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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MESTRADO EM BIOQUÍMICA
PABLO DE CASTRO SANTOS
ATIVIDADE β
-D-
N-ACETILGLUCOSAMINIDÁSICA DE
ENZIMAS IMOBILIZADAS EXTRAÍDAS DA Artemia
franciscana E POSSÍVEIS APLICAÇÕES
BIOTECNOLÓGICAS
NATAL
2008
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2
PABLO DE CASTRO SANTOS
ATIVIDADE β
-D-
N-ACETILGLUCOSAMINIDÁSICA DE
ENZIMAS IMOBILIZADAS EXTRAÍDAS DA Artemia
franciscana E POSSÍVEIS APLICAÇÕES
BIOTECNOLÓGICAS
Dissertação apresentada ao
Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande
do Norte como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Bioquímica
Orientador: Prof Dr. Hugo Alexandre
de Oliveira Rocha
Natal
2008
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PABLO DE CASTRO SANTOS
ATIVIDADE β-
D
-N-ACETILGLUCOSAMINIDÁSICA DE ENZIMAS
IMOBILIZADAS EXTRAÍDAS DA Artemia franciscana E POSSÍVEIS
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em: 24/10/2008
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
Departamento de Bioquímica – UFRN
Orientador
____________________________________________
Prof Dr. Wogelsanger Oliveira Pereira
Departamento de Ciências Biomédicas - UERN
____________________________________________
Prof Dr. Carlos Eduardo Bezerra de Moura
Departamento de Morfologia – UFRN
4
A Deus, por sua magna capacidade de
permitir o acontecimento da vida, desde
um simples agrupamento de moléculas
até a capacidade de pensar, por isso
enfatizo minha eterna gratidão.
5
A minha família em especial a minha
mãe que sempre foi meu berço e meu
degrau. Ao meu Avô que mesmo tendo
ido a casa do pai, sinto sua presença
constante ao meu lado, nestes me
espelho e tomo como exemplo suas
melhores atitudes. A minha Namorada
Ana Karinne pelo apoio e
companheirismo.
6
Ao meu orientador Hugo, pela amizade,
orientação, compreensão, apoio e
oportunidade de concluir esse trabalho.
A Luciana da Matta, pela amizade,
orientação, força e empenho. A Luiz Diz
pelo apoio. Meus sinceros
agradecimentos!!!
7
AGRADECIMENTOS
Aos professores do Departamento de Bioquímica da UFRN, pela atenção,
respeito e contribuição prestada à minha formação.
Aos funcionários do Departamento: Eliene, Itamar, Jonas, Kildare, e
Demais pelo acolhimento, carinho e grande contribuição para realização deste
trabalho.
A Professora Teresa e Olivia da Microbiologia pela ajuda e apoio em
alguns experimentos.
Aos mestrandos e demais alunos de iniciação científica do Departamento,
pela ajuda, respeito e atenção.
Ao Departamento de Química que nos ajudaram com os infra-vermelhos.
Ao Núcleo de Petróleo e Gás da UFRN, em especial a Artjose que nos
ajudou com a microscopia eletrônica.
Aos meus amigos do laboratório Robério Medeiros, Ádila Lorena, Edílson
Gomes, Lúcia Andrade, Roberta, a estes eu agradeço pelo respeito, sinceridade
e pela oportunidade de me considerar amigo.
A Todos do Biopol que sempre me ajudaram e apoiaram.
Aos meus amigos Diego, Flavio, Marcio, Rui, Zé Eduardo, Leandro, e
amigas: Juliana, Lucy, Bianca, Priscila, pela ótima convivência e pelos
constantes incentivos.
Aos meus colegas de Turma (Adriana, Ana Celly, Cleysyvan, Danielle,
Lissandra, Ludovico, Rodrigo, Sergio, Videanny e Virginia) pelo apoio nos
momentos mais difíceis.
A todos que contribuíram de alguma forma na realização deste trabalho
8
“Cada segundo é tempo para mudar tudo para sempre”.
Charles Chaplin
9
RESUMO
A β
-D
-N-acetilglucosaminidase, extraída e parcialmente isolada do
crustáceo Artemia franciscana através de precipitação com sulfato de amônio e
cromatografia em gel filtração Bio Gel A 1.5m foi imobilizada em Dacron
ferromagnético rendendo um derivado insolúvel ativo contendo 5,0 unid/mg de
proteína e retendo 10,35% da atividade da enzima solúvel. A β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético foi facilmente removida do meio
reacional com o auxílio de um campo magnético e pôde ser reutilizada por dez
vezes seguidas sem perda de atividade. O Dacron ferromagnético foi melhor
ativado a pH 5,0 As partículas visualizadas no microscópio eletrônico de
varredura (MEV) apresentaram diferentes tamanhos, variando entre 721nm e
100µm. O infra vermelho confirmou a imobilização ao suporte, quando exibiu os
picos de aminas primárias a 1640 e 1560 cm
-1
. A enzima imobilizada apresentou
K
m
aparente de 2,32 ± 0,48 mM e atividade ótima a temperatura de 50°C. Ambos
apresentaram praticamente a mesma estabilidade térmica da enzima solúvel e
maior atividade enzimática no pH 5,5. A β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético apresentou-se sensível a alguns íons como a prata (AgNO
3
),
demonstrando perda de atividade. A atividade β
-D
-N-acetilglucosaminidasica
para cloreto de mercúrio (HgCl
2
), que é uma das substâncias mais tóxicas
encontradas na natureza, apresentou-se diminuída já a 0,01mM e perdeu a
atividade total a 4mM, indicando sensibilidade a esse tipo de metal. A enzima
ainda demonstrou capacidade degradativa sobre o heparan sulfato, sugerindo
uma possível aplicação para produzir fragmentos desse glicosaminoglicano.
Palavras chave: β
-D
-N-acetilglucosaminidase; Imobilização; Enzima; Artemia
franciscana; Biotecnologia.
10
ABSTRACT
A β-D-N-acetilglucosaminidase extracted and partially isolated from
crustacean Artemia franciscana by ammonium sulfate precipitation and filtration
gel chromatography Bio Gel A 1.5m. the enzyme was immobilized on
ferromagnetic Dacron yielding a insoluble active derivative with 5.0 units/mg
protein and 10.35% of the soluble enzyme activity. β-D-N-acetilglucosaminidase-
ferromagnetic Dacron was easily removed from the reaction mixture by a
magnetic field, it was reused for ten times without loss in its activity. The
ferromagnetic Dacron was better activated at pH 5.0. The particles visualized at
scanning electron microscope (SEM) had presented different sizes, varying
between 721nm and 100µm. Infra red confirmed immobilization on support, as
showed by primary amino peaks at 1640 and 1560 cm
-1
. The immobilize enzyme
presented K
m
of 2.32 ± 0.48 mM and optimum temperature of 50°C. Bought
presented the same thermal stable of the soluble enzyme and larger enzymatic
activity at pH 5.5. β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético showed
sensible for some íons as the silver (AgNO3), with loss of activity. The β-D-N
acetilglucosaminidase activity for mercury chloride (HgCl2), whom is one of the
most toxic substance joined in nature, it was presented activity already
diminished at 0,01mM and lost total activity at 4mM, indicating sensitivity for this
type of metal. β-D-N-acetilglucosaminidase-ferromagnetic Dacron showed
degradative capacity on heparan sulfate, the enzyme still demonstrated
degradative capacity on heparan sulphate, suggesting a possible application to
produce fractions of this glycosaminoglycan.
Key Words: β-D-N-acetylglucosaminidase; Immobilization; Enzyme; Artemia
franciscana; Biotechnology.
11
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01:
Ação da β
-N-
acetilglucosaminidase sobre o p-nitrofenil
-N-
acetil-β-D-
glucosaminideo..............................................................................................................................22
FIGURA 02:
Ilustração de Métodos de imobilização................................................................ 24
FIGURA 03:
Estrutura do polietilenotereftalato........................................................................ 27
FIGURA 04:
Artemia franciscana............................................................................................. 34
FIGURA 05:
Atividades enzimáticas presentes em frações de Artemia franciscana
(Fracionamento com sulfato de amônio)...................................................................................... 46
FIGURA 06:
Perfil de eluição da β
-N-
acetilglucosaminidase em cromatografia de gel filtração
Bio Gel A 1.5m .............................................................................................................................47
FIGURA 07:
Perfil de eluição de glicosidases em cromatografia de gel filtração Bio Gel A
1.5m...............................................................................................................................................48
FIGURA 08:
Perfil das atividades enzimáticas da fração da cromatografia em gel filtração Bio
Gel A 1.5m ...................................................................................................................................49
FIGURA 09
: Atividade enzimática em diferentes pH de ativação do Dacron
ferromagnético...............................................................................................................................50
FIGURA 10:
Imagem a partir do microscópio eletrônico de varredura
(MEV)............................................................................................................................................52
FIGURA 11:
Espectro infravermelho das nano e micro particulas magnéticas com e sem a β-
D-N-acetilglucosaminidase imobilizada ........................................................................................53
FIGURA 12:
Determinação do K
m
da β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético
.......................................................................................................................................................54
12
FIGURA 13:
Efeito da temperatura sobre a atividade da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético ..............................................................................................................................55
FIGURA 14
: Estabilidade térmica da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético....56
FIGURA 15:
Efeito do pH sobre a atividade da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético...............................................................................................................................57
FIGURA 16:
Influência do tempo sobre a atividade β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético ..............................................................................................................................58
FIGURA 17:
Influência dos sais sobre a atividade β-
D
-N-acetilglucosaminidaseica ................59
FIGURA 18:
Influência do mercúrio sobre a atividade β-
D
-N-acetilglucosaminidasica ............60
FIGURA 19:
Reutilização da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético.................60
FIGURA 20:
Ação da β-D-N-acetilglucosaminidase solúvel e imobilizada sobre os substratos
naturais condroitim sulfato(CS), dermatam sulfato(DS) e heparam sulfato(HS). .........................61
13
LISTA DE TABELAS
Tabela I : Classificação das Enzimas..................................................................20
Tabela II: Características estruturais dos principais glicosaminoglicanos...........29
14
LISTA DE ABREVIATURAS
° C Grau Celsius
µg microgramas
µl microlitro
µm micrômetro
µM micromolar
AH Äcido hialurônico
BSA Albumina sérica bovina
C4S Condroitim-4-sulfato
C6S Condroitim-6-sulfato
cm Centímetro
DS Dermatan Sulfato
g grama
g/L Grama por litro
GAGS Glicosaminoglicanos Sulfatados
Hep Heparina
Hg Mercúrio
kDa Quilodaltons
Kg kilograma
K
m
Constante de Mikaelis-Menten
KS Queratan Sulfato
M molar
MEV Microscópio eletrônico de varredura
15
Mg miligrama
Min minuto
mL mililitro
mM milimolar
nm nanômetro
PDA Diaminopropano-acetato
PET Polietilinotereftalato
pH Potencial hidrogeniônico
V
max
Velocidade máxima
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 20
1.1 ENZIMAS E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS .............................................. 20
1.2 GLICOSIDASES....................................................................................................
21
1.2.1 Endo-β-N-acetilglucosaminidase...................,................................................
21
1.2.2 Exo-β-N-acetilglucosaminidase...................................................................... 21
1.3 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA.............................................................................. 22
1.3.1 Adsorção ..........................................................................................................
24
1.3.2 Ligação covalente............................................................................................ 25
1.3.3 Aprisionamento................................................................................................ 25
1.3.4 Encapsulação .................................................................................................. 26
1.4 SUPORTES UTILIZADOS PARA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS........................ 26
1.4.1 Dacron (polietilenotereftalato)........................................................................ 26
1.4.2 Glutaraldeído.................................................................................................... 27
1.5 GLICOSAMINOGLICANOS.................................................................................. 28
1.6 O MERCÚRIO ...................................................................................................... 30
1.7Artemia franciscana................................................................................................
