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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
FORTALEZA-CE
2008
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2
JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade
Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Pequenos Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes
FORTALEZA-CE
2008
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JOSÉ MAURÍCIO MACIEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO DO SÊMEN OVINO DILUÍDO E CONGELADO
EM MEIO À BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) OU TRIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de
Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Aprovada em: 15/12/2008
Banca Examinadora
_______________________________________________
Prof. Dr. José Ferreira Nunes (Presidente da Banca)
Orientador - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________
Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro
Co-orientadora - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________
Profª. Dra. Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley
Examinadora - Universidade Estadual do Ceará
_______________________________________________
Prof. Dr. Arlindo de Alencar Araripe Moura
Examinador - Universidade Federal do Ceará
4
Para minha mãe, que em todos os
momentos me transmitiu carinho,
força e tranqüilidade.
Dedico
5
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Dr. José Ferreira Nunes, por sua orientação e dedicação por todos
estes anos, desde meu início na área da Medicina Veterinária.
À Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, minha co-orientadora, que também
vem me acompanhando desde minha entrada no Laboratório de Tecnologia do Sêmen
Caprino e Ovino. Exemplo de força e determinação, que muito tem ajudado a manter este
laboratório e a fazê-lo crescer.
À Dra. Carminda Sandra Brito Salmito-Vanderley, pelas sugestões dadas ainda no
início deste trabalho, que muito contribuiu para alcançar e ampliar os objetivos propostos.
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(FUNCAP), pelo concedimento de minha bolsa de pós-graduação.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias (PPGCV), com quem tenho convivido desde a graduação.
À Fazenda Líbanus, em particular ao gerente Robson Lima, por terem concedido os
animais do experimento. Certamente, esta parceria será duradoura.
Aos estudantes de iniciação científica: Oscar Oliveira Brasil, Divens Firmino Reis de
Souza, Edgar Tavares de Assis Neto, Mateus Nunes Diógenes e João Batista e Silva Júnior
pela ajuda durante a realização da parte prática do trabalho. Mais que ajudar, eles foram co-
realizadores do experimento, pois, sem a participação destes, os momentos de descontração e
de apoio, este trabalho teria sido muito mais difícil de ser realizado.
Aos médicos veterinários e mestres Rodrigo Vasconcelos de Oliveira e Erika da Silva
Bezerra de Menezes, pelo companherismo, apoio, opiniões e aprendizagem.
À toda minha família, em particular minha afilhada Christiane de Sousa Barbosa e
“minhas mães” Avelina dos Santos Maciel e Maria das Graças de Sousa, pelo apoio, carinho e
atenção dados durante todos estes anos.
E a Deus, que só com suas bênçãos, todo este esforço foi possível!
6
RESUMO
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em
programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a
disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de
origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados
satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do
uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS sobre a motilidade
espermática e na morfometria da cabeça de espermatozóides em sistema de análise de sêmen
auxiliada por computador (CASA). Foram realizadas 12 coletas de sêmen de quatro ovinos da
raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e
diluídas em ACP-102c e TRIS e criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após
descongelamento (T0), após uma hora (T1) e duas horas (T2) de incubação, para percentual
de espermatozóides morfologicamente normais e de células vivas (pela técnica de coloração
com eosina-nigrosina), avaliação da integridade acrossomal e de viabilidade celular (com uso
da técnica de coloração tripla) e análise de motilidade em sistema CASA. Foram ainda
realizados esfregaços tanto para o sêmen fresco como congelado em ACP-102c e TRIS,
corados com Rosa Bengala e submetidos à análise morfométrica no módulo de morfometria
do sistema CASA. Foram avaliados 150 espermatozóides corretamente digitalizados por
lâmina para os parâmetros comprimento, largura, área e perímetro da cabeça. Não foram
encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen criopreservado nos diluidores ACP-102c e
TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de coloração. Foram observadas diferenças
estatísticas logo após descongelamento entre os diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade
total, motilidade progressiva e amplitude lateral da cabeça, com valores superiores
encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram equivalentes quanto aos
parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos (velocidade curvilinear e
velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento cruzado do flagelo. Após
duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram significativamente para os parâmetros de
motilidade avaliados, exceto para o parâmetro linearidade O diluidor ACP-102c apresentou
maior variabilidade individual entre reprodutores. Os parâmetros morfométricos para o sêmen
fresco foram significantemente superiores aos do sêmen criopreservado, não sendo detectadas
diferenças estatísticas para espermatozóides criopreservados em ACP-102c ou TRIS. Os
parâmetros morfométricos, entretanto, sofreram variações individuais entre os animais
estudados. A semelhança dos resultados morfométricos de espermatozóides diluídos em ACP-
102c e TRIS é indicativo de que ambos possuem similar capacidade de preservação estrutural
da cabeça de espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação. Recomenda-se a pesquisa
de novos protocolos de criopreservação que otimizem os resultados obtidos na
criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da interação entre constituintes do
plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com componentes do diluidor e a
avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em programas de inseminação
artificial.
Palavras-chave: ACP-102c. CASA. Criopreservação. Motilidade, Morfometria. Sêmen ovino.
7
ABSTRACT
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and
ovine breed conservation programs. To facilitate the disponibility of seminal extenders and
reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water (PCW-
102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of studies
using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study were to evaluate the
efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS on sperm motility and sperm
head morphometry using computer assited semen analysis (CASA). Twelve semen collections
were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was divided into two
aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The semen was evaluated
at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2) of incubation, for
percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by eosin-nigrosin dyeing
technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by triple stain technique)
and motility evaluation at CASA system. Fresh and frozen-thawed semen were smeared and
stained in Bengal Rose dye and analyzed using the morphometric module of CASA system.
At least 150 properly digitized sperm head per slide were analyzed for length, width, area and
perimeter. It weren’t observed statistical differences between semen cryopreserved on PCW-
102c and TRIS extenders for the parameters adopted in each stain technique. There are
significant differences at the moment of thawing between PCW-102c and TRIS extenders for
total motility, progressive motility and head lateral amplitude, with superior values for TRIS
extender, but both extenders was equivalent for qualitative (straightness and linearity) and
quantitative parameters (curvilinear velocity and average velocity), and frequency of track
crossing. After two hours of incubation, both extenders were significantly different for
motility parameters evaluated, except for linearity. The PCW-102c extender shows more
individual variability between rams. The morphometric parameters for fresh semen were
statistically superior to those of frozen-thawed semen, not being observed statistical
differences for spermatozoa cryopreserved on PCW-102c or TRIS. The morphometric
parameters, however, suffered individual variations between the animals studied. The
similarity of morphometric resulties of spermatozoa extended on PCW-102c and TRIS
indicate that both have similar capacity of preserve the head structure of ram spermatozoa
cryopreservated. It was recommended the research of new cryopreservation protocols that
optimize the results obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c,
the interaction of seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders
components and the evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial
insemination programs.
Keywords: PCW-102c. CASA. Cryopreservation. Motility. Morphometry. Ram Semen.
8
LISTA DE QUADROS
Pág.
Quadro 1. Principais parâmetros cinéticos de espermatozóides obtidos através do
sistema CASA...............................................................................................
24
9
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Diferentes categorias de espermatozóides ovinos corados pela técnica de
coloração tripla (adaptada de Talbot e Chacon, 1991)..................................
21
Figura 2. Velocidade curvilinear (VCL), velocidade média da trajetória (VAP) e
velocidade linear (VSL) obtidas em sistema CASA.....................................
24
Capítulo 1
Figura 1. Desenho experimental para coleta, criopreservação e avaliação do sêmen
criopreservado de ovinos nos diluidores ACP-102c e TRIS.......................
40
Figura 2. Parâmetros de motilidade de sêmen ovino criopreservado em ACP-102c e
TRIS avaliados pelo software SCA em diferentes tempos de
incubação........................................................................................................
45
Capítulo 2
Figura 1. Dispersão dos parâmetros morfométricos comprimento e largura de
espermatozóides ovinos no sêmen fresco, criopreservados em ACP-102c e
TRIS..............................................................................................................
75
10
LISTA DE TABELAS
Pág.
Capítulo 1
Tabela 1. Média ± erro padrão dos percentuais dos parâmetros avaliados de
viabilidade espermática pelas técnicas de coloração com eosina-nigrosina
(EV) e coloração tripla (VA, VR, MA e MR) em sêmen fresco e
criopreservado em TRIS e ACP-102c...........................................................
43
Tabela 2. Média ± erro padrão dos parâmetros de motilidade do sêmen ovino fresco e
criopreservado em TRIS e ACP-102c, avaliados pelo software
SCA.................................................................................................................
44
Tabela 3. Média ± erro padrão dos parâmetros de percentual de espermatozóides
móveis totais (MOV) e de progressivos (PROG) para sêmen ovino fresco
e criopreservado nos diluidores TRIS e ACP-102c, segundo os
reprodutores utilizados..................................................................................
46
Capítulo 2
Tabela I. Média ± erro padrão (coeficiente de variação) dos parâmetros
morfométricos da cabeça de espermatozóides ovinos avaliados segundo
tratamento (sêmen fresco, sêmen criopreservado em ACP-102c e sêmen
criopreservado em TRIS)..............................................................................
74
Tabela II. Média ± erro padrão dos parâmetros morfométricos da cabeça de
espermatozóides ovinos avaliados segundo tratamento (sêmen fresco,
sêmen criopreservado em ACP-102c e sêmen criopreservado em TRIS)
para cada animal............................................................................................
74
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP
®
água de coco em pó
ACP- 102 meio diluente para sêmen ovino à base de água de coco em pó
ACP- 102c meio para criopreservação de sêmen ovino à base de água de coco em pó
ALH amplitude do deslocamento lateral da cabeça
BCF freqüência de batimento cruzado
CASA análise de sêmen auxiliada por computador
CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal
EV porcentagem de espermatozóides vivos avaliados pelo método de eosina-
nigrosina
IAA ácido 3-indol-acético
LIN linearidade
MA percentual de espermatozóides mortos com acrossoma pela técnica de
coloração tripla
MOV porcentagem de motilidade total através análise de sêmen auxiliada por
computador
MR percentual de espermatozóides mortos sem acrossoma pela técnica de
coloração tripla
PROG porcentagem de motilidade progressiva através análise de sêmen auxiliada por
computador
SCA
®
Sperm Class Analyser
STR retilinearidade
T0 momento de avaliação do sêmen logo após descongelamento
T1 momento de avaliação do sêmen após uma hora de incubação a 37
o
C
T2 momento de avaliação do sêmen após uma hora de incubação a 37
o
C
VA percentual de espermatozóides vivos com acrossoma pela técnica de coloração
tripla
VAP velocidade média da trajetória
VCL velocidade curvilinear
VR percentual de espermatozóides vivos sem acrossoma pela técnica de coloração
tripla
VSL velocidade linear
12
SUMÁRIO
Pág.
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 13
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 14
2.1. Preservação do sêmen de ovinos......................................................................... 14
2.1.1. Diluição seminal.................................................................................................. 14
2.1.2. Congelamento seminal......................................................................................... 14
2.1.3. Qualidade seminal e fertilidade após a descongelação....................................... 17
2.1.4. Avaliação do sêmen ovino................................................................................... 18
2.1.5 Técnicas básicas................................................................................................... 19
2.1.6. Análise do sêmen auxiliada por computador....................................................... 22
2.2. Diluentes à base de água de coco............................................................................ 26
3. JUSTIFICATIVA.......................................................................................................
29
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA..........................................................................................
30
5. OBJETIVOS.............................................................................................................. 31
Capítulo 1. Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de
coco em pó (ACP-102c) e TRIS....................................................................................
32
Capítulo 2. Efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de
espermatozóides de ovinos diluídos em meio à base da água de coco em pó (ACP-
102c) e TRIS.................................................................................................................. 58
8. CONCLUSÕES......................................................................................................... 76
9. PERSPECTIVAS....................................................................................................... 77
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………………. 78
13
1. INTRODUÇÃO
A grande capacidade dos ovinos em adaptar-se aos modernos sistemas de exploração,
uma maior produção de carne por hectare/ano, além da facilidade de manejo, fazem com que
a ovinocultura possibilite uma maior produtividade em relação às criações tradicionais como a
bovinocultura, tornando a criação de ovinos ideal para pequenos produtores e da agricultura
familiar, perfil fundiário predominante no Nordeste (IBGE, 2007).
Os índices reprodutivos influenciam o nível produtivo de um rebanho. A inseminação
artificial permite o incremento na eficiência reprodutiva e aumento da produtividade de um
rebanho através da utilização de reprodutores selecionados. O uso do sêmen diluído e
criopreservado se destaca entre as técnicas aplicadas por conservar a capacidade fecundante
do sêmen por longos períodos de armazenamento, contribuindo significativamente em
programas de melhoramento genético
Devido aos resultados obtidos com os primeiros estudos da água de coco in natura na
conservação de células espermáticas realizados por Nunes (1998), objetivou-se a elaboração
de um meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP
®
), caracterizado pela
padronização e estabilização da água de coco in natura através de um processo de
desidratação e subseqüente formulação de meios de conservação específicos para
espermatozóides. Entretanto, até o momento atual, existe necessidade no estabelecimento de
protocolos adequados de criopreservação do sêmen ovino que utilizem como diluidor a água
de coco em pó. Este estudo poderá permitir a disponibilidade da água de coco em centros de
pesquisa que ‘não disponham da matéria-prima (coco), e que visem sua utilização em
programas de criopreservação de espermatozóides.
14
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Preservação do sêmen de ovinos
2.1.1. Diluição seminal
Os diluentes permitem o aumento do volume total do ejaculado, facilitando sua
divisão em doses inseminantes e proporcionando um meio favorável para a sobrevivência dos
espermatozóides in vitro (Derivaux, 1980). Sua composição difere segundo a espécie animal
da procedência do sêmen e da tecnologia seminal empregada (Hopkins e Evans, 1991).
Hafez e Hafez (2004) sugerem que um diluente deve proporcionar nutrientes como
fontes de energia; proteger os espermatozóides do efeito maléfico do frio; proporcionar um
meio tampão; manter a pressão osmótica adequada; inibir o crescimento bacteriano; aumentar
o volume do ejaculado e proteger as células espermáticas durante congelamento. A dose
inseminante ótima para sêmen de ovinos por inseminação cervical é de 400 milhões
espermatozóides, em um volume de 0,25 a 0.50 mL (Evans e Maxwell, 1990).
Alguns diluentes mantêm a viabilidade do sêmen à temperatura ambiente, enquanto
que outros são apropriados no resfriamento entre 4 e 5°C para ajudar a controlar o
crescimento bacteriano e reduzir a taxa metabólica das células espermáticas (Hopkins e
Evans, 1991).
2.1.2. Congelamento seminal
Atualmente, existem dois métodos que permitem a manutenção de níveis aceitáveis de
fertilidade obtidos por inseminação artificial (IA) em ovinos: o resfriamento, realizado a 15
o
C
ou 4
o
C, e o congelamento, principalmente pelo uso da laparoscopia (Anel et al., 2006).
Entretanto, a fertilidade da IA ovina depende da interação entre a preservação do sêmen e a
técnica de aplicação seminal (vaginal, cervical ou deposição intrauterina) (Anel et al., 2006).
Um problema metodológico é derivado desta interação, o que proporcionou um largo leque de
técnicas baseadas no sêmen ovino congelado (Anel et al., 2006).
