( PDF ) Análise da expressão de p53 no câncer gástrico precoce e suas implicações prognósticas

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FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE P53 NO CÂNCER GÁSTRICO

PRECOCE E SUAS IMPLICAÇÕES PROGNÓSTICAS

Andréa Rodrigues Gonçalves

Rio de Janeiro

2008

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UFRJ

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE P53 NO CÂNCER GÁSTRICO PRECOCE E

SUAS IMPLICAÇÕES PROGNÓSTICAS

Andréa Rodrigues Gonçalves

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Curso de Pós-graduação em Medicina

(Clínica Médica), da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do

título de Mestre em Medicina

(Gastroenterologia).

Orientadores: Prof. Dr. Antonio José de Vasconcellos Carneiro e

Prof. Dr. Heitor Siffert Pereira de Souza

Rio de Janeiro

Julho de 2008

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Gonçalves, Andréa Rodrigues

Análise da expressão de p53 no câncer gástrico precoce e suas

implicações prognósticas / Andréa Rodrigues Gonçalves. – Rio de Janeiro:

UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.

xi, 78 f. : il. ; 31 cm.

Orientadores: Antonio José de Vasconcellos Carneiro e Heitor Siffert

Pereira de Souza

Dissertação (mestrado) – UFRJ/Faculdade de Medicina,

Programa

de Pós-Graduação em Clínica Médica, Gastroenterologia

, 2008.

Referências bibliográficas: f. 68-77

1. Neoplasias gástricas - genética. 2. Mutação. 3. Genes p53 . 4.

Prognóstico. 5. Imunoistoquímica. 6. Humanos. 7. Gastroenterologia – Tese.

I. Carneiro, Antonio José de Vaconcellos. II. Souza, Heitor Siffert Pereira de

III. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Faculdade de Medicina,

Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Gastroenterologia

IV. Título.

A Luisa, razão da minha vida, e a Antonio,

meu amor.

Aos meus pais, pelo apoio incondicional na

vida.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Antonio José Carneiro pelo estímulo e paciência, e pelo tempo que

disponibilizou para ensinar e orientar este trabalho.

Ao Prof. Heitor Siffert, por estar sempre disponível para ensinar, discutir, corrigir,

orientar, sendo incansável.

A Dra. Ivanir Martins, participante do trabalho, que muito me ensinou, ajudou e

incentivou, e que também esteve disponível em todos os momentos, ajudando com

sua competência na realização deste trabalho.

A Dra. Maria Aparecida Ferreira, que assistiu a vários pacientes que participaram do

trabalho, e que participou da coleta dos dados arquivados, sempre ajudando e

ensinando, neste e em outros momentos da minha vida.

Ao Antonio por estar sempre ao meu lado, ajudando-me e apoiando-me. Mais do

que marido...amigo, colega de profissão, companheiro de todas as horas.

Às colegas do SACC, Patrícia, Nathalie, Claudia Cardoso, pela ajuda imprescindível

e compreensão.

Ao Dr. Carlos Henrique, meu chefe no HUCFF, por tornar viável e incentivar a

realização do mestrado.

Aos residentes que comigo trabalharam durante todo período do mestrado, por

colaborar nos momentos de ausência em função das aulas, principalmente ao Dr.

Cláudio.

Ao Dr. Alexandre Mello, colega de trabalho do INCa, pela ajuda com a estatística.

À minha filha Luisa, por tornar tudo na vida especial e mais fácil.

À minha mãe, Selma, por viabilizar todos os meus projetos na vida.

SUMÁRIO:

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Vi

LISTA DE TABELAS viii

RESUMO Ix

ABSTRACT X

1- INTRODUÇÃO 1

2- OBJETIVOS 3

3- REVISÃO BIBLIOGRAFICA 4

4- MATERIAL E MÉTODOS 44

4.1 IMUNOHISTOQUÍMICA 44

4.2 PACIENTES 48

4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 49

5- RESULTADOS 50

5-1 VARIÁVEIS DEMOGRAFICAS 50

5-2 TIPO HISTOLÓGICO E GRAU DE DIFERENCIAÇO 51

5-3 MORFOLOGIA DA LESAO 52

5-4 LOCALIZACAO DA LESÃO 53

5-5 METASTASES PARA LINFONODOS 54

5.6 TAMANHO TUMORAL 55

5.7 p53 55

5.8 SOBREVIDA 59

6 DISCUSSÃO 63

7 CONCLUSÕES 67

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68

9- ANEXOS 77

9-1 ANEXO A: Associações realizadas entre as variáveis e valores dos testes não

paramétricos de e nível p de significância.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A:T

Adenina:timina

Arg

arginina

AKT

Serina Treonina quinase

APC

Adenomatosis polyposis coli (polipose adenomatosa colônica)

Bax

BCL2-associated X protein ( proteína X associada a BCL2)

bcl-2

B-cell lImphoma 2 ( linfoma célula B 2)

CCC

Prolina

CD44

CD44 molecule ( indian blood group)/ molécula CD44 (grupo

Sanguíneo indiano)

CDH1

Cadherin1, type 1, e-cadherina ( caderina tipo 1, e-caderina)

CGC

Arginina

c-met

Met proto oncogene

COX2

Cicloxigenase 2

Células dendríticas

DCC

Deleted in colorectal carcinoma ( deletado no câncer colorretal)

DNA

Ácido deoxirribonucleico

EGF

Fator de crescimento epidérmico

ERCC3

Excision repair cross-complementing rodent repair (reparo de roedor

complementando-cruzado reparo de excisão)

GADD45

Growth arrest and DNA-damage-inducible (parada de crescimento e

induzível por dano do DNA)

Bem diferenciado

Moderadamente diferenciado

Pouco diferenciado

G:C

Guanina:citosina

H. pylori

Helicobacter pylori

HDGC

Câncer gástrico difuso hereditário

H-E

Hematoxilina-eosina

HGF

Fator de crescimento do hepatócito

Hmlh1

Human Mut L homolog 1 gene ( gene humano Mut L homólogo 1)

Hmsh2

Human Mut S homolog 2 gene ( gene humano Mut S homólogo 2)

HSP70

Heat shock protein 70 ( proteína de calor e choque 70)

IL1α

Interleucina 1 alfa

IMH

Imunohistoquímica

iNOS

Inducible nitric oxide synthase ( sintase induzível pelo óxido nítrico)

LDH

Desidrogenase lática

MDM2

Murine double minute ( murino duplo minuto)

MDR-1

Gene de resistência a múltiplas drogas

MMR

Genes de reparo do mismatch

nm23

Non-metastatic cells 1 ( células não metastáticas 1)

p13K

Phosphatidylinositide 3-kinase ( fosfatidilinositide 3-quinase)

PCR-RFLP

Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (

reação de cadeia de polymerase- polimorfismo de comprimento de

fragmento de restrição)

PCR-SSCP

Polymerase chain reaction -single strand conformation polymorphism

(reação de cadeia de polymerase- polimorfismo de conformação de cadeia

única

PenA

Penetrante A

PenB

P-gp

Penetrante B

P-gp

Glicoproteína P

Pro

Prolina

Retinoblastoma

RER+

Reparos de erro de replicação positivos

RNAt

Ácido ribonucleico transportador

sLeª

Sialyl Lewisª

SMAD4

SMAD ( Similar to Mothers Against Decapentaplegic) family member 4/

membro 4 da família SMAD (semelhante a mães contra decapentaplégico)

Sm1

Terço superior da submucosa

Sm3

Terço inferior da submucosa

Super

Superficial

TGFα

Fator transformador de crescimento alfa

VEGF

Fator de crescimento endotelial vascular

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Resultados de séries da literatura com relação ao número de tumores precoces

estudados, freqüência de positividade de p53 e a técnica empregada.

Tabela 2

Relação entre o tipo histológico de Laurén e o aspecto macroscópico do tumor.

Tabela 3

Freqüência dos tipos macroscópicos encontrados com relação ao grau de

diferenciação tumoral.

Tabela 4

Relação entre o aspecto macroscópico do tumor e a localização.

Tabela 5

Relação entre a a localização tumoral e a sobrevida em 5 anos.

Tabela 6

Freqüência da positividade da p53 conforme o tipo histológico de Laurén.

Tabela 7

Relação entre o grau de diferenciação tumoral e a positividade da p53.

Tabela 8

Relação entre a positividade da p53 e o tipo macroscópicos

Tabela 9

Relação dos casos p53 positivos dentre os tumores limitados à mucosa.

Tabela 10

Relação dos casos p53 positivos dentre os tumores submucosos.

Tabela 11

Comparação do tipo histológico de Laurén com a positividade da p53 nos tumores

submucosos. 59

Anexo A

Associações realizadas entre as variáveis e valores dos testes não paramétricos

de e nível p de significância.

RESUMO

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE P53 NO CÂNCER GÁSTRICO PRECOCE E

SUAS IMPLICAÇÕES PROGNÓSTICAS

Andréa Rodrigues Gonçalves

Orientadores: Prof. Dr. Antonio José Carneiro e Prof. Dr.Heitor Souza

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina

(Clinica Medica- Gastroenterologia), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de

Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina

(Clinica Medica- Gastroenterologia).

Fundamentos: Existem evidências de que mutações do gene supressor tumoral p53

estejam implicadas no prognóstico do câncer gástrico. O objetivo desse estudo foi avaliar a

ocorrência da mutação do gene p53 e suas possíveis implicações prognósticas no câncer

gástrico precoce. Métodos: Em estudo retrospectivo, foram estudados 80 pacientes com

câncer gástrico precoce tratados cirurgicamente entre 1982 e 2001. A mutação do p53 foi

pesquisada por imunohistoquímica em tecido cirúrgico e comparada com as variáveis sexo,

idade, tipo histológico de Laurén, aspecto macroscópico, grau de diferenciação, tamanho e

localização tumoral, acometimento de linfonodos e sobrevida em 5 anos.Resultados: A

positividade da p53 foi mais freqüente entre os tumores do tipo intestinal de Laurén (p=0,003

), bem ou moderadamente diferenciados (p=0,007 ), e nos tumores elevados (p=0,038 ). A

mutação do p53 não apresentou associação com a sobrevida em 5 anos, nem com a

freqüência do acometimento linfonodal. Conclusões: Nesta amostra, o p53 não foi

determinante em termos prognósticos. A associação do p53 com o tipo intestinal, o grau de

diferenciação e características morfológicas, podem refletir influência de processo

inflamatório crônico gástrico subjacente. Novos estudos com um número maior de pacientes

e com maior tempo de acompanhamento são necessários para esclarecer se as mutações

de p53 têm implicação prognóstica e poderiam influenciar abordagens terapêuticas

diferenciadas.

PALAVRAS-CHAVE: Câncer gástrico precoce, p53, Prognóstico.

ABSTRACT

ANALYSIS OF P53 EXPRESSION IN EARLY GASTRIC CANCER AND ITS

PROGNOSTIC IMPLICATIONS

Andréa Rodrigues Gonçalves

Orientadores: Prof. Dr. Antonio José Carneiro e Prof. Dr.Heitor Souza

Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina

(Clinica Medica- Gastroenterologia), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de

Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Medicina

(Clinica Medica- Gastroenterologia).

Background: There is some evidence that mutations of p53 tumor suppressor gene

are associated with gastric cancer prognosis. The aim of this study was to evaluate the

occurrence of p53 gene mutations and their possible implications in early gastric cancer.

Methods: In a retrospective study, we analyzed 80 consecutive patients surgically treated for

early gastric cancer between 1982 and 2000. P53 mutations were accessed by

imunohistochemistry of surgical tissue, and compared with variables such as age, sex,

Laurén’s histhologic type, macroscopic aspect, degree of differentiation, size, and

localization of the tumor, lymph node’s metastasis, and five year survival. Results: Positive

immunostaining for p53 was significantly more frequent among Laurén’s intestinal-type

tumors (p=0.003), the well or moderately differentiated tumors (p=0.007), and in the elevated

tumors (p=0.038). However, p53 mutation was not associated with five year survival, or with

the frequency of lymph node metastasis. Conclusions: In this study, p53 did not influence

patients’ prognosis. P53 association with the intestinal-type, the degree of differentiation, and

the morphologic characteristics of the tumor may reflect the existence of an underlying

chronic inflammatory process within the gastric mucosa. New studies with a larger population

sample and longer follow-up are necessary to clarify whether p53 mutations do have

prognostic implications, possibly influencing the selection of distinct therapeutic approaches.

KEY-WORDS: Early gastric cancer, p53, Prognosis.

1 INTRODUÇÃO

O gene p53 é um gene supressor tumoral de 20kb envolvido na

carcinogênese em vários órgãos (dentre eles o estômago), estando situado

no braço curto do cromossomo 17p13. Está envolvido na regulação do ciclo

celular, na síntese e no reparo do DNA e na morte celular programada

(apoptose). O produto protéico por ele codificado é uma proteína de 53kDa

composta por 390 aminoácidos (IRELAND, 1997; SOUSSI, 2000).

O câncer gástrico é na maioria das vezes adenocarcinoma, existindo

variantes raras, como o carcinoma adenoescamoso, o carcinoma de células

escamosas, o carcinoma indiferenciado, o carcinoma-carcinóide misto, o

carcinoma de pequenas células, o carcinoma de células parietais, o

coriocarcinoma, o tumor do seio endodérmico, o carcinoma embrional, o

adenocarcinoma rico em células de Paneth e o adenocarcinoma hepatóide

(FENOGLIO-PREISER, 2002).

O carcinoma gástrico pode ser dividido em precoce ou avançado,

conforme o nível de invasão da parede do órgão, definindo-se como precoce

aquele que acomete apenas a mucosa ou mucosa e submucosa,

independente da existência de metástases para linfonodo, de acordo com a

definição da Sociedade Japonesa de Endoscopia Digestiva. O primeiro caso

de câncer gástrico precoce descrito é atribuído a Hauser de Leipzig (1883) ou

Versé de Leipzig (1908) ou Saeki do Japão (1938) (DIAS, 1999).

A carcinogênese gástrica é um processo gradual, envolvendo

alterações genéticas que se acumulam progressivamente, as quais podem

ser diferentes entre si e em relação ao momento de ocorrência conforme o

tipo de adenocarcinoma gástrico.

No presente trabalho objetivou-se estudar a ocorrência da mutação do

p53 no câncer gástrico precoce, através da pesquisa da proteína mutante por

imunohistoquímica, correlacionando sua presença com a ocorrência de

metástases para linfonodos e com a sobrevida dos pacientes.

2 OBJETIVOS

Definir a ocorrência da mutação do gene p53 no câncer gástrico precoce.

Estabelecer correlação entre a superexpressão da proteína p53 no tecido

tumoral e o prognóstico do câncer gástrico precoce.

Correlacionar a superexpressão da proteína p53 no tecido tumoral com o tipo

histológico de Laurén, o grau de diferenciação, o aspecto macroscópico, a

localização e o tamanho tumorais, e variáveis demográficas.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O gene p53 codifica uma proteína que está implicada na sua ação

supressora tumoral. A proteína selvagem do gene p53 ativa a p21, a qual

inibe a atividade da kinase ciclina-dependente, induzindo uma parada do ciclo

celular em G1, imediatamente antes da replicação do DNA, ou em G2,

imediatamente antes da mitose, impedindo que a célula entre na fase S, e

levando também à apoptose. Ainda não está claro o que determina a indução

da parada do ciclo celular em umas células e em outras a apoptose (SOUSSI,

2000). No câncer gástrico a expressão diminuída do gene p21 pode ocorrer

independentemente da existência de mutação do p53. Sabe-se também que

o p53 estimula o reparo do DNA através de GADD45 e ERCC3.

