ads:
A ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA DE PACIENTES COM
LINFOMA DE HODGKIN REVELA PADRÕES DIFERENCIAIS DE
ACORDO COM O STATUS DO VÍRUS EPSTEIN-BARR
JULIANE GARCEZ MUSACCHIO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
A ANÁLISE PROTEÔMICA COMPARATIVA DE PACIENTES COM
LINFOMA DE HODGKIN REVELA PADRÕES DIFERENCIAIS DE
ACORDO COM O STATUS DO VÍRUS EPSTEIN-BARR
Juliane Garcez Musacchio
Orientadores: Prof. Nelson Spector e Prof.
a
Maria da Glória da Costa Carvalho
Tese submetida ao Corpo Docente do programa de Pós-Graduação em Clínica
Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Doutor em Clínica Médica.
Banca Examinadora:
_______________________________________________
Prof. Dr. José Carlos Oliveira de Morais
_______________________________________________
Prof. Dr. Marcio Luiz Moore Nucci
_______________________________________________
Prof. Dr. Neio Lucio Fernandes Boechat
_______________________________________________
Prof. Dr. Carlos Gil Moreira Ferreira
_______________________________________________
Prof. Dr. José Cláudio Casali da Rocha
Suplentes:
_______________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Gerardin Poirot Land
_______________________________________________
Prof. Dr. Januário Cabral Neto
Rio de Janeiro
Novembro, 2008
ads:
iii
MUSACCHIO, Juliane G.
A análise proteômica comparativa de pacientes com linfoma
de
Hodgkin revela padrões diferenciais conforme o status do vírus
Epstein-Barr/Juliane G. Musacchio. Rio de Janeiro, UFRJ, Faculdade de
Medicina, 2008.
xvi, 122 p., il.
Orientadores: Nelson Spector e Maria da Glória da Costa Carvalho
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Faculdade de Medicina, 2008.
Referências bibliográficas: f.96-122
1. Linfoma de Hodgkin. 2. Herpes vírus humano 4. 3. Proteoma. 4.
DNA viral. 5. Imuno-histoquímica. 6. Hematologia –
Tese. I. Spector,
Nelson. II. da Costa Carvalho, Maria da Glória. III. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina. IV.Título
iv
À memória de meu avô, Garcez
Aos meus queridos pais, Dayse e Nelson
Ao amor da minha vida, Fernando.
v
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, professor Nelson Spector e professora Maria da Glória,
pela nova oportunidade de viabilizar a integração da pesquisa básica com a
pesquisa clínica. Agradeço pelo ensinamento de que a persistência é o fator
fundamental no caminho da pesquisa e de que, uma vez a hipótese elaborada,
deve-se perseguir sempre a resposta.
Agradeço ao professor e amigo Nelson Spector, que contribuiu de forma
intensa na minha formação, pela confiança em mim depositada, pelos
conselhos e ensinamentos fundamentais que irei guardar para a vida inteira.
À professora Maria da Glória, que mais do que uma orientadora, foi uma
grande amiga. Agradeço a sua disponibilidade irrestrita e a sua forma criativa
de argüir as idéias apresentadas.
Ao professor Gilberto Domont, por abrir as portas do seu laboratório para mim
e ser fundamental na realização desta tese.
Aos meus colegas do laboratório do professor Gilberto Domont: aos
pesquisadores Juliana Fischer pela amizade e paciência de ensinar a uma
simples clínica os fundamentos da técnica proteômica, Carlos Garcia pela
enorme contribuição na análise dos dados e Paulinho pelas sugestões sempre
bem vindas.
Ao querido professor José Carlos Morais a quem tanto admiro, pela revisão das
lâminas.
À querida Dra. Adriana Scheliga, pela ajuda na coleta de dados e de sangue
dos pacientes do INCA.
vi
À Gizele e Debora, funcionárias do Laboratório de Hemostasia, pela grande
ajuda no manuseio das amostras dos pacientes.
À Andréia e Cristina, funcionárias do Departamento de Hematologia, pela
colaboração com os prontuários e o material já coletado.
Aos professores Marcio Nucci e José Claudio da Rocha, pela gentileza em
participarem do exame prévio de qualificação desta tese.
Ao professor Rony Schaffel e à professora Irene Biasoli, pela ajuda e incentivo
constantes.
Aos meus amigos, Dr. Marcio Hori, Dr. Carlos Pizzino, Dr. Antonio Alexandre,
Dr. Jamison Menezes e Dra. Tereza Attem, que no convívio diário vivenciaram
parte da confecção desta tese, e muito contribuíram para a sua realização.
À querida Teresa pelo carinho e dedicação a nós, alunos da pós-graduação.
Aos meus pais, Dayse e Nelson, pela sólida formação dada até minha
juventude, que me proporcionou a continuidade nos estudos até a chegada ao
doutorado, meus eternos agradecimentos.
Ao meu amado Fernando pelo total apoio e carinho, além das opiniões valiosas
para a realização desta tese.
A Deus por tudo.
vii
"Se as coisas são inatingiveis...ora! Não é motivo para não querê-las...
Que tristes os caminhos, se não fora a mágica presença das estrelas."
Mario Quintana
viii
SUMÁRIO
Resumo...............................................................................................xiii
Abstract...............................................................................................xv
1) Introdução.......................................................................................1
2) Revisão de Literatura.......................................................................3
2.1) Evidências epidemiológicas da associação do linfoma de Hodgkin com um
agente infeccioso....................................................................................3
2.2) A biologia do EBV.............................................................................4
2.3) O papel do EBV na patogenia do linfoma de Hodgkin.............................6
2.4) Epidemiologia do linfoma de Hodgkin associada ao EBV.........................7
2.5) Presença do EBV nos gânglios de pacientes com linfoma de Hodgkin.......9
2.6) Presença do DNA do EBV no sangue periférico de pacientes com
neoplasias............................................................................................11
2.7) Presença do DNA circulante do EBV em pacientes com linfoma de
Hodgkin...............................................................................................13
2.8) Proteoma do soro de pacientes com câncer........................................15
2.9) Padrão proteômico em pacientes com doenças linfoproliferativas...........20
2.10) Padrão proteômico em pacientes com linfoma de Hodgkin..................23
3) Objetivos.......................................................................................26
4) Pacientes e Métodos......................................................................27
4.1) Detecção do DNA circulante do EBV no sangue periférico.....................29
4.1.1) Coleta do sangue periférico...........................................................29
4.1.2) Transporte do sangue coletado......................................................30
4.1.3) Processamento do sangue.............................................................30
4.1.4) Extração do DNA..........................................................................30
4.1.5) Técnica de PCR............................................................................31
4.2) Detecção dos produtos virais do EBV no gânglio..................................32
4.2.1) Técnica de imuno-histoquímica no gânglio.......................................32
4.3) Técnica de eletroforese e espectrometria de massa.............................33
4.3.1) Técnica de eletroforese de proteínas em gel bidimensional (2D-E)......33
4.3.2) Digestão por tripsina das proteínas com expressão diferencial............35
ix
4.3.3) Análise por MALDI-TOF e identificação das proteínas.........................36
5) Resultados.....................................................................................39
5.1) Detecção do DNA do EBV no sangue periférico....................................39
5.1.1) Detecção do DNA do EBV no sangue periférico dos pacientes com
linfoma de Hodgkin................................................................................39
5.1.2) Detecção do DNA do EBV no sangue periférico dos controles
saudáveis.............................................................................................41
5.2) Seleção dos pacientes com linfoma de Hodgkin para a análise
proteômica...........................................................................................41
5.2.1) Características dos pacientes com linfoma de Hodgkin não-associado ao
EBV.....................................................................................................42
5.2.2) Características dos pacientes com linfoma de Hodgkin associado ao
EBV.....................................................................................................42
5.3) Seleção do grupo controle para a análise proteômica...........................43
5.4) Análise proteômica em gel bidimensional (2D-E).................................43
6) Discussão......................................................................................54
6.1) Importância do estudo....................................................................54
6.2) Definição do status EBV positivo e EBV negativo.................................54
6.3) Proteínas com expressão aumentada no “pool” de soro dos pacientes com
linfoma de Hodgkin não-associado ao EBV................................................56
6.3.1) Fator B do complemento...............................................................56
6.3.2) Inibidor da inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4...............................58
6.3.3) Haptoglobina...............................................................................59
6.4) Proteínas com expressão aumentada no “pool” de soro dos pacientes com
linfoma de Hodgkin associado ao EBV.......................................................62
6.4.1) Hemopexina................................................................................62
6.4.2) Alfa-1B glicoproteína....................................................................63
6.4.3) Alfa-1 antiquimotripsina................................................................64
6.5) Proteínas com expressão diminuída no “pool” de soro dos pacientes com
linfoma de Hodgkin................................................................................66
6.5.1) Plasminogênio.............................................................................66
6.5.2) Cadeias beta e gama do fibrinogênio..............................................67
x
6.6) Proteínas diferencialmente expressas entre os dois grupos de pacientes
com linfoma de Hodgkin.........................................................................68
6.7) Limitações do estudo.......................................................................70
6.8) Perspectivas..................................................................................71
7) Conclusões.....................................................................................72
8) Anexos...........................................................................................73
8.1) Anexo 1 - Ficha de dados clínicos de pacientes com LH........................73
8.2) Anexo 2 – Termo informativo...........................................................78
8.3) Anexo 3 – Termo de consentimento livre e informado..........................79
8.4) Anexo 4 – Identificação de proteínas pelo Matrixscience.......................80
9) Referências bibliográficas..............................................................96
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
LH – linfoma de Hodgkin
EBV – vírus Epstein-Barr (“Epstein-Barr virus” )
RS – Reed-Sternberg
LNH – linfoma não-Hodgkin
LMP-1 – proteína latente de membrana-1 (“latent membrane protein-1”)
EBER – RNA não-poliadenilado (“Epstein-Barr encoded RNA”)
PCR – reação em cadeia pela polimerase (“polymerase chain reaction”)
RT-PCR – reação em cadeia pela polimerase em tempo real (“real time -
polymerase chain reaction”)
HIV – vírus da imunodeficiência humana (“human immunodeficiency virus”)
SIDA – síndrome da imunodeficiência adquirida
LES – lúpus eritematoso sistêmico
Gel 2D-E – eletroforese em gel bidimensional
pI – ponto isoelétrico
MM – massa molecular
xii
LLC-B – leucemia linfocítica crônica de células B
IFN – interferon
TNF – fator de necrose tissular (“tissue necrosis factor”)
NF–κB – fator nuclear kappa-B (“nuclear factor kappa-B”)
IL-6 – interleucina-6
IL-10 – interleucina-10
CFB – fator B do complemento (“complement factor B”)
ITIH4 – inibidor de inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4 (“inter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain H4”)
HP – haptoglobina
HPX – hemopexina
A1BG – alfa-1B glicoproteína
SERPINA3 – alfa-1 antiquimotripsina
PLG – plasminogênio
FGB – cadeia beta do fibrinogênio (“fibrinogen beta chain”)
FGG – cadeia gama do fibrinogênio (“fibrinogen gamma chain”)
xiii
RESUMO
Objetivos
O vírus Epstein-Barr (EBV) está freqüentemente associado ao linfoma de
Hodgkin (LH). O objetivo deste estudo foi identificar e analisar proteínas
diferencialmente expressas no soro de pacientes com LH conforme o status
do EBV.
Pacientes e Métodos
Trinta pacientes com LH recém-diagnosticado foram estudados, assim como
um grupo controle composto por 13 indivíduos saudáveis. O DNA do EBV no
plasma foi determinado pela PCR convencional. A presença do EBV no
gânglio envolvido pelo LH foi avaliada pela técnica de imuno-histoquímica.
Foram considerados como pacientes com LH não-associado ao EBV aqueles
que apresentavam negatividade para o EBV nos seguintes materiais
biológicos: “buffy coat”, plasma e gânglio. Diferentemente do grupo
anterior, foram considerados pacientes com LH associado ao EBV aqueles
pacientes com positividade em 2 dos 3 materiais biológicos estudados,
sendo obrigatória a presença do DNA livre circulante do EBV no plasma. Os
pacientes com positividade para o HIV foram excluídos. Para o “pool” do
grupo controle, foram selecionados, dentre os indivíduos saudáveis, aqueles
sem a presença do DNA do EBV no “buffy coat” e no plasma. Os pacientes
com LH foram então divididos em dois grupos: LH não-associado ao EBV
(n=9) e LH associado ao EBV (n=7). A identificação das proteínas no soro
xiv
do “pool” dos pacientes com LH e dos indivíduos saudáveis foi realizada pela
técnica de eletroforese em gel bidimensional (2D-E) e MALDI-TOF. Entre os
grupos estudados, as proteínas que apresentaram diferença quantitativa
marginal de duas vezes do seu volume normalizado foram confrontadas
estatisticamente, através do teste t-Student, para rejeição da hipótese nula
de expressão diferencial. Foram consideradas proteínas diferencialmente
expressas aquelas que apresentavam p valor<0,05.
Resultados
As proteínas identificadas como fator B do complemento (CFB), inibidor de
inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4 (ITIH4) e haptoglobina (HP) tiveram a
sua expressão aumentada no soro de pacientes com LH não-associado ao
EBV. No soro de pacientes com LH associado ao EBV, houve aumento dos
níveis das proteínas identificadas como hemopexina (HPX), alfa-1B
glicoproteína (A1BG) e alfa-1 antiquimotripsina (SERPINA3). As proteínas
identificadas como cadeia beta do fibrinogênio (FGB) e cadeia gama do
fibrinogênio (FGG) tiveram a sua expressão diminuída no soro de pacientes
com LH associado ao EBV. Por fim, o plasminogênio teve a sua expressão
diminuída no soro de pacientes com LH, independente do status do EBV.
Conclusões
Dois padrões proteômicos distintos foram identificados no soro de pacientes
com LH conforme o status do EBV.
xv
ABSTRACT
Objectives
Epstein-Barr virus (EBV) is often present in patients with Hodgkin's
lymphoma (HL). The purpose of this study was to identify and analyze
differentially expressed proteins in pooled sera from patients with HL
according to their EBV status.
Material and Methods
Thirty patients with newly diagnosed HL were studied. The control group
consisted of 13 healthy adult volunteers. EBV DNA in plasma was
determined by conventional PCR. Immunohistochemistry was performed to
detect EBV on paraffin-embedded tissues. Patients with HL and no EBV in
the buffy coat, plasma and lymph node were considered as not associated
with EBV. Conversely, patients with EBV associated HL should have EBV in
two of three biological materials, and free circulating EBV DNA in plasma
was mandatory. HIV-positive patients were excluded. For the control group,
healthy individuals who were EBV-negative in both the buffy coat and
plasma were selected. Pooled sera from patients with EBV-non-associated
HL (n=9), EBV associated HL (n=7) and healthy controls (n=10) were
submitted to bidimensional gel eletrophoresis (2D-E) technique coupled to
MALDI-TOF. Proteins were considered over or underexpressed using the 2-
fold cutoff and p<0.05.
xvi
Results
Six up-regulated proteins were identified in patients with HL: factor B
complement (CFB), inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and
haptoglobin (HP) in the sera from patients with EBV-non-associated HL, and
hemopexin (HPX), alpha-1B glycoprotein (A1BG) and alpha-1
antichymotrypsin (SERPINA3) in the sera from patients with EBV associated
HL. On the other hand, serum fibrinogen beta chain and fibrinogen gamma
chain levels in patients with EBV associated HL were lower than in controls.
Only plasminogen was down-regulated in the two groups of patients,
irrespective of the EBV status.
Conclusions
Comparative proteomics analysis of patients with HL revealed differential
patterns depending on the EBV status.
1
1) INTRODUÇÃO
Desde os relatos de Hodgkin, Sternberg e Reed, houve grande controvérsia
sobre a natureza neoplásica ou infecciosa do linfoma de Hodgkin (LH).
Diversos aspectos epidemiológicos e clínico-patológicos do LH sugeriram que
um agente infeccioso estivesse envolvido na sua etiologia, o que foi
primeiramente observado por MacMahon em 1957.
1
Em 1964, três virologistas, Epstein, Achong e Barr, descreveram, pela
primeira vez, um novo tipo de vírus, que ficou conhecido como vírus Epstein-
Barr (“Epstein-Barr virus”- EBV) através do estudo de microscopia eletrônica
da cultura de linfoblastos dos pacientes com linfoma de Burkitt.
2
No fim da
década de 70, o genoma do EBV foi identificado nas células do linfoma de
Burkitt.
3
No LH, o EBV foi encontrado pela primeira vez por Weiss em 1987.
4
Ironicamente, a descoberta da associação do LH com o EBV ajudou a
demonstrar que se trata realmente de uma doença neoplásica, pois o EBV
encontrado nas células de Reed-Sternberg (RS) é de origem clonal, o que
indica que as células RS se originam de uma população de células infectadas
por um mesmo EBV.
Além da associação com o LH e o linfoma de Burkitt, o EBV tem sido descrito
em associação com outros linfomas não-Hodgkin (LNH). O EBV está presente
nos linfomas associados à síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA),
5,6
nos linfomas pós-transplante,
7,8
nos linfomas primários do sistema nervoso
central,
9
nos linfomas de cavidades,
10
nos linfomas difusos de grandes
células B,
11
nos linfomas linfocíticos / leucemia linfocítica crônica,
12
nos
linfomas anaplásicos,
13
nos linfomas de células “natural killer” / T
2
angiocêntrico nasal,
14,15
linfomas nodais T periféricos
16
e na micose fungóide
sem imunodeficiência.
17
O EBV também foi encontrado em neoplasias não-linfoproliferativas como o
carcinoma nasofaríngeo,
18
o carcinoma de cabeça e pescoço,
19
o carcinoma
indiferenciado de língua,
20
o carcinoma epidermóide de orofaringe,
21
o
carcinoma de esôfago,
22
o adenocarcinoma gástrico,
23
o hepatocarcinoma
24
,
os tumores colorretais,
25
o adenocarcinoma de pulmão,
26
o carcinoma de
pulmão “linfoepitelioma-like”,
27
o leiomiossarcoma associado à
imunossupressão,
28
o carcinoma avançado de mama,
29,30
e mais
recentemente, as lesões de alto grau de cérvix uterino.
31
A identificação de novos biomarcadores pode contribuir para melhor
entendimento das doenças hematológicas neoplásicas e definição do
prognóstico destes pacientes. A técnica proteômica no soro possibilita a
detecção de potenciais biomarcadores tumorais e virais, mas há poucos
estudos em hematologia.
32
Este tema é de grande importância clínico-epidemiológica. Caso se confirme
que o EBV tem realmente um papel como agente causador ou facilitador do
desenvolvimento das referidas neoplasias, a sua eliminação poderá propiciar
a diminuição da incidência destes tumores. Sendo assim, os esforços no
combate ao EBV, entre eles o desenvolvimento de uma vacina, são
plenamente justificados para a possível prevenção de diversas doenças
neoplásicas.
3
2) REVISÃO DA LITERATURA
2.1) EVIDÊNCIAS EPIDEMIOLÓGICAS DA ASSOCIAÇÃO DO LINFOMA
DE HODGKIN COM UM AGENTE INFECCIOSO
Desde a sua primeira descrição por Thomas Hodgkin, em 1832,
33
os
aspectos clínicos do LH levaram muitos médicos a suspeitar de uma causa
infecciosa. A febre freqüente, por vezes em ciclos recorrentes (febre de Pel-
Ebstein), a sudorese profusa e a linfadenomegalia progressiva, em adultos
jovens previamente saudáveis, pareciam estar associados a uma doença de
origem infecciosa.
O próprio Thomas Hodgkin pensou ser mais provável se tratar de um tipo de
hipertrofia do sistema linfático do que de uma forma de câncer.
34
Outras
figuras importantes na discussão sobre a etiologia do LH foram Karl
Sternberg, que acreditava ser uma forma de tuberculose, e Dorothy Reed,
que pensava, assim como Hodgkin, se tratar de um processo inflamatório
mais do que um tipo de neoplasia.
34-36
Como resultado, a literatura está repleta de publicações científicas sobre as
suspeitas de causas infecciosas do LH. Na primeira parte do século 20, foram
descritos possíveis agentes etiológicos como o Bacillus hodgkini e o
Corynebacterium granulomatis maligni.
37,
38
No entanto, o marco dos estudos epidemiológicos sobre o LH foi a
observação da existência de uma curva bimodal de idade com dois picos de
incidência, feita por MacMahon em 1957. Ao avaliar os registros de 573
pacientes com LH residentes no Brooklyn, em Nova Iorque, MacMahon
observou que o primeiro pico de incidência era dos 25 aos 29 anos e o outro
após os 50 anos, atingindo o máximo em torno dos 70 anos.
1
4
Para explicar este padrão epidemiológico incomum, foi levantada a hipótese
da existência de etiologias distintas que justificassem a ocorrência de dois
picos de incidência da doença. Os casos em crianças e jovens poderiam estar
associados a um agente infeccioso, o que levou a um questionamento da
natureza neoplásica do LH nesta faixa etária.
39
Outras contribuições para a hipótese da relação entre infecção e LH foram os
estudos realizados nos anos 70, que correlacionaram a mononucleose
infecciosa com o LH. Em uma grande coorte de pacientes com diagnóstico de
mononucleose infecciosa foi demonstrado um aumento do risco global de
câncer, particularmente de linfomas, e em especial de LH.
40
Outros estudos utilizando sorologia para os vírus Epstein-Barr,
citomegalovírus e herpes foram realizados em pacientes com LH e
evidenciaram que estes pacientes, por ocasião do diagnóstico, apresentavam
títulos de anticorpos anti-EBV bem mais elevados do que seus controles,
enquanto a sorologia para outros vírus não diferia em relação aos
controles.
41-43
Atualmente, o EBV tem sido intensamente estudado como um agente
causador do LH, levando muitos autores a acreditar realmente que este vírus
tenha um importante papel no seu desenvolvimento.
2.2) A BIOLOGIA DO EBV
O EBV, um vírus de DNA, é um membro da família herpesviridae, sendo
conhecido também como herpes vírus humano 4. A infecção pelo EBV é
generalizada na espécie humana, sendo a prevalência em adultos maior do
que 90%.
44
5
O EBV é transmitido através da saliva, de transfusão sanguínea, do
transplante de medula óssea e de órgãos sólidos. A forma mais freqüente de
transmissão se dá por contato íntimo através de secreção oral e a fonte de
infecção mais comum é representada pelos portadores do vírus na
população, que o eliminam de forma intermitente na saliva.
45
Nos países em desenvolvimento e nas classes sociais mais baixas, a infecção
costuma ocorrer na infância devido à exposição precoce ao vírus. Já nos
países industrializados e nas classes sociais mais altas, os indivíduos tendem
a se infectar apenas na adolescência.
44
A maioria das infecções pelo EBV na infância é subclínica ou indistinguível de
outras viroses respiratórias.
46
No entanto, a infecção primária pelo EBV em
adolescentes e adultos jovens se manifesta em 25% a 75% dos casos como
mononucleose infecciosa, uma doença linfoproliferativa aguda e
autolimitada.
47-49
Este vírus apresenta um forte tropismo por linfócitos, e é capaz de
transformar as células B in vitro em um estado de proliferação contínua
chamado imortalização,
50
tal como ocorre com certas células neoplásicas.
O EBV também determina a diferenciação dos linfócitos B em plasmócitos
com grande produção de anticorpos (gamopatia policlonal). Estas alterações
se resolvem em pouco tempo, embora a infecção persista por toda a vida do
indivíduo, durante a qual a taxa de linfócitos transformados é mantida baixa
pelo sistema imune do hospedeiro.
50
Após a resposta específica de células T citotóxicas ao EBV, o vírus estabelece
uma infecção latente durante toda a vida do hospedeiro no compartimento
6
de células B.
51
Estas células latentes podem ocasionalmente ser ativadas e
iniciar uma fase replicativa.
50
2.3) O PAPEL DO EBV NA PATOGENIA DO LINFOMA DE HODGKIN
A detecção de títulos elevados previamente ao diagnóstico do LH contribui
para a evidência de que o EBV esteja envolvido na patogênese do LH.
52, 53
Por outro lado, o EBV não é encontrado em todos os casos de LH. Este fato
pode ser explicado por pelo menos quatro hipóteses. Uma hipótese seria a
existência de outras vias patogênicas da doença independentes do EBV.
54
Uma segunda hipótese seria a presença de outro vírus envolvido na
patogênese dos casos de LH EBV-negativos. Porém, vários estudos falharam
em identificar outros vírus implicados na etiologia da LH.
55-57
Assim, partindo da hipótese de que o EBV seja o único vírus sabidamente
envolvido na patogenia do LH, uma outra explicação seria a limitação da
técnica empregada, através da qual não se conseguiria detectar pequenas
quantidades de genoma viral.
A última hipótese seria que o EBV infecta a célula, altera o DNA de alguma
forma, e é então eliminado, o que deixaria a célula transformada ou
susceptível à transformação neoplásica, mecanismo este conhecido como
“hit-and-run”.
58
Porém, espera-se que esta eliminação do EBV com suas
proteínas imunogênicas ocorra mais freqüentemente em pacientes com
sistema imune ativo, como as pacientes jovens com LH subtipo esclerose
nodular.
59
No entanto, esta última hipótese já foi questionada por vários autores e
recentemente foi demonstrado, através de técnicas sorológicas e moleculares
combinadas, que os casos de LH EBV-negativos têm uma soropositividade
7
para o EBV menor do que o grupo controle. Isto demonstra que muitos
pacientes com LH nunca entraram em contato com o EBV.
60
Tudo indica que,
de fato, o EBV não está relacionado ao LH em uma proporção dos pacientes.
Recentemente, a detecção da associação do EBV com o LH foi facilitada pelo
desenvolvimento de técnicas moleculares que permitem a visualização da
infecção latente do EBV nas células de Reed-Sternberg (RS), as prováveis
células tumorais do LH. Os métodos-padrão de detecção incluem hibridização
in situ para EBERs e imunoperoxidase para LMP-1.
61,
62
Ainda nos anos 90, foi descrita a detecção do genoma do EBV no soro e no
plasma dos pacientes com doenças relacionadas ao vírus, através da técnica
de reação em cadeia pela polimerase (“polymerase chain reaction”- PCR).
63-66
Esta parece ser uma técnica promissora para a detecção do vírus e para um
melhor entendimento da patogênese do LH.
Em suma, o EBV parece ser um cofator da transformação neoplásica do LH,
cujo mecanismo é complexo e pouco entendido, de forma análoga à relação
que existe entre muitos outros vírus e tumores.
2.4) EPIDEMIOLOGIA DO LINFOMA DE HODGKIN ASSOCIADO AO EBV
O LH é um linfoma caracterizado pela presença da célula de Reed-Sternberg
(RS), encontrada em meio a um microambiente composto por células
inflamatórias e fibrose.
34,
67, 68
A diversidade morfológica levou à
classificação de subtipos do LH: predomínio linfocítico nodular, forma clássica
rica em linfócitos, esclerose nodular, celularidade mista e depleção
69
linfocítica.
Os epissomas monoclonais do EBV e os produtos gênicos latentes têm sido
encontrados em 40-50% dos pacientes com LH.
70-72
Além disso, a
8
associação com o EBV difere de acordo com o subtipo histológico, sendo
maior na celularidade mista do que na esclerose nodular, o subtipo mais
67, 71
73, 74
se mantém por até
70, 77
LH não-associado ao EBV. Os
idade.
79, 80
Em contraste, a taxa de incidência estimada no LH
81
, enquanto o LH é mais freqüente em brancos do que em
comum, enquanto que no subtipo predomínio linfocítico é virtualmente
nula.
A evidência sorológica da infecção pelo EBV tem sido associada
prospectivamente com um risco de três a quatro vezes para o
desenvolvimento do LH.
75, 76
Já o antecedente de mononucleose infecciosa
está associado a um risco três vezes maior de LH, que
duas décadas após a infecção, e é mais importante quando o diagnóstico de
mononucleose é feito dos 15 aos 29 anos de idade.
Recentemente, em 2007, Hjalgrim e cols. pesquisaram a história prévia de
mononucleose infecciosa e os fatores sócio-ambientais de 586 pacientes com
LH e 3187 controles. Os autores observaram que a história de mononucleose
infecciosa está realmente relacionada a um aumento da prevalência de LH
associado ao EBV, porém sem relação com o
linfomas associados à mononucleose infecciosa ocorreram após um período
mediano de 2,9 anos a partir da infecção.
78
A incidência do LH é bimodal, com pico em adultos jovens e acima dos 50
anos de
associado ao EBV é mais alta em crianças e pessoas com mais de 70 anos de
idade.
Assim como o LH em geral, a doença EBV-positiva é mais comum em
homens do que em mulheres, principalmente na faixa etária dos 20 aos 49
anos.
71
Porém
9
outras raças étnicas, o LH associado ao EBV é mais comum em não-
brancos.
67, 71
A incidência do LH varia também com a classe sócio-econômica, ocorrendo
em adultos jovens com melhor poder aquisitivo.
67, 82-84
Ao contrário, o risco
ciada ao aumento do risco de LH,
ros linfomas.
90-95
.
96
Logo se postulou que um vírus pudesse ser o indutor da
s de pacientes com LH.
4
Foi então proposto que o genoma do EBV se
de LH associado ao EBV é maior nos países mais pobres, particularmente nas
crianças.
85-89
A infecção pelo HIV também está asso
particularmente uma forma virulenta associada ao EBV, mas em um grau
muito menor do que os out
2.5) PRESENÇA DO EBV NOS GÂNGLIOS DE PACIENTES COM
LINFOMA DE HODGKIN
Somente em 1986 foi possível demonstrar a clonalidade da célula RS em
fragmentos de linfonodos de pacientes com LH. Isto foi realizado através da
detecção do rearranjo clonal do gene da imunoglobulina em tecido de
pacientes com LH
proliferação clonal de células B no LH, devido à imunossupressão gerada pela
própria doença.
No ano seguinte, Weiss e cols. detectaram o DNA do EBV, através da técnica
de hibridização por Southern blot, em quatro de 21 amostras de tecidos
linfóide
integrava às células RS e que este seria o vírus envolvido na patogênese do
LH.
