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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
BRUNA VIANA SOARES
ESTUDO FITOQUÍMICO E ANTIFÚNGICO DE EXTRATOS DE
PLANTAS CONTRA Microsporum canis E Candida spp. ISOLADOS DE
CÃES
FORTALEZA-CE
2008
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BRUNA VIANA SOARES
ESTUDO FITOQUÍMICO E ANTIFÚNGICO DE EXTRATOS DE
PLANTAS CONTRA Microsporum canis E Candida spp. ISOLADOS DE
CÃES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual Do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,
onívoros e aves.
Orientadora: Dra. Selene Maia de Morais
Co-orientador: Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
FORTALEZA-CE
2008
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S676e Soares, Bruna Viana
Estudo fitoquímico e antifúngico de extratos de plantas contra
Microsporum canis e Cândida spp. Isolado de cães / Bruna Viana Soares
– Fortaleza, 2008
95 p.; il.
Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de Morais.
Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade
Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
1. Cães. 2. Fitoquímico. 3. Antifúngico. 4. Plantas – Nordeste
Brasileiro I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
II. Título.
CDD: 636.089
BRUNA VIANA SOARES
ESTUDO FITOQUÍMICO E ANTIFÚNGICO DE EXTRATOS DE
PLANTAS CONTRA Microsporum canis E Candida spp. ISOLADOS DE
CÃES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual Do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,
onívoros e aves.
Dissertação Aprovada em: 10/12/2008
Conceito: Satisfatório
Nota: 9,0 (nove)
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Selene Maia de Morais (Orientadora)
Universidade Estadual do Ceará
Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha
Universidade Estadual do Ceará
Profa. Dra. Eveline Solon Barreira Cavalcante
Universidade Estadual do Ceará
À Deus, à minha família e aos animais,
dedico com amor.
AGRADECIMENTOS
Agradeço e louvo a Deus por essa grande conquista.
À minha mãe Telma Viana Soares, ao meu pai Antônio José Silva Soares, ao meu irmão Ítalo
Viana Soares, à Luna e ao Ciro, minha amada família, pelo apoio, amor e carinho em todos os
momentos da minha vida.
À FUNCAP pelo suporte financeiro nesses dois anos de mestrado.
À professora Dra. Selene Maia de Morais, por ter aceitado me orientar mesmo sem me
conhecer, por seus ensinamentos e seu exemplo como pesquisadora.
Ao professor Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pela co-orientação e apoio durante a fase
experimental deste trabalho.
À Dra. Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle por sua valorosa amizade e por estar comigo
durante todo o mestrado, me ensinando, orientando, corrigindo e incentivando o interesse pela
pesquisa.
À coodenação, corpo docente e funcionários do PPGCV.
Aos professores, pesquisadores e funcionários do Centro Especializado em Micologia
Médica, pelo acolhimento, auxílio e ensinamentos que me foram ofertados.
Ao Carlos Henrique Medeiros de Abreu e sua família, por todo amor, carinho, paciência e
compreensão.
Aos colegas do mestrado em Ciências Veterinárias do PPGCV.
A todos os alunos de iniciação científica, voluntários, mestrandos e doutorandos do
laboratório de Química em Produtos Naturais, em especial às alunas Vanessa Araujo de
Queiroz e Christiana Maria Coelho Pereira pela indispensável colaboração na execução do
experimento.
RESUMO
A elevada incidência de dermatomicoses na medicina veterinária, bem como o
desenvolvimento de resistência fúngica frente às drogas antimicóticas usuais têm incentivado
a pesquisa em busca de novos agentes antifúngicos que possam ser utilizados como métodos
alternativos de tratamento destas enfermidades. Várias plantas do Nordeste brasileiro têm sido
estudadas quanto ao seu potencial antifúngico, apresentando resultados satisfatórios que
estimulam a busca por novas plantas possuidoras de princípios ativos contra fungos. Indo ao
encontro desta perspectiva, os objetivos deste trabalho foram avaliar a atividade antifúngica in
vitro de extratos e óleos esenciais obtidos de plantas comumente encontradas no Nordeste
brasileiro contra cepas de M. canis e Candida spp isoladas de cães, bem como determinar a
constituição química dos óleos essenciais, a fim de identificar os seus constituintes
majoritários. Foram estudados os extratos etanólicos das plantas Momordica charantia L,
Piper tuberculatum Jacq, Peschiera affinis (Müll.Arg.) Miers e Calotropis procera, o decocto
da Mangifera indica, o líquido da castanha de caju e seus constituintes ácido anacárdico,
cardol e cardanol (Anacardium occidentale) e os óleos essenciais de Coriandrum sativum L. e
das variedades Tommy Atkins, Rosa, Moscatel e Jasmim de M. indica. Os óleos essenciais
formam obtidos através do método de destilação por arraste de vapor d’água e seus
constituintes analisados por cromatografia de gás acoplados à espectrometria de massas. As
cepas fúngicas foram recuperadas da micoteca do Centro Especializado em Micologia
Médica e a atividade antifúngica foi averiguada pelos métodos de difusão em ágar e
microdiluição em caldo. Os extratos etanólicos de M. charantia, P. tuberculatum, P. affinis e
o decocto da M. indica demonstraram atividade apenas contra as cepas de M. canis, enquanto
o óleo essencial de C. sativum foi ativo contra todos os fungos testados. Os óleos essenciais
das variedades de M. indica apresentaram boa atividade anti-Candida, porém a variedade
Jasmim foi a mais efetiva. O óleo essencial de C. sativum possui o linalol e o geraniol como
constituintes majoritários. As variedades Rosa, Moscatel e Jasmin apresentam o óxido de
cariofileno e o epóxido de humuleno II como principais constituintes, já a variedade Tommy
Atkins possui o β–selineno e o óxido de cariofileno como constituintes majoritários.
ABSTRACT
The high incidence of dermatomycosis in veterinary medicine and the development of fungal
resistance front the usual antifungal drugs have stimulated the research to find new antifungal
agents, which can be used as alternative methods in the treatment of these diseases. Some
plants of Brazilian Northeast have been studied about its antifungal potential and its
satisfactory results have stimulated the search for new actives plants against fungi. Going to
the meeting of this perspective, the aims of this study were to evaluate the antifungal activity
of extracts and essential oils obtained from plants commonly found in Brazilian Northeast
against strains of M.canis and Candida spp. isolated from dogs, and to determine the chemical
constitution of essential oils, in order to identify its majority constituents. The ethanolic
extracts of Calotropis procera, Momordica charantia, Peschiera affinis and Piper
tuberculatum, the cashew nut shell liquid (CNSL) and constituents (anacardic acid, cardol and
cardanol) obtained from Anacardium occidentale, the of decoct of Mangifera indica, and the
essential oils from Coriandrum sativum and the varieties Tommy Atkins, Rosa, Moscatel and
Jamim of M. indica were evaluated. The essential oils were obtained by hydro-distillation
method and the chemical compositions were analyzed by gas chromatography/mass
spectroscopy. The fungal strains were obtained from the collection of the Specialized Medical
Mycology Center, and the antifungal activity was ascertained by agar-well diffusion and broth
microdilution methods. The ethanolic extracts of M. charantia, P. tuberculatum, P. affinis and
the decoct of M. indica were effective only against M. canis strains, while the essential oil
from C. sativum was active against all tested fungi. The essential oils from M. indica varieties
showed good anti-Candida activity, however the Jasmim variety was most effective. Linalool
and geraniol were the main constituents of the C. sativum essential oil. The varieties Rosa,
Moscatel and Jasmim presents caryophyllene oxide and humulene II epoxide as main
constituents, while the main constituents of Tommy Atkins variety were β–selinene and
caryophyllene oxide. Facing the foregoing, it appears that the flora of Northeast is a rich
source of plants with antifungal potential, and more studies must be conducted in order to
optimize the utilization of natural resources in the treatment of mycosis in veterinary
medicine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Morfologia geral do C. sativum.................................................................................16
Figura 2 - C. sativum.................................................................................................................16
Figura 3 - M.indica....................................................................................................................17
Figura 4 - M.charantia..............................................................................................................19
Figura 5 - P. Tuberculatum.......................................................................................................20
Figura 6 - P. affinis...................................................................................................................21
Figura 7 - C. Procera................................................................................................................22
Figura 8 - Colônias de M. canis, aspecto algodonoso e relevo radiado....................................27
Figura 9 - Colônias de Candida spp........................................................................................28
Figura 10 - Blastoconídios de leveduras...................................................................................28
Figura 11 - Tinea capitis...........................................................................................................30
Figura 12 - Dermatofitose – lesões alopécicas polimórficas, disseminadas, tendendo à
coalescência..............................................................................................................................31
LISTA DE ABREVEATURAS
ATCC - Americal Type Culture Collection
CFM - Concentração fungicida mínima
CIM - Concentração inibitória mínima
CL
50
- Concentração letal média
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
CNSL - Cashew Nut Shell Liquid
DL
50
- Dose letal média
DMSO - Dimetil-sulfóxido
°C - Graus Celsius
ISO - International Standard Organization
K.I. - Índice de retenção na coluna do cromatógrafo
LC
50
- Medium lethal concentration
LCC - Líquido da castanha de cajú
LD
50
- Medium lethal dose
µg - Micrograma
mL – Mililitro
mg - Miligrama
MFC - Minimum fungicidal concentration
MIC - Minimum inhibitory concentration
MOPS - Ácido 3 (N-morfolino) propanossulfônico
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
PPM - Parte por milhão
QPN - Química de produtos naturais
RPMI - Solução nutritiva desenvolvida no Instituto Roswell Park Memorial
UFC/mL - Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................7
LISTA DE ABREVEATURAS...............................................................................................8
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................11
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................................13
2.1 Plantas medicinais: generalidades...................................................................................13
2.1.1 Importância das plantas medicinais.................................................................................13
2.1.2 Óleos essenciais..............................................................................................................14
2.2 Plantas estudadas nesta dissertação................................................................................15
2.2.1 Coriandrum sativum L.....................................................................................................15
2.2.2 Mangifera indica L.........................................................................................................17
2.2.3 Momordica charantia L...................................................................................................18
2.2.4 Piper tuberculatum Jacq..................................................................................................19
2.2.5 Peschiera affinis (Müll.Arg.) Miers................................................................................21
2.2.6 Calotropis procera..........................................................................................................22
2.2.7 Anacardium occidentale – Líquido da castanha de caju (LCC)................................... 23
2.3 Principais constituintes dos óleos essenciais abordados nesta dissertação................24
2.3.1 Linalol........................................................................................................................24
2.3.2 Geraniol........................................................................................................................24
2.3.3 Óxido de cariofileno..................................................................................................25
2.4 Fungos: aspectos gerais....................................................................................................25
2.4.1 Dermatófitos.....................................................................................................................26
2.4.2 Leveduras.........................................................................................................................28
2.5 Estudo sobre a incidência das dermatofitoses................................................................29
3 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................33
4 HIPÓTESE...........................................................................................................................34
5 OBJETIVOS........................................................................................................................35
5.1 Objetivo Geral...................................................................................................................35
5.2 Objetivos específicos.........................................................................................................35
6 CAPÍTULO 1........................................................................................................................36
Antifungal activity, toxicity and chemical composition of the essential oil of
Coriandrum sativum L. fruits………………………………………..………………………..36
7 CAPÍTULO 2......................................................................................................................51
Screening of antifungal natural products of plants from the Northeast of Brazil against
Microsporum canis and Candida spp. strains………………………….……………………..51
8 CAPÍTULO 3…………………………………………………..…………………………..65
Chemical composition and anti-Candida activity of essential oils from Mangifera
indica L. varieties……………………………………………………………………………..65
9 CONCLUSÕES GERAIS…………………………….………………………….………..79
10 PERSPECTIVAS……………………………………...………………………………....80
11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………....………………………….81
11
1 INTRODUÇÃO
Os fungos são microrganismos que constituem um grupo diversificado e
abundante na natureza, fazendo parte de vários nichos no ambiente, incluindo a microbiota de
homens e animais. São caracterizados por estruturas unicelulares ou multicelulares e
classificados de acordo com sua morfologia em filamentosos, leveduras e dimórficos. Na
clínica veterinária de pequenos animais, os fungos patogênicos mais freqüentemente isolados
são os filamentosos, especialmente os dermatófitos, seguidos das leveduras. As doenças
infecciosas causadas por fungos constituem um problema crítico para a saúde pública,
especialmente em regiões tropicais e subtropicais em desenvolvimento (PAIXÃO et al.,
2001).
A dermatofitose nos animais de guarda e companhia, que mantêm estreito contato
com seus proprietários, se constitui em dermatopatia de importância não só pela freqüência
com que é diagnosticada em todo mundo mas, principalmente, pelo seu potencial zoonótico
(BALDA et al., 2004).
A resistência a antibióticos e a toxicidade durante tratamentos prolongados com
várias drogas antifúngicas, têm sido a razão para uma extensiva procura de novas drogas para
a terapêutica de infecções causadas por fungos. Os extratos obtidos de plantas como espécies
do gênero Croton, Lippia sidoides, Santalum album, Melaleuca alternifolia, Foeniculum
vulgare, Mentha piperita, Citrus lemon, Thuja orientales, Euphorbia prostata, Salvia texana,
Colubrina greggii, Clematis drummondii, dentre outras, têm demonstrado resultados
promissores que estimulam a busca de novas plantas com potencial antifúngico (HAMMER;
CARSON; RILEY, 1998; EZZAT, 2001; ALANÍS-GARZA et al., 2007; FONTENELLE,
2008; MATASYOH; MAYO; NGURE, 2008).
O uso das plantas medicinais e suas virtudes terapêuticas foram acumulados
durante séculos, e muito desse conhecimento empírico se encontra disponível atualmente. O
conhecimento sobre plantas medicinais representou e ainda representa o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos (DI STASI, 1996). Durante a última
metade do século XX a prática da fitoterapia tornou-se difundida por todo mundo. Isto é
suficiente, em parte, para o reconhecimento do valor do sistema de medicina tradicional e a
identificação de plantas medicinais que têm mostrado um significativo poder de cura no seu
estado natural ou como fonte de novos agentes farmacológicos (ELVIN-LEWIS, 2001).
A medicina alopática utiliza universalmente cerca de 119 drogas, com estruturas
definidas, que são extraídas de plantas superiores (CHADWICK; MARSH, 1990). A
12
existência de cerca de 250.000 espécies de plantas superiores permite deduzir que muitas
substâncias com atividade medicinal podem ser isoladas e caracterizadas estruturalmente
desses organismos vegetais. A Química de Produtos Naturais é dentro da química brasileira a
área mais antiga e a que, talvez ainda hoje, congregue um maior número de pesquisadores
(PINTO et al., 2002). Testes fitoquímicos são essenciais para a identificação dos componentes
presentes nos produtos naturais obtidos de plantas, principalmente quando estes extratos
possuem bioatividade e se pretende isolar substâncias a fim de encontrar princípios ativos.
