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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Centro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Avaliação do efeito anti-proliferativo do antagonista do
peptídeo liberador de gastrina, RC-3095, e em associação
com a temozolamida em modelos experimentais de gliomas.
Marianne Schrader de Oliveira
Orientador: Rafael Roesler
Co-orientador: Guido Lenz
Porto Alegre, agosto de 2008.
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Milhares de livros grátis para download.
2
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Centro de Biotecnologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Avaliação do efeito anti-proliferativo do antagonista do
peptídeo liberador de gastrina, RC-3095, e em associação
com a temozolamida em modelos experimentais de gliomas.
Marianne Schrader de Oliveira
Tese submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Molecular e Celular
da UFRGS como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre
Orientador: Rafael Roesler
Co-orientador: Guido Lenz
Porto Alegre, agosto de 2008.
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3
Instituições e Fontes Financiadoras
Este trabalho foi realizado no laboratório de Pesquisa em Câncer do
Hospital de Clínicas de Porto Alegre em colaboração com o laboratório de
Sinalização e Plasticidade Celular do Departamento de Biofísica da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul e com o laboratório de
Enzimologia do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul. A pesquisa teve suporte financeiro pelo projeto do
CNPq 400839/2005-9, pela South American Office for Anticancer Drug
Development - SOAD - e pelo Instituto do Câncer Infantil – ICI. O RC-
3095 foi gentilmente cedido pela Zentaris ltda, Alemanha.
4
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por colocar pessoas tão
maravilhosas em meu caminho. Agradeço a oportunidade de realizar este
estudo em um laboratório com pessoas muito dedicadas e inteligentes,
sendo totalmente especiais. Principalmente agradeço ao meu orientador,
Dr. Rafael Roesler que confiou e acreditou no meu trabalho, muito
obrigada por tudo! Gostaria de agradecer às pessoas do Laboratório de
Pesquisa em Câncer do Hospital de Clínicas de Porto Alegre por todo o
apoio e amizade, em especial, Caroline Farias, Ana Abujamra, Gustavo
Reolon, Daniela Cornélio, Natasha Maurmann, Débora Flores e Luciana
Lima.
Uma pessoa muito importante nesta minha formação foi o Dr. Guido
Lenz que sempre me auxiliou em muitas realizações, muito obrigada por
toda confiança, principalmente por me possibilitar trabalhar com uma
pessoa tão especial como a Giovana Cechim, pois sem ela, certamente
este trabalho não teria obtido todo o sucesso. Gostaria de agradecer
também a Dra. Ana Maria Battastini que gentilmente abriu as portas do
seu laboratório possibilitando experimentos. E especialmente gostaria de
agradecer à Elizandra Braganhol por todo apoio.
Agradeço ao pessoal do Laboratório de Imunogenética, em especial,
Nance Nardi, Kátia Kvito, Camila Ilgenfritz, Eduardo Ávila, Melissa
Camassola e Daniel Santos por me mostrarem o caminho da pesquisa,
fazendo com que eu viesse a apreciar tanto.
5
Aos colegas do laboratório Endocrimeta, em especial, Luciane Cerioli,
Shisue Katagiri, Célia Martins e Lusia Leal pela ajuda e compreensão.
Gostaria de agradecer a todos os meus amigos que me deram o
importante apoio psicológico e emocional, em especial, Aldrey Bonassina,
Vivian Zilberstein, Mauricio Maumahd, Karina Grigol, Anelise
Vollkweiss e Danila Fossano. Principalmente gostaria de agradecer todo o
apoio e amor de Thiago Dutra Rodrigues, muito obrigada.
Em especial, gostaria de agradecer aos meus pais, Cláudio Prestes de
Oliveira e Gisela Schrader de Oliveira, por todo o apoio e carinho sempre.
Sem vocês nada seria possível, muito obrigada por todo esforço para que
eu seja uma pessoa melhor e possa fazer diferença na sociedade.
6
Índice
1 – Lista de Abreviaturas.................................................................7
2 – Resumo.......................................................................................8
3 – Abstract......................................................................................9
4 – Introdução...................................................................................10
5 – Objetivos.....................................................................................19
6 – Manuscrito..................................................................................20
7 – Discussão....................................................................................50
8 – Conclusão...................................................................................57
9 – Apêndice I..................................................................................58
10 – Referências Bibliográficas........................................................61
11 – Curriculum.................................................................................68
7
Lista de Abreviaturas
BB: bombesin / bombesina
EGF: endothelial growth factor / fator de crescimento endotelial
ERK: extracellular signal-regulated protein kinase / proteína quinase
regulada por sinal extracelular.
GRP: gastrin-releasing peptide / peptídeo liberador de gastrina
GRPR: gastrin-releasing peptide receptor / receptor do peptídio
liberador de gastrina
Gq: proteína pertencente à família das proteínas G
MAPK: mitogen-activated protein kinase / proteína quinase ativada por
mitógeno
NMB: neuromedin B / neuromedina B
NMBR: neuromedin B receptor / receptor de neuromedina B
NMDA: N-metil-D-aspartato
mRNA: messenger ribonucleic acid / ácido ribonucléico mensageiro
PKA: protein kinase A / proteína quinase A
PKC: protein kinase C / proteína quinase C
PLC: phospholipase C / fosfolipase C
RC-3095: [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesin (6-14)
8
Resumo
Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas
modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e
quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos
tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina
(GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento
de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso
em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a
proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi
investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP,
como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico
alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem
C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095
quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em
associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos
experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5
mm
3
), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo
na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm
3
). Porém, a combinação dos dois agents produziu
a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm
3
), assim como, apresentou
índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a
combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em
modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um
forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de
agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes.
9
Abstract
Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments
like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to
their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing
peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of
cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on
glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the
present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the
GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA
alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models.
Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ +
RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most
effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52
± 15.5 mm
3
), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant
effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm
3
). The combined therapy
produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm
3
), greater than with
either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and
TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore
making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting
agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.
10
Introdução
Gliomas consistem no tipo de tumor primário mais freqüente no sistema
nervoso central (SNC), sendo originados de células da glia ou de células
precursoras de células gliais. Correspondem a 78% dos tumores neuronais em
adultos apresentando aproximadamente 20.000 novos casos por ano nos Estados
Unidos. São comumente encontrados na substância branca do cérebro, mas
também podem ocorrer em qualquer região do SNC, tais como nos nervos
ópticos. World Health Organization (WHO) classifica-os em diferentes subtipos
de acordo com sua histologia, sendo o mais agressivo denominado de
glioblastoma multiforme. Este possui o pior prognóstico tendo um tempo médio
de sobrevida depois de diagnosticado de aproximadamente 12 meses [revisado
por Kleihues et al, 2000; Prados et al, 2000; Stupp et al, 2005]. Gliomas de alto
grau são tumores altamente vascularizados e com grande potêncial de infiltração
apresentando áreas extensivas de necrose e hipóxia. Excessiva proliferação,
crescimento tumoral disseminado, resistência a estímulos apoptóticos,
neovascularização e supressão da auto-imunidade tumoral contribuem para o
fenótipo maligno dos gliomas [Rich et al, 2004; John et al, 2006].
O tratamento depende da localização e do grau tumoral, sendo a
remoção cirúrgica a abordagem mais usual. Porém, gliomas de alto grau na
maioria dos casos reincidem algum tempo após a cirurgia. Assim, a terapia
padrão é a associação de radioterapia seguida por quimioterapia após a remoção
tumoral cirúrgica. Ainda assim, gliomas apresentam alta resistência a estes
tratamentos [Grobben et al, 2002; Schwartzbaum et al, 2006]. Grande ênfase
tem sido gerada no desenvolvimento de novas substâncias que tem como alvo as
11
vias de sinalização celular envolvidas no crescimento tumoral. Em tumores
malignos, normalmente ocorre uma super ativação de vias envolvidas na
proliferação celular e concomitante diminuição dos mecanismos regulatórios de
morte celular [Holland et al, 2001]. Pesquisas recentes incluem a restauração da
função dos genes supressores tumorais perdidos, as alterações induzidas no
ciclo celular, a inibição das metaloproteinases indutoras de metástases, da
angiogênese e das vias de transdução de sinais.
Temozolamida (TMZ), um agente imidazólico alquilante, foi
recentemente introduzido na clínica médica para o tratamento de gliomas
malignos e tem apresentado grande potêncial antitumoral [Danson et al, 2001].
TMZ possui vantagens importantes sobre outros agentes alquilantes por ser uma
pequena molécula lipofílica com peso molecular de 194 Da podendo ser
administrada via oral e ter a capacidade de atravessar a barreira
hematoencefalica eficientemente. Seus níveis tanto no cérebro como no fluído
cefaloespinhal encontram-se na faixa de 30-40% da concentração plasmática
[Newlands et al, 1997; Kanzawa et al, 2004]. Além disso, é uma substância
com menor toxicidade em relação às células progenitoras hematopoeticas que
outros agentes quimioterapicos convencionais por não resultar mutações de
cross-link nos padrões de DNA. A citotoxidade da TMZ ocorre devido à
formação do agente monometil-triaceno-imidazol-carboxamida (MTIC) que
induz a uma alquilação na posição O
6
do DNA promovendo despareamento de
timina durante o ciclo de replicação do DNA [D’Atri et al, 1995; Friedman et
al, 2000; Kanzawa et al, 2004] demonstrado na Fig 1.
12
Fig. 1.
http://www.uspharmacist.com/NewLook/pix/drug/apr00rap.gif
Fig 1. Formação do agente citotóxico MTIC resultante da degradação da TMZ,
o qual iduzirá alquilação na posição O
6
do DNA.
Rotineiramente a TMZ é administrada concomitantemente com
medicamentos contra náuseas. Contudo, a associação da TMZ com outros
agentes antineoplásicos ainda se encontra em fase experimental. Estudos de fase
I e II têm demonstrado que a associação de TMZ à radioterapia ocasiona grande
beneficio em relação à melhora do prognóstico e aumento do tempo de
sobrevida dos pacientes diagnosticados com gliomas [Yung et al, 2000]. Ainda
assim, a vasta maioria destes pacientes apresenta uma sobrevida de no máximo
12 meses [Prados et al, 2000].