(IRELAND,1997). Quando o reparo do DNA não é possível, o p53 induz a

apoptose celular através da regulação da transcrição e da interação com Bcl-

2 e Bax (MOSS,1998).

O gene p53 desempenha papel crítico de forma a evitar a proliferação celular

inapropriada. Quando ocorre lesão do DNA, a proteína codificada pelo p53 se torna

ativada, e ativa a transcrição de vários genes, que irão evitar a proliferação do DNA

lesado, sintetisar novamente o mesmo após a remoção do segmento lesado, e

estimular o seu reparo. A mutação do p53 vai evitar que ocorra a morte celular

quando o DNA estiver lesado. A forma mutante da p53 não ativa p21,

comprometendo sua função supressora tumoral (YOKOSAKI, 2001).

Atualmente sabe-se que existem outros estímulos, além do dano do DNA

para a ativação do gene p53, como outros distúrbios celulares: ativação de

oncogenes celulares, concentrações anormais de ribonucleotídeos celulares e

hipóxia, os quais vão ativar outras vias, que levarão à ativação do p53 (SOUSSI,

2000).

Questiona-se se a reintrodução da forma selvagem do gene poderia ser

capaz de restaurar a apoptose das células tumorais, assim como a conversão da

forma mutante em selvagem . Paralelamente estudos têm demonstrado que as

mutações do p53 podem ter papel na quimiossensibilidade tumoral, configurando-

lhes implicação terapêutica (SOUSSI, 2000). Estudos recentes sugerem que a

regressão de vários tipos tumorais em ratos pode ser obtida com a restauração da

função do p53 isoladamente (KASTAN, 2007).

O p53 interage com o oncogene MDM2, criando uma alça de feedback entre

ambos, o que pode desempenhar papel relevante na regulação da proteína

selvagem do p53. O MDM2 codifica uma proteína que gera a degradação da

proteína selvagem do p53 após ligar-se a mesma. A própria proteína selvagem

estimula a síntese da proteína do MDM2 (up regulation), o que seria perdido a partir

da mutação do p53, levando em última análise ao acúmulo da proteína mutante no

núcleo celular. Tanto a mutação do gene p53 como a amplificação da proteína do

MDM2 com conseqüente superexpressão desta podem resultar em quebra desta

alça auto-reguladora, o que poderia estar implicado na carcinogênese

(CRAANEN,1999).

Como os demais genes supressores tumorais, é necessário que ocorra a

perda da cópia selvagem do p53, permanecendo apenas a forma que sofreu

mutação no núcleo, para que ocorra perda da função do gene. Em cada loci do

genoma há duas cópias dos genes, sendo o p53 considerado dominante, bastando a

presença de apenas uma das cópias para que haja atividade da cópia selvagem. Daí

a necessidade de perda do alelo selvagem além da ocorrência de mutação no outro

alelo. Porém em algumas mutações a proteína mutante inibe a atividade do alelo

normal (atuam de uma forma dominante) (KAY, 1996). Em outras é necessário a

perda dos dois alelos para que haja perda da função supressora tumoral normal. A

mutação do gene p53 com perda concomitante do alelo normal está superexpressa

em alguns tumores humanos, como no caso do câncer gástrico, levando a detecção

da proteína p53 mutante, a qual apresenta meia–vida maior que a proteína

selvagem, podendo ser detectada mais facilmente que esta e por mais tempo (a

mutação confere-lhe alterações conformacionais que aumentam sua estabilidade). A

sua alta estabilidade confere-lhe uma meia vida de algumas horas (cerca de 5 a 10

horas), em comparação com a meia-vida de cerca de 20 min da proteína selvagem,

acumulando-se no núcleo das células neoplásicas (SOUSSI, 2000).

As mutações do gene podem ser tanto nonsense [“mutação sem sentido,

supressora, que altera um anticódon em um RNA t, de modo que é complementar a

um códon de terminação, suprimindo assim a terminação de uma cadeia de

aminoácidos” (STEDMAN, 1996)], na minoria dos casos, como missense (“mutação

de sentido equívoco, em que uma alteração ou substituição da base resulta em um

códon que leva à inserção de um aminoácido diferente na cadeia polipeptídica em

crescimento, dando origem a uma proteína alterada” segundo Stedman), as quais

levam à perda da atividade da proteína selvagem, e envolvem resíduos de contato

do DNA além da estrutura conformacional de alguns resíduos importantes. As

mutações do p53 ocorrem na sua maioria nos exons 5-8, já tendo sido

demonstradas mutações a outros níveis, como no exon 4 (SOUSSI,2000)

(SHEPHERD, 2000). Acredita-se que as mutações do gene p53 sejam os eventos

genéticos mais freqüentes na carcinogênese humana, sendo as mutações mais

freqüentes as mutações missense pontuais dentro da seqüência codificadora do

gene, localizadas em 4 dos 5 domínios evolutivos conservados (II ao V ) entre os

aminoácidos 120 e 300 (KAY,1996). No câncer gástrico o gene p53 pode

apresentar principalmente as seguintes alterações: mutações mis-senses, frame

shifts (mutação por deslocamento da estrutura) e perda de heterozigosidade

(relatada como ocorrendo em 60-70% dos casos (KOUNTOURAS, 2005). As

mutações são relatadas como ocorrendo em 38-71% dos casos (KOUNTOURAS,

2005). A frequência da mutação do gene p53 no câncer gástrico precoce é variável

conforme a série estudada (tabela 1). A perda de heterozigosidade pode ocorrer

após o acúmulo de outras mutações, podendo ser um evento mais tardio. A perda

alélica correlacionou-se com estágio avançado da doença em uma das séries da

literatura (RENAULT, 1996). Há relatos também de diferentes incidências de

anormalidades do p53 de acordo com o tipo histológico de câncer gástrico. O

espectro de mutações do p53 no carcinoma gástrico revela um padrão intermediário

entre o do cólon e o do esôfago (YOKOSAKI, 2001). As mutações do p53 no grupo

A:T são freqüentes no tipo bem diferenciado, enquanto transições G:C a A:T

predominam no câncer pouco diferenciado. As N-nitrosaminas causam

predominantemente substituições de base G:C a A:T e são um dos candidatos a

carcinógenos gástricos, estando freqüentemente contidas em peixes salgados secos

e vegetais em conserva, e também podem ser produzidas a partir de aminas com

nitratos no ambiente ácido do estômago. Isto poderia ser bem aplicado ao tipo pouco

diferenciado. Já no tipo bem diferenciado a principal fonte de compostos nitrosos

seria a flora bacteriana anormal anaeróbica que coloniza o estômago com gastrite

atrófica (devido ao ambiente com pH mais elevado) (CORREA, 1994)

Tabela 1-resultados de séries da literatura com relação ao número de tumores

precoces estudados, freqüência de positividade da p53 e a técnica empregada.

IMH=imunohistoquímica; PCR-SSCP= polymerase chain reaction- single strand

conformation polymorphism

Séries Nº de cânceres

precoces

Freqüência de

positividade da p53

Técnica empregada

1-Sakurai e cols. 27 48% IMH

2-Wu e cols. 56 35,7% IMH

3-Blok e cols. 45 60% IMH

4-Igarashi e cols. 16 43,7% IMH

5-Ikeda e cols. 29 58,6% IMH

6-Oiwa e cols. 159 21,3% IMH

7-Kyokane e cols. 40 30% IMH

8-Wang e cols. 12 41,6% IMH

9-Tamura e cols. 8 50% PCR- SSCP

10-Luinetti e cols. 70 31,4% IMH

11-Cho e cols. 29 26% IMH

12-Xiangming e

cols.

101 29,7% IMH

13-Craanen e cols. 45 60% IMH

As alterações genéticas do p53 (mutação com consequente perda de

heterozigosidade) estão envolvidas na conversão maligna do adenoma em

adenocarcinoma durante a sequência adenoma-adenocarcinoma do cólon,

estando presente em cerca de 70% dos casos de adenocarcinoma colônico, e

em mais de 60% dos adenocarcinomas gástricos. Todavia estudos do gene

p53 nos adenomas gástricos mostram que alterações deste nestas lesões

são muito menos frequentes do que nos adenomas colônicos, ocorrendo em

cerca de 30% destes (TAHARA,1996). Sakurai e cols. estudaram 19 casos de

adenocarcinoma que coexistiam com adenomas gástricos ( acreditando-se

nestes casos que os adenocarcinomas originavam-se de adenomas prévios ),

e encontraram uma superexpressão do p53 no componente de

adenocarcinoma em apenas 26 % dos casos, em contraste com o mesmo

achado em cerca de metade das células tumorais de um total de 27 casos de

adenocarcinoma gástrico precoce ( os quais se acreditavam não terem

surgido de adenomas ) (SAKURAI,1995). A mutação do p53 com perda de

alelo também foi encontrada na metaplasia intestinal, sendo relatada na

literatura com freqüências diferentes [ em cerca de 10% dos casos (TAHARA,

1995); em cerca de 38% (KOUNTOURAS,2005)]. Outro fato que também

sugere a ocorrência precoce da mutação do p53 na carcinogênese gástrica é

o relato de mutação do p53 em 58% dos casos de displasia gástrica

(KOUNTOURAS, 2005). Correa e cols realizaram imunohistoquímica para p53

em 33 espécimes de tumor gástrico e displasia, e encontraram positividade

em 61% dos carcinomas gástricos, 64% das displasias graves, 27% das

displasias moderadas, 19% das displasias leves, enquanto que a mucosa

gástrica sem displasia ou metaplasia teve imunohistoquímica negativa

(CORREA, 1994).

Cho e cols estudaram amostradas teciduais de 81 cânceres gástricos (sendo

29 precoces) ressecados cirurgicamente, analisando também a mucosa normal e

com alterações não displásicas contígua aos mesmos, além de material obtido por

endoscopia de 10 pólipos hiperplásicos e 22 adenomas. Os autores determinaram a

expressão da p53, da p21 e da bcl2 nestes materiais (por imunohistoquímica), além

de pesquisar mutações por PCR-SSCP e sequenciamento do DNA. Na mucosa

gástrica normal a expressão de p21 limitou-se às células epiteliais foveolares, e a de

bcl2 e p53 a poucas células epiteliais regenerativas da região do colo da mucosa.

Nos pólipos hiperplásicos foi encontrada expressão aumentada de p21 (esta restrita

a células epiteliais hiperplásicas) e p53, sem expressão de bcl-2. Nos adenomas a

expressão de bcl2 foi limitada à metade inferior dos mesmos na maior parte dos

casos, e a de p21 surgiu na parte superior dos mesmos. Nos adenomas a expressão

da p53 foi notada em toda e extensão dos mesmos, predominando no

compartimento médio. A expressão de bcl2 e de p21 foi maior nos adenomas do que

nos carcinomas, ao contrário de p23 (esse achado não teve significado estatístico).

Nos carcinomas a mutação do p53 foi observada em 36% dos pacientes. Os autores

sugerem que esse padrão ordenado topograficamente para a imunoexpressão de

p53, p21 e bcl2 seria alterado durante o desenvolvimento da neoplasia, e que o

controle da apoptose pelo p53 seria um evento precoce na carcinogênese gástrica

(CHO, 1998).

Graziano e cols estudaram 94 pacientes submetidos a tratamento cirúrgico

curativo para câncer gástrico, realizando imunohistoquímica nas amostras teciduais

para pesquisar a expressão do p53 e do DCC, tendo encontrado alta freqüência de

expressão da p53 em casos com envolvimento linfonodal (N1 e N2), assim como

nos tumores com invasão da muscular. A expressão da p53 foi encontrada em

estágios mais precoces, sendo detectada também nos tumores limitados à mucosa.

Já a expressão da DCC foi encontrada precocemente, porém em tumores pT3N0 a

mesma encontrava-se abolida. Os autores sugeriram que a superexpressão da p53

ocorreria desde os estágios precoces da carcinogênese gástrica, enquanto as

anormalidades do DCC seriam um evento tardio (GRAZIANO, 2001).

A detecção das mutações do gene p53 pode ser feita a partir de 3 métodos:

polimerase chain reaction (PCR) e tanto SSCP ( single-strand chain polymorphism )

ou menos comumente eletroforese com gel denaturante com ou sem

sequenciamento direto, imunohistoquímica e sorologia ( apenas 30 a 50% dos

tumores que apresentam mutação do p53 levam ao aparecimento de anticorpos anti-

p53 Ab no soro, por fenômeno de autoimunização ) (SOUSSI, 2000) (MOSS,1998).

Durante a realização da PCR as regiões que são seqüenciadas são os exons 5-8,

uma vez que a maior parte das mutações do p53 localiza-se nesta região. Pode

haver contaminação com quantidades variáveis de DNA de células não epiteliais,

mesmo com a microdissecção prévia, principalmente nos estágios precoces da

seqüência do câncer gástrico segundo Moss, o que faz com que a

imunohistoquímica ainda seja um método com papel importante na pesquisa das

mutações do p53. As técnicas de imunohistoquímica basicamente detectam a forma

mutante da proteína codificada pelo p53, uma vez que a forma selvagem da mesma

apresenta meia-vida muito curta (20 min), fazendo com que a forma mutante possa

ser detectada com probabilidade muito maior que a selvagem. Desta forma as

mutações missense são detectáveis por imunohistoquímica com uma probabilidade

muito maior que as nonsense, as quais em 10 a 15% dos casos não produzem

níveis detectáveis da proteína mutante (SOUSSI, 2000). A forma mutante acumula-

se no núcleo das células, e a maioria dos anticorpos disponíveis liga-se tanto à

forma selvagem como à mutante, não sendo específica para nenhuma das duas

(ALLGAYER, 1997). Diante de todos estes fatos percebe-se que a imunodetecção

pode subestimar a frequência da ocorrência de mutação do gene do p53 (SOUSSI,

2000) (STEMMERMANN, 1994). A positividade da imunohistoquímica para a p53

pode às vezes resultar da estabilização da forma selvagem da p53, que pode estar

superexpressa em células normais em resposta ao dano do DNA, levando ao

acúmulo da proteína na ausência de mutação genética (MARINONE, 2001). Na série

de Soong e cols envolvendo 116 adenocarcinomas gástricos, 23% dos casos

apresentaram imunohistoquímica positiva e 25% apresentavam mutação detectável

por PCR, com concordância de 85% (SOONG, 1996). Segundo Moss a correlação

entre a superexpressão da p53 e a mutação detectada por sequenciamento é boa

em estudos comparativos. Os anticorpos monoclonais DO1 e DO7 parecem ser os

que fornecem resultados mais reproduzíveis (SOUSSI, 2000).

Na maioria dos casos as mutações do p53 resultaram na alteração de uma

única base, levando a substituições de aminoácidos: em torno de três quartos foram

mutações de G:C para A:T(MOSS,1998).