31
1.8.OBJETIVOS GERAIS............................................................................................
33
1.8.1 Objetivos específicos......................................................................................
33
2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................
34
2.1. MATERIAL BIOLÓGICO...................................................................................... 34
2.1.2. Substrato sintético..........................................................................................
35
2.1.3 Glicosaminoglicanos....................................................................................... 35
2.1.4 Outros compostos........................................................................................... 35
2.1.5 Equipamentos...................................................................................................
36
2.2 MÉTODOS............................................................................................................ 37
17
2.2.1 Obtenção do extrato protéico..................................................................37
2.2.2 Fracionamento com sulfato de amônio..................................................37
2.2.3 Cromatografia em gel filtração Bio Gel A 1.5m......................................38
2.2.4 Determinação das atividades enzimáticas com p-nitrofenis derivados
de açúcar e sulfato e dosagem de proteínas..................................................38
2.2.5 Obtenção do Dacron ferromagnético e ativação com glutaraldeído ..39
2.2.6 Processo de imobilização enzimática ....................................................40
2.2.7 Análise do complexo PET e enzima imobilizada em Microscópio
Eletrônico de Varredura (MEV).........................................................................40
2.2.8 Espectroscopia de infravermelho...........................................................41
2.2.9 Determinação do K
m
da enzima imobilizada..........................................41
2.2.10 Influência da temperatura sobre a atividade β
ββ
β-D-N-
acetilglucosaminidásica....................................................................................41
2.2.11 Influência do pH sobre a atividade β
ββ
β-D-N-acetilglucosaminidásica.42
2.2.12 Influência do tempo sobre a atividade β
ββ
β-N-
acetilglucosaminidásica....................................................................................42
2.2.13 Atividade enzimática na presença de sais inorgânicos......................43
2.2.14 Teste de reutilização enzimática...........................................................43
2.2.15 Ensaio enzimático na presença de diferentes concentrações de
Cloreto de mercúrio...........................................................................................43
2.2.16 Ensaio enzimático com polissacarídeos e eletroforese.....................44
3. RESULTADOS...............................................................................................45
3.1 OBTENÇÃO DA β-D-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE.................................45
3.2 ISOLAMENTO PARCIAL DA β-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE................45
3.2.1 Determinação das atividades enzimáticas das frações provenientes
do fracionamento com sulfato de amônio:......................................................45
18
3.2.2. Cromatografia em gel filtração Bio Gel A 1.5m.....................................46
3.2.3 Atividade encontrada para imobilização enzimática.............................49
3.3 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DA IMOBILIZAÇÃO..................................50
3.3.1 Influência do pH na ativação do Dacron ferromagnético.....................50
3.3.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)...........................................51
3.3.3 Confirmação de imobilização por infravermelho...................................52
3.4 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS..................................54
3.4.1 Determinação do K
m
e V
max
da β-D-N-acetilglucosaminidase-dacron
ferromagnético...................................................................................................54
3.4.2 Efeito da temperatura sobre a atividade da β-D-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético..............................................55
.3.4.3 Estabilidade térmica ...............................................................................56
3.4.4 Efeito do pH sobre a atividade da β-D-N-acetilglucosaminidase-
Dacron ferromagnético.....................................................................................57
3.4.5 Influência do tempo sobre a atividade da β-D-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético..............................................58
3.4.6 Influência de diferentes sais sobre a atividade da β-D-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético..............................................58
3.4.7 Efeito da atividade β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético incubada em diferentes concentrações de mercúrio..........59
3.4.8 Reutilização da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético...................................................................................................60
3.5 AÇÃO DA Β-D-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE SOLÚVEL E IMOBILIZADA
SOBRE SUBSTRATOS NATURAIS....................................................................61
4. DISCUSSÃO....................................................................................................62
19
5. CONCLUSÃO..................................................................................................69
REFERÊNCIAS...................................................................................................70
ANEXOS..............................................................................................................83
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 ENZIMAS E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
O termo enzima deriva do grego zýme, (fermento) para designar os
fermentos solúveis, cuja ação independe da presença de microorganismos
(SKINNER, 1961). Nesta acepção, a palavra passou intacta para o inglês e o
francês, e com a grafia de enzima para o italiano, espanhol e português. Podem
ser proteínas ou nucleotídeo (RNAse), e podem ser classificadas em
intracelulares quando sintetizadas e utilizadas no citoplasma e extracelulares,
quando secretadas através da membrana plasmática. Estas biomoléculas são
muito importantes, pois funcionam como catalisadores das reações biológicas
complexas, participando diretamente dos processos de catabolismo e
anabolismo nos sistemas biológicos através do aumento da velocidade das
reações (CLELAND, 1963). As enzimas podem ser classificadas de acordo com
vários critérios. O mais utilizado foi estabelecido pela União Internacional de
Bioquímica (IUB), e mostra 6 classes, apresentadas na tabela I.
Tabela I – Classificação das Enzimas
Número Classificação Propriedades Bioquímicas
1. Oxidorredutases São enzimas que catalisam reações de transferência de elétrons,
ou seja: reações de oxi-redução. Encontram-se nessa classe as
desidrogenases e as Oxidases.
2. Transferases Enzimas que catalisam reações de transferência de grupamentos
funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc.
3. Hidrolases Catalisam reações de hidrólise de ligação covalente.
4. Liases Catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de
moléculas de água, amônia e gás carbônico.
5. Isomerases Catalisam reações de interconversão entre isômeros ópticos ou
geométricos
6. Ligases Catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da
ligação entre duas já existentes, quase sempre utilizando ATP.
Fonte: União internacional de Bioquímica (UIB/IUPAC)
21
1.2 GLICOSIDASES
As glicosidases são moléculas protéicas responsáveis pela hidrólise de
glicosídeos O-, N- e S- ligados (SPENCER; DAVIES, 2001) envolvidas no
catabolismo de polissacarídeos e glicoconjugados (MALEY et al., 1989). São
importantes para aplicações terapêuticas e biotecnológicas podendo ser usadas
como biocatalizadores na síntese de oligossacarídeos (BRUINS et al., 2003).
Seu estudo constitui importante contribuição para o esclarecimento das
características estruturais dos carboidratos (SPENCER; DAVIES, 2001),
As glicosidases podem ser classificadas como endoglicosidases ou
exoglicosidases. As primeiras clivam cadeias polissacarídicas liberando
dissacarídeos e oligossacarídeos, já as últimas clivam as cadeias
polissacarídicas a partir de sua porção não redutora liberando monossacarídeos
(MALEY et al., 1989).
1.2.1 Endo-β-N-acetilglucosaminidase
Estas enzimas são responsáveis pela hidrólise da ligação glicosídica
entre um resíduo de N-acetil-β
-D-
glucosamina e um monossacarídeo adjacente
dentro de uma cadeia polissacarídica. São classificadas em três grupos: as
endo-β-N-acetilglucosaminidase que degradam proteínas como a mureína, e as
que degradam quitina e os N-glicanos (KARAMANOS, 1997).
1.2.2 Exo-β-N-acetilglucosaminidase
Pertencem ao grupo de enzimas que hidrolisam componentes O-ligados,
removendo resíduos terminais não redutores de β
-D
-N-acetilglucosamina, sendo
dessa forma considerados exoglicosidases (HORSCH et al., 1997). Elas podem
ser denominadas também como β-
D
-N-acetilhexosaminidase (EC 3.2.1.52) por
apresentar atividade tanto β-
D
-N-acetilglucosaminidásica como β-
D
-N-
22
acetilgalactosaminidásica. (HORSCH et al., 1997; KRESSE; GLOSSL, 1987;
NIIMI SHEPHER; CANNON, 2001).
As exo-β-N-acetilglucosaminidases atuam sobre o p-nitrofenil-β
-D
-N-
acetil-glucosaminídeo. Os p-nitrofenis são substratos sintéticos compostos por
uma molécula de p-nitrofenol e um resíduo de radical substituinte (carboidrato,
sulfato ou fosfato). Estes quando clivados liberam como produto o p-nitrofenol e
o radical, o qual, neste caso, é a β
-D
-N-acetilglucosamina (Figura 1). Em meio
básico o p-nitrofenol transforma-se em p-nitrofenolato que absorve luz no
comprimento de onda de 405 nm. Tais substratos além de fornecerem produtos
satisfatórios, são bastante utilizados para detecção de atividades enzimáticas
em extratos protéicos, e financeiramente acessíveis(SINGH et al., 1997;
SCIGELOVA , et. al., 1999).
β-
D
-N-acetilglucosaminidase
p-nitrofenol
p-nitrofenil-β
-D
-N-acetilglucosaminideo+ H
2
O
β-
D
-N-acetilglucosamina
Figura 1: Ação da β-N-acetilglucosaminidase sobre o p-nitrofenil-β-D-N-acetil-glucosaminideo.
1.3 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA
Devido a sua ação como catalisador, as enzimas possuem também
importância em vários setores produtivos, dentre os quais destacam-se a
indústria alimentícia, farmacêutica, cosmética, de limpeza e de química
(DEVAUX-BASSÉGUY, et al.,1997), ainda no tratamento de efluentes, produção
de bioetanol e biodiesel (CHIBATA; TOSA; SATO, 1991), (CHIBATA, et
al.,1978). O mercado de utilização de enzimas como ferramentas biotecnologias
está em ampla expansão e atualmente é estimado em US$ 2,3 bilhões (VITOLO,
23
et al.,1998; ALLAN, et al, 2006). Esses valores poderiam ser muito maiores se
não fossem certas características físico-químicas das enzimas (SCHIMIDELL et
al.,2001). Pode-se destacar como uma das principais dificuldades na utilização
de enzimas a necessidade da constância de um pH, devido à variação deste em
virtude da formação de produtos e intermediários, a necessidade de temperatura
constante, pois essa influencia diretamente na velocidade das reações. Além
desses, outros fatores como a dificuldade de separação do produto final e
enzima, a inativação desta na presença de solventes orgânicos e perda de
enzima após o processo catalítico, também constituem fatores limitantes para a
aplicação de enzimas. Com o intuito de minimizar tais problemas, vários autores
propõem a imobilização de enzimas para que essas possam ser utilizadas
biotecnologicamente (ALLAN, et al, 2006; LIN et al, 2005). A técnica de
imobilização enzimática confina, ou liga, uma enzima cataliticamente ativa em
uma região definida do espaço, retendo suas atividades biológicas (KENNEDY
et al., 1988; PEREIRA, 1999). Há diversas razões para se aplicar esta técnica,
dentre as quais pode-se citar:
• Obtenção de maior estabilidade enzimática;
• A possibilidade de fácil separação da enzima do produto no meio
reacional;
• A reutilização da enzima;
• A enzima imobilizada apresenta maior especificidade, o que permite a
formação de um produto final mais elaborado;
• Promove a redução de custos para a obtenção do produto.
Dessa forma, a utilização de enzimas imobilizadas contribui para uma
otimização das reações e redução de custos em diversos setores industriais.
Ao se imobilizar uma enzima é importante a escolha de um método de
ligação que previna a perda de atividade enzimática, ou seja, que ligue a enzima
causando mínimos danos à sua estrutura. Neste processo é importante proteger
o sítio ativo da enzima durante a ligação ao suporte, esta proteção pode ser
24
obtida utilizando-se um substrato ou um inibidor competitivo da enzima
(DORDIK; BUNGAY, 1998).
Os principais métodos utilizados para imobilização de enzimas são:
adsorção, ligação covalente, aprisionamento e encapsulação (Figura 2)
(BICKERSTAFF, 1997).
Figura 2: Ilustração de Métodos de imobilização.
