Download PDF
ads:
TATIANA IERVOLINO RICCA
A expressão de Timp1 associada à desmetilação de seu
promotor confere resistência ao anoikis durante a
transformação maligna de melanócitos murinos
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo para obtenção
do título de Doutor em Ciências.
São Paulo
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
TATIANA IERVOLINO RICCA
A expressão de Timp1 associada à desmetilação de seu
promotor confere resistência ao anoikis durante a
transformação maligna de melanócitos murinos
Tese preparada durante o Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia e Imunologia do
Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia (DMIP), na Disciplina de Imunologia e
apresentada à Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis
São Paulo
2008
ads:
FICHA CATALOGRÁFICA
RICCA, Tatiana Iervolino
A expressão de Timp-1 associada à desmetilação de seu promotor
confere resistência ao anoikis durante a transformação maligna de
melanócitos murinos. Tatiana Iervolino Ricca – São Paulo, 2008.
xvii, 203f
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola
Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Microbiologia e
Imunologia.
Título em inglês. Timp-1 expression associated with promoter
demethylation confers anoikis resistance along murine melanocyte
malignant transformation.
1. Inibidor de metaloprotease 1 (Timp1). 2. Resistência ao anoikis.
3. Metilação de DNA. 4. Transformação maligna. 5. Melanoma
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA,
IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE IMUNOLOGIA
Chefe de Departamento: Prof. Dr. José Daniel Lopes
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara
Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de
Imunologia do Departamento de Microbiologia,
Imunologia e Parasitologia da Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina, com auxílios
financeiros concedidos pela Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES).
Aos meus pais, Artur e Valquíria, pelo amor
e apoio incondicionais, e pelo exemplo de vida
que me guiou até aqui, obrigada. Amo vocês.
Ao meu irmão mais querido, Gustavo, pelo
apoio constante, dedicação, paciência e amor,
obrigada.
À Profa. Dra. Miriam Galvonas Jasiulionis
pela orientação, apoio, paciência e
perseverança, expresso minha profunda
gratidão por sua inabalável determinação e
pelos ensinamentos que enriqueceram minha
formação profissional, obrigada.
Ao Prof. Dr. José Daniel Lopes pelos
valiosos ensinamentos, por sua
disponibilidade e auxílio indispensáveis para
a realização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
São inúmeras as pessoas a quem desejo agradecer pelo apoio e carinho que me
dedicaram durante a realização deste trabalho. Agradeço:
Aos Professores Doutores da Disciplina de Imunologia, Mario Mariano, Joel
Machado Júnior, Ieda Maria Longo Maugéri, Célia Regina Whitaker Carneiro e Zulma
Peixinho, pelo apoio científico, sugestões e críticas no decorrer do trabalho.
À Dra. Mariângela Corrêa pelo apoio, sensatez, críticas e sugestões valiosas que
foram muito importantes para a execução deste trabalho.
À amiga de todas as horas Fabiana Aliperti que sempre esteve ao meu lado,
trazendo equilíbrio em horas difíceis, alegria nos momentos de tristeza e muita
paciência durante todo o meu trajeto. Obrigada pela amizade incondicional, pela
lealdade e por estar aqui sempre quando precisei.
À amiga Amanda G. S. Silva pela maravilhosa convivência, amizade e apoio
constante. Obrigada pelo auxílio técnico e pelas ricas discussões científicas que foram
essenciais em muitos momentos do meu trabalho.
À queridona amiga Ana Paula Mitsue Suenaga pelo apoio, paciência,
generosidade, ajuda, principalmente na hora de realizar os ensaios in vivo feitos neste
trabalho, e por sua amizade. A sua presença tornou esse caminho mais fácil.
À grande amiga Dra Flávia Vigna pelo seu companheirismo infinito, amizade,
apoio e confiança. A minha gratidão não cabe em palavras, mas posso dizer que a
diversão ao seu lado está sempre garantida.
Às minhas queridas amigas Adriana Konno, Aline Morgado e Fabiana Toshie pela
presença constante, apoio, paciência e amizade. Certamente sem vocês não teria sido
tão divertido.
Ao meu namorado Aldo de Paula Júnior pelo carinho, sensatez, equilíbrio, apoio e
amor dados no final deste importante caminho da minha vida. Obrigada por tudo.
Ao Dr. Rubens Bollos pela amizade, carinho e ensinamentos da vida
Ao amigo André Bachi pela lealdade, ajuda nos experimentos, amizade e apoio
ao longo deste difícil caminho. Obrigada por fazer parte da “turminha”!!!
Ao amigo Leandro S. L. Nunes que trouxe um pouco de testosterona para o
laboratório, mostrando como tudo é mais fácil quando somos práticos. Obrigada
também pela amizade, apoio e momentos de alegria.
Às meninas do laboratório, Adriana Taveira da Cruz, Karina Santiago, Alice S.
Moraes, Mariana Toricelli, Camila Souza, Letícia Abigail, Viviane C. Cordaro, Paula
Sola, Fabiana Melo, pela agradável convivência, generosidade e incentivo constante.
Aos demais colegas pós-graduandos da Disciplina de Imunologia e da Disciplina
de Microbiologia pelo carinho, apoio e amizade.
Aos Professores e funcionários do Departamento de Microbiologia, Imunologia e
Parasitologia pelo auxílio.
Aos funcionários da Disciplina de Imunologia Aparecido Mendes, Geová dos
Santos, Zélia Pereira, Creusa Marina, Ivone Mozat Eraldina do Nascimento, Gisélia
Lopes e Creuza Rosa pelo carinho e constante ajuda.
Às instituições de fomento CAPES e FAPESP pelo auxilio financeiro.
À todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
ÍNDICE
INTRODUÇÃO......................................................................................................... 1
1. Melanoma.............................................................................................................
2. Resistência ao anoikis e transformação maligna.................................................
3. Timp1....................................................................................................................
3.1 Timp e câncer.................................................................................................
3.2 Aspectos gerais de Timp1..............................................................................
3.3 Timp1 como molécula multifuncional.............................................................
3.3.1 Regulação da proliferação celular.........................................................
3.3.2 Regulação da angiogênese...................................................................
3.3.3 Regulação da apoptose........................................................................
3.4 Timp1 e eventos epigenéticos........................................................................
4. Metilação de DNA e câncer..................................................................................
5. Modelo de transformação neoplásica...................................................................
1
6
8
8
13
15
15
16
16
19
21
27
OBJETIVOS............................................................................................................. 31
1. Objetivo geral.......................................................................................................
2. Objetivos específicos............................................................................................
31
31
MATERIAL............................................................................................................... 32
1. Comitê de Ética e Pesquisa.................................................................................
2. Animais.................................................................................................................
3. Anticorpos.............................................................................................................
4. Drogas e reagentes..............................................................................................
5. Enzimas................................................................................................................
6. Linhagens Celulares.............................................................................................
7. Oligonucleotídeos.................................................................................................
8. Programas............................................................................................................
32
32
32
33
35
36
36
36
MÉTODOS............................................................................................................... 37
1. Meios de Cultura..................................................................................................
1.1 Preparação dos meios de cultura...................................................................
1.2 Meios para cultivo de bactérias......................................................................
1.3 Meios para cultivo e manutenção de células de mamíferos..........................
2. Cultivo e manutenção dos estoques celulares de mamíferos..............................
2.1 Cultivo celular em suspensão........................................................................
2.2 Cultivo celular em soft-agar............................................................................
3. Desenho dos oligonucleotídeos...........................................................................
4. Extração de RNA total..........................................................................................
5. Síntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) – Transcrição reversa
e reação de polimerase em cadeia (RT-PCR).....................................................
6. RT-PCR semiquantitativo.....................................................................................
7. Western Blot............................................................. ...........................................
8. Imunofluorescência indireta..................................................................................
9. Extração de DNA genômico.................................................................................
10. Tratamento de tecido murino com Liberase.......................................................
11. Tratamento das células melan-a com agente desmetilante...............................
12. Tratamento do DNA genômico com bissulfito de sódio......................................
13. Desulfonação do DNA tratado com bissulfito de sódio......................................
14. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)………..
15. Construção do plasmídeo de expressão............................................................
16. Preparação de bactérias competentes...............................................................
17. Transformação de bactérias competentes por CaCl
2.............................................................
18. Mini-preparação para extração de DNA plasmidial (MiniPrep).........................
19. Seleção dos clones pcDNA3.1-T1S...................................................................
20. Confirmação da seqüência dos clones selecionados por seqüenciamento
de DNA...............................................................................................................
21. Maxi-preparação para extração de DNA plasmidial (MaxiPrep) ......................
22. Purificação plasmidial por coluna de gradiente de Césio (CsCl
2
) .....................
23. Tranfecção de DNA plasmidial com lipossomos em células de camundongo..
24. Ensaio de proliferação celular in vitro.................................................................
25. Ensaio de ciclo celular......................................................................................
26. Tumorigênese in vivo.........................................................................................
27. Ensaio de metástase experimental....................................................................
37
37
37
37
38
38
38
39
40
41
43
43
44
45
46
47
48
48
49
50
52
53
53
54
56
57
58
59
61
61
62
62
28. Zimograma.........................................................................................................
29. Imunohistoquímica.............................................................................................
30. Ensaio de migração celular in vitro.....................................................................
31. Ensaio de invasão celular in vitro.......................................................................
32. Ensaio de imunoprecipitação.............................................................................
33. Análise Estatística..............................................................................................
63
64
65
65
66
67
RESULTADOS......................................................................................................... 68
1. Transformação maligna associada com resistência ao anoikis...........................
1.1 Morfologia das linhagens ao longo da transformação maligna………………
1.2 Análise da proliferação celular in vitro e tumorigenicidade in vivo das
linhagens celulares derivadas das células melan-a.......................................
1.3 Análise da resistência ao anoikis ao longo da transformação maligna
dos melanócitos.............................................................................................
2. Padrão de expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna..................
2.1 Análise da atividade de Mmps reguladas por Timp1 ao longo da
transformação maligna dos melanócitos...................…...............……………
3. Expressão de Timp1 regulada por mecanismos epigenéticos.............................
3.1 Expressão do RNA mensageiro de Timp1 em células melan-a após
tratamento com agente desmetilante...............................................................
3.2 Presença de dinucleotídeos CpG na seqüência genômica do gene Timp1...
3.3 Nível da metilação de DNA no gene Timp1…………………………………….
4. Papel da expressão de Timp1 nos melanócitos e em células de
melanoma...............................................................................................................
4.1 Expressão do RNA mensageiro de Timp1 em células melan-a e Tm5
após transfecção com plasmídeo de expressão para Timp1.........................
4.2 Superexpressão de Timp1 não influencia na proliferação celular…………...
4.3 A superexpressão de Timp1 causa resistência ao anoikis em
melanócitos e em células de melanoma cultivados por 96 horas em
suspensão......................................................................................................
4.4 A superexpressão de Timp1 causa resistência ao anoikis em
melanócitos melan-a cultivados em soft-agar................................................
4.5 A superexpressão de Timp1 causada pelo
tratamento com agente desmetilante 5-Aza-CdR
não resulta na resistência ao anoikis em melanócitos melan-a.....................
4.6 A superexpressão de Timp1 em melanócitos melan-a não é capaz de
induzir crescimento tumoral in vivo……………………………………………...
68
68
71
74
76
79
82
82
82
85
88
88
88
91
93
93
96
4.7 A superexpressão de Timp1 aumenta a migração in vitro de células de
melanoma....... ..........………………………………………………....................
4.8 A superexpressão de Timp1 em células de melanoma não resulta em
fenótipo mais invasivo in vitro………………………………………………........
4.9 Possível participação de Timp1 na sinalização celular..................................
98
101
104
DISCUSSÃO............................................................................................................ 106
REFERÊNCIAS........................................................................................................ 116
ABSTRACT
APÊNDICE
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Modelo de progressão do melanoma proposto por Clark.........................
Figura 2. Principais passos na formação da metástase...........................................
Figura 3. Estrutura primária da proteína TIMP1.......................................................
Figura 4. Mapa esquemático de genes que flanqueiam TIMP1...............................
Figura 5. Mecanismo de metilação de DNA.............................................................
Figura 6. Metilação de DNA e câncer.......................................................................
Figura 7. Modelo de transformação maligna de melanócitos
associado à resistência ao anoikis...........................................................................
Figura 8. Produto de RT-PCR gerado a partir de cDNA
enriquecido para o gene Timp1................................................................................
Figura 9. Esquema de seleção dos clones de Timp1 senso e anti-senso...............
Figura 10. Morfologia dos melanócitos melan-a e das linhagens obtidas após
ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem.........................................................
Figura 11. Proliferação celular in vitro......................................................................
Figura 12: Tumorigenicidade in vivo das linhagens derivadas de células melan-a..
Figura 13: Linhagens estabelecidas após submeter melanócitos a ciclos
seqüenciais de bloqueio de ancoragem são mais resistentes ao anoikis que a
linhagem parental melan-a.......................................................................................
Figura 14. Cluster de genes associados ao câncer de Mus Musculus....................
Figura 15. Aumento da expressão do RNA mensageiro de Timp1 durante a
transformação maligna dos melanócitos melan-a....................................................
Figura 16. Análise da expressão da proteína Timp1 durante a transformação
maligna dos melanócitos melan-a............................................................................
Figura 17. Análise da atividade das metaloproteases 2 e 9 durante a
transformação maligna dos melanócitos melan-a....................................................
Figura 18. O tratamento com agente desmetilante induz a expressão de Timp1
em melanócitos melan-a..........................................................................................
Figura 19. Representação esquemática da localização dos sítios CpG no
promotor e primeiro exon de Timp1.........................................................................
Figura 20. A desmetilação do promotor e primeiro exon de Timp1 está
correlacionada com sua expressão nos melanócitos melan-a.................................
Figura 21. A desmetilação progressiva do promotor e primeiro exon de
Timp1 está correlacionada com sua expressão durante a
transformação neoplásica dos melanócitos melan-a...............................................
Figura 22. Superexpressão de Timp1 em melanócitos melan-a
e em células de melanoma Tm5..............................................................................
4
9
12
14
23
24
28
51
55
69
72
73
75
77
78
80
81
83
84
86
87
89
Figura 23. A superexpressão de Timp1 não afeta a proliferação
das linhagens melan-a e Tm5..................................................................................
Figura 24. Células melan-a superexpressando Timp1 tornam-se resistentes ao
anoikis......................................................................................................................
Figura 25. Células melan-a expressando Timp1 são capazes
de formar colônias em soft-agar como a linhagem de melanoma Tm5...................
Figura 26. Células melan-a tratadas com agente desmetilante
não se tornam resistentes ao anoikis.......................................................................
Figura 27. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de melanócitos melan-a
superexpressando Timp1.........................................................................................
Figura 28. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de células de melanoma Tm5
superexpressando Timp1.........................................................................................
Figura 29. Metástase experimental in vivo de células de melanoma Tm5
superexpressando Timp1.........................................................................................
Figura 30. Ensaio de migração celular in vitro dos melanócitos melan-a e de
células de melanoma Tm5 superexpressando Timp1..............................................
Figura 31. Ensaio de invasão celular in vitro dos melanócitos melan-a e de
células de melanoma Tm5 superexpressando Timp1..............................................
Figura 32. A proteína Timp1 está associada com β1 integrinas..............................
90
92
94
95
97
99
100
102
103
105
LISTA DE ABREVIATURAS
µg micrograma
µL microlitro
µM micromolar
1C linhagem obtida após submeter céluals melan-a um ciclo de
bloqueio da adesão ao substrato.
2C linhagem obtida após submeter céluals 1C um ciclo de
bloqueio da adesão ao substrato.
3C linhagem obtida após submeter céluals 2C um ciclo de
bloqueio da adesão ao substrato.
4C linhagem obtida após submeter céluals 3C um ciclo de
bloqueio da adesão ao substrato.
4C3, 4C11, Tm1 e Tm5 diferentes linhagens de melanoma obtidas a partir da
diluição limitante de esferóides formados após submeter a
linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da adesão ao substrato.
ATP adenosina-trifosfato
bp pares de base
BSA soro albumina bovina
cDNA DNA complementar
dinucleotídeo CpG nucleotídeo citosina precedido de uma guanina
DNA ácido desoxirribonucleico
DNMT DNA metiltransferase
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilenodiamino tetracético
FACS Fluorescence Activeted Cell Sorting
GST gene suppressor de tumor
Ig Imunoglobulina
IL interleucina
ilha CpG região rica em dinucleotídeos CpG
Kb quilo base
kDa quilo Dalton
MB membrana basal
MBD methyl binding protein
MEC matrix extracelular
mg miligrama
mL mililitro
mM milimolar
MMP metaloprotease de matriz
nM nanomolar
pb pares de base
PBS Tampão salino fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
PMA Éster de forbol-miristato
RGP melanoma primário de fase de crescimento radial
RNA ácido ribonucléico
rpm rotação por minuto
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
Timp inibidor de metaloprotease de matriz
v/v volume a volume
VGP melanoma primário de fase de crescimento vertical
RESUMO
Embora a resistência ao anoikis seja considerada um importante processo
envolvido no fenótipo maligno, a relação causal entre transformação neoplásica e
crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa
correlação, foi desenvolvido em nosso laboratório um modelo experimental de
transformação maligna de melanócitos murinos, em que melanócitos melan-a foram
submetidos a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo,
foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermediárias
da progressão tumoral como linhagens de melanoma, as quais são progressivamente
resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progressão tumoral. Análises de
expressão gênica mostraram aumento da expressão de Timp1 nas linhagens de
melanoma quando comparadas à linhagem parental de melanócitos. Ainda que descrita
como inibidora de MMPs, essa proteína foi recentemente associada à resistência ao
anoikis em células epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste
trabalho: 1) a relação entre expressão de Timp1 e aquisição do fenótipo resistente ao
anoikis e 2) a possível regulação epigenética da expressão de Timp1 por metilação de
DNA neste modelo. Enquanto células melan-a expressam baixos níveis de Timp1,
todas as linhagens derivadas desta expressam níveis elevados desta proteína. O
tratamento dos melanócitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina
resultou em aumento significativo da expressão de Timp1. De fato, a análise pelo
ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou
aumento progressivo na desmetilação do gene Timp1 em paralelo a sua crescente
expressão ao longo da transformação maligna. A superexpressão de Timp1 em células
melan-a resultou no aumento da sobrevivência das mesmas em condições
independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transformá-las. Além disso, o tempo
de latência para o aparecimento de tumores foi menor para células de melanoma
transfectadas com Timp1, indicando que esta molécula pode estar associada com a
agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expressão de Timp1
durante a transformação maligna, em decorrência da desmetilação gênica progressiva,
associado ao aumento da resistência ao anoikis, mas não à aquisição de um fenótipo
maligno transformado.
INTRODUÇÃO
Introdução
1. Melanoma
Em 2005 o câncer foi responsável por 13% das mortes ocorridas no mundo,
sendo que mais de 70% destas ocorreram em países de média ou baixa renda (WHO,
2006). No ano passado, foram estimados 59.940 novos casos de melanoma nos
Estados Unidos, com uma expectativa de 8.110 mortes (American Cancer Society,
2007). Estima-se que em 2008 dentre todos os tipos de câncer o de pele será o mais
incidente na população brasileira com 120.930 casos novos, dos quais 4,9% serão de
melanoma (INCA, 2007). Mesmo sendo o tipo de câncer de pele mais raro, o
melanoma é responsável pela maioria das mortes (aproximadamente 80%)
relacionadas ao câncer de pele (Lewis et al., 2005; Medic et al., 2007), sendo que
apenas 14% dos pacientes com melanoma metastático sobrevivem por cinco anos
(American Cancer Society, 2003).
A maioria dos pacientes diagnosticados com melanoma primário é curada após
excisão cirúrgica do tumor (Miller & Mihm, 2006). Porém, em estádios avançados
raramente é tratável por não responder às formas de terapia utilizadas atualmente e
por isso apresenta prognóstico ruim com taxa de sobrevida média de seis meses
(Wascher et al., 2003; Miller & Mihm, 2006). Diferente da maioria, o melanoma não está
associado à idade, sendo um dos tipos de câncer mais comuns e letais entre pessoas
na faixa dos 20 a 35 anos. Por afligir jovens e adultos na meia idade, o impacto
socioeconômico e psicológico é enorme, pois há perda de produtividade destes
indivíduos causada pela patologia (Houghton & Polsky, 2002; Tsao et al., 2004).
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma são histórico
familiar, múltiplos nevos (benignos ou atípicos) e ocorrência de melanoma prévio.
Fatores de risco adicionais incluem sensibilidade ao sol, exposição solar excessiva e
doenças imunossupressoras. Cada um desses fatores corresponde a uma
predisposição genética ou um estressor ambiental que contribuirão para a gênese do
melanoma (Miller & Mihm, 2006). Aliás, o melanoma é visto como um dos melhores
exemplos de como genética e meio ambiente interagem na patogenicidade do tumor
(Houghton & Polsky, 2002), já que sua incidência é influenciada pela cor da pele e
parâmetros geográficos como altitude e latitude (Armstrong & Kricker, 2001).
1
Introdução
A exposição à radiação ultravioleta é o único fator de risco relacionado ao meio
ambiente conhecido em melanoma e o aumento dramático na incidência de
melanomas nos últimos 50 anos pode ser associado em parte às mudanças de hábitos
em relação ao sol (Tsao et al., 2004), já que ocorre mais frequentemente em locais do
corpo que são expostos à radiação solar. Além disso, o melanoma é
predominantemente uma doença de populações de pele clara e sua incidência é de 5 a
20 vezes menor nas populações de pele escura. Dentro da população caucasiana, a
incidência é influenciada pela proximidade ao Equador, sugerindo uma associação
desta doença com a exposição solar. Nos Estados Unidos esta relação é bem evidente,
já que a incidência do melanoma é de duas a três vezes maior nos estados do Sul
quando comparada aos estados do Norte (American Cancer Society, 2007). Por outro
lado, dados epidemiológicos sugerem que exposições crônicas ou de baixo grau à luz
ultravioleta induzem proteção contra danos ao DNA, enquanto que exposições intensas
e intermitentes com freqüentes queimaduras causam danos genéticos (Gilchrest et al.,
1999).
O melanoma se origina a partir dos melanócitos epidermais ou a partir de células
precursoras de melanócitos. Melanócitos são células produtoras do pigmento melanina,
derivadas da crista neural, que migram para a pele durante o desenvolvimento e estão
normalmente confinadas sobre a membrana basal da epiderme num padrão não
randômico (Bennett, 1993; Hsu et al., 2002). Por meio de prolongamentos dendríticos,
os melanócitos interagem com queratinócitos que se encontram na camada basal e
superficial da pele (Miller & Mihm, 2006). Cada melanócito transfere melanossomos
contendo pigmentos por estes prolongamentos para aproximadamente 36
queratinócitos basais e suprabasais, formando a unidade de melanina epidermal. Uma
vez nos queratinócitos, o pigmento protege a pele da absorção de radiação solar
nociva. Os queratinócitos são considerados parceiros celulares dominantes dos
melanócitos na epiderme e são capazes de controlar a proliferação, grau de
prolongamento dendrítico (morfologia) e quantidade de melanina contida nos
melanócitos, por estabelecerem contato direto por meio de receptores de adesão
célula-célula, como a E-caderina (Meier et al., 1998; Hsu et al., 2002).
2
Introdução
Baseado em características clínicas e histopatológicas, cinco fases da progressão
do melanoma foram propostas (Clark et al., 1984; Meier, 1998): clusters de melanócitos
normais (nevo comum), nevo displásico, melanoma primário de fase de crescimento
radial (RGP), melanoma primário de crescimento vertical (VGP), e melanoma
metastático (Figura 1).
A progressão de um melanócito para um nevo é comum e não acompanha
mudanças genéticas. O nevo comum tem tempo de vida finito e geralmente não
carrega anormalidades citogenéticas (Mancianti et al., 1993). Meier e colaboradores
(1998) acreditam que essa progressão ocorra pela perda de controle do
comportamento dos melanócitos pelos queratinócitos, mediada pelo contato normal
célula-célula. Realmente, alterações na expressão de moléculas de adesão celular
como caderinas, integrinas e proteínas da superfamília das imunoglobulinas são
importantes para o crescimento e a metástase do melanoma (McGary et al., 2002). A
diminuição dos níveis de E-caderina parece ser responsável pela redução da interação
entre melanócitos e queratinócitos (Hsu et al., 1996; Li et al., 2001). De modo inverso, o
aumento nos níveis de N-caderina pode permitir que células de melanoma interajam
com fibroblastos presentes no estroma (Smalley ecol., 2005), o que pode facilitar sua
sobrevivência fora da epiderme (Hsu et al., 2002; Haass et al., 2005).
Mudanças genéticas acompanham o desenvolvimento de nevos displásicos que
apresentam citologia e arquitetura atípicas, e são considerados precursores do
melanoma (Kraemer & Greene, 1985). Estas células podem surgir a partir de um nevo
comum preexistente ou como novas lesões (Miller & Mihm, 2006).
O aparecimento do melanoma primário RGP é gradual e espontâneo, e pode não
requerer mudanças moleculares adicionais. Estas células são capazes de se espalhar
horizontalmente na epiderme e na parte superior da derme, mas são raramente
metastáticas (Houghton & Polsky, 2002) e por isso estão associados a um bom
prognóstico (Gaglioli & Sahai, 2007).
3
Introdução
Figura 1. Modelo de progressão do melanoma proposto por Clark. Os melanomas são classificados
histologicamente de acordo com sua locação e estágio da progressão. Cinco estágios foram propostos
na evolução do melanoma com base nesses critérios histológicos: nevo adquirido e congênito comum
sem mudanças displásicas; nevo displásico com estrutura e arquitetura atípicas; melanoma primário de
fase de crescimento radial (RGP), melanoma primário de crescimento vertical (VGP), e melanoma
metastático (Clark et al., 1984). Figura modificada de Miller & Mihm, 2006.
4
Introdução
Invasão local e metastatização são processos responsáveis pela morbidade e
mortalidade associadas ao melanoma. O aparecimento de características invasivas
ocorre na fase de crescimento vertical (VGP), quando células de melanoma são
capazes de penetrar a membrana basal, crescer intradermicamente e metastatizar
(Guerry et al., 1993). Além disso, essas células apresentam inúmeras anormalidades
citogenéticas, sugerindo uma considerável instabilidade genômica (Meier et al., 1998).
O desenvolvimento do melanoma metastático, a partir de melanomas primários
VGP, ocorre quando essas células dissociam-se da lesão primária, migram através do
estroma adjacente e invadem os vasos linfáticos e/ou sangüíneos para formar o tumor
em sítios distantes (Haass et al., 2005). A invasão e migração do melanoma estão
relacionadas com alterações na adesão celular. Normalmente, a adesão celular
controla a migração da célula, organização dos tecidos e organogênese (Johnson,
1999). Distúrbios na adesão contribuem para a invasão do tumor, interação tumor-
estroma e sinalização entre células tumorais e células normais (Miller & Mihm, 2006)
Embora haja na literatura inúmeros trabalhos com diferentes modelos (tecidos,
linhagens celulares e anticorpos) indicando mudanças em várias moléculas envolvidas
na gênese do melanoma, as alterações responsáveis pelo desenvolvimento e a
progressão do melanoma ainda não são totalmente conhecidas.
5
Introdução
2. Resistência ao anoikis e transformação maligna
Em organismos multicelulares, as células não vivem isoladas, ao invés disso, elas
encontram-se associadas com células vizinhas e com o ambiente extracelular (Assoian,
1997), do qual a matriz extracelular (MEC) faz parte. Além de servir como suporte físico
para a adesão das células, a MEC também garante a elas informação necessária para
sua proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência em relação ao seu contexto
dentro de um órgão ou tecido (Lukashev & Werb, 1998; Valentijn et al., 2004).
A ancoragem da célula aos componentes da MEC é mediada por moléculas de
adesão do tipo integrinas, que além de garantirem a ligação estrutural entre a MEC e o
citoesqueleto, são responsáveis pela ativação de moléculas de sinalização que irão
governar seu destino (Reddig & Juliano, 2005; Sepulveda et al., 2005). A perda do
contato das integrinas com os componentes da MEC tem efeito deletério para a vida de
uma célula, o que a leva a um tipo específico de apoptose, denominado anoikis (Frisch
& Francis, 1994). Esse fenômeno ocorre mesmo quando elas são cultivadas na
presença de todos os fatores de crescimento e nutrientes necessários à sua
sobrevivência (Meredith et al., 1993). Durante o processo de anoikis, todos os aspectos
que caracterizam a apoptose, incluindo fragmentação nuclear e permeabilidade da
membrana, são observados (Fadeel & Orrenius, 2005).
O anoikis foi descoberto primeiramente em células epiteliais, mas já foi observado
em inúmeros tipos celulares (Meredith et al., 1993; Frisch & Francis, 1994). Estudos
mostraram sua participação durante o desenvolvimento embrionário (Coucouvanis &
Martin, 1995) e na manutenção da homeostase de diferentes tecidos como a pele
(Polakowska et al.,1994), tecido epitelial (Hall et al., 1994) e glândulas mamárias
(Boudreau et al., 1995). Quando o controle do anoikis é perdido, células aderentes
podem tanto entrar em uma fase estacionária do ciclo celular, como proliferar sem as
restrições de adesão até que um ambiente adequado seja encontrado (Frisch &
Ruoslahti, 1997; Reed, 1999; Frisch & Screaton, 2001).
A capacidade de sobreviver independentemente de ancoragem é considerada
passo importante para a transformação maligna das células, além de ter participação
fundamental durante a progressão tumoral através do aumento do tempo de
sobrevivência na ausência da adesão, facilitando a migração e a colonização em
6
Introdução
órgãos distantes (Shanmugathasan & Jothy, 2000; Grossmann, 2002; Díaz-Montero &
McIntyre, 2003). Em modelos animais, os tumores resistentes ao anoikis apresentam
incidência maior de lesões metastáticas e aumento na sobrevivência de células
circulantes no sangue (Howlett et al., 1995; Nikiforov et al., 1996; Zhu et al., 2001).
Particularmente em tumores não epiteliais como melanomas, foi demonstrado que a
transformação neoplásica confere resistência ao anoikis (Petitclerc et al., 1999; Zhu et
al., 2001). Esta propriedade, observada nas células quando cultivadas in vitro, pode ser
correlacionada ao seu potencial oncogênico encontrado in vivo (Wang, 2004).
A resistência ao anoikis pode ser decorrente de vários mecanismos como
alterações no padrão de moléculas de adesão celular, perda da função de genes
supressores de tumor, como PTEN e p53, expressão de oncogenes, como ras, raf, rac
e src, aumento no nível de sinais de sobrevivência, inativação de membros envolvidos
em vias de sinalização de sobrevicência ou mesmo defeitos na execução das mesmas
(Hanahan & Weinberg, 2000; Grossmann, 2002). A diferença de expressão desses
fatores é influenciada pelo ambiente, microambiente, fatores genéticos e epigenéticos,
e, como são fundamentais em vários processos biológicos, pode contribuir tanto com o
início da transformação maligna como com a progressão tumoral (McGary et al., 2002).
Apesar da forte correlação entre a resistência de células transformadas ao anoikis
e sua capacidade de formar tumores in vivo, a evidência direta de uma relação causal
entre estas duas características ainda não foi claramente estabelecida.
7
Introdução
3. Timp1
3.1 Timp e câncer
A metástase é responsável pela maioria das mortes causadas pelo câncer e o
processo de sua formação pode ser resumido em uma série de passos distintos em
que a célula tumoral deixa o tumor primário, invade os tecidos adjacentes e migra para
sítios distantes através do sistema circulatório, onde estabelece o tumor secundário
(Woodhouse et al., 1997). Durante esse processo, é necessário que essas células
adquiram características que as tornem capazes de migrar por diferentes
compartimentos e invadir a MEC (Figura 2).
A principal barreira que impede a disseminação tumoral é a membrana basal
(MB), uma forma especializada de MEC composta de uma rede de colágeno tipo IV,
laminina, perlecan e nidogênio (Albini, 1998). A invasão da MB é considerada um
evento fisiológico raro, regulado cuidadosamente, que ocorre, por exemplo, durante o
desenvolvimento placentário, quando células trofoblásticas invadem o endométrio, e
durante a angiogênese, onde células endoteliais invadem sua própria membrana basal
vascular a fim de extravasar e formar um novo capilar (Liotta et al., 1991). Por isso, o
tumor é classificado como não invasivo enquanto suas células permanecerem dentro
das barreiras da MB e torna-se invasivo a partir do momento em que adquirem a
capacidade de rompê-las e invadir tecidos adjacentes (Kopfstein & Christofori, 2006).
8
Introdução
Figura 2. Principais passos na formação da metástase. O primeiro passo (a) ocorre com a
transformação celular e proliferação tumoral, seguido de intensa vascularização que ocorre geralmente
quando a massa do tumor excede 2 mm de diâmetro (b). A invasão local ocorre (c) e a desadesão e a
embolização de uma única célula ou de células agregadas (d) ocorre em seguida. Após sobreviverem na
circulação sangüinea, as células tumorais ficam presas nos capilares de órgãos distantes por aderirem
nas células do endotélio capilar. O extravasamento ocorre depois (e), provavelmente pelos mesmos
mecanismos envolvidos na invasão inicial. A proliferação dentro do órgão secundário completa o
processo metastático (f). Para continuar proliferando, a micrometástase precisa desenvolver uma rede
de vasos e escapar das defesas do organismo. Figura modificada de Fidler, 2003.
9
Introdução
Enzimas proteolíticas, através da capacidade em degradar as proteínas da MEC,
tornam-se componentes importantes para o processo de transformação maligna das
células. Com o seqüenciamento do genoma humano, mais de 500 genes foram
identificados como codificadores de proteases ou proteínas do tipo protease, com um
número enorme sendo associado ao processo tumoral (López-Otín & Overall, 2002).
Dentre estas, as metaloproteases de matriz (MMPs) – um grupo de 24 enzimas que
degradam os componentes da MEC e da MB (Brinckerhoff & Matrisian, 2002) – têm
sido o foco de muitas pesquisas contra o câncer (Coussens et al., 2002; Egeblad &
Werb, 2002). Essa família de glicoproteínas é secretada como pró-enzima latente,
ativada pela proteólise de uma região conservada presente no domínio N-terminal e
está dividida em seis grupos dependendo do tipo de substrato que degradam (Visse &
Nagase, 2003).
As MMPs são reguladas tanto em nível transcricional como traducional
(Westermarck & Kähäri, 1999). Esses mecanismos de regulação operam
coordenadamente para garantir que a expressão e a atividade das MMPs ocorram
apenas onde a proteólise é necessária. Entretanto, tumores malignos apresentam
estratégias que evitam esses mecanismos reguladores e propiciam atividade
proteolítica que acompanha o desenvolvimento do câncer e da metástase (Overall &
López-Otín, 2002).
A transcrição gênica das MMPs é influenciada por fatores que incluem citocinas,
fatores de crescimento, hormônios, oncogenes e promotores tumorais (Westermarck &
Kähäri, 1999). Em nível protéico, a atividade biológica das MMPs é determinada por
seu estado de ativação. Como descrito anteriormente, a maioria das MMPs é secretada
pelas células em forma latente e a conversão para sua forma funcionalmente ativa
requer um processo de ativação de vários passos específicos (Hofmann et al., 2005).
Após ativação, a atividade das MMPs é modulada através de inibidores comuns de
endopeptidases, como as α2-macroglobulinas, que estão presentes no plasma e fluído
dos tecidos e, mais especificamente, pelos inibidores de metaloproteases de matriz
(TIMPs) (Overall & López-Otín, 2002; Hofmann et al., 2005). Quatro membros da
família TIMP (TIMP1, TIMP2, TIMP3 e TIMP4) foram identificados em vertebrados, e
podem ser encontrados ancorados na MEC ou secretados pela célula (Brew et al.,
2000). TIMPs são proteínas de 21 a 34 kDa, que possuem uma estrutura com dois
10
Introdução
domínios, um N- e um C-terminal de 125 e 65 aminoácidos, respectivamente, com cada
um contendo três ligações dissulfeto conservadas (Williamson et al., 1990; Murphy et
al., 1991) (Figura 3). O domínio N-terminal contém a região de maior homologia entre
os quatro membros e é suficiente para inibir a atividade proteolítica das MMPs (Murphy
et al., 1991; Willenbrock & Murphy, 1994; Caterina et al., 1997; Huang et al., 1997). A
inibição das MMPs pelos TIMPs ocorre através de ligação resistente à denaturação
pelo calor e à degradação proteolítica, mas reversível e não-covalente, formando um
complexo estequiométrico de 1:1 (Gomez et al., 1997; Brew et al., 2000). O domínio C-
terminal de TIMP parece ser importante para a interação com outras proteínas e para a
formação de complexos com as pró-MMPs, retardando ou até impedindo o processo de
ativação das MMPs (Lambert et al., 2004).
O balanço entre as atividades da protease e do inibidor determina o potencial
proteolítico do tumor, e a diminuição nos níveis de TIMP está geralmente
correlacionada com a tumorigênese (Khokha et al., 1989). Desse modo, aumentos de
expressão e atividade das MMPs são encontrados em quase todos os cânceres
humanos. Interessantemente, a expressão de seus inibidores, TIMPs, também se
encontra geralmente aumentada em vários cânceres. Dentre eles, TIMP1 foi associado
a um prognóstico negativo em muitos cânceres humanos incluindo câncer de mama
metastático, câncer coloretal, linfoma e carcinoma de pulmão (non-small cell lung
carcinoma), sugerindo um valor promissor de TIMP1 como marcador prognóstico do
tumor (Kossakowska et al., 1991; Zeng et al., 1995; Fong et al., 1996; Ree et al., 1997;
McCarthy et al., 1999; Schrohl et al., 2004). Este foi um achado inicialmente inesperado
considerando o papel bem estabelecido de TIMP1 na inibição da degradação da MEC
pelas MMPs, invasão da célula tumoral e formação de metástases.
11
Introdução
Figura 3. Estrutura primária da proteína TIMP1. O diagrama mostra uma reprentação esquemática da
seqüência de aminoácidos de TIMP1, incluindo seis pontes dissulfeto formadas pela ligação de cisteínas.
Os sítios de N-glicosilação encontram-se nos aminoácidos 30 e 78 (Q). Na figura estão indicadas as
alças formadas pelas pontes dissulfeto (L1 a L6) e a junção entre os domínios N- e C-terminal da
proteína (Stop). Figura modificada de Caterina et al., 1998.
12
Introdução
3.2 Aspectos gerais de TIMP1
O gene TIMP1 está localizado no cromossomo humano Xp11.1-p11.4 e seu RNA
mensageiro (mRNA) de 900pb codifica uma proteína de 184 aminoácidos e de massa
molecular variando de 29 a 34kDa, dependendo do grau de glicosilação (Carmichael et
al., 1986; Huebner et al., 1986; Lambert et al., 2004). Essa glicosilação parece ter papel
em várias funções incluindo a conformação correta da proteína, o transporte da
molécula para a superfície da célula e o aumento de sua estabilidade (Caterina et al.,
1998). Derry e Barnard (1992) demonstraram que o gene TIMP1 encontra-se dentro do
intron seis do gene synapsin I (SYN1) tanto em camundongos como em humanos
(Figura 4). Sua transcrição ocorre na direção oposta à deste gene em camundongos e
presumivelmente em humanos. O gene ARAF, que também é transcrito na mesma
direção de TIMP1, está situado a 10kb de distância (Derry & Barnard, 1992).
TIMP1 na maioria das vezes apresenta-se na forma solúvel e sua expressão é
induzida e geralmente tecido-específica, sendo maior no sistema reprodutivo (Chirco et
al, 2006), embora já tenha sido descrita em uma variedade de culturas celulares
(Welgus et al., 1985; Cawston et al., 1986; Bord et al., 1999; Ries et al., 1999).
Camundongos que tiveram o gene Timp1 silenciado permanecem viáveis, mas
apresentam redução no tempo de vida reprodutivo e aumento na resistência a
Pseudomonas aeruginosas (Gomez et al., 1997).
O promotor de TIMP1 não possui TATA box e a regulação de sua expressão
ocorre primariamente em nível transcricional envolvendo vários elementos responsivos
como AP-1, Sp1, NF-kappaB e fatores de transcrição CRE (Logan et al., 1996; Botelho
et al., 1998; Trim et al., 2000; Dean et al., 2000; Sohara et al., 2002; Aicher et al.,
2003; Bachmeier et al., 2005). Consequentemente, a expressão de TIMP1 é regulada
por vários fatores incluindo ésteres de forbol, soro, citocinas (TGF-β, IL-6, IL-1 e IL-1β),
fatores de crescimento (b-FGF, PDGF, EGF), entre outros (Gomez et al., 1997;
Lambert et al., 2004). Embora ainda não esteja claro como a regulação da expressão
de TIMP1 ocorre em cânceres humanos e se o aumento de sua expressão contribui ou
não para a progressão do tumor, muitos estudos clínicos o reportam como um
promissor marcador tumoral em malignidades humanas.
13
Introdução
Figura 4. Mapa esquemático de genes que flanqueiam TIMP1. O gene TIMP1 encontra-se no
cromossomo X dentro do intron seis do gene SYN1, mas com transcrição oposta. O gene ARAF1 está
situado a 10kb de distância de TIMP1 e é transcrito na mesma direção. Os demais genes, ELK1, ZNF41
e ZNF157, encontram-se num raio de aproximadamente 100kb de distância de TIMP1. Tel: telômero;
Cen: centrômero. Figura modificada de Anderson e Brown, 1999.
14
Introdução
Sabe-se que TIMP1 inibe a atividade da maioria das MMPs, exceto MMP-19 e
vários membros da subfamília das metaloproteases tipo membrana (MT-MMPs), e
suprime a atividade da desintegrina e metaloprotease 10 (ADAM-10) (Baker et al.,
2002). Além de se ligar no sítio ativo das MMPs, TIMP1 também é capaz de formar um
complexo estável com a pró-MMP9 através de seu domínio C-terminal, retardando sua
ativação (Fassina et al., 2000).
3.3 Outras funções de TIMP1
A função primária descrita para a família TIMP foi sua habilidade de inibir as
MMPs, entretanto inúmeros trabalhos têm relatado uma variedade de outras funções
como indução da proliferação celular, inibição da angiogênese, participação na
embriogênese e inibição de apoptose. Algumas destas funções são atribuídas à
inibição das MMPs, entretando dados recentes da literatura têm monstrado que TIMPs
também exibem atividades celulares independentes desta inibição.
3.3.1 Regulação da proliferação celular
Quando TIMP1 foi identificado, foi descoberto ser idêntico à proteína de
potencialização da atividade eritróide (EPA), capaz de estimular a proliferação e
diferenciação de precursores dos eritrócitos murinos, células de leucemia mielóide
crônica humana K-562, e da linhagem celular de leucemia ELM-1-1-3 (Gasson et al.,
1985; Docherty et al., 1985; Niskanen et al., 1988; Murate et al., 1993). Desde então
inúmeros trabalhos descreveram seu papel na promoção da proliferação de diversos
tipos celulares incluindo queratinócitos, condrócitos, fibroblastos, células epiteliais e
endoteliais, células linfóides e mielóides, hepatoma, carcinoma de mama e
osteosarcoma humano (Bertaux et al., 1991; Hayakawa et al, 1992; Yamashita et al.,
1996; Kikuchi et al., 1997; Fata et al., 1999; Baker et al., 2002; Wang et al., 2002). Uma
série de resultados parece provar que a promoção da proliferação celular por TIMP1
ocorre independentemente de sua atividade de inibir as MMPs, já que a redução da
15
Introdução
capacidade inibidora de TIMP1 não altera sua habilidade em estimular a proliferação
celular (Hayakawa et al., 1994; Chesler et al., 1995; Guedez et al., 1998a).
3.3.2 Regulação da angiogênese
O processo de angiogênese requer a invasão da célula endotelial na matriz
intersticial (Carmeliet & Jain, 2000). Portanto, os efeitos pró-angiogênicos das MMPs
via degradação dos componentes da MEC e as atividades anti-angiogênicas dos
TIMPs através da capacidade de inibir as MMPs têm sido extensivamente estudados in
vitro, assim como em modelos animais (Fassina et al., 2000). O envolvimento dos
TIMPs na angiogênese foi demonstrado pela primeira vez em embriões de galinhas
onde a angiogênese foi inibida por TIMP1 e TIMP2 (Takigawa et al., 1990). A
superexpressão de TIMP1 em células tumorais pancreáticas reduziu a angiogênese e a
implantação destas células (Bloomston et al., 2002). Como TIMP1 está principalmente
envolvido no controle da MMP9, uma das moléculas que medeia o processo de
extravasamento celular pela digestão do colágeno tipo IV da MB vascular, esta
atividade anti-angiogênica de TIMP1 está envolvida com a inibição das MMPs (Lambert
et al., 2004).
3.3.3 Regulação da apoptose
Como descrito anteriormente, interações célula-matriz extracelular e o
remodelamento da MEC por enzimas específicas influenciam enormemente na
sobrevivência da célula, e a dissociação de células dependentes de ancoragem à MEC
resulta em apoptose (Frisch & Francis, 1994; Boudreau et al., 1996).
Consistentemente, foi demonstrado que a superexpressão da MMP3 induz
apoptose em células epiteliais de mama in vitro e em camundongos transgênicos
(Boudreau et al., 1995), e que esta indução de apoptose é significativamente inibida
quando camundongos transgênicos para a expressão de Mmp3 são cruzados com
camundongos que superexpressam Timp1 (Chirco et al., 2006). A inibição de apoptose
por TIMP1 através da inibição das MMPs também foi relatada em células estreladas
hepáticas ativadas (Bachem et al., 1992), já que a perda da função de inibir a MMP
16
Introdução
extingue sua atividade anti-apoptótica nessas células, sugerindo que esta é
dependente desta inibição (Murphy et al., 2002). Este envolvimento da inibição das
MMPs na atividade anti-apoptótica de TIMP1 pode ser explicado por meio da
prevenção da degradação da matriz e consequentemente a extinção da morte celular
por anoikis.
Recentemente, muitos estudos têm demonstrado que TIMP1 pode atuar como um
fator de sobrevivência celular independente de seu papel de inibir as MMPs. Alguns
destes estudos observaram que TIMP1 pode atuar como fator de sobrevivência em
células de linfoma, além de sua expressão, e não a das MMPs, estar correlacionada
com grau clínico em linfoma não-Hodgkin, sugerindo um mecanismo independente da
inibição das MMPs pelo qual TIMP1 medeia sobrevivência celular (Kossakowska et al.,
1991; Oelmann et al., 2002). Além disso, observou-se que TIMP1 aumentava a
sobrevivência de células B do centro germinativo, células B normais de tonsila e em
linhagens de linfoma de Burkitt pela supressão da apoptose através da indução do
gene anti-apoptótico bcl-x
L
e de fatores de sobrevivência e de diferenciação de células
B, como IL-10, mesmo quando estas células eram tratadas com um inibidor de MMP e
com uma forma de TIMP1 que não possuia atividade inibidora de MMP, concluindo que
a regulação da apoptose por TIMP1 nestas células é independente da inibição das
MMPs (Guedez et al., 1998a; Guedez et al., 1998b; Gaudin et al., 2000; Guedez et al.,
2001).
Adicionalmente, foi demonstrado que a superexpressão de Bcl-2 induz a
expressão de TIMP1 e que este, atuando como uma molécula anti-apoptótica
downstream a Bcl-2, protege células epiteliais de mama humanas da morte celular
intrínseca e extrínseca, causada por diversos fatores como choque-térmico,
adriamicina, peróxido de hidrogênio, irradiação por raios-X, e anoikis (Li et al., 1999; Liu
et al., 2003; Liu et al., 2005). A proteção contra apoptose nessas células foi efetiva
quando se comparou um mutante de TIMP1, o mesmo que falhou em inibir a apoptose
em células hepáticas ativadas, com seu controle normal, sugerindo que a regulação
especifica da apoptose independe da atividade de inibir as MMPs em células epiteliais
de mama humana. Em concordância com esses estudos, Lee e colaboradores (2003)
relataram a habilidade de TIMP1 em inibir a apoptose em células de carcinoma de
mama humano ser decorrente da ativação seqüencial de moléculas envolvidas na
17
Introdução
cascata da via de sinalização de sobrevivência (c-Scr, PI3-K e AKT) e não da inibição
das MMPs.
Juntos, torna-se claro que a regulação da apoptose por TIMP1 dependente ou
independente da inibição de MMP coexiste. Em um microambiente onde a degradação
da MEC afeta a sobrevivência, é possível prever que TIMP1 regula a apoptose
primariamente através da inibição das MMPs. Se a sobrevivência celular é regulada por
um estimulo independente das MMPs, TIMP1 pode ser considerado um determinante
crítico da morte celular através de sua função em regular vias de transdução de sinais
intracelulares. É pouco provável que a regulação da morte celular dependente e não
das MMPs seja mutuamente exclusiva, parecendo haver mais uma interação entre
elas, dependendo do estimulo pró-apoptótico, do microambiente celular, dos níveis de
MMPs, e da disponibilidade de um receptor hipotético para TIMP1 na superfície das
células.
A primeira evidência de que TIMP1 poderia sinalizar através de um receptor de
membrana celular ocorreu a partir de estudos com proteínas recombinantes de TIMP1
marcadas radioativamente ligando-se a superfície celular de células de linfoma
mielóide crônico e queratinócitos (Chirco et al., 2006). Desde então, muitos
investigadores têm focado seus trabalhos na identificação de um receptor para TIMP1
em diversos tipos celulares (Luparello et al., 1999; Ritter et al., 1999; Tan et al., 2003).
Recentemente, análises de imunoprecipitação e microscopia confocal revelaram a
interação da molécula CD63 com TIMP1 e com β1 integrina, e suas co-localizações na
superfície das células epiteliais de mama humana (Jung et al., 2006). A molécula CD63
é uma proteína transmembrana da família das tetraspaninas que faz ligação com
diversos tipos de proteínas e, na membrana plasmática, os membros desta família,
incluindo a CD63, são conhecidos por interagir com moléculas de adesão celular como
as integrinas, regular vias de transdução de sinais incluindo as de adesão celular,
motilidade e sobrevivência (Berditchevski, 2001; Hemler, 2001; Yunta & Lazo, 2003).
Nas células epiteliais de mama humana, quando a expressão de CD63 foi diminuída,
observou-se efetiva redução na ligação de TIMP1 na superfície celular, na sua co-
localização com β1 integrinas e, consequentemente, reversão do estado de ativação da
integrina mediada por TIMP1, da sinalização de sobrevivência celular e da inibição da
apoptose mesmo em células que superexpressavam TIMP1. Além disso, os autores
18
Introdução
conseguiram demonstrar correlação entre expressão de TIMP1 e nível de β1 integrina
na superfície da célula independente da adesão celular (Jung et al., 2006).
A identificação de um receptor para TIMP1 na superfície da célula é apenas o
começo para explicar as diversas ações moleculares exercidas por esta molécula. O
complexo mecanismo da via de sinalização de sobrevivência por TIMP1 no
microambiente tecidual ainda necessita intensa investigação.
3.4 TIMP1 e eventos epigenéticos
Recentemente, alguns trabalhos vêm sugerindo a participação de eventos
epigenéticos, como a metilação do DNA, na regulação da expressão de Timp1 (Xu et
al., 1998; MacDougall et al., 1999; Huang et al., 2000). Além de participarem da
regulação da expressão gênica, esses eventos também estão envolvidos na inativação
do cromossomo X, onde o gene TIMP1 se encontra. Em mamíferos, essa inativação
silencia a maioria dos genes de um dos dois cromossomos encontrados nas fêmeas. O
cromossomo X humano preserva seu status de ativação quando isolado em células
somáticas híbridas de roedores/humanos, e esses híbridos, que podem conter tanto o
cromossomo X ativo como o inativo, têm sido usados para avaliar o estado de
inativação dos genes ligados a ele (genes ligados ao X). O gene TIMP1 é expresso em
alguns, mas não em todos os cromossomos X inativos desses híbridos, sugerindo que
este gene está propenso tanto à reativação como à variabilidade da sua inativação. Já
que muitos genes que escapam da inativação do cromossomo X encontram-se em
grupos, Anderson e Brown (1999) examinaram a expressão de quatro genes (ARAF1,
ELK1, ZNF41 e ZNF157) encontrados aproximadamente 100kb de distância de TIMP1
(Figura 4) e constataram que os quatro genes eram expressos apenas pelo
cromossomo X ativo, demonstrando, portanto, que os fatores que permitem a
expressão de TIMP1 a partir do cromossomo X inativo são única e exclusivamente
específicos para este gene. Além disso, para determinar se essa variação da inativação
de TIMP1 é uma função do ambiente da célula híbrida ou também se poderia ser
observada em humanos, os autores desenvolveram um ensaio de análise alelo-
especifico para avaliar a expressão de TIMP1 em mulheres. A expressão dos dois
alelos foi detectada em 37,5% das mulheres analisadas, enquanto que o restante das
19
Introdução
mulheres não apresentou expressão de TIMP1 no cromossomo X inativo, sugerindo
que a inativação deste gene é polimórfica em mulheres.