Outros estudos promissores encontram-se em um nível pré-clinico,
como a associação TMZ com agentes que inibem a atividade de COX-2 que
podem alterar o ciclo cellular como o rofecoxib ou celecoxib [Kang et al, 2006;
Hau et al, 2008]. Acredita-se que este agente recrute células tumorais ao
período S do ciclo celular com atraso do seu crescimento. Também outros
13
estudos de combinações com agentes antiangiogênicos, como o sunitinib – um
inibidor de tirosina quinase, à TMZ demonstram terapias promissoras no
tratamento de muitos tipos de tumores [Zhou et al, 2008]. Inibidores dos
receptores de fator de crescimento epidérmico (EGF), que estão envolvidos no
desenvolvimento de diversos cânceres, apresentaram bons resultados quando
combinados à TMZ [Terrance et al, 2003]. Porém, estes estudos ainda não
demonstraram eficácia satisfatória no aumento da sobrevida dos pacientes
submetidos aos ensaios clínicos.
Muitas vias de transdução de sinais são anormalmente ativadas em
tumores, proporcionando às células tumorais uma vantagem de sobrevivência
em relação às células não-neoplásicas [Mulholland et al, 2005; Sanson, 2004].
A ativação de receptores de fatores de crescimento está envolvida em todas as
fases de desenvolvimento tumoral, como na indução de angiogênese, no
aumento da invação local tumoral e na formação de metástases. O peptídio
liberador de gastrina (GRP), peptídeo mamário análogo à Bombesina
encontrada na pele do anfibio Bombina bombina, tem surgido como um fator
importante de crescimento autócrino envolvido no desenvolvimento de muitos
tumores [Patel et al, 1766; Moody et al, 1989]. Uma expressão aberrante tanto
do peptídio GRP como de seu receptor (GRPR, também conhecido como
receptor BB2) foi relatada em estudos recentes [Zhou et al, 2004; Cornelio et al,
2007]. A expressão do receptor de GRP foi caracterizada em gliomas malignos
e a ativação desses receptores por agonistas do peptídio GRP ou bombesina
estimula a mitogênese em muitas linhagens celulares de gliomas [Staley et al,
1993]. Ambos, GRP (27 aminoácidos) e Bombesina (14 aminoácidos), possuem
a seqüência 7-aminoácido COOH-terminal altamente conservada, a qual é
14
requerida para a imunogenicidade e para a alta afinidade de ligação aos
receptores de GRP, o que confere a estes peptídeos uma atividade fisiológica
bem semelhante [Sunday et al, 1988].
Três receptores dos peptídeos bombesin-like (BLP) foram clonados em
mamíferos: GRPR, receptor da neuromedina B (NMBR) e o receptor de
bombesina 3 (BRS3). São receptores com sete domínios transmembrana
acoplado à proteína Gq (Fig. 2) [Benya et al, 2000]. Esses receptores acoplados
à proteína Gq via domínios intracelulares, quando ativados induzem múltiplas
vias de transdução de sinalização intracelular.
Fig. 2.
Benya et al, 2000.
Fig 2. Receptor sete-transmembrana acoplado à proteína Gq do peptídeo
liberador de gastrina (GRP).
15
Fisiologicamente, o GRP age como um peptídeo importante na
regulação da contração do músculo liso, liberação de hormônios no trato
gastrointestinal (GI), secreção de enzimas pancreáticas e neurotransmissão de
sinais no sistema nervoso central (SNS) [Bunnet et al, 1994]. Alguns estudos
verificaram os efeitos patogênicos destes peptídeos em modelos pré-clínicos de
doenças como desordens neurológicas, tumores e distúrbios autoimunes, entre
outros. Roesler e colaboradores investigaram os efeitos dos BLPs, assim como
da ativição de GRPR, na regulação de funções neurais, demonstrando possíveis
implicações do GRPR em doenças psiquiátricas [Roesler et al, 2004 e Roesler
et al, 2006]. GRPR parece ter uma interação funcional com outros
neurotransmissores e sistemas de receptores como com os receptores de GABA,
dopamina e glicocorticóides, os quais estão envolvidos nas patologias de
Parkinson e Esquisofrenia, assim como, na mediação de respostas de stress e
ansiedade. Estudos recentes indicam que agentes que atuam ativando ou
reprimindo GRPR são candidatos em potêncial no tratamento da doença de
Alzheimer [Roesler et al, 2006]. GRP foi também relacionado a processos
inflamatórios. Dal Pizzol et al. recentemente reportaram antagonistas seletivos
do GRPR diminuem a liberação de citocinas pró-inflamatórias in vitro e in vivo
e a sobrevida em modelos pré-clinicos de sepse [Dal Pizzol et al, 2006]
Os mecanismos de sinalização ativados pelo GRPR que causam os
efeitos mitogênicos do GRP em tumores ocorrem através da ativação da via de
sinalização da proteína quinase C (PKC), proteína quinase regulada por sinal
extracelular (ERK) e proteína quinase fosfatidilinositol 3 (PI3K). A ativação de
GRPR estimula AMP cíclico (cAMP) e fosfatidil inositol 3 fosfato (PIP3),
aumentando a hidrólise de fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) aumentando os
16
níveis intracelulares de cálcio e promovendo uma transativação de receptores do
fator de crescimento epidérmico (EGFR) [Gutkind et al, 2007] (Fig. 3). Os
receptors de GRP são acoplados à proteina Gq que ativa diretamente a via da
PKC em células da linhagem C6 [Flores et al, 2008]. Evidências indicam que
estimuladores da via de cAMP/PKA inibem a proliferação celular e induzem
apoptose em células das linhagens U-87 e U-138 de gliomas, sendo o
envolvimento da ativação dos GRPRs com a via de sinalização da proteína
quinase A (PKA) demonstrada por estudos do nosso grupo [Farias et al, 2008].
Fig. 3.
Gutkind et al, 2007.
Fig 3. Mecanismos de sinalização ativados pelo GRPR que causam os efeitos
mitogênicos do GRP em tumores.
17
A evidência de que o GRP e seu receptor têm um efeito importante no
crescimento tumoral proporcionou o desenvolvimento de antagonistas seletivos
ao GRPR como potenciais agentes antineoplásicos. Um exemplo desses
antagonistas seletivos é o [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)Leu14] bombesin (RC-
3095) desenvolvido por Schally e colegas, sendo experimentalmente avaliado
em diversos tipos tumorais [Radulovik et al, 1991; Pinski et al, 1994]. RC-3095
surge como um agente interessante para o tratamento de gliomas por ser capaz
de atravessar a barreia hematoencefálica, atingindo assim regiões cerebrais
importantes. Também demonstrou não apresentar alta toxicidade em modelos
animais experimentais [Szepeshazi et al, 1997].
A expressão do GRPR em um grande espectro de tumores humanos foi
revisada por Cornélio e colaboradores (Tabela 1) demonstrando a relevância
deste receptor como fator de crescimento tumoral quando ativado, o que provem
suporte a estudos de antagonistas do GRPR como agentes anti-tumorais
experimentais [Cornélio et al, 2007]. Estudos clínicos com antagonistas do
GRPR, como o RC-3095, em pacientes com câncer estão em fase inicial, sendo
necessário mais estudos relacionados a toxicidade e dosagem destes agentes.
18
Tabela 1. Expressão do GRPR em tumores humanos.
Cornélio et al, 2007
19
Objetivo
No presente estudo, nós investigamos o efeito antitumoral do RC-3095
em modelos experimentais de glioma C6 de rato e seu possível potencial em
associação à TMZ, um agente alquilante de DNA, visando procedimentos
multimodais no tratamento de glioblastoma multiforme.
Objetivos específicos
- Avaliar o efeito anti-proliferativo do RC-3095, da TMZ e de
ambos os agentes em combinação em linhagens tumorais de
glioma de rato C6;
- Avaliar o tratamento com RC-3095 e TMZ ao longo do tempo
visando avaliar a sobrevida in vitro;
- Avaliar a indução de morte celular induzida pelos tratamentos
com RC-3095 e TMZ;
- Avaliar a eficácia do tratamento com RC-3095 e em associação
à TMZ em modelos in vivo de gliomas.
20
Submited article
Journal of Neuro-Oncology
Original paper
LABORATORY INVESTIGATION
Running head: combination of RC-3095 and temozolomide in gliomas.
Anti-proliferative effect of gastrin-release peptide receptor antagonist, RC-
3095, combined with temozolomide in experimental glioblastoma models
Marianne de Oliveira - Giovana Cechim - Elisandra Braganhol – Daniel Garcia
Santos - Luise Meurer - Cláudio Galvão de Castro - Algemir Lunardi Brunetto -
Gilberto Schwarstmann - Ana Maria Oliveira Battastini - Guido Lenz - Rafael
Roesler.
M.S. Oliveira – G. Cechim – C.G. Castro - A.L. Brunetto – G. Schwartsmann – R.
Roesler
Cancer Research Laboratory, Academic Hospital Research Center, Federal
University of Rio Grande do Sul, Rua Ramiro Barcelos, 2350, 90035-003, Porto
Alegre, RS, Brazil.
G. Cechim – G. Lenz
Laboratory of Cellular Signaling and Plasticity, Department of Biophysics,
Institute of Biosciences, Federal University of Rio Grande do Sul, 901501-970,
Porto Alegre, RS, Brazil.
21
E. Braganhol – A.M.O. Battastini
Laboratory of Enzimology, Department of Biochemistry, Federal University of
Rio Grande do Sul, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil.
D.G. Santos
Imunogenetics Research group, Department of Genetics, Institute of Basic Health
Sciences, Federal University of Rio Grande do Sul, 901501-970, Porto Alegre,
RS, Brazil.
C.G. Castro - A.L. Brunetto
Children’s Cancer Institute and Pediatric Oncology Unit, Academic Hospital,
Federal University of Rio Grande do Sul, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil.
L. Meurer - G. Schwartsmann
Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Federal University of Rio
Grande do Sul, 90035-003, Porto Alegre, RS, Brazil.
M.S. Oliveira – R. Roesler
Cellular and Molecular Neuropharmacology Research Group, Department of
Pharmacology, Institute for Basic Health Sciences, Federal University of Rio
Grande do Sul, 90046-900, Porto Alegre, RS, Brazil.