1.3.1 Adsorção
É considerado um método simples de imobilização, baseado na adsorção
física da enzima sobre a superfície de suportes insolúveis em água. Causa
pouca ou nenhuma mudança conformacional no sitio ativo da enzima,
(FUENTES et al., 2001). A maior vantagem da adsorção é que nenhum reagente
é necessário e poucos passos são requeridos para o processo de imobilização
em si. Este método é menos agressivo para a proteína que os químicos, pois as
principais forças que mantém a enzima imobilizada são as pontes de hidrogênio,
LIGAÇÃO COVALENTE
ADSORÇÃO
APRISIONAMENTO
ENCAPSULAÇÃO
25
ligações iônicas e de van der Waals, o que se assemelha com situações que
ocorrem naturalmente no ambiente celular (DORDIK ; BUNGAY, 1998). As
desvantagens estariam relacionadas à relativa facilidade de desadsorção da
enzima do suporte durante seu uso devido às fracas interações entre eles, assim
como a possibilidade de adsorção não específica de outras proteínas ou
substâncias juntamente com a enzima (WOODWARD, 1985).
1.3.2 Ligação covalente
Técnica bastante estudada no processo de imobilização enzimática e
envolve a formação de ligações covalentes entre a enzima e o suporte. Na
escolha deste método deve-se ter cuidado com a reação envolvida na formação
da ligação para tentar minimizar a perda de atividade enzimática, dessa forma o
sítio ativo da enzima não pode ser afetado pelos reagentes utilizados no
processo de imobilização (DORDIK; BUNGAY, 1998), os grupos funcionais dos
aminoácidos que podem ser utilizados nas ligações covalentes são: amino,
hidroxila, tiol, carboxila, imidazol, sulfidrila, fenólico e indol.
A ligação covalente pode alterar a estrutura conformacional e o centro
ativo da enzima, resultando em maior perda da atividade. Contudo, a força da
ligação entre a enzima e o suporte é suficientemente forte para impedir a
desadsorção da enzima tanto na presença do substrato, quanto em soluções de
alta força iônica (DORDIK; BUNGAY, 1998).
1.3.3 Aprisionamento
É um método de confinamento de enzimas dentro de matrizes
poliméricas, onde a enzima é adicionada numa solução contendo monômeros,
que após a polimerização as aprisiona. Géis de poliacrilamida são comumente
utilizados para tais técnicas (VILLENEUVE et al., 2000).
Geralmente as enzimas que possuem pequenos substratos são mais
utilizadas para a técnica de aprisionamento, pois substratos maiores são
26
incapazes de atravessar os poros e chegar ao sítio ativo da enzima aprisionada
(VILLENEUVE et al., 2000).
1.3.4 Encapsulação
Essa técnica hoje em dia é bastante aplicada na produção de fármacos, é
semelhante ao aprisionamento, porém, neste caso a enzima e o ambiente são
imobilizados, criando assim células artificiais delimitadas por membranas.
Moléculas grandes como as enzimas não são capazes de se difundir através da
membrana enquanto que, pequenas moléculas como substratos e produtos
podem atravessá-la (VILLENEUVE et al., 2000).
1.4 SUPORTES UTILIZADOS PARA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
Diversos polímeros têm sido utilizados como suportes para imobilização
de proteínas, tais como: Dacron (MATTA, 2004; CARVALHO JR et al., 1987),
discos de álcool polivinílico-glutaraldeído (ARAÚJO et al., 1996), pérolas de
polisiloxano-álcool polivinílico (COELHO et al., 2003), poliacrilamida (BARBOSA
et al., 1995; CARVALHO JR et al., 1987), resinas, géis (CHEN JP et al., 2003),
fibras, nylon, látex (CHEN JP et al., 2001), polietileno (SHYH-YS et al., 2006),
poly(acrylonitrile-co-2-hydroxyethyl methacrylate) (XIAO-JUN HUANG et al.,
2008) dentre outros. Aliado ao uso dos polímeros como suporte, está se
tornando mais comum à magnetização e, conseqüentemente, a utilização de
suportes magnetizados para a imobilização de proteínas (CARNEIRO-LEÃO et
al., 1991; PINHEIRO et al., 1999; KONERACKÁ et al.; 1999; KATO et al.; 1998 ;
GÜLAY BAYRAMOĞLU., 2008).
1.4.1 Dacron (polietilenotereftalato - PET)
O Dacron é um poliéster, componente de fibras de resinas e utilizado na
manufatura de garrafas de refrigerante. É sintetizado a partir do etilenoglicol e do
27
ácido tereftálico (PAIVA, 1999). Caracteriza-se por apresentar a seguinte
estrutura (Figura 3):
Figura 3: Estrutura do polietilenotereftalato, onde n pode assumir valores em torno de 15.000
(CARNEIRO-LEÃO et al., 1991).
MELO (1984) propôs um mecanismo para imobilizar proteínas em Dacron
(Polietilenotereftalato-PET) em três etapas: a primeira consiste na hidrazinólise
parcial dos filmes de Dacron com conseqüente transformação deste em pó; na
etapa seguinte utiliza-se nitrito de sódio a fim de converter os grupos hidrazida a
azida; o terceiro passo consiste na imobilização covalente da enzima ao suporte.
CARNEIRO-LEÃO(1991) propôs a imobilização de amiloglicosidase em
Dacron em pó magnetizado por este apresentar maior facilidade operacional.
MATTA (2004) imobilizou uma sulfatase, extraída de molusco, utilizando o
Dacron em pó magnetizado e substituindo o segundo passo proposto por MELO
(1984) pela ligação do glutaraldeído ao Dacron-hidrazida e posterior
imobilização da enzima.
1.4.2 Glutaraldeído
A ativação do suporte por glutaraldeído é uma das técnicas mais
utilizadas para imobilização de enzimas em diferentes suportes, porém a exata
estrutura do glutaraldeído no suporte ainda está em discussão. Monsan (1978)
mostrou que uma ou duas moléculas de glutaraldeído se ligam as aminas
primárias de forma estável, tornando dessa forma possível a ligação a proteína.
n
CCO
O
O
C H
2
C H
2
O H
O
C H
2
C H
2
28
1.5 GLICOSAMINOGLICANOS
Os Glicosaminoglicanos (GAGs) são macromoléculas
(heteropolissacarídeos não ramificados) formadas por unidades dissacarídicas
repetidas onde um resíduo é de hexosamina (glucosamina ou galactosamina) e
outro de ácido urônico (glucurônicos ou idurônicos) ou ainda galactose
(BRIMACOMBE ; WEBER, 1964). Podem apresentar grupamentos sulfato que
juntamente com os grupamentos carboxilas presentes nos ácidos urônicos,
conferem alta densidade de cargas negativas a esses compostos. Os principais
tipos de glicosaminoglicanos são: ácido hialurônico (AH), condroitim 4-sulfato
(C4S), condroitim 6-sulfato (C6S), dermatam sulfato(DS), heparam sulfato(HS),
heparina (Hep) e queratam sulfato (KS). A tabela II da lista descreve as
principais características estruturais destes compostos.
Nos tecidos animais, todos os glicosaminoglicanos, com exceção do ácido
hialurônico, ocorrem covalentemente ligados às proteínas, formando os
proteoglicanos (PG), os quais apresentam alto peso molecular (LOHMANDER et
al., 1980; NILSSON et al., 1982; GOWDA et al., 1986 )
29
Tabela II
Características estruturais dos principais glicosaminoglicanos
Glicosaminoglicanos
(JEANLOZ, 1960. Adaptada)
P.M.
1
(kDa) Monossacarídeos
2
Posição do
Sulfato
Ligação
Glicosídica
Ácido hialurônico (AH) 500 – 50.000 N-acetilglicosamina
Ácido glicurônico
-
-
β (1-4)
β (1-3)
Condroitim 4-sulfato (C4S) 20 - 70 N-acetilgalactosamina
Ácido glicurônico
4
-
β (1-4)
β (1-3)
Condroitim 6-sulfato (C6S) 20 - 50 N- acetilgalactosamina
Ácido glicurônico
6
-
β (1-4)
β (1-3)
Dermatam sulfato
(Xasshdsjkcs, et al.)
20 - 50 N-acetilgalactosamina
Ácido glicurônico
Ácido idurônico
4
-
-
β (1-4)
β (1-3)
α (1-3)
Heparam sulfato
(Xasshdsjkcs, et al.)
10 - 60 Glicosamina
N-acetilglicosamina
Ácido glicurônico
Ácido idurônico
2 / 6
- / 6
-
-
α (1-4)
α (1-4)
β (1-4)
α (1-4)
Heparina (Hep) 5 - 50 Glicosamina
Ácido glicurônico
Ácido idurônico
2 / 6
-
2
α (1-4)
β (1-4)
α (1-4)
Queratam sulfato (KS)
Acharan sulfato (AC)
Chondrosan
10 – 30
-
-
N-acetilglicosamina
Galactose
L-IdoA
D-GlcA
6
- / 6
2
-
β (1-3)
β (1-4)
α (1-4)
β (1-3)
1
o peso molecular médio varia neste intervalo de acordo com a origem dos glicosaminoglicanos
30
2
todos os açúcares estão na configuração D, exceto o ácido idurônico que apresenta
configuração L.
(-) representa ausência de éster de sulfato
Os GAGS estão presentes em todos os filos do reino animal que
apresentam organização tissular (DIETRICH et al., 1983, MEDEIROS et al.,
2000). Apresentam diversas funções tais como: resistência à infecção
(WARREN; GRANHAM, 1950), controle de água e eletrólitos (DORFMAN,
1958), cicatrização (DORFMAN, 1958), divisão e crescimento celular
(KRAEMER; TOBEY, 1972; OHNISHI et al., 1975; CHIARUGI; VANNUCHI,
1976; VANNUCHI E CHIARUGI, 1977; DIETRCH 1984; BIANCO et al., 1990;
PORCIONATTO et al., 1999), adesão celular (STALLCUP et al., 1990),
reconhecimento intercelular (LÓPEZ-CASTILHAS et al., 1991), manutenção da
transparência da córnea (KRESSE et al., 1993), auxilio no controle da divisão
celular e lubrificação das articulações (ROSTAND e ESKO, 1997;
SCHMIDTCHEN et al., 2001; NADER ; DIETRICH, 1984; ESCO, 1991).
1.6 O MERCÚRIO
O mercúrio (Hg) é um elemento químico do grupo IIb (metais de transição),
da tabela periódica. Chamado pelos antigos de ágyros khytós, “prata derretida”,
por sua semelhança, em aspecto e cor, com o metal nobre, possui um número
atômico igual a 80, solidifica-se a -38,87º C e entra em ebulição a 356,9º C. É
um metal que apresenta toxicidade elevada em baixas concentrações
(RATCLIFFE HE; SWANSON G.M; FISCHER L.J; 1996). As fontes naturais de
liberação de mercúrio são através de gases da crosta terrestre, a evaporação
dos oceanos e a queima de combustível fóssil (petróleo). As principais fontes
que contribuem para a contaminação do solo, atmosfera e água, provêem das
indústrias de equipamentos eletrônicos, cosméticos, revestimento cerâmico,
cloroalcalis, a agricultura (fungicidas), as aplicações militares, o uso
odontológico.
O mercúrio metálico interage com os diversos componentes do meio,
modificando suas propriedades físico-químicas, como por exemplo, a metilação
a compostos orgânicos, particularmente, o metilmercúrio que, pela elevada
31
estabilidade química e alta afinidade lipídica, incorporam-se à cadeia alimentar
na qual é biomagnificado nos diversos níveis tróficos (CLARKSON, et al., 1972;
GOYER et al., 1991; WHO, 1989, 1990). Um das principais rotas de
contaminação humana ao Hg é através do consumo de peixes e outros animais
aquáticos (MYERS et al, 2000). O Hg bioacumula-se e biomagnifica-se, desta
forma, os maiores teores de Hg são encontrados em animais aquáticos que
estão no topo da cadeia trófica, como por exemplo, os peixes carnívoros
(CABANA et al., 1994; MCINTYRE; BEAUCHAMP, 2007). A contaminação
aguda por mercúrio se caracteriza por efeitos neurotóxicos e manifestações
clínicas como: visão turva, déficit auditivo, distúrbios olfatórios e gustatórios,
perda de sensibilidade nas mãos, ataxia, disartria, desordens somatosensoriais
e psíquicas. Em gestantes expostas ao metal podem apresentar fetos anormais.