20
Introdução
4. Metilação de DNA e câncer
Atualmente são conhecidas inúmeras alterações moleculares que foram descritas
em melanomas malignos, quando comparados aos melanócitos. Diversas outras, a
maioria talvez desconhecida, estão sendo descobertas a partir de análises
comparativas de perfis de expressão gênica de melanomas de várias fases (Curtin et
al., 2005; Haqq et al., 2005; Kabbarah & Chin, 2006; Gray-Schopfer et al., 2007;
Jönsson et al., 2007). Com esse acesso infindável de informações, certamente, o mais
importante será distinguir as causas primárias da transformação maligna de
melanócitos.
O principal evento durante um processo de transformação pode ser acarretado
por uma mudança celular que é clonalmente herdada. Este evento poderá contribuir
para uma eventual malignidade, o que ocorreria independentemente e não como um
resultado secundário de algumas outras mudanças oncogênicas. Todas as outras
alterações, ocorrendo como conseqüência da mudança primária, poderiam ser
chamadas de mudanças secundárias (Bennett, 2008). Inúmeras técnicas podem ser
utilizadas para detectar centenas destas mudanças (Winnepenninckx et al., 2006;
Hoek, 2007; Johansson et al., 2007; Stark & Hayward, 2007), mas infelizmente nem
todas contribuirão para a malignidade. Portanto, identificar eventos primários é de
extrema importância, pois, por definição, são a causa do desenvolvimento tumoral.
Conseqüentemente, durante sua evolução clonal, tal evento primário resultaria em um
clone que apresentaria uma vantagem de crescimento comparado aos seus vizinhos,
ou uma vantagem alternativa e seletiva como capacidade de migração (Hoek et al.,
2006).
A maioria dos estudos sobre a etiologia do câncer considera as alterações
genéticas (mutação, deleção, amplificação e translocação) como os únicos
mecanismos responsáveis pela gênese do tumor (Davies et al., 2002; Houghton &
Polsky, 2002; Carr et al., 2003; Chin, 2003; Medic et al., 2006; Miller & Mihm, 2006;
Gagglioli & Sahai, 2007). Recentemente, entretanto, eventos epigenéticos tem atraído
a atenção dos investigadores, e um número crescente de trabalhos têm demonstrado a
participação de alterações epigenéticas tanto na iniciação como na promoção de
tumores e, ao que tudo indica, esses eventos são tão importantes quanto as mutações
21
Introdução
(Baylin & Herman, 2000). Eventos epigenéticos podem alterar o estado fenotípico sem
que haja mudanças no genótipo e, mesmo sendo potencialmente reversíveis, são
geralmente herdados durante a divisão celular (Laird, 2005). Neste processo, múltiplos
mecanismos interagem para estabelecer coletivamente um estado da cromatina,
envolvendo modificações em histonas, associação de proteínas, atividade
transcricional e, em mamíferos, metilação do DNA (Robertson & Jones, 1998).
A única modificação epigenética que ocorre no DNA de mamíferos é a metilação
no carbono C5 da citosina que precede a guanina nos dinucleotídeos CpG (Bird, 2002)
(Figura 5), e tem sido reconhecida como um importante mecanismo de regulação da
expressão gênica destas células (Jones & Takai, 2001; Jones & Baylin, 2002). A
maquinaria da metilação de DNA em mamíferos é composta pelas DNA
metiltransferases (DNMTs), que estabelecem e mantém o padrão de metilação do
DNA, e pelas methyl binding proteins (MBDs), que estão envolvidas no reconhecimento
da metilação (Robertson, 2005).
Em células normais, a metilação ocorre predominantemente em regiões
repetitivas do genoma, incluindo DNA satélites, elementos transponíveis e retrovírus
endógenos (Robertson, 2002). Além disso, participa da inativação do cromossomo X e
do imprinting genômico, que é definido como uma modificação epigenética de um
cromossomo parental específico, no gameta ou no zigoto, que leva à expressão
diferencial de dois alelos de um gene na célula somática do descendente (Feinberg et
al., 2002). Ilhas CpG (regiões ricas em dinucleotídeos CpG), localizadas em
promotores de cerca de 50% de todos os genes, apresentam-se geralmente
desmetiladas (Jones & Baylin, 2002), embora um aumento no número de exceções
tenha sido identificado (Liu et al., 2005; Song et al., 2005) (Figura 6). A metilação do
DNA pode reprimir a transcrição gênica diretamente, através da inibição da ligação de
fatores de transcrição específicos e, indiretamente, pelo recrutamento de MBDs e suas
associações a proteínas repressoras e remodeladoras da cromatina (Robertson, 2005).
22
Introdução
Figura 5. Mecanismo de metilação de DNA. As fitas de DNA estão enroladas em volta de um octâmero
de histonas, formando os nucleossomos. Estes nucleossomos são organizados em cromatina, que é o
bloco de construção dos cromossomos. A metilação de DNA ocorre no carbono 5 da citosina que
precede uma guanina, e esta reação é catalizada pelas DNA metiltransferases (DNMTs). Essa metilação
garante uma assinatura epigenética única que regula a expressão gênica. Figura modificada de
Rodenhiser & Mann, 2006.
23
Introdução
Figura 6. Metilação de DNA e câncer. O diagrama mostra uma região representativa do DNA genômico
de uma célula normal. Essa região contém heterocromatina pericentromérica hipermetilada rica em
repetições e um gene suppressor de tumor (GST) ativamente transcrito associado a uma ilha CpG
hipometilada (indicada em vermelho). Em células tumorais, a heterocromatina rica em repetições torna-
se hipometilada e isso contribui para a instabilidade genômica, uma característica de células tumorais,
por meio do aumento de eventos mitóticos recombinantes. Metilação de novo de ilhas CpG também
ocorre em tumor, e pode resultar no silenciamento transcricional de genes que regulam a proliferação.
Mudanças no padrão de metilação do DNA parecem ocorrer no início da tumorigênese. Figura
modificada de Robertson, 2005.
24
Introdução
O estabelecimento adequado e a manutenção dos padrões de metilação são
essenciais para o desenvolvimento normal dos mamíferos e para o funcionamento do
organismo adulto. Além de ser responsável pelo silenciamento da expressão gênica, a
metilação do DNA mantém a estabilidade genômica, tendo em vista a vasta quantidade
de regiões repetitivas, que, quando desmetiladas, podem favorecer recombinações e
causar a desregulação transcricional de genes próximos a estas regiões (Eden et al.,
2003). Por isso, sua importância tem sido cada vez mais ressaltada por meio de um
número crescente de estudos com doenças humanas que ocorrem quando padrões
epigenéticos não são apropriadamente estabelecidos e/ou mantidos (Egger et al.,
2004). Além de ser comumente relacionada ao desenvolvimento do câncer humano
(Brueckner & Lyko, 2004; Das & Singal, 2004; Jiang et al., 2004; Levenson, 2004),
anormalidades epigenéticas são encontradas em várias outras doenças, entre elas
desordens neurológicas, psiquiátricas e imunes, e malformações congênitas
(Robertson, 2005).
Inúmeros trabalhos mostram a hipermetilaçao de DNA reprimindo a transcrição de
genes que codificam supressores de tumor (Zheng et al., 2000; Jackson-Grusby et al.,
2001), reguladores do ciclo celular (Gonzalez-Gomez, 2003), enzimas responsáveis
pelo reparo do DNA (Dobrovic & Simpfendorfer, 1997; Chan et al., 2002), receptores de
hormônios (Nass et al., 2000) e promotores de apoptose (Soengas et al., 2001). De
fato, dados obtidos de estudos de screening de alterações epigenéticas no genoma de
células tumorais demonstraram que os produtos de genes modificados
epigeneticamente estão envolvidos na regulação de todas as funções celulares e que o
silenciamento epigenético destes genes contribui com a tumorigênese (Herman &
Baylin, 2003). Nos últimos cinco anos, estudos com melanomas malignos revelaram
por exemplo a hipermetilação aberrante de regiões promotoras de pelo menos 50
genes (Paz et al., 2003; van der Velden et al., 2003; Gallagher et al., 2005). Embora o
padrão epigenético anormal de genes possa ocorrer em qualquer fase da progressão
tumoral, estudos têm indicado que ele ocorre com maior freqüência durante os estágios
iniciais do processo neoplásico (Yamada et al, 2005).
A perda da metilação global é um evento freqüente e precoce no câncer, e está
relaciona com a gravidade da doença e com o potencial metastático de muitos tipos de
tumores (Widschwendter et al., 2004). A perda da metilação em promotores gênicos
25
Introdução
também pode ocorrer durante a carcinogênese. A desmetilação acompanhada pelo
aumento da expressão tem sido relatada em alguns genes como o gene SERPINB5,
inibidor de serina protease (também conhecido como maspina) em câncer gástrico
(Akiyama et al., 2003), bem como o oncogene
γ
-synuclein (SNCG) em melanoma
(Wada et al., 2004) e nos cânceres de mama e de ovário (Gupta et al., 2003), e a
família de genes MAGE, que codifica antígenos tumorais de função desconhecida (De
Smet et al., 1999). No início da tumorigênese, a hipometilação global pode predispor
instabilidade genômica e, conseqüentemente, mais alterações genéticas, enquanto que
a hipometilação do promotor poderia ser um evento tardio, que permitiria a adaptação
das células tumorais em seu ambiente local e promoveria a metástase. Entretanto, a
perda do controle epigenético que reativa a transcrição de genes no desenvolvimento
de cânceres ainda é muito pouco compreendida.
26
Introdução
5. Modelo de transformação neoplásica
Com o objetivo de estudar a relação entre resistência ao anoikis e transformação
maligna de uma maneira mais direta, o modelo de estudo de transformação maligna de
melanócitos murinos utilizado durante esse trabalho foi desenvolvido no nosso
laboratório a partir da restrição da adesão ao substrato da linhagem não tumorigênica
de melanócitos, melan-a (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al, 2006). Nele, a condição
de impedimento seqüencial de ancoragem foi suficiente para o estabelecimento tanto
de linhagens celulares não tumorigênicas, correspondentes às etapas que levam à
transformação dos melanócitos melan-a, como de linhagens de melanoma com
diferentes níveis de agressividade (Figura 7).
Melan-a é uma linhagem de melanócitos pigmentados imortalizados que foi
estabelecida a partir de melanoblastos epidermais normais de embriões de
camundongos C57BL (Bennett et al., 1987). Estas células proliferam em condições
semelhantes àquelas requeridas pelos melanócitos e melanoblastos de camundongos
normais não estabelecidos, como dependência de forbol miristato acetato (PMA) e pH
extracelular baixo. Elas não formam tumores em camundongos singenêicos ou nude,
mesmo quando inoculadas em quantidade elevada (2×10
7
células por animal), e retém
todas as características de melanócitos normais testadas, exceto pela resposta
proliferativa à toxina da cólera na presença de PMA e pela senescência (Bennett et al.,
1987).
Células melan-a (10
5
células/mL) foram mantidas em suspensão por 96 horas –
tempo que corresponde a um ciclo impedimento de ancoragem. Apesar de não serem
tumorigênicas, as células melan-a formaram pequenos esferóides em uma baixa
proporção de aproximadamente 0,1%. Esses esferóides foram transferidos para uma
placa de cultura, cultivados em condições normais de adesão e expandidos, dando
origem a uma nova linhagem, denominada 1C (linhagem obtida após um ciclo de
bloqueio da adesão ao substrato). Essa sublinhagem de melan-a foi submetida a um
novo ciclo de impedimento de ancoragem e, após 96 horas, células sobreviventes
foram resgatadas e a sublinhagem 2C (dois ciclos de bloqueio de adesão ao substrato)
foi obtida.
27
Introdução
1C
2C, 3C, 4C
melan-a
anoikis
Diluição
limitante
96h
Linhagens de
Melanoma
Figura 7. Modelo de transformação maligna de melanócitos associado à resistência ao anoikis.
Representação esquemática do protocolo experimental que resulta na transformação dos melanócitos
melan-a. Melanócitos não tumorigênicos da linhagem melan-a foram submetidos a ciclos seqüenciais de
bloqueio de ancoragem. Os esferóides formados após submeter estas células ao 5º ciclo de bloqueio de
ancoragem foram clonados e todos os clones, selecionados aleatoriamente, foram tumorigênicos quando
inoculados subcutaneamente em camundongos singenêicos. Desta forma, diferentes linhagens de
melanoma foram obtidas, apresentando diferentes taxas de proliferação tanto in vitro quanto in vivo,
além de diferentes padrões de pigmentação. 1C, 2C, 3C e 4C: células melan-a submetidas,
respectivamente, a 1, 2, 3 e 4 ciclos de bloqueio de ancoragem; 96h: tempo de cultivo em condição de
bloqueio de ancoragem em horas.
28
Introdução
Estes ciclos seqüenciais de impedimento de ancoragem por 96 horas, seguidos
pelo cultivo em adesão e expansão das células sobreviventes, foram repetidos dando
origem às linhagens 3C e 4C (três e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato,
respectivamente). As linhagens 1C, 2C, 3C e 4C, como a parental, não são capazes de
formar tumores in vivo, mas já apresentam crescimento independente de PMA (Oba-
Shinjo et al., 2006).
Esferóides formados após submeter a linhagem 4C a um ciclo de bloqueio da
adesão ao substrato foram sujeitos à diluição limitante originando diferentes linhagens
de melanoma (4C3, 4C11, Tm1 e Tm5, entre outras). Esses clones também
apresentaram capacidade de crescimento independente de PMA, uma característica de
células de melanoma em cultura (Mufson et al., 1979), e foram testados quanto a sua
tumorigenicidade, sendo transplantados subcutaneamente (5×10
5
células/animal) no
dorso de camundongos C57BL/6 singenêicos. Surpreendentemente, todos os clones
analisados derivados dos esferóides da linhagem 4C mostraram-se tumorigênicos, com
períodos de latência para o aparecimento do tumor variando de 12 a 30 dias.
Posteriormente, estes clones foram avaliados quanto à capacidade de formação de
esferóides e mostraram-se capazes de formar esferóides em uma proporção 20 a 320
vezes maior que as células parentais. Além disso, estas células apresentam diferenças
fenotípicas como pigmentação, velocidade de crescimento em cultura, agregação e
capacidade metastática (Oba-Shinjo et al., 2006).
Assim, este modelo confere uma vantagem excepcional para elucidar quais
mecanismos estão envolvidos no início da tumorigênese e quais deles são
responsáveis pela sua progressão. Isso porque foram estabelecidas tanto linhagens
celulares não tumorigênicas, correspondentes às etapas que levam à transformação
dos melanócitos melan-a, como linhagens de melanoma com diferentes níveis de
agressividade, sendo que todas elas, bem como a linhagem parental melan-a, têm uma
origem genética comum.
Esta heterogeneidade sugere a contribuição de mecanismos epigenéticos na
origem da neoplasia. Portanto, as teorias que propõem uma origem epigenética para a
transformação maligna (Rubin, 2001 e 2005; Esteller, 2005 e 2006; Baylin & Ohm,
2006; Feinberg et al., 2006) também fundamentam as bases do estabelecimento deste
29
Introdução
modelo. Deste modo, é possível que o impedimento de adesão ao substrato atue então
como um fator desencadeador da transformação celular induzindo, através de
mecanismos epigenéticos, alterações cumulativas ao longo dos ciclos de bloqueio de
adesão ao substrato.
30
OBJETIVOS
Objetivos
1. Objetivo geral
Identificar genes superexpressos ao longo da transformação maligna de
melanócitos melan-a induzida pelo bloqueio de adesão ao substrato e correlacionar
seus papéis na aquisição do fenótipo resistente ao anoikis.
2. Objetivos específicos
• Determinar o nível de expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna
dos melanócitos;
• Estudar uma possível regulação epigenética da expressão deste gene;
• Investigar o papel biológico de Timp1 na aquisição do fenótipo resistente ao
anoikis.
• Investigar o papel biológico de Timp1 na transformação maligna dos
melanócitos.
31
MATERIAL
Material
1. Comitê de Ética em Pesquisa
O desenvolvimento deste projeto foi autorizado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, sob o
processo de número 175/07.
2. Animais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6, do sexo feminino,
com 6 a 8 semanas de idade, obtidos do biotério do Centro de
Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade
Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Os animais foram
mantidos em condições padronizadas de temperatura e iluminação (ciclo 12/12
horas claro/escuro), sem restrição alimentar. A manipulação e manutenção dos
animais estiveram de acordo com procedimentos padrão definidos no Guia
Internacional de Princípios para a Pesquisa Biomédica Envolvendo Animais
(CIOMS, Genebra, 1985).
3. Anticorpos
• Anticorpo primário policlonal produzido em coelho, direcionado a
seqüências de aminoácidos específicas da região carboxi-terminal do inibidor
de metaloprotease 1 (TIMP1) humano, reativo para amostras de camundongo,
rato e humano, procedentes da Affinity BioReagents (ABR, Golden, CO, USA);
• Anticorpos primários policlonais produzidos em cabra, direcionados a
seqüências de aminoácidos específicas de regiões da beta-actina, MMP9 e
CD34, reativos para amostras de camundongo, procedentes da Santa Cruz
Biotechnology, Inc. (San Diego, CA, USA);
32
Material
•
Anticorpo secundário policlonal produzido em cabra, direcionado à IgG
de coelho, e anticorpo secundário policlonal produzido em coelho, direcionado
à IgG de cabra, conjugados com HRP (Horseradish Peroxidase), procedentes
da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).
• Anticorpo secundário policlonal produzido em cabra, direcionado à IgG
de coelho, conjugado com Alexa 610, procedentes da Molecular Probes
(Eugene, OR, USA)
4. Drogas e reagentes
• β-mercaptoetanol, fosfato de sódio monobásico (NaH
2
PO
4
), fosfato de
sódio dibásico (Na
2
HPO
4
), formamida deionizada, Nonidet P-40, ortovanato de
sódio, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), polyoxyethilenesorbitan
monolaurate (Tween 20), procedentes da Amresco (Sólon, Ohio, USA);
• 5-Aza-2’-deoxicidina (5-Aza-CdR), aprotinina, 4’-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI), Corante tetrazolium amarelo solúvel 3-(4,5,-
dimethylthiazol)-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), leupeptina,
procedentes da Calbiochem (Darmstadt, Germany);
• Ácido acético glacial, ácido clorídrico 37% (HCl), azul brilhante
Comassie R-250, azul de bromofenol, azul de toluidina, cloreto de potássio
(KCl), cloreto de sódio (NaCl), clorofórmio,
dimetilsulfóxido (DMSO), etanol
absoluto, extran, formaldeído 37%, fosfato de potássio (K
2
HPO
4
), hidroquinona,
isopropanol, metanol,
xilol e xyleno cyanol, procedentes da Merck (Darmstadt,
Germany);
• Ácido bórico, ampicilina, bicarbonato de sódio, geneticina (G418), meio
de cultura RPMI 1640, penicilina-estreptomicina, soro fetal bovino, procedentes
da Gibco (Carlsbad, CA, USA);
• Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfônico (HEPES), albumina
de soro bovino (BSA), brometo de etídeo, diethylpyrocarbonate (DEPC),
33
Material
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), phorbol 12-myristate13-acetate (PMA),
procedentes da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA);
• Ágar, procedente da Vetec Química Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ);
• agarose (DNA typing grade), dNTP Mix, fenol saturado em Tris-HCl
UltraPure™ Buffer-Saturated Phenol, LB Broth Base, Lipofectamine™ 2000
Transfection Reagent, tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris base),
tris[hydroxymethyl]aminomethane hydrochloride (Tris-HCl), TRIzol
®
,
procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
• Câmaras de Boyden modificadas Transwell
®
, procedentes da Corning
(Acton, MA, USA);
• Colunas de purificação de DNA GFX™ PCR DNA and Gel Band
Purification, filmes para autoradiografia Hyperfilm ECL™, membranas de
PVDF, procedentes da Amersham (Piscataway, NJ, USA);
• Colunas Wizard minipreparation, procedentes da Promega (Madison,
WI, USA);
• Criotubos, filtros com membrana de 0,2 µm para meio de cultura celular
Filtropur, placas de cultura celular de 100 mm e de 60 mm de diâmetro, placas
de Petri para cultura de bactéria, placas plásticas de cultura celular contendo 6,
24 e 96 poços, ponteiras de micropipetas com capacidade de volume máximo
de 0,1, 0,2 e 1 mL, tubos para microcentrífuga com capacidade de volume
máximo de 0,2, 0,5, 1,5 e 2,0 mL e tubos para centrífuga com capacidade de
volume máximo de 15 e 50 mL, procedentes da Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht,
Germany);
• Kit de detecção de quimioluminescência SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate procedente da Pierce Chemical (Rockford, IL,
USA);
• Kit QIAquick Gel Extraction, procedentes da Qiagen (Valencia, CA,
USA);
34
Material
•
Leite em pó desnatado Molico, procedente da Nestlé (São Paulo, SP);
• Marcadores de peso molecular para DNA, procedentes da Fermentas
International Inc (Ontário, Canadá);
• MATRIGEL
®
Basement Membrane Matrix, procedentes da Becton
Dickinson Labware (Bedford, MA, USA);
• Permount, procedente da Fisher Scientific (New Jersey, NJ, USA);
• Reagente Bio-Rad protein assay dye reagente concentrate, procedente
da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA);
• Solução de tripsina 0,25%/EDTA 0,5mM, procedente do Instituto Adolfo
Lutz (São Paulo, SP).
5. Enzimas
• 1:1 Taq/TaqStart antibody, procedente da BD Biosciences Clontech
(Palo Alto, CA, USA);
• DNA polimerase BioTools DNA Polymerase—Recombinant from
Thermus thermophilus procedente da BioTools (Madri, Espanha);
• DNase I (Amplification Grade), Ribonuclease A (RNAse A),
RNAseOUT™, Superscript™ III, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA,
USA);
• Enzima Liberase, procedente da Roche (Basel, Switzerland);
• Enzimas de restrição BamHI e NotI, procedentes da New England
Biolabs (Ipswich, MA, USA);
• Taq DNA polimerase recombinante, T4 DNA Ligase e enzimas de
restrição Bgl2, EcoRI e XhoI, procedentes da Fermentas International Inc.
(Ontário, Canadá).
35
Material
6. Linhagens celulares
Diversas linhagens celulares foram utilizadas neste estudo e representam
fases distintas da transformação maligna de melanócitos murinos e da
progressão do melanoma. A linhagem de melanócitos melan-a (Bennett et al.,
1987) foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Michel Rabinovitch da Disciplina de
Parasitologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). As demais
linhagens (2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram estabelecidas após
submeter células melan-a a ciclos seqüenciais de impedimento de ancoragem
ao substrato (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al., 2006).
7. Oligonucleotídeos
M13 (-21), Oligo(dT)
12-18
Primer, T3 Promoter e T7 Promoter, Timp1 F,
Timp1 R, Act F, Act R, procedentes da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
Timp1SNuPE R, S1, S2, S3, procedentes da Operon Biotechnology
(Huntsville, AL, USA);
Timp1Transf F, Timp1Transf R, procedentes da Integrated DNA
Technologies (Idt, Coralville, IA, USA).
8. Programas
Para a quantificação da intensidade dos pixels presentes na imagem das
bandas geradas por eletroforese em gel de agarose 1%, foi utilizado o
programa Image Processing and Analysis in Java, ImageJ 1.38b (Wayne
Rasband, National Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/).
36
MÉTODOS
Métodos
1. Meios de cultura
1.1 Preparação dos meios de cultura
Os meios de cultura para o cultivo de bactérias foram preparados com água
deionizada e esterilizados em autoclave a 120°C por 15 minutos. No caso do cultivo
das células de mamíferos, os meios de cultura também foram preparados com água
deionizada, mas esterilizados por filtração positiva através de membrana de 0,2 µm.
1.2 Meios para cultivo de bactérias
• Meio LB: 200 mg/L de LB Broth Base.
• Meio LB amp: meio LB acrescido de 100 µg/mL de ampicilina.
• Meio LB Ágar: meio LB acrescido de 2% de ágar e 100 µg/mL de ampicilina.
1.3 Meios para cultivo e manutenção de células de mamíferos
• Meio RPMI: 10 g de RPMI 1640, acrescido de 10 mM HEPES, 24 mM de
bicarbonato de sódio, 10mL/L de penicilina-estreptomicina e 200 nM de PMA. O pH do
meio de cultura foi ajustado para 6,9.
• Meio R5: meio RPMI suplementado com 5% de SFB.
• Meio R10: meio RPMI suplementado com 10% de SFB.
• Meio de congelamento: 10% de DMSO em SFB (v/v).
37
Métodos
2. Cultivo e manutenção dos estoques celulares de mamíferos
Todas as linhagens utilizadas neste trabalho (células melan-a e as linhagens
derivadas 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5) foram cultivadas em monocamadas em
placas plásticas de cultura celular de 100 mm de diâmetro, em meio R5, até atingirem
subconfluência. O pH e a temperatura da cultura foram mantidos através de incubação
em estufa com atmosfera de 5% de CO , a 37°C.
2
Estoques celulares foram
armazenados em criotubos, congelados em meio de congelamento e mantidos em
nitrogênio líquido.
2.1 Cultivo celular em suspensão
Para os ensaios de bloqueio de adesão ao substrato, as placas plásticas de
cultura de 100 mm de diâmetro foram previamente recobertas com um fino filme de
agarose 1% para impedir a adesão das células às mesmas. As linhagens celulares (10
5
células/placa) foram então cultivadas em meio R5 em suspensão por diferentes
tempos. A linhagem melan-a foi mantida em suspensão por 1, 3, 5, 24, 48, 72 e 96
horas em estufa com atmosfera de 5% de CO , a 37°C
2
, enquanto que as demais
linhagens foram mantidas apenas por 24, 48, 72 e 96 horas nesta condição.
2.2 Cultivo celular em soft-agar
Diferentes linhagens celulares foram cultivadas em meio semi-sólido denominado
soft-agar. Duas soluções foram preparadas - uma contendo 0,6% de agarose em meio
de cultura RPMI sem SFB, e outra contendo apenas 0,3% de agarose em meio R5 – e
mantidas a 37
o
C. Três mililitros da primeira solução foram utilizados para cobrir cada
placa de cultura celular de 35 mm de diâmetro. Depois de solidificada, essa primeira
camada foi coberta por uma suspensão de células (10
3
células/placa) em 3 mL da
segunda solução. As placas foram incubadas em estufa com atmosfera de 5% de CO ,
a 37°C
2
, e após uma hora, a suspensão celular já solidificada foi recoberta com meio
R10. As células foram mantidas por 21 dias em estufa com atmosfera de 5% de CO , a
2
38
Métodos
37°C, coradas com 2 mL de solução de cristal violeta 0,005% e as colônias contadas
com a ajuda de uma lupa.
3. Desenho dos oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram desenhados com base em
seqüências publicadas no Genbank através do site do NCBI (National Center for
Biotechnology Information – http://ncbi.nlm.nih.gov), e estão descritos abaixo.
Timp1 F: 5’ GCTAAAAGGATTCAAGGC 3’;
Timp1 R: 5’ GCACAAGCCTAGATTCCG 3’;
Act F: 5´ CGAGGCCCAGAGCAAGAGAG 3’;
Act R: 5’ AGGAAGAGGATGCGGCAGTGG 3’;
Timp1Transf F: 5’ TTGAATTCACCACCATGATGGCCCCCTTTGCA 3’;
Timp1Transf R: 5’ TT
CTCGAGTCATCGGGCCCCAAGGGATC 3’;
Timp1SNuPE R: 5’ CTAACTAAAAATCCTAATACCTACAA 3’;
S1: 5’ TGGGTGGATGAGTAATG 3’;
S2: 5’ TTATTTTTTATTGTGTAGTTTTTGT 3’;
S3: 5’ ATTAGAGGTAAGTGGGAGT 3’.
39
Métodos
4. Extração de RNA total
O RNA total das linhagens melan-a, 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 e Tm5 cultivadas
em adesão, e da linhagem melan-a cultivada em suspensão por uma, três, cinco e 24
horas, foi extraído por TRIzol
®
, de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.
Para a extração, as células aderidas foram cultivadas conforme descrito no item 2,
lavadas em PBS (NaCl 137mM, KCl 2,68 mM, Na
2
HPO
4
8,03 mM e K
2
HPO
4
1,46 mM,
pH 7,2 – 7,4), removidas da placa de cultura com solução de tripsina 0,25%/EDTA
0,5mM, lavadas em meio R10 e mais uma vez em PBS. Já as células melan-a
cultivadas em suspensão foram transferidas diretamente para tubos e lavadas com
PBS. Ao final das lavagens, todas as células foram suspensas e homogeneizadas em
500 µL de TRIzol
®
, e transferidas para tubos de microcentrífuga. Para permitir a
completa dissociação dos complexos núcleo-protéicos, as amostras homogeneizadas
foram mantidas a temperatura ambiente por 5 minutos. Foram adicionados 100 µL de
clorofórmio, os tubos agitados vigorosamente por 15 segundos e incubados a
temperatura ambiente por 3 minutos. As amostras foram centrifugadas a 10440 rpm,
durante 15 minutos, a 4ºC, separando a solução em três fases distintas – a fase
superior aquosa, contendo o RNA, foi transferida para tubos novos, e as demais foram
descartadas. O RNA foi precipitado com 250 µL de isopropanol durante 10 minutos a
temperatura ambiente, e em seguida, os tubos foram centrifugados a 10440 rpm,
durante 10 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado, lavado com
1 mL de etanol 75% e centrifugado a 7000 rpm, durante 5 minutos, a 4ºC. Os tubos
ficaram abertos em temperatura ambiente até que todo o etanol evaporasse. O RNA foi
então ressuspenso em água deionizada tratada com 1% de DEPC (água DEPC) e
imediatamente congelado a 80ºC negativos.
Para a quantificação do RNA extraído, 2 µL da suspensão foram utilizados para
determinar sua concentração em espectrofotômetro (Nanodrop) em comprimento de
onda de 260 nm, obedecendo à proporção de 40 µg de RNA/mL por absorbância de 1
(Sambrook et al., 1989). Também foram efetuadas medidas a 280 nm para avaliar a
pureza do RNA. A razão dos valores obtidos a 260 e 280 nm foi calculada e deveria
estar em torno de 1,9 para que o material fosse considerado puro o bastante para
análise. Caso este valor não fosse atingido, o material era descartado e procedia-se
nova extração de RNA.
40
Métodos
A integridade do RNA total extraído das diferentes linhagens celulares foi
analisada por eletroforese em gel de agarose 1,5%, preparado em tampão fosfato de
sódio 10 mM, contendo 16% de formaldeído. Para 50 mL de gel, 0,75 g de agarose foi
acrescentado a 37 mL de água DEPC e 5 mL de tampão fosfato 100 mM, pH 7,4
(Na
2
HPO
4
77,4 mM e NaH
2
PO
4
22,6 mM). Esta solução foi aquecida até que toda a
agarose se dissolvesse. Após acrescentar 8 mL de formaldeído, a solução foi colocada
no suporte e deixada esfriando a temperatura ambiente durante 1 hora. Utilizou-se 5 μg
de RNA total de cada amostra adicionados a 3 vezes o volume do RNA de tampão de
amostra para RNA (750 µL de formamida deionizada, 90 µL de formaldeído 37%, 150
µL de tampão fosfato 100 mM, 0,1 mg de azul de bromofenol e 135 µL de água DEPC)
e 1 μL de brometo de etídio 1 mg/mL. As amostras foram desnaturadas a 65ºC por 5
minutos, esfriadas em gelo e aplicadas no gel. A corrida eletroforética foi realizada em
tampão fosfato de sódio 10 mM a 60 volts por 2 horas. A cada 20 minutos o tampão era
recirculado para equilibrar o pH. O gel foi visualizado em transiluminador sob luz
ultravioleta acoplado a uma câmera a qual digitalizou sua imagem (Kodak digital
Science- Eletrophoresis Documentation and Analysis System 120, Eastman Kodak
Company, NY, USA).
5. Síntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) - Transcrição
reversa e reação de polimerase em cadeia (RT-PCR)
Para excluir a possibilidade de contaminação por DNA genômico, 4 µg de RNA
total foram tratados com a enzima DNase I, Amp Grade seguindo as instruções do
fabricante. O volume da solução de RNA foi ajustado para 21 µL com água DEPC.
Foram acrescentadas 1 unidade da enzima DNase I e 20 unidades do inibidor de
Ribonuclease, RNaseOUT™ em uma solução contendo 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50
mM KCl, 2 mM MgCl
2
e esta foi incubada a temperatura ambiente por 15 minutos. A
enzima foi inativada pela adição de 1 µL de EDTA 25 mM (pH 8,0), seguida de
incubação a 65ºC por 10 minutos.
Aproximadamente 1 µg do RNA total tratado com DNase I (6,25 µL) foi incubado a
65ºC por 5 minutos em solução contendo 500 ng de Oligo(dT)
12-18
Primer e 1,5 mM de
41
Métodos
dNTP Mix em um volume de 6,5 µL, e imediatamente em gelo por 2 minutos. Depois
que a reação chegou a temperatura ambiente, foram acrescentados 7 µL de uma
solução contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl
2
, 5 mM
de DTT, 40 unidades de RNaseOut™ e 200 unidades da transcriptase reversa
Superscript™ III e a reação realizada a uma temperatura de 25
o
C por 5 minutos,
seguidos de 60 minutos a 50
o
C e mais 60 minutos a 55
o
C, finalizando com 70ºC por 15
minutos. Os cDNAs foram estocados a 20ºC negativos.
Para a verificação da síntese e integridade da primeira fita do cDNA, o produto
sintetizado por RT-PCR foi amplificado com oligonucleotídeos específicos para o gene
da β-actina. Nesta reação adicionou-se 1 µL do cDNA sintetizado, tampão contendo 75
mM de Tris–HCl (pH 9.0), 2 mM de MgCl
2
, 50 mM de KCl, 20 mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 0,36
mM de dNTP Mix (0,36 mM de cada dinucleotídeo), 0,36 mM de cada oligonucleotídeo
(Act F e Act R), e 1 unidade de Taq DNA polimerase recombinante. A reação foi
realizada com uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos; seguida de 17 ciclos de
94ºC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 1 minuto; e extensão de 72ºC
por 10 minutos. As amostras de RNA total, antes e depois de serem tratadas com
DNase I, também foram submetidas a esta reação para descartar a hipótese da
amplificação do gene ser decorrente de uma contaminação por DNA genômico. Este
controle positivo sempre era feito quando se utilizava um cDNA pela primeira vez e
quando nova alíquota do mesmo era feita a partir do estoque. Além deste controle, em
todas as PCRs foram realizadas, como controle negativo, reações sem a adição de
cDNA, para garantir que os reagentes utilizados estavam livres de contaminação.
As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1% preparado
em tampão TBE (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM, pH 8,0). A
corrida eletroforética foi realizada a 100 volts por 45 minutos em tampão TBE. O gel foi
analisado sob transiluminação ultravioleta e sua imagem digitalizada através de um
sistema automático Kodak (Kodak digital Science - Electrophoresis Documentation and
Analysis System 120, Eastman Kodak Company, NY, USA).
42
Métodos
6. RT-PCR semiquantitativo
Diversas ciclagens foram utilizadas para a amplificação do gene Timp1 e da β-
actina (controle da reação). As reações foram realizadas em um volume final de 25 µL,
utilizando-se 1 µL da primeira fita de cDNA, tampão contendo 75 mM de Tris–HCl (pH
9.0), 2 mM de MgCl
2
, 50 mM de KCl, 20 mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 0,36 mM de dNTP Mix,
0,36 mM de cada oligonucleotídeo (Timp1 F e Timp1 R ou Act F e Act R), e 1 unidade
de DNA polimerase, BioTools DNA Polymerase—Recombinant from Thermus
thermophilus. Todas as reações foram realizadas em termociclador Personal Eppendorf
(Hamburg, Germany). Para análise semiquantitativa da expressão de Timp1 foram
realizadas três reações para cada amostra tendo apenas o número de ciclos diferentes
entre elas. As condições de ciclagem utilizadas foram iniciadas com desnaturação a
94ºC por 5 minutos; seguida de 29, 32 e 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por
45 segundos e 72°C por 1 minuto, e extensão de 72ºC por 10 minutos. Para o gene da
β-actina foi utilizada ciclagem iniciada pela desnaturação a 94°C por 5 minutos, 11, 14
e 17 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto. Os
produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1 % preparado
em tampão TBE. O gel foi visualizado em transiluminador sob luz ultravioleta e a
imagem capturada por um sistema automático Kodak.
A intensidade emitida pelas bandas foi quantificada através do programa ImageJ
1.38b. Os resultados foram normalizados através da relação dos valores obtidos na
amplificação dos dois genes (razão da expressão de Timp1/β-actina).
7. Western Blot
As linhagens celulares foram cultivadas como descrito anteriormente, lavadas em
PBS e incubadas em tampão de lise gelado contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 100
mM de NaCl, 50 mM de NaF, 0.5% de Nonidet P-40, 1 mM de PMSF, 1 mM de
ortovanato de sódio, 10 µg/mL de aprotinina e 10 µg/mL leupeptina em gelo por 15
minutos. O lisado foi precipitado por centrifugação a 14000 rpm por 15 minutos a 4ºC e
o sobrenadante foi recuperado e transferido para tubos novos. A concentração protéica
43
Métodos
foi determinada através do reagente Bio-Rad protein assay dye reagente concentrate,
em leitor de ELISA em comprimento de onda de 570 nm.
A mesma quantidade protéica (80 μg do extrato protéico total) de cada amostra foi
fervida em tampão de amostra reduzido (Tris-HCl 62 mM, pH 8,8, SDS 0,2%, β-
mercaptoetanol 50 mM, azul de bromofenol 0,005% e glicerol 10%) e separada em gel
reduzido de poliacrilamida 10% (SDS-Page) em tampão de corrida (Tris base 25 mM,
glicina 190 mM, pH 8,3, e SDS 0,1 %). Após 1,5 horas de corrida a 60 V, as proteínas
foram transferidas para membrana de PVDF em tampão de transferência (metanol
20%, Tris base 25 mM e glicina 192 mM) por 1 hora a 100V. A membrana foi então
bloqueada a 4ºC durante 2 horas com 5% de leite em pó desnatado em TBS-Tween
(Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM,
e Tween 20 0,02%), exposta ao anticorpo
primário policlonal de coelho anti-Timp1 por 16 horas a 4ºC, lavada com 5% de leite em
pó desnatado em TBS-Tween e incubada com anticorpo secundário anti-IgG de coelho,
conjugado com peroxidase, por 2 horas a temperatura ambiente. Após lavar cinco
vezes com TBS-Tween por 10 minutos, as proteínas foram detectadas com kit de
detecção de quimioluminescência SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate.
A membrana foi exposta e revelada em filme para autoradiograma Hyperfilm ECL™.
Para a detecção da proteína β-actina, controle interno do ensaio, a mesma membrana
foi utilizada. Após lavagem exaustiva em tampão de lavagem (glicina 1,87% e SDS 1%
em água deionizada estéril) a membrana foi mais uma vez bloqueada com 5% de leite
em pó desnatado em TBS-Tween e exposta primeiramente ao anticorpo primário
policlonal de cabra anti-β-actina e posteriormente com anticorpo secundário anti-IgG de
cabra. O ensaio foi realizado como descrito acima.
8. Imunofluorescência indireta
Lamínulas de vidro foram lavadas por 2 horas com extran 0,2% e enxaguadas
com água deionizada estéril por 16 horas. Depois de secas, as lamínulas foram
autoclavadas e colocadas em placas de cultura de 24 poços (1 lamínula por poço).
Diferentes linhagens celulares (2×10
4
células/poço) foram cultivadas em meio completo
sobre as lamínulas de vidro até atingirem subconfluência. As células foram lavadas
44
Métodos
duas vezes com PBS, fixadas em 3,7% de formaldeído em PBS por 15 minutos a 20ºC
negativos e lavadas novamente em PBS. As lamínulas tiveram seus sítios inespecíficos
bloqueados em solução de BSA 1% em PBS (PBS-BSA 1%) durante 30 minutos. As
células foram incubadas por 1h com anticorpo policlonal de coelho anti-Timp1, lavadas
3 vezes em PBS-BSA 1% e incubadas com um anticorpo secundário anti-IgG de coelho
conjugado à Alexa 610 e com DAPI por 45 minutos. Após a incubação com o anticorpo
secundário, as lamínulas foram lavadas inúmeras vezes em PBS. As lâminas foram
então montadas e analisadas em microscópio confocal (Zeiss, Göttingen, Germany).
9. Extração de DNA genômico
O DNA genômico foi extraído a partir de tecido de camundongo e de culturas
subconfluentes das diferentes linhagens celulares. As amostras foram ressuspensas
em 500 μL de solução de lise TELT (Tris HCl 50 mM, pH 8,0; EDTA 62,5 mM; 4%
Triton X-100; 2,5 M LiCl
2
) e a solução foi homogeneizada por inversão durante 5
minutos. Foram adicionados 500 μL de fenol saturado em Tris 0,1 M pH 8.0 /
clorofórmio (1/1), a solução foi novamente homogeneizada por inversão durante 5
minutos e os tubos centrifugados a 12.000 rpm por 10 minutos a 4ºC. A fase aquosa
superior foi transferida para tubos limpos, um volume igual de clorofórmio foi
adicionado e a solução foi homogeneizada por inversão durante 10 segundos. Os tubos
foram centrifugados a 12.000 rpm por 10 minutos, a 4ºC, e a fase superior foi
transferida para tubos limpos. Foram adicionados 2,5 vezes o volume da fase superior
de etanol absoluto gelado e o DNA foi precipitado a 20ºC negativos por 1 hora. Os
tubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 10 minutos, a 4ºC, e o sobrenadante foi
descartado. O precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70% e os tubos centrifugados
a 14.000 rpm por 5 minutos a 4ºC. Após descarte do sobrenadante, o DNA foi seco
durante 15 minutos a temperatura ambiente e ressuspenso em água deionizada estéril.
Ao DNA adicionou-se RNase A, em concentração final de 20 μg/mL, que
permaneceu a 37ºC durante 15 minutos. O DNA foi precipitado em solução contendo
10 µL acetato de sódio (NaOAc) 3M, pH 5,3, e 220 µL de etanol absoluto gelado por 10
minutos em banho de gelo e os tubos centrifugados a 14.000 por 15 minutos a 4ºC.
45
Métodos
Após descarte do sobrenadante, foram adicionados 500 µL de etanol 80% para a
retirada do sal. O tubo foi centrifugado novamente a 14.000 por 15 minutos a 4ºC, o
etanol foi descartado e o precipitado seco durante 10 minutos a temperatura ambiente.
A dissolução completa do DNA foi realizada em 50 µL de água deionizada estéril.
Para a quantificação da concentração, 2 µL de DNA genômico foram utilizados. A
absorbância foi medida em 260 nm de comprimento de onda em espectrometria
(Nanodrop) e a concentração calculada, lembrando que a absorbância igual a 1 contém
uma concentração de 50 µg/mL de DNA de dupla fita (Sambrook et al., 1989). Também
foi medida a absorbância a 280 nm de comprimento de onda para verificar a presença
de proteínas e estimar a pureza da amostra. A razão entre as leituras (260/280nm)
permitiu considerar a solução de DNA pura já que apresentou valores superiores a 1,8.
Amostras que apresentaram valores inferiores foram descartadas e sua extração
realizada novamente.
A integridade do DNA genômico extraído das diferentes linhagens celulares foi
analisada por eletroforese em gel de agarose 1%, preparado em tampão TBE. Um
microlitro de cada amostra foi aplicado em gel corado com 0,1 mg/mL de brometo de
etídeo. O gel foi submetido à eletroforese em corrente de 100 V por 1 hora. A
visualização do gel foi feita em transiluminador sob luz ultravioleta em sistema
automático Kodak.
10. Tratamento de tecido murino com Liberase
Pedaços de 1 cm
2
foram removidos cirurgicamente da pele do dorso de três
animais. Os tecidos foram embebidos em 10 mL de meio RPMI, picotados com a ajuda
de um bisturi e transferidos para um tubo de centrífuga com capacidade para 50 mL.
Foram acrescentados 5 mL de solução de digestão (10 unidades da enzima liberase
(Roche) e 0,65 mg de DNase I em 5 mL de RPMI) e o tubo incubado em agitação por 2
horas a 37ºC. Após centrifugação a 1500 rpm por 5 minutos, o precipitado foi lavado
em 10 mL de RPMI, ressuspenso em 5 mL de solução de tripsina 0,25%/EDTA 0,5mM
e o tubo, incubado em agitação por 45 minutos a 37ºC. Foram adicionados 5 mL de
R10 aos tubos, estes foram centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante
46
Métodos
foi descartado e o material foi lavado novamente com R10. Após a lavagem, o
precipitado foi ressuspenso em 5 mL de PBS-EDTA (1 µM de EDTA pH 8,0 em PBS),
solução incubada por 20 minutos a temperatura ambiente e os tubos centrifugados a
1500 rpm por 5 minutos. O tecido digerido foi ressuspenso em 1 mL de PBS e o volume
da solução dividida em dois tubos de microcentrífuga com capacidade para 1,5 mL. Os
tubos foram centrifugados e seus sobrenadantes descartados. O material de um do
tubo foi utilizado para extração de RNA total, e a ele, portanto, foram adicionados 500
µL de TRIzol
®
, enquanto que ao outro foram adicionados 500 μL de solução de lise
TELT para a extração de DNA genômico, como descrito anteriormente.
11. Tratamento das células com agente desmetilante
A linhagem melan-a (2×10
6
células) foi cultivada em meio R5 por 24 horas para
posterior tratamento com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-CdR). O
agente desmetilante 5-Aza-CdR é um análogo da citosina que apresenta modificações
no carbono 5 desta molécula. Durante a replicação, o agente é incorporado na fita do
DNA inibindo a atividade das DNMTs que se ligam a ele (Taylor & Jones, 1982).
Durante 2 dias, essas células foram cultivadas em meio R10 acrescido de 5 µM
do agente. Após 24 horas de cultivo, o meio foi trocado por meio R10 fresco contendo
5-Aza-CdR. Como controle do tratamento, células melan-a foram cultivadas
simultaneamente, nas mesmas condições, exceto pela adição do agente desmetilante.
O RNA total destas células, tratadas ou não com 5-Aza-CdR, foi extraído, o cDNA
foi sintetizado e o produto do gene Timp1 foi amplificado conforme descrito
anteriormente utilizando os oligonucleotídeos Timp1 F e Timp1 R. As condições de
ciclagem utilizadas nesta reação iniciaram com desnaturação a 94ºC por 5 minutos;
seguida de 35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 45 segundos e 72°C por 1
minuto, e extensão de 72ºC por 10 minutos. Os produtos finais da reação foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 1%. A visualização do gel foi feita em
transiluminador sob luz ultravioleta acoplado a uma câmera a qual digitalizou sua
imagem (Kodak). O DNA genômico destas células também foi extraído como descrito
anteriormente.
47
Métodos
12. Tratamento de DNA genômico com bissulfito de sódio
O DNA genômico extraído foi tratado com bissulfito de sódio conforme Frommer e
colaboradores (1992). Através deste tratamento toda a citosina não metilada é
convertida em uracila, que é então convertida à timina após amplificação por PCR.
Com isso é possível distinguir, através da análise da seqüência tratada, todas as
citosinas que se apresentam metiladas. Seis microgramas de DNA genômico, em um
volume total de solução de 20 µL, foram desnaturados a 95ºC durante 20 minutos.
Foram adicionados 5 µL de NaOH 3 M, pH 5,2, e a solução incubada a 45ºC durante
20 minutos. Foram preparadas as soluções de bissulfito de sódio 3,6 M, pH 5,0 (7,52 g
de bissulfito acrescido de 2mL de NaOH 3M em 20mL de água deionizada estéril) e de
hidroquinona 0,1 M (0,011 g de hidroquinona em um volume final de 1mL de água
deionizada estéril). Então, 208 µL da solução de bissulfito de sódio e 12 µL de
hidroquinona foram acrescentados ao DNA. A solução foi homogeneizada suavemente,
cerca de 4 gotas de óleo mineral adicionadas e o tubo incubado no escuro a 55ºC
durante 16 horas.
O DNA tratado com bissulfito de sódio foi coletado sob o óleo e purificado usando
colunas Wizard minipreparation de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. O
êmbolo da seringa foi retirado, 1 µL da resina foi transferido para a seringa com filtro. O
DNA tratado foi misturado à resina e, com a ajuda do embolo, toda a solução foi filtrada
lentamente. O DNA, preso ao filtro, foi lavado com 2 mL de solução de lavagem (wash
solution). O filtro foi removido da seringa, colocado em um tubo e centrifugado a 13.000
rpm durante 1 minuto para tirar o excesso da solução de lavagem. Foram aquecidos 50
µL de água deionizada estéril a 80ºC para a eluição do DNA.
13. Desulfonação do DNA tratado com bissulfito de sódio
Foram adicionados 5 µL de NaOH 3M aos 50 µL do DNA e posteriormente
incubados a 40ºC por 15 minutos. Para a precipitação do DNA adicionou-se 1 µL de
glicogênio 20 mg/mL, 50 µL de NaOAc 3M (pH 5,2) e 300 µL de etanol absoluto. Após
incubação a 80ºC negativos por 50 minutos, o tubo foi centrifugado a 13.000 rpm por
48
Métodos
30 minutos e o sobrenadante descartado. O DNA foi lavado com 1 mL de etanol 75% e
o tubo centrifugado a 13.000 rpm durante 10 minutos. O precipitado foi seco a
temperatura ambiente durante 15 minutos, ressuspenso em 40 µL de água deionizada
estéril e estocado a 80ºC negativos.
14. Methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE)
Através desta técnica é possível analisar o padrão de metilação de dinucleotídeos
específicos dentro de uma seqüência de DNA. Nela, o DNA genômico tratado com
bissulfito de sódio é amplificado por PCR através de um oligonucleotídeo que tem sua
terminação 3’ precedendo exatamente a citosina presente no dinucleotídeo CpG a ser
analisado (Figura 9). Para cada dinucleotídeo CpG analisado, é necessário apenas um
oligonucleotídeo (Gonzalgo & Jones, 1997 e 2002).
Cerca de 2 µL do DNA tratado com bissulfito de sódio foi utilizado para a
amplificação por PCR de uma parte do promotor e início do primeiro exon de Timp1.
Nesta reação foram utilizados os oligonucleotídeos S1 e Timp1SNuPE R e ciclagem
iniciada pela desnaturação de 94ºC por 3 minutos, seguida de 44 ciclos a 94ºC por 1
minuto, 52ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, e finalizada pela extensão de 72ºC
durante 10 minutos. Após a amplificação, 5 µL de cada produto de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, preparado em tampão TBE, a uma
voltagem de aproximadamente 100V, durante 45 minutos. Os fragmentos foram então
cortados do gel, e purificados com a utilização do kit QIAquick Gel Extraction, de
acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Cada produto da PCR purificado foi
eluído em 40 µL de água deionizada estéril.
O padrão de metilação de DNA de Timp1 foi analisado em três dinucleotídeos
CpG, sendo um presente na seqüência do promotor, denominado S1, e dois dentro do
primeiro exon de Timp1, S2 e S3 respectivamente. A reação de extensão para a
análise de cada CpG foi realizada em dois tubos distintos contendo 4 µL do DNA
purificado, 1 µM do oligonucleotídeo específico (S1, S2 e S3), em solução contendo
tampão da enzima, 1 unidade de 1:1 Taq/TaqStart antibody, sendo que em um dos
tubos a reação foi realizada com 1 µCi de
32
P-dCTP e no outro com 1 µCi de
32
P-dTTP.