22
Abstract Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modal
treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy. Evidence
has indicated that gastrin-releasing peptide and its receptors (GRPR) play a major role
in the development of a variety of cancers including gliomas. In the present study, we
investigated the effects of RC-3095, a selective GRPR antagonist, alone or in
combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in in vitro and in vivo
experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was significantly reduced by
all treatments with the combined administration of TMZ and RC-3095 being the most
effective treatment. In in vivo experiments, the control group displayed the largest
tumors (52 ± 15.5 mm
3
), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most
significant effect at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm
3
). The combined therapy
produced further reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm
3
). Our results show that the
combination of RC-3095 with TMZ produced an important reduction in in vitro and in
vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects
of the DNA alkylating agent TMZ in the treatment of glioma.
Keywords RC-3095 - gastrin-releasing peptide receptor – temozolomide -
glioblastoma multiforme.
23
Background
Glioblastoma multiform (GBM), the most frequent and aggressive type of
primary brain tumor in adults, has a very poor prognosis because of its treatment
resistance and the ability to infiltrate into brain tissue. Excessive proliferation,
disseminated tumor growth, resistance toward apoptotic stimuli,
neovascularization and suppression of antitumoral immune surveillance are key
biological features that contribute to the phenotype of malignant human gliomas.
The current standard treatment approach in patients diagnosed with GBM is
neurosurgical resection and radiotherapy followed by adjuvant chemotherapy [1,
2]. Currently emphasis is being placed on promising new compounds that target
individual signal transduction pathways. However, until such therapies result in
significant clinical advances, the rationale for studying more broadly targeted
drugs, such as DNA alkylating chemotherapeutics, remains strong [3, 4].
Temozolomide (TMZ), an oral imidazotetrazinone methylating agent, has
demonstrated schedule-dependent activity in several cancers, including gliomas
[5]. TMZ is rapidly absorbed and is spontaneously cleaved in vivo to monoethyl
triazenoimidazole carboxamide (MTIC), a reactive DNA methylating species. The
cytotoxicity of MTIC is thought to be caused by methylation of the O6 position of
guanine [6]. Apart from its methylating properties, inhibition of protein kinase C
has been implicated as a possible mechanism of action [7]. TMZ is highly bio-
available after oral administration, has excellent central nervous system
penetration, and reaches the brain in therapeutic concentrations [8].
In Phase II studies TMZ improved the progression-free period of patients
with relapsed high-grade glioma and showed a lower toxicity profile than
24
equivalent chemotherapeutic agents. Recently, the concomitant administration of
TMZ and radiotherapy has led to significantly improved overall survival rates.
However, the vast majority of patients who are diagnosed with GBM have a mean
survival of only 12 months [2, 9].
Considerable progress has been made over the last several decades in
understanding specific cellular, molecular and genetic mechanisms contributing to
cancer growth and progression. Several signal transduction pathways are
abnormally activated in cancers, giving tumor cells a survival advantage over
surrounding non-neoplastic tissues [10, 11]. The gastrin-releasing peptide (GRP),
a mammalian bombesin (BB)-like peptide, has emerged as a major autocrine
growth factor involved in the development of a variety of human cancers.
Aberrant expression of both GRP and GRP receptor (GRPR, also known as BB2
receptor) has been reported in many tumor types [12 - 13]. GRPR expression has
been characterized in human glioma cells, and GRPR activation by its antagonist
BB and GRP stimulates mitogenesis in several glioma cell lines [11 - 14].
The evidence indicating that GRP and GRPR play a role in cancer growth
has led to the development of selective GRPR antagonists as potential targeted
anticancer agents [10 – 15]. An example of these synthetic GRPR antagonists is
[D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)Leu14] bombesin (6-15) (RC-3095), developed by
Schally and colleagues [16, 17] and evaluated as a potential anticancer drug in a
variety of experimental cancer models [18, 19].
In the present study, we investigated the potential of RC-3095 in
experimental rat C6 glioma models and also in combination with TMZ
multimodal targeting therapeutic. This is the first study assessing the possible
25
anti-proliferative effect of GRPR antagonism in C6 glioma tumor graft models in
rats.
Materials and methods
Chemicals
Both TMZ (Schering-Plough, Kenilworth, USA) and RC-3095 (AEterna Zentaris
GmbH, Frankfurt am Main, Germany) were dissolved in 4% dimethylsulfoxide
(DMSO) in saline. All experimental protocols were approved by the Institutional
Research Ethics and Animal Care Committee. All in vivo experiments were
performed in accordance with the National Institutes of Health Guide for Care and
Use of Laboratory Animals (NIH publication No. 80-23 revised 1996). All efforts
were made to minimize the number of animals and their suffering.
Cell culture
The rat C6 malignant glioma cell line was obtained from American Type Culture
Collection (Rockville, Maryland, USA). The cells were grown and maintained
in low glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Gibco BRL,
Carlsbad, USA) containing 0.1% Fungizone, 100U/l gentamicin and
supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Sorali, Campo Grande, Brazil).
Cells were kept at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO
2
.
26
Cell proliferation assay
Cells were seeded at 10000 cells per well in 500 µM DMEM/10% FBS into 24-
well plates and incubated either with 0.05 to 1.0 µM of RC-3095, 90 and 180 µM
TMZ and different combinations of each. Cell counting was carried out 48 h after
treatment. The culture medium was removed, cells were washed with Hank’s
Balanced Salt Solution (HBSS; Invitrogen, São Paulo, Brazil) and 100 µL of
0.25% trypsin/EDTA solution was added to detach the cells, which were counted
immediately in a hemocytometer. Results are represented as 3 independent
experiments performed in triplicates.
Cell viability assay
Cell viability was measured by 3-(4,5-dimethyl-thiazoyl)-2,5-diphenyl-SH-
tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich) assay, which measures the
mitochondria activity, as previously described [20]. C6 glioma cells were plated
in 96-well culture plates 24 hrs before treatment. After 48 h exposure to RC-
3095 (0.05, 0.1, 0.5, and 1.0 µM), TMZ (22.5, 45, 90 and 180 µM) and different
combinations of these drugs, the cells were treated with 10 µL MTT and the
microplates were further incubated at 37°C for 4 hours. To lise the cells, 100 µL
of 10% dimethylsulfoxide was used. The absorbance values of each well were
determined with a microplate enzyme-linked immunoassay reader (ELISA)
equipped with a 492 nm filter. The negative control well was used for the
baseline zero absorbance. Three independent experiments were carried out in
27
triplicate. The viability was determined as the percentage absorbance of treated
cultures compared with those of untreated cultures – MTT index.
Flow cytometry assay
Tumor cells were grown in 24-well culture plates at 10000 cells/well and were
treated with RC-3095 (0.1 and 1.0 µM doses), TMZ (90 and 180 µM doses) and
different combinations of those drugs for 48 h. The cells were then collected and
washed with HBSS, fixed in 70% ethanol, resuspended in phosphate-buffered
saline containing 1mg/ml RNase, and stained with propidium iodide (final
concentration of 50µg/ml) and YO-PRO-1 (final concentration of 0.1mM;
Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA) based upon the method described by
Peluso et al [21]. Briefly, a loss in plasma membrane integrity enables YO-PRO-1
to enter apoptotic cells, while healthy cells remain impermeable to this nucleic
acid stain. After 10 min in the presence of YO-PRO-1 and propidium iodide, the
rate of apoptotic cells was analyzed using flow cytometry (FACSCalibur, BD
Biosciences, Heidelberg, Germany).
Clonogenic survival assay
Clonogenic assay was performed as described previously [22]. C6 glioma cells
were seeded into 6-well plates (400 cells/well) after treatment with RC-3095 or
temozolomide and RC-3095 in combination with temozolomide. After
incubation for 10-14 days, the cells were fixed with 70% ethanol and
counterstained with 0.5% crystal violet. Only colonies containing 50 or more
28
cells were scored under a microscope. The radiation survival fraction (SF) was
then calculated as:
Number of colonies in treated cells
SF = ––––––––––––––––––––––––––––––––––– x 100
Number of colonies in control
Glioma implantation and pharmacological treatments
Rat C6 glioma cells grown to around 70% confluence were trypsinized, washed
once in DMEM/10% FBS, centrifuged and ressuspended in the same medium. A
total of one million cells were injected at 6.0mm in the right striatum (coordinates
with regard to bregma: 0.5 mm posterior and 3.0mm lateral) of anesthetized male
Wistar rats, 250–270 g [23]. After 20 days, the rats were euthanized by guillotine
and the entire brain was removed, sectioned and fixed with 10%
paraformaldehyde.
Ten days post-implantation, the rats were treated with 5 mg/Kg (i.p.) once a
day of temozolomide, 0.1, 0.3 and 1.0 mg/Kg twice a day of RC-3095 (i.p.) or
DMSO (control group) during 7 consecutive days. The drug was dissolved in
DMSO at a final concentration of 5% [24].
Tumor volume quantification
Hematoxylin and eosin (H&E) sections (4 µm thick, paraffin embedded) of each
tumor were analyzed by a pathologist. For tumor size quantification, images were
captured using a digital camera and analyzed using Image Tool Software™. The
29
total tumor volume (mm
3
) was computed by adding the segmented areas and
multiplying by the slice resolution.
Behavior assay
After ten days of tumor implantation, animals were exposed to an Open Field
assay. Open field exploration was carried on a 40 × 45-cm arena, surrounded by
45cm high walls, made of brown plywood with a frontal glass wall. The floor of
the arena was divided into nine equal squares by black lines. Rats were put in the
apparatus, placed on its left rear quadrant, and left to freely explore the arena for 5
minutes. Crossings of the black lines, rearings performed and latency to start
locomotion were counted. The number of crossings and rearings was used
respectively as measures of locomotor activity and exploratory behavior, whereas
the latency to start locomotion was used as measures of anxiety. After the
treatment of 5 days with RC-3095 and/or TMZ, animals were exposed again to the
open field arena for 5 min. and the same measures were taken. Comparisons were
made between the cancer control group that had no treatment and different
treatments with RC-3095 and TMZ before and after the treatment.
Statistics
The statistical significance was analyzed using one-way ANOVA analysis,
followed by Student’s t-test and Tukey multiple comparison test when
appropriate. All statistical work was carried out using the SPSS software for
30
Windows (Release 11.0.1, Chicago, IL). Differences were considered to be
significant when P < 0.05.
