( PDF ) Expressão ectópica do gene NIK em tomateiros: efeitos no desenvolvimento e na infecção por geminivírus

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SILVANA RODRIGUES PIRES

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal, para obtenção

do título de Magister Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL

2007

EXPRESSÃO ECTÓPICA DO GENE NIK EM TOMATEIROS: EFEITOS

NO DESENVOLVIMENTO E NA INFECÇÃO POR GEMINIVÍRUS

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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Pires, Silvana Rodrigues, 1981-

P667e Expressão ectópica do gene NIK em tomateiros :

2007 efeitos no desenvolvimento e na infecção por geminivirus

/ Silvana Rodrigues Pires. – Viçosa, MG, 2007.

xi, 53f. : il. (algumas col.) ; 29cm.

Orientador: Elizabeth Pacheco Batista Fontes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de

Viçosa.

Referências bibliográficas: f. 45-53.

1. Biologia molecular. 2. Plantas - Biologia molecular.

3. Plantas transgênicas. 4. Engenharia genética vegetal.

5. Fisiologia vegetal. 6. Tomate - Genética. 7. Vírus de

Plantas. 8. Bioquímica. I. Universidade Federal de Viçosa.

II.Título.

CDD 22.ed. 572.8

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SILVANA RODRIGUES PIRES

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa,

como parte das exigências do

Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal, para

obtenção do título de Magister

Scientiae.

APROVADA: 28 de setembro de 2007.

Prof

Elizabeth Pacheco Batista Fontes

(Orientadora)

Prof

Andréa Miyasaka de Almeida

(Co-orientadora

)

Prof. Luciano Gomes Fietto

Prof

Maria Cristina Baracat Pereira

Prof. Francisco Murilo Zerbini Júnior

(Co-orientador)

EXPRESSÃO ECTÓPICA DO GENE NIK EM TOMATEIROS: EFEITOS

NO DESENVOLVIMENTO E NA INFECÇÃO POR GEMINIVÍRUS

DEDICO

Às pessoas especiais da minha vida:

Meu esposo Gabriel, meus pais, Walter e

Sônia,

e meus irmãos Adriana, Viviane e Rochiel.

iii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela certeza da presença constante, a força nos momentos

difíceis, a paciência sempre necessária, e indispensável em muitos momentos.

À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realização do

Curso. Ao Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), pela

oportunidade da realização deste trabalho.

Ao Departamento de Biologia Vegetal, ao coordenador do Programa de

Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, professor Rolf Puschmann, às secretárias

Beth e Cássia. Aos professores do departamento, pelos ensinamentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de estudo.

À professora Elizabeth Pacheco Batista Fontes, pela orientação e

competência.

Aos professores Andréa Miyasaka de Almeida e Murilo Zerbini Júnior,

pela co-orientação e pela colaboração dada ao trabalho.

Aos meus pais, pelo amor incondicional, pelo apoio e por sempre

acreditarem em mim e não medirem esforços para que eu atingisse meus

objetivos. Aos meus irmãos, pelo amor, carinho e apoio.

A meu esposo Gabriel, pela confiança e força, por acreditar. Por sempre

estar presente na minha vida, mesmo à distância. Por compreender a minha

ausência. Por ser o amor da minha vida, meu grande amor.

A minha avó e madrinha Elza, tia Vininha, tia Santuza, tio Maurinho e em

especial a grande pessoa que foi tio Tarcísio e tia Aparecida, pela força e imenso

apoio nos momentos difíceis, só posso agradecer por tudo...

Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas e do

Laboratório de Purificação e Expressão de Proteínas, amizade e colaboração

para obtenção dos resultados. Em especial, Anete, Ana Paula, amigas de

sempre, João Paulo, Rejane pela força, Carol, Gui, Anésia, Max... Galera, valeu

pela ajuda e contribuição nos experimentos, mas sobretudo por estarem comigo.

À amiga Daniela, pela ajuda nos experimentos. Confiança em mim,

confiança no trabalho, jamais esquecerei de você.

Aos funcionários Serafim, Marlene e Renata, pela presteza.

Aos amigos Alisson, Miguel, Paulo César e em especial Gustavo, pelo

excelente convívio e apoio nos experimentos.

Aos colegas do curso de Fisiologia Vegetal. Aos amigos da Bioquímica

2001.

Ao funcionário da estufa, Fizinho, pela presteza.

Ao Laboratório de Cultura de Tecidos, na pessoa do professor Wagner

Otoni.

Às eternas companheiras de república, em especial Rachel, irmãs por

opção, sempre a me erguer nos momentos difíceis.

Aos amigos da república, em especial Gustavo Gomes, por acreditar em

mim, e me fazer prosseguir.

Aos amigos de Ubari, em especial Fernanda, que, mesmo distante,

esteve sempre por perto, me apoiando, me segurando, fazendo tudo valer a

pena.

À Fernanda e seu esposo Daniel, pela força nos momentos difíceis.

À amiga forte e linda que Deus me deu de presente. Jô valeu demais!

Aos companheiros de sempre Reginaldo, Raianny, em especial Vanessa

e D. Neinha (saudades eternas), pela força que tanto precisei, quantas vezes

me ouvir chorar, me fazer levantar quando tudo parecia sem fim, esta tese é de

vocês também. Um muito obrigada, de coração.

A todos os amigos e familiares, que de alguma forma, contribuíram para

meu crescimento profissional e pessoal. E a todos que, direta ou indiretamente,

contribuíram para a realização deste trabalho.

BIOGRAFIA

SILVANA RODRIGUES PIRES, filha de Walter José Pires e Sônia Maria

Rodrigues Pires, nasceu no dia primeiro de dezembro de 1981, em Ubá, MG.

Em março de 2001, ingressou no curso de Bioquímica, na Universidade

Federal de Viçosa, MG, graduando-se como Bacharel em Bioquímica em janeiro

de 2005.

Em agosto de 2005, ingressou no Programa de Pós-Graduação em

Fisiologia Vegetal, em nível de mestrado, na mesma instituição, concentrando

seus estudos na área de Biologia Molecular de Plantas.

Em outubro de 2007, submeteu-se à defesa de sua dissertação.

SUMÁRIO

RESUMO.............................................................................................. viii

ABSTRACT........................................................................................... x

INTRODUÇÃO...................................................................................... 1

REVISÃO DE LITERATURA................................................................ 4

1 – Família Geminiviridae ................................................................... 4

1.1 – Organização taxonômica e genômica......................................... 4

1.2 – Mecanismo de replicação viral.................................................... 6

1.3 – Diversidade genética de begomovírus em tomateiro.................. 8

1.4 – Movimento célula-a-célula e a longa distância durante a

infecção viral.......................................................................................

1.5 – Interações geminivírus-hospedeiro............................................ 10

2 – Receptores do tipo serina/treonina quinases............................... 12

2.1 – Caracterização............................................................................ 12

2.2 – Família RLK em plantas............................................................. 14

2.3 – Subfamília LRRII-RLK................................................................ 15

3 – Receptores NIK (NSP-Interacting Protein)................................... 15

MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 18

1. – Construções de DNA................................................................... 18

1.1– Construção do clone pk7AtNIK1-1............................................... 18

1.2 – Construção do clone pk7ILeNIK-(RNAi)...................................... 19

2 – Material Vegetal............................................................................ 23

3 – Procedimentos para transformação de tomateiros........................ 24

3.1 – Transformação de agrobactéria LBA4404 com os clones

pk7AtNIK1-1 e pk7ILeNIK-(RNAi- LBA4404)........................................

3.2 – Transformação de tomateiros...................................................... 24

3.3 – Diagnóstico Molecular dos transformantes.................................. 25

3.4 – Expressão do transgene.............................................................. 26

3.5 – Aclimatação dos transformantes primários................................. 26

4 – Análise de desenvolvimento dos transformantes primários em

cultura de tecidos e em casa-de-vegetação........................................

5 – Ensaios de infectividade por biobalística....................................... 28

5.1 – Extração do DNA viral................................................................. 28

vii

5.2 – Bombardeamento....................................................................... 28

5.3 – Diagnóstico molecular da infecção viral..................................... 29

RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................... 30

1- Obtenção do clone pk7ILeNIK-(RNAi).............................................. 30

2- Transformação de agrobactéria LBA4404........................................ 32

2.1- Obtenção do clone pk7AtNIK1- 1-LBA4404)................................. 32

2.2- Obtenção do clone pk7ILeNIK-(RNAi- LBA4404).......................... 32

3 – Obtenção e análise das plantas transgênicas............................... 33

4 – Superexpressão da proteína NIK retarda o crescimento das

plantas..................................................................................................

5 – Superexpressão de AtNIK não altera taxa de infecção por

ToYSV-[MG-Bi2], mas interfere no desenvolvimento de sintomas.......

CONCLUSÕES..................................................................................... 44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 45

viii

RESUMO

PIRES, Silvana Rodrigues, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de

2007. Expressão ectópica do gene NIK em tomateiros: Efeitos no

desenvolvimento e na infecção por geminivírus. Orientadora: Elizabeth

Pacheco Batista Fontes. Co-Orientadores: Andréa Miyasaka de Almeida e

Francisco Murilo Zerbini.

Geminivírus são vírus de plantas com partículas semi-icosaédricas

geminadas e genoma de DNA circular de fita simples, podendo ser mono ou

bissegmentados, sendo, no último caso, os dois componentes genômicos,

denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A, encontram-se os genes que

codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e encapsidação. O

DNA-B codifica duas proteínas de movimento, Movement Protein, MP e Nuclear

Shuttle Protein, NSP, ambas requeridas para o estabelecimento de uma infecção

sistêmica. NSP transporta o DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e atua

cooperativamente com MP para transportar o DNA viral de célula-a-célula

através da parede celular. Os geminivírus são altamente dependentes de fatores

do hospedeiro para sua proliferação. A proteína NSP interage com uma quinase

receptora da membrana plasmática, designada NIK (NSP-Interacting Kinase) de

tomate, soja e Arabidopsis. Foi demonstrado, em estudos anteriores, que a

inativação do gene NIK aumenta a suscetibilidade dos mutantes à infecção viral.