49
Métodos
As reações foram incubadas a 95
o
C por 30 segundos, 51
o
C por 30 segundos e
finalmente 72
o
C por 1 minuto. Às soluções foram adicionados 5 µL de stop solution
(formamida 95%, EDTA 20 mM pH 8.0, azul de bromofenol 0,05% e xyleno cyanol
0,05%) antes de serem desnaturadas a 94°C por 5 minutos e aplicadas em gel
desnaturante de poliacrilamida 15% (TBE, acrilamida 14,25%, bis-acrilamida 0,75% e
uréia 7 M). Os níveis de metilação foram quantificados através de um PhosphoImager
(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). O padrão de metilação do promotor e primeiro
exon de Timp1 representa a média do nível de metilação dos três sítios CpG
analisados. Essa técnica foi realizada no Norris Comprehensive Cancer Center em Los
Angeles, durante colaboração com o Dr. Peter A. Jones e Dr. Gangning Liang.
15. Construção do plasmídeo de expressão
O RNA total das células da linhagem de melanoma Tm5 foi extraído com o
reagente TRIzol
®
conforme descrito anteriormente.
Para a síntese do cDNA, 1 µg de RNA total extraído foi incubado com o
oligonucleotídeo específico Timp1Transf R, no lugar do Oligo(dT)
12-18
Primer, para
garantir o enriquecimento de cópias específicas para a seqüência de Timp1. O cDNA
enriquecido foi amplificado por RT-PCR. A reação foi realizada em duplicata utilizando-
se 1 µL do cDNA enriquecido, tampão contendo 75 mM de Tris–HCl (pH 9.0), 2 mM de
MgCl
2
, 50 mM de KCl, 20 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 0,36 mM de dNTP Mix, 0,36 mM dos
oligonucleotídeos Timp1Transf F e Timp1Transf R e 1 unidade de BioTools DNA
polimerase. As condições de ciclagem utilizadas foram 94ºC por 5 minutos; seguida de
35 ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto, e
extensão de 72ºC por 10 minutos. O produto final de 646 pb gerado por esta reação
(Figura 8), analisado em gel de agarose 1%, contém a seqüência completa do cDNA
de Timp1, inclusive o códon de iniciação, e sítios de restrição para as enzimas EcoRI
(contido na extremidade 5’ do oligonucleotídeo Timp1Transf F) e XhoI (contido na
extremidade 5’ do oligonucleotídeo Timp1Transf R, ou seja, na extremidade 3’ do
produto gerado), que também são encontrados na seqüência do plasmídeo de
expressão pcDNA3.1.
50
Métodos
L 1 2 C-
1000 -
500 -
Figura 8. Produto de RT-PCR gerado a partir de cDNA enriquecido para o gene Timp1. Os produtos
foram analisados em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, visualizado em transluminador
sob luz ultravioleta e a imagem adquirida em sistema automático Kodak. L: ladder 100pb; 1: produto
gerado pela PCR; 2: duplicata do produto 1; C -: controle negativo da reação sem DNA.
51
Métodos
Portanto, o produto de 646 pb e o plasmídeo de expressão foram submetidos à
digestão com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI a fim de gerar extremidades
coesivas. Para a digestão de 10 µg de DNA foram necessárias 10 unidades de cada
enzima de restrição em uma solução contendo 66 mM de Tris-acetato (pH 7,9 a 37ºC),
20 mM de acetato de magnésio, 132 mM de acetato de potássio e 0,2 mg/mL de BSA.
As reações foram incubadas a 37ºC por 2 horas e inativadas a 65ºC por 15 minutos. Os
produtos da digestão foram purificados em colunas de purificação de DNA GFX™ PCR
DNA and Gel Band Purification segundo especificação do fabricante, e submetidos à
reação de ligação com uma relação molar de 5:1 (inserto:vetor), utilizando-se a enzima
T4 DNA Ligase conforme instrução do fabricante. A reação foi realizada a 14ºC por 16
horas, em solução contendo 40 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl
2
, 10 mM de DTT, 0,5
mM de ATP (pH 7,8 a 25°C) e 5 unidades de T4 DNA Ligase, em um volume final de 20
µL.
16. Preparação de bactérias competentes
A linhagem E. coli DH5α foi preparada para a transformação de acordo com a
metodologia descrita por Sambrook e colaboradores (1989).
Uma colônia de E. coli foi inoculada em 2 mL de meio LB. Após incubação a 37ºC
por 16 horas sob agitação de 200 rpm, uma alíquota de 500 µL da cultura foi diluída em
50 mL de meio LB fresco em um erlenmeyer. A cultura foi incubada sob agitação de
200 rpm por um período de 2 horas a 37ºC, para que as células entrassem em fase
logarítmica de crescimento. A absorbância da solução foi medida em espectrofotômetro
em comprimento de onda de 560 nm. Após a obtenção da leitura óptica entre 0,5 e 0,7,
a cultura foi colocada em banho de gelo e centrifugada a 6.000 rpm por 5 minutos a
4ºC. Em seguida, o sobrenadante foi removido e o precipitado ressuspenso em 5 mL
de CaCl
2
100 mM gelado. Após completar o volume com CaCl
2
100 mM gelado para 50
mL, a suspensão foi incubada em gelo por 10 minutos e centrifugada a 6.000 rpm por 5
minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso com CaCl
2
100 mM em volume 10 vezes maior que o valor da DO da cultura. A suspensão foi
incubada no gelo por 30 minutos e depois conservada em geladeira até o dia seguinte
52
Métodos
quando foi adicionado glicerol em concentração final de 15% do volume. Foram
preparadas alíquotas de 50 µL estocadas a 80ºC negativos até o momento do uso.
17. Transformação de bactérias competentes por CaCl
2
Uma alíquota de bactérias competentes foi descongelada e acrescentada ao
volume total da ligação prosseguindo uma incubação de 30 minutos em banho de gelo.
As células foram submetidas ao choque térmico a 42ºC por 1,5 minutos e retornadas
ao gelo por 2 minutos. A suspensão foi transferida para um tudo contendo 250 mL de
meio LB e incubadas a 37ºC durante 1 hora com agitação suave de 125 rpm para
permitir a expressão do gene de resistência à ampicilina. Uma placa de cultura de
bactéria contendo meio LB agar foi recoberta pela suspensão e incubada a 37ºC por 18
horas.
18. Mini-preparação para extração de DNA plasmidial (MiniPrep)
As colônias transformantes portadoras dos clones recombinantes tiveram o seu
DNA extraído pela técnica de MiniPrep (Sambrook et. al., 1989). A presença do inserto
do tamanho esperado foi verificada pela digestão com enzimas de restrição.
Para isso, quarenta colônias foram selecionadas randomicamente e cultivadas em
3 mL de meio de cultura LB amp a 37
o
C durante 16 horas sob agitação. Um e meio
mililitros da cultura foram transferidos para tubos estéreis e centrifugados por 1 minuto
a 14.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em 100 µL
de solução I (glicose 50 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, e EDTA 10 mM) contendo 1 µL
de RNAse A em uma concentração de 10 mg/mL. Foram adicionados 200 µL de
solução II (NaOH 0,2 N e SDS 1%) e a suspensão, homogeneizada suavemente
através da inversão dos tubos por três vezes, foi incubada à temperatura ambiente por
5 minutos. Após a adição de 200 µL de solução III (KAc 3 M e ácido acético glacial
11,5%), a mistura foi homogeneizada invertendo-se os tubos por oito vezes, incubada
em gelo por 30 minutos e centrifugada a 14.000 rpm por 15 minutos à temperatura
53
Métodos
ambiente. Aos tubos limpos foram adicionados 300 µL de isopropanol gelado, sendo
transferidos 400 µL do sobrenadante obtido na etapa anterior. As misturas foram
homogeneizadas invertendo-se os tubos por quatro vezes e os tubos centrifugados à
temperatura ambiente por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
lavado com 500 µL de etanol 70% gelado. Os tubos foram invertidos por duas vezes e
centrifugados a 14.000 rpm por 5 minutos, e o sobrenadante drenado em papel
absorvente. Para garantir que todo etanol fosse retirado das amostras, os tubos foram
colocados destampados em estufa a 42ºC por 15 minutos. Os precipitados foram então
ressuspensos em 20 µL de água deionizada estéril e estocados a 20ºC negativos.
19. Seleção dos clones pcDNA3.1-T1S
Dez microgramas do DNA extraído foram digeridos com as enzimas de restrição
EcoRI e XhoI com a finalidade de liberar o inserto do vetor para a verificação de clones
que receberam o mesmo. A reação foi realizada em solução contendo 66 mM de Tris-
acetato (pH 7,9 a 37ºC), 20 mM de acetato de magnésio, 132 mM de acetato de
potássio, 0,2 mg/mL de BSA e 10 unidades de cada enzima de restrição, a 37ºC por 2
horas. Os insertos foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1 % em
tampão TBE. O gel foi visualizado em transiluminador sob luz ultravioleta acoplado a
uma câmera a qual digitalizou sua imagem (Kodak).
Além de selecionar as colônias que continham o inserto através desta primeira
digestão, estes clones também foram analisados quanto à direção em que o inserto foi
inserido (direção senso ou anti-senso) como mostra o esquema da Figura 9. Para cada
clone foram então realizadas duas reações de digestão: uma utilizando as enzimas de
restrição Bgl2 e EcoRI e outra com Bgl2 com XhoI. Nas duas reações, 5 µg do inserto
foram digeridos a 37ºC durante 2 horas. A primeira reação foi realizada em solução
contendo 10 unidades de cada enzima (Bgl2 e EcoRI), 50 mM de Tris-HCl (pH 7.5 a
37°C), 10 mM de MgCl
2
, 100 mM de NaCl e 0,1 mg/mL de BSA e a segunda em
solução contendo 10 unidades de cada enzima (Bgl2 e XhoI), 66 mM de Tris-acetato
(pH 7,9 a 37ºC), 20 mM de acetato de magnésio, 132 mM de acetato de potássio, 0,2
mg/mL de BSA.
54
Métodos
E
E
c
c
o
o
R
R
I
I
+
+
X
X
h
h
o
o
I
I
M
M
i
i
n
n
i
i
p
p
r
r
e
e
p
p
2
2
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
-
-
6
6
5
5
0
0
e
e
5
5
4
4
2
2
8
8
p
p
b
b
2
2
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
-
-
3
3
0
0
e
e
5
5
4
4
2
2
8
8
p
p
b
b
V
V
e
e
t
t
o
o
r
r
v
v
a
a
z
z
i
i
o
o
V
V
e
e
t
t
o
o
r
r
+
+
T
T
i
i
m
m
p
p
1
1
B
B
g
g
l
l
2
2
+
+
X
X
h
h
o
o
I
I
B
B
g
g
l
l
2
2
+
+
E
E
c
c
o
o
R
R
I
I
S
S
e
e
n
n
s
s
o
o
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
d
d
e
e
9
9
5
5
0
0
e
e
5
5
1
1
2
2
8
8
p
p
b
b
;
;
a
a
n
n
t
t
i
i
-
-
s
s
e
e
n
n
s
s
o
o
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
d
d
e
e
1
1
5
5
0
0
0
0
e
e
4
4
5
5
7
7
8
8
p
p
b
b
.
.
S
S
e
e
n
n
s
s
o
o
:
:
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
d
d
e
e
1
1
5
5
0
0
0
0
e
e
4
4
5
5
7
7
8
8
p
p
b
b
;
;
a
a
n
n
t
t
i
i
-
-
s
s
e
e
n
n
s
s
o
o
:
:
b
b
a
a
n
n
d
d
a
a
s
s
d
d
e
e
9
9
5
5
0
0
e
e
5
5
1
1
2
2
8
8
p
p
b
b
.
.
Figura 9. Esquema de seleção dos clones de Timp1 senso e anti-senso.
55
Métodos
Os produtos resultantes da digestão foram analisados por eletroforese em gel de
agarose 1 % em tampão TBE e visualizados em transiluminador sob luz ultravioleta.
Os clones que apresentaram padrão de bandas com tamanho esperado foram
seqüenciados para confirmar a montagem de seqüência completa do cDNA de Timp1
no plasmídeo de expressão pcDNA3.1.
20. Confirmação da seqüência dos clones selecionados por
seqüenciamento de DNA
Os insertos clonados no plasmídeo de expressão pcDNA3.1 foram seqüenciados
utilizando oligonucleotídeos T3 Promoter e T7 Promoter (5’
ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’ e 5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’,
respectivamente, Invitrogen). Foi utilizado o método de terminação de cadeia por
dideoxinucleotídeo (Sanger et al., 1977) modificado para seqüenciamento realizado
com terminadores de cadeia dideoxinucleotídeos fluorescentes BigDye™ em
seqüenciador automático ABI PRISM 377/96 DNA Sequencer (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA). De acordo com protocolo sugerido pelo fabricante, 400ng do
plasmídeo extraído por Miniprep foram adicionados a uma solução contendo 2 µL de
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix, 1,6 pM de oligonucleotídeo M13 (-21) (5’
TGTAAAACGACGGCCAGT 3’) e a reação realizada em programa de ciclagem de
temperatura iniciado por 96ºC durante 5 minutos, seguido 25 ciclos de 96ºC por 20
segundos, 50ºC por 10 segundos e 60ºC durante 4 minutos. Ao fim da ciclagem, foi
acrescentado à reação 100 µL de etanol 80%, os tubos incubados a temperatura
ambiente por 30 minutos no escuro e centrifugados a 4.000 rpm por 45 minutos, a
temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, 200 µL de etanol 70% foram
adicionados e os tubos foram novamente centrifugados a 4.000 rpm por 15 minutos, a
temperatura ambiente. O sobrenadante foi drenado e os tubos foram colocados
destampados em estufa a 42ºC por 15 minutos. Dois e meio microlitros de tampão de
corrida para seqüenciamento (blue dextram/EDTA e formamida deionizada 1:5) foram
adicionados à solução, os tubos incubados a 60ºC por 5 minutos e a solução
56
Métodos
homogeneizada em vórtex. No momento da aplicação do gel, as amostras foram
desnaturadas a 90ºC por 2 minutos, seguida por incubação em gelo por mais 2
minutos.
A análise das seqüências em bancos genômicos foi feita através do site do
National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
utilizando a ferramenta Blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), para verificação da
existência de similaridade da região analisada com seqüências de cDNA de Timp1 de
Mus musculus depositadas no GeneBank.
As seqüências foram analisadas no programa Chromas 1.44, para confirmar a
presença do códon iniciador ATG dentro da seqüência do inserto. Depois de
confirmada a presença de um inserto apresentando a seqüência completa do cDNA de
Timp1 na posição senso (T1S), o clone 16 foi então expandido por MaxiPrep e
purificado em coluna de gradiente de Césio.
21. Maxi-preparação para extração de DNA plasmidial (MaxiPrep)
Aproximadamente 250 ng do clone 16 foram transformados em bactérias E. coli
DH5α por choque térmico previamente descrito. Uma colônia foi cultivada em 3 mL de
meio LB amp a 37ºC durante 5 horas sob agitação de 200 rpm. A cultura foi transferida
para 1,2 L de meio LB amp e cultivada por mais 16 horas com agitação de 180 rpm a
37ºC. A suspensão bacteriana foi transferida para 4 garrafas de 500 mL e centrifugada
a 6.000 rpm por 20 minutos a 8ºC (Sorvall). O sobrenadante foi descartado e o
precipitado ressuspenso em 25 mL de solução I e homogeneizado em vórtex. Foram
então adicionados 25 mL de solução II e a solução foi homogeneizada invertendo-se as
garrafas por 3 vezes e incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. Por fim, foram
adicionados 25 mL de solução III gelada e a solução foi homogeneizada invertendo-se
o tubo por 8 vezes, incubada em banho de gelo por exatamente 30 minutos e
centrifugada a 6.000 rpm por 30 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi filtrado com uma
gaze e seu volume determinado em uma proveta. Um mesmo volume de isopropanol
foi adicionado e a mistura transferida para garrafas de 100 mL e incubada por 16 horas
a 20ºC negativos. A solução foi centrifugada a 12.500 rpm por 30 minutos a 4ºC, o
57
Métodos
sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso em 1 mL de tampão TE (pH
8,0). A solução foi transferida para tubo de 15 mL e adicionado a ela o mesmo volume
de LiCl 5M gelado. Os tubos foram centrifugados a 5.000 rpm por 15 minutos, o volume
dos sobrenadantes determinados e transferidos para tubos de 15 mL limpos
juntamente com o mesmo volume de isopropanol. Após incubação a 20ºC negativos
por 16 horas, os tubos foram centrifugados a 8.000 rpm por 30 minutos a 4ºC e o
sobrenadante descartado. O precipitado foi então ressuspenso em 1 mL de tampão TE
(pH 8,0), incubado em banho-maria por 15 minutos a 56ºC e 10 µg de RNAse foram
acrescentados à solução. Após incubação a 37ºC por 15 minutos em banho-maria,
todo o volume da solução foi transferido para tubos de 1,5 mL contendo o mesmo
volume de PEG NaCl (PEG 8000 13%, NaCl 1,6 M). Por fim, os tubos foram
centrifugados a 14.000 rpm por 30 minutos, a 4ºC, os sobrenadantes descartados e o
DNA precipitado foi ressuspenso em tampão TE até a solução atingir um volume final
de 4,2 mL.
22. Purificação plasmidial por coluna de gradiente de Césio (CsCl
2
)
Aos 4,2 mL de solução de DNA foram adicionados 4,5 g de CsCl
2
e 300 µL de
brometo de etídeo a 10 mg/mL. Após ser bem homogeneizada com o auxílio de uma
seringa de 3 mL, a mistura foi transferida cuidadosamente, evitando o aparecimento de
bolhas, para tubos de ultracentrífuga. Os tubos foram selados e centrifugados em
ultracentrífuga, com rotor VTI 90, a 60.000 rpm por 16 horas a 4ºC. Com a ajuda de um
transiluminador sob luz ultravioleta, a banda correspondente ao DNA plasmidial foi
retirada cuidadosamente do tubo com a ajuda de uma seringa e transferida para tubos
de 15 mL.
Para retirar o brometo de etídeo incorporado em suas fitas, o DNA foi lavado com
2 vezes de seu volume de n-butanol saturado e hidratado. Após homogeneizar bem a
solução em vórtex, os tubos foram centrifugados a 4.000 rpm por 2 minutos, a
temperatura ambiente. A fase superior foi descartada em recipiente próprio para
descarte de material contaminado por brometo de etídeo e o processo de lavagem
repetido por mais 6 vezes ou até a fase inferior ficar completamente transparente.
58
Métodos
À solução de DNA desprovida de brometo de etídeo foram acrescentados 3 vezes
de seu volume de água deionizada estéril e 2 vezes de etanol absoluto. O DNA foi
precipitado por 2 horas a 20ºC negativos e os tubos centrifugados a 5.000 rpm por 40
minutos, a 8ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 1 mL de
etanol 70% gelado e transferido para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Os tubos
foram centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos, a 8ºC e o sobrenadante descartado.
O precipitado foi seco em Speed Vac por 20 minutos com a tampa dos tubos aberta e
ressuspenso em 200 µL de tampão TE. A solução de DNA foi incubada a 50ºC em
banho-maria por 10 minutos e no gelo por 5 minutos, antes de ser quantificada em
espectrofotômetro, como descrito anteriormente, e estocada a 20ºC negativos.
23. Transfecção com lipossomos
O plasmídeo de expressão purificado contendo o gene Timp1 (pcDNA3.1-T1S) foi
transfectado em células melan-a e Tm5 com Lipofectamine™ 2000 Transfection
Reagent segundo protocolo sugerido pelo fabricante. Um dia antes da transfecção, as
células melan-a (2,5×10
5
células/placa) e Tm5 (10
5
células/placa) foram plaqueadas em
placas de cultura de 60 mm em 5 mL de meio R5 para que, no dia seguinte, no
momento de serem transfectadas, atingissem confluência de 90 a 95%. Para cada
reação de transfecção 8 µg do plasmídeo pcDNA3.1-T1S foram diluídos em 500 µL de
meio RPMI, enquanto que, em um tubo separado, 20 µL de Lipofectamine™ 2000
também foram diluídos em 500 µL de meio RPMI. Os tubos foram incubados por 5
minutos a temperatura ambiente. O DNA foi adicionado a Lipofectamine™ 2000, a
solução foi homogeneizada por 10 segundos e incubada por 20 minutos a temperatura
ambiente para a formação dos complexos DNA-lipossomo. Todo o volume da solução
(1 mL) foi adicionado lentamente na placa de cultura contendo as células em 4 mL de
meio RPMI e homogeneizado gentilmente movendo-se as placas de cultura para frente
e para trás. As placas foram incubadas por 6 horas em estufa com atmosfera de 5% de
CO a 37°C e o meio de cultura trocado por meio R5.
2
As células transfectadas foram
cultivadas em meio R5 na presença de 2 mg/mL de G418 para garantir a seleção
daquelas que foram transfectadas com pcDNA3.1-T1S. Após 15 dias de seleção, as
células melan-a e Tm5 transfectadas com Timp1 (ma T1S e Tm5 T1S,
59
Métodos
respectivamente) foram expandidas e congeladas em meio de congelamento em
nitrogênio líquido.
Como controle da transfecção de Timp1, foi utilizado o plasmídeo de expressão
pcDNA 3.1 ligado à proteína fluorescente verde, GFP (pcDNA3.1-GFP), gentilmente
cedido pelo Prof. Dr. Sang W Han, do Centro de Terapia Gênica da UNIFESP.
Resumidamente, para a construção deste plasmídeo, a seqüência do gene GFP foi
retirada do plasmídeo comercial pEGFP-N3 e depois ligada no plasmídeo pcDNA3.1+.
Para isso, os dois plasmídeos foram digeridos com as enzimas BamHI e NotI. O inserto
liberado (GFP) do plasmídeo pEGFP-N3 e o plasmídeo pcDNA3.1+ linearizado foram
purificados em gel de agarose 1%. Estes foram então submetidos à reação de ligação
com uma relação molar de 5:1 (GFP:vetor), utilizando-se a enzima T4 DNA Ligase,
transformados em bactérias E. coli DH5α por CaCl
2
e por fim estas foram plaqueadas
em meio LB agar e incubadas a 37ºC por 18 horas. Dez colônias foram selecionadas
randomicamente. Seus DNAs foram extraídos e digeridos com as enzimas de restrição
BamHI e NotI. O padrão de bandas gerado foi analisado em gel de agarose 1 %. Os
clones positivos foram então seqüenciados e suas seqüências analisadas sendo
possível observar a seqüência inteira do gene GFP. Em seguida, o clone pcDNA3.1-
GFP foi expandido por MaxiPrep e purificado em coluna de gradiente de Césio como
descrito acima. Este plasmídeo foi então transfectado em células melan-a e Tm5 com
Lipofectamine™ 2000 e as células transfectadas foram selecionadas com antibiótico
por 15 dias e analisadas em microscópio invertido de fluorescência (Axiovert 40, Zeiss)
para se avaliar a eficiência da transfecção.
A expressão de Timp1 foi analisada nas linhagens transfectadas com pcDNA3.1-
T1S (ma T1S e Tm5 T1S) e com pcDNA3.1-GFP (ma GFP e Tm5 GFP) tanto por RT-
PCR, como por Imunofluorescência indireta, previamente descritos.
60
Métodos
24. Ensaio de proliferação celular
Para estudos de proliferação celular, as linhagens celulares foram plaqueadas em
placas de 96 poços (2,5×10
3
células/poço/100 µL de meio R5) e cultivadas por 24
horas em meio completo. Após diferentes tempos (0, 24, 48, 72 e 96 horas), o número
de células foi estimado através do método colorimétrico baseado na redução
metabólica do corante tetrazolium amarelo solúvel, MTT, em formazan púrpura
insolúvel pela ação da succinyl-desidrogenase mitocondrial (Mosmann, 1983). A leitura
da absorbância foi obtida em espectrofotômetro a 570 nm de comprimento de onda.
Este mesmo ensaio foi realizado nas linhagens celulares após serem mantidas em
suspensão por 96 horas.
25. Ensaio de Ciclo Celular
As células melan-a e Tm5 (2×10
5
células), transfectadas ou não, após serem
cultivadas em suspensão por 0, 24, 48, 72 e 96 horas, foram transferidas para tubos de
15 mL e centrifugadas a 1.500 rpm por 5 minutos, a 4ºC. As células foram lavadas,
ressuspensas em 500 µL de PBS e transferidas para um tubo de 1,5 mL. Um mililitro de
etanol absoluto foi adicionado lentamente sob agitação constante e os tubos
armazenados a 4ºC por 16 horas.
Passado este período, os materiais foram centrifugados a 1.500 rpm por 5
minutos, a 4ºC, e o etanol foi removido cuidadosamente. As células foram lavadas com
1 mL de PBS, novamente centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos e ressuspensas em
100 µL de PBS e 100 µL de RNase A a 100 µg/mL permanecendo por 5 minutos a
temperatura ambiente.
Foram adicionados 400 µL de iodeto de propídio (50 µg/mL) gelado e os tubos
incubados por 30 minutos a 4ºC no escuro. Em seguida, o conteúdo de DNA do núcleo
corado foi analisado por citometria de fluxo (FACSCalibur
TM
; Becton-Dickinson, San
Diego, CA, USA) e quantificada utilizando o programa CellQUEST
TM
. Em todas as
análises, pelo menos 10000 células foram avaliadas.
61
Métodos
26. Tumorigenicidade in vivo
Camundongos singenêicos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente no
flanco esquerdo com 2×10
5
células das linhagens melan-a, melan-a tratada com agente
desmetilante, ma GFP, ma T1S, Tm5, Tm5 GFP e Tm5 T1S em 100 µL de PBS. Cada
grupo experimental consistiu de 5 animais.
Os tumores foram mensurados diariamente com o auxílio de paquímetro. Após os
tumores atingirem um volume de aproximadamente 300 mm
3
ou após 15 dias de
experimento, os animais foram sacrificados e examinados com relação à invasão local
e à formação de metástase espontânea em diferentes órgãos.
O volume foi calculado pela fórmula descrita a seguir:
Volume em mm
3
= (diâmetro menor)
2
x diâmetro maior
2
27. Ensaio de metástase experimental
Camundongos singenêicos C57BL/6 foram inoculados na veia lateral da cauda
com 2×10
5
células das linhagens Tm5 GFP e Tm5 T1S em 100 µL de PBS. Foram
utilizados 5 animais por cada grupo experimental.
Após 23 dias, os pulmões dos camundongos, juntamente com o coração, foram
extraídos cirurgicamente e focos metastáticos foram contados com a ajuda de uma
lupa.
62
Métodos
28. Zimograma
A atividade proteolítica das MMP2 e MMP9 foi analisada no sobrenadante da
cultura das diferentes linhagens celulares.
As células foram cultivadas em placas de 100 mm de diâmetro em 5 mL de meio
RPMI (sem SFB) por 48 horas. O meio de cultura foi transferido para tubos limpos e
estes foram centrifugados a 1.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi recuperado e
transferido para tubos novos. A concentração protéica total presente nas células e no
sobrenadante foi determinada através do reagente Bio-Rad protein assay dye reagente
concentrate.
A mesma quantidade protéica (80 μg) de cada amostra foi adicionada a três vezes
de seu volume de tampão de amostra não reduzido (Tris-HCl 62 mM, pH 8,8, azul de
bromofenol 0,005% e glicerol 10%), incubada por 10 minutos a temperatura ambiente e
separada em gel reduzido de poliacrilamida 7,5% (SDS-Page) contendo 1 mg/mL de
gelatina tipo IV (calf skyn) em tampão de corrida. Após 1,5 horas de corrida a 120V, o
gel foi tratado em solução de incubação (Tris-HCl 50 mM, pH 7, 4, NaCl 200 mM e
CaCl
2
5 mM) acrescido de 2,5% de Triton X-100 por 30 minutos sob agitação a
temperatura ambiente, por três vezes. Em seguida, o gel foi mantido sob agitação
constante em solução de incubação a temperatura ambiente por 1 hora e a 37ºC por 16
horas. O tampão foi desprezado e o gel corado sob agitação em solução de Azul de
Coomassie (Coomassie R-250 0,2%, metanol 50% e ácido acético 10% em água
deionizada estéril) por 1 hora a temperatura ambiente. O gel foi lavado com água
deionizada estéril, tratado com 50 mL de solução descorante forte (metanol 50% e
ácido acético 10% em água deionizada estéril) por 10 minutos, lavado novamente com
água deionizada estéril e incubado com 50 mL de solução descorante fraca (ácido
acético 10% em água deionizada estéril) por 5 horas. O gel foi seco em papel celofane
por 2 dias a temperatura ambiente e sua imagem digitalizada em scanner.
63
Métodos
29. Imunohistoquímica
Os tumores mensurados por 15 dias (item 26), formados pela inoculação com as
linhagens de melanoma Tm5 transfectadas com GFP ou Timp1, foram removidos
cirurgicamente, dissecados, seccionados e imersos em solução fixadora (formol 10%
em PBS) por 16 horas. Os tecidos foram desidratados com concentrações crescentes
de etanol (70 a 100%), embebidos em xilol e parafinizados. Cortes seriados de 5 µm de
espessura foram obtidos em criostato e colocados sobre lâminas silanizadas. A
parafina foi retirada em banhos de xilol (3 vezes por 10 minutos cada) e, em seguida, a
reidratação do tecido foi realizada por meio da imersão das lâminas em concentrações
decrescentes de etanol (100, 95, 70 e 50%, 5 minutos cada). Os tecidos foram corados
com hematoxilina e eosina (HE), desidratados novamente com concentrações
crescentes de etanol e diafanizados em xilol. Lamínulas foram fixadas utilizando
Permount. Os resultados foram visualizados com o auxílio de um microscópio óptico de
luz (Zeiss).
Também foi analisada nos tumores a expressão de Timp1, Mmp9 e CD34. Os
cortes foram desparafinizados em banhos de xilol e reidratados. Durante o processo de
reidratação, para inativar qualquer atividade de peroxidase endógena, os cortes foram
incubados por 5 minutos em solução de etanol 70% contendo peróxido de hidrogênio
1% (vol/vol). Os tecidos foram então bloqueados com solução PBS-BSA 5%, por 15
minutos a 37 ºC em câmara úmida. Os cortes foram lavados com TBST.
As lâminas foram tratadas com anticorpos policlonais específicos, anti-Timp1,
anti-MMP9 e anti-CD34, por 16 horas em câmara úmida a 4ºC, lavadas com PBS e
incubadas com anticorpo secundário específico conjugado com peroxidase por 30
minutos a temperatura ambiente. Os cortes foram lavados em PBS, revelados por 5
minutos em solução contendo 0,05% de DAB, pH 7,4, 0,01% de peróxido de hidrogênio
e 50 mM de Tris-HCl, pH 7,2, e contra corados levemente com hematoxilina. Esse
procedimento foi realizado em colaboração com a Dra. Suely Nonogaki do laboratório
do Hospital A. C. Camargo. Os resultados foram visualizados com o auxílio de um
microscópio de luz (Zeiss).
64
Métodos
30. Ensaio de migração celular in vitro
Câmaras de Boyden modificadas Transwell
®
com membranas de policarbonato
contendo poros de 8 µm de diâmetro foram bloqueadas em sua face inferior com
solução PBS-BSA por uma hora a 37ºC. A cada poço da placa foi acrescentado 500 µL
de meio R10, enquanto que os insertos foram preenchidos com 200 µL da suspensão
de 2×10
5
células em meio RPMI e incubados por 5 horas a 37ºC em estufa úmida
contendo 5% de CO
2
. Em seguida, as membranas foram lavadas cuidadosamente com
PBS, fixadas por 5 minutos em metanol gelado, lavadas com água e coradas com azul
de toluidina 1% em tetraborato de sódio 1% (bórax) por 5 minutos. Após lavagem
exaustiva em água, as células que permaneceram na face superior da membrana
foram cuidadosamente removidas com algodão restando apenas células que migraram
para a face inferior da membrana. A lise das células e a conseqüente eluição do
corante foi feita com SDS 1% em água, aplicando-se 200 µL por câmara e incubando-
se por 30 minutos a 37ºC. A leitura da absorbância foi obtida em espectrofotômetro
(Nanodrop) a 570 nm de comprimento de onda. O controle negativo foi feito pela
análise da migração inespecífica em direção ao meio RPMI sem soro fetal bovino.
31. Ensaio de invasão celular in vitro
Um dia antes de o ensaio ser realizado, todo o material necessário, MATRIGEL
®
Basement Membrane Matrix, caixa de ponteiras, placa com câmaras de Boyden
modificadas Transwell
®
e meio RPMI, foi mantido em banho de gelo dentro da
geladeira. Durante a execução da técnica, o material permaneceu em banho de gelo
dentro do fluxo laminar.
O Matrigel foi diluído em meio RPMI em uma proporção 1:1. Para cada Transwell
®
foram adicionados 50 µL da diluição e as placas foram mantidas em estufa a 37ºC por
30 minutos. As células (4×10
5
células/câmara) foram ressuspensas em 150 µL de meio
RPMI e transferidas para dentro das câmaras sobre o MATRIGEL
®
, e a cada poço foi
acrescentado 300 µL de meio R10. As placas foram mantidas por 16 horas a 37ºC em
estufa úmida contendo 5% de CO
2
. Em seguida, as membranas foram lavadas
65
Métodos
cuidadosamente com PBS, fixadas por 5 minutos em metanol gelado, lavadas com
água e coradas com azul de toluidina 1% em tetraborato de sódio 1% (bórax) por 5
minutos. Após lavagem exaustiva em água, as células que permaneceram na face
superior da membrana foram cuidadosamente removidas com algodão restando
apenas células coradas que invadiram o MATRIGEL
®
e migraram para a face inferior
da mesma. A lise das células, seguida da eluição do corante, foi feita com SDS 1% em
água, aplicando-se 200 µL por câmara e incubando-se por 30 minutos a 37ºC. A leitura
da absorbância foi obtida em espectrofotômetro (Nanodrop) a 570 nm de comprimento
de onda. O controle negativo foi feito pela análise da migração em direção ao meio
RPMI sem soro fetal bovino.
32. Ensaio de imunoprecipitação
O extrato protéico foi extraído das diferentes linhagens celulares como descrito no
item Western Blot. Um miligrama de extrato protéico diluídos em 1 mL de tampão de
lise foi adicionado a 50 µL de proteína A-agarose e mantida em agitação constante por
1 hora a 4ºC. Os tubos foram centrifugados a 2.000 rpm por 10 minutos a 4ºC, o
sobrenadante foi transferido para tubos novos e a eles foram adicionados 20 µL de
anticorpo policlonal de cabra anti-β1 integrina. A solução foi incubada em agitação
constante por 16 horas a 4ºC. Após adição de 50 µL de proteína A-agarose, a solução
foi mantida por 2 horas a 4ºC sob agitação constante, os tubos centrifugados a 2.000
rpm por 10 minutos a 4ºC e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado 3
vezes em tampão contendo 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1% de Triton X-100 e 150
mM de NaCl e lavado 1 vez em tampão Tris-HCl 10 mM, pH 6,8. As lavagens foram
realizadas sob agitação constante durante 10 minutos a temperatura ambiente. Os
tubos foram centrifugados a 2.000 rpm por 5 minutos a 4ºC, o sobrenadante
descartado e o precipitado ressuspenso em 50 µL de tampão de amostra reduzido. Os
imunoprecipitados foram analisados por Western Blot como descrito previamente,
utilizando o anticorpo anti-Timp1.
66
Métodos
33. Análise Estatística
Todos os experimentos foram realizados pelo menos em duplicata. Para a
avaliação da significância estatística dos resultados foi aplicado o teste T Student não-
pareado na maioria dos experimentos, exceto quando indicado nos resultados outro
teste. Foram considerados estatisticamente significativos os valores de p <0,05. As
análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa computacional GraphPad
Prism 4.02 (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA).
67
RESULTADOS
Resultados
1. Transformação maligna associada com resistência ao anoikis.
As linhagens celulares obtidas pela restrição da adesão ao substrato da linhagem
não tumorigênica de melanócitos, melan-a, que correspondem a diferentes etapas da
transformação maligna dos melanócitos, foram analisadas simultaneamente quanto à
morfologia, proliferação in vitro e capacidade de formar tumores in vivo.
1.1 Morfologia das linhagens ao longo da transformação maligna.
Como observado na Figura 10, as linhagens 2C e 4C já apresentam modificações
marcantes em sua morfologia, tendo um aspecto fusiforme, diferente da linhagem
parental melan-a, que apresenta morfologia mais dendrítica. Essa morfologia
apresentada pelas linhagens derivadas de melan-a muito se assemelha a das
linhagens de melanoma 4C3- e 4C11-, a qual muda drasticamente quando comparada
àquela apresentada pelas linhagens de melanoma 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5 (Figura
10), de aspecto dendrítico e com menos pontos de adesão ao substrato semelhante à
apresentada pela linhagem de melanoma B16F10.
68
Resultados
69
Resultados
Figura 10. Morfologia dos melanócitos melan-a e das linhagens obtidas após ciclos seqüenciais de
bloqueio de ancoragem. As diferentes linhagens celulares foram cultivadas em placas plásticas de
cultura em meio completo e fotomicrografadas em microscópio invertido (Zeiss). As fotomicrografias
foram obtidas em aumento de 20X. Três padrões morfológicos distintos são observados nestas
linhagens: 1) melanócitos melan-a: padrão dendrítico com corpo celular bem espalhado na superfície da
placa; 2) linhagens não tumorigênicas 2C e 4C e linhagens de melanoma de crescimento lento, 4C3- e
4C11-: padrão fibroblastóide com aspecto fusiforme e corpo celular bem espalhado na superfície da
placa; 3) linhagens de melanoma de crescimento rápido, 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5: padrão dendrítico
com corpo celular pouco aderido à superfície da placa. ma: melanócitos melan-a; 2C e 4C: melanócitos
melan-a submetidos a 2 e 4 ciclos de bloqueio de ancoragem, respectivamente; 4C3- e 4C11-: linhagens
de melanoma de crescimento lento; 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5: linhagens de melanoma metastático;
B16F10: linhagem estabelecida de melanoma metastático.
70
Resultados
1.2 Análise da proliferação celular in vitro e tumorigenicidade in vivo das
linhagens celulares derivadas das células melan-a.
A análise de proliferação celular in vitro mostrou que as linhagens não
tumorigênicas melan-a, 2C, 4C, e as tumorigênicas 4C3- e 4C11- apresentam menor
taxa de proliferação in vitro quando comparadas às linhagens de melanoma 4C3+,
4C11+, Tm1 e Tm5 (Figura 11).
Além disso, ensaios de tumorigenicidade mostraram que, dentre as linhagens que
apresentaram menor velocidade de proliferação in vitro, as linhagens melan-a, 2C e 4C
não foram capazes de formar tumores, enquanto que as demais linhagens que
apresentaram menor velocidade de proliferação in vitro, 4C3- e 4C11-, foram capazes
de formar melanomas de crescimento lento após longos períodos de latência para seu
aparecimento. Por outro lado, a inoculação das linhagens que apresentaram maior
velocidade de proliferação in vitro, 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5, resultou em tumores de
crescimento bastante rápido, palpáveis após curto tempo de latência (Figura 12).
71
Resultados
Figura 11. Proliferação celular in vitro. A taxa de proliferação das diferentes linhagens celulares utilizadas
neste trabalho foi avaliada por ensaio de MTT. As linhagens celulares foram inicialmente cultivadas em
placas de 96 poços (2,5×10
3
células/poço/200µL de meio R5), sendo o número de células estimado nos
tempos 0, 24, 48, 72 e 96 horas de cultivo em estufa de CO
2
a 37
o
C. ma: células melan-a; 2C e 4C:
células melan-a submetidas a dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato, respectivamente;
4C3-, 4C11-: linhagens de melanoma de crescimento lento; 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5: linhagens de
melanoma de crescimento rápido (símbolos pretos). Os valores representam a média ± o desvio padrão
dos valores obtidos de sextuplicatas.
72
Resultados
Figura 12. Tumorigenicidade in vivo das linhagens derivadas de células melan-a. A capacidade das
diferentes linhagens celulares derivadas de melan-a de formar tumores in vivo foi avaliada pela
inoculação de 10
6
células no tecido subcutâneo do dorso direito de camundongos fêmeas singenêicos
C57BL/6. Os animais foram observados diariamente quanto ao aparecimento de tumores palpáveis. O
volume dos tumores foi calculado pela fórmula [(menor diâmetro)
2
× maior diâmetro]/2. ma: células
melan-a; 2C e 4C: células melan-a submetidas a dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao
substrato, respectivamente; 4C3-, 4C11-: linhagens de melanoma de crescimento lento; 4C3+, 4C11+,
Tm1 e Tm5: linhagens de melanoma de crescimento rápido. Os valores representam a média ± o desvio
padrão dos valores obtidos de um grupo de cinco animais.
73
Resultados
1.3 Análise da resistência ao anoikis ao longo da transformação maligna dos
melanócitos melan-a.
Uma das características mais marcantes da neoplasia é a resistência ao anoikis.
Isso porque, células capazes de sobreviver e proliferar independente da adesão ao
substrato tem maior chance de formar tumores e metastizar. Mesmo sendo
consideradas como um importante processo envolvido no fenótipo maligno,
pouquíssimas vezes as alterações no padrão de adesão foram consideradas como
fator principal da transformação maligna.
Para a análise de aquisição de resistência ao anoikis ao longo do processo que
resultou na transformação maligna dos melanócitos, células melan-a e as diferentes
linhagens derivadas dos ciclos de bloqueio de ancoragem foram cultivadas por 96
horas em placas revestidas com uma fina camada de agarose 1% e, em seguida, por
3h em condições de adesão. Após este período, o número de células viáveis foi
estimado pelo ensaio colorimétrico de MTT. Este resultado mostrou aumento
significativo (p<0,0001) na sobrevivência das células em condições independentes de
ancoragem ao longo da transformação maligna dos melanócitos melan-a, mesmo nas
fases mais precoces como é visto nas linhagens 2C e 4C (Figura 13).
74
Resultados
Figura 13. Linhagens estabelecidas após submeter melanócitos a ciclos seqüenciais de bloqueio de
ancoragem são mais resistentes ao anoikis que a linhagem parental melan-a. As diferentes linhagens
celulares (10
5
células/placa) foram mantidas em suspensão por 96h e, após 3h de cultivo em
adesão, as células viáveis foram estimadas através de ensaio de MTT. ma: células melan-a; 2C e
4C: células melan-a submetidas a dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato,
respectivamente; 4C3-, 4C11-: linhagens de melanoma de crescimento lento; 4C11+, Tm1 e Tm5:
linhagens de melanoma de crescimento rápido. As linhagens não tumorigênicas estão
representadas por barras vazadas e as tumorigênicas, por barras pretas. Os valores representam
a média ± o desvio padrão de sextuplicatas (p<0,0001). Valor de P foi determinado por análise de
variância não-paramétrica One-way ANOVA.
75
Resultados
2. Padrão de expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna.
Análises prévias de microarray de cDNA feitas em parceria com o Dr. João Bosco
Pesquero e o Dr. José António da Silva Júnior do Departamento de Biofísica da
UNIFESP sugeriram aumento na expressão de Timp1 nas linhagens de melanoma
Tm1 e Tm5 quando comparadas à linhagem parental melan-a cultivada tanto em
condições de adesão, como em suspensão por 24 horas (Figura 14). Como a
hibridização das membranas não apresentou boa qualidade, e a análise gráfica de
clusters apresentou um grau de correlação (R) muito próximo a zero, esse resultado foi
considerado apenas como um indicativo da expressão diferencial de Timp1 nessas
células e confirmado por outras metodologias.
Sabendo que a linhagem melan-a tem sua proliferação dependente de PMA
(Bennett et al., 1987) e que esta molécula induz a expressão de Timp1 (Gomez et al.,
1997; Lambert et al., 2004), todas as linhagens estudadas foram cultivadas na
presença deste fator. A quantidade de RNA mensageiro de Timp1 foi estimada por RT-
PCR semiquantitativo (Figura 15) em todas as linhagens celulares cultivadas em
condições de adesão (melan-a, 2C, 4C, 4C3-, 4C11-, Tm1 e Tm5) e em células melan-
a cultivadas em suspensão por diferentes tempos. Enquanto os melanócitos melan-a,
apenas quando cultivados em adesão e não quando mantidos em suspensão,
apresentaram discreta expressão de RNA mensageiro de Timp1, as linhagens
celulares derivadas dos ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem destes
melanócitos apresentaram aumento marcante na expressão deste transcrito (Figura
15). A expressão do gene da β-actina foi utilizada como controle interno da reação. A
quantificação da intensidade média dos pixels gerados pelas bandas visualizadas em
transiluminador sob luz ultravioleta de todos os grupos experimentais, representada
pela razão entre as quantidades estimadas de Timp1 e β-actina para cada amostra,
mostrou que o nível de Timp1 aumentou significativamente a partir da linhagem 2C
(gráfico da Figura 15).
76
Resultados
Figura 14. Cluster de genes associados ao câncer de Mus Musculus. As amostras estão correlacionadas
de acordo com suas similaridades. Em destaque, a expressão de Timp1 pelas células melan-a cultivadas
em adesão (ma) e em suspensão por 24 horas (mad24h) está representada pela primeira e segunda
coluna respectivamente, enquanto que a expressão pelas linhagens tumorigênicas Tm1 e Tm5 estão
representadas pelas terceira e quarta coluna. A faixa amarela indica onde está o padrão de expressão
do gene Timp1 e, em detalhe, este pode ser visto do lado direito da figura. Abaixo do detalhe, a legenda
mostra o padrão de cores que indica quanto, mais ou menos, os genes encontram-se expressos
77
Resultados
Figura 15. Aumento da expressão do RNA mensageiro de Timp1 durante a transformação maligna dos
melanócitos melan-a. A expressão do RNA mensageiro de Timp1 foi analisada em células melan-a e nas
linhagens derivadas dos ciclos de bloqueio de ancoragem por RT-PCR semiquantitativo. Eletroforese em
gel de agarose 1%, visualizado em transiluminador sob luz ultravioleta, dos transcritos para Timp1
(painel superior) e β-actina (painel inferior). O gráfico representa a média das razões das intensidades
dos pixels gerados pelas bandas correspondentes aos dois transcritos, Timp1 e β-actina, para cada
amostra obtida por RT-PCR. ma: células melan-a; D1h, D3h, D5h, D24h: células melan-a submetidas ao
bloqueio de ancoragem por uma, três, cinco e 24 horas, respectivamente; 2C, 4C: células melan-a
submetidas a dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato, respectivamente; 4C3- e 4C11-:
linhagens de melanoma de crescimento lento; Tm1 e Tm5: linhagens de melanoma de crescimento
rápido. Os valores do gráfico representam a média ± o desvio padrão de três experimentos. (p=0,0016).
Valor de P foi determinado por análise de variância não-paramétrica One-way ANOVA.
78
Resultados
O padrão de expressão protéica de Timp1 também foi avaliado nas diferentes
linhagens celulares (Figura 16). A expressão da proteína Timp1 nas células melan-a
cultivadas tanto em adesão como em condições de bloqueio de adesão ao substrato
por diferentes tempos não foi detectada por Western Blot. Em contrapartida, mostrou-
se aumentada em todas as linhagens derivadas dos ciclos seqüenciais de bloqueio de
ancoragem dos melanócitos melan-a. Contudo, esse aumento é substancialmente
maior nas linhagens não tumorigênicas 2C e 4C (Figura 16A). A Figura 16B mostra a
expressão da proteína Timp1 nas diferentes linhagens detectada por
Imunofluorescência indireta, corroborando o padrão de expressão demonstrado na
Figura 16A.
2.1 Análise da atividade de Mmps reguladas por Timp1 ao longo da
transformação maligna dos melanócitos
Como o balanço entre a atividade das metaloproteases e a expressão de seus
inibidores determina o potencial proteolítico do tumor, e essa atividade encontra-se
aumentada na maioria dos tumores, foi verificado se há mudança na atividade das
metaloproteases 2 e 9 (Mmp2 e Mmp9, respectivamente), alvos de regulação por
Timp1, ao longo da transformação maligna. Por meio de ensaios de zimograma
observou-se uma atividade constante da Mmp2 em todas as linhagens, com exceção
dos melanomas de crescimento rápido Tm1, que apresenta baixíssima atividade desta
protease, e Tm5, que é a única linhagem que não apresenta nenhuma atividade de
Mmp2, mas por outro lado, é a única linhagem que possui atividade da Mmp9 (Figura
17).
79
Resultados
A
B
Figura 16. Análise da expressão da proteína Timp1 durante a transformação maligna dos melanócitos
melan-a. A expressão da proteína Timp1 foi analisada nas linhagens celulares correspondendo a
diferentes etapas da transformação maligna dos melanócitos melan-a por Western Blot (A) e por
imunofluorescência indireta (B). Em A, no painel superior, lisados celulares foram separados por
eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, transferidos para membranas de PVDF e analisados quanto à
presença de Timp1 utilizando um anticorpo anti-TIMP-1, e no painel inferior, a mesma membrana foi
exposta ao anticorpo anti-β-actina como controle interno do ensaio. O gráfico em A representa a média
das razões das intensidades dos pixels gerados pelas bandas correspondentes a Timp1 e β-actina, para
cada amostra obtida por Western Blot. Em B, as células (2×10
4
células/poço), plaqueadas em lamínulas,
foram incubadas com anticorpo anti-TIMP-1 seguido de incubação com anticorpo secundário conjugado
à Alexa 610 (quadrado maior); e no quadrado menor as imagens foram capturas em DIC, 40x. ma:
células melan-a; D1h, D3h, D5h, D24h: células melan-a submetidas a crescimento independente de
ancoragem por uma, três, cinco e 24 horas, respectivamente; 2C, 4C: células melan-a submetidas a dois
e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato, respectivamente; 4C3-, 4C11-: linhagens de
melanoma de crescimento lento; Tm1, Tm5: linhagens de melanoma de crescimento rápido.
80
Resultados
Figura 17. Análise da atividade das metaloproteases 2 e 9 durante a transformação maligna dos
melanócitos melan-a. A atividade das metaloproteases Mmp2 e Mmp9 foi analisada nas linhagens
celulares correspondendo a diferentes etapas da transformação maligna dos melanócitos melan-a por
Zimograma. Os sobrenadantes das culturas celulares foram separados por eletroforese em gel de
poliacrilamida com 1% de gelatina e corados com azul de Comassie. Neste ensaio, onde há atividade da
metaloprotease há digestão da gelatina e esta está representada na imagem pelas bandas brancas. ma:
células melan-a; D1h, D3h, D5h, D24h: células melan-a submetidas a crescimento independente de
ancoragem por uma, três, cinco e 24 horas, respectivamente; 2C, 4C: células melan-a submetidas a dois
e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato, respectivamente; 4C3-, 4C11-: linhagens de
melanoma de crescimento lento; Tm1, Tm5: linhagens de melanoma de crescimento rápido.
81
Resultados
3. Regulação da expressão de Timp1 por mecanismos epigenéticos
3.1 Expressão do RNA mensageiro de Timp1 em células melan-a após
tratamento com agente desmetilante
Com o objetivo de determinar se a expressão de Timp1 nos melanócitos melan-a
estaria sob controle de mecanismos epigenéticos, em especial metilação do DNA,
analisamos se a desmetilação do DNA induzida por um agente desmetilante seria
capaz de mudar o padrão de expressão de Timp1 nestes melanócitos. Para tanto,
essas células foram tratadas com 5 µM do agente desmetilante 5-Aza-CdR por 48
horas.
Análises por RT-PCR mostraram nível bastante reduzido de expressão de Timp1
nas células melan-a (Figura 15) e forte indução de sua expressão após tratamento
com 5-Aza-CdR, sugerindo que a transcrição de Timp1 é controlada em melanócitos
melan-a pela hipermetilação de seu promotor (Figura 18).
3.2 Presença de dinucleotídeos CpG na seqüência genômica do gene Timp1
Para avaliar se a expressão de Timp1 é regulada diretamente por eventos
epigenéticos ao longo da transformação maligna dos melanócitos melan-a, a seqüência
do promotor e gene de Timp1 foi analisada. Curiosamente, foi constado que este gene,
diferente de outros genes que podem ter sua expressão regulada por metilação de
DNA, não possui ilhas CpG típicas e sim uma região rica em dinucleotídeos CpG
presente em seu promotor e primeiro exon (Figura 19). Dentre eles, três dinucleotídeos
CpG, 1 deles presente na região promotora do gene (S1) e os outros dois presentes no
primeiro exon (S2 e S3, respectivamente), foram escolhidos para serem analisados
quanto ao nível de metilação do DNA ao longo da transformação maligna dos
melanócitos melan-a (Figura 19).