15
A composição do diluente é um dos fatores que afeta a proporção de espermatozóides
vivos após a descongelação (Watson, 1995), sendo seu incremento um dos desafios da
biotecnologia da reprodução de ovinos.
Os diluentes para congelamento devem possuir uma substância orgânica que atue
como crioprotetor externo e que proteja as células contra o choque térmico que se produz ao
resfriar o sêmen desde os 20°C aos 5°C, tal como a gema de ovo ou leite desnatado; uma
fonte de energia, como a glicose ou frutose; um componente tampão, como citrato de sódio ou
tris-(hidroximetil) aminometano (TRIS); um crioprotetor interno que proteja aos
espermatozóides durante congelamento, a exemplo do glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO),
etilenoglicol; e antibióticos para prevenir o crescimento bacteriano, como a penicilina,
estreptomicina ou gentamicina.
O congelamento de sêmen na espécie ovina encontra-se atualmente estagnado devido
à escassa difusão deste processo aplicada ao campo (Anel et al., 2006). Vários métodos de
uso comercial vêm sendo desenvolvidos com resultados aceitáveis (Maxwell et al., 1995),
mas seu uso geral tem sido restrito a deposição do sêmen intra-uterino por laparoscopia,
devido à baixa taxa de fertilidade observada no sêmen descongelado por inseminação
vaginal/cervical, especialmente no estro induzido (Curry, 2000). Entretanto, os métodos de
congelamento podem ser melhorados, visando contornar problemas relacionados à
manipulação do sêmen, congelabilidade das células espermáticas e aumento da população de
espermatozóides recuperados após a criopreservação (Anel et al., 2006).
Segundo Hopkins e Evans (1991), a sensibilidade dos espermatozóides às mudanças
de temperaturas se deve a ação protetora do plasma seminal e à integridade da membrana
espermática. Esta última relaciona-se tanto com sua composição lípido-protéica como de
colesterol e fosfolipídios (Darin-Bennett e White, 1977).
Pérez-Pé et al. (2001) verificaram que proteínas do plasma seminal conferem proteção
aos espermatozóides ovinos contra o choque térmico. Estas proteínas, identificadas como
RSVP14 e RSVP20 (Barrios et al. 2005; Fernández-Juan et al., 2006), secretadas na vesícula
seminal (Fernández-Juan et al., 2006), tem seu papel na estabilização da membrana
espermática, evitando a capacitação (Barrios et al. 2005).
A baixa taxa de fertilidade de espermatozóides ovinos criopreservados pode ser devido
às alterações ultra-estruturais, bioquímicas e funcionais ocorridas numa boa parte da
população de espermatozóides, que resulta em insuficiente motilidade e perda de viabilidade
dos mesmos no trato reprodutivo da fêmea (Salamon e Maxwell, 2000). Mudanças ultra-
estruturais afetam principalmente a membrana plasmática, pois durante o processo de
16
congelamento-descongelamento, existe uma redistribuição de lipídios que altera as interações
lipídio-lipídio e lipídio-proteína da membrana espermática (Park e Graham, 1992).
A maioria dos diluentes apresenta a gema de ovo como componente básico, já que a
fosfatidilcolina (lecitina) e lipoproteínas da gema, bem como a caseína nos diluentes à base de
leite, protegem os espermatozóides contra o choque térmico (Mies Filho et al., 1982; Das,
1995).
A fração ativa da gema de ovo é uma lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Waltson
e Martin, 1975). Tem sido sugerido que a LDL pode-se agregar à membrana plasmática
durante o processo de congelamento, evitando a perda de fosfolipídios da membrana e
aumentando a tolerância ao processo de criopreservação (Graham e Foote, 1987). Entretanto o
papel dos componentes lipídicos e protéicos da LDL ainda não foi elucidado. Alguns autores
obtiveram bons resultados no uso da LDL em sêmen bovino (Moussa et al., 2002, Amirat et
al., 2004). Outras substâncias como fosfocaseinato ou lactoglobulina (Batellier et al., 1997)
têm sido testadas em sêmen resfriado, mas sua aplicação em sêmen ovino criopreservado
ainda não foi verificada (Anel et al., 2006). Em bovinos, Manjunath et al. (2002) e Bergeron
et al. (2007) propuseram que tanto a LDL da gema de ovo como a caseína do leite ligam-se às
proteínas do plasma seminal bovino (BSP), evitando a ligação das mesmas ao
espermatozóide. As proteínas BSP ligam-se à membrana dos espermatozóides (Manjunath et
al., 1994), induzindo o efluxo de colesterol e fosfolipídeos (Thérien et al., 1998, 1999),
resultando na desestabilização da membrana. A LDL e a caseína do leite presente nos
diluidores seminais seqüestram a maioria das BSP, resultando em mínima modificação da
membrana plasmática, permitindo melhor conservação do sêmen (Manjunath et al., 2002).
Proteínas semelhantes à BSP têm sido encontradas em outras espécies, inclusive em ovinos
(Jobim et al., 2005) e os mecanismos de proteção podem ser similares aos observados em
bovinos (Manjunath et al., 2002; Bergeron et al., 2007).
Na espécie ovina, o glicerol é o principal crioprotetor utilizado. A sobrevivência
espermática, entretanto, é altamente afetada pelo glicerol durante a criopreservação (Anel et
al., 2003). Deste modo, a adição de glicerol em etapas parece representar o melhor balanço
entre a citotoxicidade e crioproteção. Entretanto, a variabilidade de resultados leva a concluir
que mais estudos se fazem necessários sobre a adição de glicerol e sua relação com diluentes
e curvas de congelamento requeridas para se obter ótimos resultados na IA (Salamon e
Maxwell, 1995). Outras substâncias (DMSO, etilenoglicol, açúcares, polímeros, proteínas
anti-congelantes), têm sido testadas, mas apresentam resultados inferiores em comparação aos
obtidos com o glicerol (Salamon e Maxwell, 2000).
17
Segundo Maxwell e Evans (1990), o sêmen ovino pode ser congelado em palhetas ou
em peletes. No acondicionamento em palhetas, o sêmen pode ser diluído em uma ou duas
etapas. No método de duas etapas, o sêmen é diluído a 30
º
C com diluentes sem glicerol. É
então resfriado até 4
º
C em 1,5-2,0 horas, sendo então adicionado à porção do diluente com
glicerol. No método de uma etapa, o sêmen a 30
º
C é diluído com diluente com glicerol,
resfriado até 4
º
C em 1,5-2,0 horas e então envasado em palhetas de 0,25 mL. O congelamento
é realizado inicialmente em vapores de nitrogênio líquido, colocando as palhetas resfriadas
horizontalmente em gradil a 4
º
C a 3-4 cm acima do nível do nitrogênio líquido, referentes a
temperaturas de -80 a -100
º
C, onde permanecem por 7 a 8 minutos, quando então são imersas
e armazenadas em nitrogênio líquido.
O objetivo principal do processo de criopreservação é a manutenção de ótimas taxas
de congelamento. Byrne et al. (2000), observou melhores resultados de fertilidade, tanto in
vitro como in vivo, com rápidas taxas de congelamento (-5
º
C/min). O mesmo foi constatado
por Kumar et al. (2003), que obteve taxas de congelamento ótimas entre -20 e -30
º
C/min. Em
geral, o dano na membrana espermática ovina durante o congelamento ocorre entre -10 e -
20
º
C/min (Salamon e Maxwell, 1995). Uma significativa melhoria poderia ser mantida com o
uso de gradientes multi-térmicos (Arav et al., 2002). Isto permite um ajuste progressivo e
contínuo de congelamento e formação de cristais de gelo, reduzindo a crioinjúria.
O resfriamento deve ser suficientemente lento para minimizar a formação de cristais
de gelo intracelular e o suficientemente rápido para tornar mínimo o dano do "efeito solução"
(Watson, 1995).
2.1.3. Qualidade seminal e fertilidade após a descongelação
As injúrias causadas pela criopreservação são prejudiciais ao transporte e
sobrevivência dos espermatozóides no trato reprodutivo feminino (Salamon e Maxwell,
1995). Segundo Bailey et al. (2000), a capacitação espermática induzida pela congelação
poderia produzir uma população de espermatozóides após a descongelação com viabilidade
curta e ineficiente.
Após o processo de preservação, as células espermáticas devem apresentar boa
motilidade a fim de alcançar o local da fecundação e manter a integridade das membranas
espermáticas para levar a cabo a penetração do ovócito (Royere, 1996), já que qualquer falha
18
inerente à fisiologia espermática poderia prejudicar sua capacidade de fertilização do oócito
como também de suportar o desenvolvimento embrionário (Holt e Look, 2004).
Durante a conge1ação-descongelação, os espermatozóides são submetidos a condições
desfavoráveis como desidratação, mudanças da fase de transição dos fosfolipídios da
membrana, efeito solução e a formação de gelo intracelular (Parks e Graham, 1992).
A conseqüência imediata destes processos é a ruptura da membrana plasmática
(Watson, 1995) devido aos estresses térmico, mecânico, químico e osmótico exercidos sobre a
célula durante congelamento (Parks e Graham, 1992). O acrossoma também pode sofrer
mudanças estruturais e degenerativas, como ruptura da membrana acrossomal (Hafez, 1995).
2.1.4. Avaliação do sêmen ovino
A avaliação da qualidade seminal é complementar ao exame clínico para estimar o
potencial de um macho como reprodutor e normalmente julga o volume, aspecto,
concentração, motilidade e morfologia espermática (Rodriguez-Martinez, 2005).
No caso de ovinos, devido a problemas específicos na IA, o desenvolvimento de
técnicas de avaliação do sêmen que predigam a fertilidade a campo, constitui um importante
objetivo no progresso da reprodução assistida. Tem sido demonstrado que técnicas
convencionais não são aptas para estimar acurada e repetidamente a fertilidade de uma
amostra de sêmen (Correa et al., 1997). Técnicas que avaliam o status funcional de organelas
espermáticas (acrossomos, mitocôndrias), ou a integridade de componentes celulares
(membranas, cromatina), têm ganhado importância durante as últimas décadas (Martinez-
Pastor et al., 2004). Além disso, o desenvolvimento destas técnicas poderia possibilitar uma
avaliação acurada diariamente do sêmen, podendo ser usado para avaliar e melhorar os
protocolos de preservação. O uso de técnicas de alto valor preditivo para fertilidade poderia
resultar em incremento na IA, oferecendo a possibilidade da deposição intravaginal do sêmen
congelado.
19
2.1.5 Técnicas básicas
Atualmente, a avaliação do sêmen em centrais de IA é baseada em técnicas
convencionais como aspecto externo (volume e coloração), motilidade subjetiva (motilidade
massal e motilidade individual) e concentração espermática, principalmente usando o
espectrofotômetro (Anel et al., 2006). São ensaios rápidos e práticos, requerendo
equipamentos simples que efetivamente detecta amostras de sêmen de baixa qualidade (Anel
et al., 2006).
Tradicionalmente, a morfologia espermática pode ser avaliada através de preparação
úmida e esfregaços corados (Bearden e Fuquay, 1992). As anormalidades espermáticas podem
afetar, isolada ou simultaneamente, as diferentes regiões da cabeça, peça intermediária e peça
principal (Derivaux, 1980). As anormalidades espermáticas foram primeiro classificadas em
primárias, ocorridas durante a espermatogênese, e secundárias, resultado de condições não
fisiológicas que afetam os espermatozóides após a espermatogênese. Posteriormente os
espermatozóides passaram a ser classificados como defeitos maiores ou menores,
caracterizados pela gravidade dos seus efeitos deletérios à fertilidade (Nöthling e Irons, 2008).
Em ovinos, o percentual de espermatozóides morfologicamente normais possui correlação
com a fertilidade, podendo esta correlação ser superior a 0,5 (Colas, 1981).
A integridade da membrana espermática é um atributo essencial para a fertilidade do
espermatozóide e, por isso, a análise deste parâmetro é fundamental para a predição da
fertilidade (Luz et al., 2000). O uso de corantes vitais, como a eosina-nigrosina, é eficiente na
determinação de espermatozóides com danos na membrana, uma vez que estes corantes não
podem passar pela membrana de uma célula viva, mas penetra em células mortas, corando-as
(Bearden e Fuquay, 1992).
De modo semelhante, a integridade do acrossoma é pré-requisito básico para garantir
um bom potencial de fertilidade dos espermatozóides, uma vez que o percentual de
espermatozóides que apresentaram reação acrossomal possui correlação negativa com a
fertilidade (Gil et al., 2000). Entretanto, a integridade acrossomal não reflete necessariamente
a integridade de membrana, sendo importante o uso de testes que combinem ambas avaliações
(Holt, 2000). É possível a ocorrência de lesões do acrossoma durante congelação e
descongelação, sem que isto interfira na motilidade espermática (Tasseron et al., 1977).
Torna-se interessante o uso de técnicas que aliem a vitalidade espermática com a
integridade acrossomal. Talbot e Chacon (1991) desenvolveram uma técnica de coloração
tripla que faz uso de três corantes: Azul de Tripan (coloração vital), Marrom de Bismark e
20
Rosa Bengala (coloração do acrossoma). Baseado no tipo de padrão de coloração apresentado
pelo espermatozóide, eles podem ser classificados em quatro categorias (Figura 1):
a) espermatozóides mortos, com acrossoma intacto: acrossoma corado de rosa e
região pós-acrossomal de marrom escuro;
b) espermatozóide morto, sem acrossoma: região acrossomal e pós-acrossomal
marrom escuro;
c) espermatozóide vivo com acrossoma: acrossoma com coloração rosa e região pós-
acrossomal marrom claro;
d) espermatozóide vivo, sem acrossoma: região acrossomal e pós-acrossomal em
marrom claro.
Sendo uma técnica relativamente rápida e de fácil execução, apresenta ainda como
vantagens o fato dos esfregaços submetidos a esta coloração poderem ser guardados por
longos períodos, baixo custo e permitir avaliar também a morfologia espermática (Risopatrón
et al., 2001). Sua eficácia foi comparada à técnica fluorescência usando a aglutinina da Pisum
sativum (FITC-PSA) em sêmen humano, resultando em semelhantes percentuais de
espermatozóides viáveis e com acrossoma íntegro (Köhn et al., 1997, Risopatrón et al., 2001).
Os ensaios tradicionais de avaliação seminal podem ser suficientes quando é aplicada
IA cervical com sêmen resfriado, pois há um elevado número de espermatozóides por dose
(Anel et al., 2006). Entretanto, melhor estimação da qualidade espermática é requerida
quando sêmen criopreservado é utilizado (Anel et al., 2006). Além disso, em situações
específicas (problemas de sub-fertilidade, avaliação acurada de machos, etc.), estas técnicas
são insuficientes devido a sua alta subjetividade, baixa sensibilidade e pobre correlação com
fertilidade a campo (Anel et al., 2006). Desta forma, novas técnicas de análise e avaliação do
sêmen são necessárias, como a análise seminal auxiliada por computador.
21
Figura 1. Diferentes categorias de espermatozóides ovinos corados pela técnica de coloração
tripla (adaptada de Talbot e Chacon, 1991).