Em pacientes com câncer gástrico Wang e cols estudaram a presença no

soro de genes circulantes relacionados ao tumor através de PCR-SSCP. Relatos

prévios indicavam que tumores podem liberar DNA ou RNA na circulação. A taxa de

detecção de marcadores moleculares para o p53 no soro foi de 36,4%, enquanto a

mutação do p53 foi encontrada em 32,4% dos pacientes. Além do p53, os autores

também estudaram a mutação do gene APC nestes pacientes, e a compararam com

a detecção de seu marcador molecular no soro dos pacientes. Os marcadores

moleculares séricos positivos correlacionaram-se diretamente com a recorrência no

pós-operatório ou com metástases, podendo representar marcadores prognósticos

potenciais nos pacientes com câncer gástrico (WANG, 2004).

Como já foi dito anteriormente, a expressão da p21 pode ocorrer

independentemente da mutação do p53. Craanen e cols. estudaram 45 espécimes

obtidos de pacientes gastrectomizados devido a carcinoma precoce gástrico, e

sugeriram que a indução do p21 pode ocorrer de forma independente do p53 em

uma proporção considerável de casos, podendo também ocorrer no tecido normal,

em áreas de gastrite crônica e na metaplasia intestinal, sendo pouco provável que

tal achado se explique por mutação do p21, dada a raridade de tal fato. Além disso

concluem que a inativação do p53 durante a carcinogênese gástrica segue uma via

diferente da alça de feedback p53/MDM2. O evento primário não parece ser a

amplificação do MDM2 e sim a inativação do p53 a partir da mutação de um dos

alelos e perda do outro. 60% dos casos estudados apresentavam acúmulo nuclear

da p53. Não foi encontrada diferença estatística de acordo com o tipo histológico de

Laurén, mas sim diferenças nas características de coloração, o que poderia ser pelo

menos em parte causado por diferença na prevalência das mutações missense do

gene p53 (CRAANEN, 1999).

Kay e cols (1996) encontraram uma variabilidade de 7% na interpretação da

marcação para o p53 no seu estudo, tendo considerado-a baixa.

Estudando uma possível relação entre o p53 e proteínas de choque térmico

70 (HSP70), Maehara e cols não encontraram resultados que a confirmassem: a

superexpressão da p53 foi notada da mesma forma nos pacientes que tinham tanto

níveis altos como baixos de HSP70, sugerindo que o prolongamento da meia vida da

proteína do p53 no câncer gástrico não depende da expressão destas proteínas

(MAEHARA, 2000b).

O câncer gástrico precoce é uma doença em geral silenciosa, sem quadro

clínico específico (CORREA, 2004), acarretando muitas vezes o retardo no

diagnóstico, devido ao baixo índice de suspeição clínica. Freqüentemente o paciente

não apresenta sintomas, mas até 50% pode ter queixas gastrointestinais

inespecíficas tais como dispepsia (FENOGLIO-PREISER, 2002). O diagnóstico

baseia-se principalmente na associação dos achados endoscópicos e

histopatológicos, necessitando de familiarização do endoscopista com a doença,

podendo o mesmo lançar mão do auxílio da cromoscopia durante o exame.

O câncer gástrico é uma doença cuja incidência vem caindo, porém mesmo

assim ainda representa o quarto tipo de câncer mais comum no mundo, e o segundo

tipo de câncer que mais leva a morte (CORREA, 2004). Em 2006 Anderson e cols

relataram o câncer gástrico como o segundo tipo de câncer mais comum no mundo .

No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde (2006), o câncer gástrico aparece

como o sexto tumor mais incidente na população brasileira, atingindo mais o sexo

masculino, com percentuais altos em värias cidades brasileiras, distribuídas pela

maioria das regiões.

Nos países do ocidente o câncer gástrico é encontrado em apenas 1 a

2% dos pacientes submetidos a exames endoscópicos para avaliação de

dispepsia, sendo que 80-90% dos pacientes vão apresentar tumores

avançados com baixas taxas de cura (FENOGLIO-PREISER, 2002). O câncer

gástrico precoce é visto com uma freqüência muito maior no Japão (país no

qual há programas de rastreamento para câncer gástrico) do que nos países

ocidentais, nos quais não responde por mais de 7 a 9% dos casos em

algumas séries (TRAYNOR, 1987), com relato de incidência de 16-24% por

outros autores (FENOGLIO-PREISER, 2002). No Japão 80% dos tumores

diagnosticados durante os programas de rastreamento são precoces. Porém

como nem todos pacientes aceitam participar dos mesmos, apenas cerca de

50% dos tumores são diagnosticados nesta fase (FENOGLIO-PREISER,

2002).

No câncer gástrico a maioria dos casos é esporádica, mas cerca de 8 a

10% dos tumores estão relacionados a um fator genético familiar herdado

(EL-RIFAI, 2002). Oliveira e cols estudaram 32 famílias portuguesas com

história positiva para câncer gástrico que preenchiam critérios para HDGC

(câncer gástrico difuso hereditário) e 23 pacientes com câncer gástrico de

início precoce. Apenas em uma família foi encontrada uma mutação

germinativa do CDH1 (gene que codifica a E-cadherina). Nas demais famílias

e pacientes os autores pesquisaram a ocorrência da mutação do p53, além

de mutação na caspase 10 e SMAD4, hMLH1 e hMSH2 (nos que

apresentaram instabilidade microssatélite), tendo encontrado uma mutação

germinativa missense em uma família com agregação de casos. Encontraram

também duas variantes de seqüência para SMAD4 (não afetando a seqüência

codificadora), dois novos polimorfismos na caspase-10. Não foram

encontradas mutações germinativas dos genes hMLH1 e hMSH2. Os autores

concluem que é necessário o rastreamento para mutações do p53 em

famílias com excesso de câncer gástrico, e que essas famílias devem ter um

sequimento clínico distinto (OLIVEIRA, 2004).

A sobrevida do câncer gástrico precoce após tratamento cirúrgico

radical é alta, sendo relatada na literatura taxa de sobrevida de até 99,5% em

cinco anos, não havendo diferença significativa quando comparados os

tumores limitados à mucosa com aqueles que atingem a submucosa. As

metástases para linfonodos podem ocorrer em 2,3% dos cânceres intra-

mucosos e em 19,6% dos submucosos (FENOGLIO-PREISER, 1996). A

sobrevida também é diferente quando se leva em consideração os tipos

macroscópicos definidos por Kodama, sendo relata sobrevida em 5 anos de

64,8% para o tipo Pen A, e de cerca de 90% em 5 anos para os demais tipos

macroscópicos (FENOGLIO-PREISER,2002). A taxa de recorrência após

tratamento cirúrgico pode alcançar 25% após vários anos de seguimento. Na

série de Traynor e cols. a recorrência observada foi de 18%

(TRAYNOR,1987).

De acordo com os critérios definidos por Laurén o câncer gástrico pode

ser classificado do ponto de vista histológico em intestinal ou difuso. Estes

dois subtipos apresentam diferenças não somente morfológicas, mas também

clínicas e epidemiológicas, existindo um conjunto diferente de alterações

genéticas envolvidas em cada subtipo, inclusive no que diz respeito ao p53.

Entre os cânceres precoces de estômago cerca de 60% são do tipo intestinal,

e este número aumenta para 80% quando se considera apenas o câncer

gástrico mínimo (no máximo 5 mm no seu maior eixo). A frequência do tipo

intestinal aumenta com a diminuição das dimensões do câncer gástrico

precoce. Sud e cols estudaram tecidos obtidos de 26 carcinomas gástricos

(não especificando quantos destes eram precoces e quantos eram

avançados), identificando mutação somática do p53 em 8 dos mesmos, dos

quais sete eram do tipo intestinal e apenas um do tipo difuso. Porém esta

diferença não apresentou significado estatístico quando comparada com a

ocorrência de mutação do p53 (p=0,19) (SUD, 2001). Imazeki e cols

estudaram tecidos de 10 adenocarcinomas gástricos obtidos de peça

cirúrgica, encontrando mutação do p53 em 5 dos mesmos. Dos 10 tumores

dois eram diferenciados e 8 indiferenciados. Os cinco casos nos quais não

foram detectadas mutações do p53 eram indiferenciados. O número de casos

foi considerado pequeno pelos autores, inviabilizando conclusões definitivas

(IMAZEKI, 1992). Oki e cols estudaram as alterações do p53 (através de

sequenciamento direto por PCR do exon 4 ao exon 8) em 113 casos de

adenocarcinoma gástrico que foram submetidos a tratamento cirúrgico,

encontrando mutações do p53 mais frequentemente no tipo intestinal do que

no difuso (OKI, 2005).

O câncer gástrico precoce pode estar localizado em qualquer um dos

três terços nos quais se divide o estômago, e seu aspecto macroscópico

enquadra-se nos tipos definidos pelas Sociedades Japonesas de Endoscopia

Gastroenterológica e para pesquisa do Câncer Gástrico em 1962 e 1963

(DIAS, 1999):

Tipo 0-I- protruso- lesão séssil ou pedunculada, nodular ou

cerebriforme, protrusa para o lúmen, de qualquer diâmetro;

Tipo 0-II-superficial

0-IIa-elevado- lesão elevada com até duas vezes a espessura da

mucosa, vermelha, superfície irregular e que sangra facilmente;

0-IIb-plano- lesão superficial, plana, ao nível da mucosa, vermelha

ou esbranquiçada;

0-IIc-deprimido- depressão bem definida, coloração vermelha,

superfície irregular, e com depósitos de fibrina;

Tipo 0-III- escavado- lesão escavada, forma irregular, bordas

granulares, fundo liso ou espiculado.

Foto 1 Foto 2

Foto 3

Foto3 Foto 4

Fotos1,2,3,4- exemplos de tumores gástricos precoces. Foto 1-adenocarcinoma gástrico

precoce tipo 0-I. Foto 2-adenocarcinoma gástrico precoce tipo 0-IIa. Foto 3-adenocarcinoma gástrico

precoce tipo 0-IIb. Foto 4-adenocarcinoma gástrico precoce tipo 0-IIc + III.

Segundo Pelayo Correa há duas entidades clínico-patológicas distintas,

englobadas pelo nome de câncer gástrico: uma é o tipo intestinal ou

expansivo, endêmico, ocorrendo a partir de lesões precursoras em população

de alto risco, e a outro é o tipo difuso ou infiltrativo, ocorrendo mais em

população de baixo risco, sem lesões precursoras definidas. Fiocco defende

a existência de um histiotipo misto, que aparecia durante a progressão

neoplásica, no qual haveria alterações típicas da carcinogênese do tipo

intestinal e do tipo difuso misturadas. Ao longo do desenvolvimento do tipo

intestinal participariam sequencialmente deste processo a gastrite crônica, a

atrofia glandular, com perda e regeneração celular, a ação dos agentes

genotóxicos e a metaplasia intestinal. Esta poderia ser tanto do tipo delgado,

ocorrendo mais comumente em jovens, sem displasia, ou do tipo colônica,

ocorrendo mais em idosos, com displasia ou alterações carcinomatosas

precoces, sugerindo uma transição gradual de um tipo para o outro.

O aparecimento da gastrite atrófica poderia estar associado à

diminuição dos níveis séricos de pepsinogênio, os quais poderiam voltar a

aumentar com o advento do carcinoma. Com o aparecimento da metaplasia

intestinal completa (do tipo delgado) algumas enzimas normalmente

secretadas no delgado seriam produzidas no estômago, o que não acontece

na metaplasia intestinal incompleta. A presença anormal de beta

glicuronidase e de desidrogenase lática (LDH) já foi observada no suco

gástrico de jejum nos casos de metaplasia intestinal incompleta.

Alterações na produção de mucina também são notadas nesta fase,

com produção inicial de mucinas neutras durante o processo metaplásico,

com aparecimento posterior de mucinas sulfatadas, as quais são abundantes

quando a displasia e o carcinoma já estão presentes (CORREA, 1988).

Sugai e cols estudaram amostras de 62 cânceres gástricos precoces e

correlacionaram o perfil genético dos tumores bem diferenciados com o

fenótipo de mucina celular encontrado, com o objetivo de definir se estes

fenótipos distintos refletem alterações genéticas moleculares específicas.

Eles subdividiram os tumores em 4 grupos distintos conforme o fenótipo

encontrado, usando análise imunohistoquímica das mucinas, tendo

encontrado 13 fenótipos gástricos, 17 intestinais, 31 mistos e 1 não

classificado. Os autores usaram PCR e análise imunohistoquímica para

detectar perdas alélicas cromossômicas de vários loci cromossômicos

relacionados ao câncer, instabilidade microssatélite e superexpressão da

p53. Imunorreatividade para a p53 não foi encontrada na mucosa gástrica

não neoplásica, na metaplasia intestinal e nos adenomas gástricos. Não foi

encontrada diferença significativa na freqüência de superexpressão da p53

nos cânceres de fenótipo intestinal, gástrico ou misto. Eles concluíram que a

superexpressão da proteína do p53 é comum no câncer gástrico do tipo

diferenciado (SUGAI, 2004).

A carcinogênese gástrica é um processo progressivo que envolve

múltiplos passos, com ocorrência paulatina de várias alterações genéticas,

que vão acumulando-se, levando à transformação das células epiteliais

normais em células cancerosas. Várias alterações genéticas são relatadas ao

longo desta via, e estas alterações seqüenciais podem estar envolvidas na

progressão do câncer gástrico. São descritos como relevantes neste

processo a instabilidade genética, a perda dos genes supressores tumorais, a

ativação de oncogenes e a ocorrência de alterações genéticas de citocinas,

fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, telômeros/atividade de

telomerase e reguladores do ciclo celular. Entre os genes supressores

tumorais envolvidos encontra-se papel relevante para o p53 já nas fases

precoces do processo (TAHARA,1996,1998).

TIPO HISTOLÓGICO SEGUNDO LAURÉN:

BEM DIFERENCIADO

Célula normal→instabilidade genética

↓ superexpressão do cripto

↓ deleção do gene 2.2kb

metaplasia intestinal

mutação do p53, K-ras, APC ↓

ADENOMA PH do APC, PH do p53, c-

met

↓ 6.0Kb,perda do gene bcl-2

Ca precoce

Perda 18q (DCC),PH do 1p ↓

Mudança no receptor de TGFβ ↓

Transcrição anormal do CD44 ↓

Ca avançado PH 7q, amplificação do c-erb 2,

↓ redução em n-

m23

Metástases

POUCO DIFERENCIADO

Célula normal→instabilidade genética

↓ mutação do p53 e perda alélica

↓ expressão do c-met 6.0

Ca precoce

perda de caderina, PH 1p, ↓

superexpressão TGFβ ↓

mudança no receptor TGFβ ↓

Ca avançado

PH 7q, amplificação do K-sam e c-met, ↓

redução em n-m23 ↓

Metástases

Figura 1-alterações genéticas segundo Tahara ( adaptado de TAHARA, 1996)

Tahara também relata que os dois tipos histológicos de câncer gástrico

podem ter vias genéticas distintas. Dentre todas as alterações genéticas

encontradas na doença, a ativação do gene c-met, a inativação do gene p53

e a transcrição anormal do CD44 seriam eventos comuns tanto no tipo

intestinal como no difuso (TAHARA, 1995).