82
Resultados
Figura 18. O tratamento com agente desmetilante induz a expressão de Timp1 em melanócitos melan-a.
Análise da expressão do RNA mensageiro de Timp1 por RT-PCR após tratamento in vitro por 48 horas
de células melan-a com 5 µM do agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-CdR). Eletroforese
em gel de agarose 1%, visualizado em transiluminador sob luz ultravioleta, dos transcritos Timp1
(bandas superiores) e β-actina (bandas inferiores). ma -: células melan-a não tratadas com 5-Aza-CdR;
ma +: células melan-a tratadas com 5 µM de 5-Aza-CdR por 2 dias.
83
Resultados
Figura 19. Representação esquemática da localização dos sítios CpG no promotor e primeiro exon de
Timp1. S1, S2 e S3 indicam os sítios CpG analisados pela técnica Methylation-sensitive single-nucleotide
primer extension (Ms-SNuPE). A seta indica o sítio de início da transcrição e os números representam a
localização dos dinucleotídeos CpG encontrados na seqüência promotora e do primeiro exon de Timp1,
de acordo com a distância do sítio de iniciação.
84
Resultados
3.3 Nível de metilação do DNA no gene Timp1
Através da técnica de Ms-SNuPE, a média da metilação de DNA nos três
dinucleotídeos estudados (S1, S2 e S3) foi determinada em todas as linhagens,
incluindo células melan-a tratadas com 5-Aza-CdR (Figura 20), células melan-a
mantidas em suspensão por 5 e 24 foras e as linhagens representando diferentes
etapas da transformação maligna cultivadas em condição de adesão (Figura 21).
Como melan-a é uma linhagem não tumorigênica, porém imortalizada, DNA extraído da
pele de camundongos foi utilizado com o objetivo de comparar o padrão de metilação
no promotor e primeiro exon de Timp1 nos melanócitos melan-a e em tecidos normais
(Figura 20).
A seqüência de DNA analisada foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico
das diferentes linhagens celulares tratado com bissulfito de sódio. O produto da PCR,
purificado do gel de agarose, foi utilizado em reações de extensão na presença de
32
P-
dCTP ou
32
P-dTTP. Os produtos de reação foram separados em gel de
seqüenciamento e submetidos à autoradiografia. A incorporação de dCTP indica que o
sítio CpG analisado está metilado, enquanto que a de dTTP indica não metilação do
mesmo. A porcentagem de metilação de Timp1 foi determinada como uma média da
intensidade das bandas que representam a metilação nos 3 sítios CpG distintos
contidos na seqüência analisada.
Essa análise mostrou diminuição na metilação de DNA do gene Timp1 após as
células melan-a serem tratadas com 5-Aza-CdR (Figura 20) e desmetilação
progressiva de Timp1 durante a transformação maligna de melan-a (Figura 21). No
início da transformação, comparando as linhagens melan-a e 2C, é possível observar
uma diminuição de aproximadamente 25% no nível de metilação do DNA nas células
2C. Em relação às outras linhagens analisadas, há drástica diminuição na média da
metilação de DNA, que atinge cerca de 5%, se comparada ao nível de metilação da
linhagem parental (66%). No gráfico da Figura 21, a média da porcentagem de
metilação dos três sítios analisados para cada amostra está representa pelos
retângulos e a média da expressão de Timp1 representada por pontos, mostrando
claramente que a desmetilação progressiva é concomitante ao ganho de expressão
deste gene, ao longo da transformação maligna de melan-a.
85
Resultados
Figura 20. A desmetilação do promotor e primeiro exon de Timp1 está correlacionada com sua
expressão nos melanócitos melan-a. Análise quantitativa do nível de metilação nos três sítios CpG (S1,
S2 e S3) localizados no promotor e primeiro exon de Timp1 em várias amostras de DNA utilizando a
técnica de Methylation-sensitive Single-Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE). A porcentagem de
metilação em cada sítio CpG foi determinada considerando a intensidade das bandas em C e T. A média
da metilação dos três sítios analisados está mostrada na parte inferior de cada painel. Os DNAs
utilizados foram extraídos de: pele: pele de camundongo; ma -: células melan-a não tratadas com 5-Aza-
CdR; ma +: células melan-a tratadas com 5 µM de 5-Aza-CdR por 2 dias. Os valores do gráfico
representam a média de metilação ± o desvio padrão nos três sítios CpG analisados.
86
Resultados
Figura 21. A desmetilação progressiva do promotor e primeiro exon de Timp1 está correlacionada com
sua expressão durante a transformação neoplásica dos melanócitos melan-a. Análise quantitativa do
nível de metilação nos três sítios CpG (S1, S2 e S3) localizados no promotor e primeiro exon de
Timp1 em várias amostras de DNA utilizando a técnica de Methylation-sensitive Single-Nucleotide
Primer Extension (Ms-SNuPE). A porcentagem de metilação em cada sítio CpG foi determinada
considerando a intensidade das bandas em C e T. A média da metilação dos três sítios analisados
está mostrada na parte inferior de cada painel. Os DNAs utilizados foram extraídos de: ma:
células melan-a cultivadas em condições de adesão; D5h, D24h: células melan-a submetidas a
bloqueio de ancoragem por 5 e 24 horas, respectivamente; 2C e 4C: células melan-a submetidas a
dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão ao substrato, respectivamente; 4C3- e 4C11-:
linhagens de melanoma de crescimento lento; 4C3+, Tm1 e Tm5: linhagens de melanoma de
crescimento rápido. Os valores do gráfico representam a média de metilação ± o desvio padrão
nos três sítios CpG analisados. Valor de P foi determinado por análise de variância não-
paramétrica One-way ANOVA.
87
Resultados
4. Efeito da superexpressão de Timp1 nos melanócitos e células de
melanoma
4.1 Expressão do RNA mensageiro de Timp1 em células melan-a e Tm5 após
transfecção com plasmídeo de expressão para Timp1
A linhagem de melanócitos melan-a, que não expressa Timp1, e a de melanoma
Tm5, que expressa, foram submetidas à transfecção com o gene Timp1, resultando em
sua superexpressão. Como controle deste ensaio, as mesmas linhagens foram
transfectadas com o gene GFP (Green fluorescence protein).
A Figura 22 mostra a expressão de Timp1 por RT-PCR (A), Western Blot (B) e
imunofluorescência indireta (C) nas células após a transfecção com Timp1 ou GFP. A
superexpressão de Timp1 é claramente observada nos clones das células melan-a
transfectadas com Timp1 (ma T1S) e, em menor intensidade na linhagem de
melanoma Tm5 (Tm5 T1S). Os melanócitos melan-a transfectados com o gene Timp1
(ma T1S) expressam níveis iguais ou até maiores de Timp1 comparado às células de
melanoma Tm5 (Tm5 GFP).
4.2 Superexpressão de Timp1 não afeta a proliferação celular
A taxa de proliferação in vitro foi quantificada pelo ensaio de MTT em diferentes
tempos nas células melan-a não-transfectadas (ma C), tranfectadas com GFP (ma
GFP), e transfectadas com Timp1 (ma T1S), e em células de melanoma Tm5 não-
transfectadas (Tm5 C), tranfectadas com GFP (Tm5 GFP), e transfectadas com Timp1
(Tm5 T1S). A Figura 23 revela taxas de proliferação muito semelhantes entre as
células que superexpressam Timp1 e seus controles, tanto na linhagem não
tumorigênica melan-a como na linhagem tumorigênica Tm5, indicando que o aumento
de expressão de Timp1 não afeta a proliferação celular no modelo estudado.
88
Resultados
C A
B
Figura 22. Superexpressão de Timp1 em melanócitos melan-a e em células de melanoma Tm5.
Análise da expressão de Timp1 por RT-PCR (A) Western Blot (B) e por imunofluorescência indireta (C)
após transfecção com plasmídeo de expressão para o gene Timp1 nas linhagens melan-a e Tm5. Em A,
eletroforese em gel de agarose 1%, visualizado em transiluminador sob luz ultravioleta, dos transcritos
Timp1 (bandas superiores) e β-actina (bandas inferiores). Em B, no painel superior foram analisados
quanto à presença de Timp1, e no painel inferior, a mesma membrana foi exposta ao anticorpo anti-β-
actina como controle interno do ensaio.Os gráficos em A e B representam a razão da média da
intensidade de pixels gerados pelas bandas de Timp1 e β-actina de cada amostra. Em C, nos quadrados
da esquerda as células foram incubadas com anticorpo primário policlonal de coelho anti-TIMP-1 e as
imagens foram capturadas em comprimento de onda 610; enquanto que nos quadrados da direita, as
imagens foram capturas em comprimento de onda 488 (aumento de 40x). Células transfectadas com
GFP foram utilizadas como controle do ensaio de transfecção. ma: células melan-a; Tm5: linhagem de
melanoma de crescimento rápido; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células
transfectadas com o gene Timp1.
89
Resultados
Figura 23. A superexpressão de Timp1 não afeta a proliferação das linhagens melan-a e Tm5. A taxa de
proliferação celular in vitro foi avaliada por ensaio de MTT. As linhagens celulares foram inicialmente
cultivadas em placas de 96 poços (2,5×10
3
células/poço/200µL de meio R5), sendo o número de células
estimado nos tempos 0, 24, 48, 72 e 96 horas de cultivo em estufa de CO
2
a 37
o
C. Células transfectadas
com GFP foram utilizadas como controle do ensaio de transfecção. ma: células melan-a; Tm5: linhagem
de melanoma de crescimento rápido; C: células controle não-transfectadas; GFP: células transfectadas
com o gene GFP; T1S: células transfectadas com o gene Timp1. Os valores representam a média ± o
desvio padrão de sextuplicatas.
90
Resultados
4.3 A superexpressão de Timp1 confere resistência ao anoikis em
melanócitos e em células de melanoma
Os melanócitos melan-a e as células de melanoma Tm5 superexpressando Timp1
(ma T1S e Tm5 T1S) foram cultivadas em condição de bloqueio de adesão ao
substrato. A coloração com Azul de Trypan mostrou que as células melan-a
permaneceram 100% viáveis após 24 horas em suspensão (dados não mostrados).
Após 96 horas, a porcentagem de células com DNA fragmentado foi determinada por
marcação com iodeto e propídio e análise por citometria de fluxo (Figura 24A) e a
viabilidade celular foi determinada por ensaio de MTT (Figura 24B). Esses estudos
mostraram que células que superexpressam Timp1 (ma T1S) são mais resistentes à
apoptose por perda de adesão que sua contraparte não transfectada (ma C)(Figura 24
A e B) ou transfectada com GFP (Figura 24B). Na Figura 24B, é possível observar
que células melan-a transfectadas com Timp1 (ma T1S) são 2,5 vezes mais resistentes
ao anoikis que o controle não transfectado (ma C), 3,4 vezes mais resistentes que o
controle transfectado com GFP (ma GFP) e tão resistentes ao anoikis quanto células
de melanoma Tm5 (Tm5 C). Nesta mesma figura, pode-se observar também que a
resistência ao anoikis aumentou nas células de melanoma Tm5 que superexpressam
Timp1 (Tm5 T1S), sendo 2 vezes maior que o controle não transfectado (Tm5 C) e 1,5
vezes maior que o controle transfectado com GFP (Tm5 GFP).
91
Resultados
A
B
Figura 24. Células melan-a superexpressando Timp1 tornam-se resistentes ao anoikis. A: As diferentes
linhagens celulares (10
5
células/placa) foram mantidas em suspensão por 96h e o número de células
apoptóticas foi determinado pela análise do ciclo celular realizada para quantificar a população de
células na fração sub-G1 por citometria de fluxo após incubação das células com iodeto de propídio. A
morte celular está expressa em porcentagem, considerando 100% as células no tempo zero, antes de
serem submetidas à condição de impedimento de ancoragem, onde dez mil eventos foram avaliados por
amostra. Em B, as diferentes linhagens celulares (10
5
células/placa) também foram mantidas em
suspensão por 96h e, após 5h de cultivo em adesão, a viabilidade celular foi estimada através de ensaio
de MTT. Células transfectadas com GFP foram utilizadas como controle do ensaio de transfecção. ma:
células melan-a; Tm5: linhagem de melanoma de crescimento rápido; C: células controle não-
transfectadas; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células transfectadas com o gene
Timp1. Os valores representam a média ± o desvio padrão da média de dez mil eventos em A e de três
experimentos em B. *p<0,05; **p<0,005, ***p<0,0005.
92
Resultados
4.4 A superexpressão de Timp1 em melanócitos melan-a confere capacidade
de crescimento em soft-agar
O fenótipo de resistência ao anoikis também foi testado nas células controle e
transfectadas com Timp1 ou GFP quando as mesmas foram cultivadas em soft-agar.
Como observado na Figura 25, cinco vezes mais células melan-a que
superexpressavam Timp1 permaneceram viáveis, mesmo após 21 dias cultivadas
nessas condições. Interessantemente, essas células foram capazes de sobreviver em
soft-agar tanto quanto as linhagens de melanoma Tm5 transfectadas com GFP e
Timp1, que não apresentaram diferença significativa no número de colônias formadas
no soft-agar quando comparadas entre elas (Figura 25).
4.5 A superexpressão de Timp1 causada pelo tratamento com agente
desmetilante 5-Aza-CdR não resulta em resistência ao anoikis em melanócitos
melan-a
Como o tratamento das células melan-a com o agente desmetilante 5-Aza-CdR
induz a expressão de Timp1 e o aumento desta expressão provoca resistência ao
anoikis, foi testada a competência do tratamento com 5-Aza-CdR em converter o
fenótipo sensível ao anoikis de células melan-a. Com este propósito, células melan-a
tratadas e não com 5-Aza-CdR forma mantidas em suspensão por 96 horas e, após
este período, o número de células viáveis foi avaliado pelo ensaio de MTT. Neste caso,
não há diferença significativa no número de células capazes de sobreviver em
condições de bloqueio de ancoragem entre as células melan-a tratadas com o agente
desmetilante e seu controle não tratado (Figura 26).
93
Resultados
Figura 25. Células melan-a expressando Timp1 são capazes de formar colônias em soft-agar como a
linhagem de melanoma Tm5. Os melanócitos melan-a e as células de melanoma Tm5, transfectados
com GFP ou Timp1, foram cultivados em placas contendo meio semi-sólido (soft-agar). Após 21 dias
cultivadas nessas condições, as colônias formadas foram coradas com solução de cristal violeta e o
número de colônias formadas foi determinado. Células transfectadas com GFP foram utilizadas como
controle do ensaio de transfecção. ma: células melan-a; Tm5: linhagem de melanoma de crescimento
rápido; C: células controle não-transfectadas; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células
transfectadas com o gene Timp1. Os valores representam a média ± o desvio padrão da média de dois
experimentos. ***p<0,0005.
94
Resultados
Figura 26. Células melan-a tratadas com agente desmetilante não se tornam resistentes ao anoikis.
Células melan-a tratadas in vitro com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina (5-Aza-CdR) foram
posteriormente mantidas em suspensão por 96 horas e, após cinco horas de cultivo em adesão, a
viabilidade celular foi estimada através de ensaio de MTT. ma: células melan-a não tratadas com 5-Aza-
CdR (controle positivo tratamento); ma 5-Aza-CdR: células melan-a tratadas com 5 µM de 5-Aza-CdR
por 2 dias.Os valores representam a média ± o desvio padrão da média de 2 experimentos. p=ns:
diferença estatística não significativa.
95
Resultados
4.6 A superexpressão de Timp1 em melanócitos melan-a não é capaz de
induzir crescimento tumoral in vivo
Já que as células melan-a transfectadas com Timp1 tornaram-se hábeis em
crescer independente da ancoragem em meio semi-sólido e a aquisição desta
habilidade é considerada um ensaio clássico para avaliação in vitro da transformação
maligna de diversas linhagens celulares (Frisch, 1994), a relação causal entre
expressão de Timp1 e aquisição de um fenótipo maligno nestas células foi testada.
Portanto, células melan-a, tratadas com 5-Aza-CdR, transfectadas com GFP e
transfectadas com Timp1 (10
7
células/animal) foram inoculadas no tecido subcutâneo
de camundongos C57Bl/6 e o desenvolvimento de tumores foi checado diariamente por
mais de três meses. Nenhum desenvolvimento tumoral foi observado em nenhum dos
grupos experimentais (Figura 27), independentemente da quantidade de Timp1
expresso por cada uma delas das linhagens celulares inoculadas.
96
Resultados
Figura 27. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de melanócitos melan-a superexpressando Timp1. A
capacidade de formar tumores in vivo pelos melanócitos melan-a tratados com agente desmetilante ou
transfectados com GFP ou Timp1 foi avaliada pela inoculação de 10
7
células no tecido subcutâneo do
dorso direito de camundongos fêmeas singenêicos C57BL/6. Como controle do ensaio, células (2×10
5
células/animal) das linhagens de melanoma 4C3- e Tm5 também foram injetadas. Os animais foram
observados diariamente quanto ao aparecimento de tumores palpáveis. ma: células melan-a não
tratadas com 5-Aza-CdR e não transfectadas (controle positivo); ma 5-Aza-CdR: células melan-a
tratadas com 5 µM de 5-Aza-CdR por 2 dias; ma GFP: células melan-a transfectadas com o gene GFP;
ma T1S: células melan-a transfectadas com o gene Timp1. 4C3-: linhagem de melanoma de crescimento
lento; Tm5: linhagem de melanoma de crescimento rápido.Os valores representam a média ± o desvio
padrão de um grupo de cinco animais.
97
Resultados
4.7 A superexpressão de Timp1 em células de melanoma resulta em fenótipo
mais agressivo in vivo
Diferente do que foi visto na Figura 28, ensaios de tumorigenicidade com a
linhagem de melanoma Tm5 mostraram que a inoculação do clone que superexpressa
Timp1, Tm5 T1S, resultou no aumento da velocidade de crescimento tumoral in vivo e
na diminuição no tempo de latência para o aparecimento desses tumores (Figura 28).
Esses tumores foram então extraídos e analisados por meio do ensaio de
imunohistoquímica quanto à expressão das proteínas Timp1, Mmp9 e CD34. Nenhuma
diferença foi notada quando se comparou a linhagem de melanoma Tm5
superexpressando Timp1 (Tm5 T1S) com seu controle Tm5 GFP (dados não
mostrados).
Quando inoculados intravenosamente na cauda dos camundongos, essas células
apresentaram maior potencial metastático in vivo, já que foram capazes de formar 2,5
vezes mais o pulmão (Figura 29) e de colonizarem também o pericárdio (dados não
mostrados).
98
Resultados
Figura 28. Ensaio de tumorigenicidade in vivo de células de melanoma Tm5 superexpressando Timp1. A
capacidade de células de melanoma Tm5 transfectadas com GFP ou Timp1 de formar tumores in vivo foi
avaliada pela inoculação de 2×10
5
células no tecido subcutâneo do dorso direito de camundongos
fêmeas singenêicos C57BL/6. Os animais foram observados diariamente quanto ao aparecimento de
tumores palpáveis. O volume dos tumores foi calculado pela fórmula [(menor diâmetro)
2
× maior
diâmetro]/2. Tm5 GFP: linhagem de melanoma de crescimento rápido transfectadas com o gene GFP;
Tm5 T1S: linhagem de melanoma de crescimento rápido transfectadas com o gene Timp1. Os valores
representam a média ± o desvio padrão da média de um grupo de cinco animais (p=0,0466).
99
Resultados
Figura 29. Metástase experimental in vivo de células de melanoma Tm5 superexpressando Timp1. A
capacidade de células de melanoma Tm5 transfectadas com GFP ou Timp1 de formar colônias
metastáticas no pulmão foi avaliada pela inoculação endovenosa de 2×10
5
células pela veia caudal de
camundongos singenêicos C57BL/6 do sexo feminino. Após 28 dias, os animais foram sacrificados e o
número de colônias presentes no pulmão foi determinado. Tm5: linhagem de melanoma de crescimento
rápido; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células transfectadas com o gene Timp1. Os
valores representam a média ± o desvio padrão da média de um grupo de cinco camundongos.
100
Resultados
4.8 A superexpressão de Timp1 em células de melanoma não resulta em um
fenótipo mais invasivo in vitro
Como as células de melanoma Tm5 tornaram-se mais agressivas in vivo (Figuras
28 e 29), verificou-se se estes resultados eram reflexo de alterações nos processos
relacionados à migração e invasão destas células. Essas análises também foram
realizadas na linhagem melan-a, já que esta, mesmo após ser transfectada com Timp1,
não apresentou perfil tumorigênico in vivo.
Para tanto, foram realizados ensaios in vitro de migração e invasão celular com
células melan-a não-transfectadas (ma C), tranfectadas com GFP (ma GFP), e
transfectadas com Timp1 (ma T1S), e com células de melanoma Tm5 não-
transfectadas (Tm5 C), tranfectadas com GFP (Tm5 GFP), e transfectadas com Timp1
(Tm5 T1S).
No caso das células melan-a não houve diferença significativa no número de
células capazes migrar e invadir in vitro (Figuras 30 e 31). Já a linhagem de melanoma
Tm5 transfectada com Timp1, apresentou aumento significativo (p<0,05), embora sutil,
na capacidade de migração in vitro, quando comparada ao seu controle não
transfectado (Tm5 C) (Figura 30), apesar de não se tornarem mais invasivas in vitro
após a superexpressão de Timp1 (Figura 31).
101
Resultados
Figura 30. Ensaio de migração celular in vitro dos melanócitos melan-a e de células de melanoma Tm5
superexpressando Timp1. A capacidade de migração das células melan-a e Tm5 transfectadas com
Timp1 foi avaliada. Células (2×10
5
células/câmara) em meio RPMI sem soro fetal bovino foram alocadas
na porção superior das câmaras de Boyden modificadas Transwell
TM
. Cada câmara foi arranjada dentro
de um poço contendo meio RPMI com 10% de soro fetal bovino. Após 5 horas, células que migraram
para a face inferior da membrana foram quantificadas através da coloração com solução azul de
Toluidina. Células transfectadas com GFP foram utilizadas como controle do ensaio de transfecção. ma:
células melan-a; Tm5: linhagem de melanoma de crescimento rápido; C: células controle não-
transfectadas; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células transfectadas com o gene
Timp1. Os valores representam a média ± o desvio padrão de dois experimentos. *p<0,05.
102
Resultados
Figura 31. Ensaio de invasão celular in vitro dos melanócitos melan-a e de células de melanoma Tm5
superexpressando Timp1. A capacidade de invasão das células melan-a e Tm5 transfectadas com
Timp1 foi avaliada. Células (2×10
5
células/câmara) em meio RPMI sem soro fetal bovino foram alocadas
na porção superior das câmaras de Boyden recobertas com Matrigel. Cada câmara foi arranjada dentro
de um poço contendo meio RPMI com 10% de soro fetal bovino. Após 16 horas, células que migraram
para a face inferior da membrana foram quantificadas através da coloração com solução azul de
Toluidina. Células transfectadas com GFP foram utilizadas como controle do ensaio de transfecção. ma:
células melan-a; Tm5: linhagem de melanoma de crescimento rápido; C: células controle não-
transfectadas; GFP: células transfectadas com o gene GFP; T1S: células transfectadas com o gene
Timp1. Os valores representam a média ± o desvio padrão de dois experimentos.
103
Resultados
5. Possível participação de Timp1 na sinalização celular
Como Timp1 tem sido considerado um determinante crítico da morte celular
através de sua função em regular vias de transdução de sinais intracelulares, foi
verificado neste modelo se a proteína Timp1 poderia interagir com moléculas
responsáveis pela regulação de vias de transdução de sinais que regulam
sobrevivência celular. Como já havia sido demonstrada a colocalização de Timp1 com
a molécula β1 integrina na superfície de células epiteliais de mama, a ligação destas
das duas foi testada em nosso modelo de estudo. Após imunoprecipitação com o
anticorpo anti-β1 integrina, foi realizado uma análise por Western Blot para a proteína
Timp1 e foi possível observar a presença desta proteína em todas as linhagens
analisadas (Figura 32), significando haver neste modelo, uma associação de Timp1
com β1 integrinas.
104
Resultados
Figura 32. A proteína Timp1 está associada com β1 integrinas. A associação destas duas moléculas foi
analisada por imuoprecipitação. Um miligrama de extrato protéico total foi imunoprecipitado com
anticorpo primário de cabra anti-β1 integrinas associado com a proteína A-agarose. O imunoprecipitado
foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, transferido para membrana de PVDF e
analisado quanto à presença de Timp1 utilizando um anticorpo primário policlonal de coelho anti-Timp-1.
ma: células melan-a; 2C, 4C: células melan-a submetidas a dois e quatro ciclos de bloqueio da adesão
ao substrato, respectivamente; 4C3-, 4C11-: linhagens de melanoma de crescimento lento; Tm1, Tm5:
linhagens de melanoma de crescimento rápido.
105
DISCUSSÃO
Discussão
Em condições normais as células encontram-se associadas com células vizinhas
e com a MEC. Este contato com a matriz garante não somente suporte físico para a
adesão das células, mas também importantes informações necessárias para
proliferação, diferenciação, migração e sobrevivência celular (Otsuka & Moskowitz,
1975; Farmer et al., 1978; Ben-Ze'ev & Raz, 1981; Stoker et al., 1990; Adams & Watt,
1993; Hay, 1993; Assoian, 1997; Lukashev & Werb, 1998; Valentijn et al., 2004).
Células normais presentes em um ambiente inapropriado são impedidas de se associar
à MEC, o que resulta na interrupção de sinais de sobrevivência, levando a célula a um
tipo especializado de morte, denominado anoikis (Frisch & Francis, 1994). Acredita-se
que este tipo de apoptose ajude a manter o número apropriado de células em um
determinado tecido e, desta forma, a arquitetura tecidual (Polakowska et al.,1994; Hall
et al., 1994; Boudreau et al., 1995; Coucouvanis & Martin, 1995).
Deixando de lado sua relevância em condições fisiológicas, a perda da
dependência da ancoragem é considerada um dos mecanismos cruciais da
transformação maligna e da progressão tumoral, já que células capazes de proliferar
sem necessidade de adesão espalham-se a partir do tumor primário e resistem ao
anoikis (MacPherson & Montagnier, 1964; Stoker et al., 1968; Freedman & Shin, 1974;
Shin et al.; 1975; Baserga, 1997; Grossmann et al., 2001). A habilidade distinta de
células tumorais de crescer em suspensão, meio de cultura semi-sólido ou como
esferóides multicelulares tem sido freqüentemente associada ao crescimento
independente de ancoragem (Guadagno et al.,1991; Rak et al., 1999) e, mais
recentemente, à sobrevivência independente de ancoragem (Meredith & Schwartz,
1997). Embora haja forte correlação entre resistência de células transformadas ao
anoikis e habilidade de formar tumores in vivo, evidências diretas de uma relação
causal entre estes eventos continuam desconhecidas.
Com o intuito de explicar uma possível correlação entre a transformação maligna
e a sobrevivência independente de ancoragem, foi estabelecido um modelo in vitro de
carcinogênese murina (Correa et al., 2005; Oba-Shinjo et al., 2006), que favorece
especificamente a aquisição de resistência ao anoikis por uma linhagem de
melanócitos imortalizados, mas não tumorigênicos, denominada melan-a (Bennett et
al., 1987). Neste modelo de estudo, a exposição de células melan-a a ciclos
seqüenciais de impedimento de ancoragem ao substrato com duração de 96 horas
106
Discussão
levou ao estabelecimento espontâneo de variantes celulares que apresentam reduzida
suscetibilidade ao anoikis, como observado na Figura 13. As linhagens derivadas de
melan-a denominadas 2C e 4C, mesmo não sendo capazes de formar tumores in vivo
(Figura 12), tornam-se significativamente mais resistentes ao anoikis (Figura 13)
quando comparadas às células melan-a e apresentam taxa de proliferação celular
similar à linhagem parental (Figura 11). Linhagens distintas de melanoma (4C3-, 4C11-
, 4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5) obtidas a partir da diluição limitante de esferóides de
células 4C são capazes de crescer como tumores quando injetadas subcutaneamente
em camundongos singenêicos, com diferentes tempos de latência para o aparecimento
de tumores (Figura 12), e mostram-se resistentes ao anoikis (Figura 13). Como pode
ser observado na Figura 11, há uma diferença marcante na proliferação celular in vivo
entre as diversas linhagens de melanoma, separando-as em linhagens de crescimento
lento, menos agressivas (4C3- e 4C11-) e linhagens de crescimento rápido, mais
agressivas (4C3+, 4C11+, Tm1 e Tm5). Além dessas modificações, alterações
graduais na morfologia das linhagens estabelecidas após submeter os melanócitos
melan-a a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem foram observadas (Figura 10).
Desta forma, estas células têm sido utilizadas como representativas de etapas
correspondendo a diferentes fases da gênese do melanoma, onde melan-a, 2C e 4C
poderiam corresponder às fases de nevo a nevo displásico; as linhagens de melanoma
4C3- e 4C11- corresponderiam a melanomas pouco agressivos; e as demais linhagens
de melanoma, a melanomas mais agressivos ou de fase de crescimento vertical, já que
são capazes de levar à formação de metástases à distância (dados não mostrados).
Assim, como observado também por outros autores, a falta de adesão ao substrato
implica em diversas alterações celulares que se tornam cada vez mais evidentes com o
aumento do grau de transformação celular (Benecke et al., 1978; Wittelsberger et al.,
1981).
Análises prévias de microarray de cDNA sugeriram aumento na expressão de
Timp1 nas linhagens de melanoma Tm1 e Tm5 quando comparadas à linhagem
parental melan-a cultivada tanto em condições de adesão, como em suspensão por 24
horas (Figura 14). Esse resultado, após ser confirmado por RT-PCR, foi considerado
inesperado levando em consideração a função bem estabelecida de Timp1 de impedir
a degradação da MEC mediada pelas MMPs e, conseqüentemente, de inibir a invasão
da célula tumoral e a formação de metástases por diferentes tipos tumorais, incluindo o
107
Discussão
melanoma (Xu et al., 1998; Airola et al., 1999; MacDougall et al., 1999). Entretanto,
estudos correlacionaram aumento de expressão de Timp1 com progressão maligna e
mau prognóstico, tanto em tumores humanos como em modelos experimentais murinos
(Curran & Murray, 1999; Murashige et al., 1996; Guedez et al., 2001; Schrohl et al.,
2003; Rhee et al., 2004). Esses efeitos contraditórios podem ser resultado de outras
importantes funções exercidas por Timp1, não relacionadas a MMPs. De fato, tem sido
comumente demonstrado que essa molécula induz proliferação de inúmeros tipos
celulares através de mecanismos aparentemente independentes das MMPs (Hayakawa
et al., 1994; Chesler et al., 1995; Guedez et al., 1998a), promove a regulação da
angiogênese (Bloomston et al., 2002; Ikenaka et al., 2003) e regula apoptose
(Kossakowska et al., 1991; Oelmann et al., 2002). Li e colaboradores (1999) mostraram
que a expressão de Timp1 protege células epiteliais de mama de diferentes tipos de
apoptose, incluindo anoikis. No presente trabalho, foi mostrado aumento significativo da
expressão de Timp1 durante a transformação maligna de melanócitos melan-a em
paralelo à aquisição do fenótipo de resistência ao anoikis. Interessantemente, este
aumento já é observado no início do processo de transformação maligna, ou seja, nas
linhagens não tumorigênicas 2C e 4C (Figura 15 e 16), que corresponderiam a lesões
pré-malignas.
Inúmeros trabalhos têm mostrado que o genoma das células tumorais apresenta-
se globalmente hipometilado quando comparado ao genoma das células normais
(Laird, 2005) e que mudanças no padrão de metilação do DNA, particularmente em
ilhas CpG encontradas em regiões promotoras, tanto na forma de hipometilação
levando à ativação de proto-oncogenes, como de hipermetilação resultando no
silenciamento de genes supressores de tumor, também podem ocorrer (Gopisetty et al.,
2006). Dados prévios do laboratório mostraram alteração significativa no nível global de
metilação do DNA neste modelo ao longo do processo de transformação neoplásica
(Campos et al., 2007; e dados não publicados). Neste modelo foram observadas
significativa hipermetilação global do DNA quando melanócitos melan-a foram mantidos
em suspensão por diferentes tempos (Campos et al., 2007) e progressiva
hipometilação global ao longo da progressão tumoral (dados não mostrados). Esses
resultados mostram que há mudanças no padrão de metilação do DNA nas células
melan-a durante os ciclos de bloqueio de adesão, o que pode ser extremamente
importante para a expressão de alguns genes e silenciamento de outros. Estas
108
Discussão
alterações epigenéticas poderiam refletir em um novo padrão de expressão gênica
favorável à aquisição do fenótipo transformado.
Levando em conta essas mudanças e considerando a metilação do DNA como
um possível mecanismo de regulação da expressão de Timp1 (Xu et al., 1998; Huang
et al., 2000; MacDougall et al., 1999), o efeito da metilação de DNA no controle da
expressão deste gene foi avaliado nos melanócitos melan-a após tratamento com o
agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina, já que a expressão deste gene apresenta-
se bastante reduzida nestas células (Figura 15). Após o tratamento com este agente
desmetilante, a expressão de Timp1 nos melanócitos melan-a aumentou
substancialmente (Figura 18). Por conseqüência, o nível de metilação no promotor e
primeiro exon de Timp1 foi analisado através do ensaio de Ms-SNuPE nos melanócitos
melan-a. O presente trabalho mostrou pela primeira vez uma forte correlação entre a
expressão de Timp1 – que apresenta uma região rica em dinucleotídeos CpG (Figura
19), e não uma ilha CpG típica na região promotora e do primeiro exon – e o nível de
metilação nesta região, já que nossos dados mostraram aumento de sua expressão
após o tratamento das células com o agente desmetilante (Figura 18 e 20).
Além dos melanócitos melan-a, as demais linhagens estudadas também foram
avaliadas quanto ao nível de metilação na região promotora e em parte do primeiro
exon deste gene. Constatou-se, através do ensaio de MS-SNuPE, diminuição gradativa
na metilação de Timp1 nas linhagens derivadas dos ciclos de bloqueio de ancoragem
dos melanócitos, quando estas foram comparadas com a linhagem parental, melan-a
(Figura 21). Conseqüentemente, a desmetilação progressiva que ocorre inversamente
ao aumento de expressão de Timp1 ao longo da transformação maligna de melan-a
(Figura 21), sugere fortemente uma correlação entre a desmetilação do DNA e a
expressão de Timp1 neste modelo. O fato de se observar forte expressão do RNA
mensageiro e da proteína Timp1 na linhagem não tumorigênica 2C, mesmo tendo 50%
dos dinucleotídeos CpG analisados ainda metilados, pode estar relacionado ao número
limitado de sítios CpG avaliados. É possível que neste modelo outros dinucleotídeos
CpG sejam desmetilados e tenham papel tão ou mais importante na regulação da
transcrição do que aqueles até agora estudados.
Enquanto a maioria dos estudos descreve hipermetilação de ilhas CpG
encontradas em promotores levando ao silenciamento gênico (Jones & Baylin, 2007),
109
Discussão
alguns estudos recentes têm mostrado que a metilação de DNA também pode afetar a
transcrição de genes que apresentam baixa densidade de dinucleotídeos CpG na
região promotora (Bruniquel & Schwartz, 2003). No caso de genes que não possuem
ilha CpG, o status de metilação do DNA parece ser inverso àquele observado em
regiões ricas em CpG, já que a região promotora destes aparece hipermetilada nas
células normais e hipometilada no tumor (Eckhardt et al., 2004). A expressão aberrante
de genes que não contém essas ilhas em seus promotores, aproximadamente 40% de
todos os genes humanos (Takai & Jones, 2002), associada à hipometilação deste DNA,
tem sido mostrada em alguns genes incluindo, por exemplo, os genes maspina (Wada
et al., 2004), sinuclein-gamma (Liu et al., 2005), e genes da família MAGE (De Smet et
al., 1999). Além disso, esses trabalhos mostraram correlação entre a expressão tecido-
específica e a metilação destes genes que não possuem ilha CpG, mas apenas uma
região rica nesses dinucleotídeos. Esses achados, juntamente com os encontrados
neste trabalho, sugerem que todos os genes poderiam ser alvos potenciais da
maquinaria de metilação do DNA e, portanto, poderiam ter sua expressão regulada por
mecanismos epigenéticos. Como o processo de desmetilação do DNA parece estável
uma vez iniciado (Figura 21), sua função no modelo descrito neste trabalho parece ser
a de aumentar a transcrição de Timp1 nas linhagens derivadas dos ciclos de bloqueio
de ancoragem dos melanócitos melan-a.
O aumento progressivo da expressão de Timp1 observado durante a progressão
tumoral nesse modelo poderia estar relacionado funcionalmente com o aumento da
resistência ao anoikis e, conseqüentemente, com a aquisição do fenótipo maligno, já
que dados da literatura também associam esta molécula à aquisição de resistência ao
anoikis (Li et al., 1999; Chirco et al., 2005), à potencialização da carcinogênese (Rhee
et al., 2004) e a um histórico clínico negativo (Schrohl et al., 2004; Ruokolainen et al.,
2005; Wang et al., 2006). Para determinar a função de Timp1 neste modelo, foi
realizada uma abordagem genética utilizando ensaios de transfecção para
superexpressar o gene Timp1 em duas linhagens de melanócitos diferentes, a não
tumorigênica melan-a e a tumorigênica Tm5.
A homeostase de um tecido depende do balanço entre proliferação e morte
celular. Já que Timp1 também pode participar da regulação da proliferação celular em
alguns contextos (Würtz et al., 2005), a possibilidade da viabilidade celular observada
após as linhagens celulares serem mantidas em suspensão por 96 horas (Figura 13)
110
Discussão
ser decorrente de uma diferença na taxa de proliferação celular das linhagens ao invés
da aquisição progressiva da resistência ao anoikis foi avaliada. Portanto a taxa de
proliferação celular foi quantificada em diferentes tempos nos melanócitos melan-a e no
melanoma Tm5, superexpressando ou não Timp1, e revelou-se similar entre as células
que superexpressam Timp1 e seus controles, tanto na linhagem não tumorigênica
melan-a como na tumorigênica Tm5 (Figura 23). Esse resultado mostra que o aumento
na expressão de Timp1 observado durante a progressão neoplásica (Figuras 15 e 16)
não afeta a proliferação celular neste modelo.
A inibição da apoptose por Timp1 pode ser resultado de sua habilidade de
estabilizar a interação entre a célula e a MEC através da inibição da atividade das
MMPs. Se este fato fosse considerado, Timp1 não seria capaz de proteger células
contra apoptose induzida pela perda da interação entre células e substrato. Como há
atividade de Mmp2 nas células melan-a e de Mmp9 no melanoma Tm5 (Figura 17),
essas células, superexpressando ou não Timp1, foram cultivados em suspensão para
que o anoikis fosse induzido. A coloração com Azul de Trypan indicou uma viabilidade
celular de 100% das células melan-a cultivadas em suspensão por 24 horas (dados
não mostrados). Após 96 horas em suspensão, a viabilidade celular foi determinada por
citometria de fluxo utilizando iodeto de propídio e por ensaio de MTT (Figura 24 A e B).
O fenótipo de resistência ao anoikis também foi avaliado cultivando as células em soft-
agar (Figura 25). Esses resultados mostraram que células que superexpressam Timp1
resistem ao anoikis e são capazes de formar colônias em soft-agar. Esses dados
sugerem fortemente que a resistência ao anoikis induzida por Timp1 não depende da
sua habilidade de estabilizar interações entre célula e matriz, e, portanto, é
independente da inibição das Mmps.
Nos melanócitos melan-a, a transfecção de Timp1 resultou em resistência ao
anoikis. Melanócitos superexpressando Timp1 foram capazes não somente de
sobreviver após 96 horas de cultivo em suspensão, mas também de proliferar quando
cultivados em condições independentes de ancoragem, já que estas células foram
capazes de resistir à morte e formar colônias durante os 21 dias em que foram
cultivadas em soft-agar. Levando em consideração que o tratamento com o agente
desmetilante 5-Aza-CdR induz a expressão de Timp1 nas células melan-a (Figura 18)
e que o aumento desta expressão provoca resistência ao anoikis (Figura 24 e 25), foi
avaliado se o tratamento destes melanócitos com 5-Aza-CdR era capaz de conferir a
111
Discussão
estas células um fenótipo sensível ao anoikis. Não foi possível observar diferença
significativa no número de células viáveis, capazes de sobreviver em suspensão após
96 horas, quando melanócitos melan-a tratados com o agente desmetilante foram
comparados com seu controle não tratado (Figura 26). Isso pode estar relacionado ao
fato do agente desmetilante não ser específico para Timp1. Durante o tratamento com
5-Aza-CdR, inúmeros promotores gênicos que estavam metilados tornam-se
desmetilados, resultando em um padrão de expressão totalmente alterado. A
superexpressão de Timp1 no melanoma maligno Tm5 (Tm5 T1S), linhagem que já
apresenta fenótipo anoikis-resistente, resultou em uma habilidade ainda maior de
resistir à morte, quando cultivadas em suspensão (Figura 24), mas nenhuma diferença
foi observada quanto à sua capacidade de formar colônias em soft-agar (Figura 25).
Enquanto células não transformadas normalmente não sobrevivem em condições
independentes de ancoragem em meios semi-sólidos, células malignas são capazes de
sobreviver e crescer nestas condições (Frisch, 1994). Como as células melan-a
superexpressando Timp1 proliferaram em soft-agar tanto quanto a linhagem de
melanoma e esta habilidade passou a ser considerada um ensaio clássico para a
avaliação in vitro da transformação maligna de diversas linhagens em cultura (Stoker et
al., 1968; Freedman & Shin, 1974; Shin et al.; 1975), foi questionado se esta
superexpressão seria capaz de causar completa transformação maligna nestas células.
Portanto, células melan-a, tratadas ou não com agente desmetilante 5-Aza-CdR, e
transfectadas (ma T1S) ou não com Timp1 (ma C), foram injetadas em grandes
quantidades (10
7
células/camundongo) no flanco de camundongos C57Bl/6 e, mesmo
após três meses, nenhum desenvolvimento tumoral foi encontrado nos animais
transplantados com essas células (Figura 27). Por outro lado, quando células de
melanoma Tm5 transfectadas com Timp1 (Tm5 T1S) foram injetadas nos
camundongos, tanto subcutaneamente como intravenosamente, constatou-se aumento
de sua malignidade in vivo, uma vez que o tempo de latência para o aparecimento do
tumor diminuiu (Figura 28) e o potencial metastático destas células aumentou (Figura
29).
Linhagens de melanoma mais agressivas e resistentes ao anoikis, como Tm1 e
Tm5, expressam altos níveis de RNA mensageiro, mas níveis não tão expressivos da
proteína Timp1, quando comparadas às linhagens pré-malignas (2C e 4C) e malignas
menos agressivas (4C3- e 4C11-). Esta discrepância tem sido investigada e pode estar
112
Discussão
relacionada a uma taxa diferente da produção da proteína Timp1 ou a uma regulação
pós-transcricional deste gene, já que o nível de RNA mensageiro está correlacionado
com a desmetilação de seu promotor. A superexpressão de Timp1 no melanoma
maligno Tm5 aumentou ainda mais a resistência dessas células à morte quando
cultivadas em suspensão e a sua malignidade in vivo, sugerindo que a inibição do
anoikis por Timp1 pode ser crítica para a viabilidade independente da ancoragem de
células que estão se disseminando durante o processo metastático.
O aumento da agressividade in vivo do melanoma Tm5 que superexpressa Timp1
pode ser decorrente não só de uma maior resistência ao anoikis destas células, mas
também de alterações na atividade da Mmp9 que explicaria uma maior invasão destas
células e conseqüentemente uma maior colonização pulmonar. Por conta disso, foram
realizados ensaios in vitro de migração e invasão celular. Confirmando os resultados
observados nos ensaio realizado in vivo (Figura 27), os melanócitos melan-a
superexpressando Timp1 (ma T1S), não apresentam diferenças na taxa de migração
celular (Figura 30) e tão pouco em seu potencial invasivo (Figura 31), quando
comparadas com o controle (ma C). Este resultado apenas comprovou, mais uma vez,
que Timp1 atua apenas como inibidor da morte celular causada pelo impedimento da
adesão ao substrato em melanócitos murinos. Ao contrário do que se observou
anteriormente, quando a expressão de Timp1 foi aumentada na linhagem de melanoma
Tm5 (Tm5 T1S), foi possível observar uma maior tendência de migração in vitro
(Figura 30). Como foi observado nos melanócitos melan-a, o aumento da expressão de
Timp1 não mudou o potencial invasivo in vitro das células de melanoma Tm5 (Figura
31). Isso provavelmente se deve ao fato de Timp1 não inibir a atividade das Mmps
neste modelo (Figura 17).
Esses dados vão contra inúmeros trabalhos que correlacionam o aumento de
expressão de Timp1 com um melhor prognóstico, resultado da inibição da migração e
invasão celular de diversos tumores (Kawamata et al.,1995; Morán et al., 2005; Che et
al., 2006; Nasser et al., 2006), mas corroboram com aqueles mostrados por Rhee e
colaboradores (2004), os quais sugerem que Timp1 pode atuar como um importante
contribuidor da carcinogênese epitelial, especialmente durante os primeiros estágios da
progressão tumoral, e que embora níveis elevados de Timp1, encontrados em células
displásicas e carcinomas, estabilizem a MEC, isso não impede a conversão de
113
Discussão
displasias pré-malignas em carcinomas, a invasão do carcinoma no estroma, ou o
espalhamento metastático de carcinomas primários.
Numa primeira análise, os resultados demonstrados neste trabalho com o
melanoma Tm5 superexpressando Timp1 podem parecer um pouco contraditórios
considerando os ensaios in vivo e in vitro que testam o potencial invasivo destas
células. Mas se for analisado cautelosamente, é possível notar que estas células,
mesmo não sendo significativamente mais invasivas que seus controles (Figura 31),
formam duas vezes mais colônias no pulmão (Figura 29). Isso pode ser explicado pelo
fato destas células apresentarem o dobro da capacidade de sobreviver ao anoikis,
como demonstrado na Figura 24B, o que equivaleria inocular o dobro das células Tm5,
não transfectada com Timp1, na veia da cauda dos animais. Essa suposição foi
suportada por Zhu e colaboradores (2001) que mostraram que a seleção in vitro de
células resistentes ao anoikis aumenta a capacidade metastática de células de
melanoma em um modelo experimental murino. De fato, existem inúmeros trabalhos
que apontam a resistência ao anoikis como uma propriedade crucial das células
metastáticas, já que células tumorais, que entram na circulação e extravasam em sítios
secundários, são tanto desprovidas de uma matrix como expostas aos componentes da
matriz hospedeira (Mehlen & Puisieux, 2006).
Recentemente, a proteína CD63 foi identificada como molécula de ligação entre
TIMP1 em células epiteliais de mama humana (Jung et al., 2006). Além disso, esses
autores confirmaram por microscopia confocal a colocalização de TIMP1 com CD63 e
β1 integrina. Outros autores demonstraram que CD63 regula algumas vias de
sinalização celular envolvidas na atividade anti-apoptótica de TIMP1 (Berditchevski &
Odintsova, 1999). Portanto, é possível sugerir que neste modelo Timp1 também pode
estar envolvido com a via de sinalização da apoptose, já que o ensaio de
imunoprecipitação mostra a associação de Timp1 com β1 integrinas (Figura 32).
Então, os resultados mostrados neste trabalho fornecem evidências claras da
função de Timp1 como um inibidor da morte celular induzida por condições
independentes de ancoragem, já que sua expressão é necessária para a aquisição de
um fenótipo resistente ao anoikis na linhagem não tumorigênica de melanócitos melan-
a. Além disso, destaca sua relevância uma vez que o tumor tenha sido formado, já que
Timp1 parece estar envolvido no fenótipo mais agressivo das linhagens tumorigênicas.
114
Discussão
Esses dados são sustentados por estudos de pacientes tratados com inibidores
sintéticos de MMP que não mostram nenhuma alteração da sobrevida ou tempo de
progressão da doença quando comparados ao grupo placebo (Zucker et al., 2000;
Coussens et al., 2002). No modelo aqui estudado, a resistência ao anoikis é necessária
para o aumento da malignidade do melanoma, mas insuficiente para a aquisição de
uma competência tumorigênica in vivo pelos melanócitos.
Em conclusão, esses achados fornecem evidências diretas que Timp1 protege as
linhagens de melanócitos e de melanoma murinos da morte celular causada pelo
bloqueio de ancoragem ao substrato e que o aumento de sua expressão ao longo da
carcinogênese é provavelmente conseqüência da desmetilação progressiva deste
gene. Portanto, a reexpressão – ou a superexpressão - de Timp1 resulta em aumento
da resistência ao anoikis, indicando que este gene atua como contribuidor do processo
de transformação maligna dos melanócitos melan-a, potencializador da agressividade
in vivo das células de melanoma Tm5, mas por si só, não é capaz de induzir a
completa transformação maligna de células não tumorigênicas.
115
REFERÊNCIAS
Referências
Adams JC & Watt FM. Regulation of development and differentiation by
extracellular matrix. Development. 1993; 117:1183-1198.
Aicher WK, Alexander D, Haas C, Kuchen S, Pagenstecher A, Gay S, et al.
Transcription factor early growth response 1 activity up-regulates expression of tissue
inhibitor of metalloproteinases 1 in human synovial fibroblasts. Arthritis Rheum.
2003;48:348–359.
Airola K, Karonen T, Vaalamo M, Lehti K, Lohi J, Kariniemi AL, Keski-Oja J,
Saarialho-Kere UK. Expression of collagenases-1 and -3 and their inhibitors TIMP-1
and -3 correlates with the level of invasion in malignant melanomas. Br J Cancer. 1999;
80:733-43.
Akiyama Y, Maesawa C, Ogasawara S, Terashima M, Masuda T. Cell-type
specific repression of the maspin gene is disrupted frequently by demethylation at the
promoter region in gastric intestinal metaplasia and cancer cells. Am J Pathol. 2003;
163(5):1911-9.
Albini A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The
matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol
Oncol Res. 1998;4:230-41.
American Cancer Society. Cancer & Figures, 2003, Atlanta: American Cancer
Society, 2003.
American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta: American
Cancer Society, 2007.
Anderson CL, Brown CJ. Polymorphic X-chromosome inactivation of the human
TIMP1 gene. Am J Hum Genet. 1999; 65:699-708.
Armstrong BK, Kricker A. The epidemiology of UV induced skin cancer. J
Photochem Photobiol B. 2001; 63:8-18.
Assoian RK. Anchorage-dependent cell cycle progression. J Cell Biol. 1997;
136:1–4.
116
Referências
Bachem MG, Meyer D, Melchior R, Sell KM, Gressner AM. Activation of rat liver
perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike
cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis. J Clin Invest.
1992; 89:19-27.
Bachmeier BE, Vene R, Iancu CM, Pfeffer U, Mayer B, Noonan D, et al.
Transcriptional control of cell density dependent regulation of matrix metalloproteinase
and TIMP expression in breast cancer cell lines. Thromb Haemost. 2005 93:761–769.
Baker AH, Edwards DR, Murphy G. Metalloproteinase inhibitors: biological actions
and therapeutic opportunities. J Cell Sci. 2002; 115:3719-27.
Baserga R. The price of independence. Exp Cell Res. 1997; 236:1-3.
Baylin SB & Ohm JE. Epigenetic gene silencing in cancer- a mechanism for early
oncogenic pathway addiction? Nat Rev Cancer. 2006; 6:107-16.
Baylin SB. & Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics
joins genetics. Trends Genet. 2000; 16:168-74.
Ben-Ze'ev A, Raz A. Multinucleation and inhibition of cytokinesis in suspended
cells: reversal upon reattachment to a substrate. Cell. 1981 Oct;26(1 Pt 1):107-15.
Benecke BJ, Ben-Ze’ev A, Penman S. The control of mRNA production,
translation and turnover in suspended and reattached anchorage-dependent
fibroblasts.Cell.1978; 14:931–939.
Bennett DC, Cooper PJ, Hart IR. A line of non-tumorigenic mouse melanocytes,
syngeneic with the B16 melanoma and requiring a tumour promoter for growth. Int J
Cancer. 1987; 39:414-8.
Bennett DC. Genetics, development, and malignancy of melanocytes. Int Rev
Cytol. 1993; 146:191-260.
