( PDF ) Estudo do polimorfismo IIe 462 Val do gene CYP1A1 em pacientes com Câncer colorretal

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PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM

ESTUDO DO POLIMORFISMO Ile 462 Val DO GENE

CYP1A1 EM PACIENTES COM CÂNCER

COLORRETAL

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo - EPM, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências.

Orientadora : Profa Dra Nora Manoukian Forones

Co-orientador: Prof. Dr. Ismael Dalle Cotrim Guerreiro da Silva

São Paulo

2005

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III

PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM

Universidade Federal de São Paulo

Escola Paulista de Medicina

Disciplina de Gastroenterologia Clínica

Chefe do Departamento de Medicina:

Profa Dra Emilia Inoue Sato

Cordenador do Programa de Pós -Graduação:

Prof. Dra. Maria Lucia Gomes Ferraz

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PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM

POLIMORFISMO Ile 462 Val NO GENE

CYP1A1 EM PACIENTES COM CÂNCER COLORRETAL

Presidente da Banca: Profa. Dra. Nora Manoukian Forones

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. _________________________________________

Aprovado em: ____/___/___

A Deus, pelo dom da vida, pelas grandes dificuldades e imensas conquistas, pois

apenas com a superação das dificuldades se conquista as grandes vitórias

Aos meus pais, Cecília e Waldemar, meus melhores e grandes amigos por seu

eterno amor e apoio em todos os momentos de minha vida.

Aos meus amados marido Rui e filhos Bruna e Guilherme, pelo incentivo, imenso

amor, estando sempre ao meu lado, sem vocês esta conquista não seria possível.

As minhas irmãs Myrian Tânia e Vanessa, vocês sempre estiveram presentes em

minhas maiores vitórias.

Agradecimentos

À Profa. Dra Nora Manoukian Forones, chefe da disciplina de Gastroenterologia

da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, orientadora, pelo respeito e

confiança depositadas e por sua dedicação à orientação deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, professor-adjunto e

coordenador do Laboratório de Ginecologia Molecular do departamento de

Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, co-orientador, pela

oportunidade e co-orientação deste trabalho.

A Prof Dra Maria Lucia Gomes Ferraz, coordenadora do programa de Pós

Graduação da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo

UNIFESP, pela oportunidade de realizar o estudo.

As minhas amigas pós graduandas Jacqueline Miranda de Lima e Lessileia

Gomes Souza da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São

Paulo UNIFESP pela amizade e incentivo e companheirismo sempre presente. Esta

vitória também é de vocês.

As amigas pós graduandas Fabíola Elizabeth Vilanova e Audrey Yumi Otsuka e

técnica Tatiana dos Santos do Laboratório de Ginecologia Molecular do

Departamento de Ginecologia da Medicina da Universidade Federal de São Paulo

UNIFESP pelo carinho e incentivo em todos os momentos.

Aos pós graduandos e residentes Dr.Jaime Zaladek Gil, Dr. Luciana Zaia

Polvegliano, Marta Medeiros, Vanessa Maria Nunes Roque, Lidiane Pereira da

Silva da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo

UNIFESP-EPM pelo incentivo na realização deste trabalho.

VII

À Dra. Celina Tizuko Fujiyama Oshima do Laboratório da Disciplina de

Anatomia Patológica da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP pelo

interesse e apoio constante durante a execução desta tese.

À Auxiliar de enfermagem Vera Lucia de Souza do Ambulatório

Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM , por seu

carinho e sua disposição em colaborar na execução deste trabalho

Aos secretários Magali Angélica Romano e Valdir Sophia, da disciplina de

Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, pelo interesse e

atenção durante a elaboração desta tese

Ao Dr Fabio Tadeu Montesano pela disponibilidade e execução dos métodos de

estatísticos deste trabalho

As minhas amigas Maria Enéas Serafim, Márcia Batista Serafim Fillocomo e

Shirley de Fátima Serafim Pereira que estiveram sempre presente incentivado com

sua alegria e torcendo por mim.

Aos pacientes que atenciosamente colaboraram para que esse trabalho pudesse ter

sido realizado.

“A beleza da vida consiste na simplicidade implícita nas novas descobertas de cada

dia e de como a enxergamos”

VIII

Sumário

Lista de Tabelas---------------------------------------------------------------------------------X

Listas de Quadros e Figuras-----------------------------------------------------------------XII

Abreviaturas--------------------------------------------------------------------------------------XIII

Resumo-------------------------------------------------------------------------------------------XIV

Abstract

1. Introdução..................................................................................................01

1.1 Objetivos...................................................................................................

2. Revisão de literatura.................................................................................

2.1 Câncer ......................................................................................................

2.2 Câncer colorretal.......................................................................................

2.3 Citocromo P 450 .......................................................................................

2.4 Polimorfismo genético no gene CYP1A1..................................................

3. Casuística e Métodos ...............................................................................

3.1 Casuística .................................................................................................

3.1.1. Descrição dos Grupos...........................................................................

3.2 Métodos ....................................................................................................

3.2.1. Extração do DNA genômico..................................................................

3.2.2 Quantificação de DNA............................................................................

3.2.3. Reações de amplificação (PCR) ...........................................................

3.2.4. Análise do polimorfismo no gene CYP1A1............................................

3.3. Analise Estatística....................................................................................

4. Resultados.................................................................................................

4.1 PCR e Genotipagem por R.F.L.P..............................................................

4.2 Comparação entre Controles e Pacientes.................................................

4.3 Análise de correspondência......................................................................

4.4 Estudo entre os Alelos e Variáveis............................................................

4.5 Estudo das Características Ligadas à Doença..........................................

4.6 Analise de Sobrevivência..........................................................................

5. Discussão .................................................................................................

6. Conclusão..................................................................................................

7. Anexos1 ....................................................................................................

Lista de Tabelas

Tabela 1: Características dos Oncogenes e Genes supressores de

tumor. ................................................................

................................

Tabela 2: Distribuição de pacientes e controles quanto ao sexo.

................................

Tabela 3: Distribuição de pacientes e controles quanto à etnia.

................................

Tabela 4: Distribuição de pacientes e controles quanto à história

familiar de câncer.................................................................

................................

Tabela 5: Distribuição de pacientes e controles quanto ao etilismo.

................................

Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles quanto ao tabagismo.

..............................

Tabela 7: Distribuição de pacientes e controles quanto aos alelos

estudados.................................................................

................................

Tabela 8: Resultados da comparação entre pacientes e controles.

................................

Tabela 9: Medidas descritivas da idade dos indivíduos, segundo grupo.

..........................

Tabela 10: Distribuição de variáveis quanto aos alelos

................................

Tabela 11. Distribuição da amostra quanto ao grau de diferenciação

celular.................................................................

................................

Tabela 12. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Sexo

...............................

Tabela 13. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etnia

...............................

Tabela14. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e História

familiar ................................................................

................................

Tabela 15. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etilismo

..........................

Tabela 16. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Tabagismo................................................................

................................

Tabela 17. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Alelos

.............................

Tabela 18. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Grau de

diferenciação................................................................

................................

Tabela19. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Localização ................................................................

................................

Tabela 20. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Classificação T................................................................

................................

Tabela 21. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Classificação N................................................................

................................

Tabela 22. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Classificação M................................................................

................................

Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Estadiamento................................................................

................................

Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e

Estadiamento................................................................

................................

Tabela 24. Resultados do estudo da associação entre cada variável e a

situação atual, isoladamente................................

................................

Tabela 25. Resultados do primeiro modelo ajustado.................................

...........................

Tabela 26. Resultados do modelo ajustado, excluindo-se a variável

estadiamento ................................................................

................................

XII

Listas de Quadros e Figuras

Quadro 1: Estádio do câncer colorretal ................................

..................

Quadro 2 : Classificação das famílias, subfamílias e genes

individuais ................................................................

.............

Quadro 3: Substrato e funções da família, sub-família e dos

genes do citocromo humano................................

..................

Quadro 4. Características das pacientes do grupo I.

.............................

Quadro 5: Características das pacientes do grupo II (grupo

controle).................................................................

................

Figura1: NADPH-Citocromo redutase................................

..................

Figura 2: Apresenta a foto da separação eletroforética,

demonstrando amplificação do produto de PCR

com tamanho de 340 pb.................................

.......................

Figura 3: Apresenta foto de separação eletroforética,

demonstrado os sítios de restrição com tamanhos

de 340bp, 200bp e 140 bp.................................

....................

Figura 4: Gráfico da análise de correspondência.

................................

Figura 5. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo

de Cox, segundo o estadiamento da doença.

........................

Figura 6. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo

de Cox, segundo a etnia dos pacientes.

................................

XIII

Abreviaturas

Bp Pares de base

CCR Câncer Colorretal

CEA Antígeno Carcinoembrionário

CYP Citocromo P450

CYP1A1 Citocromo P450 da familia 1 A 1

DNA Acido Desoxirribonucleico

GIST Tumor Estromal Gastrointestinal

HAA Aminas Aromáticas

HNPCC Câncer colorretal hereditário não polipoide

M Metástase

N Linfonodos

T Tumor

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

PHAs Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos

R.F.L.P. Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição

RNA Ácido Ribonucleíco

UICC Union International Against Cancer

UV Ultravioleta

GST Glutationa-S-transferase

UDP Glucuronusiltranferase

NAT N-acetiltransferase

XIV

Resumo

Introdução: A enzima Citocromo P450 é integrante de uma superfamília de

proteínas organizadas em famílias, subfamílias e genes individuais com base na

porcentagem de identidade entre as seqüências de aminoácidos. Essas enzimas

desempenham o importante papel de metabolisar e detoxificar diversos compostos.

A família do gene CYP1 é induzida pelo receptor aril hidrocarboneto hidroxilase

(AHH) que acarretará na ativação dos hidrocarbonetos policíclico aromático (PAHs),

presente em vários compostos resultando em um aumento da atividade da enzima.

Foram descritos na literatura dois polimorfismos associados ao gene CYP1A1,

transição T→C na região 3’ não codificadora, e uma outra transição de A → G

(Ile462 Val, exon 7). Cada uma das alterações dão origem a sítios de restrição MspI .

Somente o polimorfismo T→C recebe o nome da enzima MspI. Entretanto, apenas o

polimorfismo.

A→G demonstra ter associação com o aumento da inducibilidade do gene

CYP1A1demonstrando um maior significância e de interesse para esse estudo.

Objetivo: investigar a incidência do polimorfimo A → G (Ile462 Val, exon 7) e sua

associação com câncer colorretal, correlacionando com alguns fatores de risco da

doença .

Casuística e Método: Foram selecionados 114 pacientes portadores de câncer

colorretal e 114 indivíduos sem câncer que constituíram o grupo controle. Todos

foram submetidos à entrevista e a coleta de sangue periférico para extração do DNA

genômico. Investigamos a presença do polimorfismo do gene CYP1A1 utilizando

técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) e reação de genotipagem por

técnica de RFLP. As amostras foram analisadas por meio de corrida eletroforética

em gel de agarose e gel Low melting para a identificação da presença do

polimorfismo .

Resultados: No grupo caso, 64 eram do sexo masculino, 96 eram da etnia branca,

10 negros e 8 amarelos, 53 eram etilistas , 68 tabagistas, 59 tinham historia de

câncer . Em relação ao polimorfismo estudado 14 eram homozigotos selvagem A/A,

97 heterozigoto A/G e 3 homozigotos mutados : No grupo controle, 61 eram do sexo

masculino, 99 eram da etnia branca e 15 eram negros , 67 eram etilistas , 53

tabagistas, 40 tinham história de câncer . Em relação ao polimorfismo estudado 81

eram homozigotos selvagem A/A, 33 heterozigoto A/G. O tabagismo, historia familiar

de câncer e a presença do alelo G foram mais freqüentes entre os indivíduos com

câncer. Não observamos correlação entre a evolução da doença e freqüência dos

alelos. Os pacientes de etnia amarela e estádio III tiveram maior índice de

recorrência da doença.

Conclusão: Para estudar a associação conjunta dos fatores estudados com

a presença ou ausência da doença, verificou-se que a característica mais ligada à

doença foi a presença do alelo G. Observou-se um aumento da proporção do alelo

A/G e G/G em três vezes, no grupo de pacientes com câncer colorretal em relação

ao grupo controle. Sugerindo que a enzima CYP1A1 possa ser um marcador de

risco para a doença. O uso do tabaco e história familiar positiva foram mais

freqüentes entre os doentes com câncer. Não foi encontrada correlação entre o

polimorfismo e sexo, grau de diferenciação, estádio ou evolução da doença.