A instabilidade genética pode ter papel crítico principalmente no

desenvolvimento do adenocarcinoma difuso segundo Nakamura (erros de

replicação de loci microssatélites detectados em 64 % dos difusos em

comparação com 17% dos intestinais), o qual geralmente ocorre em áreas

não metaplásicas do estômago de populações jovens (HAN,1993 apud

TAHARA, 1995). A expressão da instabilidade genética pode ser

representada por mutações somáticas de seqüências microssatélites devido a

erros de replicação do DNA (TAHARA, 1995). Já Fiocca relata que na sua

experiência os tumores gástricos com fenótipo de erros de replicação

pertenciam exclusivamente ao histotipo intestinal ou misto, e mostravam

exclusão mútua com relação às mutações do gene p53, referindo também

que outros autores encontraram correlação com a localização antral, pouca

tendência metastática e um melhor prognóstico. Entre os tumores precoces

que Fiocca estudou os tumores com fenótipo de erro de replicação estavam

confinados à mucosa e não eram metastáticos, enquanto os que eram p53

positivos preferencialmente invadiam a submucosa e não raramente

desenvolviam metástases linfonodais (FIOCCA, 2001).

No tipo intestinal a mutação e a perda alélica do APC ocorrem em

mais de 50% dos casos, sendo a mutação geralmente do tipo missense (ao

contrário do que ocorre no câncer colo-retal, onde freqüentemente encontra-

se a mutação nonsense), assim como ocorre a perda de heterozogosidade no

locus do DCC e bcl-2, sugerindo que alguns cânceres gástricos do tipo

intestinal podem se desenvolver por uma via genética semelhante à do

câncer colo-retal. No tipo intestinal perda de heterozigosidade no

cromossoma 1q freqüentemente ocorre (em 44% dos tumores), enquanto

perda de heterozigosidade no cromossomo 1p é relativamente comum no

difuso avançado. Tahara sugere a possível existência de um gene supressor

tumoral no cromossoma 1 normal. Já no tipo difuso observa-se a

superexpressão do bcl-2 (TAHARA, 1995).

Dentre os oncogenes implicados no câncer gástrico, a amplificação do

gene c-erb 2 é detectada apenas no tipo intestinal, e sua superexpressão

está intimamente relacionada a ocorrência de metástase hepática (que ocorre

mais freqüentemente no tipo intestinal). O gene c-met codifica o receptor

para o fator de crescimento de hepatócitos, estando implicado nos dois tipos

histológicos, e freqüentemente amplificado no câncer gástrico avançado,

particularmente em 39% dos carcinomas cirrosos, apresentando perda de

heterozigosidade em 30% dos cânceres intestinais, independente de sua

amplificação. O gene k-sam está amplificado no câncer gástrico difuso, e é

membro da família de receptores para o fator de crescimento do fibroblasto

(TAHARA, 1995,1996).

Um amplo espectro de fatores de crescimento e citoquinas atua como

moduladores autócrinos e parácrinos, e organiza a interação entre células

tumorais e estromais.TGF α, EGF, anfirregulina e IL1 α funcionam como

fatores de crescimento autócrinos. O HGF (fator de crescimento do

hepatócito) está implicado na progressão e na morfogênese do câncer

gástrico, promovendo a formação tubular no tipo intestinal, ou a dispersão

das células cancerosas, levando ao tipo difuso (nos clones que mostram

redução ou perda da E-cadherina, que é uma molécula importante na adesão

intercelular, ou cateninas). Cripto, membro da família EGF (fator de

crescimento epidérmico), é um estimulador do crescimento positivo para os

dois tipos de câncer gástrico. Está freqüentemente associado com o câncer

gástrico e a metaplasia intestinal, havendo uma boa correlação entre a sua

expressão e o estágio tumoral ou prognóstico. TGFα (fator transformador de

crescimento) está comumente superexpresso no tipo difuso. Resultados de

trabalhos sugerem que a maioria dos cânceres gástricos avançados escapa

da inibição do crescimento pelo TGF α através de mudanças nos genes para

os seus receptores. Evidentemente induz a expressão do gene p21, e está

implicado na apoptose em algumas linhagens celulares de câncer gástrico

humano. Pode funcionar como um inibidor do crescimento parácrino ou

autócrino, sendo um gatilho para a apoptose. O índice de apoptose é

significativamente maior no tipo intestinal do que no difuso (TAHARA,

1994,1995).

Mattar e cols pesquisaram a perda de heterozigosidade para p53, DCC

APC e Rb em 22 tumores gástricos ressecados cirurgicamente, e também

nos leucócitos do sangue periférico dos mesmos 22 pacientes, não a

encontrando para nenhum dos genes pesquisados. A imunohistoquímica para

p53 foi positiva em 63,6% dos casos, sendo negativa na mucosa normal

(MATTAR, 2004).

As moléculas de adesão celular também podem funcionar como

proteínas de supressão tumoral. A expressão da E-cadherina e α -catenina é

significativamente inferior no difuso comparado com a encontrada no

intestinal. Fiocca e cols relataram que 50% dos tumores difusos revelavam

mutações para o gene da E-cadherina, sendo que mutações de linhagem

germinativa foram relatadas em famílias com câncer gástrico do tipo difuso,

mas não naquelas com câncer do tipo intestinal. Mutações ou perda de

expressão da E-cadherina parecem se correlacionar com a perda da estrutura

glandular nos tipos mistos, podendo marcar a transição do tipo intestinal para

este (FIOCCA, 2001).

Murakami e cols estudaram (em 140 pacientes com câncer gástrico

operados) a expressão imunohistoquímica do pAkt (serine/threonine kinase)

ativada pela Pi3k (phosphatidylinositide 3-kinase), a qual é ativada pela

ligação à superfície celular de fator de sobrevida. Nos pacientes com

estadiamento T3 (88 pacientes) os autores realizaram análise

imunohistoquímica para o p53, e encontraram que os tumores tanto p53 como

pAkt positivos apresentaram um prognóstico significativamente pior do que os

pacientes que eram tanto p53 como PAkt negativos. A via pi3k/Akt diminui

(ativa downstream) a expressão do p53 (MURAKAMI, 2007).

A superexpressão do p53 e da ciclina E foi estudada por Bani-Hani e

cols em 89 pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer gástrico,

tanto no tecido tumoral como na mucosa normal adjacente. A superexpressão

da ciclina E foi encontrada em 39,3% dos tumores, e a do p53 em 51,7% dos

mesmos. Na mucosa gástrica normal nenhuma célula do epitélio glandular se

corou. Os autores encontraram uma correlação significativa entre a

superexpressão da ciclina E e o acúmulo anormal da proteína p53 nas

células tumorais ( p<0,0001). Tumores fortemente positivos para ciclina E

apresentaram a tendência para prognóstico pior do que os outros, assim

como os tumores positivos para p53 mostraram uma tendência para

prognóstico pior do que os p53 negativos. Pacientes com imunohistoquímica

positiva tanto para p53 como para ciclina E tiveram um prognóstico

significativamente pior. A combinação da superexpressão da ciclina E, da

expressão do p53 e do estágio tumoral foi o único preditor significativo de

sobrevida (BANI-HANI, 2005).

Estudos mostram que a mutação do gene p53 ocorre em uma fase inicial da

carcinogênese gástrica, sendo detectada nos tumores precoces em várias séries da

literatura (FENOGLIO-PREISER, 1996), estando principalmente associada ao tipo

intestinal de Laurén. WANG e cols estudaram 36 casos de adenocarcinoma gástrico

operados em Taiwan (destes 12 casos eram de adenocarcinoma gástrico precoce),

encontrando diferença na mutação do p53 entre adenocarcinomas gástricos

precoces e avançados do tipo intestinal (40 x 20%), o que não aconteceu no tipo

difuso (16,7 x 11,8) (WANG, 2001). As anormalidades do p53 podem ocorrer em

uma fase precoce do processo neoplásico, gerando instabilidade genética e

favorecendo a ocorrência de outras mutações posteriormente. Stemmermann e cols.

encontraram imunorreatividade para o p53 em todos os estágios do câncer gástrico,

indicando que as alterações do p53 não estão confinadas aos tumores em estágios

avançados ( STEMMERMANN,1994).

Estudos mostram uma certa estabilidade genética dos adenomas gástricos,

sendo rara a detecção da mutação do gene p53 nestas lesões, o que sugere que a

ocorrência da seqüência adenoma-adenocarcinoma no estômago seja rara, devendo

a maioria dos adenocarcinomas gástricos se desenvolver por uma via de novo ou a

partir da própria metaplasia intestinal, sem a ocorrência prévia do adenoma. Sakurai

e cols estudaram 19 adenocarcinomas gástricos precoces surgidos de adenomas

gástricos e 27 adenocarcinomas gástricos precoces sem componentes

adenomatosos, e encontrou uma freqüência de imunopositividade para a p53 menor

nos adenocarcinomas gástricos que surgiam a partir de adenomas (26% x 48%),

sugerindo que as alterações do gene p53 possam não estar relacionadas a

conversão maligna na seqüência adenoma-adenocarcinoma gástrica, que pode ter

uma via diferente do que no cólon (SAKURAI,1995).

Os erros de replicação em loci micro-satélites no adenocarcinoma gástrico

foram encontrados em 33% dos casos estudados por Semba e cols. A presença

destes reflete instabilidade genética secundária a defeitos no sistema de reparo do

DNA, as quais acompanham o processo de carcinogênese, aumentando a taxa de

mutação normal e levando a mutações em oncogenes e genes supressores

tumorais. Baseados em seus achados com relação à freqüência de erros de

replicação encontrada na metaplasia intestinal, adenomas e adenocarcinomas bem

diferenciados, os mesmos sugerem que a instabilidade genética é um dos eventos

mais precoces na carcinogênese gástrica, especialmente no adenocarcinoma bem

diferenciado que se origina da seqüência adenoma-adenocarcinoma. Porém os

mesmos não encontraram associação entre a presença de um fenótipo positivo para

erros de replicação e a ocorrência de alterações genéticas do p53 nos 24 casos de

tumores gástricos por eles estudados (SEMBA, 1996).

Uma possível associação entre a mutação do p53 e a ocorrência de

instabilidade microssatélite foi investigada em estudo conduzido por Renault e cols.

Mutações genéticas funcionais do p53 foram encontradas em 40% dos tumores, e

32,5% apresentavam erros de replicação em pelo menos um dos marcadores

testados, e 25% apresentavam instabilidade em mais de um marcador. Os autores

encontraram uma associação negativa entre mutações do gene p53 e instabilidade

microssatélite, e concluíram que como estas duas alterações genéticas não estão

simultaneamente presentes nos tumores, elas provavelmente agem através de vias

diferentes durante o desenvolvimento da doença (RENAULT, 1996).

Forones e cols estudaram através de imunohistoquímica os corpos

apoptóticos, o p53, a expressão do bcl-2 (gene que codifica uma proteína que inibe

a apoptose, e pode ser o mecanismo potencial pelo qual as células tumorais

escapam da apoptose mediada pelo p53) e a taxa de proliferação celular através da

quantificação do ki-67, tanto em 22 amostras de tecido de adenoma gástrico como

em 22 biópsias de metaplasia intestinal. A imunohistoquímica para p53 foi negativa

em todos os tecidos de metaplasia intestinal e positiva em 68% dos tumores (mais

frequentemente nos estágios avançados). A imunorreatividade para bcl-2 na

metaplasia intestinal e no câncer gástrico não apresentou diferença significativa,

porém bcl-2 foi expresso nos tumores precoces mais frequentemente do que nos

tumores avançados, o que poderia estar associado com o processo precoce de

carcinogênese gástrica, ocorrendo antes que outros eventos carcinogênicos fossem

adquiridos, como a mutação do p53 (FORONES, 2005). Segundo Stock e cols a

expressão de bcl2 e p53 foi maior nos tumores metastáticos do que nos não

metastáticos (STOCK, 2005).

As mutações no códon 72 do exon 4 do gene p53 têm sido estudadas, e vêm

sendo associadas ao alto risco de desenvolvimento de vários tipos de câncer. Há

autores que descrevem uma associação potencial entre o polimorfismo do códon 72

do gene p53 e o aumento da susceptibilidade de conversão maligna para diferentes

doenças neoplásicas. O polimorfismo do gene p53 que ocorre no códon 72 codifica

ou a arginina (CGC) ou a prolina (CCC). Pérez-Pérez e cols estudaram 65 pacientes

com câncer gástrico distal, e encontraram associação do genótipo Arg/Arg com o

câncer gástrico distal. O genótipo Arg/Arg ocorreu em 53,8% dos pacientes com

câncer gástrico distal, em comparação com 37,4% dos pacientes sem câncer

(PÉREZ-PÉREZ, 2005).

Yi e cols também estudaram o polimorfismo do códon 72 do p53, e o

compararam nos cânceres precoce e avançado. A partir da extração do DNA do

sangue periférico de 292 pacientes com câncer gástrico (103 precoces e 189

avançados) e de 216 controles, o polimorfismo foi determinado por PCR-RFLP. Eles

observaram um aumento marcado na frequência do alelotipo Pro/Pro nos pacientes

com câncer de estômago, principalmente nos pacientes com tumor precoce. Por

regressão logística eles concluíram que o genótipo homozigoto Pro 72 leva a um

aumento de 3,9 vezes no desenvolvimento de câncer gástrico, quando comparado

com a homozigose Arg e a heterozigose Arg/Pro, com risco de desenvolvimento de

câncer precoce de 5,35 vezes. Encontraram também que os pacientes com câncer

gástrico em anel de sinete tinham uma relação maior de genótipo Pro/Pro do que os

não anel de sinete (com diferença significativa do ponto de vista estatístico). Porém

o significado funcional desse polimorfismo é desconhecido, mas já foi relatado que

as propriedades transcripcionais dos diferentes genótipos são diferentes. Os autores

colocam que estruturas diferentes das proteínas p53 (resultantes da substituição de

Pro por Arg no códon 72) podem ter funções diferentes na responsividade a

estímulos diferentes causadas por carcinógenos diversos (YI, 2006).

O polimorfismo do códon 72 do gene p53 também foi estudado por Lai e cols.

em 51 pacientes com câncer gástrico e 59 controles, e não encontraram diferença

significativa na distribuição dos genótipos entre esses dois grupos. Quando

estudaram apenas o grupo com câncer e estabeleceram uma comparação entre os

diferentes genótipos e as variáveis idade, sexo, fumo, álcool, localização tumoral,

diferenciação histológica, envolvimento nodal, metástase à distância e estágio

tumoral, apenas encontraram resultado estatisticamente significativo entre as

diferentes localizações tumorais e genótipos. Encontraram na cárdia

predominantemente homozigose Pro, enquanto no antro e corpo encontraram

predomínio da homozigose Arg e heterozigotos. Não houve diferença significativa na

distribuição dos alelos entre os casos e os controles, mas sim na distribuição dos

alelos com relação às diferentes localizações tumorais. O alelo Arg foi mais comum

nos tumores de antro e corpo, enquanto o alelo Pro foi encontrado mais nos tumores

da cárdia. Os autores relatam que as características estruturais do exon 4 do p53

resíduos 61-94 foram bem preservadas através da evolução , o que não aconteceu

com o códon 72, o qual é alvo de polimorfismo. As diferenças nos alelos causam

mudanças na estrutura primária da proteína, sendo que as duas variantes

polimórficas apresentam habilidades diferentes para ativar transcrição, induzir

apoptose, reprimir transformação das células primárias e de ligar componentes da

maquinaria transcricional. A variante Arg da p53 seria um melhor indutor de

transcrição. Os autores sugerem que poderia ser esperado que o genótipo

homozigoto para Pro estivessse mais associado à resistência terapêutica que o

homozigoto para Arg, e abordam também o relato por outros autores de diferente

vulnerabilidade a diferentes carcinógenos conforme o genótipo, podendo ter relação

com variações étnicas na freqüência da doença (LAI, 2005).

