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THAIS PERETTI
EXPRESSÃO DA HEPARANASE-2 E SINDECAM-1 EM
TUMORES COLORRETAIS
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
São Paulo
2006
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THAIS PERETTI
EXPRESSÃO DA HEPARANASE-2 E SINDECAM-1 EM
TUMORES COLORRETAIS
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
São Paulo
2006
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Peretti, Thais
Expressão da heparanase-2 e sindecam-1 em tumores colorretais.
/ Thais Peretti - São Paulo, 2006. xviii, 113f.
Tese (Mestrado) Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.
Programa de Pós-graduação em Ciências.
Título em inglês: Heparanase-2 and syndecan-1 expression in colorectal tumors.
1. Adenocarcinoma 2. Imunohistoquimica 3. Neoplasias colorretais
4. Marcadores biológicos de tumor 5. Proteoglicanas
Tese elaborada no Programa de Pós-
graduação do Departamento de Medicina,
disciplina de Clínica Médica (recomendado pelo
Conselho Técnico Científico - OF./CTC/Nº
61/2003 de 24/03/2003 de acordo com as
normas vigente, Portaria Ministerial nº 2264 de
19/12/1997) e apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Orientadora: Profª. Drª Maria Aparecida da
Silva Pinhal.
Co-Orientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emilia Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Profa. Dra. Leny Toma
THAIS PERETTI
EXPRESSÃO DA HEPARANASE-2 E SINDECAM-1 EM
TUMORES COLORRETAIS
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dra. __Leny Toma_(UNIFESP)________________________
Prof. Dr. ___Edvaldo da Silva Trindade (UFPR)_______________
Prof. Dr. ___Wilson Roberto Catapani (FMABC)______________
Prof. Dr. ___Ivarne Luis dos Santos Tersariol (UMC)__________
Aprovada em _25_/ 08_/ 2006_
A determinação é a qualidade da mente e do coração que nos faz
resistir à tentação de parar ou retroceder diante da oposição,
do perigo, ou do sofrimento.
Ela implica em reunir todas as nossas forças para atingir o alvo!
A determinação é a firmeza de espírito e a coluna dorsal dos
princípios que nos fazem prosseguir até alcançar o sucesso
sem deixar de avaliar e calcular corretamente
os riscos envolvidos.
Toda conquista valiosa só é alcançada após
ultrapassarmos os obstáculos!
É preciso superar os obstáculos tirando-os do nosso caminho ao invés
de permitir que ele nos tire do nosso caminho.
É preciso ter determinação!!!
Dedicatória
Dedicatória i
Esta tese é dedicada aos meus pais, Vicente e Madalena,
pela formação, por me ensinarem tantas coisas, me amarem
e serem exemplos de dedicação, caráter, humildade e vitória!
Ao meu querido irmão Fábio, presente acima de tudo
em meu coração, obrigada por seus conselhos e por tudo!
Eu amo vocês!
Dedicatória ii
A Leonardo, meu amor, por estar
tão presente em minha vida e decisões,
por me dar forças em todos os momentos
e fazer parte dos meus melhores sonhos.
Agradecimentos
Agradecimentos iii
Agradeço em especial a Profa. Dra. Cida
Pinhal, que representa para mim exemplo de
integridade, profissionalismo e competência.
Meu eterno agradecimento por todas as
oportunidades, pela orientação e confiança,
que foram indispensáveis para a
realização deste trabalho
Agradecimentos iv
Ao Prof. Dr. Jaques Waisberg, pela
sabedoria, competência, ensinamentos,
atenção e por fazer parte da realização
deste trabalho. Meu sinceros agradecimentos!
Agradecimentos v
A meu sogro e sogra, José e Angela, que são meus
segundos pais, exemplo de amor e dedicação!
Aos meus cunhados: Carina, Leandro e Fabiana.
A todos da minha maravilhosa família!
Agradecimentos vi
Agradeço a Deus por permitir
que meus sonhos tornem-se reais.
Muito obrigada Mestre dos Mestres!!!
Agradecimentos vii
Agradecimentos
À Profa. Dra. Helena B. Nader pelo exemplo de profissionalismo,
determinação e dedicação, por possibilitar minha vivência em um grande
laboratório.
Ao Prof. Dr. Jõao Paulo Achè de Freitas e Dra. Marcia Rodrigues Garcia
Tamousauskas pela atenção e apoio na realização prática deste trabalho,
disponibilizando seu laboratório.