Visando elucidar o possível papel de NIK no mecanismo de proteção à infecção

por geminivírus, este estudo propôs uma avaliação dos efeitos da

superexpressão de NIK na resposta de tomate à infecção por geminivírus. Assim

sendo, o gene NIK de Arabidopsis thaliana foi utilizado para transformar

tomateiro. Os transformantes primários foram confirmados por PCR,

selecionados por RT-PCR, de acordo com a expressão do transgene, repicados

in vitro e utilizados em experimentos de análise de desenvolvimento in vitro e em

casa-de-vegetação. Análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão

da proteína promoveu retardo de crescimento dos transformantes, os quais

apresentaram baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor

desenvolvimento de sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas.

O fenótipo observado nas linhagens transgênicas superexpressando NIK é muito

similar àquele resultante da inibição da via de biossíntese ou sinalização de

brassinosteróides. Os ensaios de infectividade em tomateiro com o vírus ToYSV-

[MG-Bi2] revelaram que a superexpresão de NIK causou atenuação dos

sintomas uma vez que os transformantes apresentaram menor severidade de

sintomas em relação ás linhagens não transformadas. Estes resultados são

consistentes com o papel protetor de NIK contra a infecção viral e sugere que a

sinalização mediada por NIK comunica-se, em algum nível, com a via de

sinalização de brassinosteróides.

ABSTRACT

PIRES, Silvana Rodrigues, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, october of

2007. Ectopic expression of NIK gene in tomato plants: effects on

development and geminivirus infection. Adviser: Elizabeth Pacheco

Batista Fontes. Co-Advisers: Andréa Miyasaka de Almeida e Francisco Murilo

Zerbini.

Geminivirus are plant virus packed as geminate semi-icosahedral

particles and single-stranded circular DNA genomes. They can be either mono or

bipartite and in the bipartite geminivirus, the genomic components are designated

DNA-A and DNA-B. DNA-A encodes the proteins needed for replication,

transactivation and encapsidation of the viral genome. DNA-B encodes two

movement proteins, Movement Protein, MP, and Nuclear Shuttle Protein, NSP,

both required for the establishment of a systemic infection. NSP transports the

viral DNA between the nucleus and cytoplasm and acts cooperatively with MP to

move the viral DNA cell-to-cell across the wall. The geminivirus are highly

dependent on the host factors for proliferation and spread. NSP interacts with a

plasma membrane receptor kinase, designated NIK (NSP-interacting kinase),

from tomato, soybean and Arabidopsis. It has been demonstrated previously that

inactivation of NIK gene enhances the susceptibility of the mutant to geminivirus

infection. To elucidate the possible role of NIK in the protection mechanism to

geminivirus infection, we investigated here the effects of NIK overexpression in

the tomato response to geminivirus infection. The NIK gene from Arabidopsis

thaliana was used to transform tomato. The primary transformants were

confirmed by PCR, selected by RT-PCR according to the transgene expression,

in vitro replicated and used for developmental analysis in vitro and in green

house. NIK overexpression affected the overall developmental performance of

transgenic lines which display delayed and stunted growth, with lower stem, less

developed root and shoot systems and a leaf curly phenotype. These transgenic

line phenotypes overexpression NIK were similar to that displayed by inhibition of

Brassinosteroid synthesis or signaling. Infectivity assays in tomato with ToYSV-

[MG-Bi2] revealed that overexpression of NIK caused attenuation of symptom, as

the transgenic lines developed less severe symptoms in comparison with the

untransformed lines. These results are consistent with a protective role of NIK

against viral infection and suggest that the NIK-mediated signaling communicates

to some level with the brassinosteroid signaling.

INTRODUÇÃO

Desde a década de 1980, as principais áreas onde o tomateiro é

cultivado no mundo têm sido severamente afetadas por begomovírus (família

Geminiviridae).

A família Geminiviridae é constituída por vírus de plantas com partículas

semi-icosaédricas geminadas e genoma de DNA circular de fita simples (Van

Regenmortel et al., 2000). É dividida em quatro gêneros (Mastrevirus, Curtovirus,

Begomovirus e Topocuvirus), com base no número de componentes do genoma,

inseto vetor, gama de hospedeiros e relacionamento filogenético (Fauquet et al.,

2003). Os begomovírus incluem os vírus transmitidos por “mosca-branca”

(Bemisia tabaci, Homoptera: Aleyrodidae) a espécies dicotiledôneas, e que

possuem um ou dois componentes genômicos (denominados DNA-A e DNA-B).

No DNA-A encontram-se os genes que codificam as proteínas necessárias para

a replicação viral e encapsidação. O DNA-B codifica duas proteínas de

movimento, “Movement Protein” MP e “Nuclear Shuttle Protein” NSP, ambas

requeridas para o estabelecimento de uma infecção sistêmica. NSP transporta o

DNA viral entre o núcleo e o citoplasma e então atua cooperativamente com MP

para movimentar o DNA viral de célula-a-célula através da parede celular.

O controle das doenças causadas por begomovírus é dificultado pela

existência de poucas fontes naturais de resistência e pela diversidade genética

do inseto vetor. Sendo assim, o estabelecimento de um mecanismo de

resistência que possa ser introduzido em espécies economicamente relevantes,

como o tomateiro, representaria enormes ganhos para os produtores.

Dentro desse contexto, a caracterização bioquímica e funcional de

proteínas da planta hospedeira que interagem com proteínas virais deve auxiliar

na elucidação do mecanismo de infecção viral, bem como na estruturação de um

modelo da interação planta: patógeno, possibilitando o desenvolvimento de

estratégias de resistência. Esta caracterização já foi bem utilizada na

identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com proteínas virais

durante o processo de replicação de geminivírus (Alberter et al., 2005; Gutierrez

et al., 2004; Malik et al, 2005), e também com a proteína NSP de begomovirus

(Florentino et al., 2006; Fontes et al., 2004; Mariano et al., 2004; McGarry et al.,

2003). Porém, a maquinaria de transporte do hospedeiro que possibilita a

movimentação de geminivírus pela planta, possibilitando a instalação de uma

infecção sistêmica, ainda é muito pouco elucidada (Rojas et al., 2001; Zhang et

al., 2001). Assim sendo, a proteína NSP (“Nuclear Shuttle Protein”), em

cooperação com MP, consiste em um excelente alvo para elucidação molecular

das interações geminivírus-hospedeiro.

A via fundamental de NSP no movimento viral prediz que esta proteína

pode interagir com fatores do hospedeiro em diferentes compartimentos

subcelulares. Foi demonstrado que NSP interage com uma acetilase nuclear de

Arabidopsis thaliana, designada AtNSI (“NSP interactor”) (McGarry et al., 2003),

como também com uma quinase receptora da membrana plasmática, designada

NIK (“NSP-interacting kinase”), de tomate, soja e Arabidopsis (Mariano et al.,

2004). Em Arabidopsis, NSP interage com três membros da família LRR-RLK,

NIK1, NIK2 e NIK3, que são serina/treonina quinases autênticas com

propriedades bioquímicas consistentes com a função de receptor sinalizador

(Fontes et al., 2004). Evidências sugerem que a interação NIK-NSP pode ser

biologicamente relevante. A interação com NIK é altamente específica, não

interagindo com nenhuma outra proteína viral, nem com outras proteínas

controles. A proteína NIK está localizada na membrana plasmática e exibe

propriedades bioquímicas consistentes com uma função sinalizadora. A

oligomerização de NIK precede a autofosforilação de seu domínio quinase e a

interação da proteína viral NSP com NIK inibe a autofosforilação deste receptor

suprimindo a resposta antiviral mediada por NIK (Fontes et al., 2004). Esta

interação não é vírus-específica, e a inativação do gene NIK aumenta a

suscetibilidade dos mutantes à infecção viral (Fontes et al., 2004). A efetividade

de manipulação dos níveis de NIK no processo de infecção viral ainda não foi

avaliada em tomateiros e pode constituir uma alternativa eficaz para controle da

doença. Assim sendo, os objetivos primordiais dessa dissertação foram

transformar tomateiros com o gene NIK1 de Arabidopsis e avaliar o efeito da

manipulação dos níveis de NIK na eficiência de infecção por geminivírus.

REVISÃO DE LITERATURA

1 Família Geminiviridae

1.1 Organização taxonômica e genômica

A família Geminiviridae é caracterizada pela morfologia de partículas

icosaédricas geminadas e genoma composto por DNA circular de fita simples

(Hanley-Bowdoin et al., 1999). A família é subdividida em quatro gêneros:

Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus e Topocuvirus (Stanley et al., 2005). O

gênero Mastrevirus inclui os geminivírus com um componente genômico

transmitidos por cigarrinhas (Homoptera:Cicadellidae) a plantas

monocotiledôneas. Este gênero inclui patógenos importantes de culturas como o

milho (Maize streak virus, MSV) e o trigo (Wheat dwarf virus, WDV). O gênero

Curtovirus engloba geminivírus com um componente genômico transmitidos por

cigarrinhas a espécies dicotiledôneas. O Beet curly top virus (BCTV) é a principal

espécie de importância econômica. O gênero Topocuvirus possui apenas uma

espécie (Tomato pseudo-curly top virus, TPCTV), com um componente

genômico e transmitida por cigarrinhas (Homoptera: Auchenorrhyncha) a

espécies dicotiledôneas. O gênero Begomovirus inclui espécies com um ou dois

componentes genômicos transmitidas pela mosca-branca (Bemisia tabaci) a

espécies dicotiledôneas. Entre os begomovírus de maior importância econômica

pode-se citar o Bean golden mosaic virus (BGMV), o African cassava mosaic

virus (ACMV) e o Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Moriones & Navas-

Castillo, 2000; Were et al., 2004). Já se tem relato de mais de 130 espécies de

begomovírus, incluindo mais de 40 espécies que podem infectar o tomateiro

(Fauquet et al., 2003).

Em sua maioria, os begomovírus possuem genoma dividido em dois

componentes, denominados DNA-A e DNA-B. No DNA-A encontram-se os

genes que codificam as proteínas necessárias para a replicação viral e

encapsidação. O DNA-B possui genes que codificam proteínas responsáveis

pelo movimento do vírus na planta (Hanley-Bowdoin et al., 1999), (Figura 1).