Bennett DC. How to make a melanoma: what do we know of the primary clonal
events? Pigment Cell Melanoma Res. 2008; 21:27–38.
117
Referências
Berditchevski F, Odintsova E. Characterization of integrin-tetraspanin adhesion
complexes: role of tetraspanins in integrin signaling. J Cell Biol. 1999; 146:477-92.
Berditchevski F. Complexes of tetraspanins with integrins: more than meets the
eye. J Cell Sci. 2001; 114:4143–4151
Bertaux B, Hornebeck W, Eisen AZ, Dubertret L. Growth stimulation of human
keratinocytes by tissue inhibitor of metalloproteinases. J Invest Dermatol 1991; 97:679–
85.
Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 2002; 16:6-
21.
Bloomston M, Shafii A, Zervos EE, Rosemurgy AS. TIMP-1 overexpression in
pancreatic cancer attenuates tumor growth, decreases implantation and metastasis,
and inhibits angiogenesis. J Surg Res. 2002; 102:39–44.
Bord S, Horner A, Beeton CA, Hembry RM, Compston JE. Tissue inhibitor of
matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) distribution in normal and pathological human
bone. Bone. 1999; 24:229–35.
Botelho FM, Edwards DR, Richards CD. Oncostatin M stimulates c-Fos to bind a
transcriptionally responsive AP-1 element within the tissue inhibitor of
metalloproteinase-1 promoter. J Biol Chem. 1998; 273:5211–5218.
Boudreau N, Sympson CJ, Werb Z, Bissell MJ. Suppression of ICE end apoptosis
in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 1995; 267:891-893.
Boudreau N, Werb Z, Bissell MJ: Suppression of apoptosis by basement
membrane requires three-dimensional tissue organization and withdrawal from the cell
cycle. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93:3509–3513.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de
Câncer. Coordenação de Prevenção e Vigilância de Câncer. Estimativas 2008:
Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro: INCA, 2007. 94p.
Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H. Tissue inhibitors of metalloproteinases:
evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta. 2000;1 477:267–283.
118
Referências
Brinckerhoff CE, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that
became a prince. Nature Rev Mol Cell Biol. 2002; 3:207–214.
Brueckner B & Lyko F. DNA methyltransferase inhibitors: old and new drugs for an
epigenetic cancer therapy. Trends Pharmacol Sci. 2004; 25:551–4.
Bruniquel D & Schwartz RH. Selective, stable demethylation of the interleukin-2
gene enhances transcription by an active process. Nat Immunol. 2003; 4:235-40.
Carmeliet P & Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 2000;
407:249–257.
Carmichael DF, Sommer A, Thompson RC, Anderson DC, Smith CG, Welgus HG,
et al. Primary structure and cDNA cloning of human fibroblast collagenase inhibitor.
Proc Natl Acad Sci USA. 1986; 83:2407-11.
Carr KM, Bittner M, Trent JM. Gene-expression profiling in human cutaneous
melanoma. Oncogene. 2003; 22:3076-80.
Caterina NC, Windsor LJ, Bodden MK, Yermovsky AE, Taylor KB, Birkedal-
Hansen H, et al. Glycosylation and N-terminal domain mutants of the tissue inhibitor of
metalloproteinases- 1 (TIMP-1). Biochim Biophys Acta 1998; 1388:21–34.
Caterina NC, Windsor LJ, Yermovsky AE, Bodden MK, Taylor KB, Birkedal-
Hansen H, Engler JA. Replacement of conserved cysteines in human tissue inhibitor of
metalloproteinases-1. J Biol Chem 1997; 272:32141–9.
Cawston TE, Noble DN, Murphy G, Smith AJ, Woodley C, Hazleman B. Rapid
purification of tissue inhibitor of metalloproteinases from human plasma and
identification as a gamma-serum protein. Biochem J. 1986; 238:677–82.
Chan KY, Ozçelik H, Cheung AN, Ngan HY, Khoo US. Epigenetic factors
controlling the BRCA1 and BRCA2 genes in sporadic ovarian cancer. Cancer Res.
2002; 62:4151-6.
Che G, Chen J, Liu L, Wang Y, Li L, Qin Y, et al. Transfection of nm23-H1
increased expression of beta-Catenin, E-Cadherin and TIMP-1 and decreased the
119
Referências
expression of MMP-2, CD44v6 and VEGF and inhibited the metastatic potential of
human non-small cell lung cancer cell line L9981. Neoplasma. 2006; 53:530-7.
Chesler L, Golde DW, Bersch N, Johnson MD. Metalloproteinase inhibition and
erythroid potentiation are independent activities of tissue inhibitor of metalloproteinases-
1. Blood 1995; 86:4506–15.
Chin L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nat
Rev Cancer. 2003; 3:559-70.
Chirco R, Liu XW, Jung KK, Kim HR. Novel functions of TIMPs in cell signaling.
Cancer Metastasis Rev. 2006; 25:99-113.
Clark WH Jr, Elder DE, Guerry D 4th, Epstein MN, Greene MH, Van Horn M. A
study of tumor progression: the precursor lesions of superficial spreading and nodular
melanoma. Hum Pathol 1984;15:1147-65.
Correa M, Machado J Jr, Carneiro CR, Pesquero JB, Bader M, Travassos LR,
Chammas R, Jasiulionis MG. Transient inflammatory response induced by apoptotic
cells is an important mediator of melanoma cell engraftment and growth. Int J Cancer.
2005; 114:356-63.
Coucouvanis E & Martin G. Signals for death and survival: a twostep mechanism
for cavitation in the vertebrate embryo. Cell. 1995;83:279-287.
Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. Matrix metalloproteinase inhibitors and
cancer: trials and tribulations. Science. 2002;295:2387–2392.
Curran S & Murray GI. Matrix metalloproteinases in tumour invasion and
metastasis. J Pathol. 1999; 189:300-8.
Curtin JA, Fridlyand J, Kageshita T, Patel HN, Busam KJ, Kutzner H, Cho KH,
Aiba S, Bröcker EB, LeBoit PE, Pinkel D, Bastian BC. Distinct sets of genetic alterations
in melanoma. N Engl J Med. 2005 Nov 17;353(20):2135-47.
Das PM & Singal R. DNA methylation and cancer. J Clin Oncol. 2004;22:4632–42.
120
Referências
Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, et al. Mutations of
the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002; 417:949-54.
De Smet C, Lurquin C, Lethé B, Martelange V, Boon T. DNA methylation is the
primary silencing mechanism for a set of germ line- and tumor-specific genes with a
CpG-rich promoter. Mol Cell Biol. 1999; 19:7327-35.
Dean G, Young DA, Edwards DR, Clark IM. The human tissue inhibitor of
metalloproteinases (TIMP)-1 gene contains repressive elements within the promoter
and intron 1. J Biol Chem. 2000; 275:32664-71.
Derry JM & Barnard PJ. Physical linkage of the A-raf-1, properdin, synapsin I, and
TIMP genes on the human and mouse X chromosomes. Genomics. 1992; 12:632-8.
Díaz-Montero CM & McIntyre BW. Acquisition of anoikis resistance in human
osteosarcoma cells. Eur J Cancer. 2003; 39:2395-402.
Dobrovic A & Simpfendorfer D. Methylation of the BRCA1 gene in sporadic breast
cancer. Cancer Res. 1997; 57:3347–50.
Docherty AJ, Lyons A, Smith BJ, Wright EM, Stephens PE, Harris TJ, et al.
Sequence of human tissue inhibitor of metalloproteinases and its identity to erythroid-
potentiating activity. Nature. 1985; 318:66–69.
Eckhardt F, Beck S, Gut IG, Berlin K. Future potential of the Human Epigenome
Project. Expert Rev Mol Diagn. 2004; 4:609-18.
Eden A, Gaudet F, Waghmare A, Jaenisch R. Chromosomal instability and tumors
promoted by DNA hypomethylation. Science. 2003; 300(5618):455.
Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer
progression. Nature Rev Cancer. 2002; 2:163–175.
Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and
prospects for epigenetic therapy. Nature. 2004; 429:457-63.
Esteller M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism. Ann Rev
Pharmacol Toxicol. 2005; 45:629-656.
121
Referências
Esteller M. Epigenetics provides a new generation of oncogenes and tumour-
suppressor genes. Br J Cancer. 2006; 94:179-83.
Fadeel B & Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-
ranging implications in human disease. J Intern Med. 2005; 258:479-517.
Farmer SR, Ben-Ze'av A, Benecke BJ, Penman S. Altered translatability of
messenger RNA from suspended anchorage-dependent fibroblasts: reversal upon cell
attachment to a surface. Cell. 1978; 15:627-37.
Fassina G, Ferrari N, Brigati C, Benelli R, Santi L, Noonan DM, et al. Tissue
inhibitors of metalloproteases: regulation and biological activities. Clin Exp Metastasis.
2000; 18:111-20.
Fata JE, Leco KJ, Moorehead RA, Martin DC, Khokha R. Timp-1 is important for
epithelial proliferation and branching morphogenesis during mouse mammary
development. Dev Biol 1999; 211:238–54.
Feinberg AP, Cui H, Ohlsson R. DNA methylation and genomic imprinting: insights
from cancer into epigenetic mechanisms. Semin Cancer Biol. 2002; 12:389-98.
Feinberg AP, Ohlsson R, Henikoff S. The epigenetic progenitor origin of human
cancer. Nat Rev Genet. 2006; 7:21-33.
Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis
revisited. Nat Rev Cancer. 2003; 3:453-8.
Fong KM, Kida Y, Zimmerman PV, Smith PJ. TIMP1 and adverse prognosis in
non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 1996; 2:1369–1372.
Freedman VH & Shin SI. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell
growth in semi-solid medium. Cell. 1974; 3:355–359.
Frisch SM & Francis H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces
apoptosis. J Cell Biol. 1994; 124:619–26.
Frisch SM & Screaton RA. Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Biol. 2001;
13:555–662.
122
Referências
Frisch SM & Ruoslahti E. Integrins and anoikis. Curr Opin Cell Biol. 1997; 9:701-6.
Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, et al. A
genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues
in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992; 89:1827-31.
Gaggioli C & Sahai E. Melanoma invasion - current knowledge and future
directions. Pigment Cell Res. 2007; 20:161-72.
Gallagher WM, Bergin OE, Rafferty M, Kelly ZD, Nolan IM, Fox EJ, et al. Multiple
markers for melanoma progression regulated by DNA methylation: insights from
transcriptomic studies. Carcinogenesis. 2005; 26:1856-67.
Gasson JC, Golde DW, Kaufman SE, Westbrook CA, Hewick RM, Kaufman RJ, et
al. Molecular characterization and expression of the gene encoding human erythroid-
potentiating activity. Nature. 1985; 315:768-71.
Gaudin P, Trocmé C, Berthier S, Kieffer S, Boutonnat J, Lamy C, et al. TIMP-
1/MMP-9 imbalance in an EBV-immortalized B lymphocyte cellular model: Evidence for
TIMP-1 multifunctional properties. Biochim Biophys Acta 2000; 1499: 19–33.
Gilchrest BA, Eller MS, Geller AC, Yaar M. The pathogenesis of melanoma
induced by ultraviolet radiation. N Engl J Med. 1999; 340:1341-8.
Gomez DE, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP. Tissue inhibitors of
metalloproteases: structure, regulation and biological functions. Eur J Cell Biol. 1997;
74:111-2.
Gonzalez-Gomez P, Bello MJ, Alonso ME, Arjona D, Lomas J, de Campos JM, et
al. CpG island methylation status and mutation analysis of the RB1 gene essential
promoter region and protein-binding pocket domain in nervous system tumors. Br J
Cancer. 2003; 88:109-14.
Gonzalgo ML & Jones PA. Quantitative methylation analysis using methylation-
sensitive single-nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Methods. 2002; 27:128-33.
123
Referências
Gonzalgo ML & Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific
sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE).
Nucleic Acids Res. 1997; 25:2529-31.
Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. Melanoma biology and new targeted
therapy. Nature. 2007; 445:851-7.
Grossmann J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Schölmerich J. Apoptotic
signaling during initiation of detachment-induced apoptosis ("anoikis") of primary human
intestinal epithelial cells. Cell Growth Differ. 2001; 12:147-55.
Grossmann J. Molecular mechanisms of “detachment-induced apoptosis—
Anoikis”. Apoptosis. 2002;7:247–60.
Guadagno TM, Assoian RK. G1/S control of anchorage-independent growth in the
fibroblast cell cycle. J Cell Biol. 1991; 115:1419-25.
Guedez L, Courtemanch L, Stetler-Stevenson M. Tissue inhibitor of
metalloproteinase (TIMP)-1 induces differentiation and an antiapoptotic phenotype in
germinal center B cells. Blood. 1998b; 92:1342-9.
Guedez L, McMarlin AJ, Kingma DW, Bennett TA, Stetler-Stevenson M, Stetler-
Stevenson WG. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 alters the tumorigenicity of
Burkitt’s lymphoma via divergent effects on tumor growth and angiogenesis. Am J
Pathol. 2001; 158:1207–1215.
Guedez L, Stetler-Stevenson WG, Wolff L, Wang J, Fukushima P, Mansoor A, et
al. In vitro suppression of programmed cell death of B cells by tissue inhibitor of
metalloproteinases-1. J Clin Invest. 1998a; 102:2002–10.
Guerry D 4th, Synnestvedt M, Elder DE, Schultz D. Lessons from tumor
progression: the invasive radial growth phase of melanoma is common, incapable of
metastasis, and indolent. J Invest Dermatol. 1993; 100:342S-345S.
Gupta A, Godwin AK, Vanderveer L, Lu A, Liu J. Hypomethylation of the synuclein
γ gene CpG island promotes its aberrant expression in breast and ovarian carcinoma.
Cancer Res. 2003; 63:664-73.
124
Referências
Haass NK, Smalley KS, Li L, Herlyn M. Adhesion, migration and communication in
melanocytes and melanoma. Pigment Cell Res. 2005 Jun;18(3):150-9.
Hall P, Coates P, Ansari B, Hopwood D. Regulation of cell number in the
mammalian gastrointestinal tract: the importance of apoptosis. J Cell Sci. 1994;
107:3569-3577.
Hanahan D & Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000; 100:57-70.
Haqq C, Nosrati M, Sudilovsky D, Crothers J, Khodabakhsh D, Pulliam BL, et al.
The gene expression signatures of melanoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A.
2005; 102:6092-7.
Hay ED. Extracellular matrix alters epithelial differentiation. Curr.Opin. Cell Biol.
1993; 5:1029-1035
Hayakawa T, Yamashita K, Ohuchi E, Shinagawa A. Cell growth-promoting activity
of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2). J Cell Sci 1994; 107:2373–9.
Hayakawa T, Yamashita K, Tanzawa K, Uchijima E, Iwata K. Growth-promoting
activity of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) for a wide range of cells. A
possible new growth factor in serum. FEBS Lett. 1992; 298:29–32.
Hemler ME. Specific tetraspanin functions. J Cell Biol. 2001; 155:1103–1107.
Herman JG & Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter
hypermethylation. N Engl J Med. 2003; 349:2042-54.
Hoek KS, Schlegel NC, Brafford P, Sucker A, Ugurel S, Kumar R, et al. Metastatic
potential of melanomas defined by specific gene expression profiles with no BRAF
signature. Pigment Cell Res. 2006; 19:290-302.
Hoek KS. DNA microarray analyses of melanoma gene expression: a decade in
the mines. Pigment Cell Res. 2007; 20:466-84.
Hofmann UB, Houben R, Bröcker EB, Becker JC. Role of matrix
metalloproteinases in melanoma cell invasion. Biochimie. 2005; 87:307-14.
125
Referências
Hornebeck W. Down-regulation of tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1
(TIMP-1) in aged human skin contributes to matrix degradation and impaired cell growth
and survival. Pathol Biol (Paris). 2003; 51:569-73.
Houghton NA & Polsky D. Focus on melanoma. Cancer Cell. 2002; 2:275-8.
Howlett AR, Bailey N, Damsky C, Petersen OW, Bissell MJ. Cellular growth and
survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in
breast carcinoma. J Cell Sci. 1995; 108:1945–1957.
Hsu MY, Meier F, Herlyn M. Melanoma development and progression: a
conspiracy between tumor and host. Differentiation. 2002; 70:522-36.
Hsu MY, Wheelock MJ, Johnson KR, Herlyn M. Shifts in cadherin profiles between
human normal melanocytes and melanomas. J Investig Dermatol Symp Proc. 1996;
1:188-94.
Huang X, Orucevic A, Li M, Gorelik E. Nitric oxide (NO), methylation and TIMP-1
expression in BL6 melanoma cells transfected with MHC class I genes. Clin Exp
Metastasis. 2000; 18:329-35.
Huang W, Meng Q, Suzuki K, Nagase H, Brew K: Mutational study of the amino-
terminal domain of human tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1) locates an
inhibitory region for matrix metalloproteinases. J Biol Chem. 1997; 272:22086–22091.
Huebner K, Isobe M, Gasson JC, Golde DW, Croce CM. Localization of the gene
encoding human erythroid-potentiating activity to chromosome region Xp11.1—-Xp11.4.
Am J Hum Genet. 1986; 38:819–826.
Ikenaka Y, Yoshiji H, Kuriyama S, Yoshii J, Noguchi R, Tsujinoue H, et al. Tissue
inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) inhibits tumor growth and angiogenesis in the
TIMP-1 transgenic mouse model. Int J Cancer. 2003; 105:340-6.
Jackson-Grusby L, Beard C, Possemato R, Tudor M, Fambrough D, Csankovszki
G, et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic
deregulation. Nat Genet. 2001; 27:31–9.
126
Referências
Jiang Y, Goldberg ID, Shi YE. Complex roles of tissue inhibitors of
metalloproteinases in cancer. Oncogene. 2002; 21:2245–2252.
Jiang YH, Bressler J, Beaudet AL. Epigenetics and human disease. Annu Rev
Genomics Human Genet. 2004; 5:479–510.
Johansson P, Pavey S, Hayward N. Confirmation of a BRAF mutation-associated
gene expression signature in melanoma. Pigment Cell Res. 2007; 20:216-21.
Johnson JP. Cell adhesion molecules in the development and progression of
malignant melanoma. Cancer Metastasis Rev. 1999; 18:345-57.
Jones PA & Baylin SB. The epigenomics of cancer. Cell. 2007; 128:683-92.
Jones PA & Baylin SB. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat
Rev Genet. 2002; 3:415–28.
Jones PA & Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.
Science. 2001; 293:1068–70.
Jönsson G, Dahl C, Staaf J, Sandberg T, Bendahl PO, Ringnér M, et al. Genomic
profiling of malignant melanoma using tiling-resolution arrayCGH. Oncogene. 2007;
26:4738-48.
Jung KK, Liu XW, Chirco R, Fridman R, Kim HR. Identification of CD63 as a tissue
inhibitor of metalloproteinase-1 interacting cell surface protein. EMBO J. 2006; 25:3934-
42.
Kabbarah O & Chin L. Advances in malignant melanoma: genetic insights from
mouse and man. Front Biosci. 2006; 11:928-42.
Kawamata H, Kawai K, Kameyama S, Johnson MD, Stetler-Stevenson WG,
Oyasu R. Over-expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases (TIMP1 and
TIMP2) suppresses extravasation of pulmonary metastasis of a rat bladder carcinoma.
Int J Cancer. 1995; 63:680-7.
Khokha R. et al. Antisense RNA-induced reduction in murine TIMP levels confers
oncogenicity on Swiss 3T3 cells. Science. 1989; 243:947–950.
127
Referências
Kikuchi K, Kadono T, Furue M, Tamaki K. Tissue inhibitor of metalloproteinase 1
(TIMP-1) may be an autocrine growth factor in scleroderma fibroblasts. J Invest
Dermatol 1997; 108:281–4.
Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases and metastasis.
Cancer Chemother Pharmacol. 1999; 43:S42-51.
Kopfstein L, Christofori G. Metastasis: cell-autonomous mechanisms versus
contributions by the tumor microenvironment. Cell Mol Life Sci. 2006; 63:449-68.
Kossakowska AE, Urbanski SJ, Edwards DR. Tissue inhibitor of
metalloproteinases-1 (TIMP-1) RNA is expressed at elevated levels in malignant non-
Hodgkin's lymphomas. Blood. 1991; 77:2475-81.
Kraemer KH & Greene MH. Dysplastic nevus syndrome. Familial and sporadic
precursors of cutaneous melanoma. Dermatol Clin. 1985 Apr;3(2):225-37.
Laird PW. Cancer epigenetics. Hum Mol Genet. 2005;14 Spec No 1:R65-76.
Lambert E, Dasse E, Haye B, Petitfrere E. TIMPs as multifacial proteins. Crit Rev
Oncol Hematol. 2004; 49:187–198.
Lee SJ, Yoo HJ, Bae YS, Kim HJ, Lee ST. TIMP-1 inhibits apoptosis in breast
carcinoma cells via a pathway involving pertussis toxin-sensitive G protein and c-Src.
Biochem Biophys Res Commun. 2003; 312:1196–1201.
Levenson VV. DNA methylation biomarker of cancer: moving toward clinical
application. Future Med. 2004; 5:699–707
Lewis TB, Robison JE, Bastien R, Milash B, Boucher K, Samlowski WE, et al.
Molecular classification of melanoma using real-time quantitative reverse transcriptase-
polymerase chain reaction. Cancer. 2005; 104:1678-86.
Li G, Fridman R, Kim HR. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 inhibits apoptosis
of human breast epithelial cells. Cancer Res. 1999; 59:6267–6275.
128
Referências
Li G, Schaider H, Satyamoorthy K, Hanakawa Y, Hashimoto K, Herlyn M.
Downregulation of E-cadherin and Desmoglein 1 by autocrine hepatocyte growth factor
during melanoma development. Oncogene. 2001; 20:8125-35.
Liu H, Liu W, Wu Y, Zhou Y, Xue R, Luo C, et al. Loss of epigenetic control of
synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human
cancers. Cancer Res. 2005; 65:7635-43
Liu XW, Bernardo MM, Fridman R, Kim HR. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1
protects human breast epithelial cells against intrinsic apoptotic cell death via the focal
adhesion kinase/phosphatidylinositol 3-kinase andMAPKsignaling pathway. J Biol
Chem. 2003; 278:40364–40372.
Liu XW, Taube ME, Jung KK, Dong Z, Lee YJ, Roshy S, et al. Tissue inhibitor of
metalloproteinase-1 protects human breast epithelial cells from extrinsic cell death: a
potential oncogenic activity of tissue inhibitor of metalloproteinase-1. Cancer Res. 2005;
65: 898–906.
Logan SK, Garabedian MJ, Campbell CE, Werb Z. Synergistic transcriptional
activation of the tissue inhibitor of metalloproteinases-1 promoter via functional
interaction of AP-1 and Ets-1 transcription factors. J Biol Chem. 1996; 271:774–782.
López-Otín C, Overall CM. Protease degradomics, a new challenge for
proteomics. Nature Rev Mol Cell Biol. 2002; 3:509–519.
Lukashev ME & Werb Z. ECM signalling: orchestrating cell behaviour and
misbehaviour. Trends Cell Biol. 1998; 8:437-41.
Luparello C, Avanzato G, Carella C, Pucci-Minafra I. Tissue inhibitor of
metalloprotease (TIMP)-1 and proliferative behaviour of clonal breast cancer cells.
Breast Cancer Res Treat. 1999; 54:235–244.
MacDougall JR, Bani MR, Lin Y, Muschel RJ, Kerbel RS. 'Proteolytic switching':
opposite patterns of regulation of gelatinase B and its inhibitor TIMP-1 during human
melanoma progression and consequences of gelatinase B overexpression. Br J Cancer.
1999; 80:504-12.
129
Referências
MacPherson I & Montagnier L. Agar suspension culture for the selective assay of
cells transformed by polyoma virus. Virology. 1964; 23:291–294.
Mancianti ML, Györfi T, Shih IM, Valyi-Nagy I, Levengood G, Menssen HD, et al.
Growth regulation of cultured human nevus cells. J Invest Dermatol. 1993; 100:281S-
287S.
McCarthyK, Maguire T, McGreal G, McDermott E, O’Higgins N, Duffy MJ. High
levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 predict poor outcome in patients with
breast cancer. Int J Cancer. 1999; 84:44–48.
McGary EC, Lev DC, Bar-Eli M. Cellular adhesion pathways and metastatic
potential of human melanoma. Cancer Biol Ther. 2002; 1:459-65.
Medic S, Pearce RL, Heenan PJ, Ziman M. Molecular markers of circulating
melanoma cells. Pigment Cell Res. 2007; 20:80-91.
Meier F, Satyamoorthy K, Nesbit M, Hsu MY, Schittek B, Garbe C, Herlyn M.
Molecular events in melanoma development and progression. Front Biosci. 1998 Sep
15;3:D1005-10.
Meredith JE Jr & Schwartz MA. Integrins, adhesion and apoptosis. Trends Cell
Biol. 1997; 7:146-50.
Meredith JE Jr, Fazeli B, Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival
factor. Mol Biol Cell. 1993;4:953–61.
Miller AJ & Mihm MC Jr. Melanoma. N Engl J Med. 2006;355:51–65.
Morán A, Iniesta P, García-Aranda C, De Juan C, Díaz-López A, Sánchez-
Pernaute A, et al. Clinical relevance of MMP-9, MMP-2, TIMP-1 and TIMP-2 in
colorectal cancer. Oncol Rep. 2005; 13:115-20.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983; 65:55-63.
130
Referências
Mufson RA, Fisher PB, Weinstein IB. Effect of phorbol ester tumor promoters on
the expression of melanogenesis in B-16 melanoma cells. Cancer Res. 1979
Oct;39(10):3915-9.
Murashige M, Miyahara M, Shiraishi N, Saito T, Kohno K, Kobayashi M. Enhanced
expression of tissue inhibitors of metalloproteinases in human colorectal tumors. Jpn J
Clin Oncol. 1996 Oct;26(5):303-9.
Murate T, Yamashita K, Ohashi H, Kagami Y, Tsushita K, Kinoshita T, et al.
Erythroid potentiating activity of tissue inhibitor of metalloproteinases on the
differentiation of erythropoietin-responsive mouse erythroleukemia cell line, ELM-I-1-3,
is closely related to its cell growth potentiating activity. Exp Hematol. 1993; 21:169–176.
Murphy FR, Issa R, Zhou X, Ratnarajah S, Nagase H, Arthur MJ, Benyon C,
Iredale JP. Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of
metalloproteinase-1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition:
implications for reversibility of liver fibrosis. J Biol Chem. 2002;277:11069–11076.
Murphy G, Houbrechts A, Cockett MI, Williamson RA, O’Shea M, Docherty AJ.
The N-terminal domain of tissue inhibitor of metalloproteinases retains
metalloproteinase inhibitory activity. Biochemistry. 1991; 30: 8097–8102.
Nass SJ, Hman JG, Gabrielson E, Iversen PW, Parl FF, Davidson NE, Graff JR. et
al. Aberrant methylation of the estrogen receptor and E-cadherin 5’ CpG islands
increases with malignant progression in human breast cancer. Cancer Res. 2000 Aug
15;60(16):4346-8.
Nasser JA, Falavigna A, Ferraz F, Duigou G, Bruce J. Transcription analysis of
TIMP-1 and NM23-H1 genes in glioma cell invasion. Arq Neuropsiquiatr. 2006
Sep;64(3B):774-80.
Nikiforov MA, Hagen K, Ossovskaya VS, Connor TM, Lowe SW, Deichman GI,
Gudkov AV. p53 modulation of anchorage independent growth and experimental
metastasis. Oncogene. 1996 Oct 17;13(8):1709-19.
Niskanen E, Gasson JC, Teates CD, Golde DW. In vivo effect of human erythroid-
potentiating activity on hematopoiesis in mice. Blood. 1988; 72: 806–810.
131
Referências
Oba-Shinjo SM, Correa M, Ricca TI, Molognoni F, Pinhal MA, Neves IA, Marie SK,
Sampaio LO, Nader HB, Chammas R, Jasiulionis MG. Melanocyte transformation
associated with substrate adhesion impediment. Neoplasia. 2006; 8:231-41.
Oelmann E, Herbst H, Zuhlsdorf M, Albrecht O, Nolte A, Schmitmann C, Manzke
O, Diehl V, Stein H, Berdel WE. Tissue inhibitor of metalloproteinases 1 is an autocrine
and paracrine survival factor, with additional immune-regulatory functions, expressed by
Hodgkin/Reed-Sternberg cells. Blood. 2002; 99: 258–267.
Ossowski L, Mira y Lopez R. Proteolytic enzymes in cancer invasion. Introduction
Enzyme Protein. 1996; 49: 5-6.
Otsuka H, Moskowitz M. Arrest of 3T3 cells in G1 phase in suspension culture. J
Cell Physiol. 1975 Dec;87(2):213-9.; Ben-Ze'ev A, Raz A. Multinucleation and inhibition
of cytokinesis in suspended cells: reversal upon reattachment to a substrate. Cell. 1981
Oct;26(1 Pt 1):107-15.
Overall CM, López-Otín C. Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for
the post-trial era. Nat Rev Cancer. 2002; 2: 657-72.
Paz MF, Fraga MF, Avila S, Guo M, Pollan M, Herman JG, Esteller M. A
systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines. Cancer Res. 2003
Mar 1;63(5):1114-21
Petitclerc E, Strömblad S, von Schalscha TL, Mitjans F, Piulats J, Montgomery
AM, Cheresh DA, Brooks PC. Integrin alpha(v)beta3 promotes M21 melanoma growth
in human skin by regulating tumor cell survival. Cancer Res. 1999 Jun 1;59(11):2724-
30.
Polakowska R, Piacentini M, Bartlett R, Goldsmith L, Haake A. Apoptosis in
human skin development: morphogenesis, periderm and stem cells. Dev Dyn.
1994;3:176-188.
Rak J, Mitsuhashi Y, Sheehan C, Krestow JK, Florenes VA, Filmus J, Kerbel RS.
Collateral expression of proangiogenic and tumorigenic properties in intestinal epithelial
cell variants selected for resistance to anoikis. Neoplasia. 1999 Apr;1(1):23-30.
132
Referências
Reddig PJ & Juliano RL. Clinging to life: cell to matrix adhesion and cell survival.
Cancer Metastasis Rev. 2005 Sep;24(3):425-39.
Ree AH, Florenes VA, Berg JP, Maelandsmo GM, Nesland JM, Fodstad O. High
levels of messenger RNAs for tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1 and
TIMP-2) in primary breast carcinomas are associated with development of distant
metastases. Clin Cancer Res. 1997; 3: 1623–1628.
Reed JC. Mechanism of apoptosis avoidance in cancer. Curr Opin Oncol.
1999;11(1):68 – 75.
Rhee JS, Diaz R, Korets L, Hodgson JG, Coussens LM. TIMP-1 alters
susceptibility to carcinogenesis. Cancer Res. 2004 Feb 1;64(3):952-61.
Ries C, Loher F, Zang C, Ismair MG, Petrides PE. Matrix metalloproteinase
production by bone marrow mononuclear cells from normal individuals and patients with
acute and chronic myeloid leukemia or myelodysplastic syndromes. Clin Cancer Res
1999; 5: 1115–24.
Ritter LM, Garfield SH, Thorgeirsson UP. Tissue inhibitor of metalloproteinases-1
(TIMP-1) binds to the cell surface and translocates to the nucleus of human MCF-7
breast carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 257: 494–499.
Robertson KD & Jones PA. The human ARF cell cycle regulatory gene promoter is
a CpG island which can be silenced by DNA methylation and down-regulated by wild-
type p53. Mol Cell Biol. 1998 Nov;18(11):6457-73.
Robertson KD. DNA methylation and chromatin — unraveling the tangled web.
Oncogene. 2002 Aug 12;21(35):5361-79.
Robertson KD. DNA methylation and human disease. Nat Rev Genet. 2005
Aug;6(8):597-610.
Rodenhiser D & Mann M. Epigenetics and human disease: translating basic
biology into clinical applications. CMAJ. 2006 Jan 31;174(3):341-8.
Rubin H. Defrees and kinds of selection in spontaneous neoplastic transformation:
an operational analysis. PNAS. 2005;102(26):9276-9281.
133
Referências
Rubin H. Selected cell and selective microenvironment in neoplastic development.
Cancer Res. 2001;61:799-807.
Ruokolainen H, Pääkkö P, Turpeenniemi-Hujanen T. Tissue inhibitor of matrix
metalloproteinase-1 is prognostic in head and neck squamous cell carcinoma:
comparison of the circulating and tissue immunoreactive protein. Clin Cancer Res. 2005
May 1;11(9):3257-64
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977; 74:5463-7.
Schrohl AS, Holten-Andersen MN, Peters HA, Look MP, Meijer-van Gelder ME,
Klijn JG, et al. Tumor tissue levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 as a
prognostic marker in primary breast cancer. Clin Cancer Res. 2004; 10: 2289–2298.
Schrohl AS, Christensen IJ, Pedersen AN, Jensen V, Mouridsen H, Murphy G, et
al. Tumor tissue concentrations of the proteinase inhibitors tissue inhibitor of
metalloproteinases-1 (TIMP-1) and plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) are
complementary in determining prognosis in primary breast cancer. Mol Cell Proteomics.
2003 Mar;2(3):164-72.
Sepulveda JL, Gkretsi V, Wu C. Assembly and signaling of adhesion complexes.
Curr Top Dev Biol. 2005;68:183-225.
Shanmugathasan M & Jothy S. Apoptosis, anoikis and their relevance to the
pathobiology of colon cancer. Pathol Int. 2000 Apr;50(4):273-9.
Shin S, Freedman VH, Risser R, Pollack R. Tumorigenicity of virus-transformed
cells in nude mice is correlated specifically with anchorage-independent growth in vitro.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975; 72:4435–4439.
Smalley KS, Brafford P, Haass NK, Brandner JM, Brown E, Herlyn M. Up-
regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates
134
Referências
with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. Am J Pathol. 2005
May;166(5):1541-54.
Soengas MS, Capodieci P, Polsky D, Mora J, Esteller M, Opitz-Araya X, et al.
Inactivation of the apoptosis effector Apaf-1 in malignant melanoma. Nature. 2001 Jan
11;409(6817):207-11.
Sohara N, Trojanowska M, Reuben A. Oncostatin M stimulates tissue inhibitor of
metalloproteinase-1 via a MEK-sensitive mechanism in human myofibroblasts. J
Hepatol. 2002; 36: 191–199.
Song F, Smith JF, Kimura MT, Morrow AD, Matsuyama T, Nagase H, et al.
Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential
gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Mar 1;102(9):3336-41.
Stark M & Hayward N. Genome-wide loss of heterozygosity and copy number
analysis in melanoma using high-density single-nucleotide polymorphism arrays.
Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2632-42.
Stoker AW, Streuli CH, Martins-Green M, Bissell MJ. Designer microenvironments
for the analysis of cell and tissue function. Curr. Opin. Cell Biol. 1990; 2:864-874.
Stoker M, O’Neill C, Berryman S, Waxman V. Anchorage and growth regulation in
normal and virus-transformed cells. Int. J. Cancer. 1968; 3:683–693.
Takai D &Jones PA. Comprehensive analysis of CpG islands in human
chromosomes 21 and 22. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 19;99(6):3740-5.
Takigawa M, Nishida Y, Suzuki F, et al. Induction of angiogenesis in chick yolk-sac
membrane by polyamines and its inhibition by tissue inhibitors of metalloproteinases
(TIMP and TIMP-2). Biochem Biophys Res Commun. 1990; 171: 1264–71.
Tan HK, Heywood D, Ralph GS, Bienemann A, Baker AH, Uney JB. Tissue
inhibitor of metalloproteinase 1 inhibits excitotoxic cell death in neurons. Mol Cell
Neurosci. 2003; 22: 98–106.
135
Referências
Taylor SM & Jones PA. Mechanism of action of eukaryotic DNA
methyltransferase. Use of 5-azacytosine-containing DNA. J Mol Biol. 1982 Dec
15;162(3):679-92.
Trim JE, Samra SK, Arthur MJ, Wright MC, McAulay M, Beri R, et al. Upstream
tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) element-1, a novel and essential
regulatory DNA motif in the human TIMP-1 gene promoter, directly interacts with a 30-
kDa nuclear protein. J Biol Chem. 2000;275:6657-63.
Tsao H, Atkins MB, Sober AJ. Management of cutaneous melanoma. N Engl J
Med. 2004;351:998–1012.
Valentijn AJ, Zouq N, Gilmore AP. Anoikis. Biochem Soc Trans. 2004
Jun;32(Pt3):421-5.
van der Velden PA, Zuidervaart W, Hurks MH, Pavey S, Ksander BR, Krijgsman
E, et al. Expression profiling reveals that methylation of TIMP3 is involved in uveal
melanoma development. Int J Cancer. 2003 Sep 10;106(4):472-9.
Visse R, Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of
metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ Res. 2003;92:827-39.
Wada K, Maesawa C, Akasaka T, Masuda T. Aberrant expression of the maspin
gene associated with epigenetic modification in melanoma cells. J Invest Dermatol.
2004 Mar;122(3):805-11.
Wang CS, Wu TL, Tsao KC, Sun CF. Serum TIMP-1 in gastric cancer patients: a
potential prognostic biomarker. Ann Clin Lab Sci. 2006 Winter;36(1):23-30.
Wang LH. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer
cells. Mt Sinai J Med. 2004;71(6):361-7.
Wang T, Yamashita K, Iwata K, Hayakawa T. Both tissue inhibitors of
metalloproteinases-1 (TIMP-1) and TIMP-2 activate Ras but through different pathways.
Biochem Biophys Res Commun 2002;296:201–5.
136
Referências
Wascher RA, Morton DL, Kuo C, Elashoff RM, Wang HJ, Gerami M, et al.
Molecular tumor markers in the blood: early prediction of disease outcome in melanoma
patients treated with a melanoma vaccine. J. Clin. Oncol. 2003;21:2558–2563.
Welgus HG, Campbell EJ, Bar-Shavit Z, Senior RM, Teitelbaum SL. Human
alveolar macrophages produce a fibroblast-like collagenase and collagenase inhibitor. J
Clin Invest 1985;76:219–24.
Westermarck J, Kähäri VM. Regulation of matrix metalloproteinase expression in
tumor invasion. FASEB J. 1999;13:781–792.
Widschwendter M, Jiang G, Woods C, Müller HM, Fiegl H, Goebel G, et al. DNA
hypomethylation and ovarian cancer biology. Cancer Res. 2004 Jul 1;64(13):4472-80.
Willenbrock F, Murphy G. Structure-function relationships in the tissue inhibitors of
metalloproteinases. Am J Respir Crit Care Med. 1994;150:S165–170.
Williamson RA, Marston FA, Angal S, Koklitis P, Panico M, Morris HR, et al.
Disulphide bond assignment in human tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP).
Biochem J. 1990;268:267–274.
Winnepenninckx V, Lazar V, Michiels S, Dessen P, Stas M, Alonso SR, et al.
Melanoma Group of the European Organization for Research and Treatment of Cancer.
Gene expression profiling of primary cutaneous melanoma and clinical outcome. J Natl
Cancer Inst. 2006 Apr 5;98(7):472-82.
Wittelsberger SC, Kleene K, Penman S. Progressive loss of shape-responsive
metabolic controls in cells with increasingly transformed phenotype. Cell. 1981; 24:859–
866.
Woodhouse EC, Chuaqui RF, Liotta LA. General mechanisms of metastasis.
Cancer. 1997;80:1529-37.
World Health Organization (WHO). Cancer. Geneva: World Health Organization;
2007 [cited 2007 Oct 10]. Available from:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/print.html). Fact sheet n° 297. Feb
2006.
137
Referências
Würtz SØ, Schrohl AS, Sørensen NM, Lademann U, Christensen IJ, Mouridsen H,
et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in breast cancer. Endocr Relat Cancer.
2005 Jun;12(2):215-27.
Xu F, Carlos T, Li M, Sanchez-Sweatman O, Khokha R, Gorelik E. Inhibition of
VLA-4 and up-regulation of TIMP-1 expression in B16BL6 melanoma cells transfected
with MHC class I genes. Clin Exp Metastasis. 1998 May;16(4):358-70.
Yamada Y, Jackson-Grusby L, Linhart H, Meissner A, Eden A, Lin H, et al.
Opposing effects of DNA hypomethylation on intestinal and liver carcinogenesis. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2005 Sep 20;102(38):13580-5.
Yamashita K, Suzuki M, Iwata H, Koike T, Hamaguchi M, Shinagawa A, et al.
Tyrosine phosphorylation is crucial for growth signaling by tissue inhibitors of
metalloproteinases (TIMP-1 and TIMP-2). FEBS Lett. 1996;396:103–107.
Yunta M, Lazo PA. Tetraspanin proteins as organisers of membrane
microdomains and signalling complexes. Cell Signal. 2003;15:559–564
Zeng ZS, Cohen AM, Zhang ZF, Stetler-Stevenson W, Guillem JG. Elevated tissue
inhibitor of metalloproteinase 1 RNA in colorectal cancer stroma correlates with lymph
node and distant metastases. Clin Cancer Res. 1995;1:899–906.
Zheng S, Chen P, McMillan A, Lafuente A, Lafuente MJ, Ballesta A, Trias M,
Wiencke JK. Correlations of partial and extensive methylation at the p14ARF locus with
reduced mRNA expression in colorectal cancer cell lines and clinicopathological
features in primary tumors. Carcinogenesis. 2000;21:2057–64.
Zhu Z, Sanchez-Sweatman O, Huang X, Wiltrout R, Khokha R, Zhao Q, Gorelik E.
Anoikis and Metastatic Potential of Cloudman S91 Melanoma Cells. Cancer Res.
2001;61(4):1707-16.
Zucker S, Cao J, Chen WT. Critical appraisal of the use of matrix
metalloproteinase inhibitors in cancer treatment. Oncogene. 2000 Dec 27;19(56):6642-
50.
138
ABSTRACT
ABSTRACT
Although anoikis resistance has been considered a hallmark of malignant
phenotype, the causal relation between neoplastic transformation and anchorage-
independent growth remains undefined. We developed an experimental model of
murine melanocyte malignant transformation, where a murine melanocyte lineage
(melan-a) was submitted to sequential cycles of substrate adhesion blockade. Cells
corresponding to intermediate phases of tumor progression and melanoma cell lines
were established and show progressive anoikis-resistance. Gene expression analysis
showed up-regulation of Timp1 in all melan-a-derived lineages. Treatment with a
demethylating agent resulted in marked expression of Timp1 in melan-a melanocytes.
In fact, Ms-SNuPE analysis showed increased demethylation in Timp1 gene in parallel
with its expression along malignant transformation. Although described as a MMP
inhibitor, this protein has been recently associated with apoptosis resistance in human
breast epithelial cells. Melan-a cells overexpressing the Timp1 gene showed increased
survival in anchorage-independent conditions, but were unable to form tumors in vivo,
whereas Timp1-overexpressing melanoma cells showed reduced latency time for tumor
appearance. Our results show an increment in Timp1 expression along carcinogenesis,
possibly associated to a progressive gene demethylation, which is causally related with
an increase in anoikis-resistance but not with the acquisition, by itself, of a fully
transformed malignant phenotype.
APÊNDICE
Causal relation between Timp1 gene demethylation and anoikis resistance
along melanocyte malignant transformation
Tatiana I. Ricca
1
, Gangning Liang
2
, Ana Paula M. Suenaga
3
, Sang W. Han
4
, Peter
A. Jones
2
, Miriam G. Jasiulionis
1, 5
1
Department of Immunology, Universidade Federal de São Paulo, SP, Brazil;
2
Department of Urology, Norris Comprehensive Cancer Center, University of Southern
California, CA, USA,
3
Department of Biochemistry, Universidade Federal de São Paulo,
SP, Brazil;
4
Centro Interdisciplinar de Terapia Gênica, Universidade Federal de São
Paulo, SP, Brazil;
5
Department of Pharmacology, Universidade Federal de São Paulo,
SP, Brazil
Running title: Timp1 induces
anoikis resistance in melanocytes.
Keywords: Timp1, DNA methylation, anoikis, malignant transformation,
melanoma
Requests for reprints: Miriam G. Jasiulionis, Universidade Federal de São Paulo,
Rua Botucatu, 862, 4
o
andar, São Paulo, SP, Brazil, 04023-900, Phone: +55 11 5576-
4529, Fax: +55-11-5572-3328, e-mail: [email protected]
ABSTRACT
Although anoikis resistance has been considered a hallmark of malignant
phenotype, the causal relation between neoplastic transformation and anchorage-
independent growth remains undefined. We developed an experimental model of
murine melanocyte malignant transformation, where a murine melanocyte lineage
(melan-a) was submitted to sequential cycles of substrate adhesion blockade. Cells
corresponding to intermediate phases of tumor progression and melanoma cell lines
were established and show progressive
anoikis-resistance. Gene expression analysis
showed up-regulation of Timp1 in all melan-a-derived lineages. Treatment with a
demethylating agent resulted in marked expression of Timp1 in melan-a melanocytes.
In fact, Ms-SNuPE analysis showed increased demethylation in Timp1 gene in parallel
with its expression along malignant transformation. Although described as a MMP
inhibitor, this protein has been recently associated with apoptosis resistance in human
breast epithelial cells. Melan-a cells overexpressing the Timp1 gene showed increased
survival in anchorage-independent conditions, but were unable to form tumors in vivo,
whereas Timp1-overexpressing melanoma cells showed reduced latency time for tumor
appearance. Our results show an increment in Timp1 expression along carcinogenesis,
possibly associated to a progressive gene demethylation, which is causally related with
an increase in anoikis-resistance but not with the acquisition, by itself, of a fully
transformed malignant phenotype.
INTRODUCTION
Several studies have shown that the interaction of cells with the extracellular
matrix (ECM) is crucial for cell survival, proliferation, migration and differentiation
(Lukashev and Werb, 1998; Sepulveda et al., 2005). Loss of matrix attachment results
in a type of apoptosis, termed anoikis (Frisch and Francis, 1994), which plays an
important role during development and maintenance of tissue homeostasis
(Grossmann, 2002).
The acquired ability to survive independently of anchorage is one of the hallmarks
of malignant transformation and is important during tumor progression by increasing the
survival time in the absence of attachment, facilitating migration and colonization of
distant sites (Wang, 2004; Díaz-Montero and McIntyre, 2003). Although resistance to
anoikis has been described in many types of human malignancies including in
melanoma (Zhu et al., 2001), the causal relationship between neoplastic transformation
and anchorage-independent growth remains undefined.
The tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP) family consists of four members
(TIMP1, 2, 3 and 4) that act as endogenous inhibitors of the matrix metalloproteinases
(MMPs) (Nagase and Woessner, 1999
). By inhibiting MMPs activities, TIMPs participate
in tissue remodeling of ECM. So, the balance between MMPs and TIMPs activities is
involved in both normal and pathological events such as wound healing, tissue
remodeling, angiogenesis, invasion, tumorigenesis and metastasis (Lambert
et al.,
2004). Almost all human cancers have been found to augment the expression and
activity of MMPs. Interestingly, TIMPs are also often upregulated in many tumors and it
has been related to negative prognosis in many human cancers (Yan and Moses, 2001;
Hornebeck et al., 2005). Although well-described as a MMP inhibitor, TIMP1 has been
recently associated with other functions related to regulation of proliferation,
angiogenesis and apoptosis (Würtz
et al., 2005).
TIMP1 is expressed by a variety of culture cell types and tissues, but its
expression is induced by external stimuli such as phorbol esters, serum, cytokines
(TGF- β1, IL-6, IL-1 and IL-1β) and growth factors (b-FGF, PDGF and EGF) (Lambert et
al., 2004). The mechanisms of TIMP1 regulation have been intensively investigated but
still remain largely unknown. Its induction occurs primarily at the transcription level
involving AP-1, SP-1, NF-kappaB and CRE transcription factors (Chirco et al., 2006).
DNA methylation is an important mechanism of regulation of gene expression (Jones,
1996), and some studies indicate that DNA methylation could be responsible for the
down-regulation of Timp1 in B16 melanoma cells since treatment of different melanoma
cells with a DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2´-deoxycytidine (5-Aza-CdR),
resulted in up-regulation of Timp1 expression (Xu et al., 1998; Huang et al., 2000).
We studied the correlation between malignant transformation and anoikis
resistance by submitting a non-tumorigenic murine melanocyte lineage, melan-a
(Bennett et al., 1987), to sequential substrate adhesion impediment cycles. This
process resulted not only in the establishment of non-tumorigenic melan-a sublines
corresponding to distinct phases of tumor progression, but also of a series of melanoma
cell lines (Oba-Shinjo et al., 2006; Correa et al., 2005). Previous gene expression
analysis comparing melan-a and two melanoma cell lines, showed up-regulation of the
Timp1 gene expression in melanoma cells. These data prompted us to investigate
whether Timp1 expression is related to the acquisition of anoikis resistance phenotype
and regulated by DNA methylation in this model. Here we report an increase in Timp1
expression during melanoma genesis, possibly resulting from progressive gene
demethylation, which is causally associated with an increase in
anoikis resistance but
not with the acquisition, by itself, of a fully transformed malignant phenotype.
RESULTS
Melanocyte malignant transformation associated with
anoikis resistance. To
study a possible correlation between neoplastic transformation and anchorage-
independent growth, we used an experimental model of murine melanocyte malignant
transformation (Oba-Shinjo et al., 2006; Correa et al., 2005), where the non-tumorigenic
melanocyte lineage melan-a was subjected to sequential cycles of anchorage blockade
for 96h. After 2, 3, and 4 deadhesion cycles, non-tumorigenic melan-a sublines 2C, 3C
and 4C, were respectively established. Distinct tumorigenic lineages (4C3, 4C11, Tm1,
and Tm5) were obtained by limiting dilution after a new deadhesion cycle of 4C cells. To
analyze the acquisition of anoikis resistance during malignant transformation, cells were
cultured in suspension for 96 hours and cell viability was determined by MTT assay
(Fig. 1). This result shows a progressive increase in cell survival in anchorage-
independent conditions along melanocyte malignant transformation.
Increased expression of Timp1 during melanocyte malignant progression.
Several studies of human and murine cancer have shown increases in TIMP1
expression related to a poor prognosis (Curran and Murray, 1999; Rhee et al., 2004).
Using this model, we wished to examine the expression pattern of Timp1 during
melanocyte malignant transformation. Since Timp1 expression is induced by phorbol
esters, and melan-a cells require it for growth, all cells in this study were cultured in the
presence of phorbol 12-myristate13-acetate (PMA). In Fig. 2, the amount of Timp1 was
estimated by semi-quantitative PCR and Western blot analysis in all lineages cultured in
adhesion condition (melan-a, 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1 and Tm5) and in melan-a cells
cultured in suspension for 1, 3, 5 and 24 hours. Whereas melan-a cells expressed only
low levels of Timp1 mRNA when cultured on plastic, and no detectable expression of
Timp1 protein, even in suspension for different times, the cell lines derived from it
showed a remarkable increase both in Timp1 mRNA (Fig. 2A) and protein expression
(Fig. 2B).
Progressive Timp1 promoter demethylation associated to Timp1 expression
along neoplastic progression. Given that previous data from our lab showed a
significant alteration in the global DNA methylation level in this model along the pathway
to neoplastic transformation (Campos et al., 2007; and data not shown), and DNA
methylation was demonstrated as being a possible regulatory mechanism of Timp1
expression (Xu
et al., 1998; Huang et al., 2000), we tested whether the DNA
demethylation induced by 5-Aza-CdR would change the pattern of Timp1 expression in
melan-a cells. After the treatment, Timp1 expression in melan-a cells was found to be
highly elevated (Fig. 3A). For that reason, we wished to confirm whether DNA
methylation plays a direct role in the regulation of Timp1 expression in this model. Thus,
using Ms-SNuPE assay, the average methylation at one CpG dinucleotide within Timp1
promoter, S1, and two different CpG dinucleotides present in the first exon, S2 and S3
(Fig. 3B), was analyzed. The DNA methylation level in the promoter and exonic non-
CpG islands of Timp1 were quantified in all lineages (Fig.C and D), including ma-5-Aza-
CdR cells, melan-a cells cultured in suspension for 5 and 24 hours and non-treated
melan-a derived lineages culture in adhesion. Given that melan-a cells are an
immortalized non-tumorigenic lineage, we used DNA extracted from murine skin to
analyze how was the methylation in the normal tissue. This analysis has shown a
progressive decrease in DNA methylation in the Timp1 gene in ma-5-Aza-CdR cells
(Fig. 3C) and in non-treated melan-a derived lineages when compared with melan-a
cells (Fig.3D).
