dos
soros negativos.
Esta distinção inesperada da qualidade das linhas de precipitação e, por
conseqüência, das leituras dos técnicos, suscitou dúvidas quanto à ocorrência de
possíveis vícios, devido à intensidade das linhas obtidas pelo uso do kit A, na leitura das
demais rosetas, em função da manutenção da disposição dos soros e dos kits nas três
rosetas de cada lâmina. No esforço de remoção do viés, um dos técnicos procurou
proceder sua leitura, evitando a observação das rosetas adjacentes e optando pela
posição da dúvida, que recomendaria a repetição do exame, o que correntemente é
plausível. Apesar do prejuízo na padronização dos critérios estabelecidos inicialmente
para as leituras, esta postura forneceu informações interessantes. Considerados estes
fatos e aventada a possibilidade de viés, um novo experimento foi realizado.
No experimento 2, tanto as posições dos soros nas rosetas, quanto à
qualificação dos soros (positivos e negativos) e à disposição dos kits foi desconhecida
pelos técnicos. Desta vez, corrigidos os possíveis vícios, apesar da discrepância citada
na qualidade (nitidez, contraste e brilho) entre as linhas de precipitação produzidas
pelos três kits, a reprodutibilidade entre as leituras dos técnicos e os resultados
referenciados, previamente, foi de 100%. Após a análise inicial deste resultado, conclui-
se que, apesar das diferenças marcantes observadas, o padrão de qualidade da leitura
dos três técnicos, face à sua extensa experiência anterior e adquirida ao longo dos
experimentos, poderia representar um viés não removível, em relação a técnicos, menos
experientes.
A discussão das diferenças constatadas no experimento inicial também levou
à detecção de um fator inesperado e extremamente significativo: nos bulários originais
dos kits importados foram observadas condições técnicas marcadamente distintas
d´aquelas determinadas pela Portaria Ministerial, ao contrário das mesmas relativas ao
kit nacional, apesar da tradução em português estar de acordo com a portaria.
Especificamente, as medidas dos diâmetros das cavidades e distâncias entre estas, além
das quantidades de trabalho de 50 microlitros para os reagentes dos kits importados
contrariam as recomendações do MAPA. Como, por força da Lei, e em consideração
às condições empregadas no País, restringindo-se às provas de IDGA a estas
recomendações, gerou-se contradições técnicas durante o emprego dos kits importados,
o que justificaria as discrepâncias mencionadas na visibilidade das linhas de
precipitação dos diferentes kits. Ademais, como o custo por exame dos três kits é,
praticamente igual, nas condições do MAPA (25 microlitros dos reagentes por animal),
quando utilizados nas condições dos fabricantes (50 microlitros dos reagentes por
animal), o teste por animal aumentaria significativamente de preço.
Considerando que os kits importados têm diferentes condições técnicas
recomendadas pelos fabricantes, o experimento 3 foi desenhado a fim de se observar se
a aplicação recomendada forneceria leituras equivalentes entre os kits. Este permitiu a
constatação desta justificativa para as diferenças observadas nos experimentos
anteriores. As taxas relativamente baixas dos erros nas escolhas dos kits, durante o
experimento 2, corroboram com as distinções observadas na qualidade das linhas
formadas nos experimentos entre os três kits.
Quanto aos três kits utilizados, constatada a contradição entre as normas do
MAPA e dos fabricantes dos reagentes importados, a análise ficou comprometida de
sobremaneira. Apesar da experiência dos técnicos, comprovada pela reprodutibilidade
de 100% obtida, a visibilidade das linhas de precipitação e os títulos menores dos
antígenos B e C podem favorecer leituras falso negativas, por técnicos menos
experientes.
A análise da visibilidade das linhas, baseada nos pareceres dos técnicos
também reafirmou o kit A como superior no exame da AIE por IDGA. A avaliação dos
títulos dos três antígenos comprovou a maior concentração do reagente no kit A.
Outro ponto a ser analisado é ligado ao antígeno recombinante utilizado no
kit B e, eventualmente, também no kit C. Tentativas de contatos com os representantes,
na busca de informações técnicas como títulos dos soros e dos antígenos e sua
tecnologia não foram bem sucedidas e não está descrito da bula do kit C qual tipo de
antígeno utilizado. É de conhecimento comum que antígenos recombinantes podem ter
sua conformação tridimensional modificada, em prejuízo aos epítopos de superfície
(não lineares) alterando a antigenicidade dos mesmos, o que poderia justificar as
reações mais fracas observadas nos kits B e C.
O diagnóstico da AIE baseado na IDGA, apesar de sua segurança, traz
limitações que podem ser observadas no decorrer deste trabalho. Frente ao interesse
do MAPA no controle e erradicação desta virose, sistemas alternativos de diagnóstico
têm sido propostos e aplicados.
