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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
IARA TERSIA FREITAS MACEDO
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE
Eucalyptus spp SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS
FORTALEZA-CE
2008
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1
IARA TERSIA FREITAS MACEDO
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA
DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE Eucalyptus spp
SOBRE NEMATÓIDES GASTRINTESTINAIS
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de mestre em
Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos
ruminantes.
Orientador (a): Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
FORTALEZA-CE
2008
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2
3
A
Aos meus pais,
Antônio Albuquerque de Macedo e
Adeilza Freitas de Carvalho;
À Deus
Dedico.
4
AGRADECIMENTOS
À Deus por sua grande misericórdia me guiando e dando forças em mais esta etapa
da minha vida.
À CAPES pelo apoio financeiro durante estes dois anos de trabalho.
À EMPRAPA/ Caprinos que gentilmente cedeu às instalações fundamentais para
realização deste trabalho.
Á professora Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua por ter me ensinado e acompanhado
durante todo esse período, pelo incentivo, paciência e acima de tudo, amizade e orientação.
Ao Dr. Luiz Vieira pelos ensinamentos e ajuda para a realização do projeto.
Aos professores Dra. Adriana da Rocha Tomé e Dr. Nilberto Robson Falcão do
Nascimento pela ajuda e colaboração que foram importantes para a concretização deste
trabalho.
À Dra. Ana Carolina Fonseca Lindoso Melo pela colaboração na defesa da
dissertação.
À todos os meus companheiros do Laboratório de Doenças Parasitárias - PPGCV,
que contribuiram para realização deste projeto e estiveram ao meu lado durante este
período, Maria Vivina Barros Monteiro, Michelline do Vale Maciel, Fernanda Cristina
Macedo Rondon, Rafaella Albuquerque e Silva, Marina Parissi Accioly, Vitor Luz
Carvalho, Aline Araguão, Ana Carolina Moura Rodrigues, Camila de Albuquerque
Almeida. Em especial, Ana Lourdes Camurça Fernandes Vasconcelos, Cícero Temístocles
Coutinho Costa, Roberta da Rocha Braga, Fabrício Rebouças de Oliveira, Eudson Maia de
Queiroz Júnior, Renata Simões Barros, Bruno Granjeiro Portela, cuja ajuda foi de
fundamental importância para a realização desse trabalho.
5
Às minhas amigas Lorena Mayana Beserra de Oliveira e Sthenia Santos Albano
Amóra, pela amizade, companheirismo e principalmente paciência, me ajudando em todos
os momentos do trabalho, contribuindo para o meu crescimento profissional e pessoal.
Aos estagiários e funcionários do Laboratório de Parasitologia da
EMBRAPA/Caprinos pela atenção e colaboração, especialmente a Helena Araújo da Ponte
e Felipe Cavalcante Machado.
À Adriana Maria Sales Albuquerque e Ana Cristina Sabóia Nascimento, secretárias
do PPGCV, que em muito me ajudaram durante todo o mestrado.
À minha família que sempre me apoiou, principalmente nos momentos difíceis da
realização deste trabalho, em especial a meu pai e minha mãe, exemplo de dedicação;
Aos meus irmãos, pelo companheirismo e pela amizade que nos une.
Ao meu namorado, pelo amor ,carinho e compreensão.
E por fim, as demais pessoas que não foram aqui mencionadas, mas que contribuíram
direta ou indiretamente em mais uma etapa do caminho da minha realização profissional.
6
RESUMO
O parasitismo por nematóides gastrintestinais representa um dos principais problemas para
a produção de ovinos e caprinos. Plantas com atividade anti-helmíntica vêm sendo
pesquisadas como uma alternativa de controle destes parasitos. O objetivo deste trabalho
foi avaliar a atividade anti-helmíntica dos óleos essenciais de Eucalyptus citriodora
(OEEC), E. staigeriana (OEES) e E. globulus (OEEG) sobre nematóides gastrintestinais de
pequenos ruminantes. Os óleos foram avaliados através dos testes de eclosão de ovos e de
desenvolvimento larvar sobre Haemonchus contortus. Identificação dos constituintes dos
óleos essenciais foi realizada através da análise de cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massa. OEEC e OEES foram submetidos aos testes de toxicidade aguda
e subaguda utilizando animais de laboratório. A avaliação da atividade anti-helmíntica in
vivo do OEEC e OEES foi realizada inicialmente sobre parasitos intestinais de
camundongos e posteriormente sobre nematóides gastrintestinais de caprinos. As
concentrações efetivas sobre ovos e larvas foram 10,6 e 2,65 mg ml
-1
; 5,4 e 2,7 mg ml
-1
e
43,5 e 21,75 mg ml
-1
, para OEEC, OEES e OEEG, respectivamente. A análise química
revelou como principais componentes o citronellal no OEEC, o limonemo no OEES e o
cineol no OEEG. No teste de toxicidade aguda a DL50 para o OEEC e OEES foi de 4153 e
4112,9 mg kg
-1
, respectivamente. Os testes de toxicidade subaguda com OEEC e OEES
não revelaram alterações que indicassem toxicidade. A dose de 500 mg kg
-1
dos óleos
OEEC e OEES tiveram eficácia de 69% e 86,3% na redução da carga parasitária de
camundongos e de 58% e 59% na redução da eliminação de ovos nas fezes de caprinos
infectados com nematóides gastrintestinais. Os óleos essenciais de E. citriodora e E.
staigeriana demonstraram efeito promissor sobre o controle de nematóides gastrintestinais
de caprinos.
Palavras-chave: Fitoterapia. In vivo. In vitro. Toxicidade. Haemonchus contortus
7
ABSTRACT
Gastrointestinal parasites represent one of the main problems for sheep and goat
production. Plants with anthelmintic activity are being researched as one alternative of
control of these parasites. The objective of this work was to evaluate the anthelmintic
activity of Eucalyptus citriodora (EcEO), E. staigeriana (EsEO) and E. globulus (EgEO)
essentials oils on small ruminant gastrointestinal nematodes. The oils were evaluated
through egg hatching and larval development inhibition test against Haemonchus
contortus. Essential oils constituents’ identification was performed by gas chromatography
coupled mass spectrometry. EcEO and EsEO were submitted by acute and subacute
toxicity tests using laboratory animals. The assessment of in vivo anthelmintic activity of
EcEO and EsEO was accomplished initially on mice intestinal parasites and after on goat
gastrointestinal nematodes. The effective concentrations on eggs and larvae were 10.6 and
2.65 mg ml
-1
; 5.4 and 2.7 mg ml
-1
and 43.5 and 21.75 mg ml
-1
, to EcEO, EsEO and EgEO,
respectively. Chemical analysis revealed as main components the citronellal to EcEO,
limonene to EsEO and cineol to EgEO. DL50 of acute toxicity to EcEO and EsEO were
4153 and 4112.9 mg kg
-1
, respectively. No alterations were found in the subacute toxicity
test with EcEO and EsEO that indicating toxicity. In dose of 500 mg kg
-1
EcEO and EsEO,
the efficacy was 69% and 86.3% on reduction of mice worm burden and efficacy of 58%
and 59% on reduction elimination eggs in fecal of goat infected by gastrointestinal
nematodes. The essentials oils of E. citriodora and E. staigeriana showed effect on control
of gastrointestinal nematodes goat
Keywords: Phytotherapy. In vivo. In vitro. Toxicity. Haemonchus contortus.
8
LISTA DE FIGURAS
FIGURA. 1. Flores e folhas de Eucalyptus globulus
17
FIGURA 2. Folhas de Eucalyptus staigeriana
18
FIGURA 3. Flores e folhas de Eucalyptus citriodora
19
9
LISTA DE TABELAS
CAPITULO I
Tabela 1. Eficácia média ± erro padrão do óleo essencial de Eucalyptus globulus na
inibição da eclosão de ovos de Haemonchus contortus.
31
Tabela 2. Eficácia média ± erro padrão do óleo essencial de Eucalyptus globulus na
inibição do desenvolvimento larvar de Haemonchus contortus.
32
CAPITULO II
Table 1. Mean percentage efficacy ± standard error of Eucalyptus staigeriana
essential oil on Haemonchus contortus egg hatching (EHT) and larval development
(LDT).
45
Table 2. Effect of 300 mg kg
-1
Eucalyptus staigeriana essential oil (mean ± SE) on
hematological parameters on rats (n=10) treated during 30 days.
46
Table 3. Effect of 300 mg kg
-1
Eucalyptus staigeriana essential oil (mean ± SE) on
biochemical parameters of rats (n=10) treated during 30 days.
46
Table 4. Mean efficacy (±SE) of Eucalyptus staigeriana essential oil and febendazole
based on worm burden reduction of mice intestinal nematodes.
47
Table 5. Mean efficacy and epg (±SE) of Eucalyptus staigeriana essential oil and
ivermectin based on fecal egg count reduction test in goats.
48
CAPITULO III
Table 1. Mean percentage efficacy ± standard error of Eucalyptus citriodora essential
oil on Haemonchus contortus egg hatching (EHT) and larval development (LDT).
65
Table 2. Mean ± SE of hematological parameters on rats (n=10) treated with 400 mg
kg
-1
Eucalyptus citriodora essential oil over 30 days.
65
Table 3. Effect (mean ± SE) of 400 mg kg
-1
Eucalyptus citriodora essential oil on
biochemical parameters of rats (n=10) treated during 30 days.
66
Table 4. Mean efficacy (±SE) of Eucalyptus citriodora essential oil and febendazole
based on worm burden reduction of mice intestinal nematodes.
66
Table 5. Mean efficacy and epg (±SE) of 500 mg kg
-1
Eucalyptus citriodora essential
oil and 0.2 mg kg
-1
ivermectin based on fecal egg count reduction test in goats.
67
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT-alanine aminotransferase
AST-aspartate aminotransferase
CE
50
/EC
50 -
Concentração efetiva p/ inibir 50% de eclosão dos ovos e desenvolvimento das
larvas/Effective concentration to inhibit 50% of egg hatching and larval development
DL
10
/LD
10 -
Dose letal para 10% dos camundongos/Letal dose to kill 10% of the mice
DL
50
/LD
50 -
Dose letal para 50% dos camundongos/Letal dose to kill 50% of the mice
Dp/sd – Desvio padrão/ Standart Deviation
EP/SE – Erro padrão/ Standart error
FECRT – Teste de redução da contagem de ovos nas fezes
Hb- Hemoglobin concentration
Ht- Hematocrit
Kg/g/mg - Kilograma/Grama/Miligrama
l/ml/µl – Litro/Mililitro/Microlitro
MCHC-Mean corpuscular hemoglobin concentration
MCV- Mean corpuscular volume
MHC- Mean corpuscular hemoglobin
OEEC/EcEO- Óleo essencial de Eucalyptus citriodora/ E. citriodora essential oil
OEEG/EgEO- Óleo essencial de Eucalyptus globulus/ E. globulus essential oil
OEES/EsEO - Óleo essencial de Eucalyptus staigeriana/ E. staigeriana essential oil
OPG/EPG – Ovos por grama de fezes/ Egg counts per gram of feces
Plt-Platelets
RBC -Red blood cell count
TDL/LDT – Teste de desenvolvimento larvar/ Larval development test
TEO/EHT – Teste de eclosão de ovos/ Egg hatching test
WBC- White blood cell count
11
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS------------------------------------------------------------------------
8
LISTA DE TABELAS------------------------------------------------------------------------ 9
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍGLAS------------------------------------------- 10
1) INTRODUÇÃO----------------------------------------------------------------------------- 12
2) REVISÃO DE LITERATURA ----------------------------------------------------------
13
2.1) Plantas Medicinais------------------------------------------------------------------
13
2.2) Plantas com atividade anti-helmíntica -----------------------------------------
14
2.3) Eucalyptus spp-----------------------------------------------------------------------
16
2.3.1) Eucalyptus globulus --------------------------------------------------------------
16
2.3.2) Eucalyptus staigeriana----------------------------------------------------------
17
2.3.3) Eucalyptus citriodora --------------------------------------------------------
18
2.3.4) Óleos essenciais ------------------------------------------------------------------
19
2.3.5) Potencial uso do Eucalyptus spp------------------------------------------------
21
3) JUSTIFICATIVA---------------------------------------------------------------------------
23
4) HIPÓTESE CIENTIFICA----------------------------------------------------------------
24
5) OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------------------
25
6) CAPITULO I ------------------------------------------------------------------------------
26
7) CAPITULO II-------------------------------------------------------------------------------
38
8) CAPITULO III------------------------------------------------------------------------------
57
9) CONCLUSÕES
-------------------------------------------------------------------------------------------
75
10) PERSPECTIVAS--------------------------------------------------------------------------
76
11) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS------------------------------------------------
77
12
1. INTRODUÇÃO
Os nematóides gastrintestinais são um dos fatores limitantes para a produção
de caprinos e ovinos em todo o mundo, especialmente nas regiões tropicais, onde os
prejuízos econômicos são mais acentuados, acarretando atraso no crescimento, baixa
produção leiteira, perda de peso e mortalidade (GASBARRE et al., 2001; GITHIGIA et al.,
2001).
Anti-helmínticos têm sido desenvolvidos e empregados para controlar as
nematodeoses e reduzir as perdas devido ao parasitismo. No entanto, o uso intenso e
inadequado destes produtos tem favorecido o desenvolvimento de populações de
nematóides resistentes, sendo um dos mais importantes e atuais problemas no controle de
parasitos (MELO et al., 2003; RODRIGUES et al., 2007).
Além da resistência, as drogas anti-helmínticas disponíveis no comércio
possuem desvantagens como alto custo, resíduos nos alimentos (WALLER, 2006), risco de
poluição ambiental (HAMMOND et al., 1997) e redução da eficiência na produção de
ovinos e caprinos devido à baixa eficácia. Considerando esses problemas, a fitoterapia vem
sendo pesquisada como alternativa para auxiliar o controle das parasitoses gastrintestinais
de pequenos ruminantes (VIEIRA, 2008).