Testes de sensibilidade in vitro e testes fitoquímicos são essenciais para que se
possa encontrar na flora nordestina novas plantas ativas contra fungos de importância
veterinária. Esta dissertação aborda estudos fitoquímicos de produtos naturais obtidos de
plantas encontradas no Nordeste brasileiro, bem como a avaliação do potencial antifúngico
contra o dermatófito Microsporum canis e a levedura Candida spp. isolados de cães.
13
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plantas medicinais: generalidades
O contexto social moderno, as necessidades do mercado farmacêutico e o
reconhecimento de que pesquisas com plantas medicinais usadas na medicina popular
representam uma abordagem compatível com o desenvolvimento de novas drogas levaram a
um aumento do número de publicações neste campo, em virtude do reconhecimento da
importância desta área de estudo por parte das instituições privadas ou governamentais
(RATES, 2001).
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no tratamento e na cura
de enfermidades é tão antigo quanto a espécie humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do
país e até mesmo nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em
feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais (MACIEL et al.,
2002).
O uso de plantas medicinais vem crescendo substancialmente nos últimos anos,
haja vista a facilidade de acesso, o baixo custo e sua compatibilidade cultural, principalmente
na região Nordeste. As formas de uso de plantas medicinais podem variar desde o uso de
chás, preparados com plantas frescas, até o uso de pós, gotas, cápsulas e outros tipos de
fitoterápicos (NOGUEIRA et al., 1996).
2.1.1 Importância das plantas medicinais
A utilização de plantas no tratamento de diversas enfermidades infecciosas ou não,
é uma prática que foi bastante utilizada por nossos antepassados, principalmente em épocas de
inexistência de produtos farmacêuticos mais avançados. O uso de produtos naturais com
propriedades terapêuticas é tão antigo quanto é a civilização humana e, por um longo tempo,
produtos minerais, plantas e animais foram as principais fontes de drogas (RATES, 2001).
Ao longo do tempo têm sido registrados variados procedimentos clínicos
tradicionais utilizando plantas medicinais. Apesar da grande evolução da medicina alopática a
partir da segunda metade do século XX, existem obstáculos básicos na utilização pelas
populações carentes, que vão desde o acesso aos centros de atendimento hospitalares à
obtenção de exames e medicamentos. Estes motivos, associados com a fácil obtenção e a
grande tradição do uso de plantas medicinais, contribuem para sua utilização pelas populações
dos países em desenvolvimento (VEIGA JR.; PINTO; MACIEL, 2005).
14
As plantas com propriedades terapêuticas utilizadas no cuidado de saúde
tradicional constituem uma importante fonte de novos compostos biologicamente ativos. Elas
aparecem como parte do cuidado tradicional de saúde em muitas partes do mundo ao longo de
décadas e têm despertados o interesse de vários pesquisadores (BELÉM, 2002; MICHELLIN
et al., 2005; FONTENELLE et al, 2007; FONTENELLE, 2008).
2.1.2 Óleos essenciais
As dificuldades observadas na utilização prática de substâncias naturais dependem
de vários fatores, podendo-se destacar, além de outros aspectos técnico científicos: (a) a
solubilidade e as quantidades relativamente pequenas bioproduzidas pelos organismos vivos;
(b) reduzido número de pesquisadores dedicados aos trabalhos de investigações,
especialmente no Brasil; (c) dificuldades sintéticas e viabilidade econômica, principalmente
quando as moléculas naturais apresentam-se dotadas de vários centros quiráis; (d) ausência de
uma política consistente para a ciência, educação e tecnologia no país; (e) interação
interdisciplinar incipiente; (f) competição com indústrias qua aplicam altos investimentos
almejando lucros exorbitantes e controle de mercado consumidor (BRAZ-FILHO, 2007).
Tanto extratos de plantas obtidos com solventes orgânicos ou por arraste com
vapor d’água (óleos essenciais) tem demonstrado atividade antimicrobiana. Os óleos
essenciais são originados do metabolismo secundário das plantas e possuem composição
química complexa. Estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência
vegetal, exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos. Ainda tem sido
estabelecido cientificamente que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades
antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (OLIVEIRA et al., 2006).
A ISO (International Standard Organization) define óleos essenciais como
misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Seus
constituintes variam desde hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpênicos, aldeídos,
cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e
até compostos com enxofre. Na mistura, tais constituintes apresentam-se em diferentes
concentrações, normalmente, um deles é o composto majoritário, existindo outros em
menores teores e alguns em baixíssimas quantidades (SIMÕES, 2004).
A composição do óleo é determinada geneticamente, sendo geralmente específica
para um determinado órgão e característica para seu estágio de desenvolvimento, contudo as
condições ambientais são capazes de causar variações significativas. Alguns aspectos
determinantes da variabilidade podem ser citados, tais como: ciclo vegetativo, processo de
15
obtenção, quimiotipos (vegetais botanicamente idênticos que diferem quimicamente) e fatores
extrínsecos (SIMÕES, 2004).
Quanto à sua aplicabilidade, os óleos essenciais são detentores de grande
importância econômica, sendo largamente utilizados tanto na indústria como edulcorantes e
aromatizantes (CRAVEIRO et al., 1977), quanto na medicina popular como componentes de
chás e infusões para aliviar distúrbios gastrintestinais (ITOKAWA et al., 1981), como
analgésicos diuréticos (MENDONÇA et al., 1991), anti-maláricos (KLAYMAN, 1985) dentre
outras atividades.
Os óleos essenciais obtidos de diversas plantas têm ganhado popularidade e
despertado interesse de pesquisadores de todo o mundo. Na medicina tradicional, muitos
óleos essenciais têm apresentado atividade contra fungos patógenos, por essa razão, pesquisas
nesta área que comprovem esta atividade de acordo com protocolos científicos modernos e
adequados tornam-se cada vez mais necessários (FONTENELLE, 2008). Muitos óleos
essenciais têm sido empregados como medicamentos complementares no tratamento de
infecções fúngicas e bacterianas (HAMMER; CARSON; RILEY, 1998). Estudos anteriores
têm demonstrado atividade de óleos essenciais contra dermatófitos e leveduras (HAMMER;
CARSON; RILEY, 1998; EZZAT, 2001; FONTENELLE et al., 2007; MATASYOH;
MAYO; NGURE, 2008). Devido a sua complexa composição, os óleos essenciais
demonstram uma variedade de ações farmacológicas, tornando-os potenciais fontes para o
desenvolvimento de várias drogas (SANTOS, 1997).
2.2 Plantas estudadas nesta dissertação
2.2.1 Coriandrum sativum L.
O C. sativum, pertencente a família das umbelíferas, é uma planta herbácea ereta,
anual, ramificada, aromática, que mede de 30-50cm de altura (Figura 1) e é conhecida
popularmente como coentro, coendro, coentro-das-hortas, coandro, caopunga, coriandro,
xendro e coendro (BRAGA, 2001; LORENZI; MATOS, 2002).
Suas folhas são compostas, pinatífidas e finas, suas flores alvas, pequenas e
dispostas em umbelas e seus frutos diaquênios globosos e minúsculos (Figura 2). Oriundo da
Europa meridional e do Oriente próximo, o coentro é amplamente cultivado no Nordeste
brasileiro, geralmente em canteiros elevados do chão (BRAGA, 2001).
É cultivado em hortas e jardins domésticos de quase todo o Brasil, principalmente
Norte, Nordeste e Centro-Oeste. Suas folhas são amplamente utilizadas como condimento na
16
culinária brasileira. É também utilizado como aromatizante de pães, licores, cervejas e na
industria de perfumes (LORENZI; MATOS, 2002).
(Fonte: www.botanical.com)
FIGURA 1- Morfologia geral do C. sativum
(Fonte: courses.nres.uiuc.edu/hort343/id/herbs.htm)
FIGURA 2 - C. sativum
Suas folhas, frutos e sementes são utilizados na medicina caseira de algumas
regiões do país, sendo considerados: sudorífico, hemostático e carminativo, empregado
principalmente para atonia gastro-intestinal (contra gases intestinais, fermentação excessiva e
cólicas gastrointestinais), contra ansiedade, nervosismo e como moderador de apetite
(LORENZI; MATOS, 2002).
17
Na sua composição química destacam-se: óleo essencial, pectinas, taninos,
mucilagem, flavonóides, acido acético e oxálico, coriandrol, limoneno, terpineno e linalool
(LORENZI; MATOS, 2002).
O óleo essencial extraído das folhas do coentro apresentou atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, e leveduras (MATASYOH;
MAYO; NGURE, 2008).
2.2.2 Mangifera indica L.
A M. indica, conhecida popularmente como mangueira, é pertencente à família
das anacardiáceas e é originaria da Ásia austro-oriental, porém hoje é naturalizada em todas as
regiões intertropicais. Trata-se de uma árvore de elevado porte, as vezes com mais de 20m de
altura e até 2,50m de diâmetro, esgalhada, formando densa e frondosa copa, em cuja sombra
não cresce planta alguma (Figura 3) (BRAGA, 2001).
(Fonte: www.nybg.org)
FIGURA 3 - M.indica
A manga, uma das mais populares frutas tropicais, originária do sudeste asiático,
foi introduzida no Brasil no século XVI, dando origem, através de sementes, a diversas
variedades cultivadas, as quais representam desde a década de 60 a mangicultura brasileira.
(SUBRAMANYAM et al., 1975; BOTREL, 1994; DONADIO et al., 1982). Há perto de cinco
18
centenas de variedades de mangas, distintas na forma, coloração e qualidade dos
frutos (BRAGA, 2001).
Recomenda-se o uso de partes da mangueira no tratamento das bronquites
crônicas e outras afecções do peito, contra disenteria, hemorragias intestinais, catarro da
bexiga, graças a presença da terebintina e outros princípios constitutivos das frutas. Ainda é
diurética e estimulante da função láctea. As folhas são galactagogas e adstringentes. As
sementes possuem propriedades anti-helmínticas (BRAGA, 2001).
2.2.3 Momordica charantia L.
A M. charantia L. é uma trepadeira pertencente à família Cucurbitaceae sendo
comumente conhecida no inglês como “bitter melon”, que significa melão amargo
(GROVER; YADAV, 2004). No Brasil foi denominada popularmente como melão-de-são-
caetano, erva-de-lavadeira, erva-de-são-vicente, fruta-de-cobra e melãozinho (SOUZA, 2001).
A M. charantia L. (Figura 4) possui folhas com bordas pontiagudas que dão à
impressão de terem sido mordidas. Todas as partes da planta, incluindo os frutos, possuem
sabor amargo. Os frutos são de formato retangular e se assemelham a um pequeno pepino,
quando jovens são de coloração verde esmeralda e passando a amarelo alaranjado quando
maduros (GROVER; YADAY, 2004).
É composta de glicosídeos, saponinas, alcalóides, óleos fixos, triterpenos,
proteínas e esteróides que são os responsáveis por suas ações biológicas (RAMAN & LAU,
1996). Vários constituintes fitoquímicos tem sido isolados de todas as partes das
plantas,sendo estes: momorcharins, momordicilin, momordenol, momordicins, momordicinin,
momordin, momordolol, charantin, charina, criptoxantin, cucurbitins, cucurbitacins,
cucurbitanas, goiaglicosídios, goiasaponinas e multiflorenol (HUSEIN et al., 1994; XIE et al.,
1998; YUAN et al., 1999; MURAKAMI et al., 2001).
Os frutos verdes são fontes de vitamina A e C, ferro e fósforo (GROVER; YADAY,
2004). Apresentam também uma mistura de saponinas esteroidais conhecidas como
charantina, peptídeos semelhantes à insulina e alcalóides (RAMAN; LAU, 1996), que são
responsáveis pela atividade hipoglicemiante e antihiperglicêmica (ALI et al., 1993). Dos
frutos da M. charantia foi isolada a proteína MAP30, a qual foi atribuída à atividade anti-
tumoral in vitro, observada em certas linhagens celulares (RYBAK et al., 1994) e a atividade
anti-HIV (ROSS, 1999). Observou-se in vitro uma atividade antibacteriana contra
Helicobacter pylori quando se utilizou o extrato etanólico obtido dos frutos de M. charantia
(YESILADA et al., 1999).
19
Os extratos das folhas (aquoso, etanólico e metanólico) de M. charantia têm
demonstrado, clinicamente e experimentalmente, atividade antimicrobiana de largo espectro
de ação (KHAN, 1998). In vitro, apresentou ação contra Escherichia coli, Salmonella
paratyphi, Shigella dysenterae e Streptomyces griseus (OMEREGBE et al., 1996), observou-
se também um aumento na resistência a infecções virais (CUNNICK et al., 1990).
No Nordeste brasileiro a M. charantia é encontrada em abundância e foram descritas
onze subespécies que são próprias da região. Muitas pesquisas têm sido feitas com essas
subespécies, suas folhas foram usadas oralmente na forma de infusão e cozimento como
antidiarréico e anti-reumático (MATOS, 1997). O extrato etanólico das folhas demonstrou
atividade contra o Haemonchus contortus, nematóide comum em caprinos (BATISTA et al.,
1999), atividade antiinflamatória em modelos experimentais (FARIAS, 2003), contra
Microsporum canis em camundongos e coelhos tratados durante cinco dias consecutivos
(BRAGA, 2003) e atividade contra lesões gástricas induzidas experimentalmente por etanol
(LEITE et al., 2002; LEITE, 2004).
(Fonte: www.hear.org)
FIGURA 4 - M.charantia
2.2.4 Piper tuberculatum Jacq.
É uma planta subarbustiva nativa do Brasil, pertencente à família Piperaceae,
constituída de um arbusto ereto, ramificado, perenifólio, de hastes articuladas e nodosas, de 2-
4 m de altura (Figura 5). Possui folhas simples, inteiras, cartáceas, opacas em ambas a faces,
com a inferior finamente pubescente. Suas flores são pequenas, discretas, reunidas em espigas
alongadas, densas e curvas, de 10-17 cm de comprimento, e multiplica-se por sementes
(LORENZI; MATOS, 2002).
20
É considerada uma planta daninha entre as pastagens, sendo ocasionalmente
cultivada com fins ornamentais. Contudo, é na medicina natural que sua popularidade é
maior, onde seus preparados são utilizados como tônico, carminativo, antiespasmótico, contra
blenorragia e afecções do fígado, vesícula e baço. Externamente é utilizada contra a erisipela
e seu óleo essencial mostrou atividade contra cercárias, forma intermediária do agente
causador da esquistossomose. Análises fitoquímicas encontraram nas folhas de P.
tuberculatum um derivado do ácido cinâmico, a piperlongumina, e um alcalóide dimérico
pouco comum na natureza (LORENZI; MATOS, 2002).