Dentro de uma mesma espécie viral, os componentes genômicos não possuem

identidade de seqüência, exceto por uma região intergênica com

aproximadamente 200 nucleotídeos denominada região comum (RC), que é

altamente conservada (acima de 90% de identidade para o DNA-A e DNA-B de

uma determinada espécie). A partir da região intergênica divergem os genes

virais, nos sentidos viral e complementar (Howarth et al., 1985; Stanley, 1983)

(Figura 1).

Figura 1- Representação esquemática do genoma de um begomovírus.

As linhas grossas representam o genoma viral, dividido em dois componentes,

cada um com aproximadamente 2.600 nucleotídeos. As setas indicam os genes

virais e a direção em que ocorre a transcrição. A região comum (RC) também

está indicada. A seqüência sublinhada, conservada em todos os membros da

família Geminiviridae, constitui a origem de replicação do genoma viral. * Gene

presente apenas nos begomovírus originários da Europa, Ásia e África (“Velho

Mundo”). O DNA A, codifica as proteínas: Rep, Re

plication-Associated Protein;

TrAP, Tr

ans-Activating Protein; Ren, Replication-Enhancer Protein e a proteína

capsidial CP, C

oat Protein. O DNA B codifica as proteínas: MP, Movement

rotein e NSP Nuclear Shuttle Protein.

DNA A

DNA B

rep

trap

ren

av1* cp

TAATATT

↓

TAATATT

↓

O DNA-A dos begomovírus tem o potencial de codificar de quatro a seis

proteínas: uma proteína associada à replicação (Rep, Re

plication-Associated

rotein, também denominada AC1 ou AL1); uma proteína transativadora (TrAP,

ans-Activating Protein, anteriormente AC2 ou AL2) que ativa a transcrição dos

genes CP e NS e está envolvida na supressão do silenciamento gênico pós-

transcricional (PTGS) (Voinnet et al., 1999; Wang et al., 2005); a proteína Ren

eplication-Enhancer Protein, anteriormente AC3 ou AL3), fator de amplificação

da replicação viral; e a proteína capsidial (CP, C

oat Protein, anteriormente AV1

ou AR1), essencial para a transmissão do vírus pelo inseto vetor (Briddon et al.,

1990; Hanley-Bowdoin et al., 1999; Hofer et al., 1997a). O DNA-B codifica as

proteínas MP (M

ovement Protein, anteriormente BC1 ou BL1) e NSP (Nuclear

huttle Protein, anteriormente BV1 ou BR1), a primeira envolvida no movimento

célula-a-célula do vírus por meio do aumento do limite de exclusão dos

plasmodesmas (Noueiry et al., 1994), e a segunda responsável pelo transporte

do DNA através do envelope nuclear (Sanderfoot et al., 1996; Sanderfoot &

Lazarowitz, 1995).

1.2 Mecanismo de replicação viral

O sítio de replicação dos geminivírus localiza-se no núcleo das células

infectadas. A replicação viral e transcrição dos genes virais são dependentes da

maquinaria do hospedeiro, o que faz dos geminivírus modelos ideais para o

estudo da replicação e expressão gênica em plantas.

Geminivírus replicam o seu genoma por meio de um intermediário de fita

dupla (conhecido como forma replicativa, RF), utilizando o mecanismo de círculo

rolante semelhante ao utilizado pelos bacteriófagos ϕX174 e M13 (Saunders et

al., 1991; Stanley, 1995). Na replicação dos geminivírus, a fita complementar

serve de molde para a síntese de várias cópias do DNA genômico, que formam

uma longa fita simples de DNA linear contendo vários genomas unitários

(multímero ou concatâmero). O multímero é clivado gerando monômeros (os

DNAs genômicos), que serão religados gerando moléculas circulares de ssDNA

correspondentes ao genoma viral, as quais por sua vez serão encapsuladas

formando os vírions (Laufs et al., 1995; Lazarowitz, 1992; Timmermans et al.,

1994). A origem de replicação (ori) está localizada na região intergênica comum

entre os dois componentes genômicos. A ori possui uma organização modular,

com pelo menos três módulos funcionais (Fontes et al., 1994b). A seqüência da

ori é conservada entre componentes de um mesmo vírus, porém variável entre

espécies, com exceção de uma região (módulo do início da replicação) de

aproximadamente 30 nucleotídeos que é essencial para a replicação (Davies et

al., 1987; Lazarowitz, 1992). Nesta região, localiza-se uma seqüência repetida e

invertida composta predominantemente por guanina e citosina, formando uma

estrutura conservada (“structurally-conserved element”, SCE) em forma de

grampo, com uma seqüência invariável (5’-TAATATTAC-3’) encontrada em todos

os geminivírus (Lazarowitz, 1992) que constitui o domínio funcional da origem de

replicação (Orozco et al., 1998). É neste nonanucleotídeo que ocorre a clivagem

(TAATATT↓AC) para início do processo de replicação por círculo rolante

(Gutierrez, 1999; Hanley-Bowdoin et al., 1999). Esta clivagem é realizada pela

proteína Rep, que atua como uma endonuclease sítio-específica com

requerimento de estrutura e de seqüência (Laufs et al., 1995; Orozco & Hanley-

Bowdoin, 1998). Na RC encontram-se também seqüências específicas para a

ligação da proteína Rep (Fontes et al., 1992; Fontes et al., 1994b) e regiões

promotoras da RNA polimerase tipo II, responsável pela transcrição dos genes

virais (Hanley-Bowdoin et al., 1999).

O sítio de ligação de Rep ao DNA está localizado entre a caixa TATA do

gene rep e a SCE (Orozco et al., 1998), e é constituído por duas seqüências

idênticas repetidas (denominados “iterons”). A ligação de Rep aos iterons é

essencial para o início da replicação. Após a ligação de Rep ao DNA viral e

estabilização do complexo formado por Rep, Ren e fatores do hospedeiro, a

proteína Rep cliva o nonanucleotídeo localizado na SCE, dando início à

replicação por círculo rolante (Gutierrez, 1999). O reconhecimento dos iterons

por Rep é considerado vírus-específico (Argüello-Astorga et al., 1994a; Harrison,

1999), de modo que Rep preferencialmente inicia a replicação de seu DNA

cognato.

1.3 Diversidade genética de begomovírus em tomateiro

O tomateiro é, dentre as culturas economicamente mais importantes, uma

das mais afetadas pelo aumento na incidência de begomovírus (Morales &

Anderson, 2001; Moriones & Navas-Castillo, 2000; Polston & Anderson, 1997;

Ribeiro et al., 2003). A diagnose é realizada em geral por "polymerase chain

reaction" (PCR) ou por hibridização com sondas radioativas, embora novos

métodos estejam sendo testados (Santana et al., 2007). Em grande parte, o

aumento da incidência de begomovírus está associado ao aumento populacional

do biótipo B do inseto vetor, a mosca-branca Bemisia tabaci (Morales & Jones,

2004; Naranjo & Ellsworth, 2001). As fêmeas do biótipo B apresentam maiores

taxas de oviposição, alta capacidade reprodutiva, baixa mortalidade em

hospedeiros e uma gama de hospedeiros muito mais ampla que o biótipo A,

incluindo solanáceas como o tomateiro e outras plantas silvestres e/ou daninhas,

além de possuir maior um grau de adaptação e dispersão (Bedford et al., 1994).

Com estas características, o inseto provavelmente transfere para o tomateiro

espécies de begomovírus nativos presentes nas plantas daninhas. Diversas

espécies de begomovírus infectando plantas daninhas como Sida rhombifolia e

Ageratum conizoides já foram isoladas e caracterizadas (Frischmuth et al.,

1997b; Tan et al., 1995). Um exemplo é o Sida golden mosaic virus (SiGMV),

isolado de S. rhombifolia, que é capaz de infectar também plantas de tomateiro e

feijoeiro (Frischmuth et al., 1997a).

No Brasil, uma década após o relato da presença do biótipo B de mosca-

branca, levantamento realizado por meio do seqüenciamento parcial do genoma

de begomovírus infectando tomateiros nas regiões Sudeste e Nordeste indicou a

presença de pelo menos sete novas espécies associadas à cultura (Ribeiro et

al., 2003). No estado de Minas Gerais foram caracterizadas três novas espécies.

A espécie predominante no Triângulo Mineiro foi denominada Tomato rugose

mosaic virus (ToRMV) (Fernandes et al., 2000). Na Zona Metalúrgica, foi descrito

o Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) (Ambrozevicius et al., 1999; Andrade

et al., 2002; Ribeiro et al., 2003). Isolados de ToCMoV também foram

identificados no Rio de Janeiro, Espírito Santo e em estados do nordeste como

Bahia e Pernambuco (Ribeiro et al., 2003). Uma terceira espécie denominada

Tomato yellow spot virus (ToYSV) foi recentemente caracterizada (Calegario et

al., 2007). Além dessas três espécies, cujos genomas encontram-se clonados e

foram totalmente seqüenciados, relatos de possíveis novas espécies infectando

o tomateiro continuam ocorrendo (Albuquerque et al., 2004; Andrade et al., 2006;

Cotrim et al., 2007; Fernandes et al., 2006; Pires et al., 2004), sugerindo que o

processo de transferência de vírus nativos para o tomateiro, com a conseqüente

evolução de novas espécies, ainda se encontra em andamento.

1.4 Movimento célula-a-célula e a longa distância durante a infecção

viral

O sucesso da infecção sistêmica depende do transporte do vírus a longa

distância e de sua entrada no floema. Este movimento no interior do hospedeiro

pode ser dividido em dois processos: movimento célula-a-célula, via

plasmodesmas, e movimento a longa distância, no qual o vírus é transportado

sistêmicamente para toda a planta hospedeira após atingir o sistema vascular.

Qualquer bloqueio neste processo acarreta o aparecimento de sintomas

atenuados, ou mesmo a resistência do hospedeiro à infecção sistêmica

(Gilbertson & Lucas, 1996).