O uso de plantas como medicamento é uma prática bastante difundida pela
população, porém sem comprovação do nível de segurança e da atividade biológica
(BARBOZA et al., 2007). Entretanto, é importante lembrar que o correto aproveitamento
das plantas medicinais e seus derivados têm como etapa inicial obrigatória a sua validação
pela pesquisa, envolvendo vários testes que visam confirmar a eficácia bem como
determinar a segurança de sua utilização em organismos vivos (RATES, 2001).
Muitas espécies do gênero Eucalyptus são usadas na medicina popular
brasileira como analgésicos, antiinflamatórios e para sintomas de infecções respiratórias
(SILVA et al., 2003). O eucalipto é uma das árvores mais plantadas no mundo sendo
amplamente cultivado no Brasil. Já foi observada eficácia de uma espécie de eucalipto
sobre nematóides de ruminantes, criando a expectativa sobre possível atividade de outras
espécies deste gênero contra endoparasitos gastrintestinais (BENNET-JENKINS e
BRYANT, 1996).
13
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Plantas Medicinais
O emprego de vegetais como medicamentos foi uma das primeiras
manifestações do esforço do homem em compreender e utilizar a natureza. As plantas
medicinais são matéria prima de origem vegetal utilizadas para aliviar, prevenir ou curar
uma doença ou para alterar seu processo fisiológico e patológico (RATES, 2001). O
conhecimento tradicional sobre sua utilização vem sendo adquirido pelas comunidades ao
longo de muitos anos e transmitido verbalmente através das gerações (BARBOZA et al.,
2007).
As primeiras drogas puras foram obtidas de plantas, que continuam a servir
como fonte de novas e valiosas opções (THOMPSON, 1996). Atualmente relata-se que
aproximadamente 25% das drogas prescritas mundialmente provêm de plantas, havendo
121 compostos ativos em uso corrente (RATES, 2001). Neste contexto, o Brasil ganha
destaque, pois apresenta grande biodiversidade de espécies vegetais, o que constitui uma
de suas maiores riquezas e uma possível fonte para obtenção de novas substâncias com
finalidade terapêutica (OMENA et al., 2007). Entretanto, menos de 10% dessa diversidade
foi avaliada em relação as suas características biológicas e pouco menos de 5% foi
submetida à análise fitoquímica (LUNA et al., 2005).
As plantas são produtoras de substâncias químicas que podem ser úteis no
tratamento de uma grande variedade de doenças em homens e animais (McGAW e
ELOFF, 2008). Seus compostos ativos podem ser originados de dois tipos de metabólitos:
primários e secundários. Os metabólitos primários são substâncias amplamente distribuídas
na natureza, ocorrendo em praticamente todos os organismos. Nas plantas superiores tais
compostos se concentram freqüentemente em sementes e órgãos de armazenamento e são
necessários para o desenvolvimento fisiológico, já que possuem papel importante no
metabolismo celular básico (CHAGAS, 2004a). Os metabólitos secundários são compostos
derivados biologicamente dos metabólitos primários. Freqüentemente têm um papel
ecológico, como: atrativos para polinizadores, representam adaptações químicas à pressão
ambiental ou defensores químicos contra microrganismos, insetos e predadores superiores.
As atividades biológicas das plantas medicinais são freqüentemente atribuídas aos seus
14
metabólitos secundários, como exemplos da sua utilidade comercial têm a nicotina, a
morfina, a cocaína e os óleos de eucalipto (CHAGAS, 2004a).
Diversas doenças têm sido alvos de pesquisas que envolvem plantas, muitas
destas afetam os animais de produção, com destaque para os nematóides gastrintestinais,
considerados como uma das principais causas de redução na produtividade de ruminantes
em todo o mundo (VIEIRA, 2008). Com a evolução da ciência intensificaram-se os
estudos sobre as plantas medicinais utilizadas popularmente, relacionando sua composição
química com seus efeitos (FRANCO, 2005), sendo indispensável a validação cientifica das
plantas para a aceitação da sua utilização (MAKKAR et al., 2007).
2.3 Plantas com atividade anti-helmíntica
Uma variedade de plantas tem sido utilizada tradicionalmente para tratar
doenças parasitárias que acometem os animais de produção. Embora a maioria das
evidências da propriedade terapêutica seja baseada em relatos populares, muitos trabalhos
têm sido desenvolvidos no sentido de investigar e comprovar a atividade anti-helmíntica de
plantas (ATHANASIADOU et al., 2007). Entretanto, para aceitação de uma planta como
anti-helmíntico pela medicina científica, é necessário que a eficácia seja avaliada e
confirmada, assim como deve ser garantida que sua administração a organismos vivos
ocorra sem riscos para saúde através do processo de validação cientifica (McGAW e
ELOFF, 2008).
A primeira etapa no processo de validação científica é a seleção da planta a ser
testada através de levantamento dos dados de literatura, incluindo identificação botânica e
dados sobre o uso popular (parte da planta usada, forma de administração, doses e tempo
de tratamento). Posteriormente, são necessários testes in vitro para avaliar a provável
propriedade anti-helmíntica da planta através da observação do seu efeito sobre a eclosão
de ovos e desenvolvimento ou motilidade de larvas. Estes são testes de triagem com as
plantas, seus extratos ou óleos essenciais para escolha dos mais promissores, apresentando
como vantagem a possibilidade de medir a eficácia, simultaneamente, de vários compostos,
além da rapidez, simplicidade e baixo custo (ATHANASIADOU e KYRIAZAKIS, 2004).
Como exemplos, testes com 0,5% do óleo essencial de Chenopodium ambrosioides e 1,33
µl ml
-1
de Ocimum gratissimum apresentaram 100% de ação ovicida sobre Haemonchus
contortus (KETZIS et al. 2002; PESSOA et al., 2002). O extrato acetato de etila das folhas
15
de Azadirachta indica na concentração de 50 mg ml
-1
inibiu em 51,31% a eclosão dos ovos
e em 68,10% o desenvolvimento larvar de H. contortus (COSTA et al., 2008).
A seguir realizam-se os testes in vivo através estudos toxicológicos
inicialmente em animais de laboratório para determinação da margem de segurança da
planta em organismos vivos (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2005). Estes testes
permitem determinar os possíveis efeitos decorrentes da exposição a determinadas
substâncias (BARROS e DAVINO, 2003) que podem ser avaliados após 24 horas da
administração, toxicidade aguda, ou após administrações em doses repetidas, toxicidade
sub-crônica e crônica. Após a detrerminação da margem de segurança, a planta é
submetida a testes pré-clínicos de eficácia para avaliação da atividade anti-helmíntica em
animais de laboratório. Estes testes possibilitam uma estimativa de doses para o uso
terapêutico da planta na espécie alvo (CAMURÇA-VASCONCELOS, 2006). Em estudo
usando camundongos naturalmente infectados com nematóides Syphacia obvelata e
Aspiculuris tetraptera observou-se que 800 mg kg
-1
de óleos essenciais de Lippia sidoides
e Croton zehntneri e 240 mg kg
-1
de extrato de Punica granatum apresentaram eficácia de
46%, 11% e 67%, respectivamente na redução da carga parasitária (MICHELIN et al.,
2005; CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007).
A última etapa de uma pesquisa sobre a atividade de plantas medicinais são
testes de eficácia anti-helmintica realizados na espécie alvo, devido à laboriosidade, alto
custo e necessidade de utilização de um grande número de animais (CAMURÇA-
VASCONCELOS et al., 2005). São considerados mais confiáveis e devem ser realizados
com animais natural ou experimentalmente infectados (GITHIORI et al., 2006). Os ensaios
mais utilizados são o teste de redução da contagem de ovos nas fezes (FECRT) (COLES et
al., 1992) e o teste controlado (WOOD et al.,1995). Por exemplo, 0,90 g kg
-1
do extrato
aquoso de Coriadrum sativum promoveu uma redução de 24,49% no número de ovos por
grama de fezes (OPG) de ovinos após dois dias de tratamento (EGUALE et al., 2007). O
extrato etanólico de Spigelia anthelmia na concentração de 500 mg kg
-1
reduziu em 76% o
OPG de ovinos nove dias após o tratamento (ADEMOLA et al., 2007), e a administração
de 283 mg kg
-1
de óleo essencial de L. sidoides causou redução de 54% no OPG de ovinos
13 dias após o tratamento (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2008).
Estes resultados demonstram boas possibilidades da utilização de plantas no
controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes.
16
2.3 Eucalyptus spp
Eucalipto (do grego = "verdadeira cobertura") é a designação genérica das
várias espécies vegetais do gênero Eucalyptus, família Myrtaceae, nativas da Austrália,
amplamente cultivadas em áreas tropicais e subtropicais. No Brasil, existe grande área
plantada com eucalipto, cobrindo uma área de mais de três milhões de hectares (PEREIRA
et al., 2006; SALARI et al., 2006). São, em termos gerais, árvores, em alguns raros casos,
arbustos, que apresentam copa geralmente rala e alongada e o tronco quase sempre
retilíneo e cilíndrico. As folhas possuem a característica comum, entre a maioria das
espécies, o fato de serem aromáticas e dispostas nos ramos de maneira oposta na parte
inferior e alternas na parte superior. Os frutos são constituídos por cápsulas lenhosas
deiscentes com sementes muito pequenas. As flores geralmente são melíferas, contribuindo
para a produção de mel de abelha (BAKKALI et al., 2008).
O gênero Eucalyptus é composto de espécies de múltiplos usos, podendo sua
madeira ser utilizada como combustível para siderurgia, indústria de móveis, na construção
civil, como postes, na produção de celulose, mel, e, suas folhas serem utilizadas para
extração de óleos essenciais usados na fabricação de produtos de limpeza, alimentícios,
perfumes e medicamentos (VITTI e BRITO, 2003). Existem mais de 600 espécies e
variedades, das quais 20 têm sido exploradas comercialmente e menos de 12 têm
importância econômica no mercado mundial de óleos essenciais (FRANCO, 2005). No
Brasil, as principais espécies de eucalipto exploradas para a produção de óleo essencial
são: E. globulosus, E. staigeriana e E. citriodora.
2.3.1 Eucalyptus globulus
E. globulus é uma árvore frondosa e de grande porte que mede até 60 m de
altura. Sua casca lisa branco-cremosa vai se renovando ao longo do tempo; a folhagem
juvenil é ovalada e de coloração prata-azulada. As folhas adultas são brilhantes, têm
formato de foice e medem até 25 cm de comprimento (FIGURA 1) e são cultivadas para
extração de óleo essencial medicinal. A madeira desta espécie é usada apenas como lenha,
apesar das referências favoráveis para a produção de celulose e papel (VITTI e BRITO,
2003).
17
FIGURA 1. Folhas e flores de Eucalyptus globulus
Fonte: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eucalyptus_globulus...
Seus principais constituintes obtidos por cromatografia gasosa são 1,8-cineol
ou eucalyptol (85,84%), alfa-pineno (9,93%), gama-terpineno (1,24%), beta-mirceno
(1,23%), beta-pineno (0,88%), 1-felandreno (0,56%) e alfa-terpinoleno (0,32%) (CHAGAS
et al., 2002). Existem relatos da atividade do eucaliptol sobre as bactérias Candida
albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus (CARSON e RILLEY, 1995; CHA et
al., 2007), os fungos Fusarium graminearum, F. culmorum e Pyrenophora graminea
(TERZI et al., 2007) e os coleopteros Tribolium castanaeum (TRIPATHI et al., 2001;
STAMOPOULOS et al., 2007), Sitophilus oryzae e Rhyzopertha dominica (LEE et al.,
2004). O eucaliptol também apresentou atividade in vitro sobre larva do nematóide
Anisakis simplex (NAVARRO et al., 2008).
2.3.2 Eucalyptus staigeriana
E. staigeriana é uma árvore de tamanho médio, podendo chegar a 22 m de
altura, com copa reduzida e espalhada. As folhas (FIGURA 2) apresentam cheiro
característico cítrico, proveniente do seu principal componente, o citral. Está adaptada a
zonas climáticas quentes e subúmidas, a solos pobres e bem drenados, matas ou florestas
18
abertas. Sua cultura é destinada basicamente à obtenção de óleos essenciais para
perfumaria sendo a madeira vendida como lenha (VITTI e BRITO, 2003).
FIGURA 2. Folhas de Eucalyptus staigeriana
Fonte:
http://en.wikipedia.org/wiki/Eucalyptus_staigeriana
Seus principais constituintes obtidos por cromatografia gasosa são dl-
limonemo (24,78%), E-citral (14,99%), Z-citral (11,36%), alfa-terpinoleno (10,78%),
acetato de geranila (7,61%), 1-felandreno (3,32%), alfa-pineno (3,37%), gama-terpinemo
(2,36%), beta-pineno (2,30%), beta-mirceno (0,97%), entre outros em menor percentual
(CHAGAS et al., 2002). Estudos têm sido realizados com seu principal constituinte, citral,
reportando atividade sobre insetos Culex pipiens (LEE et al. 2003; YANG et al., 2005),
sobre bactérias e fungos (FISHER et al., 2007; YAMASAKI et al., 2007), sobre os
fitonematóides Bursaphelenchus xylophilus e Meloidogyne incognita (BAUSKE et al.,
1994; CHOI et al., 2007), bem como sobre larvas do nematóide A. simplex (HIERO et al.,
2006).
2.3.3 Eucalyptus citriodora
Conhecida popularmente como eucalipto limão é uma árvore de porte médio,
com casca áspera e pulverulenta de coloração branca, às vezes rosa ou vermelha e folhas
juvenis lanceoladas. A folhagem adulta é lisa (FIGURA 3), estreita e mais longa que a
19
juvenil. Todas as partes contêm forte aroma de limão. É utilizada para produção de carvão
vegetal, postes, madeira para serraria, como lenha, sendo mais cultivado para obtenção de
óleo essencial para perfumaria (VITTI e BRITO, 2003).