Estudos com extratos de plantas da família Piperaceae tem mostrado uma grande
diversidade de metabólitos com marcantes atividades biológicas. Dentre estes metabólitos
podem ser citados lignanas, neolignanas, terpenos, propenilfenóis, chalconas, flavonas,
benzopiranos e amida. Na Paraíba P. tuberculatum, conhecida popularmente como “pimenta-
longa” e “pimenta d’arda”, tem sido largamente empregada na medicina tradicional como
sedativo e antídoto para picadas de cobras. Constituintes isolados (amidas) desta planta
demonstraram excelente atividade contra o fungo Cladosporium sphaerospermum e
Cladosporium cladosporioides, onde os valores dos MICs para as amidas foram similares aos
observados para os compostos de referência, miconazol e nistatina (DEBONSI et al., 2006;
SILVA et al., 2007).
(Fonte: huntbot.andrew.cmu.edu)
FIGURA 5 - P. tuberculatum
21
2.2.5 Peschiera affinis (Müll.Arg.) Miers
P. affinis é um arbusto da família Apocynaceae, conhecida popularmente como
“empigeira”, “grão de bode”, grão de porco” em diversas partes do País e como “grão de
galo” no Estado do Ceará. É uma espécie que tem como habitat natural o cerrado brasileiro,
entretanto existem registros de sua ocorrência no Nordeste, especialmente no Ceará
(MONNERAT et al., 2005; SANTOS, 2008).
A família Apocynaceae caracteriza-se pela freqüênte ocorrência de compostos
alcalóidicos. Nas espécies de Peschiera, há predominantemente a presença de alcalóides
indólicos, os quais apresentam diversidades estruturais. A literatura reporta a presença de
alcalóides indólicos como alguns dos mais significativos marcadores quimiotaxonômicos
deste gênero (KAM; SIM; PANG, 2003; MONNERAT et al., 2005).
Os alcalóides indólicos apresentam diversas atividades biológicas tais como anti-
tumoral, antimicrobiana, anti-hipertensiva, contraceptiva, antinflamatória, antimalarial, anti-
HIV, bactericida e leishmanicida, além de ação estimulante sobre o sistema nervoso central
(ANDRADE et al., 2005; MONNERAT et al., 2005).
A P. affinis (Figura 6) é um arbusto esgalhado com cerca de 1-1,5 metro de altura.
Todas as partes possuem abundante látex branco e viscoso. A floração nos anos de chuvas
normais é iniciada em agosto, atingindo o seu apogeu entre os meses de janeiro e fevereiro
quando começa a frutificação. A parte aérea é formada por vários caules epígeos, lenhosos,
curtos, muito ramificados e originados de um xipódio subterrâneo. Os espécimes mais velhos
chegam a formar um tronco tortuoso de pequena espessura (3-10 cm), revestido pou um súber
pardo escuro muito rugoso e fendilhado (WOLTER-FILHO, 1981).
(Fonte: Santos, 2008)
FIGURA 6 - P. affinis
22
2.2.6 Calotropis procera
É uma Asclepiadácea conhecida popularmente como algodão de seda, seda,
hortência, flor-de-seda, ciúme, ciumeira, leiteiro, paininha-de-seda, queimadeira e janaúba. A
C. procera trata-se de um arbusto perene, ereto, pouco ramificado, fortemente lactescente,
com casca esponjosa e pode alcançar de 1,5 a 3,5 metros de altura. É provavelmente nativa da
Índia e naturalizada em todas as regiões tropicais semi-áridas da América, inclusive no Brasil
desde o Nordeste até o norte de Minas Gerais. Suas folhas são grandes, subcoriáceas, com
tomento esbranquiçado na face inferior, medindo 15 a 30 cm de comprimento. Possui flores
arroxeadas, dispostas em inflorescências fasciculadas terminais. Os frutos são cápsulas
infladas, globosas, grandes, com sementes envolvidas em painas sedosas brancas. Multiplica-
se apenas por sementes que são disseminadas pelo vento (Figura 7) (LORENZI; MATOS,
2002; BRAGA, 2003).
A literatura etnofarmacológica registra o emprego de suas folhas, raízes e látex na
medicina caseira em algumas regiões do país. Suas folhas em cozimento são tônicos
estimulantes, anti-reumáticas e tranquilizantes, seu látex é utilizado por sertanejos como
odontálgico (LORENZI; MATOS, 2002; BRAGA, 2003).
(Fonte: www.bushtrucker.ch)
FIGURA 7 - C. procera
Preparados da planta também são utilizados para o tratamento de epilepsia,
histeria, câncer, escaras, elefantíase, febre, gota e picada de cobra. Estudos adicionais
mostraram que seu látex tem forte atividade proteolítica e que o extrato das raízes possui
23
atividade antinflamatória e ação analgésica segundo ensaios realizados com animais de
laboratório (LORENZI; MATOS, 2002). Populares também a utilizam para tratar pruridos e
problemas de pele de seus animais de estimação, porém não há nenhuma comprovação
científica sobre este uso.
2.2.7 Anacardium occidentale – Líquido da castanha de caju (LCC)
O cajueiro (Anacardium occidentale, L.) é uma planta nativa do Brasil, e encontra-se
hoje espalhado também na África e Ásia. Produz um fruto, a castanha, de importância
industrial por si e, pela produção, durante o beneficiamento da amêndoa da castanha de caju,
de um subproduto denominado líquido da castanha do caju (LCC), conhecido
internacionalmente como Cashew Nut Shell Liquid (CNSL) (RODRIGUES, 2006).
A agroindústria do caju representa para a região Nordeste uma atividade econômica e
social de grande expressão, que garante renda para mais de 300 mil pessoas e gera divisas
superiores a 100 milhões de dólares anuais. Durante muito tempo somente a amêndoa foi
considerada parte utilizável do caju, enquanto o LCC era considerado produto secundário que
dificultava o processamento da amêndoa (RODRIGUES, 2006).
O LCC é constituído de uma mistura de compostos fenólicos extraídos da casca da
castanha de caju. O principal componente do LCC é o ácido anacárdico (ácido 3-n-
pentadecilsalicílico), um composto aromático com uma cadeia alquilica longa e insaturada,
presente em 80-90%, enquanto o cardol (3-n-pentadecilresorcinol), o cardanol (3-n-
pentadecilfenol) e o metilcardol (2-metil-5-n-pentadecilresorcinol) estão presentes em
menores quantidades (KATTIMUTTATHU; VADI, 2005).
Sais de amônio quaternário, obtidos a partir do cardanol, vêm sendo utilizados como
desinfetantes, germicidas e agentes sanitários, principalmente na indústria de alimentos e de
limpeza (PRABHAKARAN et al., 2001). Outra aplicação dos derivados do cardanol que vem
crescendo bastante nos últimos anos é como antioxidante, onde são utilizadas principalmente
para estabilizar principalmente alimentos, combustíveis, lubrificantes e polímeros
(KLEMCHUCK, 1999).
O extrato metanólico da casca do caule do cajueiro apresentou atividade in vitro contra
Cryptococcus neoformans (BRAGA et al., 2007). FENNER et al.(2006) relatam que diversas
partes do cajueiro são utilizadas na medicina popular como anti-séptico e para o tratamento de
aftas, úlceras, feridas, impingens, e leucorréia. Agentes indígenas de saúde da área Araribóia,
no Maranhão, utilizam a casca do cajueiro para o tratamento de diabetes (COUTINHO et al.,
24
2002), e SALGADO et al. (2001) citam uso popular como anti-séptico vaginal e para o
tratamento de diarréia, calos e infecções de pele.
2.3 Principais constituintes dos óleos essenciais das plantas estudadas
A composição química dos óleos essenciais depende de vários fatores. Além da
técnica de extração utilizada outros, tais como, a localização geográfica, o estágio do ciclo
vegetativo da planta, condições climáticas, as técnicas de cultivo, variações sazonais e
circadianas podem levar a obtenção de óleos cujo aroma difere daquele da planta de origem
(SILVA, 2007).
2.3.1 Linalol
O linalol é um componente monoterpenóide comumente encontrado em óleos
essenciais de plantas aromáticas. Espécies vegetais que contém linalol são utilizadas para
aliviar sintomas e até mesmo curar uma ampla variedade de doenças agudas
e crônicas (PEANA; MORETTI, 2002).
A atividade antimicrobiana do linalol contra fungos e bactérias
tem sido amplamente estudada (CARSON; RILEY, 1995; PATTNAIK et
al., 1997; PEANA et al., 1999; DELAQUIS et al, 2002). Dorman e Deans
(2000) avaliaram a atividade antimicrobiana de vários constituintes de óleos
essenciais, onde relataram atividade do linalol contra 23 diferentes tipos de
bactérias.
Além da atividade antimicrobiana do linalol, foram relatadas várias outras
propriedades medicinais, tais como: sedativa (ELISABETSKY et al., 1995; LINCK et al.,
2008), anticonvulsivante (ELISABETSKY et al., 1999), anti-inflamatória (PEANA et al.,
2002), efeito espasmolítico (LIS-BALCHIN; HART, 1999) e atividade anestésica
(GHELARDINI et al., 1999; RE et al., 2000).
2.3.2 Geraniol
O geraniol, também chamado de rhodinol, é monoterpeno e um álcool
presente na constituição química de óleos essenciais extraídos de várias
plantas como o coentro (C. sativum), capim-citronela (Cymbopogon
winterianum Jowitt.), alfavaca (Ocimum gratissimum L.), óleo de rosas,
limão, dentre outros. Devido ao seu odor, é muito empregado em perfumes e
25
aromatizantes de alimentos sabor pêra, amora, melão, maçã vermelha, lima, laranja, limão,
melancia e abacaxi.
Pesquisas têm evidenciado o geraniol como um efetivo repelente de insetos
(BARNARD & XUE, 2004). Por outro lado, ele também é produzido por glândulas olfativas
de abelhas para ajudar a marcar as flores com néctar e localizar as entradas para suas
colméias.
2.3.3 Óxido de cariofileno
O óxido de cariofileno é um sesquiterpeno descrito na literatura como
antinflamatório (SHIMIZU et al,1990), fagorrepelente (KEELER; TU, 1991), antitumoral
(ZHENG et al, 1992), além de inseticida (BETTARINI; BORGONOVI, 1991).
Provavelmente existe uma correlação entre a atividade antifúngica
dos óleos essenciais estudados e seus principais constituintes.
Estudos prévios têm demonstrado que óleos essenciais possuidores
de espatulenol e óxido de cariofileno como principais constituintes
têm exibido atividade inibitória contra espécies de fungos
filamentosos (FARAG et al., 2004; WENQIANG et al., 2006)
2.4 Fungos: aspectos gerais
Os fungos são organismos onipresentes em nosso ambiente. Apesar de milhares de
espécies existentes, a grande maioria é saprofítica do solo ou agente patogênico vegetal, e
apenas 300 são descritos como capazes de causar doenças em animais. Vários critérios são
utilizados para diferenciar fungos patogênicos de contaminantes como: origem; número de
colônias isoladas; espécies; se os elementos fúngicos podem ser repetidamente isolados;
demonstração de organismos fúngicos no tecido lesado; e títulos sorológicos positivos e
ascendentes em testes pareados. Com base em critérios clínico-laboratoriais, as infecções
micóticas podem ser classificadas quanto à sua distribuição em localizadas, multifocais e
generalizadas; e quanto ao tecido acometido em superficiais, subcutâneas e sistêmicas ou
profundas (ANDRADE, 2002).
Micoses sistêmicas, tais como histoplasmose, paracoccidioidomicose e
criptococose, são infecções fúngicas que acometem os órgãos internos, constituindo-se um
grande problema na clínica humana e veterinária devido a seu caráter crônico e a dificuldade
de diagnóstico (BEER, 1999; SPINOSA; GÒRNIAK; BERNARDI, 2002).
26
As afecções fúngicas recebem os nomes de micoses superficiais ou
dermatomicoses quando os fungos somente afetam a epiderme e suas formações anexas
(pêlos, cornos, unhas e cascos), ficando limitados às mesmas. As dermatomicoses dos animais
domésticos são provocadas, preferencialmente, por diversas espécies de dermatófitos e,
esporádica e excepcionalmente, por leveduras (BEER, 1999).
2.4.1 Dermatófitos
Dermatófitos são fungos patogênicos causadores de infecções na pele, cabelo, pêlo
e unhas, onde utilizam o substrato queratinoso como fonte alimentar (MARTINEZ-ROSSI;
PERES; ROSSI, 2008).
Os dermatófitos pertencem ao reino Fungi, filo Mycota. As dermatofitoses são
causadas por três gêneros de fungos patogênicos: Microsporum, Trichophyton e
Epidermophyton (SIDRIM; ROCHA, 2004), cuja diferenciação é realizada de acordo com a
forma dos macroconídios e dos microconídios (GRÄSER et al., 1998). Entretanto, as espécies
responsáveis pela ocorrência de dermatofitose em cães e gatos pertencem especialmente aos
gêneros Microsporum e Trichophyton (MACIEL; VIANA, 2005). Embora haja inúmeras
espécies de dermatófitos, a maioria dos casos clínicos em cães e gatos é causada por três
delas: M. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes (CABAÑES et al., 1997; BRILHANTE et
al., 2003).
De acordo como seu habitat natural os dermatófitos são classificados em
geofílicos, zoofílicos e antropofílicos (SIDRIM; ROCHA, 2004). Os geofílicos habitam o
solo, vivem como saprófitas e podem parasitar o hospedeiro desencadeando intensa reação
inflamatória; os zoofílicos são dermatófitos adaptados à pele e pêlos de animais, e raramente
são encontrados no solo; os antropofílicos são adaptados à pele e anexos de seres humanos, e
não sobrevivem no solo (OLIVARES, 2003).
Vários autores citam que algumas dermatofitoses são consideradas zoonoses
(GARCIA; BLANCO, 2000; CRESPO et al., 2000; TAKAHASHI, 2003). Devido aos
aspectos de saúde pública, as dermatofitoses em cães e gatos merecem atenção especial, uma
vez que estes animais mantêm estreito contato com humanos, especialmente crianças. O
animal é infectado quando, apesar dos mecanismos de defesa do hospedeiro, o agente penetra
o extrato córneo ou o folículo piloso (MENDLEAU; RISTIC, 1992). A instalação do processo
infeccioso primário clássico está relacionada ao fato de os dermatófitos produzirem enzimas
queratolíticas e lipase, cuja ação favorece entrada e instalação da micose na pele e pêlos
(CARLTON; MCGAVIN,1998), e, em segundo plano, a forças mecânicas. Viani et al.
27
(2001), em estudos sobre a atividade enzimática em cepas de M. canis, analisaram
queratinases, li pases e elastases e demonstraram que a enzima queratinase está correlacionada
diretamente com o desenvolvimento dos sintomas das lesões dermatofíticas, não sendo
observada tal situação com as demais enzimas.