XVI

Abstract

Introduction The enzyme Citocromo P450 is an integrant of a super family of

proteins organized in families, subfamilies and individual genes based on the

percentual of the identity of the amino acid sequences. These enzymes play an

important role in the metabolization and detoxification of various compounds. The aril

hydro-carbon hidroxilase (AHH) receptor induce the family of the gene CYP1

responsible for the activation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), that are

present in high concentration in cigarette smoke, polluted air and foods.

Two polymorphisms of the gene CYP1A1 has been described, one on the transition

T→C in the 3' noncoding region, and the other one in the A→ G transition (Ile462 Val,

exon 7). Both the polymorphisms generate fragments that are digestion sites of MspI,

but only the T→C polymorphism receives the name of MspI enzyme. Due to its high

inducibility of the CYP1A1 gene polymorphism A→G had a bigger interest.

AIM: to investigate the incidence of the polymorphism A→ G (Ile462 Val, éxon 7) in

colorectal cancer patients and the correlation of this polymorphism and others risk

factors.

Patients and Method: 114 patients with colorectal cancer and 114 without cancer

matched by age with the case group were included in the control group. All of the

patients had been submitted to an interview and peripheral blood was drawn for DNA

extraction. The presence of the polymorphism in the CYP1A1 gene was determined

by a specific polymerase chain reaction (PCR) and RFLP technique. The samples

had been analyzed agarosis electrophoresis gel and gel Low melting for the

identification of the presence of the polymorphism.

Results: In the case group 64 were male, being 96 white, 10 blacks and 8 yellows,

53 were etilists, 68 smokers, and 59 had family history of cancer. In the relation of

the polymorphism studied 14 were wild homozygous A/A, 97 heterozygous A/G and 3

homozygous mutated G/G. In the control group 61 were male, 99 were white race

and 15 black, 67 were etilists, 53 smokers, 40 had history of cancer, and 81 were wild

homozygous A/A and 33 heterozygous A/G. The percentual of smokers, the familiar

XVII

history of cancer and the presence of the allele G had been more frequent in the

cancer group. The asiatics and stage III patients had higher index of recurrence of the

disease.

Conclusion: The presence of the G had been the most important aspect observed

when the characteristics studied were correlated to the presence of cancer. The

colorectal cancer group had a higher proportion of A/G or G/G alleles in 3 times.

These results suggest that the CYP1A1 Val allele may be a marker of risk for the

disease. The tabagism and positive history of cancer were also more frequent in the

patients with cancer. There were not found any correlation among this polymorphism

and sex, grade of differentiation, stage or evolution of the disease.

XVIII

______________________________________________

INTRODUÇÃO

XIX

1. INTRODUÇÃO

O câncer como doença é definido por suas propriedades de proliferação local

descontrolada de células, com invasão de estruturas normais adjacentes, e pela

disseminação à distância, ou metástase, através da corrente sanguínea dos linfáticos

ou em uma cavidade do organismo (Willard, 2002).

Mundialmente, o câncer de cólon e reto somam cerca de 943 mil novos casos a

cada ano, ocupando o quinto lugar entre os mais incidentes. Segundo dados do INCA

as estimativas para 2005 indicam que o câncer de colón e reto é a quarta neoplasia

mais incidente em ambos os sexos. A maior incidência de casos ocorre na faixa etária

entre 50 e 70 anos de idade, porém a possibilidade de desenvolvimento já aumenta a

partir dos 40 anos de idade (Instituto Nacional do Câncer INCA online, 2005).

Muitos carcinógenos químicos são metabolicamente ativados acarretando

efeitos deletérios em nosso organismo (Hayashi et al, 1991). A conversão pelo

citocromo P450 (CYP) em derivados hidrofílicos facilita a sua eliminação. A

superfamília de genes CYP450 codifica numerosas enzimas que catalizam uma notável

variedade de reações químicas e um grande número de substratos.

Consequentemente, o CYP450 é considerado o sistema biológico de catalização mais

versátil (Conforti, 2004).

Presume-se que no genoma humano existam em torno de 60 a 100 genes

codificadores de P450, e cerca de 20 deles estão envolvidos na codifição de enzimas

que metabolizam compostos exógenos (Conforti, 2004)

O CYP foi primeiramente descrito na década de 1960, e recebeu esta

terminologia pela presença de um pigmento com ação enzimática e pela faixa de

absorção no espectro de 450 nanômetros. Ainda em meados de 1960, foi associado ao

metabolismo de esteróides e drogas. Em 1970 foram estudadas algumas enzimas

associadas à membrana celular e a um sistema de detoxificação de metabólitos

(Nebert, Russell, 2002).

Aproximadamente por volta de 1980 Gonzalez e colaboradores isolaram o

primeiro RNA mensageiro (mRNA) completo de um citocromo P 450, localizado no

cromossomo 15 no lócus MPl, obtendo muitos resultados a partir da clonagem de

diferentes enzimas. De acordo com as seqüências, identificaram similaridade entre o

citocromo de humanos e bactérias. As isoenzimas P450 foram divididas em famílias,

com base em sua relação evolutiva determinada pelo grau de homologia de genes

individuais, e assim, estruturas de aminoácidos nas proteínas (Okey, 1990).

O citocromo P450 é uma enzima que atua principalmente na presença de

carcinógenos da dieta e do tabaco. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs)

gerados pela combustão de alguns carcinógenos, incluindo os existentes no tabaco são

metabolizados por esta enzima (Badawi et al , 1996).

Estudos com os genes do citocromo P 450 humanos têm demonstrado que

estes são polimórficos e diferem nas populações quanto à origem racial e étnica

(Badawi et al, 1996).

Estas diferenças determinadas geneticamente, são responsáveis pelas

diferentes respostas às drogas e carcinógenos (Song et al, 2001).

Estudos caso-controle mostram um aumento do risco relativo para o câncer em

indivíduos portadores do genótipo C, (indivíduos homozigotos mutados G/G), em

relação aos indivíduos que apresentam os genótipos A, (homozigotos tipo selvagem

A/A) e B (heterozigotos A/G), com o consumo do tabaco (Hayashi et al, 1991).

Ensaios foram realizados na pesquisa de alterações genéticas ligadas à

presença dos polimorfismos associado a mutações nos alelos da região 3’ no sitio MspI

e do exon 7 (Inoue et al, 2000), que acarretará a troca de uma interleucina por valina.

Estes polimorfismos genéticos no gene CYP1A1 aumentam o risco do

desenvolvimento de câncer de pulmão. No câncer colorretal ainda não há um consenso

quanto à associação entre o polimorfismo e maior risco de desenvolvimento da doença

(Kampman et al,1999, Inoue et al, 2000, Song et al, 2001, Sivaraman et al, 1994).

XXI

1.1 Objetivos

1. Avaliar a eventual correlação entre o polimorfismo Ile 462 Val no gene CYP1A1

com a presença de adenocarcinoma colorretal.

2. Correlacionar à presença do polimorfismo com o tabagismo, etilismo, etnia,

idade, sexo, estádio anátomo-patológico, grau de diferenciação e evolução do

câncer colorretal.

XXII

____________________________________________________________

Revisão de Literatura

XXIII

2. Revisão de Literatura

2.1 Câncer

O termo câncer deriva de Karkinos, palavra grega que significa caranguejo e

como uma entidade clínica, está nos primeiros escritos gregos e romanos, e assumiu

uma posição de importância especial como doença muito temida e objeto de pesquisa

biomédica intensiva (Chanber et al, 1993)

A maioria dos cânceres origina-se de uma célula única, geneticamente

alterada. Vários tumores possuem células homozigóticas para certos marcadores, para

os quais o hospedeiro é heterozigoto o que sugere sua clonalidade (Chanber et al,

1993). À medida que o tumor cresce e produz metástase, vários subclones celulares

emergem, conferindo heterogeneidade à população celular maligna. Instabilidade

genética e progressão tumoral, onde as células tumorais passam pelas fases do ciclo

celular (G0, G1, MS, G2,) são as características básicas do câncer (Murad, 1996).

O crescimento de uma população celular depende do tempo gasto para a

realização do ciclo celular (tempo decorrido entre duas mitoses sucessivas), da fração

do crescimento porcentagem de célula que ativamente passam pelo ciclo celular e da

taxa de perda celular (Murad,1996).

Existem três formas principais de câncer os sarcomas, nos quais o tumor

surgiu em tecido mesenquimal, tal como o tumor de osso, músculos ou tecido

conjuntivo; os carcinomas, que se originam no tecido epitelial, tal como as células que

revestem o intestino, os brônquios ou os ductos mamários e as malignidades

hematopoéticas e linfóides, tais como as leucemias e os linfomas, que se espalham

pela medula óssea, pelo sistema linfático e sangue periférico. Dentro de cada um dos

grupos principais, os tumores são classificados de acordo com o local, os tipos de

tecido, o aspecto histológico e o grau de malignidade (Cooper, 2001).

A neoplasia ocorre em decorrência de um desequilibrio entre a proliferação

celular e apoptose. As células proliferam a medida que passam pelo ciclo celular e

sofrem mitoses. A morte celular programada da célula remove as células de um tecido

XXIV

por meio de um processo normal de fragmentação do DNA e suicídio celular chamado

de apoptose (Willard, 2002).

Os processos de divisão celular são regulados por uma grande gama de

genes. Amplas pesquisas realizadas durante as ultimas décadas revelaram que

mutações nos genes que controlam a proliferação e a morte são responsáveis pelo

câncer. Na maioria dos cânceres, as mutações ocorrem em uma única célula somática,

que então se divide e promove o câncer. Quando o câncer ocorre como parte de uma

síndrome de câncer hereditário, as mutações iniciais são herdadas por meio da

linhagem germinativa e, portanto, estão presentes em cada célula do organismo. Uma

vez iniciado, o câncer evolui pelo acúmulo adicional de danos genéticos, por meio de

mutação nos genes que codificam a maquinaria celular que repara o DNA danificado e

mantém a normalidade citogenética. Os danos a estes genes produzem uma cascata

maior de mutações em um número crescente de genes que controlam a proliferação

celular e o reparo aos danos no DNA. Deste modo, o clone original da célula

neoplásica pode evoluir em várias sublinhagens de graus variados de malignidade,

cada uma carreando um conjunto de mutações que são diferentes das mutações de

outras sublinhagens (Willard, 2002).

Desta maneira acredita-se que o câncer é o resultado de alterações estruturais

e/ou funcionais de alguns genes cuja função é controlar o crescimento normal e a

diferenciação das células que compõem o organismo. As alterações genéticas

envolvem tanto a amplificação e ativação de proto-oncogenes quanto mutações que

levam à perda e/ou à inativação dos alelos de genes supressores de tumor. A tabela 1

sumariza as principais características dos oncogenes e genes supressores de tumor.

Uma ou mais mutações podem ser herdadas ou podem surgir como conseqüência da

exposição a carcinógenos ambientais ou a agentes infecciosos.(Conforti, 2004).

XXV

Tabela 1. Características dos Oncogenes e

Supressores de tumor.

Características Oncogene

Supressores de tumor

Número de eventos mutacionais para

o desenvolvimento tumoral

Um Dois

Atividade demonstrada em ensaios de

Transfecção

Sim Sim

Função do alelo mutante Dominante

(ganho de função)

Recessiva

(perda de função)

Associação com síndromes de câncer

hereditário

Raramente

(proto-oncogene)

Frequentemente

Mutações somáticas contribuem para

o desenvolvimento do câncer

Sim Sim

Fonte: Conforti, 2004

Os oncogenes são formas alteradas dos proto-oncogenes, genes envolvidos no

controle da proliferação celular, que podem diferir tanto na estrutura quanto na função

da proteína codificada pelo seu homólogo normal e que são envolvidos no processo de

transformação maligna (Jensen, Hunter, 2001)

O que torna as mutações ocorridas nas células cancerosas diferentes é a

seleção positiva para a proliferação celular ou sobrevida da célula. É o fenótipo de uma

célula cancerosa, sua proliferação descontrolada e excessiva, permitindo que uma

célula mutante se desenvolva em doença. Em contraste, muitas vezes as mutações

fazem com que uma célula dentre muitas, perca a função ou morra sem causar efeitos

fenotípicos por que a perda da célula é mascarada pela grande maioria das outras

saudáveis em um órgão ou tecido (Cooper, 2001).

Enquanto as proteínas controladas por oncogenes promovem o câncer em

geral por mutações com ganho de função ou pelo aumento ou expressão imprópria de

um alelo do gene, existem muitos outros genes nos quais as mutações contribuem para

a malignidade por um mecanismo diferente: com a perda de função de ambos os alelos

do gene. Tais genes são genes supressores de tumor. Os genes supressores tumorais

XXVI

são altamente heterogêneos. Alguns são verdadeiros supressores tumorais, no sentido

de que estão diretamente envolvidos na regulação do ciclo celular ou na inibição do

crescimento pelo contato célula-célula (Lodish et al, 2002).