Results
The GRPR antagonist RC-3095 plus TMZ inhibits proliferation of C6 glioma
cells in vitro
The treatments with TMZ, RC-3095 or a combination of both drugs were effective
in inhibiting the proliferation of C6 glioma cells. RC-3095 reduced cell
proliferation by more than 50% 48hrs after treatment, while TMZ reduced cell
proliferation by 80%. Both drugs combined really abrogated cell growth, similarly
to the effect of cell proliferation in serum depletion. Fig. 1a shows the anti-
proliferative effect of the treatment with RC-3095 and TMZ, better seen at 0.5 µM
or 1.0 µM associated to 90 µM, respectively.
MTT assays were used to determine drug efficacy and interaction. The dose-
effect plot for C6 glioma cells in Fig. 1b shows that the treatment of RC-3095 and
TMZ alone exhibits lower cell viability relative to cancer control (* P < 0.0001)
and an enhanced drug combination of RC-3095 and TMZ effect (decreased cell
viability labeled effect) relative to RC-3095 and TMZ alone. RC-3095 (1.0 µM
and 0.5 µM) in combination with TMZ (90 and 180 µM) has a significant effect
compared with either drug alone.
31
Fig. 1
32
Fig. 1 (a) Influence of the gastrin-release peptide receptor antagonist RC-3095
combined with the alkylant agent temozolomide on proliferation of C6 rat glioma
cells. Data are expressed in number of cells found 48 h after treatment with RC-
3095 (0.1 and 1.0 µM), TMZ (90 and 180 µM) and combinations of both drugs
(RC-3095 0.1 plus TMZ 90, RC-3095 1.0 plus TMZ 90, RC-3095 0.1 plus TMZ
180, RC-3095 1.0 plus TMZ 180) compared to the number of cells found with
fetal bovine serum alone (cancer control). * P < 0.0001 compared to untreated
control cells; ** P < 0.001 compared to treatments with just one drug. (b) Effects
of cell viability by RC-3095 (0.05 to 1.0) and TMZ (22.5 to 180) in C6 rat glioma
cell lines. Cells were treated for 48 h with increasing concentrations of RC-3095
or TMZ alone and the respective combinations. * P < 0.0001, significant
difference between untreated cells and cells treated with RC-3095 or TMZ alone;
#
P < 0.001 and
# #
P < 0.0001, significant difference between cells treated with the
drugs alone or in combination. Experimental set were repeated for at least three
times with triplicate wells for each condition (mean ± SD).
Apoptotic cells induced by the combination of RC-3095 and TMZ
Upon morphological examination, RC-3095 and TMZ treated cells exhibited
apoptitic features, such as cell shrinkage, nuclear fragmentation and formation of
apoptotic bodies. When we quantified the apoptotic cells after the treatment with
TMZ or RC-3095 alone compared to those drugs combined, we identified a
significant difference in the apoptotic nuclei in the subdiploid region (sub G1
peak) of the histograms. Fig. 2 shows that apoptotic cells induced in C6 glioma
cells treated with 180 µM TMZ alone are prominent whereas RC-3095 does not
33
induced apoptotic cells when administrated alone, but increased cell death
significantly when combined with TMZ. This cell death is probably necrotic,
since apoptotic staining was decreased.
Fig. 2
34
Fig. 2 (a). C6 rat glioma cells treated with RC-3095 (0.1 and 1.0 µM) and/or TMZ
(90 and 180 µM). After 48h, those cells were analyzed by flow cytometry. Data
were expressed by percentage of viable, apoptotic and dead cells (b). C6 cells
stained with propidium iodide (IP) and YO-PRO-1; A = Apoptotic cells, D = Dead
cells and V = Viable cells. * P < 0.005, * P < 0.001. Experimental set were
repeated for at least three times for each condition (mean ± SD).
Decrease of C6 glioma cell surviving time by RC-3095 and temozolomide
The survival time in vitro was assessed by clonogenic assay. Colony formation
was clearly affected after the treatment with temozolomide or RC-3095 alone, but
na effect was particularly seen when cells were treated with a combination of RC-
3095 and temozolomide. The combination of temozolomide 180 µM and RC-3095
1.0 µM induced a decrease in the survival time in 87% compared to untreated
glioma cells, as shown in Fig. 3.
Fig.3.
35
Fig. 3. Effect of RC-3095 or temozolomide and RC-3095 in combination with
temozolomide in C6 glioma cell survival fraction. Following the treatments, cells
were incubated for 10-14 days. Colonies containing a cluster of more than 50 cells
were scored. Data were expressed as the percentage of the survival fractions of
treated cells versus untreated cells. Data were plotted as the mean ± SD of three
different experiments in triplicate wells for each condition. * P <0.05 was
considered significantly different from untreated cells, ** P < 0.01 was
considered significantly from the treatment with drugs alone.
Tumor size reduction induced by treatment with RC-3095 and TMZ in vivo
To determine whether RC-3095 in combination with TMZ can suppress tumor
growth in vivo, adult Wistar rats were inoculated in the striatum with C6 glioma
cells and, after the tumor development, were treated with 0.1, 0.3, and 1.0 mg/kg
of RC-3095 or 5.0 mg/kg of TMZ alone or a combination of both drugs during
five days. There was a significant suppression of tumor growth when rats were
treated with RC-3095 or TMZ when compared to normal tumor growth (52 ±
15.5). This tumor size reduction was more evident when these drugs were
administrated together rather than alone (10 ± 7.5) Fig. 4.
Haematoxylin and eosin examination shows that the untreated tumor
presented a high mitotic index, nuclear pleomorfism, foci of tumor necrosis and
parenchymal invasion – Fig. 5 e Fig. 6. These characteristics were less
pronounced when rats were treated with RC-3095 and TMZ, and especially with
the combination of the two drugs as showed in Table 1.
36
Fig. 4
Fig. 4. Tumor size was measured 20 days in the different treatment groups after
tumor implantation. Rats treated with RC-3095 alone (0.1, 0.3 and 1.0 mg/kg) and
TMZ alone (5 mg/kg) induced a significant tumor size reduction compared by
tumor size in untreated rats (N = 6 animals). RC-3095 combined with TMZ
reduced in 21% the tumor size compared to untreated rats. * P < 0.002 was
considered significantly different from untreated animals.
Fig. 5.
37
Fig. 5. The sections of implanted rat glioma were stained with haematoxylin and
eosin. Histological characteristics that define glioblastoma multiform as seen in
rats implanted glioma – cancer control – and in rats treated with RC-3095 0.3
mg/kg, TMZ 5.0 mg/kg and combination of both drugs. Necrosis (N) and
microvascular proliferation (V) seen in untreated rats and rats treated with
temozolomide, gliosis (G) seen in rats treated with RC-3095 combined with TMZ.
Scale = 50 um.
Fig. 6.
Fig. 6. Haematoxylin and eosin (HE) examination of tumor size – brain x tumor –
compared treated animals with the untreated animals.
38
Table 1.
Control RC-3095
0.1 mg/kg
RC-3095
0.3 mg/kg
RC-3095
1.0 mg/kg
TMZ
5.0 mg/kg
RC-3095
0.3 mg/kg
plus TMZ
5.0 mg/kg
Coagulative
necrosis
6/6
4/6
3/6
4/6
3/6
2/6
Intratumoral
Hemorrhage
5/6 3/6 3/6 3/6 4/6 1/6
Lymphocytic
infiltration
3/6 4/6 4/6 5/6 3/6 3/6
Mitotic index:
mitosis/HPF
10.6 ± 0.3
6.4 ± 0.7* 6.05 ± 0.6*
6.8 ± 0.8 6.1 ± 1.0*
4.4 ± 0.6 **
Reactional
gliosis
___ ___ 1 ___ ___ 2 *
Table 1. The histological variables (coagulative necrosis, intratumoral
hemorrhage, lymphocytic infiltration) were regarded as present or absent. Mitosis
was counted in ten high power fields (HPF) of the periphery of the lesion, and the
average of this counting was used as mitotic index. * P < 0.05 compared to
histological variables of untreated animals, ** P < 0.01 compared to histological
variables of animals treated with drugs alone.
Behavioral improvement by RC-3095 in animals with glioma
The open field exposure paradigm is a well accepted animal model for measuring
general behavioral aspects of brain function such as locomotion, exploration, and
anxiety-related behaviors [25]. Rats that received the tumor graft – 14 days of
tumor development - were exposed to open field before and after treatment with
RC-3095 and/or TMZ. Fig. 7 a and b shows that the number of crossings and
rearings decrease significantly as tumor progresses in both untreated rats and rats
39
given TMZ alone, indicating reduced locomotion and exploration. In contrast,
animals given RC-3095 alone or combined with TMZ showed the same number of
crossings and rearings before and after treatment. Another parameter considered
was the latency (time that rats needs to explore the environment). Fig. 7 c shows
that the latency of untreated rats and rats treated with TMZ alone were
significantly longer after five days of treatment. Otherwise, rats that received only
RC-3095 alone or combined with TMZ had lower latency after the treatment
period.
40
Fig.7.
41
Fig. 7. Behavior analysis. (A) number of crossings, (B) number of rearings and
(C) time of latency before the treatment, with 10 days of tumor development, and
after the treatment, with 18 days of tumor development. Treatments with RC-3095
and /or TMZ compared by rats untreated (N = 10 animals). * P < 0.05 was
considered significantly different from animals after treatment compared to those
animals before treatment.
Discussion
Treatment of primary central nervous system tumors includes surgery, radiation
and chemotherapy with single-agents such as temozolomide, BCNU or 1-(2-
chloroethyl)-3-cyclohexyl-L-nitrosourea combined with vincristine [4].
Unfortunately, combined modality therapy yields only 2% to 5% five-year
survival rates, and poor treatment response is considered to be a consequence of
intrinsic and/or acquired drug resistance. GRPR antagonist has already been
shown to be effective in vivo in inhibiting the growth of human U-87MG and U-
373MG glioma xenografted into athymic nude mice [16, 26]. In addition, we have
recently shown that RC-3095 inhibits the growth of C6 gioma cells in vitro [27].
Nevertheless, previous studies have not examined the effects of GRPR
antagonism in C6 rat glioma models in vivo, and relatively few studies have
evaluated the anti-proliferative effects of different concentrations of GRPR
antagonist in glioma C6 cells in vitro. Consequently, we decided to examine the
possible anti-proliferative effects of RC-3095 in C6 glioma models in vitro and in
vivo, and in combination with temozolomide in the same C6 models looking for
multimodal therapies.