Hiyama e cols estudaram o polimorfismo do códon 72 do gene p53 em 117

pacientes com câncer gástrico e gastrite crônica pelo H. pylori, dos quais 72 tumores

eram do tipo intestinal de Laurén e 45 do tipo difuso, e em 116 controles (pacientes

com gastrite crônica pelo H. pylori, sem câncer gástrico). As freqüências genotípicas

foram semelhantes entre os dois grupos, porém o genótipo Pro/Pro foi associado a

aumento do risco de câncer gástrico difuso de 2,98 vezes em comparação com o

genótipo Arg/Arg. Os autores concluíram que o genótipo Pro/Pro no códon 72 pode

estar implicado na susceptibilidade de desenvolver câncer gástrico do tipo difuso de

Laurén nos pacientes com gastrite crônica por H.pylori. (HIYAMA, 2002 apud

LYNCH, 2005).

Wu e cols encontraram diferença na superexpressão do p53 entre os casos

de câncer precoce e de câncer avançado de acordo com o subtipo de Laurén. No

tipo intestinal a superexpressão do p53 foi semelhante tanto nos casos precoces

como nos avançados (50% X 54,4%), enquanto que no tipo difuso foi maior nos

casos avançados do que nos precoces (50% x 16,7%), podendo significar a

ocorrência mais precoce de mutações do p53 no tipo intestinal e mais tardiamente

no tipo difuso (WU, 2000). Os autores também não encontraram relação entre a

infecção pelo Helicobacter pylori e a prevalência de alterações genéticas do p53

(entre outros supressores tumorais) com o subtipo histológico de Laurén ou o

estágio do tumor. Da mesma forma Blok e cols não encontraram diferença na

prevalência de acúmulo nuclear da p53 entre pacientes colonizados ou não por esta

bactéria ao estudar 45 casos de câncer gástrico precoce (BLOK, 1999). A infecção

estaria ligada à proliferação celular aumentada, como parte de um processo

inflamatório, com aumento na proteína selvagem p53 (MARINONE, 2001).

A partir de amostras teciduais obtidas por biópsia endoscópica em 108

pacientes com dispepsia (incluindo pacientes com exame normal, ou metaplasia

intestinal ou gastrite) e por ressecção gástrica curativa em 46 pacientes com câncer

gástrico, juntamente com a análise do DNA do sangue periférico, Li e cols

estudaram a imunopositividade para a p53, a ocorrência de instabilidade

microssatélite e a correlação com a infecção por Helicobacter pylori. A

imunohistoquímica para a p53 foi positiva com frequência maior nos pacientes com

câncer H. pylori positivo do que nos pacientes com câncer H. pylori negativo

(p=0,013). Dentre os pacientes com câncer gástrico, eles encontraram alta

instabilidade microssatélite (quando identificavam instabilidade em dois ou mais

marcadores) com frequência significativamente maior no grupo H. pylori positivo do

que no grupo H. pylori negativo, e concluíram que o H. pylori afeta o padrão da p53

na mucosa gástrica quando o sistema MMR (genes de reparo do mismatch) falha

(LI, 2005).

Dentre os genes do sistema MMR, os genes hMSH2 (human mutS homolog

2gene) e hMLH1 ( human Mut Lhomolog 1 gene) têm sido considerados como

fortemente relacionados à carcinogênese do trato digestivo. Analisando amostras

teciduais obtidas de biópsias endoscópicas de 129 casos de câncer gástrico, 74

casos de gastrite e 10 casos de mucosa normal, Jianmei e cols realizaram análise

imunohistoquímica para o hMSH2, hMLH1 e p53, além de pesquisar a infecção pelo

H.pylori pelo teste da urease e coloração pelo H-E. A taxa de expressão positiva do

hMSH2 no tecido com câncer gástrico foi maior do que a no tecido sem câncer

gástrico (p<0,001), enquanto a do hMLH1 no câncer gástrico foi menor do que a do

tecido não canceroso (p<0,01). A taxa de expressão positiva da p53 no câncer

gástrico foi maior do que a encontrada no tecido não canceroso (p, 0,01). A

imunohistoquímica positiva para hMSH2 e hMLH1 foi encontrada nos pacientes com

câncer gástrico com infecção pelo H. pylori com frequência menor do que naqueles

tecidos sem infecção (p<0,01), o mesmo acontecendo nos tecidos não câncer com

relação à infecção pelo H. pylori, porém sem significado estatístico. A expressão

positiva do p53 nos tecidos com câncer gástrico e infecção pelo H. pylori também foi

maior do que nos pacientes sem infecção, porém também sem significado estatístico

(JIANMEI, 2005).

Ikeda e cols. estudaram 88 estômagos removidos cirurgicamente devido a

câncer gástrico, e encontraram que a freqüência de expressão nuclear da p53 foi

basicamente a mesma nos doentes com câncer mínimo, precoce e avançado,

corroborando os achados que sugerem ser a ocorrência de mutação do p53 um

evento precoce na carcinogênese gástrica (IKEDA,1998).

Ohta e cols encontraram diferença na média de idade dos pacientes

com câncer gástrico de acordo com a macroscopia do tumor: os tipos

elevados acometendo mais indivíduos ao longo da sua sétima década de vida

e os tipos deprimidos acometendo mais indivíduos entre 40 e 60 anos de

idade (OHTA, 1987).

Milne e cols estudaram as alterações genéticas (padrão de expressão

molecular) encontradas em 113 casos de câncer gástrico em pacientes com

até 45 anos de idade, e o compararam com as alterações encontradas em 91

casos de câncer gástrico convencional (acima de 45 anos). Encontraram

positividade da imunofluorescência para a p53 com frequência maior nos

casos em pacientes com mais de 45 anos (48% x 31%, p=0,009). Outro

achado do trabalho foi o fato da imunopositividade da p53 estar associada

com nível aumentado de expressão da COX-2, além de encontrarem

positividade da p53 relacionada significativamente com tumores da cárdia

(p=0,007), entre outros achados (MILNE, 2006).

Com o objetivo de investigar a presença de instabilidade microssatélite

em tumores gástricos diagnosticados em indivíduos com menos de 40 anos

de idade, Hayden e cols analisaram o DNA extraído de material arquivado de

dez carcinomas gástricos (cujos pacientes possuíam entre 19 e 39 anos). Os

autores não encontraram instabilidade microssatélite (através da realização

de PCR) dentro do gene p53, encontrando porém desequilíbrio alélico dentro

dos 12 lócus microssatélites estudados. Os autores relatam que esse

desequilíbrio alélico pode ser explicado por perda de heterozigosidade ou

deleções genéticas espontâneas (HAYDEN, 1997).

Luinetti e cols pesquisaram a presença de mutação do p53 (por

procedimentos com imunoperoxidase e PCR) em 130 tumores (peças

cirúrgicas), sendo 70 casos de cânceres preoces. Eles distinguiram 2

padrões genéticos dentro dos tumores do tipo intestinal: aqueles com

instabilidade microssatélite e aqueles com mutação do p53. No tipo intestinal

as mutações tiveram distribuição semelhante entre os tumores precoces e os

avançados. O tipo misto apresentou um padrão intermediário entre o tipo

intestinal e o difuso puros, frequentemente com mutação do p53 e acúmulo

nuclear da proteína p53, porém com concentração das mesmas na fase mais

avançada da doença. Já o tipo difuso apresentou mutação do p53 em apenas

um caso, e nenhum caso foi RER+ (reparo de erros de replicação positivos)

(LUINETTI, 1998).

Com relação a imunorreatividade e/ou mutação genética do p53, Fléjou

e cols encontraram que estas são mais freqüentes nos adenocarcinomas da

cárdia do que nos do antro (FLEJOU,1999).

Sasaki e cols encontraram diferença na ocorrência de positividade para

a p53 não só no que diz respeito ao tipo histológico de adenocarcinoma, mas

também com relação ao padrão morfológico do câncer precoce, sendo a

freqüência mais alta encontrada no tipo IIc quando comparada com os tipos

IIa e IIb (SASAKI,1999). Kyokane e cols estudaram 40 casos de câncer

gástrico precoce, e os dividiram entre superficial elevado (8 casos) e

superficial deprimido (32 casos), encontrando superexpressão da p53

exclusivamente nos tumores deprimidos, não encontrando diferença neste

aspecto entre os tumores restritos a mucosa e os que atingem a submucosa

(KYOKANE,1998).

Alguns descrevem a ocorrência da mutação do p53 em uma fase mais

tardia (SOONG, 1996), assim como Igarashi e cols, que encontraram

superexpressão da p53 mais freqüentemente nos casos de câncer gástrico

avançado do que nos de precoce, não encontrando relação entre a presença

de metástases para linfonodos e a superexpressão da p53 nos dois grupos (

IGARASHI,1999). Porém estes resultados diferem de várias outras séries,

como, por exemplo, a série de Xiangming e cols. Estes autores

demonstraram uma associação positiva entre a expressão do p53 e a

ocorrência de metástases linfonodais, através da análise de 101 casos de

câncer gástrico precoce. E através de análise multivariada encontraram que a

co-ocorrência da p53 e da alfa catenina (uma das moléculas de adesão

celular) é um fator independente para o envolvimento linfonodal

(XIANGMING, 1999). Há também os genes que estão relacionados com a

ocorrência de metástases. O nm23 é um candidato a gene supressor para

metástases, e uma redução da sua expressão está freqüentemente associada

com metástases de câncer gástrico e colorretal. Tahara encontrou uma

transcrição anormal da CD44 (importante molécula de adesão celular para a

interação célula-célula) em todos os tecidos de câncer gástrico e tumores

metastáticos, observando diferença no padrão de transcrição entre os dois

tipos, sugerindo vias genéticas distintas para os dois.

Tahara também relata que a invasão e disseminação peritoneal podem

requerer não apenas anormalidades das moléculas de adesão celular, mas

também perda de heterozigosidade do braço longo do cromossoma 7. Em

estudo o autor encontrou que a perda de heterozigosidade no lócus D7S95

estava intimamente correlacionada com o pior prognóstico e a alta incidência

de disseminação peritoneal no câncer gástrico (ocorrendo mais

freqüentemente no tipo difuso), podendo conter um candidato a gene

supressor tumoral, com implicações possíveis para o prognóstico do câncer

gástrico (TAHARA, 1996).

Feng e cols estudaram por imunohistoquímica a expressão da p53, de iNOS,

e do VEGF em 55 casos de câncer gástrico submetidos a tratamento cirúrgico ( dos

quais 11 eram submucosos e os demais avançados) e em 60 pacientes

assintomáticos participantes de um programa de rastreamento endoscópico para

câncer gástrico e esofagiano na China. A imunohistoquímica para p53 foi positiva

em 51% dos tumores gástricos, sem haver diferença na mesma com relação à

profundidade do acometimento, sendo mais frequente nos tumores pouco

diferenciados. Nos materiais obtidos por biópsias os tecidos normais e com gastrite

crônica superficial apresentaram todas as imunohistoquímicas negativas. Já nos

tecidos com gastrite atrófica, metaplasia intestinal e displasia,a imunohistoquímica

para p53, iNOS e VEGF foi positiva com freqüência crescente, compatível com a

progressão histológica da lesão. A positividade da imunohistoquímica para p53 foi

mais freqüente nos tumores T2, T3 e T4 do que nos tumores T1. A

imunohistoquímica positiva para iNOS correlacionou-se positivamente com a

presença de metástases para linfonodos. Os autores concluem que p53, iNOS e

VEGF podem ser úteis como marcadores para agressividade do tumor gástrico

(FENG, 2002).

A existência ou não de um papel prognóstico para o p53 ainda não foi

totalmente definida na literatura, sendo os dados existentes ainda conflitantes. É

relatado que os tumores gástricos que contém o tipo selvagem da p53 seriam mais

quimio-sensíveis do que os que apresentam anormalidades da mesma (FENOGLIO-

PREISER, 1996). Em muitos cânceres a principal fonte de quimiorresistência seria a

presença de um fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR-1), sendo que as

neoplasias que apresentassem este fenótipo superexpressariam a P-glicoproteína

(P-gp ). Lacueva e cols estudaram a expressão desta glicoproteína e da p53 e

encontraram que a perda da expressão da P-gp nestes tumores frequentemente era

acompanhada de ausência de acúmulo da p53 nos casos estudados (LACUEVA,

2000).

Há estudos que não encontraram relevância prognóstica no acúmulo da p53.

Em sua série Oiwa e cols encontraram implicações prognósticas para o acúmulo da

p53 no câncer gástrico precoce, dividindo os tumores conforme a classificação de

Imokuchi e Sugimachi (MING, 1998). Oiwa e cols. estudaram a relação entre o p53 e

o padrão de crescimento do câncer gástrico precoce em 159 casos da doença

(sendo 43 do tipo Super , 37 do tipo Pen A , 16 do tipo Pen B e 63 do tipo “Small

mucosal type “) . Sabendo-se que o padrão de crescimento é um importante fator de

prognóstico no câncer gástrico precoce, o achado de frequências diferentes na

superexpressão do p53 entre os diferentes padrões favorece a existência de

implicação prognóstica do p53 nesta doença. Cerca de 43% dos pacientes com o

tipo Pen A apresentaram expressão positiva da p53 em contraste com os 16% do

tipo Super que foram positivos para a p53. No tipo Pen B este número foi de 29%, e

no “Small mucosal type“ foi de 8%. O tipo Pen A foi o que apresentou pior

prognóstico, com menor sobrevida em 10 anos, maior incidência de invasão venosa,

além de ter maior incidência do tipo diferenciado, ser um tumor com crescimento

mais rápido, e morfologicamente manifestar-se geralmente como um tumor do tipo

elevado. As recorrências após cirurgia neste grupo ocorreram mais precocemente,

estando este tipo associado a uma alta incidência de metástases hepáticas (OIWA,

1995).

Maehara e cols afirmam que o comportamento biológico das células

cancerosas deve ser determinado nos pacientes com câncer gástrico precoce e com

prognóstico menos favorável, a fim de detectar potenciais recorrências precoces no

fígado. Com relação ao tipo macroscópico de Kodama eles afirmam que o Pen A

tem um prognóstico menos favorável devido à recorrência precoce no fígado. Este

tipo tem recorrência predominantemente hematogênica, tendo maior densidade de

microvasos. Estaria associado à instabilidade cromossômica com aneuploidia do

DNA e superexpressão da p53, angiogênese tumoral induzida por ativação do fator

de crescimento endotelial vascular, invasão vascular e metástase hematogênica. As

recorrências fatais nos pacientes operados por câncer precoce não foram melhores

do que naqueles pacientes com câncer avançado. No câncer precoce as

recorrências ocorreram mais no fígado, e estiveram associadas a tumores pequenos

com invasão maciça da submucosa. Questionou-se que o câncer precoce teria

vários padrões de crescimento, que estariam relacionados ao modo de recorrência e

prognóstico. O p53 tem sido relatado como envolvido na regulação da expressão de

VEGF, o que justificaria o papel do p53 no controle da angiogênese (MAEHARA,

2001).