Espermatozóide morto com acrossoma
Espermatozóide vivo com acrossoma
Espermatozóide vivo com acrossoma
Espermatozóide morto sem acrossoma
Espermatozóide vivo sem acrossoma
22
2.1.6. Análise do sêmen auxiliada por computador
A motilidade é comumente tida como uma das mais importantes características
associadas com a habilidade de fertilização do sêmen. Ela é a expressão da viabilidade e
integridade estrutural dos espermatozóides. Classicamente, o julgamento da qualidade seminal
tem sido baseado em uma avaliação subjetiva de parâmetros como motilidade massal e
individual (Verstengen et al., 2002). A avaliação subjetiva tem reduzido a predição da
fertilidade devido à alta variabilidade observada entre avaliadores. Assim, variação de 30-
60% tem sido registrada na estimação da motilidade no mesmo ejaculado. Desta forma, a
ênfase é dada para o desenvolvimento de métodos de avaliação objetivas (Anel et al., 2006).
Mack et al. (1988) ressaltaram que a necessidade de uma metodologia objetiva
motivou a elaboração e desenvolvimento de instrumentos automatizados capazes de analisar
as trajetórias dos espermatozóides.
A Análise de Sêmen Assistida por Computador (CASA) é definida como um sistema
automatizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas dos espermatozóides,
fornecendo informação acurada, precisa e significativa do movimento individual de cada
espermatozóide e também resumos estatísticos da população espermática (Amann e Katz,
2004). A automatização desta análise permite maior objetividade e rapidez, uma vez que esta
é realizada numa fração do tempo requerido pela avaliação subjetiva (Motimer, 1997).
Os sistemas CASA têm permitido a detecção de súbitas mudanças no movimento
espermático, além de melhorar a discriminação a nível laboratorial de estudos com novos
diluentes (Amann e Katz, 2004).
Os parâmetros comumente obtidos através de analisadores de sêmen
computadorizados são: velocidade do percurso curvilinear (VCL), velocidade do percurso
médio (VAP), velocidade em linha reta (VSL), retilinearidade (STR), linearidade (LIN),
oscilação (WOB), freqüência de batimento cruzado (BCF), e deslocamento lateral da cabeça
(ALH) (Motimer, 1997; Verstegen et al., 2002) (Quadro 1; Figura 2).
Os três parâmetros de velocidade (VCL, VAP, VSL), são comumente utilizados para
descrição gral do movimento do espermatozóide, entretanto, para uma avaliação adicional,
foram estabelecidos os parâmetros STR, LIN e WOB, que tratam das relações entre estas
velocidades (Motimer, 1997). A retilinearidade fornece uma indicação da relação entre o
percurso líquido percorrido e a trajetória média do espermatozóide, de modo que em situações
em que o percurso médio se aproxima da trajetória em linha reta apresente elevado STR, com
baixa ALH. Ao contrário, percursos circulares possuem baixos STR, pois o percurso médio
23
apresenta valores superiores que o retilíneo. A linearidade expressa a relação entre o percurso
líquido percorrido pelo espermatozóide e sua trajetória real, de modo que uma trajetória
circular pode apresentar baixa linearidade uma vez que o percurso real do espermatozóide é
maior que seu deslocamento efetivo. A oscilação (WOB) apresenta-se baixa em percursos em
que o espermatozóide percorre vasta área em seu deslocamento (elevado ALH), mas alto em
trajetórias circulares ou retilíneas uma vez que a VAP e a VCL se assemelham (Motimer,
1997).
Algumas centrais de inseminação têm adotado o CASA em sua rotina de avaliação de
sêmen, mas, geralmente, apenas como métodos padronizados de cálculo da motilidade
progressiva e total. Parâmetros de motilidade que são os mais correlacionados com a
fertilidade não são comumente usados e a avaliação de sub-população de espermatozóides não
tem sida aplicada (Anel et al., 2006).
Deve-se ressaltar a possibilidade de potenciais erros nas mensurações realizadas pelo sistema
CASA. Uma destas é a dificuldade na distinção entre espermatozóides e debris ou células
não-espermáticas, levado a uma superestimação da concentração espermática e subestimação
na proporção de espermatozóides móveis. A presença de espermatozóides aglutinados
também afeta a correta avaliação da concentração espermática e de percentual de
espermatozóides móveis. Concentração elevada de espermatozóides na amostra analisada
interfere na reconstrução da trajetória dos espermatozóides analisados, podendo haver
sobreposição de trajetórias distintas de modo que sejam interpretados como uma só.
(Motimer, 1997).
Outra análise possibilitada pelo CASA é a da morfologia e morfometria dos
espermatozóides. A morfologia normal dos espermatozóides pode ser um indicador do
potencial de fertilização do mesmo, porém a avaliação subjetiva tem mostrado considerável
variação entre avaliadores. O desenvolvimento da análise morfométrica do sêmen assistida
por computador (CASMA), tem permitido reduzir esta variação e revelar sutis diferenças
entre indivíduos que não podem ser detectados usando métodos subjetivos (Anel et al., 2006).
24
Quadro 1. Principais parâmetros cinéticos de espermatozóides obtidos através do sistema
CASA.
Parâmetro Unidade Descrição
Velocidade do percurso curvilinear (VCL)
µm/s
Velocidade da trajetória real
percorrida pelo espermatozóide
Velocidade do percurso médio (VAP)
µm/s
Velocidade da média da trajetória
real percorrida pelo espermatozóide
Velocidade em linha reta (VSL)
µm/s
Velocidade em linha reta do ponto
inicial ao final do trajeto analisado
Retilinearidade (STR) % Relação percentual entre VSL e
VAP
Linearidade (LIN) % Relação percentual entre VSL e
VCL
Oscilação (WOB) % Relação percentual entre VAP e
VCL
Freqüência de batimento cruzado (BCF) Hz Freqüência com que o percurso real
do espermatozóide cruza o
percurso médio
Deslocamento lateral da cabeça (ALH)
µm
Distância do espermatozóide em
seu trajeto real da trajetória média
Fonte: Motimer (1997).
Figura 2. Velocidade curvilinear (VCL), velocidade média da trajetória (VAP) e velocidade
linear (VSL) obtidas em sistema CASA.
VSL
VAP
VCL
25
Devido à precisão do CASMA, morfometria da cabeça do espermatozóide pode ser
um indicador de alterações reprodutivas e de animais sub-férteis, uma vez que as dimensões
dos espermatozóides de animais férteis são homogêneas. As diferenças nas dimensões em
animais sub-férteis têm sido verificadas em eqüinos (Casey et al., 1997). Entretanto, mais que
a média do tamanho da cabeça dos espermatozóides, é o grau de variação nas dimensões dos
espermatozóides é o melhor preditor da fertilidade em humanos e bovino (Katz et al., 1986;
Sailer et al., 1996).
Estudos utilizando CASMA têm demonstrado que a criopreservação reduz as
dimensões dos espermatozóides nas mais diversas espécies com caprinos (Hidalgo et al.,
2006; Marco-Jiménez et al., 2006), bovinos (Rubio-Guillén et al., 2007; Gravance et al.,
1998), eqüinos (Arruda et al., 2002) e suínos (García-Herreros et al., 2007). Este efeito tem
sido explicado por alguns mecanismos como mudanças osmóticas durante a criopreservação,
danos acrossomais e alterações na condensação da cromatina (Gravance et al., 1998, Hidalgo
et al., 2006, Garcia-Herreros et al., 2007).
As dimensões morfométricas apresentam ligações com o protocolo de congelamento.
A área, bem como o formato do espermatozóide, tem importantes implicações na
criopreservação do sêmen, por influir nas trocas térmicas e no fluxo de água e íons durante
congelamento e são os principais determinantes na taxa ótima de congelamento (Curry et al.,
1996). Esteso et al. (2006) afirmam que cervídeos caracterizados como congeláveis ou não-
congeláveis apresentaram diferenças morfométricas no sêmen fresco, mas não em outros
parâmetros de qualidade seminal como percentual de espermatozóides móveis, integridade de
membrana e acrossoma, sendo razoável supor que as variações na morfologia espermática
podem influenciar as características biofísicas dos espermatozóides que são essenciais para o
sucesso da criopreservação.
Outra importância do CASMA é permitir distinguir diferentes sub-populações de
espermatozóides numa amostra (Núñez-Martinez et al., 2007), uma vez que a susceptibilidade
para a capacitação e habilidade de fertilização variam segundo estas sub-populações
(Williams e Ford, 2001). Desta forma, sub-populações de espermatozóides podem ser
definidas segundo a morfometria da cabeça do espermatozóide e a distribuição destas sub-
populações pode estar relacionada com a fertilidade (Anel et al., 2006). De modo semelhante,
Thurston et al. (2001) detectaram sub-populações morfologicamente distintas de
espermatozóides suínos, cuja proporção no ejaculado correlacionou com a análise da
qualidade seminal após criopreservação. A análise de sêmen deveria contemplar a presença de
26
sub-populações e não apenas fornecer valores médios para a população de espermatozóides
como um todo (Sancho et al., 1998).
É notório que o perfil da cabeça dos espermatozóides pode ser relacionado com a
organização da cromatina espermática. Além disso, potenciais problemas no DNA podem
resultar em alterações no padrão da cabeça do espermatozóide, detectados pelo CASMA
(Anel et al., 2006). Núñez-Martinez et al. (2007) encontraram significante correlação entre as
variáveis morfométricas e a quantidade de DNA desnaturado no ejaculado canino, uma vez
que a distribuição morfométrica de sub-populações foi similar àquela derivada da integridade
do DNA. A variação da morfologia espermática é um indicador da estrutura anormal da
cromatina e conseqüentemente, da fertilidade (Karabinus et al., 1997).
Em ovinos, alguns estudos têm sido realizados de modo a desenvolver métodos
acurados no emprego do CASMA (Gravance et al., 1998a) e outros têm analisado o efeito da
criopreservação na cabeça do espermatozóide devido a criopreservação (Lambrechts et al.,
2000). Entretanto a possível relação entre o CASMA e a fertilidade precisa de comprovação
na espécie ovina (Anel et al., 2006).
2.2. Diluentes à base de água de coco
A água de coco é uma solução ácida, natural e estéril, composta de sais, proteínas,
açúcares, vitaminas, gorduras neutras (Nunes e Combarmous, 1995), além de indutores da
divisão celular e eletrólitos diversos, que conferem densidade e pH compatíveis com o plasma
sangüíneo, proporcionando, os nutrientes necessários para manter a sobrevivência e
viabilidade de gametas masculinos e femininos criopreservados (Blume e Marques Jr., 1994).
A água de coco tem sido utilizada em biotecnologias da reprodução animal obtendo-se
bons resultados com a utilização da água de coco na preservação do sêmen de animais
domésticos como caprinos (Nunes, 1988; Salles, 1989; Campos et al., 2003), ovinos (Araújo,
1990; Figueredo et al., 2001), suínos (Toniolli e Mesquita, 1990), peixes (Carvalho, et al.,
2002) e cães (Montezuma Jr. et al., 1994; Cardoso et al. 2003; Cardoso et al. 2006).
Nunes (1986, 1987), avaliando o sêmen caprino após duas horas de incubação a 37°C,
observou que tanto a motilidade individual progressiva (MIP) como a porcentagem de
espermatozóides móveis (PEM) eram superiores quando o sêmen se diluía em uma solução
baseada em água de coco, que em leite desnatado. A motilidade individual progressiva dos
27
espermatozóides diluídos em água de coco quando comparados aos diluídos em leite
glicosado foi superior ao final de 2 horas de incubação (Nunes e Salgueiro, 1999).
Resultados similares foram obtidos ao utilizar ambos os diluentes na refrigeração de
sêmen a 4°C e em seu uso para inseminação artificial em cabras nas que se haviam
sincronizado o estro com tratamentos hormonais (Nunes, 1986). Com o uso da inseminação
artificial com sêmen caprino diluído em água de coco e refrigerado a 4°C se obtiveram taxas
de parição superiores a 60% (Nunes, 1986).
Freitas (1988) observou 55,6% de fêmeas contra 44,4% de machos nascidos de partos
de cabras inseminadas com sêmen diluído em água de coco. Salles (1989) inseminou 78
cabras com sêmen resfriado a 4°C e diluído em água de coco na forma in natura, estabilizada
e em gel, observando as respectivas taxas de parições: 63,15%, 87,50% e 92,59%. Com
relação à proporção sexual, foram obtidos valores de 83,33%, 76,00% e 67,89% de fêmeas
nascidas, segundo a forma da água de coco utilizada: in natura, estabilizada e em gel,
respectivamente.
Araújo e Nunes (1991) avaliando o sêmen caprino diluído e congelado em água de
coco in natura com gema de ovo (10%) e sem gema, verificando após a descongelação que a
adição da gema de ovo conferiu uma maior sobrevivência espermática in vitro.
Tratando de determinar a fração da água de coco que atua sobre os espermatozóides,
Nunes et al. (1994) isolaram uma molécula pertencente ao grupo das auxinas, o ácido 3- indol
acético (IAA), que ativa o metabolismo dos espermatozóides. A introdução do IAA na
composição dos diluentes convencionais do sêmen de diferentes espécies conferiu aos
espermatozóides um aumento de motilidade, maior taxa de fertilidade, além de permitir sua
conservação durante períodos mais prolongados (Nunes et al., 1994). A presença do IAA
pode variar com o estágio de maturação e a espécie do fruto e influir nos resultados in vitro e
in vivo em sêmen diluído em água de coco (Nunes e Salgueiro, 1999).
Diluidores de sêmen à base de água de coco apresentam como vantagens o baixo
custo, fácil preparo, além do fato do coco ser abundante no Nordeste do Brasil. Entretanto, a
água de coco apresenta deficuldades quando à conservação por longos períodos após sua
extração do fruto, limitações na disponibilidade do fruto em regiões onde há a carência do
vegetal, além de variações na constituição bioquímica da água de coco entre diferentes frutos.
Isto motivou o desenvolvimento do produto água de coco em pó (ACP), onde os constituíntes
nutricionais da água de coco são obtidos em sistema de desidratação a alto vácuo. O produto
ACP se caracteriza por possuir composição padronizada, obtido a partir de frutos oriundos de
plantações orgânicas certificadas, além de possuir características bioquímicas similares às da
28
água de coco in natura. Para conservação do sêmen ovino, a formulação ACP-102 foi
desenvolvida.
Pesquisas foram realizadas objetivando avaliar o diluidor ACP-102 na conservação do
sêmen ovino. Braz et al. (2003) não encontraram diferenças estatísticas entre os diluidores
ACP-102 e leite na conservação do sêmen ovino diluído e resfriado a 4
o
C ou 15
o
C.
Com relação à inseminação artificial em ovelhas, Salgueiro et al. (2004), obtiveram
fertilidade de 66,67% e 54,54% com uso de sêmen ovino diluído em ACP-102 e resfriado a
4
o
C por 24h e 48h, respectivamente. Resultados semelhantes foram encontrados por
Cavalcante et al. (2005), que verificaram fertilidade de 53,13% e 63,38% com uso de sêmen
ovino resfriado em ACP-102 por 24h e 48h, respectivamente. Machado et al. (2006) com uso
de sêmen resfriado a 4
o
C diluído em ACP-102, encontrou fertilidade nas ovelhas inseminadas
48% para inseminação cervical e de 70,3% para inseminação por laparoscopia. Salgueiro et
al. (2007), usando sêmen ovino resfriado a 4
o
C diluído em ACP-102 e TRIS por 24 horas,
encontraram taxas de fertilidade de 88,5% e 82,6%, respectivamente, para ambos diluentes.
Tais resultados vêm demonstrar a viabilidade técnica do uso do ACP-102 como diluente de
sêmen ovino.
Objetivando uma melhor solubilização da gema de ovo adicionada ao diluidor, foi
elaborado, a partir da formulação do diluidor ACP-102, o diluidor ACP-102c para uso na
criopreservação do sêmen ovino.