Os supressores tumorais foram chamados de genes protetores, pois regulam

diretamente o crescimento celular. Outros genes, chamados de genes de manutenção,

estão envolvidos em reparar danos de DNA e manter a integridade genômica. A perda

de ambos os alelos dos genes que estão envolvidos em reparar danos no DNA ou

quebras cromossômicas leva indiretamente ao câncer, pois permitem que mutações

secundárias adicionais se acumulem em proto-oncogenes ou em outros genes

supressores tumorais. Os produtos de muitos genes supressores tumorais foram

isolados e estes são por natureza protetores contra o câncer. O melhor entendimento

destes mecanismos contribuirá na evolução de terapias anticâncer (Lodish et al, 2002).

2.2 Câncer Colorretal

O câncer colorretal é predominantemente uma doença de pessoas com idade

superior aos 50 anos de idade. No Brasil, é a 4ª causa de câncer em homens e a 3ª

em mulheres, sendo também a 5ª causa de morte por câncer nos homens e a 3ª. entre

as mulheres. O câncer colorretal será responsável por 7230 óbitos e 16165 casos

dessa doença serão diagnosticados neste ano (Instituto Nacional do Câncer – INCA

online, 2005).

Em relação ao sexo, a freqüência entre mulheres foi ligeiramente superior que

entre homens (11,73: 10,96 casos novos a cada cem mil habitantes). Há

predominância dos cânceres nos segmentos do lado esquerdo (descendente, sigmóide

e reto em 70%), seguidos em menor freqüência pelo ascendente e transverso (Forones

et al, 2004).

O adenocarcinoma é responsável por mais de 90% das neoplasias de cólon e

reto. Sarcomas, mielomas, carcinóides, tumores estromais gastrointestinais (GIST) e

linfomas ocorrem raramente. Os tumores são classificados segundo o grau de

diferenciação, como moderado, pouco diferenciado e indiferenciado. O estudo do

tecido tumoral permite avaliar as invasões venosas, neurais e linfáticas (Forones et al,

2004).

XXVII

O diagnóstico das neoplasias colorretais baseia-se no quadro clínico e em

exames complementares. A queixa mais freqüente é alteração de hábito intestinal,

diarréia na maioria dos tumores de cólon direito e obstipação nos de cólon esquerdo.

No câncer de reto, as queixas principais são afilamento das fezes, eliminação de muco

serossangüinolento e dor para evacuar. Perda de peso e astenia leve costuma ocorrer.

Parada de eliminação de fezes e flatos há algumas horas, acompanhada de distensão

abdominal e dor, caracterizando quadro de abdome agudo obstrutivo podem ser os

sintomas iniciais da doença em 10% dos doentes com câncer de cólon esquerdo

(Forones et al, 2004).

Laboratorialmente, o paciente poderá apresentar: anemia ferropriva

hipocrômico-microcítica, assim como perda de sangue oculto nas fezes. A

gamaglutamiltranspeptidase e a fosfatase alcalina poderão apresentar-se elevadas,

devido a metástases hepáticas acompanhadas, nesses casos, de discreta elevação

das transaminases séricas. O antígeno carcinoembrionário (CEA) é um marcador

tumoral que se eleva em aproximadamente 50% dos doentes, principalmente nos

estádios avançados (III e IV) e quando elevado, ao diagnóstico da doença, é um fator

de pior prognóstico (Minsky, 2002).

A colonoscopia e /ou a retossigmoidoscopia permite a confirmação diagnóstica

pelo aspecto da lesão e pelo estudo anatomopatológico da biópsia dirigida. A

visualização de todo o cólon é necessária porque podem existir tumores sincrônicos

(lesões concomitantes em outra região colônica) em 7 a 10 % dos doentes. Nos

tumores obstrutivos que impedem a passagem do aparelho, a colonoscopia deve ser

realizada nos primeiros meses de acompanhamento pós-operatório. O enema opaco

também permite o diagnóstico da lesão, mas é menos sensível.

A ultra-sonografia endoscópica permite determinar o grau de invasão da

parede intestinal pelo tumor e presença de linfonodos, possibilitando melhor estádio

pré-operatório dos tumores de reto (Berlin, 2001).

O câncer colorretal pode ser classificado pela União Internacional Contra o

Câncer (Union International Against Câncer - UICC), segundo a infiltração tumoral (T),

invasão de linfonodos (N) e a presença de metástases (M), ou pela classificação de

XXVIII

Dukes ou de Dukes modificada por Aster Coller (Quadro1) (Forones et al, 2004; Astler,

Coller, 1954).

Os fatores de prognóstico principais são: níveis séricos dos marcadores

tumorais, tamanho do tumor primário, grau de diferenciação histopatológica e estádio

(Aster, Coller, 1954).

Quadro1: Estádio do câncer colorretal

Classificação Estadiamento

Dukes

Aster-Coller

Estádio

II A

II B

III A

III B

III C

A Tumor limitado á mucosa e muscular

B Tumor invade todas as camadas do intestino

C Tumor com metástase em linfonodo independente da penetração tumoral

A Tumor limitado a mucosa

B1 Tumor invade a muscular própria

B2 Tumor invade todas as camadas do intestino

B3 Tumor invade órgãos adjacentes

C1 Tumor invade a muscularis própria com metástase linfonodal

C2 Tumor invade todas as camadas do intestino com metástase linfonodal

C3 Tumor invade órgãos adjacentes com metástase linfonodal

D Metástase á distância

TNM

TisN0M0

T1N0M0

T2N0M0

T3N0M0

T1N0M0

T2N1M0

T3-4N1M0

TqN2M0

TqNqM1

Fonte: Forones et al,2004.

Tis = tumor in situ, T1 = invasão de mucosa, T2 = invasão de muscular principal,. T3 = invasão de serosa

ou gordura, T4 = invasão através da serosa para outros órgãos. Tq = qualquer dos T , N0 = sem

metástase linfonodal, N1 = 1 a 3 linfonodos comprometidos, N2 = > 4 linfonodos comprometidos ao longo

de grandes vasos, M0 = sem metástase á distância, M1 = com metástase á distância

XXIX

Os fatores que levam uma pessoa a desenvolver a neoplasia são a

predisposição genética associada a fatores ambientais. A associação do consumo

excessivo de carnes vermelhas, principalmente preparadas em altas temperaturas,

dietas pobres em resíduos e fibras, está relacionada ao aumento significativo do câncer

colorretal. Situações onde ocorrem aumentos dos sais biliares ao nível dos intestinos,

como alimentação rica em gordura e pacientes que retiraram a vesícula biliar,

aumentam a predisposição à doença

(Heath et al, 2001)

Fatores de risco para o desenvolvimento do câncer colorretal podem incluir

ambos os fatores hereditários e ambientais (Heath et al, 2001). Entre os fatores

ambientais, químicos genotóxicos, assim como ingesta de alimentos co-carcinogênicos,

podem estar envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal, alguns desses

agentes são formados durante o preparo dos alimentos, como aminas heterociclicos

aromáticos (HAA) (Terry et al, 2002).

2.3 Citocromo P 450

O citocromo é um termo genérico de uma superfamília de hemoproteínas,

formada por uma parte protéica (apoproteína) e outra por um grupo heme

monoxigenase em forma de proporfirina IX. Todos os CYPs possuem íons não-

covalentes e são classificadas com base nas seqüências de aminoácidos

(Pirmohamed, Park, 2003). Os CYPs estão localizados na sua grande maioria nas

membranas intracelulares do retículo endoplasmático celular, mas também podem se

localizar na membrana da mitocôndria e na membrana citoplasmática. Em seres

humanos os CYPs se localizam, principalmente, no fígado, e em menor quantidade no

tubo gastrointestinal (Weide, Steijins, 1999).

Numerosos genes do citocromo P450 codificam diferentes enzimas. Para fins

práticos estes genes estão agrupados em famílias, sub-famílias e genes individuais. A

nomenclatura do sistema caracteriza-se pelo acréscimo de um número arábico à sigla

CYP que caracteriza a família (exemplo CYP1, CYP2), de uma letra maiúscula que

caracteriza a sub-família (CYP1A, CYP1B), e novamente de um número arábico que

indicam um gene individual que codifica uma única enzima (CYP1A1, CYP2E10)

XXX

(Weide, Steijins, 1999). As famílias apresentam uma similaridade ≥ 55% entre si e as

subfamílias apresentam identidade ≥ 40% (Gonzalez, Gelboin,1993).

Atualmente existem 270 famílias diferentes, 249 genes são ativos e 24 são não

funcionais ou pseudogenes. Em humanos existem 57 genes humanos e 33

pseudogenes, estes são agrupados em 18 famílias e 42 subfamílias (Quadro 2)

(Gonzalez, Gelboin,1993).

Quadro 2 : Classificação das famílias, subfamílias e genes individuais

Fonte: Weide et al, 1999

O citocromo p450 atua numa enorme gama de substratos que incluem

vitaminas, esteróides, ácidos graxos, prostaglandinas, aminase, xenobióticos, tais

como drogas (incluindo antibióticos), carcinógenos ambientais, antioxidantes,

solventes, anestésicos, corantes, pesticidas, produtos derivados do petróleo, álcoois,

entre outros (Quadro 3).

Família

CYP1

CYP2

CYP3

Subfamília

CYP1A →

CYP2E

Gene individual

CYP1A1

CYP1B2

XXXI

Quadro 3: Substrato e funções das sub-famílias e dos genes do citocromo

humano

N˚ de subfamília

. de genes

Substrato e Funções

Ácidos araquidônico, ecoisanóides

Ácidos araquidônico,ecoisanóides

Ácidos araquidonico, graxos e

ecoisanóides

Ácidos graxos, araquidônicos e

ecoisanóides

Tromboxano Sintetase

Colesterol, síntese de ácido biliar

Prostaciclina síntese de ácido biliar

Esteróides

Esterol 17 hidroxilase

Aromatase

Desconhecido

Esterol 21 hidroxilase

Vitamina D, 24 hidroxilase

Hidroxilação de acido retinoico

Biossíntese de ácido biliar,

24 hidroxicolesterol

24 hidroxilase colesterol

14 desmetilase colesterol

Fonte: (Nebert, Russell, 2002).

A maioria das reações inicia-se pela transferência de elétrons da NAD(P)H

para o citocromo P450 NADPH redutase, no sistema microssomal ou para a ferroxina

redutase e então, para o citocromo P450. Isso leva a uma ativação reduzida do

oxigênio molecular, seguido da inserção de um átomo de oxigênio no substrato. As

reações incluem hidroxilação, epoxidação, peroxidação, desaminação, desulfuração,

XXXII

desalogenação, bem como redução. A maior parte dos substratos é lipofílico e não há

evidências de que as interações de carga contribuam para a união pelo citocromo.

Algumas das transformações são essenciais para a vida, como a conversão do

colesterol a corticóide e hormônios sexuais; outras particularmente com relação aos

xenobióticos, conduzem a formação de compostos mais polares, mais facilmente

excretáveis diretamente, ou a conjugação com agentes hidrossolúveis, como o ácido

glicurônico e a glutationa. A conjugação representa o processo de detoxificação,

contudo grande parte dos compostos estranhos é convertida, mediado pelo CYP450, a

produtos com poder aumentado de citotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade.

Alguns dos CYP450, tais como os envolvidos na transformação de esteróides, são

bastante seletivos em suas escolhas para os substratos, enquanto outros CYP450

particularmente os do microssomo hepático, não possuem, comumente ampla

especificidade de encaixe (Conforti, 2004)

Figura1: NADPH-Citocromo redutase

Fonte: Google/imagem (online)

NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase

O DPH-citocromo P450 redutase existe em todos os tecidos mediando

reações de substratos endógenos que ocorrem em nosso esteróides, ácidos

graxos e prostaglandinas e exogenas como drogas terapêuticas, tóxicos

ambientais e carcinógenos.organismo incluindo

XXXIII

De uma forma simplista podemos dizer que a estrutura da enzima possui sítios para

atracar duas moléculas constituindo duas fases (Gonzalez, Gelboin, 1993).

● Fase I – mediado pelo metabolismo oxidativo que consiste na adição do

grupamento hidroxila a um átomo de carbono (Okei,1990). Este pode ser

catalisado por uma reação de hidroxilação, onde o Citocromo utiliza o oxigênio

como substrato. Desta forma os compostos são convertidos por reação oxidativa

em metabolitos eletrofilicos (Nebert, Russell, 2002).