Estes autores citam o trabalho prévio de Okamura e cols, e falam sobre os

possíveis efeitos da quimioterapia adjuvante no pós-operatório de pacientes com

câncer gástrico do tipo Pen A, relatando que micrometástases hepáticas podem

ocorrer mesmo após a ressecção curativa, e que são necessários estudos

randomizados controlados para elucidar o efeito da quimioterapia no pós-operatório

nestes pacientes (MAEHARA, 2001).

Nodaa e cols estudaram a expressão das proteínas p53 e p21 (por

imunohistoquímica) em 133 casos de adenocarcinomas gástricos atingindo a

submucosa, correlacionando-a com o padrão de crescimento tumoral. Encontraram

a maior incidência de expressão da p53 e perda da p21 nos tumores do tipo Pen-A

(71,4%). Novamente foi encontrado prognóstico pior nos pacientes com o tipo Pen-

A, em termos de sobrevida em 5 anos, encontrando-se uma taxa de recorrência de

14,3%. Quando se considerou a expressão do p53 e o prognóstico, foi encontrado

pior prognóstico nos pacientes p53 positivos em termos de sobrevida em 5 anos

(p=0,01 ) (NODAA,2001).

No câncer colo-retal trabalhos mostram que o tipo de ploidia do DNA

(aneuploidia, multiploidia ou diploidia) está associada com alterações genéticas

diferentes. Diante disto Sugai e cols estudaram as alterações genéticas associadas

com aneuploidia, diploidia ou multipoidia no câncer gástrico a partir do isolamento de

cripta, uma vez que o câncer gástrico compartilha alguns aspectos genéticos com o

câncer colo-retal, e o pouco conhecimento sobre a relação destas alterações e o

estado de ploidia do DNA, o que é importante para entender a carcinogênese

gástrica. A partir da técnica de isolamento de cripta, usando análise de citometria de

fluxo, eles classificaram o estado de ploidia do DNA de 54 cânceres gástricos

esporádicos, e estudaram a mutação do gene p53 através de análise por PCR-

SSCP. Encontraram poucas alterações genéticas (incluindo mutação do p53) nos

tumores diplóides, em contraste com tumores aneuplóides e multiplóides (em

particular com a população aneuplóide destes) (SUGAI, 2005).

Também com relação ao prognóstico sabemos que o câncer precoce gástrico

vai progredir em direção à serosa, levando às metástases linfáticas e/ou

hematogênicas. Com relação à presença de metástases linfonodais, Igarashi não

encontrou relação entre a superexpressão da p53 e a ocorrência de metástases

linfonodais, tanto nos casos de carcinoma precoce como nos avançados

(IGARASHI, 1999). Já Maehara e cols. relataram que a superexpressão da p53 está

associada a angiogênese tumoral e metástases a distância (MAEHARA, 2000a).

Ming e cols também relatam que as alterações do p53 têm sido relacionadas

ao grau de invasão tumoral em alguns relatos, a coesividade do crescimento

tumoral, além da ploidia do DNA e das metástases (MING, 1998). Maeta e cols

estudaram a ocorrência de mutação do p53, a detecção da p53 mutante no soro e a

produção de anticorpos anti-p53 específicos em 62 pacientes com adenocarcinoma

gástrico operados em vários estágios. Encontraram aumento estatisticamente

significativo dos níveis da p53 mutante em pacientes com estadiamento T3/T4 e

invasão de vasos sanguíneos, em comparação com pacientes com estadio T1/T2 e

sem invasão vascular. Também detectaram níveis circulantes de anticorpo anti-p53

exclusivamente em pacientes com tumores T3/T4, envolvimento nodal, invasão

linfática ou sanguínea, e em pacientes com estádio III / IV, configurando prognóstico

pior destes pacientes, com diferença estatisticamente significativa (MAETA, 2000).

Maruyama estudou 4734 casos de câncer gástrico tratados cirurgicamente, e

avaliou a importância prognóstica de variáveis relacionadas aos pacientes, aos

tumores e ao tratamento. Encontrou impacto no prognóstico para as seguintes

variáveis: metástases à distância (incluindo disseminação peritoneal, metástases

para linfonodos e metástases hepáticas) e profundidade da invasão, além de tipo

macroscópico de tumor avançado (Borrmann 4 teve prognóstico pior), localização

tumoral ( sendo o local associado a pior prognóstico o terço superior), e o grau de

diferenciação ( o tipo pouco diferenciado tendo sobrevida em 5 anos inferior aos dois

outros tipos) (MARUYAMA, 1987).

Ohashi e cols relatam já ter sido demonstrado previamente que a existência

de metástases para linfonodos no câncer gástrico precoce diminui a taxa de

sobrevida, tendo impacto no prognóstico, e que estas são comuns em tumores

submucosos, principalmente com mais de 4 cm, e do tipo difuso com invasão

vascular. Com base nesses fatos, eles estudaram 201 casos de câncer gástrico

submucoso, dos quais 39 apresentavam metástases para linfonodos. Eles

estudaram a relação entre a existência de metástases linfonodais e a idade do

paciente, sexo, tamanho tumoral, histologia, extensão da invasão submucosa,

invasão linfática e venosa, ulceração do tumor, e a imunohistoquímica para p53,

Ki67, VEGF, αfetoproteína, sLeª e células dendríticas. A imunohistoquímica foi

realizada em 191 pacientes (dos quais 38 apresentavam metástases para

linfonodos). Não houve diferença significativa nos parâmetros da imunohistoquímica

entre os pacientes com ou sem metástases para linfonodos. As metástases para

linfonodo nos tumores sm1 relacionaram-se com a expressão de VEGF, e nos

tumores sm3 com a expressão de DC. A presença de metástases para linfonodos

relacionou-se com o tamanho tumoral, a profundidade da invasão submucosa, a

invasão linfática e a invasão venosa (OHASHI, 2007).

Com a evolução do conhecimento da carcinogênese gástrica e seus múltiplos

passos envolvidos no desenvolvimento da doença, a análise molecular propiciará o

diagnóstico mais precoce e melhores opções de manejo terapêutico. Com o uso de

marcadores moleculares será mais fácil a identificação de vários subgrupos dentro

dos pacientes com câncer gástrico (EL-RIFAI, 2002).

Scartozzi e cols reforçam a necessidade de se considerar os fatores

biológicos (que são derivados freqüentemente de processos genéticos) na definição

das características tumorais, uma vez que um papel definitivo para os mesmos está

emergindo, como indicadores prognósticos e fatores preditivos, Os mesmos

acreditam que no futuro, fatores biológicos poderão ser incorporados, juntamente

com fatores clínicos clássicos, ao processo de tomada de decisão no que concerne

à terapêutica, desde que validados em estudos randomizados prospectivos

(SCARTOZZI, 2004).

Várias técnicas operatórias menos invasivas têm sido descritas para o

tratamento do câncer gástrico precoce, incluindo ressecção aberta limitada,

ressecção laparoscópica, ressecção em cunha e ressecção endoscópica da

mucosa. Kopp e cols relatam que para definir quais pacientes podem ser candidatos

a estes procedimentos menos invasivos será importante o uso de marcadores

(KOPP, 2005).

Com o objetivo de tentar definir a relevância prognóstica da imunorreatividade

da p53 e da bcl-2 em pacientes com tumor gástrico precoce invasivo pT1/pT2

tratados com cirurgias standart, eles estudaram amostras histológicas de 65

cânceres gástricos. A imunorreatividade para a bcl-2 esteve associada a tumores do

tipo intestinal de Laurén, enquanto a imunorreatividade da p53 estava aumentada

em tumores mais invasivos (pT1 X pT2). Eles encontraram a classificação T,

acometimento de linfonodos e o estadiamento da UICC como sendo parâmetros

prognósticos significativos por análise univariada, e definiram um grupo de pacientes

com sobrevida mais longa: pacientes com tumores moderadamente diferenciados

com imunohistoquímica negativa para bcl2 e p53, em relação aos tumores

moderadamente diferenciados com imunohistoquímica positiva para ambos,

encontrando também como fator de impacto independente de prognóstico a

imunohistoquímica negativa para bcl2 e p53 indenpendente do estadiamento T e do

envolvimento linfonodal. Concluíram que os resultados obtidos para este subgrupo

de pacientes podem fornecer evidências para uma nova classificação biológica para

câncer gástrico com estágios precoces no pré-operatório, com possíveis implicações

para terapêuticas menos invasivas (KOOP, 2005).

Segundo Yasui e cols o impacto do p53 no prognóstico permanece

controverso após a realização de vários estudos, e cita o fato de trabalhos mais

recentes terem demonstrado importância da expressão anormal da p53 na sobrevida

acumulada e na resposta a quimioterapia (YASUI, 2005).

4- MATERIAL E MÉTODOS

Foram estudados retrospectivamente 80 casos de adenocarcinoma gástrico

precoce matriculados no Hospital do Câncer I do Instituto Nacional de Câncer, e

submetidos a tratamento cirúrgico no período 1982 até 2001. Os dados foram

obtidos dos prontuários lotados no arquivo médico e dos prontuários eletrônicos.

Nenhum dos pacientes foi submetido à outra forma de tratamento pré-operatório,

tanto quimioterápico como radioterápico.

O câncer gástrico precoce foi definido conforme o conceito da Sociedade

Japonesa de Endoscopia Digestiva. Todos os tumores foram classificados com

relação ao grau de diferenciação com base na classificação da Organização Mundial

de Saúde. De acordo com os critérios de Laurén os tumores foram classificados em

intestinal ou difuso. Todas as lâminas contendo tecido tumoral (coradas com

hematoxilina- eosina ) foram revisadas pelo mesmo patologista. Os blocos de

parafina (fixados em formalina) com maior representatividade de tecido tumoral

foram selecionados para corte. Foram obtidos fragmentos de cerca de 3 micra,

tendo sido realizados um ou mais cortes ,de acordo com a necessidade e a

qualidade do material obtido.

4.1 IMUNOHISTOQUÍMICA

Para a pesquisa da proteína mutante do p53 foi utilizado o anticorpo

monoclonal de camundongo anti-proteína p53 humana (DAKO). Realizou-se cortes

teciduais de 3µm em lâminas aderidas à poli-L-lisina a 0,01% (P8920, Sigma-

Aldrich) que foram desparafinizadas, hidratadas e submetidas à recuperação

antigênica em panela de pressão utilizando tampão citrato pH6,0 durante 3min após

atingir pressão. A seguir, realizou-se o bloqueio da peroxidase endógena utilizando

peróxido de hidrogênio 3% durante 20 minutos. As lâminas foram lavadas 3 vezes

em tampão TBS 0,05M (TRIS Buffered Saline) por 5 min cada lavagem. Em seguida,

realizou-se a incubação overnight do anticorpo primário em câmara úmida a 4°C. No

dia seguinte, as lâminas foram lavadas em TBS 0,05M (3 X 5min) e posteriormente

foram incubadas por 30min com o anticorpo secundário universal biotinilado

(BIOTILYLATED LINK, K690, DAKO Cytomation, Denmark). As lâminas foram

lavadas com TBS 0,05M (3 X 5min) e incubadas com o terciário estreptavidina-

peroxidase (Streptavidin-HRP, K690, DAKO Cytomation, Denmark) durante 30min.

Em seguida, as lâminas foram lavadas em TBS 0,05M (3 X 5min) e reveladas com o

cromógeno 3,3’ diaminobenzidina durante 5 min (K3468, Dako Cytomation,

Denmark), contracoradas com hematoxilina de Mayer, desidratadas e montadas em

bálsamo do Canadá.Obtivemos controles positivos a partir de caso sabidamente

positivo de câncer de cólon. O controle negativo foi obtido com a inclusão de uma

lâmina onde não foi feita a incubação do anticorpo primário. De cada caso foi obtido

um corte, sendo este número ampliado caso necessário (em função da qualidade e

da representatividade do material).

Interpretação do resultado: foram considerados positivos os casos que

apresentavam acúmulo do p53 em mais de 10% dos núcleos celulares por campo

(fotos 5,6,7,8 e 9).

Foto 5- Adenocarcinoma bem diferenciado (padrão tubular) – imuno-reatividade

nuclear ao anticorpo p53 (corte histológico, x100)

Foto 6- Adenocarcinoma moderadamente diferenciado (padrão tubular) – imuno-

reatividade nuclear ao anticorpo p53 (corte histológico, x100)

Foto 7- Adenocarcinoma moderadamente diferenciado (padrão tubular) – imuno-

reatividade nuclear ao anticorpo p53 (corte histológico, x40)

Foto 8- Adenocarcinoma moderadamente diferenciado (padrão túbulo-papilífero) –

imuno-reatividade nuclear ao anticorpo p53 (corte histológico, x40)

Foto 9- Adenocarcinoma (padrão tubular) – imuno-reatividade nuclear ao anticorpo

p53 (corte histológico, x200)

4.2 PACIENTES

Cem pacientes consecutivos portadores de câncer gástrico precoce foram

submetidos a ressecção gástrica no Serviço de Cirurgia Oncológica Abdomino-

pélvica do Hospital do Câncer do Instituto Nacional do Câncer entre 1982 e 2001.

Destes 12 pacientes apresentavam mais de um tumor gástrico (tumores

sincrônicos), sendo excluídos do trabalho. Dos 88 casos restantes dois

apresentavam problemas com a qualidade do material armazenado para estudo do

p53, um apresentava problemas com o registro dos dados e cinco com o

armazenamento do material, impossibilitando a recuperação dos mesmos.

Dos oitenta pacientes restantes 37 tinham tumores intramucosos e 43

tumores que se estendiam até a submucosa. A média de idade dos pacientes foi de

60 anos. Destes 42 eram homens e 38 mulheres. Com relação à idade, os pacientes

tinham até 60 anos e mais de 60 anos. Com relação ao tamanho do tumor, os

pacientes foram agrupados em dois grupos׃ aqueles com tumor até 4cm no seu

maior eixo, e aqueles com mais de 4cm.

4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados usando o teste χ2, sendo os cálculos efetuados

através do programa SPSS-11, comparando-se o p53 com as seguintes variáveis:

idade, sexo, localização, aspecto macroscópico, tipo histológico de Laurén, grau de

diferenciação, acometimento de linfonodos, tamanho tumoral e sobrevida em 5 anos.

O nível de significância estatística foi definido como p valor inferior a 0,05.

5 RESULTADOS

5.1 VARIÁVEIS DEMOGRÁFICAS

Os pacientes foram estudados com relação à idade e ao sexo. A média etária

dos pacientes foi de 60 anos e a mediana 61 anos. A idade dos pacientes variou de

33 a 86 anos. Os pacientes foram divididos em dois grupos: aqueles com idade até

60 anos no momento da cirurgia e aqueles com mais de 60 anos. Não encontramos

nenhuma relação significativa entre a idade e as demais variáveis, exceto o tamanho

tumoral. Nos pacientes com até 60 anos houve predomínio dos tumores com até

4cm (64,1%), enquanto nos pacientes com mais de 60 anos predominaram os

tumores com mais de 4cm ( 58,5%), sendo esta relação estatisticamente significativa

(p=0,043). Com relação ao sexo, 42 pacientes (52,5%) eram homens e 38 (47,5%)

eram mulheres. A variável sexo não apresentou relação com nenhuma das demais

variáveis estudadas, porém houve uma tendência a uma maior sobrevida em cinco

anos nas mulheres ( 91,2% x 74,2%), embora não tenha sido encontrado significado

estatístico ( p=0,068). Quando dividimos os pacientes em dois grupos, encontramos

os resultados que se seguem: o grupo dos pacientes com tumor restrito à mucosa foi

composto por 37 pacientes, sendo a média de idade de 59,89 anos, com idade

mínima de 36 anos e máxima de 86, com mediana de 59 anos. Destes 21 (56,8%)

eram homens e 16 (43,2%) eram mulheres.