Historicamente, encontra-se relatos de desastres ocasionados por mercúrio
como o envenenamento pelo metilmercurio da baia de Minamata a população
Japonesa em 1953 e no Iraque em 1971 e 1972 compostos mercuro-organicos
foram utilizados como fungicida causando vários óbitos (BAKIR et al., 1973). No
Brasil, em especial na Amazônia devido a manipulação inadequada de produtos
agrícolas e metodologias incorretas utilizadas por garimpeiros, estão
aumentando descargas de mercúrio nos sistemas aquáticos, expondo
populações ribeirinhas aos efeitos do mercúrio (DOLBEC et al., 2000; DO´REA ;
BARBOSA, 2007).
1.7 Artemia franciscana
A Artemia franciscana, também conhecida como camarão de salmora, é
um micro crustáceo que encontra-se distribuído mundialmente, sendo
considerado cosmopolita e adaptada a vários ambientes (MEDEL, 1997).
Apresenta grande capacidade adaptativa à salinidade e à temperatura, podendo
habitar ambientes com variados gradientes de concentrações de cloreto de
sódio, chegando a suportar níveis de salinidades próximos a 340%
o
, condições
que outras espécies não tolerariam (WEAR; HASLETT, 1986; BARNABÉ, 1994).
32
Esta importante adaptação é possível graças a um eficiente mecanismo de
defesa fisiológica, através do controle da pressão osmótica. A Artemia sp possui
o melhor sistema de osmorregulação conhecido no reino animal para manter a
composição do líquido corporal constante (salinidade de 9g/L) em meio externo.
Nele, o sistema de osmorregulação troca água com o meio, e apresenta um
notável mecanismo de excreção de sais, mantendo, assim, hipotônica a
concentração iônica de seu sangue em relação a ambientes com altas
salinidades (LOCKWOOD, 1968). A dieta desse animal é constituída
principalmente de bactérias (Halobacterium e Halococcus), algas unicelulares
(Dunaliella salina e D. viridis), pequenos protozoários e detritos presentes no
meio aquático em que vive (AMAT, 1985).
A Artemia pode ser dióica e quando adultos apresentam dimorfismo sexual
(DREWS, 2002) Pode apresentar dois tipos de reprodução, por partenogênese
ou sexualmente. Em ambos os casos as fêmeas podem produzir os dois tipos de
ovos, com posturas de 100 a 400 ovos a cada 4 dias: por ovoviviparidade, em
que o desenvolvimento embrionário da fêmea se da dentro do útero, nascendo
na forma de nauplius (0,45mm) e por oviparidade, onde o desenvolvimento do
ovo é interrompido na fase de gástrula, sendo produzido, sendo revestido por
uma casca protetora ainda no útero e liberados sob forma de cistos latentes
(0,25mm) em diapausa (NARCISO, 2000). A produção de ovos por
ovoviviparidade dá-se em condições ambientais estáveis, enquanto que por
oviparidade acontece em condições extremas, sendo capazes de mudar de uma
para outra em resposta as flutuações do ambiente (Salinidade, Oxigênio,
temperatura, luz e pH). Os ovos ou cistos contêm um embrião robusto, que
podem permanecer desidratados por um longo período (diapausa). A Artemia
alcança a maturidade por volta do 10° ao 14° e vive mais de 6 meses (COLL.,
1983). Estes micro crustáceos adquirem seus nutrientes através da filtração da
água, podendo ingerir partículas de 5 a 50 mícron. Desde os anos 30 SEALE,
GROS e ROLLEFSEN iniciaram suas pesquisas a respeito da importância das
Artemias nas técnicas modernas de aqüicultura de peixes e crustáceos, como
principal fonte protéica, sendo também ricos em vitaminas (caroteno) e sais
33
minerais (AMAT, 1985), por isso são utilizadas em larga escala na aqüicultura,
para alimentar as diversas fases larvais e pós- larvais de peixes e crustáceos
(COSTA, 1985). Essa alta qualidade nutricional da Artemia tem provocado um
constante interesse em se obter um melhor e mais amplo conhecimento sobre a
biologia e ecologia deste crustáceo (AMAT, 1985).
1.8.OBJETIVOS GERAIS
O presente trabalho tem como objetivos gerais extrair glicosidases da
Artemia franciscana, fazer o isolamento parcial, imobilizar e estudar as melhores
condições de utilização da enzima.
1.8.1 Objetivos específicos
• Extrair glicosidases do crustáceo marinho Artemia franciscana;
• Promover o isolamento parcial das maiores atividades encontradas;
• Imobilizar o extrato de enzimas em suporte ferromagnético;
• Realizar testes cinéticos do “pool” de enzimas imobilizadas, baseados nas
maiores atividades;
• Verificar a morfologia e tamanho do suporte utilizado na imobilização
através do Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV);
• Confirmar a imobilização através de análise em Infra Vermelho;
• Verificar os parâmetros cinéticos da atividade β
-D
-N-
acetilglucosaminidasica imobilizada;
• Obter a taxa de reutilização enzimática;
• Verificar a atividade β
-D
-N-acetilglucosaminidasica imobilizada na
presença de diferentes sais e gradientes de concentração do Cloreto de
mercúrio(HgCl
2
);
• Analisar a ação da glicosidase imobilizada sobre glicosaminoglicanos.
34
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MATERIAL BIOLÓGICO
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Classe: Crustacea
Subclasse: Brachiopoda
Ordem: Anostraca
Família: Artemiidae
Gênero: Artemia
Espécie: Artemia franciscana
Figura 4: Artemia franciscana
Autor: Sabrina Müller -2005
O microcrustáceo (congelado à -20°C) foi adquirido no mercado local,
proveniente do município de Grossos-RN. A biomassa de Artemia foi mantida
35
em isopor com gelo até chegar ao Laboratório de Química e Função de
Proteínas, no Departamento de Bioquímica da UFRN, onde foi acondicionada
em freezer a -20°C até sua utilização.
2.1.2 Substrato sintético
O p-nitrofenil β-D-N-acetilglucosaminídeo foi obtido da Sigma Chemical
Company (St. Louis, MO, EUA).
2.1.3 Glicosaminoglicanos
O condroitim sulfato (C4S), extraído da cartilagem de baleia e o dermatam
sulfato (DS) extraído da pele de porco foram adquiridos da Miles Laboratories
Inc. (Elkhart, IN, EUA). O Heparam sulfato foi extraído de pulmão bovino
conforme descrito por Dietrich e Nader. A heparina foi adquirida comercialmente
da Sanofi Aventis Inc.
2.1.4 Outros compostos
Albumina sérica bovina (BSA), 1,3-diamino propano e azul de toluidina
foram adquiridos da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EUA);
Hidróxido de sódio (NaOH) foi obtido da QEEL - Química Especializada
Erich LTDA;
Acetato de bário da CIRQ - Cromato Produtos Químicos LTDA;
Acido acético (C
2
H
4
O
2
) da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A.
(Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
Acetato de sódio (NaC
2
H
3
O
2
), cloreto de sódio (NaCl), ácido clorídrico
(HCl), sulfato de amônio ((NH
4
)
2
SO
4
) e fosfato de sódio monobásico
(Na
2
HPO
4
.H
2
O) e benzina foram obtidos da VETEC Química Fina LTDA – RJ;
36
Azul de toluidina da Fisher Scientific company, USA;
Fosfato de sódio dibásico (Na
2
H
2
PO
4
) da Nuclear CAQ - Casa da
Química Indústria Brasileira (SP);
CETAVLON - brometo de cetiltrimetilamônio P.A.(CETREMIDE)
(C
19
H
42
BrN) e álcool etílico (C
2
H
6
O) foram obtidos da CIRQ - Cromato Produtos
Químicos LTDA;
Agarose e Bio Gel A 1.5m foi adquirida da Bio Rad Laboratóries
(Richmond, CA, EUA);
Dacron (polietirenotereftalato) foi adquirido da Terphane, Inc. (Cabo,
Brasil);
Membranas de diálise (limite de exclusão: 6.000-8.000 e 12.000-14.000
dáltons) da Spectrum Medical Industries, Inc. (Houston TX, EUA);
Tris hidroximetil amino metano (Cromato Produtos Químicos LTDA,
Brasil);
Glutaraldeído (C
5
H
8
O
2
) da NUCLEAR-Casa da Química, Indúdtria
Brasileira (SP);
Glicina (C
2
H
5
NO
2
) Vetec Química Fina LTDA;
Cloreto de potasio
(KCL)
, Cloreto de magnésio
(MgCl
2
)
, Cloreto de Cálcio;
(CaCl
2
)
, Cloreto de manganês
(MnCl
2
)
,Sulfato de zinco
(ZnSO4), Sulfato de cobre
(CuSO
4
)
e Nitrato de prata(
AgNO
3
) provenientes da USB corporation (USA).
2.1.5 Equipamentos
Além dos aparelhos habitualmente empregados em laboratórios pode-se
citar:
Agitador orbital (modelo 2525), banhos e estufas de temperaturas
constantes FANEM LTDA (São Paulo, SP, BR);
Centrífuga refrigerada (modelo CR21) e espectrofotômetro U 2000,
ambos HITACHI (Japão);
37
Homogeneizador de tubos de ensaio AP 22, Phoenix (USA);
Medidor de pH, Digimed (São Paulo, SP, BR);
Coletor de frações e bomba peristáltica obtidos da, Pharmacia Biotech,
RediFrac (Upsala, Suiça);
Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por
JACQUES e Col (1968);
Capela de fluxo laminar Baker (Sanford, Maine EUA);
Bomba à vacuo SPEEDIVAC-2 (Edwards, Brasil);
Liofilisador da terroni Equipamentos LTDA;
Microscópio Eletrônico de Varredura-MEV (Scanning Electron
Microscope, SEM) Modelo XL 30 - ESEM, marca Phillips;
Infravermelho Perker-Elmer do Departamento de Química da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Obtenção do extrato protéico
O extrato protéico foi obtido a partir de 1,8 Kg de Artemia franciscana
homogeneizados com o auxilio de gral e pistilo em uma proporção de 1:2 (p/v)
de tampão acetato de sódio 0,1 M; pH 5,0 a 4°C. A fração solúvel foi separada
por centrifugação a 27.000 x g a 4°C e submetida a fracionamento com sulfato
de amônio.
2.2.2 Fracionamento com sulfato de amônio
O fracionamento com sulfato de amônio foi realizado em três faixas de
concentrações: 0-30%, 30-50% e 50-80%. Após 18 horas da adição do sal em
cada etapa, a solução foi centrifugada por 30 minutos, a 27.000 x g, a 4°C. O
precipitado foi ressuspenso em tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0 e o
38
sobrenadante submetido ao próximo fracionamento. Ao término foram obtidas
três frações, denominadas F-I, F-II e F-III, respectivamente. Em seguida, estas
foram dialisadas por 18 horas com 4 trocas com tampão acetato de sódio 0,1 M;
pH 5,0. Com essas frações foram realizados ensaios para identificar as
atividades enzimáticas presentes em cada uma delas.