FIGURA 3. Folhas e flores de Eucalyptus citriodora
Fonte: http://www.pbase.com/yvonneii/gum_blossoms
Seus constituintes obtidos por cromatografia gasosa são: acetato de citronelila
(2,61%), trans-cariofileno (2,49%) e o principal constituinte citronelal (94,9%), (CHAGAS
et al., 2002). O metabólito secundário citronelal é usado em perfumaria, detergentes e
como repelentes de insetos. Estudos com citronelal mostraram atividade inseticida sobre
Musca domestica (LEE et al., 2003) e larvas da mosca Lucilia sericata (SILVA, et al.,
2007), além de atividade sobre o fitonematóide Bursaphelenchus xylophilus (CHOI et al.,
2007).
2.3.4 Óleos essenciais
Os óleos essenciais de eucalipto são compostos formados por uma complexa
mistura de diferentes concentrações de componentes orgânicos voláteis, e apresentam
grupos químicos como hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres. A
grande maioria, no entanto, é constituída de terpenos complexos, que constituem uma
grande variedade de substâncias vegetais derivadas de unidades do isopreno. Os compostos
20
terpênicos mais freqüentes nos óleos voláteis são os monoterpenos (90 % dos óleos) e os
sesquiterpenos (SALGADO et al., 2003).
Os monoterpenos são metabólitos secundários que podem causar interferência
tóxica nas funções bioquímicas e fisiológicas dos parasitos, apresentando a vantagem de,
na maioria das vezes, serem pouco tóxicos para os mamíferos (RICE e COATS, 1994).
Alguns monoterpenos têm sido considerados como alternativas aos produtos comerciais
sintéticos, sendo utilizados como condimentos artificiais, perfumes (TEMPLETON, 1998)
e em formulações de expectorantes, descongestionantes, analgésicos externos e anti-
sépticos (WINDHOLZ et al., 1998).
Os óleos de eucalipto ocorrem, principalmente, nas folhas, onde são
produzidos em pequenas cavidades globulares, chamadas glândulas. Existem vários fatores
que podem exercer influência na variação da composição desses óleos. Os mais típicos são
a variabilidade genética, a idade das folhas, as condições ambientais, o tipo de manejo
florestal, os métodos utilizados para amostragem das folhas, os processos de extração e de
análise do óleo (CIMANGA et al., 2002; BAKKALI et al., 2008).
A ação dos óleos essenciais está relacionada com a sua volatilidade, pois, por
meio dessa característica, agem como sinais de comunicação química com o reino vegetal
e como arma de defesa contra o reino animal. Eles já foram considerados como repelentes
de insetos que se alimentavam de suas folhas, inibidores da germinação e de crescimento
de outras plantas, controladores da atividade microbiológica de alguns fungos e bactérias,
atrativos de polinizadores, proteção contra a perda de água e aumento de temperatura entre
outros (FRANCO, 2005).
Em função do seu uso final, os óleos essenciais de eucalipto podem ser
divididos em três grupos: óleos medicinais, óleos industriais e óleos para perfumaria
(VITTI e BRITO, 2003). Óleos medicinais são aqueles que apresentam como componente
principal o cineol e são destinados à fabricação de produtos farmacêuticos como inalante,
estimulantes de secreção nasal, produtos de higiene bucal, dentre outros. A principal
espécie produtora deste óleo no Brasil é E. globulus. Os óleos industriais têm como
componentes principais o felandreno, que é usado como solvente e matéria-prima na
produção de desinfetantes e desodorizantes e o mentol usado como aromatizante de
produtos medicinais. E os óleos de perfumaria fazem parte da composição de perfumes,
sendo mais usados nos produtos de limpeza, E. citriodora é a principal espécie cultivada
21
no Brasil para a produção deste tipo de óleo, seguida pela espécie E. staigeriana (VITTI e
BRITO, 2003).
2.3.5 Potencial uso do Eucalyptus spp
Muitas espécies do gênero Eucalyptus são usadas na medicina popular
brasileira para uma variedade de condições medicinais. Os óleos essenciais de eucalipto
são também amplamente empregados como cosméticos, em alimentos e na indústria
farmacêutica (SILVA et al., 2003). O efeito biológico do óleo pode ser resultado do
sinergismo de todas as moléculas ou somente da ação do principal componente presente
em níveis mais altos.
Vários trabalhos foram realizados demonstrando efeitos das espécies de E.
citriodora, E. globulus e E. staigeriana sobre vários organismos.
O extrato aquoso das folhas secas de E. citriodora é tradicionalmente usado
como analgésico, antiinflamatório, antipirético e para tratar infecções respiratórias
(BAKKALI et al., 2008). O óleo essencial de E. citriodora apresentou atividade inibitória
sobre as bactérias Staphylococcus aureus, Salmonella choleraeseus e Escherichia coli
(ESTANISLAU et al., 2001), os fungos Colletotrichum lindemuthianum, C. sublineolum,
Fusarium oxysporum, Alternaria triticina, A. alternata e Rhizoctonia solani (RAMEZANI
et al., 2002; BONALDO et al., 2007), os insetos coleópteros Acanthoscelideos obtectus
(MAZZONETTO e VENDAMIM, 2003). Esse óleo também apresentou atividade tóxica in
vitro sobre as larvas do fitonematóide Meloidogyne incognita (PANDEY et al., 2000).
E. globulus é uma erva aromática, estimulante, descongestionante e
expectorante, relaxa espasmos e diminui febre. É usada externamente em inalações para
bronquite, sinusite, resfriados e gripe; para contusões e dores musculares; em feridas e
abscessos. O uso do óleo essencial de E. globulus apresenta múltiplas aplicações
medicinais, incluindo atividade antiinflamatória, analgésica (SILVA et al., 2003) e
antioxidante (CRUZ et al., 2005). Estudos demonstraram atividade desse óleo sobre
bactérias e fungos (NAVARRO et al., 1996; TAKAHASHI et al., 2004; SALARI et al.,
2006), sobre o carrapato Boophilus microplus (CHAGAS et al., 2002), bem como atividade
inseticida sobre M. domestica (MORSY e HALIM, 2005), Pediculus humanus capitis
(YANG et al., 2004), além do coleóptero Acanthoscelides obtectus (PAPACHRISTOS e
STAMOPOULOS, 2004). Através do processo de hidrodestilação, esse óleo apresentou
22
atividade inseticida sobre o caruncho do milho Sitophilus zeamais (SANDI e BLANCO,
2007).
O óleo essencial E. staigeriana mostrou-se eficiente no controle do coleoptero
Callosobruchus maculatus provocando mortalidade de adultos através do processo de
fumigação (BRITO et al., 2006). O mesmo óleo foi testado quanto à ação acaricida
verificando-se atividade sobre larvas e fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus
microplus (CHAGAS et al., 2002).
Testes preliminares utilizando os óleos essenciais das espécies E. citriodora, E.
globulus e E. staigeriana foram realizados in vitro verificando-se inibição do
desenvolvimento larvar de helmintos gastrintestinais de caprinos (CHAGAS, 2004b). Tais
resultados são extremamente significativos, pois criam à possibilidade de utilização destes
compostos no controle de endoparasitos.
23
3. JUSTIFICATIVA
A aplicação de medidas de controle para o parasitismo causado por nematóides
gastrintestinais é essencial para o sucesso na produtividade da ovinocaprinocultura. Esse
controle é feito basicamente pela utilização de anti-helmínticos onerosos e, algumas vezes,
pouco eficazes devido ao desenvolvimento de populações resistentes. Acredita-se que a
aplicação de compostos naturais vegetais, como óleos essenciais de Eucalyptus spp, pode
ser uma alternativa para controlar o parasitismo, pois apresentam como vantagens um
desenvolvimento mais lento da resistência, além serem biodegradáveis, não causarem
poluição ambiental, diminuírem o problema dos resíduos, redução nos custos, além de
prolongar a vida útil dos produtos disponíveis no mercado.
24
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os óleos essenciais de Eucalyptus citriodora, E. staigeriana e E. globulus
possuem atividade contra nematóides gastrintestinais de caprinos.
25
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
• Identificar um fitoterápico para controlar as nematodioses de pequenos
ruminantes.
5.2 Objetivos Específicos
• Avaliar in vitro a atividade ovicida e larvicida dos óleos essenciais de
Eucalyptus citriodora, E. globulus e E. staigeriana sobre ovos e larvas de
H. contortus;
• Determinar a toxicidade aguda e subaguda dos óleos essenciais de E.
citriodora e E. staigeriana em animais de laboratório;
• Avaliar in vivo a atividade anti-helmíntica dos óleos essenciais de E.
citriodora e E. staigeriana na redução da carga parasitária de camundongos
infectados com parasitos intestinais;
• Avaliar in vivo a atividade anti-helmíntica dos óleos essenciais de E.
citriodora e E. staigeriana na redução do OPG de caprinos infectados por
nematóides gastrintestinais.
26
Capitulo I
ARTIGO
Atividade ovicida e larvicida do óleo essencial de Eucalyptus globulus
sobre Haemonchus contortus
(Ovicidal and larvicidal activity of Eucalyptus globulus essential oils
by Haemonchus contortus)
Artigo submetido à revista: Ciência Animal
Iara T. F. Macedo
a
, Claudia M L Bevilaqua
a*
, Lorena M. B. de Oliveira
a
, Ana L. F.
Camurça-Vasconcelos
a
, Luiz da S. Vieira
b
, Fabrício R. Oliveira
a
, Eudson M. Queiroz-
Junior
a
, Bruno G. Portela
a
, Renata S. Barros
a
, Ana C.S. Chagas
b
a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brasil;
b
EMBRAPA/CNPC, Brasil.
27
Atividade ovicida e larvicida do óleo essencial de Eucalyptus globulus
sobre Haemonchus contortus
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito ovicida e larvicida do óleo essencial de
Eucalyptus globulus (OEEG) sobre Haemonchus contortus. A determinação da
composição química do OEEG foi feita através de cromatrografia gasosa acoplada a
espectrometria de massa. No teste de eclosão de ovos (TEO) foram utilizadas as
concentrações 21,75; 17,4; 8,7; 5,43 e 2,71 mg ml
-1
, e no desenvolvimento larvar (TDL) as
concentrações foram 43,5; 21,75; 10,87; 5,43 e 2,71 mg ml
-1
. Cada ensaio foi
acompanhado por um controle negativo com o diluente Tween 80 (3%) e controle
positivo, 0,02 mg ml
-1
tiabendazol, no TEO e 0,008 mg ml
-1
ivermectina no TDL. A
eficácia máxima obtida pelo OEEG sobre ovos foi de 99,3% na concentração de 21,75 mg
ml
-1
e sobre larvas foi de 98,7% na concentração de 43,5 mg ml
-1
. A concentração do
OEEG que inviabilizou 50% dos ovos e das larvas do parasito foi de 8,3 mg ml
-1
e 6,92
mg ml
-1
, respectivamente. A análise química do óleo identificou como principal
componente o monoterpeno 1,8-cineol. O OEEG apresentou atividade ovicida e larvicida
sobre H. contortus, revelando um bom potencial para utilização no controle de nematóides
gastrintestinais.
PALAVRAS-CHAVE: fitoterapia, Haemonchus contortus, anti-helmíntico.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate ovicidal and larvicidal effect of Eucalyptus
globulus essential oil (EgEO) on Haemonchus contortus.
The chemical composition
determination of EgEO was through gas chromatography and mass spectrometry. Egg
hatch test (EHT) was performed in concentrations 21.75; 17.4; 8.7; 5.43 e 2.71 mg ml
-1
,
and in larval development test (LDT) were used the concentrations 43.5; 21.75; 10.87;
5.43 e 2.71 mg ml
-1
. Each trial was conducted by negative control with Tween 80 (3%) and
positive control, 0.02 mg ml
-1
of thiabendazole in EHT and 0.008 mg ml
-1
of ivermectin in
LDT. The maximum effectiveness of EgEO on eggs was 99.3% in concentration of 21.75
28
mg ml
-1
and on larvae was 98.7% in concentration 43.5 mg ml
-1
. The concentration of
EgEO that inhibits 50% of the eggs and larvae was 8.3 mg ml
-1
and 6.92 mg ml
-1
,
respectively. The oil chemical analysis identified as main component the monoterpen 1,8-
cineol. The EgEO presented ovicidal and larvicidal activity, revealing a good potential for
use in the control of gastrointestinal nematodes.
KEY WORDS: phytoterapic, Haemonchus contortus, anthelmintic.
INTRODUÇÃO
As endoparasitoses gastrintestinais se constituem no principal entrave da
ovinocultura, em todo o mundo, especialmente, nas regiões tropicais, onde os prejuízos
econômicos são mais acentuados (VIEIRA, 2008). Dentre os parasitos gastrintestinais,
destaca-se o nematóide hematófago Haemonchus contortus, devido a sua alta prevalência
e patogenicidade (AROSEMENA et al., 1999). O comprometimento da produção ocorre
em decorrência da perda de apetite, diarréia, anemia e em casos severos, morte do animal
(ATHANASIADOU e KYRIAZAKIS, 2004).
Para tentar controlar e reduzir as perdas causadas pelas infecções por helmintos são
utilizados anti-helmínticos sintéticos (EGUALE et al., 2007). Entretanto, o rápido
desenvolvimento de populações de nematóides resistentes, associado ao alto custo, risco
de resíduos nos alimentos e de contaminação ambiental tornou necessária a busca por
novas alternativas de controle (HERD, 1996; MELO et al., 2003). Opções como a
utilização de plantas medicinais pode representar uma alternativa para o controle das
nematodeoses e minimizar alguns desses problemas apresentando a vantagem de serem
sustentáveis e ambientalmente aceitas (COSTA et al., 2008).