29
3. JUSTIFICATIVA
Trabalhos têm demonstrado que a água de coco pode exercer uma ação benéfica sobre
a conservação celular. Entretanto, ainda é grande a necessidade da realização de estudos,
especialmente quanto aos protocolos de criopreservação.
O problema consiste no fato de que a água de coco é um produto oriundo de
vegetações tipicamente tropicais, o que limita a sua difusão em trabalhos em regiões de clima
temperado. Além de ser susceptível a contaminação após sua retirada do fruto e, por isso, de
difícil conservação. Vale ressaltar a necessidade de pessoas aptas a identificar o estágio de
frutificação ideal para uso como conservante celular. Neste sentido, a estabilização da água de
coco na forma de pó (ACP
®
) facilitará a sua utilização, bem como a sua difusão para regiões
que não disponham da matéria-prima (coco).
O rebanho ovino nordestino, em sua maioria, é composto por animais sem padrão
racial definido e de baixa produtividade. A inseminação artificial de ovelhas com sêmen de
reprodutores de raças puras otimizará o melhoramento genético, aumentando a produtividade
do plantel ovino nordestino.
O interesse pelo uso da água de coco em pó como diluidor seminal vem crescendo,
sendo necessário o estabelecimento de protocolos experimentais de congelação adequados ao
referido meio. Além disso, há a necessidade de trabalhos que avaliem os diluentes à base de
água de coco em pó para a congelação do sêmen ovino, que permitirá a criopreservação do
sêmen de animais geneticamente superiores, para a constituição de bancos de germoplasma.
30
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
A água de coco em pó poderá se constituir em um eficiente diluidor capaz de
criopreservar o sêmen ovino, tornando-se mais uma alternativa mercadológica para a área de
reprodução animal, uma vez que este apresenta relação custo/benefício equiparável aos
diluentes tradicionais.
31
5. OBJETIVOS
Geral:
Avaliar a viabilidade in vitro do sêmen de ovinos congelado nos meios diluentes à
base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS.
Específicos:
• Avaliar o sêmen fresco e diluído de ovinos em ACP-102c e TRIS através de
análise computadorizada (SCA, Microptics S.L., Espanha), quanto aos seguintes
parâmetros: percentual de espermatozóides móveis (MOV), percentual de
espermatozóides com movimento progressivo (PROG), velocidade curvilinear
(VCL), velocidade média do percurso (VAP), linearidade (LIN), retilinearidade
(STR), deslocamento lateral de cabeça (ALH) e freqüência de batimento cruzado
(BCF), bem como o de integridade da membrana espermática com uso de
coloração vital eosina-nigrosina e integridade de membrana plasmática e
acrossomal com uso da coloração tripla;
• Avaliar o efeito da criopreservação e do tipo de diluente sobre os parâmetros
morfométricos de comprimento, largura, área e perímetro da cabeça de
espermatozóides frescos e criopreservados de ovinos nos meios diluentes à base de
ACP-102c e TRIS.
32
Capítulo 1
Artigo 1:
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c)
e TRIS
[Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water (PCW-102c)
and TRIS]
Periódico: Small Ruminant Research (a ser submetido)
ISSN: 0921-4488
33
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó
(ACP-102c) e TRIS
Resumo
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em
programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a
disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de
origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados
satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do
uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS. Foram realizadas
12 coletas de sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada
ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas em ACP-102c e TRIS e
criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e
duas horas (T2) de incubação, para percentual de espermatozóides morfologicamente normais
e de células vivas (pela técnica de coloração com eosina-nigrosina), avaliação da integridade
acrossomal e de viabilidade celular (com uso da técnica de coloração tripla) e análise de
motilidade em sistema CASA. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen
criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de
coloração. Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os
diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade total, motilidade progressiva e amplitude lateral
da cabeça, com valores superiores encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram
equivalentes quanto aos parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos
(velocidade curvilinear e velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento
cruzado do flagelo. Após duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram
significativamente para os parâmetros de motilidade avaliados, exceto para o parâmetro
linearidade. O diluidor ACP-102c apresentou maior variabilidade individual entre
reprodutores. Recomenda-se a pesquisa de novos protocolos de criopreservação que otimizem
os resultados obtidos na criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da
interação entre constituintes do plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com
componentes do diluidor e a avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em
programas de inseminação artificial.
Palavras-chave: sêmen ovino, criopreservação, ACP-102c, TRIS, CASA.
34
Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water
(PCW-102c) and TRIS
Abstract
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and
ovine breed conservation programs. To facilitate semen the disponibility of seminal extenders
and reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water
(PCW-102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of
studies using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study was to
evaluate the efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS. Twelve semen
collections were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was
divided into two aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The
semen was evaluated at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2)
of incubation, for percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by
eosin-nigrosin dyeing technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by
triple stain technique) and motility evaluation at CASA system. It weren’t observed statistical
differences between semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS extenders for the
parameters adopted in each stain technique. There are significant differences at the moment of
thawing between PCW-102c and TRIS extenders for total motility, progressive motility and
head lateral amplitude, with superior values for TRIS extender, but both extenders was
equivalent for qualitative (straightness and linearity) and quantitative parameters (curvilinear
velocity and average velocity), and frequency of track crossing. After two hours of
incubation, both extenders were significantly different for motility parameters evaluated,
except for linearity. The PCW-102c extender shows more individual variability between rams.
It was recommended the research of new cryopreservation protocols that optimize the results
obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c, the interaction of
seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders components and the
evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial insemination programs.
Keywords: ram semen, cryopreservation, PCW-102c, TRIS, CASA.
35
Criopreservação do sêmen ovino em meio diluente à base de água de coco em pó
(ACP-102c) e TRIS
Cryopreservation of ram semen in extenders based on powder coconut water
(PCW-102c) and TRIS
Cavalcante, J.M.M.
1*
; Nunes, J.F.
1
; Salgueiro, C.C.M.
1
; Salmito-Vandederley, C.S.B.
1
;
Brasil, O.O.
1
; Souza, D.F.R.
1
; Assis Neto, E.T.
1
; Silva Júnior, J.B.
1
1
Programa Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Faculdade de Veterinária. Núcleo
Integrado de Biotecnologia. Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino.
Universidade Estadual do Ceará. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP: 60.740-000,
Fortaleza, Ceará, Brasil.
*Experimento integrante da dissertação de Mestrado do primeiro autor. E-mail:
[email protected]
Resumo
A inseminação artificial com uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em
programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas. No intuito de facilitar a
disponibilidade de diluidores seminais e reduzir seus custos, foi desenvolvido o diluidor de
origem vegetal à base de água de coco em pó (ACP-102), que tem apresentado resultados
satisfatórios na conservação do sêmen ovino resfriado. Há, no entanto, carência de estudos do
uso deste diluidor na criopreservação do sêmen ovino. O objetivo deste trabalho foi avaliar a
eficiência do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS. Foram realizadas
12 coletas de sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês. As amostras de sêmen de cada
ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas em ACP-102c e TRIS e
criopreservadas. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e
duas horas (T2) de incubação, para percentual de espermatozóides morfologicamente normais
e de células vivas (pela técnica de coloração com eosina-nigrosina), avaliação da integridade
acrossomal e de viabilidade celular (com uso da técnica de coloração tripla) e análise de
motilidade em sistema CASA. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen
criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de
36
coloração. Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os
diluidores ACP-102c e TRIS para motilidade total, motilidade progressiva e amplitude lateral
da cabeça, com valores superiores encontrados no diluidor TRIS, mas ambos diluidores foram
equivalentes quanto aos parâmetros qualitativos (retilinearidade e linearidade) e quantitativos
(velocidade curvilinear e velocidade média do percurso), bem como freqüência de batimento
cruzado do flagelo. Após duas horas de incubação, ambos diluidores diferiram
significativamente para os parâmetros de motilidade avaliados, exceto para o parâmetro
linearidade. O diluidor ACP-102c apresentou maior variabilidade individual entre
reprodutores. Recomenda-se a pesquisa de novos protocolos de criopreservação que otimizem
os resultados obtidos na criopreservação de sêmen ovino com o uso do ACP-102c, da
interação entre constituintes do plasma seminal e de membrana dos espermatozóides com
componentes do diluidor e a avaliação do sêmen ovino criopreservado em ACP-102c em
programas de inseminação artificial.
Palavras-chave: sêmen ovino, criopreservação, ACP-102c, TRIS, CASA.
Abstract
The cryopreservated semen at artificial insemination programs is a value tool for genetic and
ovine breed conservation programs. To facilitate semen the disponibility of seminal extenders
and reduce the costs, it was developed a vegetal extender based on powder coconut water
(PCW-102), that shown satisfactory results in chilled ram semen. However, there is a lack of
studies using this extender in ram semen cryopreservation. The aim of this study was to
evaluate the efficiency of ram semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS. Twelve semen
collections were taken from four Santa Ines rams. Semen samples of each ejaculate was
divided into two aliquots and extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved. The
semen was evaluated at the moment of thawing (T0), after one hour (T1) and two hours (T2)
of incubation, for percentage of spermatozoa morphologically normal and alive cells (by
eosin-nigrosin dyeing technique), evaluation of acrosomal integrity and cellular viability (by
triple stain technique) and motility evaluation at CASA system. It weren’t observed statistical
differences between semen cryopreserved on PCW-102c and TRIS extenders for the
parameters adopted in each stain technique. There are significant differences at the moment of
thawing between PCW-102c and TRIS extenders for total motility, progressive motility and
37
head lateral amplitude, with superior values for TRIS extender, but both extenders was
equivalent for qualitative (straightness and linearity) and quantitative parameters (curvilinear
velocity and average velocity), and frequency of track crossing. After two hours of
incubation, both extenders were significantly different for motility parameters evaluated,
except for linearity. The PCW-102c extender shows more individual variability between rams.
It was recommended the research of new cryopreservation protocols that optimize the results
obtained on the ram semen cryopreservation with the use of PCW-102c, the interaction of
seminal constituents and spermatozoa membrane with the extenders components and the
evaluation of ram semen cryopreserved on PCW-102c at artificial insemination programs.
Keywords: ram semen, cryopreservation, PCW-102c, TRIS, CASA.
1. Introdução
A inseminação artificial, particularmente com uso do sêmen criopreservado, é uma
ferramenta valiosa nos programas de melhoramento genético e conservação de raças ovinas
(Anel et al., 2006). Diluidores utilizados para preservação seminal a baixas temperaturas
contém ingredientes básicos e aditivos que possibilitam proteção dos espermatozóides contra
mudanças na temperatura (Salamon & Maxwell, 1995). O diluidor deve conter substratos
energéticos, tampões que mantenham pH e osmolaridade e componentes que protejam o
espermatozóide contra dano criogênico, de modo a permitir a sobrevivência das células
espermáticas durante a diluição, resfriamento, congelamento e descongelamento (Salamon &
Maxwell, 2000).
O diluidor Tris-frutose-gema é o mais comumente utilizado na criopreservação do
sêmen ovino (Salamon & Maxwell, 1995). Entretanto, no intuito de facilitar a disponibilidade
dos mesmos e reduzir seus custos, novos diluidores têm sido desenvolvidos. Usualmente, os
ingredientes de um diluidor variam de componentes químicos puros a produtos de origem
animal ou vegetal (Gil et al., 2003). Nunes (1988) desenvolveu um diluidor de origem vegetal
à base de água de coco que tem se mostrado efetivo na conservação de sêmen de caprinos
(Nunes, 1988; Campos et al., 2003), ovinos (Figueredo et al., 2001), suínos (Toniolli et al,
1998), peixes (Carvalho, et al., 2002) e cães (Cardoso et al., 2003; Cardoso et al., 2006). Foi
verificada que uma auxina, o ácido indol-3-acético (IAA), presente na água de coco,
proporciona uma melhor motilidade in vitro aos espermatozóides caprinos e da fertilidade ao
38
sêmen ovino na inseminação artificial (Nunes, 1998). O diluidor à base de água de coco é de
baixo custo, fácil preparo e abundante na região Nordeste do Brasil. Entretanto, o uso deste
diluidor tem apresentado algumas desvantagens como a dificuldade de armazenamento da
água de coco por longos períodos e a limitada disponibilidade de frutos em algumas regiões
desprovidas do vegetal. Além disso, a constituição bioquímica pode variar entre frutos,
afetando diretamente a habilidade do diluidor em preservar o espermatozóide. Assim, estudos
foram conduzidos para o desenvolvimento do produto água de coco em pó (ACP
®
), obtido a
partir da desidratação da água de coco a alto vácuo. Este produto caracteriza-se pelo fácil
armazenamento e uso, além do pronto envio para regiões onde a água de coco não é
disponível. De composição padronizada, obtido de frutos oriundos que plantações orgânicas
certificadas, as características bioquímicas de interesse da ACP
®
, após dissolução em água
destilada, são similares àquelas encontradas na água de coco, de modo que este diluidor tem
sido aprovado para uso na conservação do sêmen de diferentes espécies animais como ovinos
(Salgueiro et al., 2004; Machado, et al., 2006), cães (Cardoso et al., 2005; Cardoso et al.,
2007), gatos (Silva et al., 2007) e peixes (Vieira et al., 2007). Apesar dos resultados
promissores obtidos com o sêmen ovino resfriado, há carência de pesquisas com a
criopreservação do sêmen desta espécie. Este trabalho tem como objetivo avaliar parâmetros
do sêmen ovino criopreservado nos diluidores ACP-102c e TRIS em sistema de análise de
sêmen auxiliada por computador (CASA).
2. Materiais e Métodos
2.1. Animais e coleta de sêmen
O experimento foi executado no Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e
Ovino do Núcleo Integrado de Biotecnologia da Universidade Estadual do Ceará, no
município de Fortaleza (03°43’ S, 38°30’ O), Ceará, Brasil, durante os meses de maio a julho
de 2008. Foram utilizados quatro ovinos da raça Santa Inês, idade média de três anos,
mantidos em baias individuais, alimentados com feno de tifton (Cynodon sp.) e concentrado
comercial com 18% PB, além de sal mineral e água à vontade. As coletas de sêmen foram
realizadas com uso de vagina artificial duas vezes por semana, perfazendo 12 coletas por
animal, totalizando 48 ejaculados. Após a coleta, cada ejaculado foi avaliado quanto ao
volume (medido em tubo graduado), concentração (por espectrofotometria), motilidade
39
massal, percentual de espermatozóides móveis e vigor, segundo Chemineau et al. (1991).
Foram utilizados apenas ejaculados com volume superior a 0,5 mL, concentração mínima de
espermatozóides de 3,5 x 10
9
células/mL, motilidade massal e vigor mínimo de 3,5,
percentual de espermatozóides móveis superior a 80% e percentual de patologias espermáticas
inferior a 10%.