Timp1 overexpression does not induce cell proliferation. The progressive
increase in Timp1 expression observed during melan-a malignant transformation
suggests that its expression might be functionally related to neoplastic development.
Considering the relationship between Timp1 expression and the acquisition of anoikis-
resistant phenotype (Li
et al., 1999; Chirco et al., 2005), we tested the functional
significance of increased Timp1 expression during neoplastic progression by
transfected Timp1 (T1S) in melan-a and Tm5 cells. Timp1 overexpression in transfected
clones was confirmed by RT-PCR (Fig. 4A) and immunofluorescence microscopy (Fig.
4B).
Homeostasis of cell numbers in tissues depends on the balance between the
proliferative and apoptotic index. Because Timp1 may regulate proliferation in some
contexts (Würtz
et al., 2005), we asked whether the increased Timp1 expression
observed along the malignant transformation was related to an altered proliferation rate.
Accordingly, proliferation index was quantified by MTT assay in different times revealed
that the proliferation were very similar in Timp1 overexpressing cells and their controls
in both non-tumorigenic and tumorigenic lineages (Fig. 4C). These data showed that the
augmented Timp1 expression observed during neoplastic progression (Fig. 1) do not
affect cell proliferation in this model.
Melan-a melanocytes overexpressing Timp1 become anoikis resistant.
Apoptosis inhibition by Timp1 may result from its ability to stabilize cell-ECM
interactions by inhibiting MMPs. If so, Timp1 would not protect cells against apoptosis
induced by loss of cell-substrate interactions. Then, melan-a, ma GFP, ma T1S, Tm5,
Tm5 GFP and Tm5 T1S cells were cultured in suspension. Trypan blue staining showed
100% melan-a cell viability up to 24h in suspension (data not shown). After 96 hours,
cell viability was determined by MTT assay (Fig. 5A) and the percentage of cells
presenting DNA fragmentation was determined by flow cytometry analysis (Fig. 5B).
These studies showed that Timp1-overexpressing cells remained viable in suspension.
Ma T1S cells became resistant to
anoikis when compared to their anoikis-sensitive
controls (2.5 fold more than ma and 3.4 fold more than ma GFP). This resistance was
also increased (2 fold more than Tm5 and 1.5 fold more than Tm5 GFP) in Timp1-
overexpressing melanoma cells, a lineage already resistant to anoikis (Fig. 1). Anoikis-
resistant phenotype was also evaluated by culturing cells in soft agar. As shown in Fig.
5C, fivefold ma T1S remained viable when compared to the control, even after 21 days
of culture in soft agar. There is no significant difference in the number of cells able to
growth in anchorage independent condition when Tm5 T1S was compared to its control.
Interestingly, ma T1S cells were able to survive in soft agar as its tumorigenic
counterpart. Thus, Timp1 can prevent anoikis in melan-a cells. In view of the fact that 5-
Aza-CdR treatment induces Timp1 expression in melan-a cells and this increased
expression provokes resistance to
anoikis, we tested whether the treatment with 5-Aza-
CdR was competent to convert the
anoikis sensitive phenotype of melan-a cells. For
these proposed, non-treated and 5-Aza-CdR-treated melan-a cells were kept in
suspension for 96 hours. Cell viabilities were compared and there was no significant
difference in the number of cells able to survive in suspension when ma-5-Aza-CdR
cells were compared to its control (data not shown).
Tm5 melanoma cells overexpressing Timp1 acquire a more aggressive
phenotype in vivo. Since ma T1S were able to grow independent of anchorage in
semisolid agar and this ability became a classical assay for in vitro evaluation of
malignant transformation of various cultured cell lines (Frisch, 1994), we examined
whether Timp1 overexpression was capable to cause the acquisition of a fully
transformed malignant phenotype in these cells. Then, melan-a, ma-5-Aza-CdR, ma
GFP and ma T1S cells (10
7
cells/animal) were subcutaneously injected in the flank of
C57Bl/6 mice and tumor development was checked daily during 3 months. No tumor
development was observed in mice transplanted with any of these cells (data not
shown). On the other hand, in melanoma cells, Timp1 overexpression not only reduced
the latency time for tumor appearance (Fig. 6A) but also increased their metastatic
potential (Fig. 6B).
DISCUSSION
In normal conditions, cells are found associated with the neighboring cells and the
ECM. The cell-ECM contact provides not only a physical support on which the cells
adhere, but also provides the information required for proliferation, differentiation,
migration and survival (Valentijn
et al., 2004). The presence of normal cells in an
inappropriate environment prevents their association with the ECM and then disrupts
survival signals leading the cell to anoikis (Grossmann, 2002). This kind of apoptosis is
believed to help to maintain proper cell number, geographic architecture and position in
epithelia organs. Apart from its relevance in physiological conditions, loss of anchorage
dependency is believed to be one of the key mechanisms to tumor progression and
malignant transformation since the cells are able to proliferate detached and spread
from the primary tumor without undergoing anoikis (Grossmann et al., 2001; Freedman
and Shin, 1974; Baserga, 1997) The distinct ability of tumor cells to grow in suspension,
semisolid media, or multicellular spheroid culture has been frequently linked to
anchorage-independent growth (Rak et al., 1999; Guadagno et al.,1994), and more
recently, to anchorage independent
survival (Meredith and Schwartz, 1997). Despite the
strong correlation between the resistance of transformed cells to
anoikis and their ability
to form tumors in vivo, direct evidence for a causal relationship between them remains
unknown.
In order to explain some of these interrelationships in a more direct manner, we
established an in vitro murine carcinogenesis model, which specifically favor the
acquisition of resistance to anoikis of an immortalized, but non-tumorigenic, melanocyte
lineage, melan-a. In this model, the sequential exposure of melan-a cells to substrate
anchorage impediment cycles spontaneously leads to the establishment of cellular
variants with a markedly reduced susceptibility to anoikis (Fig. 1). Melan-a sublines (2C
and 4C) became progressively more resistant to anoikis, although these lineages were
not able to form tumors in vivo. Distinct lineages (4C3, 4C11, Tm1 and Tm5), obtained
by limiting dilution after a new deadhesion cycle of 4C cells, are anoikis resistant (Fig. 1)
and grow as tumors when injected subcutaneously in syngeneic mice, with different
latency times for tumor appearance (Oba-Shinjo
et al., 2006). Previous cDNA
microarray analysis revealed an up-regulation of Timp1 expression in melanoma cells
(Tm1 and Tm5) when compared to their parental cell line, melan-a. These results were
unexpected considering the well-established function of Timp1 in the inhibition of
MMPs-mediated ECM degradation, tumor cell invasion and metastasis formation in
different tumors, including melanoma (Xu
et al., 1998; Airola et al., 1999; MacDougall et
al., 1999). However, controversy studies correlated Timp1 overexpression with
malignant progression and poor clinical prognosis of several human cancers (Rhee et
al., 2004; Guedez et al., 2001; Murashige et al., 1996; Schrohl et al., 2003). These
contradictory events may be due to other important functions of Timp1. It has been
shown that Timp1 induces proliferation in a wide range of cell types by mechanisms that
are apparently independent of MMPs (Chesler et al., 1995), promotes activation of
angiogenesis, regulates apoptosis (Chirco et al., 2006) and amplifies inflammation
(Apparailly et al., 2001). Recently, Li et al. (1999) showed that TIMP1 expression
protects human breast epithelial cells from different kinds of apoptosis, including
anoikis. In the present study, we have shown during melanocyte malignant
transformation a progressive up-regulation of Timp1, even in melanocyte lineages
corresponding to pre-malignant lesions (as 2C and 4C cell lines) (Fig. 2) parallel to a
successive increase of anoikis-resistant phenotype (Fig. 1).
It was shown that the genome of cancer cells is globally hypomethylated when
compared to their normal counterparts (Laird, 2005) and changes in DNA methylation
pattern, particularly in the promoter CpG islands, can also occur (Gopisetty et al., 2006).
In our model, we observed a significant global hypermethylation when melanocytes are
maintained in suspension and a progressive global DNA hypomethylation during tumor
progression (Campos et al., 2007; and data not shown). These results suggest that
there are changes in the methylation pattern of melan-a cells during the substrate
adhesion blockade cycles which might be extremely important for the expression of
some genes and silencing of others, resulting to a new expression gene pattern related
to the transformed phenotype. Taking these changes into account of and considering
the fact that Timp1 expression can be regulated by DNA methylation (Xu et al., 1998;
Huang et al., 2000), Timp1 expression in melan-a cells was evaluated after treatment
with 5-Aza-CdR (Fig. 3A). The strong reexpression of Timp1 led us to use Ms-SNuPE
method to examine the methylation status of CpG sites in Timp1 promoter of melan-a
cells (treated and non-treated with 5-Aza-CdR) and melan-a derived lineages (Fig. 3C).
The present work demonstrated that Timp1, whose promoter and first exon present
CpG-rich regions instead of CpG islands (Fig. 3B), has its expression regulated by DNA
methylation, since our data shows the augment of Timp1 expression in melan-a cells,
occurring after 5-Aza-CdR treatment, in which case resulted in a 10% decrease of
methylation on its promoter (Fig. 3C). This result might explain a possible inverse
correlation between promoter demethylation and Timp1 gene expression during
melanocyte malignant transformation (Fig. 3D). The fact of non-tumorigenic 2C cell line
strongly expresses Timp1 mRNA and protein (Fig.2A), but has almost 50% of the
analyzed CpG-sites still methylated (Fig.3D) might be probably related to limited
number of CpG-sites analyzed. It is possible that in this model other CpG-sites are
demethylated earlier and have more important transcription regulatory function than the
CpG-sites studied. While the majority of studies report promoter CpG islands
hypermethylation leading to gene silencing (Jones and Baylin, 2007), some recently
studies has been shown that DNA methylation can also affect transcription of genes
whose 5’ UTR had low CpG density (Bruniquel and Schwartz, 2003) and, in case of
these non-CpG islands genes, the correlation between methylation and transcription is
inversed (Eckhardt et al., 2004). The aberrant expression of genes that do not contain
bona fide CpG islands in their promoters, which is approximately 40% of human genes
(Takai and Jones, 2002), associated with promoter hypomethylation, has been shown in
some genes, including the maspin gene (Wada et al., 2004), the human synuclein-
gamma (SNCG) gene (Liu
et al., 2005), and the family of MAGE genes (van Doom et
al., 2005). In addition, these works have shown correlations between methylation of
non-CpG islands and tissue-specific expression. Taken together, these previous data
and ours suggest that, in fact, all genes can be potential targets of DNA methylation
machinery and could have their expression regulated by this epigenetic mechanism. As
the demethylation process seemed to be stable once initiated, its function would seem
to be an enhancement of the amount of transcription of Timp1 in these cells to facilitate
the resistance to anoikis during the malignant transformation process.
To determine whether increased Timp1 expression would be associated with the
increase of anoikis-resistance and, consequently, with the acquisition of a fully
transformed malignant phenotype as suggested by observations associating Timp1 with
potentiation of carcinogenesis and with poor clinical outcome, we took a genetic
approach using a transfection assay to overexpress Timp1 in two different melanocyte
lineages, the non-tunorigenic melan-a cells and the tumorigenic Tm5 cells (Fig. 4).
Results from the current study provide insight into the function of Timp1 as an inhibitor
of cell death induced by anchorage-independent growth conditions and highlight the
relevance of this inhibition once tumors have already formed. In melan-a cells, the
overexpression of Timp1 resulted in an anoikis-resistant lineage capable not only to
survive but also to grow when they were cultured in suspension, even after 96 hours,
and in soft-agar medium (Fig. 5). Aggressive and anoikis-resistant melanoma cell lines,
like Tm1 and Tm5, express high levels of Timp1 mRNA but reduced protein levels
compared to intermediate (2C and 4C) and less aggressive (4C3- and 4C11-) cell lines.
This discrepancy has been investigated in our lab and may be related to different
turnover rate of Timp1 protein, since mRNA levels correlate to promoter demethylation.
Overexpression of Timp1 in malignant Tm5 melanoma augmented the resistance to
anoikis when cultured in suspension and increased the malignancy of these cells in
vivo, suggesting that Timp1 inhibition of anoikis may be critical for anchorage-
independent viability of disseminating cells during tumor cell metastasis (Fig. 6).
Previous data from Rhee et al (2004) suggest that Timp1 could be an important
contributor to epithelial carcinogenesis, especially during the early stages of neoplastic
progression. In addition, these authors showed that Timp1 can inhibit tissue gelatinolytic
activity in tumor stroma without inhibiting tumor progression or development of
metastases. Our data provide evidence that Timp1 expression is required for the
acquisition of an anoikis-resistant phenotype in non-tumorigenic melanocyte lineages,
and is implicated in a more aggressive phenotype of tumorigenic melanocyte cell lines.
These data are sustained by those reports showing patients submitted to clinical trials
with synthetic metalloproteinase inhibitors fail to show any alterations in terms of overall
survival or time to progression compared with placebo group (Zucker et al., 2000;
Coussens et al., 2002). In our model, the anoikis resistance is needed to melanoma
malignancy but is insufficient for acquisition of tumorigenic competence by melanocytes
cells in vivo.
In conclusion, these findings provide evidence that Timp1 protects a murine
melanocyte lineage and a melanoma cell line from anoikis, and the increase in Timp1
expression along the carcinogenesis is possibly a consequence from progressive gene
demethylation. Consequently, the expression of Timp1 resulted in increased anoikis
resistance, indicating that this gene functions as an oncogene in this model, but alone is
not capable to induce a fully transformed malignant phenotype of non-tumorigenic cells.
MATERIAL AND METHODS
Cell lines and culture. Murine melanocyte lineage melan-a (Bennett
et al., 1987)
and melan-a cell sublines (2C, 4C, 4C3-, 4C3+, 4C11-, 4C11+, Tm1, Tm5), established
after submitting melan-a cells to sequential substrate adhesion impediment cycles
(Oba-Shinjo et al., 2006; Correa et al., 2005), were maintained in RPMI 1640 (Gibco,
Carlsbad, CA), pH 6.9, containing 5% fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA), 40
mg/L gentamicin and 200 nM PMA (Sigma, St. Louis, MO) at 37
o
C in 5% CO
2
. For
substrate adhesion blockade assays, 10
5
cells were plated on 1% agarose-treated
plates and cultured for different times in conditions described above. Cell proliferation
and viability were determined using the standard methyl thiazol tetrazolium assay (MTT,
Amresco, Solon, Ohio) as described previously (Mosmann, 1983). Melan-a cells were
treated with 5 µM 5-Aza-CdR (Calbiochem, Darmstadt, Germany) during 48 hours.
Fresh medium containing 5-Aza-CdR was added after 24 hours of treatment.
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). The total RNA
was isolated from cells with TRizol
®
(Invitrogen, Carlsbad, CA). One microgram of RNA
was reverse-transcribed to cDNA with Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA). The
resulting single-strand cDNAs were amplified by PCR in a reaction mixture containing
75 mM Tris-HCl pH9.0, 2 mM MgCl
2
, 50 mM KCl, 20 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 0.4 mM of each
deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 0.4 µM of each primer, 1 unit of BioTools DNA
Polymerase - Recombinant from Thermus thermophilus (BioTools, Madrid, Spain). The
thermal cycling conditions were as follows: initial 5 minutes at 94°C,
followed by cycles
(33 for Timp1 and 17 for beta-actin amplifications) of 94°C for 45 seconds, 55°C for 45
seconds and 72°C for 60 seconds. The beta-actin mRNA was used as control. PCR
fragment amplification was confirmed by 1% agarose gel. The PCR primers were as
follow: Timp1F 5’ GCTAAAAGGATTCAAGGC 3’; Timp1R 5’
GCACAAGCCTAGATTCCG 3’; ActinF 5’ CGAGGCCCAGAGCAAGAGAG 3’; ActinR 5’
AGGAAGAGGATGCGGCAGTGG 3’.
Western Blot Analysis. Cells were lysed in cold buffer containing 50mM Tris-HCl
(pH 8.0), 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 10 µg/mL aprotinin and 10 µg/mL leupeptin.
Eighty µg of total protein were separated on SDS polyacrylamide gels and transferred
onto PVDF membranes (Amersham, Piscatway, NJ). Proteins were detected using
rabbit polyclonal anti-Timp-1 antibody (ABR, Golden, CA) and the signal was detected
using peroxidase-conjugated secondary antibody (KPL, Gaithersburg, Maryland)
followed by development using chemiluminescence substrate (SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrate; Pierce Chemical, Rockford, IL).
Quantification of DNA methylation by Methylation-sensitive single-
nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). The average methylation at 3 different
CpG sites present in Timp1 promoter was quantified using Ms-SNuPE as described
previously (Gonzalgo and Jones, 2002). Briefly, genomic DNA (4 µg) was treated with
sodium bisulfite. The bisulfite-treated DNA was amplified by PCR using the primers as
follow: S1 5’ TGGGTGGATGAGTAATG, and Timp1 SNuPE reverse 5’
CTAACTAAAAATCCTAATACCTACAA 3’. The PCR conditions were 94°C for 3
minutes, 44 cycles of 94°C for 1 minute, 52°C for 1 minute, and 72°C for 1 minute. The
PCR products were separated by electrophoresis through a 2% agarose gel, purified
from the gel using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) and eluted in 40
µL of H
2
O. The single nucleotide extensions were obtained adding 4 µL of the template
to 6 µL of reaction mixture containing 1× PCR buffer, 1 µM SNuPE primer (S1, S2 5’
TTATTTTTTATTGTGTAGTTTTTGT 3’ or S3 5’ ATTAGAGGTAAGTGGGAGT 3’, one
for each reaction), 1 µCi (
32
P)dCTP or (
32
P)dTTP, and 1 unit 1:1 Taq/TaqStart antibody
(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). This mixture was incubated at 95°C for 30
seconds, 51°C for 30 seconds, and finally 72°C for 1 minute and then combined with 5
µL of stop solution (95% formamide, 20 mM EDTA (pH 8.0), 0.05% bromophenol blue,
and 0.05% xylene cyanol) before being denatured at 94°C for 5 minutes and loaded
onto a 15% denaturing polyacrylamide gel (Tris–Borate–EDTA buffer, 14.25%
acrylamide, 0.75% bis-acrylamide, 7 M urea). Methylation levels were quantified on a
PhosphoImager analysis system (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). The
methylation status of the Timp1 promoter and first exon represents the average
methylation levels of three CpG sites.
Plasmid Construction and Transfection. Stable melan-a and Tm5 cell lines
overexpressing Timp1 (ma T1S and Tm5 T1S, respectively) were generated by RT-
PCR amplification of full-length coding sequence from Tm5 cells using the gene-specific
EcoRI-flanked (underlined) forward primer 5’
TTGAATTCACCACCATGATGGCCCCCTTTGCA 3’ and XhoI-flanked (underlined)
reverse primer 5’ TTCTCGAGTCATCGGGCCCCAAGGGATC 3’, digested with EcoRI
and XhoI restriction enzymes and subcloning into the EcoRI/XhoI cut pcDNA3.1 vector
(Invitrogen, Carlsbad, CA). The inserts were sequenced to confirm the desire DNA
sequence. Stable transfectants were produced by transfection with Lipofectamine™
2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) and selected during 15 days in medium containing 2
mg/mL Geneticin
®
(G418, Gibco, Carlsbad, CA). Transfection with pcDNA3.1 containing
GFP coding sequence was used as control for transfection efficiency. The transgene
expression was analyzed using RT-PCR, Western blot and immunofluorescence
analysis.
Immunofluorescence analysis. Cells were cultured on glass coverslips and fixed
in 3.7% paraformaldehyde in PBS. Coverslips were blocked with 1% BSA, incubated for
1 hour with rabbit anti-Timp1 polyclonal antibody (ABR, Golden, CA) and then with
Alexa 488–conjugated anti-rabbit antibody (Molecular Probes, Carlsbad, CA) mixed with
4’-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 45 minutes. Slides were analyzed in a
confocal fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany).
Flow cytometry. Percentage of cells presenting DNA fragmentation - sub-G1
population - were determined by flow cytometric analysis using a FACSCaliburTM
cytometer (Becton Dickinson, San Juan, CA) as described previously (Supiot et al.,
2005). Briefly, 10
5
cells were maintained in suspension for 96 hours, fixed with 70%
ethanol, resuspended in 0.5 mL solution containing 50 µg/mL propidium iodide and 20
µg/mL RNAse in PBS, and incubated for 30 min at 37
o
C. Ten thousand events were
evaluated per assay.
Soft-agar assay. Cells (10
3
cells/well) were suspended in 3 mL of complete
culture
medium with 0.3% agarose. This suspension was layered over of 0.6% agarose-
medium
base layer in 35 mm diameter dishes. After 21 days, cells were stained with 2
mL of crystal
violet solution and colonies
were counted.
Tumorigenicity Assay. Cells (2×10
5
/animal) were injected subcutaneously in the
flank of syngeneic 7-week-old C57Bl/6 female mice. Animals were checked daily for
tumor development during 2 weeks, and were kept in the Center for Development of
Experimental Models for Medicine and Biology (CEDEME, UNIFESP, SP, Brazil) under
the International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals
(CIOMS), Genebra (1985).
Experimental Metastasis Assay. Female 7-week-old C57Bl/6 mice were
inoculated intravenously with 2×10
5
cells. Lungs were harvested 23 days later and
metastatic foci in the lungs counted.
Data analysis. All experiments were repeated for at least two to three times. Non-
parametric two-tailed unpaired t tests were used for most experiments, except where
otherwise indicated. P-values <0.05 were considered statistically significant. Statistical
analysis was performed using GraphPad Prism 4.02 Software (San Diego, CA).
Acknowledgements
This study was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo - FAPESP, grants 02/06935-7 and 06/61293-1 (MGJ), Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, grant 33009015003P3
(MGJ).
REFERENCES
Airola K, Karonen T, Vaalamo M, et al. (1999). Expression of collagenases-1 and -
3 and their inhibitors TIMP-1 and -3 correlates with the level of invasion in malignant
melanomas. Br J Cancer 80: 733-43.
Apparailly F, Noel D, Millet V, et al. (2001). Paradoxical effects of tissue inhibitor of
metalloproteinases 1 gene transfer in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum 44:
1444–54.
Baserga R. (1997). The price of independence. Exp Cell Res 236: 1-3.
Bennett DC, Cooper PJ, Hart IR. (1987). A line of non-tumorigenic mouse
melanocytes, syngeneic with the B16 melanoma and requiring a tumour promoter for
growth. Int J Cancer 39: 414-8.
Bruniquel D and Schwartz RH. (2003). Selective, stable demethylation of the
interleukin-2 gene enhances transcription by an active process. Nat Immunol 4: 235-40.
Campos ACE, Molognoni FHM, Melo F, et al. (2007). Oxidative stress modulates
DNA methylation during melanocyte anchorage blockade associated with malignant
transformation. Neoplasia 9: 1111-21.
Chesler L, Golde DW, Bersch N, Johnson MD. (1995). Metalloproteinase inhibition
and erythroid potentiation are independent activities of tissue inhibitor of
metalloproteinases-1. Blood 86: 4506–15.
Chirco R, Liu XW, Jung KK, Kim HR. (2006). Novel functions of TIMPs in cell
signaling. Cancer Metastasis Rev 25: 99-113.
Correa M, Machado JJr., Carneiro CRW, et al. (2005). Transient inflammatory
response induced by apoptotic cells is an important mediator of melanoma cell
engraftment and growth.
Int J Cancer 114: 356-363.
Coussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. (2002). Matrix metalloproteinase
inhibitors and cancer: trials and tribulations.
Science 295: 2387-2392.
Curran S and Murray GI. (1999). Matrix metalloproteinases in tumour invasion and
metastasis.
J Pathol 189: 300-8.
Díaz-Montero CM and McIntyre BW. (
2003). Acquisition of anoikis resistance in
human osteosarcoma cells. Eur J Cancer 39: 2395-402.
Eckhardt F, Lewin J, Cortese R, et al. (2006). DNA methylation profiling of human
chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet 38: 1378-85.
Freedman VH and Shin SI. (1974). Cellular tumorigenicity in nude mice:
correlation with cell growth in semi-solid medium. Cell 3: 355-9.
Frisch SM and Francis H. (1994). Disruption of epithelial cell-matrix interactions
induces apoptosis. J Cell Biol 124: 619–26.
Frisch SM. (1994). E1a induces the expression of epithelial characteristics. J Cell
Biol 127: 1085–1096.
Gonzalgo ML and Jones PA. (2002). Quantitative methylation analysis using
methylation-sensitive single-nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Methods 27:
128-33.
Gopisetty G, Ramachandran K, Singal R. (2006). DNA methylation and apoptosis.
Mol Immunol 43: 1729-40.
Grossmann J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Schölmerich J. (2001). Apoptotic
signaling during initiation of detachment-induced apoptosis ("anoikis") of primary human
intestinal epithelial cells. Cell Growth Differ 12: 147-55.
Grossmann J. (2002). Molecular mechanisms of “detachment-induced apoptosis—
Anoikis”. Apoptosis 7: 247–60.
Guadagno TM, Ohtsubo M, Roberts JM, Assoian RK. (1994). A link between cyclin
A expression and adhesion-dependent cell cycle progression. Science 262: 1572–5.
Guedez L, Mansoor A, Birkedal-Hansen B, et al. (2001). Tissue inhibitor of
metalloproteinases 1 regulation of interleukin-10 in B-cell differentiation and
lymphomagenesis. Blood 97: 1796–802.
Hornebeck W, Lambert E, Petitfrère E, Bernard P. (2005). Beneficial and
detrimental influences of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in tumor
progression. Biochimie 87: 377-83.
Huang X, Orucevic A, Li M, Gorelik E. (2000). Nitric oxide (NO), methylation and
TIMP-1 expression in BL6 melanoma cells transfected with MHC class I genes.
Clin Exp
Metastasis 18: 329-35.
Jones PA and Baylin SB. (2007). The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-92.
Jones PA. (1996). DNA methylation errors and cancer. Cancer Res 56: 2463–7.
Laird PW. (2005). Cancer epigenetics.
Hum Mol Genet 14: R65-76.
Lambert E, Dassé E, Haye B, Petitfrère E. (2004). TIMPs as multifacial proteins.
Crit Rev Oncol Hematol 49: 187-98.
Li G, Fridman R, Kim HR. (1999). Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 inhibits
apoptosis of human breast epithelial cells. Cancer Res 59: 6267-75.
Liu H, Liu W, Wu Y, Zhou Y, Xue R, Luo C, et al. (2005). Loss of Epigenetic
Control of Synuclein-g Gene as a Molecular Indicator of Metastasis in a Wide Range of
Human Cancers. Cancer Res 65: 7635-43.
Lukashev ME, Werb Z. (1998). ECM signalling: orchestrating cell behaviour an.d
misbehaviour. Trends Cell Biol 8: 437-41.
MacDougall JR, Bani MR, Lin Y, Muschel RJ, Kerbel RS. (1999). 'Proteolytic
switching': opposite patterns of regulation of gelatinase B and its inhibitor TIMP-1 during
human melanoma progression and consequences of gelatinase B overexpression. Br J
Cancer 80: 504-12.
Meredith JE Jr and Schwartz MA. (1997). Integrins, adhesion and apoptosis.
Trends in Cell Biology 7: 146–50.
Mosmann T. (1983). Rapid colorimetric assay for growth and survival: application
to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 65: 55-63.
Murashige M, Miyahara M, Shiraishi N, Saito T, Kohno K, Kobayashi M. (1996).
Enhanced expression of tissue inhibitors of metalloproteinases in human colorectal
tumors. Jpn J Clin Oncol 26: 303–9.
Nagase H and Woessner JF Jr. (1999). Matrix metalloproteinases. J Biol Chem
274: 21491-4.
Oba-Shinjo SM, Correa M, Ricca TI, et al. (2006). Melanocyte transformation
associated with substrate adhesion impediment. Neoplasia 8: 231-41.
Rak J, Mitsuhashi Y, Sheehan C, et al. (1999). Collateral expression of
proangiogenic and tumorigenic properties in intestinal epithelial cell variants selected for
resistance to
anoikis. Neoplasia 1: 23-30.
Rhee JS, Diaz R, Korets L, Hodgson JG, Coussens LM. (2004). TIMP-1 alters
susceptibility to carcinogenesis. Cancer Res 64: 952-61.
Robertson KD. (2005). DNA methylation and human disease.
Nat Rev Genet 6:
597-610.
Schrohl AS, Christensen IJ, Pedersen AN,
et al. (2003). Tumor tissue
concentrations of the proteinase inhibitors tissue inhibitor of metalloproteinases-1
(TIMP-1) and plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) are complementary in
determining prognosis in primary breast cancer.
Mol Cell Proteomics 2: 164–172.
Sepulveda JL, Gkretsi V, Wu C. (2005). Assembly and signaling of adhesion
complexes.
Curr Top Dev Biol 68: 183-225.
Supiot S, Gouard S, Charrier J, et al. (2005). Mechanisms of cell sensitization to a
radioimmunotherapy by doxorubicin or paclitaxel in multiple myeloma cell lines. Clin
Cancer Res 11: 7047-52s.
Takai D and Jones PA. (2002). Comprehensive analysis of CpG islands in human
chromosomes 21 and 22. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 3740-5.
Valentijn AJ, Zouq N, Gilmore AP. (2004). Anoikis. Biochem Soc Trans 32: 421-5.
van Doorn R, Gruis NA, Willemze R, van der Velden PA, Tensen CP. (2005).
Aberrant DNA methylation in cutaneous malignancies. Semin Oncol 32: 479-87.
Wada K, Maesawa C, Akasaka T, Masuda T. (2004). Aberrant expression of the
maspin gene associated with epigenetic modification in melanoma cells.
J Invest
Dermatol 122: 805-11.
Wang LH. (2004). Molecular signaling regulating anchorage-independent growth
of cancer cells. Mt Sinai J Med 71: 361-7.
Würtz SØ, Schrohl AS, Sørensen NM, et al. (2005). Tissue inhibitor of
metalloproteinases-1 in breast cancer. Endocr Relat Cancer 12: 215-27.
Xu F, Carlos T, Li M, et al. (1998). Inhibition of VLA-4 and up-regulation of TIMP-1
expression in B16BL6 melanoma cells transfected with MHC class I genes. Clin Exp
Metastasis 16: 358–70.
Yan L and Moses MA. (2001) A case of tumor betrayal: biphasic effects of TIMP-1
on Burkitt's lymphoma. Am J Pathol 158: 1185-90.
Zhu Z, Sanchez-Sweatman O, Huang X et al. (2001). Anoikis and Metastatic
Potential of Cloudman S91 Melanoma Cells. Cancer Res 61: 1707-16.
Zucker S, Cao J, Chen WT. (2000). Critical appraisal of the use of matrix
metalloproteinase inhibitors in cancer treatment. Oncogene 19: 6642-6650.
Legends to figures
Figure 1. Melanocyte malignant transformation associated with
anoikis
resistance. Cell lines were maintained in suspension (10
5
cells) for 96 hours. Cell
viability was determined by MTT assay. ma: melan-a cells; 2C and 4C: melan-a cells
submitted to 2 and 4 substrate adhesion blockade cycles, respectively; 4C3-, 4C11-:
slow-growing melanoma cell lines; 4C11+, Tm1, Tm5: fast-growing melanoma cell lines.
Bars, SD of the mean of six samples. P<0.0001.
Figure 2. Increased expression of Timp1 throughout melanocyte malignant
transformation. Timp1 expression analysed in melan-a cells and melan-a-derived cell
lines by RT-PCR (A) and Western Blot (B) analyses. In B, the same blot was reprobed
with anti-actin antibody (bottom panel). ma: melan-a cells; D1h, D3h, D5h, D24h:
melan-a cells cultured in suspension for 1, 3, 5 and 24 hours, respectively; 2C and 4C:
melan-a cells submitted to 2 and 4 substrate adhesion blockade cycles, respectively;
4C3-, 4C11-: slow-growing melanoma cell lines; Tm1, Tm5: fast-growing melanoma cell
lines.
Figure 3. Timp1 promoter demethylation induces Timp1 expression along
melanoma genesis. A: Analysis of Timp1 expression by RT-PCR after
in vitro
treatment of melan-a cells with 5µM 5-Aza-CdR for 2 days. ma-: non-treated melan-a
cells (positive control); ma+: melan-a cells treated with 5-Aza-CdR. B: Schematic
representation of CpG site location in Timp1 promoter and first exon. S1, S2 and S3
indicate CpG dinucleotide analyzed by Methylation-sensitive single-nucleotide primer
extension (Ms-SNuPE). Arrow indicates transcriptional start site. C and D: Quantitative
methylation analysis of three CpG sites in the promoter and first exon of the Timp1 gene
in various DNA samples using Ms-SNuPE. The percentage of methylation at each CpG
site was determined by the C:T signal ratio (Left axis). In D, the average methylation of
the three CpG sites is shown at the bottom of each panel. The curve in the graph
represents Timp1/actin mRNA ratio (Right axis). skin: DNA extracted from mouse skin;
ma: melan-a cells; ma-5-Aza-CdR: melan-a cells treated with 5-Aza-CdR; D5h, D24h:
melan-a cells cells cultured in suspension for 5 and 24 hours respectively; 2C, 4C:
melan-a cells submitted to 2 and 4 substrate adhesion blockade cycles, respectively;
4C3-, 4C11-: slow-growing melanoma cell lines; 4C3+, Tm1, Tm5: fast-growing
melanoma cell lines.
Figure 4. Timp1 overexpression do not induce cell proliferation both in
melan-a melanocytes and Tm5 melanoma cells. A: Timp1 expression analyzed by
RT-PCR in melan-a and Tm5 cells transfected with Timp1. B: Indirect
Immunofluorescence using Timp1-specific antibody (ABR, Golden, CA). C: In vitro cell
proliferation was quantified by MTT assay. GFP-transfected cells were used as
transfection control. ma: melan-a cells; Tm5: fast-growing melanoma cell line; C: non-
transfected cells; GFP: GFP-transfected cells; T1S: Timp1-transfected cells. Bars, SD of
the mean of 5 samples.
Figure 5. Melan-a melanocytes overexpressing Timp1 become anoikis
resistance, but not tumorigenic in vivo. Timp1-overexpressing melan-a and Tm5
cells were maintained in suspension for 96 hours. Cell viability (A) was determined by
MTT assay in triplicate. Cell cycle analysis (B) was performed to quantify sub-G1
population of cells in suspension by flow cytometric analysis and cell death is expressed
as a percentage of control cells (100%) at 0-h treatment, where 10,000 events were
evaluated per assay. In C, melan-a and Tm5 cells were cultured in soft agar medium for
21 days and this assay was performed in duplicate. ma: melan-a cells; Tm5: fast-
growing melanoma cell line; C: non-transfected cells; GFP: GFP-transfected cells; T1S:
Timp1-transfected cells. Bars: SD of the mean of analyzed samples. *p<0.05;
**p<0.005, ***p<0.0005.
Figure 6. Tm5 melanoma cells overexpressing Timp1 acquire more
aggressive phenotype in vivo. A: Tumorigenicity assay in vivo. Mice were
subcutaneously injected with 2×10
5
Tm5 transfected cells. B: Experimental metastasis
assay. 2×10
5
Tm5 transfected cells were injected via the caudal vein. Mices were
sacrified 23 days later, their lungs were removed and metastatic foci in the lungs
counted. Tm5: fast-growing melanoma cell line; Tm5 GFP: GFP-transfected Tm5 cells;
Tm5 T1S: Timp1-transfected Tm5 cells; GFP: GFP-transfected cells; T1S: Timp1-
transfected cells. Bars: SD of the mean of 5 animals per group. ***p<0.0005.
Illustrations
Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Melanocyte Transformation Associated with Substrate
Adhesion Impediment
1
Sueli M. Oba-Shinjo *
,2
, Mariangela Correa
y,2
, Tatiana I. Ricca
y
, Fernanda Molognoni
y
, Maria A. Pinhal
z
,
Izabel A. Neves
z
, Sueli K. Marie*,Lu
´
cia O. Sampaio
z
, Helena B. Nader
z
,
Roger Chammas
§
and Miriam G. Jasiulionis
y
*Laborato
´
rio de Biologia Molecular, Departamento de Neurologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sa˜o
Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil;
y
Disciplina de Imunologia, Departamento de Micro, Imuno e Parasitologia, Universidade
Federal de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil;
z
Disciplina de Biologia Molecular, Departamento de Bioquı
´
mica,
Universidade Federal de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil;
§
Laborato
´
rio de Oncologia Experimental,
Faculdade de Medicina, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, Brazil
Abstract
Exclude experimental models of malignant transfor-
mation employ chemical and physical carcinogensor ge-
netic manipulations to study tumor progression. In this
work, different melanoma cell lines were established
after submitting a nontumorigenic melanocyte lineage
(melan-a) to sequential cycles of forced anchorage
impediment. The great majority of these cells underwent
anoikis when maintained in suspension. After one de-
adhesion cycle, phenotypic alterations were noticeable
in the few surviving cells, which became more numerous
and showed progressive alterations after each adhe-
sion impediment step. No significant differences in cell
surface expression of integrins were detected, but a
clear electrophoretic migration shift, compatible with an
altered glycosylation pattern, was observed for B
1
chain
in transformed cell lines. In parallel, a progressive en-
richment of tri- and tetra-antennary N-glycans was
apparent, suggesting increased N-acetylglucosaminyl-
transferase V activity. Alterations both in proteoglycan
glycosylation pattern and core protein expression were
detected during the transformation process. In conclu-
sion, this model corroborates the role of adhesion state
as a promoting agent in transformation process and
demonstrates that cell adhesion disturbances may act
as carcinogenic stimuli, at least for a nontumorigenic
immortalized melanocyte lineage. These findings have
intriguing implications for in vivo carcinogenesis, sug-
gesting that anchorage independence may precede, and
contribute to, neoplastic conversion.
Neoplasia (2006) 8, 231–241
Keywords: Melanocyte transformation, substrate adhesion impediment,
adhesion molecules, N-glycans, proteoglycans.
Introduction
The incidence of melanoma in most developed countries
has increased more quickly than any other cancer type over
the past 50 years [1]. Melanoma arises from the malignant
transformation of pigment-producing cells (melanocytes), and
this process results from complex interactions between genetic
and environmental factors. Melanocytic nevi (moles), formed
by benign clusters of melanocytes, have drawn special atten-
tion as potential precursor lesions, and ‘‘atypical nevi’’ are
a marker for an increased risk of melanoma [2]. In vivo, 20%
to 30% of human malignant melanomas are associated with
benign or dysplastic nevi in histologic contiguity [3,4]. Clark
et al. [5] proposed a five-stage model of melanoma progres-
sion from preneoplastic lesions (benign and dysplastic nevi) to
thin radial growth superficial melanoma, followed by an inva-
sive lesion and culminating in metastatic disease.
In humans, one of the first tissue alterations involved in
melanoma progression is the presence of melanocytes in the
dermis, topographically distant to basal keratinocytes. Keratino-
cytes in the ‘‘epidermal melanin unit’’ play a fundamental role in
controlling the proliferation and expression of adhesion mole-
cules in melanocytes, loss of cell–cell contact, and disruption
of tissue architecture. Such activities have recently been impli-
cated in genotypic and phenotypic changes in melanocytes [6].
The extracellular matrix (ECM) surrounding the cells is an-
other important element controlling cell proliferation, adhesion,
and migration. Changes in the expression or function of ad-
hesion molecules, such as integrins, Mel-CAM/MUC18, CD44,
intercellular adhesion molecule-1, cadherins, and cell surface
Abbreviations: ECM, extracellular matrix; L-PHA, leukoagglutinin from Phaseolus vulgaris;
PG, proteoglycan; SGAG, sulfated glycosaminoglycan; CS, chondroitin sulfate; DS, dermatan
sulfate; GnT-V, N-acetylglucosaminyltransferase V
Address all correspondence to: Dr. Miriam Galvonas Jasiulionis, Disciplina de Imunologia,
Departamento de Micro, Imuno e Parasitologia, R. Botucatu, 862-4j andar, Sa˜o Paulo 04023-
900, Brazil. E-mail: miriamleon@ecb.epm.br
1
This work was supported by grants from the Fundac¸a˜o de Amparo a
`
Pesquisa do Estado de
Sa˜o Paulo and the Coordenac¸a˜o de Aperfeic¸oamento de Pessoal de Nı
´
vel Superior.
2
Sueli M. Oba-Shinjo and Mariangela Correa share first authorship.
Received 23 November 2005; Revised 9 January 2006; Accepted 12 January 2006.
Copyright D 2006 Neoplasia Press, Inc. All rights reserved 1522-8002/06/$25.00
DOI 10.1593/neo.05781
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, March 2006, pp. 231 – 241 231
www.neoplasia.com
RESEARCH ARTICLE
proteoglycans (PGs), have all been documented in the
progression of primary melanomas [7,8]. In particular, the
switch from a low-risk radial to a high-risk vertical growth
primary melanoma is characterized by significant changes in
the expression of molecules involved in cell – cell and cell –
ECM contact, as well as of proteases [9].
Cell–ECM interactions have also been shown to deter-
mine the molecular progression of poorly metastatic mela-
noma cells, changing them to exhibit a highly aggressive
phenotype [10]. The acquisition of resistance to cell death
induced by substrate adhesion blockade (anoikis resistance)
is a hallmark of neoplastic transformation and is also a criti-
cal step during metastatic progression [11].
Most findings relating adhesion molecules and the trans-
formation process were obtained from primary skin cultures
or human melanoma lesions in different stages of progres-
sion. Until now, all experimental models of melanocyte
transformation utilize chemical or environmental carcino-
gens and genetic manipulations to study the progression of
this deadly disease. In this work, we describe an in vitro
murine model that focuses on cellular adhesion blockade as a
transforming factor and characterize some alterations
in adhesion molecule expression, which accompanies mela-
nocyte transformation.
Materials and Methods
Cell Lines and Culture
The nontumorigenic murine melanocyte lineage, melan-a
[12], a kind gift of Dr. Michel Rabinovitch (Department of
Parasitology, UNIFESP, Sa˜ o Paulo, Brazil), was cultured in
RPMI (pH 6.9; Gibco, Carlsbad, CA), supplemented with 5%
fetal calf serum (Gibco) and 200 nM 12-o-tetradecanoyl
phorbol-13-acetate (PMA; Tocris, Ellisville, MO) at 37jCin
a humidified atmosphere of 5% CO
2
and 95% air. Melanoma
cell lines (4C3, 4C8, 4C11, Tm1, Tm5, and S11) derived from
melan-a cells after sequential cycles of substrate adhesion
impediment were cultured in the same conditions, without
PMA. Cell proliferation was determined using a standard
methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay [13].
Anchorage-Independent Growth Assays
The nontumorigenic cell line melan-a (10
5
cells/ml) was
plated on 1% agarose and cultured for 96 hours in conditions
described above. Small spheroids were collected by de-
cantation and plated on standard culture plates, favoring cell
adhesion. Cells were allowed to proliferate to subconfluent
growth. The deadhesion (spheroid formation) cycle was re-
peated for four or five times; after the last deadhesion step,
spheroids were counted and plated by limiting dilution (0.5–
1 spheroid/well). Melan-a cells submitted to two and four
deadhesion cycles were named, respectively, 2C and 4C.
Tm1, Tm4, Tm5, S11, and 14 other melanoma cell lines were
obtained by cloning melan-a cells submitted to five dead-
hesion cycles. In a second melan-a deadhesion assay, 4C3,
4C8, 4C11, and five other melanoma cell lines were estab-
lished after four deadhesion steps.
Adhesion Assays
Briefly, 96-well microtiter plates were coated with 0.5 mgof
human plasma fibronectin (Sigma, St. Louis, MO) or human
placenta laminin (Calbiochem, San Diego, CA) in phosphate-
buffered saline (PBS), incubated at 37jC for 2 hours, and
blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour after
washing. Cells (3
Â
10
4
) suspended in 100 ml of serum-free
RPMI were added to each coated well and incubated at
37jC for 30 minutes. Wells were washed three times with
cold PBS to remove unbounded cells. Viable adherent cells
were quantified using a standard MTT assay [13].
Immunofluorescence Microscopy
Different cell lines were cultured on glass coverslips until
subconfluence and fixed in 1% paraformaldehyde in PBS.
After washing with PBS, 50 mM glycine (pH 7.4) was added
for 1 hour, and coverslips were blocked with 1% BSA. Cells
were incubated for 1 hour with rabbit anti-fibronectin polyclonal
antibody (Calbiochem), washed with 1% BSA, and incu-
bated with an fluorescein isothiocyanate (FITC)–conjugated
anti-rabbit antibody (KPL, Gaithersburg, MD) for 45 minutes.
Slides were mounted and observed in a fluorescence micro-
scope (Nikon Inc., Melville, NY).
Analysis of Surface Molecule Expression by Flow Cytometry
Expressions of integrins (a
v
, a
5
, a
6
, b
1
,andb
3
subunits) and
leukoagglutinin from Phaseolus vulgaris (L-PHA) –positive
glycoconjugates were quantified by flow cytometry. The cells
were detached with trypsin, washed and suspended in PBS
(1
Â
10
6
cells/100 ml), and incubated with primary antibodies
or FITC-conjugated L-PHA (Sigma; for L-PHA– positive gly-
coconjugates) on ice for 1 hour. All antibodies were diluted
in PBS containing 0.5% BSA. The cells were then washed
twice, suspended in 100 ml of appropriate FITC-conjugated
anti-IgG on ice for 45 minutes, washed twice, and suspended
in PBS. Negative controls were incubated only with sec-
ondary antibody. At least 10,000 cells were analyzed by Cell-
QUEST program using FACSCalibur (Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, Franklin Lakes, NJ).
Western Blot Analysis and Lectin Blotting
Cells were washed twice with PBS and lysed in a buffer
containing 1% Triton, 150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl (pH 7.4),
5 mM EDTA, and protease and phosphatase inhibitors
(0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mg/ml leupeptin,
10 mg/ml aprotinin, and 1 mM sodium orthovanadate) on
ice for 15 minutes. The lysates were pelleted by centrifugation
for 15 minutes at 4jC, and protein concentration was deter-
mined using the Bradford reagent (Bio-Rad, Hercules, CA).
Equal amounts of protein (80 mg of total protein) from each
sample were resolved by reduced 7.5% sodium dodecyl
sulfate– polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
gels and blotted onto polyvinylidine fluoride membranes
(Amersham, Piscatway, NJ). Membranes were blocked with
5% dried milk in PBS for 1 hour at room temperature be-
fore exposure to primary antibodies to b
1
integrin (rabbit
polyclonal serum; a kind gift from Dr. K. Yamada, National
Institute for Dental Research, Bethesda, MD) for 2 hours at
232 Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al.
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
room temperature. Membranes were washed in 5% dried
milk containing PBS and incubated with horseradish peroxi-
dase (HPR)–conjugated anti-rabbit IgG (Sigma). After
extensive washing with PBS, proteins were visualized by
incubating the membrane with the substrate for peroxidase,
diaminobenzidine (DAB; Sigma). For lectin blotting, after in-
cubating the membrane with blocking reagent (Boehringer
Mannheim, Mannheim), 1 mg/ml biotinylated L-PHA (Sigma)
in blocking solution was added for 2 hours, followed by incu-
bation with streptavidin HPR (R&D Systems, Minneapolis,
MN) for another 1 hour at room temperature. The blots were
washed and developed with DAB.
Tumorigenicity Assays
Cells were harvested after trypsin treatment of subcon-
fluent monolayers, counted, and then suspended in PBS.
Melan-a cells (2
Â
10
7
cells) and its derived clones (1
Â
10
6
cells) were injected subcutaneously in the flank of syn-
geneic 6- to 8-week-old C57Bl/6 female mice. Animals were
kept under 12-hour daylight cycles, without food restriction,
and checked daily for tumor development. Each experimental
group consisted of at least five animals. Subcutaneous
masses and axillary lymph nodes were excised and submit-
ted to histologic analysis after paraffin embedding and he-
matoxylin and eosin (H&E) staining.
PG and Glycosaminoglycan (GAG) Analysis
Cell cultures were radiolabeled with 150 mCi of carrier-free
35
[S]sulfate (IPEN, Sa˜o Paulo, Brazil) for 18 hours, essen-
tially as previously described [14]. The medium was sepa-
rated, and the cell layer and ECM were removed with 7 M urea
in 12.5 mM Tris–HCl (pH 8.0). Each experiment was carried
out in triplicate. For PG analysis, protease inhibitors were
added to a final concentration of 100 mM a-aminocaproic
acid, 6.5 mM benzamidine HCl, 5.5 mM iodoacetamide, and
0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Total protein con-
tent was determined using the Bradford reagent and BSA
as standard. For GAG analysis, 50 mM Tris –HCl buffer
(pH 8.0), containing 0.15 M NaCl and 2 mg/ml maxatase
(Biocon, Rio de Janeiro, Brazil), was added. The mixture
was incubated at 50jC overnight and then at 100jCfor
10 minutes to inactivate the protease. PG and sulfated
glycosaminoglycan (SGAG) –free chains were analyzed by
agarose gel electrophoresis in 50 mM 1,3-diaminopropane
acetate buffer (pH 9.0), according to Nader et al. [15]. Elec-
trophoresis was run for about 1 hour at 100 V, and com-
pounds were precipitated in the gel with 0.1% CETAVLON
(N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide) for at least
2 hours. The gel was dried and stained with 0.1% toluidine
blue in 1% acetic acid and 50% ethanol. SGAG identifica-
tion was based on the migration of the compounds, compared
to standards, after exposure to X-ray film and degradation
by specific enzymes [16]. Gel slices were cut and counted
in scintillation liquid for the quantification of [
35
S]sulfate-
radiolabeled SGAG. Relative contents of disaccharides in
chondroitin sulfate (CS) and dermatan sulfate (DS) were
determined after incubation of SGAG (25,000 cpm) with
chondroitinases AC (Tris–acetate 50 mM, pH 8.0) and ABC
(ethylene diamine acetate buffer, EDA 0.05 M, pH 8.0)
(Seikagaku, Tokyo, Japan). The relative amounts of disac-
charides in heparan sulfate (HS) were determined after di-
gestion of heparitinases I and II (0.05 M EDA, pH 7.0) [17,18].
Incubation mixtures were applied to descending paper chro-
matography [isobutyric acid: 1.25 M NH
4
OH (5/3, vol/vol)].
Sulfated disaccharides were localized after exposure of the
chromatogram to an X-ray film, cut, and counted in scintil-
lation liquid.
Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR)
Total RNA were extracted from cultures with Trizol (Invi-
trogen, Carlsbad, CA), according to the manufacturer’s in-
structions. One microgram of RNA was reverse-transcribed
to cDNA with Superscript III (Invitrogen), according to the
manufacturer’s recommendations. PCR amplification was
performed using the following primers: decorin (forward: 5V-
gggtttggacaaagtgccctgg-3V; reverse: 5V-gcctggtgcatcaac-
cttgg-3V; 512 bp), syndecan-4 (forward: 5V-tgctgctcctcggaggc-
ttc-3V; reverse: 5V-ccttgggctctgaggggaca-3V; 282 bp), versican
(forward: 5V-caaacccatgcctcaacggagg-3V; reverse: 5V-ccttca-
gcagcatcccatgtgcgt-3V; 300 bp), perlecan (forward: 5V-gcccg-
tgcacgctgagattga-3V; reverse: 5V-ggggcagaccctggatctaag-3V;
812 bp), heparanase (forward: 5V-ctcgagatgctgctgcgctcgaag-
cctgcg-3V; reverse: 5V-ccatggtcaagtgcaagcagcaactttggc-3V;
1261 bp), and b-actin (forward: 5V-cttcgagcaggagatggcc-3V;
reverse: 5V-ggtgcacgatggaggggccg-3V; 439 bp). Except for
heparanase, the annealing temperature used in PCR am-
plification was 60jC, with different cycles. PCR reactions were
performed in 25-ml reaction mixtures containing 75 mM Tris–
HCl (pH 9.0), 2 mM MgCl
2
,50mMKCl,20mM(NH
4
)
2
SO
4
,
0.4 mM of each deoxynucleotide triphosphate, 0.4 mM of each
primer, 1 U of BioTools DNA Polymerase—Recombinant
from Thermus thermophilus (BioTools, Madrid, Spain), and
1 ml of cDNA in different dilutions. After the initial denaturing
step for 5 minutes at 94jC, thermal cycling consisting of
35 cycles of 30 seconds, denaturing at 94jC, 30 seconds of
annealing at 60jC, and 1 minute of extension at 72jCwas
carried out, followed by a final extension of 10 minutes at
72jC. For heparanase PCR, the reaction was performed
using Master Mix Kit (Promega Biosciences Inc., Madison
WI), 0.4 mMofeachprimer,2ml of cDNA, and 200 mM be-
taine. After a denaturing step at 94jC for 5 minutes, the fol-
lowing cycles were carried out: 5 cycles of 1 minute at 94jC,
1minuteat60jC, and 2 minutes at 72jC; 20 cycles of 1 minute
at 94jC, 1 minute at 55jC, and 2 minutes at 72jC; 10 cycles of
1minuteat94jC, 1 minute at 50jC, and 2 minutes at 72jC;
and a final extension step of 7 minutes at 72jC. PCR fragment
amplification was confirmed by agarose gel staining with
ethidium bromide.