Eucalyptus globulus pertence à família Myrtaceae é uma espécie nativa da
Austrália que está distribuída mundialmente. Essa espécie vegetal é eficaz no tratamento
de inflamações pulmonares e excessiva mucosidade (ROCHA e SANTOS, 2007). O uso
do óleo essencial obtido a partir das suas folhas apresenta importância farmacêutica, sendo
propostas múltiplas aplicações medicinais, incluindo atividade antiinflamatória, analgésica
(SILVA et al., 2003) e anti-oxidante (CRUZ et al., 2005). Estudos demonstraram atividade
desse óleo sobre bactérias e fungos (NAVARRO et al., 1996; TAKAHASHI et al., 2004;
SALARI et al., 2006; CARMELLI et al., 2008), sobre o carrapato Boophilus microplus
29
(CHAGAS et al., 2002), bem como atividade inseticida sobre Musca domestica (MORSY
e HALIM, 2005), Pediculus humanus capitis (YANG et al., 2004), além dos coleópteros
Acanthoscelides obtectus (PAPACHRISTOS e STAMOPOULOS, 2004), Zabrotes
subfasciatus e Callosobruchus maculatus (BRITO et al., 2006).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro do óleo essencial de E.
globulus sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento larvar de H. contortus.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção do óleo essencial
Foi utilizada uma preparação comercial do óleo essencial de E. globulus (OEEG)
adquirido de Dierberguer óleos essenciais Ltda. Para aumentar a solubilidade em meio
aquoso, o óleo foi diluído em Tween 80 a 3%.
Obtenção de ovos e larvas de H. contortus
Dois ovinos sem raça definida foram mantidos em gaiolas metabólicas e tratados
inicialmente com três anti-helmínticos de diferentes princípios ativos em dias alternados
para eliminar todos os nematóides gastrintestinais. Após a constatação da eliminação da
infecção foram inoculadas 5.000 larvas infectantes (L3) de H. contortus e posteriormente
foram realizados exames coprológicos para confirmar o estabelecimento da infecção
experimental.
Teste de eclosão de ovos (TEO)
Foram coletadas 10 g de fezes diretamente da ampola retal de ovino portador de
infecção monoespecífica por H. contortus. As fezes foram processadas de acordo com a
técnica descrita por Hubert e Kerbeouf (1992) para recuperação de ovos. O teste de
eclosão de ovos foi baseado na metodologia descrita por Coles et al. (1992).
Aproximadamente 250 µl de solução de ovos, contendo no mínimo 100 ovos, foram
incubados com 250 µl da solução a ser testada de acordo com os seguintes tratamentos:
T1: diluente Tween 80 a 3%, controle negativo; T2: 0,02 mg ml
-1
tiabendazol, controle
positivo; T3: óleo essencial de E. globulus nas concentrações 2,71; 5,43; 8,7; 17,4 e 21,75
mg ml
-1
. Após 48 horas, foi acrescentado Lugol objetivando interroper a eclosão dos ovos
30
e realizar a contagem de ovos e larvas eclodidas. Foram realizadas três repetições com
cinco réplicas para cada tratamento.
Teste de desenvolvimento larval (TDL)
Para a obtenção das larvas de primeiro estágio (L1), uma alíquota da suspensão de
ovos obtida segundo Hubert e Kerbeouf (1992) foi incubada por 24 h em estufa a 37°C. O
teste de desenvolvimento larvar foi realizado conforme método descrito por Roberts e
O’Sullivan (1950) modificado. Uma alíquota de 1 ml, contendo aproximadamente 250 L1
de H. contortus, foi incubada durante 6 dias com 2 g de fezes provenientes de um animal
livre de nematóides gastrintestinais, juntamente com 1 ml do óleo essencial de E. globulus
nas concentrações 2,71; 5,43; 10,87; 21,75 e 43,5 mg ml
-1
. O controle negativo foi
constituído pelo diluente Tween 80 (3%) e o positivo, por ivermectina (0,008 mg ml
-1
). Ao
final, foi acrescentado lugol e realizada a contagem de larvas de 3° estágio. Foram
realizadas três repetições com cinco réplicas para cada tratamento.
Análise química do óleo essencial
A composição química do óleo essencial usado neste estudo foi determinada
através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. O óleo essencial foi
analisado usando o equipamento Velocity XPT sob as seguintes condições: coluna capilar
de sílica fundida dimetilpolisiloxano DB 5ms; gás de arraste: Ne (1 mL/min); temperatura
do injetor: 250°C; temperatura do detector: 200°C; temperatura da coluna: 35- 180°C a
4°C /min e depois 180-25°C a10°C /min. Amostras foram analisadas pelo CG– SM no
QP2010, com impacto eletrônico a 70 e V.
Análise estatística
Nos testes in vitro, os resultados foram expressos em percentagem de eficácia da
inibição da eclosão de ovos e do desenvolvimento larvar de H. contortus. Os resultados
foram analisados usando ANOVA e comparados através do teste de Tukey com nível de
significância de 5% usando o programa Prism 3.0.
A eficácia de cada tratamento no teste de eclosão de ovos foi determinada com
base no percentual de eclosão calculado usando-se a seguinte fórmula: (nº de larvas
eclodidas/ nº de larvas eclodidas + nº de ovos) x 100.
31
No teste de desenvolvimento larvar, a eficácia foi calculada usando a fórmula: (L3
grupo controle negativo - L3 grupo tratado) / L3 grupo controle negativo x 100.
A concentração efetiva 50 (CE50), ou seja, a concentração capaz de inibir 50% da
eclosão de ovos ou do desenvolvimento larvar foi calculada usando o programa estatístico
SPSS 8.0 para Windows.
RESULTADOS
As percentagens médias de eficácia do OEEG obtidas no teste de eclosão de ovos
estão dispostas na tabela 1. O OEEG na concentração de 17,4 mg ml
-1
apresentou 87,3%
de eficácia não sendo diferente estatisticamente do anti-helmíntico (p>0,05). A CE50 do
OEEG foi de 8,3 (5,46 - 12,31) mg ml
-1
.
Tabela 1. Eficácia média ± erro padrão do óleo essencial de Eucalyptus globulus na
inibição da eclosão de ovos de Haemonchus contortus.
Concentrações (mg ml
-1
)
Eficácia ± e.p
21,75
99,07± 0,28A
17,4
87,3 ± 2,55B
8,7
43,25± 1,05C
5,43
21,87± 2,27D
2,71
9,93± 1,49E
Controle negativo (3% Tween 80)
3,12 ± 0,45E
Controle positivo (0.025 mg ml
-1
Tiabendazol)
92,7 ± 1,28AB
Letras diferentes indicam significância estatística nas linhas (p<0,05)
A tabela 2 apresenta as percentagens médias de eficácia do OEEG no teste de
desenvolvimento larvar. Na concentração de 21,75 mg ml
-1
, o OEEG inibiu em 90,96% o
desenvolvimento larvar, sendo equivalente à eficácia do anti-helmíntico (p>0,05). A CE50
do OEEG foi de 6,92 (5,12- 9,01) mg ml
-1
.
32
Tabela 2. Eficácia média ± erro padrão do óleo essencial de Eucalyptus globulus na
inibição do desenvolvimento larvar de Haemonchus contortus.
Concentrações (mg mL
-1
)
Eficácia ± e.p
43,5
98,7± 0,36A
21,75
90,96 ± 2,17A
10,87
67,75± 3,83B
5,43
47,6 ± 4,56C
2,71
8,37 ± 2,08D
Controle negativo (3% Tween 80)
3,5 ± 0,57D
Controle positivo (0.008 mg ml
-1
Ivermectina)
99,81 ± 0,1A
Letras diferentes indicam significância estatística nas linhas (p<0,05)
O óleo essencial apresentou efeito inibitório dose-dependente sobre a eclosão de
ovos e desenvolvimento larvar de H. contortus.
A análise obtida por cromatografia gasosa indicou como principais constituintes e
suas concentrações: α-pineno (4,15%), o-cimeno (2,93%), (+)-limoneno (8,16%),
eucaliptol (83,89%) e γ-terpineno (0,87%).
DISCUSSÃO
O modelo in vitro reportado neste estudo demonstrou efeito anti-helmíntico do
OEEG, sugerindo a presença de algum constituinte químico que atua sobre ovos e larvas
de H. contortus. O uso de H. contortus nesses testes pode ser justificado pelo fato de que
este nematóide é um parasito gastrintestinal de grande importância econômica na produção
de pequenos ruminantes, apresentando alta prevalência e patogenicidade (DIEHL et al.,
2004). Em trabalho anterior o óleo essencial de E. globulus também apresentou atividade
in vitro sobre nematóides gastrintestinais na concentração de 5%, entretanto o teste
utilizou outra metodologia baseada em coproculturas de caprinos com infecção mista e o
óleo foi testado na forma de emulsão (CHAGAS, 2004).
33
Os testes in vitro se constituem na observação da ação do fármaco pelo contato
direto com os estágios de ovo ou larva do parasito para avaliar seu efeito sobre a eclosão
de ovos e desenvolvimento de larvas. Atualmente estes testes além de verificarem a ação
de anti-helmínticos sintéticos, têm sido utilizados para triagem de plantas medicinais,
apresentando as vantagens de facilidade de execução, baixo custo e rapidez. Esses ensaios
servem como uma indicação inicial da atividade a ser pesquisada e permitem a seleção dos
extratos mais promissores, diminuindo gastos, evitando perda de tempo e uso
indiscriminado de animais de experimentação (CAMURÇA-VASCONCELOS et al.,
2005).
Neste estudo, o OEEG apresentou atividade in vitro sobre H. contortus superior a
outras plantas testadas. Como exemplo é possível citar que 50 mg ml
-1
do extrato hexânico
das folhas de Melia azedarachta inibiram em 16,92% a eclosão de ovos e em 67,9% o
desenvolvimento larvar, respectivamente (MACIEL et al., 2006); o extrato acetato de etila
de Azadirachta indica inibiu 51,31% a eclosão de ovos e 68,10% o desenvolvimento
larvar na concentração de 50 mg ml
-1
(COSTA et al., 2008); o extrato metanólico de
Spigelia anthelmia inibiu 97,4% a eclosão de ovos e 84,4% o desenvolvimento larvar na
concentração de 50 mg ml
-1
(ASSIS et al., 2003).
Neste trabalho OEEG foi menos efetivo que os anti-helmínticos sintéticos usados
como controle positivo. Entretanto o tiabendazol e a ivermectina são substancias ativas
isoladas, enquanto que o óleo essencial é uma mistura contendo vários constituintes
químicos, dentre eles o princípio ativo com ação ovicida e larvicida, porém em pequenas
quantidades.
A investigação de componentes químicos provenientes de produtos naturais é de
fundamental importância para o desenvolvimento de novas drogas anti-helmínticas
(ASSIS et al., 2003). Neste estudo, a análise CG-SM identificou que o OEEG é composto
por cinco constituintes químicos que podem ser responsáveis pela potencial atividade anti-
helmíntica encontrada in vitro. O principal constituinte encontrado foi o monoterpeno 1,8-
cineol, também conhecido por eucaliptol. Alguns trabalhos já foram realizados com esse
composto para avaliar sua atividade inseticida sobre coleopteros Tribolium castanaeum
(TRIPATHI et al., 2001; STAMOPOULOS et al., 2007) e Sitophilus oryzae, Oryzaephilus
surinamensis, Musca domestica e Blattella germanica (LEE et al., 2003). Existem relatos
sobre ação contra as bactérias, Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus
34
aureus (CARSON e RILLEY, 1995; CHA et al., 2007), sobre os fungos Fusarium
graminearum, F. culmorum e Pyrenophora graminea (TERZI et al., 2007) e larva do
nematóide Anisakis simplex (NAVARRO et al., 2008).
O óleo essencial de E. globulus pode ser uma fonte alternativa para o controle de
nematóides gastrintestinais. Entretanto, estudos são necessários para avaliar a sua
toxicicidade e seus efeitos in vivo, bem como isolamento e avaliação de seus componentes
ativos.
REFERÊNCIAS
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38
Capitulo II
ARTIGO
ANTHELMINTIC ACTIVITY OF Eucalyptus staigeriana ESSENTIAL
OIL AGAINST GOAT GASTROINTESTINAL NEMATODES
(Atividade anti-helmíntica do óleo essencial de Eucalyptus staigeriana
sobre nematóides gastrintestinais de caprinos)
Artigo submetido ao periodico: Fitoterapia
Iara T. F. Macedo
a
, Claudia M L Bevilaqua
a*
, Lorena M. B. de Oliveira
a
, Ana L. F.
Camurça-Vasconcelos
a
, Luiz da S. Vieira
b
, Fabrício R. Oliveira
a
, Eudson M. Queiroz-
Junior
a
, Adriana da R. Tomé
a
, Nilberto R. F. Nascimento
a
a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brazil;
b
EMBRAPA/CNPC, Brazil.
39
ANTHELMINTIC ACTIVITY OF Eucalyptus staigeriana ESSENTIAL OIL
AGAINST GOAT GASTROINTESTINAL NEMATODES
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia anti-helmintica do óleo essencial de
Eucalyptus staigeriana (OEES). Os efeitos in vitro do OEES foram determinados através
do teste de eclosão de ovos e inibição do desenvolvimento larvar de Haemonchus
contortus. O óleo foi submetido à toxicidade aguda e subaguda. Os efeitos in vivo foram
determinados através da contagem de nematóides intestinais de camundongos e da redução
da contagem de ovos nas fezes em caprinos. 1,35 e 5,4 mg mL
-1
de OEES inibiram em
99,27% e 99,20% a eclosão de ovos e o desenvolvimento larvar de H. contortus. Na
toxicidade subaguda, todos os parâmetros encontrados estavam dentro da variação normal
e análise hirtopatologica dos órgãos não apresentou alterações. Na concentração de 500 mg
kg
-1
, o óleo essencial foi efetivo em 86% contra nematóides de camundongos. A eficácia
de OEES contra nematóides gastrintestinais de caprinos foi de 59% 15 dias após o
tratamento. Óleo essencial de E. staigeriana mostrou atividade anti-helmintica in vitro e in
vivo.