2.2. Diluição, congelamento, descongelamento e incubação seminal
Foram utilizados os diluidores ACP-102c (pH 7,0; 434 mOsm/Kg) e TRIS (pH 6,8;
302 mOsm/Kg) para a criopreservação. Ambos diluidores foram divididos em duas frações
(fração “A” e “B”) (Figura 1). A fração “A” do diluidor ACP-102c (ACP Biotecnologia
®
,
Fortaleza-Ceará, Brasil), foi preparada segundo recomendação do fabricante, com acréscimo
de 40 mg de gentamicina e 15% de gema de ovo, enquanto a fração “A” do diluidor TRIS
consistiu de 3,786 g de Tris, 2,11 g de ácido cítrico, 1,0 g de frutose, 40 mg de gentamicina,
20% de gema de ovo em 100 mL de água destilada (Singh et al., 1995). A fração “B” de cada
diluidor teve a mesma constituição da fração “A”, mas acrescida de 10% de glicerol, de modo
a obter, após sua diluição, concentração final de 5% de glicerol. As amostras de sêmen de
cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas nas frações “A” de ACP-102c e
TRIS. Estas diluições foram realizadas a 32
o
C de modo a obter uma concentração de 800x10
6
sptz/mL. Em seguida o sêmen diluído foi resfriado até 4
o
C em 120 minutos, quando então foi
realizada a adição, em três etapas (Chemineau et al., 1991), da fração “B” de cada diluidor,
obtendo concentração final de 400x10
6
sptz/mL. O sêmen foi mantido em equilíbrio a 4
o
C por
duas horas, envasado em palhetas de 0,25 mL, colocadas em suportes e congeladas em vapor
de nitrogênio líquido a 3,5 cm acima do nível do nitrogênio líquido por 10 minutos (-80
o
C),
em seguida imersas em nitrogênio líquido, acondicionadas em racks e estocadas em botijões
criogênicos. Uma palheta por diluidor e de cada ejaculado foi descongelada 15 dias após
criopreservação por imersão da mesma em banho-maria a 37
o
C por 30 segundos e seu
conteúdo de sêmen alocados em tubos modelo Eppendof
®
mantidos em banho-maria a mesma
temperatura. O sêmen foi avaliado logo após descongelamento (T0), após uma hora (T1) e
duas horas (T2) de incubação.
40
Figura 1. Desenho experimental para coleta, criopreservação e avaliação do sêmen
criopreservado de ovinos nos diluidores ACP-102c e TRIS.
Coleta do sêmen
Avaliação da qualidade seminal
(volume, concentração, motilidade massal,
% espermatozóides móveis, vigor, patologias)
37
C
Diluição fração “A”
ACP-102c ou TRIS
(800 x 10
6
sptz/mL)
Resfriamento
(4
o
C/120 min.)
32
C
Diluição fração “B”
(ACP-102c ou TRIS)
3 etapas, intervalo 5 min.
4
00 x 10
6
sptz/
mL
4
C
Tempo de equilíbrio
120 minutos
Envase
Palhetas 0,25 mL
Congelamento
Vapores de nitrogênio líquido
(-80
o
C/10 min)
Armazenamento em botijões criogênicos
(15 dias)
Descongelamento das palhetas
(37
o
C/30 s)
Avaliação
(Coloração eosina/nigrosina, coloração tripla, CASA)
41
2.3. Avaliação do sêmen
2.3.1. Análise padrão do sêmen
O percentual de espermatozóides morfologicamente normais e de células vivas foi
determinado pela técnica de coloração com eosina-nigrosina, segundo metodologia de
Chemineau et al. (1991), onde o percentual de células vivas não coradas (EV) foi registrado.
A avaliação simultânea da integridade acrossomal e de viabilidade celular foi utilizada a
técnica de coloração tripla (adaptada de Talbot & Chacon, 1981 e Garde et al., 1992).
Amostras de 10µL de sêmen fresco diluído ou descongelado foram re-diluídas em azul de
Tripan 1% e incubados por 10 minutos a 37
o
C seguida por confecção de realizado esfregaço
em lâmina. Após secagem ao ar, cada lâmina foi fixada por 30 minutos em solução de
glutaraldeído a 3% em tampão fosfato (pH 7,2). Após lavagem com água destilada e secagem
ao ar, as lâminas foram coradas por 10 minutos a 41
o
C em solução de etanol a 30% com 0,8%
de marrom de Bismark. Após nova lavagem com água destilada e secagem ao ar, as lâminas
foram coradas por 20 minutos em solução de 0,8% de rosa Bengala 0,8%, tamponada a pH
5,3, seguida de uma última lavagem e secagem, sendo feita montagem permanente da lâmina
com lamínula. A coloração rósea na região acrossomal evidenciou integridade do acrossoma,
enquanto a coloração da região pós-acrossomal caracterizou a vitalidade (marrom claro) ou
não (marrom escuro) da célula. Para tanto foram classificados 200 espermatozóides por
lâmina em: vivos com acrossoma (VA), vivos sem acrossoma (VR), mortos com acrossoma
(MA) e mortos sem acrossoma (MR). Foram considerados espermatozóides ainda viáveis
aqueles classificados como VA, enquanto que aqueles que sofreram reação acrossomal
classificados como VR. Estas avaliações foram realizadas tanto com o sêmen fresco bem
como sêmen criopreservado em ACP-102c ou TRIS logo após descongelamento.
2.3.2. Análise do sêmen auxiliada por computador (CASA)
A análise de motilidade foi realizada em sistema CASA com uso do programa Sperm
Class Analyser
®
(SCA
®
, Microptic S.L, Barcelona, Espanha), tanto com o sêmen fresco bem
como no sêmen criopreservado em ACP-102c e TRIS, logo após descongelamento (T0),
incubado com uma hora (T1) e incubado com duas horas (T2). Foram utilizados os seguintes
parâmetros do programa: 25 quadros/s, número de quadros: 25/campo, velocidade limite para
espermatozóides lentos: 30µm/s, limite para velocidade média: 60 µm/s, retilinearidade
mínima para espermatozóides progressivos: 80%. Para a avaliação, sêmen fresco ou
42
descongelado foi diluído em solução citrato-glicose (Evans & Maxwell, 1990) a 37
o
C, de
modo a obter concentração 40x10
6
sptz/mL. Dez microlitros desta suspensão foi colocada em
câmara de contagem de Makler (Sefi Medical Instruments Ltda, Haifa, Israel), pré-aquecida a
37
o
C. Um mínimo de 200 espermatozóides foram avaliados pelo sistema CASA usando
microscópio de contraste de fase. Dentre os parâmetros espermáticos fornecidos foram
avaliados: percentual de espermatozóides móveis (MOV), percentual de espermatozóides com
movimento progressivo (PROG), velocidade curvilinear (VCL - µm/s), velocidade média do
percurso (VAP - µm/s), linearidade (LIN - %), retilinearidade (STR - %), deslocamento
lateral de cabeça (ALH - µm) e freqüência de batimento cruzado (BCF - Hz).
2.4. Análise estatística
Os resultados foram expressos em termos de média ± erro padrão. Após transformação
em arcoseno dos valores dados em percentual, as médias foram avaliadas usando análise de
variância, seguido de teste de Tukey post hoc para determinar diferenças significativas em
todos os parâmetros avaliados entre sêmen fresco, congelado em diluidor ACP-102c e TRIS,
com nível de significância de 5%.
3. Resultados
Os ejaculados utilizados neste estudo tiveram os seguintes valores médios: 0,96±0,4
mL de volume, 4,1±0,6x10
9
espermatozóides/mL de concentração espermática, 8,46% de
alterações morfológicas.
A criopreservação afetou significativamente o percentual de células viáveis, observada
tanto pelo método de coloração por eosina-nigrosina como da coloração tripla, com redução
no percentual de células viáveis no sêmen criopreservado (Tab. 1). Dentre os parâmetros
analisados pela técnica de coloração tripla, o único não afetado pela criopreservação foi VR
(espermatozóides vivos sem acrossoma), que permaneceu em baixos percentuais em relação
aos demais parâmetros. Também não foram encontradas diferenças estatísticas entre o sêmen
criopreservado em diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros adotados em cada técnica de
coloração. Apesar de um percentual superior de células viáveis pelo método da coloração
tripla (espermatozóides vivos com acrossoma intacto - VA) tanto no sêmen fresco como no
criopreservado, o percentual de células classificadas como MA (espermatozóides mortos com
acrossoma) e MR (espermatozóides mortos sem acrossoma) aumentou significativamente no
43
sêmen criopreservado quando comparado ao sêmen fresco. O percentual encontrado de
células vivas pelo método da coloração tripla (VA+VR) foi semelhante ao encontrado pelo
método de eosina-nigrosina, o que corrobora o uso destas técnicas na avaliação da viabilidade
seminal. O percentual de alterações morfológicas no sêmen teve média de 8,24% para ambos
diluidores, não diferindo estatisticamente do percentual encontrado para o sêmen fresco.
Tabela 1. Média ± erro padrão dos percentuais dos parâmetros avaliados de viabilidade
espermática pelas técnicas de coloração com eosina-nigrosina (EV) e coloração
tripla (VA, VR, MA e MR) em sêmen fresco e criopreservado em TRIS e ACP-
102c
Letras diferentes entre colunas indicam diferenças estatísticas (P<0,05).
VA = espermatozóides vivos com acrossoma; VR = espermatozóides vivos sem acrossoma;
MA = espermatozóides mortos com acrossoma; MR = espermatozóides mortos sem
acrossoma.
Os efeitos da criopreservação também foram verificados nos parâmetros de motilidade
avaliados pelo software SCA. Excetuando os parâmetros velocidade média do percurso
(VAP) e linearidade (LIN), em todos os demais foi possível verificar diferenças estatísticas
entre o sêmen fresco e o criopreservado, com sêmen fresco apresentando valores superiores
aos encontrados logo após descongelamento (Tab. 2).
Sêmen criopreservado Parâmetro
Sêmen fresco
TRIS ACP-102c
EV (%) 86,5±1,2
a
51,9±2,0
b
50,0±1,7
b
VA (%) 88,6±1,4
a
50,9±1,8
b
48,3±1,8
b
VR (%) 1,2±0,2 1,7±0,3 1,8±0,3
MA (%) 7,7±1,2
b
20,4±1,5
a
19,6±1,6
a
MR (%) 2,4±0,4
b
26,5±1,7
a
30,3±2,2
a
44
Tabela 2. Média ± erro padrão dos parâmetros de motilidade do sêmen ovino fresco e
criopreservado em TRIS e ACP-102c, avaliados pelo software SCA.
Sêmen criopreservado
Parâmetro Sêmen fresco
TRIS ACP-102c
MOV 78,7±1,5
a
63,1±2,6
b
39,0±2,8
c
PROG 46,7±1,4
a
32,3±1,4
b
19,7±1,5
c
VCL (µm/s) 131,9±2,6
a
123,3±2,0
b
116,1±2,1
b
VAP (µm/s) 108,3±3,2
a
104,9±2,0
a
101,7±2,3
a
LIN (%) 66,8±1,2
a
67,4±1,0
a
68,9±1,4
a
STR (%) 82,0±0,7
a
79,2±0,7
b
78,6±1,1
b
ALH (µm) 3,4±0,1
a
3,0±0,1
b
2,6±0,1
c
BCF (Hz) 9,4±0,2
a
8,1±0,1
b
7,9±0,1
b
Letras diferentes entre colunas indicam diferenças estatísticas (P<0,05).
MOV = percentual de espermatozóides móveis totais; PROG = percentual de
espermatozóides progressivos; VCL = velocidade curvilinear; VAP = velocidade média do
percurso; LIN = linearidade; STR = retilinearidade; ALH = amplitude lateral da cabeça do
espermatozóide; BCF = freqüência de batimento cruzado.
Foram observadas diferenças estatísticas logo após descongelamento entre os
diluidores ACP-102c e TRIS nos parâmetros MOV, PROG e ALH, com valores superiores
encontrados no diluidor TRIS. Não foram apresentadas diferenças estatísticas entre diluidores
para VCL, VAP, LIN, STR e BCF (Tab. 2).
O tempo de incubação exerceu efeito quanto aos diluidores estudados, com redução
nos parâmetros de MOV, PROG, VCL, VAP e LIN ao final de duas horas de incubação para
ambos diluidores (Fig. 2 a-e). Para os parâmetros STR, ALH e BCF a incubação exerceu
efeitos significativos para o diluidor TRIS, mas não para ACP-102c (Fig. 2 f-h).
Foram encontradas diferenças estatísticas entre os diluidores ACP-102c e TRIS para
todos os parâmetros de motilidade avaliados ao final de duas horas de incubação do sêmen,
exceto para LIN e STR (Fig. 2 e-f). A diferença entre diluidores para os parâmetros MOV e
PROG, verificadas logo após descongelamento, foi mantida praticamente constante durante
incubação (Fig. 2 a-b).
45
0
10
20
30
40
50
60
70
T0 T1 T2
tempos de incubação
MOV (%)
TRIS
ACP-102
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
T0 T1 T2
Tempos de incubação
VCL (µm/s)
TRIS
ACP-102
0
5
10
15
20
25
30
35
40
T0 T1 T2
tempos de incubação
PROG (%)
TRIS
ACP-102
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
T0 T1 T2
tempos de incubação
VAP (µm/s)
TRIS
ACP-102
40
45
50
55
60
65
70
75
T0 T1 T2
tempos de incubação
LIN (%)
TRIS
ACP-102
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
T0 T1 T2
tempos de incubação
ALH (µm)
TRIS
ACP-102
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
T0 T1 T2
tempos de incubação
BCF (Hz)
TRIS
ACP-102
65
67
69
71
73
75
77
79
81
83
85
T0 T1 T2
tempos de incubação
STR (%)
TRIS
ACP-102
Figura 2. Parâmetros de motilidade de sêmen ovino criopreservado em ACP-102c e TRIS
avaliados pelo software SCA em diferentes tempos de incubação.
a
c
e
f
g
h
b
d
f
46
Quando comparados os parâmetros MOV e PROG para o sêmen fresco e
criopreservado em ACP-102c e TRIS entre os reprodutores ovinos utilizados, não houve
diferenças entre as características do sêmen fresco e criopreservado em TRIS entre os animais
(Tab. 3). Entretanto, houve variabilidade individual quanto a estes mesmos parâmetros
seminais para o diluidor ACP-102c, onde o animal 3 mostrou melhor congelabilidade para
este diluidor em relação aos demais (Tab. 3), o que é indicativo de possível influência
individual na qualidade da criopreservação do sêmen diluído em ACP-102c.
Tabela 3. Média ± erro padrão dos parâmetros de percentual de espermatozóides móveis totais
(MOV) e de progressivos (PROG) para sêmen ovino fresco e criopreservado nos
diluidores TRIS e ACP-102c, segundo os reprodutores utilizados
Sêmen Criopreservado
Sêmen Fresco
TRIS ACP-102c
Animal
MOV PROG MOV PROG MOV PROG
1 81,5±2,2
A
(9,5)
47,3±1,9
A
(13,8)
72,5±3,9
A
(18,6)
36,8±2,8
A
(26,5)
43,9±6,7
A,B
(52,7)
17,9±2,5
B
(48,0)
2 80,1±1,9
A
(8,4)
44,4±3,2
A
(25,0)
57,0±5,2
A
(31,3)
28,9±2,9
A
(35,0)
31,5±3,7
B
(41,0)
13,8±2,1
B
(52,3)
3 78,1±3,1
A
(13,8)
49,6±3,0
A
(21,1)
61,0±4,8
A
(27,4)
31,8±2,3
A
(25,0)
50,9±6,0
A
(40,7)
29,9±3,4
A
(39,6)
4 74,9±3,9
A
(18,0)
45,6±3,0
A
(23,1)
61,8±6,4
A
(35,7)
31,9±3,3
A
(36,2)
29,7±3,0
B
(35,0)
17,2±1,6
B
(31,8)
Letras maiúsculas diferentes entre linhas são estatisticamente diferentes (P<0,05)
Número entre parênteses: coeficiente de variação
4. Discussão
A integridade da membrana espermática e acrossomal são atributos essenciais para a
fertilidade do espermatozóide e a análise destes parâmetros é fundamental para a predição de
sua fertilidade (Luz et al., 2000; Gil et al., 2000).