O dermatófito acomete o tecido queratinizado, penetra a pele, pêlos e unhas
causando danos mecânicos que resultam em descamação da superfície epitelial e quebra do
pêlo. Seus metabólitos se difundem pelas células da epiderme causando reação inflamatória e
de hipersensibilidade, responsáveis pelo desenvolvimento das lesões (DAHL, 1994). A
apresentação clínica da dermatofitose é muito variada, mas a lesão clássica descrita na
literatura é caracterizada por alopecia circinada, irregular ou difusa e de expansão centrífuga.
As lesões acometem mais comumente a face, as orelhas, as patas e a cauda, podem evoluir
para uma cura espontânea ou para lesão generalisada crônica que afeta todo o corpo do animal
(MACIEL; VIANA, 2005). Em geral, o prurido é mínimo ou ausente, mas pode ser acentuado
pela presença de ectoparasias ou alergias.
O M. canis (Figura 8), dentre os dermatófitos, é o responsável pela maioria de
casos de micoses em animais de estimação e o mais freqüente dermatófito zoofílico de
humanos, em diversas áreas urbanas (SIMPANYA; BAXTER, 1996; CABAÑES, 2000;
BRILHANTE et al., 2003). É um fungo filamentoso, cosmopolita, transmitido por diversos
animais domésticos, tendo como principal reservatório felinos jovens, que podem apresentar-
se clinicamente afetados e, em contraste, os adultos portadores podem não apresentar lesões
(SIDRIM; ROCHA, 2004).
(Fonte: CEMM, 2007)
FIGURA 8: Colônias de M. canis, aspecto
algodonoso e relevo radiado
28
2.4.2 Leveduras
O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes hialinos, que
apresentam duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou teleomorfa.
Taxonomicamente são enquadradas no grupo dos ascomicetos, visto que a reprodução
sexuada é caracterizada pela produção de ascos (SIDRIM; ROCHA, 2004).
O isolamento de Candida spp a partir da microbiota de animais saudáveis é pouco
relatado, no entanto sabe-se que são leveduras sapróbias de homens e animais. Espécies do
gênero estão presentes em diferentes sítios, como tubo digestivo, mucosas e pele de várias
espécies animais, incluindo muitos pássaros. C. albicans e C. parapsilosis são tidas como as
espécies mais isoladas e normalmente habitam os sistemas gastrointestinal e respiratório, além
da mucosa genital de animais (RINALDI, 1993; HESELTINE et al., 2003).
Espécies de Candida que vivem como comensais podem se tornar patógenas e
causar enfermidades, denominadas candidíases, em decorrência de distúrbios nas proteções
física, química e imunológica do hospedeiro associados à virulência da cepa (MUELLER et
al., 2002; MORETTI et al., 2004). São fatores predisponentes a esse tipo de infecção:
presença de doenças auto-imunes, Diabetes mellitus, uso de corticosteróide e antimicrobianos
de largo espectro, cateterismo venoso e urinário e administração de nutrição parenteral
(HESELTINE et al., 2003).
O gênero Candida spp apresenta colônia de coloração branca, superfície lisa e
textura glabrosa úmida (RAPOSO et al., 1996) (Figura 9), que crescem bem dentro de 48
horas, entre temperaturas de 25 e 37°C (SIDRIM; ROCHA, 2004). Com relação à
microscopia, se lâminas forem preparadas diretamente a partir de um fragmento da colônia ou
de amostra clínica positiva, apenas estruturas unicelulares, denominadas blastoconídios, que
podem estar isoladas ou apresentando brotamento, vão ser visualizadas (Figura 10).
(Fonte: CEMM, 2005) (Fonte: CEMM, 2005)
FIGURA 9- Colônias de Candida spp. FIGURA 10- Blastoconídios de leveduras
29
Para identificação e fenotipagem de uma espécie do gênero Candida, muitos
aspectos são levados em consideração, como morfologia, capacidade de formar tubo
germinativo, assimilação de carboidratos, assimilação de nitrogênio e fermentação de
carboidratos (DEL CASTILLO et al., 1997; SIDRIM; ROCHA, 2004; BRITO, 2005).
2.5 Estudo sobre a incidência das dermatofitoses
O termo zoonose pode ser definido como infecção ou doença transmitida
naturalmente entre animais vertebrados e o homem. As dermatofitoses estão entre as zoonoses
micóticas mais difundidas no mundo, e são contraídas principalmente pelo íntimo contato
com os agentes (FERREIRO et al., 2007).
A magnitude de ocorrência e o fato dessas dermatopatias constituírem
antropozoonoses de alta incidência em pacientes humanos, sobretudo nas primeiras faixas
etárias, levaram ao estudo pormenorizado de aspectos clinicoepidemiológicos das
dermatofitoses tanto na medicina veterinária quanto na medicina humana (LARSSON;
LUCAS; GERMANO, 1997).
As dermatopatias de etiologia fúngica de cães e gatos, principalmente a
microsporíase, são de grande relevância no contexto da Saúde Pública, visto que a criação e a
manutenção de animais de companhia no ambiente domiciliar é amplamente difundido em
todas as camadas da sociedade. As crianças, os adultos debilitados, os idosos e os
imunodeficientes constituem o grupo de maior risco, sendo, contudo, os portadores do HIV os
indivíduos que inspiram maior preocupação, dada a grande suscetibilidade a infecções por
fungos (LARSSON; LUCAS; GERMANO, 1997).
É possível a infecção humana por dermatófitos zoofílicos ou geofílicos, entretanto
é rara a infecção animal por dermatófitos antropofílicos, os quais dificilmente regridem na
cadeia ecológica (PINHEIRO; MOREIRA; SIDRIM, 1997).
Pinheiro, Moreira e Sidrim (1997) apontaram uma freqüência maior das espécies
antropofílicas sobre as espécies zoofílicas na etiologia de dermatofitoses humanas no meio
urbano, contrastando com achados de pesquisas realizadas em regiões rurais, onde se
caracteriza o contato direto do homem com os animais domésticos de diferentes espécies e a
predominante ocorrência de dermatofitoses zoofílicas (PINHEIRO; MOREIRA; SIDRIM,
1997).
É possível admitir que a ocorrência de dermatofitose por espécies antropofílicas
está, direta ou indiretamente, associada a diversos fatores, entre os quais não se inclui o
contato com cães e gatos domésticos. Quanto às infecções humanas por dermatófitos
30
zoofílicos, estas, apesar de esporádicas, estão diretamente associadas a animais infectados.
Este fato não inviabiliza o convívio do homem com cães e gatos domésticos, uma vez que as
dermatofitoses zoofílicas no meio urbano apresentam baixa freqüência e o convívio do
homem com animais domésticos tem pequena representação em microepidemias familiares
por dermatófitos antropofílicos (PINHEIRO; MOREIRA; SIDRIM, 1997).
O Tricophyton rubrum é a espécie predominante do total de dermatófitos isolados em
humanos, seguido do Trichophyton tonsurans, M. canis e T. mentagrophytes. O T. tonsurans
é o principal causador de microepidemias familiares, sendo o agente etiológico mais freqüênte
da Tinea capitis (Figura 11) nas regiões Norte e Nordeste, mostrando-se bastante adaptado à
temperatura e umidade relativas elevadas (PINHEIRO; MOREIRA; SIDRIM, 1997;
BRILHANTE et al., 2000). As principais regiões humanas acometidas pelos dermatófitos são
o corpo (regiões de pele glabra), especialmente a região inguinal; o couro cabeludo e os pés
(BRILHANTE et al., 2000).
(Fonte: www.visualdxhealth.com)
FIGURA 11 - Tinea capitis
O dermatófito isolado com maior freqüência em cães e gatos é o M. canis, seguido
pelo M. gypseum e T. mentagrophytes, embora ocorra variação de espécies em diferentes
regiões do mundo. No que tange à predisposição etária quanto à instalação das dermatofitoses,
animais com menos de 12 meses de idade são os mais acometidos, podendo esta maior
suscetibilidade estar vinculada à imaturidade do sistema imunológico (BALDA et al., 2004).
Animais de raça são os mais acometidos e pode ser observada uma maior prevalência
em cães da raça Yorkshire Terrier, Poodle e Pastor Alemão e gatos Persa (LEWIS et al., 1991;
CABAÑES, 2000; BRILHANTE et al., 2003). Teoricamente os pêlos alongados facilitam as
condições ótimas de temperatura e umidade para que as estruturas fúngicas fiquem protegidas
31
contra a dissecação, favorecendo assim a sua propagação. Tais evidências conflitam com
trabalhos realizados sobre dermatofitoses em humanos, onde o pêlo curto favorece a
implantação de artroconídios. A presença de substâncias na pele como sebo e suor, ou ainda
fatores genéticos podem ser considerados fatores de susceptibilidade de algumas raças às
dermatofitoses (SPARKER, 1993).
Com relação à sazonalidade, não se demonstra vinculação das dermatofitoses às
estações do ano. No tocante ao sexo do animal, não são verificadas predisposições sexuais
relacionadas às infecções fúngicas superficiais (LARSSON; LUCAS & GERMANO, 1997;
BALDA et al., 2004). As lesões geralmente não apresentam prurido, ou quando este está
presente, é de intensidade moderada. Topograficamente, observam-se lesões assestadas em
ambas espécies, geralmente em ordem decrescente de freqüência nas regiões cefálica,
torácica, de membros, cervical e abdominal (Figura 12). As dermatofitoses são caracterizadas
por lesões alopécias, crostosas, discrômicas, descamativas, papulares e nos cães
adicionalmente, pela presença de liquenificação, pústulas e de lesão em colarinho epidérmico
(BALDA et al., 2004).
(
Fonte: HOVET/FMVZ-USP,São Paulo, 2001)
FIGURA 12 - Dermatofitose – lesões alopécicas
polimórficas, disseminadas, tendendo à coalescência.
Dentro da relação entre seres humanos e animais, não se pode atribuir potencial
zoonótico somente aos animais domésticos que apresentem quadro clínico de dermatofitoses,
mas também animais assintomáticos, portadores do microrganismo como parte de microbiota
da pele normal (ROMANO, 1987; CABAÑES et al., 1997), em até 88% de prevalência
(SPARKES, 1994). Observa-se uma estreita correlação entre estes portadores assintiomáticos
32
e a boa adaptação de M. canis aos pêlos e pele destes pequenos animais (MORIELLO;
DEBOER, 1991).
33
3 JUSTIFICATIVA
A elevada incidência de dermatomicoses na medicina veterinária, bem como o
desenvolvimento de resistência fúngica têm incentivado a pesquisa em busca de novos
agentes antifúngicos que possam ser utilizados como métodos alternativos de tratamento
destas enfermidades. No Laboratório de Química em Produtos Naturais da Universidade
Estadual do Ceará e no Centro Especializado em Micologia Médica da Universidade Federal
do Ceará, várias plantas têm sido estudadas quanto ao seu potencial antifúngico, apresentando
resultados satisfatórios que estimulam a busca por novas plantas possuidoras de princípios
ativos contra fungos.
34
4 HIPÓTESE
Os extratos etanólicos das plantas Momordica charantia L, Piper tuberculatum
Jacq, Peschiera affinis (Müll.Arg.) Miers e Calotropis procera, o decocto da Mangifera
indica, o líquido da castanha de caju e seus constituintes ácido anacárdico, cardol e cardanol
(Anacardium occidentale) e os óleos essenciais de Coriandrum sativum L. e das variedades
Tommy Atkins, Rosa, Moscatel e Jasmim de M. indica apresentam atividade antifúngica
contra cepas de M. canis e Candida spp. isoladas de cães.
35
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
Realizar o estudo fitoquímico de extratos e óleos esenciais de plantas comumente
encontradas no Nordeste brasileiro e avaliar sua atividade antifúngica contra cepas de M.
canis e Candida spp isoladas de cães.
5.2 Objetivos específicos
1 Obter extratos e óleos essenciais das plantas selecionadas;
2 Testar a atividade antifúngica de extratos e óleos essenciais de plantas selecionadas;
3 Analisar a constituição química do óleos essenciais e identificar seus constituintes
majoritários.
36
6 CAPÍTULO 1
ANTIFUNGAL ACTIVITY, TOXICITY AND CHEMICAL COMPOSITION OF THE
ESSENTIAL OIL OF CORIANDRUM SATIVUM L. FRUITS
Running Head: ANTIFUNGAL CORIANDRUM SATIVUM ESSENTIAL OIL
B.V. Soares
a
, S.M. Morais
a,b*
, R.O.S. Fontenelle
c
, V.A. Queiroz
b
, N.S. Vila-Nova
a
,
C.M.C. Pereira
b
, E.S. Brito
d
, M.A. Souza Neto
d
, M.F.G. Rocha
a,c
.
a
Faculty of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State University of
Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
b
Department of Chemistry, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
c
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
d
Embrapa Tropical Agroindustry Center, Fortaleza, Ceará, Brazil
Corresponding author: Selene Maia de Morais. Rua Ana Bilhar, 601, Apto 400: Meireles.
CEP: 60 160-110. Fortaleza, Ceará, Brazil, Phone: 55 (85) 3232-3834. Fax: 55 (85) 3495-
8692. E.mail: [email protected]
37
Resumo
Objetivo: Encontrar novos agentes antifúngicos.
Metodologia e Resultados: O óleo essencial dos frutos do C. sativum foi obtido por hidro-
destilação e analisado por cromatografia gasosa/espectrometria de massas. O constituinte
majoritário foi o linalol (58,22%). O óleo essencial foi considerado bioativo, pois mostrou
uma CL
50
de 23 µg mL
-1
no teste de letalidade frente à Artemia salina. A atividade
antifúngica contra Microsporum canis e Candida spp foi avaliada através do método de
difusão em ágar e a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima
(CFM) através do teste de microdiluição em caldo. O óleo essencial induziu zonas de inibição
de 28 ± 5.42 e 9.25 ± 0.5 para M. canis e Candida spp., respectivamente. As CIMs e CFMs
para cepas de M. canis foram de 78 a 620 e de 150 a 1250 µg mL
-1
, e as CIMs e CFMs para as
cepas de Candida spp foram de 310 a 620 e de 620 a 1250 µg mL
-1
, respectivamente.
Conclusões: O óleo essencial obtido dos frutos de C. sativum é ativo contra M. canis e
Candida spp., demonstrando boa atividade antifúngica.
Significado e impacto deste estudo: O óleo essencial dos frutos de C. sativum pode ser uma
fonte útil de compostos antifúngicos para a medicina veterinária.
Palavras-chave: Coriandrum sativum, Óleo essencial, Microsporum canis, Candida spp.,
Artemia salina, Linalol.
38
Abstract
Aims: To find new antifungal agents.