Palavras-chave: Fitoterapia; Anti-helmintico; In vivo; In vitro; Toxicidade.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the anthelmintic efficacy of Eucalyptus staigeriana
essential oil (EsEO). The in vitro effects of EsEO were determined through the egg hatching
test and the inhibition of larval development of Haemonchus contortus. The oil was subjected
to acute and subacute toxicity. The in vivo effects were determined through worm count of
mice intestinal nematodes and fecal egg reduction count in goats. 1.35 and 5.4 mg mL
-1
EsEO
inhibited 99.27% and 99.20% H. contortus egg hatching and larval development. In subacute
toxicity of EsEO, all parameters were found to be in the normal range, and histopathological
analysis of organs did not present alterations. At a concentration of 500 mg kg
-1
, the essential
oil was 86% effective against mice nematodes. EsEO efficacy against goat gastrointestinal
nematodes was 59% at 15th day after treatment. E. staigeriana essential oil showed in vitro
and in vivo anthelmintic activity.
Keywords: Phytotherapy; Anthelmintic; In vivo; In vitro; Toxicity.
40
Introduction
Gastrointestinal parasitism is a significant obstacle in the breeding of sheep and
goats (Pessoa et al., 2002). Parasitism, especially by helminth species, impairs health by
causing lack of appetite, diarrhea, anemia and, in severe cases, death (Athanasiadou and
Kyriazakis, 2004). Synthetic anthelmintics have been used throughout the world for
decades to minimize the losses caused by helminth infection. However, anthelmintic
resistance in nematodes has become a major practical problem in many countries (Varady
and Corba, 1999). Parasite resistance increases costs, reduces production efficiency and
increases the risk of environmental contamination. Frequent use, increased dosage, and
increased application rate all correlate with declining effectiveness (Donald, 1994). These
disadvantages have stimulated a search for alternative control methods, such as the use of
traditional medicinal plants. Screening and proper evaluation of medicinal plants could
reveal bioactive compounds that may be sustainable and environmentally acceptable
(Eguale et al., 2007).
Recently, there has been an increasing interest in ethnomedical and ethnoveterinary
practices around the world, especially as they pertain to the use of medicinal plants in
treating various ailments (Bizimenyera, 2006). For acceptance of medicinal plants into
scientific medicine, it is necessary that their effectiveness and safety be evaluated and
confirmed through in vitro and in vivo testing (Rates, 2001).
Eucalyptus (Myrtaceae), a native plant of Australia, is mainly cultivated for the
paper, pharmaceutical and cosmetic industries (Hasegawa et al., 2008). Much research has
been conducted on the medicinal properties of Eucalyptus spp. The leaf extract, or
essential oil from the leaves of Eucalyptus spp. has been reported to possess antifungal,
antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant, mosquito repellent, and anthelmintic
properties (Bennet-Jenkins and Bryant, 1996; Ramezani et al., 2002; Silva et al., 2003;
Erler et al., 2006; Salari et al., 2006). E. staigeriana is the species most commonly used in
Brazil for extraction of essential oil, and the main chemical component is citral (Vitti &
Brito, 2003). Studies have shown that the essential oil exhibits antibacterial biological
activity (Dupont et al., 2006). Furthermore, fumigation using essential oil has been shown
to be effective in the control of insects such as Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus
maculatus (Brito et al., 2006). Chagas et al. (2002) detected acaricide activity of the oil
toward the tick Boophilus microplus.
41
The objective of the current study was therefore to assess the in vitro and in vivo
anthelmintic potential of E. staigeriana essential oil toward gastrointestinal nematodes.
Materials and Methods
Obtaining Essential Oil
A commercial preparation of E. staigeriana essential oil (EsEO) furnished by
Dierberguer óleos essenciais Ltda was used in the experiments described here. To increase
the solubility in aqueous medium, the essential oil was diluted in 3% Tween 80.
Chemical analysis
The chemical composition of EsEO used in this study was determined by gas
chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). The oil was analyzed on a Velocity
XPT using the following experimental conditions: DB 5ms fused silica capillary column;
carrier gas: hydrogen; injector temperature 250°C; detector temperature 250°C; column
temperature 50°C (6 min), 500-200°C, at 3°C/min. Samples were analyzed by GC–MS on
QP2010, with impact electronic in 70 and V. The identification of the constituents was
performed by a computer-based library search, as well as retention indices and visual
interpretation of the mass spectra.
Egg hatch test
The egg hatching test was performed based on the methodology described by Coles
et al. (1992). Sheep experimentally infected with H. contortus were used as a source of
fresh eggs of this parasite. H. contortus eggs were recovered according to Hubert and
Kerboeuf (1992). Briefly, 10 g of feces collected directly from the rectum were mixed with
distilled water and filtered through 590, 149, 101 and 30 µm aperture sieves. 250 µL of egg
suspension, containing approximately 100 fresh eggs, and 250 µL EsEO at concentrations
of 0.08, 0.16, 0.33, 0.67 and 1.35 mg mL
-1
were incubated for 48 h at room temperature.
After incubation, drops of Lugol were added. The eggs and L1 were counted under a
microscope. A negative control containing the diluent (3% Tween 80) and a positive
control with 0.025 mg mL
-1
thiabendazole were performed in parallel. Three repetitions
with five replicates for each E. staigeriana essential oil concentration and for each control
were performed.
42
Larval development test
An aliquot of egg suspension obtained according to Hubert and Kerboeuf (1992),
was incubated for 24 h at 37°C to obtain first-stage larvae (L1). The larval development
test (LDT) was performed using 1 mL of larval suspension, containing approximately 250
L1, and 1 mL of EsEO at concentrations of 0.33, 0.67, 1.35, 2.7 and 5.4 mg mL
-1
incubated
with 2 g of feces from a nematode-free sheep for 6 days at room temperature. Then, the
third-stage larvae (L3) were recovered according to Roberts and O'Sullivan (1950) and
counted under a microscope. A negative control with 3% Tween 80 and a positive control
with 0.008 mg mL
-1
ivermectin were also performed. Three repetitions with five replicates
for each oil concentration and for each control were conducted.
Toxicity tests
The care and handling of animals were in accordance with the internationally
accepted standard guidelines for use of animals, and the protocol was approved by the
Ethical Committee of Ceará State University (number: 08332518-2).
Acute toxicity in mice
Swiss albino mice (n=96) of both sexes, with average weight of 27.5g, were kept in
polypropylene boxes and fed with commercial feed and water ad libitum. The mice were
randomly divided into 12 groups (n = 8): G1 through G5 received 1000, 2000, 3000, 4000
and 5000 mg kg
-1
EsEO by oral administration. G6 received 3% Tween 80 by the same
route. G7 through G11 received 200, 300, 400, 500, and 600 mg kg
-1
EsEO by
intraperitoneal administration. G12 received 3% Tween 80 by intraperitoneal
administration. The animals were observed for general behavioral changes, signs of
toxicity and mortality for 6 h after treatment. After 24 h, the total number of dead animals
was verified and the lethal doses were calculated (LD10 and LD50).
Subacute toxicity in rats
Female Wistar albino rats weighing 190-260 g were housed in polypropylene cages
and fed with commercial feed and water ad libitum. The animals were randomly divided
into two groups (n=10). Group I received the dose corresponding to EsEO LD10 that had
been obtained in the acute toxicity study. As a control, group II received only vehicle (3%
43
Tween 80). The treatments were administered daily by gavage for 30 days. Toxic
manifestations and mortality were monitored daily. At the end of the 30-days period, body
weights were recorded. Blood samples were obtained by retro-orbital puncture under
diethyl ether anesthesia for hematological and biochemical analysis. This was performed at
day zero, and again at the end of the experiment. The hematological parameters analyzed
were red blood cell count (RBC), hemoglobin concentration (Hb), hematocrit (Ht), mean
corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular
hemoglobin concentration (MCHC), platelets (Plt), white blood cell count (WBC) and
white blood cell differential count (segmented neutrophils, eosinophils, lymphocytes and
monocytes).
Serum creatinine, urea, aspartate aminotransferase (AST) and alanine
aminotransferase (ALT) were determined enzymatically using specific kits by
measurement of the optical density of the reaction products at the corresponding
wavelength with a spectrophotometer (BioSystems BTS-310 photometer). After 30 days
the animals were sacrificed and the organs (kidneys, heart, liver, spleen and lungs) were
collected. The selected organs were removed, macroscopically analyzed, fixed and
preserved in 10% formalin for histopathological analysis. The tissues were soaked in
paraffin, and prepared and stained with haematoxylin and eosin for microscopic
examination.
Efficacy test on mice intestinal nematodes
Twenty-four albino Swiss mice with natural intestinal nematode infections were
allocated in standard polypropylene cages (40 cm x 34 cm x 17 cm). Every week, feces
were collected from cages to determine the infection level of Syphacia obvelata and
Aspiculuris tetraptera according to the method of Willis (1927).
The mice were randomly distributed into three groups (n = 8) and treated by gavage
over a period of five days with the following preparations: G1 – water (negative control);
G2 – 0.56 mg kg
-1
fenbendazole; G3 – 500 mg kg
-1
EsEO. Seven days after the first-day
treatment, mice were sacrificed and submitted to necropsy for parasite recovery. The large
intestine of each animal was opened into a Petri dish and examined under a stereoscopic
microscope in order to collect the parasites. Nematodes recovered were placed into glass
44
containers and fixed in AFA solution (alcohol + formol + acetic acid). They were then
counted and identified under a microscope.
Fecal egg count reduction test (FECRT)
Thirty goats from both sexes, aged from 12 to 16 months and 30 kg average weight,
were obtained from the EMBRAPA farm in the Sobral municipality. This is a semi-arid
region of northeastern Brazil. Goats were kept in paddocks and fed with fresh grass,
mineral salt and water ad libitum, from May to September 2008.
Individual fecal samples were collected to determine the level of gastrointestinal
nematode infection using a modified McMaster technique (Ueno and Gonçalves, 1998).
The animals with egg counts per gram of feces (epg) less than 1000 were inoculated with a
single dose of 1500 H. contortus L3. After 21 days, another epg analysis was carried out
and goats were divided into three homogeneous groups (mean epg of the group 6000) (n =
10). Each group was administered the following treatments: G1- untreated animals; G2 –
0.2 mg kg
-1
ivermectin; G3 – 500 mg kg
-1
EsEO. Fecal samples from each animal were
collected on treatment day 0 and on days 8, 15 and 22 post-treatment to determine epg.
Coprocultures were performed with feces using the method of Roberts and O’Sullivan
(1950).
Statistical analysis
The results of the in vitro tests are expressed as mean efficacy percentage of egg
hatching or larval development inhibition ± standard error. The analysis was performed
using ANOVA and compared by Tukey’s test (P<0.05) using the Graph Pad Prism 3.0
program. The effective concentration to inhibit 50% (EC50) egg hatching and larval
development were determined by probit method using SPSS 8.0 for Windows.
The lethal doses required to kill 50% (LD50) and 10% (LD10) of mice were
calculated for each administration route used in the acute toxicity study by probit method
using SPSS 8.0 for Windows.
The results of subacute toxicity were analyzed by ANOVA and compared by
Tukey’s test (P<0.05) using the Graph Pad Prism 3.0 program.
Efficacy of EsEO in treatment of intestinal mice nematodes was calculated by the
following formula: (worm burden of negative control group – worm burden of treated
45
group) / worm burden of negative control group X 100. The results were analyzed by
ANOVA and compared by Kruskal-Wallis test (P<0.05) using the Graph Pad Prism 3.0
program.
FECRT efficacy was calculated according to Coles et al. (1992). Results were
analyzed using ANOVA and Kruskal-Wallis test with 5% significance level.
Results
Mean efficacy percentage of egg hatching and larval development tests using EsEO
are presented in table 1. The EC50 for egg hatching was 0.324 mg mL
-1
and the EC50 for
larval development was 1.702 mg mL
-1
. EsEO treatment presented a dose-dependent effect
on inhibition of H. contortus egg hatching and larval development.
The LD10 and LD50 for orally administered EsEO calculated in the acute toxicity
study were 2675.04 (0.20- 3457.78) and 4112.94 (2814.35-38966.74) mg kg
-1
respectively.
The intraperitoneal administration of 600 mg kg
-1
EsEO killed all mice, and the LD10 and
LD50 were 299.04 (199.83-348.84) and 408.95 (351.39-466.87) mg kg
-1
, respectively.
Table 1. Mean percentage efficacy ± standard error of Eucalyptus staigeriana essential oil
on Haemonchus contortus egg hatching (EHT) and larval development (LDT).
Concentrations
(mg mL
-1
)
EHT LDT
5.4 - 99.26± 1.22A
2.7 - 59.54 ± 10.7B
1.35 99.27± 1.09A 32.15 ± 13.5C
0.67 92,64 ± 4.94A 19.46 ± 5.4D
0.33 41.54 ± 9.95B 4.26 ± 7.29D
0.16 8.24 ± 3.36C -
0.08 6.46 ± 1.76C -
Tween 80 (3%) 3.44 ± 0.44C 3.5 ± 0.57D
Positive Control * 86.69 ± 2.5A 99.81 ± 0.1A
Letters compare means in the lines. Different letters indicate significantly different values
(P < 0.05). * Positive control for EHT was 0.025 mg mL
-1
thiabendazole and for LDT
0.008 mg mL
-1
ivermectin
46
The results obtained in the subacute toxicity study starting with hematological
analyses of mice treated with E. staigeriana essential oil are presented in table 2. The
parameters affected by treatment were: CTH, Ht and Hb. The values of these parameters
were significantly smaller on the 30th day in mice treated with E. staigeriana in relation to
the control (P<0.05). Other hematological parameters did not differ statistically among
studied groups.
Table 2. Effect of 300 mg kg
-1
Eucalyptus staigeriana essential oil (mean±SE) on
hematological parameters on rats (n=10) treated during 30 days.
Parameters
Control group
Treated group
Day 0
Day 30
Day 0
Day 30
White blood cell (×10
3
mm
-3
) 9.38±0.51
a
9.16±0.42
a
9.12±0.54
a
8.94±0.43
a
Red blood cell (×10
6
mm
-3
) 7.58±0.20
ab
7.89±0.17
a
7.08±0.12
ab
6.87±0.34
b
Hemoglobin concentration (g/dl) 14.30±0.17
a
14.53±0.18
a
13.78±0.13
ab
13.07±0.54
b
Hematocrit (%) 44.39±0.73
ab
46.30±0.68
a
43.12±0.40
ab
42.14±1.94
b
Platelets (×10
3
mm
-3
) 881.20±49.09
a
848.40±46.75
a
836.40±41.97
a
892.4± 55,5
a
Segmented leukocyte (%) 14.33±2.04
a
21.11±1.23
a
16.50± 1.88
a
21.90± 4.90
a
Lymphocyte (%) 81.89±1.85
a
73.78±1.45
a
78.00±2.06
a
72.30±5.00
a
Eosinophilic leukocyte (%) 0.77±0.32
a
1.11±0.45
a
1.70±0.80
a
1.10 ± 0.31
a
Monocyte (%) 3.44±0.29
a
4.33±0,55
a
3.70 ± 0.44
a
4.00 ± 0.55
a
Mean corpuscular volume (FL) 58.70±0.92
a
58.80±0.69
a
60.95 ± 0.82
a
61.45±0.61
a
Mean corpuscular hemoglobin (pg) 18.93±0.37
a
18.46±0.22
a
19.47±0.31
a
19.1±0.25
a
Mean corpuscular hemoglobin
concentration (g/dl)
32.23±0.24
a
31.40±0.19
ab
31.97±0.29
ab
31.06±0.31
b
Small letters compare mean in the columns. Different letters indicate significantly
different values (P < 0.05).
Table 3 presents the biochemical parameters analyzed for treated animals (P>0.05).
We found no significant difference in body weight or organ morphology between treated
and control groups.
Table 3. Effect of 300 mg kg
-1
Eucalyptus staigeriana essential oil (mean ± SE) on
biochemical parameters of rats (n=10) treated during 30 days.
Parameters
Control group
Treated group
Day 0
Day 30
Day 0
Day 30
AST (UI/l) 99.11±3.80
a
58.8±3.96
b
87.00±5.30
ab
78.70±14.43
ab
ALT (UI/l) 46.00 ±2.92
a
25.22±2.45
a
45.90±2.66
a
40.00±11.8
a
Urea (mg/dL) 59.67±1.53
a
44.73±2.07
b
60.30±2.61
a
53.44±4.94
ab
Creatinine (mg/dL) 0.63±0.02
a
0.41±0.02
b
0.66±0.01
a
0.43±0.03
b
Letters compare mean in the columns. Different letters indicate significantly different
values
(P < 0.05).
47
Gas chromatography analysis indicated the following constituents of EsEO: α-
pinene (3.27%), β-pinene (2.15%), β-myrcene (0.89%), α-phellandrene (1.89%), o-cymene
(1.76%), (+)-limonene (28.82%), Eucalyptol (5.39%), y-terpinene (1.74%), α -terpinolen
(9.4%), β-linalool (1.67%), β-citronellal (0.8%), 4-terpineol (1.16%), alpha-terpineol
(1.07%), cis-geraniol (1,95%), Z-citral (10.77%), trans-geraniol (4.2%), E-citral (14.16%),
methyl geranate (3.66%), nerol acetate (1.4%) and geraniol acetate (3.86%).
The effects of EsEO on nematodes in mice are presented in table 4. The nematode
species recovered from the mice were A. tetraptera and S. obvelata. Administration of 500
mg kg
-1
EsEO resulted in 85% reduction of worm burden, similar to febendazole which has
an efficacy of 88.4%.
Table 4. Mean efficacy (±SE) of Eucalyptus staigeriana essential oil and febendazole
based in worm burden reduction of mice intestinal nematodes
Treatment % Efficacy ± SE
E. staigeriana (500 mg kg
-1
) 86.31± 6.19A
Tween 80 (3%) 18.45± 7.28B
Febendazole (0.56 mg kg
-1
) 88.14± 6.78A
Letters compare mean in the lines. Different letters indicate significantly different values
(P < 0.05).
Fecal egg count reduction after treatment with EsEO varied from 33.33% to 59.6%
at 8 and 15 days post-treatment. Ivermectin varied from 53.5% to 0% in the same period
(table 5). Trichostrongylus spp was the main genus identified in coprocultures from all
tested groups.
48
Table 5. Mean efficacy and epg (±SE) of Eucalyptus staigeriana essential oil and
ivermectin based in fecal egg count reduction test in goats.
Treatment
Day 0
Day 8
Day 15
Day 22
E. staigeriana (500 mg kg
-1
)
Mean epg
6100±475.9A
a
1580±274.1A
b
2020±247.1A
b
1410±325.4A
b
Efficacy (%)
- 33.33 59.60
54.51
Ivermectin (0.2 mg kg
-1
)
Mean epg
5280±
1343A
a
1100±187.4A
b
5230±
1147B
a
1640±415.9A
b
Efficacy (%)
- 53.50 00.00 47.09
Water
Mean epg
3550±732.2A
a
2370±
478A
a
5000±647.4B
a
3100±734.8A
a
Capital letters compare mean in the lines and small letters compare mean in the columns.
Different letters indicate significantly different values (P < 0.05).
Discussion
Medicinal plants have been used in the treatment of various ailments throughout
human history. It is important to determine the appropriate use of medicinal plants through
scientific validation. Testing should be performed on traditional treatments in order to
confirm the effectiveness, as well as to determine the safety in live organisms (Matos,
1995).
Eucalyptus essential oil is a complex mixture of a number of volatile organics
component (Salgado et al., 2003). In this study, the constituents of the active oil were
identified. EsEO is composed by 20 different substances. Our results report the
predominance of limonene and citral. Some studies have reported possible activity of citral
and limonene on insects (Prates 1998; Lee et al. 2003; Yang et al., 2005). Citral was also
shown to have antifungal activity (Yamasaki et al., 2007), antibacterial activity (Fisher et
al., 2007), and activity against the phytonematodes Bursaphelenchus xylophilus,
Meloidogyne incognita (Bauske et al., 1994; Choi et al., 2007) and the larvae of Anisakis
simplex (Hiero et al., 2006).
In this study, the EsEO presented activity against H. contortus, and effectively
targeted eggs and larval development of the parasite. The results obtained in in vitro tests
are superior to other plants tested previously. It was shown that 12.5 and 50 mg mL
-1
of
Melia azedarachta leaf ethanol extract inhibited 98.24% egg hatching and 91.64% larval
development, respectively (Maciel et al., 2006). Azadirachta indica ethanol extract
inhibited 97% egg hatching and 87.11% larval development at concentrations of 3.12 e 50
mg mL
-1
(Costa et al., 2008). Cocos nucifera ethyl acetate extract at concentrations of 5
49
and 80 mg mL
-1
inhibited 100% and 97.7% egg hatching and larval development,
respectively (Oliveira et al., 2009).
The promising results obtained in vitro tests with EsEO were followed by
toxicological studies in order to determine the safety margin and to study the effects of
EsEO on live organisms. In the present work, E. staigeriana essential oil had high LD50
values when orally administered, and showed low acute toxicity. By convention, any
substance having an LD50 value equal to 1000 mg kg
-1
when administered by the oral
route is regarded as being safe or of low toxicity (Clarke and Clarke, 1977). We did not
observe similar results when EsEO was administered by the intraperitoneal route. The
difference observed between the LD50 values in oral and intraperitoneal routes of
administration may be explained by the fact that oral administration results in lower
absorption of the substance through the gastrointestinal tract. Alternatively, the substance
may be detoxified during liver passage after oral administration, while intraperitoneal
absorption is systemic and toxic effects are seen faster and with more intensity (Loomis
and Hayes, 1996). The high LD50 values obtained indicate that EsEO can be safely
administered orally.
In the subacute toxicity study, the treated group presented significant reduction of
the hematological parameters CTH, Ht and Hb. However these values dropped within the
normal limits (Mitruka and Rawnsley, 1977; Feres et al., 2006) and results are considered
normal for this animal species. Biochemical evaluation is important because kidney and
liver toxicity have been reported following the use of phytotherapeutic products (Hilaly et
al., 2004; Isnard et al., 2004; Saad et al., 2006). In the present study, significant alterations
of the levels of AST/ALT, urea and creatinine were not observed with EsEO
administration. This result indicates that kidney and hepatic functions were preserved.
The accompaniment of increased mouse corporal mass is an important indicator of
the toxicity of a substance (Teo et al., 2002). The lack of statistical difference among the
weights of mice in the various treatment groups is another parameter that indicates low
toxicity of EsEO. Thus, our results suggest that EsEO produced no toxicity during the
treatment period.
We performed an anthelmintic test in mice in order to estimate a dose for
therapeutic use in the target species. We found that EsEO anthelmintic activity is similar to
febendazole, which was used as a positive control. The efficacy of a plant preparation can
50
be considered biologically significant when a reduction in worm burden is above 70%
(Gitriori et al., 2003). Another study using mice naturally infected with S. obvelata and A.
tetraptera, found that 800 mg kg
-1
Lippia sidoides and Croton zehntneri essentials oils
were respectively 46% and 11% effective at reducing worm burden (Camurça-Vasconcelos
et al., 2007). Mentha longifolia and Jasminum fruticans extracts at a dose of 100 mg kg
-1
were over 60% effective (Kozan et al., 2006) and Punica granatum and Syzygium cuminii
extracts at a dose of 240 mg kg
-1
were respectively 67% and 78% effective (Michelin et
al., 2005). The use of this model of activity evaluation is recommended to obtain
trustworthy and reproducible results (Kozan et al., 2006). One disadvantage the target
species are nematodes from gastrointestinal tract of small ruminants and mice nematodes
have as habitat large intestine. Nonetheless, testing effectiveness against nematodes in
mice is useful for dose extrapolation in the target species.
The high efficacy of EsEO toward mice nematodes, as well as its low cost,
prompted us to test EsEO on goat gastrointestinal nematodes. FECRT is the recommended
method for in vivo evaluation of plant anthelmintic activity and some extracts have already
yielded encouraging results. Khaya senegalensis, Calotropis procera and Hilderbrantia
sepalosa promoted epg reductions of 71%; 88.4% and 90%, respectively (Ademola et al.,
2004; Gathuma et al., 2004; Iqbal et al., 2005). Different efficacies obtained for mice and
goat nematodes can be explained by different distribution and biotransformation
mechanisms of E. staigeriana essential oil in the two animal species.
The high prevalence of Trichostrongylus spp in goats can probably be attributed to
the use of selective treatment like FAMACHA, which focuses on the management of H.
contortus infections in sheep and goats, based on the clinical identification of anemia
(Jackson and Miller, 2006).
However, in the majority of cases, the anthelmintic activity of plants has been
found to be lower than that reported for synthetic anthelmintics. Although this might not
necessarily be a problem, criteria should be established in order to evaluate whether the
anthelmintic activity is adequate to ensure that animals do not compromise their health and
growth as a result of parasitism (Githiori et al., 2006). Plants with moderate anthelmintic
activity should still be considered. While they may not be useful as a sole alternative to
anthelmintic drugs, they may still be valuable as part of an integrated approach specifically
designed to achieve sustainable parasite control in ruminant production systems. The role
51
of plants in extending the use and increasing efficacy of commercial existing anthelmintics
should be explored, particularly in plants that might help in reversing resistance (Githiori et
al., 2006).
The low epg reduction obtained with ivermectin indicates the presence of resistant
nematodes. This is a common situation in Brazil and elsewhere (Melo et al., 1998;
Schnyder et al., 2005; Camurça-Vasconcelos et al., 2008). The use of E. staigeriana
essential oil would be justified even with effectiveness less than 95%, especially in
situations where the synthetic anthelmintic was not recommended, such as on organic
farms, in milk-producing animals, or when the cost is not compensatory.
Conclusion
E. staigeriana essential oil was shown in vitro and in vivo to possess anthelmintic
activity at the concentrations and dose levels tested. However, its efficacy does not reach
the therapeutically required level of synthetic anthelmintics. Classes of secondary
metabolites found in the current experiment are considered sources of chemical
components responsible for a wide range of therapeutic activities in several medicinal
plants. Further investigation of isolated fractions at different dose levels should be pursued.
Acknowledgements
This work received financial support from CAPES and BNB/ETENE. Dr. Bevilaqua has a
grant from CNPq. We would like to thank Felipe Cavalcante Machado and Helena Araújo
da Ponte of EMBRAPA/CNPC for their assistance and Bioterium of Ceará State
University.
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57
Capitulo III
ARTIGO
EVALUATION OF Eucalyptus citriodora ESSENTIAL OIL ON GOAT
GASTROINTESTINAL NEMATODES
(Avaliação do óleo essencial de Eucalyptus citriodora sobre nematóides
gastrintestinais de caprinos)
Artigo submetido ao periodico: Veterinary Parasitology
Iara T. F. Macedo
a
, Claudia M L Bevilaqua
a*
, Lorena M. B. de Oliveira
a
, Ana L. F.
Camurça-Vasconcelos
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, Luiz da S. Vieira
b
, Adriana da R. Tomé
a
, Michelline V. Maciel
a
,
Bruno G. Portela
a
a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brazil;
b
EMBRAPA/CNPC, Brazil.
58
EVALUATION OF Eucalyptus citriodora ESSENTIAL OIL ON GOAT
GASTROINTESTINAL NEMATODES
Resumo
Fitoterapia é uma das estratégias alternativas para o controle de parasitas
gastrintestinais. Este estudo avaliou a eficácia anti-helmintica e a toxicidade do óleo
essencial de Eucalyptus citriodora (OEEC). Os efeitos in vitro do OEEC foram
determinados através do teste de eclosão de ovos e inibição do desenvolvimento larvar de
Haemonchus contortus. Na toxicidade aguda camundongos receberam diferentes doses de
OEEC através das vias oral e intraperitoneal (v.o. e i.p.) para calcular a dose letal para 50%
dos camundongos. Na toxicidade subaguda, ratos receberam 400mg kg
-1
OEEC v.o.
durante 30 dias. Foram administrados 500 e 1000 mg kg
-1
OEEC v.o. durante cinco dias
para avaliar o efeito sobre nematóides intestinais de camundongos. Foi realizado o teste de
redução da contagem de ovos nas fezes (FECRT) usando 30 caprinos infectados com
nematóides gastrintestinais divididos nos seguintes grupos: Grupo 1- 500mg kg
-1
OEEC;
Grupo 2- 0,2 mg kg
-1
ivermectina e Grupo 3-controle não tratado. Amostras de fezes foram
coletadas de cada animal para determinar opg nos dias 8, 15 e 22 pós-tratamento. Os
resultados mostraram que 5,3 e 10,6 mg mL
-1
OEEC inibiram em 98,8% e 99,71% a
eclosão de ovos e o desenvolvimento larvar de H. contortus, respectivamente. As DL50 da
toxicidade aguda foram 4153 e 622,8 mg kg
-1
pela via oral e intraperitoneal,
respectivamente. Na toxicidade subaguda, todos os parâmetros bioquímicos e
hematológicos encontrados estavam dentro da variação normal. Análise hirtopatologica
dos órgãos não apresentou alterações. Na concentração de 1000 mg kg
-1
, o óleo essencial
foi efetivo em 82,74% contra Syphacia obvelata e Aspiculuris tetraptera, parasitos de
camundongos. No FECRT, a eficácia de OEEC e ivermectina foi de 58% e 0%,
respectivamente, em caprinos 15 dias após o tratamento. Óleo essencial de E. citriodora
mostrou atividade anti-helmintica in vitro e in vivo.
Palavras-chave: Fitoterapia, anti-helmintico, Haemonchus contotus, Trichostrongylus spp,
toxicidade.
59
Abstract
Phytotherapy can be an alternative strategy for the control of gastrointestinal parasites.
This study evaluated the anthelmintic efficacy and toxicity of Eucalyptus citriodora
essential oil (EcEO). The in vitro effects of EcEO were determined through the egg
hatching test and larval development inhibition of Haemonchus contortus. In the acute
toxicity test, mice received different doses of E. citriodora essential oil by oral and
intraperitoneal routes (vo and ip) to calculate the lethal dose for 50% of the mice. In the
subacute toxicity test, rats received 400mg kg
-1
EcEO vo during 30 days. 500 and 1000 mg
kg
-1
EcEO were administrated orally for five days to evaluate its effect on mice intestinal
nematodes. The fecal egg reduction count test (FECRT) was performed using 30 goats
infected with gastrointestinal nematodes, divided into groups as follows: Group 1:500 mg
kg
-1
EcEO, Group 2: 0.2 mg kg
-1
ivermectin, and Group 3: untreated control. Fecal samples
were collected from each animal to determine epg at 8, 15 and 22 days after treatment. The
results showed that 5.3 and 10.6 mg mL
-1
EcEO inhibited 98.8% and 99.71% of H.
contortus egg hatching and larval development respectively. The LD50 levels for acute
toxicity were 4.153 and 622.8 mg kg
-1
given orally and intraperitoneally, respectively. In
the subacute toxicity test, all biochemical and hematological parameters were found to be
in the normal range. Histopathological analysis of organs did not present alterations. At a
concentration of 1000 mg kg
-1
, essential oil was 82.74% effective against the mice
parasites Syphacia obvelata and Aspiculuris tetraptera. In the FECRT, the efficacy of
EcEO and ivermectin was 58% and 0% respectively, on goat gastrointestinal nematodes 15
days after treatment. E. citriodora essential oil showed in vitro and in vivo anthelmintic
activity.
Keywords: Phytotherapy, anthelmintic, Haemonchus contortus, Trichostrongylus spp,
toxicity.
Introduction
Gastrointestinal nematode infections are a major factor reducing the economic
productivity of livestock throughout the world (Vieira, 2008). These parasites are
responsible for severe weight loss, diarrhea, anemia and early mortality, all of which cause
60
production losses, especially in small ruminants (Diehl et al., 2004). Synthetic
anthelmintics have been used to minimize the losses caused by helminth infections.
However, intensive use has led to the global emergence of multiple resistance to
anthelmintic drugs in small ruminant nematodes (Jackson and Miller, 2006). Therefore, the
search for new nematocidal substances remains a priority (Geary et al., 1999). Substances
produced from plants may represent an alternative to control gastrointestinal nematodes,
since they have the advantage of sustainable supply and are ecologically acceptable (Costa
et al., 2008). The use of medicinal plants has been reported in treating various ailments,
increasing interest in ethnomedical and ethnoveterinary cures (Bizimenyera, 2006).
Eucalyptus citriodora (Myrtaceae) is a plant native to Australia, and is widely
cultivated around the world. It is the most common species used in Brazil for extraction of
essential oil (Hasegawa et al., 2008). Hot water extracts of dried leaves of Eucalyptus
citriodora are traditionally used as analgesic, anti-inflammatory, and antipyretic remedies
for the symptoms of respiratory infections, such as colds, flue and sinus congestion (Silva
et al., 2003). The essential oil from the leaves is purported to have multiple medicinal
applications, including use as anti-fungal and antibacterial agents (Cimanga et al., 2002;
Ramezani et al., 2002; Bonaldo et al., 2007). There are also reports demonstrating its
activity against the tick Boophilus microplus (Chagas et al., 2002), Coleopteros such as
Acanthoscelides obtectus (Mazzonetto and Vendamim, 2003), Zabrotes subfasciatus and
Callosobruchus maculatus (Brito et al., 2006), and against the phytonematode
Meloidogyne incognita (Pandey et al., 2000).
The aim of this study was to evaluate the potential anthelmintic effect of E.
citriodora essential oil on goat gastrointestinal nematodes.
Materials and Methods
Essential oil obtention
Eucalyptus citriodora essential oil (EcEO) was purchased from Dierberger Óleos
Essenciais Ltda. To increase the aqueous solubility, the oil was diluted in 3% Tween 80.
Chemical analysis
The chemical composition of the EcEO used in this study was determined by gas
chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). The oil was analyzed on a Velocity
61
XPT using the following experimental conditions: DB 5ms fused silica capillary column -
carrier gas – hydrogen; injector temperature – 250°C; detector temperature – 250°C;
column temperature – 50°C (6 min), 500-200°C, at 3°C/min. The samples were analyzed
by GC–MS in a QP2010, with impact electronic in 70 and V. The identification of the
constituents was performed by a computer-based library search, as well as retention indices
and visual interpretation of the mass spectra.
Egg hatching test
The egg hatching test was performed based on the methodology described by Coles
et al. (1992). Sheep experimentally infected with H. contortus were used as a source of
fresh eggs of this parasite. H. contortus eggs were recovered according to Hubert and
Kerboeuf (1992). Briefly, 10 g of feces collected directly from the rectum, were mixed
with distilled water and filtered through 590, 149, 101 and 30 µm mesh sieves. 250 µl of
egg suspension, containing approximately 100 fresh eggs, and 250 µl of EcEO at
concentrations of 0.33, 0.66, 1.32, 2.65 and 5.3 mg ml
-1
were incubated for 48 h at room
temperature. After this time, drops of Lugol were added. The eggs and first larval stage
(L1) were counted under a microscope. This test had two controls: a negative containing
the diluent (3% Tween 80) and a positive control, 0.025 mg ml
-1
of thiabendazole. Three
repetitions with five replicates for each E. citriodora essential oil concentration and for
each control were performed.
Larval development test
An aliquot of egg suspension obtained according to Hubert and Kerboeuf (1992)
was incubated for 24 h at 37°C to obtain the L1. The larval development test (LDT) was
performed using 1 ml of larval suspension containing approximately 250 L1, and 1 ml of
EcEO at concentrations of 0.66, 1.32, 2.65, 5.3 and 10.6 mg ml
-1
, incubated with 2 g of
feces from a nematode-free sheep for 6 days at room temperature. Then the third-stage
larvae (L3) were recovered according to Roberts and O'Sullivan (1950) and counted under
a microscope. This test had two controls, a negative with 3% Tween 80 and a positive with
0.008 mg ml
-1
ivermectin. Three repetitions with five replicates for each oil concentration
and for each control were conducted.
62
Toxicity tests
The care and handling of the animals were in accordance with the internationally
accepted standard guidelines for use of animals, and the protocol was approved by the
Ethics Committee of Ceará State University (number: 08332518-2).
Acute toxicity in mice
Swiss albino mice (n=96) of both sexes, with average weight of 27.5g, were kept in
polypropylene boxes and fed with commercial feed and water ad libitum. The mice were
randomly divided into 12 groups (n = 8): G1 to G5 – received 2000, 3000, 4000, 5000 and
6000 mg kg
-1
EcEO by oral administration; G6 – 3% Tween 80 by the same route; G7 to
G11 – 300, 400, 500, 600, and 700 mg kg
-1
EcEO by intraperitoneal administration; and
G12 – 3% Tween 80 by intraperitoneal administration. The animals were observed for
general behavioral changes, signs of toxicity and mortality for 6 h after treatment. After 24
h, the total number of dead animals was verified and the lethal doses were calculated
(LD10 and LD50).
Subacute toxicity in rats
Female Wistar albino rats weighing 190-260g were housed in polypropylene cages
and fed with commercial feed and water ad libitum. The animals were randomly divided
into two groups (n=10). Group I received the dose corresponding to EcEO LD10 obtained
in the acute toxicity study and group II, the control, received only the vehicle (3% Tween
80). The treatments were administered daily by gavage for 30 days. Toxic manifestations
and mortality were monitored daily. At the end of the 30-day period, the body weights
were recorded. Blood samples were obtained by retro-orbital puncture under diethyl ether
anesthesia for hematological and biochemical analysis, on day zero and again at the end of
the experiment. The hematological parameters analyzed were red blood cell count (RBC),
hemoglobin concentration (Hb), hematocrit (Ht), mean corpuscular volume (MCV), mean
corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC),
platelets (Plt), white blood cell count (WBC) and white blood cell differential count
(segmented neutrophils, eosinophils, lymphocytes and monocytes).
Serum creatinine, urea, aspartate aminotransferase (AST) and alanine
aminotransferase (ALT) were determined enzymatically using specific kits by
63
measurement of the optical density of the reaction products at the corresponding
wavelength with a spectrophotometer (BioSystems BTS-310 photometer). After 30 days
the animals were sacrificed and the organs, kidneys, heart, liver, spleen and lungs were
collected. The selected organs were removed, macroscopically analyzed, fixed and
preserved in 10% formalin for histopathological analysis. The tissues were soaked in
paraffin and prepared and stained with haematoxylin and eosin for microscopic
examination.
Efficacy test on mouse intestinal nematodes
Thirty -two Swiss albino mice with natural intestinal nematode infections were
allocated in standard polypropylene cages (40 cm x 34 cm x 17 cm). Every week, feces
were collected from the cages to determine the infection level of Syphacia obvelata and
Aspiculuris tetraptera, according to the method of Willis (1927).
The mice were randomly distributed into four groups (n = 8) and treated by gavage
during five days with the following preparations: G1 – water (negative control); G2 – 0.56
mg kg
-1
fenbendazole; G3 – 500 mg kg
-1
EcEO; G4 – 1000 mg kg
-1
EcEO. Seven days
after treatment, the mice were sacrificed and submitted to necropsy for parasite recovery.
The large intestine of each animal was opened into a Petri dish and examined under a
stereoscopic microscope in order to collect the parasites. The nematodes recovered were
placed in glass containers and fixed in AFA solution (alcohol + formol + acetic acid),
counted and identified under a microscope.
Fecal egg count reduction test (FECRT)
Thirty goats of both sexes, aged from 12 to 16 months and weighing 30 kg on
average, from the Embrapa research farm in Sobral municipality, a semi-arid region of
northeastern Brazil, were kept in paddocks and fed with fresh grass, mineral salt and water
ad libitum, from May to September 2008.
Individual fecal samples were collected to determine the level of gastrointestinal
nematode infection using a modified McMaster technique (Ueno and Gonçalves, 1998).
The goats were inoculated with a single dose of 1500 H. contortus L3 when the egg count
per gram of feces (epg) was less than 1000. After 21 days, another epg analysis was carried
out and the goats were divided into three homogeneous groups (mean group epg of 6000)
64
(n = 10). Each group was administered the following treatments: G1 – untreated animals;
G2 – 0.2 mg kg
-1
ivermectin; and G3 – 500 mg kg
-1
EcEO. Fecal samples from each
animal were collected on treatment day 0 and on days 8, 15 and 22 post-treatment to
determine the epg. Coprocultures were performed according to the method of Roberts and
O’Sullivan (1950).
Statistical analysis
The results of the in vitro tests were expressed as mean percentage of egg hatching
or larval development inhibition ± standard error. The analysis was performed using
ANOVA and compared by the Tukey test (P<0.05) using the Graph Pad Prism program.
The effective concentrations to inhibit 50% (EC50) of egg hatching and larval
development were determined by the probit method using SPSS 8.0 for Windows.
The lethal doses required to kill 50% (DL50) and 10% (DL10) of the mice were
calculated for each administration route from the acute toxicity study by the probit method
using SPSS 8.0 for Windows.
The subacute toxicity results were analyzed by ANOVA and compared by the
Tukey test (P<0.05) using the Graph Pad Prism 3.0 program.
The efficacy of EsEO on mouse intestinal nematodes was calculated by the
following formula: (worm burden of negative control group - worm burden of treated
group) / worm burden of negative control group X 100. The results were analyzed by
ANOVA and compared by the Kruskal-Wallis test (P<0.05) using the Graph Pad Prism 3.0
program.
The FECRT efficacy was calculated according to Coles et al. (1992). The results
were analyzed using ANOVA and the Kruskall-Wallis test (P<0.05).
Results
Egg hatching and larval development inhibition were dose dependent. Table 1
shows the mean efficacy according to the egg hatching and larval development tests using
EcEO. The EC50 for egg hatching and larval development inhibition were 1.14 (0.67 –
2.01) mg ml
-1
and 2.71 (2.00 – 3.69) mg ml
-1
, respectively.
65
Table 1. Mean percentage efficacy ± standard error of Eucalyptus citriodora essential oil on
Haemonchus contortus egg hatching (EHT) and larval development (LDT).