RH + O

+ 2H

+ 2e

ROH + H

● Fase II - o grupamento hidroxila funciona como substrato para a adição de co-

substrato hidrofílico, para a conjugação da Glutationa-S-transferase (GST), UDP-

Glucuronusiltranferase e N-acetiltransferase (NAT) (Nebert, Russell, 2002).

Entre as principais funções podemos citar:

a. Função detoxificadora – elimina substâncias exógenas como drogas,

substâncias carcinogênicas, transformando substâncias hidrossolúveis em

lipossolúveis (Conforti-Frosis,1998).

b. Função metabolizadora – metabolismo endógeno, participando no metabolismo

de esteróides, vitaminas, sais biliares, ácidos graxos saturados ou insaturados,

ecosainóides

De uma forma geral, o substrato ativa a produção de enzimas. No citocromo

P4501A1 primeiramente o químico tóxico se une a um receptor Aril hidrocarbono

hidroxilase (AAH). O complexo penetra no núcleo se une ao DNA e permite através da

transcrição para o RNA mensageiro, a produção de novas moléculas de enzima P450

que se dirigem ao retículo endoplasmático para degradação de carcinógenos

(Hayashi1991).

A metabolização de agentes químicos, geralmente resulta em um processo de

detoxificação bem sucedida, entretanto a ativação da enzima P450 pode produzir

metabolitos tóxicos, que podem contribuir para um maior risco do desenvolvimento de

câncer e efeitos tóxicos. A expressão de muitas enzimas P450 geralmente é induzida

pelo acúmulo de substrato (Sundberg, 2001).

XXXIV

2.4

Polimorfismo genético no gene CYP1A1

O polimorfismo genético caracteriza-se pela presença de diferentes versões de

uma seqüência de DNA (alelos), em um determinado local cromossômico (locus) e

encontram-se em uma freqüência superior a 1% nos cromossomos da população em

geral. Diferente do polimorfismo, o termo mutação se refere a qualquer mudança na

seqüência de nucleotídeos ou DNA e ocorrem em freqüência inferior a 1% da

população (Willard 2002).

O polimorfismo do gene P 450 pode desencadear várias alterações

(Pirmohamed, Park, 2003).

1. Abolição da atividade causada por uma deleção do gene, ou alterações splicing,

introdução de um stop códon, inativação do sítio trancripcional ou introdução de

aminoácido deletério. Determinando geneticamente, uma variação na atividade da

enzima resultando em diferentes fenótipos do metabolismo de drogas (Akiyama,

Gonzalez, 2002).

2. Alteração da atividade, onde o polimorfismo no sitio ativo, altera a especificidade

do substrato com mudanças na proteína ligando-a a diferentes substratos

(Akiyama, Gonzalez, 2002).

O CYP1A1 é uma enzima de fase I que atua na presença de carcinógenos da

dieta e do tabaco. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) gerados pela

combustão de alguns carcinógenos, incluindo os existentes no tabaco são

metabolizados por esta enzima (Colon et al ,1999).

Dois polimorfismos do CYP1A1 foram estudados em relação a maior

suscetibilidade ao câncer (Slattery et al, 2004):

transição T→ C no exon 7 na região 3’ não transcrita que cria um sítio de clivagem, o

local de restrição da enzima MSPI (Slattery et al ,2004).

transição A→ G que leva a substituição do aminoácido valina por isoleucina no

códon 462 (Ile462Val) (Slattery et al ,2004).

XXXV

Diferenças na posição de uma base como de uma Adenina (tipo A) por uma

Guanina (tipoC), este ponto de mutação resulta na substituição de uma Interleucina

(Ile) por uma Valina (Val)na região 462.A cistina esta em uma região que pode estar

ligada ao tiolato ligando ao grupo heme que é essencial para a atividade catalítica da

enzima .Esta posição polimorfica é conservada pela Ile membro da subfamília 1A1, a

substituição do aminoácido Val afeta a atividade catalítica da enzima.(Hayashi,1991)

Fonte: Cytochrome P450/Google/imagens online

Estes polimorfismos estão associados a aumento da atividade enzimática,

aumento da ativação de carcinógenos e segundo alguns autores, do risco de câncer

(Slattery et al, 2004).

Estudos mostram correlação entre este polimorfismo, fumo e risco de câncer

de pulmão. As pessoas que têm um alelo de alta “inducibilidade”, particularmente entre

os fumantes, parecem correr um maior risco de desenvolver câncer de pulmão. Os

dados indicam que o próprio fumo dos cigarros induz a expressão do gene CYP1A1.

(Marchand et al, 1998). Por outro lado, os homozigotos para o alelo recessivo de baixa

inducibilidade demonstram ser menos propensos a desenvolver câncer de pulmão

possivelmente por que sua AHH é menos eficiente, no que diz respeito a converter os

hidrocarbonetos em carcinógenos altamente reativos (Cascorbi et al 1996).

XXXVI

Casuística e Método

____________________________________________________

XXXVII

3.0 Casuística e Método

3.1 Casuística

Neste estudo foram analisados 114 pacientes com câncer colorretal atendidos

no ambulatório de Oncologia da Disciplina de Gastroenterologia da Universidade

Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, no período de setembro de

2002 a novembro 2003. Os pacientes do grupo caso foram selecionados de acordo

com o diagnóstico de adenocarcinoma colorretal, independente do estádio da

doença.

Os 114 pacientes incluídos como grupo controle, foram atendidos na

Disciplina de Gastroenterologia e Gastrocirurgia da Universidade Federal de São

Paulo, por outras doenças não neoplásicas – Escola Paulista de Medicina no período

de maio a novembro de 2004.

Todas os pacientes que participaram do estudo tiveram acesso e concordaram

de livre escolha com o termo de consentimento informado livre e esclarecido

aprovado pelo comitê de ética da UNIFESP (Anexo 1 e 2) e responderam a uma

entrevista (Anexos 3 e 4).

3.1.1. Descrição dos Grupos

As pacientes foram distribuídas em dois grupos:

Grupo I: Pacientes que apresentaram adenocarcinoma colorretal

Grupo II (grupo controle): pacientes s que não apresentaram câncer colorretal.

XXXVIII

Características do Grupo I

Os critérios de inclusão no grupo I foram:

• Diagnóstico de câncer colorretal

• Confirmação do diagnóstico pelo exame anatomo-patológico

Os critérios de exclusão do grupo I foram:

• Não confirmação do diagnóstico de câncer colorretal pelo exame anatomo-

patológico

As características das pacientes inclusas no grupo I estão resumidas no Quadro 1.

Quadro 4. Características das pacientes do grupo I.

Idade 20-90 anos

Estádio I II III

Situação atual Com doença/óbto Sem doença

Hábitos Tabagismo Etilismo

Etnia Brancos Negros Amarelos

Historia familiar Positva Negatva

XXXIX

Caracteristicas do Grupo II-Controle

Os critérios de inclusão no grupo II foram:

• Idade pareados com pacientes do grupo I (igual ou com diferença inferior a 5

anos )

• Ausência de câncer colorretal por avaliação clínica .

Os critérios de exclusão do grupo II foram:

• Diagnóstico de câncer

As características das pacientes do grupo II estão resumidas no Quadro 2.

Quadro 5:. Características das pacientes do grupo II (grupo controle).

Idade Pareados com o grupo II (20-90 anos)

Condição Ausência de adenocarcinoma

Hábitos Tabagismo Etilismo

Etnia Brancos Negros Amarelos

Historia familiar Positiva Negativa

3.2. Método

3.2.1. Extração de DNA

Extração de DNA de sangue periférico

Grupos I e II. Foram coletados 5 ml de sangue periférico através de punção

venosa, com “vacutainer” contendo anticoagulante (EDTA). O DNA genômico foi

isolado com o sistema de extração de DNA GFX (Amersham Biosciences) da

seguinte maneira: em uma coluna de cromatografia foram adicionados 100µl de

sangue e 500µl de tampão de lise. A seguir, esse material foi centrifugado a 8.000

rpm por 1 minuto a 4°C (Eppendorf modelo 5804 R). Em seguida, foram feitas duas

lavagens e centrifugações da coluna com tampão contendo etanol. Após isso, ao

DNA foram adicionados 100 µl de H

O (destilada e deionizada) autoclavada e pré-

aquecida a 70°C. O DNA purificado foi armazenado a -20°C até sua utilização.

3.2.2 Quantificação de DNA

A análise da quantidade de DNA obtida nas extrações foi feita através de

espectrofotometria com comprimento de onda de 260 nm (espectrofotômetro

Spectronic modelo Genesys 5).

XLI

3.2.3. Reações de amplificação (PCR)

Amplificação do Exon 7 do gene CYP1A1

Nas reações de amplificação do exon7 do gene do CYP1A1 foram utilizados

os seguintes oligonucleotídeos (Sivarman et al., 1994):

Oligonucleotídeo Seqüência (5’-3’)

Exon7 A/C (senso) 5’- TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT - 3’

Exon 7 A/C(anti-senso)

5’- CAGTGAAGAGGTCTAGCCGCT- 3’

Nas reações foram usados 5 µl do DNA genômico em um volume final de 30µl

de reação contendo: 0,4 pmol/µl de cada “primer” e 25 µl de mix Promega (20 mM de

Tris-HCL pH 8.4, 50 mM de KCL, 5 mM de MgCl

, 200 µM de dNTPs e 1,25U de Taq

DNA polimerase). As reações foram incubadas em termociclador (PTC-100 Peltier

Thermal Cicler Elmer) nas seguintes condições: desnaturação a 95°C durante 5 min,

seguida de 40 ciclos a 95°C por 30 seg, 62,2°C por 1min e 72°C por 1min,

finalizados com incubação a 72°C por 10 min Os produtos das amplificações foram

aplicados em um gel de agarose 2,0% (Invitrogen) corado com brometo de etídeo

(1µg/ml) e submetidos à eletroforese por 30 min a 100V numa cuba horizontal

contendo tampão de corrida TBE 1X. A detecção foi feita pela visualização em

transiluminador de luz ultravioleta dos produtos de PCR no gel de agarose. Os géis

foram então fotografados através do sistema de documentação científica EDAS 120

da Kodak.

XLII

Controle positivo. Para obter um controle interno que assegurasse presença

suficiente de DNA bem como para garantir a integridade dos reagentes, foram feitas

reações de PCR para o gene de cópia única β-globina. Nestas reações foram usados

os seguintes oligonucleotídeos (“primers”) (Gattas & Soares-Vieira, 2000)

Oligonucleotídeo Seqüência (5’-3’)

β-globiβ globina

(senso)

5´- CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC – 3

β-globiβ globina

(anti-senso)

5´- GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC – 3’

3.2.4. Análise do polimorfismo no gene CYP1A1

Perfil de restrição do éxon 7 do gene com a enzima Msp I

Para essas reações foram incubados 6,0 µl do produto de PCR com 10U de

enzima Msp1, 1,5 µl de tampão de digestão (Promega). A incubação ocorreu por 8h

a 37°C, a seguir a enzima sofreu inativação térmica a 80°C por 1 min. Os sítios de

restrição reconhecidos pela enzima MspI têm a seguinte seqüência:

5’ C/CGG 3’

3’ GGC/C 5’

Os produtos das digestões foram aplicados em gel de agarose 2,5 % “low

melting point” (Invitrogen) corado com brometo de etídeo (2 µg/ml) e submetidos à

eletroforese por 70 min a 70V numa cuba horizontal contendo tampão de corrida TBE

1X. A determinação dos tamanhos dos produtos da digestão foi feita pela

XLII

XLIII

visualização em transiluminador de luz ultravioleta. Os géis foram então fotografados

através do sistema de documentação científica EDAS 120 da Kodak.

Estratégia de determinação do SNP do éxon 7 do gene CYP1A1 resíduo 462

A determinação do polimorfismo no éxon 7 do gene CYP1A1 foi feita por

digestão dos produtos das PCRs com a enzima de restrição MspI.

O fragmento do éxon 7 do gene CYP1A1 amplificado, possui sítios (AA GG)

de restrição da enzima MspI, com isso a hidrólise completa do DNA gera os

seguintes fragmentos: 340pb,200pb e 140pb.

Na figura 2 está esquematizado o diagrama metodológico da determinação do

polimorfismo no éxon 7 do gene CYP1A1. O alelo polimórfico possui uma

substituição de nucleotídeo único (SNP) no sítio de restrição do gene do CYP1A1

(Figura 2).

Quando o individuo possui os dois alelos selvagens (genótipo homozigoto

dominante, A/A), ou seja, ausência dos sítios de restrição em ambos os alelos, a

digestão com MspI gera os fragmentos; 340pb.

Por outro lado, quando ocorre o SNP (A→G) somente em um alelo (genótipo

heterozigoto, C/N), a digestão gera os fragmentos: 340pb, 200pb e 140pb. (Figura 2

C). Por fim, quando possui dois alelos polimórficos (genótipo homozigoto), a digestão

com MspI gera os fragmentos de 200pb e 140pb.

XLIV

3.3 Análise estatística

No presente estudo foram analisadas as correlações entre o

desenvolvimento de câncer colorretal e a presença do polimorfismo MspI no exon7

do gene CYP1A1 em associação com fatores de risco tais como tabagismo, etilismo,

presença ou ausência de história familiar de câncer colorretal, sexo, etnia, idade e

mais as seguintes características localização do tumor, tipo histológico,

estadiamento da doença e evolução da mesma.

Para comparar pacientes e controles quanto a cada uma das características,

dado o pareamento da amostra, aplicou-se o teste de homogeneidade marginal. No

estudo das idades entre os dois grupos foi aplicado o teste t de Student para

amostras relacionadas (Kalbfleisch, Prentice 1980).

Para estudar a associação conjunta dos fatores estudados com a presença

ou ausência de câncer utilizou-se a Análise de correspondência (Greenacre, 1984).

O teste exato de Fisher foi realizado para estudar a associação entre cada variável e

os alelos. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi usado para estudar a

associação conjunta das variáveis estudadas e a situação atual (Cox, 1972).

XLV

Resultados

______________________________________________________________________

XLVI

4. Resultados

4.1 PCR e Genotipagem por R.F.L.P.

Todas as amostras de DNA foram extraídas com sucesso conforme descrito

em materiais e métodos, e submetidas à PCR com primers específicos para o

segmento de DNA referente à região codificadora do exon 7 do gene CYP1A1, na

qual incide o polimorfismo MspI. A reação resultou, na produção de amplicons com

tamanho de 340pb, que foram submetidos à separação eletroforética em gel de

agarose e fotodocumentados

2 3 4 5 6 7

1 - marcador de peso molecular, 100 pares de base.

2 - 7 amostras com produtos de 340 pares de base.

Figura 2. Apresenta a foto da separação eletroforética, demonstrando

amplificação do produto de PCR com tamanho de 340 pb.

A ocorrência de uma transição, resultante da troca de uma Adenina por uma

Guanina no códon 462 do gene CYP1A1(exon 7), acarreta na substituição de uma

Isoleucina por uma Valina nessa mesma posição. A referida alteração acaba por dar

origem a um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição MspI na molécula

de DNA o que tornou assim possível a genotipagem das amostras por meio de

R.F.L.P. (Figura 3). Os genótipos obtidos foram:

XLVII

h Genótipo A - indivíduos homozigotos do tipo selvagem, alelos (A/A) não

apresentam o polimorfismo

h Genótipo B - indivíduos heterozigotos, alelos (A/G) apresentam um alelo mutante

h Genótipo C - individuo homozigoto mutante, alelo (G/G) apresentam dois alelos

mutados

Figura 2.

1 2 3 4 5 6

1- macador de peso molecular 100bp

2-- Amostra de individuo heterozigoto, genótipo B – (340pb, 200bp, 140 pb)

3-Amostra de individuo homozigoto mutado, genótipo C – ( 200bp, 140 pb)

4- Amostra de individuo homozigoto selvagem , genótipo A – (340 pb)

5- Amostra de individuo homozigoto selvagem, genótipo A – (340bp)

6- Amostra de individuo homozigoto selvagem, genótipo A – (340bp)

7- Amostra de individuo heterozigoto (genótipo B) – (340pb, 200bp, 140 pb)

Figura 3. Apresenta foto de separação eletroforética, demonstrado os sítios de

restrição com tamanhos de 340bp, 200bp e 140 bp.

XLVIII

4.2 Comparação entre Controles e Pacientes

A seguir, apresentam-se as tabelas de 2-7 com informações sobre o

comportamento de pacientes e controles quanto às variáveis estudadas (resultados

expressos no Anexo 5).

Tabela 2: Distribuição de pacientes e controles quanto ao sexo.

Paciente

Controle Feminino Masculino Total

Feminino 47 6 53

Masculino 3 58 61

Total 50 64 114

Tabela 3 : Distribuição de pacientes e controles quanto à etnia.

Paciente

Controle Branco Negro Amarelo Total

Branco 83 9 7 99

Negro 13 1 1 15

Total 96 10 8 114

XLIX

Tabela 4: Distribuição de pacientes e controles quanto à história familiar de

câncer.

Tabela 5: Distribuição de pacientes e controles quanto ao etilismo.

Paciente

Controle Não Sim Total

Não 35 12 47

Sim 26 41 67

Total 61 53 114

Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles quanto ao tabagismo.

Paciente

Controle Não Sim Total

Não 25 36 61

Sim 21 32 53

Total 46 68 114

Paciente

Controle Não Sim Total

Não 36 38 74

Sim 19 21 40

Total 55 59 114

Tabela 7: Distribuição de pacientes e controles quanto aos alelos estudados.

A presença do alelo G (A/G e G/G) foi encontrado em 33 indivíduos do grupo

caso e em 100 indivíduos do grupo controle, evidenciando aumento em três vezes

da freqüência destes alelos na população de pacientes.

Para comparar pacientes e controles quanto a cada uma das características:

de sexo, historia familiar, etilismo, tabagismo e alelos estudados, descritas nas

tabelas acima, dada o pareamento da amostra, aplicou-se o teste de

homogeneidade marginal. Tabela 8, a seguir, resume os resultados obtidos sobre o

estudo de homogeneidade marginal. Verificou-se que pacientes e controles não

diferem quanto a Sexo e Etnia. Com relação às demais características, observamos

que a proporção de pacientes fumantes ou com história familiar de câncer foi maior

que a mesma proporção entre os controles. Ao contrário, a proporção de etilistas foi

maior entre os controles. Entre os controles, predominaram os alelos A/A. Entre os

pacientes a maior proporção foi de A/G ou G/A. Apenas entre os pacientes foram

encontrados casos G/G.

Paciente

Controle A/A G/A ou A/G G/G Total

A/A

G/A ou

G/A ou A/G

G/G 0 0 0 0

Total 14 97 3 114

Tabela 8: Resultados da comparação entre pacientes e controles.

Quanto à idade, a observação da tabela 9 aliada à aplicação do teste t de

Student para amostras relacionadas permite afirmar que não há diferenças entre os

grupos considerados (p = 0,529).

Tabela 9:

Medidas descritivas da idade dos indivíduos, segundo grupo.

Variável Nível descritivo

Sexo 0,317

Etnia 0,123

História Familiar 0,012

Etilismo 0,023

Tabagismo 0,047

Alelos 0,001

Grupo Média Desvio-padrão

Paciente 58,82 13,76

Controle 58,48 13,06

LII

4.3 Análise de correspondência

Para estudar a associação conjunta dos fatores estudados com a presença

ou ausência da doença, utilizou-se a Análise de correspondência (Greenacre, 1984).

Verificou-se que as características mais ligadas à doença são, nessa ordem: a

presença do alelo G, a história familiar de doença e o tabagismo. A inércia

acumulada foi de 67%. O gráfico a seguir ilustra o resultado obtido. (figura 4)

Figura 4: Gráfico da análise de correspondência.

G/?

A/A

Fum

Não Fum

Com HF

Sem HF

Paciente

Controle

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1

Componente 1

Componente 2

♦ Paciente

♦ Controle

♦ Tabagista

♦ Não tabagista

♦ Com história familiar

♦ Individuo homozigoto selvagem - alelo A/A

♦ Individuo mutado ou heterozigoto - alelo A/G ou G/G

LIII

4.4

Comportamento das amostras de pacientes e controle quanto as variáveis

e a freqüência dos alelos

Tabela10: Distribuição de variáveis quanto aos alelos

Variáveis de risco

Alelos

Freqüência

controle

Freqüência

paciente

Tabagismo

A/A

A/G ou G/A 11 55

G/G 0 2

Etilismo A/A 51 8

A/G ou G/A 17 43

G/G 0 2

Historia Familiar A/A 31 7

A/G ou G/A 10 50

G/G 0 2

Etnia:

Branca A/A 70 11

A/G ou G/A 29 82

G/G 0 3

Negra A/A 11 2

A/G ou G/A 4 8

G/G 0 0

Amarela A/A 0 1

A/G ou G/A 0 7

G/G 0 0

LIV

4.5 Estudo das Características Ligadas à Doença

A tabela 11, a seguir, descreve o comportamento da amostra quanto a

determinadas características da doença.

Tabela 11. Distribuição da amostra quanto à localização, grau de diferenciação

celular, estadiamento e evolução.

Parâmetro

Porcentagem

Localização

Cólon Dir

21,9

Cólon Esq 19 16,7

Reto 70 61,4

G de diferenciação Pouco diferenciado 9 7,9

Mod. Diferenciado 77 67,5

Bem diferenciado 28 24,6

T 1 1 0,9

2 18 15,8

3 76 66,7

4 19 16,7

N 0 58 50,9

1 41 36,0

2 15 13,2

M 0 107 93,9

1 7 6,1

I 9 7,9

Estádio II 52 45,6

III 37 32,5

IV 16 14,0

Situação atual Sem doença 40 35,1

Com doença/óbito 74 64,9

4.6 Análise de sobrevivência

As tabelas (12 e 23) a seguir descrevem a associação de cada característica

estudada e a situação atual do doente (com doença ou óbito e sem doença). Não

observamos significância entre as variáveis e evolução da doença.

Tabela 12. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Sexo.

Situação atual

Sexo Sem doença

Com

doença/óbito

Total

Feminino 17 33 50

Masculino 23 41 64

Total 40 74 114

Tabela 13. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etnia

Situação atual

Etnia Sem doença

Com

doença/óbito Total

Branco 35 61 96

Negro 3 7 10

Amarelo 2 6 8

Total 40 74 114

LVI

Tabela14. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e História familiar.

Situação atual

Hist. Familiar Sem doença

Com

doença/óbito Total

Não 22 33 55

Sim 18 41 59

Total 40 74 114

Tabela 15. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etilismo.

Situação atual

Etilismo Sem doença

Com

doença/óbito

Total

Não 21 40 61

Sim 19 34 53

Total 40 74 114

LVII

Tabela 16. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Tabagismo.

Situação atual

Tabagismo Sem doença

Com

doença/óbito Total

Não 18 28 46

Sim 22 46 68

Total 40 74 114

Tabela 17. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Alelos.

Situação atual

Alelos Sem doença

Com

doença/óbito

Total

A/A 8 6 14

G/A ou A/G 31 66 97

G/G 0 3 3

Total 40 74 114

LVIII

Tabela 18. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Grau de

diferenciação.

Situação atual

Grau de diferenciação Sem doença

Com

doença/óbito

Total

Pouco diferenciado 2 7 9

Mod. Diferenciado 27 50 77

Bem diferenciado 11 17 28

Total 40 74 114

Tabela19. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Localização.

Situação atual

Localização Sem doença

Com

doença/óbito Total

Reto 22 48 70

Cólon Esq 7 12 19

Cólon Dir 11 14 25

Total 40 74 114

LIX

Tabela 20. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação T.

Situação atual

T Sem doença

Com

doença/óbito

Total

1 1 0 1

2 7 11 18

3 27 49 76

4 5 14 19

Total 40 74 114

Tabela 21. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação N.

Situação atual

N Sem doença

Com

doença/óbito

Total

0 21 37 58

1 15 26 41

2 4 11 15

Total 40 74 114

Tabela 22. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação M.

Situação atual

M Sem doença

Com

doença/óbito Total

0 40 67 107

1 0 7 7

Total 40 74 114

Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Estadiamento.

Situação atual

Estadiamento Sem doença

Com

doença/óbito

Total

I 1 2 3

II 19 33 52

III 20 32 52

IV 0 7 7

Total 40 74 114

LXI

Tabela 24. Resultados do estudo da associação entre cada variável e a

situação atual, isoladamente.

Variável Nível descritivo

Sexo 0,830

Etnia 0,759

História familiar 0,289

Etilismo 0,874

Tabagismo 0,457

Alelos 0,145

Grau de diferenciação 0,664

Localização 0,686

T 0,483

N 0,764

M 0,094

Estadiamento 0,495

Para estudar a associação conjunta das variáveis acima descritas e da

situação atual, empregou-se o modelo de riscos proporcionais de Cox. No modelo

incluindo Sexo, Etnia, História familiar, Etilismo, Tabagismo, Alelos, Grau de

diferenciação, Localização e Estadiamento, obtiveram-se os resultados presentes na

tabela a seguir. Os indivíduos com estádio III tiveram a tendência a ter pior evolução

(Tabela 24).

LXII

Tabela 25. Resultados do primeiro modelo ajustado.

Estadiamento Coeficiente

Nível

descritivo

Risco

relativo

Intervalo de

confiança

II -0,802 0,107 0,449 0,169 1,190

III -0,935 0,066 0,392 0,145 1,063

IV 0,314 0,554 1,369 0,484 3,870

Figura 5. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo de Cox, segundo o

estadiamento da doença.

Tempo de acompanhamento (meses)

12010896847260483624120

nç

ão

bre

viv

ên

cia

1,0

0,0

Estadiamento

III

Removendo-se o Estadiamento do modelo, apenas a variável Etnia mostrou-

se relacionada à sobrevida/intervalo livre de doença dos pacientes, da forma descrita

na tabela 25.

LXIII

Tabela 26. Resultados do modelo ajustado, excluindo-se a variável estadiamento.

Estadiamento Coeficiente

Nível

descritivo

Risco

relativo

Intervalo de

confiança

Negro -0,683 0,158 0,505 0,195 1,305

Amarelo 0,958 0,031 2,608 1,091 6,231

Figura 6. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo de Cox, segundo a

etnia dos pacientes.

Tempo de acompanhamento (meses)

12010896847260483624120

Função de sobrevivência

1,0

0,0

Raça

Amarelo

Negro

Branco

LXIV

A partir dos resultados apresentados, pode-se afirmar que a mortalidade foi

maior entre os indivíduos de etnia amarela. Os negros e brancos mostraram

sobrevivência maior que os amarelos, porém foram iguais entre si.(figura 6)

LXV

Discussão

______________________________________________________________________

LXVI

5. Discussão

O câncer colorretal é uma doença multifatorial, contribuem para o seu

desenvolvimento os hábitos alimentares, sociais como o tabagismo, e a

predisposição genética (Jong et al, 2002).

Estudos recentes demonstraram associação entre o tabaco e a dieta com o

risco de desenvolvimento de câncer colorretal gerando a formação de substratos

carcinógenos que são metabolicamente ativadores da enzima CYP. O gene CYP1A1

é induzido pela enzima aril hidrocarbono hidroxilase (AHH) responsável pela

ativação de hidrocarbonetos policiclicos aromáticos (PAHs), carcinógeno presente

no cigarro (Terry et al, 2002; Inoue et al, 2000; Persson et al, 1997; Colon et al;

1999).

Existem dois polimorfismos associados ao gene CYP1A1, a transição de

T→C na região 3’ na região não transcrita, no sitio de restrição MspI e outra na

transição de A → G gerando a substituição de uma valina por uma isoleucina, no

códon (Ile462Val, exon 7) (Slattery et al, 2004). O polimorfismo da variante Ile462Val

tem maior importância devido a sua associação com o aumento da indução do gene

CYP1A1 e posterior ativação de carcinógenos. Person et.al (1997) destacaram as

diferenças funcionais entre os dois polimorfismos. A substituição da Ile para Val seria

acompanhada de diferenças no metabolismo e bioativação de carcinógenos, com

maior potencial de desenvolvimento do câncer.

Quatro mutações pontuais foram descritas no gene CYP1A1 e dois

polimorfismos, no sítio de restrição da enzima MspI e outro na região codificadora

dos aminoácidos Ile-Val. No polimorfismo MspI são três os genótipos possíveis: A

(ml/ml), B (ml/m2) e C(m2/m2). No polimorfismo Ile-Val são três os possíveis

genótipos que codificam as seqüências de aminoácidos Ile/Ile, Val/Ile e Val/Val (Bale

et al, 1987; Nakashi et al, 1991; Crofts et al, 1994; Cascorbi et al, 1996). Os autores

comentam em seu estudo uma diferença étnica ou racial na freqüência de mutações

do alelo Ile-Val, especificamente em japoneses aonde existe uma freqüência maior

do que em caucasianos.

LXVII

O objetivo central deste estudo foi analisar a relação entre os fatores de

risco para o desenvolvimento do câncer colorretal e o polimorfismo do gene

CYP1A1. Para tanto foram aplicadas ferramentas moleculares, técnicas de reação

em cadeia de polimerase (PCR) e análise do polimorfismo por enzima de restrição

(RFLP) e posterior eletroforese para a analise dos resultados.

Na primeira parte do trabalho, realizamos um processo de seleção de

pacientes e coleta de dados, que foi relevante para caracterizar o grupo de estudo e

o grupo controle, tornando possível relacionar o perfil social dos indivíduos com as

características da doença. Com esta finalidade, todos os pacientes foram

entrevistados e os prontuários foram consultados para obtenção das informações

relativas ao estadiamento da doença, grau de diferenciação, data do diagnóstico e

situação atual na última consulta (com doença, sem doença). O grupo controle,

constituído de pacientes ambulatoriais sem câncer foram selecionados e submetidos

à entrevista de forma semelhante ao do grupo caso.

Entre os 114 indivíduos com câncer estudados, a prevalência foi semelhante

em ambos os sexos, sendo mais comum após a 5ª. década assim como já foi

descrito por outros autores (Greenlee et al, 2000), sendo que setenta e seis por

cento tinham mais que 50 anos. Estudos de estimativa publicados pelo INCA

descrevem que a maioria dos doentes tem entre 50 e 70 anos (INCA.gov.br, 2005).

Quanto ao estádio clínico, a maioria dos doentes era estádio II ou III (91%), sendo

que os demais eram estádio I, doença inicial ou IV, doença metastática. Estes

percentuais também são descritos por outros estudos (Greenlee et al, 2000), o

mesmo se verificando quando avaliamos o grau de diferenciação do tumor, a grande

maioria dos tumores era bem ou moderadamente diferenciado (92%) (Huban,1998).

Observamos que 52% dos pacientes do grupo caso apresentavam algum

tipo de história familiar, o oposto foi observado entre os indivíduos do grupo controle,

onde apenas 35% dos indivíduos tinham este antecedente, sendo esta diferença

significante (p=0,012). Grover et al (2004) compararam a historia familiar através de

consultas médicas e verificaram que 50% dos mesmos apresentavam algum tipo de

antecedente de câncer na família, no entanto apenas 17% apresentaram correlação

entre história famíliar e alteração genética.

LXVIII

Estudos mais recentes mostram que 10% a 15% de todos os pacientes com

CCR têm historia familiar da doença caracterizada como HNPCC, câncer colorretal

hereditário não polipóide quando se levam em conta apenas os critérios de

anamnese estabelecidos na reunião de Amsterdã II ou ainda antecedentes de

polipose adenomatosa familiar (Bleiker et Al, 2005). Estas doenças estão associadas

a alterações gênicas que já foram identificadas na última década (Bronnor

et.al.,1994; Luo et al,2005;).

Quando estudamos o etilismo como fator de risco, notamos que o perfil dos

pacientes e controles diferiu de maneira oposta ao observado em relação à história

familiar, pois 47% dos pacientes e 59% dos indivíduos do grupo controle eram

etilistas. Muitos estudos também não encontraram maior risco de câncer entre os

etilistas, assim como não foi descrito que o álcool seja um fator protetor para esta

doença. Apesar se tratar de um substrato carcinógeno e ativador das enzimas da

família CYP, o CYP2E1, mas não o CYP1A1 metaboliza numerosos compostos, é

induzido por alguns substratos como o etanol e é ativado por compostos como N-

nitrosaminas, benzeno e outros. Esta enzima é associada à atividade catalítica, e é

expressa nos tecidos extra-hepáticos (Gonzalez ,Gelboin, 1993). Polimorfismos do

CYP2E2 já foram descritos em tumores de esôfago e estômago onde o álcool é um

importante fator de risco (Gao et al, 2002). Não observamos na literatura estudos

sobre polimorfismos do CYP1A1 e etilismo (Gonzalez, Idle,1994). Acreditamos que o

percentual menor de etilistas entre os indivíduos do grupo caso possa ser decorrente

da inibição do doente em declarar aos seus cuidadores fazer uso do álcool e

portanto ter hábitos que possam torná-lo mais suscetível à doença.

Em relação ao tabagismo observamos que 60% dos pacientes e 36,5% dos

indivíduos do grupo controle fumavam ou tinham fumado, sendo o tabagismo mais

freqüente entre os doentes com câncer colorretal (p=0,047).

Chao Ann et al (2000) descreveram que existem no tabaco 55 tipos de

carcinógenos, incluindo os PAHs, as aminas heterociclicas aromáticas e as N-

nitrosaminas. Estudos epidemiológicos têm constantemente associado o tabagismo

ao risco de adenoma colorretal (Terry et al, 2002), sustentada na identificação dos

numerosos compostos carcinógenos presentes no tabaco e na possibilidade do

LXIX

efeito direto destes compostos nos tecidos do trato digestivo e/ou por via sistêmica.

Há uma correlação entre o risco de adenoma e o número de cigarros/dia assim

como o período que o indivíduo fumou. Períodos maiores que 20 anos aumentam o

risco em 2 vezes e após 40 anos em 4 a 5 vezes (Giovannucci, 2001). Apesar da

associação entre tabagismo e risco de adenoma colorretal, nem sempre se observa

uma associação entre o tabaco e o risco de câncer colorretal. (Starterlry,1997). Uma

possível explicação seria o tempo necessário para que se desenvolvesse um câncer

a partir do adenoma. Os estudos que mostraram associação entre câncer colorretal

e fumo mostram um risco inferior a dois (Giovannucci, 2001). Uma hipótese seria

que o tabaco agiria mais como um iniciador do que como um promotor para o câncer

colorretal (Inoue et al, 2000).

Em um estudo epidemiológico com 18,447 indivíduos com idade media de

55-64 anos Robb et al (2004), investigaram a associação entre os fatores físico-

sociais e demográficos e o risco para desenvolver câncer colorretal. Os resultados

mostraram que indivíduos mais idosos do sexo masculino apresentaram um risco

menor. Entretanto os tabagistas, sedentários, com história familiar de câncer

colorretal, e maior nível de ansiedade, tinham maior risco para desenvolver a

doença.

O aumento de risco de adenomas ou mesmo de câncer entre os tabagistas

parece bem esclarecido, contudo o mecanismo pelo qual este evento ocorre é ainda

motivo de novas pesquisas (Inoue et al., 2000). Alterações genéticas herdadas ou

provocadas pelo tabaco podem ser uma das hipóteses.

Em câncer de pulmão, o polimorfismo envolvendo enzimas que ativam

carcinógenos como os PAHs, relacionadas ao tabaco, no gene CYP1A1 tem sido

associado ao maior risco de desenvolvimento desta doença. Foram pesquisados em

217 indivíduos com câncer de pulmão e 404 indivíduos controles. Três polimorfismos

do gene CYP1A1 foram estudados: MspI, Ile→Val e Thr. Como resultado

encontraram elevado risco para câncer de pulmão associado ao polimorfismo MspI,

Evidenciaram também a correlação dos polimorfismos dos genes CYP1A1, no sitio

MspI do gene e do GSTM1, em indivíduos da etnia amarela e tabagistas, à presença

LXX

de adenoma colorretal. A presença de adenomas no cólon distal foi maior nos com

polimorfismo do gene CYP1A1 com genótipo G/G (Song et al., 2001).

Recentemente, Slaterry et.al, (2004) analisaram a associação dos

polimorfismos do gene CYP1A1 e o tabaco em uma população com câncer

colorretal. Os autores descreveram que o tabaco gerou um aumento modesto de

risco para este câncer, no entanto este risco foi duas vezes e meio maior entre os

tumores com mutação de pelo menos um alelo neste gene. Estes autores ao

contrário do estudo anterior não observaram correlação entre risco e localização do

tumor no cólon. A possível hipótese para esclarecer o maior risco seria o aumento

da ativação de hidrocarbonetos policiclicos aromáticos decorrente da presença do

alelo variante do CYP1A1 somado à diminuição da capacidade de detoxificar os

PAHs, decorrente do genótipo GSTM-nulo. Uma segunda hipótese seria a

modificação do genótipo CYP1A1 pelos efeitos do tabaco e a influência dos genes

CYP1A1, no gene GSTM1 (metabolizador) e NAT2 (acetilador).

Sivaraman et al, (1994) destacaram a importância critica do CYP1A1 para o

metabolismo dos PAHs, inativando as enzimas que convertem PAHs na forma de

carcinógeno ligando–se ao DNA. Descreveram um desequilibro no CYP1A1 humano

na região 3’ terminal no resíduo 462 no exon7 desencadeando uma mutação de

adenina para uma guanina, resultando em uma substituição de uma isoleucina por

uma valina na região heme do gene CYP1A1 acarretando aumento da atividade

enzimática. Esse polimorfismo é mais comumente freqüente em japoneses que

caucasianos. Por método de PCR foi estudado a freqüência do polimorfismo MspI 3’

e mutações no exon 7(ile-val) em 43 pacientes com adenocarcinoma in situ e 129

controles em uma população japonesa e havaina. Foi estatisticamente significante a

associação entre câncer colorretal in situ e o genótipo mutante MspI nos indivíduos

japoneses e havaianos. Resultado similiar foi observado em relação ao genótipo G/G

comparado aos outros genótipos na população japonesa, sugerindo uma associação

entre o câncer de colorretal e o genótipo mutante homozigoto nesta população.

Para estudo do polimorfismo, avaliamos a separação eletroforética das

bandas conforme o peso molecular das mesmas. Desta maneira, verificamos que

85% dos pacientes apresentaram o alelo A/G, heterozigoto onde apenas um dos

LXXI

alelos sofre a transição A→G, gerando a substituição do aminoácido valina por uma

isoleucina; 12,2% dos pacientes apresentaram os alelos A/A, homozigoto tipo

selvagem, não ocorrendo o polimorfismo e apenas 2,6% dos pacientes

apresentaram o alelo G/G, homozigoto mutado, onde ocorre a presença do

polimorfismo nos dois alelos. No grupo controle, ao contrário, observamos que 29%

dos indivíduos apresentaram alelo A/G e 56,2% alelo A/A. Em relação aos alelos

G/G, estes foram encontrados somente entre os pacientes, embora em um

percentual pequeno. Estas diferenças entre os grupos foram estatisticamente

significantes. Entre as variáveis estudadas observamos que o alelo G foi a principal

variável associada à doença.

Observamos que os indivíduos da etnia amarela tiveram pior prognóstico.

Estudos americanos observaram pior evolução do câncer colorretal nos indivíduos

da etnia negra, e atribuem este fato ao baixo nível sócio-econômico desta população

e a desinformação quanto aos sintomas da doença fazendo com que esta seja

diagnosticada em fase avançada. Na amostra estudada, não observamos diferenças

sócio-econômicas entre os indivíduos estudados. Em relação ao estádio clínico,os

indivíduos da etnia amarela eram estádio I em 4, II em em 3 e em apenas um o

estádio era IV. Ao estudarmos o polimorfismo do gene CYP1A1, verificamos que o

polimorfismo em um alelo (A/G ou G/G) ocorreu em 87,5%. No entanto não

encontramos na literatura ou mesmo neste estudo correlação entre polimorfismo e

pior evolução.

Tsuchiya et al (2003) investigaram a relação entre a concentração das

dioxinas, uma vez que a concentração elevada desta substância na alimentação dos

japoneses assim como a exposição a outros poluentes químicos, e o polimorfismo

do gene CYP1A1. Bale et al, (1987); Nakashi et al, (1991); Crofts et al, (1994);

Cascorbi et al,(1996) encontraram uma diferença étnica ou racial na freqüência de

mutações do alelo Ile-val, sendo que em japoneses observaram uma freqüência

maior do que em caucasianos.

Iwasada et al. (2004) referem que são poucos os estudos investigativos de

mortalidade de imigrantes japoneses no Brasil, embora exista uma grande

população de imigrantes japoneses. O autor comenta que a mortalidade por câncer

LXXII

em imigrantes japoneses é maior no Brasil quando comparada a descrita nos

Estados Unidos, no entanto não difere da mortalidade de japoneses no Japão.

Em relação ao estádio clínico verificamos que os indivíduos com doença

mais avançada tiveram pior evolução. Conforme descrito em vários estudos

anteriores, o estádio clínico ainda é o melhor parâmetro para definir prognóstico.

Métodos de rastreamento de câncer com finalidade de permitir o diagnóstico

precoce da doença, assim como de lesões pré-cancerosas podendo

consequentemente reduzir a mortalidade vem sendo alvo de estudos clínicos. Nos

indivíduos sem história familiar, o toque retal, a pesquisa de sangue oculto, a

colonoscopia periódica após os 50 anos reduz a mortalidade. Nos indivíduos com

história familiar a detecção de alterações genéticas ou colonoscopias anuais

permitem o diagnóstico da doença em fase inicial, alem da retirada de lesões pré-

neopásicas com é o caso dos adenomas (Bleiker et. al.2005)

O impacto do polimorfismo genético e a sua possível correlação com a maior

susceptibilidade no desenvolvimento do câncer tem despertado um interesse

particular, principalmente quando associado às enzimas ativadoras de carcinógenos

do tabaco.

Nesta ultima década muita pesquisas tem se concentrado na identificação

gênica e sua relação na etiologia do câncer. Um interesse particular tem sido

desenvolvido em relação ao desenvolvimento do câncer e exposição a diversos

agentes ambientais e a associação com os diferentes polimorfismos. Diferentes

mecanismos de absorção e detoxificação frente a alguns carcinógenos podem ser

mediados por genes específicos. Mutações específicas no gene podem gerar

aumento ou diminuição do risco tornando de grande importância o desenvolvimento

de estudos de analise genética na tentativa de compreendermos melhor esses

mecanismos.

Definir fatores de risco ambientais e genéticos poderão permitir estratégias

preventivas para a população de maior risco, com estabelecimento de um público

alvo com economia dos recursos públicos e privados.

LXXIII

Conclusão

____________________________________________________________

LXXIV

6. Conclusão

A característica mais ligada à doença foi a presença do alelo G. Observou-

se um aumento da proporção em três vezes do alelo A/G e G/G entre o grupo de

pacientes com câncer colorretal em relação ao grupo controle. Sugerindo que a

enzima CYP1A1 possa ser um marcador de risco para a doença.

1. O uso do tabaco e historia familiar positiva foram mais freqüentes entre os doentes

com câncer. .

2. Não foi encontrada correlação entre o polimorfismo e sexo, grau de diferenciação,

estádio ou evolução da doença.

LXXV

Anexos

_______________________________________________________

LXXV

LXXVI

Anexo1

Termo de consentimento – grupo controle

(Projeto Estudo do polimorfismo do gene CYP1A1)

O senhor (a) está sendo admitido(a) para o tratamento de _______________________.

Como parte de seu tratamento, você será submetido a um exame de sangue. Este sangue

será utilizado em exames laboratoriais, necessários para um diagnóstico definitivo.

Para obter um maior conhecimento clínico e científico sobre o câncer, o corpo clínico

deste hospital desenvolve pesquisa clínica científica. Por meio desta pesquisa será

possível conhecer melhor os mecanismos das doenças e, portanto, oferecer novas

possibilidades de diagnóstico e tratamento. Ainda mais, este trabalho envolve a busca de

novas alterações genéticas.

Para este estudo será necessário comparar os resultados obtidos de pacientes que

possuam câncer com aqueles que não possuam câncer, como o senhor(a). Por isso,

você está sendo convidado a participar deste estudo, perante sua autorização para

realização de coleta de sangue para exames laboratoriais de pesquisa científica. O uso

deste material não implicará em riscos adicionais para você, nem exigirá que se submeta

a qualquer procedimento adicional. Este projeto de pesquisa foi aprovado no Comitê de

Ética em pesquisa do Hospital São Paulo, de acordo com o processo n° 0805/02, e todo

estudo que vier a utilizar este material será previamente apresentado à apreciação desse

Comitê.

Todo material colhido e usado nesta pesquisa será identificado no laboratório por códigos

e, portanto, sua privacidade e identidade serão preservadas. A eventual inclusão dos

resultados em publicação científica será feita de modo a manter o anonimato do paciente.

Concordando com o uso deste material, do modo descrito, é necessário esclarecer que o

senhor(a) não terá benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais resultados

decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em permitir o uso deste material para a

pesquisa, sua decisão não influenciará, de nenhum modo, o seu tratamento.

Assinatura do(a) paciente ou representante legal: _____________________________

Nome do(a) paciente:___________________________________________________

RG do prontuário:______________________________________________________

Pesquisador responsável: _______________________________________________

LXXVII

Anexo2

Termo de consentimento - grupo paciente

(Projeto Estudo do polimorfismo do gene CYP1A1)

O CCR tornou-se um grande desafio para oncologistas e pesquisadores do mundo

inteiro, devido sua alta taxa de incidência e mortalidade. Entretanto, nos últimos

trinta anos foi evidenciado redução destes índices, atribuído ao aprimoramento de

métodos diagnósticos, surgimento de novas drogas e modalidades terapêuticas, e

mais recentemente, a descobertas e conhecimento dos fatores genéticos envolvidos.

Trabalhos científicos relacionam uma série de alterações genéticas que envolvem o

polimorfismo com o câncer. A enzima CYP1A1, localizada no citocromo P 450

(CYP1A1) na população brasileira com câncer colorretal.

Este projeto de pesquisa foi aprovado no Comitê de Ética em pesquisa do Hospital

São Paulo, de acordo com o processo n° 0805/02, e todo estudo que vier a utilizar

este material será previamente apresentado à apreciação desse Comitê.

Todo material colhido e usado nesta pesquisa será identificado no laboratório por

códigos e, portanto, sua privacidade e identidade serão preservadas. A eventual

inclusão dos resultados em publicação científica será feita de modo a manter o

anonimato do paciente.

Concordando com o uso deste material, do modo descrito, é necessário esclarecer

que o senhor(a) não terá benefícios ou direitos financeiros sobre os eventuais

resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em permitir o uso deste

material para a pesquisa, sua decisão não influenciará, de nenhum modo, o seu

tratamento.

Assinatura do(a) paciente ou representante legal: _____________________________

Nome do(a) paciente: ____________________________________________________

RG do prontuário:_______________________________________________________

Pesquisador responsável: ________________________________________________

LXXVIII

Anexo 3

Ficha de entrevista –Grupo paciente

Estudo do gene CYP1A1em pacientes portadores de câncer colorretal

Registro: _____

Nome do paciente: ___________________________________________________

RG: __________ etnia: ________ Idade: _____ sexo: F( ) M( )

End: _______________________________________________________________

Tel: ________________________________________________________________

Dados Clínicos:

Diagnóstico: _________________________________________________________

Localizacão: _________________________________________________________

Estádio Clínico: _______________________________________________________

Dukes: A ( ) B ( ) C ( ) D ( )

Data do estadiamento: ___________________________

Data da ultima consulta: __________________________

C/ doença ( ) s/ doença ( ) acomp. ( ) óbto ( ) Data do óbto : ____________

Profissão: ___________________________________________________________

História familiar: ______________________________________________________

Tabagista sim( ) não ( )

Idade começou: ___________ idade que parou: _________________________

Etilista sim( ) não (

)

Idade começou: ___________ idade que parou:

_____________________

Outras drogas: sim( ) não ( )

Idade começou: ___________ idade que parou: _________________________

Hábitos alimentares:

Fibras: sim ( ) não ( )

Carne vermelha: sim ( ) não ( )

Gordura: sim ( ) não ( )

Amostra:

Sangue venoso: sim( ) não( ) data vol: ( )

LXXIX

Anexo 4

Ficha de entrevista –Grupo paciente

Estudo do gene CYP1A1 em pacientes portadores de câncer colorretal

Registro: _____

Nome do paciente: _______________________________________________________________

RG: ____________ etnia: _________ Idade: _____ sexo: F( ) M( )

Diagnóstico:

___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________

End: ___________________________________________________________________

Tel: ____________________________________________________________________

Profissão: _______________________________________________________________

História familiar: __________________________________________________________

_______________________________________________________________________

Tabagista sim( ) não ( )

Idade começou: ___________ idade que parou: _________________________

Etilista sim( ) não (

)

Idade começou: ___________ idade que parou:

_____________________

Outras drogas: sim( ) não ( )

Idade começou: ___________ idade que parou: _________________________

Hábitos alimentares:

Fibras: sim ( ) não ( )

Carne vermelha: sim ( ) não ( )

Gordura: sim ( ) não ( )

Amostra:

Sangue venoso: sim( ) não( ) data vol: ( )

LXXX

Anexo 5

Tabela de dados e resultados do GrupoControle

controle sexo

etnia

idade

hist fam Etilismo

tabaco alelos

A C F M N 60 S S N A/A

A C F M B 60 N N S A/A

A CF M B 60 N N S A/A

A CS F B 71 S N N A/G

A F S M B 69 N S S A/A

A FS M B 73 N S S A/A

A FS M B 69 N S S A/A

A J F M B 54 S S S A/A

A N S M B 64 N S N A/G

A F B F B 72 S N N A/A

A S B M N 58 N N N A/A

ABF M B 5S N S S A/A

AFS M B 69 S S S A/A

AFS F B 67 S N S A/A

AFS M B 67 N S S A/A

AS F N 57 N S N A/A

AS M B 69 S S N A/A

ASFV M B 82 N S S A/A

B M A F B 77 N N N A/G

BMSC F N 56 S N N A/A

C A F B 66 S N N A/G

C C M B 72 S N S A/G

C C C G F B 39 S N S A/A

CFB M B 51 N S S A/G

CF F B 70 N N N A/A

CR V S M B 34 N S N A/A

D F S F B 73 S N N A/A

D G S F B 51 N N S A/A

DAP F B 40 S S S A/A

E C J F B 58 N N N A/A

E E M B 68 N N N A/A

E L M M B 64 N S S A/A

E F G M N 47 S S N A/A

E P M B 26 N S N A/A

EFF F B 28 N S S A/A

EMP F B 46 S S N A/A

F F M B 75 S N N A/G

F M S M B 43 N S N A/G

FNV F B 53 N S S A/G

G A P M B 38 S S S A/A

G P M B 43 N N N A/G

GR F B 51 N N N A/G

LXXXI

Continuação da Tabela de dados e resultados do Grupo Controle

controle sexo etnia idade hist fam

Etilismo tabaco alelo

GR F B 51 N N N A/G

H G F B 73 N S S A/A

I B S F B 61 S N N A/G

I F C M B 61 N N N A/A

IMS F B 72 N N N A/A

J A F F B 47 S N S A/A

J B M N 50 N S S A/A

J B D M B 64 N S S A/A

J BM M B 72 N S S A/A

J J F M B 50 N N S A/A

J M A M B 62 S N N A/A

J N N F B 69 S N N A/A

J N Q F B 51 S S N A/A

J P R F B 68 N N N A/G

J S M B 63 S S N A/A

J S S M B 70 N S S A/A

J V F M B 45 N N S A/G

JB M B 64 N S S A/A

JDAB F N 68 N N N A/A

JG J M B 39 N S S A/G

JS S M N 61 S N N A/G

L SS F B 57 N N N A/A

M A L F B 63 S N N A/A

M A S F B 35 N N N A/G

M A S F N 36 N S S A/G

M CB F B 78 N N N A/A

M DF F B 67 N S N A/G

M E G M B 63 N S N A/A

M F S M B 61 N S N A/A

M G S F N 44 S N N A/A

M IHG F B 80 N S N A/A

M J M B 72 N S S A/A

M J A F B 72 N N N A/G

M LF F B 47 S S S A/A

M M M B 86 N S N A/A

M NS M B 49 S S N A/A

M R P M B 64 S S N A/G

M R P M B 62 S S N A/G

M V S F B 62 N N S A/A

MCSS F B 64 N N S A/A

MER F B 65 N N S A/A

MGM F N 32 S S S A/A

MHM F B 62 S N N A/A

MJ L F N 69 N N N A/A

LXXXII

Continuação da Tabela de Dados e Resultados do Grupo Controle.

controle sexo

etnia idade

hist fam

Etilismo tabaco alelo

MJ L F N 69 N N N A/A

MMSS F B 5S N S S A/A

MPA F B 47 N S S A/G

MR M B 67 N S S A/A

N M M B 48 N S S A/G

N M F F B 49 S N N A/G

NB M B 75 N S N A/G

F F M B 57 S N N A/A

FS F B 60 N S N A/G

P G M B 63 N S S A/A

PPS F B 63 S S S A/A

R C S M B 42 N S N A/A

RCBS F N 3S S S S A/G

S B S 0 B 40 N N S A/G

S J R M B 54 N S N A/A

S J S M B 50 N S S A/G

S M G F B 6S N N N A/G

SD M B 7S N S S A/A

SJVF M B 47 N S N A/A

T F S F B 69 S S S A/A

TFS M B 79 N S S A/A

V R S M B 52 N S S A/A

V S F M N 57 N N N A/A

VCA M B 62 S S S A/A

WRCF M N 42 N S N A/G

Z B F B 47 N S N A/G

ZB F B 47 N S N A/A

Legenda:

F – feminino

M – masculino

S - sim

N – não

S/D – sem doença

C/D – com doença

A/G – heterozigoto

A/A – homozigoto (selvagem)

G/G – homozigoto (mutado)

Anexo 6

Tabela de Dados e Resultados do Grupo Estudo

Paciente sexo

etnia

Idade

Hist.

Fam Etilimo

tabagismo

Alelos Estadio Situação atual

Data do

estadiamento

AAG M B 53 S S S A/G 2 S/D 27/01/2003

AAS M B 56 S S S A/G 3 S/D 07/10/2002

AB M B 71 S S S A/A 2 S/D 26/02/2001

ABR M B 66 S N S A/G 3 C/D 15/06/2002

AC M B 60 N N N A/G 2 C/D 10/08/1998

ACC F B 57 S N N A/G 2 S/D 03/08/2001

ACF M B 82 N S S A/G 2 C/D 16/01/2001

ACS M B 60 N S N G/G 2 S/D 07/11/1998

ADV M B 69 N S S A/G 3 C/D 11/03/2002

AFBA M B 54 N S S A/G 2 C/D 17/06/2003

AFC F B 81 S N N A/G 2 C/D 15/07/2003

AJF M B 63 S S S A/G 3 C/D 18/10/1999

AJS M B 64 N N S A/G 3 C/D 10/03/2000

ALP M B 76 S S S A/A 3 C/D 06/07/2002

AMB F B 47 S N S A/G 2 C/D 11/08/2002

APN M B 68 S N S A/G 2 C/D 28/01/2002

APT M B 75 S S S A/A 3 S/D 14/03/2001

ARE M B 64 N N N A/G 3 S/D 04/05/1998

ARR F B 65 S N N A/G 2 C/D 19/04/2003

ARS M N 52 N N N A/G 3 S/D 23/01/2002

ASM M B 47 S S S A/G 2 C/D 23/09/2002

AT M B 58 S N S A/G 3 C/D 30/01/2003

AZC M B 67 N N N A/G 2 S/D 15/11/1998

BARR M B 38 S S S A/G 3 S/D 22/03/2002

CAL F B 64 S N N A/G 2 S/D 10/07/1998

CE M N 43 N N N A/G 4 C/D 20/06/2001

CPL F B 67 N S S A/G 3 C/D 14/03/2001

CVL M B 68 S S S A/G 4 C/D 15/05/2000

DPF F B 70 N N N A/G 3 S/D 06/07/2002

DR F B 68 N N S A/G 3 S/D 10/07/2000

Paciente sexo

etnia

Idade

Hist.

Fam Etilimo

tabagismo

Alelos Estadio Situação atual

Data do

estadiamento

E C G F B 71 N N N A/G 2 C/D 13/09/2001

EA M B 85 S S S A/G 2 S/D 28/05/2001

EA M B 85 N N S A/G 3 C/D 21/07/2002

ECS M B 71 N N S A/G 2 C/D 04/05/1998

EM M B 62 S N S A/G 2 C/D 06/04/2000

EM M B 61 S S S A/G 2 C/D 11/09/2002

ER M B 61 N S S A/G S S/D 17/09/2002

ES M B 57 S S S A/G 3 S/D 29/03/1998

ESJ F B 74 N N N A/G 3 C/D 14/11/2001

ESM F N 63 N N N A/G 3 C/D 11/05/2002

FEB M B 66 N S S A/A 2 S/D 23/09/2002

GC F B 69 N N S A/G 2 C/D 26/02/2001

GPG M N 50 S N S A/A 3 C/D 14/02/2002

GPS F N 44 S N S A/A 3 S/D 13/06/2003

GS F B 61 S N N A/G 2 C/D 03/01/2002

I H M A 44 S S S A/A 3 C/D 06/06/1996

IAS F B 40 S N N A/G 2 C/D 17/12/2001

IF F B 70 N N N A/G 2 S/D 20/01/2001

IFVA F B 70 N N N A/G 2 S/D 10/02/2003

IH M A 44 S S N A/G 3 C/D 01/01/2001

IMJ F B 56 S S S A/G 2 C/D 10/071/998

JBS M B 60 S S S A/G 4 C/D 17/01/2000

JCSM M B 70 N N N A/G 3 C/D 12/10/2001

JCSM M B 70 N S S A/G 2 C/D 04/07/2002

JEN M N 65 S S S A/G 2 C/D 14/02/2002

JFL F N 64 S N N A/G 2 C/D 29/04/2002

JLFL M N 65 N S S A/G 2 C/D 25/10/2001

JNB M B 44 N S S A/A 3 C/D 08/08/2002

JPS M B 76 N S S A/G 2 S/D 15/07/2002

JSMC M B 62 S S S A/G 2 C/D 12/04/2002

KAA M B 62 S S N A/G 2 C/D 12/03/2002

KY M A 70 N S S A/G 2 C/D 18/06/2003

Paciente sexo

etnia

Idade

Hist.

Fam Etilimo

tabagismo

Alelos Estadio Situação atual

Data do

estadiamento

KYK M A 60 N N S A/G 3 C/D 11/06/2002

LAC F B 36 S N N A/G 3 C/D 10/072002

LGV F B 73 S S S A/G 3 C/D 28/09/2002

LJF M B 39 S N S A/G 3 C/D 10/05/2002

LPJ F B 65 S N N A/G 3 C/D 14/09/2003

MABR F B 61 N S N A/G 3 S/D 20/05/2002

MABV F B 60 S S S G/G 3 C/D 19/03/2003

MAC F B 60 N N N A/G 3 S/D 27/01/2002

MACS F B 58 N N N A/A 3 S/D 10/07/2002

MAJ F B 70 S N S A/A 3 S/D 30/06/2003

MAF F B 47 S N N A/G 4 C/D 12/10/2002

MAP M B 76 N S S A/G 2 C/D 13/06/2002

MAS M B 79 S S S A/G 3 C/D 22/02/2002

MCSS F B 35 S N N A/G 2 C/D 10/05/2002

MCSS F B 34 N S S A/G 2 C/D 20/09/200S

MFCF F B 34 N N N A/G 2 C/D 08/02/2002

MJL F B 51 S S S A/G 3 C/D 28/06/1995

MLC F B 61 S N S A/G 3 C/D 26/03/2002

MLRN F B 53 S N N A/G 2 C/D 16/05/2002

MNP F B 52 S S S A/G 3 C/D 02//08/2002

MRC M B 64 N S S A/G 3 C/D 13/09/2001

MRS F B 75 N N N A/G S C/D 28/06/1995

MRS F B 57 S N S G/G 4 C/D 10/04/2002

MT F B 47 S N N A/G 2 S/D 05/09/1998

MTS M B 47 N S S A/G 2 S/D 22/03/200S

MZV F A 79 N N N A/G 4 C/D 30/02/2002

NAC F B 49 N N N A/G 3 S/D 15/06/2003

NSS F N 27 S N N A/G 3 C/D 24/02/2003

FBS F B 44 N N N A/G 2 C/D 04/10/2002

PFE M B 62 S S S A/G 2 S/D 07/11/2003

R A C F B 44 N N N A/G 2 C/D 02/09/2001

Paciente sexo

etnia

Idade

Hist.

Fam Etilimo

tabagismo

Alelos Estadio Situação atual

Data do

estadiamento

R A C F B 44 N N N A/G 2 C/D 26/07/2002

RC M B 54 N N S A/G 3 S/D 09/09/2001

RF M B 28 N N N A/A 2 C/D 29/01/2003

RJB M B 60 S S S A/G 3 C/D 15/06/1999

RLS M B 35 S S S A/G 3 C/D 14/02/2003

RMS M B 69 S S S A/G 3 S/D 12/04/2002

RS M N 69 S S N A/G 3 S/D 03/09/1998

RSS F B 69 N N N A/G 3 S/D 13/07/2002

SJ M B 69 N S S A/G 2 C/D 16/11/1999

SMS F B 69 N S S A/A 2 S/D 13/01/2003

ST M B 43 N S S A/G 3 C/D 06/01/2003

TF M A 68 S N N A/G 2 S/D 21/02/2002

TS M A 67 N N S A/G 2 S/D 19/09/1996

TU M A 51 S N S A/G 2 C/D 26/07/2002

VAA M B 47 S S S A/G 2 S/D 06/03/2002

VTS M B 54 N N N A/A 3 C/D 04/05/1998

WA M B 64 N S S A/A 2 S/D 12/01/2001

WC F B 44 N S N A/G S C/D 07/01/2003

WF F B 66 N N N A/G 2 S/D 04/09/2001

ZFM F B 60 S S S A/G 4 C/D 09/10/2002

ZMR F B 52 S N S A/G 3 S/D 19/03/2003

Legenda:

F – feminino

M – masculino

S - sim

N – não

S/D – sem doença

C/D – com doença

A/G – heterozigoto

A/A – homozigoto (selvagem)

G/G – homozigoto (mutado)

Referências Bibliográficas

___________________________________________________

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