Data Analysis
All experiments were repeated for at least two to three
times with similar results. One-way analysis of variance
(ANOVA) tests were used for most experiments, except where
Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al. 233
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
otherwise indicated. Statistical analysis was performed using
GraphPad Prism 3.03 software (GraphPad, San Diego, CA).
Results
A New Model for Studying Melanocyte Transformation
A nontumorigenic murine melanocyte lineage, melan-a
[12], was submitted to stressful conditions by blocking adhe-
sion to substrate, as described above and as depicted in
Figure 1. As expected for a nontumorigenic immortalized cell
line, the great majority of these cells underwent apoptosis
induced by adhesion blockade (anoikis). After cultivating
melan-a cells in agarose-coated plates for 96 hours, only
10
3
small spheroids per 10
6
plated cells were observed. Each
spheroid is probably derived from a single cell, thus suggest-
ing that only 0.1% of the initial cell number was able to resist
anoikis (Table 1).
Anoikis-resistant melan-a cells were cultured in adherent
conditions and submitted to new deadhesion cycles. Sur-
viving melan-a cells submitted to two, three, and four dead-
hesion cycles were kept in adherent conditions and designated
2C, 3C, and 4C, respectively. Distinct lineages (4C3, 4C8,
4C11, S11, Tm1, Tm4, Tm5, and others) were obtained by
limiting dilution after a new deadhesion cycle of 4C cells
(0.5 spheroid/well) (Figure 1).
Altered morphology was observed in all melan-a–derived
cell lines (including 1C to 4C cells), which demonstrated
stable phenotypic characteristics and melanin production
(data not shown). Although melan-a cells require PMA as a
growth factor, all these lineages showed PMA-independent
growth, as described for human melanoma cell lines [19].
Furthermore, cell lines obtained after submitting melan-a cells
to adhesion impediment cycles showed increased spheroid
formation and shorter doubling times compared to the original
melan-a cells (Table 1). Immunofluorescence analysis using
a specific antibody showed that melan-a– derived sublines
Tm1 and Tm5 did not assemble fibronectin on the ECM, un-
like melan-a cells (Figure 2A). Curiously, tested cell lines ob-
tained after four or five deadhesion steps and after limiting
dilution (4C11, Tm1 and Tm5) showed higher adhesiveness
both to fibronectin (Figure 2B) and laminin (Figure 2C).
Considering several phenotypic characteristics asso-
ciated with neoplastic transformation that were observed in
melan-a–derived cell lines, in vivo tumorigenic capacity was
tested. Surprisingly, all lineages obtained after four dead-
hesion cycles were able to grow as tumors when injected
subcutaneously in syngeneic mice (Figure 2D), with different
latency times for tumor appearance (Table 1). In the first
melan-a detachment assay, we obtained 16 different cell
lines; 12 were injected in the subcutaneous tissue and
every one of them resulted in palpable tumors (from 5 to
20 mm in diameter) in all injected animals (groups of three to
five animals). Subcutaneous tumors derived from seven
cell lines (Tm1, Tm4, Tm5, S10, S11, a1, and a3) were sub-
mitted to histologic analysis, and all showed cytologic and
histologic characteristics of malignant cells. All cell lines, ex-
cept Tm1 and a1, showed a melanotic appearance at mi-
croscopy. In the second assay, eight cell lines were obtained.
Four of them (4C1, 4C3, 4C8, and 4C11) were injected into
syngeneic mice, and all resulted in subcutaneous tumors
when injected subcutaneouly.
When 10
6
cells were transplanted subcutaneouly into
animals, the amelanotic Tm1 and melanotic Tm5 cell lines
showed very short latency times for tumor appearance (up
to 10 days) compared to 4C3, 4C8, and 4C11 (at least
30 days). Spontaneous lymph node metastases were iden-
tified in animals injected subcutaneouly with 10
6
Tm1, Tm4,
Table 1. Some Phenotypic Alterations of Melan-A – Derived Lineages.
Cell Lines Spheroid
Formation (%)*
Melanin
Production
Latency
In Vivo
y
(days)
Doubling Time
In Vitro (hours)
Melan-a 0.1 + Nontumorigenic 22
2C ND + Nontumorigenic 22
4C ND + Nontumorigenic 20
4C3 ND À >33 ND
4C11 ND À >33 ND
S11 10 + <14 ND
Tm1 25 À <10 18
Tm5 32 + <9 14
ND, not done.
*Number of spheroids formed after plating 10
6
cells in suspension.
y
Tumorigenicity of cells injected subcutaneously in the flanks of C57Bl/6 mice
(1 million cells per flank).
Figure 1. Experimental model of melanocyte transformation induced by adhesion impediment. Schematic representation of the experimental protocol that resulted
in melan-a transformation. After detachment from the substrate, surviving cells showed altered morphology and PMA-independent growth, even after one
deadhesion cycle (1C).
234 Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al.
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
and Tm5 melanoma cells (Figure 2E), but not with 4C3, 4C8,
or 4C11. Tm1, Tm4, and Tm5 showed in vivo characteristics
of an aggressive phenotype, whereas 4C3, 4C8, and 4C11
were considered indolent melanoma lineages.
Conversely, direct cloning of melan-a cells (not submitted
to the deadhesion protocol) did not render tumorigenic line-
ages (data not shown). Melan-a cells have never been
shown to be tumorigenic, even when a great number of cells
(2
Â
10
7
cells/animal) were transplanted subcutaneouly into
mice and observed for at least 80 days.
Melanoma Cells Derived from Melan-A Showed Significant
Alterations in Glycoconjugates
Because malignant phenotype was acquired after repeti-
tive cycles of adhesion blockade, adhesion molecule expres-
sion was investigated. Integrins are an important family of
adhesion molecules involved both in cell – cell and cell– ECM
interactions, and alterations in their expression and/or pro-
cessing are frequent in several types of malignancies [20].
Surface expression of b
1
, b
3
, a
5
, a
6
, and a
v
integrin chains
was determined by flow cytometry using specific antibodies,
Figure 2. Morphologic and functional characteristics of melan-a – derived cell lines. (A) Phase-contrast microscopy (upper panels) and indirect immuno-
fluorescence depicting fibronectin deposition on ECM by melan-a, Tm1, and Tm5 cells, using a specific polyclonal antibody against fibronectin (lower panels).
Adherent cell number, as measured by an MTT protocol, after plating cells for 30 minutes in fibronectin-coated (B) or laminin-coated (C) wells. Paired t test was
used for statistical comparisons between melan-a cells and derived lineages (*P < .05, **P V .01). Histologic analysis of tumor masses (D) and axillary lymph nodes
(E) obtained from syngeneic mice injected with 10
6
cells, 14 days after inject ion. The large arrow indicates axillary lymph node, and the small arrow shows
infiltrating melanoma cells. H&E staining,
Â
40.
Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al. 235
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
and no substantial differences were found in their surface
expression levels (data not shown). Although we could not
detect differences on b
1
integrin surface expression, Western
blot analysis revealed that melan-a –derived melanomas
(Tm1 and Tm5) have a b
1
-chain with a different migration
pattern on SDS-PAGE when compared to melan-a cells
(Figure 3D), suggesting a posttranslational processing of b
1
integrins. The same altered electrophoresis mobility was
observed for the b
1
integrin chain of a well-known murine
melanoma cell line B16F10.
As previously shown by our group and others [21], a
similar shift of b
1
integrin chain migration pattern is observed
in several tumor types and is commonly related to aberrant
glycosylation resulting from N-acetylglucosaminyltrans-
ferase V (GnT-V) enzymatic activity. Tri-antennary or tetra-
antennary oligosaccharides formed by this enzyme activity
are recognized by L-PHA, and, as seen in Figure 3, A and B,
melan-a–derived melanomas show a higher expression of
L-PHA– positive surface glycoconjugates compared to their
parental cell line. Interestingly, cell lineages obtained after
submitting melan-a to two or four deadhesion cycles (2C and
4C cell lines) already demonstrate a slightly higher L-PHA –
binding glycoconjugate expression compared to melan-a.
The total glycoprotein profile, shown by lectin blotting on
Figure 3C, detailed qualitative and quantitative alterations
observed after melan-a transformation.
Another important class of glycoconjugates comprises
ECM and surface PGs, which have complex structures,
with a protein core bearing at least one GAG chain. GAGs
are involved in cell growth, cell migration, and cell –cell and
cell–matrix interactions—phenomena that are essential for
tumor development. Initial analysis revealed important
modifications in electrophoretic PG profiles, both from cell
surface and culture supernatant extracts (data not shown).
These results led us to investigate the GAG composition of
these glycoconjugates.
Melanoma Cells Present an Altered GAG Profile
Compared to That of Melan-A Melanocytes
We analyzed GAG chains from cells and culture super-
natants from melan-a, Tm1, Tm5, and S11 cells (Figure 4A).
Melan-a has a tendency to accumulate PGs bearing HS on
Figure 3. Melan-a transformation is accompanied by an increase in tri-antennary and tetra-antennary oligosaccharides and by modification in
1
integrin chain.
(A) Cell surface tri-antennary and tetra-antennary oligosaccharide expression on melan-a (ma), 2C, 4C, 4C3, 4C11, Tm1, and Tm5 cell surfaces analyzed by flow
cytometry using biotin – L-PHA lectin and FITC – streptavidin. (B) Proportion of L-PHA – positive cells (same experiment as in A) (C). Glycoproteins from cell
extracts containing tri-antennary and tetra-antennary N-glycans, as shown by lectin blotting using L-PHA lectin. Analysis by flow cytometry of tri-antennary and
tetra-antennary oligosaccharide expression, as recognized by L-PHA lectin (D).
1
integrin expression on melan-a (ma), Tm5, and B16F10 cells visualized by
Western blot analysis, using a specific polyclonal antibody.
236 Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al.
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
the cell surface and/or ECM, whereas tumorigenic mela-
noma cell lines tend to express both HS and CS/DS PGs.
There is a clear difference in the electrophoretic migration
of CS synthesized by melan-a and its derived melanoma
cell lines. A band shift toward standard DS suggested an
increase in the amounts of iduronic acid– containing disac-
charides in the galactosaminoglycans of tumorigenic sub-
lines. The amount of [
35
S]GAG in relation to total protein
content was determined for HS and CS/DS, showing a sig-
nificant decrease of HS chains in cell extracts (Figure 4B) and
supernatants (Figure 4C) from tumorigenic cell lines, com-
pared to those from melan-a cells. Such decrease in the
incorporation of sulfate into HS could reflect a decrease
in synthesis (sulfation) and/or an increase of chain degrada-
tion. In our model, this HS reduction can be explained by a
progressive increase in heparanase expression along the
melan-a transformation process, as depicted in Figure 4D.
Heparanase is involved in the degradation of both cell sur-
face and ECM HS chains [22], and elevated expression of this
enzyme has been associated with tumor development and
metastasis [23 –25] In addition, HS disaccharide composition
was very similar in melan-a and in its derived sublines, except
for the Tm1 melanoma cell line. HS from Tm1 showed a de-
crease in the disaccharide bearing 2-O-sulfate in the uronic
acid residue in relation to parental melanocytes (Table 2).
The sulfated disaccharide composition for both secreted
and cellular CS/DS from each cell type was determined after
digestion with chondroitinases AC and ABC (Table 3). There
is a clear difference in the ratio of glucuronic acid – and
iduronic acid –containing disaccharides obtained by the
degradation of galactosaminoglycans when comparing
parental melanocyte lineage and its derived tumorigenic
melanoma cell line. Melan-a cells had mainly galactosami-
noglycan chains enriched in glucuronic acid –containing
disaccharides, whereas in tumorigenic counterparts, an im-
portant increase in the relative amounts of iduronic acid–
containing disaccharides was observed. Furthermore, the CS/
DS chains of the tumorigenic cells also showed 6-sulfated
disaccharides, which were not detected in the parental
cell line.
Figure 4. Melanoma cell lines show a band shift of CS toward DS and decreased levels of HS. (A) GAGs from cellular extracts and culture supernatants of melan-a
(ma) and derived melanoma cell lines (Tm1, Tm5, S11). (B and C) [
35
S]sulfate incorporation in CS/DS and HS chains. Total amount of [
35
S] incorporated in each
SGAG was determined by cutting radioactive bands from gel slides, counting in scintillation liquid, and normalizing for the protein content (cpm/g protein) of cell
extracts (B) and culture supernatants (C). (D) Heparanase mRNA expression (Hep) in melan-a (ma), melan-a maintained in suspension for 24 hours (D24 h), and
Tm1 and Tm5 melanoma cells. CS, chondroitin sulfate; DS, dermatan sulfate; HS, heparan sulfate.
Table 2. Relative Proportion of Heparan [
35
S]Sulfate Disaccharides Yielded
by Degradation with Heparitinases I and II.
HS Supernatants Cell Extracts
ma Tm1 Tm5 S11 ma Tm1 Tm5 S11
DUA-GlcNAc,6S 11 10 10 11 9 9 8 10
DUA-GlcNS 41 37 34 36 33 33 25 31
DUA-GlcNS,6S 29 43 41 35 36 44 44 35
DUA,2S-GlcNS,6S 19 11 15 18 22 14 23 24
The radioactivity of the disaccharides was measured after the separation (by
paper chromatography) of compounds incubated with both heparitinases I
and II. The types of uronic acid were not taken into account.
ma, melan-a; Tm1, Tm5, and S11, tumorigenic melanoma cell lines; DUA-GlcNS,
O-(4-deoxy-hex-4-enopyranosyluronic acid)-(1 – 4)-2-sulfamino-
D-glucose;
DUA-GlcNAc,6S, O-(4-deoxy-hex-4-enopyranosyluronic acid)-(1 – 4)-2-acetamido-
D-glucose 6-sulfate; DUA-GlcNS,6S, O-(4-deoxy-hex-4 enopyranosyluronic
acid)-(1 – 4)-2-sulfamino-
D-glucose 6-sulfate; DUA,2S-GlcNS,6S, O-(4-deoxy-
hex-4-enopyranosyluronic acid 2-sulfate)-(1 – 4)-2-sulfamino-
D-glucose.
Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al. 237
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
Melanocyte Transformation Is Accompanied by Alterations
in Decorin, Versican, and Perlecan Expressions
To better characterize PG expression alterations that
occur during melanocyte transformation induced by cycles
of substrate adhesion blockade, we analyzed protein core
expression by semiquantitative RT-PCR (Figure 5). We also
analyzed melan-a cells submitted to two and four deadhesion
cycles (2C and 4C cell lines) and two other melanoma cell
lines (4C3 and 4C8) for protein core transcripts. Perlecan,
versican, and decorin (but not syndecan- 4) protein core
expressions were altered in melanoma cell lines, compared
to those in melan-a and 2C cells. Interestingly, nontumori-
genic 2C and 4C cell lines, submitted to two and four dead-
hesion cycles, already showed some of these modifications,
suggesting that these PGs are associated with melanocyte
transformation in our model.
Discussion
Acquisition of anchorage-independent growth is a hallmark
of neoplastic transformation, but this property is not consid-
ered to be carcinogenic per se. In this work, we show that
repetitive adhesion blockade events are sufficient to induce
malignant transformation in nontumorigenic immortalized
melanocytes (melan-a). Although we cannot exclude clonal
selection as the principal mechanism responsible for tumori-
genic conversion, several results indicate that adhesion
impediment may trigger the carcinogenic process. All tumori-
genic cell lines derived from melan-a have faster doubling
times than their parental lineage (Table 1), but even after
80 in vitro passages, melan-a cells were never tumorigenic
in vivo (data not shown). No negative influence of melan-a
over its derived subline proliferation rate could be demon-
strated either in vitro (not shown) or in vivo [26]. In addition,
cell clones obtained after limiting the dilution of melan-a cells
Table 3. Relative Proportion of Chondroitin [
35
S]Sulfate/Dermatan [
35
S]Sul-
fate Disaccharides Yielded by Degradation with Chondroitinases AC and ABC.
CS/DS Supernatants Cell Extracts
ma Tm1 Tm5 S11 ma Tm1 Tm5 S11
DIdoA-GalNAc,4S 0 23 30 20 22 9 26 30
DGlcA-GalNAc,4S 100 57 46 57 78 76 50 57
DGlcA-GalNAc,6S 0 20 24 23 0 15 24 13
The radioactivity of the disaccharides was measured after separation by
paper chromatography. Chondroitinase AC exclusively yields glucuronic
acid – containing disaccharides, whereas chondroitinase ABC yields both
glucuronic acid – and iduronic acid – containing disaccharides. The relative
amount of DIdoA-4S was obtained by the difference between degradation
product yields after the action of both chondroitinases.
ma, melan-a; Tm1, Tm5, and S11, tumorigenic melanoma cell lines; DIdoA-
GalNAc,4S, O-(4-deoxy-hex-4-enopyranosyluronic acid)-(1– 3)-2-acetamido-
D-
galactose 4-sulfate; DGlcA-GalNAc,4S, O-(4-deoxy-hex-4-enopyranosyluronic
acid)-(1 – 3)-2-acetamido-
D-galactose 4-sulfate; DGlcA-GalNAc,6S, O-(4-
deoxy-hex-4-enopyranosyluronic acid)-(1–3)-2-acetamido-
D-galactose 6-sulfate.
Figure 5. The expression of perlecan, versican, and decorin, but not syndecan-4, becomes altered during melan-a transformation. cDNA obtained from RT was
diluted and amplified by semiquantitative PCR for syndecan-4 (A), perlecan (B), versican (C), and decorin (D), with resulting products visualized on agarose gel.
Ethidium bromide staining intensity was analyzed for each gene and for an internal control (-actin). Numbers on the y axis represent the mean ratio between
protein core/-actin expression for each cell type, determined for four different cDNA dilutions. Amplified products from one initial cDNA dilution are depicted below
each panel for syndecan-4 (1:16), perlecan (1:16), versican (1:8), decorin (1:2), and -actin (same dilution as that of the respective protein core). ma, melan-a; D,
melan-a submitted to adhesion blockade for 24 hours. ANOVA tests were used for statistical analysis.
238 Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al.
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
were not tumorigenic in vivo, suggesting that transformed
cells are not initially present in the parental cell line (not
shown) and that repeated adhesion blockade is important to
induce malignant phenotype. Epigenetic modifications are
the most probable candidates to explain the myriad of
morphologic and molecular alterations observed after re-
peated deadhesion cycles, and preliminary results from
ongoing experiments in our laboratory indicate that such is
the case, indeed.
Stressful conditions resulting from cell –cell and cell –
substrate adhesion modifications have previously been
associated with malignant transformation. Rubin [27] has
consistently shown that high-density cultures yield tumori-
genic clones, which he attributes to clonal selection, without
excluding a direct effect of adhesion alterations in the carci-
nogenic process. Another group has shown that the forced
anchorage-independent growth of a nontumorigenic, immor-
talized epithelial cell line resulted in the acquisition of an
anoikis-resistant phenotype and in tumorigenesis [28]. As
demonstrated by Zhu et al. [29], selected anoikis-resistant
melanoma cells showed increased metastatic potential and
multiple alterations in their phenotypic properties. Diaz-
Montero and McIntyre [30] obtained anoikis resistance osteo-
sarcoma sublines through modifications of culture conditions,
attributing this phenotype to epigenetic events. Ongoing re-
search in our laboratory has shown that adhesion alterations
can also induce malignant transformation in the fibroblast
cell line NIH 3T3, implying adhesion loss as a crucial factor
for carcinogenesis in different cell types.
Interestingly, the proportion of spheroid formation for each
cell line (melan-a and derived lineages; Table 1) resembles
the percentage of soft agar cell growth from different phases
of melanocyte transformation [31], where melan-a corre-
sponds to dysplastic lesions and Tm melanoma cells corre-
spond to invasive melanoma. These results reinforce the
idea that the cell lines utilized in this work truly represent a
continuum along the transformation process.
Integrins, which are the most important class of adhesion
molecules related to ECM interactions, have been shown in
most cellular types to impart survival signals on adhesion to
substrate and surface clustering [32,33]. However, Lewis
et al. [34] showed that loss of integrin-mediated cell adhesion
may abrogate cell death in cells submitted to DNA damage,
through p19
Arf
and p53 signaling. In melan-a– derived cell
lines, no modification of b
1
, b
3
, a
5
, a
6
, and a
v
integrin ex-
pression was detected (not shown). Nevertheless, an elec-
trophoretic migration shift was observed for b
1
integrin
chain (Figure 3D), which has been demonstrated by sev-
eral groups, including ours, to be related to an aberrant
N-glycosylation pattern [35,36]. This alteration, caused by
GnT-V overexpression, is associated with acquisition of
migratory phenotype and tumor progression [37]. The forced
expression of GnT-V results in decreased fibronectin attach-
ment of colon carcinoma cells [38] possibly caused by
aberrant b
1
integrin chain glycosylation [35], but this same,
the glycosylation pattern was associated with increased
fibronectin adhesion (Figure 2B) in the melanoma cell lines
presented here.
Although GnT-V expression was not investigated, a
marked increase of its products (GlcNAcb1,6Mana1,6–
branched surface molecules) was demonstrated for all
melan-a–derived cell lines in a progressive manner during
the transformation process (Figure 3, A and B). A qualita-
tive alteration in the N-glycosylation protein profile was
demonstrated for melanoma cells derived from melan-a
(Figure 3C). The above studies and our findings suggest
that GnT-V activity is causally associated with malignant
transformation because melan-a cells submitted to sequen-
tial deadhesion cycles (but not yet tumorigenic) already
show augmented levels of tri-antennary and tetra-antennary
N-glycan products.
Even though it is quite clear that several tumors accumu-
late glycoproteins bearing b1 – 6–branched N-linked oligo-
saccharides recognized by L-PHA, the precise function of this
altered pattern of glycosylation in glycoprotein function
remains elusive. An interesting hypothesis considering
GnT-V as a transforming enzyme was proposed by Dennis
et al. [39], who had initially shown that its forced expres-
sion in a nontumorigenic cell line could convert those cells
capable of forming tumors in nude mice [40]. Based on more
recent studies, Morgan et al. [41] proposed that growth
factor and cytokine receptors, which are also modified by
GnT-V, exist as lattices on the cell surface. Maintenance of
these lattices would depend on extracellular glycan-binding
proteins, such as galectins. Complexes of glycoproteins and
lectins would render cells more sensitive to growth factors,
whose interaction with their cognate receptors usually lead
to receptor dimerization/oligomerization. If correct, the pre-
diction is that L-PHA binding correlates with autonomous
growth. Integrins [35,42,43] and cadherins [44,45] are also
substrates of GnT-V. Similarly to integrins, no differences
in cadherin expression were detected by serial analysis of
gene expression [46], RT-PCR, or Western blot analysis
(data not shown). The higher adhesiveness of tumorigenic
cell lines (4C11 and Tm5), both to fibronectin and laminin
(Figure 2, B and C), could be attributed to this aberrant
glycosylation pattern present in b
1
integrin chains. However,
the true impact of this pattern of glycosylation in this model
warrants further investigation.
PGs, another class of surface molecules, are also in-
volved in neoplastic transformation in several cell types. HS
and CS have been particularly implicated in tumor formation,
including melanoma, because of their capacity to bind and
modulate a large number of molecules that are important for
tumor development, such as basic fibroblast growth factor
and vascular endothelial growth factor [47]. HS may either
promote or inhibit tumor progression, depending on heparan
fragments generated on digestion [48]. In our model, the ex-
pression of HS was significantly decreased after transfor-
mation, although no structural modifications were discernible
(Figure 4; Table 2). In parallel, an increased expression of
heparanase was demonstrated not only in melan-a–derived
melanoma cell lines, but also in melan-a maintained in sus-
pension for 24 hours, indicating that heparanase may con-
tribute to early changes involved in melan-a transformation.
Using a different approach for the detection of heparanase
Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al. 239
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
in different melanoma cell lines, an increase in enzymatic
activity was related to a higher metastatic phenotype [49].
However, CS/DS levels were similar in both nontumorigenic
and tumorigenic cell lines, but their disaccharide composition
was clearly different from the parental cell lineage (Figure 4;
Table 3). It is clear that transformation leads to an increase in
the relative amounts of a-
L-iduronic acid, suggesting a pos-
sible upregulation of the b-
D-glucuronic acid C-5-epimerase.
Furthermore, during transformation, the glucuronic acid –
containing disaccharides show the presence of N-acetylga-
lactosamine-6-O-sulfate, contrasting with the parental line
that bears only N-acetylgalactosamine-4-O-sulfate, indicat-
ing that malignant transformation leads to the expression
of N-acetylgalactosamine 6-O-sulfotransferase, as previ-
ously observed in brain tumors [50].
In addition, the protein core expression levels of some
PG subclasses were determined by semiquantitative RT-
PCR. As shown in Figure 5, perlecan levels increase during
transformation, decorin and versican levels decrease, and
syndecan-4 level does not change. Among extracellular
PGs, decorin has emerged as an inhibitor of tumor progres-
sion, whereas perlecan seems to be a promoter of this pro-
cess [51,52]. Perlecan apparently supports the growth
and invasion of tumor cells through its ability to store angio-
genic factors [53]. This last observation also corroborates
our hypothesis that melan-a –derived melanoma cell lines
were not selected by multiple cycles of adhesion blockade
because perlecan increased during the transformation pro-
cess even in the absence of a selective pressure related
to angiogenesis.
Our model of melanocyte carcinogenesis allows the iden-
tification of morphologic and molecular alterations that
precede full malignant transformation and reinforce micro-
environmental role as a transforming factor, particularly the
loss of cell– substrate adhesion.
References
[1] Oliveria S, Dusza S, and Berwick M (2001). Issues in the epidemiology
of melanoma. Expert Rev Anticancer Ther 1, 453 – 459.
[2] Houghton AN and Polsky D (2002). Focus on melanoma. Cancer Cell
2, 275 – 278.
[3] Elder DE, Greene MH, Bond EE, and Clark WH (1981). Acquired
melanocytic nevi and melanoma: the dysplastic nevis syndrome. In
Ackerman, AB (Ed), Pa tholo gy of Malig nant Melan oma.NewYork:
Masson, pp. 185 – 215.
[4] Gruber SB, Barnhill RL, Stenn KS, and Roush GC (1989). Nevomela-
nocytic proliferations in association with cutaneous malignant mela-
noma: a multivariate analysis. J Am Acad Dermatol 21, 733 – 780.
[5] Clark WH Jr, Elder DE, Guerry D IV, Epstein MN, Greene MH, and Van
Horn M (1984). A study of tumor progression: the precursor lesions of
superficial spreading and nodular melanoma. Hum Pathol 15 (12),
1147 – 1165.
[6] Hsu MY, Meier FE, Nesbit M, Hsu JY, Van Belle P, Elder DE, and
Herlyn M (2000). E-cadherin expression in melanoma cells restores
keratinocyte-mediated growth control and down-regulates expression of
invasion-related adhesion receptors. Am J Pathol 156 (5), 1515 – 1525.
[7] Bogenrieder T and Herlyn M (2002). Cell-surface proteolysis, growth
factor activation and intercellular communication in the progression of
melanoma. Crit Rev Oncol Hematol 44, 1 – 15.
[8] Li G, Satyamoorthy K, and Herlyn M (2002). Dynamics of cell inter-
actions and communications during melanoma development. Crit Rev
Oral Biol Med 13, 62 – 70.
[9] Herlyn M, Padarathsingh M, Chin L, Hendrix M, Becker D, Nelson M,
DeClerck Y, McCarthy J, and Mohla S (2002). New approaches to the
biology of melanoma: a workshop of the National Institutes of Health
Pathology B Study Section. Am J Pathol 161 (5), 1949 – 1957.
[10] Hendrix MJ, Seftor EA, Kirschmann DA, Quaranta V, and Seftor RE
(2003). Remodeling of the microenvironment by aggressive melanoma
tumor cells. Ann NY Acad Sci 995, 151 – 161.
[11] Grossmann J (2002). Molecular mechanisms of ‘‘detachment-induced
apoptosis—Anoikis’’. Apoptosis 7, 247 – 260.
[12] Bennett DC, Cooper PJ, and Hart IR (1987). A line of non-tumorigenic
mouse melanocytes, syngeneic with the B16 melanoma and requiring
a tumour promoter for growth. Int J Cancer 39, 414 – 418.
[13] Mosmann T (1983). Rapid colorimetric assay for growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods
65, 55 – 63.
[14] Porcionatto MA, Moreira CR, Lotfi CF, Armelin HA, Dietrich CP, and
Nader HB (1998). Stimulation of heparan sulfate proteoglycan syn-
thesis and secretion during G1 phase induced by growth factors and
PMA. J Cell Biochem 70 (4), 563 – 572.
[15] Nader HB, Dietrich CP, Buonassisi V, and Colburn P (1987). Heparin
sequences in the heparan sulfate chains of an endothelial cell proteo-
glycan. Proc Natl Acad Sci USA 84, 3565 – 3569.
[16] Nader HB, Buonassisi V, Colburn P, and Dietrich CP (1989). Heparin
stimulates the synthesis and modifies the sulfation pattern of hep-
aran sulfate proteoglycan from endothelial cells. J Cell Physiol 140,
305 – 310.
[17] Nader HB, Porcionatto MA, Tersariol IL, Pinhal MA, Oliveira FW,
Moraes CT, and Dietrich CP (1990). Purification and substrate specific-
ity of heparitinase I and heparitinase II from Flavobacterium heparinum.
Analyses of the heparin and heparan sulfate degradation products by
13
C NMR spectroscopy. J Biol Chem 265, 16807 – 16813.
[18] Nader HB, Kobayashi EY, Chavante SF, Tersariol IL, Castro RA, Shinjo
SK, Naggi A, Torri G, Casu B, and Dietrich CP (1999). New insights on the
specificity of heparin and heparan sulfate lyases from Flavobacterium
heparinum revealed by the use of synthetic derivatives of K5 poly-
saccharide from E. coli and 2-O-desulfated heparin. Glycoconj J 16,
265 – 270.
[19] Mufson RA, Fisher PB, and Weinstein IB (1979). Effect of phorbol ester
tumor promoters on the expression of melanogenesis in B-16 mela-
noma cells. Cancer Res 39 (10), 3915 – 3919.
[20] Hynes RO (2002). Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines.
Cell 110, 673 – 687.
[21] Gu J and Taniguchi N (2004). Regulation of integrin functions by
N-glycans. Glycoconj J 21, 9 – 15.
[22] Cohen IR, Murdoch AD, Naso MF, Marchetti D, Berd D, and Iozzo RV
(1994). Abnormal expression of perlecan proteoglycan in metastatic
melanomas. Cancer Res 54, 5771 – 5774.
[23] Hullet MD, Freeman C, Hamdorf BJ, Baker RT, Harris MJ, and Parish
CR (1999). Cloning of mammalian heparanase, an important enzyme
in tumor invasion metastasis. Nat Med 5 (7), 803 – 809.
[24] Vlodavsky I, Elkin M, Pappo O, Aingora H, Atzmon R, Ishai-Michaeli R,
Avi A, Pecker I, and Friedmann Y (2000). Mammalian heparanase as
mediator of tumor metastasis and angiogenesis. Isr Med Assoc J 2,
37 – 45.
[25] Vlodavsky I and Friedmann Y (2001). Molecular properties and involve-
ment of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. J Clin
Invest 108, 341 – 347.
[26] Correa M, Machado J Jr, Carneiro CR, Pesquero JB, Bader M,
Travassos LR, Chammas R, and Jasiulionis MG (2005). Transient in-
flammatory response induced by apoptotic cells is an important medi-
ator of melanoma cell engraftment and growth. Int J Cancer 114 (3),
356 – 363.
[27] Rubin H (2001). Selected cell and selective microenvironment in neo-
plastic development. Cancer Res 61, 799 – 807.
[28] Rak J, Mitsuhashi Y, Sheehan C, Krestow JK, Florenes VA, Filmus J,
and Kerbel RS (1999). Collateral expression of proangiogenic and
tumorigenic properties in intestinal epithelial cell variants selected for
resistance to anoikis. Neoplasia 1 (1), 23 – 30.
[29] Zhu Z, Sanchez-Sweatman O, Huang X, Wiltrout R, Khokha R, Zhao Q,
and Gorelik E (2001). Anoikis and metastatic potential of Cloudman
S91 melanoma cells. Cancer Res 61, 1707 – 1716.
[30] Diaz-Montero CM and McIntyre BW (2003). Acquisition of anoikis
resistance in human osteosarcoma cells. Eu r J Cancer 39 (16),
2395 – 2402.
[31] Herlyn M, Clark WH, Rodeck U, Mancianti ML, Jambrosic J, and
Koprowski H (1987). Biology of tumor progression in human melano-
cytes. Lab Invest 56, 461 – 474.
[32] Krengel S, Stark I, Geuchen C, Knoppe B, Scheel G, Schlenke P, Gebert
240 Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al.
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
A, Wunsch L, Brinckmann J, and Tronnier M (2005). Selective down-
regulation of the alpha6-integrin subunit in melanocytes by UVB light.
Exp Dermatol 14 (6), 411 – 419.
[33] Guo W and Giancotti FG (2004). Integrin signalling during tumour pro-
gression. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 816 – 826.
[34] Lewis JM, Truong TN, and Schwartz MA (2002). Integrins regulate the
apoptotic response to DNA damage through modulation of p53. Proc
Natl Acad Sci USA 99 (6), 3627 – 3632.
[35] Guo HB, Lee I, Kamar M, Akiyama SK, and Pierce M (2002). Aberrant
N-glycosylation of b
1
integrin causes reduced a
5
b1 integrin clustering
and stimulates cell migration. Cancer Res 62, 6837 – 6845.
[36] Jasiulionis MG, Chammas R, Ventura AM, Travassos LR, and Brentani RR
(1996). Alpha6beta1-integrin, a major cell surface carrier of beta1– 6 –
branched oligosaccharides, mediates migration of EJ-ras– transformed
fibroblasts on laminin-1 independently of its glycosylation state. Cancer
Res 56 (7), 1682– 1689.
[37] Guo P, Wang QY, Guo HB, Shen ZH, and Chen HL (2004). N-acetyl-
glucosaminyltransferase V modifies the signaling pathway of epidermal
growth factor receptor. Cell Mol Life Sci 61, 1795 – 1804.
[38] Murata K, Miyoshi E, Ihara S, Noura S, Kameyama M, Ishikawa O, Doki
Y, Yamada T, Ohigashi H, Sasaki Y, et al. (2004). Attachment of
human colon cancer cells to vascular endothelium is enhanced by N-
acetylglucosaminyltransferase V. Oncology 66, 492 – 501.
[39] Dennis JW, Granovsky M, and Warren CE (1999). Glycoprotein gly-
cosylation and cancer progression. Biochim Biophys Acta 1473 (1),
21 – 34.
[40] Demetriou M, Nabi IR, Coppolino M, Dedhar S, and Dennis JW (1995).
Reduced contact-inhibition and substratum adhesion in epithelial cells
expressing GlcNAc-transferase V. J Cell Biol 130, 383 – 392.
[41] Morgan R, Gao G, Pawling J, Dennis JW, Demetriou M, and Li B (2004).
N-acetylglucosaminyltransferase V (Mgat5) – mediated N-glycosylation
negatively regulates Th1 cytokine production by T cells. J Immunol 173
(12), 7200 – 7208.
[42] Chammas R, Veiga SS, Travassos LR, and Brentani RR (1993).
Functionally distinct roles for glycosylation of alpha and beta integrin
chains in cell – matrix interactions. Proc Natl Acad Sci USA 90 (5),
1795 – 1799.
[43] Bellis SL (2004). Variant glycosylation: an underappreciated regulatory
mechanism for beta1 integrins. Biochim Biophys Acta 1663 (1 – 2),
52 – 60.
[44] Guo HB, Lee I, Kamar M, and Pierce M (2003). N-acetylglucosaminyl-
transferase V expression levels regulate cadherin-associated homo-
typic cell – cell adhesion and intracellular signaling pathways. JBiol
Chem 278 (52), 52412 – 52424.
[45] Przybylo M, Hoja-Lukowicz D, Litynska A, and Laidler P (2002). Dif-
ferent glycosylation of cadherins from human bladder non-malignant
and cancer cell lines. Cancer Cell Int 2, 6 – 10.
[46] De Souza GA, Godoy LMF, Teixeira VR, Otake AH, Sabino A, Rosa JC,
Dinarte AR, Pinheiro DG, Silva WA Jr, Eberlin MN, et al. (2006). Pro-
teomic and SAGE profiling of murine melanoma progression indicates
the reduction of proteins responsible for ROS degradation. Proteomics
6 (in press).
[47] Sasisekharan R, Shriver Z, Venkataraman G, and Narayanasami U
(2002). Roles of heparan-sulfate glycosaminoglycans in cancer. Nat
Rev Cancer 2, 521 – 528.
[48] Liu D, Shriver Z, Venkataraman G, El Shabrawi Y, and Sasikharan R
(2002). Tumor cell surface heparin sulfate as cryptic promoters or in-
hibitors of tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci USA 99,
568 – 573.
[49] Staquicini FI, Moreira CR, Nascimento FD, Tersariol IL, Nader HB,
Dietrich CP, and Lopes JD (2003). Enzyme and integrin expression
by high and low metastatic melanoma cell lines. Melanoma Res 13,
11 – 18.
[50] Dietrich CP, Schibuola CT, Sampaio LO, and Ibara I (1978). Changes in
the composition of sulfated mucopolysaccharides during neoplastic
transformation of cerebral tissue. Cancer Res 38, 3969 – 3971.
[51] Sharma B, Handler M, Eichstetter I, Whitelock JM, Nugent MA, and
Iozzo RV (1998). Antisense targeting of perlecan blocks tumor growth
and angiogenesis in vivo. J Clin Invest 102, 1599 – 1608.
[52] Timar J, Lapis K, Dudas J, Sebestyen A, Kopper L, and Kovalszky I
(2002). Proteoglycans and tumor progression: Janus-faced molecules
with contradictory functions in cancer. Semin Cancer Biol 12, 171 – 173.
[53] Iozzo RV, Cohen IR, Grassel S, and Murdoch AD (1994). The biology
of perlecan: the multifaceted heparan sulfate proteoglycan of base-
ment membranes and pericellular matrices. Biochem J 302 (Part 3),
625 – 639.
Adhesion Loss and Melanocyte Transformation Oba-Shinjo et al. 241
Neoplasia . Vol. 8, No. 3, 2006
10.1101/gr.2111304Access the most recent version at doi:
2004 14: 1413-1423Genome Res.
The LudwigFAPESP Transcript Finishing Initiative, Mari Cleide Sogayar and Anamaria A. Camargo
Transcriptome
A Transcript Finishing Initiative for Closing Gaps in the Human
Material
Supplemental
http://genome.cshlp.org/content/suppl/2004/07/02/2111304.DC1.html
References
http://genome.cshlp.org/content/14/7/1413.full.html#related-urls
Article cited in:
http://genome.cshlp.org/content/14/7/1413.full.html#ref-list-1
This article cites 65 articles, 41 of which can be accessed free at:
service
Email alerting
click heretop right corner of the article or
Receive free email alerts when new articles cite this article - sign up in the box at the
http://genome.cshlp.org/subscriptions/
go to:Genome ResearchTo subscribe to
Cold Spring Harbor Laboratory Press
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
A Transcript Finishing Initiative for Closing Gaps
in the Human Transcriptome
The Ludwig–FAPESP Transcript Finishing Initiative,
1
Mari Cleide Sogayar,
2
and
Anamaria A. Camargo
2
We report the results of a transcript finishing initiative, undertaken for the purpose of identifying and characterizing
novel human transcripts, in which RT-PCR was used to bridge gaps between paired EST clusters, mapped against the
genomic sequence. Each pair of EST clusters selected for experimental validation was designated a transcript finishing
unit (TFU). A total of 489 TFUs were selected for validation, and an overall efficiency of 43.1% was achieved. We
generated a total of 59,975 bp of transcribed sequences organized into 432 exons, contributing to the definition of
the structure of 211 human transcripts. The structure of several transcripts reported here was confirmed during the
course of this project, through the generation of their corresponding full-length cDNA sequences. Nevertheless, for
21% of the validated TFUs, a full-length cDNA sequence is not yet available in public databases, and the structure of
69.2% of these TFUs was not correctly predicted by computer programs. The TF strategy provides a significant
contribution to the definition of the complete catalog of human genes and transcripts, because it appears to be
particularly useful for identification of low abundance transcripts expressed in a restricted set of tissues as well as for
the delineation of gene boundaries and alternatively spliced isoforms.
[Supplemental material is available online at www.genome.org. The sequence data from this study have been
submitted to GenBank under accession nos. CF272536–CF272733.]
A primary objective of the Human Genome Project has been the
identification of the complete set of human genes and their de-
rived transcripts. A major step towards this goal was achieved at
the beginning of 2001 with the publication of two independent
draft versions of the human genome sequence and the identifi-
cation of >30,000 genes (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001).
However, it became apparent that extracting exonic sequences
directly from the human genome is not straightforward and that
a variety of complementary strategies are required for gene iden-
tification and characterization.
In this context, microarrays (Penn et al. 2000; Dennis 2001;
Schoemaker et al. 2001; Kapranov et al. 2002) and sequence com-
parisons with other organisms at an appropriate evolutionary
distance (Batzoglou et al. 2000; Roest et al. 2000) constitute pow-
erful preliminary approaches to identifying transcribed regions
within the genome sequence. Nevertheless, transcript sequenc-
ing is necessary both for the final proof of the existence of an
expressed gene and for the precise identification of intron/exon
boundaries and alternatively spliced forms (Camargo et al. 2002).
A full-length cDNA sequence, ideally including a transcrip-
tion initiation site and a polyadenylation site, is the gold stan-
dard for transcript definition. Considerable progress has been
made in the generation of representative full-length cDNA se-
quences (Strausberg et al. 1999, 2002; Wiemann et al. 2001;
Kikuno et al. 2002; Nakajima et al. 2002), especially following the
development of sophisticated protocols for obtaining full-length
transcript molecules and to correct for transcript expression bias
(Bonaldo et al. 1996, Carninci et al. 2000).
Expressed sequence tags (ESTs) are another major source of
transcript sequence. ESTs either are single-pass, partial sequences
derived either from the 5Ј and 3Ј extremities of cDNA clones
(Adams et al. 1991) or are specifically directed towards the central
coding regions of transcripts, in the case of open reading frame
ESTs (ORESTES; Dias et al. 2000; Camargo et al. 2001). Initially,
ESTs were exploited as a source for gene discovery (Adams et al.
1992, 1993), but they have also been widely used to build tissue-
specific transcript profiles (Bortoluzzi et al. 2000a,b,c; Hu-
miniecki and Bicknell, 2000; Phillips et al. 2000; Yu et al. 2001;
Katsanis et al. 2002; Megy et al. 2003), to construct gene-based
physical maps (Hudson et al. 1994), to compare genomes of dif-
ferent organisms (Tugendreich et al. 1994; Lee et al. 2002), to
accurately identify transcripts in genomic sequences (Bailey et al.
1998; Jiang and Jacob 1998; Kan et al. 2001), and to study aspects
of mRNA structure, such as splicing variants (Hide et al. 2001;
Modrek et al. 2001; Clark and Thanaraj 2002; Kan et al. 2002; Xie
et al. 2002; Xu et al. 2002; Wang et al. 2003), alternative poly-
adenylation (Gautheret et al. 1998; Beaudoing and Gautheret
2001; Iseli et al. 2002), and single nucleotide polymorphisms
(Garg et al. 1999; Picoult-Newberg et al. 1999; Clifford et al. 2000;
Irizarry et al. 2000; Hu et al. 2002).
To date, >5,200,000 human ESTs have been generated from
different organs and tissues, deriving mainly from the Merck
Gene Index Project (Williamson 1999), the Cancer Genome
Anatomy Project (CGAP; Strausberg et al. 2000), and the Human
Cancer Genome Project Ludwig/FAPESP (HCGP; Dias et al. 2000;
Camargo et al. 2001). Nevertheless, it is widely recognized that
EST databases are subjected to artifacts related to the partial, low-
quality nature of the sequences and the presence of various kinds
of contamination (Sorek and Safer 2003). In addition, because of
the large differences in abundance between RNA species, the cov-
erage of individual transcripts by ESTs is highly variable. Despite
that, it is believed that the vast majority of transcripts have been
sampled at least once by either a full-length cDNA or EST se-
quence (Ewing and Green 2000; Liang et al. 2000).
Although the amount of transcript data currently available
is not sufficient to identify all human genes, the judicious use of
1
A complete list of authors appears at the end of this manuscript.
2
Corresponding authors.
E-MAIL [email protected]; FAX 55-11-3207-7001.
E-MAIL [email protected]; FAX 55-11-3091-3820.
Article and publication are at http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/
gr.2111304. Article published online before print in June 2004.
Methods
14:1413–1423 ©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1088-9051/04; www.genome.org Genome Research 1413
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
this data set, in conjunction with the draft sequences of the hu-
man genome, has been highly informative in the characteriza-
tion of new human genes (Reymond et al. 2002; Silva et al. 2003).
Here we describe the utilization of a transcriptome database to
guide the generation of novel human transcript sequences on a
genome-wide basis. By using the genomic sequence as a scaffold
for EST mapping and clustering, we have used RT-PCR to bridge
gaps between EST clusters that we judged as likely to be derived
from the same genes. The resulting novel sequence confirms that
the ESTs from different clusters are, in fact, derived from a com-
mon transcript and defines the intervening region between
them.
Because this process is very similar to the finishing phase of
genome projects, we called it transcript finishing (TF). This pow-
erful, albeit laborious, approach allows the characterization of
novel human transcripts and splicing isoforms, which appear to
be generally expressed at a low abundance level and/or in a re-
stricted set of tissues and avoids the necessity of a full-length
cDNA clone in order to confirm the structure of a gene.
RESULTS
Generation of the Transcriptome Database and EST
Cluster Selection for Experimental Validation
We have used the publicly available human genome and tran-
script sequences to identify and experimentally validate addi-
tional transcribed regions in the human genome. The two data
sets were integrated into the transcriptome database by using the
BLASTN program to map all transcript sequences onto the as-
sembled version of the human genome available from the Na-
tional Center for Biotechonology Information (NCBI). We have
also mapped to the genome, using the raw data generated by EST
sequencing projects, a set of trusted 3Јtags that provide unique
identifiers for transcript 3Ј ends (Iseli et al. 2002). The tags were
used for positional orientation and as a start point for transcript
reconstruction. To facilitate visualization of the alignments and
the access to information such as project and tissue source of the
sequences, alignment scores, and the position of 3Јtags, a graphi-
cal interface was also developed (Fig. 1).
We identified 244,148 human transcript clusters, of which
14,598 contained at least one full-length cDNA sequence, and
229,550 clusters that were composed exclusively of partial tran-
script sequences. Of the set of 14,598 clusters containing full-
length sequences, 13,149 (90%) had at least one corresponding
EST, and the remaining 1449 (10%) were composed only of full-
length cDNA sequences. These data demonstrate that, despite the
fact that >5 million EST sequences are available, they do not fully
cover the human transcriptome and that the generation of addi-
tional transcribed sequences is still required.
It is noteworthy that clusters composed exclusively by ESTs
have a reduced number of sequences (average, 5.9 sequences)
derived from fewer different tissues (average, 3.0), compared with
clusters containing a full-length cDNA, which have an average of
Figure 1 TFI graphical interface. The TFI graphical interface displays a region of the human genome sequence as a yellow line, with a scale in base
pairs (bp). Expressed sequence tags (ESTs) that align with the genome sequence are shown in different colors, depending on the project of origin:
ORESTES from the FAPESP/LICR Human Cancer Genome Project in purple; CGAP in green, MGC in blue, and TFI in yellow, with splicing structures
represented as gray lines. The interface shows an experimentally validated TFU (number 171) joining two EST clusters. The TFI interface also provides
information on the tissue of origin of the transcript sequences, the percentage of similarity of each exon with the human genome sequence, and the
presence of 3Ј tags represented as green triangles.
Camargo et al.
1414 Genome Research
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
65.5 sequences derived from eight different tissues. Based on
these observations, we conclude that the human transcripts that
remain to be defined are expressed at low levels in a restricted set
of tissues and that their characterization will benefit from a direct
approach such as the TF.
Because EST databases contain a significant fraction of arti-
factual and contaminant sequences, we selected, for experimen-
tal validation, pairs of clusters that consist of ESTs that align
noncontiguously to the genome, consistent with the presence of
a splicing structure. We also restricted our validation to pairs of
clusters that map at a maximum distance of 10 kb from each
other, in order to increase the probability that these clusters be-
long to the same transcript. By using these criteria, a total of 2373
pairs of clusters (∼2% of the total number of clusters composed of
partial sequences) were initially selected and subjected to manual
inspection using our graphical interface.
Manual inspection allowed the assessment of similarity and
extension of the alignments, as well as the position of the se-
lected pair of clusters relative to the 3’tags. Following this proce-
dure, a subset of 489 pairs of clusters was initially selected for
experimental validation. The number of clusters eliminated by
manual inspection was very low; therefore, the 489 pairs of clus-
ters selected for experimental validation can be considered an
unbiased sample of the 2373 initially selected clusters. Clusters
selected for validation were separated from each other by an av-
erage 2879 bp of intervening genomic sequence and were com-
posed by an average of 5.92 EST sequences derived from an av-
erage of three distinct tissues. Each pair of EST clusters selected
for experimental validation was designated as a single TF unit
(TFU). Information related to the 489 TFUs selected for validation
can be accessed at http://200.18.51.201/viewtfi.
Experimental Validation and the Generation of New
Transcribed Sequences
A general overview of the computational and experimental vali-
dation strategies is presented in Figure 2. A total of two coordi-
nation groups, four bioinformatics groups, and 29 validation
laboratories, linked through the Internet, participated in the
computational and experimental phase of the project (http://
200.18.51.201/transcript/Participants.html). Following cluster
selection and manual inspection, primers for RT-PCR validation
of each TFU were designed automatically. The genomic sequence
was chosen as a template for primer design because it is generally
of a higher quality than are EST sequences. cDNA preparation
was also a critical issue, because both the quality and the repre-
sentation of different tissues directly influence the validation ef-
ficiency. As an indicator of genomic DNA contamination, the
total RNA preparations were subjected to PCR amplification by
using primers within intronic sequences flanking the exon 12 of
the MLH1 gene and found to be negative. The quality of the
cDNA product was demonstrated by PCR amplification of se-
quences located at the 5Ј extremity of the NOTCH2 transcript (a
long transcript of 11.4 Kb). A total of 22 cDNA preparations,
derived from a number of cell lines and representing 18 distinct
tissues, were used.
The total of 3019 sequences, generated during the project,
was subjected to an automated cleaning protocol. High-quality
sequences were aligned against the genomic sequence, and the
alignment coordinates and scores for validated sequences were
loaded into the transcriptome database and displayed on the
graphical interface (Fig. 1). We successfully validated 211 of the
489 TFUs that were distributed, yielding an overall validation
efficiency of 43.1%.
A single pair of primers was tested for each TFU, and experi-
mental validation was undertaken in a high-throughput single-
pass format. Few modifications were adopted when a positive
amplification was not achieved (see Methods). To estimate the
false-negative amplification rate of the TF strategy, we deter-
mined the number of the nonvalidated TFUs for which a full-
length cDNA sequence had been made available by other se-
quencing projects during the course of our project. For 40 of the
nonvalidated TFUs, we were able to identify a full-length se-
quence linking the two EST clusters initially
selected for validation. Thus, these cases
can be considered to be false-negative am-
plifications. For 118 of the nonvalidated
TFUs, the existence of a full-length se-
quence matching just one of the two se-
lected clusters allowed us to conclude that
the two clusters were in fact part of differ-
ent transcripts. For these cases, the absence
of an RT-PCR product thus reflects true
negatives. For the 120 of the remaining
nonvalidated TFUs, a conclusive result
could not identify any corresponding full-
length sequence. Therefore, based on these
results, we can estimate that the rate of
false-negative amplifications in the TF strat-
egy is ∼25% (40/158 nonvalidated TFUs).