Vários autores têm enfatizado a maior sensibilidade do ELISA comparada a
IDGA (SUZUKI et al., 1982; SHANE et al., 1984; SUGIURA et al., 1986). Reis e
colaboradores (1994) relataram um caso de erradicação da AIE em um rebanho de 86
eqüídeos, onde 470 soros foram testados simultaneamente por ELISA e IDGA,
demonstrando que os anticorpos específicos para VAIE foram detectados pelo ELISA
um mês antes do que pelo IDGA. O sucesso da erradicação foi atribuído ao uso de testes
de maior sensibilidade como a ELISA. Dias e colaboradores (2000) compararam 1205
amostras de soros de eqüinos pelas técnicas de ELISA e IDGA e encontraram uma
sensibilidade e especificidade comparada de 95,38 % e 80,3%, enquanto que Matsushita
e colaboradores (1989) ao comparar 420 amostras de soros de eqüinos por ELISA
competitivo (CELISA) e IDGA encontraram 100% de correlação. A rapidez e
automação da prova de ELISA e IDGA devem ser consideradas. Enquanto em uma
lâmina para IDGA são processados 9 soros, na placa para ELISA são realizados 88. As
vantagens da prova de ELISA sobre o IDGA são, entre outras, economia, rapidez,
sensibilidade, detecção dos anticorpos não precipitantes, identificação de soros
fracamente positivos ou duvidosos no IDGA e o monitoramento dos níveis de
anticorpos passivos (colostrais) de potros nascidos de éguas positivas para AIE.
Segundo Lew, (1993), o custo por animal testado por ELISA é cerca de dez vezes mais
barato que o IDGA, devido às pequenas quantidades do antígeno necessárias para o
teste. Outro ponto a ser considerado é que a leitura do teste IDGA é por vezes subjetiva,
haja vista a grande quantidade de reações fracas positivas que passam despercebidas,
resultando em resultados equivocados.
Em outros países, assim como no Brasil, a utilização das duas técnicas no
diagnóstico oficial ainda não ocorre. A prova de ELISA pode ser considerada como
teste de triagem em levantamentos em áreas endêmicas para a AIE, porém todos os
resultados positivos por esta técnica são confirmados pela técnica padrão de IDGA,
embora a ELISA deva ser considerada como excelente método e deve ser utilizado em
programas de controle e erradicação da AIE.
Os resultados indeterminados e positivos na prova de ELISA, no caso de
levantamentos soroepidemiológicos para a AIE devem ser submetidos IDGA para
confirmação. No caso das amostras positivas ao IDGA e negativas ao ELISA a
possibilidade de reação cruzada com outros retrovírus deve ser considerada. A
possibilidade da existência de uma nova variedade genética resultante de mutações no
gene env e conseqüentemente na antigenicidade das proteínas do envelope como a
observada no HIV (REIS et al., 2003), já que a proteína rgp90 usada foi baseada na
seqüência clonada a partir da amostra Wyoming do VAIE em seu estudo, também pode
ser aventada. Os resultados negativos ao teste de IDGA e positivos na ELISA se devem,
principalmente, a maior sensibilidade da ELISA
Embora diversos fatores devam ser considerados, a experiência da utilização
da ELISA neste trabalho permitiu a recomendação da utilização da ELISA, no controle
de focos e na triagem rápida de animais testados, com a associação da IDGA na
confirmação dos animais positivos no primeiro teste.
6. CONCLUSÕES
●A reprodutibilidade das leituras dos três técnicos com o uso dos diferentes kits na
IDGA, em relação às leituras referenciadas, foi de 100% indicando equivalência entre
os mesmos, de forma que a os kits comercializados no Brasil são aceitáveis. Porém,
técnicos menos experientes têm mais possibilidade de erros do tipo falso negativos,
quando da utilização dos kits importados.
●A visibilidade das linhas de precipitação do kit A foi superior à do kit B e C, cujas
linhas de precipitação ofereceram maior dificuldade de visualização pelos técnicos.
●O kit nacional seguramente favorece a melhor margem de precisão das leituras,
embora a capacitação técnica possa compensar o desacordo entre as recomendações
técnicas do MAPA e dos fabricantes dos kits importados.
●Como as especificações técnicas dos kits importados contrariam frontalmente as
condições técnicas determinadas legalmente pelo MAPA, recomenda-se a adequação
dos reagentes a estas ou o estabelecimento de considerações sobre as condições dos
fabricantes em novas portarias ministeriais.
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XIX n. 155 junho/2004., acesso em 20/01/2007
Fórmulas
1.1 Gel a 1%
- Ágar nobre.................... .................................................................1%.
- Tampão borato .............................................................................. 100 mL
1.2 Tampão Borato
- Hidróxido de Sódio (NaOH)........................................................ 2,0 g.
- Ácido Bórico (H
3
BO
3
)................................................................. 9,0 g.
- Água destilada q.s.p.......................................................................1.000 mL.
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