2.2.3 Cromatografia em gel filtração Bio Gel A 1.5m
A fração F-I (34 mL; 87,72 mg de proteína) foi precipitada utilizando-se
sulfato de amônio na faixa de 0-90%. Após 18 horas a solução foi centrifugada a
27.000 x g, a 4°C e o precipitado ressuspenso em 9 mL de tampão acetato de
sódio 0,1 M, pH 5,0, em seguida as amostras foram submetidas a diálise contra
o mesmo tampão durante 18h a 4
o
C, realizando-se 4 trocas. Foram realizadas
três cromatografias onde aplicou-se 3 mL (29,24 mg de proteína) em cada uma
delas. A coluna de Bio Gel A 1.5m (72 cm x 1,8 cm) foi equilibrada em tampão
acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. Foram coletadas frações de aproximadamente
1,8 mL, em um fluxo de 0,6 ml/minuto. O perfil de eluição protéico foi monitorado
em espectrofotômetro a 280 nm e a atividade enzimática através de ensaio
enzimático, com descrito no item 2.2.4. Os experimentos realizados nos itens
acima foram feitos de acordo com o já descrito por Aquino (2004). As frações
eluídas da coluna e que apresentaram maior atividade β-D-N-
acetilglucosaminidásica foram reunidas e a enzima utilizada para a imobilização.
2.2.4 Determinação das atividades enzimáticas com p-nitrofenis derivados
de açúcar e sulfato e dosagem de proteínas
Para as frações provenientes da precipitação com sulfato de amônio e da
coluna de gel filtração: alíquotas de 20 µL de cada fração foram incubadas a
37°C durante uma hora com 5 µL do p-nitrofenil-β-D-N-acetil-glucosaminídeo a
39
uma concentração final de 0,15 mM em um volume final de 100 µL. As reações
foram interrompidas após a adição de 1 mL de NaOH 0,25N e o p-nitrofenol
liberado foi lido em espectrofotômetro a 405 nm. Para cada ensaio foram feitos
controles negativos dos substratos e das frações protéicas.
A β-
D
-N-acetilglucosaminidase imobilizada foi ensaiada adicionando-se
100 µl (8mM) de p-nitrofenil-β-D-N-acetil-glucosaminideo, transferindo a um outro
tubo a 50°C durante 30 minutos. Após este tempo, o sobrenadante foi retirado e
adicionado 1 mL de NaOH 0,25N e o p-nitrofenol liberado foi lido em
espectrofotômetro a 405 nm.
As atividades específicas foram calculadas de acordo com a relação da
quantidade de p-nitrofenol liberado e a massa em µg de proteína adicionada ao
ensaio enzimático em uma hora a 37°C a atividade foi definida como a
quantidade de proteína necessária para degradar 1 µmol de p-nitrofenil-β-D-N-
acetilglucosaminideo por minuto.
A quantificação das proteínas foi realizada utilizando o método de
SEDMAK; GROSSBERG (1977).
2.2.5 Obtenção do Dacron ferromagnético e ativação com glutaraldeído
O Dacron foi obtido conforme o descrito por Matta (2004). Os filmes de
Dacron (polietilenotereftalato) foram cortados em pequenos pedaços e
colocados em um erlenmeyer com metanol e hidrato de hidrazina na seguinte
proporção: 1 g de Dacron:10 ml de metanol 100%:2,5ml do hidrato de hidrazina.
O erlenmeyer foi colocado em Shaker com agitação constante a 40ºC por 16h.
Em seguida a mistura resultante foi filtrada em funil de Buchner e o pó obtido foi
seco em estufa. Posteriormente, foi magnetizado com FeCl
2
(0,6 M) e FeCl
3
(1,1
M) na proporção de 1:1. O produto desta etapa foi desidratado e triturado em
almofariz, para obtenção de fragmentos mais homogêneos, o material ainda foi
selecionado pela sua passagem em um tamis de 100µm.
40
O Dacron (10 mg) assim obtido foi lavado 10 vezes com 1ml de tampão
acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 com auxílio de um campo magnético, para
separar as partículas que foram magnetizadas das demais, em seguida foi
ativado utilizando-se 2,5% de glutaraldeído em diferentes pH por 2h sob
agitação constante (30 RPM). Transcorrido o tempo o Dacron foi novamente
lavado 10 vezes com o mesmo tampão acima e utilizado para eliminar o excesso
de glutaraldeído.
2.2.6 Processo de imobilização enzimática
Para o processo de imobilização enzimática, foi pesado 10 mg de Dacron
ferromagnético em tubos de ensaio, onde foi adicionado 1ml (10,8µg) da solução
enzimática rica na enzima β-
D
-N-acetilglucosaminidase, por 16 horas (MATTA,
2004). Após esse tempo, o sobrenadante foi retirado do tubo e foram feitas dez
lavagens com tampão acetato de sódio (NaOH) 0,1N, pH 5,0 no suporte e
posterior quantificação das proteínas presentes no sobrenadante. A
concentração de enzima imobilizada foi calculada levando-se em consideração a
diferença entre a concentração de proteína ofertada e a existente após as
lavagens. Em seguida 1ml de glicina 1M foi adicionado ao dacron com a enzima
imobilizada durante 2h, para bloquear os sítios restantes.
2.2.7 Análise do complexo PET e enzima imobilizada em Microscópio
Eletrônico de Varredura (MEV)
Essa técnica permite a obtenção de informações estruturais e químicas
de amostras diversas. Um feixe fino de elétrons de alta energia incide na
superfície da amostra onde, durante o contato com a amostra, parte do feixe é
refletida e coletada por um detector que converte este sinal em imagem de BSE
(ou ERE) - imagem de elétrons retroespalhados - ou nesta interação a amostra
41
emite elétrons produzindo a chamada imagem de ES (elétrons secundários).
Ocorre também a emissão de raios-X que fornece a composição química
elemental de um ponto ou região da superfície, possibilitando a identificação de
praticamente qualquer elemento presente. O polietilenotereftalato com e sem a
enzima imobilizada foi submetido ao MEV. As imagens foram geradas em
diferentes aumentos, de quinhentas vezes (500x) a dez mil vezes(10.000x) para
se analisar a estrutura das partículas
2.2.8 Espectroscopia de infravermelho
Foram medidas em absorbância e transmitância as amostras do dacron
com a enzima imobilizada e na ausência da mesma nos diferentes estágios e
analisadas através da espectroscopia de infravermelho no comprimento de onda
compreendido entre 4400 e 400 cm
-1
.
2.2.9 Determinação do K
m
da enzima imobilizada.
Para se determinar o K
m
aparente, a β-D-N-acetilglucosaminidase
imobilizada (10,8 µg de proteína) foi incubada com concentrações crescentes de
p-nitrofenil-β-
D
-N-acetilglucosaminideo (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0; 3,0; 4,0; 6,0;
8,0 e 10,0 mM) durante 30 min a 45°C. Os ensaios foram interrompidos com
1mL de NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado foi lido em espectrofotômetro a
405 nm. Os valores de K
m
e V
máx
foram calculados de acordo com o programa
origin 5.0 levando-se em consideração a linearização da equação de Michaelis-
Menten através do gráfico de Hanes-Woolf.
2.2.10 Influência da temperatura sobre a atividade β
ββ
β-D-N-
acetilglucosaminidásica
42
Para avaliar o efeito da temperatura sobre a hidrólise do p-nitrofenil-β-
D
-
N-acetilglucosaminideo, a enzima imobilizada (2 µg) foi incubada em diferentes
temperaturas (5; 25; 37; 45; 50; 60; 70 e 80°C) com uma concentração final de 8
mM de substrato a 50°C. Após 30 minutos os ensaios foram interrompidos
conforme descrito no item 2.2.4.
Em outro experimento, foram feitas pré-incubações da β-D-N-
acetilglucosaminidase imobilizada (2 µg) durante 1; 15; 20; 30; 60; 90; 120 e 240
minutos a 50°C, na ausência do substrato. Passado cada intervalo de tempo
especificado foi adicionado p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo para uma
concentração final de 8 mM e os ensaios ocorreram a 50°C durante 30min. Em
seguida, as reações foram interrompidas conforme o descrito no item 2.2.4
2.2.11 Influência do pH sobre a atividade β
ββ
β-D-N-acetilglucosaminidásica
Com objetivo de analisar a influencia do pH sobre a N-acetil-β-D-
glucosaminídase, foram preparados tampões cloreto de potássio 0,1 M pH 2,0;
acetato de sódio 0,1 M (pH 3,5; 4,5 e 5,5); fosfato de sodio 0,1 M pH 6,5 e tris
HCl 0,1 M (pH 7,5 e 8,5). Os ensaios foram realizados a 50ºC. Transcorrido o
tempo de ensaio as reações foram interrompidas e quantificadas a 405 nm em
espectrofotômetro, como descrito no item 2.2.4.
2.2.12 Influência do tempo sobre a atividade β-N-acetilglucosaminidásica
Para avaliar a influência do tempo na hidrólise do p-nitrofenil-β-D-N-
acetilglucosaminídeo, os ensaios com a enzima imobilizada (2 µg de proteína)
foram realizados em diferentes tempos de incubação (5min; 10min; 15min;
30min; 60min; 90min; 150min; 210min; 300min e 360min;) a 50°C e uma
concentração final de substrato de 8mM. Após cada intervalo de tempo
43
especificado, a reação foi interrompida com 1mL de NaOH 0,25 N e o p-
nitrofenol liberado lido em espectrofotômetro a 405 nm.
2.2.13 Atividade enzimática na presença de sais inorgânicos
A influencia de diferentes sais inorgânicos sobre a enzima imobilizada e
solúvel, foi observada através da incubação da enzima e os sais KCL, MgCl
2
,
CaCl
2
, MnCl
2
, ZnSO
4
, CuSO
4
e AgNO
3
a 1mM durante 30 minutos a 50°C e
37°C respectivamente.
2.2.14 Teste de reutilização enzimática
A estabilidade da β-D-N-acetilglucosaminidase imobilizada após uso
repetido foi determinada pela medida da atividade residual da enzima após o
término de cada reação. Foram realizadas 10 reações em seqüência durante um
dia a 50
0
C por 30 minutos. Transcorrido o tempo de cada reação, estas foram
interrompidas como descrito no item 2.2.4
2.2.15 Ensaio enzimático na presença de diferentes concentrações de
Cloreto de mercúrio.
O teste de atividade enzimática na presença do mercúrio foi verificado
com a enzima imobilizada (10,8 µg de proteína) incubada com concentrações
crescentes de HgCl
2
(0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2;
2,4; 2,6; 2,8; 3,0; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8 e 4,0 mM) na presença do substrato sintético
p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo (8,0mM) durante 30 min a 50°C. Os
ensaios foram interrompidos com 1mL de NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado
foi lido em espectrofotômetro a 405 nm. Os gráficos foram realizados utilizando-
se o software origin 5.0.
44
2.2.16 Ensaio enzimático com polissacarídeos e eletroforese
A β-D-N-acetilglucosaminidase solúvel (pool da Bio Gel A 1.5m) e
imobilizada em Dacron foram incubadas com os glicosaminoglicanos (7µg):
condroitim sulfato, dermatam sulfato e heparam sulfato. Estes ensaios foram
realizados a 45°C, por 48 horas. Após este tempo o material foi submetido
(alíquotas de 10 µg) a eletroforese em lâminas de gel de agarose 0,55%, tampão
1,3 diaminopropano-acetato (PDA) pH 9,0, em caixa refrigerada a 4°C, sob
tensão de 8 V/cm durante 60 minutos. Nestas condições os GAGS migram para
o pólo positivo. Em seguida, os glicosaminoglicanos foram precipitados no gel
com CETAVLON 0,1%, por um período mínimo de 2 horas. Transcorrido este
tempo, o gel foi submetido a uma corrente de ar quente para secar, sendo
posteriormente corado com azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol
50%, por 15 minutos. A seguir, o excesso de corante foi removido com solução
de ácido acético 1% em etanol 50%, e as lâminas foram deixadas para secar à
temperatura ambiente.