Methods and Results: The essential oil from fruits of C. sativum L. obtained by hydro-
distillation was analyzed by gas chromatography/mass spectroscopy. Linalool was the main
constituent (58.22%). The oil was considered bioactive, showing an LC
50
value of 23 µg mL
-1
in the Artemia salina lethality test. The antifungal activity was evaluated against
Microsporum canis and Candida spp. by the agar-well diffusion method and the minimum
inhibitory concentration (MIC) and the minimum fungicidal concentration (MFC) by the
broth microdilution method. The essential oil induced growth inhibition zones of 28 ± 5.42
and 9.25 ± 0.5 for M. canis and Candida spp. respectively. The MICs and MFCs for M. canis
strains ranged from 78 to 620 and 150 to 1250 µg mL
-1
, and the MICs and MFCs for Candida
spp strains ranged from 310 to 620 and 620 to 1250 µg mL
-1
, respectively.
Conclusions: C. sativum essential oil is active in vitro against M. canis and Candida spp.
demonstrating good antifungal activity.
Significance and impact of this study: C. sativum essential oil can be a useful source of
antifungal compounds for veterinary medicine.
Keywords: Coriandrum sativum, Essential oil, Microsporum canis, Candida spp., Artemia
salina, Linalool.
39
Introduction
Dermatophytosis are one of the most frequent skin diseases of pets and livestock.
Contagion among animal communities, high treatment cost, difficulties of control measures
and public health consequences of animal ringworm are all factors urging the study of these
fungi (Chermette et al., 2008). Fungal disease agents are widespread and can be isolated from
a wide range of sick animals or asymptomatic carriers, which can represent important
reservoirs for people in close contact with them. This situation should be considered as an
important risk factor for those with impairment of their immune systems and, therefore,
anyone working with or handling animals. The dermatophytosis caused by Microsporum
canis presents an increasing incidence in human patients in several Brazilian cities and also in
the world and it is often the predominant fungus in dermatological clinics (Ferreiro et al,
2007).
Yeast of the genera Candida can be found as commensal microorganisms in
animals and are considered one of the most important species in veterinary medicine. Strains
of Candida spp. isolated from dogs showed high resistance to azole antifungal agents (Brito et
al., 2007). Although effective antimicrobials have been developed over the years, there has
been increased development of antimicrobial drug resistance to currently available
antimicrobials (Chopra, 2007). Many essential oils and plant extracts used in therapy have
many advantages over antibiotics, although the latter are more effective (Fontenelle et al,
2007).
The essential oil from leaves of C. sativum showed antimicrobial activity against
both Gram positive and Gram negative bacteria. This plant is known not to be toxic because it
has been consumed for centuries without showing any signs of toxicity (Matasyoh et al.,
2008).
Due to known antibacterial activity of the leaf essential oil of C. sativum, the aim
of this study was to evaluate the antifungal activity of the essential oil from fruits by the agar
diffusion and microdilution methods, and to determine its main chemical constituents. In
order to evaluate the potential use of C. sativum essential oil as a phytotherapic product, the
toxicity was investigated using the Artemia salina lethality test.
Materials and Methods
Plant material and extraction of essential oils
The fruits used for extraction of the essential oil were harvested from
plants cultivated in the Medicinal Plants Orchard of State University of Ceará, from
40
commercial seeds produced by ISLA Sementes Ltda. (Porto Alegre, RS, Brazil). The C.
sativum essential oil was extracted by the hydro-distillation method in a modified
Clevenger apparatus, as described by Craveiro et al. (1976).
Gas-chromatography/mass spectral (GC-MS) analysis
The chemical analysis of the essential oil constituents was performed on a
Shimadzu QP-2010 instrument employing the following conditions: column: DB-5ms
(Agilent, part No. 122-5532) coated fused silica capillary column (30m x 0.25mm x 0.25µm);
carrier gas: He (1mL/min, in constant linear velocity mode); injector temperature was 250°C,
in split mode (1:100), and the detector temperature was 250°C. The column temperature
programming was 35 to 180°C at 4°C/min then 180 to 280°C at 17°C/min, and at 280°C for
10 min; mass spectra: electron impact 70 eV. The injected sample volume was 1µL.
Compounds were indentified by their GC retention times relative to know compounds and by
comparison of their mass spectra with those present in the computer data bank (National
Institute for Standard Technology – NIST – 147, 198 compounds) and published spectra
(Stenhagen et al., 1974; Adams, 2001).
Brine shrimp lethality bioassay
The essential oil of C. sativum was assayed using a modified test of lethality to A.
salina (Meyer et al., 1982). The eggs of A. salina were incubated in a hatching chamber with
seawater and kept at room temperature (average 27 °C) under artificial light around the clock.
Larvae after 48 hours were extracted and counted using a Pasteur pipette. A standard solution
of 1000 µg mL
-1
was prepared with 100 mg of essential oil diluted in 1.0 mL of DMSO, and
the volume was completed with seawater in a 100 mL volumetric flask. Concentrations of
900, 100, 10 and 1 µg mL
-1
were prepared using standard solution. For each concentration,
10 brine shrimp larvae were used, placed in flasks that were filled with seawater to a total
volume of 5 mL. Intermediate concentrations were made to calculate the LC
50
. For the control
group, a solution was prepared with 100 µL of DMSO and 4.9 mL of seawater. After 24
hours, the dead larvae were counted and the LC
50
value was estimated using the Origin 7.0
statistical program.
LD
50
estimate calculation for C. sativum essential oil
The LD
50
value was based on the comparative study of the assay of A. salina and
the lethal dose (LD
50
) value in mice, to determine acute oral toxicity of plant extracts (Parra et
41
al., 2001). The published LC
50
and LD
50
values of the extracts were correlated using the
Origin 7.0 statistical program to obtain the linear regression equation Y= 169.57 + 85.67X (R
= 0.86), where Y is the LD
50
value, X is the LC
50
value and R is the correlation coefficient.
The LD
50
figure was expressed in mg/Kg.
Fungal strains
A total of five strains of M. canis and five strains of Candida spp. were included
in this study. Both M. canis and Candida spp. strains were isolated from symptomatic dogs
and cats. The strains were stored in the fungal collection of the Specialized Medical
Mycology Center – CEMM ((Federal University of Ceará, Brazil), where they were
maintained in saline (0.9% NaCl), at 28°C. At the time of the analysis, an aliquot of
each suspension was taken and inoculated into potato dextrose agar (Difco, Detroit,
USA), and then incubated at 28°C for 2-10 days.
Inoculum preparation for antifungal susceptibility tests
For the agar-well difusion method, based on Fontenelle et al. (2007), stock
inocula were prepared on day 2 and day 10 for Candida spp. and M. canis, respectively,
grown on potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA) at 28° C. Potato dextrose agar was
added to the agar slant and the cultures were gently swabbed to dislodge the conidia. The
suspensions with blastoconidia of Candida spp. or suspension of hyphal fragments of M.
canis were transferred to a sterile tube and adjusted by turbidimetry to obtain inocula of
approximately 10
6
cfu/mL blastoconidia of Candida spp. and 10
5
cfu/mL hyphal fragments or
conidia of M. canis. The optical densities of the suspensions were spectrophotometrically
determined at 530 nm and then adjusted to 95% transmittance.
For the broth microdilution method, standardized inocula (2.5 – 5 x 10
3
cfu/mL for
Candida spp. and 5 x 10
4
cfu/mL for M. canis) were also prepared by turbidimetry. Stock
inocula were prepared on day 2 and day 10 for Candida spp. and M. canis cultures,
respectively, grown on potato dextrose agar at 28°C. Sterile normal saline solution (0.9%;
3mL) was added to the agar slant and the cultures were gently swabbed to dislodge the
conidia from the hyphal mat for the M. canis (Brilhante et al., 2005) and the blastoconidia
from Candida spp. (Brito et al., 2007). The suspensions of conidia with hyphal fragments of
M. canis and blastoconidia suspension of Candida spp. were transferred to a sterile tubes, and
the volume of both suspensions adjusted to 4 mL with sterile saline solution. The resulting
42
suspension were allowed to settle for 5 min at 28°C, and their density was read at 530nm and
the adjusted to 95% transmittance. The suspensions were diluted to 1:2000 for Candida spp.
and 1:500 for M. canis, both with RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute –
1640) with L-glutamine, without sodium bicarbonate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.),
buffered to pH 7.0 with 0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma Chemical
Co., St. Louis, Mo.), to obtain the inoculum size of approximately 2.5 – 5 x 10
3
cfu/ml for
Candida spp. and 5 x 10
4
cfu/mL for M. canis.
Agar-well diffusion susceptibility test
The antifungal activity of essential oil from C. sativum was evaluated against
Candida spp. (n=4) and M. canis (n=4), by the agar-well diffusion method according to
Fontenelle et al. (2007). Petri dishes with 15 cm diameter were prepared with potato dextrose
agar (Difco, Detroit, USA). The wells (6 mm in diameter) were then cut from the agar and
100 µL of essential oil was delivered into them. The oil was weighed and dissolved in DMSO
to obtain the test concentration of 10000 µg mL
-1
. Stock solutions of griseofulvin (1000 µg
mL
-1
; Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) and amphotericin B (5 µg mL
-1
; Sigma Chemical
Co., USA) were prepared in distilled water and tested as positive controls for M. canis and
Candida spp., respectively. Each fungal suspension was inoculated on to the surface of the
agar. After incubation, for 3-5 days for Candida spp. and 5-8 days for M. canis, at 28˚C, all
dishes were examined for zones of growth inhibition and the diameters of these zones were
measured in millimeters. Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
The minimum inhibitory concentration (MIC) for Candida spp. was determined
by the broth microdilution method, in accordance with the Clinical and Laboratory Standards
Institute – CLSI (formerly NCCLS; M27-A2), (NCCLS, 2002). The broth microdilution assay
for M. canis was performed as described by Brilhante et al. (2005), based on the M38-A
document (CLSI; formerly NCCLS, 2002). The minimum fungicidal concentration (MFC) for
both Candida spp. and M. canis were determined according Fontenelle et al. (2007). In
addition, C. parapsilosis (ATCC 22019) and C. albicans (ATCC 1023) strains were used as
quality controls for broth microdilution method.
The essential oil of C. sativum was prepared in DMSO. Amphotericin B (AMB)
(Sigma, Chemical Co., USA) and griseofulvine (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) were
43
prepared in distilled water. For the susceptibility analysis, the essential oils were tested in
concentrations ranging from 4 to 5000 µg mL
-1
.
The microdilution assay was performed in 96-well microdilution plates. Growth
and sterile control wells were included for each isolate tested. The microplates were incubated
at 37° C and read visually after 2 days for Candida spp. and 5 days for M. canis. The assays
for all essential oils were run in duplicate and repeated at least twice. The MIC was defined as
the lowest oil concentration that caused 100% inhibition of visible fungal growth. The results
were read visually as recommended by CLSI. The MFC was determined by subculturing 100
µL of solution from wells without turbidity, on potato dextrose, at 28˚C. The MFCs were
determined as the lowest concentration resulting in no growth on the subculture after 2 days
for Candida spp. and 5 days for M. canis.
Statistical analysis
Antifungal activity was expressed as mean ± SD of the diameter of the growth
inhibition zones (mm). The antifungal activity of the essential oils was analyzed by linear
correlation for individual analysis and the two-tailed Student’s t-test at 95% confidence
intervals was used to evaluate differences between the essential oil and the controls. For the
brine shrimp lethality bioassay, the LC
50
and the LC
50
values were estimated using the Origin
7.0 statistical program.
Results
The chemical analysis of the C. sativum is shown in Table 1. The main
constituents of the essential oil of C. sativum were linalool (58.65%), geraniol (17.87%) and
neryl acetate (12.22%). The brine shrimp lethality test of the essential oil showed an LC
50
of
23 µg mL
-1
, being considered bioactive, and the estimated LD
50
obtained by the linear
regression was 2139.98 mg/kg.
The essential oil from C. sativum fruits was effective against all tested fungal
strains in the agar-well diffusion susceptibility tests (Table 2). The oil induced a significant
growth inhibition zone (28 ± 5.42mm) at a concentration of 10000 µg mL
-1
against M. canis
strains (n = 4). For Candida strains (n = 4), the growth inhibition zone induced by the oil was
9.25 ± 0.5mm, at a concentration of 10000 µg mL
-1
. The positive control, griseofulvine,
induced a significant growth inhibition zone (55.25 ± 3.69mm) against M. canis and
amphotericin B induced a significant growth inhibition zone (10.25 ± 1.26mm) against
Candida spp.
44
The broth microdilution method showed that the MICs for M. canis strains (n=5)
ranged from 78 to 620 µg mL
-1
and the MFCs ranged from 150 to 1250 µg mL
-1
. The MICs
for Candida spp. strains (n=5) ranged from 310 to 620 µg mL
-1
and the MFCs ranged from
620 to 1250 µg mL
-1
(Table 3).
Discussion
Many essential oils have been advocated for use in complementary medicine for
bacterial and fungal infections (Hammer et al., 1998). Previous studies have investigated the
activity of the essential oils against dermatophytes and yeasts (Hammer et al., 1998;
Fontenelle et al., 2007; Matasyoh et al., 2008). In our ongoing search for new antimicrobial
agents, the essential oil of C. sativum was tested against animal fungal strains and produced
good results.
The antifungal activity of the essential oil of C. sativum fruits may be attributed to
its main constituent, linalool (58.22%) and geraniol (17.87%). Previous studies of the
chemical composition of C. sativum fruit essential oil carried out by Pino et al. (1996) and
Burt (2004) reported a linalool concentration of 54.57% and 70%, respectively. Antimicrobial
activity of linalool against several bacteria and fungi has also been reported (Pattnaik et al.,
1997; Peana et al., 1999; Delaquis et al, 2002). Dorman and Deans (2000) tested the
antimicrobial activity of some essential oils and their main chemical constituents. Among
them, linalool and geraniol were individually effective against 23 different bacterial strains.
Linalool and linalyl acetate are monoterpenoid compounds that are common in
many essential oils of several aromatic species. A number of linalool and linalyl acetate
producing species are used in traditional medicinal systems to relieve symptoms and cure a
variety of ailments, both acute and chronic (Peana and Moretti, 2002).
The essential oil from leaves of C. sativum showed antimicrobial activity against
Gram positive (Staphylococcus aureus, Bacillus spp.) and Gram negative bacteria
(Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis) and a
pathogenic fungus (Candida albicans), and the main constituents revealed by chemical
analysis were 2E-decenal (15.9%), decanal (14.3%), 2E-decen-1-ol (14.2%) and n-decanol
(13.6%) (Matasyoh et al., 2008). According to these authors, the MIC against C. albicans was
163 mg/mL and the oil from fruits in this study was 434 µg mL
-1
. The essential oil from fruits
of C. sativum exhibits a higher antifungal activity against Candida spp.
In veterinary practice, dermatophytoses are among the most common infectious
skin diseases in mammals worldwide. They are frequently observed in domestic animals, but
45
also in captive and wild fauna (Chermette et al., 2008). Based on the results of this study, the
essential oil obtained from fruits of C. sativum could be an alternative natural source to treat
animal dermatophytoses.