Já o grupo dos tumores com invasão até submucosa foi composto por 43

pacientes, com média etária de 60,1 anos, com idade mínima de 33 anos e máxima

de 83 anos, com mediana de 62 anos. A distribuição por sexo foi a seguinte: 22

(51,2%) eram mulheres e 21 (48,8%) eram homens.

5.2 TIPO HISTOLÓGICO E GRAU DE DIFERENCIAÇÃO

Com relação ao tipo histológico de Laurén, analisando todos os casos em

conjunto foram encontrados 37 tumores do tipo difuso (46,25%) e 43 do tipo

intestinal (53,75%). Com relação ao grau de diferenciação, encontramos 37 tumores

pouco diferenciados (G3), 30 tumores de moderado grau de diferenciação (G2) e 13

tumores bem diferenciados (G1). O tipo histológico foi comparado com as demais

variáveis estudadas, tendo sido encontrada significado estatístico na relação do

mesmo com o grau de diferenciação: 100% dos tumores difusos foram classificados

como pouco diferenciados. Já os tumores intestinais foram classificados quanto ao

grau de diferenciação da seguinte forma: 71,4% como moderadamente

diferenciados e 28,6% como bem diferenciados (p<0,00001). Os tumores difusos

também apresentaram uma freqüência maior de envolvimento linfonodal (26,3%) em

comparação com os tumores intestinais, embora não tenha sido encontrada uma

relação significativa entre estas duas variáveis (p=0,099). Com relação ao tipo

macroscópico, houve um aumento da freqüência das formas elevadas nos tumores

intestinais: neste grupo 30,95% dos tumores foram elevados e 69,05% deprimidos,

em comparação com 2,6% de tumores elevados e 97,4% de tumores deprimidos nos

tumores difusos (p=0,001) (tabela 2).

Tabela 2-Relacão entre o tipo histológico de Laurén e o aspecto macroscópico do

tumor.

Tipo difuso Tipo intestinal Total

Tumor elevado 1 (7,1%) 13 (92,9%) 14 (100%)

Tumor deprimido 37 (56,1%) 29 (43,9%) 66 (100%)

Total 38 (47,5%) 42 (52,5%) 80(100%)

O grau de diferenciação tumoral também apresentou associação com o tipo

macroscópico: nos três tipos possíveis de tumores com relação ao grau de

diferenciação houve predomínio das formas deprimidas, porém houve uma maior

freqüência de tumores elevados nos tipos bem diferenciados e moderadamente

diferenciados em relação aos poucos diferenciados (p=0,002) (tabela 3).

Tabela 3-Freqüência dos tipos macroscópicos encontrados com relação ao grau de

diferenciação tumoral.

TUMORES ELEVADOS TUMORES DEPRIMIDOS Total

G1 5 (38,5%) 8 (61,5%) 13 (100%)

G2 8 (26,7%) 22 (73,3%) 30 (100%)

G3 1 (2,7%) 36 (97,3%) 37 (100%)

Total 14 (17,5%) 66 (82,5%) 80 (100%)

Nos pacientes com tumores restritos à mucosa foram encontrados 19

adenocarcinomas do tipo intestinal (51,4%) e 18 do tipo difuso (48,6%). Já no grupo

dos tumores até a submucosa, foram encontrados 20 (46,5%) carcinomas difusos e

23 (53,5%) carcinomas intestinais. No subgrupo dos tumores intramucosos houve

predomínio dos tumores pouco diferenciados, respondendo por 48,6% destes (18

casos), com cerca de 24,3% sendo tumores bem diferenciados ( 9 casos ) e 27% de

tumores moderadamente diferenciados (10 casos). Enquanto isso nos tumores

submucosos, encontramos 3 tumores G1 (7,0%), 20 G2 (46,5%) e 20 tumores G3

(46,5%).

5.3 MORFOLOGIA DA LESÃO

Com relação ao aspecto macroscópico do tumor, optamos por agrupa-los em

dois grupos principais, com relação ao componente predominante e suas

implicações prognósticas: tumores elevados ou deprimidos. Em ambos os grupos

predominaram tumores cujo aspecto macroscópico da lesão era deprimido. No total

de 80 pacientes apenas 14 (17,5%) lesões eram elevadas, enquanto 66 (82,5%)

eram deprimidas.

Além da relação estatisticamente significativa encontrada entre o tipo

macroscópico, o tipo histológico de Laurén e o grau de diferenciação já citada, o tipo

macroscópico também apresentou relação significativa com a localização do tumor.

No terço superior do estômago houve predomínio das formas elevadas (66,66% x

34,44%), enquanto nos dois terços distais houve predomínio das formas deprimidas

(84,44% x 16,66%) (p=0,022) (tabela 4). Porém devemos ressaltar que o número de

tumores localizados no terço superior em nossa série foi muito pequeno, sendo

apenas três, o que dificulta a valorização desse resultado.

Tabela 4-relação entre o aspecto macroscópico do tumor e a localização.

Localização Tumor elevado Tumor deprimido Total

Terço superior 2 (14,3%) 1 (1,5%) 3 (3,8%)

Dois terços distais

12 (85,7%) 65 (98,5%) 77 (96,3%)

Total 14 (100%) 66 (100%) 80 (100%)

5.4 LOCALIZAÇÃO DA LESÃO

Com relação a localização dos tumores, os tumores foram divididos em quatro

grupos: o grupo dos tumores localizados no terço inferior, o grupo dos tumores

localizados no terço médio, o dos tumores localizados nos terços médio-inferior, e o

dos localizados no terço superior. O local de ocorrência mais freqüente foi o terço

inferior do estômago: 39 casos (48,8%) estavam situados nesta topografia, 23

(28,8%) tinham localização médio-inferior, 15 (18,8%) estavam situados no terço

médio e apenas 3 casos (3,8%) no terço superior. Optamos por agrupar os tumores

em dois grupos principais: os localizados no terço superior e os localizados nos dois

terços distais. Além da relação significativa do ponto de vista estatístico entre a

localização tumoral e o tipo macroscópico, também encontramos relação entre a

localização dos tumores e a sobrevida em 5 anos. Os tumores do terço superior do

estômago apresentaram uma sobrevida menor em 5 anos: 33,3% em comparação

com a sobrevida encontrada para os tumores do resto do órgão (82,8%) (p=0,034)

(tabela 5). Novamente ressaltamos o fato de termos encontrado somente três

tumores no terço superior.

Tabela 5-Relação entre a localização tumoral e a sobrevida em 5 anos.

Localização Vivo após 5 anos Morto após 5 anos Total

Terço superior 1 (33,3%) 2 (66,7%) 3 (100%)

Dois terços distais 53(82,8%) 11(17,2%) 64 (100%)

Total 54(19,4%) 13 (80,6%) 67 (100%)

Nos tumores intramucosos foi encontrada a seguinte distribuição: 15 tumores

no terço inferior (40,5%), 12 médio-inferior (32,4%), 10 no terço médio (27%) e

nenhum no terço superior (0%). Entre os tumores até submucosa 24 estavam

situados no terço inferior (55,8%), 11 médio-inferior (25,63%), 5 no terço médio

(11,6%) e 3 no terço superior ( 7%).

5.5 METÁSTASES PARA LINFONODOS

Apenas 15 pacientes (18,8%) apresentavam metástases para linfonodos no

momento da cirurgia. A variável linfonodo não apresentou relação significativa do

ponto de vista estatístico quando comparada com as demais variáveis.

Quando dividiu-se os pacientes em dois grupos, foram encontrados os

seguintes resultados: no grupo dos tumores intramucosos este número foi de 4

(10,8%) , aumentando para11 no grupo dos tumores submucosos ( 25,6% ).

5.6 TAMANHO TUMORAL

Os casos foram analisados tanto com relação ao tamanho de cada tumor

isoladamente, assim como também foram agrupados como tumores com até 4cm no

seu maior eixo e tumores com mais de 4cm. Quando se comparou o tamanho

tumoral com as demais variáveis, encontramos relação entre este e a idade dos

pacientes (já citado anteriormente ) apenas.

5.7 p53

Dos 80 casos estudados 22 pacientes (27,5%) apresentaram positividade

para a p53 pela técnica empregada, distribuídos da seguinte forma entre os dois

grupos: 9 pacientes entre os 37 nos tumores intramucosos ( 24,3% ) e 13 pacientes

entre os tumores submucosos (30,2%).

Inicialmente comparou-se o p53 com as demais variáveis nos 80 pacientes

estudados, independente de serem limitados à mucosa ou submucosa, e foi

encontrada diferença estatística significante apenas quando comparada a p53 com o

tipo macroscópico, o tipo histológico de Lauren e o grau de diferenciação. A

positividade da p53 foi encontrada com freqüência maior no tipo intestinal (18 casos

com imunohistoquímica positiva – 81,8% dos casos p53 positivos) em comparação

com a positividade da p53 encontrada no tipo difuso (4 casos apenas,

correspondendo a 18,2% dos casos p53 positivos), com significado estatístico

(p=0,003) (tabela 6).

Tabela 6-Frequência da positividade da p53 conforme o tipo histológico de Laurén

P53 Intestinal Difuso Total

Positivo 18 (81,8%) 4 (18,2%) 22 (100%)

Negativo 24 (41,4%) 34 (58,6%) 58 (100%)

Total 42 (52,5%) 38 (47,5%) 80 (100%)

Com relação ao grau de diferenciação, a positividade da p53 foi encontrada

com frequência maior no tipo bem diferenciado (em 6 casos - 46,15% dos casos

bem diferenciado), seguido do tipo moderadamente diferenciado (12 casos positivos-

40% dos casos moderadamente diferenciados) , sendo o grupo com frequência

menor o do tipo pouco diferenciado ( apenas 4 casos com imunohistoquímica

positiva- 10,8% dos casos pouco diferenciados)(tabela 7). Esta relação da

imunoexpressão da p53 com o grau de diferenciação apresentou significado

estatístico (p=0,007).

Tabela 7-Relação entre o grau de diferenciação tumoral e a positividade da p53

A comparação do aspecto macroscópico do tumor com a imunopositividade

do tumor para a p53 mostrou que esta foi encontrada com freqüência maior nas

formas elevadas em relação às formas deprimidas. Nos tumores do tipo elevado (14

casos ao todo) sete casos (50%) apresentaram imunohistoquímica positiva para a

p53, em comparação com 15 casos (22,7%) em um total de 66 tumores deprimidos

(p=0,038) (tabela 8).

P53 G1 G2 G3 Total

Negativa 7 (12,1%) 18 (31%) 33 (56,9%) 58 (100%)

Positiva 6 (27,3%) 12 (54,5%) 4 (18,2%) 22 (100%)

Total 13 30 37 80(100%)

Tabela 8-Relação entre a positividade da p53 e o tipo macroscópico.

P53 Elevados Deprimidos Total

Negativa 7 (50%) 51 (77,3%) 58 (72,5%)

Positiva 7 (50%) 15 (22,7%) 22 (27,5%)

Total 14 (100%) 66 (100%) 80(100%)

Embora não tenha sido encontrada relação significativa do ponto de vista

estatístico entre a p53 e o tamanho tumoral, houve uma tendência a uma maior

positividade da p53 nos tumores até 4 cm (p=0,084).

No grupo dos tumores intramucosos (tabela 9), quando comparada a

positividade da p53 com as variáveis tipo histológico de Laurén, grau de

diferenciação, sexo, ocorrência de metástases linfonodais, tamanho e localização do

tumor, os valores do χ2 encontrados identificaram não haver diferença significativa

quanto a positividade da p53. Porém quando a comparação foi realizada com a

idade dos pacientes, houve diferença significativa: a positividade da p53 foi

encontrada com frequência maior entre os pacientes com mais de 60 anos do que

naqueles com idade até 60 anos. (10,52% e 38,8%, respectivamente) (p=0,044).

Também houve relação entre a positividade da p53 e o tipo macroscópico neste

grupo de pacientes: a positividade da p53 foi encontrada com frequência maior nos

tumores elevados em relação aos tumores deprimidos-60% x 18,75% (p=0,046).

Vale a pena ressaltar que tais achados podem ter sido influenciados pelo

pequeno número de tumores elevados (5 casos neste grupo), dos quais três foram

positivos com relação ao p53 ( totalizando 60% de positividade ).

Já no grupo submucoso (tabela 10) a comparação da positividade do p53 com

as variáveis sexo, localização, metástases para linfonodos, revelou valores do teste

de χ2 que foram considerados não significativos, ou seja, não diferiram quanto a

positividade ou não da p53. Porém quando divididos os tumores com relação ao

tamanho em aqueles com até 4cm no seu maior eixo e aqueles com mais de 4cm, a

positividade da p53 foi encontrada com frequência maior no grupo dos tumores com

até 4cm (52,17% x 5,26%) (p=0,001). A comparação da positividade do p53 com o

grau de diferenciação mostrou haver diferença significativa (χ2=15,028) (p=0,001).

Nos tumores G1 100% dos mesmos apresentaram positividade da p53 por

imunohistoquímica, enquanto nos tumores G2 este valor caiu para 45% e nos G3

para 5%. Com relação ao tipo histológico também foi encontrada diferença

estatística pelo teste do χ2, observando-se haver maior positividade da p53 no tipo

intestinal (52,2% x 5%, χ2=11,287 e p=0,001) (tabela 11). Também encontramos

relação entre a idade e a positividade do p53: a mesma foi maior na parcela dos

pacientes com até 60 anos (45%), em comparação com os pacientes com mais de

60 anos (17,4%) (p=0,049).

Tabela 9-relação dos casos p53 dentre os tumores limitados a mucosa.

Paciente Sexo Idade local Tamanho (cm) Morfologia

Histologia Diferenciação

Celular

Linfonodos

1 M 70 inf 5,0 IIc +III Difuso G3as +

2 M 86 m-inf 5,0 I Intestinal G1 -

3 M 59 inf 3,5 III Intestinal G2 -

4 F 74 med 4,5 I Intestinal G1 -

5 F 82 med 4,0 IIc + III Difuso G3 -

6 F 84 inf 5,0 IIc Difuso G3as -

7 M 61 med 2,4 IIa Intestinal G1 -

8 M 77 inf 5,0 IIc Intestinal G2 -

9 M 51 m-inf 8,0 IIc+III Intestinal G2 -

Tabela 10-relação dos casos p53 positivos dentre os tumores submucosos

Paciente Sexo Idade Local Tamanho Morfologia Histologia Diferenciação

Celular

Linfonodos

1 F 72 Inf 3,2 I Intestinal G2 +

2 M 51 m-inf 2,0 III Intestinal G2 -

3 F 58 Inf 3,4 IIc Difuso G3 +

4 M 78 Sup 3,0 IIa Intestinal G2 -

5 M 58 Sup 1,2 I Intestinal G1 -

6 M 57 Inf 2,6 I Intestinal G1 -

7 M 77 m-inf 3,5 III Intestinal G1 +

8 F 53 Inf 2,5 IIc Intestinal G2 -

9 F 44 Inf 2,5 IIc Intestinal G2 -

10 M 53 Med 3,5 III + IIc Intestinal G2 -

11 M 39 Med 2,0 IIc + III Intestinal G2 -

12 F 55 Inf 2,5 III Intestinal G2 -

13 F 75 Inf 5 IIc+III Intestinal G2 -

Tabela 11–Comparação do tipo histológico de Laurén com a positividade da p53 nos

tumores submucosos.