45
3. RESULTADOS
3.1 OBTENÇÃO DA Β
-D
-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE
A atividade β
-D
-N-acetilglucosaminidase apresentou-se maior na fração
denominada F-I. Esta atividade, por sua vez, foi isolada por cromatografia em
gel filtração Bio Gel A 1.5m (Figura 6) resultando em um perfil de eluição que
revelou uma faixa de atividade da β
-D
-N-acetilglucosaminidásica bastante
pronunciada. As frações desta coluna, contendo a atividade da enzima, foram
reunidas e este material foi utilizado para os experimentos de imobilização.
3.2 ISOLAMENTO PARCIAL DA β-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE
3.2.1 Determinação das atividades enzimáticas das frações provenientes
do fracionamento com sulfato de amônio:
No extrato bruto, F I, F II e F III as catorze atividades testadas encontravam-
se presentes. As melhores atividades obtidas foram: β-N-
acetilgalactosaminidásica, α-fucosidásica, β-fucosidásica, β-manosidásica, β-
glucosidásica e β-galactosidásica. A atividade β-N-acetilglucosaminidásica, foco
desse trabalho, se mostrou mais pronunciada na F I tal atividade foi maior em
relação às demais frações (Figura 5).
46
Figura 5: Atividades enzimáticas presentes em frações de Artemia franciscana
(Fracionamento com sulfato de amônio)
A atividade específica (D.O. 405nm/µg de proteína) foi encontrada através da relação entre a
quantidade de p-nitrofenil liberado e a massa em µg de proteínas de cada fração contida no
ensaio, por um período de uma hora.
3.2.2. Cromatografia em gel filtração Bio Gel A 1.5m
A fração FI foi escolhida por ter apresentado uma boa atividade específica
sobre o p-nitrofenil-N-acetil-β
-D-
glucosaminídeo. Assim, 2 mL (20,6 mg de
proteína) desta fração foram aplicados na Bio Gel A 1.5m resultando em um
perfil de eluição que revelou uma faixa de atividade β-N-acetilglucosaminidásica
bastante pronunciada (6-30) (Figura 6). Estas frações foram ensaiadas para
outras atividades específicas (β-N-acetilgalactosaminidásica, β-fucosidásica, β-
manosidásica, β-glucosidásica e β-galactosidásica), e foi observado que a
atividade β-N-acetilgalactosaminidásica acompanha a atividade β-N-
47
acetilglucosaminidásica, entretanto as demais atividades mostraram-se
presentes nas frações coletadas a partir do tubo 14 (Figura 7). Para evitar maior
contaminação, foram reunidas somente as frações iniciais (6-13), e estas foram
usadas nos ensaios de imobilização.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 74 78 82 86
Fração (2 ml)
D. O. (405 nm)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
D. O. (280 nm)
b-N-acetilglucosaminidase Proteína
Figura 6: Perfil de eluição da β
ββ
β
-N-
acetilglucosaminidase em cromatografia de gel filtração
Bio Gel A 1.5m
34 mL da FI (87,72 mg de proteína) foram aplicados em coluna de 72 cm x 1,8 cm de gel
filtração. A coluna foi equilibrada em tampão acetato de sódio 0,1 M; pH 5,0, e eluída com o
mesmo tampão em um fluxo de 0,6 mL/min. O perfil de eluição de proteína foi obtido através de
leitura óptica a 280 nm, e de atividade enzimática a 405 nm em espectrofotômetro.
Número de frações (1,8mL)
48
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Fração (2 ml)
D. O. (405 nm)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
D. O. (280 nm)
b-N-acetilglucosaminidase b-manosidase b-fucosidase
b-galactosidase b-glucosidase b-N-acetilgalactosaminidase
Proteína
Figura 7: Perfil de eluição de glicosidases em cromatografia de gel filtração Bio Gel A
1.5m
34 mL da FI (87,72 mg de proteína) foram aplicados em coluna de 72 cm x 1,8 cm de gel
filtração. A coluna foi equilibrada em tampão acetato de sódio 0,1 M; pH 5,0, e eluída com o
mesmo tampão em um fluxo de 0,6 mL/min. O perfil de eluição de proteína foi obtido através de
leitura óptica a 280 nm, e de atividade enzimática a 405 nm em espectrofotômetro.
Após a reunião das frações eluídas (6-13) da Biogel A 1.5m a atividade β-
N-acetilglucosaminidásica e a atividade β-N-acetilgalactosaminidásica foram as
únicas atividades glicosidásicas significativamente presentes, destacando-se a
primeira que apresentou atividade específica maior (figura 8)
Número de frações (1,8mL)
49
0
100
200
300
400
Fração (T6 - T13)
Atividade Específica
Sulfatase a-fuco sidase b-fuco sidase
a-manosidase b-manosidase a-xilosidase
b-xilosidase a-N-acetilgalactosaminidase b-N-acetilgalactosaminidase
a-N-acetilglucosaminidase b-N-acetilglucosaminidase b-glucorunidase
b-glucosidase b-galactosidase
Figura 8: Perfil das atividades enzimáticas da fração da cromatografia em gel filtração Bio
Gel A 1.5m 1,8mL
O perfil de eluição de proteína foi obtido através de leitura óptica a 280 nm. A atividade
específica (6-13) foi verificada a 405 nm em espectrofotômetro.
3.2.3 Atividade encontrada para enzima imobilizada
A enzima foi imobilizada em partículas de Polietilenotereftalato-PET
ferromagnético via glutaraldeido (Dacron), com retenção de proteína de 2,0
µg/mg de suporte, rendendo um derivado insolúvel contendo 5,0 unid/mg de
proteína e retendo 10,35% da atividade da enzima solúvel.
50
3.3 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DA IMOBILIZAÇAO
3.3.1 Influencia do pH na ativação do Dacron ferromagnético
Para se verificar os possíveis efeitos do pH sobre a ativação do suporte e
atividade da enzima, ativou-se o dacron em três diferentes pH (5,0; 7,0 e 9,0)
respectivamente, as melhores atividade enzimáticas ocorreram quando a
imobilização se deu em pH 5,0. Estes resultados são coerentes com os já
descritos na literatura em que o glutaraldeído é mais estável a pH ácidos e
neutros, o que evita sua polimerização e facilita o processo de ativação (WALT;
AGAYN, 1994).
Após a imobilização da enzima nestes suportes suas atividades foram
testadas (Figura 9). Observou-se maior atividade da β
-D
-N-
acetilglucosaminidase em pH 5,0. Observa-se dessa forma que os pH ácidos e
neutros são os melhores para ativação do suporte e assim todo o trabalho foi
realizado ativando-se o suporte a pH 5,0.
Figura 9: Atividade enzimática em diferentes pH de ativação do Dacron ferromagnético. A
β-D-N-acetilglucosaminidase foi imobilizada nos suportes ativados em diferentes pH (5,0; 7,0 e
9,0) e posteriormente foi realizado o teste de atividade enzimática, conforme o descrito no item
2.2.4 de métodos.
4 5 6 7 8 9 10
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Atividade enzimática (405 nm)
pH de ativação do suporte
51
3.3.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura propicia que imagens sejam
aumentadas várias vezes como por exemplo nesse trabalho onde utilizamos
aumentos de 500 a 10.000 vezes o tamanho das partículas de dacron, (Figura
10) permitindo visualizar características como a forma e tamanho destas
partículas. Dessa maneira comparou-se o dacron livre (Figura 10 - A; C; E e G)
com o ligado a enzima (Figura 10 - B; D; F e H), foram observadas diferenças
entre o dacron livre e o dacron com a enzima imobilizada, onde este último
apresentou estrutura com aspecto floculado como mostrado na seta (Figura 10-
H). As partículas visualizadas apresentaram o menor comprimento de 721nm e
os maiores a 100 µm, este último semelhante ao diâmetro do tamis utilizado
para obtenção do dacron.
Dacron na ausência de enzima Dacron com enzima imobilizada
A
B
C
D
52
Figura 10: Imagem a partir do microscópio eletrônico de varredura (MEV).
As imagens foram geradas em diferentes escalas de 500 a 10.000 vezes para se verificar a
morfologia do dacron na ausência de enzimas (A; C; E e G) e na presença da enzima
imobilizada (B; D; F e H), para os aumentos 500 (A-B), 1.000 (C-D), 2.000 (E-F), e 10.000 (G-H)
respectivamente.
3.3.3 Confirmação de imobilização por infravermelho
Observa-se na Figura 11 os espectros das partículas do PET ativado
(A), enzima imobilizada ao PET (B) e enzima livre (C). No item A observa-se a
presença de grupos aldeídos livres em 1718 cm
−1
( ), já no item B verificou-
se uma diminuição do espectro para os grupamentos aldeído, indicando um
sucesso na ativação dos grupos aminados na enzima pelo glutaraldeído, e
consumo após imobilização pela β-
D
-N-acetilglicosaminidase, confirmando
dessa forma a imobilização via glutaraldeído. No item C encontra-se a enzima
livre desprovida do glutaraldeído.
E
G
F
H
53
Figura 11: Espectro infravermelho das nano e micro partículas magnéticas com e sem a β-
D
-N-
acetilglucosaminidase imobilizada. As partículas foram acondicionadas em botões de
KBr e posteriormente foram analisados pelo equipamento de infravermelho. (A) Partículas do
PET ativado; (B) Enzima imobilizada ao PET; (C) Enzima livre.
54
3.4 DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS
3.4.1 Determinação do K
m
e V
max
da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético
Estes experimentos foram realizados incubando-se a β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético com diferentes concentrações de
p-nitrofenil-β
-D
-N-acetilglucosaminideo. Os resultados mostraram um K
m
aparente de 2,32 ± 0,48 mM e V
max
= 1,58mM x 60min
-1
x mL
-1
. O resultado é
melhor visualizado pelo gráfico da Figura 12.
Figura 12. Determinação da K
m
e V
max
da β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético. Concentrações crescentes de p-nitrofenil
-N-
acetil-β-D-glucosaminídeo (0,1;
0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10,0 mM) foram incubados com a β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético durante trinta minutos a 50°C. Transcorrido esse
tempo, as reações foram interrompidas como descrito em 2.2.4 de métodos.
0 2 4 6 8 10
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Absorbância 405 nm
concentração de substrato mM
55
3.4.2 Efeito da temperatura sobre a atividade da β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético
No estudo do efeito da temperatura sobre a atividade da enzima, incubou-
se a β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético com p-nitrofenil-β
-D
-N-
acetil-glucosaminídeo sob diferentes temperaturas. Estes resultados mostraram
maior atividade enzimática a 50°C, embora se observe atividades significativas
nas temperaturas de 45°C e 60°C. Os resultados mostraram que β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético apresenta estabilidade maior
frente a temperaturas mais elevadas.
Figura 13: Efeito da temperatura sobre a atividade da β-D
-N-
acetilglucosaminidase-
Dacron ferromagnético. A β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético foi incubada
com o p-nitrofenil
-N-
acetil-β-D-glucosaminídeo (100µl-3mM) a diferentes temperaturas (5; 25;
37; 45; 50; 60; 70 e 80°C) de acordo como descrito em 2.2.10 de métodos.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Absorbância 405 nm
Temperatura (
0
C)
56
3.4.3 Estabilidade térmica
O efeito da temperatura, a 50° C, sobre a atividade da β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético foi testada incubando-se a enzima
imobilizada por diferentes tempos, na ausência do substrato, e a atividade
residual foi medida ensaiando-se, em seguida, a enzima com o p-nitrofenil-N-
acetil-β
-D-
glucosaminídeo a 50° C durante 30 minutos. A Figura 14 mostra este
resultado. Podemos avaliar que após 15 minutos de pré-incubação, a eficiência
na degradação do p-nitrofenil-N-acetil-β
-D-
glucosaminídeo pela enzima começa
a ser prejudicada e ela perde 12% de sua atividade. No tempo de 240 minutos
de pré-incubação, a atividade catalítica cai em 76%.