Em seguida, Weiss e cols. utilizaram outra técnica para a detecção do DNA
do EBV em tecidos, a hibridização in situ, que detecta o genoma viral no
interior das células tumorais. Isto trouxe clara vantagem sobre a hibridização
10
por Southern blot, pois nesta o DNA é extraído do tecido, o que não permite
a sua visualização no íntimo dos tecidos. Novamente foi identificado o
54
os
e a técnica era um pouco mais simples do que a
98
9-102
enquanto
103-105
R) e PCR em tempo real (“real time -
genoma viral em três de 16 pacientes estudados (19%), presente
exclusivamente nas células RS.
Na mesma época, foi publicado um estudo no qual foi aplicada uma nova
técnica de detecção do EBV, a imuno-histoquímica. Foram utilizadas
amostras de tecidos congelados, nos quais o EBV foi evidenciado em 40 d
84 casos (48%). A prevalência foi mais alta no subtipo celularidade mista
(96%), enquanto que no subtipo esclerose nodular foi de somente 32%.
97
Em 1992, foi realizada com sucesso a técnica de imuno-histoquímica em
material parafinado. Esta técnica trouxe uma grande vantagem para o
estudo do EBV no LH, já que o material se encontrava disponível em
arquivos de patologia
hibridização in situ. Nos pacientes estudados, o EBV estava presente em 22
dos 46 casos (48%).
A partir de então, vários artigos sobre a prevalência do EBV no LH foram
publicados utilizando-se ambas as técnicas. No entanto, é grande a
variabilidade dos resultados encontrados. Em geral, os países desenvolvidos,
ou seja, os Estados Unidos, a maioria dos países da Europa e Israel,
apresentam uma prevalência média do EBV de 20% a 30%,
62, 9
os países em desenvolvimento, particularmente aqueles com alto número de
casos de LH na faixa pediátrica, podem chegar a 100%.
Já foi descrita uma técnica mais sensível de detecção do DNA do EBV em
amostras de tecidos neoplásicos, a reação em cadeia pela polimerase
(“polymerase chain reaction”- PC
11
polymerase chain reaction”- RT-PCR), que permitem a detecção de 1 célula
positiva em cerca de 10
6
células.
Não há publicações, até o momento, sobre a utilização desta técnica em
amostras de tecidos de pacientes com LH. Porém, em 2007, Hsieh e cols.
estudaram 19 casos de linfoma nasal de células T e “natural killer” para a
quantificação de DNA do EBV no tecido tumoral, pela técnica de RT-PCR. Os
autores observaram que os pacientes com menor quantidade do DNA do EBV
(<1 cópia/célula) tiveram uma sobrevida maior do que os pacientes com alta
carga viral (≥1 cópia/célula). Concluiu-se que o DNA do EBV presente nas
ção destes pacientes.
106
Utilizando um
a
cluindo artrite reumatóide, glomerulonefrite, pancreatite,
células tumorais do linfoma nasal de células T e “natural killer” é um
indicador útil para predizer a evolu
2.6) PRESENÇA DO DNA DO EBV NO SANGUE PERIFÉRICO DE
PACIENTES COM NEOPLASIAS
Em 1948, cinco anos antes de Watson e Crick elucidarem a estrutura de
dupla-hélice do DNA, Mandel e Mztais identificaram pela primeira vez a
presença de ácidos nucléicos no sangue periférico humano.
107
método de precipitação com ácido perclórico, esses autores encontraram o
RNA e o DNA no plasma de indivíduos saudáveis e doentes.
Em 1960, novos estudos sobre o DNA circul nte foram publicados.
Inicialmente foram detectadas amostras de DNA no sangue periférico de
pacientes com lupus eritematoso sistêmico (LES)
108
e posteriormente, em
outras doenças in
colelitíase, doença inflamatória intestinal, doença ulcerosa péptica, hepatite,
esofagite e sepse.
109-112
12
No entanto, apenas alguns anos mais tarde, Leon e cols. observaram que os
pacientes com câncer tinham níveis mais altos de DNA circulante do que os
controles saudáveis. A concentração média de DNA nos controles normais foi
13 ng/ml, enquanto que, nos pacientes com neoplasia, essa média aumentou
113
ativa de DNA pelo
smas características do DNA circulante.
115
nova técnica ser aplicada em amostras de
116-118
te, foi publicado um estudo sobre a detecção do DNA circulante do
para 180 ng/ml. Curiosamente, os níveis de DNA circulante foram maiores no
soro de pacientes com metástases pelo tumor, comparados àqueles com
doença localizada.
A origem do DNA circulante permanece incerta. Uma das teorias elaboradas
é a liberação do DNA dos linfócitos ativados como propôs o estudo em
pacientes com LES. A outra hipótese seria a liberação do ácido nucléico das
próprias células do tumor, pelos mecanismos de necrose tissular e apoptose.
Uma terceira hipótese, e a mais aceita, seria a liberação
tumor na corrente sanguínea.
114
Para a confirmação destas duas últimas
teorias, seria necessário observar se o DNA das células neoplásicas tem
realmente as me
No final dos anos 80, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi
finalmente desenvolvida para melhor detecção do DNA e análise de suas
seqüências.
Não demorou, portanto, esta
sangue de pacientes com doenças associadas às infecções por vírus, em
especial pelo EBV e, mais recentemente, pelo HPV (“human papyloma virus”-
papiloma vírus humano).
Em 1994, foi detectado pela primeira vez o DNA do EBV no soro de pacientes
com diagnóstico de mononucleose infecciosa através da técnica de PCR.
63
No
ano seguin
13
EBV em doenças associadas à sua presença nos tecidos, como o carcinoma
nasofaríngeo, uma das neoplasias mais comuns na Ásia e em especial, na
China.
119
Além do carcinoma de nasofaringe,
120,
121
os níveis séricos e plasmáticos do
DNA circulante do EBV foram correlacionados ainda com a resposta clínica ao
noma “linfoepitelioma-like” de pulmão
124
e com
125
u res ainda pesquisaram a presença do DNA após o
f emonstrado que ocorrem alterações nos níveis de
DNA circulante do EBV durante o curso das doenças linfoproliferativas e há
tratamento de pacientes com linfoma pós-transplante,
122
linfoma de células T
e “natural killer”,
123
carci
carcinoma gástrico com positividade para o EBV.
2.7) PRESENÇA DO DNA CIRCULANTE DO EBV EM PACIENTES COM
LINFOMA DE HODGKIN
Em 1999, Gallagher e cols. demonstraram a presença de genoma do EBV no
soro de pacientes com LH através da técnica de RT-PCR. O DNA circulante do
EBV foi detectado no soro de 30 dos 33 pacientes com LH associado ao EBV,
mas em somente seis dos 26 pacientes com LH não-associado ao EBV
(p<0.001). Por outro lado, as amostras dos controles saudáveis foram
negativas. Os a to
tratamento quimioterápico, e sugeriram que aqueles que se mantinham com
amostras do DNA circulante do EBV positivas (5 em 14 dos casos) tinham
pior prognóstico.
66
No ano seguinte, em um estudo com 13 pacientes com doenças
linfoproliferativas associadas ao EBV, Lei e cols. verificaram que, em cinco
pacientes com LH, houve uma queda dos níveis de DNA circulante do EBV
após o tratamento quimioterápico e radioterápico. Este estudo foi de grande
importância, pois nele oi d
14
uma correlação evidente dos níveis de DNA do EBV com a resposta ao
tratamento instituído.
126
Em 2001, outro estudo foi publicado sobre a detecção do DNA do EBV no
sangue periférico de crianças com LH. Anteriormente ao tratamento, foram
detectadas amostras de DNA circulante do EBV em 13 das 24 crianças
estudadas (54%). Após a quimioterapia, porém, nenhum genoma de EBV foi
encontrado osn pacientes em remissão completa. No entanto, nos cinco
e com a sua observação inicial de que o DNA do EBV não foi
á multivariada, os altos níveis de DNA do EBV (>6,1 x
pacientes em recaída, dois tiveram suas amostras de sangue positivas para o
EBV (40%).
127
Neste mesmo trabalho, Wagner e cols. demonstraram que nenhum dos 20
indivíduos saudáveis apresentou o DNA livre circulante do EBV, achado
compatív l
detectado no plasma ou soro de 355 pessoas saudáveis através da técnica
de PCR.
128
Em outro estudo, 39 pacientes imunocompetentes portadores de linfoma de
células “natural killer” e linfomas associados ao EBV, sendo quatro pacientes
com diagnóstico de LH, foram analisados para a quantificação do DNA do
EBV no plasma. Foi verificada a presença do DNA circulante do EBV em todos
os casos de linfoma associado ao vírus, com os níveis de DNA do EBV
tornando-se indetectáveis na remissão clínica e elevados na doença
refratária. Na an lise
107 cópias/ml) foram significantemente associados com menor sobrevida
livre de doença.
129
Em novo estudo realizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
da UFRJ, com 30 pacientes com LH e 13 indivíduos saudáveis, foi detectado
15
o DNA circulante do EBV no plasma de 43% dos pacientes com LH, e em
todos os seis pacientes com LH associado ao HIV. A prevalência do DNA
130
131
s pacientes com LH pode
diagnóstico, o
acompanhamento e o tratamento destes pacientes.
re as técnicas mais utilizadas para estudar o
molecular dos tumores e identificação de novos marcadores tumorais. Nos
circulante do EBV foi maior nos pacientes com doença avançada,
independente do status para o HIV.
No mesmo ano, foi publicado um estudo onde se utilizaram 43 amostras de
“buffy coat” e 52 amostras de plasma, de um total de 58 pacientes com LH
(31 com LH recém-diagnosticado, 6 em recaída e 21 em remissão
prolongada), para detecção do DNA do EBV pela técnica de RT-PCR. Foi
verificada a presença do DNA circulante do EBV em todos os pacientes antes
do tratamento. Naqueles pacientes que responderam ao tratamento, nos que
estavam em remissão prolongada de doença e nos pacientes com LH não-
associado ao EBV, os níveis de DNA circulante do EBV foram indetectáveis.
Estes estudos comprovam que as técnicas de PCR e RT-PCR para a detecção
do DNA circulante do EBV em pacientes com LH são importantes para a sua
avaliação. O DNA detectado no sangue periférico do
ser considerado como um marcador tumoral para o
2.8) PROTEOMA DO SORO DE PACIENTES COM CÂNCER
O proteoma é o conjunto de proteínas expressas em um instante por um
determinado genoma. Dent
proteoma destacam-se a eletroforese em gel bidimensional (gel 2D-E) e a
espectrometria de massa.
Desde que foi descrita por O’Farrell em 1975,
132
a técnica de gel 2D-E vem
se mostrando um instrumento útil para a caracterização da patogênese
16
anos 90, os progressos em relação à técnica de espectrometria de massa
levaram à disseminação do uso do proteoma para a identificação de
em um gel 2D-E,
133
gel, digeridas por tripsina e identificadas por
134
assa e a carga
135
polipeptídeos.
O cerne desta tecnologia consiste na comparação entre 2 amostras (ex:
normal e tumor) através da eletroforese de proteínas em gel 2D-E, que
separa as proteínas de acordo com o ponto-isoelétrico (pI) na primeira
dimensão (ponto onde a carga total da proteína é zero) e com a massa
molecular (MM) na segunda dimensão (geralmente de 6 a 300 kDa). Com
isso, após a coloração do gel, são visualizados múltiplos pontos que
correspondem a proteínas com pI e MM específicos. Teoricamente, é possível
a demonstração de até 10.000 espécies de proteínas
mas na prática, os géis contêm de 1000 a 2000 spots.
Em seguida, com o auxilio de programas computacionais especializados, as
imagens são analisadas e comparadas. Os dados são processados para a
identificação de pontos de interesse, utilizando-se p valor menor que 0,05 e
um ponto de corte de duas vezes. As proteínas que estão diferencialmente
expressas são recortadas do
espectrometria de massa.
A análise por espectrometria de massa consiste, fundamentalmente, na
produção de íons a partir de um composto orgânico, como por exemplo as
proteínas. Através da detecção desses íons é produzido um espectro de
massas onde a ordenada corresponde à razão entre a m
(m/z), e a abscissa corresponde à intensidade dos picos.
No espectrômetro de massa do tipo Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), macromoléculas biológicas não-
17
voláteis (como, por exemplo, os peptídeos oriundos da digestão por tripsina)
são ionizadas. Nesse processo, a matriz (um ácido de baixo peso molecular)
e o analito co-cristalizam, e a matriz absorve a maior parte da energia do
laser, transferindo apenas parte desta às macromoléculas, o que as protege
da degradação e resulta em uma leve ionização, o que permite a detecção
135
135
em aos
de pacientes com câncer,
em uma forma intacta do analito (proteína).
Uma vez ionizadas, as moléculas são analisadas por tempo de vôo, do inglês
“time of flight” (TOF). Nesse tipo de instrumento, os íons formados são
acelerados por um potencial de voltagem, assumem uma velocidade que
depende de sua razão m/z e viajam por uma região de campo livre e a
vácuo, chegando a um detector em diferentes espaços de tempo.
Após serem detectados, os íons são transformados pelo processador em
sinais que podem ser analisados. Esses dados são organizados em gráficos
de intensidade versus m/z, denominados espectros de massa. Esses
espectros são então convertidos em dados numéricos que correspond
diferentes tamanhos peptídicos da proteína digerida.
Utilizando a metodologia 2D-E acoplada à espectrometria de massa, alguns
pesquisadores vêm analisando amostras de soro
na tentativa de encontrar marcadores tumorais.
Em câncer de pulmão, pesquisadores da Universidade de Michigan utilizaram
a proteômica para identificar proteínas que induzem resposta imunológica
humoral nos pacientes. Para isso, amostras de câncer de pulmão e da
linhagem celular A549 (adenocarcinoma de pulmão) foram submetidas à 2D-
E e ao Western-blot, e o soro de indivíduos com câncer de pulmão serviu
como anticorpo primário. Em 30% dos pacientes foram identificados
18
anticorpos contra a anexina I, uma proteína envolvida na inibição do
crescimento celular induzido por glicocorticóides. Em 33% dos casos também
estavam presentes anticorpos contra a anexina II, que é uma proteína de
136
ntavam o anticorpo circulante, o antígeno PGP 9,5
136
be-se que eram proteínas hidrofóbicas e de baixo peso
137
co do soro de pacientes com câncer de próstata
138
e mama.
139
membrana possivelmente envolvida na proteólise extracelular.
Em trabalho posterior, com a mesma metodologia, os autores identificaram,
no soro de 14% dos pacientes com câncer do pulmão anticorpos contra PGP
9,5, um peptídeo neuro-específico que também é encontrado em amostras
tumorais de câncer de pulmão pequenas células. Adicionalmente, em dois
pacientes que não aprese
foi detectado no soro.
No início do ano 2002, Liotta e cols. publicaram um trabalho inovador no
diagnóstico do câncer de ovário.
137
Neste estudo, foi utilizada a técnica de
SELDI-TOF-MS (uma variante do MALDI-TOF) para análise do perfil
proteômico do soro de 50 portadoras de câncer de ovário e 50 mulheres não
afetadas, mas pertencentes a um grupo de alto risco. Foi então identificado
um padrão proteômico que discerniu completamente os dois grupos. Para
validação do método, os pesquisadores analisaram um grupo adicional de
116 amostras sem saber a identidade das mesmas e, onde discriminou-se
completamente todos os casos de câncer de ovário e 95% dos casos de
mulheres não afetadas. Embora a identidade dos peptídeos não tenha sido
esclarecida, sa
molecular.
Após a publicação desse artigo, outros trabalhos foram publicados com a
análise do perfil proteômi
19
Maciel e cols., em 2005, ao estudarem 20 pacientes com adenocarcinoma de
pulmão e 20 indivíduos saudavéis pela técnica de MALDI-TOF, identificaram
cinco proteínas superexpressas (imunoglobulina cadeia lâmbda, monômero
de transtiretina, haptoglobina e duas isoformas da proteína amilóide sérica)
e uma proteína subexpressa (apolipoproteína A-I) no grupo de pacientes
quando comparado ao controle.
140
Recentemente, pesquisadores da Universidade Johns Hopkins e da
Universidade de Pittsburgh, após a análise proteômica do soro de 111
pacientes com câncer colorretal, desenvolveram marcadores colorretais
específicos. Leman e cols. verificaram que um destes marcadores, CCSA-2,
era capaz de distinguir indivíduos com câncer colorretal daqueles que não
apresentavam a neoplasia.
141
Em 2008, foram estudadas amostras de soro de 41 pacientes com câncer
hepático e 51 pacientes com cirrose hepática pela técnica de SELDI-TOF-MS.
Os autores identificaram um perfil de 11 picos de proteínas para o
diagnóstico de câncer hepático, indepedentemente da alfa-fetoproteína.
142
Ainda em 2008, Wei e cols. observaram um perfil discriminante de quatro
proteínas no soro de 55 pacientes com carcinoma de nasofaringe quando
comparado ao encontrado no soro de 60 indivíduos saudáveis.
143
A existência de padrões discriminantes no proteoma de soro está de acordo
com a hipótese de que diversas proteínas e peptídeos emanam de
microambientes específicos do tumor-hospedeiro, especialmente nos
primeiros estágios do câncer.
144
20
Esse padrão proteômico poderia ser discernido e poderia conter informações
diagnósticas, o que estabeleceria a tecnologia de proteoma como um
importante instrumento no diagnóstico precoce das neoplasias.
2.9) PADRÃO PROTEÔMICO EM PACIENTES COM DOENÇAS
LINFOPROLIFERATIVAS
Apesar do desenvolvimento recente na área proteômica, há limitações ao seu
uso que incluem a necessidade de grande quantidade de material inicial e a
inabilidade para a identificação de proteínas pouco abundantes,
145
o que
explica o número limitado de estudos na área de hematologia.
Hanash e cols. revisaram seus estudos em leucemias agudas, que se
iniciaram nos anos 80, e identificaram um número de polipeptídeos que eram
distintos entre os subgrupos de leucemia linfóide aguda (LLA) e entre LLA e
leucemia mielóide aguda (LMA).
146
O marcador encontrado em altos níveis
de expressão em pacientes com LLA foi seqüenciado e finalmente
identificado como pequena proteína do choque térmico, Hsp27, em 1990.
147
Os estudos em leucemia linfocítica crônica B (LLC-B), utilizando-se a técnica
de gel 2D-E, apresentaram uma correlação entre o perfil de expressão de
proteínas e aberrações genéticas específicas.
148
Em pacientes com deleção
do gene supressor de tumor p53, foram detectados níveis mais baixos de
glutatione-S-transferase.
149,150
e tioredoxina peroxidase I, um inibidor de
apoptose distinto da família Bcl-2.
151
A combinação de altos níveis de
expressão de Hsp27 com baixos níveis de tioredoxina peroxidase I e de
proteína disulfito isomerase foram correlacionados com menores taxas de
sobrevida.
152
21
Em 2003, pesquisadores investigaram as diferenças na expressão de
proteínas entre dois grupos distintos de pacientes com LLC-B, com base na
presença ou ausência de hipermutações somáticas na região variável da
cadeia pesada da imunoglobulina (IgV
H
).
153
Foram identificadas três
proteínas com aumento significativo de sua expressão no grupo com LLC
mutada em comparação ao grupo de pacientes com LLC não-mutada:
proteína F-actina subunidade beta, 14-3-3 beta proteína e proteína de
ligação da laminina. Os autores ainda identificaram vários spots
correspondentes à nucleofosmina no grupo de pacientes com LLC mutada, o
que indicou variações entre os dois grupos.
Uma ferramenta que facilitou o estudo do desenvolvimento linfóide normal e
neoplásico foi a publicação de mapas de proteoma da linhagem celular
linfoblastóide, após a análise do gel 2D-E e espectrometria de massa.
154, 155
Este grupo estabeleceu um mapa de referência para a linhagem celular do
linfoma de Burkitt (DG 75) após a exposição à 5’-azicitidina, um agente
desmetilizante.
156
Pela análise por gel 2D-E, foram identificados 21
polipeptídeos subexpressos e 14 polipeptídeos superexpressos, incluindo a
caspase-10D, um ativador da cascata da caspase
157
e a proteína Gars.
156
A técnica proteômica SELDI-TOF-MS também já foi aplicada em amostras de
tecido ganglionar de pacientes com linfoma folicular. Lin e cols. identificaram
proteínas que poderiam estar envolvidas na progressão do linfoma
folicular,
158
já Fan e cols. identificaram a proteína histona H4 como um
potencial marcador que parece distinguir entre linfoma folicular grau I e grau
III.
159
Em 2005, foi feita a análise proteômica em 7 gânglios linfáticos congelados
acometidos pelo linfoma da zona do manto, pelo método de microarranjo. Os
22
autores utilizaram como referência para a definição de superexpressão de
proteínas os valores de 1,3 e duas vezes em, no mínimo, 67% das amostras
do tumor quando comparadas ao controle normal de células B. Dos
polipeptídeos, 77 tiveram aumento da sua expressão quando utilizado o
corte de 1,3 vezes e 13 apresentaram aumento da expressão quando
utilizado o corte de duas vezes. Entre as proteínas diferencialmente
expressas no linfoma da zona do manto, há proteínas reguladoras do ciclo
celular (regulador da condensação de cromossomo [RCC1], murina minuto 2
[MDM2]), uma cinase (cinase citron Rho-interação [CRIK]), proteínas
chaperonas (proteína do choque térmico 90 kDa [Hsp90], Hsp10) e proteínas
reguladoras de fosfatase (proteína fosfatase 5 [PP5], proteína 1 cinase
ancora [AKAP149] e inibidor 2).
160
Cussac e cols. utilizaram o gel 2D-E seguido do MALDI-TOF-MS para
comparar o proteoma de proteínas solúveis citoplasmáticas de uma linhagem
celular de linfoma anaplásico ALK-positivo (SUDHL-1) e de uma linhagem
celular de linfoma anaplásico ALK-negativo (FE-PD). Foram detectadas 82
proteínas diferencialmente expressas entre as duas linhagens. A identificação
das proteínas demonstrou que elas pertenciam a cinco categorias funcionais
incluindo sinalização, citoesqueleto e motilidade, chaperonas, controle da
expressão protéica e degradação, e hemostasia e metabolismo.
161
Recentemente, em 2007, Cowen e cols. analisaram amostras de soro de 45
pacientes com micose fungóide, 56 pacientes com psoríase e 47 controles,
com a utilização de duas plataformas de espectrometria de massa de
diferentes resoluções, e determinaram um padrão de proteínas séricas para
a distinção de pacientes com micose fungóide, psoríase e de indivíduos
saudáveis.
162
23
No mesmo ano, Zhang e cols. realizaram o espectro proteômico do soro de
132 pacientes com linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) e de 75
controles pela técnica de SELDI-TOF-MS. Nove picos foram considerados
como potenciais biomarcadores de doença (sensibilidade de 94% e
especificidade de 94%) e quatro picos tiveram correlação com à resposta ao
tratamento quimioterápico padrão, com sensibilidade de 94% e
especificidade de 92% para a detecção de pacientes com pior prognóstico.
163
Utilizando-se a técnica de gel 2D-E e espectrometria de massa, Ueda e cols.
detectaram duas proteínas no plasma de pacientes com LNH, L-plastina e
alfa-enolase, capazes de reagir com anticorpos plasmáticos. As taxas de
detecção do anticorpo anti-L-plastina foram significantemente altas: 84%
(21/25) em pacientes com LNH, 0% (0/4) em pacientes com LH, 38% (5/13)
em pacientes com doenças auto-imunes, 20% (2/10) em pacientes com
leucemia e 13% (1/8) nos indivíduos saudáveis. Os autores então sugeriram
que este anticorpo poderia ser um novo marcador diagnóstico para LNH.
164
2.10) PADRÃO PROTEÔMICO EM PACIENTES COM LINFOMA DE
HODGKIN
Alguns estudos em doenças hematológicas neoplásicas com a utilização da
técnica de proteoma têm sido feitos, porém a sua aplicação no LH ainda é
muito limitada.
Fujii e cols. compararam o proteoma de linhagens celulares de LH e de
linhagens de linfoma anaplásico de grandes células e de LNH, utilizando 2D-
DIGE (“two-dimensional difference gel electrophoresis” - eletroforese em gel
bidimensional diferencial) do total de células lisadas. A linhagem de células
de LH expressou níveis elevados de piridoxina-5’-fosfato oxidase (PNPO),
24
vinculina (VCL), proteína relacionada a dihidropirimidinase-2 (DPYSL2) e
NADH-ubiquinona oxidoredutase (NDUFS3), quando comparada ao linfoma
anaplásico de grandes células. Em comparação às linhagens celulares de
LNH, as células de LH tiveram níveis mais altos de PNPO, gama-enolase
(ENO2), VCL, vimentina (VIM), galectina-1 (LGALS1), anexina A5 (ANXA5) e
substrato de proteína cinase C (PRKCSH).
165, 166
Em 2007, Carvalho e cols. identificaram mudanças no espectro no soro de
pacientes com LH quando comparado ao grupo controle, com o uso do
espectrômetro de massa híbrido quádruplo-TOF, porém não foi realizada a
identificação de tais proteínas.
167
Utilizando-se a técnica proteômica em conjunto com a cromatografia líquida
e a análise bioinformática, pesquisadores da Universidade de Utah
estudaram o proteoma de três compartimentos celulares das linhagens de
células derivadas do LH L428 e KMH2. Um total de 1945 proteínas foram
identificadas, sendo 785 da fração citosólica, 305 da fração de membrana e
414 de proteínas liberadas. A expressão destas proteínas foi confirmada por
Western-blot (BRAF, Erb-B3), microscopia de imunofluorescência (axina1,
tenascina-X, mucina-2) e imuno-histoquímica por microarranjo em tecido
(BRAF, PIM1).
168
No estudo mais recente nesta área, Ma e cols. detectaram novas proteínas
relacionadas à patogênese do LH, ao analisarem o secretoma das células RS.
As 1290 proteínas presentes no sobrenadante de quatro linhagens celulares
de LH foram identificadas. Do grupo funcional das proteínas secretadas, 37
proteínas estavam envolvidas na resposta imune. Destas, 16 proteínas
(ALCAM, catepsina C, catepsina S, CD100, CD150, CD26, CD44, CD63,
CD71, fractalina, IL1R2, IL25, IP10, MIF, RANTES e TARC) foram validadas
25
nas linhagens celulares de LH e 15 proteínas foram ainda confirmadas nos
tecidos envolvidos pelo LH. Sete proteínas (ALCAM, catepsina S, CD26,
CD44, IL1R2, MIF e TARC) tiveram os seus níveis significativamente
aumentados no plasma de pacientes com LH, quando comparados ao do
grupo controle formado por indivíduos saudáveis.
169
26
3) OBJETIVOS
Principais:
• Identificar e analisar proteínas diferencialmente expressas no soro de
pacientes com LH conforme o status do EBV.
• Comparar os achados obtidos nos pacientes com LH com o grupo
controle composto por indivíduos saudáveis.
Secundários:
• Determinar a presença do DNA circulante do EBV no sangue periférico
dos pacientes com LH.
• Determinar a presença do EBV em tecido ganglionar envolvido pela LH
pela técnica de imuno-histoquímica.
• Determinar a presença do DNA circulante do EBV no sangue periférico
do grupo controle.
27
4) PACIENTES E MÉTODOS
Foram estudados os pacientes com LH recém-diagnosticado em tratamento
no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do
Rio de Janeiro (HUCFF/UFRJ) e no Instituto Nacional de Câncer (INCA).
Todos os pacientes registrados nesses dois serviços de novembro de 2001 a
novembro de 2003 foram avaliados para a inclusão no estudo.
A) Critérios de inclusão
Todos os pacientes com diagnóstico histopatológico confirmado de LH, sem
tratamento quimioterápico e/ou radioterápico prévio, acompanhados durante
todo o tratamento e após o tratamento em uma das duas instituições.
B) Critérios de exclusão
Os pacientes foram excluídos do estudo nas seguintes circunstâncias:
1. impossibilidade de extração de DNA
2. se não houve bloco de parafina disponível para a realização de imuno-
histoquímica no tecido ganglionar envolvido pelo LH
Após a assinatura pelo paciente do termo de consentimento livre e
esclarecido, foram colhidas amostras de sangue periférico dos pacientes
antes do início do tratamento.
Também foi estudado um grupo-controle, composto por indivíduos
saudáveis. Este grupo foi formado por voluntários, entre funcionários, alunos
de graduação e de pós-graduação em medicina da UFRJ.
O sangue colhido foi utilizado para os seguintes procedimentos laboratoriais:
28
1. detecção do DNA livre circulante do EBV no plasma e no “buffy coat” de 30
pacientes com LH sem tratamento prévio e de 13 indivíduos saudáveis,
através da técnica de PCR convencional;
2. determinação do padrão proteômico no “pool” de soro dos pacientes com
LH pré-tratamento, de acordo com o status do EBV, e dos indivíduos
saudáveis.
Foram considerados como pacientes com LH não-associado ao EBV aqueles
que apresentavam negatividade para o EBV nos seguintes materiais
biológicos: “buffy coat”, plasma e gânglio.
Diferentemente do grupo anterior, foram considerados pacientes com LH
associado ao EBV aqueles pacientes com positividade em dois dos três
materiais biológicos estudados, sendo obrigatória a presença do DNA livre
circulante do EBV no plasma.
Para o “pool” do grupo controle, foram selecionados, dentre os indivíduos
saudáveis, aqueles sem a presença do DNA do EBV no “buffy coat” e no
plasma.
A pesquisa do DNA do EBV pela técnica de PCR qualitativo foi feita no
Laboratório de Controle da Expressão Gênica, localizado no Centro de
Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) e
chefiado pela Prof.
a
Maria da Glória da Costa Carvalho.
A análise e a identificação do perfil proteômico foram realizados no
Laboratório de Química de Proteínas, localizado no Instituto de Química (IQ)
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) chefiado pelo Prof. Gilberto
Barbosa Domont.