Aos Prof(s). Dr(s). Leny Toma, Ivarne Luis dos Santos Tersariol, Edvaldo
da Silva Trindade e Wilson Roberto Catapani, pela atenção, dedicação e
disponibilidade na avaliação deste trabalho.
Às Prof(as). Dr(as). Ana Maria A. Mader e Rita Sinigaglia Coimbra pela
prestigiosa e valiosa colaboração, dedicação, e ensinamentos indispensáveis nas
análises patológica e imunohistoquímica, sem as quais este trabalho não teria sido
realizado.
À Profa. Gleice Margarete de Souza Conceição e ao aluno Leandro Luongo
Matos pela valiosa colaboração na análise estatística e disponibilização de dados
para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Ricardo Borges da Costa e Dra. Hitomi O. Yamassaki do laboratório
de Patologia Cirúrgica Ferdinando Costa, pela valiosa colaboração na
disponibilização dos tecidos e dados clínicos e patológicos.
Ao técnico Juan Francisco Sander, pela amizade e ensinamentos na
realização prática deste estudo.
Ao secretário da pós-graduação Venâncio Pedroza Ribeiro pelo
profissionalismo, competência, organização, amizade, paciência e pelas ajudas
constantes e importantes durante este curso.
Aos Prof(s). Dr(s). Marimélia Porcionato, Lúcia Sampaio, Yara Michelacci e
João Roberto M. Martins pela competência, profissionalismo e ensinamentos.
À Elsa, Aline e Marie pela atenção, disposição, alegria, e conversas
agradáveis.
Às secretárias da Biologia Molecular Clélia e Patrícia, pelo auxílio e
organização. Obrigada pelo sorriso e palavras de incentivo que para mim foram
muito importantes.
À “Dona” Vera, “Dona” Jú e “Dona” Cida pelo grande carinho, pelo alegre
convívio além do material de trabalho sempre pronto para uso e cafezinhos e
chás deliciosos!
Aos queridos amigos Ritchelli e Marcelo, Carol (Olinda, “linda”), Romine e
Kátia pelos momentos gostosos de bate papo, pela amizade, por nossos almoços,
por me ouvirem, me ajudarem, me apoiarem e tornarem meu dia-a-dia muito
melhor aí no Infar! Vocês são maravilhosos!!!
Agradecimentos viii
À todos do Infar pela convivência, auxílio e amizade: Thaís e Rodrigo ,
Sabrina, Ana Paula, Alessandro, Angela, Valquíria, Paty Semedo, Fábio, Paty
Santos e todas as meninas do 5° andar, todos da sala 1 e sala 3 e “Seu”Laurindo.
Agradecimento carinhoso aos amigos da FMABC: Thèrése, Eloah, Paulo,
“Carolzinha” (obrigada por todas as vezes que me ajudou nas “imunos”), Manoel,
Adriana, Ana Paula (da Bioquímica), todo o pessoal do laboratório de análises
clínicas.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelos recursos
fornecidos para a execução deste trabalho.
A todos que de alguma forma me ajudaram e torceram por mim, muito
obrigada!!!!
Índice
Índice Geral ix
ÍNDICE GERAL
APRESENTAÇÃO
.........................................................................................
1
INTRODUÇÃO
............................................................................................. 3
1. NEOPLASIAS ...................................................................................................................................
3
2. CÂNCER COLORRETAL ................................................................................................................. 4
2.1. SEQÜÊNCIA ADENOMA-CARCINOMA ..................................................................................... 5
2.2.
FATORES
DE
RISCO
.................................................................................................................
7
2.3. ESTADIAMENTO ....................................................................................................................... 9
2.4. METÁSTASE E CCR ..................................................................................................................11
3.
MARCADORES
TUMORAIS
...........................................................................................................
12
4.
TRANSFORMAÇÃO
NEOPLÁSICA
E
MODULAÇÃO
PELA
MATRIZ
EXTRACELULAR
.............14
4.1.
GLICOSAMINOGLICANOS
E
PROTEOGLICANOS
..................................................................16
4.1.1.
PROTEOGLICANO
DE
HEPARAM
SULFATO
E
PROGRESSÃO
TUMORAL...................................
19
4.1.1.1
SINDECAM
...........
..................................................................................................................
23
5. DEGRADAÇÃO DE PGHS ............................................................................................................. 24
6.
HEPARANASE
................................................................................................................................
27
6.1.