Figura 14: Estabilidade térmica da β-D
-
N
-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético. A
β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético (2 µg) foi pré-incubada durante 1; 15; 20;
30; 60; 90; 120 e 240 minutos a 50°C, na ausência do substrato. Passado cada intervalo de
tempo especificado foi adicionado p-nitrofenil
-N-
acetil-β-D-glucosaminídeo para uma
concentração final de 8 mM e os ensaios ocorreram a 45°C durante 30min. Após esse período
as reações foram interrompidas como descrito em 2.2.4 de métodos.
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Atividade Residual (%)
Tempo (minutos)
57
3.4.4 Efeito do pH sobre a atividade da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético
Neste experimento foi observado que a maior atividade da β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético ocorre no pH 5,5; embora a
enzima ainda apresente em torno de 92% e 95% de atividade nos pH 6,5 e 7,5;
respectivamente. Percebe-se então que a β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético, aparentemente, apresenta maior estabilidade frente a pH ácidos
como ainda a pH neutros.
Figura 15: Efeito do pH sobre a atividade da β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético. O p-nitrofenil
-N-
acetil-β-D-glucosaminídeo foi preparado nos tampões cloreto
de potássio 0,1 M pH 2,0; acetato de sódio 0,1 M (pH 3,5; 4,5 e 5,5); fosfato de sódio 0,1 M pH
6,5 e tris HCl 0,1 M (pH 7,5 e 8,5). Os ensaios foram realizados a 50ºC. Transcorrido o tempo de
ensaio as reações foram interrompidas e quantificadas a 405 nm em espectrofotômetro, como
descrito no item 2.2.4.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Absorbância 405 nm
pH
58
0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
Absorbância a 405 nm
Tempo em minutos
3.4.5 Influência do tempo sobre a atividade da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-
Dacron ferromagnético
Após os primeiros 30 minutos iniciais, podemos observar que houve
diminuiçã da velocidade de reação (Fig. 16). O gráfico mostra que após 300
minutos a 50° C a atividade residual da enzima foi 96,7%, atividade elevada,
demonstrando uma ótima estabilidade da β
-D
-N-acetilglucosaminidase em
função do tempo.
Figura 16: Influência do tempo sobre a atividade β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético. Ensaios com a β-
D
-
N
-
acetilglucosaminidase imobilizada foram realizados em
banho Maria a 50°C em diferentes tempos (5, 10, 15, 30, 60, 90, 150, 210,e 300 minutos), em
seguida as reações foram interrompidas e a atividade foi lida a 405 nm em espectrofotômetro,
como descrito no item 2.2.4
3.4.6 Influência de diferentes sais sobre a atividade da β
-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético
Foi observado que os sais KCL, MgCl
2
, CaCl
2
e MnCl
2
potencializaram a
atividade da enzima imobilizada, observado na Figura 17, já a solúvel foi
potencializada apenas pelo MnCl
2
, o AgNO
3
inibiu a atividade de ambas.
59
Figura 17: Influência dos sais sobre a atividade β-D
-N-
acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético. Ensaios com a β-D
-N-
acetilglucosaminidase imobilizada foram realizados em
banho Maria a 50°C na presença de diferentes sais KCl, MgCl
2
, CaCl
2
, MnCl
2
, ZnCl
2
, CuSO
4
,
AgNO
3
, e na ausência de sal, em seguida as reações foram interrompidas e a atividade foi lida a
405 nm em espectrofotômetro, como descrito no item 2.2.4
3.4.7 Efeito da atividade β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético incubada em diferentes concentrações de mercúrio.
O resultado apresentado na Figura 18 mostrou que a inativação enzimática
frente ao mercúrio foi concentração dependente. Devido ao aumento da concentração
de mercúrio, houve decréscimo na atividade enzimática. Quando o mercúrio atingiu a
concentração de 4mM, houve a inativação completa da enzima.
60
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1
0
20
40
60
80
100
120
Atividade Residual (%)
N úm e ro de reu tiliza çõ es
Figura 18: Influência dos mercúrio sobre a atividade β-
D
-
N
-
acetilglucosaminidasica da
enzima imobilizada. Ensaios com a β-
D
-
N
-
acetilglucosaminidase imobilizada foram realizados
em banho Maria a 50°C na presença de cloreto de mercúrio, em diferentes concentrações (0,1;
0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3,0; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8 e 4,0
mM).
3.4.8
Reutilização da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético
A Figura19, mostra a atividade da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético, As micro e nano partículas com as enzimas imobilizadas foram
utilizadas dez vezes (10x) seguidas com atividade semelhantes de acordo com a
Figura 19.
Figura 19: Reutilização da β-D-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético 100µl (8
mM) de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foram incubados com a β-D-N-
61
acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético durante 30 minutos a 50°C. Após esse período as
reações foram interrompidas como descrito em 2.2.4 de métodos.
3.5 AÇÃO DA Β
-D
-N-ACETILGLUCOSAMINIDASE SOLÚVEL E IMOBILIZADA
SOBRE SUBSTRATOS NATURAIS
Neste experimento observou-se a ação da β
-D
-N-acetilglucosaminidase
solúvel e imobilizada sobre os substratos naturais condroitim sulfato, dermatam
sulfato e heparam sulfato. Os resultados mostraram uma possível atividade da
enzima solúvel sobre o condroitim sulfato e dermatam sulfato. Estes indicam que
pode se tratar de β
-D
-N-acetilhexosaminidase, pois ambos os substratos não
apresentam β
-D
-N-acetilglucosamina na estrutura e sim β
-D
-N-
acetilgalactosamina. Já a enzima imobilizada apresentou melhor atividade sobre
o heparam sulfato.
Figura 20: Ação da β-D
-N-
acetilglucosaminidase solúvel e imobilizada sobre os
substratos naturais condroitim sulfato(CS), dermatam sulfato(DS) e heparam sulfato(HS).
Estes ensaios foram realizados a 45°C, por 48 horas. Após este tempo o material foi submetido
(alíquotas de 10 mg) a eletroforese em lâminas de gel de agarose em caixa refrigerada a 4°C
durante 60 minutos. Em 1, 3 e 5 a enzima solúvel foi ensaiada com condroitim, heparam e
dermatam sulfato, respectivamente. Em 2, 4 e 6, são os respectivos controles. Em 7, 9 e 11, a
CS
DS
HS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
IMOBILIZADA
SOLÚVEL
62
enzima imobilizada foi ensaiada com condroitim, heparam e dermatam sulfato, respectivamente.
Em 8, 10 e 12, são os controles, respectivamente. Em 13, controle de corrida.
4. DISCUSSÃO
O ambiente marinho apresenta grande complexidade e diversidade de
organismos, estes por sua vez desenvolveram durante milhões de anos
mecanismos adaptativos (ex.: mutações) frente às flutuações ambientais, os
quais permitiram sua sobrevivência. Dessa forma, pode-se esperar que
glicosidases presentes nos organismos aquáticos apresentem características
diferentes das encontradas no ambiente terrestre. As Glicosidases são
importantes ferramentas para estudos de características estruturais de grupos
de polissacarídeos e seu papel biológico (KUSAYKIN et al., 2003).
Os estudos relacionados à glicosidases de microrganismos aquáticos vêm
ocorrendo nas ultimas duas décadas (WALLLECHA; MISHRA, 2003) e uma das
principais preocupações é a utilização dessas enzimas como ferramentas
biotecnológicas aplicada a importantes setores da sociedade como indústria
(BIRO; KIVIHARJU; 2007), saúde (SLAWSON et al 2001; SANON, et al, 2005;)
e meio ambiente (EKENLER, 2002; LIN et al; 2005 ). Outras fontes marinhas
interessantes de glicosidases são os invertebrados, elas já foram identificadas
em vários organismos como: celenterados, anelídeos, artrópodes, moluscos,
equinodermos (KUSAYKIN et al., 2003) e crustáceos (LIN, 2005).
Seguindo esse contexto o grupo de pesquisadores do Laboratório de
Química em Função de Proteína da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN) vem ao longo dos últimos anos, realizando um trabalho de
prospecção em busca de glicosidases com potencial biotecnológico isoladas de
invertebrados marinhos (SOUZA, 2003; MATTA; ABREU, 2005; NASCIMENTO,
2008). Esse grupo usa p-nitrofenis derivados de açúcar como ferramentas
básicas para a identificação de glicosidases. Assim foram encontradas por
exemplo, atividades β-N-acetilglucosaminidásicas nos celenterados Palythae
coribaeroum (SOUZA, 2003); Palythoa voriabitis (FERREIRA, 2003) e duas
63
atividades β-N-acetilglucosaminidásicas no crustáceo Artemia franciscana
(AQUINO 2004; NASCIMENTO, 2008).
Neste trabalho uma atividade β-N-acetilglucosaminidásica foi isolada por
precipitação com sulfato de amônio e cromatografia em gel filtração (Bio Gel A
1.5 m). Após estas etapas, ensaio com p-nitrofenis indicaram um bom
isolamento dessa atividade em relação às demais analisadas (Figura 8). Uma
purificação de enzimas, inclusive glicosidases, muitas vezes inviabiliza a sua
utilização biotecnológica, pois geralmente são necessárias várias etapas de
purificação (JIA et al; 2006). Portanto, optou-se pela utilização da atividade
isolada para os estudos posteriores descritos nesse trabalho em detrimento de
sua purificação e assim indicar potencialidades biotecnológicas para essa
atividade.
Análises de Microscopia eletrônica de varredura (MEV) demonstraram na
Figura 10 que o procedimento de imobilização não alterou a morfologia da
superfície das partículas nem o tamanho médio das partículas, o que demonstra
que a metodologia utilizada pode ser utilizada para a imobilização de enzimas
sem promover alterações na estrutura do dacron. Diferente do que ocorre com o
uso de outras matrizes, como nanogeis de natureza coloidal (JUN HONG et al.,
2007).
A espectroscopia de infravermelho é uma excelente ferramenta para
demonstrar a presença de grupamentos funcionais em moléculas. Os dados
obtidos demonstraram a presença de bandas pronunciadas em 1640 a 1560
cm
-1
no suporte com a enzima imobilizada. Essa é uma região típica de aminas
primárias (NH
3
+
), como aquelas encontradas em proteínas, devido à presença
dos aminoácidos lisina e arginina (LIN-VIEN., 1991). Esses picos também foram
observados quando a enzima livre foi analisada por IR. Outro dado importante,
foi o desaparecimento do sinal referente ao aldeído encontrado na Figura 12
(1718 cm
−1
) , este sinal é atribuído ao grupamento aldeído do glutaraldeído
(ALLAN E. DAVID., 2006). Fato semelhante foi observado quando uma invertase
64
de Saccharomyces cerevisiae foi imobilizada em uma matriz de sílica gel com
auxílio de glutaraldeído (ALLAN E. DAVID., 2006). Esse desaparecimento ocorre
porque grupamento aldeído se liga covalente a enzimas durante o processo de
imobilização.
Na tentativa de comprovar o processo de imobilização da β-
D
-N-
acetilglucosaminidase em micro e nano partículas ferromagnéticas, foram feitas
análises físico químicas e ensaios com paranitrofenis. Este último demonstrou
uma taxa de imobilização de 10,35%. Não existem dados publicados disponíveis
a respeito de outras glicosaminidases imobilizadas nesse mesmo tipo de
suporte, inviabilizado a comparação. Vários fatores podem influenciar na taxa de
imobilização como natureza do suporte utilizado, tamanho da partícula, área
superficial, tipo de imobilização. Não se encontrou na literatura trabalhos
suficientes que mostram a imobilização de β-
D
-N-acetilglucosaminidase em
dacron ferromagnético, portanto uma comparação com trabalhos de outros
autores ficou prejudicada nesse aspecto. Estudos futuros poderão esclarecer
que fator(es) seriam os principais responsáveis para esse baixo rendimento.