42
We choose temozolomide to evaluate the potential of RC-3095 in adjuvant
therapy because it is commonly used to treat gliomas. We showed that the
combination effect of RC-3095 and temozolomide in vitro and in vivo models has
an important effect in tumor growth inhibition. In in vitro experiments, RC-3095
seems to be an interesting adjuvant for the glioma treatment with temozolomide,
since the combination of both drugs decreased cell proliferation and viability more
than the effect of these drugs when administered alone. A previous study [28]
demonstrated that different classes of epidermal growth factor receptor – EFGR -
inhibitors can have synergistic antitumor activity when combined with
temozolomide or cisplatin by a subsequent reactivation of MYC inducing
apoptosis in the surviving tumor cells. TNF-α converting enzyme – TACE -
undergoes a Src dependent phosphorylation by phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-
K) that regulates release of the EGFR ligand amphiregulin upon GRP treatment
[29].
We also found that addition of RC-3095 to temozolomide enhanced cell cycle
arrest and growth inhibition. Because RC-3095 is known to be an anti-angiogenic
agent blocking the tumor growth [30] and temozolomide causes DNA damage,
leading to apoptosis, RC-3095 may enhance the effect of temozolomide increasing
cell death by apoptosis. RC-3095 alone did not induced apoptosis, but when
administered in combination with temozolomide, apoptotic cell death was higher
than with temozolomide alone. Kanashiro and colleagues [31] found that another
antagonist of GRPR, RC-3940, diminished the relative ratio of Bcl-2:Bax by
around 70% indicating apoptotic gain.
To determine the potency of the GRPR antagonist, RC-3095, relative to
temozolomide, glioma cells were plated at clonal density, exposed to drug for 48
43
h, and cultured for up to two weeks. Colonies of more than 50 cells were counted,
and the surviving fraction was calculated relative to untreated cells. C6 glioma
cells showed an important level of sensitivity to both drugs and were more
sensitive when RC-3095 was combined to TMZ. GRPR antagonists induces cell
cycle arrest in glioma genic assays, which measure both cell death and growth
arrest, and therefore provide the most comprehensive indication of a drug’s impact
on the cell [30]. On the basis of these data, addiction of RC-3095 to TMZ can be
said to be 20 times more effective than dose drugs administered alone at inhibiting
colony formation of gliomas.
RC-3095 reduced C6 cell proliferation in vitro and also in vivo when
administered alone, but this reduction was increased when combined with TMZ.
Our results corroborate the data presented by Schally and colleagues [17 - 19]
which show a significant decrease in proliferation when RC-3095 was used to
treat U-87 and U-373 glioma cell cultures. This effect was reproduced in
xenograft C6 glioma model in which RC-3095 reduced tumor size compared to
untreated animals. Analysis of tumor histology showed an important reactional
gliosis in some treated animals with 1.0 mg/kg of RC-3095 and with RC-3095 in
combination with TMZ. This data indicates that GRPR antagonists may be
candidates for antitumoral agents in the treatment of glioblastomas.
A phase I trial of RC-3095 in patients with advanced solid tumors has been
recently carried out by Schwartsmann and colleagues [32], and larger trials are
now warranted. The findings that RC-3095 improves the TMZ treatment in C6 rat
glioma models can be used to design new approaches to treat glioma patients. It is
important to consider that RC-3095 is more effective in lower doses therefore
these findings from preclinical studies reporting different effects of low and high
44
doses of GRPR antagonist should be taken into account when establishing the
doses to be used in clinical trials.
In summary, using cultured C6 cells and the in vivo C6 glioma model, we
were able to show that the GRPR antagonist RC-3095 produces significant
inhibition of glioma growth, an effect potentiated by combination with TMZ.
These data supports the view that regimens based on GRPR antagonists plus TMZ
should be further investigated for the treatment of gliomas.
Acknowledgements
This research was supported by CNPq (grant 400839/2005-9); the South
American Office for Anticancer Drug Development (SOAD, Porto Alegre,
Brazil), and the Childrens Cancer Institute (ICI-RS, Porto Alegre, Brazil). Authors
thank Caroline B. Farias, Débora G. Flores and Gustavo K. Reolon for the
excellent technical assistance.
45
References
1. Kleihues P, Burger PC, Collins VP, Newcomb EW, Oghaki H, Cavanee WK.
(2000) Glioblastoma Tumours of the Nervous System: Pathology and Genetics.
Inter Agency for Res on Cancer Press 1: 29–98.
2. Stupp R, Mason WP, Van den Bent MJ, Weller M, Fischer B, Taphoom MJ,
Belanger AA, Marosi C, Bogdalun U, Curshmann J, Janzer RC, Ludwig SK, Gorlia
T, Lacombe D, Eisenhauser E, Mirimanoff RO. (2005) Radiotherapy plus
concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Méd 352: 987-
996.
3. John PF, Henry B, Steven B, Andrew L, Geoffrey B, Weidong H,Ricardo P. (2006)
In vitro drug response and molecular markers associated with drug resistance in
malignant gliomas. Clin Brain Res 4523-4532.
4. Rich Jn, Bigner DD. (2004) Development of novel targeted therapies in the
treatment of malignant gliomas. Nat Ver Drug Discov 3: 430-446.
5. Danson SJ, Middleton MR. (2001) Temozolomide: a novel oral alkylating agent.
Expert Rev Anticancer Ther 1: 13-9.
6. Payne MJ, Pratap SE, Middleton MR. (2005) Temozolamide in the treatment of
solid tumours: current results and rationale for dosing/scheduling. Critical Rev in
Oncol Hematol 53: 241-252.
7. Tentori L, Leonetti C and Aquino A. (1995) Temozolomide reduces the metastatic
potential of Lewis lung carcinoma (3LL) in mice: role of alpha-6 integrin
phosphorylation. Eur J Cancer 31A: 746-754.
8. Plowman J, Waud WR, Koutsoukos AD, Rubinstein LV, Moore TD, Grever MR.
(1994) Preclinical antitumor activity of temozolomide in mice: efficacy against
46
human brain tumor xenografts and synergism with 1,3-bis (2-chloroethyl)-1-
nitrosourea. Cancer Res 54: 3793-9.
9. Yung WK, Albright RE, Olson J, Fredericks R, Fink K, Prados MD. (2000) A phase
II study of temozolomide vs. Procarbazine in patients with glioblastoma multiforme
at first relapse. Br J Cancer 83: 588-593.
10. Mulholland PJ, Thirlwell C, Brock CS, Newlands ES. (2005) Emerging targeted
treatments for malignant glioma. Expert Opin Emerg Drugs 10: 845-854.
11. Sanson M, Thillet J, Hoang-Xuan K. (2004) Molecular changes in gliomas. Curr
Opin Oncol 16: 607-613.
12. Patel O, Shulkes A, Baldwin GS. (2006) Gastrin-releasing peptide and cancer.
Biochim Biophys Acta 1766: 23-41.
13. Cornelio D, Roesler R, Schwartsmann G. (2007) Gastrin-releasing peptide receptor
as a molecular target in experimental anticancer therapy. Ann Oncol 18: 1457-66.
14. Moody TW, Mahmoud S, Staley J, Naldini L, Cirillo D, South V, Felder S, Kris R
(1989) Human glioblastoma cell lines have neuropeptide receptors for
bombesin/gastrin-releasing peptide. J Mol Neurosci 1: 235-242.
15. Staley J, Coy DH, Jensen RT, Moody TW. (1993) Solubilization and purification of
bombesin/gastrin releasing peptide receptors from human cell lines. J Mol Neurosci
4: 29-40.
16. Pinski J, Schally AV, Halmos G, Szepeshazi K, Groot K. (1994) Somatostatin
analogues and bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 inhibit the
growth of human glioblastomas in vitro and in vivo. Cancer Res 54: 5895-5901.
17. Zhou J, Chen J, Mokotoff M, Ball ED. (2004) Targeting gastrin-releasing peptide
receptors for cancer treatment. Antican Drugs 15: 921-927.
47
18. Radulovic S, Cai RZ, Serfozo P, Groot K, Redding TW, Pinski J, Schally AV.
(1991) Biological effects and receptor binding affinities of new pseudononapeptide
bombesin/GRP receptor antagonists with N-terminal D-Trp or D-Tpi. Int J Pept
Protein Res 38: 593-600.
19. Szepeshazi K, Schally AV, Halmos G, Lamharzi N, Groot K, Horvath JE. (1997) A
single in vivo administration of bombesin antagonist RC-3095 reduces the levels
and mRNA expression of epidermal growth factor receptors in MXT mouse
mammary cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 10913-10918.
20. Ural AU, Yilmaz MI, Avcu F, Pekel A, Zerman M, Nevruz O, Sengul A, Yalcin A.
(2003) The bisphosphonate zoledronic acid induces cytotoxicity in human myeloma
cell lines with enhancing effects of dexamethasone and thalidomide. Int J Hematol,
78: 443-449.
21. Peluso JJ, Pappalardo A, Fernandez G. (2001) Basic fibroblast growth factor
maintains calcium homeostasis and granulose cell viability by stimulating calcium
efflux via a PKC d-dependent pathway. Endocrinology 142: 4203–4211.
22. Petersen C, Petersen S, Milas L, Lang FF and Tofilon PJ. (2000) Enhancement of
intrinsic tumor cell radiosensitivity induced by a selective cyclooxygenase-2
inhibitor. Clin Cancer Res 6: 2513-2520.
23. Takano T, Lin JHC, Arcuino G, Gao Q, Yang J, Nedergaard M. (2001) Glutamate
release promotes growth of malignant gliomas. Nature Med 7: 1010-1015.
24. Patel VJ, Elion GB, Houghton PJ, Keir S, Pegg AE, Johnson SP, Dolan ME, Bigner
DD, Friedman HS. (2000) Schedule-dependent activity of temozolomide plus CPT-
11 against a human central nervous system tumor-derived xenograft. Clin Cancer
Res 6: 4154-4157.
48
25. Bouwknecht JA, Spiga F, Staub DR, Hale MW, Shekhar A, Lowry C. (2007)
Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on anxiety-
related behavior; relationship to c-FOS expression on serotonergic and non-
serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Res Bull 72: 32-43.
26. Kiaris H, Schally AV, Sun B, Armatis P, Groot K. (1999) Inhibition of growth of
human malignant glioblastoma in nude mice by antagonists of bombesin/gastrin-
releasing peptide. Oncog 18: 7168-7173.