In the evaluation of plant extract toxicity by the brine shrimp bioassay, an LC
50
value lower than 1000 µg/mL is considered bioactive (Meyer et al., 1982). In this study, the
essential oil from C. sativum fruits showed an LC
50
value of 23 µg/mL. This result
corroborates the antifungal properties of the oil. Parra et al. (2001) assessed the effect of acute
treatment of A. salina larvae and mice with several extracts drawn from autochthonous plants
in Cuba. The aim of their study was to develop a low-cost method applicable to countries
where the use of medicines obtained from vegetable species is common and is an affordable
way to fight diseases. They calculated LC
50
values for A. salina larvae and LD
50
values for
mice and established significant correlations between both parameters, suggesting the use of
A. salina larvae as a suitable, accurate and inexpensive alternative to pre-screening chemical
toxicity with mammals (Nunes et al., 2006). The estimated LD
50
in mice for C. sativum
essential oil was 2139.98 mg/kg and this value indicates a low toxicity in accordance with
Hedge and Sterner (1949).
Although the essential oil of C. sativum was shown to present low toxicity by
theoretical calculation, with good antifungal activity in vitro, it is necessary to evaluate the
acute toxicological effects and antifungal efficacy in vivo in order to be considered for a safe
and effective antifungal agent.
Acknowledgements
The authors acknowledge the financial support of FUNCAP (Ceará State
Foundation for Scientific and Technological Development) and CNPq (National Research
Council; Brazil).
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48
Table 1 – Chemical composition of the essential oil from C. sativum
K.I.* Components Composition (%**)
1098 Linalool 58.22
1144 Camphor 2.15
1168 Borneol 1.19
1203 n-Decanal 2.53
1247 Geraniol 17.87
1258 2E-Decenal 1.32
1373 Neryl acetate 12.22
1405 Dodecanal 2.35
1462 2E-Dodecenal 0.95
* Retention index. The identified constituents are listed in their order of elution from a nonpolar column.
**The % composition is the % peak area of the total essential oil composition.
49
Table 2- Antifungal activity of the essential oil from C. sativum against Microsporum canis
and Candida spp. in the agar-well diffusion assay.
Strains
Growth inhibition zones (mm)
C. sativum essential oil
(µg mL
-1
)
Griseofulvine
(µg mL
-1
)
Amphotericin B
(µg mL
-1
)
10000 1000 5
M. canis
CEMM 01-5-190
30 60 -
CEMM 01-4-104
20 55 -
CEMM 01-3-188
32 55 -
CEMM 01-3-186
30 51 -
(mean ±SD)
(28 ± 5.42) (55.25 ± 3.69)
-
Candida
spp
.
CEMM 01-3-077
9 - 12
CEMM 01-3-069
9 - 10
CEMM 01-2-078 10 - 10
CEMM 01-2-081 9 - 09
(mean ±SD)
(9.25 ± 0.5) - (10.25 ± 1.26)
Each experiment was performed in duplicate
50
Table 3 – Minimum inhibitory and fungicidal concentrations of C. sativum essential oil
against M. canis and Candida spp.
Strains
C. sativum essential oil
MIC
(µg mL
-1
)
MFC
(µg mL
-1
)
M. canis
CEMM 01-5-190 78 150
CEMM 01-4-104 310 620
CEMM 01-3-188 620 1250
CEMM 01-3-186 620 1250
CEMM 01-3-165 620 1250
(Geometric mean) 449.6 904
Candida
spp
.
CEMM 01-3-077 620 1250
CEMM 01-3-069 310 620
CEMM 01-2-078
310 620
CEMM 01-2-081
620 1250
CEMM 01-3-068
310 620
(Geometric mean)
434 872
MIC: Minimum inhibitory concentration expressed in µg mL
-1
;
MFC: Minimum fungicidal concentration expressed in µg mL
-1
;
CEMM: Specialized Medical Mycology Center. Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
51
7 CAPÍTULO 2
SCREENING OF ANTIFUNGAL NATURAL PRODUCTS OF PLANTS FROM THE
NORTHEAST OF BRAZIL AGAINST MICROSPORUM CANIS AND CANDIDA SPP.
STRAINS
B.V. Soares
a
, S.M. Morais
a,b*
, R.O.S. Fontenelle
c
, V.A. Queiroz
b
, N.S. Vila-Nova
a
, M.P.
Accioly
a
, M.F.G. Rocha
a,c
a
Faculty of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State University of
Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
b
Department of Chemistry, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
c
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
Corresponding author: Selene Maia de Morais. Rua Ana Bilhar, 601, Apto 400: Meireles.
CEP: 60 160-110. Fortaleza, Ceará, Brazil, Phone: 55 (85) 3232-3834. Fax: 55 (85) 3495-
8692. E.mail: [email protected]
52
Resumo
Objetivos: Encontrar novas plantas com potencial antifúngico com utilidade em medicina
veterinária.
Métodos e Resultados: Os produtos naturais obtidos de plantas comumente encontradas no
Nordeste brasileiro foram avaliados contra cepas de Microsporum canis e Candida spp.
isoladas de cães sintomáticos. Os extratos etanólicos de Calotropis procera, Momordica
charantia, Peschiera affinis e Piper tuberculatum, o líquido da castanha de cajú (LCC) e seus
constituintes (ácido anacárdico, cardol e cardanol) obtidos de Anacardium occidentale, e a
fração acetato de etila do decocto de Mangifera indica foram inicialmente avaliados pelo
método de difusão em ágar. Destes extratos, cinco induziram halo de inibição contra M. canis:
P. tuberculatum (20 mm), M. indica (14 mm), M. charantia (13 mm), P. affinis (11 mm) e
cardol (10 mm); entretanto, nenhum deles induziu halo de inibição significativo contra
Candida spp. As substâncias significativamente ativas foram submetidas ao teste de
microdiluição em caldo contra cepas de M. canis (n=5), a fim de encontrar a concentração
inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM). As medias geométricas
dos valores da CIM foram 0.59, 0.37, 0.35, 0.17 mg/mL, e dos valores da CFM foram 1.19,
0.75, 0.7, 0.34 mg/mL, para M. charantia, P. affinis, P. tuberculatum and M. indica,
respectivamente.
Conclusões: Os extratos obtidos de M. charantia, P. affinis, P. tuberculatum e M. indica são
ativos in vitro contra M. canis, demonstrando boa atividade antifúngica.
Significado e impacto deste estudo: A vegetação do Nordeste brasileiro pode ser fonte de
agentes antifúngicos úteis para a medicina veterinária.
Palvras-chave: Microsporum canis, Candida spp., Mangifera indica, Momordica charantia,
Piper tuberculatum, Peschiera affinis, Produtos Naturais, Antifúngicos.
53
Abstract
Aims: To find new plants with antifungal potential in veterinary medicine.
Methods and Results: The natural products obtained from plants common found in
Brazilian’s northeastern were evaluated against Microsporum canis and Candida spp. strains
isolated from symptomatic dogs. The ethanolic extracts of Calotropis procera, Momordica
charantia, Peschiera affinis and Piper tuberculatum, the cashew nut shell liquid (CNSL) and
constituents (anacardic acid, cardol and cardanol) obtained from Anacardium occidentale, and
the ethyl acetate fraction of decoct of Mangifera indica were initially evaluated by the agar-
well diffusion method. These, five induced growth inhibition zone against M. canis: P.
tuberculatum (20 mm), M. indica (14 mm), M. charantia (13 mm), P. affinis (11 mm) and
cardol (10 mm); and none of then induced significant growth inhibition zone against Candida
spp. The significant active substances were submitted to the broth microdilution method for
M. canis strains (n=5), to find the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum
fungicidal concentration (MFC). The geometric means for the MICs values were 0.59, 0.37,
0.35, 0.17 mg/mL, and for the MFCs value were 1.19, 0.75, 0.7, 0.34 mg/mL, for M.
charantia, P. affinis, P. tuberculatum and M. indica, respectively.
Conclusions: M. charantia, P. affinis, P. tuberculatum and M. indica are active in vitro
against M. canis, demonstrating good antifungal activity.
Significance and impact of this study: The Brazilian Northeastern vegetation can be source
of antifungal agents for veterinary medicine.
Keywords: Microsporum canis, Candida spp., Mangifera indica, Momordica charantia,
Piper tuberculatum, Peschiera affinis, Natural Products, Antifungal.
54
Introduction
Many plants from Brazilian biomes, such as the Caatinga, the Cerrado (savannah),
the Atlantic and the Amazon rain-forests, have been used as natural medicines by local
populations in the treatment of tropical diseases, including leishmaniasis, malaria,
schistosomiasis, fungal and bacterial infections (Alves et al., 2000; Duarte et al., 2005;
Fontenelle et al., 2007;2008). Moreover, many exotic plants were introduced in Brazil
following colonization, and have been incorporated into folk medicine (Duarte et al., 2005).
Plant extracts and essential oils isolated from plants have been shown to exert biological
activity in vitro and in vivo, which justified research on traditional medicine focused on the
characterization of antimicrobial activity of these plants (Martinez et al., 1996; Runyoro et al.,
2006).
Though effective antimicrobials have been developed over the years, there has
been increased development of antimicrobial drug resistance to presently available
antimicrobials (Chopra, 2007). The indiscriminate use of antibiotics also contributes to the
worsening of this picture, leading the installation of fungal infections. On this basis, it is
necessary to have antifungal available for the efficient control of fungal infections (Martinez-
Rossi et al., 2008).
In veterinary practice, dermatophytoses are among the most common infectious
skin diseases in mammals worldwide. They are frequently observed in domestic animals, but
also in captive and wild fauna. Few antifungal agents are available and licensed for use in
veterinary practice, and the use of systemic drugs is limited in livestock due to problems of
residues in products intended for the human consumption (Chermette et al, 2008). Yeast of
the genera Candida can be found as commensal microorganisms in animals and are
considered one of the most important species in veterinary medicine. Strains of Candida spp.
isolated from dogs showed high resistance to azole antifungal agents (Brito et al., 2007). The
aim of this study was to screen plants commonly found on Northeast of Brazil against
Microsporum canis and Candida spp. strains isolated from symptomatic dogs to find new
antifungal agents.
Materials and Methods
Plant material
55
Table 1 shows the names of plants, collection site, used plant part and extract type
used in this study. The plant material was dried at room temperature for seven days, and
powdered using a knife mill. The powdered material was extracted using 98% ethanol as
solvent at room temperature for seven days. The extracts were then filtered and concentrated
under vacuum in rotary evaporator. The decoct resulted from the extraction of the essential oil
was extracted with ethyl acetate and after solvent elimination ethyl acetate extract obtained.
The cashew nut shell liquid (CNSL) and its constituents anacardic acid, cardol and cardanol
were obtained according to Paramashivappa et al. (2001) from selected cashew nuts. All the
natural products were kept in tightly stoppered bottle in a freezer until used for biological
tests.
Fungal strains
A total of five strains of M. canis and five strains of Candida spp. were included
in this study. Both M. canis and Candida spp. strains were isolated from symptomatic dogs
and cats. The strains were stored in the fungal collection of the Specialized Medical
Mycology Center – CEMM ((Federal University of Ceará, Brazil), where they were
maintained in saline (0.9% NaCl), at 28°C. At the time of the analysis, an aliquot of
each suspension was taken and inoculated into potato dextrose agar (Difco, Detroit,
USA), and then incubated at 28°C for 2-10 days.
Inoculum preparation for antifungal susceptibility tests
For the agar-well difusion method, based on Fontenelle et al. (2007), stock
inocula were prepared on day 2 and day 10 for Candida spp. and M. canis, respectively,
grown on potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA) at 28° C. Potato dextrose agar was
added to the agar slant and the cultures were gently swabbed to dislodge the conidia. The
suspensions with blastoconidia of Candida spp. or suspension of hyphal fragments of M.
canis were transferred to a sterile tube and adjusted by turbidimetry to obtain inocula of
approximately 10
6
cfu/mL blastoconidia of Candida spp. and 10
5
cfu/mL hyphal fragments or
conidia of M. canis. The optical densities of the suspensions were spectrophotometrically
determined at 530 nm and then adjusted to 95% transmittance.
For the broth microdilution method, standardized inocula (2.5 – 5 x 10
3
cfu/mL
for Candida spp. and 5 x 10
4
cfu/mL for M. canis) were also prepared by turbidimetry. Stock
inocula were prepared on day 2 and day 10 for Candida spp. and M. canis cultures,
56
respectively, grown on potato dextrose agar at 28°C. Sterile normal saline solution (0.9%;
3mL) was added to the agar slant and the cultures were gently swabbed to dislodge the
conidia from the hyphal mat for the M. canis (Brilhante et al., 2005) and the blastoconidia
from Candida spp. (Brito et al., 2007). The suspensions of conidia with hyphal fragments of
M. canis and blastoconidia suspension of Candida spp. were transferred to a sterile tubes, and
the volume of both suspensions adjusted to 4 mL with sterile saline solution. The resulting
suspension were allowed to settle for 5 min at 28°C, and their density was read at 530nm and
the adjusted to 95% transmittance. The suspensions were diluted to 1:2000 for Candida spp.
and 1:500 for M. canis, both with RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute –
1640) with L-glutamine, without sodium bicarbonate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.),
buffered to pH 7.0 with 0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma Chemical
Co., St. Louis, Mo.), to obtain the inoculum size of approximately 2.5 – 5 x 10
3
cfu/ml for
Candida spp. and 5 x 10
4
cfu/mL for M. canis.
Agar-well diffusion susceptibility test
The antifungal of plants extracts were evaluated against Candida spp. (n=4) and
M. canis (n=4), by the agar-well diffusion method according to Fontenelle et al. (2007). Petri
dishes with 15 cm diameter were prepared with potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA).
The wells (6 mm in diameter) were then cut from the agar and 100 µL of essential oil was
delivered into them. The extracts were weighed and dissolved in DMSO to obtain the test
concentration of 10000 µg mL
-1
. Stock solutions of griseofulvin (1000 µg mL
-1
; Sigma
Chemical Co., St. Louis, USA) and amphotericin B (5 µg mL
-1
; Sigma Chemical Co., USA)
were prepared in distilled water and tested as positive controls for M. canis and Candida spp.,
respectively. Each fungal suspension was inoculated on to the surface of the agar. After
incubation, for 3-5 days for Candida spp. and 5-8 days for M. canis, at 28˚C, all dishes were
examined for zones of growth inhibition and the diameters of these zones were measured in
millimeters. Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
The minimum inhibitory concentration (MIC) for Candida spp. was determined
by the broth microdilution method, in accordance with the Clinical and Laboratory Standards
Institute – CLSI (formerly NCCLS; M27-A2), (NCCLS, 2002). The broth microdilution assay
for M. canis was performed as described by Brilhante et al. (2005), based on the M38-A
document (CLSI; formerly NCCLS, 2002). The minimum fungicidal concentration (MFC) for
57
both Candida spp. and M. canis were determined according Fontenelle et al. (2007). In
addition, C. parapsilosis (ATCC 22019) and C. albicans (ATCC 1023) strains were used as
quality controls for broth microdilution method.