HEPARANASE
1
E
PROTEOGLICANOS
DE
HEPARAM
SULFATO
........................................
31
6.2.
HEPARANASE
1
E
RELAÇÃO
COM
TUMOR
E
METÁSTASE
..................................................32
OBJETIVOS
..............................................................................................
36
MATERIAL
E
MÉTODO
................................................................................
37
1.
CASUÍSTICA
...................................................................................................................................
37
2.
MATERIAL
......................................................................................................................................
40
2.1.
AMOSTRAS
DE
TECIDOS
.......................................................................................................
40
2.2.
REAGENTES
............................................................................................................................
41
2.3.
EQUIPAMENTOS
.....................................................................................................................
41
2.4.
PROGRAMAS
..........................................................................................................................
42
3.
MÉTODOS
......................................................................................................................................
42
3.1.
IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA
A
HEPARANASE
...................................................................
42
3.2.
IMUNOHISTOQUÍMICA
PARA
O
SINDECAM-1
......................................................................
43
3.3.
QUANTIFICAÇÃO
DIGITAL
DA
IMUNOMARCAÇÃO
CITOPLASMÁTICA
..............................
44
3.3.1.
CÁLCULO
DO
ÍNDICE
DE
POSITIVIDADE
(IP
DIG
)
.........................................................................
45
3.3.2.
CÁLCULO
DA
INTENSIDADE
DE
EXPRESSÃO
(ITE
DIG
)
..............................................................
45
3.3.3.
CÁLCULO
DO
ÍNDICE
DE
EXPRESSÃO
(IE
DIG
)
............................................................................
46
4.
ANÁLISE
ESTATÍSTICA
................................................................................................................
47
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO
.......................................................................
48
1.
EXPRESSÃO
DA
HEPARANASE
EM
CÂNCER
COLORRETAL
.................................................
48
2.
EXPRESSÃO
DO
SINDECAM-1
EM
CÂNCER
COLORRETAL
....................................................
52
3.
EXPRESSÃO
DA
HEPARANASE
E
SINDECAM-1
CORRELACIONADOS
À
VARIÁVEL
SEXO
.........................................................................................................................................................
55
4.
VALORES
DE
REFERÊNCIA
(OU
PONTOS
DE
CORTE)
DOS
ÍNDICES
IMUNOHISTOQUÍMICOS
PARA
CLASSIFICAR
UM
PACIENTE
COMO
SADIO
OU
DOENTE ...............................................56
5.
RELAÇÃO
ENTRE
A
EXPRESSÃO
DA
HEPARANASE
E
DE
SINDECAM-1
COM
VARIÁVEIS
PATOLÓGICAS
EM
PACIENTES
COM
CARCINOMA
COLORRETAL..........................................60
6.
RELAÇÃO
ENTRE
ÍNDICES
IMUNOHISTOQUÍMICOS
DE
EXPRESSÃO
DA
HEPARANASE
E
DE
SINDECAM-1 ..............................................................................................................................66
CONCLUSÕES
..........................................................................................
68
Índice Geral x
SUMÁRIO
................................................................................................ 69
ABSTRACT
................................................................................................
70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.................................................................