Tipo histológico de Laurén

p53 positiva p53 negativa

Intestinal 12 pacientes 11 pacientes

Difuso 1 paciente 19 paciente

5. 8 SOBREVIDA

Dos 80 pacientes estudados a sobrevida em 5 anos só foi estudada em

apenas 67 pacientes (81,25%). Os demais 13 pacientes não puderam ser

acompanhados por pelo menos 5 anos. Dos 80 pacientes incluídos no estudo, 15

evoluíram para óbito, sendo que 13 destes antes de completarem 5 anos de cirurgia,

e 2 pacientes após este período. As causas de óbito foram variadas, sendo 5 casos

devidos a complicações no pós-operatório ( 2 casos de deiscência de sutura, 1 caso

de abscesso retroperitoneal com sepse, hemoperitônio, 1 caso de morte súbita no

terceiro dia de pós-operatório). Dois pacientes faleceram com menos de cinco anos

de follow up devido a segundo tumor primário (adenocarcinoma de cabeça de

pâncreas e carcinoma epidermóide de cordas vocais). As causas dos demais óbitos

foram as seguintes׃

-1 paciente falecido por TCE após 19 meses de cirurgia;

-1 paciente por tamponamento cardíaco, cerca de 17 meses após a cirurgia;

-1 paciente falecido cerca de 2 anos e meio após a cirurgia, tendo sido

constatada presença de massa epigástrica ao exame físico, tendo realizado

ultrassonografia abdominal que foi normal, evoluindo para óbito antes que a

investigação pudesse ser estendida;

-1 paciente evoluiu para óbito com quase 5 anos e 10 meses de seguimento

pós-cirúrgico devido a estrongiloidíase disseminada;

-1 paciente evoluiu para óbito após 8 anos e 6 meses de seguimento, devido

a complicações no pós-operatório de colecistectomia eletiva, evoluindo no terceiro

dia de pós-operatório com insuficiência respiratória e óbito;

-1 paciente evoluiu para óbito com dias de seguimento devido a complicações

da cirurgia: peritonite e sepse abdominal;

-1 paciente deu entrada na emergência do hospital em parada cardio-

respiratória, evoluindo para óbito, não sendo possível identificar a causa. Vinha em

acompanhamento ambulatorial, sem sinais de recidiva da doença. Havia sido

submetida a tratamento cirúrgico para o tumor gástrico há aproximadamente 1 ano e

10 meses.

-1 paciente evoluiu para óbito após ter sido atendido no hospital com quadro

de ascite, tendo o exame citopatológico do líquido ascítico revelado adenocarcinoma

metastático. A tomografia omputadorizada de abdome revelava múltiplas lesões

hepáticas, evoluindo em três dias para óbito (faltavam apenas 5 dias para que o

paciente completasse 5 anos de cirurgia)

Dos 67 pacientes que não haviam a princípio falecido após 5 anos de

seguimento,13 casos haviam sido perdidos ao longo deste período e 54 estavam

vivos. Desta forma a sobrevida em 5 anos foi de 80,59%, sendo de 78,57% para

tumores intramucosos e 81,48% para tumores submucosos. Nenhuma das mortes

ocorreu sabidamente por recidiva da doença, podendo ser questionada apenas em 2

pacientes (o que apresentava massa epigástrica ao exame físico e o que

apresentava adenocarcinoma metastático para peritônio), os quais apresentavam

tumores submucosos. As demais mortes ocorreram por causas não diretamente

relacionadas à doença de base.

Houve um total de 15 óbitos, sendo sete casos entre os tumores intramucosos

(1caso por causa não identificada, 2 óbitos por sepse, 1 óbito por TCE, 1 óbito por

estrongiloidíase disseminada e 2 por desenvolvimento de segundos tumores

primários, os quais evoluíram ) e 8 entre os tumores submucosos ( 1 óbito por

tamponamento cardíaco, 4 por complicações no pós-operatório precoce, 1 no pós-

operatório de outra cirurgia eletiva, 1 por causa não conhecida, 1 caso por

adenocarcinoma metastático e 1 caso com massa epigástrica com ultrassonografia

abdominal normal).

Quando comparados separadamente os pacientes com imunohistoquímica

positiva para a p53 com os com imunohistoquímica negativa, excluindo-se os casos

perdidos, encontrou-se uma sobrevida em 5 anos de 81,3% e de 83,7%,

respectivamente. A sobrevida foi semelhante nos dois grupos, como pode ser

viasualizado pela curva de Kaplan – Meyer, não sendo demonstrada nenhuma

relação estatisticamente significativa entre esta variável e as demais.

Survival Functions

TEMPO DE SEGUIMENTO

2001000-100

Cum Survival

1,02

1,00

,98

,96

,94

,92

,90

,88

,86

,84

P53

1,0

1,0-censored

,0-censored

Figura 2-curva de Kaplan-Meyer mostrando as curvas de sobrevida muito semelhantes entre

os pacientes com tumores p53 positivos e p53 negativos. Cum Survival = sobrevida

acumulada; survival functions= funções de sobrevida; censored=censurado.

6 DISCUSSÃO

A mutação do gene p53 é um evento precoce na carcinogênese gástrica,

podendo ocorrer no adenocarcinoma gástrico precoce e em lesões precursoras de

tumores gástricos. No presente trabalho encontrou-se que 27,5 % dos tumores

gástricos precoces apresentavam positividade para a p53 no tecido, sendo este

número de 30,2% nos tumores até submucosa e 24,3% nos tumores restritos à

mucosa. Este resultado é compatível com os resultados da literatura, em que a

freqüência da positividade da p53 é variável (relatos variam entre 21,3 a 60%).

Os resultados não demonstraram nenhuma relação entre a positividade da

imunohistoquímica para a p53 (assumindo-se que a mesma é igual à ocorrência da

mutação do gene p53) e as variáveis que poderiam configurar implicação

prognóstica da mesma, que seriam a ocorrência de metástase para linfonodos , a

sobrevida em 5 anos e a sobrevida livre de doença. Porém o fato de estudar uma

doença onde a sobrevida em 5 anos é alta, e a morte por doença é um fenômeno de

baixa ocorrência, pode ter influenciado os resultados obtidos. Possivelmente seria

necessária uma casuística muito maior para que se pudesse encontrar uma relação

estatisticamente significante. As implicações prognósticas da mutação do p53 são

relatadas e demonstradas na literatura (XIANGMING, 1999; OIWA, 1995;

MAEHARA, 2000, 2001; NODAA, 2001), e a taxa de recorrência pode aumentar

consideravelmente quando o período de seguimento dos pacientes é longo.

Encontrou-se que a ocorrência de mutação da p53 esteve relacionada na

nesta série com o tipo histológico de Laurén e o grau de diferenciação, sendo mais

freqüente no tipo intestinal de Laurén e no tipo bem diferenciado. Essa freqüência

aumentada da mutação do p53 no tipo intestinal é descrita na literatura, e também é

relatada na série de Sud e de Wang (WANG, 2001). Segundo Tahara a mutação do

p53 estaria incluída no grupo das alterações genéticas que são encontradas na

progressão tumoral dos dois tipos de Laurén, em momentos diferentes. Segundo os

achados de Wu (2000) o que poderia ser diferente seria o momento da ocorrência

da mutação nos dois tipos, sendo um evento mais precoce no tipo intestinal e mais

tardio no tipo difuso (ocorreria com a mesma freqüência dos tumores intestinais

tanto precoces como avançados, sendo encontrada nos tumores difusos avançados

com freqüência maior do que nos precoces). Também poderia significar uma

evolução do tipo intestinal para o tipo difuso durante a carcinogênese gástrica. O

presente estudo abrange apenas tumores gástricos precoces, permitindo somente

concluir que a mutação no câncer gástrico precoce é encontrada com freqüência

maior no tipo intestinal de Laurén.

Também foi encontrada relação entre a mutação do p53 e o tipo

macroscópico do tumor, ocorrendo com freqüência maior nos tumores elevados. Os

achados diferem de relatos prévios de Sasaki e Kyokane, que encontraram maior

prevalência de mutação do p53 nas formas deprimidas de tumor gástrico precoce.

Na presente série de um total de 80 pacientes, 14 tumores foram considerados

elevados (destes 14 tiveram imunohistoquímca positiva-50%-e 14 negativa), em

comparação com os 66 restantes, que foram predominantemente deprimidos (destes

apenas 15-22,7%-tiveram imunohistoquímica positiva). Embora os dados difiram dos

relatos prévios, foram considerados representativos, dada a menor prevalência dos

tumores elevados e o valor de p encontrado no teste qui-quadrado (p=0,038).

Com relação ao fato de não ter sido encontrada relação estatisticamente

significante entre a imunopositividade do p53 e o tamanho tumoral, e sim apenas

uma tendência a maior positividade no grupo dos tumores até 4 cm, esse achado

pode estar relacionado à maior prevalência de imunopositividade do p53 no tipo

intestinal, sabendo-se que a frequência do tipo intestinal aumenta com a diminuição

das dimensões do câncer gástrico precoce. Ou seja, no grupo dos tumores menores

é mais freqüente o tipo intestinal de Laurén, sendo a positividade do p53 mais

freqüente neste último.

A comparação das variáveis entre si revelou a relação entre o tipo histológico

de Laurén e o grau de diferenciação com o aspecto macroscópico do tumor, além

obviamente da relação existente entre o tipo de Laurén e o grau de diferenciação: o

aumento da freqüência dos tumores elevados nos tumores intestinais em relação

aos difusos e a maior freqüência de tumores elevados nos tumores bem e

moderadamente diferenciados. Tais achados permitem concluir que nesta amostra

os tumores que são classificados tanto como intestinais, moderadamente ou bem

diferenciados, e macroscopicamente elevados, têm uma probabilidade maior de

terem imunohistoquímica positiva para a p53. Estes tumores frequentemente

originam-se de lesões precurssoras ( metaplasia intestina, displasia), podendo a

mutação do p53 estar presente desde estes estágios iniciais, o que poderia estar

relacionado a existência de um processo inflamatório crônico na topografia da lesão,

no qual poderia estar implicada também a infecção por H. pylori. Tal processo

crônico levaria a proliferação celular aumentada, o que poderia estar implicado no

aumento do número de células, e no aparecimento de lesões elevadas com

frequência maior neste tipo de Laurén. Li e cols ( 2005) demonstraram que a

infecção por H. pylori está associada a aumento da freqüência da mutação do p53

no câncer gástrico, além do aumento da freqüência do achado de instabilidade

microssatélite nestes tumores. A maioria dos tumores com alta instabilidade

microssatélite e infecção pelo H. pylori apresentavam imunoexpressão para p53,

enquanto esta não foi encontrada em nenhum tumor com instabilidade microssatélite

sem detecção do H. pylori.

O predomínio dos tumores elevados no terço superior do estômago, embora

diante do pequeno número de tumores nesta topografia, apresenta coerência com o

achado de maior freqüência de positividade do p53 nos tumores elevados, e o relato

da literatura de achado mais freqüente de tumores p53 positivos nesta topografia

(FLEJOU, 1999), embora não se tenha conseguido demonstrar relação entre a

positividade da imunohistoquímica para p53 e a localização do tumor.

Os pacientes com tumores localizados no terço superior do estômago

apresentaram uma sobrevida em 5 anos menor do que os tumores localizados no

restante do órgão, configurando um pior prognóstico para os tumores localizados

nesta topografia, embora não se tenha conseguido estabelecer uma relação entre a

localização tumoral e o acometimento de linfonodos. O baixo número de tumores

nesta topografia na presente amostra inviabiliza a valorização deste achado.

Na literatura não encontramos evidências de relação entre a idade dos

pacientes e o tamanho tumoral, como foi encontrado entre os pacientes. A idade já

foi relacionada com o tipo macroscópico de tumor, o tipo histológico de Laurén e

também com a imunopositividade da p53, o que não consegui-se demonstrar no

presente trabalho.

7 CONCLUSÕES

-a positividade da p53 no câncer gástrico precoce não apresentou implicação

prognóstica;

-a mutação do p53 é mais frequente no tipo intestinal de Laurén, nos tumores

moderadamente e bem diferenciados e nos tumores elevados. A frequência

aumentada da positividade da p53 no câncer gástrico precoce do tipo intestinal pode

estar relacionada à ocorrência mais precoce da mutação do p53 nestes tumores em

relação ao tipo difuso.

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10 ANEXOS

ANEXO A- Associações realizadas entre as variáveis e valores dos testes não-

paramétricos de χ2 e nível p de significância.

Associações χ2 P valor

Tamanho x idade 4,108 0,043

Tamanho x localização 0,251 0,616

Tamanho x aspecto macroscópico 0,043 0,837

Tamanho x sobrevida 1,867 0,172

Tamanho x grau de diferenciação 0,774 0,679

Tamanho x acometimento linfonodal 0,005 0,943

Sexo x localização tumoral 2,820 0,093

Sexo x tipo de Lauren 0,764 0,382

Sexo x grau de diferenciação 1,375 0,503

Sexo x acometimento linfonodal 0,252

0,616

Sexo x sobrevida em 5 anos 1,227 0,268

Sexo x aspecto macroscópico 0,147 0,702

Sexo x idade 0,045 0,832

Sexo x tamanho tumoral 1,749 0,186

Grau de diferenciação x acometimento linfonodal 2,860 0,239

Grau de diferenciação x aspecto macroscópico 12,419 0,002

Localização x tipo de Lauren 2,820 0,093

Localização x grau de diferenciação 2,886 0,236

Localização x acometimento linfonodal 0,719 0,396

Localização x sobrevida em 5 anos 4,486 0,034

Localização x aspecto macroscópico 5,219 0,022

Acometimento linfonodal x sobrevida em 5 anos 0,167 0,683

Acometimento linfonodal x aspecto macroscópico 0,222 0,638

Tipo de Lauren x grau de diferenciação 80,00 0,000

Tipo de Lauren x acometimento linfonodal 2,720 0,099

Tipo de Lauren x sobrevida em 5 anos 0,752 0,386

Tipo de Lauren x aspecto macroscópico 11,083 0,001

Idade x grau de diferenciação 3,639 0,162

Idade x localização 0,297 0,586

Idade x sobrevida em 5 anos 0,062 0,803

Acometimento linfonodal x idade 0,032 0,858

Idade x tipo de Lauren 0,201 0,654

Idade x aspecto macroscópico 0,236 0,627

Tamanho x tipo de Lauren 0,764 0,382

Grau de diferenciação x sobrevida em 5 anos 1,131 0,568

P53 x idade 0,019 0,890

P53 x sexo 0,529 0,467

P53 x localização 2,398 0,121

P53 x aspecto macroscópico 4,309 0,038

P53 x tipo de Lauren 10,459 0,001

P53 x grau de diferenciação 10,889 0,004

P53 x sobrevida em 5 anos 0,045 0,832

P53 x acometimento linfonodal 0,006 0,936

P53 x tamanho tumoral 2,992 0,084

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