The plant extracts (10 mg) were diluted in DMSO (1 mL). Amphotericin B
(AMB) (Sigma, Chemical Co., USA) and griseofulvine (Sigma Chemical Co., St. Louis,
USA) were prepared in distilled water. For the susceptibility analysis, the essential oils were
tested in concentrations ranging from 4 to 5000 µg mL
-1
.
Statistical analysis
Antifungal activity was expressed as mean ± SD of the diameter of the growth
inhibition zones (mm). The antifungal activity of the essential oils was analyzed by linear
correlation for individual analysis and the two-tailed Student’s t-test at 95% confidence
intervals was used to evaluate differences between the essential oil and the controls.
Results and discussion
The antifungal activity of natural products obtained from common plants found in
Brazilian’s northeast was initially tested by the agar-well diffusion assay, at the 10 mg/mL
concentration, against 4 strains of M. canis and Candida spp. isolated from symptomatic
dogs. Of nine tested substances, five induced growth inhibition zone against M. canis, but
none of then induced significant growth inhibition zone against Candida spp. These results
are shown in Table 2. The ethanolic extract of P. tuberculatum (20 mm) was the most
effective against M. canis, followed by M. indica (14 mm), M. charantia (13 mm), P. affinis
(11 mm) and cardol (10 mm), the latter considered not significant. The positive control,
griseofulvine, induced a significant growth inhibition zone (55.25 ± 3.69mm) against M. canis
and amphotericin B induced a significant growth inhibition zone (10.25 ± 1.26mm) against
Candida spp.
Based on this initially screen, the active substances were submitted to the broth
microdilution method (Table 3) just for M. canis strains (n=5). For the M. charantia extract,
the MIC ranged from 0.15 to 1.25 mg/mL, and the MFC ranged from 0.31 to 2.5 mg/mL; for
the P. affinis extract, the MIC ranged from 0.31 to 0.62 mg/mL, and the MFC ranged from
0.62 to 1.25 mg/mL; for the P. tuberculatum extract, the MIC ranged from 0.039 to 0.62
mg/mL, and the MFC ranged from 0.078 to 1.25 mg/mL; and for M. indica, the MIC ranged
from 0.078 to 0.31 mg/mL, and the MFC ranged from 0.15 to 0.62 mg/mL.
P. tuberculatum shows the lowest MIC (0.039 mg/mL) and MFC (0.078 mg/mL)
values, but according to geometric means, the extract of M. indica was the most effective,
58
showing the lowest values for MIC (0.17mg/mL) and MFC (0.34mg/mL), followed by P.
tuberculatum, P. affinis e M. charantia (Table 3).
Several Piper species have been used in traditional medicine to treat many
diseases, including gynaecological maladies, vaginitis, intestinal disorders, psychotropic,
antimicrobial, antioxidant and cytotoxic effects (Maia et al., 1998; Moreira et al., 1998).The
chemical studies carried out on Brazilian Piperaceae species have revealed the occurrence of
pyrones, lignoids and chromenes besides various amides witch showed potent insecticide and
antifungal properties. The essential oils from leaves, stems and fruits of P. tuberculatum, P.
aduncum and P. arboreum were active against Cladosporium sphaerospermum and C.
cladosporioides (Debonsi et al., 2006). The ethanolic extract of P. tuberculatum shows good
activity against M. canis strains, corroborating that this plant have antifungal properties.
M. indica (Anacardiaceae) grows in the tropical and subtropical region and its
parts are commonly used in folk medicine for a wide variety of remedies (Coe and Anderson,
1996). VIMANG
®
is an anti-inflammatory produced in Cuba from M. indica compounds, and
this property is mainly associated to a metabolite also found in mango leaves, mangiferin, the
predominant component of aqueous extract (Garrido et al., 2004). Mangiferin, traditionally
used by native inhabitants of Bolivia, Southern Guiana, the Antilles, Colombia, the
Philippines and India in the treatment of a number of diseases, has subsequently been proved
to have a varied pharmacological activity, such as antiviral and antitumor, spasmolytic,
antioxidant, antidiabetic, immunostimulating. antifungal and antibacterial activity (Stoilova et
al., 2005). The decoct of M. indica didn’t shows antifungal activity against Candida albicans,
Cryptococcus neoformans and Trichophyton rubrum (Schormoulo et al., 2005), but in this
study, the ethyl acetate fraction of decoct show good activity against five strains of M. canis.
M. charantia (Cucurbitaceae) commonly know as balsam pear, bitter gourd or
karela, is used in several purposes in traditional medicine is an important medicinal plant. The
fruits, leaves and roots of this plant have been used as laxative and anthelmintic, and studies
show an hypoglycemic potential in normal and diabetic rats (Begum et al., 1996; El Batran et
al., 2006). Schormoulo et al. (2005) report a popular use for scabies, and the aqueous extracts
was effective against C. albicans and C. neoformans in vitro, showing 150 and 180 ng/mL
MICs values. In this study, the ethanolic extract of M. charantia didn’t show significant
activity against four stains of Candida spp.
In veterinary practice, dermatophytoses are among the most common infectious
skin diseases in mammals worldwide. They are frequently observed in domestic animals, but
also in captive and wild fauna (Chermette et al., 2008). Based on the results of this study, the
59
natural products obtained from plants found in Brazilian’s northeastern could be an alternative
natural source to treat animal dermatophytoses.
Acknowledgements
This work received financial support from FUNCAP and CNPq. We would like to
thank the Specialized Medical Mycology Center of Federal University of Ceará.
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62
Table 1 - Plant extracts used in the study
Scientific name Place of collection Part used Kind of extract
Calotropis procera R.Br. Itapery Campus of State
University of Ceará
Leaves Ethanolic
Momordica charantia L. Pici Campus of Federal
University of Ceará
Leaves,
fruits,
flowers, stalk
Ethanolic
Peschiera affinis
(Müll.Arg.) Miers
Pici Campus of Federal
University of Ceará
Leaves Ethanolic
Piper tuberculatum
Jacq. Pici Campus of Federal
University of Ceará
Leaves Ethanolic
Anacardium occidentale L. Embrapa – Experimental
farm
Cashew nut Cashew nut shell
liquid
Mangifera indica L. Messejana county of
Fortaleza city - Ceará
Leaves Ethyl acetate
fraction of decoct
63
Table 2 - Antifungal activity of the plant extracts and fractions against Microsporum canis
and Candida spp. in the agar-well diffusion assay.
Extracts and
fractions
Test
concentration
Growth inhibition zones (mm)
(mean ± SD):
(mg/mL)
M. canis
NI
13
11
20
NI
NI
10
NI
14
(55.25 ± 3.69)
-
Candida spp.
C. procera 10 NI
M. charantia 10 NI
P. affinis 10 NI
P. tuberculatum 10 11
CNSL 10 NI
Anacardic acid 10 NI
Cardol 10 NI
Cardanol
M. indica
10
10
NI
NI
*Griseofulvine
*Amphotericin B
1
0.005
-
(10.25 ± 1.26)
Each experiment was performed in duplicate
(NI): No inhibitory activity
(-): Not tested
(*): Control group
64
Table 3 – Minimum inhibitory and fungicidal concentrations of plant extracts against M.
canis strains.
Strains Plant extracts
M. charantia
P. affinis P. tuberculatum M. indica
MIC
MFC MIC MFC MIC MFC MIC MFC
M. canis
CEMM 01-5-190
0.15
0.31
0.31
0.62
0.039
0.078
0.078
0.15
CEMM 01-4-104 0.31 0.62 0.31 0.62 0.15 0.31 0.078 0.15
CEMM 01-3-188 0.62 1.25 0.31 0.62 0.31 0.62 0.078 0.15
CEMM 01-3-186 0.62 1.25 0.31 0.62 0.62 1.25 0.31 0.62
CEMM 01-3-165 1.25 2.5 0.62 1.25 0.62 1.25 0.31 0.62
(Geometric mean) 0.59 1.19 0.37 0.75 0.35 0.7 0.17 0.34
MIC: Minimum inhibitory concentration expressed in mg/mL;
MFC: Minimum fungicidal concentration expressed in mg/mL;
CEMM: Specialized Medical Mycology Center.
Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
65
8 CAPÍTULO 3
CHEMICAL COMPOSITION AND ANTI-CANDIDA ACTIVITY OF ESSENTIAL
OILS FROM MANGIFERA INDICA L. VARIETIES
B.V. Soares
a
, S.M. Morais
a,b*
, R.O.S. Fontenelle
c
, V.A. Queiroz
b
, C.M.C. Viana
b
, E.S.
Brito
d
, M.A. Souza Neto
d
, M.F.G. Rocha
a,c
a
Faculty of Veterinary, Postgraduate Program in Veterinary Sciences, State University of
Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
b
Department of Chemistry, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
c
Department of Pathology and Legal Medicine, School of Medicine, Specialized Medical
Mycology Center, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil
d
Embrapa Tropical Agroindustry Center, Fortaleza, Ceará, Brazil
Corresponding author: Selene Maia de Morais. Rua Ana Bilhar, 601, Apto 400: Meireles.
CEP: 60 160-110. Fortaleza, Ceará, Brazil, Phone: 55 (85) 3232-3834. Fax: 55 (85) 3495-
8692. E.mail: [email protected]
66
Resumo
Objetivo: Encontrar novos agentes antifúngicos.
Métodos e Resultados: Os óleos essenciais obtidos das folhas de variedades de Mangifera
indica foram obtidos por hidro-destilação e analizados por cromatografia
gasosa/espectrometria de massas. A variedade Tommy Atkins possui o β–selineno (29.49%),
o óxido de cariofileno (12.40%) e o epóxido II humulemo (8.66%) como constituintes
majoritários, enquanto os principais constituintes das variedades Rosa, Moscatel e Jasmin
foram o óxido de cariofilieno (23.62, 48.42 e 30.77%, respectivamente) e o epóxido II
humulemo (11.56, 23.45, 16.27%, respectivamente).
A atividade anti-Candida contra cepas isoladas de cães foi avaliada pelo método de difusão
em ágar, e a concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo método de
microdiluição em caldo. Os halos de inibição foram de 11 ± 0.71, 13.5 ± 3.54, 10.5 ± 0.71 e
13.5 ± 0.71mm para as variedades Tommy Atkins, Rosa, Moscatel e Jasmim respectivamente.
Para Tommy Atkins a CIM variou de 0.62 a 1.25 mg/mL; para a Rosa, variou de 0.31 a 1.25
mg/mL; para a Jasmim, variou de 0.31 a 0.62 mg/mL; e para a Moscatel, o valor da CIM foi
o mesmo para todas as cepas de Candida spp..
Conclusões: Os óleos essenciais de M. indica são ativos in vitro contra Candida spp.,
demonstrando boa atividade antifúngica.
Significância e impacto desse estudo: Os óleos essenciais de M. indica podem ser fontes
úteis de compostos antifúngicos para a medicina veterinária.
Palavras-chave: Mangifera indica, Óleos Essenciais, Candida spp., β–Selineno, Óxido de
Cariofileno, Epóxido II Humuleno.
67
Abstract
Aims: To find new antifungal agents.
Methods and Results: The essential oils from leaves of Mangifera indica varieties obtained
by hydro-distillation were analyzed by gas chromatography/mass spectroscopy. Tommy
Atkins variety has β–selinene (29.49%), caryophyllene oxide (12.40%) and humulene II
epoxide (8.66%) as main constituents, while the main constituents of Rosa, Moscatel and
Jasmin varieties are caryophyllene oxide (23.62, 48.42 and 30.77%, respectively) and
humulene II epoxide (11.56, 23.45, 16.27%, respectively). The anti-Candida activity was
evaluated against strains isolated from dogs by the agar-well diffusion method and the
minimum inhibitory concentration (MIC) by the broth microdilution method. The means of
inhibition zones were 11 ± 0.71, 13.5 ± 3.54, 10.5 ± 0.71 and 13.5 ± 0.71mm to Tommy
Atkins, Rosa, Moscatel and Jasmim varieties, respectively. For Tommy Atkins, the MIC
ranged from 0.62 to 1.25 mg/mL; for Rosa, ranged from 0.31 to 1.25 mg/mL; for Jasmim
ranged from 0.31 to 0.62 mg/mL; and for Moscatel, the MIC value was the same for all
strains of Candida spp..
Conclusions: M. indica essential oils are active in vitro against Candida spp. demonstrating
good antifungal activity.
Significance and impact of this study: M. indica essential oils can be a useful source of
antifungal compounds for veterinary medicine.
Keywords: Mangifera indica, Essential oil, Candida spp., β–Selinene, Caryophyllene Oxide
Humulene II epoxide.
68
Introduction
Medicinal plants have been used in developing countries as alternative treatments
to health problems (Duarte et al., 2005). Many plant extracts and essential oils isolated from
plants have been shown to exert biological activity in vitro and in vivo, which justified
research on traditional medicine focused on the characterization of antimicrobial activity of
these plants (Martinez et al., 1996; Duarte et al., 2005; Runyoro et al., 2006; Fontenelle et al.,
2007; 2008).
Fungal infections, especially those caused by dermatophytes and Candida spp.,
are very common in humans and animals. Yeast of the genera Candida can be found as
commensal microorganisms in animals and are considered one of the most important species
in veterinary medicine. Strains of Candida spp. isolated from dogs showed high resistance to
azole antifungal agents (Brito et al., 2007). Candida albicans is an opportunistic pathogen that
can cause local and systemic infections in predisposed persons, commonly affecting
immunologically compromised patients and those undergoing prolonged antibiotic treatment
(Zhang et al., 2002). Among the different HIV-associated fungal infections, oral mucosal
lesions caused by Candida species are far the most frequent manifestation (Vazquez, 1999).
Although effective antimicrobials have been developed over the years, there has
been increased development of antimicrobial drug resistance to currently available
antimicrobials (Chopra, 2007). Many essential oils and plant extracts used in therapy have
many advantages over antibiotics, although the latter are more effective (Fontenelle et al,
2007). Mangifera indica (Anacardiaceae) grows in the tropical and subtropical region and its
parts are commonly used in folk medicine for a wide variety of remedies (Coe and Anderson,
1996). It is a rich source of antioxidants, and studies show antitumor, antibacterial, antiviral
activities of their extracts and essential oils (Keita et al., 2004; Ribeiro et al., 2008).
In the present study, essential oils from leaves of four varieties of M. indica found
in Brazil were screened for antimicrobial activity against Candida spp. strains isolated from
symptomatic dogs. Their chemical compositions were characterized by gas
chromatography/mass spectral in order to identify their major compounds.