A redução do percentual de espermatozóides viáveis entre o sêmen fresco e
criopreservado avaliado pelas técnicas de coloração com eosina-nigrosina e coloração tripla
foram respectivamente 35,6% e 39%. É conhecida a ação da criopreservação em induzir
danos físicos nas células (Holt, 2000), o que justifica esta redução dos espermatozóides
47
viáveis no sêmen criopreservado, estando estes resultados de acordo com os encontrados por
Garde (1992). As semelhanças dos resultados obtidos com os diluidores TRIS e ACP-102c
para os métodos de coloração utilizados são indicativos da equivalência destes diluidores na
preservação integridade de membrana e acrossomal.
O percentual de células com acrossoma intacto pelo método da coloração tripla
(VA+MA) para ambos diluidores foram semelhantes aos encontrados por Bag et al. (2004),
Gil et al. (2003), O´Meara et al. (2008) e maiores aos encontrados por Joshi et al. (2005),
Sanchez-Partida et al. (1999), D'Alessandro et al. (2001) e Marco-Jiménez et al. (2004). Estas
diferenças podem ser imputadas a diversos fatores como raça dos animais utilizados,
formulação dos diluidores, protocolos adotados para criopreservação e metodologia de
avaliação seminal.
A diminuição do percentual de células viáveis encontradas tanto pelo método de
coloração por eosina-nigrosina, como pela coloração tripla, refletiu no desempenho do sêmen
criopreservado na avaliação dos parâmetros seminais de motilidade. A população espermática
que sobrevive ao processo de congelamento-descongelamento apresenta alterações
particularmente na membrana plasmática (Gil et al., 2003). A ocorrência de alterações
semelhantes à capacitação, induzida pela criopreservação, resulta numa população de
espermatozóides com menor tempo de vida (Peréz et al., 1996).
A redução verificada na quase totalidade dos parâmetros de motilidade entre o sêmen
fresco e o criopreservado, avaliados no sistema CASA, deve ser atribuída ao próprio
congelamento. A diferença entre sêmen fresco e criopreservado em TRIS para MOV e PROG
foi, respectivamente, de 15,6% e 14,4% e os mesmos parâmetros para ACP-102c foram de
39,7% e 27%, respectivamente. Alterações ultraestruturais, bioquímicas e funcionais,
ocorridas durante o processo de criopreservação, levam à redução da motilidade e perda de
viabilidade espermática (Salamon & Maxwell, 2000). Como verificado neste trabalho, tanto o
percentual de células viáveis avaliados pelas técnicas de coloração como os de motilidade
avaliados pelo CASA foram reduzidos após criopreservação.
Os percentuais de espermatozóides móveis e progressivos obtidos para o diluidor
TRIS são compatíveis aos encontrados por Marco-Jiménez et al. (2004), Sanchez-Partida et
al. (1999), D'Alessandro et al. (2001), Aisen et al. (2000), Matsuoka et al. (2006), Anel et al.
(2003); maiores aos obtidos por Aisen et al. (2002), Maxwell et al. (1995); porém menores
aos obtidos por Joshi et al. (2005) e Bag et al. (2002, 2004). Vale ressaltar que estes autores
fizeram uso de diversas formulações para diluidores TRIS e de diferentes métodos de
avaliação, o que reflete na diversidade de resultados entre os mesmos.
48
Os efeitos da criopreservação sobre os parâmetros de motilidade para ambos
diluidores também foram observados durante a incubação do sêmen, uma vez que a exposição
do sêmen descongelado ao teste de termoresistência revela danos que podem não ter sido
imediatamente aparentes após descongelamento (Aisen et al., 2000). O significante declínio
no percentual de espermatozóides móveis durante incubação pode ser devido à inabilidade do
espermatozóide criopreservado em gerar adenosina de trifosfato (ATP), suficiente pelas
mitocôndrias em conseqüência dos danos sofridos por estas organelas (Viswanath & Shannon,
1997), ou devido ao efeito nocivo das enzimas aminoácido-aromático-oxidase ligadas à
membrana plasmática e liberadas pelos espermatozóides mortos (Shannon & Curson, 1972).
A produção de radicais livres durante a incubação também contribui para o decréscimo da
sobrevivência espermática, uma vez que no ambiente aeróbico ou parcialmente anaeróbico a
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é inevitável (Viswanath & Shannon, 1997).
Entretanto, a diminuição da VCL e VAP para ambos diluidores submetidos à incubação estão
em desacordo com os resultados encontrados por Krzyzosiak et al. (1999), Bag et al. (2004) e
Joshi et al. (2005). Para estes autores, a velocidade dos espermatozóides não é alterada com a
incubação sob condições aeróbicas. Deve-se observar que, logo após o descongelamento, o
percentual de espermatozóides móveis e o percentual de progressivos encontrados por Bag et
al. (2004) e Joshi et al. (2005) foram superiores aos obtidos neste trabalho, mas não os
parâmetros de velocidade VCL e VAP. É possível que estes autores tenham trabalhado com
animais cujo sêmen seja resistente ao processo de criopreservação (good freezers; Watson,
1995) e, com menor velocidade espermática (implicando em menor metabolismo e menor
geração de ROS), tenham conseguido bom desempenho durante incubação.
Os animais utilizados neste estudo não foram selecionados pela congelabilidade do
sêmen e os valores para PROG no sêmen fresco foram baixos, o que pode ter influenciado no
resultado final dos parâmetros de motilidade do sêmen criopreservado (Gil et al., 2003).
Logo após o descongelamento, os diluidores TRIS e ACP-102c diferiram
estatisticamente para os parâmetros de motilidade MOV, PROG e ALH, porém não foram
verificadas diferenças para os demais parâmetros. O diluidor ACP-102c apresentou similar
preservação quantitativa (VCL, VAP) e qualitativa (STR e LIN) da velocidade dos
espermatozóides em relação ao diluidor TRIS. Após duas horas de incubação do sêmen a
37
o
C, o diluidor ACP-102c diferiu estatisticamente do diluidor TRIS nos demais parâmetros
de motilidade, exceto para LIN. O parâmetro LIN está associado com o padrão de movimento
linear da célula espermática de modo que espermatozóides com movimento circular
apresentam baixos valores de LIN (Mortimer, 1997
)
. A semelhança estatística entre ACP-
49
102c e TRIS para LIN indica que ambos diluidores mantêm semelhante padrão de movimento
espermático referente a este parâmetro após incubação.
Schober et al. (2007) comentam que o dano mitocondrial durante criopreservação
pode ser a maior razão para redução da qualidade do sêmen pós-descongelamento. É razoável
supor que a redução em MOV e PROG encontrados para o diluidor ACP-102c se deva, dentre
outros fatores, às injúrias sofridas na atividade mitocôndrial de espermatozóides que sofreram
criodano. Os parâmetros de velocidade são considerados indicadores indiretos da função
mitocondrial do espermatozóide (Budworth et al, 1988). É possível que a atividade
mitocondrial dos espermatozóides móveis diluídos em ACP-102c após descongelamento,
estivesse compatível com aquela encontrada nos espermatozóides criopreservados em TRIS,
uma vez que os parâmetros de velocidade obtidos em ambos os diluidores, logo após
descongelamento, foram estatisticamente semelhantes. O maior percentual de células mortas
pós-descongelamento no diluidor ACP-102c acarretou em comprometimento da qualidade do
meio, tendo como conseqüência uma redução dos valores nos demais parâmetros de
motilidade avaliados pelo CASA, em relação aos obtidos no diluidor TRIS.
A semelhança estatística entre os diluidores ACP-102c e TRIS quanto aos resultados
obtidos de viabilidade pelas técnicas de coloração por eosina-nigrosina e coloração tripla; nos
parâmetros qualitativos (STR e LIN) e quantitativos (VCL e VAP) de velocidade logo após
descongelamento e do parâmetro LIN após duas horas de incubação, podem ser sugestivos do
uso do ACP-102c na inseminação artificial com sêmen ovino criopreservado. Outros autores
têm relatado a respeito da eficiência do diluidor ACP-102c na conservação do sêmen ovino
resfriado, tanto em avaliações in vitro, como resultantes de inseminação artificial. Braz et al.
(2003), não encontraram diferenças estatísticas para o sêmen ovino resfriados a 4
o
C ou 15
o
C
em diluidores ACP-102c ou leite. Salgueiro et al. (2004) encontraram percentual de ovelhas
prenhes inseminadas com sêmen ovino resfriado a 4
o
C por 24 e 48h, de 66,7% e 54,5%,
respectivamente. Machado et al. (2006) com uso de sêmen resfriado a 4
o
C diluído em ACP-
102c, encontraram fertilidade de 48% nas ovelhas inseminadas cervicalmente e de 70,3% para
inseminadas por laparoscopia. Salgueiro et al. (2007), usando sêmen ovino resfriado a 4
o
C
diluído em ACP-102c e TRIS por 24 horas, encontraram taxas de fertilidade de 88,5% e
82,6%, respectivamente, para ambos diluidores. Estes resultados apontam para a
aplicabilidade do diluidor ACP-102 na conservação do sêmen ovino.
O processo de criopreservação reduz a motilidade num grau maior que a integridade
estrutural, já que a membrana plasmática e acrossomal são mais vulneráveis que as estruturas
envolvidas no movimento espermático (Dourado et al., 2007; Salamon & Maxwell, 1995).
50
Isto foi verificado no sêmen criopreservado no diluidor TRIS, onde o percentual de redução
de espermatozóides viáveis em relação ao sêmen fresco avaliados pela coloração tripla e
eosina-nigrosina foram respectivamente 42,6% e 40,0%, enquanto o percentual de redução
para MOV foi apenas 19,8%. Porém, esta informação parece ser influenciada pelo tipo de
diluidor. O percentual de redução para MOV no diluidor ACP-102c acompanhou a redução
do percentual de espermatozóides viáveis avaliados pelas técnicas de coloração. A redução
verificada no ACP-102c para a coloração tripla e eosina-nigrosina foi de 45,5% e 42,2%,
próxima da redução de 50,4% no MOV avaliados pelo CASA.
A taxa ótima de resfriamento, congelamento e descongelamento, pode diferir com a
composição do diluidor (Salamon & Maxwell, 1995). É possível postular que o procedimento
de criopreservação adotado ainda não seja o protocolo ótimo para o diluidor ACP-102c de
modo que novos procedimentos de criopreservação poderiam ser testados.
A semelhança estatística entre os valores de MOV e PROG para o sêmen fresco revela
a homogeneidade da qualidade seminal entre os reprodutores utilizados neste estudo. Também
para os mesmos parâmetros do sêmen criopreservado em TRIS, a semelhança do resultado
entre os animais é indicativo que a criopreservação foi bem sucedida e adequadamente
aplicada em todas as coletas. Entretanto, no sêmen criopreservado em ACP-102c, foi
verificado variação individual, uma vez que o animal 3 apresentou estatísticamente maiores
valores de MOV e PROG em relação aos demais. Possivelmente isto seja indicativo de uma
interação entre o diluidor e as características seminais individuais do referido animal. É
conhecido o fato de ocorrerem variações individuais entre animais ou mesmo entre ejaculados
de um mesmo animal (Söderquist et al., 1997; Windsor, 1997; Gil et al., 2003). Esta
variabilidade individual pode ocorrer na composição proteica do plasma seminal entre
animais (Graham, 1994; Killian et al., 1993). Aos componentes protéicos do plasma seminal
tem sido atribuído importante papel na manutenção da motilidade espermática (Mortimer &
Maxwell (2004); Graham, 1994), melhoria da viabilidade (Ashworth et al., 1994; Maxwell et
al., 1997), e proteção da membrana plasmática ao choque térmico (Barrios et al., 2000, Pérez-
Pé, et al., 2001). A variabilidade na composição seminal pode explicar os diferentes graus de
suscetibilidade do sêmen entre animais. Além disso, componentes do plasma seminal
interagem com constituintes dos diluidores (Manjunath et al., 2002). Portanto, é razoável
supor haver possíveis interações entre os constituintes do plasma seminal e da composição da
membrana plasmática destes espermatozóides com os componentes do diluidor durante o
processo de criopreservação, o que explicaria a variabilidade da congelabilidade do sêmen em
ACP-102c entre os animais trabalhados.
51
5. Conclusões
Apesar dos diluidores ACP-102c e TRIS diferiram quanto aos parâmetros percentuais
de motilidade, ambos foram semelhantes quanto à integridade acrossomal e de vitalidade
espermática e nos parâmetros quantitativos (VCL e VAP) e qualitativos (LIN e STR) de
velocidade logo após descongelamento. Também se assemelharam nos parâmetros
qualitativos de velocidade após duas horas de incubação. O diluidor ACP-102c apresentou
maior variabilidade individual entre reprodutores. Sugere-se a avaliação de novos protocolos
de congelamento apropriados para este diluidor, da investigação de possíveis interações entre
constituintes seminais e de membrana dos espermatozóides, e a avaliação do sêmen ovino
criopreservado em ACP-102c para programas de inseminação artificial. O produto ACP-102c
possibilita uma maior difusão do uso de biotecnologias reprodutivas, bem como permite
novas oportunidades para o desenvolvimento de toda uma cadeia produtiva com base num
produto regional, típico do nordeste do Brasil.
Agrecimentos
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária
da Universidade Estadual do Ceará, à Fazenda Líbanus pelos animais utilizados no
experimento, à FUNCAP pelo financiamento da pesquisa e à empresa ACP Biotecnologia
pelo fornecimento do diluente ACP-102c para os experimentos.
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58
Capítulo 2
Artigo 2:
Efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de espermatozóides de ovinos
diluídos em meio à base da água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS
[Cryopreservation effects on head morphometry of ram spermatozoa extended on media based
on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS]
Periódico: Archívos de Zootecnia (submetido em 31/10/2008)
ISSN: 0004-0592
59
Artigo 2
Efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de espermatozóides de ovinos
diluídos em meio à base da água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS
Resumo
A criopreservação permite a conservação do sêmen animais de alto valor genético,
porém induz efeitos deletérios na atividade espermática e fertilidade. Este trabalho teve como
objetivo avaliar os efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de
espermatozóides de ovinos diluídos em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) e
TRIS. Sêmen de quatro ovinos da raça Santa Inês foi coletado e cada ejaculado foi dividido
em duas alíquotas, diluídas em ACP-102c e TRIS e criopreservadas. Foram realizados
esfregaços tanto para o sêmen fresco como congelado em ACP-102c e TRIS, corados com
Rosa Bengala e submetidos à análise morfométrica no módulo de morfometria do sistema
CASA (Sperm Class Analizer
®
). Foram avaliados 150 espermatozóides corretamente
digitalizados por lâmina para os parâmetros comprimento, largura, área e perímetro da cabeça.
Os parâmetros morfométricos para o sêmen fresco foram significantemente superiores aos do
sêmen criopreservado, não sendo detectadas diferenças estatísticas para espermatozóides
criopreservados em ACP-102c ou TRIS. Os parâmetros morfométricos, entretanto, sofreram
variações individuais entre os animais estudados. A semelhança dos resultados morfométricos
de espermatozóides diluídos em ACP-102c e TRIS é indicativo de que ambos possuem
similar capacidade de preservação estrutural da cabeça de espermatozóides ovinos submetidos
à criopreservação.
Palavras-chave: Santa Inês. Rosa Bengala. CASA.