27. Flores DG, Leites J, Farias CB, Oliveira MS, Lima RC, Tamajusuku ASK, DiLeone
LP, Meurer L, Brunetto AL, Schwartsmann G, Lenz G, Roesler R. (2008) Gastrin-
Releasing Peptide Receptors Regulate Proliferation of C6 Glioma Cells through a
Phosphatidylinositol 3-Kinase-Dependent Mechanism. Curr Neurovasc Res in
press.
28. Angela AV, Rushika MP, Achim AJ, Elisabeth S, Lloyd JO, Terrance GJ, Rodney
BL, Carmel M, Francesca W, Janet W, Edouard CN, Antony WB, Andrew MS.
(2003) Antitumor efficacy of cytotoxic drugs and the monoclonal antibody 806 is
enhanced by the EGF receptor inhibitor AG1478. PNAS 100: 15871-15876.
29. Qing Z, Sufi MT, Vivian WaiYanLui, Sichuan X, Jill MS, Huizhou F, Thomas ES,
Gordon BM, Jennifer RG. (2006) Phosphorylation of TNF-α converting enzyme by
gastrin-releasing peptide induces amphiregulin release and EGF receptor activation.
PNAS 103: 6901-6906.
30. Lefranc F, Mijatovic T, Mathieu V, Rorive S, Decaesthercke C, Debeir O, Brothji J,
Van Ham P, Salmon I, Kiss R. (2004) Characterization of Gastrin-Induced
proangiogenic effects in vivo in orthotopic U373 experimental human glioblastomas
and in vitro in human umbilical vein endothelial cells. Clin Cancer Res 10: 8250-
8265.
49
31. Kanashiro CA, Schally AV, Cai RZ, Halmos G. (2005) Antagonists of
bombesin/gastrin-releasing peptide decrease the expression of angiogenic and anti-
apoptotic factors in human glioblastoma. Anticancer drugs 16: 159-165.
32. Schwartsmann G, DiLeone LP, Horowitz M, Schunemann D, Cancella A, Pereira
AS, Richter M, Souza F, da Rocha AB, Souza FH, Pohlmann P, De Nucci G. (2006)
A phase I trial of the bombesin/gastrin-releasing peptide (BN/GRP) antagonist
RC3095 in patients with advanced solid malignancies. Invest New Drugs 24: 403-
412.
50
Discussão
Apesar dos tratamentos agressivos como neuro ressecção cirúrgica tumoral,
radioterapia e quimioterapia com diferentes agentes antitumorais, o prognóstico
de glioma ainda é muito precário sendo o tempo médio de sobrevida dos pacientes
com esta enfermidade de aproximadamente 12 meses. Isso se deve à alta
invasividade e resistência apresentada por esses tumores [Prados et al, 2000;
Kleihues et al, 2000; Stupp et al, 2005]. TMZ, um agente alquilante de DNA, é
comumente aplicado clinicamente a pacientes com gliomas por suas
características lipofílicas, tendo uma alta disponibilidade na região encefálica, e
por sua baixa toxicidade [Newlands et al, 1997; Friedman et al, 2000]. Porém,
após certo tempo de tratamento, gliomas acabam adquirindo resistência a TMZ
por expressarem uma enzima denominada O6-methylguanin methyltransferase
(MGMT) que tem como função o reparo do dano no DNA causado pela TMZ.
Estudos mostraram [Craincross et al, 2007] que a regulação da expressão de
MGMT ocorre via p53 monstrando a importância de se verificar as vias
regulatórias envolvidas no crescimento tumoral e na ativação dos possíveis
tratamentos.
Antagonistas do GRPR já demonstraram ser efetivos na inibição de muitos
tipos tumorais [Zhou et al, 2004; Mulholland et al, 2005] . Shally e colaboradores
[Radulovik et al, 1991; Pinski et al, 1994] desenvolveram o RC-3095, antagonista
seletivo dos receptores de GRP, e verificaram sua atividade na inibição do
crescimento tumoral nas linhagens celulares U-87 e U-373 in vitro e em
camundongos atímicos. Recentemente nosso grupo demonstrou que há uma super
expressão do GRPR na linhagem de glioma C6 e a redução da proliferação celular
51
desta linhagem quando adicionado RC-3095 à cultura celular [Flores et al, 2008].
Porém, não há nenhum estudo que demonstre a atividade de antagonistas do
receptor de GRP em modelos in vivo de glioma C6. Também não foi encontrado
nenhum trabalho que avalie a combinação do RC-3095 com outros agentes
antitumorais. Conseqüentemente decidimos avaliar o efeito anti-proliferativo do
RC-3095 em modelos experimentais C6 de glioma de rato e em combinação com
TMZ visando terapias multimodais.
Em geral, os agentes quimioterápicos são divididos em agentes citostáticos
e citotóxicos. Agentes citotóxicos resultam em morte celular via mecanismos que
incluem a alquilacção de DNA, cross-linking de DNA e quebra dos padrões de
DNA. Já os agentes citostáticos alteram a biologia celular tumoral por inibir o
crescimento, a invasão e a angiogênese tumoral ou ambas as ações, mas eles não
causam morte tumoral diretamente [Parney et al, 2003]. Assim, a combinação de
agentes citostáticos, como o RC-3095, a agentes citotóxicos, como a TMZ,
aparece como uma opção antitumoral eficaz, como no tratamento de gliomas.
Demonstramos que RC-3095 reduziu efetivamente a proliferação celular da
linhagem C6 in vitro, porém, quando associado à temozolamida, a redução da
proliferação foi significativamente maior em relação à proliferação de células
tumorais com somente 10% de FCS sem tratamento, assim como, em relação aos
agentes como monoterapias. O efeito anti-proliferativo desta combinação foi
verificado por contagem celular com exclusão por tripan blue e confirmada em
uma relação maior de doses destes agentes antitumorais em ensaios de MTT.
Após, verificamos o efeito do tratamento com RC-3095 e/ou TMZ
prolongado in vitro na linhagem celular de glioma C6. Foram realizados
experimentos de clonogenic que demonstraram a sobrevida celular após o
52
tratamento com agentes antitumorais. Tanto o RC-3095 como a temozolamida
foram altamente efetivos diminuindo a formação de colônias após tempo
prolongado de tratamento em relação às células sem tratamento algum, apenas
com 10% FCS. Já o tratamento com RC-3095 em associação a temozolamida foi
significativamente mais efetivos na redução de formação de colônias celulares em
relação ao tratamento com os agentes como monoterapias.
Além da redução da proliferação in vitro da linhagem celular C6,
demonstramos que o RC-3095 reduziu efetivamente o volume tumoral em
modelos de glioma C6 de ratos Wistar tendo uma redução em média de 50% do
volume tumoral comparado com animais que não receberam tratamento algum.
Quando foi administrado RC-3095 em associação à TMZ, a redução do volume
tumoral foi em média de 70% maior em relação aos animais não tratados,
demonstrando ser um tratamento mais efetivo que os agentes como monoterapia.
Isso é também demonstrado pelos parâmetros histológicos apresentados pela
coloração de HE nos tecidos tumorais dos animais. Todos os animais que não
receberam tratamento apresentaram necrose coagulativa e os maiores índices de
hemorragia intratumoral, e alto índice mitótico também foi apresentado por este
grupo de animais. Importante observar que alguns dos animais tratados com RC-
3095 em combinação com TMZ apresentaram somente gliose reacional, não
havendo indícios de proliferação tumoral após o tratamento. Estes resultados
indicam que antagonistas do receptor GRP, como o RC-3095, são fortes
candidatos como adjuvantes à TMZ no tratamento de glioblastomas multiformes.
Realizamos experimentos de campo aberto (open field) que é um paradigma
bem aceito para verificar aspectos gerais de comportamento locomotor e
exploratório como também a ansiedade de modelos animais. Este paradigma
53
baseia-se em um conflito entre um comportamento do animal para explorar um
novo ambiente (com base no potencial de ganho de resultados) versus um
comportamento do animal para evitar um novo ambiente (com base no potencial
de resultados aversivos) [Bouwknecht et al, 2007]. Para demonstrar como tal
comportamento pode ser afetado pelo tumor e com o tratamento com RC-3095 e
TMZ, ratos que receberam o enxerto tumoral foram expostos ao campo aberto
antes e após o tratamento, apresentando um tumor de dez dias de
desenvolvimento no primeiro experimento antes do início dos tratamentos. Foi
avaliado o número de crossings – que corresponde à quantidade de vezes que os
animais cruzavam os quadrantes - e o número de rearings – comportamento
exploratório executado pelos animais caracterizado pelo posicionamento nas duas
patas traseiras – assim como o tempo que os animais demoravam a sair da posição
inicial e se direcionar a outro quadrante entre o grupo de animais que receberam
tratamento com RC-3095 e em combinação com TMZ, e o grupo de animais que
não receberam tratamento. Com o desenvolvimento tumoral, o grupo de animais
que não recebeu tratamento apresentou um déficit no número de crossings e
rearings, assim como um tempo maior de latência demonstrando uma maior
apatia e défict locomotor. Já os animais que receberam RC-3095 em doses
maiores e em combinação à TMZ apresentaram o mesmo padrão de
comportamento antes e após o tratamento. Porém, quando TMZ foi administrada
como monoterapia, os animais demonstraram um padrão de comportamento
apático semelhante aos animais que não receberam tratamento algum. Assim, o
RC-3095 parece reverter o padrão de comportamento motor associado ao
desenvolvimento do glioma e ao tratamento com TMZ sendo opção como
adjuvante em terapias antitumorais por amenizar aspectos comportamentais.
54
Um estudo clínico de fase I do RC-3095 em pacientes com tumores
avançados foi recentemente desenvolvido pelo Dr. Gilberto Schwartzmann e
colegas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre [Schwartzmann et al, 2006]
obtendo bons resultados no tratamento tumoral destes pacientes sendo necessário
um estudo em maior escala. Os resultados obtidos neste trabalho indicando que
RC-3095 melhora o tratamento com TMZ em modelos da linhagem C6 de glioma
de ratos podem ser utilizados para conceber novas abordagens para o tratamento
de pacientes com gliomas. Sendo importante considerar que o RC-3095 apresenta
efeitos eficazes em doses mais baixas, portanto, esses achados de estudos pré-
clínicos que reportam diferentes efeitos de baixas e altas doses de antagonistas de
GRPR são de grande importância para se estabelecer as doses que serão utilizadas
em pacientes em estudos clínicos.
Visando analisar uma possível ação sinergística do RC-3095 em relação à
TMZ dada a importante supressão tumoral in vitro e in vivo, realizamos
experimentos de citometria de fluxo com células C6 marcadas tanto com iodeto
propídico como com YO-PRO-1, que analisam a morte celular e células
apoptóticas, respectivamente. Nossos dados mostram que o RC-3095
praticamente não induziu morte celular nesta linhagem em 48 horas de
tratamento. Já a temozolamida induziu alguma morte via apoptose em células da
linhagem C6 em doses mais altas. O tratamento combinado de RC-3095 e TMZ
foi altamente significativo na indução de morte celular, estando quase 90% das
células da linhagem C6 mortas provavelmente por apoptose em 48 horas de
tratamento. Este efeito deve-se possivelmente pela inibição dos antagonistas do
GRP na via de sinalização celular da PKC/PI3K/ERK, inibindo assim a expressão
dos genes c-MyC e c-FOS.
55
Estudos prévios [Angela et al, 2003] demonstraram que diferentes classes
de inibidores dos receptores do fator de crescimento epidérmico – EGFR –
possuem uma atividade sinergística antitumoral quando combiandos à TMZ ou
cisplatina por subseqüente reativação de c-MyC induzindo apoptose nas células
tumorais sobreviventes. Já foi demonstrado que o GRP e EGF atuam na
fosforilação dos mesmos subtratos, sendo o RC-3095 um antagonista seletivo do
GRP, pois atua regulando negativamente os receptores de EGF [Liebow et al,
1994]. A enzima conversora de TNF-α - TACE – é fosforilada pela
fosfatidilinositol 3 kinase (PI3K), que regula a liberação do ligante anfiregulador
de EGFR mediante ativação pelo GRP [Qing et al, 2006].
Defeitos no mecanismo de apoptose resultam não somente em
tumorigênese, mas também no aumento da resistência aos tratamentos
antitumorais. A resistência inerente de células tumorais à radioterapia e
quimioterapia ocorre por alterações genômicas em nível transcricional e pós-
transcricional de proteínas e seus fatores de transcrição. A cascata de sinalização
PI3K/AKT/ERK tem um papel importante na transmissão de sinais de receptores
de fatores de crescimento que regulam a expressão gênica e previnem apoptose.
Esses receptores aparecem super ativados em tumores, estando esta via
conseqüentemente também super ativada. Uma ativação aberrante desta cascata
de sinalização promove aos tumores resistência a estímulos citotóxicos como os
induzidos por agentes pro-apoptóticos. Assim, um possível mecanismo
sinergístico de antagonistas do receptor de GRP e agentes citotóxicos se explica
pela diminuição da ativação da cascata de sinalização PI3K/AKT/ERK devido à
inibição da ativação do GRPR diminuindo assim a transcrição de c-Myc e c-Fos,
56
reduzindo a resistência tumoral à ação da TMZ, a qual terá uma maior
potencialização de alquilação do DNA, induzindo à apoptose.
Mecanismo proposto de sinergismo entre RC-3095 e TMZ.
57
Conclusões
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de TMZ
com antagonistas do receptor GRP deve ser avaliada como possível alternativa
terapêutica para o tratamento de gliomas. A combinação destes agentes
antitumorais apresentou um efeito antiproliferativo importante in vitro e in vivo
em modelos de glioma C6 em relação aos agentes administrados como
monoterapias. Sendo também este o primeiro trabalho que mostrou o efeito
significativo na redução tumoral em modelos in vivo de gliomas C6, auxiliando na
definição de doses para futuros ensaios clínicos em pacientes com gliomas.
Porém, ainda são necessários estudos que avaliem a interação molecular destes
dois agentes, se há realmente um sinergismo na indução de vias apoptóticos e/ou
autofágicas, como também uma supressão de vias relacionadas à proliferação
celular.
58
Anexo I
Experimento de sobrevida in vivo no modelo de glioma C6 em ratos
tratados com RC-3095 e TMZ
Células confluentes da linhagem celular C6 de glioma foram inoculadas por
cirurgia esterotáxica em ratos Wistar machos adultos. Aproximadamente um
milhão de células foram injetadas a uma profundidade de 6.0 mm no estriado
direito dos animais anestesiados (coordenadas em relação ao bregma de 0.5 mm
posterior e 3.0 mm lateral) [Takano et al, 2001]. Após 90 dias de monitoramento
para a sobrevida, os animais foram eutanasiados por guilhotina e seus cérebros
eram removidos, seccionados e fixados com 10% de paraformaldeído para
coloração com HE. A sobrevida dos animais foi comparada entre os diferentes
tratamentos utilizando teste de log-rank. A sobrevida estimada é demonstrada em
uma curva de Kaplan-Meier [Saito et al, 2004].
Dez dias após a implantação tumoral, os animais eram tratados com 5.0
mg/kg de TMZ via intraperitoneal uma vez ao dia, 0.1, 0.3 ou 1.0 mg/kg de RC-
3095 via intraperitoneal duas vezes ao dia ou DMSO como grupo controle durante
sete dias consecutivos. Os agentes antitumorais foram dissolvidos em DMSO na
concentração final de 10%.
59
Resultado
Os animais que não receberam tratamento, somente DMSO via
intraperitoneal, e os animais tratados com TMZ apresentaram o menor tempo de
sobrevida apresentando uma sobrevida média de 30 dias. Os animais que
receberam o tratamento combinado de RC-3095 e TMZ apresentaram um tempo
de sobrevida um pouco maior, tendo em média 40 dias de sobrevida. O grupo que
recebeu RC-3095 na dose de 1.0 mg/kg apresentou uma sobrevida prolongada
com 100% (5 dos 5 ratos do grupo) dos animais que receberam este tratamento
vivos no tempo de corte do experimento – 90 dias. Este dado demonstra que
possivelmente o RC-3095 apresenta um efeito importante na sobrevida dos
animais. Porem, já como nem todos animais do grupo controle, os quais não
receberam tratamento, haviam falecido até o tempo de corte de 90 dias, o ideal é
que o experimento seja realizado novamente com um número maior de animais
por grupo para evitar que os animais que sofreram a cirurgia, mas não
desenvolveram tumor, sejam excluídos sem afetar a significância do experimento.
60
Fig. Anexo 1.
Fig. Anexo 1. Relação do tempo de sobrevida entre os animais tratados com
RC-3095 e/ou TMZ e os animais que não receberam tratamento (N= 5).
61
Referencias Bibliográficas
Angela AV, Rushika MP, Achim AJ, Elisabeth S, Lloyd JO, Terrance GJ, Rodney
BL, Carmel M, Francesca W, Janet W, Edouard CN, Antony WB, Andrew
MS (2003) Antitumor efficacy of cytotoxic drugs and the monoclonal
antibody 806 is enhanced by the EGF receptor inhibitor AG1478. Proc Natl
Acad Sci USA 100: 15871-15876.
Bouwknecht JA, Spiga F, Staub DR, Hale MW, Shekhar A, Lowry C (2007)
Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on
anxiety-related behavior; relationship to c-FOS expression on serotonergic
and non-serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Res Bull 72:
32-43.
Bunnet N, Walsh JH, Dockray GJ (1994) Gastrin releasing peptide: Biochemistry
and Physiology. Raven Press 1: 423-445.
D’Atri S, Piccioni D, Castellano A, Tuorto V, Franchi A, Lu K, Christiansen N,
Frankel S, Rustum YM and Papa G (1995) Chemosensitivity to triazene
compounds and O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase levels: studies with
blasts of leukaemic patients. Ann Oncol 6: 389–393
Dal Pizzol F, Di Leone LP, Ritter C, Roesler R (2006) Gastrin-releasing peptide
receptor antagonist effects on na animal modelo of sepsis. Am J Pespir Crit
Care Méd 1: 84-90.
62
Farias CB, Lima RC, Lima LO, Flores DG, Meurer L, Brunetto AL,
Schwartsmann G, Roesler R (2008) Stimulation of proliferation of U138-MG
glioblastoma cells by gastrin-releasing peptide in combination with agents
that enhance cAMP signaling. Oncology, in press.
Flores DG, Farias CB, Leites J, Oliveira MS, Lima RC, Tamajusuku ASK,
Dileone LP, Meurer L, Brunetto AL, Schwartsmann G, Lenz G, Roesler R
(2008) Gastrin-releasing peptide receptors regulate proliferation of C6
glioma cells through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism.
Curr Neurovasc Res 5: 99-105.
Friedman HS, Kerby T and Calvert H (2000) Temozolomide and treatment of
malignant glioma. Clin Cancer Res. 6: 2585–2597
Grobben B, De Deyn PP, Slegers H (2002) Rat C6 glioma as experimental model
system for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell Tissue Res
310: 257-70
Gutkind JS and Dorsam RT (2007) G-protein-coupled receptors and cancer.
Cancer Nature Reviews 7: 79-94.
Hau P, Kunz-Schughart L, Bogdahn U, Baumgart U, Hirschmann B, Weimann E,
Muhleisen H, Ruemmele P, Steinbrecher A, Reichle A (2008) Low-dose
chemotherapy in combination with COX-2 inhibitors and PPAR-gamma
63
agonists in recurrent high-grade gliomas - a phase II study. Oncology 73: 21-
25.
Holland EC (2001) Gliomagenesis: genetic alterations and mouse models. Nature
2: 120-129.
John PF, Henry B, Steven B, Andrew L, Geoffrey B, Weidong H, Ricardo P
(2006) In vitro drug response and molecular markers associated with drug
resistance in malignant gliomas. Clin Brain Res 4523-4532.
Kang SG, Kim JS, Park K, Kim JS, Groves MD, Nam DH (2006) Combination
celecoxib and temozolomide in C6 rat glioma orthotopic model. Oncol Rep
15: 7-13.
Kleihues P, Sobin LH (2000) World Health Organization classification of
tumors. Cancer 88: 2887.
Liebow C, Crean DH, Lee MT, Kamer AR, Mang TS, Schally AV (1994)
Synergistic effects of bombesin and epidermal growth factor on cancers. Proc
Natd Acad Sci USA 91: 3804-3808.
Mulholland PJ, Thirlwell C, Brock CS, Newlands ES (2005) Emerging targeted
treatments for malignant glioma. Expert Opin Emerg Drugs 10: 845-854.
64
Newlands ES, Stevens MF, Wedge SR, Wheelhouse RT and Brock C (1997)
Temozolomide: a review of its discovery, chemical properties, pre-clinical
development and clinical trials. Cancer Treat Rev 23: 35–61
Parney IF, Chang SM (2003) Current chemotherapy for glioblastoma. Cancer J 9:
149- 156.
Pinski J, Schally AV, Halmos G, Szepeshazi K, Groot K (1994) Somatostatin
analogues and bombesin/gastrin-releasing peptide antagonist RC-3095 inhibit
the growth of human glioblastomas in vitro and in vivo. Cancer Res 54:
5895-5901.
Prados, MD, Levin V (2000) Biology and treatment of malignant glioma. Semin
Oncol 27: 1-10.
Qing Z, Sufi MT, Vivian WaiYanLui, Sichuan X, Jill MS, Huizhou F, Thomas
ES, Gordon BM, Jennifer RG (2006) Phosphorylation of TNF-{alpha}
converting enzyme by gastrin-releasing peptide induces amphiregulin release
and EGF receptor activation. Proc Natl Acad Sci USA 103: 6901-6906.
Radulovic S, Cai RZ, Serfozo P, Groot K, Redding TW, Pinski J, Schally AV
(1991) Biological effects and receptor binding affinities of new
pseudononapeptide bombesin/GRP receptor antagonists with N-terminal D-
Trp or D-Tpi. Int J Pept Protein Res 38: 593-600.
65
Rich JN, Bigner DD (2004) Development of novel targeted therapies in the
treatment of malignant gliomas. Nat Ver Drug Discov 3: 430-446.
Roesler R, Henriques JA Schwartsmann G (2004) Neuropeptides and axiety
disorders: bombesin receptors as novel therapeutic targets. Trends Pharmacol
Sci 25: 241-243.
Roesler R, Luft T, Oliveira SH (2006) Molecular mechanisms mediating gastrin-
release peptide receptor modulation of memory consolidation in the
hippocampus. Neuropharmacology 51: 350-357.
Roesler R, Henriques JA, Schwartsmann G (2006) Gastrin-releasing peptide
receptors as a molecular target for psychiatric and neurological disorders.
CNS Neurol Disord Drug Targets 5: 197-204.
Saito R, Bringas JR, Panner A, Tamas M, Pieper RO, Berger MS, Bankiewicz K
(2004) Convection-enhanced delivery of tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand with systemic administration of Temozolomide
prolongs survival in an intracranial glioblastoma xenograft model. Cancer
Res 64: 6858–6862.
Schwartsmann G, DiLeone LP, Horowitz M, Schunemann D, Cancella A, Pereira
AS, Richter M, Souza F, da Rocha AB, Souza FH, Pohlmann P, De Nucci G
(2006) A phase I trial of the bombesin/gastrin-releasing peptide (BN/GRP)
66
antagonist RC-3095 in patients with advanced solid malignancies. Invest
New Drugs 24: 403-412.
Schwartzbaum, JA, Fisher, JL, Aldape, KD, Wrensch, M (2006) Epidemiology
and molecular pathology of glioma. Nat Clin Pract Neurol 2: 494-503.
Stupp R, Mason WP, Van den Bent MJ, Weller M, Fischer B, Taphoom MJ,
Belanger AA, Marosi C, Bogdalun U, Curshmann J, Janzer RC, Ludwig SK,
Gorlia T, Lacombe D, Eisenhauser E, Mirimanoff RO (2005) Radiotherapy
plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med
352: 987-996.
Sunday M, Kaplan L, Motoyama E (1988) Biology of disease: gastrin-release
peptide (mammalian bombesin) gene expression in health and disease. Lab
Invest 59: 5-24.
Szepeshazi K, Schally AV, Halmos G, Lamharzi N, Groot K, Horvath JE (1997)
A single in vivo administration of bombesin antagonist RC-3095 reduces the
levels and mRNA expression of epidermal growth factor receptors in MXT
mouse mammary cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 10913-10918.
Yung WK, Albright RE, Olson J, Fredericks R, Fink K, Prados MD (2000) A
phase II study of temozolomide vs. Procarbazine in patients with
glioblastoma multiforme at first relapse. Br J Cancer 83: 588-593.
67
Zhou J, Chen J, Mokotoff M, Ball ED (2004) Targeting gastrin-releasing peptide
receptors for cancer treatment. Antican Drugs 15: 921-927.
Zhou Q, Guo P, Gallo JM (2008) Impact of angiogenesis inhibition by sunitinib
on tumor distribution of temozolomide. Clin Cancer Res 1: 1540-1549.
68
CURRICULUM VITAE
OLIVEIRA, MS.
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Marianne Schrader de Oliveira
Local e data de nascimento: Porto Alegre, Rio Grande do Sul (RS), Brasil
17/08/1982
Endereço profissional: Rua Ramiro Barcelos, 2350, 90035-003, Porto Alegre, RS,
Brasil.
Telefone profissional: 51 – 21017616 E-mail: mari_oli_@hotmail.com
2. FORMAÇÃO
Curso de graduação: Farmácia com ênfase em Bioquímica
Instituição: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul - PUCRS
Período: 2000 a 2004
Curso de Mestrado: Biologia Molecular e Celular
Instituição: Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS
Período: 2006 a 2008
69
3. ESTÁGIOS
- Estágio com bolsa do CIEE no laboratório de Diagnóstico Molecular e Celular
Amplicon orientada pelo Dr. Luciano Krug no período do primeiro semestre de 2002;
- Estágio voluntário no laboratório de Análises Clínicas Netlab na área de
Hematologia orientada pelo Dr. Cláudio Prestes de Oliveira durante o período do
segundo semestre de 2002;
- Estágio curricular no laboratório de Análises Clínicas da Policlínica Militar nas
áreas de Microbiologia, Bioquímica, Hematologia, Imunologia e Uroanálise durante o
primeiro semestre de 2004;
4. INICIAÇÃO EM PESQUISA
- Iniciação científica no laboratório de Bioquímica Vegetal do Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS – sob
orientação da Profa. Dra. Magdolna Maria Vozari Hampe [purificação de proteínas]
no período de jan/fev de 2002;
- Bolsa de iniciação científica no Laboratório de Imunogenética do Departamento de
Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS – sob orientação
da Profa. Dra. Nance Beyer Nardi [terapia gênica e cultura de células- tronco] durante
o ano de 2003;
70
- Apresentação do trabalho "Nonviral in vivo gene transfer in the
mucopolysaccharidosis I murine model" no Salão de Iniciação Científica orientada
pela Dra. Melissa Camassola em setembro de 2003;
- Iniciação Científica em Bioquímica Clínica orientada pela Profa. Dra. Cleide
Gonçalves da Silva [dosagens bioquímicas] durante o primeiro semestre de 2004;
- Iniciação Científica no laboratório de Mutagênese orientada pela Profa. Dra. Jenifer
Saffi [reparo de DNA e citotoxicade celular] no segundo semestre de 2004;
5. EXPERIÊNCIA PROFISSIONAL ANTERIOR
- Experiência profissional em Clínica para Deficientes Físicos e Mentais no Instituto
St. Joseph Stifft, Würzburg, Alemanha durante o ano de 2005;
- Farmacêutica Bioquímica responsável pelo setor de Microbiologia e Micologia no
Laboratório Endocrimeta desde 2006;
- Farmacêutica Bioquímica plantonista nas áreas de Bioquímica, Hematologia e
Imunologia no laboratório Endocrimenta desde 2006 até o presente momento.
71
6. ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS
Flores DG, Farias CB, Leites J, Oliveira MS, Lima RC, Tamajusuku AS, Meurer L,
Brunetto AL, Schwartsmann G, Lenz G, Roesler R. “Gastrin-Releasing Peptide
Receptors Regulate Proliferation of C6 Glioma Cells through a
Phosphatidylinositol 3-Kinase-Dependent Mechanism.” Current Neurovascular
Research, 2008 5: 99-105.
Oliveira MS, Cechim G, Braganhol E, Santos DG, Battastini AMO, Meurer L, Castro
CC, Brunetto AL, Schwartsmann G, Lenz G, Roesler R. “Anti-proliferative effect
of gastrin-release peptide receptor antagonist, RC-3095, combined with
temozolomide in experimental glioblastoma models.” Journal of Neuro-
oncology, submitted – 2008.
7. CURSOS REALIZADOS
- Curso de Verão no Interdisziplinäres Zentrum für Infektionsbiologie und Immunität,
Berlin, Alemanha ["ZIBI - International Summer School on Pathogen- Host
Interplay”] em julho – agosto de 2007.
8. RESUMOS E TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
CECHIM, G.; SCHRADER, M. O. ; BRAGANHOL, E. Estudo da Eficácia das Drogas
Temozolamida e RC-3095 em Modelos de Gliomas in vitro e in vivo. In: XIX Salão
72
de Iniciação Científica, 2007, POA. Caderno de Resumos do XIX Salão de Iniciação
Científica. POA: Editora da Universidade - Gráfica UFRGS, 2007.
CECHIM, G. ; OLIVEIRA, M. S. ; BRAGANHOL, E . Combination of Temozolomide
and RC-3095 in in vivo models for gliomas' treatment. In: 39 Congresso Brasileiro
de Farmacologia Terapêutica Experimental, 2007, Ribeirão Preto. www.sbfte.org.br,
2007. v. 2007. p. 35-35.
CECHIM, G.; SCHRADER, M. O.; BRAGANHOL, E. Combination of Temozolomide
and the Gastrin-Release Peptide Receptor Antagonist, RC-3095, Reduces Glioma
Gorwth in Rats. In: VIII São Paulo Research Conferences - Câncer: da Biologia
Molecular ao Tratamento, 2007, São Paulo.
http://appliedcr.org/ojsystem/index.php/appliedcr/issue/current, 2007.
CECHIM, G.; OLIVEIRA, M. S.; BRAGANHOL, E. Combinação de Temozolamida e
RC-3095 em Modelos in vivo para Tratamento de Gliomas. In: XVIII Salão de
Iniciação Científica, 2006, Porto Alegre. Caderno de Resumos do XVIII Salão de
Iniciação Científica. Porto Alegre: Editora da Universidade - Gráfica UFRGS, 2006.
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