Apesar disso, continuou-se os estudos neste trabalho com o dacron
ferromagnético devido o fato dele ser facilmente obtido a partir de um polímero
bastante acessível, o PET, como por exemplo, ele pode ser obtido pela
reciclagem de garrafas de refrigerantes e similares. Fato que da ao trabalho aqui
apresentado um apelo ecológico.
Os parâmetros cinéticos como temperatura, estabilidade térmica, pH,
tempo de reação e K
m
das enzimas são muito importantes, pois determinam
suas condições ideais de utilização, partindo desse princípio, foram realizados
vários testes com intuito de conhecer tais parâmetros e as melhores condições
de utilização da β
-D-
N-acetil-glucosaminidase de Artemia franciscana. Esta
enzima imobilizada apresentou 50°C como a temperatura ótima de degradação
do p-nitrofenil, valor que foi inferior aquele observado para a mesma enzima
quando solúvel (não imobilizada) (Aquino, 2004). No entanto, a forma solúvel
perde bruscamente sua atividade (100%) a 70°C e 80°C, enquanto a enzima
65
imobilizada permanece com 35% e 23% de sua atividade nestas temperaturas,
respectivamente. Outras enzimas quando imobilizadas também apresentam
essa característica (SHYH-YU SHAW et al., 2006; ALLAN E. D et al., 2006).
Enzimas como β-glicosidase (BUSTO, 1998), L-ramnosase (BHUIYAN et
al., 1997) e sulfatase (MATTA, 2004), após suas imobilizações têm apresentado
maior estabilidade térmica. Os ensaios de estabilidade térmica indicaram que a
β
-D-
N-acetil-glucosaminidase de A. franciscana imobilizada apresenta atividade
catalítica acima de 90% entre os 15 minutos iniciais. Contudo essa atividade cai
rapidamente após esse período. Dados de Aquino (2004) com essa enzima
solúvel, mostram que ela apresenta uma estabilidade um pouco maior, pois sua
atividade tem uma queda semelhante da enzima imobilizada em torno de 30
minutos. Contudo, em períodos de incubação mais prolongados os resultados
para ambas as enzimas se assemelharam muito. Outro dado interessante que
deve ser analisado é o fato da temperatura ideal, Aquino (2004) demonstrou que
β
-D-
N-acetil-glucosaminidase de Artemia franciscana apresentava uma
temperatura ideal de 60°C, quando essa enzima foi imobilizada, obteve-se
neste trabalho uma temperatura ótima em torno de 50°C. Contudo, foi
encontrada uma faixa de temperatura ideal entre 45°C e 60° para a enzima
imobilizada, onde se observou 75% de atividade catalítica da enzima, enquanto
que a enzima solúvel a 70°C perde 95% de sua atividade total (AQUINO, 2004).
Esses dados indicam que a imobilização da enzima lhe deu uma maior
habilidade de apresentar atividade catalítica em mudanças maiores de
temperatura. Uma característica que não se alterou com a imobilização foi
tempo de reação.
Já com relação ao pH, determinou-se como ideal o valor em torno de 5,5
pára hidrólise do substrato sintético. Um pouco inferior daquele observado por
Aquino (2004) para a enzima solúvel. Contudo, verificou-se uma maior
estabilidade para enzima imobilizada, pois apresentou intervalo ideal de valores
entre 5,0 e 7,5, enquanto que a enzima solúvel, apresentou apenas um pico de
pH 6,0. O comportamento apresentado pela enzima imobilizada em diferentes
66
pH tem a ver, provavelmente, com a distribuição desigual de íons H
+
e OH
-
próximo ao microambiente da enzima imobilizada originando as mudanças de
pH ótimo obtidas (SPAGNA et al., 1998).
Os dados até aqui indicam que a pesar da imobilização alterar alguma
propriedades cinéticas da β
-D-
N-acetil-glucosaminidase de Artemia franciscana,
de uma forma geral a imobilização foi mais benéfica para essa enzima. Análises
estatísticas têm mostrado que somente 16% das enzimas imobilizadas
estudadas apresentam decréscimo da estabilidade atividade após a imobilização
(AZEVEDO et. al., 2001). Acredita-se que o grande sucesso da imobilização em
melhorar várias propriedades cinéticas de enzimas se dá devido as ligações
covalentes entre as enzimas e suporte, o que confere mais rigidez à estrutura da
enzima, protegendo-a do efeito desnaturante da temperatura e pH (SPAGNA et
al., 1998; JUN HONG., 2007).
O K
m
é a constante de Michaelis-Menten e representa ½ da velocidade
máxima, quando compara-se o valor do K
m
, de 2,32 encontrado para a β
-D-
N-
acetil-glucosaminidase imobilizada com aquele já descrito para a beta-N-
acetilglucosaminidase solúvel (AQUINO, 2004), o qual foi de 0,23 mM
percebemos que, após o processo de imobilização a enzima apresentou maior
K
m
, indicando perda de afinidade pelo substrato sintético testado.
As enzimas imobilizadas geralmente apresentam um valor do K
m
mais
elevado, (BAHAR ; TUNCEL, 2002; AMARAL et al 2006; ALTUN, 2007) o que
pode ocorrer devido às mudanças conformacionais sofridas por elas ao serem
imobilizadas, ou pela dificuldade de difusão do substrato em relação ao sítio
catalítico da enzima (SPAGNA et al., 1998), o K
m
representa a afinidade da
enzima pelo substrato, é muito importante para a compreensão da interação
enzima-substrato. O valor do K
m
da β
-D-
N-acetilglucosaminidase de A.
franciscana imobilizada para o ρ-nitrofenil-β
-D-
glicosaminideo difere de outras
glucosaminidases encontradas como a da borboleta Pieris brassicae (SHI, et al;
2006) que demonstrou um K
m
de 0.285mM; ou a de Tripanossoma cruzy que
67
apresentou um K
m
de 1,5mM (MOUDNI, et al 1996), estes para enzimas
solúveis. Encontrou-se poucos relatos de enzimas solúveis que apresentam
maior K
m
em relação a imobilizada (ALLAN E. DAVID., 2006).
As enzimas, quando em seu meio natural, podem interagir com diversos
sais e íons metálicos, estes por sua vez podem interagir com sítios enzimáticos
potencializando ou inibindo a atividade da enzima. Essa interação pode ser
benéfica como no caso da ligação do ferro com o grupo heme da hemoglobina,
porém nem todos metais trazem benefícios, como por exemplo o mercúrio(Hg),
o qual pode trazer uma série de transtornos fisiológicos, principalmente
neurológicos (SHIGEO, 2007) quando encontrados de forma inadequada na
natureza. Nessa perspectiva, verificou-se a ação de alguns sais e íons metálicos
sobre a atividade da enzima. Dentre os íons testados, a prata (AgNO
3
)
apresentou maior inibição da atividade enzimática frente ao ρ-nitrofenil-β
-D-
glicosaminídeo (Figura 18). Na literatura, existem relatos de outras glicosidases
que também mostraram, ação inibitória frente a prata, prata como por exemplo
uma extraída do limão Podophyllum peltatum (DAYAN et al., 2003) outra da
bactéria Sulfolobus shibatae (WOLOSOWSKA; SYMOWIECKI, 2003) e da soja
Glycine max (HSIEH; GRAHAM, 2001). Dessa forma verificamos que a inibição
por ínos é comum sobre β
-D-
glicosidase, talvez devido a ligação a grupos Sufidril
(SH) na estrutura da enzima na qual geralmente são necessários para que
esses íons possam inibir a enzima (WALLECHA; MISHRA, 2003; HSIEH;
GRAHAM, 2001), indicando a participação direta do aminoácido cisteína para
atividade enzimática.
O Mercúrio (Hg) é um metal pesado e apresenta alta toxicidade,
principalmente devido a sua ligação covalente com grupamentos sulfidrilas,
promovendo modificação ou inibição de algumas enzimas e proteínas (LIN et al.,
2003; JIMENEZ-VIDAL et al., 2004), interferindo no metabolismo e função
celular. Seguindo esta preocupação verificou-se se a N-acetil-β
-D-
glucosaminidase sofreria interferência do mesmo. Verificou-se que 0,01mM de
mercúrio já provocou diminuição da atividade enzimática, que veio a
68
desaparecer com 4mM de mercúrio. Atribui-se a essa atividade do mercúrio
devido ao fato dele se ligar aos grupos sufidrila de enzimas e inibir a sua
atividade (LIN, 2006). Essa sensibilidade da β
-D-
N-acetil-glucosaminidase de A.
franciscana sugere que a enzima imobilizada poderá ser utilizada como
biosensor de mercúrio, sendo adaptada a equipamentos sensíveis ao mercúrio
no meio ambiente.
A β
-D-
N-acetil-glucosaminidase obtida foi facilmente removida do meio
reacional com a ajuda de um campo magnético. A imobilização da enzima
facilitou assim sua utilização, uma das vantagens deste método. Infere a idéia
que houve realmente a formação de ligações covalentes entre a β
-D-
N-acetil-
glucosaminidase e o Dacron ferromagnético, criando um derivado insolúvel ativo
e que pôde ser reutilizado por dez vezes seguidas sem perda de atividade como
demonstrado na Figura 19. Estes resultados são semelhantes aos descritos para
a sulfatase imobilizada em Dacron ferromagnético onde a enzima apresentou-se
estável após onze repetidas utilizações, sem perda de atividade (MATTA, 2004).
Este estudo contribui com outros e mostram que glicosidases e sulfatases
são comuns em invertebrados marinhos, como confirmado em estudo do
laboratório onde foram identificadas nos celenterados Palythae coribaeroum
(SOUZA, 2003); Palythoa voriabitis (FERREIRA, 2003); nos moluscos Chiton sp
(VIEIRA, 2002), Aplysia cervina (MATA; ABREU, 2005); Equinoderma
Echinometra lucunter (LIMA, 2006), e também em Celenterados, Anelídeos,
Artrópodes, moluscos e Equinodermas pelo Laboratory of Enzyme Chemistry of
the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry (KUSAYKIN et al., 2003). Além
disso, mostra aplicação biotecnológica para a glicosaminidase, que apresenta
uma excelente estabilidade térmica e reutilizações, assim como tolerância a pH,
propriedades estas que estão sendo buscadas na indústria, em virtude
principalmente da estabilidade, do baixo custo operacional e que pode ser
estendida a outros setores como o meio ambiente.
69
5. CONCLUSÕES
• A β
-D
-N-acetilglucosaminidase foi imobilizada de forma eficaz ao Dacron
ferromagnético;
• O melhore pH para a ativação do suporte foi 5,0;
• O valor do K
m
aparente e V
max
obtido para a β
-D
-N-acetilglucosaminidase
imobilizada foi de 2,32 ± 0,48 mM e 1,58mM x 60min
-1
x mL
-1
respectivamente;
• A temperatura ótima para a atuação da β
-D
-N-acetilglucosaminidase-
Dacron ferromagnético foi 50°C;
• O pH ótimo para a atuação da enzima imobilizada foi 5,5;
• Até os 30 minutos o complexo β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron
ferromagnético teve a melhor velocidade inicial de reação;
• A β-
D-
N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético pôde ser
reutilizada dez vezes seguidas, sem perda significativa de atividade;
• A β
-D
-N-acetilglucosaminidase apresentou diminuição da atividade em
virtude da concentração do cloreto de mercúrio, indicando sensibilidade ao
mesmo.
• A β
-D
-N-acetilglucosaminidase-Dacron ferromagnético foi capaz de
degradar o parcialmente o heparam sulfato;
70
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Data: 14/12/2005 Natal, RN Brasil. 2005 (Monografia).
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