60
Article 2
Cryopreservation effects on head morphometry of ram spermatozoa extended on media based
on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS
Abstract
The cryopreservation allows semen conservation of animals of high genetic value,
however induce detrimental effects on sperm activity and fertility. The aim of this study was
to evaluate cryopreservation effects on head morphometry of ram spermatozoa extended on
media based on powder coconut water (PCW-102c) and TRIS. Semen from four Santa Ines
rams was collected and each ejaculate was divided into two aliquots, extended on PCW-102c
and TRIS and cryopreserved. Fresh and frozen-thawed semen were smeared and stained in
Bengal Rose dye and analyzed using the morphometric module of CASA system (Sperm
Class Analyzer
®
). At least 150 properly digitized sperm head per slide were analyzed for
length, width, area and perimeter. The morphometric parameters for fresh semen were
statistically superior to those of frozen-thawed semen, not being observed statistical
differences for spermatozoa cryopreserved on PCW-102c or TRIS. The morphometric
parameters, however, suffered individual variations between the animals studied. The
similarity of morphometric resulties of spermatozoa extended on PCW-102c and TRIS
indicate that both have similar capacity of preserve the head structure of ram spermatozoa
cryopreservated.
KEYWORDS: Santa Ines. Bengal Rose. CASA.
61
EFEITOS DA CRIOPRESERVAÇÃO SOBRE A MORFOMETRIA DA CABEÇA DE
ESPERMATOZÓIDES DE OVINOS DILUÍDOS EM MEIO À BASE DA ÁGUA DE COCO EM PÓ
(ACP-102c) E TRIS
[CRYOPRESERVATION EFFECTS ON HEAD MORPHOMETRY OF RAM SPERMATOZOA
EXTENDED ON MEDIA BASED ON POWDER COCONUT WATER (PCW-102c) AND TRIS]
Cavalcante, J.M.M.
1*
, J.F. Nunes
1
, C.C.M. Salgueiro
1
, C.S.B. Salmito-Vandederley
1
, O.O. Brasil
1
,
D.F.R. Souza
1
, E.T. Assis Neto
1
, J.B. Silva Júnior
1
1
Programa Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Faculdade de Veterinária. Núcleo Integrado de
Biotecnologia. Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino. Universidade Estadual do
Ceará. Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi, CEP: 60.740-000, Fortaleza, Ceará, Brasil.
*Experimento integrante da dissertação de Mestrado do primeiro autor. E-mail:
jmmcav[email protected]
PALAVRAS-CHAVE ADICIONAIS: Santa Inês. Rosa Bengala. CASA.
ADDITIONAL KEYWORDS: Santa Ines. Bengal Rose. CASA.
RESUMO
A criopreservação permite a conservação do sêmen animais de alto valor genético, porém
induz efeitos deletérios na atividade espermática e fertilidade. Este trabalho teve como objetivo avaliar
os efeitos da criopreservação sobre a morfometria da cabeça de espermatozóides de ovinos diluídos
em meio à base de água de coco em pó (ACP-102c) e TRIS. Sêmen de quatro ovinos da raça Santa
Inês foi coletado e cada ejaculado foi dividido em duas alíquotas, diluídas em ACP-102c e TRIS e
criopreservadas. Foram realizados esfregaços tanto para o sêmen fresco como congelado em ACP-
102c e TRIS, corados com Rosa Bengala e submetidos à análise morfométrica no módulo de
morfometria do sistema CASA (Sperm Class Analizer
®
). Foram avaliados 150 espermatozóides
corretamente digitalizados por lâmina para os parâmetros comprimento, largura, área e perímetro da
cabeça. Os parâmetros morfométricos para o sêmen fresco foram significantemente superiores aos do
sêmen criopreservado, não sendo detectadas diferenças estatísticas para espermatozóides
criopreservados em ACP-102c ou TRIS. Os parâmetros morfométricos, entretanto, sofreram variações
individuais entre os animais estudados. A semelhança dos resultados morfométricos de
espermatozóides diluídos em ACP-102c e TRIS é indicativo de que ambos possuem similar
62
capacidade de preservação estrutural da cabeça de espermatozóides ovinos submetidos à
criopreservação.
SUMMARY
The cryopreservation allows semen conservation of animals of high genetic value, however
induce detrimental effects on sperm activity and fertility. The aim of this study was to evaluate
cryopreservation effects on head morphometry of ram spermatozoa extended on media based on
powder coconut water (PCW-102c) and TRIS. Semen from four Santa Ines rams was collected and
each ejaculate was divided into two aliquots, extended on PCW-102c and TRIS and cryopreserved.
Fresh and frozen-thawed semen were smeared and stained in Bengal Rose dye and analyzed using the
morphometric module of CASA system (Sperm Class Analyzer
®
). At least 150 properly digitized
sperm head per slide were analyzed for length, width, area and perimeter. The morphometric
parameters for fresh semen were statistically superior to those of frozen-thawed semen, not being
observed statistical differences for spermatozoa cryopreserved on PCW-102c or TRIS. The
morphometric parameters, however, suffered individual variations between the animals studied. The
similarity of morphometric resulties of spermatozoa extended on PCW-102c and TRIS indicate that
both have similar capacity of preserve the head structure of ram spermatozoa cryopreservated.
INTRODUÇÃO
A criopreservação do sêmen tem permitido a preservação indefinida de gametas de animais de
alto valor genético (Hidalgo et al., 2007). Entretanto, esta técnica produz efeitos deletérios na
atividade espermática e fertilidade (Watson, 2000). A análise seminal permite determinar o potencial
de fertilização de uma amostra de sêmen (O´Meara et al., 2008). Comumente são avaliadas motilidade
espermática, integridade de membrana plasmática e acrossomal e morfologia, uma vez que a
criopreservação leva a uma redução destes parâmetros. Particularmente quanto à morfologia, tem sido
demonstrado que a redução do percentual de espermatozóides morfologicamente normais resulta num
decréscimo na fertilidade (Colas, 1981).
Entretanto, a avaliação morfológica tem sido realizada subjetivamente, resultando em variação
de resultados entre técnicos e laboratórios. Isto motivou o desenvolvimento de sistemas automatizados
de análise morfométrica do sêmen (CASMA) (Verstegen et al., 2002), permitindo uma avaliação
objetiva e acurada de diferenças sutis nas dimensões da cabeça do espermatozóide (Gravance et al.,
1998a).
63
Estudos utilizando CASMA têm demonstrado que a criopreservação reduz as dimensões dos
espermatozóides nas mais diversas espécies (Gravance et al., 1998b; Marco-Jiménez et al., 2006;
Hidalgo et al., 2007; Rubio-Guillén et al., 2007; Arruda et al., 2002; García-Herreros et al., 2007). A
criopreservação afeta várias estruturas celulares, como mitocôndrias (Windsor & White, 1995),
acrossoma (Valcarcel et al., 1997), e DNA espermático (Peris et al., 2004) e as diferenças
morfométricas encontradas no sêmen criopreservado têm sido atribuídas a estas alterações (Gravance
et al., 1998b; Arruda et al., 2002).
Os parâmetros morfométricos também são influenciados pelo tipo de diluente (Hidalgo, et al.,
2007). O diluente TRIS-frutose-gema é o mais comumente utilizado na criopreservação do sêmen
ovino (Salamon & Maxwell, 1995). No intuito de facilitar a disponibilidade de diluentes seminais e
reduzir seus custos, novos meios têm sido pesquisados. Nunes (1988) desenvolveu um diluente de
origem vegetal à base de água de coco que tem se mostrado efetivo na conservação do sêmen de
caprinos (Nunes, 1988; Campos et al., 2003), ovinos (Figueredo et al., 2001), suínos (Toniolli et al.,
1998), peixes (Carvalho et al., 2002), e cães (Cardoso et al. 2003; Cardoso et al. 2006). Para
possibilitar sua disponibilidade em regiões desprovidas do fruto (coco), permitir sua maior
durabilidade e padronização da constituição bioquímica, foi desenvolvido o produto água de coco em
pó (ACP) obtido a partir da desidratação da água de coco em alto vácuo, que tem sido testado e
comprovado na conservação do sêmen de diferentes espécies animais como ovinos (Salgueiro et al.,
2004; Machado, et al., 2006), cães (Cardoso et al., 2005; Cardoso et al., 2007), gatos (Silva et al.,
2007), e peixes (Vieira et al., 2007).
A raça também exerce influência sobre as dimensões do espermatozóide após a
criopreservação (Rubio-Guillén et al., 2007; Saraiva et al., 2007). Poucos são os trabalhos de
avaliação morfométrica do espermatozóide da espécie ovina e, em particular na raça Santa Inês
(Monteiro et al., 2006), comumente criada na região Nordeste do Brasil. Além disso, não se conhece
os efeitos do diluente ACP-102c sobre os parâmetros morfométricos do sêmen ovino criopreservado.
Deste modo, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da criopreservação sobre a
morfometria da cabeça de espermatozóides de ovinos diluídos em meio à base de água de coco em pó
(ACP-102c) e TRIS.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados quatro ovinos da raça Santa Inês, mantidos em baias individuais pertencentes
ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino do Núcleo Integrado de Biotecnologia da
Universidade Estadual do Ceará, no município de Fortaleza (03°43’S-38°30’O), Ceará, Brasil, durante
os meses de maio a julho de 2008, alimentados com feno de tifton (Cynodon sp.) e concentrado
comercial com 18% PB, além de sal mineral e água à vontade. As coletas de sêmen foram realizadas
64
com uso de vagina artificial, duas vezes por semana, sendo 10 coletas por animal, totalizando 40
ejaculados. Após a coleta, cada ejaculado foi previamente avaliado quanto ao volume (medido em
tubo graduado), concentração (por espectrofotometria), motilidade massal, percentual de
espermatozóides móveis e vigor, segundo Chemineau et al. (1991). Foram utilizados apenas
ejaculados com volume superior a 0,5 mL, concentração mínima de espermatozóides de 3,5 x 10
9
sptz/mL, motilidade massal e vigor mínimo de 3,5, percentual de espermatozóides móveis superior a
80% e percentual de patologias espermáticas inferior a 10%.
A criopreservação foi realizada em etapas segundo metodologia de Chemineau et al. (1991)
modificada. Foram utilizados os diluentes ACP-102c (pH 7,0; 434 mOsm/Kg) e TRIS (pH 6,8; 302
mOsm/Kg) para a criopreservação. Ambos diluentes foram divididos em duas frações (fração “A” e
“B”). A fração “A” do diluente ACP-102c (ACP Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brasil), foi preparada
segundo recomendação do fabricante, com acréscimo de 40 mg de gentamicina e 15% de gema de
ovo, enquanto a fração “A” do diluente TRIS consistiu de 3,786 g de TRIS, 2,11 g de ácido cítrico, 1,0
g de frutose, 40 mg de gentamicina, 20% de gema de ovo, em 100 mL de água destilada (Singh et al.,
1995). A fração “B” de cada diluente teve a mesma constituição da fração “A”, mas acrescida de 10%
de glicerol, de modo a obter, após a diluição, concentração final de 5% de glicerol. As amostras de
sêmen de cada ejaculado foram divididas em duas alíquotas e diluídas nas frações “A” de ACP-102c e
TRIS. Estas diluições foram realizadas a 32
o
C de modo a obter uma concentração de 800x10
6
sptz/mL.
Em seguida o sêmen diluído foi resfriado até 5
o
C em 120 minutos, quando então foi realizada a adição,
em três etapas, da fração “B” de cada diluente, obtendo concentração final de 400x10
6
sptz/mL. O
sêmen foi mantido em equilíbrio a 4
o
C por duas horas, quando então foram envasado em palhetas de
0,25 mL, colocadas em suportes e congeladas em vapor de nitrogênio líquido, a 3,5 cm acima do nível
do nitrogênio líquido, por 10 minutos, quando então eram imersas em nitrogênio líquido,
acondicionadas em racks e estocadas em botijões criogênicos. Uma palheta por diluente, por
ejaculado, foi descongelada 15 dias após criopreservação, por imersão das mesmas em banho-maria a
37
o
C por 30 segundos, e seu conteúdo seminal alocado em tubos modelo Eppendof
®
mantidos em
banho-maria à mesma temperatura.
As análises morfométricas foram realizadas tanto com o sêmen fresco como criopreservado
em ACP-102c e TRIS. Cinco microlitros de sêmen fresco diluído ou criopreservado foram diluídos/re-
diluídos em solução citrato-glicose (Evans & Maxwell, 1990), e incubados por cinco minutos a 37
o
C,
de modo a obter uma concentração de 50x10
6
espermatozóides/mL. Cinco microlitros desta suspensão
foram utilizados para confecção de esfregaço em lâminas para microscopia e secas ao ar. Estas
lâminas foram coradas segundo metodologia de Talbot & Chacon (1981) e adaptado por Garde et al.
(1992), sem o uso dos corantes azul de tripan e marrom de Bismark. Os esfregaços foram fixados por
30 minutos em solução de gluteraldeído 3% tamponada a pH 7,2, seguida de lavagem com água
destilada e secagem ao ar. As lâminas foram coradas por imersão em solução de Rosa Bengala 0,8%
tamponada a pH 5,3, sendo submetidas a uma última lavagem com água destilada e secagem ao ar,
65
seguida de montagem permanente de lâmina com lamínula. Um mínimo de 150 cabeças de
espermatozóides corretamente digitalizados foram analisadas utilizando o módulo morfológico do
sistema de análise do sêmen auxiliado por computador Sperm Class Analizer
®
(SCA, Microptics S.L.,
Barcelona, Espanha). O equipamento consiste de microscópio equipado com objetiva de 40x, acoplada
a uma câmera digital, para captura de imagens e transmissão a um computador onde está instalado o
software. Os espermatozóides foram capturados aleatoriamente em diferentes campos. As células
digitalizadas tinham suas bordas automaticamente definidas. Espermatozóides com erro na
digitalização destas bordas eram descartados manualmente em posterior avaliação. O módulo de
morfometria calculava automaticamente os parâmetros morfométicos dos espermatozóides analisados.
Quatro parâmetros morfométricos foram utilizados: comprimento, largura, perímetro (em µm)
e área (em µm
2
). Os parâmetros para cada espermatozóide analisado foram salvos em planilha Excel
®
(Microsoft Corporation, EUA).
Os parâmetros morfométricos foram expressos em média e erro padrão. Após a avaliação da
normalidade pelo teste Kolmogorov-Smirnov, os dados foram submetidos à análise de variância
(ANOVA), seguido de teste de Tukey post hoc para determinar diferenças significativas em todos os
parâmetros avaliados entre sêmen fresco, congelado em diluente ACP-102c ou TRIS, com nível de
significância de 5%.
RESULTADOS
Os resultados das dimensões morfométricas dos espermatozóides estão resumidos na tabela I.
A análise mostrou alterações significativas nas dimensões dos espermatozóides com a criopreservação.
As cabeças dos espermatozóides criopreservados foram significativamente menores que as do sêmen
fresco para todos os parâmetros analisados. Entretanto, não foram verificadas diferenças nos
parâmetros morfométricos entre os diluentes ACP-102c e TRIS (P>0,05). Os coeficientes de variação
foram baixos entre os tratamentos, indicando pouca variação nos parâmetros morfométricos entre
ejaculados. Porém, as amostras congeladas em ACP-102c apresentaram os maiores coeficientes de
variação, indicativo de uma variabilidade maior de resposta destes espermatozóides à criopreservação
que os congelados em TRIS. Esta variabilidade também pode ser verificada na figura 1, onde a
distribuição dos valores para comprimento e largura de espermatozóides criopreservados em ACP-
102c teve maior dispersão que em TRIS e em sêmen fresco.