Concentrations (mg ml
-1
) EHT LDT
10.6 - 99.71 ± 0.11A
5.3 98.8 ± 0.43A 87.92 ± 1.90B
2.65 97.78 ± 0.40AE 46.93 ± 2.14C
1.32 48.72 ± 3.26B 7.08 ± 1.68D
0.66 14.31 ± 0.99C 3.35± 1.32D
0.33 7.78± 1.08D -
Tween 80 (3%) 3.12 ± 0.45D 3.5 ± 0.57D
Positive Control* 92.7 ± 1.28E 99.81 ± 0.1A
Capital letters compare means in the lines. Different letters indicate significantly different values (P
< 0.05). * Positive control for EHT was 0.025 mg ml
-1
thiabendazole and for LDT 0.008 mg ml
-1
ivermectin
Table 2 shows the subacute toxicity results obtained from the hematological
analyses of mice treated with E. citriodora essential oil. The WBC differed statistically in
relation to the control (P<0.05) and its values were highest for mice treated with E.
citriodora on the 30
th
day.
Table 2. Mean ± SE of hematological parameters on rats (n=10) treated with 400 mg kg
-1
Eucalyptus citriodora essential oil over 30 days.
Parameters
Control group
Treated group
Day 0
Day 30
Day 0
Day 30
White blood cell (×10
3
mm
-3
) 9.38±0.51
ab
9.16±0.42
ab
8.44±0.53
a
11.20±0.61
b
Red blood cell (×10
6
mm
-3
) 7.58±0.20
a
7.89±0.17
a
7.18±0.19
a
7.59±0.13
a
Hemoglobin concentration (g/dl) 14.30±0.17
a
14.53±0.18
a
13.93±0.12
a
14.33±0.12
a
Hematocrit (%) 44.39±0.73
a
46.30±0.68
a
43.24±0.56
a
44.87±0.45
a
Platelets (×10
3
mm
-3
) 881.20±49.09
a
848.40±46.75
a
798.4±49.76
a
849.3± 51.5
a
Segmented leukocyte (%) 14.33±2.04
a
21.11±1.23
a
16.90± 1.38
a
19.00± 1.63
a
Lymphocyte (%) 81.89±1.85
a
73.78±1.45
a
78.60±1.70
a
76.40±1.42
a
Eosinophilic leukocyte (%) 0.77±0.32
a
1.11±0.45
a
0.70±0.30
a
0.20 ± 0.13
a
Monocyte (%) 3.44±0.29
a
4.33±0,55
a
3.60 ± 0.73
a
4.40 ± 0.52
a
Mean corpuscular volume (FL) 58.70±0.92
a
58.80±0.69
a
60.39 ± 1.02
a
59.2±0.70
a
Mean corpuscular hemoglobin (pg) 18.93±0.37
a
18.46±0.22
a
19.46±0.37
a
18.92±0.23
a
Mean corpuscular hemoglobin
concentration (g/dl)
32.23±0.24
a
31.40±0.19
a
32.22±0.16
a
31.93±0.12
a
Letters compare mean in the columns. Different letters indicate significantly different
values (P < 0.05).
66
In the acute toxicity tests, the LD10 and LD50 calculated for oral administration
were 2609 (689.7 – 3466.4) and 4153.2 (2861.8 – 5849.2) mg kg
-1
, respectively. In the test
with intraperitoneal administration, LD10 and LD50 were 478.3 (439.8 – 505) and 622.8
(603.3 – 645.5) mg kg
-1
, respectively.
The biochemical parameters for subacute toxicity are presented in table 3. All
parameters showed no significant alterations between the treated and control groups on
30
th
day. There was no significant difference between the treated and control groups with
respect to the rats’ weight. There were no morphologic alterations related to toxicity in the
organs analyzed.
Table 3. Effect (mean ± SE) of 400 Eucalyptus citriodora essential oil on biochemical
parameters of rats (n=10) treated during 30 days.
Parameters
Control group
Treated group
Day 0
Day 30
Day 0
Day 30
AST (UI/l) 99,11±3.80
a
58.8±3.96
b
101.1±4.18
a
67.00±3.54
b
ALT (UI/l) 46.00 ±2.92
a
25.22±2.45
a
45.00±2.35
a
25.30±1.68
a
Uréia (mg/dL) 59.67±1.53
a
44.73±2.07
b
61.70±2.40
a
48.72±2.28
b
Creatinine (mg/dL) 0.63±0.02
a
0.41±0.02
b
0.68±0.01
a
0.48±0.01
b
Small letters compare mean in the columns. Different letters indicate significantly different
values (P < 0.05).
The effects of EcEO on mouse nematodes are presented in table 4. The efficacy of
dose of 500 mg kg
-1
EcEO was 69.64% on worm burden reduction and the efficacy of
febendazole was 88.09%.
Table 4. Mean efficacy (±SE) of Eucalyptus citriodora essential oil and febendazole based
on worm burden reduction of mice intestinal nematodes
Treatment % Efficacy ± SE
E. citriodora (500 mg kg
-1
)
69.64± 8.8A
E. citriodora (1000 mg kg
-1
) 82.74± 4.75A
Tween 80 (3%) 18.45± 7.27B
Febendazole (0,56 mg kg
-1
) 88.09± 5.54A
Capital letters compare mean in the lines. Different letters indicate significantly different
values (P < 0.05).
67
The results obtained by gas chromatography indicated the following main
constituents and respective concentrations: beta-pinene (0.8%); beta-citronellol (2.39%);
(-)-isopulegol (6.46%); eucalyptol (0.66%); beta-citronellal (57.53%); isopulegol (3.45%);
beta-caryophyllene (1.04%); and citronellyl acetate (0.59%).
Table 5 present the results of the FECRT. On day 8 post-treatment, EcEO (P<0.05)
and ivermectin (P<0.05) reduced epg significantly. The maximum FECRT observed was
53.5% for ivermectin on day 8 and 58.24% for EcEO on day 15. The larvae identified in
coprocultures were Trichostrongylus spp and Haemonchus spp.
Table 5. Mean efficacy and epg (± SE) of 500 mg kg
-1
Eucalyptus citriodora essential oil
and 0.2 mg kg
-1
ivermectin based on fecal egg count reduction test in goats.
Tratamentos
Day 0
Day 8
Day 15
Day 22
E. citriodoraa
Mean epg 5266±475.9A
a
1777±274.1A
b
2088±247.1A
b
2188±325.4A
b
Efficacy (%) - 25.02 58.24 29.41
Ivermectin
Mean epg 5280±
1343A
a
1100±187.4A
b
5230±
1147B
a
1640±415.9A
b
Efficacy (%) - 53.50 00.00 47.09
Water
Mean epg 3550±732.2A
a
2370±
478A
a
5000±647.4B
a
3100±734.8A
a
Capital letters compare mean in the lines and small letters compare mean in the columns.
Different letters indicate significantly different values (P < 0.05).
Discussion
We found no previous publications on the anthelmintic activity of the essential oil
of E. citriodora on parasitic gastrointestinal nematodes. The in vitro model reported in this
study demonstrated the ovicidal and larvicidal effects of essential oil of E. citriodora
against H. contortus.
The investigation of chemical compounds from natural products is important for the
development of new anthelmintic drugs, especially in view of the vast worldwide flora
(Assis et al., 2003). In this study, chemical analysis of EcEO identified eight substances
that can be responsible for the anthelmintic activity found. In essential oils some
components have a higher concentration and are known as major components. Our results
68
show the predominance of citronellal. This main component showed activity against
insects such as the housefly (Lee et al., 2003) and also against females, males and juveniles
of the phytonematode Bursaphelenchus xylophilus (Choi et al., 2007).
EcEO inhibited egg hatching and larval development at a low concentration
compared to other plants studied previously. Ethyl acetate extract of Cocos nucifera at 5
and 80 mg ml
-1
concentrations inhibited 100% and 97.7% of egg hatching and larval
development (Oliveira et al., 2008). Ethyl acetate extract of Spigelia anthelmia inhibited
83.8% of egg hatching and 83.1% of larval development at concentrations of 25 mg ml
-1
(Assis et al., 2003). Aqueous extract of Annona senegalensis leaves inhibited 11.5% of egg
hatching at a concentration of 7.1 mg ml
-1
(Alawa et al., 2003).
Since the in vitro tests presented good results, the essential oil was submitted to
toxicological studies to evaluate its effect and to estimate the dose on live organisms.
Substances with LD50 value of 1000 mg kg
-1
by the oral route are regarded as being safe
or of low toxicity (Clarke and Clarke, 1977). EcEO presented low acute toxicity by the oral
route but LD50 by the intraperitoneal route was higher. The difference observed between
LD50 values via oral and intraperitoneal administration may be explained by the fact that
in oral administration less of the substance is absorbed than from the gastrointestinal tract,
or the substance can become detoxified during liver passage, while intraperitoneal
absorption is systemic and the toxic effects are produced faster and more intensely
(Loomis and Hayes, 1996). The high LD50 values obtained indicate that EcEO can be
administered with a high degree of safety.
The subacute toxicity of the treated group presented a significant increase of WBL,
however the values dropped within the normal limits (Mitruka and Rawnsley, 1977; Feres
et al., 2006). In the present study, no significant alterations were observed with EcEO
administration and the hepatic parameters (AST/ALT) and creatinine and urea levels
indicate kidney and liver function was preserved. This was also confirmed by the absence
of histopathological changes in all the organs analyzed.
Changes in body weights can indicate adverse side effects. Generally, weight loss is
a simple and sensitive index of toxicity after exposure to toxic substances (Teo et al.,
2002). The absence of statistical differences between mouse weights in this study is
another parameter that indicates low toxicity of EcEO. This suggests that EcEO does not
produced toxicity in the treatment period.
69
The anthelmintic activity of EcEO on mouse nematodes was similar to that of
febendazole, used as positive control. It is generally considered that the efficacy of a plant
preparation is biologically significant when the reduction in worm burden is above 70%
(Gitriori et al., 2003). In other studies using mice naturally infected with S. obvelata and A.
tetraptera, the effectiveness of Tynnanthus fasciculatus was 57.2% (Amorim et al., 1987),
Chenopodium ambrosioides was below 20% (Borba and Amorim, 2004) and Lippia
sidoides and Croton zehntneri essentials oils was 46% and 11%, respectively (Camurça-
Vasconcelos et al., 2007). The use of mice as models to evaluate anthelmintic activity is
recommended to obtain reliable and reproducible results (Kozan et al., 2006). Even so, it
has the disadvantage that the target nematode species inhabit the gastrointestinal tract of
small ruminants and mouse nematodes inhabit the large intestine. However, this test can
help researchers extrapolate the dose for the target species.
In the goat coprocultures, there was a high prevalence of Trichostrongylus spp. This
may be explained by the intensive use of selective treatment of animals by application of
FAMACHA system, which is focused on the management of H. contortus infections in
sheep and goats, based on the clinical identification of anemia in individual animals within
a flock (Reis, 2004).
The lack of efficacy detected in the field is similar to the results presented in other
works: 1 g kg
-1
of powdered raw Ananas comosus leaves reduced the epg by 15.3% on
13th day after administration (Hordegen et al., 2003); 3g kg
-1
of crude Zingiber officinale
powder reduced the epg by 25.6% (Iqbal et al., 2006); and 0.90g kg
-1
of crude extract of
Coriandrum sativum reduced the epg by 24.79% (Equale et al., 2007).
Two hypotheses can justify the different efficacy obtained on mouse and goat
nematodes. It could be the treatment duration, 5 days in mice and 3 days in goats. Or it
could be a difference in the mechanism of distribution and biotransformation of essential
oils in monogastric and polygastric animals. This way, the lower efficacy observed by
administering oil to goats could also be due to the destruction of active substances by the
ruminal flora and/or ruminal pH.
Ivermectin produced a small reduction of FEC, indicating the presence of resistant
nematodes, a common fact in northeastern Brazil and elsewhere (Schnyder et al., 2005;
Sargison et al., 2007; Kumsa and Abebe, 2008). The use of essential oil would be justified
even with effectiveness below 95% in situations where synthetic anthelmintics are not
70
recommended, such as in organic breeding, dairy production or when the cost is not
compensatory. Therefore, the alternative use of plants may be a useful tool associated with
other methods to control gastrointestinal nematodes of small ruminants (Camurça-
Vasconcelos et al., 2008).
Plants with moderate anthelmintic activity should still be considered, perhaps not as
a total alternative to anthelmintic drugs, but as part of an integrated approach specifically
designed to achieve sustainable parasite control in ruminant production systems. The role
of plants in extending the use and increasing the efficacy of existing anthelmintics thus
warrants study (Githiori et al., 2006).
In conclusion, E. citriodora essential oil presented promising results, but the
efficacy did not reach the therapeutically required level. Further investigation of isolated
fractions, at different dose levels, should be pursued.
Acknowledgements
This work received financial support from CAPES and BNB/ETENE. Dr. Bevilaqua has a
grant from CNPq. We would like to thank Felipe Cavalcante Machado and Helena Araújo
da Ponte of EMBRAPA/CNPC for their assistance and Bioterium of Ceará State
University.
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75
9. CONCLUSÕES
Os óleos essenciais de Eucalyptus citriodora, E. staigeriana e E. globulus
apresentaram eficácia in vitro, tanto ovicida como larvicida sobre H. contortus.
Com relação aos testes in vivo, os óleos E. staigeriana e E. citriodora apresentaram
baixa eficácia anti-helmíntica, sendo semelhantes ao grupo controle tratado com anti-
helmíntico sintético em se tratando de populações resistentes.
76
10. PERSPECTIVAS
A partir desse trabalho surgem novas perspectivas para a utilização dos óleos
essenciais de Eucalyptus, sendo necessários novos estudos para encontrar doses,
formulações e vias de administração que possibilitem potencializar a sua atividade anti-
helmíntica in vivo.
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11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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__Fortaleza, 2008.
88p. . il.
Orientadora: Prof
a
Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) -
Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Fitoterapia 2. In vivo 3. In vitro 4. Toxicidade 5. Haemonchus
contortus
I.Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 615.32
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