Materials and Methods
Plant material and extraction of essential oils
The leaves of four mango cultivars produced in the State of Ceará (3
○
33’46’’
latitude S, 41
○
05’42’’longitude W), in the northeast of Brazil, were used in this study.
The leaves of varieties Tomy Atkins, Rosa, Moscatel and Jasmin were colected in
69
Fortaleza city. The mango essential oils were extracted from leaves by the steam
distillation method in a Clevenger type apparatus, as described by Craveiro et al.
(1976). All the essential oils were kept in tightly stoppered bottle in a freezer until used for
biological tests.
Gas-chromatography/mass spectral (GC-MS) analysis
The chemical analysis of the essential oils constituents were performed on a
Shimadzu QP-2010 instrument employing the following conditions: column: DB-5ms
(Agilent, part No. 122-5532) coated fused silica capillary column (30m x 0.25mm x 0.25µm);
carrier gas: He (1mL/min, in constant linear velocity mode); injector temperature was 250°C,
in split mode (1:100), and the detector temperature was 250°C. The column temperature
programming was 35 to 180°C at 4°C/min then 180 to 280°C at 17°C/min, and at 280°C for
10 min; mass spectra: electron impact 70 eV. The injected sample volume was 1µL.
Compounds were indentified by their GC retention times relative to know compounds and by
comparison of their mass spectra with those present in the computer data bank (National
Institute for Standard Technology – NIST – 147, 198 compounds) and published spectra
(Stenhagen et al., 1974; Adams, 2001).
Fungal strains
A total of five strains of Candida spp. were included in this study. The Candida
spp. strains were isolated from symptomatic dogs and cats. The strains were stored in the
fungal collection of the Specialized Medical Mycology Center – CEMM ((Federal
University of Ceará, Brazil), where they were maintained in saline (0.9% NaCl), at
28°C. At the time of the analysis, an aliquot of each suspension was taken and
inoculated into potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA), and then incubated at
28°C for 2-10 days.
Inoculum preparation for antifungal susceptibility tests
For the agar-well difusion method, based on Fontenelle et al. (2007), stock
inocula was prepared on day 2, grown on potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA) at 28° C.
Potato dextrose agar was added to the agar slant and the cultures were gently swabbed to
dislodge the conidia. The suspension with blastoconidia of Candida spp. was transferred to a
sterile tube and adjusted by turbidimetry to obtain inocula of approximately 10
6
cfu/mL
70
blastoconidia. The optical densities of the suspensions were spectrophotometrically
determined at 530 nm and then adjusted to 95% transmittance.
For the broth microdilution method, standardized inocula (2.5 – 5 x 10
3
cfu/mL
for Candida spp.) were also prepared by turbidimetry. Stock inocula was prepared on day 2,
grown on potato dextrose agar at 28°C. Sterile normal saline solution (0.9%; 3mL) was added
to the agar slant and the culture was gently swabbed to dislodge the conidia from the
blastoconidia from Candida spp. (Brito et al., 2007). The blastoconidia suspension was
transferred to a sterile tube, and the volume of suspension adjusted to 4 mL with sterile saline
solution. The resulting suspension was allowed to settle for 5 min at 28°C, and the density
was read at 530nm and the adjusted to 95% transmittance. The suspension was diluted to
1:2000 with RPMI 1640 medium (Roswell Park Memorial Institute – 1640) with L-glutamine,
without sodium bicarbonate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), buffered to pH 7.0 with
0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), to
obtain the inoculum size of approximately 2.5 – 5 x 10
3
cfu/ml.
Agar-well diffusion susceptibility test
The antifungal activity of essential oils were evaluated against Candida spp. (n=2)
by the agar-well diffusion method according to Fontenelle et al. (2007). Petri dishes with 15
cm diameter were prepared with potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA). The wells (6 mm
in diameter) were then cut from the agar and 100 µL of essential oil was delivered into them.
The oils were weighed and dissolved in DMSO to obtain the test concentrations of 10000 µg
mL
-1
. Stock solutions of amphotericin B (5 µg mL
-1
; Sigma Chemical Co., USA) was
prepared in distilled water and tested as positive control for Candida spp.. Each fungal
suspension was inoculated on to the surface of the agar. After incubation, for 3-5 days at
28˚C, all dishes were examined for zones of growth inhibition and the diameters of these
zones were measured in millimeters. Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
The minimum inhibitory concentration (MIC) for Candida spp. was determined
by the broth microdilution method, in accordance with the Clinical and Laboratory Standards
Institute – CLSI (formerly NCCLS; M27-A2), (NCCLS, 2002). The minimum fungicidal
concentration (MFC) for both Candida spp.were determined according Fontenelle et al.
(2007). In addition, C. parapsilosis (ATCC 22019) and C. albicans (ATCC 1023) strains
were used as quality controls for broth microdilution method.
71
The essential oils of M. indica varieties were prepared in DMSO. Amphotericin B
(AMB) (Sigma, Chemical Co., USA) was prepared in distilled water. For the susceptibility
analysis, the essential oils were tested in concentrations ranging from 4 to 5000 µg mL
-1
.
The microdilution assay was performed in 96-well microdilution plates. Growth
and sterile control wells were included for each isolate tested. The microplates were incubated
at 37° C and read visually after 2 days. The assays for all essential oils were run in duplicate
and repeated at least twice. The MIC was defined as the lowest oil concentration that caused
100% inhibition of visible fungal growth. The results were read visually as recommended by
CLSI. The MFC was determined by subculturing 100 µL of solution from wells without
turbidity, on potato dextrose, at 28˚C. The MFCs were determined as the lowest concentration
resulting in no growth on the subculture after 2 days.
Statistical analysis
Antifungal activity was expressed as mean ± SD of the diameter of the growth
inhibition zones (mm). The antifungal activity of the essential oils was analyzed by linear
correlation for individual analysis and the two-tailed Student’s t-test at 95% confidence
intervals was used to evaluate differences between the essential oil and the controls.
Results and discussion
The chemical analyses demonstrated that essential oil from leaves of Tommy
Atkins variety has β–selinene (29.49%), caryophyllene oxide (12.40%) and humulene II
epoxide (8.66%) as main constituents, while the main constituents of Rosa, Moscatel and
Jasmin varieties are caryophyllene oxide (23.62, 48.42 and 30.77%, respectively) and
humulene II epoxide (11.56, 23.45, 16.27%, respectively). The constituents italiceno epoxide,
espathulenol, caryophyllene oxide, humulene II epoxide and ciclocolorenone are commom to
the four essential oils. These results are shown on Table 1. The M. indica essential oils are
composed basically of sesquiterpenoids, wich are terpenoids having a C15 skeleton (IUPAC,
1997).
Plant essential oils are a potentially useful source of antimicrobial compounds. It
is often quite difficult to compare the results obtained from different studies, because the
compositions of the essential oils can vary greatly depending upon the geographical region,
the variety, the age of the plant, the method of drying and the method of extraction the oil
(Fontenelle et al., 2007).
Several previous studies have demonstrated the activity of essential
oils isolated from plants against Candida spp. (Hammer et al., 1998; Duarte et al. 2005;
72
Fontenelle et al., 2007; 2008; Matasyoh et al., 2008). However, there is no specific study of
the anti-Candida activity of essential oils from leaves of M. indica varieties. The antifungal
activity of the essential oils was initially tested by the agar-well diffusion assay, at the 10
mg/mL concentration, against 2 strains of Candida spp. isolated from symptomatic dogs. All
of then induced growth inhibition zone, these results are shown in Table 2. The means
inhibition zones were 11 ± 0.71, 13.5 ± 3.54, 10.5 ± 0.71 and 13.5 ± 0.71mm to Tommy
Atkins, Rosa, Moscatel and Jasmim varieties, respectively. The positive control amphotericin
B induced a significant growth inhibition zone of 9.5 ± 0.71mm.
Based on this initially screen, all of mango essential oils were submitted to the
broth microdilution method (Table 3) for Candida spp. strains (n=5). For Tommy Atkins, the
MIC ranged from 0.62 to 1.25 mg/mL and the geometric mean was 0.87 mg/mL; for Rosa,
ranged from 0.31 to 1.25 mg/mL and the geometric mean was 0.68 mg/mL; for Jasmim
ranged from 0.31 to 0.62 mg/mL and the geometric mean was 0.49 mg/mL; and for Moscatel,
the MIC value was the same for all strains of Candida spp.. The most effective variety was
Jasmim, following by Rosa, Tommy Atkins and Moscatel.
The constituents
α
-pinene and 2-δ-carene, found just in Jasmim variety, have
antibacterial against many bacterial strains reported by Dorman and Deans (2000). The
α
-
pinene is a compound of Mentha arvensis var. piperita L. essential oil, and Duarte et al
(2005) shown a MIC value of 1.1 mg/mL against C. albicans for this oil. These antimicrobial
compounds may have increased the antifungal activity of Jasmim essential oil.
Probably there is a correlation between the antifungal activity of the studied oils
and their main constituents. Corroborating this hypothesis, previous studies have
demonstrated that the essential oils in which spathulenol and caryophyllene oxide are the
main compounds have inhibitory activity on filamentous fungi species (Farag et al., 2004;
Wenqiang et al., 2006). These compounds must have inhibitory activity against Candida
species too, because are abundant in all essential oils tested in this study.
In conclusion, the results of the present study indicate that the essential oils
obtained from leaves of M. indica varieties found in Brazil showed antifungal activity against
Candida spp strains. These results corroborate the importance of ethno pharmacological
surveys in the selection of plants for bioactivity screening. The results contribute to the
characterization of the anti-Candida activity of essential oils and plant extracts of traditional
medicinal plants from the Brazilian flora. Subsequently, bio-guided fractionation will be
conduced on plants showing potential anti-Candida activity to identify the active compounds.
73
Evaluations of the oils against other important human and animal pathogens are also being
conduced.
Acknowledgements
The authors acknowledge the financial support of FUNCAP (Ceará State Foundation
for Scientifical and Technological Development) and CNPq (National Council for
Technological and Scientifical Development; Brazil).
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76
Table 1 – Chemical composition of the essential oils from leaves of M. indica varieties.
Constituent Composition (%*)
Tommy
Atkins
Rosa Moscatel Jasmin K.I.**
Monoterpenoids
α
-Pinene
- - -
3,13 939
2-δ-Carene
- - -
3,31 1003
Piperitenone 1,41 - - 3,17 1307
Sesquiterpenoids
α
-Copaene
3,43 - - - 1375
β–Elemene 1,45 1,30 - - 1391
α
-Gurjunene
- 5,64 - 4,33 1401
Longifolene 3,52 - - - 1406
E-Caryophyllene - 5,40 - 4,58 1414
Aromadendrene 1,82 - - - 1437
α
-Humulene
- 4,95 2,68 4,74 1450
(allo)Aromadendrene 3,71 2,84 - - 1459
Drima-7,9(11)-diene 2,49 - - - 1469
β –Selinene 29,49
- -
2,3
1483
Viridiflorene - 2,06 - 2,2 1485
Valencene 1,15 - - 1492
Trans-cycloisolongifolol-5-ol - 2,11 - - 1512
Silfiperfol-5-en-3-ol-B - 3,64 - - 1529
Eremophila ketone 1,44 - - - 1534
Italiceno epoxide 7,81 2,56 4,42 3,32 1551
β-Germacrene 1,02 - - 1,19 1562
Espathulenol 1,93 4,32 9,19 5,81 1577
Caryophyllene oxide
12,40 23,62 48,42 30,77
1583
Viridiflorol 1,77 - - - 1604
Humuleno II epoxide
8,66 11,56 23,45 16,27
1610
Eudesmol-10-epi-gamma - - - 4,37 1624
Alloaromadendreno epoxido 2,85 - - - 1630
Xanthoirhizol 1,40 - - - 1748
Ciclocolorenone 7,26 5,91 4,55 2,68 1757
Aristolone 1,58 - - - 1761
Methylated fatty acid
Methyl linoleate - 3,04 2,26 - 2092
Total (Contet %)
96,59 78,99 94,27 92,17 -
* % peak area of the compounds in GC-FID chromatograms.
** Retention index. The identified constituents are listed in their order of elution from a non-polar column.
-: Components was not detected
77
Table 2- Antifungal activity of the essential oils of M. indica varieties against Candida spp.
in the agar-well diffusion assay
Strains Growth inhibition zones (mm)
Tommy
Atkins
10 mg/mL
Rosa
10 mg/mL
Moscatel
10 mg/mL
Jasmim
10 mg/mL
Amphotericin B
0.005 mg/mL
Candida
spp
.
CEMM 01-2-078 10 16 10 13 10
CEMM 01-2-081 12 11 11 14 09
(mean ±SD) (11 ± 0.71) (13.5 ± 3.54) (10.5 ± 0.71) (13.5 ± 0.71) (9.5 ± 0.71)
Each experiment was performed in duplicate
78
Table 3 – Minimum inhibitory concentrations of varieties of M. indica essential oils against
Candida spp.
Strains
M. indica essential oils
Tommy Atkins Rosa Moscatel Jasmim
MIC
(mg/mL)
MIC
(mg/mL)
MIC
(mg/mL)
MIC
(mg/mL)
Candida
spp
.
CEMM 01-3-077 1.25 0.62 1.25 0.62
CEMM 01-3-069 1.25 0.62 1.25 0.62
CEMM 01-2-078
0.62 0.31 1.25 0.31
CEMM 01-2-081
0.62 1.25 1.25 0.31
CEMM 01-3-068
0.62 0.62 1.25 0.62
(Geometric mean)
0.87 0.68 1.25 0.49
MIC: Minimum inhibitory concentration expressed in mg/mL;
CEMM: Specialized Medical Mycology Center. Each experiment was repeated at least twice.
Broth microdilution method
79
9 CONCLUSÕES GERAIS
- O os extratos etanólicos de P. tuberculatum, M. charantia e P. Affins, o decocto de M.
indica e o óleo essencial obtidos dos frutos de C. sativum apresentaram atividade in vitro
contra cepas de M. canis.
- Os óleos essenciais de C. sativum e das folhas das variedades de M. indica apresentaram
atividade antifúngica in vitro contra Candida spp.
- Os constituintes majoritários do óleo essencial de C. sativum foram o linalol, geraniol e
acetato de nerila, enquanto os dos óleos essenciais de M. indica foram o ß-selineno e o óxido
de cariofileno para a variedade Tommy Atkins, e o óxido de cariofileno e epóxido II
humuleno para as variedades Rosa, Moscatel e Jasmim.
80
10 PERSPECTIVAS
Estudos adicionais com as plantas P. tuberculatum, M. charantia, P. Affins, M.
indica e C. sativum são necessários para que se possa isolar seus contituintes químicos e
avaliá-los quanto ao seu potencial antifúngico in vitro e in vivo, visto que extratos destas
plantas foram ativos in vitro contra M. canis e Candida spp. isoladas de cães.
81
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