Para mediar o movimento do vírus no hospedero, os begomovírus

codificam uma proteína não estrutural denominada MP. Essa proteína associa-

se à membrana celular e possivelmente altera a arquitetura dos plasmodesmas,

facilitando o transporte do genoma viral (Noueiry et al., 1994). Como os

begomovírus se multiplicam no núcleo da célula infectada, é necessária uma

etapa adicional de transporte do núcleo para o citoplasma, que é realizada por

uma segunda proteína de movimento denominada NSP. Estas duas proteínas de

movimento, atuando de maneira cooperativa (Sanderfoot & Lazarowitz, 1995),

permitem ao vírus infectar sistemicamente o hospedeiro.

Nos begomovírus, a proteína capsidial é dispensável para o

estabelecimento de infecção sistêmica na maioria dos casos já estudados (Rojas

et al., 2005). Tanto MP quanto NSP reconhecem o DNA viral de maneira

específica em relação à forma e comprimento (Gilbertson et al., 2003; Rojas et

al., 1998), o que eliminaria a necessidade da presença da proteína capsidial para

o movimento a longa distância.

1.5 Interações geminivírus-hospedeiro

Diferentes grupos de pesquisadores demonstraram grande número de

interações entre os geminivírus e seus hospedeiros. Essas interações incluem

modificações na estrutura e função de plasmodesmas (Gilbertson et al., 2003;

Noueiry et al., 1994), respostas a diferentes mecanismos de defesa da planta

(Fontes et al., 2004; Trinks et al., 2005; Vanitharani et al., 2004; Wang et al.,

2005), interação com proteínas envolvidas na regulação do desenvolvimento

celular (Latham et al., 1997; Xie et al., 1999), e modificações no padrão de

expressão gênica do hospedeiro, principalmente no sentido de ativar genes

envolvidos na síntese de DNA e na divisão celular (Arguello-Astorga et al., 2004;

Luque et al., 2002; Settlage et al., 2001; revisado por Hanley-Bowdoin et al.,

2004).

Além da capacidade de ativação de proteínas do hospedeiro, as

proteínas de replicação dos geminivírus são capazes também de interagir com

proteínas do hospedeiro envolvidas na replicação de DNA, como a PCNA

(Castillo et al., 2003) e o fator de replicação C (Luque et al., 2002). Estes fatores

envolvidos na replicação não estão presentes em células diferenciadas

normalmente infectadas por geminivírus, de modo que o primeiro passo no

processo de infecção é interferir com o controle do ciclo celular para induzir a

síntese destas proteínas.

Outro fator de grande importância para o sucesso da infecção viral é a

capacidade do vírus em suprimir os mecanismos de defesa da planta. Os

geminivírus interferem em diferentes respostas de defesa (Trinks et al., 2005;

Vanitharani et al., 2004; Wang et al., 2003). Isto se deve, provavelmente, como

uma forma de maximizar a replicação viral em termos quantitativos, permitindo o

acúmulo de maiores quantidades de partículas virais na célula infectada, e em

termos temporais, diminuindo o intervalo necessário para o estabelecimento da

infecção sistêmica. Algumas dessas interações já foram identificadas, embora os

mecanismos moleculares ainda não tenham sido totalmente elucidados.

De acordo com a função de NSP no transporte do vírus na planta,

acredita-se que essa proteína interaja com proteínas do hospedeiro nos diversos

compartimentos celulares. Foi isolado um receptor transmembrana

serina/treonina quinase, designado LeNIK (Lycopersicum esculetum, atualmente

Solanum lycopersicum, NSP-Interacting Kinase). Também foi comprovado que

os homólogos de NIK em soja (GmNIK) e Arabidopsis thaliana (AtNIK) interagem

com NSP (Fontes et al., 2004). A proteína NSP inibe a atividade de

autofosforilação desses receptores de membrana e inativação dos genes NIKs

em Arabidopsis aumenta a suscetibilidade à infecção viral.

Outra proteína caracterizada por interagir com NSP de geminivírus é uma

acetiltransferase nuclear pertencente a uma família de acetiltransferase de

histonas nucleares, designada AtNSI (“Nuclear shuttle protein interactor”),

altamente conservada entre as plantas (McGarry et al., 2003). NSP não é

substrato para a enzima acetiltransferase. A proteína AtNSI acetila a proteína

capsidial, auxiliando a interação do ssDNA com a proteína NSP durante a

replicação por círculo rolante (McGarry et al., 2003). Em experimentos de

superexpressão de AtNSI foi demonstrado que a infecção do CaLCuV é

potencializada e vírus mutantes, cuja NSP é incapaz de interagir com AtNSI,

possuem uma infecção deficiente (Carvalho & Lazarowitz, 2004; McGarry et al.,

2003).

Além desta, foi identificada outra proteína, através de um screening de

duplo híbrido de levedura, também com capacidade de interagir com NSP: a

proteína PERK-like, também designada de NsAK (NSP-associated Kinase). A

proteína NsAK é estruturalmente organizada em um domínio N-terminal rico em

prolina, seguido por um domínio transmembrana e um domínio quinase do tipo

serina/treonina no C-terminal. Ensaio de tradução in vitro de NsAK, na presença

de NSP, mostrou aumento nos níveis de fosforilação de NSP, indicando que

NSP age como substrato para NsAK (Florentino et al., 2006). Foi demonstrado

que a perda de função de NsAK, in vivo, diminui a suscetibilidade à infecção por

CaLCuV, sugerindo uma possível regulação da função de NSP.

2 Receptores do tipo serina/treonina quinases

2.1 Caracterização

Proteínas quinases, PK, possuem um papel fundamental em uma grande

variedade de processos celulares, atuando no crescimento e desenvolvimento

em plantas e animais. Atuam catalisando a fosforilação de um ou mais

substratos através da transferência do grupamento γ-fosfato do ATP para um

grupamento hidroxila no substrato. Em muitos casos, esta função é realizada por

receptores quinases, RPK, os quais são divididos em duas grandes classes

apresentando diferentes especificidades em seus domínios quinases: receptores

tirosina-quinases, RTK, que fosforilam proteínas em específicos resíduos de

tirosina, enquanto que receptores serina/treonina–quinases, STKR, fosforilam

serina ou treoninas ou, em alguns casos, ambos resíduos de aminoácidos (Lin et

al., 1992). Células vegetais e animais utilizam receptores quinases para interagir

entre si e com o meio extracelular, porém ocorre a dominância de RTKs em

animais enquanto em plantas STKRs são predominantes. Estas duas grandes

famílias apresentam uma origem comum anterior á diversificação dos

organismos vivos em animais e plantas (Shiu e Bleecker, 2001a).

Com o seqüenciamento do genoma de Arabidopsis, um grande número

de seqüências codificando proteínas com topologia predita de receptores do tipo

quinase foram obtidas, porém, com função ainda não demonstrada e, portanto,

denominadas RLKs, Receptor-Like Kinases. Esses receptores existem na

membrana como monômeros (Becraft, 1998). A ligação do receptor à molécula

ligante induz oligomerização dos monômeros, o que as torna capazes de

transfosforilação e subseqüente ativação. Entretanto, diferentes RLK’s de

plantas são multímeros em sua forma inativa (Trotochaud et al. 1999); e existem

proteínas RLKs que possuem domínios quinase inativos (Barre et al., 2002)

As plantas, assim como os animais, utilizam extensivamente receptores

de superfície. Nos animais, os receptores são, em sua grande maioria,

associados às proteínas G, enquanto nas plantas a maioria, encontrada até

agora está associada a enzimas. Além disto, nos animais o maior grupo de

receptores associado a enzimas é da família RTKs, que é rara em plantas. Estas

contam com uma grande diversidade de STKRs que, à semelhança a RLKs

encontradas em animais, possuem um domínio quinase citoplasmático típico e

um domínio extracitoplasmático de interação com ligantes.

2.2 Família RLK em plantas

Em Arabidopsis, existem mais de 21 classes diferentes de ectodomínios

de proteínas RLKs. Com base na análise de filogenia molecular das seqüências

do domínio quinase das RLKs são encontrado mais de 610 membros desta

família, podendo estes serem classificados em 44 subfamílias (Shiu e Bleecker,

2001 a;b). Levando em consideração a organização das repetições ricas em

leucina (leucine-rich repeats-LRR), que variam de 3 a 26 no domínio

extracitoplasmático, as proteínas RLK contendo LRR são classificadas em 13

subfamílias (LRR-RLK I-XIII) (Dievart e Clark, 2003; Shiu e Bleeker, 2001). Cerca

de 235 das RLK’s de Arabidopsis são classificadas como LRR-RLKs.

RLK são receptores transmembrana que possuem uma organização

estrutural conservada, caracterizada por uma porção amino-terminal

extracitoplasmático seguida de uma região transmembrana, um sítio de ligação a

nucleotídeo (NBS) e um domínio citoplasmático serina/treonina quinase

relacionado com sinalização celular (Belkhadir et al., 2004). O domínio LRR dos

receptores quinases tem sido relacionado à capacidade de interação com

proteínas derivadas de patógenos, incitando resposta de defesa no hospedeiro

(Innes, 2004), peptídeos (Trotochaud et. al., 2000) e esteróides (Wang et al.,

2001).

A subfamília LRR-RLK também está envolvida na regulação de vários

processos de desenvolvimento e percepção de fitormônios, incluindo as

proteínas ERECTA e CLAVATA, que estão envolvidos na determinação da forma

e tamanho do órgão floral (Clark et al., 1997), SERK1 envolvida na embiogênese

(Hecht et al., 2001), BRI1 e BAK1, atuantes na sinalização e percepção de

brassinosteróides (Li & Chory, 1997).

2.3 Subfamília LRRII-RLK

A subfamília LRRII-RLK é constituída por 14 proteínas caracterizadas por

possuir no domínio extracelular cinco repetições ricas em leucina arranjadas em

um único bloco contínuo, das quais quatro são ditas completas possuindo 24

resíduos de aminoácidos, e a repetição 5 apresentando 16 resíduos de

aminoácidos (Zhang et al., 2006). Estas repetições apresentam seqüência

consenso LRR em que L e I presentes nas posições 1, 4, 6, 11, 15, 19 e 22 são

muitas vezes substituídas uma pela outra ou por aminoácidos alifático (A, V, F

ou M), enquanto os aminoácidos glicina na posição 13 e prolina na posição 16

da LRR são invariáveis. Ainda, em comum, as proteínas LRRII-RLK possuem o

número de íntrons similares, com exceção da proteína AtNIK1 e do gene

At5g10290 que perderam íntrons e do gene At5g63637, que além da perda do

íntron 4 possui um íntron adicional na região N-terminal.

Os representantes da subfamília LRRII-RLK são filogeneticamente

classificados em três grupos que também apresentam analogia funcional. O

grupo I categoriza os genes de defesa, grupo II de desenvolvimento e grupo III

de funções desconhecida (Zhang et al., 2006). A proteína AtNIK1 (At5g16000),

de acordo com estas análises filogenéticas, está inserida no grupo I da

subfamília LRRII-RLK, apresentando uma perda dos íntrons 9 e 10 que, em

outros membros da mesma subfamília, localizam-se no domínio quinase da

proteína.

3 Receptores NIK (NSP-Interacting Protein)

A proteína NIK1 é uma serina/treonina quinase pertencente à subfamília

LRRII-RLK (receptores do tipo quinase contendo repetições ricas em leucina) e

exibe propriedades bioquímicas consistentes com a função de sinalização. NIK

foi inicialmente identificada pela sua capacidade de interagir com a proteína NSP

de geminivirus, através de uma região que compreende o sítio ativo e a alça de

ativação de NIK. Além do fato de NSP inibir a atividade de quinase de NIK,

inativação dos genes NIKs em Arabidopsis aumenta a suscetibilidade á infecção

por CaLCuV, sugerindo que NIK está envolvida em respostas de defesa anti-viral

mediada pelo receptor (Fontes et al., 2004).

Foram isolados, por meio do sistema duplo híbrido e utilizando a proteína

NSP como isca, cinco cDNAs de tomateiros capazes de interagir com a proteína

viral (Mariano et al., 2004). A análise de seqüências revelou que quatro cDNAs

são idênticos e codificam um possível receptor transmembrana serina/treonina

quinase, designado LeNIK (Lycopersicum esculetum NSP-Interacting Kinase).

Também foi comprovado que os homólogos de NIK em soja (GmNIK) e

Arabidopsis thaliana (AtNIK) interagem com NSP (Fontes et al., 2004).

Em Arabidopsis, NIK atua como receptor de sinalização. NSP interage

com NIK1, NIK2 ou NIK3 através do dimínio quinase (Fontes et al., 2004).

Ensaios de interação in vitro mapearam o domínio da interação em um motivo de

80 aminoácidos que correspondem ao KD VIb (HrDvKssNxLLD) e alça de

ativação (A) ou KD VII (DFG Ak/rx) plus KD VIII (GtxGyiaPEY) da proteína

AtNIK1 (At5g16000). A alça-A exerce um papel fundamental no controle da

atividade dessas quinases por meio da fosforilação de resíduos de treonina

conservados nesse domínio (Ellis et al., 1986). A proteína NIK possui domínios

característicos de proteínas receptoras de membranas, que muitas vezes estão

envolvidas no desenvolvimento da planta ou na resistência a patógenos. Os três

homólogos de Arabidopsis thaliana desses receptores quinases contêm 3-5

LRRs. Evidências sugerem que a interação NIK-NSP é biologicamente relevante.

A funcionalidade das proteínas NIK como receptores envolvidos na sinalização

celular foi comprovada por meio de experimentos de reversa genética

demonstrando que a perda da função de NIK aumenta a suscetibilidade de

nocautes à infecção por geminivírus. A proteína NIK1 se oligomeriza provocando

a transfosforilação de seu domínio citoplasmático de quinase que, ativado, é

capaz de fosforilar substrato(s) endógeno(s) e ativar mecanismos de defesa do

hospedeiro. Conseqüentemente, a ativação dessa via de sinalização pode

culminar em interferência na replicação viral ou no movimento do vírus

impedindo o estabelecimento da infecção sistêmica. A proteína viral NSP

interage com o domínio quinase inibindo a fosforilação de resíduos de treoninas

na alça de ativação essencial para a ativação da quinase e impedindo assim a

cascata de sinalização celular que culminaria em resposta de defesa antiviral

(Santos, 2007).

A análise do papel biológico e funcional dos genes homólogos de NIK

que interagem com a proteína NSP no processo de infecção viral fornecerá

conhecimentos básicos e moleculares para o entendimento das interações

geminivírus-hospedeiro, que poderão culminar na elaboração de estratégias de

resistência engenheirada. Neste contexto, a manipulação dos níveis de NIK no

processo de infecção viral em tomateiros pode constituir uma alternativa eficaz

para controle da doença. Assim sendo, os objetivos da presente investigação

foram transformar tomateiros com o gene NIK1 de Arabidopsis e analisar o efeito

da superexpressão de NIK no desenvolvimento global das plantas transgênicas

e na eficiência de infecção pelo begomovírus Tomato yellow spot virus (ToYSV).

MATERIAL E MÉTODOS

1 Construções de DNA

1.1 Construção do clone pk7AtNIK1-1

O clone pk7AtNIK1-1, contendo o cDNA de NIK1-1(Arabdopsis thaliana

NSP-Interacting Kinase), sob o controle do promotor 35S e no vetor binário de

transformação de plantas pK7WG2, descrito por Fontes et al., 2004 (Figura 2).

O referido clone foi utilizado nos experimentos de transformação de tomateiro.

Os transformantes primários foram selecionados com base em sua resistência à

kanamicina e os transformantes que enraizaram foram testados quanto á

presença do gene NIK1 via PCR. Na reação, foram utilizados oligonucleotídeos

específicos para NIK1 e o vetor pK7WG2.

Figura 2 - Diagrama esquemático da construção pk7AtNIK1-1contendo o

cDNA de NIK1 de Arabidopsis thaliana sob controle do promotor 35S (p35S) e

sinais de terminação de transcrição do transcrito 35S de CaMV (T35S). Kan

denota o gene nptII que confere resistência a kanamicina, aatR2 e attR1 são as

regiões de recombinação homóloga.

T 35S

Fragmento

de CDNA

NIK1

attR2 attR1

Kan

35S

LB RB

1.2 Construção do clone pk7ILeNIK-(RNAi)

O clone pUFV410 foi previamente descrito (Mariano et al., 2004) e

contém um fragmento de 909 pb da região C-terminal da proteína LeNIK

(Lycopersicon sculentum NSP- Interacting Kinase), capturada em uma biblioteca

de cDNA de tomate, através do sistema duplo híbrido, utilizando NSP como isca.

Este clone, foi utilizado como molde para amplificação de uma região de 375 pb

do cDNA LeNIK (Figura 3) com oligonucleotídeos especificamente desenhados

(LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd) (Tabela 1) . Este fragmento de LeNIK foi clonado

no vetor pK7GW1WG2 (Figura 4), que induz silenciamento gênico por

possibilitar a inserção de duas cópias do fragmento em repetição invertida

(Figura 5). Para a clonagem, foi utilizado o sistema GATEWAY (Invitrogen Life

Technologies, Inc.), segundo instruções do fabricante.

>LeNIK

GAATTCGGCACGAGTTTTCACGAACAATGTGATCCAAAGATAATTCAT

AGAGATGTTAAAGCAGCAAATATATTGCTCGATGACTTTTGTGAGGCGGTTG

TGGGAGATTTTGGGCTGGCAAAGCTTTTAGATCACCAGGATTCACATGTCAC

AACAGCTGTGCGTGGTACAGTAGGGCATATAGCCCCTGAATACTTATCAACA

GGCCAATCATCTGAGAAAACAGACGTGTTTGGATTTGGGATCCTTCTACTTG

AACTGATCACAGGGATGAGAGCTATAGAATTTGGAAAAGCAGCTAACCAAAA

GGGAGTAATGCTTGATTGGGTTAGGAAAATTCACCAAGAGAAGAAACTTGAT

GTCCTTGTTGATAAAGATTTGAGAATCAATTATGATCGAATCGAGCTAGAGG

AAATGGTTCAAGTTGCTCTGCTTTGCACACAATATCTTCCAGGCCACAGACC

AAAAATGTCTGAAATCGTTCGTATGCTTGAAGGTGATGGACTTGCAGAGAG

ATGGGAAGCATCCCAAAAATTTGATGGTAGTAACAAGTACAAAACTAAAGAG

CTATCCTCATCCGAGAGATTTTCAGATCTCACCGATGATTCTTTATTACTTGT

ACAAGCCATGGAGCTGTCTGGTCCTAGGTGAGCAAGTTAAAATTACACATAA

TTATAACGTAAAATTTCACACTTAGAGAGGTAATTTATTAAGCTATGTGGTAA

TGTATAGTAATGAACCATCAAAGATTCGAAGAGCTTTGATGTGTTCTGTTATT

TTTTTGTTTCTTTATTGTATATGTTCATCTTTTAATTTTTTTCCTCGTACCTGTA

TTTGTAGTTTAGACAATGTTGTAGTTTGAAAAATCTGAAATGAAACTTTTAAG

CATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Figura 3 - Seqüência do fragmento de 909 pb da região C-terminal da

proteína LeNIK utilizada como molde para amplificação de uma região de 375 pb

do cDNA LeNIK. Em azul, destacada a região de anelamento dos

oligonucleotídeos LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd.

Tabela 1 - Oligonucleotídeos utilizados em amplificações específicas

Oligonucleotídeo Seqüência

Região de

anelamento

LRAtNIK1RG (3774)

5’-AGAAAGCTGGGTCGAGTCATAAGAGATTTCGATG-3’

Nucleotídeo 1096 de

AtNIK1

KDAtNIK1RG (3315) 5’-AGAAAGCTGGGTCTCATCTAGGACCAGAGAGCTC-3’

Região terminal de

AtNIK1 contendo

stop codon

KDAtNIK1FG (3314) 5’-AAAAAGCAGGCTTCACAATGGGAGCTGCAAGAGGG-3’

Nucleotídeo 1242 de

AtNIK1

496 5'- AAT ACT GCA GGG CTT YCT RTA CAT RGG -3' Componente A de

geminivírus

1978

5'- GCA TCT GCA GGC CCA CAT YGT CTT YCC NGT -3' Componente A de

geminivírus

MC36 (3408)

5’-TCCTTCGCGCAAGACCCTTCCTC-3’

Promotor 35S

LeNIKRvs

5’-GAAAGCTGGGTCCAAACTACAACATTGTCTAAA-3’ Região C-terminal de

LeNIK

486LeNIK-Fwd

5’- AAAAAGCAGGCTTCACAATGCTTGAAGGTGATGG-3’ Região C-terminal de

LeNIK

Figura 4 - Vetor pK7GW1WG2(I), utilizado por apresentar dois sítios

attR1 e attR2 entre os quais foram inseridas duas cópias do fragmento de

interesse em repetição invertida, sob controle do promotor 35S.

Figura 5 - Diagrama esquemático da construção contendo o cDNA de

LeNIK, sob controle do promotor 35S. A inserção do fragmento de cDNA em

repetição invertida é representada por setas em direções opostas.

T 35S

Fragmento

DNA

LeNIK

attR1 attR2

Kan p35S

Intron

attR2

Fragmento

DNA

LeNIK

attR1

Os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de LeNIK clonado

em vetor que induz silenciamento gênico, foram utilizados na transformação de

células competentes de Escherichia coli da estirpe DH5α, pelo método de

choque térmico (Sambrook et al., 1989). Os transformantes foram confirmados

por PCR (Sambrook et al, 1989). Para tal, foram utilizados dois conjuntos de

primers: os oligonucleotídeos LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd, utilizados para a

clonagem (Conjunto A) e os oligonucleotídeos LeNIKRvs e MC36 (Conjunto B)

(Tabela 1), A confirmação da inserção em repetição invertida das duas cópias

do gene de interesse foi realizada por meio de hidrólise enzimática com a a

enzima de restrição BglI, utilizada por apresentar um sítio de restrição em LeNIK

na posição 591 e não apresentar sítio de restrição no vetor pK7GW1WG2. Desta

forma, foi obtido o clone pk7ILeNIK-(RNAi) (pUFV719), que foi posteriormente

estocado em glicerol e armazenamento a -80ºC e também utilizado nos

experimentos de transformação de tomateiro, visando avaliar efeitos do

silenciamento da proteína NIK 1.

2 Material Vegetal

Em todos os experimentos que envolveram material vegetal foram

utilizadas plantas de Solanum lycopersicum cultivar Moneymaker. As sementes

foram desinfestadas através do tratamento com álcool 70% por 1 min, hipoclorito

de sódio 10% por 20 min, hipoclorito de sódio 1% por aproximadamente 12h,

seguidos de 3 lavagens em água estéril. Em seguida foram mantidas a 22°C em

frascos contendo meio MS ½ força (adaptado de Murashige e Skoog, 1962) por

uma semana. Após este período de germinação, foi realizada a excisão dos

explantes foliares a partir das folhas cotiledonares.

3 Procedimentos para transformação de tomateiros.

3.1 Transformação de agrobactéria LBA4404 com os clones

pk7AtNIK1-1 e pk7ILeNIK-(RNAi-LBA4404)

A estirpe de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi transformada por

meio do método de eletroporação (2500 mV, 3-4ms), com o clone pk7AtNIK1-1

(gene NIK1 clonado no vetor pK7WG2). Colônias crescidas em placas contendo

100 mg.L

-1

de estreptomicina e 100 mg.L

-1

de espectiomicina foram inoculadas

em meio líquido, para posterior extração de DNA plasmidial utilizando o “Plasmid

Midi Kit” (Qiagen), seguindo as recomendações do fabricante. A confirmação das

colônias positivas foi feita via PCR, testando-se a incorporação do gene. Para

tanto, foram utilizados dois conjuntos de primers: os oligonucleotídeos MC36 e

3315 (Conjunto A) e os oligonucleotídeos MC36 e 3774 (Conjunto B). Os

resultados obtidos foram avaliados em gel de agarose 1% (p/v) e corado com

brometo de etídeo 0,1 µg.mL

-1

. Colônias positivas foram novamente inoculadas

em meio líquido, para posterior estoque em glicerol e armazenamento a -80ºC.

Este clone (pk7AtNIK1-1-LBA4404) denominado pUFV701, foi posteriormente

utilizado para transformação de tomateiro.

À semelhança, foi obtido, o clone pk7ILeNIK-(RNAi-LBA4404), sendo

também utilizado para transformação de tomateiro em cultura de tecidos.

3.2 Transformação de tomateiros

O clone pk7AtNIK1-1-LBA4404 foi utilizado para a transformação de

plantas de Solanum lycopersicum, cultivar Moneymaker. A transformação foi

realizada conforme protocolo desenvolvido por Frary (1995) com modificações.

A colônia de Agrobacterium tumefaciens contendo o clone pk7AtNIK1-1-

LBA4404 (utilizado para superexpressão do transgene NIK) foi inoculada em 50

mL de meio Rhizo com 100 mg.L

-1

de estreptomicina e 100 mg.L

-1

espectiomicina, a 28

C e permaneceu sob agitação a 220 rpm por 12 horas. A

cultura foi centrifugada a 6500 rpm (no rotor F0650, da Beckman) por 10

minutos, a 14

C. O “pellet” foi ressuspendido em meio líquido MS 0,2%

(Murashige & Skoog, 1962). A concentração foi ajustada para DO

600

= 0.4.

Explantes foliares de tomateiro foram co-cultivados com as células bacterianas

durante 15 minutos, sob agitação. Após secagem em papel de filtro, os explantes

foram mantidos em placas de Petri contendo meio MS sólido, sem antibiótico,

por 2 dias, com a face adaxial em contato com o meio. Em seguida, foram

transferidos para meio MS sólido contendo 50 mg.L

-1

de kanamicina e 300 mg.L

-1

de timentim, com a face adaxial voltada para cima. As placas foram mantidas em

câmera de crescimento, com temperatura e luminosidade controladas. Os

explantes foram transferidos para um meio novo a cada 2 semanas. A

concentração de kanamicina e de timentim nas placas permaneceu constante.

Cada regenerante em uma placa representou um transformante independente.

Os regenerantes transformados, bem como os regenerantes não transformados

(controle) foram transferidos para frascos contendo meio nutritivo sólido,

segundo o protocolo de transformação, para regenerar uma nova planta, sendo

mantidos in vitro e repicados freqüentemente.

3.3 Diagnóstico molecular dos transformantes

Após a regeneração das plantas, foram coletadas amostras foliares de

cada transformante e de plantas não transformadas, utilizadas como controle,

para obtenção de DNA genômico (Dellaporta et al., 1983). O DNA foi usado

como molde na reação de PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para

AtNIK1 (oligonucleotídeos 3314 e 3315), como também para AtNIK1 e o vetor

pK7WG2 (oligonucleotídeos MC36 e 3315).

3.4 Expressão do transgene

RNA total foi extraído a partir de folhas de plantas transformadas pelo

método Trizol (Invitrogen Life Technologies, Inc.). A qualidade e a integridade do

RNA foram monitoradas, respectivamente, por espectrofotômetro e por

eletroforese em gel de agarose. Cerca de 3 µg de RNA foram tratados com

DNase (Promega, Madison, WI) e utilizados para obtenção do cDNA, usando a

enzima transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen) e oligo-dT(18), de acordo com

recomendações do fabricante. Uma vez obtido o cDNA, foi realizada reação de

PCR utilizando oligonucleotídeos específicos para AtNIK1 (3314 e 3315).

Foi realizada também reação de PCR utilizando os cDNA obtidos da

planta controle não transformada e das plantas superexpressando NIK1 com

objetivo de avaliar a expressão de NIK endógeno de tomate com

oligonucleotídeos específicos para LeNIK (LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd). Os

produtos da reação foram analisados em gel de agarose 1% (p/v) e corado com

brometo de etídeo 0,1 µg.mL

-1

. As plantas nas quais a expressão do transgene

foi confirmada foram repicadas para os ensaios de infectividade.

3.5 Aclimatação dos transformantes primários

Após o processo de enraizamento das plantas repicadas (plantas

controle, WT, e plantas transgênicas superexpressando NIK1), estas foram

retiradas dos frascos e as raízes foram lavadas com água deionizada. Em

seguida, foram acondicionadas em copos plásticos contendo substrato orgânico

(Plantmaxl) umedecido e mantidas sob condições de ambiente. Pequenos cortes

foram feitos nos sacos plásticos, durante uma semana, período em que as

plantas foram conduzidas em casa de vegetação, onde permaneceram por dois

dias, para realização dos ensaios de infectividade.

4 Análise de desenvolvimento dos transformantes primários em cultura de

tecidos e em casa-de-vegetação

Plantas controle não transformadas e plantas transgênicas

superexpressando NIK1 foram mantidas em câmera de crescimento com

temperatura e luminosidade controladas por um período de dez dias, durante as

fases iniciais de desenvolvimento. As plantas foram observadas quanto ás

características físicas (desenvolvimento do caule e altura) após 10 dias de

crescimento. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente

casualizado (DIC) com 5 plantas avaliadas e realizadas três repetições. As

médias foram comparadas pelo teste de Duncan, adotando-se o nível de 5% de

probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas utilizando procedimentos

do programa SAS - Statistical Analysis System, versão 9.1, licenciado para a

UFV/2006.

A incorporação e expressão do transgene foram confirmadas em plantas

transgências individuais utilizadas nos experimentos de análise de

desenvolvimento. Assim, procedeu-se à extração de DNA genômico a partir de

amostras foliares (Dellaporta et al., 1983) e foi realizada reação de PCR,

utilizando oligonucleotídeos específicos para o gene AtNIK1 e o vetor pK7WG2

(oligonucleotídeos MC36 e 3315). Simultaneamente, foi realizada extração do

RNA pelo método Trizol (Invitrogen Life Technologies, Inc.). Produzido o cDNA,

procedeu-se à reação de PCR, utilizando oligonucleotídeos específicos para

AtNIK1 (3314 e 3315).