29
Os pacientes foram ainda avaliados quanto à presença de EBV na biópsia de
tecido ganglionar envolvido pelo LH no momento do diagnóstico. A
classificação histopatológica foi confirmada segundo os critérios da OMS. Foi
utilizada a técnica de imuno-histoquímica para a detecção de EBV nas células
do gânglio, realizada no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF) da Universidade Federal do Rio
de Janeiro (UFRJ). A revisão das lâminas foi feita pelo professor e médico
patologista da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), o Prof. José
Carlos Morais.
As seguintes informações clínicas foram obtidas dos pacientes por ocasião do
diagnóstico: idade, sexo, estadiamento clínico, tamanho da massa tumoral,
presença de sintomas B, presença de doença associada, exames laboratoriais
e tipo de tratamento (quimioterapia e/ou radioterapia). A ficha utilizada para
a coleta de dados clínicos dos pacientes encontra-se no Anexo 8.1.
O estudo foi projetado de acordo com as Diretrizes e Normas
Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Resolução
196/1996 do Conselho Nacional de Saúde) e foi aprovado pelo Comitê de
Ética das instituições participantes. Todos os pacientes receberam um termo
informativo e assinaram um termo de consentimento livre informado (nos
Anexos 8.2 e 8.3).
4.1) DETECÇÃO DO DNA CIRCULANTE DO EBV NO SANGUE
PERIFÉRICO
4.1.1) COLETA DO SANGUE PERIFÉRICO
Foram colhidas amostras de sangue periférico de 30 pacientes com LH e de
13 indivíduos saudáveis. Foram colhidos de cada paciente, com o uso de
30
seringas e agulhas descartáveis através da punção de veia periférica, cerca
de 10 ml de sangue em tubo com EDTA e em tubo sem anticoagulante.
4.1.2) TRANSPORTE DO SANGUE COLETADO
As amostras de sangue colhidas de cada paciente, após a identificação
adequada, foram transportadas de acordo com as normas de biossegurança,
em caixas de isopor com fragmentos de gelo sob a supervisão dos
pesquisadores envolvidos.
4.1.3) PROCESSAMENTO DO SANGUE
Até uma hora após a coleta, o sangue total foi centrifugado a 2000 rpm por
10 minutos para separação de soro, plasma e “buffy coat”. Para “purificação”
do “buffy coat”, as hemácias foram lisadas com a utilização de solução
específica (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl
2
, 10 mM NaCl), centrifugação
a 2000 rpm por 10 minutos e a retirada do sobrenadante, por repetidas
vezes, até a obtenção de somente células brancas.
O material foi separado (soro, plasma e “buffy coat”), colocado
separadamente em tubo 1,5 ml da marca Eppendorf® e armazenado no
freezer a – 80ºC.
4.1.4) EXTRAÇÃO DO DNA
O DNA foi extraído de alíquotas de 200 μl de plasma e “buffy coat” que
tinham sido estocados a –80ºC. A extração do DNA foi realizada com a
utilização do QIAamp Mini Kit
®
(Qiagen
®
, Uniscience, BR) segundo
orientações do fabricante. O kit é composto das soluções AL, AW1, AW2 e
AE.
Primeiramente, pipeta-se 20 μl de proteinase Qiagen
®
(proteinase K) no
fundo de cada tubo. É adicionado 200 μl de plasma / “buffy coat” nos tubos
31
separadamente. Depois, coloca-se 200 μl de solução AL e mistura no vortex
por 15 segundos. A reação é incubada a 56ºC por 10 minutos e então,
centrifugada rapidamente. Adicionado 200 μl de etanol a 100% com mistura
no vortex por mais 15 segundos e centrifugação a 8000 rpm por 1 minuto.
Descartado o tubo inferior com etanol e transfere-se a coluna para um novo
tubo. Adiciona-se então 500 μl de solução AW1 e centrifuga-se a solução a
8000 rpm por 1 minuto. Descartado novamente o tubo inferior e colocada a
mesma coluna em novo tubo. Pipetada 500 μl da solução AW2 no novo tubo
e centrifugada a reação a 14000 rpm por 3 minutos com troca do tubo
inferior por um novo. Adicionado 50 μl da solução AE e incubada a reação a
temperatura ambiente por 5 minutos e posterior centrifugação a 8000 rpm
por 1 minuto. O DNA extraído foi armazenado no freezer a – 80ºC.
4.1.5) TÉCNICA DE PCR
Um microlitro de DNA extraído do plasma / “buffy coat” foi colocado
separadamente em um tubo com 11 μl da reação de PCR contendo 16.22 μl
de H
2
O, 2.5 μl de PCR 10 x buffer, 1.48 μl de 50 mM MgCl
2
, 0.2 μl de 25 mM
dNTPs, 0.125 μl de Tag 5 U/mcl, 0.5 μl de 5’ primer: AGT CCT TCT TGG CTA
GTC TGT TGA e 0.5 μl de 3’ primer: CTT TGG CGC GGA TCC TC. Foram
feitos dois controles, um positivo contendo DNA extraído de linhagem celular
sabidamente positiva para o EBV (Raji cell) e outro negativo somente com
mistura de reação, sem DNA. Por cima de cada tubo, foi pipetado 40 μl óleo
mineral e colocadas as amostras no termociclador.
O termociclador foi programado para as seguintes condições: desnaturação
inicial a 95ºC por 5 minutos, seguida de 40 ciclos de 94ºC em 1 minuto;
94ºC por 30 segundos, refrigeração a 55ºC em 2 minutos; 55ºC por 10
32
segundos; aquecimento a 72ºC em 1 minuto; 72ºC por 30 segundos,
seguidos por uma etapa de extensão final a 72ºC por 7 minutos.
66
Os produtos do PCR foram analisados por eletroforese em gel de
poliacrilamida a 10% (2,7 ml de H2O, 0,5 ml de TBE 5x, 1,7 ml de Acri-Bis
30:0.8, 120 μl de 10% AMP, 2,6 μl de TEMED). A mistura de 3 μl de tampão
de amostra com o DNA foi aplicada nos slots do gel e ligada a fonte da cuba
de eletroforese em voltagem de 115 V.
Após a eletroforese, o gel foi imerso na solução fixadora (5 ml de etanol a
100%, 0.4 ml de ácido acético a 100%, 45 ml de água destilada) por 10
minutos e corado com a solução de prata (0.1 g de AgNO
3
, 50 ml de água
destilada) por 10 minutos. Após a lavagem em água corrente, o gel foi
deixado na solução reveladora (1,5g de NaOH, 0,4 ml de formaldeído a 37%,
50 ml de água destilada) por 10 minutos para visualização das bandas
correspondentes.
4.2) DETECÇÃO DE PRODUTOS VIRAIS DO EBV NO GÂNGLIO
4.2.1) TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA NO GÂNGLIO
Foram avaliadas as amostras de fragmento de gânglio dos pacientes do
estudo para a presença do EBV pela técnica de imuno-histoquímica.
O anticorpo primário contra o EBV usado foi o CS 1-4, Dako
®
, um coquetel
de 4 anticorpos monoclonais que reconhecem 4 epitopos da molécula LMP1/
EBV. Os cortes histológicos foram desparafinizados em xilol a 60
0
C durante
30 minutos e, posteriormente, em temperatura ambiente, durante 20
minutos. Em seguida os cortes foram hidratados em soluções alcoólicas e
água. As lâminas foram incubadas em solução de ácido cítrico 0,01M com pH
6,0, em duas etapas de 5 minutos cada uma, no forno de microondas
33
(700W), visando a recuperação antigênica. A atividade endógena da
peroxidase foi bloqueada com solução de peróxido de hidrogênio a 3% em
metanol durante 30 minutos. O anticorpo primário, diluído na proporção de
1:50, foi colocado sobre os cortes histológicos deixados em câmara úmida a
40
0
C, durante um período de 18 horas. Após esta fase, foi feita a incubação
com o anticorpo secundário, também em câmara úmida, a 37
o
C, durante 30
minutos. Entre as incubações, foram realizadas lavagens com PBS (solução
tamponada de fosfato) com pH 7,4. A detecção da reação foi feita com o
sistema estreptoavidina-biotina-peroxidase. A revelação foi feita com o
substrato cromógeno DAB, que foi aplicado durante 5 minutos, a 37
0
C. Por
fim os cortes foram corados com hematoxilina de Harris.
4.3) TÉCNICA DE ELETROFORESE E ESPECTROMETRIA DE MASSA
4.3.1) TÉCNICA DE ELETROFORESE DE PROTEíNAS EM GEL
BIDIMENSIONAL (2D-E)
O “pool” de soro dos pacientes com LH não-associado e associado ao EBV e
dos indivíduos saudáveis foram analisados por eletroforese em gel
bidimensional (2D-E), que foi realizado como previamente descrito, com a
utilização do sistema Ettan
TM
IPGphor
TM
Isoeletric Focusing (Amersham
Biosciences) para a primeira dimensão e o sistema Ettan DALTsix system
(Amersham Biosciences) para a segunda dimensão.
Foram preparados separadamente “pools” de soro de pacientes com LH
associado ao EBV e LH não-associado ao EBV. Para os géis preparativos, 0,8
mg de proteínas de cada pool, dosado pelo método de Bradford,
170
foi
diretamente misturado ao tampão de re-hidratação (uréia 8M, CHAPS 2%,
DTT 20mM, tampão IPG 0,5% e ABF 0,002%) em um recipiente especial de
34
cerâmica (“sarcófago”) para um volume final de 350 μL. Para evitar contato
com o ar, durante a re-hidratação, as fitas foram cobertas com óleo mineral.
A mistura foi submetida à focalização isoelétrica em fitas com comprimento
de 18 cm imobilizadas de gradiente não-linear de pH 4-7 (Amersham
Biosciences). Após a re-hidratação por 12 horas a 60 V em 20º C, foi feita a
focalização isoelétrica, com 59.300 Vht. Após esta etapa, as fitas foram
incubadas duas vezes por 15 minutos em 10 ml de solução de tampão de
equilíbrio (Tris HCl 50 mM, pH 8,8; uréia 6M; glicerol 30%; SDS 2%). Na
primeira incubação foi adicionado DTT 0,01% e na segunda, o DTT foi
substituído por iodoacetamida 0,025% para remover o excesso de DTT. Após
a etapa de equilíbrio, as fitas foram submetidas a 2D-E utilizando géis na
concentração de 12% de poliacrilamida (Amersham Biosciences).
Os géis foram feitos no dia anterior para polimerização durante a noite à
temperatura ambiente com uma camada de 1ml de butanol com o tampão
de corrida Tris-Glicina. Cada fita foi colocada na parte superior do gel para a
segunda dimensão e um papel de filtro contendo o padrão de peso molecular
foi inserido ao lado da fita. Em seguida, a fita e o papel de filtro contendo o
padrão de peso molecular foram imobilizados com a adição de agarose 1%
com ABF 0,02% a 80
o
C.
A “corrida” foi realizada na cuba do sistema Ettan
TM
(GE Health) a 100 W, ou
seja, de quatro a cinco horas para seis géis simultâneos com solução tampão
composta por Tris 125 mM; 960 mM Glicina e SDS 0,5%. No compartimento
de cima da cuba, a solução tampão foi duas vezes concentrada, e no
compartimento de baixo foi uma vez concentrada. Para comparação dos dois
géis, foi necessário que estes fossem “corridos” simultâneamente a partir da
mesma solução. Ao término da “corrida”, os géis foram cuidadosamente
35
retirados das placas e imersos em 500 ml de solução fixadora (40% EtOH;
10% HOAc; 50% H
2
O Milli Q) durante a noite. No dia seguinte, os géis foram
lavados três vezes com água Milli Q e submersos, com leve agitação, em
solução coloidal Coomassie G-250, durante a noite. A solução coloidal é
composta por 0,12% de Comassie G-250, 10 % de ácido fosfórico (H
3
PO
4
),
10% de sulfato de amônio e 20% de metanol.
Os géis bidimensionais foram escaneados, com resolução de 300 dpi e 16
bits no formato “.tiff”, por meio da utilização do programa LabScan
(Amersham Biosciences) e do scanner ImageScanner (Amersham
Biosciences). A análise subseqüente das imagens foi realizada através do
software ImageMaster 2D Platinum (Amersham Biosciences).
Entre os grupos estudados, os spots que apresentaram diferença quantitativa
marginal de duas vezes do seu volume normalizado foram confrontados
estatisticamente, através do teste t-Student, para rejeição da hipótese nula
de expressão diferencial. Foram considerados spots diferencialmente
expressos aqueles que apresentavam p valor<0,05. Para maior rigor da
análise, os spots foram analisados manualmente, caso a caso, e
desconsiderados quando não estavam presentes em todos os géis de cada
comparação de grupos, apresentavam intensidade muito baixa ou estavam
em regiões de artefato de técnica.
4.3.2) DIGESTÃO POR TRIPSINA DAS PROTEÍNAS COM EXPRESSÃO
DIFERENCIAL
As proteínas diferencialmente expressas, resolvidas por 2D-E foram
excisadas dos géis em pedaços de aproximadamente 1 mm
2
, com o uso de
uma lâmina de bisturi. Os fragmentos de gel foram transferidos
36
separadamente para tubos e submetidos às seguintes etapas, seguindo o
protocolo sugerido por Shevchenko e cols.,
171
com algumas modificações:
a) Descoloração pela lavagem do spot por 30 minutos com 100 μL de solução
contendo (1:1 w/w) bicarbonato de amônio 100 mM / acetonitrila;
b) Lavagem do spot com 10 mM de bicarbonato de amônio, seguido de
desidrataçao com acetonitrila 100%;
c) Redução e alquilação das proteínas no spot, respectivamente, pelo
tratamento por 30 minutos com 10 mM de DTT e 30 minutos de solução de
iodoacetamida na concentraçao de 55 mM;
d) Em seguida os spots foram tratados "overnight" com 12,5 ng a 75 ng de
Sequencing Grade Modified Trypsin (Promega) a 37ºC;
e) Peptídeos trípticos foram extraídos da malha de poliacrilamida com a
solução (1:2 v/v 5% formic acid/ACN);
f) Peptídeos extraídos foram liofilizados e em seguida resuspendidos em
solução de ácido trifluoroacético na concentraçao de 0,1%.
Após a digestão por tripsina, os peptídeos foram extraídos do gel pela adição
de 30 μL de solução contendo ácido fórmico 5% / acetonitrila 50% por 30
minutos e foram transferidos para um tubo novo.
4.3.3) ANÁLISE POR MALDI-TOF E IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Para a análise por espectrometria de massa, a amostra extraída no
microtubo foi desalinizada e concentrada por meio de coluna POROS R2,
preparada artesanalmente segundo Thingholm,
172
e eluida diretamente na
placa de MALDI por 1 µL de matrix (ácido alfa-ciano-4-hidroxi cinamínico,
37
ácido trifluoracetico 0,1%, acetonitrila 80%) na concentração de 2 mg/ml e
deixado secar, segundo o método “dried droplet”.
Os mapas peptídicos foram obtidos com a utilização do espectrômetro de
massa MALDI-TOF/TOF MS 4700 Proteomics Analyzer, versão 3.0 (Applied
Biosystems) no modo refletor, localizado no Laboratório de Proteoma da
Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz), conforme as orientações do fabricante. Os
espectros de massa foram obtidos pelo método Reflector Positive Mode com
faixa de massa de 900 a 3500 (m/z) por 2000 shots de laser por espectro.
De Novo Peptide Sequencing foi realizado pelo método MS/MS-1K Positive
Ion Mode por 4800 shots de laser acumulados por espectro e janela de
massa de -25 +25 Da. O sequenciamento foi realizado em CID-off mode. Os
dez picos com maior intensidade absoluta, em ordem crescente de
intensidade, foram escolhidos para fragmentação, desde que superassem os
critérios de exclusão de picos. O critério de exclusão para a fragmentação foi
a lista de contaminantes tripticos (queratina, tripsina, matrix) com tolerância
de massa de 0,5 Da. As listas de massas dos MS e MS/MS foram exportadas
para arquivos ".txt" via software Applied Biosystems Data Explorer versão
4.6. para busca em banco de dados. As buscas foram realizadas no banco de
dados SwissProt versão 55.4 pelo programa Mascot com os seguintes
parâmetros: significância do score p<0,05, taxonomia Homo sapiens,
carbamidomethyl (C) para modificação fixa, “Oxidation” (M) como
modificação variável, número de clivagem perdida igual a um, “peptide mass
tolerance” variável entre 15 a 50 ppm, e “fragment mass tolerance” variável
de 100 ppm. Todos os espectros foram analisados com somente calibração
externa, utilizando-se pepmix.
38
As proteínas foram identificadas por “Peptide Mass Fingerprinting” e non-
interpreted “Peptide De Novo Sequencing” de seus mapas peptídicos, através
do programa Mascot, disponível gratuitamente na internet
(http://www.matrixscience.com). Foram adotados os seguintes parâmetros:
base de dados Swiss-Prot Universal Protein Resource (UniProtKB\Swiss-Prot)
versão 55.4 (um banco de dados de proteinas curado que fornece anotações
de alto nível - nível minimo de redundância e alto nível de integração com
outros bancos de dados), mínimo de três peptídeos necessários para a
correspondência, tolerância de massa de 50 ppm e, pelo menos, 15% de
cobertura da proteína total.
39
5) RESULTADOS
5.1) DETECÇÃO DO DNA DO EBV NO SANGUE PERIFÉRICO
5.1.1) DETECÇÃO DO DNA DO EBV NO SANGUE PERIFÉRICO DOS
PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN
Foi realizada a pesquisa do DNA do EBV no “buffy coat” e no plasma dos 30
pacientes com LH pela técnica de PCR qualitativo.
A pesquisa da presença do EBV no gânglio envolvido pelo LH foi feita pela
técnica de imuno-histoquímica para LMP-1.
Os resultados aparecem na Tabela 1.
40
Tabela 1 – Detecção do EBV no sangue periférico e no gânglio dos 30
pacientes com LH
Pacientes DNA do EBV no
“buffy coat”
DNA circulante do
EBV no plasma
IHQ
1 positivo negativo
negativo
2 positivo positivo
positivo
3 negativo positivo
positivo
4 ND negativo
negativo
5 positivo positivo
positivo
6 negativo negativo
negativo
7 negativo negativo
negativo
8 negativo negativo
negativo
9 negativo negativo
negativo
10 positivo positivo
positivo
11 positivo positivo
negativo
12 positivo positivo
positivo
13 positivo positivo
negativo
14 positivo positivo
negativo
15 positivo positivo
positivo
16 positivo positivo
positivo
17 negativo negativo
negativo
18 positivo negativo
negativo
19 negativo negativo
negativo
20 positivo positivo
positivo
21 positivo negativo
negativo
22 positivo positivo
positivo
23 negativo negativo
negativo
24 positivo negativo
negativo
25 positivo negativo
negativo
26 negativo negativo
positivo
27 positivo negativo
negativo
28 negativo negativo
negativo
29 positivo positivo
positivo
30 negativo negativo
negativo
ND: não disponível
IHQ: imuno-histoquímica
41
5.1.2) DETECÇÃO DO DNA DO EBV NO SANGUE PERIFÉRICO DOS
CONTROLES SAUDÁVEIS
A detecção do DNA do EBV no “buffy coat” e no plasma dos indivíduos
saudáveis foi feita pela técnica de PCR qualitativo. O resultados estão
descritos na Tabela 2.
Tabela 2 - Detecção do DNA do EBV no sangue periférico dos indivíduos
saudáveis
Pacientes DNA do EBV no “buffy
coat”
DNA do EBV no
plasma
1 negativo negativo
2 negativo negativo
3 negativo negativo
4 negativo negativo
5 negativo negativo
6 negativo negativo
7 negativo negativo
8 negativo negativo
9 positivo negativo
10 positivo positivo
11 positivo negativo
12 negativo negativo
13 negativo negativo
5.2) SELEÇÃO DOS PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN PARA A
ANÁLISE PROTEÔMICA
Foram selecionados os pacientes com base no status do EBV no “buffy coat”,
no plasma e no gânglio envolvido pelo LH. Os pacientes HIV-positivos,
identificados pelos números 5, 12, 15, 16, 20 e 29 na Tabela 1, foram
excluídos.
O “pool” de soro de pacientes com LH não-associado ao EBV foi composto,
portanto, por amostras de 9 pacientes, identificados pelos números 6, 7, 8,
9, 17, 19, 23, 28 e 30 na Tabela 1.
42
O “pool” de soro de pacientes com LH associado ao EBV foi, por sua vez,
composto por amostras de 7 pacientes, aos quais foram atribuídos os
números 2, 3, 10, 11, 13, 14 e 22 na Tabela 1.
5.2.1) CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES COM LINFOMA DE
HODGKIN NÃO-ASSOCIADO AO EBV
Nove pacientes com LH não-associado ao EBV participaram do estudo. A
idade mediana foi de 29 anos e 55% foram do sexo feminino. As suas
características estão na Tabela 3.
Tabela 3 – Características de cada paciente com LH não-associado ao EBV
Pacientes Idade Sexo Estágio Subtipo
6 22 M II AX EN
7 46 M II AX EN
8 32 M III A EN
9 19 F II A EN
17 34 F I AX EN
19 34 M II AX EN
23 29 F II B EN
28 27 F II B EN
30 25 F II A EN
F: feminino; M: masculino; EN: esclerose nodular.
5.2.2) CARACTERÍSTICAS DOS PACIENTES COM LINFOMA DE
HODGIN ASSOCIADO AO EBV
Sete pacientes com LH associado ao EBV participaram do estudo. A idade
mediana foi de 23 anos e 71% foram do sexo feminino. As suas
características estão na Tabela 4.
43
Tabela 4 – Características de cada paciente com LH associado ao EBV
Pacientes Idade Sexo Estágio Subtipo
2 56 F IV BS DL
3 15 F IV B EN
10 21 M III A EN
11 20 F II A EN
13 25 F IV BX EN
14 23 F IV BX EN
22 27 M III B EN
F: feminino; M: masculino; EN: esclerose nodular; DL: depleção linfocítica.
5.3) SELEÇÃO DO GRUPO CONTROLE PARA A ANÁLISE PROTEÔMICA
O “pool” de soro do grupo controle foi feito com a utilização de amostras de
10 indivíduos saudáveis, identificados pelos números 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12
e 13 na Tabela 2.
5.4) ANÁLISE PROTEÔMICA EM GEL BIDIMENSIONAL (2D-E)
A média de spots por gel foi de 265 spots, e 84 spots (35%) foram
identificados. As Figuras 1, 2 e 3 representam os géis 2D-E das proteínas
séricas identificadas no grupo de pacientes com LH não-associado ao EBV, no
grupo de pacientes com LH associado ao EBV e no grupo controle,
respectivamente.
As proteínas identificadas no “pool” de soro dos pacientes com LH e dos
indivíduos saudáveis, com seus respectivos nomes, identificação, ponto
isoelétrico (pI) e massa molecular, encontram-se na Tabela 5 e no Anexo
8.4.
44
Na Tabela 6 foram relacionadas as proteínas diferencialmente expressas,
comparando-se os pacientes com LH associado ao EBV com o grupo controle
e os pacientes com LH não-associado ao EBV com o grupo controle.
Na Tabela 7 foram identificadas as proteínas diferencialmente expressas,
comparando-se os pacientes com LH entre si (LH associado ao EBV versus
LH não-associado ao EBV).
Nas Tabelas 8, 9 e 10 foram identificados o gene relacionado e a localização
de cada uma das proteínas diferencialmente expressas nos dois subgrupos
de pacientes com LH, quando comparados ao grupo controle. Somente uma
proteína identificada como plasminogênio teve diminuição da sua expressão
no grupo de pacientes com LH não-associado ao EBV.
Os Gráficos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 ilustram as funções moleculares e biológicas das
proteínas diferencialmente expressas.
45
Figura 1 – Gel 2D-E de proteínas séricas identificadas no grupo de pacientes
com LH não-associado ao EBV
46
Figura 2 - Gel 2-DE de proteínas séricas identificadas no grupo de pacientes
com LH associado ao EBV
47
Figura 3 - Gel 2D-E de proteínas séricas identificadas no grupo controle
48
Tabela 5 – Identificação das proteínas encontradas no soro de pacientes com
LH e de indivíduos saudáveis
.
N
o
do spot Nome da proteína Identificação pI Massa Molecular
46 e 50 Fator B do complemento CFAB HUMAN 6,67 86847
47, 49 e 311 Plasminogênio PLMN HUMAN 7,04 93247
68 Gelsolina 5,90 86043
69 Afamina AFAM HUMAN 5,64 70963
79 e 85 Hemopexina HEMO HUMAN 6,55 52385
87 Alfa-1 B glicoproteína A1BG HUMAN 5,58 54809
91 Protrombina THRB HUMAN 5,64 71475
98 Serotransferrina TRFE HUMAN 6,81 79280
102 Alfa 1 antiquimotripsina AACT HUMAN 5,33 47792
107, 109, 133,
236 e 278
Albumina ALBU HUMAN 5,92 71317
137 Ig alfa-1 cadeia C IGHA1HUMAN 6,08 38486
160, 278, 331,
350 e 354
Cadeia alfa do fibrinogênio FIBA HUMAN 5,70 95656
165 e 305 Inibidor da inter-alfa-tripsina
cadeia pesada H4
ITIH4 HUMAN 6,51 103489
177, 178 e 180 Cadeia beta do fibrinogênio FIBB HUMAN 8,54 56577
190, 195 e 197 Cadeia gama do fibrinogênio FIBG HUMAN 5,37 52106
233 CD5 antigeno-like CD5L HUMAN 5,28 39603
238, 251 e 254 Haptoglobina HPT HUMAN 6,13 45861
239 Actina citoplasmática ACTB HUMAN 5,29 42052
247 Apolipoprotein A-IV APOA4HUMAN 5,28 45371
255 Complemento C3 CO3 HUMAN 6,02 188569
259 Clusterina CLUS HUMAN 5,89 53031
263, 333 e 334 Alfa-1 antitripsina A1AT HUMAN 5,37 46878
268 e 276 Complemento C4-A CO4A 6,65 194247
278 Ig kappa cadeia C KAC HUMAN 5,58 11773
279 e 293 Ig gamma cadeia C IGHG1HUMAN 8,46 36596
284 Proteína C reativa CRP HUMAN 5,45 25194
285 Apolipoproteína A-I APOA1HUMAN 5,56 30759
287 Subcomponente do
Complemento C1q
subunidade B
C1QB HUMAN 8,83 26670
295, 296 e 297 Haptoglobina HPT HUMAN 6,13 45861
299 Transtiretina TTHY HUMAN 5,52 15991
300 Hemoglobina subunidade
beta
HBB HUMAN 6,75 16102
315 Complemento C4-B CO4B HUMAN 6,73 194212
326 Alfa-2 glicoproteína rico em
leucina
A2GL HUMAN 6,45 38382
329 Calicreína plasmática KLKB1HUMAN 8,60 73433
355 Complemento factor H
relacionado à proteína 1
FHR1 HUMAN 7,75 38777
pI: ponto isoelétrico
49
Tabela 6 – Avaliação das proteínas diferencialmente expressas no soro dos
pacientes com LH associado e LH não-associado ao EBV em relação aos
controles
N
o
do
spot
Nome da proteína LH com EBV p valor LH sem EBV p valor
46 Fator B do complemento
2,11
0,059
2,49
0,033
47 Plasminogênio
-2,82
0,026
49 Plasminogênio
-2,01
0,027
50 Fator B do complemento 1,97 0,001
2,15
0,05
68 Gelsolina -0,90 0,315 1,67 0,068
79 Hemopexina 1,63 0,034 1,76 0,034
85 Hemopexina
2,09
0,048 1,82 0,123
87 Alfa-1 B glicoproteína
2,13
0,006 1,90 0,009
102 Alfa 1 antiquimotripsina
2,00
0,003 1,75 0,079
109 Albumina 1,82 0,045
137 Ig alfa-1 cadeia C -1,32 0,003 1,33
165 Inibidor da inter-alfa-tripsina
cadeia pesada H4
2,12
0,018
177 Cadeia beta do fibrinogênio
-3,85
0,035 -1,34 0,076
178 Cadeia beta do fibrinogênio -1,50 0,129 0,84 0,346
180 Cadeia beta do fibrinogênio -1,34 0,115 0,90 0,312
192 Cadeia gama do fibrinogênio -1,77 0,029 -1,03 0,213
197 Cadeia gama do fibrinogênio
-2,38
0,05 -1,32 0,074
236 Albumina -1,79 0,016
238 Haptoglobina 1,88 0,01 2,36 0,095
251 Haptoglobina 1,43 0,059 1,77 0,066
254 Haptoglobina 1,82 0,043 1,85 0,006
255 Complemento C3 1,99 0,023 1,23 0,144
279 Ig gamma cadeia C 1,56 0,037 1,89 0,016
285 Apolipoproteína A-I -1,93 0,065 -1,19 0,05
293 Ig gamma cadeia C 1,70 0,027 1,94 0,027
295 Haptoglobina 0,96 0,235
3,99
0,024
296 Haptoglobina 1,23 0,109
5,12
0,027
297 Haptoglobina -0,97 0,247
5,67
0,027
305 Inibidor de inter-alfa-tripsina
Cadeia pesada H4
-1,47 0,116 1,33 0,055
311 Fibrinogênio -1,80 0,009
315 Complemento C4-B 1,87 0,049 1,58 0,026
331 Cadeia alfa do fibrinogênio 0,64 0,393 1,84 0,072
333 Alfa-1 antitripsina 1,87 0,122 -1,16 0,078
334 Alfa-1 antitri
p
sina 1,42
0,094
-1,31 0,113
Os valores com sinal negativo significam subexpressão. Os números em negrito
significam valores com ponto de corte acima de 2 vezes e p valor<0,05.
50
Tabela 7 – Identificação das proteínas diferencialmente expressas nos
pacientes com LH em relação ao status do EBV
N
o
do
spot
Nome da proteína LH associado ao EBV x LH
não-associado ao EBV
p valor
49 Plasminogênio 1,26 x -1,26 0.058
50 Fator B do complemento -1,04 x 1,04 0,179
68 Gelsolina -2,21 x 2,21 0,083
79 Hemopexina -1,02 x 1,02 0,098
85 Hemopexina -0,72 x 0,72 0,445
87 Alfa-1B glicoproteína 1,00 x -1,00 0,158
137 Ig alfa-1 cadeia C -1,78 x 1,78 0,032
177 Cadeia beta do fibrinogênio
-2,69 x 2,69
0,004
178 Cadeia beta do fibrinogênio -1,90 x 1,90 0,055
180 Cadeia beta do fibrinogênio -1,74 x 1,74 0,011
197 Cadeia gama do fibrinogênio -0,86 x 0,86 0,238
254 Haptoglobina 0,90 x -0,90 0,364
255 Complemento C3 1,58 x -1,58 0,060
279 Ig kappa cadeia C -1,14 x 1,14 0,027
285 Apolipoproteína A-I -1,57 x 1,57 0,014
293 Ig kappa cadeia C -0,94 x 0,94 0,209
295 Haptoglobina
-3,47 x 3,47
0,018
296 Haptoglobina
-3,94 x 3,94
0,039
297 Haptoglobina
-5,86 x 5,86
0,025
305 Inibidor da inter-alfa-tripsina
cadeia pesada H4
-2,85 x 2,85
0,025
315 Complemento C4-B 1,13 x -1,13 0,145
331 Cadeia alfa do fibrinogênio -1,15 x 1,15 0,070
333 Alfa-1 antitripsina 2,70 x -2,70 0,104
334 Alfa-1 antitripsina 2,61 x -2,61 0,08
Os valores com sinal negativo significam subexpressão. Os números em negrito
significam valores com ponto de corte acima de 2 vezes e p valor<0,05.
51
Tabela 8 – Identificação de proteínas com aumento da sua expressão no soro
de pacientes com LH não-associado ao EBV
No do spot Proteínas Gene relacionado Localização
46
Fator B do complemento
CFB 6p21.3
165
Inibidor de inter-alfa-
tripsina cadeia pesada H4
ITIH4 3p21-p14
295, 296 e 297
Haptoglobina
HP 16q22.3
Tabela 9 – Identificação de proteínas com aumento da sua expressão no soro
de pacientes com LH associado ao EBV
No do spot Proteínas Gene relacionado Localização
85
Hemopexina
HPX 11p15.5-p15.4
87
Alfa-1 B glicoproteína
A1BG 19q13.4
102
Alfa-1 antiquimotripsina
SERPINA3 14q32.1
Tabela 10 – Identificação de proteínas com diminuição da sua expressão no
soro de pacientes com LH associado ao EBV
No do spot Proteínas Gene relacionado Localização
47
Plasminogênio
PLG 6q26
177
Cadeia beta do fibrinogênio
FGB 4q28
197
Cadeia gama do fibrinogênio
FGG 4q28
52
Gráfico 1 – Função biológica das proteínas superexpressas no soro de
pacientes com LH não-associado ao EBV
CFB, HP
Gráfico 2 – Função molecular das proteínas superexpressas no soro de
pacientes com LH não-associado ao EBV
Gráfico 3 – Função biológica das proteínas superexpressas no soro de
pacientes com LH associado ao EBV
Circulação sanguínea e troca gasosa
Imunidade e defesa
Metabolismo e modificação de proteínas
ITIH4 e
HP
CFB e HP
CFBITIH4 e HP
Imunidade e defesa
Protease
Molécula regulatória seletiva
CFB e HP
HPX
HPX
Coenzima e metabolismo do grupo prostético
Imunidade e defesa
Metabolismo e modificação de proteínas
Transdução de sinal
Transporte
A1BG
A1BG
SERPINA3
53
Gráfico 4 – Função molecular das proteínas superexpressas no soro de
pacientes com LH associado ao EBV
HPX
A1BG
Imunidade e defesa
Receptor
Molécula regulatória seletiva
Proteína carreadora / de transferência
A1BG
SERPINA3
Gráfico 5 – Função biológica das proteínas subexpressas no soro de
pacientes com LH associado ao EBV
Indução de apoptose
Circulação sanguínea e troca gasosa
Indução negativa da proliferação e diferenciação celular
Processos de desenvolvimento
Imunidade e defesa
Metabolismo de lipídios, ácidos graxos e esteróides
Metabolismo e modificação das proteínas
Transporte
Gráfico 6 – Função molecular das proteínas subexpressas no soro de
pacientes com LH associado ao EBV
Matriz extracelular
Protease
Proteína seletiva carreadora de cálcio
Molécula regulatória seletiva
Molécula sinalizadora
P
L
G
PLG, FGB
e FGG
PLG, FGB
e FGG
PLG, FGB
e FGG
P
L
G
PLG, FGB
FGB e
FGG
e FGG
PLG
54
6) DISCUSSÃO
6.1) IMPORTÂNCIA DO ESTUDO
Os principais objetivos deste estudo foram identificar e analisar as proteínas
diferencialmente expressas no soro de pacientes com LH conforme o status
do EBV. Até o momento, não há nenhum estudo publicado sobre o assunto
na literatura mundial.
Os únicos trabalhos sobre LH e proteoma foram realizados em culturas de
células. Fuji e cols. utilizaram células lisadas, técnica de pouca utilidade para
a detecção de proteínas pouco abundantes, e o seu objetivo foi a
comparação com o proteoma em LNH e em linfoma anaplásico de grandes
células.
165, 166
No outro estudo, mais recente, foi utilizado o sobrenadante de quatro
linhagens celulares de LH sem soro. Assim, muitas das 1290 proteínas
encontradas não eram verdadeiramente secretadas pelas células RS e
linfócitos, mas provenientes da necrose celular devido à viabilidade e
proliferação celular reduzidas. Além disso, muitas proteínas identificadas
como secretadas podem ter somente um papel intracelular e não serem
encontradas no soro de pacientes com LH. Uma outra crítica a este estudo é
o fato de a maioria das proteínas, quando confirmadas pela técnica da
imuno-histoquímica, aparecerem somente em algumas das linhagens
celulares da LH e não em todas.
169
6.2) DEFINIÇÃO DO STATUS EBV POSITIVO E EBV NEGATIVO
Em nosso estudo, os pacientes com LH foram divididos em dois grupos: LH
não-associado ao EBV e LH associado ao EBV. Foram considerados como
55
pacientes com LH não-associado ao EBV aqueles que apresentavam
negatividade para o EBV nos seguintes materiais biológicos: “buffy coat”,
plasma e gânglio. Diferentemente do grupo anterior, foram considerados
pacientes com LH associado ao EBV aqueles pacientes com positividade em
dois dos três materiais biológicos estudados, sendo obrigatória a presença do
DNA livre circulante do EBV no plasma. Todos os pacientes tinham sorologia
negativa para o HIV.
No estudo realizado por Gallagher e cols,
66
também foram demonstrados
casos de LH positivos para o DNA circulante do EBV pela técnica de RT-PCR e
negativos para imuno-histoquímica no gânglio. A explicação para isto pode
ser a maior sensibilidade do PCR qualitativo no sangue em relação à técnica
de imuno-histoquímica. A outra possibilidade é a não detecção do EBV no
gânglio em alguns casos somente pela técnica de imuno-histoquímica,
apesar da alta correlação existente entre este método e a hibridização in
situ,
173
técnica freqüentemente utilizada em estudos.
66
Sabe-se que o EBV, após a infecção primária, encontra-se latente nos
linfócitos B. Devido à imunossupressão decorrente do LH, ocorreria então a
reativação e replicação do vírus, e a sua conseqüente detecção nas células
mononucleares do sangue. Wagner e cols., através da técnica de RT-PCR,
demonstraram que os pacientes com LH que apresentavam o DNA livre
circulante do EBV no plasma, tinham uma carga viral maior do EBV nas
células mononucleares do que aqueles que não apresentavam o DNA
circulante do EBV.
127
Desta forma, a técnica mais sensível para a presença do EBV no organismo é
a detecção do DNA livre circulante no plasma. Em nosso estudo, para
56
considerarmos os pacientes com LH associado ao EBV, além da positividade
para o DNA livre circulante do EBV, exigimos a presença do EBV em outro
material biológico para afastar a falsa positividade no plasma pela técnica de
PCR qualitativa.
Apesar de a presença do EBV no gânglio envolvido pelo LH ser o padrão-ouro
para determinação do LH associado ao EBV, a simples presença do EBV no
sangue periférico poderia ser um fator de confundimento na identificação de
proteínas diferencialmente expressas relacionadas ao EBV. Assim, caso o
critério utilizado fosse o status do EBV apenas no tecido ganglionar, muitos
pacientes supostamente negativos, mas com replicação do EBV no sangue,
seriam considerados como EBV-negativos.
6.3) PROTÉINAS COM EXPRESSÃO AUMENTADA NO “POOL” DE SORO
DOS PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN NÃO-ASSOCIADO AO
EBV
No “pool” de soro dos pacientes com LH não-associado ao EBV foram
encontradas três proteínas superexpressas quando comparado ao “pool” do
grupo controle: fator B do complemento (“complement factor B” - CFB),
inibidor de inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4 (“inter-alpha-trypsin inhibitor
heavy chain H4” – ITIH4) e haptoglobina (“haptoglobin” – HP).
6.3.1) FATOR B DO COMPLEMENTO
O fator B do complemento (“complement factor B” - CFB), também
conhecido como fator-B, properdina, pró-acelerador C3, pró-ativador C3,
convertase C3/C5 e beta-glicoproteína rica em glicina, é codificado pelo gene
humano CFB localizado no cromossomo 6p21.3.
174
O CFB é um componente
57
da via alternativa da ativação do complemento e circula no sangue como um
polipeptídeo de cadeia única. Na ativação da via alternativa, o CFB é clivado
pelo fator D do complemento e é dividido em cadeia Ba não-catalítica e
cadeia Bb catalítica. A subunidade Bb ativa é uma serina protease que se
associa ao C3B para formar a convertase C3 da via alternativa.
175
Bb está
envolvida na proliferação de linfócitos B pré-ativados, enquanto que Ba inibe
a proliferação.
176,
177
Além do papel na ativação de linfócitos B, o CFB participa na fagocitose
bacteriana pelos macrófagos, na citotoxicidade de monócitos,
178,179
na
disseminação de macrófagos
180,
181
e na imunossupressão.
182
Estudos anteriores relacionaram o aumento desta proteína a diversos
processos inflamatórios, imunológicos e de citotoxicidade bacteriana.
183, 184
A
elevação dos níveis de CFB já foi descrita no choque séptico, acidente
vascular encefálico, LES, doença de Alzheimer, esclerose múltipla,
traumatismo crânio-encefálico e meningite meningocócica.
185-189
Em
doenças neoplásicas, o aumento de expressão do CFB também foi observado
no soro de pacientes com o carcinoma de mama, pela técnica de gel 2D-E.
190
Embora o CFB seja primariamente sintetizado pelo fígado,
191
ele também é
produzido em baixos níveis por uma variedade de células extra-hepáticas,
incluindo macrófagos/monócitos,
192,193
fibroblastos,
194
células epiteliais e
células endoteliais.
195,196
Nos sítios de inflamação, os macrófagos contribuem
para o aumento local de CFB. A regulação da sua expressão é feita por
citocinas inflamatórias, principalmente interferon-gama (IFN-gama) e fator
de necrose tumoral-alfa (“alpha-tissue necrosis factor” – TNF-alfa).
197, 198
58
Embora alguns estudos tenham documentado a indução do CFB por citocinas
pró-inflamatórias, como IFN-gama e TNF-alfa, pouco se sabia sobre o
mecanismo de indução do CFB por estas citocinas. Os dados de um estudo,
publicado em 2002, confirmaram a hipótese da regulação do CFB pelo TNF-
alfa através da utilização das subunidades p50 e p65 do fator nuclear Kappa
B (NF-ĸB), via sabidamente envolvida na patogênese do LH.
199
No LH, as
vias de expressão e atividade das citocinas estão relacionadas à ativação da
via do NF-ĸB.
200
Desta forma, o CFB poderia ser um biomarcador de ativação do NF-ĸB nos
pacientes com LH não-associado ao EBV, uma vez que a via alternativa do
complemento é preferencialmente ativada.
6.3.2) INIBIDOR DA INTER-ALFA-TRIPSINA CADEIA PESADA H4
A segunda proteína superexpressa identificada nos pacientes com LH não-
associado ao EBV, quando comparada aos indivíduos saudáveis, foi o inibidor
de inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4 (“inter-alpha-trypsin inhibitor heavy
chain H4” – ITIH4). O ITIH4, também conhecido como calicreína plasmática,
H4P, IHRP, PK120 e ITIHL1, é codificado pelo gene ITIH4 localizado no
cromossomo 3p21-p14.
174
A função biológica do ITIH4 ainda é desconhecida. Um possível papel
relacionado à modulação da migração celular e proliferação durante o
desenvolvimento de resposta de fase aguda tem sido discutido.
Em um estudo, pesquisadores identificaram aumento nos níveis séricos do
ITIH4 (de 1,4 a 3 vezes) em pacientes do sexo masculino com infarto agudo
do miocárdio e angina instável. Utilizando-se a linhagem de células do
59
hepatocarcinoma HepG2, foi observado o aumento de expressão do mRNA
após tratamento com interleucina-6 (IL-6).
201
A IL-6 é uma citocina
pleiotrópica com funções endócrinas, pró-inflamatórias e antiinflamatórias,
que é induzida por infecções virais, lipopolisacarídeos e uma variedade de
citocinas.
202
Esta citocina raramente é detectada em indivíduos saudáveis,
porém está em níveis elevados em pacientes com LH.
203
Os níveis altos de
IL-6 podem, portanto, estimular a síntese do ITIH4 nos pacientes com LH.
Em estudo recém-publicado, foi avaliada a expressão do ITIH4 no soro de
pacientes com 5 tipos de câncer. Nos pacientes com carcinoma de mama
(n=10), carcinoma epitelial de ovário (n=10) e carcinoma de células
germinativas de ovário (n=10), foi verificado um aumento da expressão do
ITIH4 quando comparado ao grupo controle. No entanto, o mesmo não foi
observado nos pacientes com osteosarcoma (n=7) e carcinoma de
nasofaringe (n=13).
204
Em nosso estudo, o ITIH4 somente teve expressão aumentada no grupo de
pacientes com LH não-associado ao EBV (p=0,018). Já no grupo de
pacientes com LH associado ao EBV, o ITIH4 não foi expresso, como ocorreu
no grupo de pacientes com carcinoma de nasofaringe.
204
O carcinoma de
nasofaringe é uma neoplasia sabidamente associada ao EBV,
18, 120, 121
o que
nos leva a imaginar que a presença do EBV pode levar a não-expressão
desta proteína.
6.3.3) HAPTOGLOBINA
A terceira e última proteína identificada como superexpressa no grupo de
pacientes com LH não-associado ao EBV, ao se comparar com o grupo
controle, foi a haptoglobina (“haptoglobin” – HP), também conhecida como
60
BP, HPA1S e HP2-alfa-2, e que é produzida pelo gene contido no
cromossomo 16q22.3. Este gene codifica uma pré-proteína, que é
processada para produzir cadeias alfa e beta, com consequente combinação
como um tetrâmero para produzir a HP. A HP é produzida principalmente
pelos hepatócitos, mas também pela pele, pulmão e rim.
174
A HP se liga à hemoglobina livre no plasma, o que permite que as enzimas
de degradação tenham acesso à hemoglobina. Isto previne a perda de ferro
através da urina e protege os rins de lesões causadas pela hemoglobina,
além de impedir a utilização do ferro pelas bactérias nos quadros
infecciosos.
174
Alguns estudos têm atribuído uma atividade pró-angiogência à
HP.
205
Este gene está relacionado à nefropatia diabética, à incidência de doença
coronária no diabetes tipo 1, à doença de Crohn, às doenças inflamatórias, à
colangite esclerosante primária, à susceptibilidade à doença de Parkinson
idiopática e à incidência reduzida de malária por Plasmodium falciparum.
206-
210
As mutações neste gene e/ou nas suas regiões de regulação causam
ahaptoglobinemia ou hipohaptoglobinemia. Um gene duplicado similar está
localizado próximo a este gene no cromossomo 16. Múltiplas variantes de
transcritos que codificam diferentes isoformas foram encontradas para este
gene.
174
A HP é conhecida como uma proteína de fase aguda, porém o seu papel na
modulação da reação inflamatória não está claro. Já foi demonstrado que a
HP pode atuar tanto como um fator imunossupressor da responsividade de
linfócitos quanto como um inibidor da síntese de prostaglandinas.
211
61
Concentrações aumentadas de HP,
140,212,213
bem como alterações na sua
glicosilação
214
e mudanças na distribuição dos seus fenótipos
215
já foram
observadas em diferentes tipos de câncer, dentre eles o câncer de pulmão.
A HP é considerada hoje um sinal inespecífico de reação inflamatória no
câncer.
213
O LH é, sabidamente, um linfoma caracterizado pela presença da
célula RS, encontrada em meio a um microambiente composto por células
inflamatórias e fibrose.
34, 67, 68
Uma outra possível explicação para o aumento dos níveis da HP é a sua
produção pelas células tumorais. A sustentação para esta hipótese são os
achados de síntese ectópica da HP em diferentes sítios extra-hepáticos,
174
a
presença da proteína relacionada à HP nas biópsias de câncer de mama,
216
a
identificação da HP como um imunossupressor presente nas efusões
malignas,
217
e finalmente, a liberação do complexo multiprotéico contendo
HP pelas células tumorais in vitro.
218
Em 1998, pesquisadores israelenses estudaram os níveis de HP no soro de
88 pacientes com LNH, 30 pacientes com LH e 61 indivíduos saudáveis, e
verificaram que os níveis de HP foram mais altos nos pacientes do que nos
controles (p=0,0001). Os níveis de HP diminuíram após o tratamento nos 41
pacientes testados, 38 dos quais atingiram remissão completa. Durante a
recaída em 3 pacientes, os níveis de HP voltaram a se elevar. Os autores
concluíram que a HP sérica seria um novo marcador de potencial uso em
pacientes com linfoma.
219
Foi observado um aumento nos níveis de HP somente no grupo de pacientes
com LH não-associado ao EBV em nosso estudo. Em um relato de caso de
uma criança de 27 meses com pancitopenia, hepatoesplenomegalia e
62
linfadenomegalia persistente desde os 6 meses de vida, foi observada a
replicação do EBV com níveis baixos de haptoglobina.
220
Portanto, os níveis
baixos da HP no grupo de pacientes com LH associado ao EBV, quando
comparados ao grupo de pacientes com LH não-associado ao EBV, podem
ocorrer devido à hemólise induzida pelo vírus ou por outro mecanismo ainda
não conhecido.
6.4) PROTEÍNAS COM EXPRESSÃO AUMENTADA NO “POOL” DE SORO
DOS PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN ASSOCIADO AO EBV
Já no “pool” de soro dos pacientes com LH associado ao EBV foram
encontradas três proteínas superexpressas, quando comparado ao “pool” do
grupo controle: hemopexina (“hemopexin” – HPX), alfa-1B glicoproteína
(“alpha-1B glycoprotein” – A1BG) e alfa-1 antiquimotripsina (“alpha-1
antichymotrypsin” – SERPINA3).
6.4.1) HEMOPEXINA
A hemopexina (“hemopexin” – HPX), cujo gene está localizado no
cromossomo 11p15.5-p15.4, é uma glicoproteína carreadora de heme, que,
após a HP, forma uma segunda linha de defesa contra a lesão oxidativa
mediada pela hemoglobina durante a hemólise intravascular. A diminuição
dos níveis séricos da HPX reflete uma liberação recente de compostos heme
no compartimento extra-celular.
221
Alterações dos níveis plasmáticos ou séricos da HPX são encontrados não
somente na anemia hemolítica, mas em outras condições clínicas como
doenças neuromusculares crônicas e porfíria intermitente aguda, onde a sua
utilidade diagnóstica é ainda pouco clara.
221
63
Ao estudarem 22 antígenos no soro de 29 pacientes com LH, pesquisadores
franceses subdividiram os pacientes em 2 grupos conforme a gravidade dos
sintomas clínicos. No grupo de pacientes com LH e piores sintomas, foi
observado um aumento dos níveis de HPX, antitripsina, orosomucóide e
ceruloplasmina, além de diminuição dos níveis de albumina, transferrina e
alfa-1-antilipoproteína.
222
Apesar de a análise da presença do EBV no LH em relação às sobrevidas
global e livre de eventos mostrar resultados controversos nos diferentes
estudos publicados,
223-227
sabe-se que o EBV está associado com estádios
avançados do LH ao diagnóstico.
130
Em nosso estudo, a HPX foi superexpressa nos pacientes com LH associado
ao EBV em relação aos controles (p=0,048). Desta forma, a HPX poderia ser
um possível marcador do LH associado ao EBV ou de doença avançada.
Em 1993, pesquisadores italianos observaram que as regiões promotoras de
três genes indutores, HP, HPX e proteína C reativa, contêm elementos
responsivos à IL-6, que são necessários e suficientes para induzir a ativação
da transcrição destes genes pela IL-6,
228
citocina sabidamente envolvida na
patogênese do LH. Desta forma, a IL-6 poderia contribuir para o aumento
dos níveis de HP e HPX nos pacientes com LH.
6.4.2) ALFA-1B GLICOPROTEÍNA
A segunda proteína com aumento da sua expressão nos pacientes com LH
associado ao EBV, quando comparados à expressão da mesma proteína no
grupo controle, foi a alfa-1B glicoproteína (“alpha-1B glycoprotein” – A1BG),
64
também conhecida como A1B, ABG e GAB. A A1BG é codificada pelo gene
localizado no cromossomo 19q13.4.
174
A função da A1BG é desconhecida. Esta proteína tem uma sequência similar
a várias regiões de algumas proteínas membros da família de supergenes da
imunoglobulina, que somente foi determinada em 1986 por Ishioka.
229
Até pouco tempo, não havia estudos que demonstrassem a correlação dos
níveis de A1BG com qualquer doença. Sabe-se que a A1BG está presente no
sangue de adultos normais em uma concentração de 22mg/dl.
Em 2007, Kreunin e cols. encontraram aumento da expressão da A1BG,
através da análise proteômica, na urina de pacientes com câncer de bexiga.
Todos os 186 pacientes com câncer de bexiga apresentaram aumento dos
níveis de A1BG, enquanto que a dita proteína não foi encontrada na urina de
nenhum dos indivíduos saudáveis.
230
Estudos posteriores poderão confirmar e esclarecer o aumento de expressão
da A1BG no soro dos pacientes com LH associado ao EBV.
6.4.3) ALFA-1 ANTIQUIMOTRIPSINA
A terceira e última proteína superexpressa no grupo de pacientes com LH
associado ao EBV em relação ao grupo controle foi a alfa-1 antiquimotripsina
(“alpha-1 antichymotrypsin” – SERPINA3), também conhecida como inibidor
de serpina peptidase, anti-quimotripsina, proteína inibidora do crescimento
24, proteína inibidora do crescimento 25 e inibidor de serina (ou cisteína)
proteinase. A proteína, codificada por um gene localizado no cromossomo
14q32.1, é um inibidor de protease plasmática e membro da classe de
inibidores da serina protease.
174
65
Os polimorfismos na SERPINA3 parecem ser tecido-específicos e influenciar o
alvo da protease. As variações na seqüência desta proteína foram
identificadas na doença de Alzheimer,
231
e a deficiência da SERPINA3 foi
associada à doença hepática. Já as mutações foram observadas em
pacientes com doença de Parkinson
232
e com doença pulmonar obstrutiva
crônica.
174
Os inibidores de serina proteinase compõem uma superfamília de proteínas
com diversas funções, que incluem o controle da coagulação sanguínea,
ativação do complemento, morte celular programada e desenvolvimento. A
SERPINA3 é uma das serpinas mais abundantes, juntamente com a alfa-1
anti-tripsina. Durante a inflamação, os níveis circulantes de SERPINA3
podem aumentar até quatro a cinco vezes. O maior sítio para aumento da
síntese da SERPINA3 é o fígado. Outros tecidos, como o pulmão, são capazes
de sintetizá-la, e a sua expressão pode aumentar até 100 vezes, induzida
pelas citocinas.
233
Já foi descrito que a permanente estimulação de IL-6 nos indivíduos com
doenças malignas pode ocorrer por causa dos altos níveis circulantes de
SERPINA3,
234
a maioria na sua forma inativa, juntamente com outras
proteínas de fase aguda. Na verdade, as próprias células tumorais agiriam
como uma fonte de SERPINA3 inativa,
235,
236
e a sua conversão ocorreria in
situ.
Antes de a SERPINA3 ser associada ao carcinoma de próstata,
237
pesquisadores poloneses investigaram os níveis de algumas antiproteases
em 24 pacientes com LH. Eles encontraram diminuição da concentração de
66
alfa-2 macroglobulina e aumento dos níveis de inibidor de alfa-1 proteinase e
de SERPINA3,
238
o que foi condizente com o nosso estudo.
A SERPINA3 teve a sua expressão aumentada somente no soro de pacientes
com LH associado ao EBV quando comparado ao grupo controle (p=0,003), o
que sugere ter o EBV um papel importante na sua expressão.
6.5) PROTEÍNAS COM EXPRESSÃO DIMINUÍDA NO “POOL” DE SORO
DOS PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN
6.5.1) PLASMINOGÊNIO
Apenas uma proteína teve a sua expressão diminuída nos dois subgrupos de
pacientes com LH, independente do status do EBV: plasminogênio
(“plasminogen” - PLG).
O PLG, codificado por um gene contido no cromossomo 6q26, é um
zimogênio circulante que é convertido à plasmina enzimática ativa pela
clivagem do peptídeo entre arg560 e val561. Esta conversão é mediada pela
uroquinase e pelo ativador do plasminogênio tecidual (“tissue plasminogen
activator” – TPA). A principal função da plasmina é dissolver os coágulos de
fibrina. A plasmina, como a tripsina, pertence à família das serinas
proteases.
174
As outras funções do PLG estão relacionadas à indução da apoptose e à
indução negativa da proliferação celular.
174
Como o PLG encontra-se em
níveis diminuídos nos pacientes com LH, concluímos que o mecanismo de
indução da apoptose está prejudicado e não há bloqueio da proliferação
celular, eventos comuns às neoplasias em geral. Em 1965, McAndrew já
havia descrito a diminuição dos níveis de PLG nos pacientes com LH.
239
67
A diminuição dos níveis séricos de PLG nos pacientes com LH é, portanto, um
fator independente da presença do EBV.
6.5.2) CADEIAS BETA E GAMA DO FIBRINOGÊNIO
As últimas proteínas identificadas e que foram subexpressas no “pool” de
soro dos pacientes com LH associado ao EBV, ao se comparar com o “pool”
de soro dos indivíduos saudáveis, foram a cadeia beta do fibrinogênio
(“fibrinogen beta chain” – FGB) e a cadeia gama do fibrinogênio (“fibrinogen
gama chain” – FGG).
As cadeias beta do fibrinogênio (“fibrinogen beta chain” – FGB) e gama do
fibrinogênio (“fibrinogen gamma chain” – FGG) são codificadas por um gene
localizado no cromossomo 4q28. O fibrinogênio é uma glicoproteína formada
por três pares de cadeias polipeptídicas não-idênticas. Após a lesão vascular,
o fibrinogênio é clivado pela trombina para formar a fibrina, que é o
componente mais abundante nos coágulos. Além disto, vários produtos
clivados do fibrinogênio e da fibrina regulam a adesão celular e a
proliferação, possuem atividades vasoconstrictoras e quimiotáticas, e são
mitógenos para vários tipos celulares. As mutações neste gene podem levar
a várias doenças, que incluem afibrinogenemia, disfibrinogenemia,
hipodisfibrinogenemia e trombofilia.
174
Apesar de ser sabidamente um marcador de inflamação, bem como proteína
C reativa e citocinas pró-inflamatórias, as FGB e FGG tiveram os seus níveis
diminuídos no soro de pacientes com LH associado ao EBV.
68
Já foi descrito que as citocinas interleucina-4 (IL-4), interleucina-10 (IL-10) e
interleucina-13 (IL-13) têm papel protetor contra a lesão vascular que leva a
aterosclerose, e levam a uma diminuição da biossíntese do fibrinogênio.
240,241
A IL-10 é produzida por células Th2, células B e macrófagos, antagoniza os
efeitos das citocinas inflamatórias, que inclui o TNF, IL-1 e IL-6, e inativa a
apresentação de antígenos e respostas imunes mediadas por células.
242
No contexto do LH, a IL-10 é produzida pelas células RS, com maior
expressão nas células RS infectadas por EBV quando comparadas com as
células EBV-negativas, o que sugere que possa proteger as células RS EBV-
positivas de ataques imunes.
243
Os níveis séricos de IL-10 correlacionam-se,
em muitos estudos, com o prognóstico de pacientes com LH, especialmente
na doença avançada.
244, 245
Portanto, nos pacientes com LH associado ao EBV, os níveis elevados de IL-
10 podem diminuir a expressão do fibrinogênio.
Um estudo publicado em 2006 corrobora o nosso achado. Shi e cols.
observaram declínio dos níveis plasmáticos da cadeia alfa do fibrinogênio
(“fibrinogen alpha-chain” – FGA) em pacientes com câncer de mama HER2-
positivo, que se tornaram normais após a cirurgia de mastectomia. Foi
sugerido, portanto, que a FGA pudesse ser um marcador de doença nestas
pacientes.
246
6.6) PROTEÍNAS DIFERENCIALMENTE EXPRESSAS ENTRE OS DOIS
GRUPOS DE PACIENTES COM LINFOMA DE HODGKIN
Ao compararmos os dois grupos segundo o status do EBV (pacientes com LH
não-associado ao EBV versus pacientes com LH associado ao EBV),
69
identificamos três proteínas com diferença estatisticamente significativa:
ITIH4, HP e FGB.
O ITIH4 e a HP foram superexpressas nos pacientes com LH não-associado
ao EBV, enquanto que o FGB foi subexpresso nos pacientes com LH
associado ao EBV, com diferença estatisticamente significativa. Estes
achados nos levam a colocar tais proteínas como verdadeiras discriminantes
da presença ou não do EBV no soro de pacientes com LH, mas estudos
futuros irão contribuir para o esclarecimento de tais resultados.
O LH é uma doença excepcional em sua epidemiologia e biologia. Os estudos
epidemiológicos apontaram durante muito tempo para o EBV como um fator
etiológico para o LH. Entretanto, ao contrário do que seria esperado, a
descoberta do EBV nas células RS, em 1987, não levou ao esclarecimento da
relação e do papel deste vírus com o LH.
Tudo indica que esta associação não é um simples epifenômeno, pois os
estudos de clonalidade referem que a infecção ocorre antes da expansão
clonal das células tumorais. Contudo, embora a infecção pelo EBV seja
ubíqua, o vírus é encontrado de maneira variável no LH e sua frequência
varia de forma dramática nas populações estudadas.
Através da avaliação pela técnica proteômica, foi possível identificar dois
padrões proteômicos distintos no soro de pacientes com LH conforme o
status do EBV.
Assim, é possível que a análise proteômica do LH possa ser utilizada para o
prognóstico destes pacientes. As possíveis aplicações seriam a predição da
70
resposta clínica, a definição de pacientes de alto risco, a predição de recaída
e a detecção precoce do LH.
No entanto, para a aplicação adequada das técnicas para prognóstico do LH,
algumas medidas serão necessárias: a padronização do método de detecção
das proteínas diferencialmente expressas, a validação dos marcadores para a
utilização prognóstica através de estudos prospectivos e controlados e,
consequentemente, a realização de estudos com um maior número de
pacientes e estatística apropriada.
6.7) LIMITAÇÕES DO ESTUDO
Este foi um estudo inicial para a identificação de proteínas presentes no soro
de pacientes com LH, com a utilização da técnica proteômica.
Dos 30 pacientes com LH sem tratamento prévio, somente 16 pacientes
foram selecionados para a realização do “pool” de soro. Isto ocorreu devido à
exclusão de pacientes portadores de HIV/SIDA e daqueles com status
discordante do EBV no “buffy coat”, no soro e no tecido ganglionar.
Foi feito o “pool” de soro para eliminar das possíveis diferenças individuais de
cada paciente e, assim, facilitar a identificação das proteínas nos diferentes
grupos de pacientes com LH. Este método já foi utilizado com sucesso na
análise de proteínas séricas diferentemente expressas em alcoolátras
247
e em
pacientes com câncer de pulmão.
140
A proposta é que a presença de tais
proteínas seja avaliada em novos estudos com um número maior de
pacientes com LH e de forma individual.
O soro utilizado não foi submetido à depleção das proteínas mais
abundantes, o que dificulta a identificação das proteínas mais escassas. No
71
entanto, este procedimento aumentaria o custo do experimento. Em estudos
futuros, a técnica proteômica com a utilização de filtro proporcionaria a
identificação de proteínas mais escassas, porém com custos elevados, o que
impossibilitaria a sua utilização rotineira. Optamos, portanto, pela utilização
do chamado “soro cru” (“cruded sera”), que pode ser obtido facilmente e
espelha uma amostra do estado geral do organismo em determinado
momento.
6.8) PERSPECTIVAS
As perspectivas incluem o estudo de cada uma das proteínas
diferencialmente expressas, através da detecção de anticorpos pelas técnicas
de ELISA e Western blot. Um maior número de pacientes com LH será
avaliado, utilizando-se amostra de soro de cada paciente para a correlação
com os dados clínicos e laboratoriais, a resposta ao tratamento instituído e o
prognóstico.
72
7) CONCLUSÕES
• As proteínas identificadas como fator B do complemento (CFB), inibidor de
inter-alfa-tripsina cadeia pesada H4 (ITIH4) e haptoglobina (HP) tiveram a
sua expressão aumentada no soro de pacientes com LH não-associado ao
EBV.
• As proteínas identificadas como hemopexina (HPX), alfa-1B glicoproteína
(A1BG) e alfa-1 antiquimotripsina (SERPINA3) tiveram a sua expressão
aumentada no soro de pacientes com LH associado ao EBV.
• As proteínas identificadas como cadeia beta do fibrinogênio (FGB) e cadeia
gama do fibrinogênio (FGG) tiveram a sua expressão diminuída no soro de
pacientes com LH associado ao EBV.
• A proteína identificada como plasminogênio teve a sua expressão diminuída
no soro de pacientes com LH, independente do status do EBV.
• Dois padrões proteômicos distintos foram identificados no soro de pacientes
com LH conforme o status do EBV.
73
8) ANEXOS
8.1) ANEXO 1 – FICHA DE DADOS CLÍNICOS DOS PACIENTES COM LH
Prontuario ______._ Nome ____________________________________ No.______
Idade __ Cor ___ Sexo ___ Data do diagnostico ________ Hosp ____
Nº no Serv. Hemato ____ Nº Patologia: B.Ganglio ____.__ BMO ____.__
Outras biópsias: BP1 ____.__ BP2 ____.__ BP3 ____.__ BP4 ____.__
Tratamento previo (S/N) ___ Tempo desde tratamento previo ___
Tempo do inicio ate o diagnostico _____(meses)
APRESENTACAO INICIAL LOCALIZACAO INICIAL PERFORMANCE _
Ganglios ___ Cervical ___ 0. assintomático
Febre ___ Supra-clavicular ___ 1. sintomático mas ativo
Perda de peso ___ Axilar ___ 2. acamado < 50% dia
Sudorese ___ Inguinal ___ 3. acamado > 50% dia
A ou B ? ___ Mediastino ___ 4. preso ao leito
Dispneia ___ Derrame pleural ___
Prurido? ___ Baco ___
Figado ___
M.O. ___
Retroperitoneo ___
Ganglionar ___ Pele ___
Extra-ganglionar ___ Osso ___
No.sitios _ SNC ___
RADIOGRAFIA DE TORAX _ ULTRA-SONOGRAFIA _ TC ABDOMEN _
Massa mediastinal ou abdominal
1. Grande
2. Pequena
3. Ausente
4. Nao-realizada
Comentario ___________________________________________________________
BMO _ Puncao lombar _
74
1. Positiva
2. Negativa
3. Nao realizada
HISTOPATOLOGIA(OMS) __
Linfoma de Hodgkin classico
1. Esclerose nodular (graus I e II)
2. Linfoma de Hodgkin clássico, rico em linfocitos
3. Celularidade mista
4. Deplecao linfocitica
5.Linfoma de Hodgkin predomínio linfocítico nodular
IMUNOHISTOQUÍMICA (1.positivo 2. negativo 3. nao-realizado)
CD15 ___ CD30 ___ CD20 ___ CD45 ___ CD45Ro ___
CD3 __ CD5 ___ p53 __ bcl-2 ___
EBV (S/N)
LMP-1 (imunohistoquimica) ___ PCR do gânglio ___ PCR plasma __
PCR leucócitos ___ sorologia: IgM ___ IgG ___
PATOLOGIAS ASSOCIADAS (S/N) ___
Diabetes ___ Tuberculose ___ HIV ___ H. zoster ___ Cripto ___
Anemia imunohemolitica ___ Esquistossomose ___ Strongy ___
LABORATORIO E ESTADIAMENTO
Hemoglobina __._ Leucocitos _____ Linfócitos _____ Plaquetas ______
VHS ___ albumina __.__ LDH ____ β2-microglobulina ___
Estadio ______ Bulky? ___
SCORE PROGNOSTICO (s/N; deixar em branco se ñ houver a informação)
Alb < 4g/dl _
Hb < 10,5 g/dl _
Sexo masculino _
Idade ≥ 45 anos _
Estadio IV _
leucocitos ≥ 15 mil _
linfocitos < 600/mm3 ou < 8% _
No. de fatores presentes _
No. de fatores disponíveis _
TRATAMENTO 1 __
0. Nenhum 7. TAMO 14. clorambucil
75
1. somente radioterapia 8. IMVP 15. CEM
2. MOPP 9. ICE 16. dexametasona
3. MOPP/ABV 10. DICE 17. ciclofosfamida
4. ABVP 11. ESHAP 18. ciclof + vincrist
5. ABVD 12. Gemcitabina
6. DHAP 13. MOPP/ABVD
Periodicidade (somente ABVP) _
1. 1/8 2. 1/15
Recebeu radioterapia? ___
Modalidade de radioterapia _
1. campo envolvido
2. campo extendido (manto, Y invertido)
3. TNI (irradiação ganglionar total)
Dose de radioterapia (rads) ______
Início ________
Término ________
No. ciclos __
Remissao completa? ___
Recaida? ___
Data da recaida ________
Abandono? (S/N) ___
Data do abandono ________
Obito? (S/N) ___
Data do obito ________
Tratamento 2 (S/N) ___
TRATAMENTO 2 __
0. Nenhum 7. TAMO 14. clorambucil
1. somente radioterapia 8. IMVP 15. CEM
2. MOPP 9. ICE 16. dexametasona
3. MOPP/ABV 10. DICE 17. ciclofosfamida
4. ABVP 11. ESHAP 18. ciclof + vincrist
5. ABVD 12. Gemcitabina
6. DHAP 13. MOPP/ABVD
Recebeu radioterapia? ___
Modalidade de radioterapia _
1. campo envolvido
2. campo extendido (manto, Y invertido)
3. TNI (irradiação ganglionar total)
Dose de radioterapia (rads) ______
Inicio ________
76
Termino ________
No. ciclos __
Remissao completa? ___
Recaida? ___
Data da recaida ________
Abandono? ___
Data do abandono ________
Obito? ___
Data do obito ________
Tratamento 3 (S/N) ___
TRATAMENTO 3 __
0. Nenhum 7. TAMO 14. clorambucil
1. somente radioterapia 8. IMVP 15. CEM
2. MOPP 9. ICE 16. dexametasona
3. MOPP/ABV 10. DICE 17. ciclofosfamida
4. ABVP 11. ESHAP 18. ciclof + vincrist
5. ABVD 12. Gemcitabina
6. DHAP 13. MOPP/ABVD
Recebeu radioterapia? ___
Modalidade de radioterapia _
1. campo envolvido
2. campo extendido (manto, Y invertido)
3. TNI (irradiação ganglionar total)
Dose de radioterapia (rads) ______
Inicio ________
Termino ________
No. ciclos __
Remissao completa? ___
Recaida? ___
Data da recaida ________
Abandono? ___
Data do abandono ________
SITUAÇÃO MAIS RECENTE
Obito? ___
Data do obito ________
Ultimo follow-up ________ Status atual _
1. RC 3. Vivo com doenca
2. Obito 4. Ignorado
77
Coment: _________________________________________________________________
_________________________________________________________________
STATUS SÓCIO-ECONÔMICO (CRITÉRIO BRASIL - IBOPE)
Pontos ___ Classe social ___
78
8.2) ANEXO 2 - TERMO INFORMATIVO
A doença de Hodgkin é uma doença maligna que leva ao aumento dos gânglios
e do baço.
Há algumas evidências de que a doença de Hodgkin possa ser causada por um
vírus, denominado vírus Epstein-Barr, ou que, pelo menos, este vírus seja um
fator predisponente para o desenvolvimento da doença de Hodgkin.
Muitos trabalhos já demonstraram a presença do vírus no gânglio biopsiado de
pacientes com doença de Hodgkin. Recentemente, descobriu-se que podem ser
detectadas pequenas quantidades de material genético do vírus (o DNA) no
sangue periférico destes pacientes.
O presente estudo será realizado com a coleta de sangue dos pacientes com
doença de Hodgkin antes do início do tratamento, ao final do 4º ciclo de
quimioterapia (quando são reavaliados de acordo com o estádio inicial de
doença), ao final do tratamento quimioterápico e em casos de recaída, para
detecção do material genético circulante do vírus Epstein-Barr através da
técnica de reação de cadeia de polimerase (PCR).
A coleta, de cerca de 10 ml de sangue, será feita através da punção de uma
veia periférica por uma pessoa treinada com a utilização de agulhas e seringas
descartáveis.
As informações médicas dos pacientes envolvidos no estudo poderão ser
revisadas pelo colaborador e/ou seus representantes, pelo Comitê de Ética do
estudo e pelas autoridades regulatórias com o objetivo de verificar os
procedimentos do estudo clínico e/ou dados. As informações médicas de cada
um dos participantes serão arquivadas e processadas em computador. No
entanto, os dados pessoais serão mantidos em sigilo pelo médico do estudo e
pela equipe, e não serão disponibilizados para a publicidade, a menos que sua
violação seja exigida por lei.
Os pacientes também serão avaliados quanto à presença do vírus Epstein-Barr
na biópsia de gânglio no momento do diagnóstico.
Você poderá ser informado pela equipe responsável de qualquer nova
descoberta ocorrida a respeito de sua doença durante o tratamento, se assim o
desejar.
Assim, o objetivo deste estudo clínico é avaliar se o DNA do vírus Epstein-Barr
está presente no sangue de indivíduos com a doença de Hodgkin em atividade.
Esta informação poderá ser útil, no futuro, para o diagnóstico, monitoração e
tratamento dos pacientes com doença de Hodgkin.
79
8.3) ANEXO 3 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E INFORMADO
Eu,____________________________________________________________,
paciente em tratamento no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (HUCFF-UFRJ) / Instituto Nacional do
Câncer (INCa), fui convidado a participar do estudo clínico prospectivo sobre a
associação da doença de Hodgkin e o vírus Epstein-Barr sob a coordenação do
Prof. Nelson Spector. Fui amplamente informado sobre as minhas condições
clínicas, a forma de acompanhamento clínico-laboratorial, o prognóstico da
minha doença, as possibilidades de cura, o tipo de tratamento ao qual serei
submetido e seus riscos inerentes.
Os detalhes sobre o estudo foram discutidos comigo e recebi um TERMO
INFORMATIVO com detalhes sobre o estudo. Em particular, fui informado dos
seguintes aspectos:
1- Tenho ampla liberdade de recusar-me a participar do estudo ou retirar meu
consentimento em qualquer fase deste, sem penalização ou prejuízo da
continuidade do meu tratamento.
2- Tenho a garantia de receber esclarecimentos sobre o estudo, mesmo durante
o seu decorrer.
3- Tenho a garantia de sigilo que assegure a minha privacidade quanto aos
dados confidenciais envolvidos no estudo, quando da sua divulgação ou
publicação científicas.
4- Tenho a garantia de acesso ao médico responsável pelo estudo e ao
respectivo comitê de ética institucional, quando necessário. O médico
responsável é o Prof. Nelson Spector, e na sua ausência os seguintes membros
do Serviço de Hematologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho:
Prof. Wolmar Pulcheri, Prof. Ângelo Maiolino, Prof. Marcio Nucci, Prof. Rodrigo
Portugal, Prof. Rony Schaffel, Profa. Monique Morgado, Dra Irene Biasoli e Dra.
Juliane Musacchio. Todos podem ser localizados através dos seguintes
telefones: 2562-2711, 2562-2460 ou 9687-0963 (Dra. Juliane Musacchio).
Portanto, concordo em participar do estudo e autorizo a equipe médica
responsável a fazer a coleta de sangue para exames, a manipulação dos dados
e, se necessário, o armazenamento de material biológico.
______________________________ ________________________________
Paciente Médico
______________________________ ________________________________
Testemunha Data
80
8.4) ANEXO 4 – IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MATRIXSCIENCE
Match to: CFAB_HUMAN Score: 169 Expect: 2.4e-13
Complement factor B precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 86847; Calculated pI value: 6.67
NCBI BLAST search of CFAB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 38%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MGSNLSPQLC LMPFILGLLS GGVTTTPWSL ARPQGSCSLE GVEIKGGSFR
51 LLQEGQALEY VCPSGFYPYP VQTRTCRSTG SWSTLKTQDQ KTVRKAECRA
101 IHCPRPHDFE NGEYWPRSPY YNVSDEISFH CYDGYTLRGS ANRTCQVNGR
151 WSGQTAICDN GAGYCSNPGI PIGTRKVGSQ YRLEDSVTYH CSRGLTLRGS
201 QRRTCQEGGS WSGTEPSCQD SFMYDTPQEV AEAFLSSLTE TIEGVDAEDG
251 N IYLVLDGSDS IGASNFTGAK KCLVNLIEKV HGPGEQQKRK IVLDPSGSM
301 ASYGVKPRYG LVTYATYPKI WVKVSEADSS NADWVTKQLN EINYEDHKLK
351 SGTNTKKALQ AVYSMMSWPD DVPPEGWNRT RHVIILMTDG LHNMGGDPIT
401 VIDEIRDLLY IGKDRKNPRE DYLDVYVFGV GPLVNQVNIN ALASKKDNEQ
451 HVFKVKDMEN LEDVFYQMID ESQSLSLCGM VWEHRKGTDY HKQPWQAKIS
501 VIRPSKGHES CMGAVVSEYF VLTAAHCFTV DDKEHSIKVS VGGEKRDLEI
551 EAGIP EFYDYDVALI KLKNKLKYGQ TIRPICLPCT EVVLFHPNYN INGKK
601 EGTTRALRLP PTTTCQQQKE ELLPAQDIKA LFVSEEEKKL TRKEVYIKNG
651 DKKGSCERDA QYAPGYDKVK DISEVVTPRF LCTGGVSPYA DPNTCRGDSG
701 GPLIVHKRSR FIQVGVISWG VVDVCKNQKR QKQVPAHARD FHINLFQVLP
751 WLKEKLQDED LGFL
Match to: PLMN_HUMAN Score: 273 Expect: 9.6e-24
Plasminogen precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 93247; Calculated pI value: 7.04
NCBI BLAST search of PLMN_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 44%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MEHKEVVLLL LLFLKSGQGE PLDDYVNTQG ASLFSVTKKQ LGAGSIEECA
51 AKCEEDEEFT CRAFQYHSKE QQCVIMAENR KSSIIIRMRD VVLFEKKVYL
101 SECKTGNGKN YRGTMSKTKN GITCQKWSST SPHRPRFSPA THPSEGLEEN
151 YCRNPDNDPQ GPWCYTTDPE KRYDYCDILE CEEECMHCSG ENYDGKISKT
201 MSGLECQAWD SQSPHAHGYI PSKFPNKNLK KNYCRNPDRE LRPWCFTTDP
251 NKRWELCDIP RCTTPPPSSG PTYQCLKGTG ENYRGNVAVT VSGHTCQHWS
301 AQTPHTHNRT PENFPCKNLD ENYCRNPDGK RAPWCHTTNS QVRWEYCKIP
351 SCDSSPVSTE QLAPTAPPEL TPVVQDCYHG DGQSYRGTSS TTTTGKKCQS
401 WSSMTPHRHQ KTPENYPNAG LTMNYCRNPD ADKGPWCFTT DPSVRWEYCN
451 LKKCSGTEAS VVAPPPVVLL PDVETPSEED CMFGNGKGYR GKRATTVTGT
81
501 PCQDWAAQEP HRHSIFTPET NPRAGLEKNY CRNPDGDVGG PWCYTTNPRK
551 LYDYCDVPQC AAPSFDCGKP QVEPKKCPGR VVGGCVAHPH SWPWQVSLRT
601 RFGMHFCGGT LISPEWVLTA AHCLEKSPRP SSYKVILGAH QEVNLEPHVQ
651 EIEVSRLFLE PTRKDIALLK LSSPAVITDK VIPACLPSPN YVVADRTECF
701 ITGWGETQGT FGAGLLKEAQ LPVIENKVCN RYEFLNGRVQ STELCAGHLA
751 GGTDSCQGDS GGPLVCFEKD KYILQGVTSW GLGCARPNKP GVYVRVSRFV
801 TWIEGVMRNN
Match to: AFAM_HUMAN Score: 53
Afamin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 70963; Calculated pI value: 5.64
NCBI BLAST search of AFAM_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 3%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MKLLKLTGFI FFLFFLTESL TLPTQPRDIE NFNSTQKFIE DNIEYITIIA
51 FAQYVQEATF EEMEKLVKDM VEYKDRCMAD KTLPECSKLP NNVLQEKICA
101 MEGLPQKHNF SHCCSKVDAQ RRLCFFYNKK SDVGFLPPFP TLDPEEKCQA
151 YESNRESLLN HFLYEVARRN PFVFAPTLLT VAVHFEEVAK SCCEEQNKVN
201 CLQTRAIPVT QYLKAFSSYQ KHVCGALLKF GTKVVHFIYI AILSQKFPKI
251 EFKELISLVE DVSSNYDGCC EGDVVQCIRD TSKVMNHICS KQDSISSKIK
301 ECCEKKIPER GQCIINSNKD DRPKDLSLRE GKFTDSENVC QERDADPDTF
351 FAKFTFEYSR RHPDLSIPEL LRIVQIYKDL LRNCCNTENP PGCYRYAEDK
401 FNETTEKSLK MVQQECKHFQ NLGKDGLKYH YLIRLTKIAP QLSTEELVSL
451 GEKMVTAFTT CCTLSEEFAC VDNLADLVFG ELCGVNENRT INPAVDHCCK
501 TNFAFRRPCF ESLKADKTYV PPPFSQDLFT FHADMCQSQN EELQRKTDRF
551 LVNLVKLKHE LTDEELQSLF TNFANVVDKC CKAESPEVCF NEESPKIGN
Match to: HEMO_HUMAN Score: 144 Expect: 7.6e-11
Hemopexin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 52385; Calculated pI value: 6.55
NCBI BLAST search of HEMO_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 43%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MARVLGAPVA LGLWSLCWSL AIATPLPPTS AHGNVAEGET KPDPDVTERC
51 SDGWSFDATT LDDNGTMLFF KGEFVWKSHK WDRELISERW KNFPSPVDAA
101 FRQGHNSVFL IKGDKVWVYP PEKKEKGYPK LLQDEFPGIP SPLDAAVECH
151 RGECQAEGVL FFQGDREWFW DLATGTMKER SWPAVGNCSS ALRWLGRYYC
201 FQGNQFLRFD PVRGEVPPRY PRDVRDYFMP CPGRGHGHRN GTGHGNSTHH
251 GPEYMRCSPH LVLSALTSDN HGATYAFSGT HYWRLDTSRD GWHSWPIAHQ
301 WPQGPSAVDA AFSWEEKLYL VQGTQVYVFL TKGGYTLVSG YPKRLEKEVG
351 TPHGIILDSV DAAFICPGSS RLHIMAGRRL WWLDLKSGAQ ATWTELPWPH
401 EKVDGALCME KSLGPNSCSA NGPGLYLIHG PNLYCYSDVE KLNAAKALPQ
82
451 PQNVTSLLGC TH
Match to: A1BG_HUMAN Score: 120 Expect: 1.9e-08
Alpha-1B-glycoprotein precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 54809; Calculated pI value: 5.58
NCBI BLAST search of A1BG_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 30%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MSMLVVFLLL WGVTWGPVTE AAIFYETQPS LWAESESLLK PLANVTLTCQ
51 ARLETPDFQL FKNGVAQEPV HLDSPAIKHQ FLLTGDTQGR YRCRSGLSTG
101 WTQLSKLLEL TGPKSLPAPW LSMAPVSWIT PGLKTTAVCR GVLRGVTFLL
151 RREGDHEFLE VPEAQEDVEA TFPVHQPGNY SCSYRTDGEG ALSEPSATVT
201 IEELAAPPPP VLMHHGESSQ VLHPGNKVTL TCVAPLSGVD FQLRRGEKEL
251 LVPRSSTSPD RIFFHLNAVA LGDGGHYTCR YRLHDNQNGW SGDSAPVELI
301 LSDETLPAPE FSPEPESGRA LRLRCLAPLE GARFALVRED RGGRRVHRFQ
351 SPAGTEALFE LHNISVADSA NYSCVYVDLK PPFGGSAPSE RLELHVDGPP
401 PRPQLRATWS GAVLAGRDAV LRCEGPIPDV TFELLREGET KAVKTVRTPG
451 AAANLELIFV GPQHAGNYRC RYRSWVPHTF ESELSDPVEL LVAES
Match to: THRB_HUMAN Score: 64 Expect: 0.0074
Prothrombin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 71475; Calculated pI value: 5.64
NCBI BLAST search of THRB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 21%
Matched peptides shown in Bold Red
51 VRKGNLEREC VEETCSYEEA FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL
1 MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE
101 AACLEGNCAE GLGTNYRGHV NITRSGIECQ LWRSRYPHKP EINSTTHPGA
151 DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE
201 GSSVNLSPPL EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA QAKALSKHQD
251 FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP GDFGYCDLNY CEEAVEEETG
301 DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK
351 TERELLESYI DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW
401 VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH
451 PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP VCLPDRETAA SLLQAGYKGR
501 VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQVVNLPI VERPVCKDST RIRITDNMFC
551 AGYKPDEGKR GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY
601 GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE
Match to: TRFE_HUMAN Score: 77 Expect: 0.00041
Serotransferrin precursor - Homo sapiens (Human)
83
Nominal mass (M
r
): 79280; Calculated pI value: 6.81
NCBI BLAST search of TRFE_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 24%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MRLAVGALLV CAVLGLCLAV PDKTVRWCAV SEHEATKCQS FRDHMKSVIP
51 SDGPSVACVK KASYLDCIRA IAANEADAVT LDAGLVYDAY LAPNNLKPVV
101 AEFYGSKEDP QTFYYAVAVV KKDSGFQMNQ LRGKKSCHTG LGRSAGWNIP
151 IGLLYCDLPE PRKPLEKAVA NFFSGSCAPC ADGTDFPQLC QLCPGCGCST
201 VKHSTIF ENLANKADRD QYELLCLDNT LNQYFGYSGA FKCLKDGAGD VAF
251 RKPVDEYKDC HLAQVPSHTV VARSMGGKED LIWELLNQAQ EHFGKDKSKE
301 FQLFSSPHGK DLLFKDSAHG FLKVPPRMDA KMYLGYEYVT AIRNLREGTC
351 PEAPTDECKP VKWCALSHHE RLKCDEWSVN SVGKIECVSA ETTEDCIAKI
401 MNGEADAMSL DGGFVYIAGK CGLVPVLAEN YNKSDNCEDT PEAGYFAVAV
451 VKKSASDLTW DNLKGKKSCH TAVGRTAGWN IPMGLLYNKI NHCRFDEFFS
501 EGCAPGSKKD SSLCKLCMGS G EGYYGYTGAF RCLVEKGDVA LNLCEPNNK
551 FVKHQTVPQN TGGKNPDPWA KNLNEKDYEL LCLDGTRKPV EEYANCHLAR
601 APNHAVVTRK DKEACVHKIL RQQQHLFGSN VTDCSGNFCL FRSETKDLLF
651 RDDTVCLAKL HDRNTYEKYL GEEYVKAVGN LRKCSTSSLL EACTFRRP
Match to: AACT_HUMAN Score: 183 Expect: 9.6e-15
Alpha-1-antichymotrypsin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 47792; Calculated pI value: 5.33
NCBI BLAST search of AACT_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 48%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MERMLPLLAL GLLAAGFCPA VLCHPNSPLD EENLTQENQD RGTHVDLGLA
51 SANVDFAFSL YKQLVLKAPD KNVIFSPLSI STALAFLSLG AHNTTLTEIL
101 KGLKFNLTET SEAEIHQSFQ HLLRTLNQSS DELQLSMGNA MFVKEQLSLL
151 DRFTEDAKRL YGSEAFATDF QDSAAAKKLI NDYVKNGTRG KITDLIKDLD
201 SQTMMVLVNY IFFKAKWEMP FDPQDTHQSR FYLSKKKWVM VPMMSLHHLT
251 IPYFRDEELS CTVVELKYTG NASALFILPD QDKMEEVEAM LLPETLKRWR
301 DSLEFREIGE LYLPKFSISR DYNLNDILLQ LGIEEAFTSK ADLSGITGAR
351 NLAVSQVVHK AVLDVFEEGT EASAATAVKI TLLSALVETR TIVRFNRPFL
401 MIIVPTDTQN IFFMSKVTNP KQA
Match to: ALBU_HUMAN Score: 70 Expect: 0.002
Serum albumin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 71317; Calculated pI value: 5.92
NCBI BLAST search of ALBU_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
84
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 13%
Matched peptides shown in Bold Red
51 FAQYLQQCPF EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT
1 MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA
101 VATLRETYGE MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA
151 FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF FAKRYKAAFT ECCQAADKAA
201 CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV ARLSQRFPKA
251 EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK
301 PADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EM
351 LGMFLYEYAR RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE
401 FKPLVEEPQN LIKQNCELFE QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV
451 SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV LNQLCVLHEK RVTKC TPVSD
501 CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL SEKERQIKKQ
551 TALVELVKHK PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV
601 AASQAALGL
Match to: IGHA1_HUMAN Score: 77 Expect: 0.00038
Ig alpha-1 chain C region - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 38486; Calculated pI value: 6.08
NCBI BLAST search of IGHA1_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 32%
Matched peptides shown in Bold Red
1 ASPTSPKVFP LSLCSTQPDG NVVIACLVQG FFPQEPLSVT WSESGQGVTA
51 RNFPPSQDAS GDLYTTSSQL TLPATQCLAG KSVTCHVKHY TNPSQDVTVP
101 CPVPSTPPTP SPSTPPTPSP SCCHPRLSLH RPALEDLLLG SEANLTCTLT
151 GLRDASGVTF TWTPSSGKSA VQGPPERDLC GCYSVSSVLP GCAEPWNHGK
201 TFTCTAAYPE SKTPLTATLS KSGNTFRPEV HLLPPPSEEL ALNELVTLTC
251 LARGFS WLQGSQE LPR TWA SRQEPSQGTT TFAVTSILRV PKDV LVR EKYL
301 AAEDWKKGDT FSCMVGHEAL PLAFTQKTID RLAGKPTHVN VSVVMAEVDG
351 TCY
Match to: FIBA_HUMAN Score: 78 Expect: 0.0003
Fibrinogen alpha chain precursor [Contains: Fibrinopeptide A] - Homo
sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 95656; Calculated pI value: 5.70
NCBI BLAST search of FIBA_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
85
Sequence Coverage: 14%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MFSMRIVCLV LSVVGTAWTA DSGEGDFLAE GGGVRGPRVV ERHQSACKDS
51 DWPFCSDEDW NYKCPSGCRM KGLIDEVNQD FTNRINKLKN SLFEYQKNNK
101 DSHSLTTNIM EILRGDFSSA NNRDNTYNRV SEDLRSRIEV LKRKVIEKVQ
151 HIQLLQKNVR AQLVDMKRLE VDIDIKIRSC RGSCSRALAR EVDLKDYEDQ
201 QKQLEQVIAK DLLPSRDRQH LPLIKMKPVP DLVPGNFKSQ LQKVPPEWKA
251 LTDMPQMRME LERPGGNEIT RGGSTSYGTG SETESPRNPS SAGSWNSGSS
301 GPGSTGNRNP GSSGTGGTAT WKPGSSGPGS TGSWNSGSSG TGSTGNQNPG
351 SPRPGSTGTW NPGSSERGSA GHWTSESSVS GSTGQWHSES GSFRPDSPGS
401 GNARPNNPDW GTFEEVSGNV SPGTRREYHT EKLVTSKGDK ELRTGKEKVT
451 SGSTTTTRRS CSKTVTKTVI GPDGHKEVTK EVVTSEDGSD CPEAMDLGTL
501 SGIGTLDGFR HRHPDEAAFF DTASTGKTFP GFFSPMLGEF VSETESRGSE
551 SGIFTNTKES SSHHPGIAEF PSRGKSSSYS KQFTSSTSYN RGDSTFESKS
601 YKMADEAGSE ADHEGTHSTK RGHAKSRPVR DCDDVLQTHP SGTQSGIFNI
651 KLPGSSKIFS VYCDQETSLG GWLLIQQRMD GSLNFNRTWQ DYKRGFGSLN
701 DEGEGEFWLG NDYLHLLTQR GSVLRVELED WAGNEAYAEY HFRVGSEAEG
751 YALQVSSYEG TAGDALIEGS VEEGAEYTSH NNMQFSTFDR DADQWEENCA
801 EVYGGGWWYN NCQAANLNGI YYPGGSYDPR NNSPYEIENG VVWVSFRGAD
851 YSLRAVRMKI RPLVTQ
Match to: ITIH4_HUMAN Score: 159
Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 precursor - Homo sapiens
(Human)
Nominal mass (M ): 103489; Calculated pI value: 6.51
r
NCBI BLAST search of ITIH4_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 7%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
51 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRLL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNIKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER RLDYQEGPPG VEISCWSVEL
Match to: FIBB_HUMAN Score: 164 Expect: 7.6e-13
86
Fibrinogen beta chain precursor [Contains: Fibrinopeptide B] - Homo
sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 56577; Calculated pI value: 8.54
NCBI BLAST search of FIBB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 42%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MKRMVSWSFH KLKTMKHLLL LLLCVFLVKS QGVNDNEEGF FSARGHRPLD
51 KKREEAPSLR PAPPPISGGG YRARPAKAAA TQKKVERKAP DAGGCLHADP
101 DLGVLCPTGC QLQEALLQQE RPIRNSVDEL NNNVEAVSQT SSSSFQYMYL
151 LKDLWQKRQK QVKDNENVVN EYSSELEKHQ LYIDETVNSN IPTNLRVLRS
201 ILENLRSKIQ KLESDVSAQM EYCRTPCTVS CNIPVVSGKE CEEIIRKGGE
251 TSEMYLIQPD SSVKPYRVYC DMNTENGGWT VIQNRQDGSV DFGRKWDPYK
301 QGFGNVATNT DGKNYCGLPG EYWLGNDKIS QLTRMGPTEL LIEMEDWKGD
351 K AHYGGFT VQNEANKYQI SVNKYRGTAG NALMDGASQL MGENRTMTIH VK
401 NGMFFSTYDR DNDGWLTSDP RKQCSKEDGG GWWYNRCHAA NPNGRYYWGG
451 QYTWDMAKHG TDDGVVWMNW KGSWYSMRKM SMKIRPFFPQ Q
Match to: FIBG_HUMAN Score: 195
Fibrinogen gamma chain precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M ): 52106; Calculated pI value: 5.37
r
NCBI BLAST search of FIBG_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 10%
Matched peptides shown in Bold Red
51 IADFLSTYQT KVDKDLQSLE DILHQVENKT SEVKQLIKAI QLTYNPDESS
1 MSWSLHPRNL ILYFYALLFL SSTCVAYVAT RDNCCILDER FGSYCPTTCG
101 KPNMIDAATL KSRKMLEEIM KYEASILTHD SSIRYLQEIY NSNNQKIVNL
151 KEKVAQLEAQ CQEPCKDTVQ IHDITGKDCQ DIANKGAKQS GLYFIKPLKA
201 NQQFLVYCEI DGSGNGWTVF QKRLDGSVDF KKNWIQYKEG FGHLSPTGTT
251 EFWLGNEKIH LISTQSAIPY ALRVELEDWN GRTSTADYAM FKVGPEADKY
301 RLTYAYFAGG DAGDAFDGFD FGDDPSDKFF TSHNGMQFST WDNDNDKFEG
351 NCAEQDGSGW WMNKCHAGHL NGVYYQGGTY SKASTPNGYD NGIIWATWKT
401 RWYSMKKTTM KIIPFNRLTI GEGQQHHLGG AKQVRPEHPA ETEYDSLYPE
451 DDL
Match to: CD5L_HUMAN Score: 92 Expect: 1.3e-05
CD5 antigen-like precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 39603; Calculated pI value: 5.28
NCBI BLAST search of CD5L_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
87
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 29%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MALLFSLILA ICTRPGFLAS PSGVRLVGGL HRCEGRVEVE QKGQWGTVCD
51 DGWDIKDVAV LCRELGCGAA SGTPSGILYE PPAEKEQKVL IQSVSCTGTE
101 DTLAQCEQEE VYDCSHDEDA GASCENPESS FSPVPEGVRL ADGPGHCKGR
151 VEVKHQNQWY TVCQTGWSLR AAKVVCRQLG CGRAVLTQKR CNKHAYGRKP
201 IWLSQMSCSG REATLQDCPS GPWGKNTCNH DEDTWVECED PFDLRLVGGD
251 NLCSGRLEVL HKGVWGSVCD DNWGEKEDQV VCKQLGCGKS LSPSFRDRKC
301 YGPGVGRIWL DNVRCSGEEQ SLEQCQHRFW GFHDCTHQED VAVICSG
Match to: HPT_HUMAN Score: 68 Expect: 0.0027
Haptoglobin precursor [Contains: Haptoglobin alpha chain; Haptoglobin beta
chain] - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M ): 45861; Calculated pI value: 6.13
r
NCBI BLAST search of HPT_HUMAN against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 16%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY
51 QCKNYYKLRT EGDGVYTLND KKQWINKAVG DKLPECEADD GCPKPPEIAH
101 GYVEHSVRYQ CKNYYKLRTE GDGVYTLNNE KQWINKAVGD KLPECEAVCG
151 KPKNPANPVQ RILGGHLDAK GSFPWQAKMV SHHNLTTGAT LINEQWLLTT
201 AKNLFLNHSE NATAKDIAPT LTLYVGKKQL VEIEKVVLHP NYSQVDIGLI
251 KLKQKVSVNE RVMPICLPSK DYAEVGRVGY VSGWGRNANF KFTDHLKYVM
301 LPVADQDQCI RHYEGSTVPE KKTPKSPVGV QPILNEHTFC AGMSKYQEDT
351 CYGDAGSAFA VHDLEEDTWY ATGILSFDKS CAVAEYGVYV KVTSIQDWVQ
401 KTIAEN
Match to: Score: Expect:
Actin, cytoplasmic 1 - Homo sapiens (Human)
ACTB_HUMAN 162 1.2e-12
Nominal mass (M
r
): 42052; Calculated pI value: 5.29
NCBI BLAST search of ACTB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 52%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MDDDIAALVV DNGSGMCKAG FAGDDAPRAV FPSIVGRPRH QGVMVGMGQK
88
51 DSYVGDEAQS KRGILTLKYP IEHGIVTNWD DMEKIWHHTF YNELRVAPEE
101 HPVLLTEAPL NPKANREKMT QIMFETFNTP AMYVAIQAVL SLYASGRTTG
151 IVMDSGDGVT HTVPIYEGYA LPHAILRLDL AGRDLTDYLM KILTERGYSF
201 TTTAEREIVR DIKEKLCYVA LDFEQEMATA ASSSSLEKSY ELPDGQVITI
251 GNERFRCPEA LFQPSFLGME SCGIHETTFN SIMKCDVDIR KDLYANTVLS
301 GGTTMYPGIA DRMQKEITAL APSTMKIKII APPERKYSVW IGGSILASLS
351 TFQQMWISKQ EYDESGPSIV HRKCF
Match to: APOA4_HUMAN Score: 137 Expect: 3.8e-10
Apolipoprotein A-IV precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 45371; Calculated pI value: 5.28
NCBI BLAST search of APOA4_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 37%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MFLKAVVLTL ALVAVAGARA EVSADQVATV MWDYFSQLSN NAKEAVEHLQ
51 KSELTQQLNA LFQDKLGEVN TYAGDLQKKL VPFATELHER LAKDSEKLKE
101 EIGKELEELR ARLLPHANEV SQKIGDNLRE LQQRLEPYAD QLRTQVNTQA
151 EQLRRQLTPY AQRMERVLRE NADSLQASLR PHADELKAKI DQNVEELKGR
201 LTPYADEFKV KIDQTVEELR RSLAPYAQDT QEKLNHQLEG LTFQMKKNAE
251 ELKARISASA EELRQRLAPL AEDVRGNLRG NTEGLQKSLA ELGGHLDQQV
301 EEFRRRVEPY GENFNKALVQ QMEQLRQKLG PHAGDVEGHL SFLEKDLRDK
351 VNSFFSTFKE KESQDKTLSL PELEQQQEQQ QEQQQEQVQM LAPLES
Match to: CO3_HUMAN Score: 257 Expect: 3.8e-22
Complement C3 precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 188569; Calculated pI value: 6.02
NCBI BLAST search of CO3_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 26%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MGPTSGPSLL LLLLTHLPLA LGSPMYSIIT PNILRLESEE TMVLEAHDAQ
51 GDVPVTVTVH DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK
101 GRNKFVTVQA TFGTQVVEKV VLVSLQSGYL FIQTDKTIYT PGSTVLYRIF
151 TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL SSQNQLGVLP LSWDIPELVN
201 MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE KFYYIYNEKG
251 LEVTITARFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV
301 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT
351 SPYQIHFTKT PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL
401 TQGDGVAKLS INTHPSQKPL SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG
451 NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL
501 LKAGRQVREP GQDLVVLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA SGQREVVADS
551 VWVDVKDSCV GSLVVKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKIEGDHG ARVVLVAVDK
89
601 GVFVLNKKNK LTQSKIWDVV EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS
651 GQQTAQRAEL QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE
701 NPMRFSCQRR TRFISLGEAC KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN
751 LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE PPKNGISTKL MNIFLKDSIT
801 TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSVV RNEQVEIRAV
851 LYNYRQNQEL KVRVELLHNP AFCSLATTKR RHQQTVTIPP KSSLSVPYVI
901 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF ISDGVRKSLK VVPEGIRMNK TVAVRTLDPE
951 RLGREGVQKE DIPPADLSDQ VPDTESETRI LLQGTPVAQM TEDAVDAERL
1001 KHLIVTPSGC GEQNMIGMTP TVIAVHYLDE TEQWEKFGLE KRQGALELIK
1051 KGYTQQLAFR QPSSAFAAFV KRAPSTWLTA YVVKVFSLAV NLIAIDSQVL
1101 CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD MALTAFVLIS
1151 LQEAKDICEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY MNLQRSYTVA IAGYALAQMG
1201 RLKGPLLNKF LTTAKDKNRW EDPGKQLYNV EATSYALLAL LQLKDFDFVP
1251 PVVRWLNEQR YYGGGYGSTQ ATFMVFQALA QYQKDAPDHQ ELNLDVSLQL
1301 PSRSSKITHR IHWESASLLR SEETKENEGF TVTAEGKGQG TLSVVTMYHA
1351 KAKDQLTCNK FDLKVTIKPA PETEKRPQDA KNTMILEICT RYRGDQDATM
1401 SILDISMMTG FAPDTDDLKQ LANGVDRYIS KYELDKAFSD RNTLIIYLDK
1451 VSHSEDDCLA FKVHQYFNVE LIQPGAVKVY AYYNLEESCT RFYHPEKEDG
1501 KLNKLCRDEL CRCAEENCFI QKSDDKVTLE ERLDKACEPG VDYVYKTRLV
1551 KVQLSNDFDE YIMAIEQTIK SGSDEVQVGQ QRTFISPIKC REALKLEEKK
1601 HYLMWGLSSD FWGEKPNLSY IIGKDTWVEH WPEEDECQDE ENQKQCQDLG
1651 AFTESMVVFG CPN
Match to: CLUS_HUMAN Score: 75 Expect: 0.00056
Clusterin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 53031; Calculated pI value: 5.89
NCBI BLAST search of CLUS_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 16%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MMKTLLLFVG LLLTWESGQV LGDQTVSDNE LQEMSNQGSK YVNKEIQNAV
51 NGVKQIKTLI EKTNEERKTL LSNLEEAKKK KEDALNETRE SETKLKELPG
101 VCNETMMALW EECKPCLKQT CMKFYARVCR SGSGLVGRQL EEFLNQSSPF
151 YFWMNGDRID SLLENDRQQT HMLDVMQDHF SRASSIIDEL FQDRFFTREP
201 QDTYHYLPFS LPHRRPHFFF PKSRIVRSLM PFSPYEPLNF HAMFQPFLEM
251 IHEAQQAMDI HFHSPAFQHP PTEFIREGDD DRTVCREIRH NSTGCLRMKD
301 QCDKCREILS VDCSTNNPSQ AKLRRELDES LQVAERLTRK YNELLKSYQW
351 KMLNTSSLLE QLNEQFNWVS RLANLTQGED QYYLRVTTVA SHTSDSDVPS
401 GVTEVVVKLF DSDPITVTVP VEVSRKNPKF METVAEKALQ EYRKKHREE
Match to: A1AT_HUMAN Score: 179 Expect: 2.4e-14
Alpha-1-antitrypsin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 46878; Calculated pI value: 5.37
NCBI BLAST search of A1AT_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
90
Sequence Coverage: 41%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MPSSVSWGIL LLAGLCCLVP VSLAEDPQGD AAQKTDTSHH DQDHPTFNKI
51 TPNLAEFAFS LYRQLAHQSN STNIFFSPVS IATAFAMLSL GTKADTHDEI
101 LEGLNFNLTE IPEAQIHEGF QELLRTLNQP DSQLQLTTGN GLFLSEGLKL
151 VDKFLEDVKK LYHSEAFTVN FGDTEEAKKQ INDYVEKGTQ GKIVDLVKEL
201 DRDTVFALVN YIFFKGKWER PFEVKDTEEE DFH RLGM VDQVTTV KVPMMK
251 FNIQHCKKLS SWVLLMKYLG NATAIFFLPD EGKLQHLENE LTHDIITKFL
301 ENEDRRSASL HLPKLSITGT YDLKSVLGQL GITKVFSNGA DLSGVTEEAP
351 LKLSKAVHKA VLTIDEKGTE AAGAMFLEAI PMSIPPEVKF NKPFVFLMIE
401 QNTKSPLFMG KVVNPTQK
Match to: CO4A_HUMAN Score: 80 Expect: 0.00019
Complement C4-A precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 194247; Calculated pI value: 6.65
NCBI BLAST search of CO4A_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 9%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MRLLWGLIWA SSFFTLSLQK PRLLLFSPSV VHLGVPLSVG VQLQDVPRGQ
51 VVKGSVFLRN PSRNNVPCSP KVDFTLSSER DFALLSLQVP LKDAKSCGLH
101 QLLRGPEVQL VAHSPWLKDS LSRTTNIQGI NLLFSSRRGH LFLQTDQPIY
151 NPGQRVRYRV FALDQKMRPS TDTITVMVEN SHGLRVRKKE VYMPSSIFQD
201 DFVIPDISEP GTWKISARFS DGLESNSSTQ FEVKKYVLPN FEVKITPGKP
251 YILTVPGHLD EMQLDIQARY IYGKPVQGVA YVRFGLLDED GKKTFFRGLE
301 SQTKLVNGQS HISLSKAEFQ DALEKLNMGI TDLQGLRLYV AAAIIESPGG
351 EMEEAELTSW YFVSSPFSLD LSKTKRHLVP GAPFLLQALV REMSGSPASG
401 IPVKVSATVS SPGSVPEVQD IQQNTDGSGQ VSIPIIIPQT ISELQLSVSA
451 GSPHPAIARL TVAAPPSGGP GFLSIERPDS RPPRVGDTLN LNLRAVGSGA
501 TFSHYYYMIL SRGQIVFMNR EPKRTLTSVS VFVDHHLAPS FYFVAFYYHG
551 DHPVANSLRV DVQAGACEGK LELSVDGAKQ YRNGESVKLH LETDSLALVA
601 LGALDTALYA AGSKSHKPLN MGKVFEAMNS YDLGCGPGGG DSALQVFQAA
651 GLAFSDGDQW TLSRKRLSCP KEKTTRKKRN VNFQKAINEK LGQYASPTAK
701 RCCQDGVTRL PMMRSCEQRA ARVQQPDCRE PFLSCCQFAE SLRKKSRDKG
751 QAGLQRALEI LQEEDLIDED DIPVRSFFPE NWLWRVETVD RFQILTLWLP
801 DSLTTWEIHG LSLSKTKGLC VATPVQLRVF REFHLHLRLP MSVRRFEQLE
851 LRPVLYNYLD KNLTVSVHVS PVEGLCLAGG GGLAQQVLVP AGSARPVAFS
901 VVPTAAAAVS LKVVARGSFE FPVGDAVSKV LQIEKEGAIH REELVYELNP
951 LDHRGRTLEI PGNSDPNMIP DGDFNSYVRV TASDPLDTLG SEGALSPGGV
1001 ASLLRLPRGC GEQTMIYLAP TLAASRYLDK TEQWSTLPPE TKDHAVDLIQ
1051 KGYMRIQQFR KADGSYAAWL SRDSSTWLTA FVLKVLSLAQ EQVGGSPEKL
1101 QETSNWLLSQ QQADGSFQDP CPVLDRSMQG GLVGNDETVA LTAFVTIALH
1151 HGLAVFQDEG AEPLKQRVEA SISKANSFLG EKASAGLLGA HAAAITAYAL
1201 SLTKAPVDLL GVAHNNLMAM AQETGDNLYW GSVTGSQSNA VSPTPAPRNP
1251 SDPMPQAPAL WIETTAYALL HLLLHEGKAE MADQASAWLT RQGSFQGGFR
1301 STQDTVIALD ALSAYWIASH TTEERGLNVT LSSTGRNGFK SHALQLNNRQ
1351 IRGLEEELQF SLGSKINVKV GGNSKGTLKV LRTYNVLDMK NTTCQDLQIE
1401 VTVKGHVEYT MEANEDYEDY EYDELPAKDD PDAPLQPVTP LQLFEGRRNR
1451 RRREAPKVVE EQESRVHYTV CIWRNGKVGL SGMAIADVTL LSGFHALRAD
1501 LEKLTSLSDR YVSHFETEGP HVLLYFDSVP TSRECVGFEA VQEVPVGLVQ
91
1551 PASATLYDYY NPERRCSVFY GAPSKSRLLA TLCSAEVCQC AEGKCPRQRR
1601 ALERGLQDED GYRMKFACYY PRVEYGFQVK VLREDSRAAF RLFETKITQV
1651 LHFTKDVKAA ANQMRNFLVR ASCRLRLEPG KEYLIMGLDG ATYDLEGHPQ
1701 YLLDSNSWIE EMPSERLCRS TRQRAACAQL NDFLQEYGTQ GCQV
Match to: KAC_HUMAN Score: 109
Ig kappa chain C region - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 11773; Calculated pI value: 5.58
NCBI BLAST search of KAC_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 15%
Matched peptides shown in Bold Red
1 TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN
51 SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS
101 FNRGEC
Match to: IGHG1_HUMAN Score: 184 Expect: 7.6e-15
Ig gamma-1 chain C region - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 36596; Calculated pI value: 8.46
NCBI BLAST search of IGHG1_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 51%
Matched peptides shown in Bold Red
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTK VVSVLT VLHQDWLNGK PREEQYN STYR
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
Match to: Score: Expect:
C-reactive protein precursor [Contains: C-reactive protein(1-205)] - Homo
sapiens (Human)
CRP_HUMAN 53 0.096
Nominal mass (M
r
): 25194; Calculated pI value: 5.45
NCBI BLAST search of CRP_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
92
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 24%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MEKLLCFLVL TSLSHAFGQT DMSRKAFVFP KESDTSYVSL KAPLTKPLKA
51 FTVCLHFYTE LSSTRGYSIF SYATKRQDNE ILIFWSKDIG YSFTVGGSEI
101 LFEVPEVTVA PVHICTSWES ASGIVEFWVD GKPRVRKSLK KGYTVGAEAS
151 IILGQEQDSF GGNFEGSQSL VGDIGNVNMW DFVLSPDEIN TIYLGGPFSP
201 NVLNWRALKY EVQGEVFTKP QLWP
Match to: APOA1_HUMAN Score: 131 Expect: 1.5e-09
Apolipoprotein A-I precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 30759; Calculated pI value: 5.56
NCBI BLAST search of APOA1_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 42%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MKAAVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDEPPQS PWDRVKDLAT VYVDVLKDSG
51 RDYVSQFEGS ALGKQLNLKL LDNWDSVTST FSKLREQLGP VTQEFWDNLE
101 KETEGLRQEM SKDLEEVKAK VQPYLDDFQK KWQEEMELYR QKVEPLRAEL
151 QEGARQKLHE LQEKLSPLGE EMRDRARAHV DALRTHLAPY SDELRQRLAA
201 RLEALKENGG ARLAEYHAKA TEHLSTLSEK AKPALEDLRQ GLLPVLESFK
251 VSFLSALEEY TKKLNTQ
Match to: C1QB_HUMAN Score: 123 Expect: 9.6e-09
Complement C1q subcomponent subunit B precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 26670; Calculated pI value: 8.83
NCBI BLAST search of C1QB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 29%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MKIPWGSIPV LMLLLLLGLI DISQAQLSCT GPPAIPGIPG IPGTPGPDGQ
51 PGTPGIKGEK GLPGLAGDHG EFGEKGDPGI PGNPGKVGPK GPMGPKGGPG
101 APGAPGPKGE SGDYKATQKI AFSATRTINV PLRRDQTIRF DHVITNMNNN
151 YEPRSGKFTC KVPGLYYFTY HASSRGNLCV NLMRGRERAQ KVVTFCDYAY
201 NTFQVTTGGM VLKLEQGENV FLQATDKNSL LGMEGANSIF SGFLLFPDME
251 A
Match to: HPT_HUMAN Score: 238
Haptoglobin precursor [Contains: Haptoglobin alpha chain; Haptoglobin beta
chain] - Homo sapiens (Human)
93
Nominal mass (M
r
): 45861; Calculated pI value: 6.13
NCBI BLAST search of HPT_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 12%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MSALGAVIAL LLWGQLFAVD SGNDVTDIAD DGCPKPPEIA HGYVEHSVRY
51 QCKNYYKLRT EGDGVYTLND KKQWINKAVG DKLPECEADD GCPKPPEIAH
101 GYVEHSVRYQ CKNYYKLRTE GDGVYTLNNE KQWINKAVGD KLPECEAVCG
151 KPKNPANPVQ RILGGHLDAK GSFPWQAKMV SHHNLTTGAT LINEQWLLTT
201 AKNLFLNHSE NATAKDIAPT LTLYVGKKQL VEIEKVVLHP NYSQVDIGLI
251 KLKQKVSVNE RVMPICLPSK DYAEVGRVGY VSGWGRNANF KFTDHLKYVM
301 LPVADQDQCI RHYEGSTVPE KKTPKSPVGV QPILNEHTFC AGMSKYQEDT
351 CYGDAGSAFA VHDLEEDTWY ATGILSFDKS CAVAEYGVYV KVTSIQDWVQ
401 KTIAEN
Match to: TTHY_HUMAN Score: 176 Expect: 4.8e-14
Transthyretin precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 15991; Calculated pI value: 5.52
NCBI BLAST search of TTHY_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 77%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MASHRLLLLC LAGLVFVSEA GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV
51 HVFRKAADDT WEPFASGKTS ESGELHGLTT EEEFVEGIYK VEIDTKSYWK
101 ALGISPFHEH AEVVFTANDS GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE
Match to: HBB_HUMAN Score: 174 Expect: 7.6e-14
Hemoglobin subunit beta - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 16102; Calculated pI value: 6.75
NCBI BLAST search of HBB_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 95%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS
51 TPDAVMGNPK VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD
94
101 PENFRLLGNV LVCVLAHHFG KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH
Match to: CO4B_HUMAN Score: 188 Expect: 3e-15
Complement C4-B precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 194212; Calculated pI value: 6.73
NCBI BLAST search of CO4B_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 20%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MRLLWGLIWA SSFFTLSLQK PRLLLFSPSV VHLGVPLSVG VQLQDVPRGQ
51 VVKGSVFLRN PSRNNVPCSP KVDFTLSSER DFALLSLQVP LKDAKSCGLH
101 QLLRGPEVQL VAHSPWLKDS LSRTTNIQGI NLLFSSRRGH LFLQTDQPIY
151 NPGQRVRYRV FALDQKMRPS TDTITVMVEN SHGLRVRKKE VYMPSSIFQD
201 DFVIPDISEP GTWKISARFS DGLESNSSTQ FEVKKYVLPN FEVKITPGKP
251 YILTVPGHLD EMQLDIQARY IYGKPVQGVA YVRFGLLDED GKKTFFRGLE
301 SQTKLVNGQS HISLSKAEFQ DALEKLNMGI TDLQGLRLYV AAAIIESPGG
351 EMEEAELTSW YFVSSPFSLD LSKTKRHLVP GAPFLLQALV REMSGSPASG
401 IPVKVSATVS SPGSVPEVQD IQQNTDGSGQ VSIPIIIPQT ISELQLSVSA
451 GSPHPAIARL TVAAPPSGGP GFLSIERPDS RPPRVGDTLN LNLRAVGSGA
501 TFSHYYYMIL SRGQIVFMNR EPKRTLTSVS VFVDHHLAPS FYFVAFYYHG
551 DHPVANSLRV DVQAGACEGK LELSVDGAKQ YRNGESVKLH LETDSLALVA
601 LGALDTALYA AGSKSHKPLN MGKVFEAMNS YDLGCGPGGG DSALQVFQAA
651 GLAFSDGDQW TLSRKRLSCP KEKTTRKKRN VNFQKAINEK LGQYASPTAK
701 RCCQDGVTRL PMMRSCEQRA ARVQQPDCRE PFLSCCQFAE SLRKKSRDKG
751 QAGLQRALEI LQEEDLIDED DIPVRSFFPE NWLWRVETVD RFQILTLWLP
801 DSLTTWEIHG LSLSKTKGLC VATPVQLRVF REFHLHLRLP MSVRRFEQLE
851 LRPVLYNYLD KNLTVSVHVS PVEGLCLAGG GGLAQQVLVP AGSARPVAFS
901 VVPTAAAAVS LKVVARGSFE FPVGDAVSKV LQIEKEGAIH REELVYELNP
951 LDHR RTLEI PGNSDPNMIP DGDFNSYVRV TASDPLDTLG SEGALSPGGV G
1001 ASLLRLPRGC GEQTMIYLAP TLAASRYLDK TEQWSTLPPE TKDHAVDLIQ
1051 KGYMRIQQFR KADGSYAAWL SRDSSTWLTA FVLKVLSLAQ EQVGGSPEKL
1101 QETSNWLLSQ QQADGSFQDL SPVIHRSMQG GLVGNDETVA LTAFVTIALH
1151 HGLAVFQDEG AEPLKQRVEA SISKANSFLG EKASAGLLGA HAAAITAYAL
1201 SLTKAPVDLL GVAHNNLMAM AQETGDNLYW GSVTGSQSNA VSPTPAPRNP
1251 SDPMPQAPAL WIETTAYALL HLLLHEGKAE MADQASAWLT RQGSFQGGFR
1301 STQDTVIALD ALSAYWIASH TTEERGLNVT LSSTGRNGFK SHALQLNNRQ
1351 IRGLEEELQF SLGSKINVKV GGNSKGTLKV LRTYNVLDMK NTTCQDLQIE
1401 VTVKGHVEYT MEANEDYEDY EYDELPAKDD PDAPLQPVTP LQLFEGRRNR
1451 RRREAPKVVE EQESRVHYTV CIWRNGKVGL SGMAIADVTL LSGFHALRAD
1501 LEKLTSLSDR YVSHFETEGP HVLLYFDSVP TSRECVGFEA VQEVPVGLVQ
1551 PASATLYDYY NPERRCSVFY GAPSKSRLLA TLCSAEVCQC AEGKCPRQRR
1601 ALERGLQDED GYRMKFACYY PRVEYGFQVK VLREDSRAAF RLFETKITQV
1651 LHFTKDVKAA ANQMRNFLVR ASCRLRLEPG KEYLIMGLDG ATYDLEGHPQ
1701 YLLDSNSWIE EMPSERLCRS TRQRAACAQL NDFLQEYGTQ GCQV
Match to: KLKB1_HUMAN Score: 50 Expect: 0.2
Plasma kallikrein precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 73433; Calculated pI value: 8.60
NCBI BLAST search of KLKB1_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
95
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 13%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MILFKQATYF ISLFATVSCG CLTQLYENAF FRGGDVASMY TPNAQYCQMR
51 CTFHPRCLLF SFLPASSIND MEKRFGCFLK DSVTGTLPKV HRTGAVSGHS
101 LKQCGHQISA CHRDIYKGVD MRGVNFNVSK VSSVEECQKR CTNNIRCQFF
151 SYATQTFHKA EYRNNCLLKY SPGGTPTAIK VLSNVESGFS LKPCALSEIG
201 CHMNIFQHLA FSDVDVARVL TPDAFVCRTI CTYHPNCLFF TFYTNVWKIE
251 SQRNVCLLKT SESGTPSSST PQENTISGYS LLTCKRTLPE PCHSKIYPGV
301 DFGGEELNVT FVKGVNVCQE TCTKMIRCQF FTYSLLPEDC KEEKCKCFLR
351 LSMDGSPTRI AYGTQGSSGY SLRLCNTGDN SVCTTKTSTR IVGGTNSSWG
401 EWPWQVSLQV KLTAQRHLCG GSLIGHQWVL TAAHCFDGLP LQDVWRIYSG
451 ILNLSDITKD TPFSQIKEII IHQNYKVSEG NHDIALIKLQ APLNYTEFQK
501 PICLPSKGDT STIYTNCWVT GWGFSKEKGE IQNILQKVNI PLVTNEECQK
551 RYQDYKITQR MVCAGYKEGG KDACKGDSGG PLVCKHNGMW RLVGITSWGE
601 GCARREQPGV YTKVAEYMDW ILEKTQSSDG KAQMQSPA
Match to: FHR1_HUMAN Score: 123 Expect: 9.6e-09
Complement factor H-related protein 1 precursor - Homo sapiens (Human)
Nominal mass (M
r
): 38777; Calculated pI value: 7.75
NCBI BLAST search of FHR1_HUMAN
against nr
Unformatted sequence string
for pasting into other applications
Taxonomy: Homo sapiens
Fixed modifications: Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Cleavage by Trypsin: cuts C-term side of KR unless next residue is P
Sequence Coverage: 35%
Matched peptides shown in Bold Red
1 MWLLVSVILI SRISSVGGEA TFCDFPKINH GILYDEEKYK PFSQVPTGEV
51 FYYSCEYNFV SPSKSFWTRI TCTEEGWSPT PKCLRLCFFP FVENGHSESS
101 GQTHLEGDTV QIICNTGYRL QNNENNISCV ERGWSTPPKC RSTDTSCVNP
151 PTVQNAYIVS RQMSKYPSGE RVRYQCRSPY EMFGDEEVMC LNGNWTEPPQ
201 CKDSTGKCGP PPPIDNGDIT SFPLSVYAPA SSVEYQCQNL YQLEGNKRIT
251 CRNGQWSEPP KCLHPCVISR EIMENYNIAL RWTAKQKLYL RTGESAEFVC
301 KRGYRLSSRS HTLRTTCWDG KLEYPTCAKR
96
9) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 MacMahon B. Epidemiological evidence on the nature of Hodgkin’s disease.
Cancer 1957; 10: 1045-54.
2 Epstein MA, Achong BG., Barr YM. Vírus particles in cultured linfoblasts from
Burkitt`s lymphoma. Lancet 1964; 1: 702-3.
3 Olweny CL, Atine I, Kaddu MA, Owor R, Andersson M, Klein G, Henle W.
Epstein-Barr virus genomes studies in Burkitt’s lymphomas in Uganda. J Natl
Cancer Inst 1977; 58: 1191-6.
4 Weiss LM, Strickler JG, Warnke R, Purtilo DT, Skylar J. Epstein-Barr viral DNA in
tissues of Hodgkin’s disease. Am J Path 1987; 129: 86-91.
5 Petersen JM, Tubbs RR, Savage RA, Calabrese LC, Proffitt MR, Manolova Y,
Manolov G, Shumaker A, Tatsumi E, McClain K. Small noncleaved B cell Burkitt
- like lymphoma with chromossome t (8;14) translocation and Epstein-Barr
virus nuclear-associated antigen in homosexual man with acquired immune
deficiency syndrome. Am J Med 1985; 78: 141-8.
6 Birx DL, Redfield RR, Tosato G. Defective regulation of Epstein-Barr virus
infection in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) or AIDS
related disorders. N Eng J Med 1986; 314: 874-9.
7 Hanto DW, Frizzera G, Purtillo DT, Sakamoto K, Sullivan JL, Saemundsen AK,
Klein G, Simmons RL, Najarian JS. Clinical spectrum of lymphoproliferative
disordens in renal transplant and evidence for the role of the Epstein-Barr virus.
Cancer Res 1981; 41: 4253-61.
8 Ho M, Jaffe R, Miller G, Breinig MK, Dummer JS, Makowka L, Atchison RW,
Karrer F, Nalesnik MA, Starzl TE. The frequency of Epstein-Barr virus infection
and associated lymphoproliferative syndrome after transplantation and the
manifestations in children. Transplantation 1988; 45: 719-27.
9 Bashir RM, Hochberg FH, Harris NL, Purtilo D. Variable expression of Epstein-
Barr virus genome as demonstrated by in situ hybridization in central nervous
97
system lymphomas in immunocompromised patients. Mod Pathol 1990; 4: 429-
34.
10 Aozasa K, Kanno H, Miwa H, Tomita Y. EBV and malignant lymphoma with
special emphasis on pyothorax-associated lymphoma. Curr Top Microbiol
Immunol 2001; 258: 103-20.
11
Park S, Lee J, Ko YH, Han A, Jun HJ, Lee SC, Hwang IG, Park YH, Ahn JS, Jung
CW, Kim K, Ahn YC, Kang WK, Park K, Kim WS. The impact of the Epstein–Barr
virus status on clinical outcome in diffuse large B cell lymphoma. Blood online
March 30, 2007.
12 Tsimberidou AM, Keating MJ, Ramos CEB, Kurzrock R. Epstein-Barr virus in
patients with chronic lymphocytic leukemia: a pilot study. Leuk Lymphoma
2006; 47(5): 827 – 36.
13 Anagnostopoulos I, Herbst H, Niedobitek G, Harald S. Demonstration of
monoclonal EBV genomas in Hodgkin’s disease and KI-1 positive anaplastic
large cell lymphoma by combined Southern blot and in situ hybridization. Blood
1989; 74: 810-6.
14 Ho FC, Srivastava G, Loke SL, Fu KH, Leung BP, Liang R, Choy D. Presence of
Epstein-Barr virus DNA in nasal lymphomas of B and T cell type. Hematol Oncol
1990; 8: 271-81.
15 Harabuchi Y, Yamanaka N, Kataura A, Imai S, Kinoshita T, Mizuno F, Osato T.
Epstein-Barr virus in nasal T cell lymphomas in patients with lethal midline
granuloma. Lancet 1990; 335: 128-30.
16 Jones JF, Shurin S, Abramowsky C. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr
viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med
1988; 318: 733-41.
17 Anagnostopoulos I, Hummel M, Stein H. Frequent presence of latent Epstein-
Barr virus infection in peripheral T cell lymphomas. A review. Leuk Lymphoma
1995; 19: 1-12.
98
18 Andersson AM, Forsby N, Klein G, Henle W, Biörklund A. Relationship between
the Epstein-Barr virus genome and nasopharyngeal carcinoma in Caucasian
patients. Int J Cancer 1979; 23: 762-7.
19
Yu KH, Dennis Lo YM, Tse GM, Chan KCA, Chan ABW, Chow KK, Ma TKF, Vlantis
AC, Leung SF, van Hasselt CA, Johnson PJ, Chan ATC. Quantitative analysis of
cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nonnasopharyngeal
head and neck carcinomas. Clin Cancer Res 2004: 10: 1726-32.
20 Wakisaka N, Murono S, Minato H, Furukawa M, Yoshizaki T. A case report:
Epstein-Barr virus-associated undifferentiated carcinoma of the tongue base.
Auris Nasus Larynx 2006; 33(4):487-91.
21 Shimakage M, Horii K, Tempaku A, Kakudo K, Shirasaka T, Sasagawa T.
Association of Epstein-Barr virus with oral cancers. Hum Pathol 2002; 33(6):
608-14.
22 Wu MY, Wu XY, Zhuang CX. Detection of HSV and EBV in esophageal
carcinomas from a high-incidence area in Shantou China. Dis Esophagus. 2005;
18(1): 46-50.
23 Shibata D, Hawes D, Stemmerman GN, Weiss LM. Epstein-Barr virus-associated
gastric adenocarcinoma among Japanese Americans in Hawaii. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 1993; 2: 213-7.
24 Sugawara Y, Mizugaki Y, Uchida T, Torii T, Imai S, Makuuchi M, Takada K.
Detection of Epstein-Barr virus (EBV) in hepatocellular carcinoma tissue: a
novel EBV latency characterized by the absence of EBV-encoded small RNA
expression. Virology 1999; 256: 196-202.
25
Huan-Xin Liu, Yan-Qing Ding, Xin Li, Kai-Tai Yao. Investigation of Epstein-Barr
virus in Chinese colorectal tumors. World J Gastroenterol 2003;9(11):2464-8.
26 Huber M, Pavlova B, Mühlberger H, Hollaus P, Lintner F. Detection of the
Epstein-Barr virus in primary adenocarcinoma of the lung with Signet-ring cells.
Virchows Arch 2002; 441(1):25-30.
99
27 Gall AA, Unger ER, Koss MN, Yen TS. Detection of Epstein-Barr virus in
lymphoepitelioma-like carcinoma of lung. Mod Pathol 1991; 4: 264-8.
28 McClain KL, Leach CT, Jenson HB, Joshi VV, Pollock BH, Parmley RT DiCarlo FJ,
Chadwick EG, Murphy SB. Association of Epstein-Barr virus with
leiomyosarcomas in young people with AIDS. N Engl J Med 1995; 332: 12-18.
29 Labrecque LG, Barnes DM, Fentiman IS, Griffin BE. Epstein-Barr virus in
epithelial cell tumors: a breast cancer study. Cancer Res 1995; 55(1): 39-45.
30 Bonnet M, Guinebretiere JM, Kremmer E, Grunewald V, Benhamou E, Contesso
G, Joab I: Detection of Epstein-Barr in invasive breast cancers. J Natl Cancer
Inst 1999; 91: 1376-81.
31 Lattario R, Furtado YL, Fonseca R, Silveira FA, Val IC, Almeida G, Carvalho
MGC. Analysis of human papillomavirus and Epstein-Barr virus infection and
aberrant death-associated protein kinase methylation in high-grade squamous
intraepithelial lesions. Int J Gin Cancer 2007; 14.
32
Rees-Unwin KS, Morgan GJ, Davies FE. Proteomics and the haematologist. Clin
Lab Haem 2004; 26: 77-86.
33 Hodgkin T. On some morbid appearances of absorbent glands and spleen. Med
Chir Trans 1832; 17: 68-114.
34 Kaplan HS. Hodgkin’s disease, 2nd ed. Cambridge, MA: Harvard University
Press, 1980.
35 Hoster HA, Dratman MB. Hodgkin’s disease (part I) 1832-1947. Cancer Res
1948; 8: 1.
36 Hoster HA, Dratman MB. Hodgkin’s disease (part II) 1832-1947. Cancer Res
1948; 8: 49.
37 Cunningham WF. The status of diphteroids with especial reference to Hodgkin’s
disease. Am J Med Sci 1917; 153: 406.
100
38 Yates JL, Bunting CH. The rational treatment of Hodgkin’s disease. JAMA 1915;
64: 1953.
39 MacMahon B. Epidemiology of Hodgkin’s disease. Cancer Res 1966; 26: 1189-
200.
40 Connelly RR, Christine BW. Cohort study of cancer following infectious
mononucleosis. Cancer Res 1974; 34: 1172-8.
41 Levine HP, Ablashi DV, Berard CW, Carbone PP, Waggoner DE., Malan L.
Elevated antibody titers to Epstein-Barr virus in Hodgkin’s disease. Cancer
1971; 27: 416-21.
42 Goldman JM, Aisenberg AC. Incidence of antibody to EBV, herpes simplex and
cytomegalovirus in Hodgkin’s disease. Cancer 1970; 26: 327-31.
43 Mueller N, Evans A, Harris NL, Comstock GW, Jellum E, Magnus K, Orentreich N,
Polk F, Vogelman J. Hodgkin’s disease and Epstein-Barr virus-altered antibody
pattern before diagnosis. N Eng J Med 1989; 320: 689-95.
44 de-Thé G., Day N.E., Geser A., et al. Sero-epidemiology of Epstein-Barr virus:
preliminary analysis of an international study-a review. In: de Thé G, Epstein
MA zur Hausen H editors. Oncogenesis and Herpes Viruses II. Lyon:
International Agency for Research on Cancer, 1975: 3-16.
45 Wolf H, Bogedain C, Schwarzmann F,. Epstein-Barr virus and its interation with
the host. Intervirology 1993; 35: 26-39.
46 Rickison AB, Kieff E. Epstein-Barr virus. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM,
Chanock RM, Melnick JL, Monath TP, Roizman B, Straus SE, editors. Field’s
Virology. Philadelphia PA: Lippincott-Raven, 1996: 2397-446.
47 Evans AS. The spectrum of infections with Epstein-Barr virus: A hypothesis. J
Infect Dis 1971; 124: 330-7.
48 Niederman J, Evans A, Epstein-Barr virus. In: Evans AS, Kaslow RA, editors.
Viral Infections of Humans: Epidemiology and Control. New York: Plenum,
1997: 253-83.
101
49 Sawyer RN, Evans AS, Niederman JC, McCollum RW. Prospective study of a
group of Yale University freshmen. I. Occurrence of infectious mononucleosis. J
Infect Dis 1971; 123:263-70.
50 Khanna R, Burrows SR, Moss DJ. Immune regulation in Epstein-Barr virus
associated diseases. Microbiol Rev 1995; 59: 387-405.
51 Kieff E. Epstein-Barr virus and its replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley
PM, Chanock RM, Melnick JL, Monath TP, Roizman B, Straus SE, editors. Field’s
Virology. Philadelphia PA: Lippincott-Raven, 1996: 2343-96.
52 de-Thé G, Geser A, Day NE et al.Epidemiological evidence for causal
relationship between Epstein-Barr virus and Burkitt lymphoma from Ugandan
prospective study. Nature 1978; 274: 756-61.
53 Levine PH, Stemmermann G, Lennete ET, Hildesheim A, Shibata D, Nomura A.
Elevated antibody titers to Epstein-Barr virus prior to diagnosis of Epstein-Barr-
virus-associated gastric adenocarcinoma. Int J Cancer 1995; 60: 642-4.
54 Weiss LM, Movahed LA, Warnke RA, Sklar J. Detection of Epstein-Barr viral
genomes in Reed-Sternberg cells of Hodgkin’s disease. N Eng J Med 1989; 320:
502-6.
55 Evans AS, Gutensohn NM. A population-based case-control study of EBV and
other viral antibodies among persons with Hodgkin’s disease and their siblings.
Int J Cancer 1984; 34: 149-57.
56 Clark DA, Alexander FE, McKinney PA. The seroepidemiology of human
herpesvirus-6 (HHV-6) from a case-control study of leukemia and lymphoma.
Int J Cancer 1990; 45: 829-33.
57 Armstrong AA, Shield L, Gallagher A, Jarret RF. Lack of involvement of known
oncogenic DNA viruses in Epstein-Barr virus-negative Hodgkin’s disease. Br J
Cancer 1998; 77: 1045-7.
58 Ambinder RF. Gammaherpesviruses and “Hit-and-Run” Oncogenesis. Am J Path
2000; 156: 1-3.
102
59 Harris NL. Hodgkin’s Lymphomas: Classification, Diagnosis and Grading.
60 Gallagher A, Perry J, Freeland J, Alexander F, Carman WF, Shield L, Cartwright
R, Jarrett RF. Hodgkin Lymphoma and Epstein-Barr virus (EBV): no evidence to
support hit-and-run mechanism in cases classified as non-EBV-associated. Int J
Cancer 2003; 104: 624-30.
61 Wu TC, Mann RB, Charache B et al. Detection of EBV gene expression in Reed-
Sternberg cells of Hodgkin disease. Int J Cancer 1990; 46: 801-6.
62 Pallesen G, Hamilton-Dutoit SJ, Rowe M, Young LS. Expression of Epstein-Barr
virus latent genes products in tumor cells of Hodgkin disease. Lancet 1991;
337: 320-2.
63 Gan YJ, Sullivan JL, Sixbey JW. Detection of cell-free Epstein-Barr virus DNA in
serum during acute infectious mononucleosis. J Infect Dis 1994; 170: 436-9.
64 Yamamoto M, Kimura H, Hironaka I et al. Detection and quantification of vírus
DNA in plasma of patients with Epstein-Barr virus associated disease. J Clin
Microbiol 1995; 33: 1765-8.
65 Limaye AP, Huang ML, Atienza EE, Ferrenberg JM, Lawrence C. Detection of
Epstein-Barr vírus DNA in sera from transplant recipients with
lymphoproliferative disorders. J Clin Microbiol 1999; 37: 1113-6.
66 Gallagher A, Armstrong AA, MacKenzie J et al. Detection of Epstein-Barr virus
(EBV) genomes in the serum of patients with EBV-associated Hodgkin’s
disease. Int J Cancer 1999; 84: 442-8.
67 Glaser SL, Jarret RF. The epidemiology of Hodgkin’s disease. Bailliere’s Clin
Haematol 1996; 9: 401-16.
68 Muller NE, Evans AS, London WT Jr. Viruses. In: Shottenfeld D, Fraumeni JF Jr,
editors. Cancer Epidemiology and Prevention. New York: Oxford University
Press, 1996: 502-31.
69 World Health Organization classification, 1999.
103
70 Muller NE, Evans AS, London WT Jr. Viruses. In: Shottenfeld D, Fraumeni JF Jr,
editors. Cancer Epidemiology and Prevention. New York: Oxford University
Press, 1996: 502-31.
71 Glaser SL, Lin RJ, Stewart SL et al. Epstein-Barr virus-associated Hodgkin’s
disease: epidemiologic characteristics in international data. Int J Cancer 1997;
70: 375-82.
72 Leoncini L, Spina D, Nyong’o A et al. Neoplastic cells of Hodgkin disease show
differences in EBV expression between Kenya and Italy. Int J Cancer 1996; 65:
781-4.
73 Hansmann ML, Shibata D, Lorenzen J, Hell K, Nathwani BN, Fischer R. Incidence
of Epstein-Barr virus, bcl-2 expression and chromossomal translocation t
(14;18) in large cell lymphoma associated with paragranuloma (lymphocyte-
predominant Hodgkin’s disease). Hum Pathol 1994; 25: 240.
74 Khalidi H, Lones MA, Zhou Y, Weiss LM, Medeiros LJ. Detection of Epstein-Barr
virus in the L&H cell of nodular lymphocytic predominance Hodgkin’s disease.
Report of a case documented by immunohistochemical, in situ hibridization, and
polymerase chain reaction methods. Am J Clin Pathol 1997; 108: 987.
75 Mueller N, Evans A, Harris NL et al. Hodgkin’s disease and Epstein-Barr virus.
Altered antibody pattern before diagnosis. N Engl J Med 1989; 320: 689-95.
76 Mueller N. Epidemiologic studies assessing the role of the Epstein-Barr virus in
Hodgkin’s disease. Yale J Biol Med 1987; 60: 321-32.
77 Hjalgrim H, Askling J, Per Sorensen, Madsen M, Rosdahl N, Storm H, Hamilton-
Dutoit S, Eriksen LS, Frisch M, Ekbom A, Melbye M. Risk of Hodgkin’s disease
and other cancers after infectious mononucleosis. J Nat Can Inst 2000; 92:
1522-8.
78 Hjalgrim H, Smedby KE, Rostgaard K, Molin D, Hamilton-Dutoit S, Chang ET,
Ralfkiaer E, Sundstrom C, Adami HO, Glimelius B, Melbye M. Infectious
mononucleosis, childhood social environment, and risk of Hodgkin lymphoma.
Cancer Res 2007; 67: (5).
104
79 Ries LAG, Kosary CL, Hankey BF. SEER Cancer Statistics Review, 1973-1994.
NIH Publication No 97-2789. Bethesda MD: National Cancer Institute, 1997.
80 Perkins CI, Wright WE, Schlag R. Cancer Incidence and Mortality in California by
Race / Ethnicity, 1988-1994. Sacramento, CA: California Departament of Health
Services Cancer Surveillance Section, 1997.
81 Hsu JL, Glaser SL. Epstein-Barr virus associated malignancies: epidemiologic
patterns and etiologic implications. Crit Rev Onc Hemat 2000; 34: 27-53.
82 Mueller N Jr. Hodgkin’s disease. In: Schottenfeld, Fraumeni JF Jr, editors.
Cancer Epidemiology and Prevention. New York: Oxford University Press, 1996:
893-919.
83 Correa P, O’ Connor GT. Epidemiology patterns of Hodgkin’s disease. Int J
Cancer 1971; 8: 192-201.
84 Gutensohn VN. Social class and age at diagnosis of Hodgkin’s disease: new
epidemiologic evidence for the two-disease hypotesis. Cancer Treat Rep 1982;
66: 689-95.
85 Grufferman S, Delzell E. Epidemiology of Hodgkin’s disease. Epidemiol Rev
1984; 6: 76-106.
86 Mack TM, Cozen W, Shibata DK et al. Concordance for Hodgkin’s disease in
identical twins suggesting genetic suscetibility to the young-adult form of the
disease. N Engl J Med 1995; 332: 413-8.
87 Hors J, Dausset J. HLA and susceptibility to Hodgkin’s disease. Immunol Rev
1983; 70: 167-92.
88 Oza AM, Tonks S, Lim J, Fleetwood MA, Lister TA, Bodmer JG. A clinical and
epidemiological study of human leukocyte antigen-DPB alleles in Hodgkin’s
disease. Cancer Res 1994; 54: 5101-5.
89 Klitz W, Aldrich CL, Fildes N, Horning SJ, Begovich AB. Localization of
predisposition to Hodgkin’s disease in the HLA class II region. Am J Hum Genet
1994; 54: 497-505.
105
90 Reynolds P, Sauders LD, Layefsky ME, Lemp GF. The spectrum of acquired
immunodeficiency syndrome (AIDS)-associated malignancies in San Francisco,
1980-1987. Am J Epidemiol 1993; 137: 19-30.
91 Koblin BA, Hessol NA, Zauber AG. Increased incidence of cancer among
homosexual men, New York City and San Francisco, 1978-1990. Am J
Epidemiol 1996; 144: 916-23.
92 Tirelli U, Errante D, Dolcetti R et al. Hodgkin’s disease and human
immunodeficiency virus infection: clinicopathologic and virologic features of 114
patients from the Italian Cooperative Group on AIDS and Tumors. J Clin Oncol
1995; 13: 1758-67.
93 Levy R, Colonna P, Tourani JM et al. Human immunodeficiency virus associated
Hodgkin’s disease: report of 45 cases from the French Registry of HIV-
Associated tumors. Leuk Lymphoma 1995; 16: 451-6.
94 Audoin J, Diebold J, Pallensen G. Frequent expression of Epstein-Barr virus
latent membrane protein-1 in tumour cells of Hodgkin’s disease in HIV-positive
patients. J Pathol 1992; 167: 381-4.
95 Herndier BG, Sanchez HC, Chang KL, Chen YY, Weiss LM. High prevalence of
Epstein-Barr virus in Reed-Sternberg cells of HIV-associated Hodgkin’s disease.
Am J Pathol 1993; 142: 1073-9.
96 Weiss LM, Strickler JG, Hu E, Warnke RA, Sklar J. Immunoglobulin gene
rearrangements in Hodgkin's Disease. Hum Pathol 1986; 17: 1009-14.
97 Ambinder RF, Browning PJ, Lorenzana I, Leventhal BG, Cosenza H, Mann RB,
MacMahon EM, Medina R, Cardona V, Grufferman S, Olshan A, Levin A. Epstein-
Barr virus and childhood Hodgkin’s disease in Honduras and the United States.
Blood 1993, 81: 462-67.
98 Murray PG, Young LS, Rowe M, Crocker J. Immunohistochemical demonstration
of the Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein in paraffin sections
of Hodgkin’s disease. J Pathol 1992; 166: 1-5.
106
99 Brousset P, Chittal S, Icart J, Payen C, Rigal-Huguet F, Voigt J, Delsol G.
Detection of Epstein-Barr virus messenger RNA in Reed-Sternberg cells of
Hodgkin’s disease by in situ hybridization with biotinylated probes on specially
processed modified acetone methyl benzoate xylene (ModAMex) sections.
Blood 1991; 77: 1781-6.
100 Belkaid MI, Zerhouni F, Beljord K, Brière J, Assouak W, Djebbara Z, Andrieu
JM, Colonna P. Association du virus d’Epstein-Barr à la maladie de Hodgkin:
comparison entre patients algériens et français. Bull Can 1995; 82: 357- 63.
101 Kanavaros P, Sakalidou A, Tzardi M, Darivianaki K, Delides G, Kaziaris E,
Kalmanti M. Frequent detection of Epstein-Barr virus (EBV) EBER transcripts
and latent membrane protein-1 (LMP-1) in tumor cells in Hodgkin's disease
arising in childhood. Pathol Res Pract 1994; 190: 1026-30.
102 Benharroch D, Brousset P, Goldstein J, Prinsloo I, Rabinovitch Shendler Y,
Ariad S, Levy A, Delsol G, Gopas J. Association of Epstein- Barr virus with
Hodgkin’s disease in southern Israel. Int J Cancer; 71: 138-41.
103 Peh SC, Looi LM, Pallesen G. Epstein- Barr virus and Hodgkin’s disease in a
multi-ethnic population in Malaysia. Histopathol 1997; 30: 227-33.
104 Weinreb M, Day PJR, Niggli F, Green EK, Othieno-Abinya N, Riyat MS, Raafat F,
Mann JR. The consistent association between Epstein-Barr virus and Hodgkin’s
disease in children in Kenya. Blood 1996; 87: 3828-36.
105 Monterroso V, Zhou Y, Koo S, Glackin C, Bujan W, Medeiros J. Hodgkin's
disease in Costa Rica: a report of 40 cases analyzed for Epstein- Barr virus.
Hematopathol 1997; 109: 618-24.
106
Hsieh PP, Tung CH, Chan ABW, Liao JA, Wang JS, Tseng HH, Su HH, Chang
KC, Chang CC.EBV viral load in tumor tissue is an important prognostic
indicator for nasal NK/T-cell lymphoma. Am J Clin Pathol 2007; 128: 579-84.
107 Mandel P, Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’Homme.
CR Acad Sci Paris 1948; 142: 241-43.
107
108 Tan EM, Schur PH, Carr RI, Kunkel HG. Deoxyribonucleic acid (DNA) and
antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus.
J Clin Invest 1966; 45: 1732-40.
109 Koffler D, Agnello V, Winchester R, Kunkel HG. The occurrence of single-
stranded DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus and
other diseases. J Clin Invest 1973; 52: 198-204.
110 Steinman CR. Free DNA in serum and plasma from normal adults. J Clin Invest
1975; 56: 512-15.
111 Rumore M, Steinman CR. Endogenous circulating DNA in systemic lupus
erythematosus, occurrence as multimeric complexes bound to histone. J Clin
Invest 1990; 86: 69-74.
112 Li ZJ, Steinman CR. Plasma DNA in systemic lupus erythematosus :
Characterization of cloned base sequences. Arthritis Rheum 1989; 32: 726-33.
113 Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer
patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977; 37: 646-50.
114 Yamada T, Nakamori S, Ohzato H, Oshima S, Aoki T, Higaki N, Sugimoto K,
Agaki K, Fujiwara Y, Nishisho I, Sakon M, Gotoh M, Monder M. Circulating DNA
K-ras mutation in pancreatic adenocarcinoma. Clin Cancer Res, 1998; 4: 1527-
32.
115 Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Yao SL. Soluble
normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994; 3: 67-71.
116 Dong SM, Pai SI, Rha S-H et al. Detection and quantitation of human
papillomavirus DNA in the plasma of patients with cervical carcinoma. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 3–6.
117 Pornthanakasem W, Shotelersuk K, Termrungruanglert W et al. Human
papillomavirus DNA in plasma of patients with cervical cancer. BMC Cancer
2001; 1: 2.
108
118 Capone RB, Pai SI, Koch WM et al. Detection and quantitation of human
papillomavirus (HPV) DNA in the sera of patients with HPV-associated head and
neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2000; 6: 4171–5.
119 Yamamoto M, Kimura H, Hironaka I et al. Detection and quantification of virus
DNA in plasma of patients with Epstein-Barr virus associated disease. J Clin
Microbiol 1995; 33: 1765-8.
120 Shotelersuk K, Khorprasert C, Sakdikul S et al. Epstein-Barr virus DNA in
serum / plasma as a tumor marker for nasopharyngeal cancer. Clin Cancer Res
2000; 6: 1046-51.
121 Lo YMD, Chan LYS, Lo K-W et al. Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr
virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res
1999; 59: 1188-91.
122 Doesch AO, Konstandin M, Celik S, Kristen A, Frankenstein L, Sack FU,
Schnabel P, Schnitzler P, Katus HA, Dengler TJ.Epstein-Barr virus load in whole
blood is associated with immunosuppression, but not with post-transplant
lymphoproliferative disease in stable adult heart transplant patients. Transpl
Int. 2008.
123 Lei KIK, Chan LYS, Chan WY, Johnson PJ, Dennis Lo YM. Diagnostic and
Prognostic Implications of circulating cell-free Epstein-Barr virus DNA in NK/T
cell lymphoma. Clin Cancer Res 2002; 8: 29-34.
124 Ngan RKC, Yip TTC, Cheng W-W et al. Circulating Epstein–Barr virus DNA in
serum of patients with lymphoepithelioma-like carcinoma of the lung: a
potential surrogate marker for monitoring disease. Clin Cancer Res 2002; 8:
986–94.
125 Lo YMD, Chan WY, Ng EKW et al. Circulating Epstein–Barr virus DNA in the
serum of patients with gastric carcinoma. Clin Cancer Res 2001; 7: 1856–9.
126 Lei KIK, Chan LYS, Chan WY, Johnson PJ, Lo YMD. Quantitative analysis of
circulating cell-free Epstein-Barr virus DNA levels in patients with EBV-
associated lymphoid malignancies. Brit J Haematology 2000; 111: 239-46.
109
127 Wagner HJ, Schlager F, Claviez A, Bucsky P. Detection of Epstein-Barr virus
DNA in peripheral blood of paediatric patients with Hodgkin’s disease by real-
time polymerase chain reaction. Eur J Cancer 2001; 37: 1853-7.
128 Wagner HJ, Wessel M, Jabs W et al. Patients at risk for development of
posttransplant lymphoproliferative disorder: plasma versus peripheral blood
mononuclear cells as material for quantification of Epstein-Barr viral load using
real-time quantitative polymerase chain reaction. Transplantation 2001; 72(6):
1012-9.
129 Au WY, Pang A, Choy C, Chim CS, Kwong YL. Quantification of circulating
Epstein-Barr virus (EBV) DNA in the diagnosis and monitoring of natural killer
cell and EBV-positive lymphomas in immunocompetent patients. Blood 2004;
vol 104: 243-49.
130
Musacchio JG, da Costa Carvalho MdaG, Morais JCO, Silva NH, Scheliga A,
Romano S, Spector N. Detection of free circulating Epstein-Barr virus DNA in
plasma of patients with Hodgkin’s disease. Sao Paulo Med J 2006; 124(3): 154-
7.
131 Gandhi MK, Lambley E, Burrows J, Dua U, Elliott S, Shaw PJ, Prince HM, Wolf
M, Clarke K, Underhill C, Mills T, Mollee P, Gill D, Marlton P, Seymour JF,
Khanna R. Plasma Epstein-Barr Virus (EBV) DNA Is a Biomarker for EBV-
Positive Hodgkin’s Lymphoma. Clin Cancer Res 2006; 12(2).
132 O’Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J
Biol Chem 1975; 250: 4007– 21.
133 Klose J, Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated
protocol and implications for a functional analysis of the genome.
Electrophoresis 1995; 16: 1034–59.
134 Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomes. Nature 2000;
405: 837-46.
110
135 Palma MS, Mendes MA, Marques MR, Souza BM, Santos LD, Santos KS.
Espectrometria de massas. In: Palma MS, Azevedo Jr WF. Fundamentos em
análise proteômica. Rio Claro: LBEZ - UNESP, p.1-22, 2004.
136 Brichory F, Beer D, Le Naour F, Giordano T, Hannash S. Proteomics-based
identification of protein gene product 9.5 as a tumor antigen that induces a
humoral response in lung cancer. Cancer Res 2001; 61: 7908-12.
137 Petricoin EF, Arkeani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills
GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in
serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002; 359: 572-7.
138 Adam BL, Qu Y, Davis JW, Ward MD, Clements MA, Cazares LH, Semmes OJ,
Schellhammer PF, Yasui, Y, Feng Z, Wright Jr GL. Serum protein fingerprinting
coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from
benign prostate hyperplasia and healthy men. Cancer Res 2002; 62: 3609-14.
139 Jinong L, Zhang Z, Rosenzweig J, Wang YY, Chan DW. Proteomics and
bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect
breast cancer. Clin Chem 2002; 48: 1296-304.
140 Maciel CM, Junqueira M, Paschoal ME, Kawamura MT, Duarte RL, Carvalho Mda
G, Domont GB. Differential proteomic serum pattern of low molecular weight
proteins expressed by adenocarcinoma lung cancer patients. J Exp Ther Oncol.
2005; 5(1): 31-8.
141 Leman ES, Schoen RE, Magheli A, Sokoll LJ, Chan DW, Getzenberg RH.
Evaluation of colon cancer-specific antigen 2 as a potential serum marker for
colorectal cancer. Clin Cancer Res 2008 Mar 1; 14(5): 1349-54.
142 Zinkin NT, Grall F, Bhaskar K, Otu HH, Spentzos D, Kalmowitz B, Wells M,
Guerrero M, Asara JM, Libermann TA, Afdhal NH. Serum proteomics and
biomarkers in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease. Clin Cancer
Res. 2008; 14(2): 470-7.
111
143 Wei YS, Zheng YH, Liang WB, Zhang JZ, Yang ZH, Lv ML, Jia J, Zhang L.
Identification of serum biomarkers for nasopharyngeal carcinoma by proteomic
analysis. Cancer 2008; 112(3): 544-51.
144 Liotta LA, Kohn E. The microenvironment of the tumor-host interface. Nature
2001; 411: 375-9.
145
Hanash SM, Madoz-Gurpide J, Misek DE. Identification of novel targets for
cancer therapy using expression proteomics. Leukemia 2002; 16: 478–85.
146
Hanash SM, Neel JV, Baier LJ, Rosenblum BB, Niezgoda W, Markel D. Genetic
analysis of thirty-three platelet polypeptides detected in two-dimensional
polyacrylamide gels. American Journal of Human Genetics 1986; 38: 352–60.
147 Strahler JR, Kuick R, Eckerskorn C, Lottspeich F, Richardson BC, Fox DA,
Stoolman LM, Hanson CA, Nichols D, Tueche HJ. Identification of two related
markers for common acute lymphoblastic leukemia as heat shock proteins. J
Clin Invest 1990; 85: 200–7.
148
Voss T, Ahorn H, Haberl P, Dohner H, Wilgenbus K. Correlation of clinical data
with proteomics profiles in 24 patients with B-cell chronic lymphocytic
leukemia. Int J Cancer 2001; 91: 180–6.
149 Polyak K, Xia Y, Zweier JL, Kinzler KW, Vogelstein B. A model for p53-induced
apoptosis. Nature 1997; 389: 300–5.
150
Komarova EA, Diatchenko L, Rokhlin OW, Hill JE, Wang ZJ, Krivokrysenko VI,
Feinstein E, Gudkov AV. Stress induced secretion of growth inhibitors: a novel
tumor suppressor function of p53. Oncogene 1998; 17: 1089–96.
151
Zhang P, Liu B, Kang SW, Seo MS, Rhee SG, Obeid LM. Thioredoxin peroxidase
is a novel inhibitor of apoptosis with a mechanism distinct from that of Bcl-2. J
Biol Chem 1997; 272: 30615–18.
152
Tager M, Kroning H, Thiel U, Ansorge S. Membrane bound protein disulfide
isomerase (PDI) is involved in regulation of surface expression of thiols and
drug sensitivity of B-CLL cells. Exp Hematol 1997; 25: 601–7.
112
153 Cochran DAE, Evans CA, Blinco D, Burthem J, Stevenson F, Gaskell SJ,
Whetton AD. Proteomic analysis of chronic lymphocytic leukemia subtypes with
mutated or unmutated Ig VH genes. Mol Cell Proteomics 2003; 2: 1331–41.
154
Joubert-Caron R, Le Caer JP, Montandon F, Poirier F, Pontet M, Imam N,
Feuillard J, Bladier D, Rossier J, Caron M. Protein analysis by mass
spectrometry and sequence database searching: a proteomic approach to
identify human lymphoblastoid cell line proteins. Electrophoresis 2000; 21:
2566–75.
155
Caron M, Imam-Sghiouar N, Poirier F, Le Caer JP, Labas V, Joubert-Caron R.
Proteomic map and database of lymphoblastoid proteins. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci 2002; 771: 197–209.
156
Poirier F, Pontet M, Labas V, Le Caer JP, Sghiouar-Imam N, Raphael M, Caron
M, Joubert-Caron R. Two dimensional database of a Burkitt lymphoma cell line
(DG 75) proteins: protein pattern changes following treatment with 5’-
azycytidine. Electrophoresis 2001; 22: 1867–77.
157
Ng PW, Porter AG, Janicke RU. Molecular cloning and characterization of two
novel pro-apoptotic isoforms of caspase-10. J Biol Chem 1999; 274: 10301–8.
158 Lin Z, Jenson SD, Lim MS, Elenitoba-Johnson KS. Application of SELDI-TOF
mass spectrometry for the identification of differentially expressed proteins in
transformed follicular lymphoma. Mod Pathol 2004; 17(6): 670-8.
159
Fan G, Molstad M, Braziel RM, Standley M, Huang J, Rodgers W, Nagalla S.
Proteomic profiling of mature CD10+ B-cell lymphomas. Am J Clin Pathol 2005;
124(6): 920-9.
160 Ghobrial IM, McCormick DJ, Kaufmann SH, Leontovich AA, Loegering DA, Dai
NT, Krajnik KL, Stenson MJ, Melhem MF, Novak AJ, Ansell SM, Witzig TE.
Proteomic analysis of mantle-cell lymphoma by protein microarray. Blood 2005
May 1; 105(9): 3722-30.
161 Cussac D, Pichereaux C, Colomba A, Capilla F, Pont F, Gaits-Iacovoni F,
Lamant L, Espinos E, Burlet-Schiltz O, Monsarrat B, Delsol G, Payrastre B.
113
Proteomic analysis of anaplastic lymphoma cell lines: identification of potential
tumour markers. Proteomics 2006; 6(10): 3210-22.
162
Cowen EW, Liu CW, Steinberg SM, Kang S, Vonderheid EC, Kwak HS, Booher
S, Petricoin EF, Liotta LA, Whiteley G, Hwang ST. Differentiation of tumour-
stage mycosis fungoides, psoriasis vulgaris and normal controls in a pilot study
using serum proteomic analysis. Br J Dermatol 2007; 157(5): 946-53.
163 Zhang X, Wang B, Zhang X-S, Li Z-M, Guan Z-Z, Jiang W-Q. Serum diagnosis
of diffuse large B-cell lymphomas and further identification of response to
therapy using SELDI-TOF-MS and tree analysis patterning. BMC Cancer 2007;
7: 235.
164
Ueda K, Nakanishi T, Shimizu A, Takubo T, Matsuura N. Identification of L-
plastin autoantibody in plasma of patients with non-Hodgkin's lymphoma using
a proteomics-based analysis. Ann Clin Biochem 2008; 45(Pt 1):65-9.
165 Fujii K, Kondo T, Yokoo H, et al. Protein expression pattern distinguishes
different lymphoid neoplasms. Proteomics 2005; 5: 4274-86.
166 Fujii K, Kondo T, Yamada M, Iwatsuki K, Hirohashi S. Toward a comprehensive
quantitative proteome database: protein expression map of lymphoid
neoplasms by 2-D DIGE and MS. Proteomics 2006; 6: 4856-76.
167
Carvalho PC, Carvalho Mda G, Degrave W, Lilla S, De Nucci G, Fonseca R,
Spector N, Musacchio J, Domont GB. Differential protein expression patterns
obtained by mass spectrometry can aid in the diagnosis of Hodgkin's disease. J
Exp Ther Oncol 2007; 6: 137-45.
168 Wallentine JC, Kim KK, Seiler CE 3rd, Vaughn CP, Crockett DK, Tripp SR,
Elenitoba-Johnson KS, Lim MS. Comprehensive identification of proteins in
Hodgkin lymphoma-derived Reed-Sternberg cells by LC-MS/MS. Lab Invest
2007; 87(11):1113-24.
169 Ma Y, Visser L, Roelofsen H, de Vries M, Diepstra A, van Imhoff G, van der Wal
T, Luinge M, Alvarez-Llamas G, Vos H, Poppema S, Vonk R, van den Berg A.
Proteomics analysis of Hodgkin lymphoma: identification of new players
114
involved in the cross-talk between HRS cells and infiltrating lymphocytes. Blood
2008; 111(4):2339-46.
170
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem
1976; 72: 248-54.
171
Shevchenko A, Tomas H, Havlis J, Olsen JV, Mann M. In-gel digestion for mass
spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc 2006;
1(6):2856-60.
172 Thingholm TE, Jørgensen TJD, Jensen ON, Larsen MR. Highly selective
enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat Protoc
2006;1(4):1229-1935.
173 Gulley ML, Glaser SL, Craig FE, Borowitz M, Mann RB, Shema SJ, Ambinder R.
Guidelines for interpreting EBER in situ hibridization and LMP-1
immunohistochemical tests for detecting Epstein-Barr Virus in Hodgkin’s
disease. Am J Clin Pathol 2002; 11: 259-67.
174 Gene Bank - NCBI
175 Christie DL, Gagnon J. Amino acid sequence of the Bb fragment from
complement Factor B. Sequence of the major cyanogen bromide-cleavage
peptide (CB-II) and completion of the sequence of the Bb fragment. Biochem J
1983; 209 (1): 61–70.
176 Peters MG, Ambrus JL, Fauci AS, Brown EJ. The Bb fragment of complement
factor B acts as a B cell growth factor. J Exp Med 1988; 168: 1225.
177 Praz F, Ruuth E. Growth-supporting activity of fragment Ba of the human
alternative complement pathway for activated murine B lymphocytes. J Exp
Med 1986; 163: 1349.
178 Hall RE, Blaese RM, Davis III AE, Decker JM, Tack BF, Colten HR, Muchmore
AV. Cooperative interaction of factor B and other complement components with
mononuclear cells in the antibody-independent lysis of xenogeneic
erythrocytes. J Exp Med 1982; 156: 834.
115
179 Leijh PCJ, van den Barselaar M, Daha MR, van Furth R. Stimulation of the
intracellular killing of Staphylococcus aureus by monocytes: regulation by
immunoglobulin G and complement components C3/C3b and B/Bb. J Immunol
1982; 129: 332.
180 Gotze O, Bianco C, Cohn ZA. The induction of macrophage spreading by factor
B of the properdin system. J Exp Med 1979; 149: 372.
181 Gotze O, Bianco C, Cohn ZA. Regulation of macrophage migration by products
of the complement system. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76: 888.
182 Ambrus JL, Peters MG, Fauci AS, Brown EJ. The Ba fragment of complement
factor B inhibits human B lymphocyte proliferation. J Immunol 1990; 144:
1549.
183 Clardy CW. Complement activation by whole endotoxin is blocked by
monoclonal antibody to Factor B. Infect Immun 1994; 62: 5449.
184 Fearson DT, Ruddy S, Schur PH, McCabe WR. Activation of the properdin
pathway of complement in patients with Gram-negative sepsis. N Engl J Med
1975; 292: 937.
185 Huang J, Kim LJ, Mealey R, Marsh HC, Zhang Y, Tenner AJ, Connolly ES,
Pinsky DJ. Neuronal protection in stroke by an sLex-glycosylated complement
inhibitory protein. Science 1999; 285:595.
186 Oglesby TJ, Ueda A, Volanakis JE. Radioassays for quantitation of intact
complement proteins C2 and B in human serum. J Immunol Methods 1988;
110: 55.
187 Lin RY, Astiz ME, Saxon JC, Saha DC, Rackow EC. Alterations in C3, C4, factor
B, and related metabolites in septic shock. Clin Immunol Immunopathol 1993;
69: 136.
188
Leinhase I, Rozanski M, Harhausen D, Thurman JM, Schmidt OI, Hossini AM,
Taha ME, Rittirsch D, Ward PA, Holers VM, Ertel W, Stahel PF. Inhibition of the
alternative complement activation pathway in traumatic brain injury by a
116
monoclonal anti-factor B antibody: a randomized placebo-controlled study in
mice. J Neuroinflammation 2007; 2; 4: 13.
189 Roxo Júnior P, Ferriani VP, Teixeira JE, Barbosa JE. Complement levels in
Brazilian children during and after meningococcal meningitis. Clinics 2005;
60(2): 127-30.
190
Doustjalali SR, Yusof R, Yip CH, Looi LM, Pillay B, Hashim OH. Aberrant
expression of acute-phase reactant proteins in sera and breast lesions of
patients with malignant and benign breast tumors. Electrophoresis 2004; 25
(14): 2392-401.
191 Alper CA, Raum D, Awdeh ZL, Petersen BH, Taylor PD, Starzl TE. Studies of
hepatic synthesis in vivo of plasma proteins, including orosomucoid, transferrin,
1-antitrypsin, C8, and factor B. Clin Immunol Immunopathol 1980; 16: 84.
192 Laszlo DJ, Henson PM, Weinstein L, Remigio LK, Sable C, Noble PW, Riches
DWH. Development of functional diversity in mouse macrophages. Am J Pathol
1993; 143: 587.
193 Whaley K. Biosynthesis of the complement components and the regulatory
proteins of the alternative complement pathway by human peripheral blood
monocytes. J Exp Med 1980; 151: 501.
194 Katz Y, Cole FS, Strunk RC. Synergism between interferon and
lipopolysaccharide for synthesis of factor B, but not C2, in human fibroblasts. J
Exp Med 1988; 167: 1.
195 Strunk RC, Eidlen DM, Mason RJ. Pulmonary alveolar type II epithelial cells
synthesize and secrete proteins of the classical and alternative complement
pathways. J Clin Invest 1988; 81: 1419.
196 Ripoche J, Mitchell JA, Erdei A, Madin C, Moffatt B, Mokoena T, Gordon S, Sim
RB. Interferon induces synthesis of complement alternative pathway proteins
by human endothelial cells in culture. J Exp Med 1988; 168: 1917.
197 Huang Y, Krein PM, Winston BW. Characterization of IFN regulation of the
complement factor B gene in macrophages. Eur J Immunol 2001; 31: 3676.
117
198 Lake FR, Noble PW, Henson PM, Riches DWH. Functional switching of
macrophage responses to TNF by interferons: implications for the pleiotropic
activities of TNF. J Clin Invest 1994; 93: 1661.
199 Huang Y, Krein PM, Muruve DA, Winston BW. Complement factor B gene
regulation: synergistic effects of TNF-alpha and IFN-gamma in macrophages. J
Immunol 2002; 169 (5): 2627-35.
200 Jost PJ, Ruland J. Aberrant NF-kappaB signaling in lymphoma: mechanisms,
consequences, and therapeutic implications. Blood 2007; 109 (7): 2700-7.
201 Piñeiro M, Alava MA, González-Ramón N, Osada J, Lasierra P, Larrad L, Piñeiro
A, Lampreave F. ITIH4 serum concentration increases during acute-phase
processes in human patients and is up-regulated by interleukin-6 in
hepatocarcinoma HepG2 cells. Biochem Biophys Res Commun 1999; 263 (1):
224-9.
202 Cordano P, Lake A, Shield L, Taylor GM, Alexander FE, Taylor PR, White J,
Jarrett RF. Effect of IL-6 promoter polymorphism on incidence and outcome in
Hodgkin's lymphoma. Br J Haematol 2005;128 (4):493-5.
203 Gause A, Keymis S, Scholz R, Schobert I, Jung W, Diehl V, Pohl C,
Pfreundschuh M. Increased levels of circulating cytokines in patients with
untreated Hodgkin's disease. Lymphokine Cytokine Res 1992; 11 (2):109-13.
204
Mohamed E, Abdul-Rahman PS, Doustjalali SR, Chen Y, Lim BK, Omar SZ,
Bustam AZ, Singh VA, Mohd-Taib NA, Yip CH, Hashim OH. Lectin-based
electrophoretic analysis of the expression of the 35 kDa inter-alpha-trypsin
inhibitor heavy chain H4 fragment in sera of patients with five different
malignancies. Electrophoresis. 2008;29 (12): 2645-50.
205 Cockerill GW, Gamble JR, Vadas MA. Angiogenesis: models and modulators.
Int Rev Cytol 1995; 159: 113-60.
206 Awadallah S, Hamad M. A study of haptoglobin phenotypes in patients with
chronic renal failure. Ann Clin Biochem 2003; 40 (Pt 6): 680-3.
118
207 Papp M, Foldi I, Nemes E, Udvardy M, Harsfalvi J, Altorjay I, Mate I, Dinya T,
Varvolgyi C, Barta Z, Veres G, Lakatos PL, Tumpek J, Toth L, Szathmari E,
Kapitany A, Gyetvai A, Korponay-Szabo IR. Haptoglobin polymorphism: a novel
genetic risk factor for celiac disease development and its clinical manifestations.
Clin Chem 2008;54 (4): 697-704.
208 Suleiman M, Kapeliovich MR, Roguin A, Aronson D, Meisel SR, Shochat M,
Reisner SA, Hammerman H, Lotan R, Levy NS, Levy AP. Haptoglobin type and
30-day mortality in diabetic individuals presenting with acute myocardial
infarction. Diabetes Care. 2003; 26 (9): 2699-700.
209 Costa-Mallen P, Checkoway H, Zabeti A, Edenfield MJ, Swanson PD, Longstreth
WT Jr, Franklin GM, Smith-Weller T, Sadrzadeh SM. The functional
polymorphism of the hemoglobin-binding protein haptoglobin influences
susceptibility to idiopathic Parkinson's disease. Am J Med Genet B
Neuropsychiatr Genet 2008; 147B (2): 216-22.
210 Cox SE, Doherty CP, Atkinson SH, Nweneka CV, Fulford AJ, Sirugo G, Rockett
KA, Kwiatkowski DP, Prentice AM. Haptoglobin genotype, anaemia and malaria
in Gambian children. Trop Med Int Health 2008; 13 (1): 76-82.
211 Langlois MR, Delanghe JR. Biological and clinical significance of haptoglobin
polymorphism in humans. Clin Chem 1996; 42 (10): 1589-600.
212 Dunzendorfer U, Jung K, Ohlenschläger G. Transferrin, C3 complement,
haptoglobin, plasminogen and alpha 2-microglobulin in patients with urogenital
tumors. Eur Urol 1980; 6 (4): 232-6.
213 Hansen JE, Iversen J, Lihme A, Bøg-Hansen TC. Acute phase reaction,
heterogeneity, and microheterogeneity of serum proteins as nonspecific tumor
markers in lung cancer. Cancer 1987; 60 (7): 1630-5.
214 Thompson S, Turner GA. Elevated levels of abnormally-fucosylated
haptoglobins in cancer sera. Br J Cancer 1987; 56 (5): 605-10.
215 Beckman G, Eklund A, Fröhlander N, Stjernberg N. Haptoglobin groups and
lung cancer. Hum Hered 1986; 36 (4): 258-60.
119
216 Kuhajda FP, Katumuluwa AI, Pasternack GR. Expression of haptoglobin-related
protein and its potential role as a tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A
1989; 86 (4):1188-92.
217 Oh SK, Very DL, Walker J, Raam S, Ju ST. An analogy between fetal
haptoglobin and a potent immunosuppressant in cancer. Cancer Res 1987;
47(19): 5120-6.
218 Harvey SR, Nayak SK, Markus G, Ouhammouch M, Hemperly JJ, Dillman RO,
Doyle DJ. Cancer cells release a covalent complex containing disulfide-linked
domains from urinary plasminogen activator, neural cell adhesion molecule,
and haptoglobin alpha and beta chains. Arch Biochem Biophys 1997; 345 (2):
289-98.
219 Epelbaum R, Shalitin C, Segal R, Valansi C, Arselan I, Faraggi D, Leviov M,
Ben-Shahar M, Haim N. Haptoglobin-related protein as a serum marker in
malignant lymphoma. Pathol Oncol Res 1998; 4 (4): 271-6.
220 Sugita K, Hagisawa S, Satoh Y, Eguchi M, Furukawa T. Recurrent
hepatosplenomegaly and peripheral blood cytopenia, persistent Epstein-Barr
virus infection and central nervous system manifestation in a patient with
lymphadenopathy and low serum uric acid. Acta Paediatr Jpn 1998; 40 (4):
362-6.
221
Delanghe JR, Langlois MR. Hemopexin: a review of biological aspects and the
role in laboratory medicine. Clin Chim Acta 2001; 312 (1-2): 13-23.
222
Lazar P, Brezin C, Oudin J. Classification of 29 Hodgkin's disease patients as a
function of the concentration of 22 serum antigens. Ann Biol Clin (Paris) 1975;
33 (1): 35-40.
223
Murray PG, Billingham LJ, Hassan HT, Flavell JR, Nelson PN, Scott K, Reynolds
G, Constandinou CM, Kerr DJ, Devey EC, Crocker J, Young LS. Effect of Epstein-
Barr virus infection on response to chemotherapy and survival in Hodgkin’s
disease. Blood 1999; 94: 442–7.
120
224 Morente MM, Piris MA, Abraira V, Acevedo A, Aguilera B, Bellas C, Fraga M,
Garcia-Del-Moral R, Gomez-Marcos F, Menarguez J, Oliva H, Sanchez-Beato M,
Montalban C. Adverse clinical outcome in Hodgkin’s disease is associated with
loss of retinoblastoma protein expression, high Ki-67 proliferation index, and
absence of Epstein-Barr virus-latent membrane protein 1 expression. Blood
1997; 90: 2429–36.
225 Enblad G, Sandvej K, Sundstrom C, Pallesen G, Glimelius B. Epstein-Barr virus
distribution in Hodgkin’s disease in an unselected Swedish population. Acta
Oncol 1999; 38: 425–9.
226 Naresh KN, Johnson J, Srinivas V, Soman CS, Saikia T, Advani SH, Badwe RA,
Dinshaw KA, Muckaden M, Magrath I, Bhatia K. Epstein-Barr virus association in
classical Hodgkin’s disease provides survival advantage to patients and
correlates with higher expression of proliferation markers in Reed-Sternberg
cells. Ann Oncol 2000; 11: 91–6.
227 Herling M, Rassidakis GZ, Medeiros LJ, Vassilakopoulos TP, Kliche KO, Nadali
G, Viviani S, Bonfante V, Giardini R, Chilosi M, Kittas C, Gianni AM, Bonadonna
G, Pizzolo G, Pangalis GA, Cabanillas F, Sarris AH. Expression of Epstein-Barr
virus latent membrane protein-1 in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of
classical Hodgkin’s lymphoma: associations with presenting features, serum
interleucin 10 levels, and clinical outcome. Clin Cancer Res 2003; 9: 2114-20.
228
Ramji DP, Vitelli A, Tronche F, Cortese R, Ciliberto G. The two C/EBP isoforms,
IL-6DBP/NF-IL6 and C/EBP delta/NF-IL6 beta, are induced by IL-6 to promote
acute phase gene transcription via different mechanisms. Nucleic Acids Res
1993; 21 (2): 289-94.
229
Ishioka N, Takahashi N, Putnam FW. Amino acid sequence of human plasma
alpha 1B-glycoprotein: homology to the immunoglobulin supergene family. Proc
Natl Acad Sci U S A 1986; 83 (8): 2363-7.
230
Kreunin P, Zhao J, Rosser C, Urquidi V, Lubman DM, Goodison S. Bladder
cancer associated glycoprotein signatures revealed by urinary proteomic
profiling. J Proteome Res 2007; 6 (7): 2631-9.
121
231 Llorca J, Rodríguez-Rodríguez E, Dierssen-Sotos T, Delgado-Rodríguez M,
Berciano J, Combarros O. Meta-analysis of genetic variability in the beta-
amyloid production, aggregation and degradation metabolic pathways and the
risk of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand 2008; 117 (1): 1-14.
232 Hao Y, Xie H, Xu L. Association between polymorphism of alpha 1-
antichymotrypsin and apolipoprotein E gene and Parkinson's disease in
Shanghai Hans. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2001;81 (19): 1172-5.
233 Kalsheker N, Morley S, Morgan K. Gene regulation of the serine proteinase
inhibitors alpha1-antitrypsin and alpha1-antichymotrypsin. Biochem Soc Trans
2002; 30 (2): 93-8.
234
Kelly UL, Cooper EH, Alexander C, Stone J. The assessment of
antichymotrypsin in cancer monitoring. Biomedicine 1978; 28 (4): 209-15.
235 Gaffar SA, Princler GL, McIntire KR, Braatz JA. A human lung tumor-associated
antigen cross-reactive with alpha 1-antichymotrypsin. J Biol Chem 1980;255
(17): 8334-9.
236 Kondo Y, Ohsawa N. Production of human alpha 1-antichymotrypsin-like
protein by a human malignant melanoma transplanted into nude mice. Cancer
Res. 1982;42 (4): 1549-54.
237 Licastro F, Bertaccini A, Porcellini E, Chiappelli M, Pernetti R, Sanguedolce F,
Marchiori D, Martorana G. Alpha 1 antichymotrypsin genotype is associated
with increased risk of prostate carcinoma and PSA levels. Anticancer Res 2008;
28 (1B): 395-9.
238
Dabrowska M, Kemona H, Prokopowicz J, Kiluk S. Serum concentration of
alpha-2-macroglobulin, alpha-1-antitrypsin and alpha-1-antichymotrypsin
[correction of alpha-2-antichymotrypsin] in patients with Hodgkin's disease.
Mater Med Pol 1992; 24 (1): 28-30.
239 McAndrew GM, Ogston D. Plasminogen deficiency in Hodgkin’s disease. Scott
Med J 1965; 10: 241-5.
122
240 Vasse M, Paysant J, Soria J, Collet JP, Vannier JP, Soria C. Regulation of
fibrinogen biosynthesis by cytokines, consequences on the vascular risk.
Haemostasis 1996; 26 Suppl 4: 331-9.
241 Vasse M, Paysant I, Soria J, Mirshahi SS, Vannier JP, Soria C. Down-regulation
of fibrinogen biosynthesis by IL-4, IL-10 and IL-13. Br J Haematol 1996; 93
(4): 955-61.
242 “Cytokynes” in Abbas, AK, Cellular and molecular immunology 6
a
ed, 2007:
287-301.
243 Dukers DF, Jaspars LH, Vos W, Oudejans JJ, Hayes D, Cillessen S, Middeldorp
JM, Meijer CJ. Quantitative immunohistochemical analysis of cytokine profiles in
Epstein-Barr virus-positive and -negative cases of Hodgkin's disease. J Pathol
2000; 190 (2): 143-9.
244 Bohlen H, Kessler M, Sextro M, Diehl V, Tesch H. Poor clinical outcome of
patients with Hodgkin’s disease and elevated interleukin-10 serum levels.
Clinical significance of interleukin-10 serum levels for Hodgkin’s disease. Ann
Hematol 2000; 79: 110–3.
245 Vassilakopoulos TP, Nadali G, Angelopoulou MK, Siakantaris MP, Dimopoulou
MN, Kontopidou FN, Rassidakis GZ, Doussis-Anagnostopoulou IA, Hatzioannou
M, Vaiopoulos G, Kittas C, Sarris AH, Pizzolo G, Pangalis GA. Serum interleukin-
10 levels are an independent prognostic factor for patients with Hodgkin’s
lymphoma. Haematologica 2001; 86: 274–81.
246 Shi Q, Harris LN, Lu X, Li X, Hwang J, Gentleman R, Iglehart JD, Miron A.
Declining plasma fibrinogen alpha fragment identifies HER2-positive breast
cancer patients and reverts to normal levels after surgery. J Proteome Res
2006; 5 (11): 2947-55.
247 Marshall T, Williams KM. The simplified technique of high resolution two-
dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: biomedical applications in
health and disease. Electrophoresis 1991; 12 (7-8):461-71.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