A tabela II apresenta as dimensões morfométricas individuais para os animais utilizados. Foi
verificada variação nas dimensões da cabeça de espermatozóides no sêmen fresco entre animais, onde
o animal n
o
4 apresentou dimensões significativamente menores para os parâmetros analisados em
relação aos demais animais. Também foi verificada variação individual sob a morfometria de
espermatozóides criopreservados, onde o sêmen fresco do animal n
o
3 mostrou valores
66
significativamente maiores aos do sêmen criopreservado em ACP-102c e TRIS em todos os
parâmetros morfométricos avaliados, enquanto no animal n
o
2 não foi possível verificar esta diferença.
Nos animais n
o
1 e n
o
2, o sêmen fresco apresentou valores maiores em relação aos diluentes conforme
o parâmetro analisado.
DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo mostraram que a criopreservação provocou alterações
significativas na morfometria da cabeça de espermatozóides ovinos nas amostras analisadas. Estes
resultados estão de acordo com os obtidos por vários autores para diferentes espécies, como caprinos
(Hidalgo et al., 2007; Marco-Jiménez et al., 2006), bovinos (Gravance et al., 1998b; Rubio-Guillén et
al., 2007), eqüinos (Arruda et al., 2002) e suínos (García-Herreros et al., 2007). Em caprinos,
Gravance et al. (1997) não observaram efeitos da criopreservação na morfometria dos
espermatozóides, exceto em alguns animais, o que poderia ser devido ao protocolo de congelamento
ou à presença de diferentes populações de espermatozóides presentes em alguns animais ou ejaculados
que favorecem o sucesso no processo de congelamento (Hidalgo et al., 2007).
Os parâmetros morfométricos para sêmen fresco encontrados neste trabalho foram inferiores
aos encontrados por Monteiro et al. (2006) e Lal & Pant (1982), enquanto que para o sêmen
criopreservado foram inferiores aos obtidos por Sancho et al. (1998), mas compatível com os obtidos
por Gravance et al. (1998a). Vários fatores podem contribuir para a variabilidade da avaliação
morfométrica, dentre eles, a raça (Lal & Pant, 1982; Beletti et al., 2005; Aggarwal et al., 2007;
Saraiva et al., 2007) e a técnica de coloração e fixação (Gravance et al., 1995; Ball & Mohammed,
1995; Gravance et al., 1996; Gravance et al., 1998a; Sancho et al., 1998; Gago et al., 1998; Boersma
et al., 1999; Boersma et al., 2001; Soler et al., 2003; Hidalgo et al., 2006; Garcia-Herreros et al.,
2006; Hidalgo et al., 2007).
Quanto à fixação e coloração dos esfregaços, a escolha do corante Rosa Bengala foi devido ao
seu baixo custo, por já fazer parte de outras técnicas de coloração, além de já ter sido utilizada na
constituição de colorações para avaliação em CASMA por outros autores (Gravance et al., 1996;
Casey et al., 1997; Gravance et al. 1998a; Boersma, et al., 2001). Técnicas de fixação contendo
aldeídos resultam em menor coeficiente de variação e um percentual maior de espermatozóides
corretamente digitalizados (Sancho et al., 1998), justificando o uso do glutaraldeído neste trabalho.
O tipo de diluente não influenciou na morfometria da cabeça dos espermatozóides após a
criopreservação, uma vez que não foi verificada diferença estatística entre os parâmetros
morfométricos analisados entre os diluentes ACP-102c e TRIS. Arruda et al. (2002) e Hidalgo et al.
(2007), constataram efeito de diferentes diluentes nas dimensões dos espermatozóides após a
criopreservação, sugerindo que uma menor redução nas dimensões do espermatozóide se deva a uma
67
melhor criopreservação dos espermatozóides pelo diluente, reduzindo o percentual de perda de
acrossoma, o que afetaria o tamanho da célula espermática. A semelhança nos resultados
morfométricos de espermatozóides criopreservados em ACP-102c e TRIS é indicativa de que ambos
possuem similar capacidade de preservação estrutural da cabeça de espermatozóides submetidos à
criopreservação. Apesar de não ter sido verificada diferença estatística entre diluentes, os coeficientes
de variação para todos os parâmetros avaliados no ACP-102c foram maiores que os encontrados no
TRIS e no sêmen fresco, podendo indicar uma maior variabilidade na criopreservação do sêmen ovino
com uso do ACP-102c.
Os parâmetros morfométricos variaram entre animais, evidenciando efeito individual tanto no
sêmen fresco como na resposta à criopreservação com os diluentes utilizados. A variação individual
nas dimensões dos espermatozóides no sêmen fresco foi também constatada na espécie ovina
(Gravance et al., 1998a); caprina (Gravance et al., 1995), bovina (Boersma et al., 1999); suína
(Garcia-Herreros et al., 2006); eqüina (Ball & Mohammed, 1995); canina (Dahlbom et al., 1997;
Núñez-Martinez et al., 2007). A acurácia do CASMA possibilita a detecção de pequenas, mas
significantes diferenças entre espermatozóides considerados normais de um animal (Garcia-Herreros
et al., 2006). Como fatores raciais e individuais interferem nos resultados morfométricos médios para
uma espécie, são necessários estudos em um número maior de animais para o estabelecimento de
limites normais mais precisos dos parâmetros morfométricos.
As dimensões morfométricas da cabeça do espermatozóide não foram as mesmas entre os
animais após a criopreservação. Enquanto no animal n
o
3 todos os parâmetros morfométricos foram
reduzidos após criopreservação, não foi verificada diferença estatística entre as dimensões do sêmen
fresco e criopreservado no animal n
o
2, apesar de, numericamente, os valores médios para o sêmen
fresco serem superiores aos obtidos no sêmen criopreservado para ambos diluentes neste animal. Esta
variação individual com a criopreservação foi constatada por outros autores trabalhando com
diferentes espécies (Gravance et al., 1996; Gravance et al. 1998b, Garcia-Herreros et al., 2007;
Saraiva et al., 2007). A suscetibilidade dos espermatozóides de um animal à criopreservação pode
refletir nas suas dimensões morfométricas (Gravance et al., 1998). Deste modo, animais que não
apresentaram diferença morfométrica significativa antes e após congelamento poderiam ser mais
resistentes ao processo de criopreservação. Entretanto, vale ressaltar que os parâmetros morfométricos
comumente estudados dizem respeito à cabeça dos espermatozóides e o processo de criopreservação
pode afetar, de modo distinto, diversas regiões do mesmo (Zhu & Liu, 2000), como a peça
intermediária, e tais estruturas podem não ser adequadamente contempladas nas avaliações
morfométricas. Schober et al. (2007) comentam que o dano mitocondrial durante a criopreservação
pode ser a maior razão para a redução da qualidade do sêmen pós-descongelamento.
Diferentes mecanismos têm sido sugeridos para explicar as alterações sofridas nas dimensões
morfométricas de espermatozóides com a criopreservação. Uma das possibilidades se refere ao
aumento no número de espermatozóides com danos acrossomais que ocorre durante a criopreservação
68
(Bailey et al., 2000), onde a perda do acrossoma levaria a uma redução nas dimensões do
espermatozóide. Entretanto os procedimentos de coloração usados para análise morfométrica não são
específicos para identificação do estado acrossomal (Gravance et al., 1995, 1997). Além disso, as
dimensões do acrossoma não são conhecidas, de modo a não ser possível afirmar se a redução
verificada no espermatozóide está diretamente ligada às alterações no acrossoma (Arruda et al., 2002).
Outra possibilidade relaciona à redução das medidas morfométricas da cabeça do
espermatozóide com alterações na cromatina. Uma variedade de danos espermáticos, como os
causados pela criopreservação, induz a mudanças na estrutura da cromatina, resultando numa
supercondensação da mesma (Royere et al., 1988; Hamamah et al., 1990), levando a uma redução do
compartimento nuclear e, consequentemente, à redução da cabeça do espermatozóide (Núñez-
Martinez et al., 2007). Alterações na cromatina têm sido associadas à espermatozóides com cabeça
morfologicamente anormais (McCosker, 1969).
A progressiva desidratação dos espermatozóides e a instabilidade funcional da membrana
plasmática durante a criopreservação são citadas por Garcia-Herreros et al. (2007) como mecanismos
adicionais na redução do tamanho da célula espermática. A perda da integridade da membrana e de sua
habilidade em responder ao estresse osmótico é mediada pelas mudanças dos componentes
intracelulares osmoticamente ativos (como a concentração de íons) e das alterações de mecanismos
regulatórios do volume celular durante o processo de congelamento (Petrunkina et al., 2004), que irão
resultar em alterações do volume espermático. Além disso, alterações estruturais e de funcionalidade
da membrana plasmática induzidas pela criopreservação em virtude dos mecanismos de transição e
separação de fases sofridas pelos componentes da membrana, podem ser refletidas na morfologia
espermática pós-criopreservação (Garcia-Herreros et al., 2007).
Marco-Jiménez et al. (2006) observaram que a redução nas dimensões na cabeça de
espermatozóides caprinos após criopreservação era devido à fase de equilíbrio com o crioprotetor
(glicerol) e não à crioproteção em si, sendo esta redução mais acentuada nos espermatozóides mortos
que em espermatozóides vivos. Tais resultados foram atribuídos a alterações osmóticas induzidas pelo
crioprotetor e pela criopreservação e à perda de conteúdo celular de células mortas, sem habilidade da
membrana em restaurar o equilíbrio osmótico.
Por causa da metodologia aplicada, os resultados desta pesquisa não nos permitem investigar a
contribuição das diferentes hipóteses que explicam as alterações na morfometria dos espermatozóides
criopreservados obtidos neste trabalho. Entretanto é razoável supor que tais resultados se devam à
perda acrossomal e a danos na membrana plasmática provocadas pela criopreservação (Rubio-Guillén
et al., 2007).
69
CONCLUSÕES
Como observado em outras espécies, o processo de criopreservação do sêmen ovino acarretou
em redução das medidas morfométricas da cabeça dos espermatozóides em relação ao sêmen fresco.
Esta redução, entretanto, sofreu variações entre animais, o que pode implicar em variação individual
do sêmen à criopreservação. Os diluentes de criopreservação ACP-102c e TRIS apresentaram
semelhante redução nas dimensões da cabeça dos espermatozóides, com o diluente ACP-102c
apresentando maior variação na resposta ao congelamento entre coletas, indicando semelhante
preservação das estruturas da cabeça do espermatozóide entre os diluentes.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, à Fazenda Libanus que nos cedeu os animais experimentais, à
Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP) que nos concedeu a bolsa de mestrado e à
empresa ACP Biotecnologia que nos cedeu o diluente ACP-102c para os experimentos.
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74
Tabela I. Média ± erro padrão (coeficiente de variação) dos parâmetros morfométricos da
cabeça de espermatozóides ovinos avaliados segundo tratamento (sêmen fresco,
sêmen criopreservado em ACP-102c e sêmen criopreservado em TRIS). [Media ±
standard error (variation coefficient) of ram spermatozoa morphometric head
parameters evaluated according to treatment (fresh semen, cryopreserved in PCW-
102 and semen cryopreserved in TRIS)]
Tratamento Comprimento (µm) Largura (µm) Área (µm
2
) Perímetro (µm)
Sêmen fresco 8,21±0,04
a
(2,9)
4,51±0,01
a
(1,9)
32,07±0,23
a
(4,5)
22,04±0,09
a
(2,5)
ACP-102c 8,04±0,04
b
(3,2)
4,36±0,02
b
(2,9)
30,38±0,25
b
(5,3)
21,48±0,10
b
(2,9)
TRIS 8,05±0,04
b
(2,8)
4,37±0,01
b
(1,9)
30,53±0,20
b
(4,1)
21,51±0,08
b
(2,4)
Letras minúsculas diferentes numa mesma coluna indicam diferença estatística (p<0,05).
Tabela II. Média ± erro padrão dos parâmetros morfométricos da cabeça de espermatozóides
ovinos avaliados segundo tratamento (sêmen fresco, sêmen criopreservado em
ACP-102c e sêmen criopreservado em TRIS) para cada animal. [Media ± standard
error of ram spermatozoa morphometric head parameters evaluated according to
treatment (fresh semen, cryopreserved in PCW-102 and semen cryopreserved in
TRIS) to each animal]
Letras maiúsculas diferentes: diferença estatística entre animais para dado parâmetro e tratamento
(p<0.05)
Letras minúsculas diferentes: diferença estatística entre tratamentos para mesmo parâmetro de dado
animal (p<0.05)
Animal Tratamento Comprimento
(µm)
Largura (µm) Área (µm
2
) Perímetro (µm)
Sêmen Fresco 8,16±0,06
aA,B
4,56±0,02
aA
32,30±0,37
aA,B
22,02±0,14
aA,B
1 ACP-102c 8,00±0,05
a,bA,B
4,41±0,03
bA
30,56±0,29
bA,B
21,46±0,11
bA,B
TRIS 7,95±0,05
bB,C
4,40±0,03
bA
30,34±0,33
bA,B
21,35±0,13
bB
Sêmen Fresco 8,33±0,06
aA
4,48±0,03
aA,B
32,23±0,41
aA,B
22,18±0,15
aA
2 ACP-102c 8,23±0,08
aA
4,38±0,04
aA
31,04±0,50
aA
21,83±0,20
aA
TRIS 8,27±0,05
aA
4,39±0,03
aA
31,32±0,38
aA
21,92±0,14
aA
Sêmen Fresco 8,37±0,05
aA
4,52±0,03
aA,B
32,89±0,38
aA
22,40±0,14
aA
3 ACP-102c 8,11±0,08
bA
4,36±0,05
bA
30,84±0,58
bA
21,66±0,21
bA
TRIS 8,13±0,05
bA,B
4,38±0,03
bA
30,99±0,33
bA
21,71±0,12
bA,B
Sêmen Fresco 7,99±0,07
aB
4,46±0,03
aB
30,85±0,43
aB
21,53±0,17
aB
4 ACP-102c 7,82±0,07
aB
4,28±0,03
bA
29,08±0,43
bB
20,95±0,16
bB
TRIS 7,85±0,06
aC
4,33±0,02
bA
29,48±0,32
a,bB
21,07±0,13
a,bC
75
Figura 1. Dispersão dos parâmetros morfométricos comprimento e largura de
espermatozóides ovinos no sêmen fresco, criopreservados em ACP-102 e TRIS.
76
8. CONCLUSÕES
O meio diluente à base de água de coco em pó (ACP-102c), poderá ser utilizado em
protocolos de criopreservação do sêmen ovino, conforme os parâmetros morfométricos e
cinéticos encontrados em relação a outros diluidores disponíveis no mercado.
Novos estudos de criopreservação do sêmen ovino poderão ser desenvolvidos com
adição de novos crioprotetores ao meio diluente ACP-102c e testes de avaliação in vivo para
recomendação final do produto.
77
9. PERSPECTIVAS
• Realização de novos protocolos de congelamento apropriados para o meio diluente
ACP-102c (diferentes concentrações de gema de ovo e glicerol, novas curvas de
criopreservação), visando incremento do número de espermatozóides móveis pós-
descongelação
• Avaliação de possíveis interações entre constituintes do plasma seminal com o
diluidor
• Testes de campo em programas de inseminação artificial
78
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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