In addition, to identify variables re-
lated to the expression pattern of the novel
transcripts that influence the efficiency of
validation, two sets composed of 174 vali-
dated TFUs and 208 nonvalidated TFUs
were compared. As shown in Table 1, the
validated TFUs had, on average, more ESTs
in each cluster derived from a larger num-
ber of different tissues. Both of these differ-
ences were statistically significant accord-
ing to Mann-Whitney tests, indicating that
a higher expression level and a broader ex-
pression pattern of the selected transcripts
Figure 2 General scheme of the TFI strategy. Schematic outline of the strategy used for compu-
tational and experimental validation of TFU sequences. Following the development of bioinformat-
ics tools, the generation of the transcriptome database, and automatic cluster selection, the project
tasks were divided between the coordination and the validation laboratories.
Transcribed Regions in the Human Genome
Genome Research 1415
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
favored validation. The presence of ESTs derived from the same
tissue in both clusters did not influence the likelihood of valida-
tion according to ␹
2
tests.
A total of 59,975 bp of transcribed sequence, organized into
432 exons, were generated, contributing to the definition of the
structure of 211 distinct human transcripts. Each validated TFU
had a mean of 281.6 bp and a median of 207 bp of novel se-
quence not represented by the original EST clusters and a mean
of 2.03 and a median of two newly defined exons. The validated
TFU sequences have been submitted to GenBank under the ac-
cession numbers CF272536 to CF272733, which are provided as
Supplemental Table 1.
Consensus Sequences Generation and Annotation
of the Validated Human Transcripts
Consensus sequences produced by assembling the sequences de-
rived from the validation fragment and the sequences from all
ESTs in both clusters were obtained for 186 of the 211 validated
TFUs. Assembly of a consensus sequence was not possible for
25 TFUs, due mainly to the presence of repetitive sequences
and alternative splicing forms. Consensus sequences, with an
average of 1240 bp, can be accessed at (http://200.18.51.201/
viewconsensus/).
Consensus sequences derived from the validated TFUs were
aligned to the July 2003 version of human genome sequence
assembly provided by the University of California, Santa Cruz
(UCSC), using the BLAT search tool (http://genome.ucsc.edu/cgi-
bin/hgBlat) to compare the validated consensus sequences with
known genes and gene predictions (Table 2). A significant frac-
tion (68.8%) of the validated transcripts completely overlapped
with the alignment coordinates of a known gene or full-length
human mRNA submitted to the GenBank during the course of
our project (Fig. 3A), and a smaller fraction (10.2%) represented
extensions (mostly 5Ј) to partial cDNA sequences deposited in
public databases (Fig. 3B). However, for 21% of the validated
TFUs, a full-length cDNA sequence was not available in public
databases as of July 2003. The structure of the majority (69.2%) of
the validated TFUS without a corresponding full-length cDNA
sequence had not been correctly predicted by ab initio gene pre-
diction programs such as Fgenesh++, Geneid, and GenScan.
These TFUs can thus be considered as new human transcripts.
The consensus sequences corresponding to new human
transcripts were further characterized by BLASTX analysis, and
protein domains were predicted by using the Pfam and Prosite
databases. Of the 39 consensus sequences representing new hu-
man transcripts, 27 (69.2%) contained an ORF of at least 100
amino acids, and eight (20.5%) contained a clearly defined pro-
tein domain including three IG-like domains and a protein ki-
nase. Complete information on the characterization of the vali-
dated TFUs, including consensus size, annotation, chromosomal
location, and expression pattern based on ESTs distribution, are
provided as Supplemental Table 2.
The validated transcripts that completely overlapped with
the alignment coordinates of a known gene containing a defined
ORF were used to estimate the percentage of consensus sequences
that represent complete transcripts. Only a small fraction (9.7%)
of the 93 validated TFUs analyzed contained a complete ORF.
The low percentage obtained was expected because, in the TF
strategy, RT-PCR is used to brigde gaps between partial transcript
sequences.
Identification and Experimental Validation
of Alternatively Spliced Isoforms
Several reports have suggested that at least 30% to 35% of human
genes undergo alternative splicing (Brett et al. 2000; Modrek et al.
2001); nevertheless, this value is probably underestimated be-
cause many cell types have not yet been fully explored by cDNA
sequencing. The use of different cDNA sources during the experi-
mental validation phase of the new human transcripts allowed us
to identify many new splicing variants. We explored the degree
of sequence variability due to alternative splicing in the set of
186 consensus sequences that we generated and found evidence
for alternative splicing in 22 (12%) cases (Table 3). Intron reten-
tion was observed in 11 TFUs, and alternative exon usage was
detected in 11 of the 22 TFUs with alternative splicing. Con-
served GT-AG splice junctions were present in all TFUs with al-
ternative exon usage. The possibility of genomic DNA contami-
nation, in those cases in which we have observed the retention of
an intron, was excluded due to the presence of processed introns
in the same cDNA molecule containing the retained intron.
Moreover, the RNAs used for experimental validation of the al-
ternatively spliced forms have been treated with DNase and
tested for the absence of intronic sequences, as described in
Methods.
We selected six TFUs with alternative exon usage, represent-
ing a total of 14 splicing isoforms, for further experimental vali-
dation. Each pair of primers used for experimental validation of
the alternatively spliced forms was assayed against all 22 cDNA
sources, without pooling. Touchdown PCR confirmed 10 (83%)
of the putative investigated isoforms. No PCR amplification was
achieved for one TFU. Some splicing isoforms were expressed in
Table 1. Comparison Between Validated and Nonvalidated TFUs
Validated TFUs
(Std deviation)
Nonvalidated TFUs
(Std deviation) P value
Average distance between clusters 2609 (3202) 3105 (2942) 0.008
Average no. of ESTs in each cluster 6.10 (8.91) 5.77 (13.23) 0.010
Average no. of distinct tissues in each cluster 3.45 (4.27) 2.85 (4.54) 0.002
Presence of a common tissue in both clusters Yes 63 Yes 62 0.223
No 111 No 146
Table 2. Annotation of Validated Consensus
Categories
Number of
consensus
sequences
Percentage
(%)
Known gene 128 68.8
Extension of a known gene 19 10.2
New transcript w/total prediction 12 6.5
New transcript w/partial prediction 15 8.0
New transcript w/o prediction 12 6.5
Total 186 100
Camargo et al.
1416 Genome Research
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
a restricted pattern, being detected in one or a few of the tissues
analyzed by RT-PCR (data not shown). None of these splicing
isoforms had been previously identified, highlighting the poten-
tial use of the TF strategy for uncovering the genetic variability
generated at the transcriptome level.
A typical example of this experimental validation is illus-
trated in Figure 4. In this case, we were able to identify two
alternative exons, one of which presents an extra exon of 138 bp
and the other a 21-bp extension of an exon already represented
by EST sequences. The possible combination of these variants
results in four splicing isoforms. Figure 4 shows a 388-bp product
(obtained with primers P1 and P2) corresponding to the proto-
type isoform, a 370-bp product (primers P2 and P3) correspond-
ing to the isoform containing the additional exon, a 314-bp
product (primers P1 and P4) corresponding to the isoform with
the extended exon, and a 452-bp product corresponding to the
isoform containing both the additional exon and the extended
exon.
DISCUSSION
Currently, intense activity is directed toward defining the com-
plete set of genes and their derived transcripts in the human
genome. This information will have a profound impact in diverse
areas of biology such as human evolution, structural genomics,
and medicine. However, because of the highly dispersed and
complex structure of human genes, it is extremely difficult to
correctly identify transcribed regions within the genome (Ca-
margo et al. 2002).
Estimates based on gene prediction both within individual
finished chromosomes (Dunham et al. 1999; Hattori et al. 2000),
as well as in the draft human genome sequences (Lander et al.
Figure 3 Characterization and annotation of validated TFUs. Alignment of four consensus sequences, derived from the validated TFUs, to the July 2003
version of the UCSC human genome sequence assembly, using the BLAT search tool. (A) TFU00023 corresponds to YourSeq (black) completely
overlapping with known genes based on SWISS-PROT, TrEMBL, mRNA, and RefSeq (dark blue). (B) TFU01102 represents a 5Ј extension of a partial cDNA
(FLJ23834). (C) TFU01013 represents a new human transcript structure that was correctly predicted by ab initio gene predition transcripts, such as
Fgenesh++ (green). (D) TFU00125 represents a new human transcript with no predicted transcripts described by gene prediction programs.
Transcribed Regions in the Human Genome
Genome Research 1417
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
2001; Venter et al. 2001), have uniformly concluded that the
human genome possesses <35,000 genes. This number has been
supported by a preliminary analysis of EST coverage of known
genes (Ewing and Green 2000) as well as comparative genomics
analysis (Roest et al. 2000). Most of these 35,000 genes are al-
ready represented by a full-length cDNA sequence in transcript
databases. In UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
query.fcgi?db=unigene), for example, there are currently 28,412
transcript clusters represented by at least one full-length cDNA
sequence.
Here we have proposed and validated the use of the TF strat-
egy for characterization of new human transcripts that are only
partially represented by ESTs. Because EST databases contain a
significant fraction of artifactual and contaminant sequences, we
selected pairs of clusters for experimental validation that exhib-
ited a clear splicing structure when aligned to the genome. By
requiring the occurrence of splicing, the level of contamination
in the EST databases is significantly reduced, although at the
expense of eliminating many genuine 3Ј ESTs. The selection cri-
teria used in our initial analysis are very restrictive, and the adop-
tion of less stringent criteria (including clusters without a splic-
ing structure) will certainly be required to complete the catalog of
human genes using the strategy we described. Given the 2373
initially selected clusters, of which 489 were subjected to experi-
mental validation, 1884 pairs of clusters remain to be validated.
If we assume an overall validation efficiency of 43%, we can
estimate that the TF strategy might contribute to the definition
of at least 791 additional genes in the human genome.
Several factors may have influenced our validation effi-
ciency, including experimental limitations related to primer and
cDNA synthesis, the particular characteristics of human tran-
scripts such as low expression level, and the existence of a sig-
nificant proportion of sense-antisense transcriptional units on
opposite DNA strands of the same genomic locus (Yelin et al
2003). A 25% false-negative amplification rate was estimated for
the TF strategy and is probably related to the high-throughput
single-pass format adopted for the experimental validation. In
this context, the use of additional primer pairs and modifications
of cycling parameters that would favor the amplification of dif-
ficult targets could be added to the process to reduce the negative
amplification rate.
We found that validation efficiency was enhanced by imple-
mentation of quality controls for cDNA synthesis, the use of
polyA+-derived cDNA, a combination of both oligo dT and ran-
dom primers for cDNA synthesis, and also the use of nested RT-
PCR. We also observed that validated pairs of clusters had a
higher average number of ESTs per cluster and a higher number
of different tissues represented by the clusters compared with
pairs of clusters that we were not able to validate. Validated TFUs
had, on average, 6.1 ESTs in each cluster derived, on average,
from 3.45 distinct tissues. Noteworthy, in 41% of the validated
TFUs, one of the two EST clusters was composed of a single EST,
and in 13% of the cases, both clusters corresponded to singleton
ESTs, indicating the often overlooked importance of this kind of
data.
For a reasonable fraction (21%) of the validated TFUs, a full-
length cDNA sequence was not yet available in public databases.
The structure of the majority (69.2%) of these validated TFUs had
not been correctly predicted by ab initio gene prediction pro-
grams and, consequently, was not annotated in the human ge-
nome. In addition, the use of different cDNA sources in the vali-
dation process allowed us to identify many splicing variants that
were further validated by RT-PCR. As for 21% of validated se-
quences, none of these splicing variants had been previously
identified.
We conclude that the TF strategy provides a convenient and
unique means for delineating gene boundaries and new tran-
scribed sequences. The TF strategy permits the characterization of
new human transcripts and splicing isoforms expressed at a low
level and in a restricted set of tissues and will certainly continue
to contribute to the definition of the complete catalog of human
genes and transcripts.
METHODS
Cell Culture
Human cell lines were obtained from the American Type Culture
Collection (ATCC) and cultured as recommended (http://
www.atcc.org). The following cell lines were used in order to
generate a cDNA panel representing different tissues: A172 glio-
blastoma; T98G multiform glioblastoma; FaDu squamous cell
carcinoma; SW480 colorectal adenocarcinoma; Skmel-25 malig-
nant melanoma; DU145 prostate carcinoma; HeLa cervix adeno-
carcinoma; XP Xeroderma pigmentosum fibroblasts; ZR-75-1,
MCF-7, and Hs578T breast ductal carcinoma; IM9 B transformed
lymphoblasts; TT thyroid carcinoma; U937 histyocytic lym-
phoma; Hs1.Tes normal testis; Hs732.PL normal placenta; Hep
G2 hepatocarcinoma; NCI-H1155 and H358 lung carcinoma;
SCaBER urinary bladder carcinoma; SAOS 2 osteosarcoma; and
Tu-rim primary culture of a kidney tumor.
RNA Extraction and cDNA Synthesis
Total RNA was prepared from cultured cells seeded in four 150-
mm-diameter (P150) plates by using the cesium chloride cushion
technique (Chirgwin et al. 1979). Poly A
+
RNA was isolated from
200 µg total RNA with the PolyAttract mRNA isolation kit (Pro-
mega), and the total yield of this purification was used for cDNA
synthesis. For cDNA synthesis, 100 to 200 µg total RNA or the
corresponding purified mRNA were treated with 100 U DNAse I
(FPLC-pure, Amersham) and reverse-transcribed by using oli-
go(dT)12-18, random primer and SuperScript II (Invitrogen), fol-
lowing the manufacturer’s instructions. The resulting cDNA was
then subjected to RNase H treatment and distributed among the
Table 3. Alternative Splicing Forms Within Validated TFs
Validated
consensus
Type of
alternative
splicing
Presence of
conserved
acceptor
and donor
sites
No. of
alternative
isoforms
No. of
validated
isoforms
TFU0118 Exon usage Yes 2 1
TFU0200 Exon usage Yes 4 4
TFU0274 Exon usage Yes 2 2
TFU0351 Exon usage Yes 2 2
TFU1004 Exon usage Yes 2 1
TFU1058 Exon usage Yes 3 0
TFU0155 Exon usage Yes 2 nd
TFU0238 Exon usage Yes 2 nd
TFU0308 Exon usage Yes 2 nd
TFU0003 Intron retention nd nd nd
TFU0019 Intron retention nd nd nd
TFU0035 Intron retention nd nd nd
TFU0052 Intron retention nd nd nd
TFU0099 Intron retention nd nd nd
TFU0112 Intron retention nd nd nd
TFU0125 Intron retention nd nd nd
TFU0131 Intron retention nd nd nd
TFU0209 Intron retention nd nd nd
TFU0285 Intron retention nd nd nd
TFU0371 Intron retention nd nd nd
TFU0148 Exon skipping nd nd nd
TFU1061 Exon skipping nd nd nd
nd = not done.
Camargo et al.
1418 Genome Research
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
31 validation laboratories involved in the project. The quality of
the cDNA synthesis and the absence of genomic DNA contami-
nation were evaluated for each preparation. Total RNA was sub-
jected to PCR amplification by using primers within intronic se-
quences flanking exon 12 of the MLH1 gene (forward, 5Ј-
TGGTGTCTCTAGTTCTGG-3Ј; reverse, 5Ј-CATTGTTGTAG
TAGCTCTGC-3Ј). The quality of the cDNA product was also
tested by PCR amplification of sequences located at the 5Ј ex-
tremity of the NOTCH2 transcript (a long transcript of 11.4Kb;
forward, 5Ј-ACTGTGGCCAACCAGTTCTC-3Ј; reverse, 5-Ј CTCT
CACAGGTGCTCCCTTC-3Ј).
RT-PCR and Sequencing
RT-PCR was carried out in 25 µL reaction mixtures containing 1
µL cDNA, 10ן Taq DNA polymerase buffer, 200 µM dNTP, 6
pmoles of primers, 1.5 mM MgCl
2
,and1UTaq DNA polymerase
(GIBCO BRL). Standard PCR conditions were as follows: 4 min at
94°C (initial denaturation), 40 sec at 94°C, 40 sec at 55°C, and 1
min at 72°C for 35 cycles and a final extension step of 10 min at
72°C. Modifications of the standard protocol included annealing
temperature, MgCl
2
concentration, addition of PCR enhancers
such as betaine, and the use of polymerases with hot start activ-
ity. PCR products were directly sequenced with the same primers
used for RT-PCR or cloned before sequencing. If more than one
fragment was obtained for the same TFU using different cDNA
sources, all fragments were sequenced. This was also the case if
multiple bands were obtained in PCR amplifications using a
single cDNA source. Sequencing different fragments obtained for
a specific TFU allowed us to characterize a number of alterna-
tively spliced transcripts. Sequencing reactions were carried out
by using the DYEnamic ET terminator Cycle Sequencing Kit (Am-
ersham Pharmacia) and separated by electrophoresis using an
ABI 377 Prism Sequencer (Applied Biosystems) according to sup-
plier’s recommendations.
Transcriptome Database and Graphical Interface
BLASTN was used to identify pair-wise similarities between all
known transcript sequences and the draft genome sequence de-
posited in release 66 (March 2001) of the European Molecular
Biology Laboratory (EMBL) database. Transcribed sequence data
were extracted from several sources: (1) the human EST section of
EMBL release 66, (2) human mRNA documented in the human
section of EMBL release 66, (3) ORESTES sequences from the Lud-
wig Institute for Cancer Research (LICR)/FAPESP Human Cancer
Genome project, and (4) human mRNAs documented in the
NCBI curated RefSeq database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
refseq). For genomic sequence, we used contigs of at least 10 kb
deposited in the HUM and HTG sections. Those HTG entries that
had not been fully assembled were split into individual compo-
nents. Therefore, the human genome data set used is highly redun-
dant but can easily be reduced to one of the available assemblies.
The transcript sequences were filtered for contaminants,
and repetitive elements were masked out by using the PFP soft-
ware package (Paracel). For each pair of matching transcribed and
genomic sequences, local alignments were generated by using
Sim4 (Florea et al. 1998), with parameters W = 15, R = 0, A = 4,
and P = 1. The output of Sim4 was filtered to eliminate all align-
ments that did not contain at least one matching region within
the genome with at least 95% identity over 30 nt. The alignment
coordinates and related information were uploaded into a
MySQL relational database. We used the data stored in the rela-
tional database to create clusters of transcribed sequences, based
on their position within individual genomic contigs. The coor-
dinates of the putative exons on the genome sequence were used
to determine membership in a cluster. If coordinates of at least
one exon were common to two transcripts, then these were con-
sidered to be part of the same cluster.
The 3Ј tags were generated as previously described (Iseli et al.
2002). Briefly, poly(A) or poly(T) were identified from original
sequence trace files, and the 50 nucleotides immediately adjacent
to it were recorded as a candidate tag (after obtaining the reverse
complement for poly(T) tracts). Duplicate tags were eliminated,
as were the tags matching LINE and Alu repetitive elements, ri-
bosomal or mitochondrial sequences, and those containing
simple repeats. Matches for the remaining tags were mapped to
the genome, and the 50 nucleotides found downstream of the
match were also recorded. Individual tags were incorporated into
the MySQL database. A graphical interface was developed in TCL/
TK language in order to visualize the 3Ј tags, EST alignments and
related information, such as tissue origin and project source of
the sequences.
By querying the transcriptome database, we were able to
select EST clusters that do not correspond to known full-length
mRNA for validation. These were at a maximum of 10 kb apart
from each other and exhibited a clear splicing structure when
aligned to the genome. Clusters selected for validation were vi-
sually inspected before ordering primers. All systems used in this
work were developed by using PERL and PHP programming lan-
guages on a Linux-based server running the MySQL database
management system and the Apache Web server.
Cluster Selection and Primers Design
The automated primer protocol received a fixed format file con-
taining the accession number of the genomic clones and the
Figure 4 Experimental validation of MGC5601 gene alternative splicing isoforms. ( A) Gene structure for exons XVI-XIX (boxes) of the MGC5601 gene
located on chromosome 12. Introns are represented by lines. Two alternative exons are shown on TFU reads, and a hypothetical combination of these
two exons is also shown. Sequence F07R has an extra exon between exon XVII and XVIII. Sequence A01R has an extended exon XIX. Four primers were
designed for validation tests, as indicated in the figure (P1–P4), and each pair of primers were assayed against all 22 cDNA preparations without pooling.
(B) We detected all four of these alternative splicing isoforms in MGC5601. Numbers one through four indicate the tissues from which the cDNA was
obtained (1, multiform glioblastoma; 2, glioblastoma; 3, prostate carcinoma; and 4, primary kidney cell culture). The sizes of the bands obtained are
indicated. L indicates 100-bp ladder.
Transcribed Regions in the Human Genome
Genome Research 1419
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
genomic interval where the two noncontiguous EST clusters map
and where the system searched for primers. A single pair of prim-
ers was designed for each TFU, which usually targeted the two
exons flanking the putative gap. In a few cases, in which the
presence of repetitive sequences or atypical base composition
prevented the design of primers, adjacent exons were used. The
Primer3 program (version 0.9) developed by the Whitehead In-
stitute for Biomedical Research was used for primer design,
adopting the following parameters: primer size of a minimum of
17 bp, optimal 18 bp and maximum 21 bp; melting temperature
of a minimum of 55°C, optimal 60°C and maximum 65°C; and
GC clamp set to one. The output of Primer3 was processed in
order to filter primers that had alternate annealing sites in the
given genomic sequence. The system uses a Web-based interface
that allows submission of files containing information on primer
design, retrieval of primers found, and the modification of de-
fault parameters for primer picking.
Sequence Analysis and Database Update
Sequences were subjected to an automated protocol to (1) assess
sequence quality, (2) trim vector sequences, (3) mask repetitive
elements, and (4) remove undesirable sequences such as bacte-
rial, mitochondrial, and fungi sequences. The sequence quality
was determined by Phred analysis using a trimCutOff of 0.06171
(Ewing and Green 1998; Ewing et al. 1998). Sequences with <100
bases were excluded. Mitochondrial, bacterial, and fungi se-
quences were identified by BLAST searches against the GenBank
entry corresponding to the human mitochondrial complete ge-
nome sequence and against a locally developed bacterial and
fungal database, respectively. Significant hits were determined by
using an E value of 10
מ5
for searches against mitochondrial ge-
nome and an E value of 10
מ30
for searches against bacterial da-
tabases. Masking of repetitive elements was undertaken by using
the RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org) under default
parameters. The remaining high-quality sequences were aligned
against the original genomic clone by using the BLASTN pro-
gram, and alignment coordinates and scores were loaded into the
MySQL database on a daily basis.
Consensus Assembly
The reads corresponding to validated TFs were assembled into
a contig by using the PhredPhrap. The contig sequence was
aligned with both EST clusters by using the BLASTN program,
and alignment coordinates were used for consensus generation.
A Web-based interface was developed to monitor the assembly
and access the consensus sequences (http://200.18.51.201/
viewconsensus/).
Characterization of Validated Transcripts
Characterization of validated transcripts was pursued by using
the UCSC Genome Browser (Kent et al. 2002), which is available
at http://genome.ucsc.edu. This allowed determination of se-
quence overlap between the validated consensus sequences,
known genes, and gene predictions. Consensus sequences de-
rived from the validated TFUs were aligned to the July 2003 ver-
sion of the human genome sequence assembly provided by
UCSC using the BLAT search tool. The annotation tracks used for
comparison to already known genes were known genes, RefSeq
genes, and human mRNAs from the GenBank. A validated tran-
script was considered a new gene if its alignment coordinates did
not match the coordinates of any other sequence available
through the known genes, RefSeq genes, or human mRNA anno-
tation tracks. For comparison to gene predictions, the following
tracks were used: Fgenesh++, Geneid, and GenScan predictions.
The prediction of individual exons instead of the full transcript
prediction was considered. A validated exon was considered as
predicted if it aligned within the coordinates defined by any of
the three gene prediction programs (not necessarily sharing bor-
ders) and a new validated transcript was considered not predicted
if all exons were not predicted by the computer programs. The
consensus sequences corresponding to new validated transcripts
were further characterized by BLASTX analysis, and protein do-
mains were determined by using the Pfam and Prosite databases.
Characterization and Validation of Alternatively
Splicing Forms
The individual sequences generated during the process of valida-
tion of each TFU were aligned to the human genome assembly by
using the BLAT search tool, together with the final consensus
sequence and representative sequences derived from both EST
clusters. Alternatively spliced isoforms were visually identified by
using the UCSC browser. To eliminate alignment artifacts caused
by sequencing errors and problems in the genome assembly, we
have considered as alternatively spliced forms only exons de-
fined by conserved acceptor and donor splicing sites (GT/AG).
Primers for validation of predicted alternative splicing isoforms
were designed by using Primer3 with default parameters. The
presence of alternative isoforms was analyzed by using a cDNA
panel composed of 20 different normal and tumor tissues. GAPD
amplification was used as a control for integrity and quantifica-
tion of the RNA used for cDNA synthesis. RT-PCR products ob-
tained in touchdown reactions were analyzed on 1.5% agarose gels.
Complete List of Authors
Coordination Group Ludwig Institute
Fabiana Bettoni,
3
Dirce Maria Carraro,
3
Lilian C. Pires,
3
Raphael
B. Parmigiani,
3
Elisa N. Ferreira,
3
Eloı´sadeSa´ Moreira,
3,32
Maria
do Rosa´rio D. de O. Latorre,
4
Andrew J.G. Simpson,
3
and Ana-
maria A. Camargo
3
Coordination Group University of Sa˜o Paulo
Chemistry Institute
Luciana Oliveira Cruz,
5
Theri Leica Degaki,
5
Fernanda Festa,
5
Kat-
lin B. Massirer,
5
and Mari C. Sogayar
5
Bioinformatics Groups
Fernando Camargo Filho,
6
Luiz Paulo Camargo,
6
Marco A.V.
Cunha,
7
Sandro J. De Souza,
8
Milton Faria Junior,
6
Silvana Giu-
liatti,
6
Leonardo Kopp,
9
Paulo S.L. de Oliveira,
9
Paulo B. Paiva,
10
Anderson A. Pereira,
6
Daniel G. Pinheiro,
7
Renato D. Puga,
6
and
Jorge Estefano S. de Souza
8
Validation Groups
Dulcineia M. Albuquerque,
11
Luı´s E.C. Andrade,
12
Gilson S.
Baia,
13
Marcelo R.S. Briones,
14
Ana M.S. Cavaleiro–Luna,
15
Janete
3
Ludwig Institute for Cancer Research, Sa˜o Paulo, SP, 01509–010,
Brazil
4
Department of Epidemiology, School of Public Health, University of
Sa˜o Paulo, SP, 01246–904, Brazil
5
Instituto de Quı´mica, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP,
05513–970, Brazil
6
Dep. de Eng. Quı´mica e de Informa´ tica, Bioinforma´ tica, Universi-
dade de Ribeira˜o Preto, Ribeira˜o Preto, SP, 14096–380, Brazil
7
Centro de Terapia Celular, Hemocentro e Departamento de Clı´nica
Me´dica, Faculdade de Medicina de Ribeira˜o Preto, Universidade de
Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14051–140, Brazil
8
Laborato´ rio de Biologia Computacional, Instituto Ludwig, Sa˜o
Paulo, SP, 01509–010, Brazil
9
Laborato´ rio de Gene´tica e Cardiologia Molecular, Instituto do Cora-
c¸a˜o, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05403–000, Brazil
10
Bioinformatics Laboratory, Health Informatics Department, Fed-
eral University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 04039–032, Brazil
11
Departamento de Clı´nica Me´dica, Hemocentro, Faculdade de Cieˆn-
cias Me´ dicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP,
13083–970, Brazil
12
Rheumatology Division, Federal University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo,
SP, 04113–001, Brazil
13
Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Cieˆncias
Biome´dicas, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05508–900,
Brazil
14
Department of Microbiology, Immunology and Parasitology, Fed-
eral University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 04023–062, Brazil
15
Laboratory for Cellular and Molecular Endocrinology, School of
Medicine, University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 01246–903, Brazil
Camargo et al.
1420 Genome Research
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
M. Cerutti,
16
Fernando F. Costa,
11
Eugenia Costanzi-Strauss,
17
Enilza M. Espreafico,
18
Adriana C. Ferrasi,
19
Emer S. Ferro,
13
Maria A.H.Z. Fortes,
15
Joelma R.F. Furchi,
20
Daniel Giannella-
Neto,
15
Gustavo H. Goldman,
21
Maria H.S. Goldman,
22
Arthur
Gruber,
23
Gustavo S. Guimara˜es,
16
Christine Hackel,
24
Flavio
Henrique-Silva,
20
Edna T. Kimura,
13
Suzana G. Leoni,
11
Cla´udia
Macedo,
25
Bettina Malnic,
26
Carina V. Manzini B.,
26
Suely K.N.
Marie,
27
Nilce M. Martinez-Rossi,
25
Marcelo Menossi,
28,29
Elisa-
bete C. Miracca,
30
Maria A. Nagai,
30
Francisco G. Nobrega,
31
Ma-
rina P. Nobrega,
31
Sueli M. Oba-Shinjo,
27
Ma´rika K. Oliveira,
18
Guilherme M. Orabona,
32
Audrey Y. Otsuka,
33
Maria L. Pac¸o-
Larson,
18
Beatriz M.C. Paixa˜o,
7
Jose R.C. Pandolfi,
34
Maria I.M.C.
Pardini,
19
Maria R. Passos Bueno,
32
Geraldo A.S. Passos,
35
Joao B.
Pesquero,
36
Juliana G. Pessoa,
36
Paula Rahal,
37
Cla´udia A.
Rainho,
38
Caroline P. Reis,
28
Tatiana I. Ricca,
14
Vanderlei Rod-
rigues,
39
Silvia R. Rogatto,
38
Camila M. Romano,
23
Janaı´na G.
Romeiro,
37
Antonio Rossi,
39
Renata G. Sa´,
39
Magaly M. Sales,
19
Simone C. Sant’Anna,
24
Patrı´cia L. Santarosa,
40
Fernando Se-
gato,
25
Wilson A. Silva Jr.,
7,25
Ismael D.C.G. Silva,
33
Neusa P.
Silva,
12
Andrea Soares-Costa,
20
Maria F. Sonati,
41
Bryan E.
Strauss,
42
Eloiza H. Tajara,
37
Sandro R. Valentini,
34
Fabiola E.
Villanova,
33
Laura S. Ward,
40
and Dalila L. Zanette
7
ACKNOWLEDGMENTS
We dedicate this work to Dr. Ricardo R. Brentani (Director of the
Ludwig Institute-Sa˜o Paulo Branch and of the A.C. Camargo Hos-
pital) and Dr. Jose´ Fernando Perez (Scientific Director of the Sa˜o
Paulo Research Foundation-FAPESP) for unconditional support
and constant incentive to the Brazilian Genome Initiative. We
thank Fernanda G. Barbuzano, Ma´rio H. Bengtson, Ana P. Bogos-
sian, Miriam S. Carmo, Christian Colin, De´bora C.J. Costa, Leslie
E. Ferreira, Cristiane A. Ferreira, Mariana C. Frigieri, Hellen T.
Fuzii, Augusto D. Luchessi, Claudia R. Madella, Adriana A.
Marques, Zizi de Mendonc¸a, Camila C.B.O. Menezes, Alessandra
Splendore, Flavia I.V. Errera, Julio C. Moreira, Irenice C. Silva,
Sandra R. Souza, and Fabiana Granja for dedicated and expert
technical assistance and/or critical discussions. We also thank Dr.
Winston Hide and Dr. Helena Brentani for important comments
and corrections on the manuscript and Juc¸ara Parra for acting as
the administrative coordinator of this project. The work was
equally supported by the Ludwig Institute for Cancer Research
and Fundac¸a˜o de Amparo a` Pesquisa do Estado de Sa˜o Paulo
(FAPESP).
The publication costs of this article were defrayed in part by
payment of page charges. This article must therefore be hereby
marked “advertisement” in accordance with 18 USC section 1734
solely to indicate this fact.
REFERENCES
Adams, M.D., Kelley, J.M., Gocayne, J.D., Dubnick, M., Polymeropoulos,
M.H., Xiao, H., Merril, C.R., Wu, A., Olde, B., and Moreno, R.F.
1991. Complementary DNA sequencing: Expressed sequence tags
and human genome project. Science 252: 1651–1656.
Adams, M.D., Dubnick, M., Kerlavage, A.R., Moreno, R., Kelley, J.M.,
Utterback, T.R., Nagle, J.W., Fields, C., and Venter, J.C. 1992.
Sequence identification of 2375 human brain genes. Nature
355: 632–634.
Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C., and Venter, J.C. 1993. 3,400
new expressed sequence tags identify diversity of transcripts in
human brain. Nat. Genet. 4: 256–267.
Bailey, L.C., Searls Jr., D.B., and Overton, G.C. 1998. Analysis of
EST-driven gene annotation in human genomic sequence. Genome
Res. 8: 362–376.
Batzoglou, S., Pachter, L., Mesirov, J.P., Berger, B., and Lander, E.S. 2000.
Human and mouse gene structure: Comparative analysis and
application to exon prediction. Genome Res. 10: 950–958.
Beaudoing, E. and Gautheret, D. 2001. Identification of alternate
polyadenylation sites and analysis of their tissue distribution using
EST data. Genome Res. 11: 1520–1526.
Bonaldo, M.F., Lennon, G., and Soares, M.B. 1996. Normalization and
subtraction: Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res.
6: 791–806.
Bortoluzzi, S., d’Alessi, F., and Danieli, G.A. 2000a. A computational
reconstruction of the adult human heart transcriptional profile. J.
Mol. Cell. Cardiol. 32: 1931–1938.
———. 2000b. A novel resource for the study of genes expressed in the
adult human retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 3305–3308.
Bortoluzzi, S., d’Alessi, F., Romualdi, C., and Danieli, G.A. 2000c. The
human adult skeletal muscle transcriptional profile reconstructed by
a novel computational approach. Genome Res. 10: 344–349.
Brett, D., Hanke, J., Lehmann, G., Haase, S., Delbruck, S., Krueger, S.,
Reich, J., and Bork, P. 2000. EST comparison indicates 38% of
human mRNAs contain possible alternative splice forms. FEBS Lett.
474: 83–86.
Camargo, A.A., Samaia, H.P., Dias-Neto, E., Simao, D.F., Migotto, I.A.,
16
Laborato´ rio de Endocrinologia Molecular, Disciplina de Endocrino-
logia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de Sa˜o
Paulo, Sa˜o Paulo, 04039–002, Brazil
17
Laborato´ rio de Transfereˆncia Geˆnica, Instituto de Cieˆncias Bio-
me´dicas, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05508–900, Bra-
zil
18
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Pato-
geˆnicos, Faculdade de Medicina de Ribeira˜o Preto, Universidade de
Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14049–900, Brazil
19
Laborato´ rio de Biologia Molecular, Hemocentro, Faculdade de Me-
dicina, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP, 18618–970,
Brazil
20
Departamento de Gene´tica e Evoluc¸a˜o, Universidade Federal de
Sa˜o Carlos, Sa˜o Carlos, SP, 13565–905, Brazil
21
Faculdade de Cieˆncias Farmaceˆuticas de Ribeira˜o Preto, Universi-
dade de Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14040–903, Brazil
22
Faculdade de Filosofia, Cieˆncias e Letras de Ribeira˜o Preto, Univer-
sidade de Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14040–901, Brazil
23
Depto. de Patologia, Faculdade de Medicina Veterina´ ria e Zootec-
nia, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05508–000, Brazil
24
Departamento de Gene´tica Me´dica, Faculdade de Cieˆncias Me´di-
cas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, 13081–970,
Brazil
25
Departamento de Gene´tica, Faculdade de Medicina de Ribeira˜o
Preto, Universidade de Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14040–900,
Brazil
26
Departamento de Bioquı´mica, Instituto de Quı´mica, Universidade
de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05599–970, Brazil
27
Departamento de Neurologia, Faculdade de Medicina, Universi-
dade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 01246–903, Brazil
28
Laborato´ rio de Genoma Funcional, Centro de Biologia Molecular e
Engenharia Gene´tica, Universidade Estadual de Campinas, Campi-
nas, SP, 13083–970, Brazil
29
Departamento de Gene´ tica e Evoluc¸a˜o, Instituto de Biologia, Uni-
versidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, 13084–971, Brazil
30
Departamento de Radiologia, Disciplina de Oncologia, Faculdade
de Medicina, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 01246–903,
Brazil
31
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do
Paraı´ba, Sa˜o Jose´ dos Campos, SP, 12244–000, Brazil
32
Departamento de Biologia, Centro de Estudos do Genoma Hu-
mano, Instituto de Biocieˆncias, Universidade de Sa˜o Paulo, Sa˜o
Paulo, SP, 05508–900, Brazil
33
Molecular Gynecology Laboratory, Gynecology Department, Fed-
eral University of Sa˜o Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 04039–001, Brazil
34
Department of Biological Sciences, School of Pharmacy, Sa˜o Paulo
State University, Araraquara, SP, 14801–902, Brazil
35
Disciplina de Gene´tica, Faculdade de Odontologia, Universidade
de Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto, SP, 14040–900, Brazil
36
Departamento de Biofı´sica, Universidade Federal de Sa˜o Paulo, Sa˜o
Paulo, SP, 04023–062, Brazil
37
Departamento de Biologia, Instituto de Biocieˆncias, Letras e Cieˆn-
cias Exatas, Universidade Estadual Paulista, Sa˜o Jose do Rio Preto, SP
15054–000, Brazil
38
Departamento de Gene´tica, Instituto de Biocieˆncias, Universidade
Estadual Paulista, Botucatu, SP, 18618–000, Brazil
39
Departamento de Bioquı´mica e Imunologia, Faculdade de Me-
dicina de Ribeira˜o Preto, Universidade de Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto,
SP, 14049–900, Brazil
40
Laborato´ rio de Gene´tica Molecular do Caˆncer, Departamento de
Clı´nica Me´dica, Faculdade de Cieˆncias Me´dicas, Universidade Es-
tadual de Campinas, Campinas, SP, 13083–970, Brazil
41
Departamento de Patologia Clı´nica, Faculdade de Cieˆncias Me´di-
cas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, 13083–970,
Brazil
42
Setor de Vetores Virais, Laborato´rio de Cardiologia Molecular, In-
stituto do Corac¸a˜o, Faculdade de Medicina, Universidade de Sa˜o
Paulo, Sa˜o Paulo, SP, 05403–000, Brazil
Transcribed Regions in the Human Genome
Genome Research 1421
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
Briones, M.R., Costa, F.F., Nagai, M.A., Verjovski-Almeida, S., Zago,
M.A., et al. 2001. The contribution of 700,000 ORF sequence tags to
the definition of the human transcriptome. Proc. Natl. Acad. Sci.
98: 12103–12108.
Camargo, A.A., de Souza, S.J., Brentani, R.R., and Simpson, A.J. 2002.
Human gene discovery through experimental definition of
transcribed regions of the human genome. Curr. Opin. Chem. Biol.
6: 13–16.
Carninci, P., Shibata, Y., Hayatsu, N., Sugahara, Y., Shibata, K., Itoh, M.,
Konno, H., Okazaki, Y., Muramatsu, M., and Hayashizaki, Y. 2000.
Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to
prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes.
Genome Res. 10: 1617–1630.
Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.J., and Rutter WJ. 1979.
Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources
enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294–5299.
Clark, F. and Thanaraj, T.A. 2002. Categorization and characterization
of transcript-confirmed constitutively and alternatively spliced
introns and exons from human. Hum. Mol. Genet. 11: 451–464.
Clifford, R., Edmonson, M., Hu, Y., Nguyen, C., Scherpbier, T., and
Buetow, K.H. 2000. Expression-based genetic/physical maps of
single-nucleotide polymorphisms identified by the cancer genome
anatomy project. Genome Res. 10: 1259–1265.
Dennis, C. 2001. Tiled arrays for gene hunting. Nat. Rev. Genet. 2: 161.
Dias, N.E., Garcia, C.R., Verjovski-Almeida, S., Briones, M.R., Nagai,
M.A., da Silva Jr., W., Zago, M.A., Bordin, S., Costa, F.F., Goldman,
G.H., et al. 2000. Shotgun sequencing of the human transcriptome
with ORF expressed sequence tags. Proc. Natl. Acad. Sci.
97: 3491–3496.
Dunham, I., Shimizu, N., Roe, B.A., Chissoe, S., Hunt, A.R., Collins, J.E.,
Bruskiewich, R., Beare, D.M., Clamp, M., Smink, L.J., et al. 1999. The
DNA sequence of human chromosome 22. Nature 402: 489–495.
Ewing, B. and Green, P. 1998. Base-calling of automated sequencer
traces using phred, II: Error probabilities. Genome Res. 8: 186–194.
———. 2000. Analysis of expressed sequence tags indicates 35,000
human genes. Nat. Genet. 25: 232–234.
Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M.C., and Green, P. 1998. Base-calling of
automated sequencer traces using phred, I: Accuracy assessment.
Genome Res. 8: 175–185.
Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., and Miller, W. 1998. A
computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic
DNA sequence. Genome Res. 8: 967–974.
Garg, K., Green, P., and Nickerson, D.A. 1999. Identification of
candidate coding region single nucleotide polymorphisms in 165
human genes using assembled expressed sequence tags. Genome Res.
9: 1087–1092.
Gautheret, D., Poirot, O., Lopez, F., Audic, S., and Claverie, J.M. 1998.
Alternate polyadenylation in human mRNAs: A large-scale analysis
by EST clustering. Genome Res. 8: 524–530.
Hattori, M., Fujiyama, A., Taylor, T.D., Watanabe, H., Yada, T., Park,
H.S., Toyoda, A., Ishii, K., Totoki, Y., Choi, D.K., et al. 2000. The
DNA sequence of human chromosome 21. Nature 405: 311–319.
Hide, W.A., Babenko, V.N., van Heusden, P.A., Seoighe, C., and Kelso,
J.F. 2001. The contribution of exon-skipping events on chromosome
22 to protein coding diversity. Genome Res. 11: 1848–1853.
Hu, G., Modrek, B., Riise Stensland, H.M., Saarela, J., Pajukanta, P.,
Kustanovich, V., Peltonen, L., Nelson, S.F., and Lee, C. 2002.
Efficient discovery of single-nucleotide polymorphisms in coding
regions of human genes. Pharmacogenomics J. 2: 236–242.
Hudson, T.J., Colbert, A.M., Reeve, M.P., Bae, J.S., Lee, M.K., Nussbaum,
R.L., Budarf, M.L., Emanuel, B.S., and Foote, S. 1994. Isolation and
regional mapping of 110 chromosome 22 STSs. Genomics
24: 588–592.
Huminiecki, L. and Bicknell, R. 2000. In silico cloning of novel
endothelial-specific genes. Genome Res. 10: 1796–1806.
Irizarry, K., Kustanovich, V., Li, C., Brown, N., Nelson, S., Wong, W.,
and Lee, C.J. 2000. Genome-wide analysis of single-nucleotide
polymorphisms in human expressed sequences. Nat. Genet.
26: 233–236.
Iseli, C., Stevenson, B.J., de Souza, S.J., Samaia, H.B., Camargo, A.A.,
Buetow, K.H., Strausberg, R.L., Simpson, A.J., Bucher, P., and
Jongeneel, C.V. 2002. Long-range heterogeneity at the 3Ј ends of
human mRNAs. Genome Res. 12: 1068–1074.
Jiang, J. and Jacob, H.J. 1998. EbEST: An automated tool using expressed
sequence tags to delineate gene structure. Genome Res. 8: 268–275.
Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W.R., and States, D.J. 2001. Gene structure
prediction and alternative splicing analysis using genomically
aligned ESTs. Genome Res. 11: 889–900.
Kan, Z., States, D., and Gish, W. 2002. Selecting for functional
alternative splices in ESTs. Genome Res. 12: 1837–1845.
Kapranov, P., Cawley, S.E., Drenkow, J., Bekiranov, S., Strausberg, R.L.,
Fodor, S.P., and Gingeras, T.R. 2002. Large-scale transcriptional
activity in chromosomes 21 and 22. Science 296: 916–919.
Katsanis, N., Worley, K.C., Gonzalez, G., Ansley, S.J., and Lupski, J.R.
2002. A computational/functional genomics approach for the
enrichment of the retinal transcriptome and the identification of
positional candidate retinopathy genes. Proc. Natl. Acad. Sci.
99: 14326–14331.
Kent, W.J., Sugnet, C.W., Furey, T.S., Roskin, K.M., Pringle, T.H., Zahler,
A.M., and Haussler, D. 2002. The human genome browser at UCSC.
Genome Res. 12: 996–1006.
Kikuno, R., Nagase, T., Waki, M., and Ohara, O. 2002. HUGE: A
database for human large proteins identified in the Kazusa cDNA
sequencing project. Nucleic Acids Res. 30: 166–168.
Lander, E.S., Linton, L.M., Birren, B., Nusbaum, C., Zody, M.C.,
Baldwin, J., Devon, K., Dewar, K., Doyle, M., FitzHugh, W., et al.
2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature
409: 860–921.
Lee, Y., Sultana, R., Pertea, G., Cho, J., Karamycheva, S., Tsai, J., Parvizi,
B., Cheung, F., Antonescu, V., White, J., et al. 2002.
Cross-referencing eukaryotic genomes: TIGR Orthologous Gene
Alignments (TOGA). Genome Res. 12: 493–502.
Liang, F., Holt, I., Pertea, G., Karamycheva, S., Salzberg, S.L., and
Quackenbush, J. 2000. Gene index analysis of the human genome
estimates approximately 120,000 genes. Nat. Genet. 25: 239–240.
Megy, K., Audic, S., and Claverie, J.M. 2003. Positional clustering of
differentially expressed genes on human chromosomes 20, 21 and
22. Genome Biol. 4: P1.
Modrek, B., Resch, A., Grasso, C., and Lee, C. 2001. Genome-wide
detection of alternative splicing in expressed sequences of human
genes. Nucleic Acids Res. 29: 2850–2859.
Nakajima, D., Okazaki, N., Yamakawa, H., Kikuno, R., Ohara, O., and
Nagase, T. 2002. Construction of expression-ready cDNA clones for
KIAA genes: Manual curation of 330 KIAA cDNA clones. DNA Res.
9: 99–106.
Penn, S.G., Rank, D.R., Hanzel, D.K., and Barker, D.L. 2000. Mining the
human genome using microarrays of open reading frames. Nat.
Genet. 26: 315–318.
Phillips, R.L., Ernst, R.E., Brunk, B., Ivanova, N., Mahan, M.A.,
Deanehan, J.K., Moore, K.A., Overton, G.C., and Lemischka, I.R.
2000. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science
288: 1635–1640.
Picoult-Newberg, L., Ideker, T.E., Pohl, M.G., Taylor, S.L., Donaldson,
M.A., Nickerson, D.A., and Boyce-Jacino, M. 1999. Mining SNPs
from EST databases. Genome Res. 9: 167–174.
Reymond, A., Camargo, A.A., Deutsch, S., Stevenson, B.J., Parmigiani,
R.B., Ucla, C., Bettoni, F., Rossier, C., Lyle, R., Guipponi, M., et al.
2002. Nineteen additional unpredicted transcripts from human
chromosome 21. Genomics 79: 824–832.
Roest, C.H., Jaillon, O., Bernot, A., Dasilva, C., Bouneau, L., Fischer, C.,
Fizames, C., Wincker, P., Brottier, P., Quetier, F., et al. 2000.
Estimate of human gene number provided by genome-wide analysis
using Tetraodon nigroviridis DNA sequence. Nat. Genet. 25: 235–238.
Shoemaker, D.D., Schadt, E.E., Armour, C.D., He, Y.D., Garrett-Engele,
P., McDonagh, P.D., Loerch, P.M., Leonardson, A., Lum, P.Y., Cavet,
G., et al. 2001. Experimental annotation of the human genome
using microarray technology. Nature 409: 922–927.
Silva, A.P., Salim, A.C., Bulgarelli, A., de Souza, J.E., Osorio, E.,
Caballero, O.L., Iseli, C., Stevenson, B.J., Jongeneel, C.V., de Souza,
S.J., et al. 2003. Identification of 9 novel transcripts and two RGSL
genes within the hereditary prostate cancer region (HPC1) at 1q25.
Gene 310: 49–57.
Sorek, R. and Safer, H.M. 2003. A novel algorithm for computational
identification of contaminated EST libraries. Nucleic Acids Res.
31: 1067–1074.
Strausberg, R.L., Feingold, E.A., Klausner, R.D., and Collins, F.S. 1999.
The mammalian gene collection. Science 286: 455–457.
Strausberg, R.L., Buetow, K.H., Emmert-Buck, M.R., and Klausner, R.D.
2000. The cancer genome anatomy project: Building an annotated
gene index. Trends Genet. 16: 103–106.
Strausberg, R.L., Feingold, E.A., Grouse, L.H., Derge, J.G., Klausner, R.D.,
Collins, F.S., Wagner, L., Shenmen, C.M., Schuler, G.D., Altschul,
S.F., et al. 2002. Generation and initial analysis of more than 15,000
full-length human and mouse cDNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci.
99: 16899–16903.
Tugendreich, S., Bassett Jr., D.E., McKusick, V.A., Boguski, M.S., and
Hieter, P. 1994. Genes conserved in yeast and humans. Hum. Mol.
Genet. 3: 1509–1517.
Venter, J.C., Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., Sutton,
G.G., Smith, H.O., Yandell, M., Evans, C.A., Holt, R.A., et al. 2001.
The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351.
Wang, Z., Lo, H.S., Yang, H., Gere, S., Hu, Y., Buetow, K.H., and Lee,
M.P. 2003. Computational analysis and experimental validation of
tumor-associated alternative RNA splicing in human cancer. Cancer
Camargo et al.
1422 Genome Research
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
Res. 63: 655–657.
Wiemann, S., Weil, B., Wellenreuther, R., Gassenhuber, J., Glassl, S.,
Ansorge, W., Bocher, M., Blocker, H., Bauersachs, S., Blum, H., et al.
2001. Toward a catalog of human genes and proteins: Sequencing
and analysis of 500 novel complete protein coding human cDNAs.
Genome Res. 11: 422–435.
Williamson, A.R. 1999. The Merck Gene Index project. Drug Discov.
Today 4: 115–122.
Xie, H., Zhu, W.Y., Wasserman, A., Grebinskiy, V., Olson, A., and
Mintz, L. 2002. Computational analysis of alternative splicing using
EST tissue information. Genomics 80: 326–330.
Xu, Q., Modrek, B., and Lee, C. 2002. Genome-wide detection of
tissue-specific alternative splicing in the human transcriptome.
Nucleic Acids Res. 30: 3754–3766.
Yelin, R., Dahary, D., Sorek, R., Levanon, E.Y., Goldstein, O., Shoshan,
A., Diber, A., Biton, S., Tamir, Y., Khosravi, R., et al. 2003.
Widespread occurrence of antisense transcription in the human
genome. Nat. Biotechnol. 21: 379–386.
Yu, Y., Zhang, C., Zhou, G., Wu, S., Qu, X., Wei, H., Xing, G., Dong, C.,
Zhai, Y., Wan, J., et al. 2001. Gene expression profiling in human
fetal liver and identification of tissue- and
developmental-stage-specific genes through compiled expression
profiles and efficient cloning of full-length cDNAs. Genome Res.
11: 1392–1403.
WEB SITE REFERENCES
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene; Unigene
home page.
http://www.atcc.org; American Type Culture Collection home page.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq; RefSeq home page.
http://www.repeatmasker.org; RepeatMasker program.
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat; University of California Santa
Cruz, Genome Browser.
http://200.18.51.201/viewtfi; Information related to TFUs selected for
experimental validation.
http://200.18.51.201/transcript/Participants.html; Full list of participant
groups of The Ludwig-FAPESP Transcript Finishing Initiative.
http://200.18.51.201/viewconsensus; Access to consensus sequences
generated for validated TFUs.
Received October 23, 2003; accepted in revised form March 12, 2004.
Transcribed Regions in the Human Genome
Genome Research 1423
www.genome.org
Cold Spring Harbor Laboratory Press on November 14, 2008 - Published by genome.cshlp.orgDownloaded from
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo