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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho –
HUCFF
Pós Graduação em Clínica Médica – Pneumologia
Dissertação de Mestrado
Avaliação dos antígenos MPT-64, MT-10.3, ESAT-6, 16kDa e
38 kDa de
Mycobacterium tuberculosis e KIT comercial da
Lionex na resposta imune humoral na tuberculose pulmonar e
extra pulmonar em área endêmica
Isabela Gama Sardella
RIO DE JANEIRO
Junho 2008
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
AVALIAÇÃO DOS ANTÍGENOS MPT-64, MT-10.3, ESAT-6, 16KDA E 38 KDA
DE
Mycobacterium tuberculosis E KIT COMERCIAL DA LIONEX NA
RESPOSTA IMUNE HUMORAL NA TUBERCULOSE PULMONAR E EXTRA
PULMONAR EM ÁREA ENDÊMICA.
Isabela Gama Sardella
Orientadores: Dra.Maria Helena Féres Saad e Prof
a
. Leila de Souza Fonseca
Tese submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em Clínica Médica
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, área de concentração: Ciências
Pneumológicas, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre
em Ciências Médicas.
Aprovada em 03 de Junho de 2008
Banca Examinadora:
______________________
Profa. Dra. Fernanda C. Q. Mello (Membro titular interno)
_________________________
Prof. Dr. Marcus Conde (Membro titular interno)
_____________________________
Prof. Walter Oelemann (Membro titular externo)
_______________________
Prof. Dr Afrânio Lineu Kristky (Membro suplente interno)
_________________________
Prof. Dra. Danuza Esquenazi (Membro suplente externo)
RIO DE JANEIRO
Junho 2008
ads:
Sardella, Isabela Gama
Avaliação dos antígenos MPT-64, MT-10.3, ESAT-6, 16Kda e 38 Kda de
Mycobacterium tuberculosis e KIT comercial da Lionex na reposta imune
humoral na tuberculose pulmonar e extra pulmonar em área endêmica /
Isabela Gama Sardella – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina,
2008.
xviii, 229 f. : il. ; 31 cm
Orientadores: Maria Helena Féres Saad e Leila de Souza Fonseca
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa
de Pós-graduação em Clínica Médica, 2008.
Referências bibliográficas: f. 222-226
1. Mycobacterium tuberculosis – imunologia. 2. Tuberculose pulmonar –
diagnóstico. 3. Tuberculose meníngea - diagnóstico. 4. Tuberculose pleural –
diagnóstico. 5. Antígenos – uso diagnóstico. 6. ELISA -
métodos.
7. Sensibilidade e especificidade. 8. Pneumologia - Tese. I. Saad, Maria
Helena Féres. II. Fonseca, Leila de Souza. III. Universidade Federal do Rio
de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em
Clínica Médica. IV. Título.
A toda minha família pelo incentivo aos meus estudos.
A minha avó,
Marinha Alves Gama, que com muito carinho e amor me ensinou lições
de ética e respeito.
A minha irmã,
Ana Beatriz Gama, pela amizade em todos os momentos.
Ao meu tio,
Daniel Rubens Gama, pelo incentivo e por acreditar em mim.
A minha tia,
Linda Nice Gama, pelo carinho e dedicação.
Ao meu namorado e meus amigos pela compreensão.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Dra. Maria Helena Feres Saad pela liberdade de expressão,
pelas horas de compreensão, paciência, tolerância e pela amizade.
Aos meus colegas da sala 14,
Claudia, Fé Dagmar, Leonardo, Marisa Signorelli,
Silvia Maria Machado e Vinicius Cabral
pela ajuda e companheirismo.
Aos meus amigos do laboratório de Hanseníase,
Edson Alburqueque, Dra. Maria
Eugenia Gallo e Valcemir França
pela amizade e incentivo.
Ao
Dr. Morris Kaisermann da Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro pelas
amostras de líquido pleural de pacientes com tuberculose pleural e outras pleurisias.
Ao
Dr. Rafael Heringer, supervisor de diagnóstico da NeuroLife, Rio de Janeiro,
pelas amostras de liquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite tuberculosa,
cefaléia, esclerose múltipla e outras meningites bacterianas e virais.
A professora
Dra Márzia Puccioni Sholer da Universidade Federal do Rio de Janeiro
cuja visão científica e experiência em neuropatologia favoreceu a continuação deste
trabalho iniciado pelo Dr
Rafael Heringer.
À professora Dra. Vânia M. C. Silva da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela
estreita colaboração no trabalho realizado com os pacientes TB pulmonar, cuja valiosa
cooperação tornou possível este trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS............................................................................................. viii
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.............................................................. xiv
RESUMO................................................................................................................. xvii
ABSTRACT............................................................................................................. xviii
1 – Introdução.......................................................................................................... 1
2 - Revisão de Literatura.......................................................................................... 3
2.1 – Breve histórico.......................................................................................... 3
2.2 – Agente Etiológico..................................................................................... 5
2.3 – Infectologia............................................................................................... 7
2.4 – Patogênese................................................................................................ 8
2.5 – Tuberculose extra pulmonar..................................................................... 10
2.5.1 - Tuberculose pleural (PL-TB)............................................................ 11
2.5.2 - Meningite tuberculosa (M-TB)........................................................ 13
2.6 - Resposta imune na tuberculose................................................................. 15
2.6.1 - Imunidade celular........................................................................... 15
2.6.2 - Imunidade humoral......................................................................... 18
2.7 – Diagnóstico................................................................................................ 19
2.7.1 - Tuberculose pulmonar...................................................................... 19
2.7.2 - Tuberculose pleural.......................................................................... 22
2.7.3 - Meningite tuberculosa...................................................................... 23
2.8 – Diagnóstico Sorológico.............................................................................. 26
2.8.1 – ELISA............................................................................................ 27
2.8.2 – Testes rápidos alternativos........................................................... 29
2. 9 – Antígenos................................................................................................... 31
3 – Hipóteses............................................................................................................ 40
4 - Objetivo geral..................................................................................................... 41
4.1 - Objetivos específicos................................................................................. 41
5 - Materiais e métodos............................................................................................ 42
5.1 - Tipo de estudo............................................................................................. 42
5.2 - Pacientes e espécimes clínicos...................................................................
42
5.2.1 – M- TB................................................................................................... 42
5.2.2 – PL-TB................................................................................................... 43
5.2.3 – TBpul................................................................................................ 44
5.3 – Critérios de Inclusão.................................................................................. 45
5.3.1 – LCR...................................................................................................... 45
5.3.2 - Líquido pleural...................................................................................... 45
5.3.3 – Soros..................................................................................................... 46
5.4 – Antígenos……………………………………………………………........ 47
5.5 – Padronização do ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) “in
house
”……………………………………………………………………………... 48
5.6 – Elisa Kit comercial Lionex (KIT L)........................................................... 49
5.7 - Análises Estatísticas..................................................................................... 50
6 – Resultados.......................................................................................................... 51
6.1 - Resultados dos ensaios imunoenzimático “in house” (MeningEIA) e do
KIT L no líquido cefalorraquiano............................................................................ 53
6.2 - Resultados dos ensaios imunoenzimático “in house” (PLEIA) e do KIT
L no liquido pleural.................................................................................................. 71
6.3 - Resultados dos ensaios imunoenzimático “in house” (PulmEIA) e do
KIT L no soro de indivíduos adultos....................................................................... 85
7 – Discussão........................................................................................................... 117
8- Conclusões.......................................................................................................... 146
9 – Considerações finais.......................................................................................... 149
10 – Referências Bibliográficas............................................................................... 152
11 – Anexos ……………………………...……………………………………..... 180
11.1– Anexo I………………………………………………………………..... 180
11.2 – Anexo II.................................................................................................. 183
11.3- Anexo III.................................................................................................. 186
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Vantagens e desvantagens dos principais métodos usados no
diagnóstico da tuberculose...................................................................
25
Tabela 2
Sensibilidade dos testes laboratoriais convencionais e histopatológico
na tuberculose pulmonar (P-TB) e extra pulmonar............................... 26
Tabela 3
Sensibilidade e Especificidade dos testes do ELISA com diferentes
antígenos de
Mycobacterium tuberculosis...........................................
38
Tabela 4
Características clínicas, laboratoriais e demográficas dos pacientes
com tuberculose extra pulmonar e cujos espécimes clínicos foram
utilizados neste estudo……………………………………………….. 51
Tabela 5 Condições utilizadas para o MeningEIA............................................. 53
Tabela 6
Reatividade média e o desvio padrão (DP) de IgG, IgM e IgA dos
líquidos cefalorraquidiano, de pacientes com meningite tuberculosa
(M-TB), com outras meningites infecciosas não tuberculosa (M-
NTB) e controles cefaléia e esclerose múltipla (C), obtidas nos
ensaios de
MeningEIA com diferentes antígenos recombinantes e
com o KIT L......................................................................................... 54
Tabela 7
Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do KIT L, e do
MeningEIA na detecção de IgG, IgM e IgA do líquido
cefalorraquiano (LCR) para diferentes antígenos recombinantes
ensaiados individualmente e os melhores resultados combinados dos
Ags....................................................................................................... 64
Tabela 8
Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido
cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com meningite tuberculosa
(M-TB), meningite não tuberculosa (M-NTB) e controles (C) no
MeningEIA e KIT L testados com os Ags individualmente e os
melhores resultados combinados dos antígenos de acordo com a
sorologia para HIV...............................................................................
67
Tabela 9
Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido
cefalorraquidiano de pacientes com meningite tuberculosa (M-TB),
meningite não tuberculosa (M-NTB) e controle (C) no
MeningEIA
testados com os Ags individualmente e KIT L e as melhores
combinações encontradas de acordo com proteinorraquia................. 69
Tabela 10
Análises de biovariância de fatores associados com a resposta
humoral positiva no:
A) MeningEIA, com os antígenos testados
individualmente, e KIT L e
B) MeningEIA, com os resultados
combinados dos antígenos testados, em pacientes com meningite
tuberculosa (19 pacientes)…………………………………………… 71
ix
Tabela 11
Reatividade média de IgG, IgM e IgA dos líquidos pleurais de
pacientes com TB pleural (PL-TB) e com outras pleurisias não
tuberculosa (PL-NTB), utilizando o ensaio
PLEIA para diferentes
antígenos recombinantes e com o KIT L.............................................
72
Tabela 12
Média de densidade ótica e DP na pleurisia tuberculosa (PL-TB) e
outras pleurisias não tuberculosa (PL-NTB) sub-agrupadas de acordo
com os resultados microbiológicos (cultura) e histopatológico
(biópsia), cujos líquidos pleurais foram ensaiados com
PLEIA e com
o KIT L..................................................................................................
189
Tabela 13
Sensibilidade e especificidade do
PLEIA e KIT L na detecção de
IgG, M e A de liquido pleural (LP). No PLEIA os resultados são
mostrados para os antígenos testados individualmente e os melhores
resultados dos Ags analisados cumulativamente.................................. 78
Tabela 14
Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido pleural
(LP) de pacientes com tuberculose pleural (PL-TB) e pleurisias não
tuberculosa (PL-NTB) no
PLEIA e KIT L de acordo com a
sorologia para HIV..................................
.......................................................
190
Tabela 15
Imunoreatividade do
PLEIA, com os resultados dos Ags
combinados na pleurisia tuberculosa (PL-TB) e outras pleurisias (PL-
NTB) de acordo com os resultados laboratoriais (cultura e exame
histopatológico)................................................................................... 83
Tabela 16
Análises de biovariância de fatores associados com a resposta
humoral positiva no
PLEIA e KIT L em 85 pacientes com
tuberculose pleural................................................................................ 84
Tabela 17
Características clínicas, laboratoriais e demográficas dos 201
pacientes, cujos soros foram incluídos neste estudo.............................
87
Tabela 18
Reatividade média de IgG dos soros de pacientes com TB pulmonar
(P-TB), com suspeita de TB (PS-TB), controles PPD positivo (PPD
+
)
e negativo (PPD
-
), utilizando o ensaio PulmEIA para diferentes
antígenos recombinantes e com os KIT
s L.................……………….. 89
Tabela 19
Reatividade média (
desvio padrão) de IgG dos soros de pacientes
com TB pulmonar (P-TB), com suspeita de TB (PS-TB), utilizando o
ensaio
PulmEIA para diferentes antígenos recombinantes e com os
KIT
s L de acordo com a radiografia do tórax....................................... 97
Tabela 20
(Anexo)
Freqüência de soros positivos, ensaiados no
PulmEIA e KITs L, e
seus resultados combinados
(B) dos grupos tuberculose pulmonar (P-
TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com
teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
).........................
191
x
Tabela 21
(Anexo)
Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o consumo de álcool,
cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e
seus resultados combinados
(B).......................................................... 194
Tabela 22
(Anexo)
Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o tabagismo
(fumantes e não fumantes), cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e seus resultados combinados (B)......... 197
Tabela 23
(Anexo)
Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o gênero (feminino e
masculino), cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT
L (
A) e seus resultados combinados (B)………………………...
200
Tabela 24
(Anexo)
Imunoreatividade nos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita
de tuberculose pulmonar (PS-TB), indivíduos teste tuberculinico
positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) de acordo com o resultado da
baciloscopia (BAAR positivo e negativo), cujos soros foram
ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e seus resultados
combinados
(B)……………………………………………………… 203
Tabela 25
(Anexo)
Imunoreatividade nos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita
de tuberculose pulmonar (PS-TB), indivíduos teste tuberculinico
positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) de acordo com o resultado da
cultura (cultura positivo e negativo), cujos soros foram ensaiados
com
PumlEIA e resultados dos Ags combinados, e com o KIT L 205
Tabela 26
(Anexo)
Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com resultado da
radiografia do tórax, cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e
com o KIT L
(A) e os resultados combinados do PulmEIA (B).......... 207
Tabela 27
(Anexo)
Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com marca da vacinação
BCG (com cicatriz e sem cicatriz), cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e os resultados combinados do
PulmEIA (B) ....................................................................................... 210
Tabela 28
Análise de biovariância dos fatores associados à positividade obtida
com
PulmEIA com antígenos testados individualmente e KIT L, em
85 pacientes diagnosticados com tuberculose pulmonar.......................
114
Tabela 29
Sensibilidade e Especificidade dos testes de
PulmEIA e KIT L na
detecção de IgG de soros para os antígenos testados individualmente
(
A) e os resultados combinados do PulmEIA (B)................................ 115
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Pesquisadores que contribuíram em alguns aspectos do diagnóstico
da TB...................................................................................................... 4
Figura 2 Representação esquemática da pleura.................................................... 11
Figura 3
Representação esquemática das meninges, membranas que
circundam a massa encefálica.....
......................................................... 13
Figura 4 Representação de um teste sorológico baseado em difusão lateral ou
teste de fita.............................................................................................
30
Figura 5
(Anexo)
Curva da padronização do MeningEIA utilizando pools de líquido
cefalorraquiano (LCR) com meningite tuberculosa (C+) e
controles (C-) e realizada com antígenos diluídos a 1µg/mL para
detecção de IgG (1:800), IgM (1:20.000) e IgA (1:5.000)................
183
Figura 6
Distribuição da resposta humoral para antígenos recombinantes de
M. tuberculosis e KIT L expressa em densidade óptica (DO), no
líquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite tuberculosa
(M-TB
), com outras meningites não tuberculosa (M-NTB ▲) e
com cefaléia e esclerose múltipla (C
)............................................ 56
Figura 7
Distribuição da reatividade e média de IgG, IgM e IgA de líquido
cefalorraquidiano (LCR) ensaiados pelo
MeningEIA e KIT L de
acordo com a sorologia para HIV.....................................................
58
Figura 8
Distribuição e média de reatividade de IgG, IgM e IgA de líquido
cefalorraquidiano (LCR) no
MeningEIA e KIT L de acordo com a
concentração de proteína...................................................................
60
Figura 9
Reatividade de Acs de líquido cefalorraquidiano de meningite
tuberculosa por número de antígenos................................................
65
Figura 10
(Anexo)
Curva da padronização do PLEIA utilizando pools de líquido
pleural com tuberculose pleural (C+) e controles (C-) e realizada
com antígenos diluídos a 1µg/mL para detecção de IgG
(1:50.000), IgM (1:20.000) e IgA (1:5.000)......................................
184
Figura 11
Distribuição e média de densidade ótica na pleurisia tuberculosa
(PL-TB) sub-agrupadas de acordo com os resultados
microbiológicos (cultura
+
■ e cultura
-
■) e histopatológico
(biópsia
+
■ e biopsia
-
■) e outras pleurisias não tuberculosa
(câncer
■ e outras pleurapatias ■), cujos líquidos pleurais foram
ensaiados com
PLEIA e com o KIT L....................................................... 73
Figura 12
Média de reatividade de líquido pleural de acordo com a sorologia
para HIV, ensaiados no
PLEIA para os diferentes antígenos e KIT
L. Barra curta: médias de DO............................................................
75
xii
Figura 13
Distribuição da resposta humoral de líquido pleural de pacientes
com tuberculose pleural (PL-TB
) e com outras pleuropatias (PL-
NTB
) ensaiados no PLEIA para diferentes antígenos e KIT L
Barra curta: média de DO..........................................................
77
Figura 14
Reatividade de Acs de líquido pleural de pacientes com
tuberculose pleural por número de antígenos...................................
79
Figura 15
Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido pleural
de pacientes com tuberculose pleural (PL-TB) no
PLEIA e KIT L
de acordo com a sorologia para HIV.......................
.......................... 81
Figura 16
(Anexo)
Curva da padronização do PulmEIA utilizando pools de soro com
tuberculose pulmonar (C+) e indivíduos saudáveis (C-
) e
realizada com antígenos diluídos a 1µg/mL, exceto 16 kDa
(0,5µg/mL) para detecção de IgG a 1:2.000......................................
185
Figura 17
Distribuição da resposta humoral para A) PulmEIA-IgG e B) KIT
L IgG, IgM e IgA, nos soros de pacientes com tuberculose
pulmonar (
), suspeita de tuberculose pulmonar (▲) e em
controles com teste tuberculinico positivo (
) e negativo (■)..........
90
Figura 18
Distribuição e média de reatividade de PulmEIA e KIT L nos
soros de pacientes com tuberculose pulmonar (P-TB), suspeito de
PTB (PS-TB), controles teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) de acordo com o consumo de álcool .....................
92
Figura 19
Distribuição da reatividade de PulmEIA e KIT L de soro de
tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de P-TB (PS-TB),
controles teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) de
acordo com o hábito tabagista ..........................................................
94
Figura 20
Distribuição e média de reatividade de PulmEIA e KIT L nos
soros de tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de P-TB (PS-TB),
controles teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) de
acordo com cicatriz da BCG ...........................................................
96
Figura 21
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados
usando dois Ags
, três Ags e os quatro Ags...................................... 99
Figura 22
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar,
suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com
teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados usando dois
Ags
, três Ags e os quatro Ags de acordo com o consumo de álcool. 101
xiii
Figura 23
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados
usando dois Ags
, três Ags e os quatro Ags de acordo com o hábito
do tabagismo.....................................................................................
103
Figura 24
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados de
acordo com o gênero.........................................................................
105
Figura 25
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados
usando dois Ags
, três Ags e os quatro Ags de acordo com a
baciloscopia (BAAR).......................................................................
107
Figura 26
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados
usando dois Ags
, três Ags e os quatro Ags de acordo com a cultura
pra
M. tuberculosis............................................................................
109
Figura 27
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L
e os resultados combinados
usando dois Ags, três Ags e os quatro Ags de acordo com
resultado da radiografia do tórax (Lesões de Baixa, Média e Alta
probabilidade de ser causada pela TB).............................................
111
Figura 28
Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles
com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
)
ensaiados no
PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados
usando dois Ags
, três Ags e os quatro Ags de acordo com cicatriz
da vacinação da BCG........................................................................
113
Figura 28
Padrão de resposta imunológica dos pacientes para os múltiplos
antígenos ensaiados neste estudo......................................................
116
xiv
Lista de abreviaturas e siglas
Ac Anticorpo
ADA Adenosina deaminase
Ag Antígenos
AL Alcoolistas
BAAR Bacilos álcool-ácido resistentes
BAAR
+
Baciloscopia positiva
BAAR
-
Baciloscopia negativa
BCG Bacilo de Calmette Guérin
C Controles com esclerose múltipla e cefaléia
CD
Cluster of differentiation
CFP-10 culture filtrate protein 10
CMSHB Centro Municipal de Saúde Heitor Beltrão
CR Receptores de complemento
CTL Células T Citotóxicas
Cultura
+
Resultado de cultura para M. tuberculosis positivo
Cultura
-
Resultado de cultura para M. tuberculosis negativo
Cut off Ponto de corte
Cz Cicatriz da vacina BCG
DAT 2,3-diacil trealose
DNA Ácido desoxirribonucléico
DO Densidade óptica
E. coli Escherichia coli
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay
ESAT-6 early secretory antigenic target 6
FDA
Food and Drug Administration
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
HGSCM Hospital Geral da Santa Casa de Misericórdia
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HIV
+
Vírus da Imunodeficiência Humana positivo
IFN-
Interferon gama
Ig Imunoglobulina
IgA, IgM e IgG
Imunoglobulinas das classes A, M e G
xv
IL Interleucina
kDa quilodalton
LAM Lipoarabinomanana
LCR Liquido cefalorraquidiano
LP Liquido pleural
LPS Lipopolissacarídios
LJ Löwenstein-Jensen
MeningEIA ELISA “
in house” para detecção de anticorpos na M-TB
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
M-NTB Pacientes com meningite não tuberculosa
MR Receptor de manose
M-TB Meningoencefalite tuberculosa
Mtb Mycobacterium tuberculosis
NA Não se aplica
N-Al Não alcoolistas
N-Cz Sem cicatriz da vacina BCG
NK Células
‘natural killer’
N-Ta Não tabagistas
OMS Organização Mundial da Saúde
OR
Odds ratio
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase
PPD Derivado protéico purificado
PPD
+
Teste tuberculinico positivo
PPD
-
Teste tuberculinico negativo
PGE prostaglandina
P-TB Tuberculose pulmonar
PL-TB Tuberculose pleural
PL-NTB Pacientes com outras pleuropatias que não a tuberculose
PLEIA ELISA “
in house” para detecção de anticorpos na PL-TB
PS-TB Pacientes com suspeita clínica de TB pulmonar
PTR Proteinorraquia
PulmEIA ELISA “
in house” para detecção de anticorpos na P-TB
xvi
RD Região de diferença
RFLP
Restriction Fragment Lenght Polymorphysm
RJ Rio de Janeiro
RNA Ácido ribonucléico
ROC Rec
SL tetraacil trealose
SMS Secretaria Municipal de Saúde
SNC Sistema nervoso central
Ta Tabagistas
TAT triacil trealose
TB Tuberculose
TBexp Tuberculose extra pulmonar
TBpul Tuberculose pulmonar
Th Células T auxiliares (
help)
TNF-
α Fator de necrose tumoral – alfa
TTC Teste tuberculínico cutâneo
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
VPP Valor preditivo positivo
VPN Valor preditivo negativo
Z-N Ziehl-Neelsen
xvii
RESUMO
Para avaliar o potencial imunodiagnóstico dos Ags micobacterianos MPT-64, MT-10.3,
38 kDa, 16 kDa e ESAT-6, teste
in house baseado no ensaio imuno enzimático (EIA)
foi realizado para IgG e paralelamente um KIT comercial Lionex foi testado para IgG,
M e A. Um total de 484 espécimes clínicos foram testados, sendo assim distribuídos:
159 líquidos cefalorraquidiano (LCR) dos quais 19 de pacientes com meningite
tuberculosa (M-TB), 28 de pacientes com esclerose múltipla, 45 de pacientes com
cefaléia e 67 de pacientes com outras meningites bacterianas e virais; 124 líquidos
pleurais (LP) dos quais 85 de pacientes com TB pleural (PL-TB) e 39 com outras
pleuropatias; e 201 soros dos quais 61 de pacientes com tuberculose pulmonar (P-TB),
28 pacientes diagnosticados com TB pela suspeita clínica (PS-TB), 54 pacientes com
outras pneumopatias com teste cutâneo a tuberculina positivo (PPD
+
) e 58 PPD
-
. Na M-
TB, o KIT L–IgG comercial mostrou maior sensibilidade (84,2%), seguido do
MeningEIA-IgA MPT-64/16kDa (78,9%) com especificidade de 93,2%. Foi observada
na M-TB associação positiva de reatividade de Acs com alta concentração de proteína
no LCR, para MPT-64-IgG/A, 16kDa-IgG, 38 kDa-IgA e KIT L- IgG. Na PL-TB, o
PLEIA e KIT L mostraram-se menos sensíveis que o padrão ouro (74%, exame
histopatológico - EH), mas o KIT L-IgG detectou a maioria dos casos com EH
inespecifico (68,4%) e dos PL cultura negativa (63,8%). No
PLEIA similar freqüência
foi obtida com diferentes Ags e Ig (ESAT-6-IgA e 38kDa/16kDa-IgM). A sensibilidade
dos testes
in house PulmEIA e KIT L foram baixas na P-TB. Os Ags MPT-64 e 38 kDa
mostraram uma imunodominância na TB extra pulmonar e pulmonar, respectivamente.
O Ag 38kDa confirmou forte associação com a TB ativa e lesões pulmonares extensas.
Associação positiva e negativa da reatividade de Ac foi observada entre os pacientes
TBpul alcoolista e com hábito do tabagismo, respectivamente, entretanto estudo mais
detalhado é necessário para confirmar estes dados. A utilização de dois ou mais Ags
combinados aumentou a sensibilidade dos testes “
in house” e favoreceu o KIT
comercial Lionex, que contém múltiplos Ags. Ambos os testes parecem ter potencial
como teste adjuvante no diagnóstico na TB extra pulmonar, mas na P-TB a
especificidade dos testes são comprometidos pela freqüente exposição bacilar a que os
indivíduos estão submetidos nas regiões endêmicas.
xviii
ABSTRACT
To evaluate the potential immunodiagnostic micobacterial antigens MPT-64, MT-10.3,
38 kDa, 16 kDa and ESAT-6. We employed an
house test based on enzyme immuno
assay (EIA) and the commercial KIT Lionex for IgG, M and A. A total of 484 clinical
specimens was used and distributed as follows: 159 spinal fluids of which 19 were from
patients with tuberculous meningitis (M-TB), 28 from patients with multiple sclerosis,
45 from patients with headache, 67 from patients with other bacterial or viral
meningitis; 124 pleural fluids (PL), 85 of which from patients with pleural tuberculosis
(PL-TB) and 39 from patients with other pleural diseases; and 201 sera, 61 of which
from patients with pulmonary tuberculosis (P-TB), 28 from suspects for TB, 54 from
patients with other pulmonary diseases and positive and negative (58) tuberculin skin
test. In the M-TB group, KIT L-IgG showed greater sensitivity (84,2%), followed by
in
house
MeningEIA-IgA MPT-64/16kDa (78,9%) with specificity of 93,2%, a positive
association of antibody reactivity with higher protein concentration in the spinal fluid
was observed for the following tests (MPT-64-IgG/A 16kDa-IgG, 38 kDa-IgA and KIT
L-IgG). In the PL-TB, the
in house PLEIA and KIT L showed lower sensitivity than
gold standard for TB pleural diagnosis (74%, histopathological exam-HE), but KIT L-
IgG detected the most of cases with unspecific HE (68,4%) and negative culture
(63,8%). In the
PLEIA, similar frequencies were obtained with different antigens and
antibodies (ESAT-6-IgA e 38kDa/16kDa-IgM).
In house PulmEIA and KIT L showed
low sensitivity in P-TB. The antigens MPT-64 and 38 kDa showed higher
immunodominance in extra pulmonary and pulmonary TB, respectively. 38 kDa
confirmed strong association with active TB and extensive pulmonary lesions. Positive
and negative association of antibody reactivity was also observed for alcoholic and
smoker with P-TB, respectively, meanwhile further studies are necessary to confirm this
data. Combination of 2 or more antigens increased sensitivity in both tests,
in house and
KIT commercial Lionex, that contain multiple antigens, and seem to have potential to
be use as adjuvant test in the diagnostic of the extra pulmonary TB, but in the P-TB the
specificity of the tests are jeopardized by the frequent bacillary exposition of the
individuals living in endemics regions.
1- INTRODUÇÃO
Vinte e dois são os países onde se estima ocorrer a maioria dos casos de tuberculose
(TB) do mundo, ocupando o Brasil o 16º lugar com incidência de 60/100.000 casos por ano.
O Estado do Rio de Janeiro (RJ) apresentou a mais alta taxa de incidência de TB no país em
2003 (87,5/100.000 hab.), sendo notificados 13.015 novos casos, dos quais 86% se
concentram na região metropolitana, e 889 foram a óbito (taxa de mortalidade de 6%) (WHO,
2007; SAÚDE, 2007a).
O retardamento no diagnóstico da doença é um importante fator para a manutenção
desta endemia, pois o tempo que decorre entre o aparecimento dos sintomas, o diagnóstico
correto e o início do tratamento pode significar uma maior ou menor transmissibilidade da TB
na comunidade. Esta dificuldade é devida à morosidade para se confirmar o diagnóstico
laboratorial através da cultura, que apesar de sensível necessita de 2 a 8 semanas de incubação
e, por conseguinte, o diagnóstico depende da baciloscopia do espécime clínico cuja
sensibilidade pode variar de 5% a 60% (Tabela 2, pg26). Assim, na prática clínica, o
tratamento do paciente é iniciado sem o benefício do diagnóstico laboratorial
(RAMACHANDRAN e cols, 2003; SIDDIQI, LAMBERT & WALLEY, 2003; NAHID, PAI
& HOPEW, 2006).
As técnicas moleculares têm sido amplamente utilizadas no diagnóstico das doenças
infecciosas. Porém, por momento, o uso destas técnicas no diagnóstico da TB só é viável em
centros com estrutura física adequada e pessoal especializado, o que não atende as
necessidades de diagnóstico simples, rápido e de baixo custo para ser implementado em um
Programa de Controle da TB.
Com a elucidação completa do genoma do Mycobacterium tuberculosis (Mtb), foram
identificados uma série de genes ausentes na BCG e presentes no complexo
Mtb (COLE e
cols, 1998), bem como diferentes ORFs (seqüência aberta de leitura) potencialmente
codificadoras de proteínas. Isso resultou em esperanças de encontrar moléculas com potencial
imunodiagnóstico na TB (JEPSON e cols, 2001; PYM e cols, 2003).
Os testes baseados na resposta imune dos pacientes, também têm sido investigados,
tanto para as respostas mediadas por células como por anticorpos (Ac). Recentemente, testes
in vitro baseados na resposta imune mediada por células têm sido descritos para detectar os
indivíduos com infecção latente, sendo importante na busca de contatos e para mapear grupos
de riscos em regiões não endêmicas. Todavia, estes testes necessitam de espécime clínico
fresco (células vivas) o que limita seu uso em locais cuja demanda diagnóstica é alta
(LALVANI e cols, 2001; BROCK e cols, 2001; EWER e cols, 2003, HOFF e cols 2007).
O teste sorológico pode ser uma alternativa atraente como método diagnóstico, pois é
simples, rápido e de fácil operacionalidade, o que não ocorre com os testes baseados na
resposta celular, possibilitando sua aplicação no sistema público de saúde onde a demanda
diagnóstica é alta. Os métodos sorológicos, ultimamente, têm sido objeto de interesse,
principalmente em pacientes com TB pulmonar (TBpul) com dificuldades de produzir escarro
ou que o mesmo seja bacterioscopia negativa (BAAR
-
) ou para aqueles que desenvolvem TB
extra- pulmonar (TBexp) (GARG e cols, 2003; WHO, 2007)
2 - REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Breve histórico
A TB é conhecida desde tempos remotos (2400-3400 antes de Cristo), e tem recebido
ao longo do tempo denominações, em alguns casos curiosas, de acordo com a forma clínica da
doença, tais como: phitiasis (nome de origem grega), peste branca, consumição na TBpul, Mal
do Rei (
King´s Evil) ou escrófula na TB de linfonodo (acreditava-se na Inglaterra e França
que podia ser curada pelo toque do rei ou da rainha), doença de Pott na infecção tuberculosa
da coluna vertebral, edema branco na infecção tuberculosa das juntas, lupus vulgaris na TB de
pele (REICHMAN & HERSFIELD, 1993).
A TB foi vista pela primeira vez como doença curável por Hermann Brehmer que
1854 hipotizou a cura por ação do clima temperado em sua dissertação médica:
Tuberculosis
is a Curable Disease
. Ele mesmo sofrendo de TB recuperou a saúde depois de estada no
Himalaia (BRYDER, 1988).
Robert Koch (1882) foi o primeiro a visualizar através de método de coloração o
bacilo da TB, em espécimes clínicos de pacientes com TB. Ele cultivou o bacilo e reproduziu
experimentalmente a doença em modelo animal. A coloração e a cultura permanecem até hoje
como métodos de diagnóstico da TB (SAKULA, 1983; DANIEL, 2006).
Por outro lado, é digno de nota a descoberta dos raios-X por Wilhem Conrad von
Roentgen (1845-1923), em 1895, que trouxe outra importante contribuição no conhecimento,
diagnóstico e acompanhamento da TB. O rápido desenvolvimento das técnicas radiológicas,
que envolveu desde as radiografias convencionais, passando pela fluoroscopia e chegando à
tomografia, proporcionou um melhor estudo e monitoração da doença no século XX
(MITCHISON, 2005).
No campo da radiologia, ainda, destacou-se o brasileiro Manoel Dias de Abreu (1892-
1962) que, com a invenção da roentgenfotografia em 1936, posteriormente aclamada como
abreugrafia, possibilitou o estudo radiológico em massa da população a baixo custo, causando
na época uma revolução nos métodos diagnósticos (Figura 1).
Robert W.C. von Manoel Dias
Koch Roentgen de Abreu
(1843 – 1910) (1845-1923) (1892-1962
)
Figura 1. Pesquisadores que contribuíram em alguns aspectos do diagnóstico da TB
A instituição do tratamento baseado na quimioterapia, inicialmente com a
streptomicina, administrada pela primeira vez a pacientes em 1944, seguindo-se o acido
p-
aminosalicilico (1949), isoniazida (1952), pirazinamida (1954), cicloserina (1955),
etambutol (1962) e rifampicina (1963), levou a redução de sua morbidade e,
principalmente, da mortalidade. Os aminoglicosídeos tais como capreomicina, viomocina,
kanamicina e amikacina, e as novas quinolonas (p. ex. ofloxacina e ciprofloxacina) são
usados nos casos de resistência às outras drogas (In:
http://www.umdnj.edu/~ntbcweb/history.htm
).
Com a era dos antibióticos, houve grande expectativa da eliminação dessa
enfermidade para o final do século XX. Esta já era considerada sob controle nos países
desenvolvidos, contudo o crescimento mundial da sua incidência levou, em 1993, a OMS
(Organização Mundial da Saúde) declarar essa doença em estado de emergência, alertando
para a necessidade de maiores esforços no seu combate (WHO, 1994). Pois, apesar da
existência de esquemas terapêuticos eficientes e políticas de saúde visando o controle,
alguns problemas permanecem e que são inerentes à doença. Entre estes são incluídos a
alta correlação da incidência da doença com populações pobres e a imunodepressão
causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) que favoreceu a infecção
oportunista pelo bacilo de Koch (KAUFMANN & VAN EMBDEN, 1993). Tudo isto
aliado às dificuldades de identificar e diagnosticar precocemente o indivíduo doente tem
mantido a TB como um grave problema de saúde pública, principalmente nos países em
desenvolvimento.
2. 2. O Agente Etiológico
Mtb é o agente etiológico da TB, também conhecido como Bacilo de Koch. Este
microrganismo é uma das espécies do gênero
Mycobacterium, o qual é caracterizado por sua
imobilidade e a ausência de esporos. Está classificado na ordem dos
Actinomycetales, família
das
Mycobacteriaceas que, diferentemente de outras bactérias, possui em seu DNA alto
conteúdo de guanina-citosina (61-71%) e parede celular complexa devido ao expressivo
conteúdo lipídico. A membrana plasmática está ligada a uma estrutura peptidioglicana que
protege a célula contra a pressão osmótica do citoplasma. A peptidioglicana por sua vez está
ligada a uma camada de arabinogalactana, na qual se encontram esterificados os ácidos
micólicos. O micolilarabinogalactopeptidioglicana (mAGP) constitui um dos dois
lipopolissacarídios (LPS) comuns a parede celular micobacteriana. O segundo LPS é
constituído pela lipoarabinomanana (LAM), a qual está diretamente ancorada na membrana
plasmática. Os ácidos micólicos são abundantes e diversificados nas micobactérias e podem
ser usados para caracterizar as diferentes espécies micobacterianas. Esta rica parede lipídica
lhe confere também a álcool ácido resistência quando tratados com corantes básicos como a
fucsina, alta hidrofobicidade, resistência a agentes físicos e químicos, inclusive antibióticos e
talvez contribua para o seu crescimento lento (BROOKS & BUTEL, 1998; TORTORA &
FUNKE, 2003).
Mtb juntamente com M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti e M. caprae e M.
pinnipedii
constituem espécies do complexo Mtb. As espécies do complexo são de
crescimento lento, apresentando 99% de similaridade genética e identidade na seqüência do
gene RNA ribossomal 16S, mas possuem diferenças fisiológicas na sua virulência para o
homem.
Mtb e os subtipos M. africanum e M. canetti são patogênicos para o homem; M. bovis
e M. microti infectam animais e são ocasionalmente transmitidos ao homem; M. caprae e M.
pinnipedii
foram isolados primeiramente de cabra e focas (VAN SOOLINGEN e cols, 1997;
ARANAZ e cols, 1999; COUSINS e cols
, 2003; TORTOLI, 2006).
O seqüenciamento do genoma completo da cepa
Mtb H37Rv revelou uma seqüência
cromossômica circular de 4.411.532 pares de bases (pb). Possui 91% de capacidade
codificante, com aproximadamente 3959 genes conhecidos, 606 não conhecidos e 6
pseudogenes. Aproximadamente 2441 genes têm sido atribuídos à codificação funcional e 912
são genes hipoteticamente conservados e 129 genes estão ausentes em M. bovis.
(BECORVIER, KAFRI & SELA, 1986; COLE e cols, 1998).
2.3 – Infectologia
A transmissão da TB depende de alguns fatores ambientais, que aumentam o tempo
dos perdigotos secos suspensos no ar, tais como locais pequenos onde a circulação de ar é
inadequada; ambientes hospitalares, aviões, presídios, etc; e fatores sociais tais como contato
com o caso índice doente que pode ser parente, amigo, contato eventual, etc. Portanto, para
favorecer a diminuição de inalação de partículas infecciosas presentes no ambiente, os locais
bem ventilados e expostos à luz solar (radiação por luz ultravioleta e radiação gama), são os
menos propícios à disseminação da TB (
SIGAUD, 1989; BROOKS & BUTEL, 1998; AIT-
KHALED, 2001; GILLESPIE & HAWKEY, 2006
).
Qualquer indivíduo com TBpul com baciloscopia positiva (BAAR
+
) pode transmitir
Mtb. Assim, quando a doença não é tratada, o doente pode infectar de 10 a 15 pessoas em
um ano, disseminando a doença por eliminação de gotículas ou partículas (núcleo de
Wells) de pequeno diâmetro (até 10
μm) contendo de 2 a 10 bacilos que são expelidas
através da tosse, espirro e ato de falar. As gotículas menores quando eliminadas, ficam em
suspensão no ar por várias horas, e após a respiração pode chegar aos alvéolos pulmonares
onde os bacilos se multiplicam. As gotículas maiores, com quantidades maiores de bacilos,
não constituem fonte de infecção, porque logo se depositam no solo, não formando
aerossóis e se forem inalados não conseguem chegar aos alvéolos, sendo carregadas para a
orofaringe, deglutidas e expectoradas. Os bacilos depositados em mucosas intactas ou na
pele não conseguem invadir o tecido. A estimativa para o risco de contágio para os
contatos próximos aos pacientes é de 5 a 20% e nos casos de contato casual é de 0,2 a 2%
(BATES e cols, 1980; DUTT e cols, 1989; KRITSKI e cols, 2000; MATHEMA e cols,
2006). O risco de transmissão em contactantes de pacientes paucibacilares não está
esclarecido, entretanto BEHR e cols (1999) mostraram por tipagem molecular pelo RFLP
(
Restriction Fragment Lenght Polymorphism) que pacientes com BAAR
-
e cultura positiva
(cultura
+
) eram responsáveis por 17% da transmissão da TB.
Os pacientes com TB paucibacilar são assim chamados quando os bacilos álcool
ácido-resistentes (BAAR) não são visualizados no exame direto do espécime clínico por
limitação da técnica de bacterioscopia. Os pacientes bacilíferos apresentam BAAR
+
quando estão eliminando 5000 bacilos/ml de espécime clínico. Já a cultura é mais
sensível e pode ser positiva em pacientes eliminando um número
10 a 100 bacilos/ml de
escarro (KATOCH, 2003).
2.4. Patogênese
Mtb é um patógeno aeróbico-intracelular facultativo, de transmissão aérea e com
preferência pelos tecidos do pulmão que são ricos em oxigênio. O estabelecimento da
infecção pela micobactéria depende de seu encontro com a célula hospedeira, geralmente o
macrófago alveolar que os fagocita. Os bacilos são fagocitados pelos monócitos/macrófagos
através de ligações a receptores do complemento (CR1-4), receptores de manose (MR) e
outras moléculas da superfície da célula. As prostaglandinas E2 (PGE2), IL-4 (interleucina) e
citocinas Th2 (células T auxiliares) aumentam a expressão e função dos CR e MR, já o
interferon gama (IFN-) favorece sua inibição, diminuindo a capacidade das micobactérias se
aderirem aos macrófagos (SCHLESINGER, 1996; KANG & SCHLESINGER, 1998).
Inicialmente os macrófagos não "treinados" são incapazes de destruir os bacilos,
havendo multiplicação intracelular com destruição dos macrófagos, liberação de enzimas
lisossomais, destruição tecidual com reação inflamatória inespecífica que forma o granuloma.
Com o aparecimento do fenômeno da hipersensibilidade (10 a 14 dias), ocorre uma forma
peculiar de necrose no centro do granuloma, chamada de necrose caseosa, podendo ser
observado ao exame de raios-X. As micobactérias patogênicas são capazes de sobreviver e
multiplicar dentro dos macrófagos porque inibem a fusão do fagolisosoma estabilizando em
pH 6.2–6.3, dando ao organismo acesso a nutrientes essenciais como o ferro. Tem sido
descrito que moléculas sulfatadas micobacterianas derivadas do sulfato de trealose, tais como
SL-IV, tem ação inibitória sobre a fusão do fagolisossoma (GOREN, BROKL & DAS, 1976a;
GOREN e cols, 1976b; CROFTON, HORNE & MILLER, 1994; BROOKS, & BUTEL, 1998,
GILLESPIE e cols, 2006).
Na maior parte dos indivíduos, a tendência é a cura espontânea da lesão que se torna
menos celular, ocorrendo até mesmo à calcificação da lesão, que pode ser visualizada ao
exame de raio-X de tórax. Os bacilos podem permanecer viáveis no interior destas lesões por
muitos anos, na forma latente (indivíduos estão infectados pelo bacilo, entretanto não
apresentam sinais ou sintomas da doença). Esta lesão é chamada de nódulo de Ghon
(CROFTON, HORNE & MILLER, 1994).
Quando a resposta inflamatória inicial é pouco eficiente, bacilos podem alcançar os
linfonodos (gânglios) do hilo pulmonar e provocar lesões idênticas àquelas do pulmão.
10
Quando o indivíduo apresenta as lesões pulmonares e ganglionar satélite, diz-se que ele
apresenta o complexo de Ghon ou complexo primário da TB (prima-infecção). Alguns poucos
bacilos podem alcançar órgãos distantes e permanecer em estado latente e em determinado
momento proliferar e causar lesões típicas da TB, mesmo na ausência de doença pulmonar
ativa. Em indivíduos imunossuprimidos o curso da primo-infecção tuberculosa pode ser mais
grave, com disseminação progressiva da doença (CROFTON, HORNE & MILLER, 1994;
MATHEMA e cols, 2006).
A TB secundária ou pós-primária ocorre por reativação do foco primário (por queda
da imunidade) ou por re-infecção exógena (o indivíduo entra uma vez mais em contato com o
bacilo da TB). Com a evolução da infecção, há formação de novos granulomas e a necrose
pode confluir, formando áreas de destruição pulmonar. Em casos favoráveis, ocorre a
cicatrização da lesão e cura do paciente (SIGAUD, 1989; CROFTON, HORNE & MILLER,
1994; TORTORA & FUNKE, 2003; MATHEMA e cols, 2006).
2.5 Tuberculose Extra Pulmonar
A TB pode envolver muitas áreas do corpo humano. Enquanto a TBpul é a forma mais
comum da apresentação da doença, a TBexp também se constitui em importante problema
clínico, devido a forma paucibacilar da doença, o que dificulta o seu diagnóstico pelos
métodos bacteriológicos. Em pacientes HIV
+
, a ocorrência de TBexp é mais elevada (50%)
que entre os pacientes imunocompetentes (15 a 20%). A distribuição das formas clínicas de
TBexp mais freqüentes são: TB linfática, pleural e a meningite (TRIBBLE e cols, 1997;
SHARMA e cols, 2005; GETAHUN e cols, 2007).
11
2.5.1 - Tuberculose Pleural (PL-TB)
A pleura é constituída de duas finas membranas transparentes: uma que envolve a
superfície interna torácica (pleura parietal) e outra que envolve externamente os pulmões
(pleura visceral) formando uma única membrana continua (Figura 2). A superfície pleural
consiste de uma monocamada de células mesoteliais que recobre a membrana basal, sendo
ativa metabolicamente, estando envolvida tanto na manutenção da homeostase (
homeo =
igual;
stasis = ficar parado) como na resposta inflamatória pleural. Durante os processos de
infecção da pleura, células mesoteliais são as primeiras a entrar em contato com o patógeno e
desenvolvendo uma reação apropriada. Elas possuem um papel essencial na iniciação e
manutenção da resposta inata e também da adquirida (PEEK, MORCOS & COOPER, 2000).
Figura 2 – Representação esquemática da pleura (www.elib.gov.ph)
A função do líquido no espaço pleural é de lubrificar a superfície pleural e permitir o
pulmão se mover dentro da caixa torácica durante o processo respiratório. (BURGESS, 2004;
LAI-FOOK, 2004).
12
A pleurisia é uma inflamação da mucosa pleural, acompanhada por aumento do
líquido pleural (LP). Ela ocorre pela ação irritante de um agente bacteriano ou viral. O
desenvolvimento da infecção pleural depende do balanço entre a resposta imune do paciente e
a virulência do microrganismo. As micobactérias entram na pleura após a ruptura do foco
tuberculoso subpleural, da cavidade ou do granuloma da pleura. A pleurisia pode ser seca ou
exudativa (derrame de líquido na pleura), e uma vez cessada a inflamação a pleura pode voltar
ao normal (BURGESS, 2004).
A pleurisia causada por
Mtb é considerada uma doença extra-pulmonar. A PL-TB é a
causa mais comum das efusões pleurais no mundo. Existem várias outras causas de pleurisia,
tais como: i) enfisema, onde as paredes alveolares dos pulmões têm pouca elasticidade
causada pelo ar preso nos pulmões quando a pessoa respira; ii) pneumotórax que é uma
ruptura na superfície do pulmão, permitindo que o ar entre dentro da cavidade torácica; iii)
câncer de pulmão, de difícil diagnóstico, realizado por toracocentese e citologia do fluido
pleural; iv) insuficiência cardíaca por embolia pulmonar; lupus eritematoso sistêmico, etc
(PEEK, MORCOS & COOPER, 2000; SHARMA & MOHAN, 2004; GOPI e cols, 2007;
LAZARUS, MCKAY & GILBERT, 2007).
O derrame pleural ocorre, em, aproximadamente, 60% dos casos de TB, e em 40% no
adenocarcinoma pleural. Na Europa, a PL-TB é o tipo mais freqüente de efusão pleural em
pacientes jovens. No Brasil, o derrame pleural representa a manifestação mais freqüente de
TBexp. Na cidade do RJ, mais de 40% das efusões pleurais são devido à TB, e em mais da
metade dos casos notificados, o diagnóstico não é confirmado por métodos convencionais,
como a baciloscopia. (FERRER, 1997; VALDES e cols, 2003; NEVES, CUNHA & PREZA,
2004; SHARMA & MOHAN, 2004).
13
2.5.2 - Meningite Tuberculosa (M-TB)
O cérebro está protegido pelo arcabouço craniano, por membranas finas chamadas de
meninges e pelo líquido cefalorraquidiano (LCR) ou líquor (ROHKAMM, 2004). Existem
três meninges: i) a dura-máter, que é a membrana mais externa, espessa, dura e fibrosa,
protege o tecido nervoso dos choques mecânicos. É formada por tecido conjuntivo rico em
fibras colágenas contendo vasos e nervos. Como o encéfalo não possui terminações nervosas
sensitivas, ela é a responsável por quase toda a sensibilidade intracraniana; ii) a aracnóide,
que é a membrana intermediária e mais fina, é responsável pela produção do LCR; iii) a pia-
máter, que é a membrana mais interna, está aderida intimamente ao encéfalo e à medula, é de
fina espessura e a única meningite vascularizada, portanto, é responsável pela barreira
hemato-encefálica (Figura 3).
Figura 3 – Representação esquemática das meninges, membranas que circundam a
massa encefálica (http://curlygirl.naturlink.pt/nervoso.htm
)
O líquor é um fluido incolor que ocupa o espaço subaracnóide e as cavidades
ventriculares, sendo produzido pelo plexo coróide. O plexo coróide do ventrículo lateral é
uma evaginação de vasos envoltos pela pia mater projetando-se na cavidade ventricular e
cobertos pela camada epitelial de origem ependimal. A principal função do LCR é a proteção
do sistema nervoso central (SNC) amortecendo os choques, tornando o encéfalo mais leve por
estar submerso, reduzindo assim o risco de traumatismo causado por contato com o osso;
14
retira resíduos do metabolismo, drogas e outras substâncias que se difundem no cérebro
através do sangue, além de servir como meio de difusão de células de defesa imunológica e de
anticorpos. Tem uma taxa de secreção de 500 ml
dia. Em condições normais, o LCR segue
livremente pelo espaço subaracnoide e é absorvido dentro do sistema venoso (ROHKAMM,
2004; LINDSAY, 1997).
Denomina-se meningite o processo inflamatório que ocorre nas meninges, que pode
ter várias causas, infecciosas ou não. A meningite de origem infecciosa, principalmente
causada por meningococos, por
Mtb e por Haemophilus influenzae tipo b, é a mais importante
devido ao grande potencial de transmissão e pela patogenicidade (FUNASA, 2002).
A meningite ou meningoencefalite tuberculosa (M-TB) é uma das doenças infecciosas
mais comuns entre pacientes hospitalizados por doenças neurológicas e de maior taxa de
letalidade, entre as formas de TBexp, além de deixar freqüentemente seqüelas sérias como a
paraplegia (perda parcial ou total da força dos membros inferiores). A M-TB compõe-se de
uma inflamação aguda, caseosa, localizada ou difusa da leptomeninge (membrana
aracnoidéia) causada, essencialmente, por
Mtb. Os principais fatores que estão relacionados
ao hospedeiro são: deficiência imune adquirida ou congênita, hipoesplenomegalia, e
alcoolismo (LINDSAY, 1997). A TB neurológica é invariavelmente secundária a TB em
outro nicho do corpo, e o evento crítico no desenvolvimento da meningite é a ruptura de um
tubérculo resultando na liberação de material infeccioso dentro do espaço subaracnóide. A
infecção do SNC segue, em linhas gerais, a TB como um todo (THWAITES e cols, 2000;
KATTI & ACHAR, 2004; SHARMA & MOHAN, 2004; GILLESPIE & HAWKEY, 2006).
15
A incidência da M-TB na comunidade está associada com índices socioeconômicos,
principalmente naqueles países onde há condições precárias de habitação, que são indicadores
epidemiológicos importantes de uma região, já que guarda estreita correlação com a
incidência de casos bacilíferos na população adulta. Do total de casos extra pulmonares no
Brasil, na década de 90, a M-TB foi responsável por um percentual de 5,1%. A distribuição
por faixa etária foi de 25% entre 0 a 4 anos, seguidos de 19,1% entre 30 a 39 anos. As
medidas de prevenção e controle dos casos de meningoencefalite por
Mtb são as mesmas
preconizadas na TBpul, destacando-se o diagnóstico precoce, tratamento de casos bacilíferos
e a manutenção de altas coberturas com a vacina BCG (MATHAI, 1990b;
http://www.sespa.pa.gov.br/
; PARKS e cols, 1993).
2.6 - RESPOSTA IMUNE NA TUBERCULOSE
2.6.1 -
Imunidade Celular
Mtb constitui-se no exemplo clássico de patógeno para o qual a resposta imune efetiva
é baseada na imunidade celular. Portanto, os linfócitos T têm papel fundamental na imunidade
específica contra as micobactérias e outros microrganismos intracelulares. Estão subdivididos
em: células NK (
natural killer), T Citotóxicas (CTL), T auxiliares (Th) e a população T /
(DUARTE e cols, 1997; LYDYARD, 1997). O papel destas populações celulares em reposta
ao reconhecimento de Ags micobacterianos é complexo e muitos aspectos ainda necessitam
de melhor esclarecimento.
16
As células Th têm grande importância na modulação da resposta imune. De acordo
com o perfil de citocinas secretadas no tecido, esta população se subdivide no padrão Th
1
, que
secreta principalmente interferon gamma (IFN-
), IL-2 e TNF- (Fator de Necrose Tumoral -
α); ou no padrão Th
2
, que secreta interleucinas (IL) IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 e TGF-
(Fator Transformador de Crescimento - ). O papel protetor na resposta envolvendo citocinas
do tipo Th2 não é claro, tem-se sugerido sua associação com risco na progressão da doença
bem como na sua exacerbação. As células tipo Th0 parecem secretar um padrão intermediário
destas citocinas citadas acima e a sua diferenciação para Th1 e Th2 parece ser controlada por
citocinas como IL-12 (FELDMAN, 1997, SEAH, SCOTT & ROOK, 2000, ROOK e cols,
2004; BHATT & SALGAME, 2007).
Após a infecção por
Mtb, os eventos que se seguem são ainda pouco conhecidos.
Ocorre fagocitose pelos macrófagos alveolares ou por células dendríticas (que são ativados
por IFN-
γ), a bactéria pode ser destruída ou ter sua multiplicação inibida por um processo
decorrente da produção de reativos intermediários de oxigênio e nitrogênio, que são
produzidos na presença de TNF-
α, IL-12, calcitriol ou LAM. A IL-12 produzida inicialmente
pelos macrófagos e, posteriormente, por células T
γδ e CD8 (cluster of diferentiation), é a
linfocina chave para a ativação da Th1, que induz a produção de INF-
γ. Estudos detectaram
IL-12 em infiltrado de pulmão, na pleurisia e em granulomas. Outras citocinas auxiliam na
contenção da doença e no recrutamento dos monócitos, como IL-
1β, IL-16 e IL-8. O TNF-α é
produzido pela estimulação das células imunes inatas pela micobactéria ou por produtos
micobacterianos, ele tem um papel chave na formação do granuloma, induzindo a ativação do
macrófago e tem propriedades imuno-regulatórias (VAN CREVEL, OTTENHOFF & MEER,
2002; NORTH & JUNG, 2004; RAJA, 2004; HOUBEN, NGUYEN & PIETERS, 2006).
17
Se o bacilo não for destruído, ocorre a multiplicação do patógeno que dentro de 3
semanas após a primo-infecção atinge a multiplicação máxima, ocorrendo a ativação da
imunidade mediada por células e hipersensibilidade do tipo tardio. A resposta antígeno-
específica inicia-se quando ocorre a migração dos monócitos infectados aos linfonodos
regionais. Os linfócitos T CD4 produzem citocinas que promovem a ativação do macrófago,
além de potencializar sua ação citolítica, possuindo um importante papel no controle da TB.
Os linfócitos T CD8, que reconhecem Ags ligados ao complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) de classe I, têm um papel importante na imunidade protetora
(NORTH & JUNG, 2004; RAJA e cols, 2004). Uma semana após a infecção pelo bacilo o
número de células T CD4
+
e CD8
+
provenientes dos linfonodos está aumentado no pulmão.
Nas próximas 2 a 4 semanas estas células apresentam um fenótipo de células de memória
efetora (CD44
hi
CD45
low
CD62L) das quais aproximadamente 50% são CD69
+
, indicando que
as células que migraram para o local da infecção estão ativadas e interagem com células
apresentadoras de Ags. O granuloma formado contém células CD4
+
e CD8
+
que restringem a
infecção no granuloma e previnem a reativação (SERBINA & FLYNN, 2001; VAN
FAASSEN e cols, 2005; PICHUGIN, PETROVSKAYA & APT, 2006).
Os bacilos residem primariamente no vacúolo dentro do macrófago, têm os seus Ags
apresentados ás células T CD4
+
pelo MHC de classe II, sendo portanto estas células
importantes na resposta protetora ao
Mtb. Na patogenese da infecção por HIV sabe-se que a
perda da população T CD4
+
aumenta a susceptibilidade ao desenvolvimento da TB aguda e
reativação. A função primária das células T CD4
+
é a produção de IFN- e outras citocinas
para ativação de macrófagos. Em modelo animal verificou-se que camundongos MHC de
classe II
-/-
ou CD4
-/-
apresentavam dimunuição acentuada da produção de IFN- após
infecção pelo bacilo. As células T CD8
+
também secretam IFN- e IL-4, tendo um papel
18
relevante no balanço das respostas de células Th1 e Th2 no pulmão de pacientes com TB
(CARUSO e cols, 1999).
2.6.2 - Imunidade humoral
Os linfócitos B são importantes na produção de anticorpos, mas na TB, esse evento
não tem sido correlacionado com uma resposta protetora, porém pode ter um papel na
opsonização ajudando à fagocitose pelos macrófagos e à ação citotóxica do linfócito. Alguns
autores, entretanto, demonstraram que o aumento do nível de Ac séricos contra
Mtb não afeta
sua fagocitose pelo macrófago alveolar e tão pouco a taxa de morte bacilar (ARMSTRONG &
HART, 1975; DUNLAP & BRILES, 1993).
Recentemente foi sugerido que as células B podem contribuir para a resposta imune
precoce na TB, pois em amostras de soro de voluntários, que tinham sido vacinados duas
vezes dentro de um período de seis meses, foi observado aumento de Ac anti-LAM. A
inibição do crescimento micobacteriano pelas células de resposta inata (neutrófilo, monócitos
e/ou macrófagos) mostrou ter um aumento na presença de Ac induzidos pela BCG. Acs
induzidos pela BCG também favoreceram significativamente a resposta imune mediada por
células pelo aumento da proliferação e produção de IFN-
por células T CD4 e CD8. Portanto,
produção de Ac específico para micobactérias parece ser capaz de favorecer tanto a resposta
imune natural como a adquirida. Tem sido sugerido que a ausência de Ac na fase tardia da
AIDS poderia favorecer a infecção disseminada por micobactérias atípicas, tais como as do
complexo
M. avium (BOSIO, GARDNER, ELKINS, 2000; VAN CREVEL 2002).
19
A complexidade da resposta imune não é o único evento na infecção por
Mtb, a
susceptibilidade humana a TB parece ter um componente poligênico. Tem-se observado
maior concordância entre indivíduos gêmeos idênticos que entre dizigóticos, bem como
aumento de susceptibilidade em determinadas populações. Mas, embora vários genes
relacionados tenham sido identificados com a susceptibilidade a TB, isto ocorre em graus
variados dentro de uma população. Dentre outros, genes codificando para HLA-DR-B1,
receptor de vitamina D e receptor de resistência natural associada à proteína 1 de macrófagos
(RAMP) foram associados à susceptibilidade humana em desenvolver TB. Por outro lado,
mutações em diferentes receptores, tais como IFN-
1 e 2, STAT 1, IL-12p40 e IL-12 R 1,
foram associados com o decréscimo da produção de IFN-
ou favorecimento da virulência.
Também variação na região promotora do principal receptor de
Mtb, DC-SIGN, está
associada com TB em populações européias e asiáticas. O mesmo foi observado para
pacientes coreanos com polimorfismo microsatélite na região do intron II do gene TLR-2. Foi
encontrado ainda que auto-anticorpos contra IFN-
estavam associados à infecção com cepas
micobacterianas não virulentas (KAMPEMANN e cols 2005; MARTINEAU e cols, 2006;
YIM e cols, 2006).
2. 7 – DIAGNÓSTICO
2.7.1 -
Tuberculose pulmonar
A detecção da doença em sua fase inicial é um trunfo importante no controle da TB,
pois possibilita a administração do tratamento e conseqüente quebra da cadeia de transmissão.
O diagnóstico clínico da TBpul é difícil, pois os sintomas podem ser confundidos com outras
20
enfermidades e o diagnóstico radiológico só é útil em um estado mais avançado da doença.
Aproximadamente 26,7% dos pacientes adultos no Brasil são tratados sem confirmação para
TBpul, com base apenas no quadro clínico-radiológico (CONDE e cols, 2000; NAHID e cols,
2006). Em pacientes com HIV, devido à apresentação clínica da sintomatologia para TB ser
frequentemente não específica, o diagnóstico se torna mais complicado, o que pode retardar o
tratamento e levar a letalidade (BARNES e cols, 1991).
O teste tuberculínico cutâneo (TTC) (teste de Mantoux ou teste do PPD) tem sido
usado para detecção de infecção desde os fins do século XIX, quando foi desenvolvido por
Koch como “old tuberculin” que mais tarde derivou o PPD (derivado protéico purificado). O
teste é realizado por inoculação intradérmica de 0,1mL/2UT da PPD RT23, e a reação de
hipersensibilidade tardia é observada após 48 ou 72 horas, sendo positivos ao teste indivíduos
que possuem uma reação acima de 10mm de diâmetro. Entretanto, devido a sua baixa
sensibilidade e especificidade para indicar TB doença ou infecção, tem pouco valor
diagnóstico (HUEBNER, SCHEIN & BASS, 1993; BATES & STEAD, 1993). Reação PPD
falso-negativa pode ser observada em alguns indivíduos com TB ativa bem como em co-
infectados HIV/
Mtb (TOOSSI & ELLNER, 1996). Por outro lado, reações PPD falso-positivas
podem ocorrer devido à sensibilização com outras micobactérias que compartilham o mesmo
antígeno, e mais importante o TTC não distingue vacinados com BCG daqueles infectados
com
Mtb, sendo seu valor questionado nos indivíduos vacinados nos três anos anteriores à
realização do teste (KRITSKI e cols, 2000; REICHMAN & HERSFIELD
, 1993; RICHELDI,
2006).
A baciloscopia é utilizada como método de escolha para auxiliar o diagnóstico de um
novo caso de TB, utilizando a técnica Ziehl-Neelsen (Z-N) que utiliza a fucsina como corante.
21
Embora a detecção de bacilos álcool resistentes (BAAR) seja um método simples, rápido e de
baixo custo, a sua sensibilidade é baixa (50%), não detectando as formas paucibacilares. Tem
baixa especificidade já que não distingue
Mtb de outros microrganismos álcool-ácido
resistentes, tais como
Nocardia, Rodococcus, micobactérias atípicas, etc (REICHMAN &
HERSFIELD
, 1993).
A cultura é mais sensível (80%) que a baciloscopia, e se positiva é diagnóstico de
certeza, já que permite identificação da espécie por provas bioquímicas ou moleculares e a
realização de teste de sensibilidade aos micobacteriostáticos. Sendo um organismo rico em
lipídios na sua parede celular,
Mtb necessita de meio de cultura específico para seu
crescimento adequado. O meio de Löwenstein-Jensen (LJ) é mais utilizado nos países em
desenvolvimento, e é feito a base de gemas de ovos (ricas em lipídios), a técnica é morosa (4
a 8 semanas) e laboriosa. O método radiométrico (BACTEC) monitora o crescimento de
micobactérias através da detecção do
14
CO
2
liberado, sendo mais sensível e permitindo
resultado positivo da cultura de
Mtb em torno de 14 dias, mas é mais dipendioso
(REICHMAN & HERSFIELD
, 1993; AÏT-KHALED, ENARSON & BOUSQUET, 2001).
O desenvolvimento dos métodos moleculares que detectam ácidos nucléicos trouxe
importantes avanços para o diagnóstico das doenças infecciosas. A técnica da PCR (reação
em cadeia da polimerase) permite, em poucas horas, a amplificação de seqüências específicas
do DNA (ácido desoxirribonucléico) ou do RNA de diferentes microrganismos, em cerca de
um milhão de vezes, facilitando a identificação dos microrganismos nos espécimes clínicos.
Entretanto, na prática a PCR tem apresentado acentuada variação em sensibilidade (4% a
80%) e/ou especificidade (80% a 100%), devido, entre outros fatores, aos muitos passos
envolvidos para a purificação do DNA micobacteriano, o que aumenta o risco de
22
contaminação das amostras, principalmente em laboratórios com alta demanda de diagnóstico
como os hospitais e postos de saúde da rede pública. O custo é outra limitação do uso das
técnicas moleculares, bem como a necessidade de pessoal especializado e estrutura física
adequada. Os testes moleculares ainda não podem substituir os métodos convencionais
(microscopia e cultura), mas podem ser usados como adjuvante para melhorar o diagnóstico
da TB (BEIGE e cols, 1995; QUEROL e cols, 1995; DILWORTH e cols, 1996; VILLENA e
cols
, 1998; AIT-KHALED, 2001; PAI e cols, 2003; CHENG e cols, 2005; NAHID e cols,
2006).
Recentemente, os antígenos específicos ESAT-6 (
early secretory antigenic target 6) e
CFP-10 (
culture filtrate protein 10) têm sido descritos como úteis na detecção de indivíduos
infectados por
Mtb (infecção latente). Estes desenvolvem forte resposta de células T de
memória produzindo IFN-
γ, quando estimulados com aqueles Ags, e apresentam boa
sensibilidade e especificidade na TB ativa. Entretanto, este método não se constitui em
alternativa a microscopia e cultura nos países em desenvolvimento, pois significativo
percentual da população está apenas latentemente infectada (LALVANI e cols, 2001;
BARNES e cols, 2004; MORI e cols, 2004).
2.7.2 - Tuberculose pleural
Estabelecer um diagnóstico de efusão de PL-TB pode ser clinicamente difícil porque a
efusão pleural exudativa e a reatividade cutânea ao PPD têm baixa especificidade. Assim, o
seu diagnóstico é mais freqüentemente estabelecido por histopatologia da biópsia pleural
(padrão ouro). Bacterioscopia e cultura, embora sejam realizadas, possuem baixa
23
sensibilidade (LEVINE e cols, 1970; KATOCH, 2004; RAHMAN, CHAPMAN & DAVIES,
2005).
Métodos alternativos têm sido desenvolvidos baseados na bioquímica e na seqüência
do DNA para auxiliar no diagnóstico da PL-TB, tais como: i) ADA (adenosina deaminase) -
O exame bioquímico da enzima ADA tem sido exaustivamente estudado. É uma enzima
envolvida com o metabolismo das purinas e atua como catalisadora de conversão de
adenosina e desoxiadenosina em inosina e desoxinosina, respectivamente. O teste, embora
tenha como vantagem ser rápido, de baixo custo e de fácil execução, apresenta variação de
sensibilidade e especificidade em diferentes estudos, além de baixa sensibilidade em pacientes
imunossuprimidos (CONDE e cols, 2002, CHEN e cols, 2004; LANIADO-LABORÍN e cols,
2005). ii) Testes moleculares – apresentam as mesmas vantagens e desvantagens descritas no
diagnóstico da TBpul. (FERRER, 1997; REECHAIPICHITKUL e cols, 2000; PAI e cols,
2003; MOON e cols, 2005).
2.7.3 - Meningite Tuberculosa
O diagnóstico é feito a partir de evidencias clínicas, epidemiológicas e laboratoriais. O
TTC pode ou não ser reator, variando com o estado de nutrição e com a fase da doença. O
diagnóstico diferencial da M-TB deve ser feito em casos de outras doenças infecciosas que
comprometem o SNC e que possuem manifestações clínicas e liquóricas semelhantes. Entre
essas doenças estão: meningoencefalites virais, meningites bacterianas não tuberculosas
(
Haemophylus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis), meningite
fúngica (
Cryptococcus neoformans), etc (MATHAI e cols, 1990a; SEGAL & POLLARD,
2005; http://www.sespa.pa.gov.br/
).
24
Para o diagnóstico laboratorial é essencial a punção lombar, a qual deverá ser realizada
sempre que houver a hipótese clínica da doença. O resultado do exame do LCR pode ser
muito sugestivo de M-TB, sendo de grande auxílio para a tomada de decisões quanto ao
tratamento. Os LCR têm as seguintes características: cor límpida ou xantocrômica; número de
células em geral de 10 a 500 células/mm³. Com a progressão da doença, este número pode
aumentar havendo posteriormente um predomínio de linfócitos (pleocitose), presença de
neutrofilos no começo da doença; concentração geralmente baixa de glicose em pacientes
com MTB, atingindo valores quase sempre abaixo de 40 mg
%; a concentração de proteínas
aumenta gradativamente à medida que a doença progride, em geral varia de 1- 5g
L. Valores
iniciais acima de 300 mg
dL são indicativos dos piores prognósticos (RADHAKRISHNAN &
MATHAI, 1991; LINDSAY, BONE & CALLENDER, 1997; THWAITES e cols, 2000;
http://www.sespa.pa.gov.br/
).
A pesquisa de BAAR no LCR possui uma baixa positividade pelo fato da meningite
ser uma forma clínica paucibacilar, mas deve ser sempre realizada, devido à possibilidade de
imediata confirmação do diagnóstico e simplicidade do teste. Autores de países desenvolvidos
referem positividade à bacterioscopia e à cultura em cerca de 80% dos casos, porém em países
em desenvolvimento a positividade fica entre 15% a 20% (RADHAKRISHNAN &
MATHAI, 1991; http://www.sespa.pa.gov.br/
). A cultura de LCR é de sensibilidade variável
(25 a 70%), sendo importante apenas do ponto de vista epidemiológico e não clínico
(MATHAI e cols, 1990; KATTI e cols, 2004).
Testes moleculares têm sido utilizados para auxiliar no diagnóstico em LCR, porém a
variabilidade na sensibilidade e especificidade compromete seu uso na rotina diagnostica. PAI
e cols (2003) fizeram uma revisão sistemática sobre testes moleculares (baseados nos ácidos
25
nucléicos) em M-TB, usando testes comerciais e
in house, observando variação na
sensibilidade (50 a 100% e 25 a 100%, respectivamente) e na especificidade (62 a 100%), que
também são descritas em outros estudos (MARTINS e cols, 2000; DESAI e cols, 2006;
QUAN e cols, 2006). Nas infecções paucibacilares a sensibilidade da PCR será sempre
comprometida pelo baixo número ou ausência de bacilos no espécime clínico.
As tabelas 1 e 2 abaixo sumarizam as vantagens, desvantagens e sensibilidade dos
métodos de rotina utilizados para auxiliar no diagnóstico das TBpul e TBexp.
Tabela 1. Vantagens e desvantagens dos principais métodos usados no diagnóstico da
tuberculose
Método Vantagem Desvantagem
Sintomas clínicos Rápido Pouco específico e conclusivo,
variabilidade na apresentação
ou ausente. Não confirmatório
Raio - X Relativo fácil acesso
Pode ser usado em unidades
móveis. Custo relativamente
baixo
Pouco sensível e específico.
Baixa reprodutibilidade.
Não confirmatório
Teste cutâneo a tuberculina Rápido, pouco invasivo Leitura em 72 horas.
Pouco específico.
Baciloscopia (pesquisa de
BAAR)
Rápido, de baixo custo,
simples
Baixa sensibilidade
Espécime nem sempre
disponível.
Não é feito na freqüência que
deveria
Cultura Alta sensibilidade, específica. Morosa e laboriosa.
Nem sempre existe estrutura
física e de pessoal para ser
realizada
PCR Relativamente rápida e fácil,
específica.
Relativamente cara, variável
sensibilidade.
Necessita estrutura física e
pessoal especializada.
Equipamento e insumos
dispendiosos
26
Tabela 2. Sensibilidade dos testes laboratoriais convencionais e histopatológicos na
tuberculose pulmonar (P-TB) e extrapulmonar
Sensibilidade (%)
Forma clínica
Baciloscopia Cultura Histopatologia
Referências
P-TB 40 – 60 70 – 80 NA
REICHMAN, 1993
PL-TB 5 – 20
40
70 – 80
SHARMA E MOHAN
2004
M- TB 15 - 20 25 – 70 NA
KATTI e cols, 2004
Portanto, aliança entre sensibilidade e especificidade adequada com facilidade
operacional e rapidez, além de custo adequado aos países de baixa renda per capita, são
características desejáveis no desenvolvimento de testes que auxiliem no diagnóstico da TB.
Estudos focando novos testes diagnósticos da TB por exame do escarro, sangue ou outros
espécimes clínicos têm sido incentivados (WHO, 2007). Os métodos que detectam a resposta
imune do hospedeiro parecem ser atrativos, principalmente os sorológicos, por atenderem os
critérios acima, e particularmente por serem uma alternativa para os pacientes com espécimes
paucibacilares, que não produzem escarro ou que são suspeitos de estarem desenvolvendo a
forma extra-pulmonar da doença (GARG e cols, 2003).
2. 8 – DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Dezesseis anos após a identificação de Mtb como agente etiológico da TB Arloing
(1898) introduziu um teste de aglutinação para o diagnóstico sorológico da TB. Durante as
décadas seguintes, diversas técnicas sorológicas foram empregadas para diagnosticar doenças
27
micobacterianas como, por exemplo, hemaglutinação, aglutinação em látex, fluorescência
indireta, radioimunoensaio e imunofluorescência (FAVEZ, JÉQUIER & VULLIÉMOZ, 1966;
NASSAU & MERRICK, 1970; NICHOLLS, 1975; MAHFOUZ & FRASER, 1980). Após a
análise dos resultados destas técnicas, observou-se, que nenhuma delas provou ser útil no
diagnóstico clínico da TB, apesar dos resultados iniciais promissores (DANIEL &
DEBANNE, 1987).
Em 1972, Engwall e Perlman desenvolveram uma técnica imuno-enzimática (ELISA)
altamente sensível e reprodutível. Desde então, o ELISA tem sido empregado no diagnóstico
das doenças infecciosas. Embora o método possua inúmeras vantagens, isto não o faz mais
específico que os outros métodos imunológicos. O seu sucesso depende de Ags específicos e
relevantes, além da classe de Acs pesquisados. (DANIEL & DEBANNE, 1987; REICHMAN
,
1993).
2.8.1 - ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
O ELISA é um método imuno enzimático, baseado no conhecimento de que Ac e Ag
podem ser fixados sobre uma fase sólida adsorvente, sem perder sua atividade imunológica.
Do mesmo modo, estas moléculas podem ser ligadas a uma enzima mantendo ambas as
atividades, imunológica e enzimática (SELVARAJ e cols, 2002; NARINS, 2003).
O ELISA é dependente de duas ocorrências básicas: i) Reação do Ag com o Ac – esta
fase é crucial e, portanto deve ter suas condições otimizadas, as quais variam de acordo com a
natureza do Ag e o tipo de Ac utilizados, ii) A segunda está relacionada à superfície sólida
28
em que o Ag ou Ac será adsorvido ou imobilizado. Embora a ligação das moléculas
biológicas seja influenciada por diferentes mecanismos químicos do suporte sólido, as
propriedades físicas também são importantes tais como o formato, tempo de incubação, pH
das soluções e temperaturas utilizadas (CAREL e cols, 1994; www.kpl.com
; BUTLER, 1994;
BLINCKO, 1999). As superfícies que são hidrofílicas e possuem carga neutra têm baixo
poder de ligação. As proteínas e outras moléculas se adsorvem passivamente às superfícies
através de interações hidrofóbicas e iônicas e assim um suporte sólido que não possua estas
características não permitirá a ligação das moléculas.
Há dois métodos principais do ELISA: o indireto e o direto. O ELISA indireto consiste
na adsorção do Ag especifico em uma superfície sólida, e o Ac dos fluidos corporais (ex.
soro) é detectado através de um anti-Ac marcado com uma enzima (ex: peroxidase), e após a
adição do substrato ocorre a reação colorimétrica. O ELISA direto é aquele que usa Ac
específicos ligados na superfície sólida para detecção de Ag circulante em fluidos corporais
(TRABULSI, RACHID & ALTERTHUM, 2004; CROWTHER, 2001).
Além da etapa de imobilização do Ag ou Ac a um suporte sólido, o ELISA requer
também o uso de marcadores enzimáticos e seus respectivos substratos, para a detecção do
complexo Ag x Ac formado. O sistema de detecção pode ser de pelo menos de três tipos
(CAREL e cols, 1994): ensaios colorimétricos, fluorescentes e luminescentes, ambos mais
sensíveis que o colorimétrico, embora mais onerosos.
O sistema colorimétrico resulta em uma reação colorida, onde o produto absorve luz
visível, de diferentes comprimentos de ondas. A densidade óptica da reação é proporcional à
quantidade de imunocomplexos formados. Entre as enzimas mais comuns para a marcação
29
dos Acs usados no sistema de detecção, encontram-se a: peroxidase (extraído da raiz de
rabanete), fosfatase alcalina (de intestino de vitela) e a
-D-galactosidase (extraída de E. coli).
A escolha destas enzimas se deve ao fato de que são estáveis a temperaturas de 4 a 37
C,
temperaturas estas usualmente aplicadas nos ensaios de ELISA, e é também a temperatura de
estocagem comercialmente recomendada por longo período (DANIEL & DEBANNE, 1987;
BUTLER, 1994; HOWES, 1999; GILLESPIE & HAWKEY, 2006). A etapa final do ELISA é
a adição do substrato. De acordo com a característica dos substratos, estes podem levar a
produtos de reação colorida insolúveis ou solúveis, chamados substratos cromogênicos.
Usualmente, os produtos insolúveis são aplicados em ensaios feitos sobre membranas, como
no
Dot-blots e Dot-ELISA, onde ocorre deposição do corante insolúvel desenvolvendo cor no
local da reação que pode ser visualizada ou mensurada por densitometria. Para os ensaios
imunológicos em solução, utilizando microplacas de múltiplos poços, os corantes solúveis são
mais apropriados. Um inibidor químico é geralmente usado para parar a reação, permitindo
assim que a reação se dê dentro de um tempo adequado de 15 a 30 minutos (SAAD e cols,
1991; www.kpl.com
; HOWES, 1999).
2.8.2. Testes rápidos alternativos
Os testes imunocromatográficos são também conhecidos como teste de difusão lateral
(
lateral-flow test) ou teste da fita (Strip test). São baseados no tradicional teste de aglutinação
em látex e no ELISA indireto, e vários testes comerciais têm sido disponibilizados. Entre
estes se encontram: “PATH ICS test” (
program for appropriate technology in health
immunocromatographic test
), o teste baseado no Ac monoclonal MPB84 - “MBP-84 ICA
test” (
immunochromotographic assay), o kit diagnóstico ICT-TB (ICT Diagnostics,
30
Balgowlah, New South Wales, Australia) e MAPIA (MultiAntigen Print ImmunoAssay) cujo
principio se baseia na imobilização de Ags em fita de nitrocelulose (CHIERAKUL e cols,
2001; LYASHCHENKO e cols, 2000). Estes testes, como o teste do ELISA convencional,
são de fácil operacionalidade, rápidos e reprodutíveis, mas têm por desvantagem custo mais
elevado e a subjetividade na leitura do resultado que varia entre os testes (TALBOT e cols,
2003; HASEOGAWA e cols, 2002) (Figura 4).
Figura 4. Representação de um teste sorológico baseado na difusão lateral ou teste da
fita
M1- Banda superior - reação do controle positivo, M2-4 - Banda inferior reação positiva dos soros teste
O imuno diagnóstico com Ag espécie–específicos do complexo
Mtb potencialmente
podem distinguir a infecção por este patógeno daquelas causadas por micobactérias
ambientais. Entretanto, a variabilidade da resposta imunológica dos pacientes aos diferentes
Ag tem dificultado a obtenção de um teste sorológico para TB suficientemente sensível e
específico. Portanto, um estudo de identificação de Ags que sejam reconhecidos pelos
diferentes grupos de pacientes é desejável. Os Ags selecionados seriam então combinados
para compor um teste sorológico para auxiliar no diagnóstico da TB. Múltiplos Ags devem
ser analisados também porque os Acs envolvidos neste reconhecimento podem variar em
função da clínica do paciente, isto é, se é doença pulmonar ou extra-pulmonar (PAPA e cols
,
31
1993; SAAD e cols
, 1996; SIMONNEY e cols, 1997; WILKINSON e cols, 1997; MATHUR
e cols
, 1999; ANDERSEN e cols, 2000; BRUSASCA e cols, 2001; BECK e cols, 2005).
Excetuando os Ags 38 kDa e 16 kDa, a maioria dos estudos publicados baseados na
resposta imune a Ags, individuais ou misturados, carecem de confirmação por diferentes
grupos investigativos e de avaliação em diferentes áreas geográficas, no Brasil raros estudos
têm sido realizados com estes e outros Ags. Os resultados têm-se apresentado com diferenças
marcantes talvez devido à diversidade nas características dos Ags utilizados. Outro fator a
considerar é que o resultado de um teste sorológico pode ser influenciado pela população de
diferentes áreas geográficas, diversidade genética e incidência da TB.
2.9 – ANTÍGENOS
Os principais Ags utilizados ao longo dos anos nos estudos sorológicos da TBpul e
TBexp são os brutos, os semi purificados e os purificados obtidos ou não por recombinação
gênica (Tabela 3). Os Ag brutos são extratos de micobactérias contendo Ag de várias
composições químicas, comuns às outras bactérias bem como espécies–específicos. Os Ags
semipurificados mais estudados são: A-60, Ag 5, PGL (fenol glicolipideos), LAM e o P-90. A
sensibilidade do ELISA para estes Ags usando as imunoglobulinas (Ig) G, A e M variam tanto
na detecção de TBpul como para TBexp (MAHADEVAN e cols, 1997, CONDE e cols,
20004).
Os Ags protéicos recombinantes têm sido mais explorados nesta última década devido
a maior facilidade de obtenção. São obtidos através da técnica de recombinação gênica, onde
o DNA alvo é amplificado por PCR. Após a clonagem, em plasmídios adequados, é expresso
32
usualmente na bactéria
E. coli, sendo a proteína purificada em colunas específicas. Existem
vários Ag recombinantes descritos na literatura e a Tabela 3 sumariza os resultados de
sensibilidade e especificidade obtidos com alguns deles utilizando o método do ELISA na
avaliação diagnóstica da TBpul e TBexp. Abaixo algumas características dos principais Ags
descritos com potencial imundiagnóstico na literatura internacional.
O LAM obtido de
Mtb foi primeiramente utilizado no sorodiagnóstico da hanseníase
(HUNTER e cols 1986), seguindo-se SADA e cols (1990) no imunodiagnóstico da TBpul e
TBexp. Estes autores descreveram alta especificidade (92%) e sensibilidade de 72%,
entretanto, TESSEMA e cols (2002) encontraram resultados menos promissores (78,3% e
50,5%, respectivamente). O LAM é um dos componentes do teste comercial rápido
MycoDot
que embora específico é pouco sensível, principalmente em pacientes TB/HIV (SOMI e cols
1999). No grupo dos glicolipídios, os Ags da família acil-trealose foram os mais estudados,
tais como: 2,3-diacil trealose (DAT ou SL-IV), 2,3,6, triacil trealose (TAT), 2, 3,6, 6 tetraacil
trealose (Sulfolipídeos, SL-1) e trealose 6,6-dymicolato (fator corda). Todos apresentado
variadas sensibilidade e especificidade como mostrado na Tabela 3.
O Ag 38 kDa (
phoS, phoS1, Rv0934 ou PstS-1, Ag 5) é uma lipoproteína secretada por
Mtb com função relacionada a processos na parede celular e possui epitopos específicos para
o complexo
Mtb. O 38 kDa induz uma boa resposta imune de células T produtoras de INF-,
principalmente combinado ao Ag CFP-10 (TAVARES e cols, 2007). Os resultados obtidos
em ensaios sorológicos têm-se mostrado variáveis, com taxas que vão de 16% a 94% de
sensibilidade, mas com alta especificidade. Maior imunoreatividade tem sido descrita em
pacientes BAAR
+
. Mas outros autores têm demonstrado alta sensibilidade em TB/BAAR
-
. O
uso deste Ag no ELISA comercial tem sido extensivamente avaliado em diferentes áreas
33
geográficas para o diagnóstico da TBpul apresentando variada sensibilidade e especificidade
(WILKINSON e cols, 1997; LI e cols, 1998; CHAN e cols, 2000; HARRINGTON e cols,
2000; JULIAN e cols, 2002; POTTUMARTHY e cols, 2000; DEMKOW e cols, 2004). Este
Ag ou seus peptídeos derivados fazem parte dos KITS sorológicos comerciais. Estudos
anteriores mostraram que o ELISA com 38 kDa foi útil para monitorar a evolução do
tratamento de pacientes com TB e para distinguir entre aqueles com doença ativa e os casos
tratados (AHMAD & NAZ, 1995). Mais recentemente, ARAÚJO e cols (2004) demonstraram
que o 38 kDa é mais sensível na detecção de IgA em saliva no soro de pacientes. Entretanto,
são raros os estudos de seu uso no diagnóstico da TBexp, e os resultados obtidos têm sido
descrito como comparáveis àqueles da TBpul. Até o momento nenhum estudo em TBexp foi
realizado no Brasil e raros os estudos em nosso meio na TBpul com este Ag (LODES e cols,
2001).
A proteína HSP (
Heat shock protein) 16 kDa de Mtb é também conhecida pelas
designações de sHsp16, Acr1, Rv2031c. Esta proteína foi identificada como um Ag
imunodominante e é a maior proteína de membrana, porém é considerada a menor HSP de
Mtb. É expressa pelos microrganismos em estado de latência e, quando sujeitos à escassez de
oxigênio, pode ocorrer mais de 25% de sua expressão protéica. Possui vários epitopos de
células B específicos. Outras HSP micobacterianas (M-hsp) foram descritas, tais como 60, 65
e 70/71 kDa. Acs anti-70 kDa foram detectados em maior freqüência em pacientes com TB
ativa e sarcoidosis que em controles, mas diferença significativa foi obtida apenas para Acs
anti-65 e 16 kDa (DUBANIEWICZ e cols 2006). Usando o método de ELISA para diferentes
isotipos de Ig os resultados tem sido contraditórios, enquanto alguns autores relatam
sensibilidade de 11% a 62%, outros encontram maior especificidade (83%) utilizando os
resultados dos isotipos combinados. O 16 kDa tem sido bastante estudado para resposta imune
34
em TBpul utilizando várias técnicas de imunodiagnóstico no ELISA comercial, juntamente
com o 38 kDa, mostrando sensibilidade variável, mas mantendo alta especificidade.
Recentemente, foi sugerido que a detecção de Ac-anti 16 kDa pode ter papel na detecção da
TB latente (CHANG e cols, 1996; WILKINSON e cols, 1998; GARBE e cols
, 1999; UMA
DEVI e cols, 2001; RAJA e cols, 2002; CACCAMO e cols, 2002; ABULIMITI e cols, 2003;
KENNAWAY e cols, 2005; BECK e cols, 2005; WELDING e cols, 2005; DEMISSIE e cols,
2006). Entretanto, raros ou nenhum são os estudos avaliando este Ag no imunodiagnóstico da
TB pulmonar, pleural e meningocócica em nosso meio.
A proteína ESAT-6 é codificada pelo gene
esat6 (Rv3875) e é essencial para a
sobrevivência da bactéria. É precocemente expressa na infecção, e é reconhecida pela maioria
dos pacientes com TB, mas a resposta imune celular para este Ag não consegue separar a TB
latente da TB ativa. Este Ag não está presente em cepas de
M. bovis BCG e de outras
micobacterias atípicas, com isso tem discriminado pacientes com TB e pacientes vacinados
com BCG e pacientes expostos a micobactérias não tuberculosas. Estudos recentes, no Brasil,
mostram que aproximadamente 60% dos pacientes com TBpul produzem INF-
quando
estimulados com ESAT-6 (CARDOSO e cols, 2002; TAVARES e cols, 2007). Estudos de
resposta humoral por IgG na TBpul e na M-TB mostraram sensibilidade e especificidade de
19% e 10% e 95% e 100%, respectivamente (COLANGELI e cols, 1999; CHANDRAMAKI
e cols, 2002; BLACK e cols, 2003; BAO e cols, 2003; RAO e cols, 2003; WANG e cols,
2005; TAVARES e cols, 2007). Em um estudo recente, este Ag foi utilizado para a detecção
de IgG, IgA e IgM em pacientes com PL-TB e câncer, mostrando maior sensibilidade na
resposta a IgG (35,8%), seguido da IgM (17,3%) e IgA (2,5%), com especificidade superior a
95% (YANG e cols, 2008). Em outro estudo, foi descrito alta sensibilidade em teste realizado
com uma proteína de fusão do ESAT-6/CFP-10, principalmente em áreas não endêmicas para
TB (HOFF e cols 2007).
35
O Ag MPT-64 (Rv1980c) é uma proteína secretada durante o crescimento de
Mtb.
Estudos indicam que esta proteína de 24 kDa só é expressa no complexo Mtb, e em algumas
cepas de
M. bovis BCG. Em estudo realizado no Brasil, TAVARES e cols (2007),
estimulando células do sangue periférico com a combinação MPT-64/ESAT-6, observaram
que 89% dos pacientes com TBpul apresentavam resposta para INF-
para este Ag. AL-
ATTIYAH, EL-SHAZLY & MUSTAFA (2006) sugerem que este Ags juntamente com
ESAT-6 e Ag 85b têm potencial para serem usados como candidatos à subunidade vacinal.
Existem poucos estudos com este Ag para a resposta humoral. KAISERMANN e cols (2005)
identificaram reatividade de IgA ao MPT-64 e MT-10.3 em pacientes com PL-TB, com
sensibilidade de 72% e especificidade de 96%. Para TBpul e M-TB, baixa sensibilidade e alta
especificidade foram descritas para IgG especifica ao MPT-64 (YAMAGUCHI e cols, 1989;
COLANGELI e cols, 1999; CHANDRAMAKI e cols, 2002; GEISBRECHT e cols, 2006).
O gene
esxR codifica a proteína MT-10.3 (ES6.9, TB10.3, Rv3019c) que pertence a
família ESAT-6 e ainda não tem função conhecida. TAVARES e cols (2006) mostraram
resposta celular por IFN-
para o Ag MT-10.3 em 24 % dos pacientes com TBpul em nosso
meio. Entretanto, não existem trabalhos relacionando este Ag à imunidade humoral, exceto
KAISERMANN e cols (2005) avaliando pacientes com PL-TB (SKJØT e cols, 2002;
http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/
).
Outros Ags tais como o 85b kDa ou 30 kDa (
Rv1886c), compõem a família de
proteínas do complexo antigênico 85, e representam a maior fração de proteínas secretadas
em filtrado de cultura de
Mtb. Juntamente com outras duas proteínas do complexo possuem
atividade de enzima micolyl transferase que atua na via biossintética do fator corda. Em
36
estudos imunoenzimáticos foi mostrada sensibilidade (84%) e especificidade (96,7%) altas
usando combinações de IgA e IgG para detecção do 30 kDa (UMA DEVI e cols, 2002) mas
outros autores falharam na obtenção de resultados similares (McDONOUGH e cols, 1992).
Em outros estudos, têm mostrado sensibilidades de 76,4 % a 14,5% mantendo a alta
especificidade (RAJA e cols, 2004). Epitopos deste Ag tem sido proposto como potencial
subunidade vacinal juntamente com o ESAT-6 (WANG e cols, 2005).
Outra proteína de filtrado de cultura secretado por
Mtb é o MPT32 que é homólogo a
proteína de ligação fibronectina de
M. leprae. Parece estar envolvida na invasão do epitélio e
das células de Schwann (HARBOE & WIKER, 1998). SAMANICH e cols (1998)
descreveram para este Ag um grande potencial imunodiagnóstico, com sensibilidade de 14 a
70% dependendo da Ig utilizada no teste, sendo a IgG mais reativa. Acs anti-MPT32 foram
descritos na urina de pacientes com TB, porém com baixa especificidade e em número
limitado de pacientes.
Recentemente, novos Ags que apresentaram imunoreatividade similar ao 38 kDa
foram descritos, TB9.7, TB15.3, TB16.3 e TB51 (WELDINGH e cols, 2005). Análise do seu
potencial sorológico mostrou sensibilidade de 31% a 93% com alta especificidade (97%). O
Ag micobacteriano HBHA (
heparin-binding haemagutinin adhesin, Rv0475) é uma proteína
associada à superfície celular, envolvida na aderência a células epiteliais. É importante na
disseminação dos bacilos na TBexp. É encontrada no complexo TB, inclusive BCG
(MENOZZI e cols, 1998; PETHE e cols, 2001). Os Ags PE e PPE são assim denominados
devido à presença de seqüências de aminoácidos Prolina-Glutamina (PE) e prolina-prolina-
glutamina (PPE) localizadas próximo ao N-terminal da maioria destas proteínas. A PPE55
(Rv3347c) foi descrita ser reconhecida na TB subclínica em estudo experimental em cobaias e
37
Acs foram detectados em 71% de pacientes TB/HIV
+
e em nenhum soro de controles (SINGH
e cols, 2005). A proteína PE codificada pelo gene
Rv3872, localizado na região de deleção 1
(RD1) tem sido descrita como molécula promissora ao diagnóstico da TBpul e TBexp,
mostrando 90% de sensibilidade e alta especificidade (MUKHERJEE e cols, 2007).
A fusão de vários Ags recombinantes representa uma estratégia ainda pouco utilizada,
mas que pode auxiliar na obtenção de quimeras com potencial diagnóstico, devido ao fato de
que a resposta ao
Mtb ser heterogênea, requerendo múltiplos Ags para alcançar adequada
sensibilidade e especificidade. Poliproteínas fusionadas têm sido geneticamente construídas,
tais como CFP-10/MTB8/MTB48 e o 38kDa. Um teste foi desenvolvido acrescentando a esta
poliproteína dois outros Ags revelando sensibilidade de 80% e 60% para escarro BAAR
+
e
BAAR
-
, respectivamente (HOUGHTON e cols, 2002). Entretanto, maiores estudos são
necessários neste campo.
Assim existem vários Ags descritos com possível menor ou maior potencial
diagnóstico, mas raros são os estudos em nosso meio. Atualmente com a disponibilidade no
mercado de uma série de KITs comerciais prometendo alta sensibilidade e especificidade é
necessário obter mais conhecimento quanto a reatividade dos principais Ags utilizados nestes
testes, como o 38 kDa e 16 kDa, além do ESAT-6 que vem sendo utilizado fusionado ao
CFP-10 e a outros Ags não menos promissores. Portanto, com o objetivo de obter melhor
conhecimento do potencial imunodiagnóstico de alguns destes Ags na TBpul e TBexp em
nosso meio, ensaio
in house foi desenvolvido, e um KIT comercial, contendo pelo menos um
dos Ags ensaiados, foi avaliado no presente estudo.
38
Tabela 3 – Sensibilidade e Especificidade dos testes do ELISA com diferentes antígenos de Mycobacterium tuberculosis
TB pulmonar (%) TB pleural (%) TB meningocócica (%)
Antígenos
Sensibilidade Especificidade Sensibilidade Especificidade Sensibilidade Especificidade
Referencias
Brutos
PPD IgG 50 a 100 74 a 95 IgG 45 a 65 68 a 86 IgG 59,2 a 88,8 36,3 a 94 MATHAI, 1990; PARK, 1993; ZHOU, 1994;
MATTAR, 1992; HWANG, 1993; AVDIENKO,
1998; MONTORO, 1994; KUNTER, 2003.
BCG IgG 91,5 92,5 IgG 24 a 89 94 a 100 ESCOBAR-GUITIERREZ, 1996; WATT, 1988;
ARAJ, 1993; NICULESCU, 1996; SADA , 1983;
Ex. Sonicados IgG 46 a 70 37 a 98 NR NR 50 a 90 100 KATTI, 2001; SRIVASTAVA, 1994; ARAJ, 1993;
AVDIENKO, 1998; UKLISTAIA, 1996.
Cultura proteína filtrada IgG 85 94 KASHYAP, 2004
Semipurificados
A- 60 IgG 48 a 88
IgA 86
IgM 28 a 41
71 a 95
93
90 a 95
50 a 80
77
76 a 100
94
33 a 79
66
62
94
100
100
OKUDA, 2004; CHARPIN, 1990; CAMINERO,
1994; BARIHUTA, 1993; CHIANG, 1997; GUPTA,
1995; MATTAR, 1992; GHOSHAL, 2003;
KUNTER, 2003; KALANTRI, 2005;.
LAM IgG 67,5 a 82 97,5 50 93,8 51 a 61 100 OKUDA, 2004; YOKOYAMA, 2005;
CHANDRAMAKI, 1989; MA, 1996; XUE, 1999.
Ag 5 61 a 88,8 50 a 100 MATHAI, 1990; MATHAI, 1990A;
RADHAKRISHNAN.1990.
P – 90 IgG 69
IgA 70 a 74
64
68 a 92
NR NR NR NR CONDE, 2004; ALIFANO, 1997.
DAT; PGL-TB1; SL IV;
SL-I
IgG 51 a 81
IgA 66
IgM 32 a 56
77 a 96
87
96
NR NR NR NR CAVALCANTE, 1997; SIMONEY, 1997; VERA-
CABRERA, 1994; JULIAN, 2002; HARRINGTON,
2000.
39
TB pulmonar (%) TB pleural (%) TB meningocócica (%)
Antígenos
Sensibilidade Especificidade Sensibilidade Especificidade Sensibilidade Especificidade
Referencias
Recombinantes
38 kDa IgG 18 a 85
IgA 30
IgM 10
80 a 100
100
100
79 97 8 a 80 95 a 97,6 WILKINS, 1990; JACKETT, 1988; CHIANG, 1997;
COLANGELI,1999; UMA DEVI, 2001;
KADIVAL,1994; WELDINGH, 2005; DEMKOW,
2004; CHANDRAMAKI, 2002; GREENAWAY,
2005.
19 kDa IgG 10 a 70 97,6 29 97,6 6 a 25 97,6 a 100 WILKINS, 1990; JACKETT, 1988; COLANGELI,
1999; CHANDRAMAKI, 2002.
MPT-64 IgG 5 a 57,7
IgM 78,2
97,5 a 100
IgM 100
IgA 72 96 IgG 12 a 66,6
IgM 83,3
100 KAISERMANN, 2005; COLANGELI, 1999;
CHANDRAMAKI, 2002; WANG, 2005
MT-10.3 IgA 72 96 KAISERMANN, 2005
14 kDa IgG 12 a 72 95 a 97,6 21 97,6 25 a 56 97,6 a 100 WILKINS, 1990; JACKETT, 1988; COLANGELI,
1999; CHANDRAMAKI, 2002.
16 kDa IgG 55 a 67
IgA 52
IgM 11
96,7 a 100
97
95
NR NR NR NR RAJA, 2002; UMA DEVI, 2003; WELDINGH, 2005.
30 kDa IgG 67 a 70
IgA 15
IgM14
99 a 100
96,7
92
NR NR IgG 80 91 KASHYAP, 2004; SADA, 1990; RAJA. 2004; UMA
DEVI, 2003.
ESAT –6 IgG 19 a 60,3
IgM 78,2
95 a 100
100
IgG 35,6%
IgM 17,3%
IgA 2,5 %
95% IgG 10 a 50 100 COLANGELI, 1999; CHANDRAMAKI, 2002;
WANG, 2005; GREENAWAY, 2005; YANG, 2008
40
3 - HIPÓTESES:
A sensibilidade e especificidade dos testes baseados na resposta imune humoral são
iguais no diagnóstico da infecção tuberculosa pulmonar e extra-pulmonar.
A sensibilidade e especificidade do imunodiagnóstico é superior ao diagnóstico
laboratorial convencional, dado pela bacterioscopia direta, na tuberculose pulmonar e extra-
pulmonar.
41
4- OBJETIVO GERAL
Comparar a imunoreatividade das imunoglobulinas G, M e A do líquido pleural e líquido
cefalorraquidiano de pacientes com suspeita de pleurisia tuberculosa e meningite tuberculosa,
repectivamente, e soro de pacientes com tuberculose pulmonar a antígenos específicos de
M.
tuberculosis
.
4.1-OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Estimar a sensibilidade, especificidade, do teste imunoenzimático “in house” para IgG,
IgM e IgA, utilizando os antígenos, 16 kDa, 38 kDa, ESAT-6, MPT-64 e MT-10.3 no
diagnóstico da tuberculose pleural, meningite tuberculosa e tuberculose pulmonar
2) Estimar a sensibilidade e especificidade de KIT comercial no diagnóstico da
tuberculose pulmonar e extra-pulmonar.
3) Comparar os resultados dos ensaios
in house com os antígenos propostos e do KIT L
para detecção de IgG, M e A com as características clinica, demográfica e
laboratoriais disponíveis para os espécimes clínicos dos pacientes com tuberculose
pulmonar, pleural e meningite tuberculosa.
4) Comparar a sensibilidade e especificidade dos testes imunoenzimáticos realizados
in
house
com os obtidos com KIT comercial.
42
5 - MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 - Tipo de Estudo
Estudo transversal, observacional, de avaliação da imunoreatividade das
imunoglobulinas G, M e A à antígenos (Ags) micobacterianos específicos, em amostras de
soro de pacientes com TBpul e de indivíduos sadios. Em amostras de líquido pleural e LCR o
estudo foi retrospectivo e transverso envolvendo pacientes com PL-TB, com outras pleurisias
não tuberculose (PL-NTB) e de pacientes com M-TB e outras neuropatias.
5.2 - Pacientes e espécimes clínicos
5.2.1. M-TB: foram incluídas as seguintes amostras de LCR: 19 de pacientes com TB, 28
com esclerose múltipla, 45 com cefaléia e 67 com outras meningites bacterianas e virais. Os
LCR foram depositados no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho e Laboratório
Neurolife, RJ, Brasil, entre janeiro de 2002 a maio de 2005. As amostras foram obtidas de
pacientes com suspeita de meningite tuberculosa que foram submetidos à raquicentese e
examinados para citologia global e específica, dosagem de glicose e proteínas, exame direto
para bactérias pelo método de coloração de Gram; para detecção de BAAR pelo método de
Ziehl-Neelsen (Z-N) e fungos; para criptococos e cultura para bactéria; fungo e micobactérias
(Ministério da Saúde, 1994). Todos os LCR apresentavam resultados de proteinorraquia
(PTR) e foram divididos em três grupos de acordo com a concentração de proteínas
encontradas: PTR
1
= níveis de proteína normais (≤ 40 mg/dl), PTR
2
= níveis de proteína
alterados (40<PT<300 mg/dl) e PTR
3
níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl). A detecção
de anticorpos anti-HIV foi realizada pelo teste de ELISA GenScreen de acordo com o
43
protocolo do fabricante (Biorad, França). Após a realização dos testes de rotina, as amostras
foram aliquotados em tubos de microcentrífuga e estocados em freezer -20
C. No final de
2006 os LCR de pacientes com M-TB, cefaléia e esclerose múltipla foram transferidos para a
nossa soroteca, segundo parceria de estudo proposta pela Dra Marzia Puccioni Sholer.
Professora da UFRJ, e fizeram parte da amostragem utilizada na tese intitulada “
Avaliação da
resposta imune humoral IgG, IgM e IgA contra os antígenos recombinantes MT-10.3 e MPT-
64 de Mycobacterium tuberculosis no liquido cefalorraquidiano de pacientes com meningite
tuberculosa”
do Dr. Rafael Herringer, cujos ensaios foram realizados no Laboratório de
Microbiologia Celular/Instituto Oswaldo Cruz/Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Os LCR
de pacientes com meningite não tuberculose foram enviados em meados de 2007 para o
presente estudo. As amostras são de conveniência e as informações clínicas e laboratoriais
foram obtidas da referida tese.
5.2.2. PL-TB: Foram utilizadas amostras de LP de 114 pacientes com efusão pleural, sendo
85 pacientes diagnosticados com PL-TB e 39 com outras pleuropatias, admitidos no Hospital
Geral da Santa Casa de Misericórdia (HGSCM) entre janeiro 1999 a julho de 2001. O
HGSCM é de atendimento terciário na cidade do Rio de Janeiro (RJ), Brasil. Os LP foram
obtidos após consentimento formal livre e esclarecidos dos pacientes. Estes espécimes
clínicos encontravam-se estocados em nossa soroteca e fizeram parte da amostragem utilizada
na tese intitulada “
O Diagnóstico da Tuberculose Pleural através da Dosagem da Adenosina
Deaminase, da Detecção de Três Anticorpos Específicos do M. tuberculosis e da Reação em
Cadeia da Polimerase no Líquido Pleural
”, do Dr. Morrys Casagrande Kaisermann, cujos
ensaios sorológicos foram realizados no Laboratório de Microbiologia Celular, Fundação
Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), conforme estudo colaborativo com a Dra. Anete Trajman,
44
Professora da Universidade Gama Filho. O projeto que deu origem a este trabalho foi
aprovado pelo Comitê de Ética do HGSCM-RJ. Todos os pacientes assinaram um termo de
consentimento livre e informado antes da realização da toracocentese. As informações clínicas e
laboratoriais dos pacientes foram obtidas da referida tese. Os LP dos pacientes foram
submetidos a exames microbiológicos de bacterioscopia pelos métodos de coloração de Gram
e de Z-N, citometria global e específica, cultura para germes inespecíficos e para
micobacterias em meio de LJ. Dos fragmentos de pleura, três tinham sido submetidos a exame
histopatológico e um a cultura em meio de LJ. Os exames bioquímicos e de coloração foram
realizados no Laboratório Central do HGSCM. As culturas foram realizadas no Laboratório
Noel Nutels da Secretaria Municipal de Saúde do RJ (SMS) ou no Laboratório Bronstein, RJ.
Os exames citológicos e histopatológicos foram realizados no Serviço de Anatomia
Patológica do HGSCM.
5.2.3 - TBpul: foram incluídos no estudo soros de pacientes sintomáticos respiratórios
prospectivamente atendidos, de dezembro de 2004 a dezembro de 2005, na unidade de
pneumologia do Centro Municipal de Saúde Heitor Beltrão (CMSHB, atendimento primário),
na cidade do RJ. O sangue foi coletado após consentimento formal livre e esclarecido dos
pacientes antes do início de qualquer tratamento. O estudo foi aprovado pelo comitê ético do
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, e
Instituto Oswaldo Cruz. Foi obtido um total de 251 soros que se encontram estocados na
soroteca do Laboratório de Microbiologia Celular/IOC/FIOCRUZ. Os pacientes tiveram o
escarro coletado para bacterioscopia por coloração pelo método de Z-N e cultura em meio LJ,
que foram realizados no Laboratório de Micobactérias, Instituto de Microbiologia, UFRJ
(Universidade Federal do Rio de Janeiro). O TTC foi realizado pela técnica de Mantoux
45
utilizando 2UT do PPD RT-23 (Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark). A imagem
do exame radiográfico (Raio X do tórax) foi classificada quanto às alterações observadas em:
i) pouca ou nenhuma: sugestivo de outras pneumopatias ou normal, ii) intermediária:
infiltrados, iii) extensa: infiltrados e ou cavidades. Estes procedimentos foram realizados
dentro da rotina diagnóstica do CMSHB.
Os espécimes utilizados neste estudo fazem parte de projeto de estudo de avaliação de
resposta imune realizado em parceria com a Professora Adjunta da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Dr. Vânia M. C. Silva, e a médica pneumologista do CMSHB, Dra. Aline
H.Cavalcanti. As informações clínicas e demográficas foram obtidas dos prontuários
mantidos no CMSHB
5.3 - Critérios de Inclusão
Espécimes clínicos de pacientes em regime de tratamento para TB com mais de
sete dias, de pacientes para os quais o quadro de TB não foi confirmado, seja clinicamente,
laboratorialmente e radiologicamente; pacientes com tratamento por imunossupressores;
mulheres grávidas. Alem disso, soros de pacientes com P-TB com imunodiagnóstico positivo
para HIV foram excluídos.
5.3.1 -
LCR: Foram incluídas amostras de conveniência de LCR cujos pacientes foram
diagnosticados segundo os seguintes critérios:
- Meningite tuberculosa (M-TB): caracterizada por sinais meningorradiculares, cefaléia,
febre, vomito, alteração do nível de consciência, déficit neurológico focal, alteração clínica
dos nervos cranianos e crises convulsivas, com cultura ou baciloscopia positiva para BAAR.
46
- Meningite não tuberculosa (M-NTB): LCR com cultura e baciloscopia positiva para
bactérias ou fungos.
- Controle negativo (C): pacientes diagnósticos de esclerose múltipla, cefaléia que
possuíam exames de LCR normal.
5.3.2 -
Líquido pleural: Foram incluídos LP de pacientes segundo os seguintes critérios:
- Pacientes com presença de efusão pleural e com indicações clínicas para toracocentese.
- Com pleurisia PL-TB: baseado no encontro de BAAR no LP ou escarro, ou com cultura
positiva para o complexo
M. tb no escarro, LP ou fragmento pleural, ou na identificação de
granuloma com ou sem necrose caseosa no fragmento de pleura. O diagnóstico de PL-TB
também foi estabelecido nos casos em que todos os procedimentos realizados foram
inconclusivos, mas que apresentavam um quadro clínico de febre vespertina e sudorese
noturna por pelo menos três semanas, associado a um derrame pleural exsudativo, com
predomínio linfocitário e que responderam satisfatoriamente ao tratamento anti-TB, sem uso
concomitante de outro tratamento antimicrobiano.
-Pleurisia não tuberculosa (PL-NTB) baseado nos espécimes clínicos com bacterioscopia e
cultura negativa e histopatologia da pleura compatível com outras pleurisias não tuberculose.
5.3.3 -
Soros: Foram incluídos soros de pacientes que foram diagnosticados segundo critérios
da
American Thorax Society (ATS):
- TB pulmonar confirmada (P-TB): pacientes com bacterioscopia positive e ou cultura
positiva.
- TB pulmonar suspeito (PS-TB): pacientes com bacterioscopia ou com cultura não
realizadas, mas que apresentaram melhora por imagem radiográfica após dois meses de
tratamento com tuberculostáticos.
47
- Controles com TTC positivo (PPD
+
): pacientes com outras pneumopatias não
tuberculose, com bacterioscopia e cultura do escarro negativa, TTC >10mm e história de
contato com paciente com tuberculose.
- Controles com TTC negativo (PPD
-
): pacientes com outras pneumopatias não
tuberculose ou pacientes com história de contato de TB no passado e TTC <5 mm.
5.4 – Antígenos
Os Ags protéicos utilizados neste trabalho, ESAT-6, MPT-64, MT-10.3, 16 kDa e 38
kDa, foram doados pelo Dr. Mahavir Singh (Lionex Diagnostics & Therapeutics GmbH,
Braunschweig, Alemanha), como parte do acordo com o Laboratório de Microbiologia
Celular (IOC, Fiocruz) inserido no Programa de Cooperação Brasil x Alemanha (Ministério
de Ciência e Tecnologia). Os Ags foram obtidos por recombinação genética e expressos em
E.
coli.
Resumidamente, os genes codificantes de cada Ag foram amplificados por PCR, os
fragmentos obtidos foram clonados em vetor plasmidial e as proteínas foram expressas em
E.
coli
. Quantidade e peso molecular esperado das proteínas foram observadas em gel SDS-
PAGE (gel de policramida), seguindo-se a purificação por cromatografia de afinidade.
Contaminação das frações antigênicas foram purificadas pelo sistema
Mono Q anion
exchange chromatography
. Purificação final foi feita por diálise e as proteínas foram
aliquotadas e liofilizadas. A concentração das proteínas foi determinada pelo método de
Lowry.
48
5.5 – Padronização da ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) “in house”
Foram utilizadas microplacas para ELISA Nunc, flat botton imunoplate C96 Maxisorp
(Thomas Sci USA) para a padronização e os ensaios realizados neste estudo. Nos respectivos
poços da placa foram adicionados 50
μL de Ag em tampão carbonato-bicarbonato pH = 9,6
(Na
2
CO
3
15mM, NaHCO
3
15mM), nas concentrações de 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 μg/ml. Após
incubação à 37°C por duas horas, as placas foram lavadas 4 vezes com 200
μl PBSt 0,01%
pH = 7,4 (Na
2
HPO
4
90mM, NaH
2
PO
4
18,98mM, NaCl 9,92mM, 0,01% Tween 20). Em
seguida, foi adicionado a cada poço 100
μl da solução de bloqueio PBSt-BSA 5% (albumina
sérica bovina, BSA, Fraction V), e incubada a 37°C por 2 horas. Após lavagem como descrito
acima, foram adicionados nos respectivos poços 50
μl dos pools dos respectivos espécimes
clínicos (de doentes e de controles sadios) diluídos a 1:20 a 1:1600 em PBSt-BSA 1% e
incubados a 37°C por 1 hora. Procedida à lavagem foram aplicados 50
μl dos conjugados anti
– IgG, IgM e IgA humana (-HRP) feita em cabra, em PBSt-BSA 1% diluídos em varias
concentrações (1:1000 a 1:50.000) e incubados por 1 hora a 37°C. Seguindo-se a lavagem,
foram adicionados 50μl da solução de substrato (solução de TMB [3,3’,5,5’-
tetramethylbenzidine], Zymed), e deixados em incubação por 30 minutos a temperatura
ambiente e no abrigo de luz. A reação foi parada com 50
μl de ácido sulfúrico 2,5N (H
2
SO
4
).
As placas foram lidas numa absorbância de 450 nm no leitor de ELISA (Labsystems
Multiskan MS Plate Reader, USA). Os resultados dos testes foram expressos em densidade
óptica (DO) x 1000.
Após a padronização, foram determinadas a melhor concentração de cada antígeno, de
diluição de conjugados e espécime clinico para os grupos arrolados neste estudo, M-TB
(MeningEIA), PL-TB (PLEIA) e TBpul (PulmEIA).
49
Em todas as placas foram adicionados
pools positivos e negativos em quatro diluições
para servir como controle das placas nos testes realizados no mesmo dia ou em dias
diferentes. Cada placa havia um poço contendo um controle branco (
blank) e a DO (densidade
óptica) de controle branco não ultrapassou 100. O contrário era indicativo de erro operacional,
sendo os testes repetidos. Para minimizar as variações na DO dos
pools por sucessivos
congelamentos e descongelamentos, estes, após preparo, foram aliquotados em pequenos
volumes, de modo a serem utilizados não mais de três vezes. Todos os testes foram realizados
em duplicata e os seus valores não excederam a 25% do valor médio das duplicatas; em caso
contrário o teste foi repetido. Todos os compostos químicos utilizados na confecção dos
tampões e reagentes foram obtidos da Sigma & Aldrich, Saint Louis, USA e Pierce,
Alemanha ( ver Apêndice I)
O tempo da reação de desenvolvimento de cor é muito importante e recomenda-se o
seguinte esquema: i) Buscar o tempo adequado de incubação para o substrato a ser usado; ii)
Começar a contar o tempo do momento da adição nos primeiros poços (usar pipeta multicanal
de preferência); iii) Colocar a solução substrato em pipetagem rítmica e obedecendo a um
padrão de manipulação; iv) Quando o tempo de incubação terminar adicionar a solução de
parada, da mesma forma rítmica e no mesmo padrão usados para a colocação do substrato.
5.6 - Elisa Kit Lionex Comercial (KIT L)
O ELISA utilizando o KIT L foi ensaiado de acordo com o protocolo do fabricante
(Lionex Diagnostic & Therapeutic, Germany). O KIT foi produzido com uma mistura de
diferentes Ags (
pool), o qual é desconhecido a maioria dos antígenos empregados, exceto o 38
kDa e ESAT-6. As amostras teste e os controles (padrões pronto para uso fornecidos pelo
50
fabricante) foram diluídos a 1:200 em solução diluente. Em seguida 100µL dos respectivos
espécimes clínicos foram adicionados nos poços das respectivas microplacas para detecção de
IgG, IgM e IgA. As placas foram incubadas por 45 minutos a 37°C. Após a incubação, as
placas foram lavadas três vezes com 300µL/poço de solução de lavagem (diluída 1:10 em
água milli-Q) e adicionadas com 100µL/poço da solução de conjugado, exceto nos poços
correspondentes ao
blank. Após incubação a 37C por 30 minutos e lavagem das placas como
descrito anteriormente, foram adicionados 100µl/poço de solução de substrato TMB em todos
os poços, seguida de incubação a 37º por 10 minutos e ao abrigo da luz. A reação foi parada
com 100µL/poço da solução de parada da reação. A leitura foi realizada como descrito no
teste
in house.
5.7 - Análises Estatísticas
O ponto de corte (cut off) dos ensaios in house foram obtidos através da curva de
característica operacional do receptor (ROC -
receiver operator characteristics), onde foram
calculados em diferentes limites de positividade da DO. A curva foi obtida através das taxas
dos casos verdadeiramente positivos (sensibilidade) e o falso positivo (especificidade) para
cada ponto de corte possível, que foram representados em um gráfico construído pelo
software SPSS13. Quanto mais próximo o ponto da curva, para sensibilidade e especificidade,
do valor 1, melhor foi o cut off. A sensibilidade e especificidade dos testes sorológicos com
os Ags e as diferentes Igs foram então determinados. Para comparar as diferenças das
freqüências de positividade obtidas nos diferentes grupos foram realizados testes não
pareados, e Kruskal-Wallis e Mann-Whitney foram utlizados para avaliar a significância dos
resultdos obtidos.
Odds Ratio (OR) ou razão de chances de positividade nos testes foi
mensurada para diferentes tipos de associações com as características clínicas e demográficas
dos pacientes.
51
6- RESULTADOS
Na Tabela 4 estão descritas as principais características clínicas e demográficas dos
indivíduos que tiveram os espécimes clínicos extra pulmonar incluídos no presente estudo.
Tabelas 4 – Características clínicas, laboratoriais e demográficas dos pacientes com
tuberculose extra pulmonar e cujos espécimes clínicos foram utilizados neste estudo.
Extra pulmonar N (%)
Características
M-TB M-NTB C TB-PL PL-NTB
Total 19 67 73 85 39
Idade (x ± DP) 47,9±17,6 41,7±19,97 48,9±20,01 39,42±17,2
*
57,2 14,5
Sexo
Feminino 7 (37) 27 (40) 50 (69) 12 (14) 13 (33,3)
Masculino 12 (63) 40 (60) 23 (31) 73 (86) 26 (66,7)
Bacterioscopia:
Positiva 0(0) 0(0) 0(0) 1 (1) 0(0)
Negativa 19 (100) 63(100) 73(100) 78 (92) 36 (92)
NR 6 (7) 3 (8)
Cultura:
Positiva 18 (95) 53 (80) 0 (0) 12 (14) 0(0)
Negativa 1 (5) 14 (20) 73 (100) 73 (86) 39 (100)
NR
Biopsia: NA NA NA
Positiva 63 (74) 9 (23)
Negativa 19 (22) 20 (52)
Inespecífica 3 (4) 9 (23)
Inadequada 0 (0) 1(2)
Sorologia HIV:
Positiva 8 (42) 17 (25) 0(0) 10 (12) 19 (49)
Negativa 11 (58) 50 (75) 73 (100) 59 (69) 2 (5)
NR 16 (19) 18 (46)
M-TB = meningite por M. tuberculosis; M-NTB = meningite por outras etiologias não TB; C= LCR controle inflamatório e
não inflamatório (esclerose múltipla e cefaléia); PL-TB=tuberculose pleural, PL-NTB = outras pleurisias não TB;
HIV= vírus da imunodeficiência humana,
*
p=0.0001; NA: Não se aplica.
52
Os pacientes diagnosticados com M-TB, M-NTB e o grupo controle (C) não
apresentaram diferença significativa quanto as médias de idade, que variaram de 24 a 80, 17 a
102 e 18 a 89, respectivamente. Todos os pacientes tiveram bacterioscopia negativa para
detecção de BAAR. Todos os LCR de M-TB tiveram cultura
+
para Mtb, exceto um que foi
incluído neste grupo devido à melhora clinica do paciente após tratamento específico para TB.
O grupo com M-NTB apresentou cultura
+
para os seguintes gêneros bacterianos:
Corynebacterium (1), Criptococcus (20), E. coli (1), Klebsiela (2), Neisseria meningitidis ou
meningococos (5),
Morganella (1), Pneumococcus (14), Serratia (2), Staphylococcus (3), e
Streptococcus (4). Seis pacientes M-NTB foram diagnosticados com infecção viral e oito
tiveram cultura
-
. Dos pacientes que apresentavam resultado de sorologia para HIV, 32%
(8/25) de soropositividade foi observada no grupo M-TB (Tabela 4).
Nos pacientes que foram agrupados com doença pleural, os casos PL-NTB eram em
média mais idosos que o grupo PL-TB (p< 0,0001), com intervalos variando de 15 a 85 e 18 a
69 anos, respectivamente. Apenas um paciente com PL-TB foi BAAR
+
ao exame
bacterioscópico. A cultura para
Mtb foi positiva em 14% dos espécimes clínicos de pacientes
PL-TB, dos quais 3 (25%) apresentaram resultado histopatológico inespecífico na biopsia de
pleura. Do total de espécimes submetidos ao exame histopatológico 22% apresentaram
resultado negativo para TB. Entre os pacientes PL-NTB, 23% tiveram exame histopatológico
de biopsia positiva para câncer, em um o espécime clínico foi inadequado para processamento
e em nove o exame resultou inespecífico. Os pacientes PL-NTB tiveram os seguintes
diagnósticos baseado na suspeita clínica: câncer (19), cirrose (3), empiema (2), hemotórax (1),
insuficiência cardíaca crônica (6), insuficiência respiratória crônica (2), lupus (1), neoplasia
mamária torácica (1), pneumonia (2) e dois sem diagnostico. Do total de pacientes com
pleurisia a maioria (78/124, 63%) apresentou resultado positivo para o HIV (Tabela 4).
53
6.1-
Resultados dos ensaios imunoenzimático “in house” (MeningEIA) e do KIT L com
líquido céfalorraquidiano
As amostras de LCR de pacientes com M-TB, com outras meningites infecciosas (M-
NTB) e com esclerose múltipla e cefaléia (C) foram ensaiadas quanto à reatividade de IgG e
IgA para os Ags 16 kDa e 38 kDa, e o KIT L foi ensaiado para todas as Ig. As reatividades de
IgG, IgM e IgA para MPT-64 e MT10.3 nos LCR de M-TB e C foram ensaiadas em nosso
laboratório para a tese do Dr. Rafael Heringer, já os LCR de M-NTB foram ensaiados, para
estes Ags, no presente estudo.
A Tabela 5 mostra as diluições dos diferentes Ags, LCR e conjugados utilizadas no
MeningEIA, definidas após a realização dos testes para padronização. Esta foi feita com
diluições de 1:20 a 1:800 de
pools positivo e negativo de LCR de pacientes com M-TB e de
indivíduos controles (C), respectivamente. Os Ags foram diluídos nas concentrações de 0,5
µg/ml, 1,0 µg/ml, 1,5 µg/ml e 2,0 µg/ml. Os conjugados foram testados nas diluições de
1:400 a 1:40.000 para detecção de IgG, M e A. A figura 5 (Anexo II ) mostra um exemplo da
curva da padronização realizada com os antígenos diluídos de acordo com as especificações
na tabela 5.
Tabela 5– Condições utilizadas para o
MeningEIA
Variáveis MPT - 64 MT - 10 16 kDa 38 kDa
Concentração do Ag (µg/ml)
1
gmL
Liquor (diluição de trabalho) 1:40
Conjugados
+
:
Anti – IgG 1:800 1:40.000
Anti – IgM 1:20.000 NR
Anti - IgA 1:20.000
+
Conjugados da Pierce (Germany) , *Conjugado da Sigma Audrch (USA); NR: não realizado
54
Com as condições determinadas na padronização o
MeningEIA aplicado nos grupos
de LCR forneceram as reatividades médias mostradas na Tabela 6. Apenas o
MeningEIA
para 16 kDa-IgA não apresentou reatividade média com diferença significativa entre os
grupos (p=0,314). No KIT L as médias foram significativamente diferentes entre os grupos
para todas as Igs testadas (p < 0,05), porém com desvio padrão similar ou maior que a média
obtida. Este perfil foi também observado no
MeningEIA para 16 kDa-IgG/IgA, MPT-64–
IgM, e 38 kDa-IgA, principalmente para LCR de M-TB. Comparando as médias nos pares de
grupos, através do teste Mann-Whitney, diferença significativa foi observada, exceto para
MT-10.3-IgG/M (p=0,815/0,093) nos grupos M-TB x M-NTB.
Tabela 6 – Reatividade média e o desvio padrão (DP) de IgG, IgM e IgA dos líquidos
cefalorraquidiano, de pacientes com meningite tuberculosa (M-TB), com outras meningites
infecciosas não tuberculosa (M-NTB) e controles cefaléia e esclerose múltipla (C), obtidas nos ensaios
de
MeningEIA com diferentes antígenos recombinantes e com o KIT L
M-TB M-NTB C
N
Média
DP
N
Média
DP
N
Média
DP
P
valor
a
IgG MPT-64
19
311
145
64
186
86
73
179
22
0,000
MT-10.3
19
215
130
b
63
204
101
b
73
92
12
0,000
16 kDa
19
221
238
64
105
71
73
81
31
0,000
38 kDa
19
144
105
62
82
30
71
77
18
0,000
KIT
19
362
358
65
91
91
72
39
16
0,000
KIT
19
311
145
64
186
86
73
179
22
0,000
IgM MPT-64
19
153
184
66
88
44
73
88
23
0,002
MT-10.3
19
86
49
c
66
88
39
c
73
58
11
0,000
KIT
19
145
284
65
57
51
72
31
13
0,000
IgA MPT-64
19
168
119
60
75
30
72
84
9
0,000
MT-10.3
19
141
94
61
93
32
73
78
11
0,000
16 kDa
16
119
154
9
98
117
49
66
11
0,314
38 kDa
18
216
295
8
85
51
49
91
23
0,001
KIT
19
198
349
65
98
106
72
45
14
0,000
a
χ
2
:( teste Kruskal Wallis).
b, ,C
teste Mann-Whitney: p>0, 815, p>0,093 (M-TB x M-NTB)
55
Os resultados do
MeningEIA e KIT L expresso em DO, individualmente, nos
diferentes grupos de LCR estão mostrados na Figura 6. Observa-se que, embora as médias de
DO dos LCR de pacientes com M-TB tenham se mostrado mais elevadas que o grupo M-
NTB e C, poucos são aqueles que apresentam LCR hiper-reativos. Estes foram responsáveis
pelo alto desvio padrão encontrado entre os LCR de M-TB. Por outro lado, nenhum dos LCR
de M-NTB se mostrou hiper-reativo nos ensaios (DO >500).
56
Figura 6 – Distribuição da resposta humoral para antígenos recombinantes de M. tuberculosis e KIT L expressa em densidade óptica (DO), no líquido
cefalorraquidiano de pacientes com meningite tuberculosa (M-TB
), com outras meningites não tuberculosa (M-NTB ▲) e com cefaléia e esclerose múltipla
(C
). Barra curta: média de DO. Barra longa: ponto de corte (cut off)
57
Quando foram comparadas as médias de reatividade para os grupos com resultado de
sorologia para HIV, observou-se que estas estão mais elevadas para M-TB/HIV
+
em ambos os
ensaios (p<0,08), porém sem diferença estatisticamente significativa, exceto para 38 kDa-
IgG/A (204,6 ± 137,5/355,4 ± 413,7 x 102,1 ± 44,4/ 104,5 ± 30,6; p<0,034) e 16 kDa-IgA
(208,5 ± 237,6 x 65,8 ± 13,4; p=0,042) (Figura 7 A e C).
O grupo M-NTB/HIV
-
apresentou maior reatividade que os HIV
+
, mas diferença
significativa só foi observada para MPT-64 e MT-10.3-IgM (73,5 ± 17,6 e 73,2 ± 12,6 x 94,4
± 51,5 e 93,6 ± 51,5, p<0,016) e para os KIT
s: IgG (92,6 ± 76,2 x 54,1 ± 36,5; p=0,036), IgM
(65,6 ± 57 x 30,3 ± 14,2; p=0,000) e IgA (98,2 ± 69,6 x 54,9 ± 24,7; p=0,012) (Figura 7 A, B,
C).
Entre os M-TB, as médias de maior valor foram obtidas com o KIT L IgG/A (497,5 ±
473,3 x 263,9 ± 221,9 / 351,8 ± 516,2 x 86,7 ± 37,5) seguida pela
MeningEIA MPT-64-IgG
(365,3 ±191,7 x 272,5 ± 91,9, respectivamente para HIV
+
x HIV
-
).
58
Figura 7 - Distribuição da reatividade e média de IgG, IgM e IgA de líquido cefalorraquidiano (LCR)
ensaiados pelo
MeningEIA e KIT L de acordo com a sorologia para HIV( ■ HIV
+
e ■ HIV
-
).
M-TB M-NTB
MPT-64
M
T
-10.3
16
kD
a
38 kDa
KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
IgG (DO x 1000)
MPT-64
M
T-10.3
16
kD
a
38 kDa
KIT
L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
M-TB/HIV
+
x M-TB/HIV
-
: p=0,034 ; M-NTB/HIV
–
x HIV
+
: p= 0,036
M
PT-64
MT
-
1
0
.3
K
IT L
0
200
400
600
800
1000
1200
IgM (DO x 1000)
MPT-64
M
T
-
1
0.
3
KI
T
L
0
200
400
600
800
1000
1200
M-NTB/HIV
-
x HIV
+
: p<0,016
M
P
T-
6
4
MT
-
10
.
3
1
6
kDa
3
8
kDa
KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
IgA (DO x 1000)
MPT-64
MT-10.3
1
6
k
D
a
38 kDa
K
I
T L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
M-TB/HIV
+
x M-TB/HIV
-:
p<0,042; M-NTB/HIV
–
x HIV
+
: p= 0,012. M-TB: Meningite tuberculose. M-NTB: Meningite não tuberculosa
59
Todos os LCR apresentavam resultados de proteinorraquia (PTR), e foi observado que
as médias de reatividade estão significativamente mais elevadas entre os LCR do grupo M-
TB/PTR
3
(p<0,037) em todos os ensaios, exceto para MPT-64-IgM e 16 kDa-IgA (p>0,054).
E as médias de DO mais elevadas foram obtidas para os KIT
s-IgG/A (718 ± 508,8/531,6 ±
599,9) seguidos de 16 kDa e MPT-64-IgG (481,6 ± 327,5 e 476,6 ± 202,4) em pacientes com
M-TB/PTR
3
(Figura 8).
Os LCR de M-NTB/PTR
3
apresentaram médias de reatividade menos elevada que na
M-TB (p<0,033) para a maioria dos ensaios, exceto para MT-10.3-IgG/M, MPT-64-IgM e 16
kDa- e 38 kDa-IgA (p>0,074). As DOs de M-NTB para 16 kDa e 38 kDa-IgA (DO= 412 e
211, respectivamente) refere-se a apenas uma amostra de LCR (Figura 8
C).
Nenhum dos LCRs do grupo C (cefaléia e esclerose múltipla) mostrou proteinorraquia
> 300mg/dl (PTR
3
).
60
Figura 8 – Distribuição e média de reatividade de IgG, IgM e IgA de líquido cefalorraquidiano
(LCR) no
MeningEIA e KIT L de acordo com a concentração de proteína.
M-TB (p<0,036)
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
IgG (DO x 1000)
M-NTB
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
IgG (DO x 1000)
Controle
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
IgG (DO x 1000)
PTR
1
= níveis de proteínas normais (≤ 40 mg/dl) (■); PTR
2
= níveis de proteínas alterados (40<PT<300 mg/dl) (■); PTR
3
=
níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl) (
■). *: diferença estatisticamente signifcativa entre grupos.
61
M-TB (*p< 0, 036)
MPT -64 MT-10.3 KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
IgM (DO x 1000)
M-NTB (*p=0,033)
MPT -64 MT-10.3 KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
IgM (DO x 1000)
Controles
MPT-64 MT-10.3 KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
IgM (DO x 1000)
PTR
1
= níveis de proteínas normais (≤ 40 mg/dl) (■), PTR
2
= níveis de proteínas alterados (40<PT<300 mg/dl) (■), PTR
3
=
níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl) (
■). *: diferença estatisticamente significativa entre grupos.
62
M-TB (*p<0,036)
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 00
1 2 00
1 4 00
1 6 00
IgA (DO x 1000)
M-NTB (*p<0,033)
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
IgA (DO x 1000)
Controles
MPT-64 MT-10.3 16 kDa 38 kDa KIT L
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 2 0 0
1 4 0 0
1 6 0 0
IgA (DO x 1000)
PTR
1
= níveis de proteínas normais (≤ 40 mg/dl) (■), PTR
2
= níveis de proteínas alterados (40<PT<300 mg/dl) (■), PTR
3
=
níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl) (
■). * diferença estatisticamente significativa entre grupos
63
A freqüência de LCR positivos nos ensaios imunoenzimáticos está mostrada na Tabela
7. Maior positividade entre os M-TB foi encontrada para o KIT L-IgG (15/19) seguido de
MPT-64-IgA/G (14/19 e 9/19, respectivamente) e MPT-64-IgM (8/19). As menores
positividades na M-TB foram obtidas com MT-10.3-IgG/M (2/19).
Os LCR de M-NTB e C de foram menos reativos para o MT-10.3-IgG (2/136) e
apresentaram maior número de positivos para MPT-64-IgG (7/137). Estes resultados conferem
ao
MeningEIA sensibilidade e especificidade que variam de 10,5% a 73,7% e 94,5% a 97%,
respectivamente. O KIT L-IgG apresentou maior sensibilidade (84,2%) seguido pelo
MeningEIA para MPT-64-IgA (73,7%), ambos com especificidades (95,4%, 94,8%).
Nenhum dos ensaios para detecção de IgM ultrapassou a freqüência dos 45% de positividade
(Tabela 7A).
A combinação das positividades dos diferentes antígenos testados no
MeningEIA
levou, de um modo geral, ao aumento da sensibilidade, obtendo-se melhor resultado com o
MPT-64/16 kDa-IgA (78,9%) sem alteração significativa na especificidade (93,2%). Nenhum
dos outros Ags combinados ao MPT-64 superou esta sensibilidade, mas ocorreu perda de
especificidade, exceto na combinação do MPT-64/16 kDa/38 kDa-IgA (Tabela7). As outras
possíveis combinações estão mostradas na tabela 7B no Anexo II.
64
Tabela 7 – Sensibilidade e especificidade do KIT L, e do MeningEIA na detecção de IgG, IgM e IgA
do líquido cefalorraquiano (LCR) para diferentes antígenos recombinantes ensaiados individualmente
e os melhores resultados combinados dos Ags
Numero de positivos/Total (%) (A)
Ensaios
Cut off Sensibilidade Especificidade
IgG
MPT-64 292,5 9/19 (47,4) 7/137 (95)
MT-10.3 452,5 2/19 (10,5) 2/136 (98,5)
16 kDa 191,5 6/19 (31,6) 4/135 (97)
38 kDa 131 7/19 (36,8) 5/133 (96,2)
KIT 159,5
16/19 (84,2) 8/137 (95,5)
IgM
MPT-64 133,5 8/19 (42,1) 4/139 (97,8)
MT-10.3 130 2/19 (10,5) 7/139 (95)
KIT 104,5 4/19 (21) 9/137 (93,4)
IgA
MPT-64 110 14/19 (73,7) 6/132 (95,4)
MT-10.3 134,5 7/19 (36,8) 6/134 (95)
16 kDa 85 5/16 (31,3) 3/58 (95)
38 kDa 137,5 7/18 (38,9) 3/57 (94,7)
MPT-64/16kDa 15/19
(78,9) 9/132 (93,2)
MPT-64/16 kDa/38 kDa 15/19 (78,9) 9/133 (93,2)
KIT 192,5 3/19 (16) 8/137 (94)
65
Nota-se na figura 9 que a freqüência de LCR que reconhece um antígeno é maior que
aqueles que reconhecem dois ou mais Ags, principalmente para IgA (45%), mas utilizando
dois ou três antígenos 60% (IgG) a 75% (IgA) dos LCR são detectados, mostrando a
heterogeneidade nas respostas dos espécimes clínicos.
Figura 9 - Reatividade de Acs de líquido cefalorraquidiano de meningite tuberculosa por número de
antígenos. Os resultados mostram a freqüência de positivos a diferentes números de antígenos entre os
que apresentaram densidades ópticas maiores que os valores do
cut off, respectivamente para (■) IgG e
(
■) IgA.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
I II III IV
N° de Antígenos
Em geral, as freqüências de M-TB/HIV
+
com resultados positivos no MeningEIA e
KIT L foram maiores do que nos M-TB/HIV
-
. Entretanto, nos testes envolvendo o KIT L-IgG
e MPT-64-IgA, e combinações, as freqüências de positividade foram similares (Tabela 8).
Combinando as reatividades dos Ags foi observado, em geral, pequeno aumento na
positividade para os HIV
-
, alcançando um máximo na combinação MPT-64/16kDa-IgA
(81,8%). Não houve alteração na freqüência de respondedores dos M-TB/HIV
-
quando os
outros Ags foram incluídos nesta combinação, mas ocorreu diminuição na especificidade
(Tabela 8B). Para o Ag 16 /MT-10.3 e 16kDa/38 kDa-IgA e 16kDa/MT-10.3/38 kDa ou todos
os Ags juntos os M-TB/HIV
+
mostraram maiores chances de reconhecerem estes Ags (OR
66
18,000 IC95% 1,24-260,92; 8,000 IC95%: 1,00-63,96; 15,000 IC95%: 1,21-185,20; 13,5
IC95%: 1,47-123,74 ou 8,000 IC95%: 1,00-63,96) (Tabela 8 B e Tabela 10 A, B no anexo II).
A freqüência de positividade para M-NTB/HIV
-
variou de 4,3% a 18,6% e nenhum
HIV
+
mostrou-se positivo para o KIT L-IgG e MPT-64-IgA, individualmente, ou combinado
ao 16 kDa-IgA. A reatividade cruzada obtida entre os HIV
-
, combinando os resultados do M-
NTB e C, foi de 5,1%, 5,2% e 7,8%, respectivamente, para os testes com os Ag individuais e
em combinação (Tabela 8B). As diferentes combinações observadas estão dispostas na
Tabela 8B no Anexo II.
67
Tabela 8 - Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido cefalorraquidiano (LCR)
de pacientes com meningite tuberculosa (M-TB), meningite não tuberculosa (M-NTB) e
controles (C) no
MeningEIA e KIT L testados com os Ags individualmente e com os
melhores resultados combinados dos antígenos de acordo com a sorologia para HIV
Nº de positivos / total (%)
M-TB M-NTB C
(A)
Ensaios
HIV + HIV - HIV + HIV - HIV + HIV -
IgG
MPT-64 5/8 (62,5) 4/11(36,3) 1/16 (6,2) 6/48(12,5) - 0/73(0)
MT-10.3 1/8 (12,5) 1/11(9,1) 0/15(0) 2/47(4,2) - 0/73(0)
16 kDa
4/8 (50) 2/11(18,2) 1/16 (6,2) 3/45(6,6) - 0/72(0)
38 kDa
5/8 (62,5) 2/11(18,2) 1/16 (6,2) 4/45(8,9) - 0/71(0)
KIT L
7/8 (87,5) 8/11(72,7) 0/16(0) 6/46(13) - 0/72(0)
IgM
MPT-64 4/8(50) 4/11(36,3) 0/16(0) 3/47(6,4) - 1/73(1,3)
MT-10.3 1/8(12,5) 1/11(9,1) 1/16(6,2) 6/48(12,5) - 0/73(0)
KIT L 3/8(37,5) 1/11(9,1) 0/16(0) 7/46(15,2) - 0/72(0)
IgA
MPT-64 6/8(75) 8/11(72,7) 0/16(0) 6/43(13,9) - 0/72(0)
MT-10.3 5/8(62,5) 2/11(18,2) 2/16(12,5) 4/42(9,5) - 0/73(0)
16 kDa
4/6(66,6) 1/10(10) - 1/9(11,1) - 2/49(4,1)
38 kDa
5/8(62,5) 2/10(20) - 1/8(12,5) - 2/49(4,1)
KIT L 3/8(37,5) 0/11(0) 0/16(0) 6/46(13) - 0/72(0)
MPT-64/16kDa
6/8(75) 9/11 (81,8) 0/16(0) 7/43 (16,3) - 2/72 (2,8)
MT-10.3/16kDa
6/8(75) 3/11 (27,3) 1/16(6,2) 4/42(9,5) - 2/73 (2,7)
38 kDa/16 kDa 5/8(62,5) 3/11 (27,3) - 1/9(11,1) - 2/49(4,1)
MT10.3/16/38 kDa
6/8(75) 3/11 (27,3) 1/16(6,2) 3/42 (7,1) - 2/73 (2,7)
68
Analisando a freqüência de LCR de pacientes M-TB e M-NTB com resultados
positivos no
MeningEIA e KIT L em relação a concentração de proteínas, observamos
resultados positivos para a maioria dos testes com os Ags ensaiados individualmente ou
combinados para todos os M-TB/PTR
3
(Tabela 9 A, B).
Para os M-TB/PTR
2
, o KIT L-IgG, MPT-64-IgA e as combinações MPT-64/16- e estes
mais o 38 kDa-IgA identificaram a maioria dos casos, 83,3%, 66,6% e 75%, respectivamente.
O grupo M-TB/PTR
1
está representado por apenas dois espécimes e o Ag MPT-64-IgA e suas
combinações lograram detectar 50% deles. A combinação dos resultados com todos os Ags
não alterou a freqüência de positivos neste grupo, mas diminuiu a especificidade dos testes
(Tabela 9).
A reatividade cruzada nos grupos M-NTB/PTR
3
foi mais elevada no KIT L para todas
as Igs e para as combinações do
MeningEIA (>21,7%). Para o PTR
2
as combinações que
apresentaram maior sensibilidade (MPT-64/16kDa- e MPT-64/16kDa/38kDa-IgA) mostraram
reatividade cruzada de 11,5% (3/26) (Tabela 9
B), aliás a mesma obtida com o MPT-64-IgA
testado individualmente (Tabela 9
A).
No grupo C/PTR
2
nenhum reatividade cruzada foi observada no MeningEIA ou KIT
L. No grupo C/PTR
1
não houve reatividade cruzada para o KIT L-IgG e MPT-64-IgA. Nos
resultados combinados de MPT-64/16kDa- e MPT-64/16kDa/38kDa-IgA apenas 3% (2/68)
dos LCRs foram reativos (Tabela 9 A, B).
69
Tabela 9- Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido cefalorraquidiano de
pacientes com meningite tuberculosa (M-TB), meningite não tuberculosa (M-NTB) e
controle (C) no
MeningEIA testados com os Ags individualmente e KIT L e as melhores
combinações encontradas de acordo com proteinorraquia.
Nº de positivos/ total (%)
M-TB M-NTB C
(A)
Ensaios
PTR
1
PTR
2
PTR
3
PTR
1
PTR
2
PTR
3
PTR
1
PTR
2
IgG
MPT-64 0/2 (0) 4/12(33,3) 5/5(100) 1/13(7,7) 2/26(7,7) 4/25(16) 0/68 (0) 0/5 (0)
MT-10.3 0/2(0) 1/12(8,3) 1/5(20) 0/13(0) 0/25(0) 2/24(8,3) 0/68 (0) 0/5 (0)
16 kDa 0/2(0) 1/12(8,3) 5/5(100) 0/13(0) 1/26(3,8) 3/22(13,6) 0/67 (0) 0/5 (0)
38 kDa 0/2(0) 3/12(25) 4/5(80) 0/13(0) 2/26(7,7) 3/22(13,6) 0/66 (0) 0/5 (0)
KIT 0/2(0) 10/12(83) 5/5(100) 0/13(0) 0/26(0) 6/23(26,1) 0/67 (0) 0/5 (0)
IgM
MPT-64 0/2(0) 5/12(41,6) 3/5(60) 0/13(0) 1/25(4) 2/25(8) 1/68 (1,5) 0/5 (0)
MT-10.3 0/2(0) 0/12(0) 2/5(40) 1/13(7,7) 1/26(3,8) 5/25(20) 0/68 (0) 0/5 (0)
KIT 0/2(0) 0/12(0) 4/5(80) 0/13(0) 0/26(0) 7/23(30,4) 0/67 (0) 0/5 (0)
IgA
MPT-64 1/2 (50) 8/12(66,6) 5/5(100) 0/13(0) 3/26 (11,5) 3/20(15) 0/68 (0) 0/4 (0)
MT-10.3 0/2(0) 3/12(25) 4/5(80) 1/13(7,7) 4/24(16,6) 1/21(4,7) 0/68 (0) 0/5 (0)
16 kDa 0/2(0) 3/10(30) 2/4(50) 0/6(0) 0/2(0) 1/1(100) 2/44 (4,5) 0/2 (0)
38 kDa 0/2(0) 2/11(18,2) 5/5(100) 0/5(0) 0/2(0) 1/1(100) 2/44 (4,5) 0/5 (0)
KIT 0/2 (0) 0/12(0) 3/5(60) 0/13(0) 1/26(3,8) 5/23(21,7) 0/67 (0) 0/5 (0)
MPT-64/16kDa 1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 3/26(11,5) 4/21(19) 2/68(3) 0/5(0)
MPT-64/16/38
kDa
1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 3/26(11,5) 4/21(19) 2/68(3) 0/5(0)
PTR
1
= níveis de proteína normais (≤ 40 mg/dl), PTR
2
= níveis de proteína alterados (40<PT<300 mg/dl), PTR
3
= níveis de
proteínas elevados (>300 mg/dl).
70
Tabela 10 – Análises de biovariância de fatores associados com a resposta humoral positiva
no:
A) MeningEIA, com os antígenos testados individualmente, e KIT L e B) MeningEIA,
com os resultados combinados dos antígenos testados, em pacientes com meningite
tuberculosa (19 pacientes).
ODDs Ratio (IC 95%)(A)
Ensaios
PTR
3
HIV + Idade>44anos Masculino
IgG
MPT-64 * 2,917 (0,44-19,23) 3,000(0,46-19,59) 3,500(0,47-25,9)
MT-10.3 2,750(0,14-55,16) 1,429(0,07-26,89)
** **
16 kDa * 4,500(0,57-35,52) 0,857(0,12-5,94) 1,250(0,16-9,54)
38kDa 12,00(0,93-153,88) 7,500(0,92-61,05) 1,333(0,20-8,71) 1,786(0,24-13,21)
KIT L * 2,625(0,22-31,35) 4,500(0,37-54,15) 2,000(0,21-18,69)
IgM
MPT-64 2,100(0,25-17,59) 1,750(0,27-11,15) 2,000(0,31-12,84) 8,400(0,76-93,34)
MT-10.3
** 1,429(0,07-26,89) 0,889(0,05-16,66) 0,545(0,03-10,37)
KIT L
** 6,000(0,49-73,43) 0,875(0,09-7,95) 0,500(0,05-4,67)
IgA
MPT-64 * 1,125(0,14-8,99) 2,000(0,25-15,99) 0,333(0,03-3,80)
MT-10.3 12,000(0,93-153,88) 7,500(0,92-61,05) 1,333(0,20-8,71) 0,667(0,1-4,54)
16 kDa 2,333(0,21-25,24)
18,000(1,24-
260,92)
0,391(0,04-3,35) 1,250(0,15-10,7)
38kDa
* 6,667(0,81-54,96) 1,111(0,16-7,51) 2,083(0,27-15,77)
KIT L
** ** 0,389(0,03-5,21) 0,227(0,02-3,13)
MT-10.3/16 kDa 5,600
(0,47-66,45)
8,000
(1,00-63,96)
3,000
(0,46-19,59)
1,333
(0,2-8,71)
MT-10.3/38Da 8,000
(0,66-97,31)
13,500
(1,47-123,74)
2,000
(0,31-12,84)
0,952
(0,14-6,28)
16kDa/38kDa 4,000
(0,43-37,12)
15,000
(1,21-185,20)
0,714
(0,1-5,12)
1,429
(0,18-11,08)
MT-
10.3/16kDa/38kda
5,600
(0,47-66,45)
8,000
(1,00-63,96)
3,000
(0,46-19,59)
1,333
(0,2-8,71)
*100% de positividade , **0% de positividade; PTR2= níveis de proteína alterados (40<PT<300 mg/dl),
PTR3= níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl)
71
6.2 - Resultados dos ensaios imunoenzimáticos in house (PLEIA) e do KIT L com os líquidos
pleurais.
Os líquidos pleurais foram testados quanto á reatividade de IgG, IgM e IgA para os
Ags recombinantes 16 kDa, 38 kDa e ESAT -6 no
PLEIA e para o KIT L comercial.
O
PLEIA foi padronizado com diluições (1:10 a 1:1600) de pools positivo e negativo
de LP de pacientes com PL-TB e controles (PL-NTB), respectivamente. Os Ags foram
diluídos nas concentrações de 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL, 1,5 µg/mL e 2,0 µg/mL. As diluições
realizadas para o conjugado foram de 1:1000 a 1:50.000 para detecção de IgG, M e A. Para
todos os ensaios, a concentração para todos os Ags foi determinada para o
PLEIA em 1,0
µg/mL, a melhor diluição dos LP foi 1:100, e para a detecção de IgG, M e A especifico foram
1:50.000, 1:20.000 e 1:5.000, respectivamente. A figura 10 (Anexo II) mostra um exemplo da
curva da padronização realizada com os antígenos e conjugados diluídos de acordo com as
diluições citadas acima .
Os ensaios
PLEIA mostraram diferenças significativas de reatividade nos PL-TB x
PL-NTB (p<0,05) para todos os Ags testados individualmente. Os maiores valores médios de
DO entre estes grupos foram obtidos com os antígenos ESAT-6-IgA, 16 kDa-IgA e KIT L–
IgG/A (p=0,000; Tabela 11).
72
Tabela 11 – Reatividade média de IgG, IgM e IgA dos líquidos pleurais de pacientes com TB
pleural (PL-TB) e com outras pleurisias não tuberculosa (PL-NTB), utilizando o ensaio
PLEIA para diferentes antígenos recombinantes e com o KIT L.
PL-TB PL-NTB
Ensaios
N Média ± DP N Média ± DP valor
p *
IgG
ESAT-6 82 549 ± 321 33 407 ± 147 0,010
38 kDa 79 461 ± 157 35 326 ±152 0,000
16 kDa 81 616 ± 333 33 433 ± 218 0,008
KIT L 69 1095 ± 393 26 522 ± 320 0,000
IgM
ESAT-6 82 426 ± 203 33 339 ± 191 0,005
38 kDa 79 228 ± 95 35 145 ± 70 0,000
16 kDa 81 551 ± 229 35 405 ± 151 0,000
KIT L 69 483 ± 441 26 229 ± 255 0,000
IgA
ESAT-6 74 1248 ± 430 27 819 ± 342 0,000
38 kDa 79 739 ± 242 33 527 ± 285 0,000
16 kDa 79 1066 ± 389 33 621 ± 353 0,000
KIT L 69 1026 ± 445 26 552 ± 377 0,000
DP: desvio padrão , PLEIA: Ensaio imunoenzimátioco em líquido pleural; * Teste t Mann Witheney
A Figura 11/ Tabela 12 (Anexo II) mostram as médias de DO nos PL-TB e PL-NTB de
acordo com os resultados dos testes bacteriológico e histopatológico usados para auxiliar no
diagnóstico. Os ensaios imunoenzimáticos não mostraram diferença significativa entre as
médias de imunoreatividade obtidas dos PL-TB diagnosticados com cultura
+
x cultura
-
, e com
a presença ou ausência de granuloma compatível com TB no espécime clínico (biópsia),
exceto para o 38kDa-IgM, onde os espécimes com cultura
-
para Mtb e resultado
histopatológico inespecífico apresentaram média de DO mais elevada que aqueles com os
exames positivos (p=0,017).
73
Figura 11 – Distribuição e média de densidade ótica na pleurisia tuberculosa (PL-TB) sub-agrupadas de acordo com os resultados microbiológico (cultura
+
■ e
cultura
-
■) e histopatológico (biópsia
+
■ e biopsia
-
■) e outras pleurisias não tuberculosa (câncer ■ e outras pleurapatias ■), cujos líquidos pleurais foram
ensaiados com
PLEIA e com o KIT L.
Esa
t-
6
38 kD
a
16
kD
a
Kit
L
0
500
1000
1500
2000
2500
IgG (DO x 1000)
Es
at-6
38 kDa
16
k
Da
K
i
t
L
0
500
1000
1500
2000
2500
Esat-6
3
8
kDa
1
6
kDa
K
i
t
L
0
500
1000
1500
2000
2500
E
s
a
t
-
6
3
8 k
D
a
1
6 k
D
a
Kit L
500
1500
2500
3500
IgM (DO x 1000)
Es
at
-
6
38 kDa
16
kDa
K
it
L
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
E
sa
t
-
6
38 kDa
1
6
kD
a
Kit
L
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
* p=0,017
E
s
at-
6
38 k
D
a
16 k
D
a
K
i
t L
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
IgA (DO x 1000)
Esat-6
38 kD
a
16 kD
a
Kit L
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Es
a
t-6
3
8
kDa
16
kDa
Kit L
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
74
74
Assim como na M-TB, a análise da reatividade do grupo PL-TB de acordo com o
status sorológico para o HIV mostrou valores médios de DO maiores no HIV
+
, mas apenas
para a IgG-
PLEIA e todas as Ig no KIT L. Entretanto, diferença significativa só foi observada
para a ESAT-6-IgG (791 ± 444 x 526 ± 318; p=0,038) e KIT L –IgG (1471 ± 489 x 506 ±
325; p = 0,000). Para os PL-NTB/HIV
+
, a análise não pode ser realizada, pois apenas dois
pacientes eram HIV
+
neste grupo (Figura 12).
75
Figura 12 – Distribuição e média de reatividade de líquido pleural de acordo com a sorologia para HIV
(
■ HIV
+
e ■ HIV
-
), ensaiados no PLEIA para os diferentes antígenos e KIT L. Barra curta: médias de
DO.
Pleurisia tuberculosa Pleurisia não tuberculosa
E
S
AT
-
6
38 kDa
16
kD
a
KIT
L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
IgG (DO x 1000)
E
S
A
T-
6
38 k
D
a
16 kDa
Kit L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
ES
A
T-6
3
8 kDa
16 k
D
a
KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
IgM (DO x 1000)
ESAT - 6
3
8 k
D
a
1
6
kDa
KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
E
S
AT -6
38 k
D
a
16 k
D
a
Kit L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
IgA (DO x 1000)
ESAT
-6
38 kDa
1
6
k
Da
KIT L
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
* PL-TB/HIV
+
x PL-TB/HIV
-
: p <0,038
76
A Figura 13 mostra a dispersão das densidades ópticas obtidas no
PLEIA e com o KIT
L nos grupos testados, e na Tabela 13 está registrada a freqüência de positividade. Para os PL-
TB, maior positividade foi encontrada para o KIT L-IgG (43/66) seguido do KIT L-IgM
(32/66) e ESAT-6-IgA (31/74). Estes resultados conferem sensibilidade de 65,1%, 48,5% e
41,9%, correspondendo a uma especificidade >90%, respectivamente. Entre os PL-NTB
menores reatividades foram observadas com o
PLEIA para o 16kDa-IgA (1/33) conferindo ao
teste excelente especificidade (97%), seguidos do 38 kDa-IgG/M (94,3%) e ESAT-6-IgG/M
(94%, respectivamente), porém estes ensaios apresentaram baixa sensibilidade.
Analisando-se a imunoreatividade aos Ags cumulativamente foi observado aumento na
sensibilidade, mas com comprometimento da especificidade. No
PLEIA, para IgA,
combinando as positividades do ESAT-6/16kDa obteve-se sensibilidade levemente aumentada
(44,3%) seguido das combinações 38kDa/16kDa-IgM (55,5%) e 38kDa/16kDa/ESAT-6
(58,5%), e especificidades de 91%, 88,6% e 82,8%, respectivamente (Tabela 13).
77
Figura 13- Distribuição da resposta humoral de líquido pleural de pacientes com tuberculose pleural (PL-TB ) e com outras pleuratias (PL-NTB ) ensaiados
no PLEIA para diferentes antígenos e KIT L Barra curta: média de DO. Barra longa: ponto de corte (
cut off). DO= densidade óptica.
78
Tabela 13 - Sensibilidade e especificidade do PLEIA e KIT L na detecção de IgG, M e A de
liquido pleural (LP). No PLEIA os resultados são mostrados para os antígenos testados
individualmente e os melhores resultados dos Ags analisados cumulativamente.
Número de positivos/Total (%)
Ensaios Cut off Sensibilidade Especificidade
IgG
ESAT - 6 686 13/82 (15,9) 2/34 (94,1)
38 kDa 595 17/79 (21,5) 2/35 (94,3)
16 kDa 738 25/81 (30,9) 4/35 (88,6)
KIT L 969
43/66 (65,1) 2/25 (92,3)
ESAT -6/38 kDa - 25/82 (30,5) 4/35 (88,6)
ESAT -6/16 kDa - 30/82 (36,6) 5/35 (85,7)
38 kDa/16 kDa - 32/81 (39,5) 6/35 (82,8)
38 kDa/16 kDa/ESAT6
- 35//82 (42,7) 7/35 (80)
IgM
ESAT - 6 621 8/82 (9,8) 3/34 (94)
38 kDa 242 27/79 (34,2) 2/35 (94,3)
16 kDa 579 30/81 (37) 3/35 (91,4)
KIT L 371
32/66 (48,5) 2/25 (92,3)
ESAT-6/ 38 kDa - 31/82 (37,8) 5/35 (85,7)
ESAT-6/ 16 kDa - 33/82 (40,2) 5/35 (85,7)
38 kDa/ 16 kDa
- 45/81 (55,5) 4/35 (88,6)
38 kDa/16 kDa/ESAT6
-
48/82 (58,5) 6/35 (82,8)
IgA
ESAT - 6 1316 31/74 (41,9) 2/28 (92,8)
38 kDa 1053 8/79 (10,1) 3/35 (91,4)
16 kDa 1294 18/79 (22,8) 1/33 (97)
KIT L 1205 22/66 (33,3) 2/25 (92,3)
ESAT-6/38 kDa - 31/79 (39,2) 5/35 (85,7)
ESAT-6/16 kDa
-
35/79 (44,3) 3/33 (91)
38 kDa/16 kDa
21/79 (26,6) 4/35 (88,6)
38 kDa/16 kDa/ESAT6
- 37/79(46,8) 6/35 (82,8)
79
A Figura 14 mostra a freqüência de TB-PL respondedores no PLEIA, observa-se
que o reconhecimento de um antígeno é maior que aqueles que reconhecem dois ou três
Ags, principalmente para IgM (73,4%).
Figura 14 - Reatividade de Acs de líquido pleural de pacientes com tuberculose pleural por
número de antígenos. Os resultados mostram a freqüência de positivos a diferentes números
de antígenos entre os que apresentaram densidades óticas maiores que os valores dos
cutoff,
respectivamente para (
■) IgG, (■) IgM e (■) IgA.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
I II III
Nº de Antígenos
% TB-PL Positivos
80
Analisando a freqüência de positividade dos diferentes ensaios quanto ao status
sorológico para HIV, observou-se que a freqüência de positivos entre os PL-TB/HIV
+
é em
geral mais elevada que no HIV
-
ou mesmo similar, principalmente nos testes de detecção de
IgG e IgM. Mas diferença significativa só foi observada para ESAT-6-IgG (p=0,03) (Figura
13 e Tabela 14 no Anexo II).
O KIT L-IgG detectou maior percentual de LP positivos em ambos subgrupos
(HIV
+
= 83,3% e HIV
-
= 66,7%, respectivamente), já o PLEIA detectou um máximo de
55,5% para 16kDa-IgM e ESAT-6/16kDa-IgM, e freqüências similares em ambos os
subgrupos para as combinações 16kDa/38kDa/ESAT-6-IgM (55,5% x 58,9%) e
16kDa/38kDa-IgM (55,5% x 55,5%) (Figura 13/Tabela 14)
.
A detecção de IgA mostrou, em geral, tendência de maior positividade entre os HIV,
exceto para o 16 kDa, 38 kDa e sua combinação, porém nenhum com diferença
estatisticamente significativa (p>0,18) (Figura13). Freqüência de reatividade <18%, entre os
PL-NTB/HIV
-
, foi obtida no PLEIA que apresentarou maior sensibilidade, enquanto o KIT
L apresentou freqüência
8%. O grupo PL-NTB/HIV
+
está representado por apenas dois
espécimes e, portanto, esta variável não pode ser analisada no grupo PL-NTB.
81
Figura 15 - Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido pleural de pacientes
com tuberculose pleural (PL-TB) no
PLEIA e KIT L de acordo com a sorologia para HIV
+
(■) e HIV
–
(■).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ESAT - 6 38 kDa 16 kDa ESAT -
6/38 kDa
ESAT -
6/16 kDa
38 kDa/16
kDa
Todos
Ags
KIT L
% PL-TB IgG positivos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ESAT-6 38 kDa 16 kDa ESAT -
6/38 kDa
ESAT -
6/16 kDa
16 kDa/38
kDa
Todos
Ags
KIT L
% PL-TB IgM positivos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ESAT-6 38 kDa 16 kDa ESAT -6
/38 kDa
ESAT -6
/16 kDa
38kDa
/16kDa
Todos
Ags
KIT L
% PL-TB IgA positivos
* Teste do
2
,
*
p=0,03
82
Comparando a sensibilidade dos testes com os exames laboratoriais convencionais
para o diagnóstico da PL-TB observou-se que tanto o
PLEIA como o KIT L não foram
capazes de detectar todos os casos positivos de cultura e/ou biopsia (Tabela 15A). Mas o
KIT L-IgG foi o único a identificar homogeneamente, >60% dos casos com diagnóstico
microbiológico ou histopatológico positivo ou negativo. Similar resultado no
PLEIA foi
obtido heterogeneamente, isto é, nos espécimes PL-TB cultura
+
os ensaios com IgA-ESAT-
6 detectaram 66,7%, seguido da combinação ESAT-6/16kDa (54,5%) e ESAT-
6/16kDa/38kDa ou ESAT-6/38kDa (50%). Nos espécimes cultura
-
e histopatologia positiva,
os ensaios para IgM para a combinação 38kDa/16kDa ou 38kDa/16kDa/ESAT-6 detectaram
60% dos casos. Já os PL-TB com exame histopatológico inespecífico apresentaram
imunoreatividade
50% no PLEIA IgA para as combinações ESAT-6/16 kDa (52,4%) e
ESAT-/16 kDa/38 kDa (50%) (Tabela 15).
No grupo PL-NTB, os espécimes de pacientes com câncer, em geral, foram mais
reativos que os pacientes com outras pleuropatias não tuberculosas. O percentual de
reatividade neste grupo foi <20% no PLEIA e < 10% no KIT L (Tabela 15).
Em análise de variância para fatores associados à positividade nos PL-TB para os
diferentes ensaios, observou-se que ser do sexo masculino favorece a positividade nos testes
para 38 kDa-IgG, mas a reatividade diminui quando combinado com o 16 kDa. As chances
de positividade também diminui para o 38 kDa-IgA nos espécimes cultura
+
, enquanto os PL-
TB co-infectados pelo HIV têm maior chance de serem reconhecidos pelo ESAT-6-IgG
(Tabela 16).
83
Tabela 15 - Imunoreatividade do PLEIA, com os Ags testados individualmente e os
melhores resultados dos Ag combinados e KIT L na pleurisia tuberculosa (PL-TB) e outras
pleurisias (PL-NTB) de acordo com os resultados laboratoriais (cultura e exame
histopatológico)
Numero de positivos/ total (%)
TBPL N TBPL
Cultura Histopatologia
Ensaios
Positiva Negativa positiva inespecifica
1
Câncer
2
OP
3
IgG
ESAT-6 3/11 (27,3) 10/71(14,1) 10/60 (16,6) 5/25 (20) 2/19 (10,5) 0/15 (0)
38 kDa 4/12 (33,3) 13/67 (19) 12/59 (20) 6/22 (27,3) 2/20 (10) 0/15 (0)
16 kDa 2/11 (18) 22/70 (31) 19/60 (31) 7/25 (28) 2//20 (10) 1/15 (6,7)
KIT L 6/9 (66,7) 37/58(63,8) 31/48 (64,6) 13/19 (68,4) 1/11 (9,9) 2/14 (14,3)
IgM
ESAT-6 2/11 (18) 6/71 (8,5) 5/60 (8,3) 3/25 (12) 1/19 (5,2) 2/15 (13,3)
38 kDa 1/12 (8,3) 26/67 (38,8) 19/59 (32) 10/22 (45,4) 1/20 (5) 1/15 (6,6)
16 kDa 2/11 (18) 28/70 (40) 20/60 (33) 13/24 (54,2) 2/20 (10) 0/15 (0)
KIT L 4/9 (44,4) 28/58 (47,5) 23/48 (47,9) 10/19 (52,6) 0/11 (0) 2/14 (14,3)
ESAT -6/16 kDa 3/12 (25) 42/70 (60) 34/60(56,7) 10/22 (45,4) 3/20 (15) 1/15 (6,6)
ESAT-6/16/38 kDa 5/12 (41,7) 42/70(60) 36/60 (60) 12/25 (48) 3/18 (16,6) 3/15 (20)
IgA
ESAT-6 6/9 (66,7) 25/65 (38,5) 22/54 (41) 10/22 (45,4) 1/14 (7,1) 1/14 (7,1)
38 kDa 0/12 (0) 9/67 (13,4) 4/59 (6,8) 5/22 (22,7) 3/19 (15,8) 0/16(0)
16 kDa 1/11 (9,9) 17/68 (25) 11/58 (19) 8/24 (33,3) 1/18 (9,4) 0/15 (0)
KIT L 3/9 (33,3) 19/58 (32,7) 26/48 (54,1) 10/18 (55,5) 1/11 (9,9) 1/14 (7,1)
ESAT -6/38 kDa 6/12 (50) 26/69 (38) 23/60 (38,3) 9/20 (45) 2/18 (11,1) 1/16 (6,2)
ESAT -6/16 kDa 6/11 (54,5) 30/69 (43,5) 25/59 (42,4) 11/21 (52,4) 4/19 (21) 0/16 (0)
ESAT-6/16/38 kDa 6/12 (50) 31/69(45) 25/60 (41,7) 12/24 (50) 5/19 (26,3) 1/16 (6,2)
84
Tabela 16 – Análises de biovariância de fatores associados com a resposta humoral positiva
no
PLEIA e KIT L em 85 pacientes com tuberculose pleural.
Cultura positiva Masculino HIV +
IgG
ESAT-6 2,288 (0,52-10,11) 0,492 (0,06-4,23) 6,800(1,42-32,47)
38 kDa 2,077 (0,54-7,97) 3,889 (1,02-14,86) 1,000(0,18-5,43)
16 kDa 0,818 (0,2-3,38) 2,550 (0,67-9,77) 1,500 (0,33-6,80)
Kit 1,514 (0,36-6,33) 1,077 (0,24-4,75) 2,903(0,31-26,84)
ESAT -6/38 kDa
0,549 (0,16-1,93) 0,549 (0,16-1,93) 1,788(0,42-7,41)
ESAT -6/16 kDa
0,667 (0,18-2,40) 0,543 (0,14-2,06) 1,689(0,40-7,05)
38kDa/16 kDa
0,753 (0,21-2,71)
0,233 (0,05-0,98) 0,833(0,19-3,69)
ESAT-6/38/16kDa 0,976 (0,28-3,37) 0,465 (0,13-1,61) 1,110 (0,27-4,47)
IgM
ESAT-6 2,407(0,42-13,79) 4,950(0,99-24,76) 0,850(0,76-0,94)
38 kDa 0,143(0,02-1,19) 1,742(0,48-6,34) 0,649(0,12-3,53)
16 kDa 0,333(0,07-1,66) 1,154(0,3-4,47) 2,250(0,54-9,35)
Kit 0,778(0,21-2,83) 1,250(0,31-5,11) 2,667(0,44-15,96)
ESAT -6/38 kDa
2,154(0,53-8,68) 0,484(0,13-1,75) 0,556(0,10-3,01)
ESAT -6/16 kDa
1,238(0,33-4,62) 1,036(0,27-4,00) 1,932(0,47-7,99)
38kDa/16 kDa
4,000(0,97-16,39) 0,494(0,12-2,06) 1,083(0,26-4,46)
ESAT-6/38/16kDa 0,465 (0,13-1,61) 0,976 (0,28-3,37) 0,910 (0,22-3,63)
IgA
ESAT-6 3,200(0,73-13,96) 0,469(0,11-1,93) 0,583 (0,1-3,47)
38 kDa
0,831(0,75-0,92) 2,296(0,4-13,17) 2,778(0,45-16,98)
16 kDa 0,300(0,04-2,52) 0,300 (0,04-2,52) 2,150(0,45-10,31)
Kit 1,173(0,31-4,50) 1,000(0,23-4,42) 3,765(0,62-22,69)
ESAT -6/38 kDa
0,605(0,18-2,08) 1,167(0,31-4,36) 0,427(0,08-2,30)
ESAT -6/16 kDa
0,604(0,19-2,17) 4,125(0,83-20,5) 0,696 (0,15-3,18)
38kDa/16 kDa
4,167(0,50-34,74) 1,745(0,34-8,83) 1,600 (0,34-7,53)
ESAT-6/38/16kDa
1,233 (0,39-4,50) 1,692 (0,47-6,13) 0,603 (0,14-2,59)
85
6.3. Resultados dos ensaios imunoenzimático “in house” (PulmEIA) e do KIT L com soro
Os resultados do PulmEIA aqui descritos são resultante de uma estreita cooperação
entre profissionais de clínica médica e pesquisa. Pacientes atendidos na demanda espontânea
do CMSHB, tiveram os soros testados, utilizando
PulmEIA, quanto a reatividade de IgG
para todos os Ags recombinantes propostos. Adicionalmente, os soros foram ensaiados com
os KITs comerciais L para IgG, IgM e IgA.
Um total de 201 pacientes atendeu aos critérios de inclusão propostos, sendo dividido
em quatro grupos: P-TB com 61 pacientes (30,3%), PS-TB com 28 pacientes (13,9%) e 54
pacientes PPD
+
(26,8%) e 58 (28,8%) PPD
-
com outras sintomatologias respiratórias ou
contato com pacientes com TB. Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos
relacionadas às características clínicas, laboratoriais e demográficas dos pacientes, exceto
para predominância do sexo masculino, tratamento anterior e PPD > 10mm entre os
diagnosticados com TB. Imagens radiográficas normais ou com poucas alterações
predominaram nos pacientes com outras pneumopatias, enquanto as dos pacientes com TB
mostraram alterações intermediárias ou extensivas (de alta probabilidade para TB) (Tabela
17).
Os pacientes agrupados com pneumopatia confirmada ou suspeita de TB possuíam a
forma pulmonar, exceto um paciente que foi diagnosticado com TB oftálmica (44,28%,
89/201). O grupo controle, agrupado quanto ao resultado do TTC, apresentava outras
patologias pulmonares (56,7%, 114/201), e foi assim constituído: 42 pacientes com outras
doenças infecciosas, 19 com asma ou bronquiectasia, 6 com doença pulmonar obstrutiva
crônica (DPOC) ou pneumonias, 22 contatos de pacientes com TB e 3, com câncer ou lupus
86
eritematoso sistêmico. Estes pacientes apresentaram características clínicas e demográficas
similares. Pacientes com cicatriz da BCG, alcoolistas e fumantes não mostraram diferença
estatisticamente significativa entre todos os grupos, embora para uso de álcool significância
borderline (0,060) tenha sido observada para P-TB. A idade média dos grupos foi similar,
variando de 18 a 83 anos, não diferindo na freqüência de pacientes (p=0,258). Entre os
pacientes P-TB predominaram os do sexo masculino (p=0,02), teste cutâneo a tuberculina
foi negativo em menos de 14%, espécime clínico BAAR negativo foi observado em 11,5% e
60,7% tiveram cultura
-
ou não realizada. Imagens radiográficas normais ou com poucas
alterações predominaram nos pacientes com outras pneumopatias, enquanto as dos pacientes
com TBpul mostraram frequentemente aquelas com alterações intermediárias ou extensivas
(de alta probabilidade para TB) (Tabela 17).
87
Tabela 17- Características clínicas, laboratoriais e demográficas dos 201 pacientes incluídos
no estudo
N° (%)
Características P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
P valor
+
Nº 61 28 54 58
Idade ≥ 44 anos 32(52,4) 10(35,7) 27(50) 33(56,8) 0,258
Masculino 43 (68,8)
*
23 (82,1)
*
26(48,1) 28(48,3) 0,020
Consumo de álcool 21(34,4) 13(46,4) 11(20,4) 14(24,1) 0,060
Tabagismo 22(36) 8(28,6) 16(29,6) 18(31) 0.856
Contato com TB
24(39,3) 8(28,6) 30(55,5) 20(34,5) 0.060
Tratamento anti-TB 13 (21,3)
*
5(17,8) 27(50) NA <0.001
BCG 24(39,3) 16(57,1) 27(50) 28(48,3) 0.421
PPD:
>10mm
46 (75,4)
*
19(67,9) 54(100) NA <0.001
5 - 9 mm
15(24,6) 9(32,1) NA 20(34,5) NR
Baciloscopia
BAAR Positivo 49(80,3) NR NA NA NR
Cultura para
M.tuberculosis
Positiva 25(41) NR NA NA NR
Negativa 6 (9,8) 6(21,6) 36(66,6) 44(75,8) NR
Radiografia do tórax para TB
Baixa probabilidade 8 (13,1) 7 (25) 51(94,4)
*
56(96,5)
*
<0.0017
Intermediário 13 (21,3)
*
9 (32,1)
*
2(3,7) 2(3,4) <0.001
Alta probabilidade 40 (65,6)
*
12 (42,9)
*
1(1,8) 0 (0) <0.001
P-TB= pacientes com TB confirmada; PS-TB= suspeita de TB; PPD
+
e PPD
-
= teste tuberculinico positivo
e negativo. BCG: Bacillus Calmette-Guerin
Teste χ
2
:
+
Teste Kruskal Wallis, * Teste Mann Whitney
(p<0,002); NA= não se aplica. NR = não realizado.
88
Após padronização do PulmEIA, a qual foi feita com diluições (1:200 a 1:10.000)
de
pools positivo e negativo de soros de pacientes com P-TB e controle (PPD
-
),
respectivamente. Os Ags foram diluídos nas concentrações de 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL, 1,5
µg/mL e 2,0 µg/mL. As diluições realizadas para o conjugado foram de 1:600 a 1:4.000 para
detecção de IgG. Para todos os ensaios, a concentração para todos os Ags foi determinada
para o
PulmEIA em 1,0 µg/mL, exceto para 16 kDa (0,5 µg/mL); a melhor diluição dos
soros foi 1:400, exceto para 16 kDa (1:800) e anti–IgG específica foi 1: 2.000 para todos os
Ags. A figura 16 (Anexo II) mostra um exemplo da curva da padronização realizada com os
antígenos e conjugados diluídos de acordo às diluições citadas acima.
Na Tabela 18 observa-se que as médias de reatividades obtidas no
PulmEIA e KIT L
foram significativamente diferentes nos grupos de pacientes, exceto para 16 kDa, ESAT-6 e
KIT L-IgM (p>0,071). A análise entre os grupos mostrou que as diferenças ocorriam entre
os soros de pacientes P-TB x PPD
+/-
(p<0,049) para todos os ensaios, exceto para o KIT L-
IgM (p>0,440), e para PS-TB x PPD
-
para o 38 kDa (p=0,028). Entre os controles não
houve diferença nas médias de DO. A Figura 17 mostra a dispersão das DOs individuais de
cada ensaio.
89
Tabela 18 – Reatividade média de IgG dos soros de pacientes com TB pulmonar (P-TB),
com suspeita de TB (PS-TB), controles PPD positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
), utilizando
o ensaio
PulmEIA para diferentes antígenos recombinantes e com os KITs L.
P-TB (N= 61) PS-TB (N= 28) PPD
+
(N= 54) PPD
-
(N= 58)
Ensaios
± DP
b
± DP
b c
± DP
c
± DP
p
1
valor
MPT-64 557 ± 295 454 ± 200 379 ± 200 436 ± 245 0.009
MT-10.3 531 ± 274 422 ± 175 398 ± 197 425 ± 196 0.033
38 kDa
810 ± 385
749 ± 293
*
615 ± 242 610 ± 310
*
0.003
16 kDa 516 ± 216 486 ± 189 426 ± 178 442 ± 208 0.071
ESAT-6 599 ± 309 529 ± 209 459 ± 191 483 ± 223 0.096
KIT L-IgG
(N= 60)
1003 ± 317
(N= 25)
906 ± 341
(N= 50)
803 ± 294
(N= 38)
766 ± 259 0,000
KIT L-IgM
a
234 ± 135 220 ± 126 235 ± 101 223 ± 140 0,558
KIT L -IgA 902 ± 374 833 ± 390 670 ± 319 669 ± 288 0,001
= média; DP = desvio padrão; PPD= teste tuberculínico.
1
2
(teste de Kruskal Wallis).
2
(teste de Mann Whitney):
*
p=0,028,
a
p>0,440,
b
p>0,101,
c
p>0,228
90
Figura 17– Distribuição da resposta humoral para A) PulmEIA-IgG e B) KIT L IgG, IgM e IgA, nos soros de pacientes com tuberculose
pulmonar (
), suspeita de tuberculose pulmonar (▲) e em controles com teste tuberculinico positivo () e negativo (■). Barra curta: média de
DO. Barra longa: ponto de corte (
cut off)
91
A análise da reatividade dos Acs de acordo com o consumo de álcool mostrou que,
em geral, os soros dos alcoolistas foram em média mais reativos que os de não consumidores
de bebida alcoólica, mas diferença estatisticamente significativa foi encontrada no grupo P-
TB para os Ags 38 kDa (p=0,030) e MPT-64 (p=0,014), e no grupo PPD
+
para ESAT-6
(p=0,037) e MT-10.3 (p=0,022). Não foi observada diferença na reatividade média nos soros
de PS-TB e no controle PPD
-
(Figura 18).
92
Figura 18 – Distribuição e média de reatividade de
PulmEIA e KIT L nos soros de pacientes com
tuberculose pulmonar (P-TB), suspeito de PTB (PS-TB), controles teste tuberculinico positivo
(PPD
+
) e negativo (PPD
-
) de acordo com o consumo de álcool (consumidores ■ e não
consumidores
■). Os dados representam as densidades ópticas (DO) de cada soro para os
diferentes antígenos. * diferença estatística (p<0,05).
P-TB PS-TB
PPD
+
PPD
–
93
Considerando os indivíduos com e sem hábito de fumar se observou que, em geral, os
soros de P-TB eram em média mais imunoreativos nos não fumantes, embora diferença
significativa tenha sido encontrada apenas para os Ags MPT-64 (p=0,009) e ESAT-6 (p=0,026).
Nos controles, os fumantes mostraram média de imunoreatividade ligeiramente mais elevada
que os não fumantes, mas sem significância estatística (Figura 19).
94
Figura 19 - Distribuição da reatividade de
PulmEIA e KIT L de soro de tuberculose pulmonar
(P-TB), suspeita de P-TB (PS-TB), controles teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo
(PPD
-
) de acordo com o hábito tabagista (fumante ■ e não fumante ■). Os dados representam as
densidades ópticas (DO) de cada soro para os diferentes antígenos.
* p< 0,026:
P-TB PS-TB
PPD
+
PPD
-
95
Para as variáveis sexo, cultura e baciloscopia não foram encontradas diferenças
significativas entre as médias de reatividades nos diferentes ensaios, exceto para P-TB
vacinados com BCG testados para 16 kDa e KIT L-IgM (p<0,045) (Figura 20).
96
Figura 20 –Distribuição e média de reatividade de PulmEIA e KIT L nos soros de tuberculose
pulmonar (P-TB), suspeita de P-TB (PS-TB), controles teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo
(PPD
-
) de acordo com cicatriz da BCG (com ■ e sem cicatriz ■). Os dados representam as densidades
ópticas (DO) de cada soro para os diferentes antígenos.; * p< 0,045:
P-TB PS-TB
PPD
+
PPD
-
A radiografia do tórax (Raio X) mostra que para os diferentes Ags testados e para os
KITs L não houve diferença estatisticamente significativa das médias de DO obtidas nos
grupos em relação a extensão da lesão pulmonar, exceto no KIT L-IgG. As médias de DO
97
mostraram maior reatividade de Acs nos soros de pacientes P-TB apresentando lesões
pulmonares extensas (p=0,01) e intermediárias (p=0,043)
versus imagens incipientes ou sem
lesão (Tabela 19).
Tabela 19 – Reatividade média ( desvio padrão) de IgG dos soros de pacientes com TB pulmonar (P-
TB), com suspeita de TB (PS-TB), utilizando o ensaio
PulmEIA para diferentes antígenos
recombinantes e com os KIT
s L de acordo com a radiografia do tórax.
P-TB PS-TB
Ensaios Normal Intermediária Extensa Normal Intermediária Extensa
MPT-64
565
292 553 269 557 311 397 170 442 226 496 202
MT-10.3
534
234 484 249 545 292 345 121 418 197 469 182
38 kDa
730
271 801 406 830 403 653 245 701 302 841 308
16 kDa
519
97 463 176 533 244 410 193 486 178 530 196
ESAT-6
474
162 601 313 623 329 486 143 574 232 521 232
KIT L-IgG
742
230 1046 341
*
1042 306
**
773 82 820 267 1041 435
KIT L-IgM
157
93 274 201 237 111 220 88 187 96 243 163
KIT L -IgA
706
244 996 425 911 371 704 368 883 419 868 402
*
p=0,043;
**
p=0,010. Normal: nenhuma ou poucas sugestivo de outras pneumopatias, intermediária: infiltrados,
extensa: infiltrados e ou cavidades
A freqüência de soros positivos no PulmEIA foi maior para os grupos P-TB (36,1%)
e PS-TB (28,6%) para o Ag 38 kDa, seguidos do KIT L-IgM (33,3% e 20%) e KIT L-IgG
(26,7% e 24%). Para os Ags MPT-64, ESAT-6 e MT-10.3 similar positividade foi obtidas
apenas no grupo P-TB (22,9% a 26,2%). A positividade obtida para o 16 kDa para ambos os
grupos foi <20%. Nos soros controles PPD
+
e PPD
-
, positividade 10% foi encontrada para
98
ambos os ensaios, sendo o ESAT-6 e MT-10.3 os que menos ofereceram reatividade cruzada
para o grupo PPD
+
(3,7%) e os KITs L-IgM/A para o grupo PPD
-
(5,3%) (Figura 21).
Igualmente às médias de reatividade, os percentuais de positividade não mostraram diferença
significativa entre os grupos P-TB x PS-TB e PPD
+
x PPD
-
. Nos grupos P-TB x PPD
+/-
,
similarmente as médias de reatividade, os percentuais de positividade não mostraram
diferença para KIT L-IgM, e para o Ag 16 kDa, sendo portanto menos reconhecidos pelos P-
TB. Já nos grupos PS-TB x PPD
+/-
os percentuais de positividade diferiu para o Ag 38kDa,
sendo, portanto, os P-TB e PS-TB mais reativos a este Ag.
Quando analisados os resultados cumulativos obtidos com os diferentes Ags,
observou-se que houve um aumento de positividade (7,4% a 22,4%) nos grupos controles
PPD
+
e PPD
-
e, na maioria das combinações, o grupo PPD
-
foi mais reativo (10,3% a 22,4%)
que o grupo PPD
+
(7,4% a 18,5%), mas isto não foi observado nos KITs (5,3% a 7,9% x 8% a
10%, respectivamente). Aumento de positividade também foi obtido entre os TB, quanto
maior o número de Ags combinados maior o percentual de soros reatores. E diferentemente
dos resultados com os Ags testados individualmente, foi observada diferença significativa no
percentual de positividade entre os PS-TB x PPD
+/-
nas combinações envolvendo
principalmente os Ags MPT-64, 38 kDa e 16 kDa ou combinados ao ESAT-6 e MT-10.3 (p<
0,048) (Figura 21 e Tabela 20 no Anexo II). Portanto estes Ags combinados auxiliam no
melhor reconhecimento não só dos P-TB, mas também dos PS-TB.
99
Figura 21 – Freqüência de soros positivos dos grupos TB pulmonar (P-TB■), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB■) e dos controles com
teste tuberculinico positivo (PPD
+
■) e negativo (PPD
-
■) ensaiados no PulmEIA e KITs L e os resultados combinados de 2 Ags, 3 Ags e 4 Ags.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
M
P
T
–
6
4
M
T
-
1
0
.
3
3
8
k
D
a
1
6
k
D
a
E
S
A
T
-
6
K
I
T
L
-
I
g
G
K
I
T
L
-
I
g
M
K
I
T
L
-
I
g
A
% de reativos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
M
P
T
-
6
4
/
M
T
1
0
.
3
M
P
T
-
6
4
/
3
8
k
D
a
M
P
T
-
6
4
/
1
6
k
D
a
M
P
T
-
6
4
/
E
S
A
T
-
6
M
T
-
1
0
.
3
/
3
8
k
D
a
M
T
-
1
0
.
3
/
1
6
k
D
a
M
T
-
1
0
.
3
/
E
S
A
T
-
6
3
8
k
D
a
/
1
6
k
D
a
3
8
k
D
a
/
E
S
A
T
-
6
1
6
k
D
a
/
E
S
A
T
-
6
Diferença significativa : para todos os ensaios P-TB x PPD+/- (p<0,023), Diferença significativa : para todos os ensaios P-TB x PPD
+/ -
( p<0,05) ; * P-TB x PS-TB
exceto (p > 0,406). * PS-TB x PPD+/- (p< 0,016) (p<0,05); ** PS-TB x PPD+/(p<0,05)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
M
PT
-6
4 /M
T
-10.3
/
38kD
a
MP
T
-64/
M
T-10
.3
/ 16
kD
a
MPT
-6
4/MT-10.3
/E
SAT
-
6
MPT-64
/ 38 k
D
a / 1
6
kDa
MP
T-
64 /
3
8 kD
a
/ ES
AT
-6
M
PT-6
4
/ 16
k
Da /
E
SAT
-6
M
T
-10.3
/
38 k
D
a / 16
k
Da
MT-
1
0.3 / 38 kDa / ESAT-6
M
T-
10.
3 / 1
6
kDa
/
ESA
T-
6
3
8 kD
a
/ 16
kD
a / E
S
AT-
6
% de reativos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
MP
T-
6
4
/
MT-10
.
3/
1
6/38
MPT-64/M
T
-10.3/16/
E
SAT-6
MP
T
-64/MT-
1
0.3/3
8
/ESAT
-
6
M
P
T
-
6
4/38
/1
6/ES
AT
-
6
MT-10
.
3/
1
6/38/
ES
AT-6
Todos
o
s
An
t
ígeno
s
Diferença significativa: para todos os ensaios P-TB x PPD
+/ -
( p<0,05); * PS-TB x PPD
+/ -
(p< 0,048) Diferença significativa: para todos os ensaios P-TB x PPD
+/ -
( p<0,05); * PS-TB x PPD
–
( p= 0,02); ** P-TB x PPD
+
(p=0,019)
100
O percentual de positividade nos ensaios entre os TB/alcoolistas (Al) foi maior
daqueles não alcoolistas (N-Al). Porém, a diferença significativa só foi evidenciada em
P-TB para MPT-64 (47,6% x 15%, p=0,006) e MT-10.3 (42,9% x 15%, p=0,042), e o
KIT L-IgA (52,4% x 23,1%, p=0,022). O
PulmEIA 38 kDa também detectou 52,4%
dos P-TB/Al, porém sem diferença estatística para o subgrupo P-TB/N-Al (27,5%). Não
houve diferença no percentual de positivos entre os controles alcoolistas e não
alcoolistas (Figura 22/Tabela 21, Anexo III). Em análise de variância os TB/Al
apresentaram maior chance de possuírem Acs para os Ags MPT-64, MT-10.3, 38 kDa, e
KIT L IgG e IgA (Tabela 28).
Os resultados combinados dos Ags resultaram em um aumento no percentual de
soros positivos em todos os grupos, mas mantendo maior positividade entre os
alcoolistas tanto no grupo P-TB (38,1% a 62% x 22,5% a 35%) como no grupo PS-TB
(23,1% a 61,5%). No grupo P-TB as combinações entre MPT-64, ESAT-6 e 38 kDa ou
combinados ao MT-10.3 ou 16 kDa mostraram diferença significativa de positividade
em relação aos não alcoolistas (p<0,041). Para o PS-TB as combinações mais relevantes
foram obtidas com os Ags MPT-64, MT-10.3 e ESAT-6, combinados entre si e
adicionalmente ao 16 kDa (p<0,025) (Figura 19/Tabela 22, Anexo III).
Em análise de biovariância os TB/Al foram passíveis de apresentarem resposta
positivas para todas as combinações exceto para aquela envolvendo o MT-10.3/16 kDa
e ou 38 kDa (Tabela 28)
101
Figura 22 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar, suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste tuberculinico
positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados usando dois Ags, três Ags e quatro Ags de acordo com o
consumo de álcool (Al=consumidor, N-Al=não consumidor)
0
10
20
30
40
50
60
Al N-Al Al N-Al Al N-Al Al N-Al
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT-64
MT-10.3
38 kDa
16 kDa
ESAT-6
KIT L- IgG
KIT L-IgM
KIT L-IgA
0
10
20
30
40
50
60
Al N-Al Al N-Al Al N-Al Al N-Al
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3
MPT-64/38 kDa
MPT-64/16 kDa
MPT-64/ ESAT-6
MT-10.3/38 kDa
MT-10.3/16 kDa
MT-10.3/ESAT-6
38 kDa/16 kDa
38 kDa/ ESAT-6
16 kDa/ ESAT-6
* p< 0,043 * p < 0,024 ** p< 0,023
0
10
20
30
40
50
60
70
Al N-Al Al N-Al Al N-Al Al N-Al
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT-64/MT-10.3/16kDa
MPT-64/MT-10.3/38kDa
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
MPT-64/38 kDa/16kDa
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
MT-10.3/38 kDa/16kDa
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
0
10
20
30
40
50
60
70
Al N-Al Al N-Al Al N-Al Al N-Al
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3/16kDa/38kDa
MPT-64/MT-10.3/16kDa/ESAT-6
MPT-64/MT-10.3/38kDa/ESAT-6
MPT-64/38kDa/16kDa/ESAT-6
MT-10.3/16kDa/38kDa /ESAT-6
Todos os Antígenos
* p< 0,041 ** p< 0,025 * p<0,046 ** p= 0,025
102
Analisando o percentual dos soros positivos de acordo com o tabagismo, foi
observado que o grupo P-TB/não fumante (N-Ta) possuía maior reatividade de Ac. Com
os Ags testados individualmente, diferença significativa foi observada apenas para os
Ags 38 kDa (62,5% x 26,6%) e MPT-64 (62,5% x 13,3%) (p<0,011). Nos KITs, a
positividade dos soros não diferiu entre os fumantes (Ta) e N-Ta (p>0,181) (Figura 23/
Tabela 22, Anexo III). No grupo PS-TB, a tendência da maior positividade entre os N-
Ta (0% a 22,2% x 0% 18,7%) se manteve, exceto para o
PulmEIA 38 kDa (31,6% x
22,2%) e o KIT L-IgG/M (11,1% x 31,2% / 0% x 12,5%), porém sem significância
estatística, exceto para o MT-10.3 (p=0,036). No grupo controle, embora tenha ocorrido
o inverso, isto é, os N-Ta mostrando, em geral, menor positividade (0% a 13% x 3,6% a
18,5%), exceto para ESAT-6 e KIT L –IgM, não houve diferença significativa nestes
subgrupos (Figura 23 / Tabela 22 no Anexo III).
A Figura 23 /Tabela 22 (Anexo III) mostram os resultados da positividade
combinada dos Ags testados, e como observado anteriormente houve aumento da
reatividade em todos os grupos analisados, mantendo maior positividade entre os soros
de N-Ta com diferença estatística significativa em todas as combinações para P-TB
(50% a 75% x 20% a 33,3%, p<0,029), exceto para 16 kDa/ESAT-6 (p=0,060). Por
outro lado, embora os soros dos Ta mostraram maior reatividade, dos grupos PS-TB
(5,3% a 47,3% x 22,2% a 33,3%) e controle PPD
+
(7,1% a 25% x 0% a 11,5%), não
houve diferença significativa, exceto para MPT-64/MT-10.3 para PPD
+
(p=0,047).
Positividade similar nestes subgrupos para PPD
-
foi obtida. As combinações mais
relevantes foram obtidas com a inclusão dos MPT-64, 38 kDa e 16 kDa. Em análise de
biovariança os tabagistas mostraram menos chance de produzirem Ac para o MPT-64,
MT-10.3 e para diferentes combinações de Ags citados acima (Tabela 28).
103
Figura 23- Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste
tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no PulmEIA e KITs L e os resultados combinados de dois Ags, três Ags e quatro Ags de acordo
com o hábito do tabagismo (Ta= tabagista, N-Ta = não tabagista)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT- 64
MT-10.3
38 kDa
16 kDa
ESAT- 6
KIT L - IgG
KIT L - IgM
KIT L - IgA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3
MPT-64/38 kDa
MPT-64/16 kDa
MPT-64/ ESAT-6
MT-10.3/38 kDa
MT-10.3/16 kDa
MT-10.3/ESAT-6
38 kDa/16 kDa
38 kDa/ ESAT-6
16 kDa/ ESAT-6
* p< 0,036 Diferença significativa grupo P-TB: N-Ta x Ta, p<0,019, exceto 16/ESAT-6 (p=0,060 )
*PPD
+
: Ta x N-Ta , p=0,047
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT-64/MT-10.3/16kDa
MPT-64/MT-10.3/38kDa
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
MPT-64/38 kDa/16kDa
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
MT-10.3/38 kDa/16kDa
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta Ta N-Ta
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3/16kDa/38kDa
MPT64/MT10.3/16kDa/ESAT-6
MPT-64/MT-10.3/38kDa/ESAT-6
MPT-64/38kDa /16kDa/ESAT-6
MT-10.3/16kDa/38kda/ESAT-6
Todos os Antígenos
Diferença significativa grupo P-TB: N-Ta x Ta, p<0,029 Diferença significativa grupo P-TB: N-Ta x Ta, p<0,015
104
A análise da freqüência da positividade dos soros dos pacientes TB subdivididos
quanto ao gênero, mostrou que o percentual de reativos foram similares embora haja
tendência de maior positividade com soros de pacientes do sexo masculino,
principalmente para o Ag 38 kDa (34,8% a 39,5%, p>0,158), mas sem diferença
significativa. Entre os controles, a tendência da maior positividade foi observada nos
soros de pacientes do sexo feminino, mas também sem diferença significativa, exceto
para MPT-64 entre os PPD
-
(p=0,047) e 16 kDa para os PPD
+
, nos soros de indivíduos
do sexo masculino (p=0,033) (Figura 24 A/Tabela 23, Anexo III).
Os resultados da positividade combinada dos Ags testados confirmam a tendência de
maior positividade com os soros dos pacientes do sexo masculino TB (34,9% a 51,1% x
22,2% a 27,8%, p>0,132) e PPD
+
(7,7% x 23,1% x 7,1% a 14,3%, p>0,138), porém sem
diferença significativa, exceto para as combinações do MPT-64/38kDa/16kDa, e
acrescida do ESAT-6 ou MT-10.3 no grupo PS-TB (p=0,036). O grupo PPD
-
, ao
contrário, apresentou maior positividade entre aqueles do sexo feminino (10% a 33,3%
x 3,6% a 10,7%), mas diferença significativa foi obtida para os Ags 38 kDa, 16 kDa e
ESAT-6 combinados entre si (p=0,03), três a três incluindo o MPT-64 (p<0,016) e para
todos os Ags (p=0,041). Em análise de biovariância se observou que os pacientes do
sexo masculino tinham mais chance de apresentarem Ac reativos às combinações
envolvendo os Ags 38kDa/16kDa e estes acrescido do MPT-64 e/ou MT-10.3/ESAT-6
(Tabela 28).
105
Figura 24 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste
tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados de acordo com o gênero dos pacientes (Fem
= feminino, Masc = masculino).
0
10
20
30
40
50
60
Fem Masc Fem Masc Fem Masc Fem Masc
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT- 64
MT-10.3
38 kDa
16 kDa
ESAT- 6
KIT L - IgG
KIT L - IgM
KIT L - IgA
0
10
20
30
40
50
60
Fem Masc Fem Masc Fem Masc Fem Masc
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3
MPT-64/38 kDa
MPT-64/16 kDa
MPT-64/ ESAT-6
MT-10.3/38 kDa
MT-10.3/16 kDa
MT-10.3/ESAT-6
38 kDa/16 kDa
38 kDa/ ESAT-6
16 kDa/ ESAT-6
* p= 0,033 (PPD
+
/fem x masc), ** p= 0,047(PPD
-
/fem x masc) * p=0,031 (PPD
-
/fem x masc)
0
10
20
30
40
50
60
Fem Masc Fem Masc Fem Masc Fem Masc
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
% de reativos
MPT-64/MT-10.3/16kDa
MPT-64/MT-10.3/38kDa
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
MPT-64/38 kDa/16kDa
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
MT-10.3/38 kDa/16kDa
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
0
10
20
30
40
50
60
Fem Masc Fem Masc Fem Masc Fem Masc
P-TB PS-TB PPD+ PPD-
MPT-64/MT-10.3/16kDa/38kDa
MPT64/MT10.3/16kDa/ESAT-6
MPT-64/MT-10.3/38kDa/ESAT-6
MPT-64/38kDa /16kDa/ESAT-6
MT-10.3/16kDa/38kDa/ESAT-6
Todos os Antígenos
** p<0,016 (PPD
-
/fem x masc). p< 0,036 *PS-TB Masc x Fem, ** (PPD
-
/fem x masc)
106
Os resultados da Figura 25 (Tabela 24, Anexo III) mostram que de acordo com a
bacterioscopia dos espécimes clínicos os P-TB/BAAR
–
e BAAR
+
foram mais
respondedores ao KIT L-IgA (50%) e
PulmEIA 38 kDa (40,8%), respectivamente.
Entre os PS-TB (BAAR
–
) apenas os Ags 38 kDa, 16 kDa e KIT L-IgA identificaram >
20%.
Os resultados combinados dos Ags ensaiados mostraram um aumento da
positividade nos soros de pacientes TB. As combinações envolvendo os Ags 38/16kDa
e estes mais o MPT-64 forneceram maior positividade entre os PS-TB (34,8% e 39,1%,
respectivamente). Nenhuma das combinações superou a detecção de 50% entre os P-
TB/BAAR
-
com o KIT-IgA. Entre os P-TB/BAAR
+
, ocorreu pequeno aumento na
positividade foi obtido sempre com as combinações contendo o 38 kDa/16kDa. A
positividade aumentou de acordo com o número de Ags combinados, não havendo,
entretanto, diferença significativa ente os percentuais de positividade na população TB
(p>0,082) (Figura 25 /Tabela 24, Anexo III).
Em análise de biovariança maior probabilidade de positividade com ESAT-6
combinado ao MPT-64 ou 38 kDa foi observada entre os pacientes TB (Tabela 28).
107
Figura 25 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar com baciloscopia positiva (■P-TB/BAAR
+
) e baciloscopia negativa (■P-
TB/BAAR
-
) e suspeita de tuberculose pulmonar (■PS-TB) com teste ensaiados no PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados usando dois Ags, três
Ags e os quatro Ags
0
10
20
30
40
50
60
MPT-64
MT-10.3
38
k
Da
16 kDa
ESAT-6
KIT L -IgG
KIT L -IgM
KIT
L
-IgA
% de reativos
0
10
20
30
40
50
60
MPT-64/
MT
-
10.3
MPT
-
64
/
38 kD
a
MPT-64/
16 kDa
MP
T
-
6
4/
E
S
AT-6
MT-10.3/
3
8
k
Da
MT
-
10.3/
16 kDa
MT-10.3/
ES
A
T-6
38 kD
a
/
16
kDa
38 kDa/ ESAT-6
16 kDa/ E
S
AT-6
0
10
20
30
40
50
60
MPT-64/MT-10.3 /16kDa
M
P
T-64
/MT-10
.3/
38kDa
M
P
T-64
/MT-10.3
/E
SAT-6
MPT-64/
38
kD
a/
16kDa
MPT-64/
3
8 kDa/ESAT-6
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
MT-10.3/38 kDa/16kDa
M
T-10.3
/38k
D
a/
E
SA
T-6
MT-10
.3
/16 kDa/ESAT-6
3
8 kDa/16
kD
a
/
ESA
T-6
% de reativos
0
10
20
30
40
50
60
MPT-64/MT-10.3/16 e 38kDa
MPT-6
4
/M
T-
10.3
/
16/
E
SAT-6
M
PT-6
4/MT-
1
0
.3
/38
/
E
SAT-6
M
PT-6
4
/38
e 16
k
D
a
/ESAT-6
MT
-1
0.3
/
16e
38k
D
a
/
ESA
T-6
Todos
os
Antíge
n
os
108
Considerando os resultados da cultura para Mtb, foi observado que, entre os Ags
testados individualmente, a maior positividade para pacientes com P-TB cultura
+
e
cultura
-
e aqueles com PS-TB foi obtida com o KIT L-IgA (33,3%, 66,6% e 33,3%) e
no
PulmEIA 38 kDa (32%, 33,3% e 50%, respectivamente), sendo que o KIT L
identificou a maioria dos P-TB paucibacilares e o teste
in house identificou metade dos
suspeitos. Embora os resultados dos Ags combinados favoreça a um pequeno aumento
na positividade, nenhuma das combinações forneceram resultados maiores que os
obtidos para o 38 kDa, testado individualmente, ou KIT L-IgA, para os casos cultura
negativa (Figura 26/Tabela 25, Anexo III).
109
Figura 26 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar com cultura para M. tuberculosis positiva (■P-TB/cultura
+
), com cultura para M.
tuberculosis
negativa (■ P-TB/cultura
-
) e suspeita de tuberculose pulmonar (■ PS-TB) ensaiados no PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados usando
dois Ags
, três Ags e quatro Ags.
0
10
20
30
40
50
60
70
MP
T-
64
MT-
10
.
3
38 kDa
16 kDa
ESAT-6
K
I
T L -IgG
KIT L
-
I
gM
K
I
T L -IgA
% de reativos
0
10
20
30
40
50
60
70
MP
T-64
/
MT-1
0.
3
MPT-64/38 kDa
M
PT-64
/
16
kDa
MP
T
-
6
4/ESA
T
-
6
M
T-10.3/38
k
D
a
MT
-
1
0.3/
1
6
k
D
a
MT
-
1
0.3/
E
S
AT-6
38
k
D
a/16
kDa
38
k
D
a/E
S
A
T
-
6
16 k
D
a/E
S
AT-6
0
10
20
30
40
50
60
70
MPT-64
/
MT-10.3/1
6k
Da
MPT-64
/
MT-10.3/3
8k
Da
MP
T-6
4/MT
-
1
0
.
3/
ES
A
T
-6
M
P
T-64
/3
8
k
D
a/
16kDa
MP
T-64
/38 k
D
a/
E
S
AT
-
6
MP
T-64
/16 k
D
a/
E
S
AT
-
6
M
T-10
.3/38
k
Da/
16k
Da
MT
-
10.3/38kDa/ESAT
-
6
MT-10.
3
/16 kDa/ESAT
-
6
3
8
kDa
/
16
k
Da
/
E
S
AT-6
% de reativos
0
10
20
30
40
50
60
70
M
P
T
-
6
4
/
M
T
-
1
0
.
3
/
1
6
k
D
.
.
.
M
P
T
-
6
4
/
M
T
-
1
0
.
3
/
1
6
k
.
.
.
M
P
T
-
6
4
/
M
T
-
1
0
.
3
/
3
8
k
.
.
.
M
P
T
-
6
4
/
3
8
k
D
a
/
1
6
k
D
a
.
.
.
M
T
-
1
0
.
3
/
1
6
k
D
a
/
3
8
k
D
a
.
.
.
T
o
d
o
s
o
s
A
n
t
í
g
e
n
o
s
110
Em análise dos resultados dos KITs e do PulmEIA, para os Ags testados
individualmente, de acordo com as alterações observadas no exame da radiografia do
tórax, foi observado que pacientes TB, com lesões com alta e média probabilidade para
o diagnóstico da TB, mostravam maior freqüência de positividade nos ensaios
PulmEIA 38 kDa (40% e 38,4%) e KIT L-IgA (35,9% e 46,1%) para o grupo P-TB. No
grupo PS-TB, além do 38 kDa, o 16 kDa foi reconhecido na mesma proporção (41,6% e
33,3%, respectivamente) e o KIT L-IgG detectou percentuais similares apenas naqueles
com lesões para alta probabilidade de TB (45,5%). O
PulmEIA 16 kDa e o KIT L-IgM
foram os menos reconhecidos pelo soros de P-TB. Os pacientes P-TB com lesões
discretas (de baixa probabilidade de associação com TB) foram menos reativos, sendo o
Ag MT-10.3 mais reconhecido neste subgrupo (25%). Não foi encontrada diferença
significativa entre os percentuais de soros positivos nas diferentes classes de lesões,
exceto para o KIT L IgA no grupo P-TB (p<0,045), e no KIT L-IgG e 38 kDa no grupo
PS-TB, mas a diferença foi
borderline (p<0,057) (Figura 27/Tabela 26, Anexo III).
Os resultados combinados dos Ags ensaiados mostraram um aumento da
positividade para a maioria das combinações. Os percentuais de positividade foram mais
elevados nos casos com imagens de alta (35% a 45% % e 16,7% a 58,3%) e média
(30% a 53,8% e 22,2% a 44,4%) probabilidade para TB que daquelas que possuíam
baixa (0% a 25% e 0% a 14,3%) para os grupos P-TB e PS-TB, respectivamente.
Os Ags mais relevantes envolvidos na positividade dos soros foram 38 kDa e 16
kDa combinados ao ESAT-6 e ou MT-10.3 e MPT-64 (Figura 27/Tabela 26, Anexo
III).
111
Figura 27 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste
tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no PulmEIA e KITs L e os resultados combinados usando dois Ags, três Ags e quatro Ags de
acordo com resultado da radiografia do tórax (Lesões de Baixa, Média e Alta probabilidade de ser causada pela TB).
0
10
20
30
40
50
60
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
P-TB PS-TB
% de reativos
MPT-64
MT-10.3
38 kDa
16 kDa
ESAT-6
KIT L –IgG
KIT L –IgM
KIT L - IgA
0
10
20
30
40
50
60
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
P-TB PS-TB
MPT-64/MT-10.3
MPT-64/38 kDa
MPT-64/ 16 kDa
MPT-64/ ESAT-6
MT-10.3/38 kDa
MT-10.3/16kDA
MT-10.3/ESAT-6
38Kda/16kDa
38kDa/ESAT-6
16kDa/ESAT-6
alterações rediograficas em *P-TB (alta e média probabilidade x baixa probabilidade) p<0,045,
**PS-TB (alta probabilidade x baixa probabilidade) p<0,057
0
10
20
30
40
50
60
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
P-TB PS-TB
% de reativos
MPT-64/MT-
10.3/38kDa/
MPT-64/MT-
10.3/16kDa
MPT-64/MT-
10.3/ESAT-6
MPT-
64/38kDa/16kDa
MPT-
64/38kDa/ESAT-6
MPT-
64/16kDa/ESAT-6
MT-
10.3/38kDa/16kDa
MT-
10.3/38kDa/ESAT-6
MT-
10.3/16kDa/ESAT-6
38kDa/16kDa/ESAT-
6
0
10
20
30
40
50
60
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
P-TB PS-TB
MPT-64/MT-10.3/38kDa/16kDa
MPT-64/MT-10.3/38kDa/ESAT-6
MPT-64/MT-10.3/16kDa/ESAT-6
MT-10.3/38kDa/16kDa/ESAT-6
Todos os Antígenos
112
A Figura 28/Tabela 27 (Anexo III) mostram os percentuais de positivos no
PulmEIA, com os Ags testados individualmente, e KITs de acordo com a cicatriz da
vacina BCG. Foi observada diferença estatística significativa de positividade entre os
que não apresentavam cicatriz (N -Cz) e os que apresentavam (Cz) para o ESAT-6 no
grupo PS-TB (25% x 0%, p=0,039) e para 38 kDa (14,8% x 0%, p=0,038) no grupo
PPD
+
. Percentual de positividade mais elevado foi obtido com o Ag 38 kDa para P-TB
de ambos os subgrupos (35,1% e 37,5%, respectivamente) e para PS-TB/N-Cz (41,6%).
No KIT L-IgA detectou 40,5 % dos P-TB/N-Cz.
Quando analisados os percentuais de positivos nos resultados combinados do
PulmEIA, houve um ligeiro aumento da positividade na maioria das combinações,
embora sem diferença estatisticamente significativa. Os Ags 38 kDa/16 kDa
combinados ao MPT-64 ou MT-10.3 ou ESAT-6 forneceram as maiores positividades
principalmente entre os PS-TB/N-Cz (58,3%). Apenas a combinação 38kDa/ESAT-6 no
grupo PPD
+
mostrou diferença significativa (0% x 14,8%, p=0,039) (Figura 28/ Tabela
27, Anexo III).
113
Figura 28 - Freqüência de soros positivos dos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste
tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
) ensaiados no PulmEIA e KITs L e seus resultados combinados usando dois, três e quatro Ags de acordo com
cicatriz da vacinação da BCG
0
10
20
30
40
50
60
70
Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz
P-TB PS-TB PPD + PPD-
% de reativos
MPT-64
MT-10.3
38 kDa
16 kDa
ESAT-6
KIT L - IgG
KIT L - IgM
KIT L - IgA
0
10
20
30
40
50
60
70
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
P-TB PS-TB PPD + PPD-
MPT-64/MT-10.3
MPT-64/38 kDa
MPT-64/16 kDa
MPT-64/ ESAT-6
MT-10.3/38 kDa
MT-10.3/16 kDa
MT-10.3/ESAT-6
38 kDa/16 kDa
38 kDa/ ESAT-6
16 kDa/ ESAT-6
*p=0, 039, **p=0,038 *p=0,039
0
10
20
30
40
50
60
70
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
Cicatriz Sem
cicatriz
P-TB PS-TB PPD + PPD-
% de reativos
MPT-64/MT-10.3/16kDa
MPT-64/MT-10.3/38kDa
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
MPT-64/38 kDa/16kDa
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
MT-10.3/38 kDa/16kDa
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
0
10
20
30
40
50
60
70
Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz
P-TB PS-TB PPD + PPD-
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6
MPT-64/38 /16kDa/ESAT-6
MT-10.3/16/38kDa /ESAT-6
Todos os Antígenos
114
Tabela 28- Análise de biovariância dos fatores associados à positividade obtida com PulmEIA
com antígenos testados individualmente e KIT L, em 85 pacientes diagnosticados com
tuberculose pulmonar
ODDs Ratio (intervalo de confiança)
Ensaios
Alcoolista Tabagismo BAAR
+
Raio X **
Raio X
≈*** Sexo Masc.
MPT-64
5,056
(1,69-15,1)
0,133
(0,04-0,40)
3,199
(0,95-10,72)
4,667
(0,56-39,02)
4,118
(0,43-39,48)
1,397
(0,41-4,74)
MT-10.3
3,906
(1,28-11,87)
0,254
(0,08-0,76)
1,621
(0,51-5,20)
1,548
(0,30-7,98)
1,444
(0,23-9,11)
2,827
(0,59-13,53)
38 kDa
2,603
(1,05-6,44)
0,424
(0,16-1,10)
2,567
(0,93-7,04)
9,484
(1,16-77,68)
8,000
(0,88-72,7)
2,195
(0,72-6,65)
16 kDa
1,523
(0,50-4,66)
0,518
(0,16-1,65)
1,436
(0,44-4,66)
3,333
(0,39-29,41)
3,111
(0,31-31,09)
2,575
(0,53-12,41)
ESAT-6
2,45
(0,85-7,01)
0,534
(0,18-1,58)
2,618
(0,77-8,29)
* *
1,279
(0,37-4,37)
KIT L -IgG
2,885
(1,06-7,84)
0,792
(0,28-2,27)
1,333
(0,44-4,05)
* *
0,908
(0,30-2,72)
KIT L -IgM
0,890
(0,20-3,4)
1,200
(0,22-6,41)
2,098
(0,39-10,63)
* *
1,053
(019-5,64)
KIT L -IgA
3,237
(1,23-8,52)
1,357
(0,46-3,96)
0,824
(0,31-2,20)
6,188
(0,73-50,91)
8,000
(0,87-73,4)
1,581
(0,51-4,89)
* Odds ratio não realizado devido a 100% de positividade no teste; ** Radiografia do tórax mostrando lesões de alta
probabilidade para TB. *** mostrando lesões de media probabilidade para TB
115
Finalmente, a análise da sensibilidade e especificidade do PulmEIA-IgG e do
KIT L para IgG, M e A estão mostradas na Tabela 29. O KIT L embora tenha
apresentado a melhor especificidade (92,1 a 94,7%) a sensibilidade foi baixa variando
de 9,6 para IgM a 29,6% para IgA. No
PulmEIA, a sensibilidade foi mais elevada para
o Ag 38 kDa (33,7%), e a especificidade foi similar ao KIT L (91,4%).
Analisando os resultados dos diferentes Ags cumulativamente se observou
aumento na sensibilidade, variando de 25,8% a 43,8%, mas com comprometimento da
especificidade (< 89,6%). (Tabela 29 B, Anexo III).
Tabela 29 - Sensibilidade e Especificidade dos testes PulmEIA e KIT L na detecção de IgG de
soros para os antígenos testados individualmente e com o melhor resultado dos Ags analisados
cumulativamente
Numero de positivos/Total (%)
Ensaios
Cut off Sensibilidade Especificidade
MPT-64
751 19/89 (21,3) 4/58 (93,1)
MT-10.3
737 16 /89 (17,9) 3/58 (94,8)
38 kDa
958 30/89 (33,7) 5/58 (91,4)
16 kDa
715 15/ 89 (16,8) 5/58 (91,4)
ESAT-6
838 18/89 (20,2) 4/58 (93,1)
KIT L - IgG
1115 22/85 (25,9) 3/38 (92,1)
KIT L - IgM
390 8/85 (9,6) 2/38 (94,7)
KIT L - IgA
1085 25/85 (29,6) 2/38 (94,7)
MPT-64/38kDa/16kDa - 37/89 (41,6) 9/58 (84,5)
116
Portanto, como mostrado na Figura 29, o padrão de reconhecimento dos
antígenos no grupo de TB, considerados positivos no
PulmEIA, se observa que 35,9%
possui Acs IgG para um dos Ags. Considerando os que reconheceram múltiplos Ags,
28,2% responderam a padrões de 4 Ags e 15% a padrões de 2 e 3 Ags respectivamente,
sendo que o Ag 38 kDa, individualmente foi o mais reconhecido entre o cinco Ags
testados.
Figura 29 - Padrão de resposta imunológica dos pacientes para os múltiplos antígenos
ensaiados neste estudo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
I II III IV V
Nº de Antígenos
% P-TB positivos
117
7- Discussão
O diagnóstico da TB é mais difícil de estabelecer do que a de outras infecções
bacterianas (RICHELDI, 1995). Quando o resultado da bacterioscopia é positivo, indica que
está ocorrendo uma infecção avançada da doença ou TB multibacilar; porém quando o
resultado é negativo, é necessário realizar a cultura do espécime clínico que requer de quatro
a seis semanas para a confirmação deste resultado negativo, e freqüentemente o tratamento
do paciente se inicia sem o benefício da confirmação laboratorial. Quando ocorre a forma
paucibacilar da TB, como no caso da M-TB e PL-TB, os esfregaços raramente são positivos,
sendo o diagnóstico feito pela cultura, e por histopatologia da biópsia, respectivamente.
Ambos os testes são morosos e laboriosos, a obtenção de biópsia requer procedimentos mais
invasivos e necessita de pessoal especializado para sua execução (FERRER, 1997;
CHAKRAVORTY e cols, 2005; GOPI e cols, 2007; ANDRESEN, 2007). Portanto, testes
simples, rápidos, de baixo custo e de acurácia adequada, que auxiliem no diagnóstico rápido
da TB, são demandas importantes em saúde pública. Segundo a WHO, um teste baseado na
resposta imune teria potencial para auxiliar no diagnóstico da TB, mas a sensibilidade e
especificidade não devem ser menores que 80% e 95%, respectivamente (URDEA e cols,
2007).
Considerando que tanto a imunidade mediada por células e por Ac desempenham
papel importante nas infecções por
Mtb (WILLIAMS e cols, 2004), não é improvável
esperar que a M-TB esteja associada com a produção de Ac no local da infecção (REIBER,
1998). Os Ac produzidos tanto podem ser de característica espécie-específica como podem
partilhar epítopos comuns com o organismo infectante.
118
Em nosso estudo, foram avaliados 159 LCR de pacientes com M-TB, M-NTB e
controles utilizando ELISA “in house” (
MeningEIA) e o KIT comercial da Lionex para a
detecção de IgG, IgM e IgA. A população estudada quanto à faixa etária foi homogênea,
mantendo diferença significativa nas médias das DOs dos grupos. Embora todos os LCR de
M-TB fossem BAAR
-
, foi observado que os desvios padrões das DOs eram iguais ou
maiores que a média obtida com o KIT L e
MeningEIA 16 kDa-IgG/IgA, MPT-64–IgM, e
38 kDa-IgA. Estes achados sugerem que o padrão de reatividade dos LCR concentra-se em
baixa e média presença de Acs e alguns poucos são hiperreativos independente da carga
bacilar, podendo ser um teste útil para auxiliar no diagnóstico para M-TB.
Dos Ags ensaiados no presente estudo, apenas o MT-10.3 e 16 kDa não possuem
resultados publicados na literatura internacional para M-TB, a reatividade obtida não
ultrapassou os 36%, embora com excelente especificidade para detecção de IgG e IgA
(>95%). Estes foram os únicos Ags em que não foi observada médias de DO com diferença
estatisticamente significativa em LCR de M-TB e M-NTB, para IgG, IgM e IgA,
respectivamente.
A família gênica
esat-6 é dividida em subfamílias e dentre estas se encontra o gene
que codifica a proteína TB-10.4, que tem alta homologia com outras duas proteínas a TB-
10.3 (MT-10.3) (84%) e a TB-12.9 (65%). Os epítopos imunodominantes destas proteínas
foram mapeados utilizando quatro pacientes com TB e quatro controles saudáveis
PPD
+
(SKJT e cols, 2002). Foi demonstrado que a proteína MT-10.3, juntamente com a
TB12.9, é menos antigênica, produzindo resposta imune por IFN-
γ menor que a TB10.4.
Recentemente, em estudos realizados em pacientes com P-TB do Brasil, MT-10.3 se
mostrou com alta especificidade e baixa sensibilidade para a indução de IFN-
γ (TAVARES
119
e cols, 2007). Similarmente, a resposta humoral por IgG e IgM para este Ag em LCR foram
as mais baixas, mas para IgA a freqüência de respondedores ficou na mesma faixa (36,8%)
da obtida para os Ags 38 kDa e 16 kDa-IgG/A. Estes resultados sugerem que para o MT-
10.3 e MPT-64, a IgA é a principal Ig induzida, enquanto para 38 kDa e 16 kDa ambas Ig (G
e A) são encontradas no LCR.
O
MeningEIA para MPT-64 revelou-se de maior reatividade em LCR de M-TB na
detecção de IgA e a sensibilidade do teste foi aumentada de 73,7% para 78,9%, quando a
reatividade combinada do MPT-64/16kDa foram analisadas, mantendo a boa especificidade
do teste (>94%). Estes resultados foram superiores aos obtidos por CHANDRAMAKI e cols
(2002), que também utilizaram estes Ags em população de pacientes com BAAR
-
/cultura
+
,
porém detectando apenas IgG. Este autores mostraram resultados menores que o obtido no
MeningEIA MPT-64-IgG (12% x 47,4%) e maiores para o 16 kDa-IgG (56% x 31,6%). O
MeningEIA mostrou também sensibilidade maior para o Ag 38 kDa-IgG (36,8%) que a
obtida no estudo daquele autor (8%), porém sensibilidades maiores (41,17% e 80%) foram
descritas em estudos anteriores (PATIL e cols, 1996; KADIVAL e cols, 1994). Já nos
resultados obtidos por WANG e cols (2005), a detecção de IgG e IgM para o MPT-64 foi
mais elevada que os nossos resultados em LCR (66,6% x 47,4% e 83,3% x 42,1%,
respectivamente). Porém estes autores trabalharam com um universo de apenas 6 LCR de
M-TB e a especificidade para ambos os testes foi de 100%, mas utilizando soro de doadores
saudáveis (PPD
-
). Em nosso estudo a especificidade dos testes foi menor, pois foram
incluídos além de controles com cefaléia e esclerose múltipla, LCR de pacientes com outras
meningites não tuberculosas, mas a especificidade do teste para MPT-64 e sua combinação
com o 16 kDa-IgA, foi >94%. As diferenças de reatividades descritas entre o nosso estudo e
dos outros autores podem estar relacionadas com o estágio da doença, em que os pacientes
120
se encontravam no momento do teste, pois tem sido descrito reconhecimento preferencial de
determinados Ags de acordo com a progressão da doença, bem como ao grupo M-NTB
utilizados como controle, o que interfere com o
cut-off dos testes, ou ainda ao isotipo de Ig
estudado (LYASHCHENKO e cols, 1998; SILVA e cols, 2002; SILVA e cols, 2003).
O KIT L se mostrou um teste com excelente desempenho na detecção de IgG, com
sensibilidade de 84,2% e especificidade de 95,5%, resultados estes maiores ou similares ao
MeningEIA MPT-64-IgA (73,7% x 95,4%) e MPT-64/16kDa-IgA (78,9% e 94%).
STEINGART e cols (2007a; 2007b) fizeram duas revisões sistemáticas sobre KIT
s
comerciais para detecção de Ac na TBpul e TBexp. Para a análise dos estudos na TBexp, os
autores utilizaram 9 publicações contendo 21 estudos, onde foi observada uma grande
variedade na sensibilidade (11-77%) e especificidade (88-100%) para todos os tipos de
TBexp. A maioria destes estudos (17) usaram o KIT comercial
Anda-TB, que utiliza o Ag
nativo A-60 (Anda Biological S.A., Strasbourg, França), e apenas um estudo avaliou o teste
AMRAD ICT-IgG (Balgowhah - NSW, Austrália), que contém múltiplas proteínas obtidas
por recombinação genética, incluindo o Ag 38 kDa, em LCR de M-TB na população egípcia
(MCCONKEY e cols, 2002). Outro estudo utilizando
AMRAD ICT-IgG não incluído na
revisão citada acima, utilizou soro de apenas 6 indivíduos com TBexp (TB limfonodo,
genitourinário, peritoneal e óssea) obtendo 56% de sensibilidade (BARTOLONI e cols,
2003). A sensibilidade e a especificidade descritas para estes testes comerciais foram
menores que a obtida em nosso estudo utilizando o KIT L, que também contém múltiplos
Ags incluindo o 38 kDa e o ESAT-6, entre outros. Os nossos resultados sugerem que a
detecção de IgA e IgG utilizando o
MeningEIA e o KIT L, respectivamente, podem se
tornar ferramentas promissoras para auxiliar no diagnóstico rápido da M-TB, mas ambos os
testes necessitam ser otimizados e outros Ags sensíveis devem ser incluídos para avaliação
121
de modo a melhorar a sensibilidade e especificidade dos testes. Recentemente, um estudo
avaliou reatividade de LCR de M-TB à diferentes Ags observaram que 75% dos LCR
reconheciam 5-6 Ags, em nosso estudo o mesmo percentual foi obtido utilizando três Ags na
detecção de IgA (CHANDRAMUKI e cols, 2002).
Em estudo realizado na Índia, detectando IgG para a maioria dos Ags aqui estudados,
em pacientes M-TB com ou sem co-infecção pelo HIV, foi sugerido que os co-infectados
tinham maior possibilidade de apresentarem menor reatividade de Ac no LCR, e que embora
fosse significante, essa redução não era grande (CHANDRAMUKI e cols, 2002). Em nosso
estudo, os M-TB/HIV
+
apresentaram reatividade média maior que o HIV
-
, porém a diferença
significativa foi observada apenas para 38 kDa-IgG/A e 16 kDa-IgA. A proporção de
positivos acompanhou esta reatividade, mas a significância estatística só foi obtida para 38
kDa na detecção de IgG. Entretanto, os Ags MT-10.3 e 16 kDa, individualmente, e em
combinação com o Ag 38 kDa apresentaram proporções de positivos estatisticamente
significativas. Esta discrepância pode ser atribuída ao tipo de pacientes incluídos na
amostragem, pois estes autores sugerem que a co-infecção pelo HIV se correlaciona a um
pequeno decréscimo na reatividade de Ac apenas entre os pacientes diagnosticados pela
suspeita clínica de M-TB e em nosso estudo a maioria dos LCR era cultura
+
. Entretanto,
estes autores descrevem que a freqüência de positivos entre estes grupos de pacientes não
difere. Portanto, nossos resultados sugerem, que a co-infecção pelo HIV não interfere com a
detecção de Ac, e assim testes baseados na resposta imune por Ac tem potencial para
auxiliar no diagnóstico da M-TB em pacientes imunossuprimidos, nos quais é sabido a
dificuldade de diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas como a TB
(CHANDRAMUKI e cols, 2002; GOLDEN e cols, 2005; PUCCIONI-SOHLER &
BRANDÃO, 2007).
122
Um dos exames bioquímicos realizados para auxiliar no diagnóstico da meningite é a
verificação do nível de proteína em LCR, quanto maior a concentração de proteína, maiores
chances de ser uma infecção bacteriana. Neste estudo, foi observada associação da
concentração protéica no LCR e a infecção por
Mtb, pois todos os LCR M-TB/PTR
3
e
66,6% a 75% dos LCR M-TB/PTR
2
foram positivos ao MeningEIA para MPT-64, MPT-
64/16kDa e MPT-64/16kDa/38kDa, observando-se máxima sensibilidade no KIT L - IgG
(83,3%). Esta associação não foi observada para as outras infecções não tuberculosas. Até o
presente, que seja de nosso conhecimento, não há estudo correlacionando a concentração
protéica do LCR com ensaios usando antígenos específicos de
Mtb no imunodiagnóstico da
M-TB.
Correlacionar concentrações altas de proteína no LCR e produção de Ac para Ags
específicos de
Mtb pode ser uma estratégia útil para auxiliar no diagnostico da M-TB, mas
que precisa ser melhor avaliada em estudos posteriores, aumentando o tamanho amostral de
LCR com M-TB. Embora a M-TB seja uma doença de prevalência baixa, ela é uma doença
grave que necessita de um diagnóstico diferencial rápido. Em dois casos suspeitos de M-TB
enviados ao nosso laboratório para diagnóstico, pelo Hospital Miguel Couto da Secretaria
Municipal de Saúde, RJ,
MeningEIA IgA e PCR-INS6110 foram realizados no LCR e
sangue destes pacientes infantis. Em um dos casos, ambos os testes foram positivos, com
proteinarraquia de 250 mg/mL; mais tarde M-TB foi confirmada por cultura. Já no segundo
caso, ambos os testes foram negativos no LCR com proteinarraquia de 80 mg/mL, sendo o
paciente tratado como M-NTB evoluindo para melhora clínica. Um dos LCR incluído no
presente estudo apresentou cultura negativa, sendo o diagnóstico de M-TB feito pela
evolução clínica pós-tratamento específico para TB. Este LCR foi positivo no
MeningEIA
123
MPT-64 e suas combinações-IgA, apresentava níveis de PTR
2
e soro negatividade para o
HIV.
Se considerarmos que o LCR é um fluido corporal proveniente de um local livre de
contaminantes e que a meningite é um evento raro, os resultados aqui mostrados sugerem
que o imunodiagnóstico por Ac pode ser uma estratégia diagnóstica vantajosa.
Recentemente, outros autores têm descrito variantes de testes simples e rápidos baseados no
método de ELISA demonstrando a utilidade de testes, tais como o
Dot-Iba (Ag ligado a um
suporte sólido de nitrocelulose) (KAMESWARAN e cols, 2002; MATHAI e cols, 2003).
Mas é preciso alertar que a presença de Ac no LCR nem sempre indicará M-TB, pois
anticorpos podem passar para o LCR através da barreira hematoencefálica, ocasionada,
principalmente, por lesão desencadeada por algum processo inflamatório, bem como pela
presença dos Ac inespecíficos (M-NTB) ou por Ags micobacterianos comuns ou ainda em
áreas endêmicas para TB, como no Rio de Janeiro. No presente estudo, reatividade cruzada
foi observada em <7% desses pacientes, em sua maioria infectada por bactérias tais como
Streptococcus pneumoniae e Cryptococcus spp, mantendo o VPN do teste em patamares
altos (>96%) nos ensaios de maior sensibilidade. Recentemente,
Streptococcus pneumoniae,
bem como Mtb e N. meningitidis, foram identificados como os mais freqüentes agentes
causais de meningite (SELIM e cols, 2007). Em nosso estudo estes microrganismos foram
as principais causas de reatividade cruzada na M-NTB e no grupo C apenas dois LCR
apresentaram Ac para 16 kDa e 38 kDa-IgA.
Dos quatro Ags aqui estudados, os mais imunoreativos no
MeningEIA foi o MPT-
64 que é uma proteína de 23 kDa, codificada na RD-2 e que foi inicialmente isolado das
124
cepas virulentas do complexo Mtb. Está presente em apenas algumas cepas de BCG tais
como a cepa Russian, e a usada no Brasil, cepa Moreau, mas isto parece não interferir na
especificidade dos testes com este Ag, já que o VPN dos testes mais sensíveis foi alto neste
estudo e a prevalência foi baixa (LI e cols, 1993; OETTINGER & ANDERSEN, 1994).
O Ag 16 kDa (também conhecido como proteína de 14 kDa) em estudos
sorológicos, tem mostrado significante imunogenicidade, apresentando elevada
sensibilidade na M-TB, principalmente na M-TB cultura
+
e na TB infantil, indicando ser um
Ag imunogenicamente seletivo nos estágios iniciais da infecção tuberculosa e na tuberculose
primária. Embora em nosso estudo, o 16kDa tenha se mostrado menos sensível, em
combinação com MPT-64 favoreceu ao aumento da sensibilidade do
MeningEIA (CHANG
e cols, 1996; CHANDRAMUKI e cols, 2002; UMA DEVI e cols, 2001).
O Ag 38 kDa, embora extensivamente estudado devido a sua boa especificidade,
pouco se sabe do seu potencial imunogênico na M-TB, principalmente no Brasil, onde não
existem trabalhos avaliando a presença de Acs específicos a estes Ags em LCR. O
determinante antigênico do 38 kDa é uma lipo-proteína ligadora de fosfato (PstS ou Pho),
ela é espécie-específica de
Mtb, embora tenha 30% de homologia com proteína homóloga
expressa por
E. coli (ANDERSEN & HANSEN, 1989; CHANG e cols, 1996). Em estudos
anteriores, em pacientes brasileiros com TBpul e controles saudáveis, observou-se que as
células T induzidas por MPT-64 (32%), 38 kDa (34%) e 16 kDa (54%) apresentaram
freqüência variável na produção de INF-
γ (TAVARES e cols, 2007). Sabe-se que a resposta
de Ac IgG contra proteínas são dependentes de células T e portanto presume-se um
reconhecimento da resposta humoral possa ser heterogêneo para diferentes Ags. No presente
estudo, as IgG presentes no LCR de M-TB reconheceram preferencialmente o MPT-64, mas
125
este reconhecimento foi mais efetivo para IgA, na maioria dos LCR. Os outros Ags foram
também reconhecidos, mas em menor freqüência e raros possuíam Ac com afinidade para
Ags que não o MPT-64. Embora, isto ocorra em menor freqüência este evento é suficiente
para gerar maior sensibilidade aos testes combinando a resposta de dois ou mais Ags como
obtido para o MPT-64/16kDa- e MPT-64/16kDa/38kDa-IgA e com o KIT L, que é baseado
num complexo de multi -Ags. Estes resultados estão de acordo com estudos prévios, em
amostras de soros, onde foi descrito que a maioria dos Ac reconhece de um a três Ags
(LYASHCHENKO e cols, 1998).
O fato do KIT L detectar preferencialmente IgG pode estar relacionado a composição
antigênica do teste. Contrariamente, o
MeningEIA detectou maior freqüência de IgA e isto
pode estar associado ao fato dos Ags utilizados serem produzidos por
Mtb no local da
infecção, que é uma serosa, e nestes locais IgA é preferencialmente encontrada (REIBER,
1998).
Similarmente, no ensaio
in house PLEIA utilizou-se espécime clínico obtido do
local da infecção, pleura, que por sua vez é também uma mucosa. Em estudos anteriores,
trabalhando com a mesma amostragem de LP aqui ensaiada, o isotipo IgA foi mais reativo
para o Ag MPT-64 (72%) (KAISERMANN e cols, 2005). Estes autores ainda demonstraram
que os resultados combinados deste Ag ao MT-10.3 resultaram em pequeno aumento da
sensibilidade (76%), mas isto não ocorreu com o
MeningEIA, no qual a combinação mais
promissora foi com o 16 kDa e 38 kDa. Isto pode sugerir que a reatividade a determinados
Ags pode variar dependendo do mecanismo patológico, bem como localização e evolução
clínica da doença. Em estudo de análise sistemática de resposta imune humoral de pacientes
TB mostrou que o reconhecimento de Ac às proteínas de
Mtb difere em relação ao estágio e
126
progressão da doença, sugerindo que potencial teste diagnóstico deve conter diferentes Ags
que sejam reconhecidos nos diferentes estágios da doença (RICHELDI, 2006; STEINGART
e cols, 2007a; TEIXEIRA, ABRAMO & MUNK, 2007).
No
PLEIA nenhum dos Ags recombinantes ensaiados (ESAT-6, 16kDa e 38 kDa)
individualmente ou combinados, ou mesmo o KIT L, que contém múltiplos Ags, forneceram
resultados semelhantes aos obtidos por KAISERMANN e cols (2005). Combinando os
resultados do MPT-64/MT-10.3-IgA, com os ensaiados no presente estudo, foi observado
aumento máximo de sensibilidade com os resultados combinados do MT-10.3/38 kDa
(67/82, 81,7%) mas ao custo da especificidade que caiu para 86,8% (5/38) (dados não
mostrados). Mas, seria necessário aumentar o número amostral de PL-NTB para confirmar
este dado.
Assim como no
MeningEIA, também foram obtidas no PLEIA baixas
sensibilidades para os Ags 38 kDa e 16 kDa e sua combinação para os isotipos IgG e IgA.
O Ag 38 kDa tem sido extensivamente avaliado na TBpul, mas na PL-TB existem poucos
estudos. DEMKOW e cols (2004), bem como em investigação anterior (WILKINSON e
cols, 1998), descrevem maior reatividade de IgG para o Ag 38 e 16 kDa (44% e 50%) e sua
combinação (43%), que a obtida em nosso estudo com o
PLEIA (21,5% e 39,5%,
respectivamente). Em estudo recente, resultados similares ao
PLEIA para o 38 kDa-IgG e
IgA foram descritos (21,5% x 28,4% e 10,1% x 2,47%), mas para IgM nossos resultados
foram mais elevados (34,2% x 11%) (YANG e cols, 2008). SENOL e cols (2007), utilizando
o teste comercial
Pathozyme-TB ComPlus contendo a forma recombinante destes Ags,
mostraram também resultados semelhantes ao
PLEIA para IgG (22,2%). Resultados
contraditórios foram descritos em três outros estudos, utilizando o kit comercial
ICT-TB,
127
cuja sensibilidade e especificidade foram 20% a 50,7% e 100% a 57,7%, respectivamente
(ONGUT e cols, 2006; KHAN e cols, 2004; CHIERAKUL e cols, 2001). Entretanto, em
nosso estudo o KIT L-IgG resultou na maior reatividade (65,5%) e razoável especificidade
(92,3%). A diversidade dos resultados descritos nos diferentes trabalhos pode estar
relacionada a vários fatores, entre eles o total de indivíduos incluídos no estudo, qualidade e
homogeneidade dos Ags utilizados e a fase da doença dos pacientes estudados. Em nosso
estudo foram utilizados Ags produzidos de uma mesma fonte e do mesmo lote de fabricação
na tentativa de minimizar variações em função da qualidade dos Ags. No caso dos KIT
s, é
possível que a combinação de antígenos utilizadas no KIT L foi mais eficiente ou o ELISA,
utilizando como suporte sólido os poços de microplaca de poliestireno, seja mais sensível
que o
ICT.
O
PLEIA, para o 38 kDa/16 kDa, rendeu maior reatividade para o isotipo IgM
(55,5%) com especificidade de 88,6%, e combinado a um terceiro Ag (ESAT-6) obteve-se
um discreto aumentou para 58,5%, resultado este similar ao descrito no teste
ICT-TB, mas
para a IgG, porém este teste comercial resultou em menor especificidade (82,8% x 57,7%).
A limitada capacidade diagnóstica destes Ags na TBexp pode estar relacionada ao fato dos
pacientes não desenvolverem lesão cavitária, pois foi observada correlação entre a presença
de Ac para 38 kDa e o desenvolvimento de lesão cavitária (
BECK e cols, 2005; SAMANICH,
BELISLE & LAAL, 2001; BOTHALOMEY, 1995
). Outro ponto a considerar é a maior
reatividade de IgM em relação a IgG para os Ags 38 kDa e 16 kDa no presente estudo. A
produção de IgM associada com a fase inicial de uma infecção seguida de IgG e IgA é bem
conhecida (EDWARDS & KIRKPATRICK, 1986), mas a doença extra-pulmonar reflete
uma forma crônica ou recorrente da TB, portanto a presença da IgM não seria esperada
nestes casos. Mas considerando que o Ag 16 kDa foi mais reconhecido pelos Acs em relação
128
ao 38 kDa, e como está presente geralmente na infecção latente ou inicial, isto poderia
indicar que os pacientes estariam liberando este Ag no espaço pleural decorrente de uma
lesão tuberculosa num passado recente, e isto poderia explicar a presença da IgM. Em
investigação realizada em pacientes com P-TB no Irã avaliando o KIT Anda TB A60 foi
observada a presença de IgM em pacientes sem história de TB passada (KALANTRI e cols,
2005).
O Ag ESAT-6 é específico de cepas virulentas de
Mtb, embora esteja presente em
cepas tais como
M. szulgai, M. kansassi and M. marinum (HARBOE e cols, 1996). Este Ag
tem sido exaustivamente estudado quanto a sua resposta imune em pacientes TBpul e
contatos, mas há raros estudos avaliando seu potencial imunodiagnóstico na PL-TB
(DAVIDOW e cols, 2005; TAVARES e cols, 2007; YANG e cols, 2008). Este Ag, ensaiado
individualmente no
PLEIA-IgA, mostrou maior sensibilidade (41,9%) que a obtida em
recente estudo utilizando ESAT-6 e 38 kDa na detecção de IgG (35,8% e 28,4%), IgM
(17,3% e 11%) e IgA (2,47% e 2,47%), entre outros Ags, em LP com PL-TB e câncer
(YANG e cols, 2008). Em outro estudo, utilizando soro de pacientes com TB em diferentes
sítios extrapulmonares, inclusive pleural, a detecção de IgG mostrou resultado similar
(34,4%) ao de YANG (2008). A pleura é uma mucosa, e a presença preferencial da IgA no
espaço pleural é esperada (ANTONY e cols, 2003). A discrepância obtida com o ESAT-6
nos resultados descritos acima pode está relacionada, entre outras variáveis, a diferenças
genéticas e geográficas das populações estudadas, problemas de ordem técnica e a qualidade
do Ag.
129
Um VPP alto indica que os resultados positivos de um teste podem confirmar um
diagnóstico. No nosso estudo, o VPP alto foi observado, embora o VPN tenha sido baixo o
que contribui para resultados falsos negativos no teste, porem é o esperado com uma
prevalência alta encontrada neste estudo. Mas se considerarmos que apenas 20% dos casos
de PL-TB são detectados no exame bacterioscópico, e no presente estudo apenas um dos
espécimes foi BAAR
+
(1%) e 14% cultura
+
, o PLEIA para ESAT-6 e sua combinação com
o 16 kDa-IgA e o KIT L-IgG puderam detectar rapidamente 40% a 65% destes casos,
refletindo no alto VPP destes testes (
94%).
O
PLEIA ou KIT L não mostraram maior sensibilidade que o exame padrão ouro
(histopatologia) na PL-TB, que nesta amostragem foi de 74%, mas considerando que o
ELISA é um teste mais simples e não requer pessoal especializado, o imunodiagnóstico
poderia ser mais um teste adjuvante para auxiliar no diagnóstico rápido da PL-TB. É
importante mencionar, que embora estes testes tenham mostrado baixa reatividade cruzada,
a maioria ocorreu nos casos de efusão pleural maligna. Estudos prévios têm descrito
resultados falsos positivos relacionados a este quadro clínico. Isto pode ser atribuído à
similaridade antigênica entre Ags micobacterianos e as células cancerosas, ou à exposição a
esses antígenos devido à lesão pulmonar causada pelo quadro de malignidade ou, ainda, a
uma remota infecção latente dos indivíduos devido à alta taxa de incidência da TB no Rio de
Janeiro, 114/100.000 habitantes. (http://www.saúde.rj.gov.br/tuberculose/planos.shtml
;
WADEE, BOTING & REDD, 1990; DHAND e cols, 1988).
Assim como na M-TB, os valores médios de reatividade na PL-TB/HIV
+
mostraram-
se em geral mais elevados, mas diferença estatisticamente significativa foi obtida apenas
para o Ag ESAT-6- e KIT L-IgG. Entretanto, a proporção de LP reativos só mostrou
130
significância estatística para o ESAT-6 (p=0,03) e a análise de variância demonstrou que os
pacientes PL-TB/HIV
+
tinham maior chance de produzirem Ac para este Ag. Estes
resultados, entretanto necessitam de confirmação, pois o número de amostras testadas para
pacientes HIV
+
foi pequeno. Mesmo assim, os resultados do PLEIA, com Ags
individualmente ou combinados, e o KIT L, em geral, mostram que a infecção pelo HIV não
interfere na reatividade, fazendo do imunodiagnóstico um método potencialmente útil na
PL-TB em indivíduos HIV
+
. Estes resultados são compartilhados por outros autores
(CHIERAKUL e cols, 2001) que, utilizando o teste comercial
ICT-TB, encontraram
resultados positivos comparáveis nos PL-TB/HIV
+
e HIV negativos. Mas outros estudos
utilizando testes comerciais contendo antígenos lipídicos LAM (
Mycodot test”) e o AgA60
(
ANDA KIT) têm mostrado baixa sensibilidade na detecção de P-TB co-infectados por HIV.
Por outro lado, foi mostrado que Ac anti-Ag lipídico SL-IV tem sensibilidade na detecção
de P-TB/HIV
+
(MATHUR, LOBUE & CATANZARO, 1999; LAWN, FRIMPONG &
NYARKO, 1997; SAAD e cols, 1996; THYBO e cols, 1995; VERBON e cols, 1993; VAN
DER WERF e cols, 1992; MARTIN-CASABONA e cols, 1992).
A patogenia da PL-TB, sabidamente, envolve a presença de número limitado de
bacilos, em nosso estudo apenas 14% dos espécimes testados apresentaram cultura
+
e,
portanto o padrão-ouro do diagnóstico é o exame histopatológico da pleura. Espécime com
cultura
+
significa presença de carga bacilar mais alta, mas este fato não influenciou os
resultados do KIT L para todos as Igs neste estudo, principalmente para a IgG, pois o
percentual de positividade foi similar nos dois subgrupos, o mesmo ocorrendo para os
espécimes com exame histopatológico positivo ou não concludente (>60%). Estudos
anteriores, utilizando o teste comercial
ICT-TB, mostraram diferença de reatividade em
espécimes cultura
+
versus cultura
-
, sugerindo que a discrepância de sensibilidade detectada
131
seria resultado do tempo de infecção da população estudada (MATHUR, LOBUE &
CATANZARO, 1999), mas posteriormente outro estudo não confirmou esta hipótese, já que
freqüência de positivos foi similar nos caso iniciais e tardios (CHIERAKUL e cols, 2001).
Embora o KIT L-IgG tenha detectado pouco mais de 60% dos espécimes PL-TB com
cultura
+
e exame histopatológico inespecífico, ele o fez de forma homogênea para toda a
amostragem testada, incluindo os com exames positivos para TB, o que não ocorreu para o
PLEIA. A heterogeneidade de detecção destes espécimes no PLEIA torna o teste mais
dispendioso e pode proporcionar confusão na interpretação dos resultados referente a
diferentes Igs.
Uma variedade de testes alternativos tem sido desenvolvida, inclusive métodos
imunológicos baseados na resposta imune celular e humoral do hospedeiro para a TBpul.
Recentemente, teste denominado IGRA (
interferon gama release assay) tem sido proposto
como novo método diagnóstico na TB, mas este necessita de material fresco (células do
sangue vivas), o que dificulta a realização do teste em regiões com grande demanda
diagnóstica, além de não diferenciar TB ativa de TB latente (ADETIFA e cols, 2007;
LEYTEN e cols, 2007).
Por outro lado, os testes baseados na resposta humoral continuam atraindo a atenção,
pois o indivíduo infectado desenvolve forte resposta por Ac, e entre os descritos o mais
simples e relativamente pouco invasivo é o teste sorológico que tem sido explorado com
uma variedade de Ags.
132
Recentemente, em um estudo de revisão pode-se observar a variedade de resultados a
um mesmo Ag, incluindo soros de diferentes partes do mundo, inclusive um do Brasil
(ABEBE e cols, 2007). Entretanto, o estudo brasileiro não contemplou população sadia de
nossa área endêmica, podendo causar um viés no resultado da especificidade do teste
sorológico (LODES e cols, 2001). Raros, também, são os estudos que procuram avaliar
diferentes Ags utilizando a mesma amostragem de soros. Isto poderia minimizar alterações
de reativiadade aos Ags conseqüente de diferentes processos de manipulação do material
clínico.
É certo que alguns Ags apresentam sensibilidade e especificidade promissoras para
serem considerados como componente de teste diagnóstico, e vários são os trabalhos que
investigaram a acurácia de testes comerciais elaborados com estes Ags, predominantemente
contendo os Ags 38 kDa, 16 kDa e o Ag A60, entre aqueles
kits que informam a composição
antigênica usada ou parte dela.
Em revisão sistemática de estudos com testes comerciais, publicados recentemente,
apenas dois foram realizados com soros do Brasil (STEINGART e cols, 2007b). Esta
carência de dados relevantes no desempenho dos testes diagnósticos quer seja
in house ou
comerciais em nosso meio, se constitui em uma lacuna no nosso conhecimento sobre as
potencialidades dos Ags, particularmente para doenças que tem forte apelo em saúde pública
como a P-TB.
No presente estudo, além de avaliar a sensibilidade e especificidade de testes
in
house
com diferentes Ags e com KIT comercial, ainda se observou algumas associações
133
entre as características clínicas e demográficas dos pacientes. Incluindo reatividade cruzada
pela vacinação pela BCG ou pela infecção latente, já que o Brasil, e particularmente a área
onde os soros para P-TB e controles foram coletados, é endêmica para TB (100/100.000
hab) (WHO, 2007).
Foi investigada a resposta humoral por IgG para cinco diferentes Ags recombinantes
(
PulmEIA) e KIT comercial Lionex para detecção de IgG, M e A, baseados no ELISA
indireto. Foi estudado um total de 201 soros e as médias de resposta de Acs expressas em
DO mostraram que o
PulmEIA e o KIT L distinguem significativamente os pacientes TB
dos N-TB, exceto o KIT L-IgM. Estes resultados mostram que embora o papel da imunidade
mediada por Ac na proteção à infecção por
Mtb ainda permaneça incerta, a exposição do
hospedeiro a este microrganismo induz a produção de Acs para vários Ags refletindo seu
potencial uso como marcadores da moléstia (ANDERSEN e cols, 2000; HARRINGTON e
cols; 2000).
Acompanhando a baixa reatividade, o KIT L-IgM mostrou também a menor
sensibilidade (9,6%) entre todos os testes, resultado este igual ao obtido com o kit
Myco M
(10%) (JULIAN e cols, 2004). A IgM é produzida no início de uma infecção, portanto
espera-se que esteja aumentada na TB recente. Mas um estudo epidemiológico de detecção
de casos de TBpul do Rio de Janeiro mostrou que, em geral, o paciente leva em média 60
dias (30 a 120 dias) para procurar atendimento médico após o aparecimento dos sintomas
respiratórios (CANTALICE FILHO, SANT ANNA & BÓIA, 2007). Portanto, o diagnóstico
ocorre tardiamente e neste período já ocorreu a mudança de expressão de Ig, o que
justificaria a baixa detecção de IgM.
134
É interessante notar que os soros de pacientes P-TB portadores da cicatriz da BCG
apresentaram médias de reatividade para KIT L-IgM significativamente maior que os soros
de P-TB sem cicatriz da BCG, resultado este similar para o
PulmEIA 16 kDa (p<0,045).
Portanto, vacinação com BCG pode estar interferindo na magnitude da DO nestes testes,
mas não interfere com a freqüência de positividade dos soros, pois não foi observada
nenhuma associação com esta ou outras variáveis clínicas e demográficas dos pacientes. A
síntese de IgM é regulada independentemente de células T, diferente das outras Ig que são T
dependente. Segundo alguns autores, a produção de IgM para Ags micobacterianos pode ser
influenciada por fatores tais como vacinação pela BCG, contato com outras bactérias
ambientais ou mesmo pela presença da TB latente (GUPTA, BHATIA & DATTA, 1995).
Recentemente, foi obervado, em crianças e adolescentes vacinadas com BCG persistência da
resposta imune por IFN-
e que a memória imunológica induzida esteve presente por 3
meses a 14 anos após a vacinação (WEIR e cols, 2008).
Um dos KIT
s mais estudados no diagnóstico da TBpul, descrito na literatura
internacional, é o
ANDA TB60 contendo o Ag 60 que é um componente termoestável do
PPD, e embora esteja disponível comercialmente a bastante tempo não é usado na rotina
diagnóstica, pois carece de suficiente sensibilidade e especificidade, principalmente em
áreas endêmicas para TB. Outros KIT
s têm sido lançados no mercado, a maioria deles
contendo múltiplos Ags dos quais o 38 kDa está sempre presente, pois Ac ocorrem em
maior porcentagem para este Ag na TB como demonstrado neste e em outros estudos
(STEINGART e cols, 2007b; POTTUMARTHY e cols, 2000; WILKINSON e cols, 1997).
135
Na população aqui estudada, a sensibilidade do PulmEIA foi maior para 38 kDa
(33,7%) e com boa especificidade 91,4%. Combinando os resultados dos outros Ags, o
aumento da sensibilidade no
PulmEIA ocorreu sempre na presença deste Ag, mas com
comprometimento da especificidade (>77,6%). Embora os KITs L-IgG (25,9%) e IgA
(29,6%) contenham, entre outros, este Ag sua sensibilidade foi menor que no
PulmEIA 38
kDa-IgG. Os resultados foram menores que os obtidos em outros testes comerciais, como o
ICT TB Test (ICT Diagnostics, Sidney, Austrália), que utiliza 38 kDa e mais quatro Ags
específicos para detecção da IgG, com soros de pacientes de diferentes regiões geográficas,
inclusive o Brasil (64%). Entretanto, a especificidade dos testes foi menor (<85%) que no
KIT L (94,7 %) (PERKINS e cols, 2003; MCCONKEY e cols, 2002). Em outro estudo mais
recente realizado na Turquia (ONGUT e cols, 2006), a sensibilidade do
ICT TB Test foi
similar ao
PulmEIA 38 kDa (33,3%) e especificidade de 100%, mas a população controle
incluiu apenas indivíduos sadios, e no nosso estudo e nos citados acima os controles
incluíram pacientes com outras pneumopatias que não a TB, esta população reflete melhor
os pacientes com sintomas respiratórios que procuram a rede pública.
Por outro lado, as sensibilidades obtidas nos KITs L foram similares ou menores do
que as obtidos com outros testes, extensivamente utilizados na literatura internacional, tais
como o
Panthozyme TB nas versões Complex Plus, que contém os Ags 38kDa e o 16 kDa e
Myco G e A contendo o Ag 38 kDa e o LAM (Omega Diagnostics, Alloa, Escócia, Reino
Unido). Em dois estudos realizados na Argentina (IMAZ e cols, 2004) e Espanha (JULIAN
e cols, 2004) as sensibilidades foram 29% e 31%, e 49% e 41% para os respectivos testes,
todos mostrando especificidade >86%. Os resultados do
PulmEIA combinando 38 kDa/16
kDa (39,3%), ou estes Ags + MPT-64 (40,4%), ou estes três Ags + MT-10.3, ou + ESAT-6
(42,7%) fornecem sensibilidades e especificidades (>80%) similares ao KIT
Complex Plus
136
IgG. Recentemente, em um estudo realizado na Venezuela, as sensibilidades mais elevadas
foram descritas para ambos os KIT
s, 50% e 80%, respectivamente, com especificidade
>80%, porém apenas 20 pacientes P-TB foram arrolados no estudo e, portanto esta
sensibilidade pode conter um viés de amostragem (D'ALESSANDRO & DE WAARD,
2008). JULIAN e cols (2004), utilizando o teste
Myco A, mostraram sensibilidade de 20,6%,
resultado este similar ao do KIT L-IgA (29,6%). Estes resultados mostram que o
PulmEIA
com os Ags combinados tem potencial diagnóstico similar aos KITs comerciais disponíveis
no mercado internacional.
A molécula 16 kDa é uma proteína citosólica regulatória associada a fator de
virulência, apresenta seqüências similares com a proteína de choque térmico de mamíferos
(16.3 kDa ou Acr) e com a proteína cristalina
que tem papel relevante na transparência
dos olhos dos vertebrados (GROENEN e cols, 1993; CHANG e cols, 1996). Tem sido
explorado em estudo de resposta imune humoral na TB pediátrica mostrando sensibilidades
variáveis, tais como baixa para IgM (3% a 11%), de 19 a 52% para IgA e 34% a 62% para
IgG, mas sempre mantendo boa especificidade (WILKINSON, e cols 1998; GARBE e cols,
1999; UMA DEVI e cols, 2001; IMAZ e cols, 2001; RAJA e cols, 2002; CACCAMO e
cols, 2002; ABULIMITI e cols, 2003; KENNAWAY e cols, 2005; WELDINGH e cols,
2005). Neste estudo, a especificidade foi concordante com os estudos anteriores, mas a
sensibilidade foi baixa (16,8%) concentrando-se a positividade entre os PS-TB com lesões
radiológicas extensas (41,6%). Vários autores têm sugerido que a resposta por Ac para o 16
kDa estaria associada com TB latente ou em risco de desenvolver a doença (BECK e cols,
2005; DEMISSIE e cols, 2006). Considerando que a maioria dos PS-TB respondedores ao
16 kDa foram negativos para 38 kDa (prevalente em TB ativa com lesões mais extensas) é
possível que estes pacientes estariam em diferente estágio da infecção.
137
Estudos prévios mostraram maior reatividade ao 16 kDa em contatos de TB
intrafamiliar que nos pacientes com TB ativa e em contatos por forte exposição operacional
(JACKETT e cols, 1988; BOTHAMLEY, 1995). De acordo com a imunoreatividade obtida
neste estudo não houve diferença significativa na média de DO entre TB e pacientes não TB
(p=0,071), resultados estes similares ao obtido em estudo realizado no Canadá onde
reatividade ao 16 kDa foi negativamente associado a positividade ao PPD (SILVA e cols,
2003), mas positivamente associado com TB inativa, estes achados juntamente com aqueles
dos autores mais antigos e DEMISSIE e cols (2006) sugerem que este Ag pode ser um
indicador para risco de desenvolvimento de doença. Sobre este ponto de vista, os pacientes
do grupo controle (PPD
+/-
) reativos ao 16 kDa (8,6%), no presente estudo, poderiam ser
incluído em grupo de risco para TB, embora nenhum dos controles tenha desenvolvido
doença no período de 1 ano de acompanhamento. Ou então estes pacientes estariam
respondendo a uma exposição bacilar constante, já que eles são oriundos da mesma
comunidade dos pacientes TB, e cuja prevalência local da TB é de 100/100.000 hab. De
qualquer modo um estudo por período mais longo com indivíduos contatos recente e
passado de TB, poderia fornecer resultados mais esclarecedores.
O Ag MPT-64 (Rv 1980c) é uma proteína secretada durante o crescimento de
Mtb
(YAMAGUCHI e cols, 1989; OETTINGER. & ANDERSEN, 1994; COLANGELI e cols,
1999; GEISBRECHT e cols, 2006). Este Ag tem sido explorado para teste cutâneo, mas
poucos estudos baseados na resposta por Ac tem sido desenvolvido (NAGAI e cols, 1991;
WILCKE e cols, 1996). Em dois estudos realizados na China (WANG e cols, 2005), e
Canadá (COLANGELI e cols, 1999) foram descritas sensibilidades variadas de pacientes P-
TB para o MPT-64. O primeiro, mostrou maior sensibilidade para IgM (78,2%) e IgG
138
(57,7%), e o canadense sensibilidade menor (5%) que o nosso estudo (21,3%), ambos com
maior especificidade (>97 x 93,1%). A discrepância de sensibilidade e especificidade,
considerando que China é também endêmica para TB, pode esta relacionada a diferenças
geográficas de imunreatividade dos pacientes ou até mesmo à cepa BCG vacinal utilizada
neste país (Glaxo), a qual não expressa o MPT-64, diferentemente à cepa BCG Moreau
usada no Brasil, favorecendo melhor sensibilidade e especificidade. O grupo controle do
estudo chinês foi incluído apenas indivíduos saudáveis PPD
-
o que pode ser outro fator a
contribuir para melhor especificidade, minimizando reações cruzadas nos testes, mas o
estudo do Canadá utilizou controle similar ao nosso estudo, mas os pacientes TB eram
HIV
+
. Ambos os autores apontam esta molécula com potencial para compor teste
diagnóstico para TB com outros Ags.
A região RD1 codifica para uma série de moléculas, tal como o ESAT-6, que se
tornaram alvo de estudo no campo do imunodiagnóstico da TB devido a sua presença na
cepa virulenta de
Mtb e M. bovis, e sua ausência na cepa vacinal BCG. Embora este Ag
apresente a vantagem da ausência na cepa vacinal tem apresentado sensibilidade (14% a
100%) e especificidade (44% a 100%) variáveis de acordo com a endemicidade, para TB, e
da região geográfica estudada (ZHANG e cols, 2007; BECK e cols, 2005; GREENAWAY e
cols, 2005; WANG e cols, 2005; SILVA e cols, 2003). Assim como para os outros Ags
testados no
PulmEIA e o KIT L, a reatividade ao ESAT-6 dos pacientes controles PPD
+
e
PPD
-
foi da mesma magnitude. Resultado este similar a recente estudo comparando a
resposta imune humoral a proteína de fusão ESAT-6/CFP-10 em populações com diferentes
graus de exposição à TB tais como Dinamarca, África e Brasil (HOFF e cols, 2007). Este e o
nosso estudo mostraram que as maiores DOs foram encontradas apenas entre os P-TB, mas
a maior parte dos pacientes TB e controles partilharam DOs intermediárias e mais baixas.
139
HOFF e cols (2007) ainda descrevem que a população africana apresentou 100% de
sensibilidade para P-TB, 96% para contatos de TB (PPD
+
) e especificidade de 44%,
enquanto a brasileira produziu percentuais de 60%, 22% e 91%. No nosso estudo a
sensibilidade foi menor (20,2%) e similar especificidade (93,1%). Entretanto, se tivéssemos
utilizado o
cut off aplicado no trabalho de HOFF e cols (2007) nossos resultados seriam
semelhantes aos obtidos por aquele autor na África. Esta discrepância pode está relacionada
à população utilizada nos estudos, enquanto que a nossa foi realizada com soros de pacientes
oriundos de comunidade com 100/100.000 de incidência de TB, havendo, portanto, maior
probabilidade dos pacientes não-TB estarem em constante exposição ao bacilo, para o
estudo daquele autor os pacientes não-TB foram selecionados de diferentes partes da cidade
de São Paulo. Portanto, o grau de exposição dos não-TB pode ter sido menor que os
controles usados no nosso estudo.
Os Ags combinados ESAT-6/CFP-10, bem como o 38kDa/CFP-10, têm-se mostrado
bons marcadores para infecção latente quando da detecção de IFN-
, inclusive em nosso
meio, mas a maioria dos pacientes que apresentam positividade, não desenvolve a doença. O
mesmo ocorreria com os não-TB que apresentam positividade de Ac. Portanto, em regiões
de alta endemicidade, a especificidade e sensibilidade de um teste sorológico podem ficar
comprometidas, o que não ocorre em regiões de menor endemicidade, como mostrado por
HOFF e cols (2007) com soros da Dinamarca, onde 33% dos contatos foram positivos e os
controles PPD
-
não se mostraram reativos.
Enquanto o
PulmEIA 38 kDa detectou 40,8% dos P-TB/BAAR
+
e 20% a 21,7% dos
P-TB/BAAR
-
e PS-TB, respectivamente, o KIT L-IgA detectou maior número de P-
TB/BAAR
-
(50%), mas manteve os mesmos 21,7% obtidos no PulmEIA 38 kDa e 16 kDa
140
para o grupo PS-TB. A imunodominância do 38 kDa em P-TB/BAAR
+
, já descrita em
estudos prévios, só foi partilhada no presente estudo com as combinações 38 kDa/ESAT-6
(2,786 95%IC 1,02 –7,63) e MPT-64/ESAT-6 (3,103, 95%IC 1,08 –8,9). Embora, sem
associação significativa, a combinação destes dois Ags com o 16 kDa mostrou a maior
positividade para P-TB/BAAR
+
(49%) (BOTHAMLEY, 1992; CHAN, HEIFETS &
ISEMAN, 2000; HARRINGTON e cols, 2000; JULIAN e cols, 2000). Infelizmente, nos
grupos que teriam um maior benefício (P-TB/BAAR
-
e PS-TB) a sensibilidade com
qualquer das combinações ficou aquém do obtido na TB confirmada, sugerindo que a
resposta a estes Ags é dependente da carga bacilar. Neste ponto, o KIT L-IgA mostrou-se
mais promissor, mas a maioria dos soros positivos entre os P-TB/BAAR
-
(5/10) eram
cultura
+
(4/5) e a maioria destes pacientes apresentavam lesões radiográficas com alta
probabilidade para TB. Portanto, os Acs IgA nos soros de P-TB reconhecem Ags da
composição do KIT, e este reconhecimento parece está relacionado não só a carga bacilar
mas também a gravidade do quadro clínico, pois a proporção de soros positivos para IgA
entre os PS-TB/cultura
-
foi menor que no PulmEIA 38 kDa-IgG isoladamente ou
combinando os resultados dos outros Ags. Por outro lado, nenhuma associação dos fatores
(grau das lesões pulmonares, cultura ou bacterioscopia) foi associado com positividade no
KIT L-IgA (Tabela 25). Note-se que o número de pacientes testados nestes subgrupos foi
pequeno e isto impede que a análise estatística seja realizada e, portanto, para maiores
conclusões necessita-se aumentar a amostragem. Estudos realizados com soros de pacientes
de diferentes áreas geográficas, inclusive um do Brasil e com maior número de pacientes,
relataram sensibilidades similares ao
PulmEIA 38 kDa (LI e cols, 1998; LODES e cols,
2001; CHAUDHARY e cols, 2005).
141
Vários autores têm descrito maior reatividade média de Acs IgG em TB cultura
+
que
cultura
-
(GUPTA e cols, 1995; ALIFANO e cols, 1997; WIKINSON e cols, 1997;
DEMKOW e cols, 2006), mas nossos resultados não mostraram diferença significativa estes
subgrupos. As freqüências de positividade nos testes sorológicos também não tiveram
impacto significativo, o que foi concordante com os achados de DEMKOW e cols (2006). O
Ag 38 kDa foi quem identificou maior numero de pacientes TB (P-TB/cultura
+
positiva:
32%, P-TB/cultura negativa: 33,2% e 50% em PS-TB), juntamente com o KIT L-IgA
(33,3% e, 66,6% e 33,3%, respectivamente). Os resultados dos Ags combinados não
forneceram positividade mais relevante que o Ag 38 kDa individualmente, confirmando a
imunodominância deste Ag na TB ativa (SILVA e cols, 2003; MCCONKEY e cols, 2002;
DEMKOW e cols, 2006).
Em geral, as médias de DO dos testes sorológicos aqui utilizados não mostraram
diferença significativa nos diferentes estágios clínicos da doença definido pelas variáveis
alterações radiográficas pulmonares entre os TB, mas a freqüência de soros considerados
positivos nos testes mostrou forte associação com os que possuíam resultado da radiografia
do tórax com alta probabilidade para TB, principalmente para o Ag 38 kDa e suas
combinações com ESAT-6, MPT-64 e 16 kDa. Os que apresentavam lesões moderadas a
positividade estava associada apenas aos resultados do 38kDa combinados com os daqueles
Ags. Estes resultados confirmam estudos prévios utilizando entre outros os Ags 38 kDa,
16kDa, ESAT-6 e LAM (DEMKOW e cols, 2006; BECK e cols, 2005; RAMALINGAM e
cols; 2003; SAMANICH e cols, 2001; LAAL e cols, 1997; BOTHALOMEY, 1992;
GREENAWAY e cols, 2005).
142
A imunodominância do Ag 38 kDa-IgG e KIT L-IgA em P-TB e PS-TB com
extensivas e intermediárias lesões pulmonares é acompanhada pelo 16 kDa mas,
preferencialmente, entre os PS-TB seguido do KIT L-IgG (sensibilidade entre 41% e
45,5%). Mas, freqüência de positividade com diferença estatisticamente significativa só foi
encontrada entre os P-TB para KIT L-IgA (p=0,045). No PS-TB para KIT L- e 38 kDa-IgG
a diferença foi borderline (p<0,057). Mas, note-se que o número de pacientes testados neste
grupo foi pequeno, assim um aumento da amostragem forneceria resultados mais precisos.
Contrariamente, aos resultados de detecção de IgG para ESAT-6 em pacientes
africanos com TB e lesão cavitária (76%) e sem lesão (52%)(GREENAWAY e cols, 2005).
Em nosso estudo este Ag apresentou, juntamente com o MT-10.3, menor sensibilidade:
23%, 27% e 0%, respectivamente, para alterações pulmonares extensas, intermediárias e
sem alterações. Mas, isto pode está relacionado ao
cut off estabelecido nos respectivos
estudos, visto que a especificidade no estudo da África foi menor (51%) que na presente
investigação.
A progressão da TB leva ao desenvolvimento de lesões médias e extensivas que pode
resultar da diminuição da resposta celular local, favorecendo o aumento de Ac em pacientes
imunocompetentes não tratados ou nos primeiros meses de tratamento. Sabe-se que a
resposta celular por IFN-
á Ags tais como o ESAT-6 e suas combinações com CFP-10 ou
MPT-64 e 38 kDa/CFP-10 só aumentam após o terceiro ou quarto mês de tratamento do
paciente (AL-ATTIYAH e cols, 2003; FERRAND e cols, 2005; TAVARES e cols, 2007).
Dentro deste quadro, as respostas imunes baseadas em IgG e IgA podem estar se
desenvolvendo sob o lento estímulo dos Ags que estariam sendo produzidos pelos bacilos
em multiplicação. Mas, alguns autores têm levantado que a polarização para a resposta
143
imune humoral por deficiência de resposta celular é controverso, pois a produção de Ac
pode ser um fenômeno inicial ou pode aparecer em função da progressão da doença (ROOK
e cols, 1996). Em estudo recente realizado no Brasil, os Ags 38 kDa, MPT-64, 16 kDa e
MT-10.3, testados individualmente, mantiveram níveis de IFN-
similares ou com tendência
aumentada no grupo TB não tratado x grupo tratado, favorecendo a segunda hipótese
(TAVARES e cols, 2007).
O ESAT-6 e MT-10.3 são descritos serem expressos durante a infecção e
multiplicação do bacilo (SKJOT e cols, 2002; DAVIDOW e cols, 2005). No Brasil, os
pacientes com TB geralmente, comparecerem tardiamente a assistência médica com queixa
respiratória, portanto, a TB ativa apresenta-se em estado mais avançado, como demonstrado
neste estudo em que a maioria dos pacientes com TB já apresentava alterações radiológicas
extensas. Esta condição está associada com a baixa da resposta imune, o que poderia estar
relacionado às sensibilidades mais baixas entre nossos pacientes para ESAT-6 e MT-10.3,
comparados ao 38 kDa, 16 kDa e MPT-64.
Embora o presente estudo não tenha sido desenhado para avaliar o efeito no paciente
do uso de álcool e tabaco, e seu estado imunológico, o questionário obtido durante o estudo
contemplava informação do uso destas drogas. Assim, uma análise superficial da associação
desta variável com a positividade obtida nos testes com os soros dos pacientes TB foi
realizada. Ambos os hábitos são de longa data suspeitos de interferirem com as taxas de
morbidade e mortalidade da TB afetando, entre outros, a resposta imune dos pacientes. Já
nos anos de 1785, Benjamin Rush considerou a TB uma seqüela do alcoolismo (appud
KUEMMERER & COMSTOCK, 1967; MURRAY, 1997).
144
Tem sido descrito que em pacientes alcoolista, embora o número de células B não
estejam significantemente alteradas, a presença de Ac no soro, particularmente os isotipos
IgG e IgA estão aumentados, sugerindo uma polarização em direção à resposta imune
mediada por células Th2 em detrimento de Th1 (NOURI-ARIA e cols, 1986; ROSELLE e
cols, 1988). Em nosso estudo foi observado que os pacientes TB apresentavam maior chance
(5 x) de associação com positividade para MPT-64, embora associação positiva tenha sido
observado também para MT-10.3 e 38 kDa e para a maioria das combinações antigênicas
ensaiadas, e para o KIT L-IgG e IgA, o que em parte corrobora as hipóteses acima.
Por outro lado, a associação com o tabagismo foi negativa, isto é, os pacientes
tabagistas tinham menos chance de se mostrarem positivos aos testes, principalmente para
MPT-64, MT-10.3 e a maioria das combinações envolvendo estes Ags. Estes resultados são
consonantes com estudo prévio mostrando que em tabagistas a resposta imune humoral é
mais baixa que nos não tabagistas. Paralelamente, tem-se descrito que o efeito do cigarro
afeta a imunidade mediada por células envolvendo diversos mecanismos (ARCAVI &
BENOWITZ, 2004). Embora estes achados não sejam conclusivos devido ao desenho do
estudo, e porque outras variáveis podem interferir com a produção de Ac, pelo menos chama
a atenção de que possivelmente estas variáveis devem ser consideradas em estudos de
avaliação da resposta imune humoral com cunho diagnóstico.
Estudos epidemiológicos em vários países mostram que há diferença entre os
gêneros masculino e feminino, na taxa da progressão, incidência e mortalidade da TB. A
taxa de prevalência da doença entre os indivíduos do sexo masculino é maior. Em todas as
Américas é observado que com o decorrer da idade há um aumento de notificações de casos
de TB, envolvendo em sua maioria homens, porém a TB parece matar com mais freqüência,
145
indivíduos do sexo feminino do que qualquer outra infecção (DIWAN e cols 1999;
NISSAPATORN e cols, 2006; WHO, 2007; HINO e cols, 2007). No Rio de Janeiro, TINDÓ
e cols (2004), assim como no presente estudo, observaram que a maioria daqueles que
desenvolvem a doença é do sexo masculino. Apesar da TB acometer mais freqüentemente
indivíduos deste gênero, não foi observado diferença estatisticamente significativa na
freqüência de positividade de Ac, mas
PulmEIA 38 kDa quando combinado com Ags 16
kDa, MPT-64, MT-10.3 e ESAT-6 mostrou associação com sexo masculino superior a 3
vezes no risco de serem positivos nas diferentes combinações destes Ags.
146
8- Conclusão
- MeningEIA para o Ag MPT-64 e a combinação MPT-64/16 kDa para detecção de IgA,
mostrou boa sensibilidade (73,7% e 78,9%) e especificidade (95,5% e 94%) e portanto estes
Ags são promissores para compor teste diagnóstico para M-TB baseado na detecção deste
isotipo.
- Já no
PLEIA o Ag ESAT-6 para detecção de IgA (41,9%) foi o mais reativo no PL-TB.
Este ensaio, entretanto foi menos sensível que o ProtEIA com MPT-64/MT-10.3-IgA (76%),
testado previamente com a mesma amostragem.
- Estes resultados sugerem a imunodominância do Ag MPT-64 na TB extra pulmonar.
- Os resultados para o
MeningEIA MPT-64, 16 kDa-IgA e KIT L-IgG para PTR
3,
sugerem
que há uma correlação positiva com LCR com concentrações mais altas de proteinorraquia
na M-TB, merecendo uma avaliação com maior numero de LCR para confirmar esta
relação.
- A co-infecção por HIV na TBexp não interferiu com a reatividade dos espécimes clínicos
obtidos do local da infecção, para os ensaios de maior sensibilidade. Portanto, a co-infecção
não seria fator impediente no desenvolvimento de teste imunodiagnóstico.
147
- No PL-TB, o KIT L-IgG detectou homogeneamente espécimes diagnosticadas ou não por
cultura e exame histopatológico (>63%). Mas no
PLEIA foi necessário conjugar isotipos de
Ig e Ags para detectar freqüências similares (ESAT-6–IgA, ESAT-6/16kDa-IgA e 38
kDa/16 kDa/ESAT-6-IgM) sugerindo que para a composição antigênica utilizada
in house,
diferentes isotipos de Ig são necessárias para detectar pacientes com diferentes
características clínicas. O
PLEIA aqui estudado mostrou menor acuracia que o KIT L-IgG
nestes pacientes.
- Como teste comercial o KIT L- IgG foi mais sensível tanto para a M-TB (84,2%) como
para PL-TB (65,1%), que os testes
in house. Mas deverão ser usados junto com outros testes
e sinais clínicos para auxiliar no diagnostico rápido.
- Contrariamente na TBexp, a imunodominância do
PulmEIA 38 kDa-IgG foi confirmada
em nossa população com TB pulmonar. O teste apresentou sensibilidade de 33,3% e
especificidade de 91,4%. Combinado com os outros Ags aumentou a sensibilidade para um
máximo de 43,8% com comprometimento da especificidade (77,6%). Os KITs L-IgG e IgA
apresentaram menores sensibilidades (<29,6%) e boa especificidade (<94,2%).
- A positividade ao
PulmEIA 38 kDa (e sua combinação com ESAT-6/MPT-64) foi
fortemente associada com extensas alterações pulmonares (>9 vezes), identificando
homogeneamente tanto os P-TB, com intermediaria e extensas lesões pulmonares (38% e
40%), como os PS-TB (33,3% e 41,6%, respectivamente). É interessante notar que o 16 kDa
detectou a mesma freqüência de positivos nos PS-TB, embora este Ag seja descrito estar
relacionado à TB inativa enquanto o 38 kDa à forma crônica da TB. Mas o baixo número
de soros testados para PS-TB compromete a análise.
148
- Para o KIT L, diferentes isotipos de Ig foram necessários para identificar as diferentes
formas clínicas da TB: IgA reconheceu mais entre os P-TB com médias e extensas lesões
pulmonares (46,1% e 35,9%) e o KIT L-IgG reconheceu os PS-TB com lesões pulmonares
extensas (45,5%).
- Corroborando relatos anteriores de que a combinação de Ags aumenta a positividade dos
testes, as combinações do 38 kDa com os outros Ags, principalmente com MPT-64 e ESAT-
6 apresentaram as maiores chances de positividade na TB.
- Os pacientes TB do sexo masculino mostraram ter maior chance de serem positivos ao 38
kDa quando combinados com os outros Ags, mas isto pode esta relacionada a maior
prevalência de pacientes TB do sexo masculino na amostragem.
- Associação com positividade aos testes, principalmente para MPT-64, seguido de MT-
10.3, 38 kDa e suas combinações, além de KIT L-IgG e –IgA, entre os consumidores de
bebida alcoólica foi observada. Por outro lado, a associação foi negativa entre aqueles com
hábito do tabagismo. Como o desenho de nosso trabalho não foi direcionado para este tipo
de investigação, sugere-se que estudo específico seja realizado para confirmar estes dados.
- Os resultados mostraram que em comunidades frequentemente expostas ao bacilo da TB,
as reatividades entre os indivíduos N-TB também aumenta, mesmo que o Ag seja
considerado de alta especificidade, comprometendo a especificidade do teste. Isto coloca
uma dificuldade para desenvolvimento de testes diagnóstico, para P-TB, baseados na
resposta humoral nas áreas geográficas de alta endemicidade.
149
9- CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os dados aqui descritos impõem uma pergunta: Os testes baseados na resposta imune
humoral têm espaço ou futuro no desenvolvimento de testes sorológicos?
As vantagens de se utilizar de testes imunológicos foram exaustivamente descritas neste
trabalho, mas é importante notar que para a P-TB o desafio é maior que para a TBexp, onde
o uso de múltiplos Ags aponta para um aumento da sensibilidade sem alterar
significativamente a especificidade. Mas na P-TB existe uma série de dificuldades:
- Embora tenha sido observado a imunodominancia do Ag 38 kDa entre os nossos pacientes,
verificou-se que nem todos respondem aos mesmos Ags.
- Há ainda a variedade de produção de isotipos de Ig pelos pacientes de acordo com a
apresentação clinica da doença.
- A co-infecção pelo HIV na TBexp parece não ter interferido com a reatividade dos testes
utilizando espécimes clínicos do local da infecção, mas esta análise não foi possível fazer
entre os P-TB devido ao critério de inclusão adotado, mas a literatura internacional mostra
que pacientes TB/HIV têm resposta deficitária de Ac para Ags micobacterianos.
-O grau de exposição aos Ags micobacterianos da população N-TB pode interferir com a
sensibilidade e especificidade dos testes.
150
Portanto, sumarizando, o perfil dos testes sorológicos correntes na TBpul assim se dá:
Testes com único antígeno nem todos os pacientes reconhecem.
Testes com múltiplos antígenos múltiplos marcadores de positivos para TB
Teste multi-Dot múltiplos Ags marcadores de positivos e negativos para TB
(uma solução?).
Os problemas relacionados acima são impedientes para se ter em curto prazo um
teste simples, rápido, baixo custo e relativamente pouco invasivo. Mas, os diferentes genes
ainda não estudados no genoma micobacteriano são uma fonte onde estaria a solução para o
problema da sorologia. Os Ags aqui descritos, em consonância com a literatura
internacional, mostram suas potencialidades para diagnostico de forma seletiva, quer na P-
TB e TBexp. Mas isto não é suficiente, pois a especificidade nas áreas endêmicas é o
principal problema.
Assim, estratégias de busca de novos Ags ou manipulação dos epitopos de Ags
relevantes podem contribuir para desenvolvimento de testes mais específicos em diferentes
formas ou estágios da TB.
Novos antígenos podem ser descobertos pelo uso da proteômica, analises por
microarray ou manipulação de Ags ou de seus peptídeos através de fusão de proteínas
relevantes ou de polipeptidios específicos de vários Ags ou do mesmo Ag que se revelem
mais reativos para os diferentes estágios da infecção e doença. Assim, sugerimos, por ex.,
um teste em camada (que podera conter quantos Ags foram necessarios para discriminar
entre TB ativa e TB latente):
151
Ag a – mais reativo na TB ativa
Ag b – mais reativo na TB ativa
Ag c – mais reativo na TB ativa
Ag d – mais reativo na TB latente
Ag e – mais reativo na TB latente
Testes: 1 2 3 4
Resultados:
Teste 1- positivo para TB ativa
Teste 2- positivo para TB ativa
Teste 3- positivo para TB latente
Teste 4- negativo para TB
152
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180
11- ANEXOS
11.1-Anexo I
Tampões
1) Tampão Carbonato bicarbonato pH 9.6
Nome Fórmula Peso Molecular peso
Carbonato de sódio NaHCO
3
15mM 0,733g
Bicarbonato de sodio Na
2
CO
3
15mM 0,398g
Água milli Q H
2
O - 250ml
Dissolva o carbonato e bicarbonato de sódio na água (não use o toda a água para
evitar que na hora da correção do pH não ultrapasse o volume desejado) por completo com
ajuda de uma placa agitadora e magneto.
Corriga o pH para 9,6 em seguida coloque num balão volumétrico para acertar o
volume. Coloque o tampão nas garrafas para autoclavar 15 minutos.
Após a esterilização, dentro de um fluxo laminar, aliquotar o tampão em tubos tipo
“falcon” de 15 ml estéreis e congelar a -20°C.
Descongelar apenas no dia do uso
2) Tampão de lavagem (PBSt 0,01% pH 7.4)
Nome Fórmula Peso Molecular peso
Fosfato de sódio dibásico Na
2
HPO
4
90mM 25,6g
Fosfato de sódio monobásico NaH
2
PO
4
18,98mM 5,24g
Cloreto de sódio NaCl 9,92mM 1,16g
Tween 20 Tween 20 - 200µl
Água milli Q H
2
O - 2 L
181
Dissolva o fosfato de sódio monobásico e o dibásico, o cloreto sódio na água por
completo com ajuda de uma placa agitadora e magneto (não use toda a água para evitar que
na hora da correção do pH não ultrapasse o volume desejado).
Corriga o pH para 7,4 em seguida coloque num balão volumétrico para acertar o
volume. Coloque o tampão nas garrafas para autoclavar por 15 minutos.
Após a esterilização congelar o tampão a -20°C.
Descongelar apenas no dia do uso.
3) Tampão de bloqueio (PBSt 0,01% -BSA 5%)
Nome Fórmula Peso Molecular peso
Tampão de lavagem PBSt 0,01% - 300ml
Soro albumina bovina BSA 15g
Adicionar o PBSt no BSA cuidadosamente, vedar o becker com um parafilme e
deixe dissolver naturalmente dentro da geladeira.
NÃO DISSOLVER EM PLACA AGITADORA.
Após dissolver por completo aliquotar em tubos tipo “falcon” de 15 ml e congelar a -
20°C. Descongelar apenas no dia do uso.
4) Tampão de diluição (PBSt 0,01% -BSA 1%)
Nome Fórmula Peso Molecular peso
Tampão de lavagem PBSt 0,01% - 300ml
Soro albumina bovina BSA 3g
Adicionar o PBSt no BSA cuidadosamente, vedar o becker com um parafilme e
deixe dissolver naturalmente dentro da geladeira.
NÃO DISSOLVER EM PLACA.
Após dissolver por completo aliquotar em tubos tipo “falcon” de 15 ml e congelar a -
20°C. Descongelar apenas no dia do uso.
182
5) Acido Sulfúrico a 2,5N
Nome Fórmula Peso Molecular volume
Ácido sulfúrico H
2
NO
4
P.A 70ml
Água milli Q H
2
O 930ml
Numa proveta colocar a água no volume desejado, depois cuidadosamente adicionar
o ácido sulfúrico.
Deixar em temperatura ambiente.
183
11.2- Anexo II
Figura 5 – Curva da padronização do MeningEIA utilizando pools de líquido
cefalorraquiano (LCR) com meningite tuberculosa (C+) e controles (C-) e realizada com
antígenos diluídos a 1µg/mL para detecção de IgG (1:800/1:40:000), IgM (1:20.000) e IgA
(1:20.000/1:2.000)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgG(DO x 1000)
C+ /MPT-64 C-/MPT-64 C+ /MT-10.3 C-/MT-10.3 C+ /38 kDa C-/38kDa C+/16 kDa C-/16 kDa
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgM (DO x 1000)
C+/MPT-64 C-/MPT-64 C+ /MT-10.3 C-/MT-10.3
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgA (DO x1000)
C+ /MPT-64 C-/MPT-64 C+ /MT-10.3 C-/MT-10.3 C+ /38 kDa C-/38kDa C+/16 kDa C-/16 kDa
184
Figura 10 – Curva da padronização do PLEIA utilizando pools de líquido pleural com
tuberculose pleural (C+) e controles (C-) e realizada com antígenos diluídos a 1µg/mL para
detecção de IgG (1:50.000), IgM (1:20.000) e IgA (1:5.000)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgG (DO x 1000)
C+ /38 kDa C-/38kDa C+/16 kDa C-/16 kDa C+/ESAT-6 C-/ESAT-6
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgM (DO x 1000)
C+ /38 kDa C-/38kDa C+/16 kDa C-/16 kDa C+/ESAT-6 C-/ESAT-6
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
1:10 1:20 1:40 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1000 1:1200 1:1600
IgA (DO x 1000)
C+ /38 kDa C-/38kDa C+/16 kDa C-/16 kDa C+/ESAT-6 C-/ESAT-6
185
Figura 16 – Curva da padronização do PulmEIA utilizando pools de soro com tuberculose
pulmonar (C+) e indivíduos saudáveis (C-) e realizada com antígenos diluídos a 1µg/mL,
exceto 16 kDa (0,5µg/mL) para detecção de IgG a 1:2.000.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600
DO x 1000
C+ /MPT-64 C-/MPT-64 C+ /MT-10.3 C-/MT-10.3 C+ /38 kDa C-/38kDa
C+/16 kDa C-/16 kDa C+/ESAT-6 C-/ESAT-6
186
11.3 – ANEXO III
Tabela 7 – Sensibilidade, especificidade e valores preditivos do MeningEIA na detecção de IgG,
IgM e IgA do líquido cefalorraquiano (LCR) para diferentes combinações de antígenos
recombinantes
Numero de positivos/Total (%)
(B)
Combinações
Sensibilidade Especificidade
IgG
MPT-64/MT-10.3 10/19 (52,6) 8/137 (94,1)
MPT-64/38kDa 10/19 (52,6) 9/137 (93,4)
MPT-64/16kDa 9/19 (47,4) 10/137 (92,8)
MT-10.3/38kDa 8/19 (42,1) 6/136 (95,6)
MT-10.3/16kDa 7/19 (36,8) 5/136 (96,3)
38 kDa/16 kDa
8/19 (42,1) 6/135 (65,5)
MPT-64/MT-10.3/38kda 11/19 (58) 11/137 (92)
MPT-64/MT-10.3/16kDa 10/19 (52,6) 11/137 (92)
MPT-64/16 kDa/38 kDa 10/19 (52,6) 11/139 (92,1)
MT-10.3/16kDa/38 kDa 9/19 (47,3) 7/137 (94,8)
Todos Ags 11/19 (58) 12/139 (91,3)
IgM
MPT-64/MT-10.3 8/19 (42,1) 9/139 (93,5)
IgA
MPT-64/MT10.3
14/19 (73,7) 10/134 (92,5)
MPT64/38kDa
14/19 (73,7) 8/132 (94)
MPT-64/16kDa
15/19
(78,9) 9/132 (93,2)
MT-10.3/38kDa 9/19 (47,4) 6/134 (95)
MT-10.3/16kDa 9/19 (47,4) 7/134 (94,8)
38 kDa/16 kDa 7/19 (36,8) 3/58 (95)
MPT-64/MT-10.3/38kda 15/19 (78,9) 11/136 (92)
MPT-64/MT-10.3/16kDa 14/19 (73,7) 12/134 (91)
MPT-64/16 kDa/38 kDa 15/19 (
78,9) 9/133 (93,2)
MT-10.3/16kDa/38 kDa 9/19 (47,3) 9/133 (93,2)
Todos Ags 15/19 (78,9) 12/136 (91,2)
187
Tabela 8 B - Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido cefalorraquidiano
(LCR) de pacientes com meningite tuberculosa (M-TB), meningite não tuberculosa (M-NTB)
e controles (C) no
MeningEIA com diferentes combinações dos antígenos de acordo com a
sorologia para HIV
Nº de positivos / total (%)
M-TB M-NTB C
(B)
Combinações
HIV + HIV - HIV + HIV - HIV + HIV -
IgG
MPT-64/MT-10.3
5/8 (62,5) 5/11 (45,4) 1/16 (6,2) 7/48 (14,6) - 0/73(0)
MPT-64/38kDa
6/8 (75) 4/11(36,3) 2/16(12,5) 8/48 (16,7) - 0/73(0)
MPT-64/16kDa
5/8 (62,5) 4/11(36,3) 2/16(12,5) 8/48 (16,7) - 0/73(0)
MT-10.3/38kDa
5/8 (62,5) 3/11 (27,3) 1/16 (6,2) 4/47 (8,5) - 0/73(0)
MT-10.3/16kDa
4/8 (50) 3/11 (27,3) 1/16 (6,2) 5/47 (10,6) - 0/73(0)
38 kDa/16 kDa 5/8 (62,5) 3/11 (27,3) 1/16 (6,2) 6/46(13) - 0/72(0)
MPT64/MT-10.3/38
6/8 (75) 5/11 (45,4) 2/16(12,5) 9/48 (18,7) - 0/73(0)
MPT64/MT-10.3/16 5/8 (62,5) 5/11 (45,4) 2/16(12,5) 9/48 (18,7) - 0/73(0)
MPT-64/16/38 kDa
6/8 (75) 4/11(36,3) 2/16(12,5) 9/48 (18,7) - 0/73(0)
MT10.3/16/38 kDa 5/8 (62,5) 4/11(36,3) 1/16 (6,2) 6/48 (12,5) - 0/73(0)
Todos Ags
6/8 (75) 5/11 (45,4) 2/16(12,5) 10/48 (20,8) - 0/73(0)
IgM
MPT-64/MT-10.3
4/8(50) 4/11(36,3) 1/16(6,2) 7/46(15,2) - 1/73(1,3)
IgA
MPT-64/MT-10.3
6/8(75) 8/11(72,7) 1/16(6,2) 8/43 (18,6) - 0/73(0)
MPT-64/38kDa
6/8(75) 8/11(72,7) 0/16(0) 7/43 (16,3) - 2/72 (2,8)
MPT-64/16kDa
6/8(75) 9/11 (81,8) 0/16(0) 7/43 (16,3) - 2/72 (2,8)
MT-10.3/38kDa
6/8(75) 3/11 (27,3) 1/16(6,2) 4/42(9,5) - 2/73 (2,7)
MT-10.3/16kDa
6/8(75) 3/11 (27,3) 1/16(6,2) 4/42(9,5) - 2/73 (2,7)
38 kDa/16 kDa 5/8(62,5) 3/11 (27,3) - 1/9(11,1) - 2/49(4,1)
MPT64/MT-10.3/38
6/8(75) 9/11 (81,8) 1/16(6,2) 9/43 (20,9) - 2/73 (2,7)
MPT64/MT-10.3/16
6/8(75) 8/11(72,7) 1/16(6,2) 9/43 (20,9) - 2/73 (2,7)
MPT-64/16/38 kDa
6/8(75) 9/11 (81,8) 0/16(0) 7/43 (16,3) - 2/73 (2,7)
MT10.3/16/38 kDa
6/8(75) 3/11 (27,3) 1/16(6,2) 3/42 (7,1) - 2/73 (2,7)
Todos Ags
6/8(75) 9/11 (81,8) 1/16(6,2) 9/43 (20,9) - 1/73(1,3)
188
Tabela 9B- Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido cefalorraquidiano de
pacientes com meningite tuberculosa (M-TB), meningite não tuberculosa (M-NTB) e
controle (C) no
MeningEIA com as diferentes combinações realizadas com os Ags de
acordo com proteinorraquia.
.Nº de positivos/ total (%)
M-TB M-NTB C
(B)
Ensaios
PTR
1
PTR
2
PTR
3
PTR
1
PTR
2
PTR
3
PTR
1
PTR
2
IgG
MPT-64/MT-10.3 0/2(0) 5/12(41,6) 5/5(100) 1/13(7,7) 2/26(7,7) 5/25(20) 0/68(0) 0/5(0)
MPT-64/38kDa 0/2(0) 5/12(41,6) 5/5(100) 1/13(7,7) 4/26(15,4) 5/25(20) 0/68(0) 0/5(0)
MPT-64/16kDa 0/2(0) 4/12(33,3) 5/5(100) 1/13(7,7) 3/26(11,5) 6/25(24) 0/68(0) 0/5(0)
MT-10.3/38kDa 0/2(0) 4/12(33,3) 4/5(80) 0/13(0) 2/26(7,7) 4/25(16) 0/68(0) 0/5(0)
MT-10.3/16kDa 0/2(0) 2/12(16,6) 5/5(100) 0/13(0) 1/26(3,8) 5/25(20) 0/68(0) 0/5(0)
38 kDa/16 kDa 0/2(0) 3/12(25) 5/5(100) 0/13(0) 2/26(7,7) 4/25(16) 0/67(0) 0/5(0)
MPT64/MT-
10.3/38
0/2(0) 6/12(50) 5/5(100) 1/13(7,7) 4/26(15,4) 6/25(24) 0/68(0) 0/5(0)
MPT64/MT-
10.3/16
0/2(0) 5/12(41,6) 5/5(100) 1/13(7,7) 3/26(11,5) 7/25(28) 0/68(0) 0/5(0)
MPT-64/16/38
kDa
0/2(0) 5/12(41,6) 5/5(100) 1/13(7,7) 4/26(15,4) 6/25(24) 0/68(0) 0/5(0)
MT-10.3/16/38
kDa
0/2(0) 4/12(33,3) 5/5(100) 0/13(0) 2/26(7,7) 5/25(20) 0/68(0) 0/5(0)
Todos Ags 0/2(0) 6/12(50) 5/5(100) 1/13(7,7) 4/26(15,4) 7/25(28) 0/68(0) 0/5(0)
IgM
MPT-64/MT-10.3 0/2(0) 5/12(41,6) 3/5(60) 1/13(7,7) 2/26(7,7) 5/25(20) 1/68(1,5) 0/5(0)
IgA
MPT-64/MT-10.3 1/2(50) 8/12(66,6) 5/5(100) 0/13(0) 6/26(23) 4/21(19) 0/68(0) 0/5(0)
MPT-64/38kDa 1/2(50) 8/12(66,6) 5/5(100) 0/13(0) 3/26(11,5) 4/21(19) 2/68(3) 0/5(0)
MPT-64/16kDa 1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 3/26(11,5) 4/21(19) 2/68(3) 0/5(0)
MT-10.3/38kDa 0/2(0) 4/12(33,3) 5/5(100) 0/13(0) 4/24(16,6) 2/21(9,5) 2/68(3) 0/5(0)
MT-10.3/16kDa 0/2(0) 5/12(41,6) 4/5(80) 0/13(0) 4/24(16,6) 2/21(9,5) 2/68(3) 0/5(0)
38 kDa/16 kDa 0/2(0) 3/12(25) 5/5(100) 0/6(0) 0/2(0) 1/1(100) 2/44(4,5) 0/5(0)
MPT64/MT
-10.3/38 1/2(50) 8/12(66,6) 5/5(100) 0/13(0) 5/26(19,2) 5/21(23,8) 2/68(3) 0/5(0)
MPT64/MT
-10.3/16 1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 5/26(19,2) 5/21(23,8) 2/68(3) 0/5(0)
MPT-64/16/38 kDa 1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 3/26(11,5) 4/21(19) 2/68(3) 0/5(0)
MT
-10.3/16/38 kDa 0/2(0) 5/12(41,6) 4/5(80) 0/13(0) 3/26(11,5) 1/16(6,2) 2/68(3) 0/5(0)
Todos Ags 1/2(50) 9/12(75) 5/5(100) 0/13(0) 5/26(19,2) 5/21(23,8) 2/68(3) 0/5(0)
PTR
1
= níveis de proteína normais (≤ 40 mg/dl), PTR
2
= níveis de proteína alterados (40<PT<300 mg/dl), PTR
3
= níveis de
proteínas elevados (>300 mg/dl).
189
Tabela 10 – Análises de biovariância de fatores associados com a resposta humoral positiva
com diferentes combinações realizadas no
MeningEIA em pacientes com meningite
tuberculosa (19 pacientes).
ODDs Ratio (IC 95%)(B)
Ensaios
PTR
3
HIV + Idade>44anos Masculino
IgG
MPT-64/MT10.3 * 2,000
(0,31-12,84)
1,875
(0,30-11,63)
1,867
(0,28-12,13)
MPT-64/16kDa * 2,917
(0,44-19,23)
3,000
(0,46-19,59)
3,500
(0,47-25,90)
MPT-64/38kDa * 5,250
(0,70-39,47)
4,667
(0,67-32,33)
5,000
(0,65-38,15)
MT-10.3/16 kDa * 2,667
(0,39-19,16)
0,536
(0,08-3,53)
0,667
(0,1-4,54)
MT-10.3/38Da 8,000
(0,67-97,31)
4,444
(0,63-31,29)
0,873
(0,13-5,17)
0,952
(0,14-6,28)
16kDa/38kDa * 4,444
(0,63-31,29)
2,000
(0,31-12,84)
2,500
(0,34-18,32)
MPT-64/MT-
10.3/16kDa
* 2,000
(0,31-12,84)
1,875
(0,3-11,63)
1867
(0,28-12,31)
MPT64/MT-
10.3/38kDa
* 3,600
(0,49-26,40)
2,917
(0,44-19,23)
2,667
(0,39-18,16)
MPT-64/16kDa/38kDa * 5,250
(0,7-39,47)
4,667
(0,67-32,36)
5,000
(0,65-3815)
MT-10.3/16kDa/38kda * 2,917
(0,44-19,23)
1,250
(0,2-7,61)
1,333
(0,2-8,71)
Todos Ags * 3,600
(0,49-26,38)
2,917
(0,44-19,23)
2,667
(0,39-18,16)
IgM
MPT-64/MT-10.3 2,100
(0,25-17,59)
1,750
(0,27-11,15)
2,000
(0,31-12,84)
8,400
(0,75-93,34)
IgA
MPT-64/MT-10.3 * 1,125
(0,14-8,99)
2,000
(0,25-15,99)
0,333
(0,03-3,8)
MPT-64/16kDa * 0,667
(0,07-6,11)
4,500
(0,37-54,15)
0,500
(0,04-6,01)
MPT-64/38kDa * 1,125
(0,14-8,99)
2,000
(0,25-15,99)
0,333
(0,03-3,8)
MT-10.3/16 kDa 5,600
(0,47-66,45)
8,000
(1,00-63,96)
3,000
(0,46-19,59)
1,333
(0,2-8,71)
MT-10.3/38Da 8,000
(0,66-97,31)
13,500
(1,47-123,74)
2,000
(0,31-12,84)
0,952
(0,14-6,28)
16kDa/38kDa 4,000
(0,43-37,12)
15,000
(1,21-185,20)
0,714
(0,1-5,12)
1,429
(0,18-11,08)
MPT-64/MT-
10.3/16kDa
* 0,667
(0,07-6,11)
4,500
(0,37-54,15)
0,500
(0,04-6,01)
MPT-64/MT-
10.3/38kDa
* 1,125
(0,14-8,99)
2,000
(0,25-15,99)
0,333
(0,03-3,8)
MPT64/16kDa/38kDa * 0,667
(0,07-6,11)
4,500
(0,37-54,15)
0,500
(0,04-6,01)
MT-10.3/16kDa/38kda 5,600
(0,47-66,45)
8,000
(1,00-63,96)
3,000
(0,46-19,59)
1,333
(0,2-8,71)
Todos Ags * 0,667
(0,07-6,11)
4,500
(0,37-54,15)
0,500
(0,04-6,01)
*100% de positividade , **0% de positividade; PTR2= níveis de proteína alterados (40<PT<300 mg/dl),
PTR3= níveis de proteínas elevados (>300 mg/dl)
190
Tabela 12 - Média de densidade ótica e DP na pleurisia tuberculosa (PL-TB) e outras pleurisias não
tuberculosa (PL-NTB) sub-agrupadas de acordo com os resultados microbiológicos (cultura) e
histopatológico (biópsia), cujos líquidos pleurais foram ensaiados com
PLEIA e com o KIT L
TBPL N TBPL
Ensaios
Cultura
positiva
Cultura
negativa
Biopsia
positiva
Biopsia
inespecifica
1
Câncer
2
OP
3
IgG
ESAT-6 729,1±631,2 522,1±238,3 551,2±324 546,3±321,6 467,2±234,3 377,8±87,02
38 kDa 515,7±152,7 452,2±157,3 450,3±146,1 496,1±186,4 366,3±156,4 273,7±133,9
16 kDa 579,7±277,3 622,5±342,6 606,5±339,1 645,9±322,1 512,6±244,8 407,7±265,1
Kit L 1115,8 ±370 1094±401 1075,4±378,2 1154,3±463,7 538,2±331,8 508,3±335,1
IgM
ESAT-6 489,6±204,1 416,3±203 414,6±147,5 457,7±312 355,4±217,5 389,8±318,1
38 kDa 174,4±38,4 237,9±99
4
221,3±89,2 248,6±110,3
4
151,6±80,7 138,2±57,1
16 kDa 436±123,2 569,2±238 530,5±229,1 512,3±223,1 455,7±218,4 378,1±97
Kit L 482,4±455,2 438,8±307,7 441,9±343,6 452,3±289,3 174,2±88 280,6±335,9
IgA
ESAT-6 1361±342,6 1232,9±441,7 1243,3±389 1262,3±538 897,1±403,1 792,5±320,8
38 kDa 775,2±138,4 732,7±256,8 715,5±236,3 809,1±252,6 666,6±338 443,2±249,9
16 kDa 1087±135,3 1062,8±416,4 1024,5±353,3 1181,4±464,4 700±371,3 527,1±317,2
Kit L 1173,7±277,8 985,7±477,4 993,3±437,7 1059,6±520 595,4±341,2 473,2±379,5
1
Exame histopatológico inespecífico ou não realizados,
2
carcinoma pulmonar, linfoma,
3
OP= outras doenças
pleurais e pneumológicas.
4
médias significativamente maiores que nos espécimes cultura ou biopsia positiva
(p=0,017)
191
Tabela 14. Freqüência de positividade de IgG, IgM e IgA em líquido pleural (LP) de
pacientes com tuberculose pleural (PL-TB) e pleurisias não tuberculosa (PL-NTB) no
PLEIA e KIT L de acordo com a sorologia para HIV (+:positivo, -: negativo).
Nº de positivos / total (%)
PL-TB PL-NTB
Ensaios
HIV
+
HIV
-
HIV
+
HIV
-
IgG
ESAT - 6 4/9 (44,4) 9/73(12,3) 0/1 (0) 2/33 (6,1)
38 kDa 2/8 (25) 15/71 (21,1) 0/2 (0) 2/33 (6,1)
16 kDa 3/9 (33,3) 22/73 (30,1) 0/2 (0) 4/33 (12,1)
KIT L
5/6 (83,3) 38/60 (63,3) 0/1 (0) 2/24 (8)
ESAT -6/38 kDa 4/9 (44,4) 21/73 (28,7) 0/2 (0) 4/33 (12,1)
ESAT -6/16 kDa 4/9 (44,4) 26/73 (35,6)1 0/2 (0) 5/33 (15,1)
38 kDa/16 kDa 3/9 (33,3) 29/72 (40,3) 0/2 (0) 6/33 (18,2)
38 kDa/16 kDa/ESAT6 4/9 (44,4) 31/73 (42,4) 0/2 (0) 7/33 (21,2)
IgM
ESAT-6 0/9 (0) 8/73 (10,9) 0/1 (0) 3/33 (9,1)
38 kDa 2/8 (25) 25/71 (35,2) 0/2 (0) 2/33 (6,1)
16 kDa
5/9 (55,5) 25/72 (34,7) 0/2 (0) 3/33 (9,1)
KIT L
4/6 (66,7) 28/60 (46,6) 1/1 (100) 1/24 (4)
ESAT -6/38 kDa 2/9 (22,2) 29/73 (39,7) 0/2 (0) 5/33 (15,1)
ESAT -6/16 kDa
5/9 (55,5) 27/73 (37) 0/2 (0) 5/33 (15,1)
16 kDa/38 kDa
5/9 (55,5) 40/72 (55,5) 0/2 (0) 4/33 (12,1)
16 kDa/38 kDa/ESAT6
5/9 (55,5) 43/73 (58,9) 0/2 (0) 6/33 (18,1)
IgA
ESAT-6 2/8 (25) 29/66 (43,9) 1/1 (100) 1/27 (3,7)
38 kDa 2/8 (25) 6/71 (8,4) 0/1 (0) 3/34 (8,8)
16 kDa 3/8 (37,5) 15/71 (21,1) 0/1 (0) 1/32 (3,1)
KIT L
3/6 (50) 33/60 (55) 1/1 (100) 1/24 (4)
ESAT -6/38 kDa 2/8 (25) 29/71 (40,1) 2/2 (100) 4/34 (11,7)
ESAT -6/16 kDa 3/8 (37,5) 32/71 (45,1) 2/2 (100) 2/32 (6,2)
38kDa/16kDa 3/8 (37,5) 18/71 (25,3) 0/1 (0) 4/34 (11,7)
38 kDa/16 kDa/ESAT6 3/8 (37,5) 34/71 (47,9) 1/1 (100) 5/34 (14,7)
192
Tabela 20 – Freqüência de soros positivos, ensaiados no PulmEIA e KITs L, e seus
resultados combinados
(B) dos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose
pulmonar (PS-TB) e dos controles com teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e negativo (PPD
-
).
(A)
Número de positivos/Total (%)
Ensaios
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
MPT – 64
16/61(26,2)
3/28(10,7) 3/54(5,5) 4/58(6,9)
MT -10.3 14/61 (22,9) 2/28(7,1) 2/54(3,7) 4/58(6,9)
38 kDa
22/61(36,1) 8/28(28,6) 4/54(7,4) 5/58(8,6)
16 kDa 10/61(16,4)
5/28(17,8)
4/54(7,4) 5/58(8,6)
ESAT-6 15/61(24, 6) 3/28(10,7) 2/54(3,7) 4/58(6,9)
KIT L - IgG
16/60 (26,7) 6/25(24) 5/50(10) 3/38(7,9)
KIT L - IgM 6/60(10) 2/25(8) 4/50(8) 2/38(5,3)
KIT L - IgA
20/60(33,3) 5/25(20) 4/50(8) 2/38(5,3)
193
Número de positivos/Total (%)
(B)
Ensaios
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
MPT-64/MT-10.3
19/61(31,1) 3/28(10,7) 5/54(9,2) 6/58(10,3)
MPT-64/38 kDa
23/61 (37,7) 9/28(32,1) 8/54(14,8) 7/58(12,1)
MPT-64/16 kDa
20/61(32,8) 7/28(25) 8/54(14,8) 7/58(12,1)
MPT-64/ ESAT-6
22/61(36,1) 5/28(17,8) 4/54(7,4) 7/58(12,1)
MT-10.3/38 kDa
23/61 (37,7) 8/28(28,6) 6/54(11,1) 8/58(13,8)
MT-10.3/16 kDa
19/61(31,1) 6/25(24) 5/54(9,2) 8/58(13,8)
MT-10.3/ESAT-6
21/61(34,4) 4/28(14,3) 4/54(7,4) 7/58(12,1)
38 kDa/16 kDa
24/61(39,3) 11/28(39,3) 8/54(14,8) 8/58(13,8)
38 kDa/ ESAT-6
23/61 (37,7) 8/28(28,6) 4/54(7,4) 8/58(13,8)
16 kDa/ ESAT-6
19/61(31,1) 8/28(28,6) 6/54(11,1) 8/58(13,8)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
23/61 (37,7) 7/28(25) 7/54(12,9) 10/58(17,2)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
24/61(39,3) 9/28(32,1) 7/54(12,9) 10/58(17,2)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
24/61(39,3) 5/28(17,8) 5/54(9,2) 9/58(15,5)
MPT-64/38 kDa/16kDa
25/61(41) 12/28(42,8) 10/54(18,5) 9/58(15,5)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
24/61(39,3) 9/28(32,1) 6/54(11,1) 9/58(15,5)
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
24/61(39,3) 9/28(32,1) 8/54(14,8) 9/58(15,5)
MT-10.3/38 kDa/16kDa
25/61(41) 10/28(35,7) 9/54(16,6) 11/58(20)
MT-10.3/38 kDa/ ESAT-6
24/61(39,3) 8/28(28,6) 6/54(11,1) 10/58(17,2)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
23/61 (37,7) 8/28(28,6) 7/54(12,9) 10/58(17,2)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
25/61(41) 11/28(39,3) 8/54(14,8) 11/58(20)
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa
26/61 (42,6) 12/28(42,8) 10/54(18,5) 11/58(20)
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6
25/61(41) 9/28(32,1) 8/54(14,8) 11/58(20)
MPT-64/MT-10.3/38 / ESAT-6
25/61(41) 9/28(32,1) 7/54(12,9) 11/58(20)
MPT-64/ 38 /16kDa/ESAT-6
26/61 (42,6) 12/28(42,8) 10/54(18,5) 11/58(20)
MT-10.3/16/38/ESAT-6
26/61 (42,6) 11/28(39,3) 9/54(16,6) 13/58(22,4)
Todos os Antígenos
27/61(44,3) 12/28(42,8) 10/54(18,5) 13/58(22,4)
194
Tabela 21- Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o consumo de álcool, cujos soros foram ensaiados com PumlEIA e com o KIT L (A) e seus
resultados combinados
(B)
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(A)
Ensaios
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
MPT-64
10/21 (47,6)
6/40 (15) 3/13 (23,1) 0/15 (0) 0/11 (0) 3/43 (7) 0/14(0) 4/44 (9,1)
MT-10.3
9/21 (42,9) 6/40 (15) 2/13 (15,4) 0/15 (0) 0/11(0) 3/43 (7) 1/14 (7,1) 3/44 (6,8)
38 kDa
11/21 (52,4)
11/40 (27,5) 5/13 (38,5) 3/15 (20) 0/11(0) 4/43 (9,3) 1/14 (7,1) 4/44 (9,1)
16 kDa
4/21 (19,1) 6/40 (15) 3/13 (23,1) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 3/43 (7) 1/14 (7,1) 4/44 (9,1)
ESAT-6
7/21 (33,3) 8/40 (20) 3/13 (23,1) 0/15 (0) 0/11(0) 2/43 (4,6) 2/14 (14,3) 2/44 (4,5)
KIT L - IgG
8/21 (38,1) 8/39 (20,5) 5/13 (38,5) 1/12 (8,3) 2/11 (18,2) 5/39 (12,8) 1/11 (9,1) 2/27 (7,4)
KIT L - IgM
2/21 (9,5) 4/39 (10,2) 1/13 (7,7) 1/12 (8,3) 1/11 (9,1) 3/39 (7,7) 0/11(0) 2/27 (7,4)
KIT L - IgA
11/21 (52,4)
9/39 (23,1) 4/13 (30,8) 1/12 (8,3) 2/11(18,2) 4/39 (10,2) 1/11 (9,1) 1/27 (3,7)
195
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
MPT-64/MT-10.3
11/21 (52,4) 9/40 (22,5) 3/13 (23,1) 0/15 (0) 0/11 (0) 4/43 (9,3) 1/14 (7,1) 5/44(11,3)
MPT-64/38 kDa
12/21 (57,1) 11/40 (27,5) 6/13 (46,1) 3/15 (20) 0/11 (0) 6/43 (13,9) 1/14 (7,1) 6/44 (13,6)
MPT-64/16 kDa
10/21 (47,6) 10/40 (25) 5/13 (38,4) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 6/43 (13,9) 1/14 (7,1) 6/44 (13,6)
MPT-64/ ESAT-6
12/21 (57,1) 10/40 (25) 5/13 (38,4) 0/15 (0) 0/11 (0) 4/43 (9,3) 2/14 (14,3) 5/44(11,3)
MT-10.3/38 kDa
11/21 (52,4) 12/40 (30) 5/13 (38,4) 3/15 (20) 0/11 (0) 6/43 (13,9) 2/14 (14,3) 5/44(11,3)
MT-10.3/16 kDa
8/21 (38,1) 11/40 (27,5) 4/13 (30,7) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 4/43 (9,3) 2/14 (14,3) 5/44(11,3)
MT-10.3/ESAT-6
10/21 (47,6) 11/40 (27,5) 4/13 (30,7) 0/15 (0) 0/11 (0) 4/43 (9,3) 3/14 (21,4) 4/44 (9,1)
38 kDa/16 kDa
10/21 (47,6) 13/40 (32,5) 7/13 (53,8) 4/15 (26,6) 1/11 (9,1) 7/43 (16,3) 1/14 (7,1) 7/44 (15,9)
38 kDa/ ESAT-6
12/21 (57,1) 11/40 (27,5) 5/13 (38,4) 3/15 (20) 0/11 (0) 4/43 (9,3) 2/14 (14,3) 6/44 (13,6)
16 kDa/ ESAT-6
9/21 (42,9) 10/40 (25) 6/13 (46,1) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 5/43 (11,6) 2/14 (14,3) 6/44 (13,6)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
11/21 (52,4) 11/40 (27,5) 5/13 (38,4) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 6/43 (13,9) 2/14 (14,3) 7/44 (15,9)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
12/21 (57,1) 12/40 (30) 6/13 (46,1) 3/15 (20) 0/11 (0) 7/43 (16,3) 2/14 (14,3) 7/44 (15,9)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
12/21 (57,1) 11/40 (27,5) 5/13 (38,4) 0/15 (0) 0/11 (0) 5/43 (11,6) 3/14 (21,4) 5/44(11,3)
MPT-64/38 kDa/16kDa
12/21 (57,1) 13/40 (32,5)
8/13 (61,5) 4/15 (26,6) 1/11 (9,1) 9/43 (21) 1/14 (7,1) 8/44 (18,2)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
13/21 (62) 11/40 (27,5) 6/13 (46,1) 3/15 (20) 0/11 (0) 6/43 (13,9) 2/14 (14,3) 7/44 (15,9)
196
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
Alcoolista
Não
Alcoolista
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
12/21 (57,1) 12/40 (30) 7/13 (53,8) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 8/43 (18,6) 2/14 (14,3) 8/44 (18,2)
MT-10.3/38 kDa/16kDa
11/21 (52,4) 14/40 (35) 7/13 (53,8) 4/15 (26,6) 1/11 (9,1) 8/43 (18,6) 2/14 (14,3) 8/44 (18,2)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
12/21 (57,1) 12/40 (30) 5/13 (38,4) 3/15 (20) 0/11 (0) 6/43 (13,9) 3/14 (21,4) 6/44 (13,6)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
10/21 (47,6) 13/40 (32,5) 7/13 (53,8) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 6/43 (13,9) 3/14 (21,4) 7/44 (15,9)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
11/21 (52,4) 13/40 (32,5) 7/13 (53,8) 4/15 (26,6) 1/11 (9,1) 7/43 (16,3) 2/14 (14,3) 10/44 (22,7)
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa
12/21 (57,1) 14/40 (35) 8/13 (61,5) 3/15 (20) 1/11 (9,1) 9/43 (21) 2/14 (14,3) 9/44 (20,4)
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6
12/21 (57,1) 13/40 (32,5) 7/13 (53,8) 2/15 (13,3) 1/11 (9,1) 7/43 (16,3) 3/14 (21,4) 8/44 (18,2)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6
13/21 (62) 12/40 (30) 6/13 (46,1) 3/15 (20) 0/11 (0) 7/43 (16,3) 3/14 (21,4) 8/44 (18,2)
MPT-64/38 /16kDa/ESAT-6
13/21 (62) 13/40 (32,5) 8/13 (61,5) 3/15 (20) 1/11 (9,1) 9/43 (21) 2/14 (14,3) 9/44 (20,4)
MT-10.3/16kDa/38kDa /ESAT-6
12/21 (57,1) 14/40 (35) 7/13 (53,8) 3/15 (20) 1/11 (9,1) 8/43 (18,6) 3/14 (21,4) 10/44 (22,7)
Todos os Antígenos
13/21 (62) 14/40 (35) 8/13 (61,5) 4/15 (26,6) 1/11 (9,1) 9/43 (21) 3/14 (21,4) 10/44 (22,7)
197
Tabela 22- Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o tabagismo (fumantes e não fumantes), cujos soros foram ensaiados com PumlEIA e com o
KIT L
(A) e seus resultados combinados (B)
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(A)
Ensaios
Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes
MPT-64
6/45 (13,3)
10/16 (62,5)
1/19 (5,3) 2/9 (22,2) 3/28 (10,7) 0/26 (0) 2/29 (6,9) 2/29 (6,9)
MT-10.3
8/45 (17,8) 7/16 (43,7) 0/19 (0) 2/9 (22,2) 3/28 (10,7) 0/26 (0) 2/29 (6,9) 2/29 (6,9)
38 kDa
12/45 (26,6)
10/16 (62,5) 6/19 (31,6)
2/9 (22,2) 2/28 (7,1) 2/26 (7,7) 3/29 (10,3) 2/29 (6,9)
16 kDa
6/45 (13,3) 4/16 (25) 3/19 (15,9) 2/9 (22,2) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 3/29 (10,3) 2/29 (6,9)
ESAT-6
9/45 (20) 6/16 (37,5) 2/19 (10,5) 1/9 (11,1) 1/28 (3,6) 1/26 (3,8) 1/29 (3,5) 3/29 (10,3)
KIT L - IgG
10/45 (22,2)
6/15 (40)
5/16 (31,2)
1/9 (11,1) 4/27 (14,8) 3/23 (13) 2/22 (9,1) 1/16 (6,2)
KIT L - IgM
4/45 (8,9) 2/15 (13,3) 2/16 (12,5) 0/9 (0) 2/27 (7,4) 2/23 (8,7) 1/22 (4,5) 1/16 (6,2)
KIT L - IgA
16/45 (35,5)
4/15 (26,7) 3/16 (18,7) 2/9 (22,2) 5/27 (18,5) 1/23 (4,3) 2/22 (9,1) 0/16 (0)
198
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Combinações
Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes
MPT-64/MT-10.3
10/45(22,2) 10/16 (62,5) 1/19 (5,3) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 0/26 (0) 3/29 (10,3) 3/29 (10,3)
MPT-64/38 kDa
12/45(26,6) 11/16(68,7) 7/19(36,8) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 3/29 (10,3)
MPT-64/16 kDa
9/45(20) 11/16(68,7) 4/19(21) 3/9(33,3) 6/28(21,4) 1/26 (3,8) 3/29 (10,3) 4/29(13,8)
MPT-64/ ESAT-6
11/45(24,4) 11/16(68,7) 3/19 (15,9) 2/9 (22,2) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 3/29 (10,3) 4/29(13,8)
MT-10.3/38 kDa
13/45(29) 10/16 (62,5) 6/19 (31,6) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 3/29 (10,3)
MT-10.3/16 kDa
10/45(22,2) 9/16(56,2) 3/19 (15,9) 3/9(33,3) 4/28(14,3) 1/26 (3,8) 4/29(13,8) 3/29 (10,3)
MT-10.3/ESAT-6
12/45(26,6) 9/16(56,2) 2/19 (10,5) 2/9 (22,2) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 3/29 (10,3) 4/29(13,8)
38 kDa/16 kDa
13/45(29) 11/16(68,7) 6/19 (31,6) 3/9(33,3) 5/28(17,8) 3/26(11,5) 4/29(13,8) 4/29(13,8)
38 kDa/ ESAT-6
13/45(29) 10/16 (62,5) 6/19 (31,6) 2/9 (22,2) 2/28 (7,1) 2/26 (7,7) 3/29 (10,3) 5/29(17,2)
16 kDa/ ESAT-6
11/45(24,4) 8/16(50) 5/19(26,3) 3/9(33,3) 4/28(14,3) 2/26 (7,7) 3/29 (10,3) 5/29(17,2)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
11/45(24,4) 11/16(68,7) 4/19(21) 3/9(33,3) 6/28(21,4) 1/26 (3,8) 4/29(13,8) 5/29(17,2)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
13/45(29) 11/16(68,7) 7/19(36,8) 2/9 (22,2) 5/28(17,8) 2/26 (7,7) 5/29(17,2) 4/29(13,8)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
12/45(26,6) 11/16(68,7) 3/19 (15,9) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 1/26 (3,8) 4/29(13,8) 4/29(13,8)
MPT-64/38 kDa/16kDa
13/45(29) 12/16(75) 9/19(47,3) 3/9(33,3) 7/28(25) 3/26(11,5) 4/29(13,8) 5/29(17,2)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
13/45(29) 11/16(68,7) 7/19(36,8) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 5/29(17,2)
199
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Combinações
Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes Fumantes Não fumantes
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
12/45(26,6) 12/16(75) 6/19 (31,6) 3/9(33,3) 7/28(25) 2/26 (7,7) 3/29 (10,3) 7/29(24,1)
MT-10.3/38 kDa/16kDa
14/45(31,1) 11/16(68,7) 8/19(42,1) 3/9(33,3) 6/28(21,4) 3/26(11,5) 5/29(17,2) 5/29(17,2)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
14/45(31,1) 10/16 (62,5) 6/19 (31,6) 2/9 (22,2) 4/28(14,3) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 5/29(17,2)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
13/45(29) 10/16 (62,5) 6/19 (31,6) 3/9(33,3) 5/28(17,8) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 6/29(20,7)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
13/45(29) 11/16(68,7) 8/19(42,1) 3/9(33,3) 5/28(17,8) 3/26(11,5) 5/29(17,2) 7/29(24,1)
MPT-64/MT-10.3/16/38
14/45(31,1) 12/16(75) 9/19(47,3) 3/9(33,3) 7/28(25) 3/26(11,5) 5/29(17,2) 6/29(20,7)
MPT64/MT10.3/16/ESAT-6
13/45(29) 12/16(75) 6/19 (31,6) 3/9(33,3) 6/28(21,4) 2/26 (7,7) 4/29(13,8) 7/29(24,1)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6
14/45(31,1) 11/16(68,7) 7/19(36,8) 2/9 (22,2) 5/28(17,8) 2/26 (7,7) 5/29(17,2) 6/29(20,7)
MPT-64/38 /16/ESAT-6
14/45(31,1) 12/16(75) 9/19(47,3) 3/9(33,3) 7/28(25) 3/26(11,5) 4/29(13,8) 7/29(24,1)
MT-10.3/16/38/ESAT-6
15/45(33,3) 11/16(68,7) 8/19(42,1) 3/9(33,3) 6/28(21,4) 3/26(11,5) 5/29(17,2) 8/29(27,6)
Todos os Antígenos
15/45(33,3) 12/16(75) 9/19(47,3) 3/9(33,3) 7/28(25) 3/26(11,5) 5/29(17,2) 8/29(27,6)
200
Tabela 23 - Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com o gênero (feminino e masculino), cujos soros foram ensaiados com PumlEIA e com o KIT L (A)
e seus resultados combinados (
B)
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(A)
Ensaios
Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino
MPT-64
4/18 (22,2) 12/43 (27,9) 0/5 (0) 3/23 (13,1) 2/28 (7,1) 1/26 (3,8) 4/30 (13,3) 0/28 (0)
MT-10.3
2/18 (11,1) 13/43 (30,2) 0/5 (0) 2/23 (8,7) 2/28 (7,1) 1/26 (3,8) 2/30 (6,7) 2/28 (7,1)
38 kDa
5/18 (27,3) 17/43 (39,5) 0/5 (0) 8/23 (34,8) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 4/30 (13,3) 1/28 (3,6)
16 kDa
2/18 (11,1) 8/43 (18,6) 0/5 (0) 5/23 (21,7) 0/28 (0) 4/26 (15,4) 4/30 (13,3) 1/28 (3,6)
ESAT-6
4/18 (22,2) 11/43 (25,6) 0/5 (0) 3/23 (13,1) 2/28 (7,1) 0/26 (0) 3/30 (10) 1/28 (3,6)
KIT L - IgG
6/17 (35,3) 10/43 (23,2) 0/5 (0) 6/20 (30) 5/26 (19,2) 2/24 (8,3) 1/16 (6,2) 2/22 (9,1)
KIT L - IgM
2/17 (11,8) 4/43 (9,3) 0/5 (0) 2/20 (10) 2/26 (7,7) 2/24 (8,3) 2/16 (12,5) 0/22 (0)
KIT L - IgA
5/17 (29,4) 15/43 (34,9) 0/5 (0) 5/20 (25) 4/26 (15,4) 2/24 (8,3) 1/16 (6,2) 1/22 (4,5)
201
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino
MPT-64/MT-10.3
4/18 (22,2) 16/43 (37,2) 0/5 (0) 3/23 (13) 2/28 (7,1) 2/26 (7,7) 4/30 (13,3) 2/28 (7,1)
MPT-64/38 kDa
5/18 (27,8) 17/43 (39,5) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 4/28 (14,3) 2/26 (7,7) 6/30 (20) 1/28 (3,6)
MPT-64/16 kDa
4/18 (22,2) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 7/23 (30,4) 2/28 (7,1) 5/26 (19,2) 6/30 (20) 1/28 (3,6)
MPT-64/ ESAT-6
5/18 (27,8) 16/43 (37,2) 0/5 (0) 5/23 (21,7) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 6/30 (20) 1/28 (3,6)
MT-10.3/38 kDa
5/18 (27,8) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 8/23 (34,8) 4/28 (14,3) 2/26 (7,7) 3/30 (10) 3/28 (10,7)
MT-10.3/16 kDa
4/18 (22,2) 15/43 (34,9) 0/5 (0) 6/23 (26,1) 1/28 (3,6) 4/26 (15,4) 4/30 (13,3) 3/28 (10,7)
MT-10.3/ESAT-6
5/18 (27,8) 16/43 (37,2) 0/5 (0) 4/23 (17,4) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 4/30 (13,3) 3/28 (10,7)
38 kDa/16 kDa
5/18 (27,8) 19/43 (44,2) 0/5 (0) 11/23 (47,8) 3/28 (10,7) 5/26 (19,2) 7/30 (23,3) 1/28 (3,6)
38 kDa/ ESAT-6
5/18 (27,8) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 8/23 (34,8) 3/28 (10,7) 1/26 (3,8) 7/30 (23,3) 1/28 (3,6)
16 kDa/ ESAT-6
4/18 (22,2) 15/43 (34,9) 0/5 (0) 8/23 (34,8) 2/28 (7,1) 4/26 (15,4) 7/30 (23,3) 1/28 (3,6)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
4/18 (22,2) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 7/23 (30,4) 2/28 (7,1) 5/26 (19,2) 6/30 (20) 3/28 (10,7)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
5/18 (27,8) 19/43 (44,2) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 3/28 (10,7) 3/26 (11,5) 6/30 (20) 3/28 (10,7)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
5/18 (27,8) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 5/23 (21,7) 3/28 (10,7) 2/26 (7,7) 5/30 (16,7) 3/28 (10,7)
MPT-64/38 kDa/16kDa
5/18 (27,8) 20/43 (46,5) 0/5 (0) 12/23 (52,2) 3/28 (10,7) 6/26 (23,1) 8/30 (26,7) 1/28 (3,6)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
5/18 (27,8) 19/43 (44,2) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 3/28 (10,7) 2/26 (7,7) 8/30 (26,7) 3/28 (10,7)
202
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino Feminino Masculino
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
5/18 (27,8) 19/43 (44,2) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 3/28 (10,7) 6/26 (23,1) 9/30 (30) 1/28 (3,6)
MT-10.3/38 kDa/16kDa
5/18 (27,8) 20/43 (46,5) 0/5 (0) 11/23 (47,8) 3/28 (10,7) 5/26 (19,2) 7/30 (23,3) 3/28 (10,7)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
5/18 (27,8) 15/43 (34,9) 0/5 (0) 8/23 (34,8) 3/28 (10,7) 2/26 (7,7) 6/30 (20) 3/28 (10,7)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
5/18 (27,8) 18/43 (41,8) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 3/28 (10,7) 4/26 (15,4) 7/30 (23,3) 3/28 (10,7)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
5/18 (27,8) 19/43 (44,2) 0/5 (0) 11/23 (47,8) 3/28 (10,7) 5/26 (19,2) 10/30 (33,3) 2/28 (7,1)
MPT-64/MT-10.3/16/38
5/18 (27,8) 21/43 (48,8) 0/5 (0) 12/23 (52,2) 4/28 (14,3) 6/26 (23,1) 8/30 (26,7) 3/28 (10,7)
MPT64/MT10.3/16/ESAT-6
5/18 (27,8) 20/43 (46,5) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 3/28 (10,7) 5/26 (19,2) 8/30 (26,7) 3/28 (10,7)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6
5/18 (27,8) 20/43 (46,5) 0/5 (0) 9/23 (39,1) 4/28 (14,3) 3/26 (11,5) 8/30 (26,7) 3/28 (10,7)
MPT-64/38 /16/ESAT-6
5/18 (27,8) 21/43 (48,8) 0/5 (0) 12/23 (52,2) 4/28 (14,3) 6/26 (23,1) 10/30 (33,3) 1/28 (3,6)
MT-10.3/16/38/ESAT-6
5/18 (27,8) 21/43 (48,8) 0/5 (0) 11/23 (47,8) 4/28 (14,3) 5/26 (19,2) 10/30 (33,3) 3/28 (10,7)
Todos os Antígenos
5/18 (27,8)
22/43 (51,1)
0/5 (0)
12/23 (52,2)
4/28 (14,3) 6/26 (23,1)
10/30 (33,3)
3/28 (10,7)
203
Tabela 24 - Imunoreatividade nos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), indivíduos teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) de acordo com o resultado da baciloscopia (BAAR positivo e
negativo), cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e seus
resultados combinados
(B).
Número de positivos/Total (%)
P-TB
(A)
Ensaios
BAAR
+
BAAR
-
PS-TB
MPT-64
15/49 (30,6) 1/10 (10) 3/23 (10,7)
MT-10.3
12/49 (24,5) 3/10 (30) 2/23 (8,7)
38 kDa
20/49 (40,8)
2/10 (20) 5/23 (21,7)
16 kDa
10/49 (20,4) 0/10 (0) 5/23 (21,7)
ESAT-6
13/49 (26,5) 2/10 (20) 2/23(8,7)
KIT L -IgG
6/48 (12,5) 3/10 (30) 3/23 (13)
KIT L -IgM
6/48 (12,5) 0/10 (0) 2/23 (8,7)
KIT L -IgA
14/48 (29,2)
5/10 (50)
5/23 (21,7)
204
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB
(B)
Ensaios
BAAR
+
BAAR
-
BAAR
-
MPT-64/MT-10.3
16/49 (32,6)
3/10 (30)
3/23 (13)
MPT-64/38 kDa
21/49 (42,8) 2/10 (20) 6/23 (26,1)
MPT-64/16 kDa
19/49 (38,8) 1/10 (10) 7/23 (30,4)
MPT-64/ ESAT-6
20/49 (40,8) 2/10 (20)
4/23 (17,1)
MT-10.3/38 kDa
20/49 (40,8)
3/10 (30)
5/23 (21,7)
MT-10.3/16 kDa
16/49 (32,6)
3/10 (30)
6/23 (26,1)
MT-10.3/ESAT-6
18/49 (36,7)
3/10 (30)
3/23 (13)
38 kDa/16 kDa
22/49 (44,8) 2/10 (20) 8/23 (34,8)
38 kDa/ ESAT-6
21/49 (42,8) 2/10 (20)
5/23 (21,7)
16 kDa/ ESAT-6
17/49 (34,7) 2/10 (20) 7/23 (30,4)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
19/49 (38,8)
3/10 (30)
7/23 (30,4)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
20/49 (40,8)
3/10 (30)
6/23 (26,1)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
20/49 (40,8)
3/10 (30)
4/23 (17,4)
MPT-64/38 kDa/16kDa
23/49 (46,9) 2/10 (20) 9/23 (39,1)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
22/49 (44,9) 2/10 (20) 6/23 (26,1)
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
22/49 (44,9) 2/10 (20) 8/23 (34,8)
MT-10.3/38 kDa/16kDa 22/49 (44,9)
3/10 (30)
8/23 (34,8)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6 21/49 (42,8)
3/10 (30)
5/23 (21,7)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6 20/49 (40,8) 2/10 (20) 7/23 (30,4)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6 23/49 (46,9) 2/10 (20) 8/23 (34,8)
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa 23/49 (46,9)
3/10 (30)
9/23 (39,1)
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6 22/49 (44,9)
3/10 (30)
8/23 (34,8)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6 21/49 (42,8)
3/10 (30)
6/23 (26,1)
MPT-64/ 38 /16kDa/ESAT-6 24/49 (49)
2/10 (20)
9/23 (39,1)
MT-10.3/16/38/ESAT-6 23/49 (46,9) 3/10 (30) 8/23 (34,8)
Todos os Antígenos 24/49 (49)
3/10 (30)
9/23 (39,1)
205
Tabela 25 - Imunoreatividade nos grupos tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de
tuberculose pulmonar (PS-TB), indivíduos teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) de acordo com o resultado da cultura (cultura positivo e negativo),
cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e seus resultados
combinados
(B).
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB
(A)
Ensaios
Cultura
+
Cultura
-
MPT-64
7/25 (28) 1/6 (16,7) 1/6 (16,7)
MT-10.3
8/25 (32) 1/6 (16,7) 1/6 (16,7)
38 kDa
8/25 (32) 2/6 (33,3) 3/6 (50)
16 kDa
1/25 (4) 0/6 (0) 2/6 (33,3)
ESAT-6
5/25 (20) 2/6 (33,3) 1/6 (16,7)
KIT L -IgG
4/24 (16,6) 1/6 (16,7) 2/6 (33,3)
KIT L -IgM
0/24 (0) 1/6 (16,7) 0/6 (0)
KIT L -IgA
8/24 (33,3) 4/6 (66,6)
2/6 (33,3)
206
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB
(B)
Ensaios
Cultura
+
Cultura
-
Cultura
-
MPT-64/MT-10.3
9/25 (36)
1/6 (16,7)
2/6 (33,3)
MPT-64/38 kDa
8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/16 kDa
7/25 (28) 1/6 (16,7) 2/6 (33,3)
MPT-64/ ESAT-6
8/25 (32)
2/6 (33,3)
2/6 (33,3)
MT-10.3/38 kDa
9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MT-10.3/16 kDa
8/25 (32) 1/6 (16,7) 2/6 (33,3)
MT-10.3/ESAT-6
9/25 (36)
2/6 (33,3)
2/6 (33,3)
38 kDa/16 kDa
8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
38 kDa/ ESAT-6
8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
16 kDa/ ESAT-6
6/25 (24)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
9/25 (36)
1/6 (16,7)
2/6 (33,3)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
9/25 (36)
2/6 (33,3)
2/6 (33,3)
MPT-64/38 kDa/16kDa
8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
8/25 (32) 2/6 (33,3) 3/6 (50)
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
9/25 (36) 2/6 (33,3) 3/6 (50)
MT-10.3/38 kDa/16kDa 8/25 (32) 2/6 (33,3) 2/6 (33,3)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6 9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6 9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6 8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa 9/25 (36) 2/6 (33,3) 3/6 (50)
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6 9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6 9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MPT-64/ 38 /16kDa/ESAT-6 8/25 (32)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
MT-10.3/16/38/ESAT-6 9/25 (36) 2/6 (33,3) 3/6 (50)
Todos os Antígenos 9/25 (36)
2/6 (33,3)
3/6 (50)
207
Tabela 26- Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com resultado da radiografia do tórax, cujos soros foram ensaiados com PumlEIA e com o KIT L (A)
e seus resultados combinados (B).
Nº de positivos/ total (%)
P-TB PS-TB
(A)
Ensaios
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
MPT-64 1/8 (12,5) 4/13 (30,8) 11/40 (27,5) 0/7 (0) 1/9 (13,6) 2/12 (16,7)
MT-10.3 2/8 (25) 3/13 (23,1) 9/40 (22,5) 0/7 (0) 1/9 (13,6) 1/12 (8,3)
38 kDa 1/8 (12,5) 5/13 (38,4) 16/40 (40) 0/7 (0) 3/9 (33,3) 5/12 (41,6)
16 kDa 0/8 (0) 2/13 (15,4) 8/40 (20) 1/7 (14,3) 3/9 (33,3) 5/12 (41,6)
ESAT-6 0/8 (0) 4/13 (30,8) 11/40 (27,5) 0/7 (0) 2/9 (22,2) 1/12 (8,3)
KIT L –IgG 0/8 (0) 4/13 (30,8) 12/39 (30,1) 0/6 (0) 1/8 (12,5) 5/11 (45,5)
KIT L –IgM 0/8 (0) 2/13 (15,4) 4/39 (10,2) 0/6 (0) 0/8 (0) 2/11 (18,2)
KIT L - IgA 0/8 (0) 6/13 (46,1) 14/39 (35,9) 1/6 (16,7) 2/8 (25) 2/11 (18,2)
208
Nº de positivos/ total (%)
P-TB PS-TB
(B)
Ensaios
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
MPT-64/MT-10.3 2/8 (25) 4/13 (30,7) 14/40 (35) 0/7 (0) 2/9 (22,2) 3/12 (25)
MPT-64/38 kDa 1/8 (12,5) 5/13 (40,8) 17/40 (42,5) 0/7 (0) 3/9 (33,3) 6/12 (50)
MPT-64/ 16 kDa 1/8 (12,5) 5/13 (40,8) 14/40 (35) 1/7 (14,3) 3/9 (33,3) 3/12 (25)
MPT-64/ ESAT-6 1/8 (12,5) 5/13 (40,8) 16/40 (40) 0/7 (0) 2/9 (22,2) 3/12 (25)
MT-10.3/38 kDa 2/8 (25) 5/13 (40,8) 16/40 (40) 0/7 (0) 3/9 (33,3) 5/12 (41,7)
MT-10.3/16kDA 2/8 (25) 5/13 (40,8) 16/40 (40) 1/7 (14,3) 3/9 (33,3) 2/12 (16,7)
MT-10.3/ESAT-6 2/8 (25) 5/13 (40,8) 16/40 (40) 0/7 (0) 2/9 (22,2) 2/12 (16,7)
38Kda/16kDa 1/8 (12,5) 6/13 (46,1) 17/40 (42,5) 1/7 (14,3) 4/9 (44,4) 4/12 (33,3)
38kDa/ESAT-6 1/8 (12,5) 6/13 (46,1) 6/40 (40) 0/7 (0) 3/9 (33,3) 5/12 (41,7)
16kDa/ESAT-6 0/8 (0) 5/13 (40,8) 14/40 (35) 1/7 (14,3) 4/9 (44,4) 3/12 (25)
209
Nº de positivos/ total (%)
P-TB PS-TB
(B)
Ensaios
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
Baixa
Probabilidade
Média
Probabilidade
Alta
Probabilidade
MPT-64/MT-10.3/38kDa/
2/8 (25)
5/13 (40,8)
17/40 (42,5)
0/7 (0) 3/9 (33,3) 6/12 (50)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
2/8 (25)
5/13 (40,8) 15/40 (37,5) 1/7 (14,3) 3/9 (33,3) 3/12 (25)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
2/8 (25)
5/13 (40,8)
16/40 (40)
0/7 (0) 2/9 (22,2) 3/12 (25)
MPT-64/38kDa/16kDa 1/8 (12,5) 6/13 (46,1)
18/40 (45)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
7/12 (58,3)
MPT-64/38kDa/ESAT-6 1/8 (12,5) 6/13 (46,1)
17/40 (42,5)
0/7 (0) 3/9 (33,3) 6/12 (50)
MPT-64/16kDa/ESAT-6 1/8 (12,5) 6/13 (46,1)
17/40 (42,5)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
4/12 (33,3)
MT-10.3/38kDa/16kDa 2/8 (25)
6/13 (46,1)
17/40 (42,5)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
6/12 (50)
MT-10.3/38kDa/ESAT-6 2/8 (25)
6/13 (46,1)
16/40 (40)
0/7 (0) 3/9 (33,3) 5/12 (41,7)
MT-10.3/16kDa/ESAT-6 2/8 (25)
6/13 (46,1)
15/40 (37,5)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
4/12 (33,3)
38kDa/16kDa/ESAT-6 1/8 (12,5) 7/13 (53,8) 16/40 (40) 1/7 (14,3) 4/9 (44,4) 6/12 (50)
MPT-64/MT-10.3/38kDa/16kDa 2/8 (25)
6/13 (46,1)
18/40 (45)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
7/12 (58,3)
MPT-64/MT-10.3/38kDa/ESAT-6 2/8 (25)
6/13 (46,1)
17/40 (42,5)
0/7 (0) 3/9 (33,3) 6/12 (50)
MPT-64/MT-10.3/16kDa/ESAT-6 2/8 (25)
6/13 (46,1)
17/40 (42,5)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
4/12 (33,3)
MT-10.3/38kDa/16kDa/ESAT-6 2/8 (25) 7/13 (53,8) 17/40 (42,5)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
6/12 (50)
Todos os Antígenos 2/8 (25) 7/13 (53,8) 18/40 (45)
1/7 (14,3)
4/9 (44,4)
7/12 (58,3)
210
Tabela 27- Imunoreatividade na tuberculose pulmonar (P-TB), suspeita de tuberculose pulmonar (PS-TB), teste tuberculinico positivo (PPD
+
) e
negativo (PPD
-
) sub-agrupadas de acordo com marca da vacinação BCG (com cicatriz e sem cicatriz), cujos soros foram ensaiados com
PumlEIA e com o KIT L (A) e seus resultados combinados (B).
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(A)
Ensaios
Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz
MPT-64
7/24 (29,2) 9/37 (24,3) 2/16 (12,5) 1/12 (8,3) 2/27 (7,4) 1/27 (3,7) 2/28 (7,1) 2/30 (6,6)
MT-10.3
5/24 (20,8) 10/37 (27) 1/16 (6,2) 1/12 (8,3) 1/27 (3,7) 2/27 (7,4) 3/28 (10,7) 1/30 (3,3)
38 kDa
9/24 (37,5) 13/37 (35,1) 3/16 (18,7) 5/12 (41,6) 0/27 (0) 4/27 (14,8) 1/28 (3,6) 4/30 (13,3)
16 kDa
3/24 (12,5) 7/37 (18,9) 3/16 (18,7) 2/12 (16,7) 2/27 (7,4) 2/27 (7,4) 2/28 (7,1) 3/30 (10)
ESAT-6
6/24 (25) 9/37 (24,3) 0/16 (0) 3/12 (25) 0/27 (0) 2/27 (7,4) 2/28 (7,1) 2/30 (6,6)
KIT L - IgG
7/23 (30,4)
9/37 (24,3) 2/14 (14,3) 4/11 (36,4) 1/24 (4,2) 6/26 (23,1) 2/19 (10,5) 1/19 (5,3)
KIT L - IgM
3/23 (13) 3/37 (8,1) 2/14 (14,3) 0/11 (0) 2/24 (8,3) 2/26 (7,7) 0/19 (0) 2/19 (10,5)
KIT L - IgA
5/23 (21,7) 15/37 (40,5) 2/14 (14,3) 3/11 (27,3) 1/24 (4,2) 5/26 (19,2) 2/19 (10,5) 0/19 (0)
211
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz
Cicatriz Sem cicatriz
MPT-64/MT-10.3
7/24 (29,2) 13/37 (35,1) 2/16 (12,5) 1/12 (8,3) 2/27 (7,4) 2/27 (7,4) 3/28 (10,7) 3/30 (10)
MPT-64/38 kDa
9/24 (37,5) 14/37 (37,8) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 4/27 (14,8) 2/28 (7,1) 5/30 (16,7)
MPT-64/16 kDa
8/24 (33,3) 12/37 (32,4) 4/16 (25) 3/12 (25) 3/37 (11,1) 3/27 (11,1) 3/28 (10,7) 4/30 (13,3)
MPT-64/ ESAT-6
8/24 (33,3) 14/37 (37,8) 2/16 (12,5) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 2/27 (7,4) 3/28 (10,7) 4/30 (13,3)
MT-10.3/38 kDa
9/24 (37,5) 14/37 (37,8) 3/16 (18,7) 5/12 (41,6) 1/27 (3,7) 5/27 (18,5) 2/28 (7,1) 5/30 (16,7)
MT-10.3/16 kDa
7/24 (29,2) 12/37 (32,4) 3/16 (18,7) 3/12 (25) 3/37 (11,1) 2/27 (7,4) 3/28 (10,7) 4/30 (13,3)
MT-10.3/ESAT-6
8/24 (33,3) 13/37 (35,1) 1/16 (6,2) 3/12 (25) 1/27 (3,7) 3/27 (11,1) 4/28 (14,3) 3/30 (10)
38 kDa/16 kDa
10/24 (41,7) 14/37 (37,8) 4/16 (25)
7/12 (58,3)
2/27 (7,4) 6/27 (22,2) 2/28 (7,1) 6/30 (20)
38 kDa/ ESAT-6
9/24 (37,5) 14/37 (37,8) 3/16 (18,7) 5/12 (41,6) 0/27 (0) 4/27 (14,8) 3/28 (10,7) 5/30 (16,7)
16 kDa/ ESAT-6
8/24 (33,3) 11/37 (29,7) 3/16 (18,7) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 4/27 (14,8) 4/28 (14,3) 4/30 (13,3)
MPT-64/MT-10.3/16kDa
8/24 (33,3) 14/37 (37,8) 4/16 (25) 2/12 (16,7) 4/27 (14,8) 3/27 (11,1) 4/28 (14,3) 5/30 (16,7)
MPT-64/MT-10.3/38kDa
9/24 (37,5) 15/37 (40,5) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 5/27 (18,5) 3/28 (10,7) 6/30 (20)
MPT-64/MT-10.3/ESAT-6
8/24 (33,3) 15/37 (40,5) 2/16 (12,5) 3/12 (25) 2/27 (7,4) 3/27 (11,1) 4/28 (14,3) 4/30 (13,3)
MPT-64/38 kDa/16kDa
10/24 (41,7) 15/37 (40,5) 5/16 (31,2)
7/12 (58,3)
4/27 (14,8) 6/27 (22,2) 3/28 (10,7) 6/30 (20)
MPT-64/38 kDa/ESAT-6
9/24 (37,5) 15/37 (40,5) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 4/27 (14,8) 3/28 (10,7) 6/30 (20)
212
Número de positivos/Total (%)
P-TB PS-TB PPD
+
PPD
-
(B)
Ensaios
Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz Cicatriz Sem cicatriz
Cicatriz Sem cicatriz
MPT-64/16 kDa/ESAT-6
9/24 (37,5) 15/37 (40,5) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 4/27 (14,8) 5/27 (18,5) 4/28 (14,3) 6/30 (20)
MT-10.3/38 kDa/16kDa
10/24 (41,7) 15/37 (40,5) 4/16 (25)
7/12 (58,3)
3/37 (11,1) 6/27 (22,2) 3/28 (10,7) 7/30 (23,3)
MT-10.3/38kDa/ ESAT-6
9/24 (37,5) 15/37 (40,5) 3/16 (18,7) 5/12 (41,6) 1/27 (3,7) 5/27 (18,5) 4/28 (14,3) 5/30 (16,7)
MT-10.3/16 kDa/ESAT-6
9/24 (37,5) 14/37 (37,8) 3/16 (18,7) 6/12 (50) 3/37 (11,1) 4/27 (14,8) 5/28 (17,8) 5/30 (16,7)
38 kDa/16 kDa/ ESAT-6
10/24 (41,7) 14/37 (37,8) 4/16 (25)
7/12 (58,3)
2/27 (7,4) 6/27 (22,2) 4/28 (14,3) 8/30 (26,7)
MPT-64/MT-10.3/16/38kDa
10/24 (41,7) 16/37 (43,2) 5/16 (31,2) 6/12 (50) 4/27 (14,8) 6/27 (22,2) 4/28 (14,3) 7/30 (23,3)
MPT-64/MT-10.3/16/ESAT-6
9/24 (37,5) 16/37 (43,2) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 4/27 (14,8) 4/27 (14,8) 5/28 (17,8) 6/30 (20)
MPT-64/MT-10.3/38/ESAT-6
9/24 (37,5) 15/37 (40,5) 4/16 (25) 5/12 (41,6) 2/27 (7,4) 5/27 (18,5) 4/28 (14,3) 7/30 (23,3)
MPT-64/38 /16kDa/ESAT-6
10/24 (41,7) 16/37 (43,2) 5/16 (31,2)
7/12 (58,3)
4/27 (14,8) 6/27 (22,2) 4/28 (14,3) 7/30 (23,3)
MT-10.3/16/38kDa /ESAT-6
10/24 (41,7) 16/37 (43,2) 4/16 (25)
7/12 (58,3)
3/37 (11,1) 6/27 (22,2) 5/28 (17,8) 8/30 (26,7)
Todos os Antígenos
11/24 (45,8) 17/37 (45,9) 5/16 (31,2)
7/12 (58,3)
4/27 (14,8) 6/27 (22,2) 5/28 (17,8) 8/30 (26,7)
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