Plantas controle não transformadas e plantas transgênicas

superexpressando AtNIK1 foram mantidas em casa-de-vegetação, à temperatura

ambiente, também por um período de dez dias. As plantas foram observadas

quanto às características físicas (desenvolvimento do caule e altura).

5 Ensaios de infectividade por biobalística

Foi realizado experimento de infecção viral via biobalística (Schaffer et al.

1995), utilizando clones infecciosos correspondentes a repetições em série do

DNA-A e DNA-B do isolado ToYSV-[MG-Bi2] (Calegario et al., 2006), mantidos a

-80

C, na forma de estoque em glicerol.

5.1 Extração do DNA viral

Os clones infecciosos foram extraídos a partir de E. coli, utilizando-se o

“Plasmid Midi Kit” (QIAGEN), segundo as recomendações do fabricante. A

qualidade e a integridade do DNA foram analisadas em gel de agarose 1% (p/v)

e a concentração foi avaliada por espectrofotometria a A

260

5.2 Bombardeamento

Aproximadamente 10 µg de cada componente de DNA foram precipitados

em micropartículas de tungstênio, na presença de CaCl

1 M e espermidina 15

mM, e lavados com etanol absoluto. As membranas preparadas foram

devidamente encaixadas no acelerador de partículas e lançadas contra os

meristemas foliares sob vácuo e com uma aceleração de 160 psi, de acordo com

Schaffer et al. (1995). Como controle, as plantas não transformadas e

transgênicas foram inoculadas apenas com micropartículas de tungstênio, sem

DNA viral.

Logo após o bombardeamento, as plantas foram transferidas para

câmara de crescimento a 22

C, com 16 horas de fotoperíodo e observadas

quanto ao aparecimento de sintomas até 30 dias após a inoculação. Para os

experimentos de análise de infecção, foram utilizadas plantas no estádio de

desenvolvimento correspondente a sete folhas. Foram utilizadas 15 plantas de

cada linhagem.

Durante a análise dos sintomas, as plantas inoculadas foram observadas

em intervalos de dois dias e fotodocumentadas. Foram levados em consideração

sintomas como manchas amarelas, clorose, enrolamento e enrugamento foliar.

5.3 Diagnóstico molecular da infecção viral

Para confirmar a presença do vírus em plantas sintomáticas, o DNA total

dos tomateiros foi extraído (Dellaporta et al., 1983) de cada planta inoculada com

vírus, a cada sete dias após a inoculação, até 40 dias após a inoculação. O DNA

extraído foi usado como molde em reações de PCR utilizando oligonucleotídeos

universais, que amplificam um fragmento específico do componente A de

begomovírus (Rojas et al., 1993). Os produtos da reação foram analisados em

gel de agarose 1% (p/v), corado com brometo de etídeo 0,1 µg.mL

-1

A percentagem de plantas infectadas foi avaliada a cada dois dias quanto

à sintomatologia e a cada sete dias quanto ao acúmulo de DNA viral.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1 Obtenção do clone pk7ILeNIK-(RNAi)

Os plasmídeos recombinantes contendo o fragmento de LeNIK clonado

em vetor que induz silenciamento gênico, foram utilizados na transformação de

células competentes de Escherichia coli. Foram obtidos um total de 21

transformantes que foram confirmados por PCR sendo utilizados dois conjuntos

de primers: os oligonucleotídeos LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd, utilizados para a

clonagem (Conjunto A) e os oligonucleotídeos LeNIKRvs e MC36 (Conjunto B)

(Tabela 1), gerando um produto de aproximadamente 512 pb (Figura 6). Foi

realizada também análise enzimática para a confirmação da inserção em

repetição invertida das duas cópias do gene de interesse, sendo utilizada a

enzima de restrição BglI, liberando um fragmento de aproximadamente 12,0 kb

e outro de aproximadamente 1,5 kb (Figura 7).

Figura 6 - Diagnóstico dos plasmídeos recombinantes de E. coli

transformada por PCR. M-Marcador de peso molecular em pb, 1-21-

transformantes obtidos. (A) pk7ILeNIK-(RNAi) amplificado com oligonucleotídeos

específicos para a proteína (LeNIKRvs e 486LeNIK-Fwd), produzindo um

fragmento de aproximadamente 375pb. (B) pk7ILeNIK-(RNAi) amplificado com

oligonucleotídeos específicos para o vetor pK7GW1WG2 e para a proteína

(MC36 e LeNIKRvs respectivamente) produzindo um fragmento de

aproximadamente 512pb. Em vermelho, destacadas, as colônias positivas.

Figura 7 - Análise dos padrões de digestão enzimática dos plasmídeos

positivos pk7ILeNIK-(RNAi), com a enzima de restrição BglI liberando um

fragmento de aproximadamente 12,0 kb e outro de aproximadamente 1,5 kb. M-

Marcador de peso molecular em kb, 1-21-transformantes obtidos. Em vermelho,

são destacadas as colônias positivas (1-6, 8-9, 11-16, e 18-21).

M M

375pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

400pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 19 20 21

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

0kb

2 Transformação de agrobactéria LBA4404

2.1 Obtenção do clone pk7AtNIK1-1- LBA4404

A estirpe de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 foi transformada com o

clone pk7AtNIK1-1 (gene NIK1 clonado no vetor pK7WG2). A confirmação das

colônias positivas foi feita via PCR, sendo utilizados dois conjuntos de primers:

os oligonucleotídeos MC36 e 3315 (Conjunto A) gerando um produto de cerca de

2,1 kb e os oligonucleotídeos MC36 e 3774 (Conjunto B) gerando um produto de

cerca de 1,2 kb. Os resultados obtidos foram avaliados em gel de agarose 1%

(p/v) e corado com brometo de etídeo 0,1 µg.mL

-1

(Figura 8).

Figura 8-Reação de PCR diagnóstico de agrobactéria transformada. (A)

pk7AtNIK1-1-LBA4404 amplificado com oligonucleotídeos específicos para o vetor e para

a proteína, MC36 e 3315, respectivamente. (B) pk7AtNIK1-1-LBA4404 amplificado com

oligonucleotídeos específicos para o vetor e para a proteína, MC36 e 3774,

respectivamente.

2.2 Obtenção do clone pk7ILeNIK-(RNAi- LBA4404)

À semelhança, foi obtido, o clone pk7ILeNIK-(RNAi-LBA4404), sendo

também utilizado para transformação de tomateiro em cultura de tecidos. Como

os resultados não foram bem sucedidos (não obtenção de tomateiros

transformados), optamos por não apresentá-los.

A B

2,1 kb

1,2 Kb

3 Obtenção e análise das plantas transgênicas:

Plantas de tomateiro foram transformadas com sucesso, via

Agrobacterium tumefaciens (estirpe LBA4404), com o clone pk7AtNIK1-1. Os

transformantes foram confirmados por PCR com oligonucleotídeos específicos

para NIK1 e o vetor pK7WG2, amplificando um fragmento de aproximadamente

2,1 kb (Figura 9). Foram obtidos seis transformantes, dos quais dois (NIK1-4 e

NIK1-6) foram selecionados para as análises posteriores.

Figura 9 - Diagnóstico de tomateiros transformados com o gene

quimérico AtNIK1(Arabdopsis thaliana NSP-Interacting Kinase). DNA total de

plantas transformadas foi amplificado com primers específicos para o vetor

pK7WG2 e para a sequência de AtNIK1(MC36 e 3315) amplificando um

fragmento de aproximadamente 2,1 kb. M (marcador de peso molecular em kb).

C+ (controle positivo da reação), C- (controle negativo da reação), WT (planta

não-transformada), 1-7 (regenerantes, designados NIK1-1-7, testados para a

incorporação do gene). Em vermelho, destacados os regenerantes

transformantes (designados NIK1-4 e NIK1-6), utilizados nos experimentos

posteriores.

A expressão do transgene foi confirmada por RT-PCR semi-quantitativo

(Figura 10). Os resultados indicaram nível similar de expressão entre os

regenerantes transformantes (NIK1-4 e NIK1-6) e bastante superior destes

quando analisados comparativamente às plantas não transformadas (WT),

confirmando assim, a superexpressão do gene NIK1 nos regenerantes

transformantes.

Figura 10 – Ativação da expressão do gene AtNIK1 em plantas de

tomate. O acúmulo de transcrito foi analisado por RT-PCR com

oligonucleotídeos específicos para a proteína NIK1 (oligonucleotídeos 3314 e

3315), amplificando um fragmento de aproximadamente 700 pb. M (marcador de

peso molecular em kb), C+ (controle positivo da reação), C- (controle negativo

da reação), WT (planta não-transformada), 4 e 6 (regenerantes NIK1-4 e NIK1-

6), testados para a expressão da proteína.

A expressão de NIK endógeno de tomate (LeNIK) foi também avaliada

por meio de RT-PCR, com oligonucleotídeos específicos para LeNIK (Figura

11). Os resultados demonstraram que o acúmulo de AtNIK nas linhagens

transformadas NIK1-4 e NIK1-6 não interferiu na expressão de LeNIK endógeno

que se manteve no nível similar àquele observado na planta não-transformada

(WT).

Figura 11 - Expressão de NIK endógeno de tomate em linhagens

transgênicas avaliada por RT-PCR. M (marcador de peso molecular, em kb), C+

(controle positivo da reação), C- (controle negativo da reação), WT (planta não-

transformada), 4 e 6 regenerantes NIK1-4 e NIK1-6, respectivamente.

As plantas confirmadas foram repicadas para os ensaios de

desenvolvimento e de infectividade dos transformantes primários.

4 Superexpressão da proteína NIK retarda o crescimento das plantas

Foram observadas diferenças fenotípicas evidentes entre as plantas

transgênicas superexpressando NIK e as plantas não-transformadas, durante as

fases iniciais de desenvolvimento, quando mantidas em câmera de crescimento

por um período de dez dias. Analisando a diferença de altura atingida pelas

plantas durante o período, verifica-se um atraso no desenvolvimento das plantas

transgênicas que apresentaram menor estatura e taxa de crescimento inferior

com um acréscimo de altura, ao longo de 10 dias de desenvolvimento,

significativamente menor do que aquele das plantas não transformadas. Após

dez dias de desenvolvimento in vitro, os transformantes alcançaram cerca de

metade de acréscimo em altura em relação às plantas não-transformadas,

apesar da semelhante altura inicial das plantas (Figura 12).

As plantas foram observadas também quanto às características físicas

durante o período de análise tanto em câmera de crescimento (Figura 13A),

quanto em casa-de-vegetação (Figura 13B e 13C). Foram observadas notáveis

diferenças no desenvolvimento, tanto em relação á altura da parte aérea quanto

ao sistema radicular e desenvolvimento foliar. As plantas transgênicas NIK1-4 e

NIK1-6 demonstraram menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de

sistema radicular e aéreo, possuindo assim, menor estatura. Além disso,

perceberam-se diferenças anatômicas e morfológicas entre os ramos (Figura

13C). As folhas das plantas transgênicas apresentaram-se

enrugadas/encarquilhadas, diferentemente da anatomia regular apresentada

pelas plantas não-transformadas. Estas características reforçam a hipótese de

que as plantas transgênicas superexpressando NIK possuem certo nível de

inibição da via de síntese de brassinosteróides, por apresentarem fenótipo

semelhante aos mutantes Br-insensitivos em tomate (Koka et al., 2000). Outros

mutantes em tomateiros, também apresentam características fenotípicas

semelhantes, como os Curl 3 (mutante insensitivo aos BRs, não se

desenvolvendo bem em meio com ou sem brassinólide) e o Abs 1 (mutante que

possui alterada a sensibilidade ao brassinólide, possuindo um fenótipo menos

drástico que o mutante Curl 3). Tal fenótipo deve-se a provável inibição em

algum ponto da via de biossíntese ou sinalização de brassinosteróides (Nomura

and Montoya, 2002).

O retardamento no desenvolvimento observado nas plantas transgênicas

pode se dever à influência da superexpressão de NIK na síntese de

determinados hormônios ou ativadores do crescimento ou em vias de sinalização

envolvidos em crescimento e desenvolvimento, como no caso da via de

brassinosteróides (Yokota and Fujioka, 2003). Entretanto, os efeitos da

superexpressâo de NIK na expressão dos componentes dessa via não foram

avaliados e, portanto, a possível comunicação entre estas duas vias de

sinalização permanece para ser determinada.

Recentemente, foi demonstrado que ativação do receptor AtNIK1 leva à

fosforilação da proteína ribossomal L10, resultando na sua translocação do

citoplasma para o núcleo (Rocha, 2007). O gene rpL10 (At1g14320) é altamente

homólogo ao gene QM inicialmente identificado como um candidato a supressor

de tumor de Wilms (Dowdy et al., 1991) e tem sido demonstrado que regula o

protooncogene c-Yes (Oh et al., 2002). O homólogo de QM de galinha,

designado Jif-1 (Jun interactor factor-1), foi identificado pela sua capacidade de

interagir com o transativador Jun e inibir a formação do homodímero Jun-Jun,

prevenindo interação com o DNA (Monteclaro and Vogt, 1993). Como uma

proteína ribossomal, QM/Jif-1 é localizada no citoplasma, mas, assim como

rpL10 de Arabidopsis, transloca para o núcleo para influenciar transcrição de

genes mediada por cJun, além de afetar apoptose (Imafuku et al., 1999). Os

genes de leveduras homólogos de QM, como GRC5 e QSR1, participam no

controle traducional da expressão gênica (Karl et al., 1999), e um homólogo de

QM de Entamoeba histolytica exibe funções extraribossomais associadas com

supressão da proliferação celular (Chavez-Rios et al., 2003). Estas funções

hipotéticas de rpL10 (controle traducional e supressão da proliferação celular)

podem justificar o efeito de ativação da via mediada por NIK tanto em

desenvolvimento, observada neste trabalho, quanto em estratégias de defesa

contra vírus (Fontes et al., 2004). A identificação de genes alvos de rpL10 será

crucial para decifrar o mecanismo pelo qual esta via de sinalização antiviral

interefere como eventos de desenvolvimento e proliferação celular.

Figura 12 – Diferenças de desenvolvimento entre as plantas transgênicas

superexpressando NIK (plantas 35S-AtNIK1-4 e 35S-AtNIK1-6) e as plantas não-

transformadas (WT). Avaliação tendo como parâmetro a altura do caule das

mesmas, após 10 dias de crescimento, in vitro. Os valores correspondem às

médias das alturas, com os respectivos desvios padrão. Médias seguidas da

mesma letra não diferem entre si, a 5 % de probabilidade pelo teste de Duncan.

Figura 13-Diferenças de desenvolvimento entre as plantas transgênicas

superexpressando NIK (plantas 35S-AtNIK1-4 e 35S-AtNIK1-6) e as plantas não-

transformadas (WT). A) Avaliação em Laboratório de Cultura de Tecidos. B)

Avaliação em casa-de-vegetação. Retardo no crescimento das plantas

transgênicas que não conseguiram se desenvolver normalmente, obtendo menor

comprimento caulinar, menor desenvolvimento de sistema radicular e aéreo em

relação às plantas não-transformadas. C) Avaliação em casa-de-vegetação. Em

detalhe, as diferenças anatômicas entre os ramos. As folhas das plantas

transgênicas apresentaram-se enrugadas/encarquilhadas, contrastando com a

anatomia regular apresentada pelas plantas não-transformadas. UN refere-se às

plantas inoculadas somente com tungstênio.

5 Superexpressão de AtNIK não altera a taxa de infecção por ToYSV-

[MG-Bi2], mas interfere no desenvolvimento de sintomas

Visando avaliar a suscetibilidade das linhagens transformadas 35S-

AtNIK-4 e 35S-AtNIK-6 à infecção por geminívirus, as plantas não transformadas

e plantas transgênicas foram inoculadas por biobalística com 1 e ½ cópia do

DNA-A e DNA-B do isolado ToYSV-[MG-Bi2] (Calegario et al., 2006). Por meio

da análise dos sintomas das plantas e do acúmulo do DNA viral, foi avaliada a

porcentagem de plantas infectadas ao longo do tempo (Figura 14). Plantas

inoculadas somente com tungstênio foram usadas como controle negativo. Tanto

plantas não transformadas (WT) quanto plantas transgênicas NIK1-4

desenvolveram os sintomas típicos de infecção por ToYSV-[MG-Bi2], porém com

intensidade distinta. Foram observadas manchas amarelas características da

infecção, clorose e enrugamento de folhas. Plantas transgênicas NIK1-4

apresentaram menor severidade de sintomas (Figura 15). O acúmulo do DNA

viral foi detectado em plantas sintomáticas por PCR (Figura 16). Os resultados

obtidos são consistentes com observações anteriores realizadas em Arabidopsis

thaliana em que a inativação do gene NIK aumentou a suscetibilidade dos

mutantes diante da infecção viral (Fontes et al., 2004). Entretanto, a taxa de

infecção monitorada pelo acúmulo de DNA viral e o tempo de desenvolvimento

de sintomas foi similar nas plantas não transformadas e transgênicas.

Figura 14- A superexpressão de AtNIK não altera a taxa de infecção

viral. O processo de infecção é relativamente similar em plantas selvagens WT e

plantas transgênicas NIK1-4. A) Percentagem de plantas sistematicamente

infectadas em diferentes dias pós-inoculação (DPI). B) Taxa de infecção em

plantas selvagens WT e plantas transgênicas NIK1-4. A taxa de infecção foi

expressa como número de DPI requerido para que 50% das plantas estivessem

infectadas (DPI 50).

Figura 15 – Plantas transformadas NIK1-4 exibem um aumento na

tolerância à infecção por geminivírus. A) e D) (Ramos, em detalhe) Sintomas

associados com a infecção por ToYSV-[MG-Bi2] em plantas selvagens. B) e E)

(Ramos, em detalhe) Sintomas associados com a infecção por ToYSV-[MG-Bi2]

em plantas transformadas 35S-AtNIK. C) e F) (Ramos, em detalhe) Sintomas

associados com a infecção por ToYSV-[MG-Bi2] em plantas transformadas 35S-

AtNIK (à direita) e plantas selvagens (à esquerda). O DNA-A e DNA-B virais

foram introduzidos nas plantas por inoculação via biobalística. IN refere-se às

plantas inoculadas com DNA viral e UN refere-se às plantas inoculadas somente

com tungstênio.

Figura 16-PCR confirmando o acúmulo de DNA viral nas plantas

bombardeadas com o vírus ToYSV-[MG-Bi2]. M (marcador de peso molecular,

em kb), C+ (DNA inoculado, usado como controle positivo da reação), C-

(plantas inoculadas somente com tungstênio, utilizadas como controle negativo

da reação), WT (plantas não-transformadas), 35S-AtNIK (plantas

transformadas). IN refere-se às plantas inoculadas com DNA viral.

CONCLUSÕES

Os resultados dessa investigação forneceram evidências de que o

receptor transmembrana NIK atua em vias de crescimento e desenvolvimento de

plantas, provavelmente por meio de interação com vias de biossíntese ou

sinalização de determinados hormônios vegetais, como os brassinosteróides.

Análises fenotípicas do desenvolvimento dos transformantes primários

demonstraram que a superexpressão da proteína promoveu retardo do

crescimento e visíveis diferenças anatômicas e morfológicas nos transformantes

(baixa estatura, menor comprimento caulinar, menor desenvolvimento de

sistema radicular e aéreo, folhas enrugadas/encarquilhadas). Nos experimentos

de infectividade viral, os resultados obtidos confirmaram o papel essencial da

proteína de potencial protetora contra a infecção viral. A superexpressão da

proteína não alterou a taxa de infecção por ToYSV-[MG-Bi2], mas interferiu

significativamente no desenvolvimento de sintomas, os quais foram bem menos

severos nas plantas transgênicas. Coletivamente, os resultados dessa

investigação reforçam o papel fundamental de NIK tanto no desenvolvimento,

como na proteção contra patógeno. Estudos posteriores deverão ser conduzidos

para avaliar os possíveis efeitos da superexpressão e/ou da repressão de NIK na

via de sinalização de brassinosteróides e as bases moleculares de integração

entre as duas vias de sinalização.

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