71
ANEXO
................................................................................................... 80
Índice de Figuras xi
ÍNDICE DE FIGURAS
F
IGURA
1
-
DIFERENÇA ENTRE ADENOCARCINOMA COLORRETAL
(
A
)
E MUCOSA COLÔNICA NORMAL
(
B
).................................................................................................................................... 6
F
IGURA
2
–
SEQÜÊNCIA DO DESENVOLVIMENTO ADENOMA
-
CARCINOMA
....................................... 7
F
IGURA
3
–
ESTADIAMENTO DO ADENOCARCINOMA COLORRETAL
................................................ 9
F
IGURA
4
–
EVENTOS NO PROCESSO DE METÁSTASE
............................................................... 12
F
IGURA
5
–
ESQUEMA GERAL DA MATRIZ EXTRACELULAR E SEUS CONSTITUINTES
,
REPRESENTADA
ABAIXO DA CAMADA EPITELIAL
.......................................................................................... 14
F
IGURA
6
–
MEMBRANA BASAL E MOLÉCULAS CONSTITUINTES
:
LAMININA
,
COLÁGENO
,
ENTACTINA E
PERLECAM
...................................................................................................................... 16
F
IGURA
7
–
MONOSSACARÍDEOS QUE COMPÕEM OS GLICOSAMINOGLICANOS E POSIÇÕES DE
SULFATAÇÃO
................................................................................................................... 17
F
IGURA
8
–
UNIDADE ESTRUTURAL DOS GLICOSAMINOGLICANOS
............................................... 18
F
IGURA
9
–
ESQUEMA DE BIOSSÍNTESE DO
PGHS ................................................................... 20
F
IGURA
10
–
LOCALIZAÇÃO DE PROTEOGLICANOS DE HEPARAM SULFATO
.................................. 22
F
IGURA
11
–
FAMÍLIA DOS SINDECANS
..................................................................................... 23
F
IGURA
12
–
ESQUEMA DE DEGRADAÇÃO DE PROTEOGLICANOS
............................................... 25
F
IGURA
13
–
DISSACARÍDEO DE HEPARAM SULFATO
................................................................ 25
F
IGURA
14
–
ESPECIFICIDADE DA ENZIMA HEPARANASE SOBRE A CADEIA DE HEPARAM SULFATO
26
F
IGURA
15
–
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO GENE COMPLETO DA HEPARANASE
-1
CROMOSSOMO
4
Q
21,3 .................................................................................................... 28
F
IGURA
16
–
MECANISMO DE AÇÃO DA HEPARANASE
1.............................................................. 31
F
IGURA
17
–
AÇÃO DA HEPARANASE
....................................................................................... 34
F
IGURA
18
–
MICROSCOPIA ÓPTICA DEMONSTRANDO A EXPRESSÃO POSITIVA DA HEPARANASE
.. 48
F
IGURA
19
–
INTERVALO DE CONFIANÇA
(95%)
PARA A MÉDIA DAS VARIÁVEIS DE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE
.................................................................................................................. 51
F
IGURA
20
–
MICROSCOPIA ÓPTICA DEMONSTRANDO A EXPRESSÃO POSITIVA DO SINDECAM
-1 ... 52
FIGURA
21
–
INTERVALO DE CONFIANÇA
(95%)
PARA A MÉDIA DAS VARIÁVEIS DE EXPRESSÃO DO
SINDECAM
-1.......................................................................................................................... 54
F
IGURA
22
–
MÉDIA PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DE HEPARANASE
(
HPA
2)
EM RELAÇÃO AO SEXO
DOS INDIVÍDUOS COM E SEM CARCINOMA COLORRETAL
...................................................... 56
F
IGURA
23
–
MÉDIA PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DE SINDECAM
-1(
SYN
-1)
EM RELAÇÃO AO SEXO
DOS INDIVÍDUOS COM E SEM CARCINOMA COLORRETAL
...................................................... 56
F
IGURA
24
–
CURVA ROC PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DA HEPARANASE
(
HPA
2)....... 57
F
IGURA
25
–
CURVA ROC PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE SINDECAM
-1
(
SYN
-1)
...... 58
F
IGURA
26
–
DIAGRAMA DE DISPERSÃO ENTRE IDADE E ÍNDICE DE EXPRESSÃO
.......................... 63
F
IGURA
27
–
DIAGRAMA DE DISPERSÃO ENTRE TAMANHO DO TUMOR E ÍNDICE DE EXPRESSÃO
.... 65
F
IGURA
28
-
DIAGRAMA DE DISPERSÃO RELACIONANDO EXPRESSÃO DE HEPARANASE
(
HPA
2)
E
SINDECAM
1(
SYN
-1) ......................................................................................................... 67
Índice de Figuras xii
F
IGURA A
1
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE
...................................................................... 85
F
IGURA A
2–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE
,
SEGUNDO O SEXO
.......................................... 85
F
IGURA A
3
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE
.................................................................... 85
F
IGURA A
4
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO O SEXO
......................................... 85
F
IGURA A
5
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE
...................................................................... 85
F
IGURA A
6
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO O SEXO
........................................... 85
F
IGURA A
7
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM
........................................................................... 86
F
IGURA A
8
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O SEXO
............................................... 86
F
IGURA A
9
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM
......................................................................... 86
F
IGURA A
10
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O SEXO
............................................ 86
F
IGURA A
11
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM
......................................................................... 86
F
IGURA A
12
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O SEXO
............................................. 86
F
IGURA A
13
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
.................................................................................................................. 88
F
IGURA A
14
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 88
F
IGURA A
15
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................... 88
F
IGURA A
16
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 88
F
IGURA A
17–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 88
F
IGURA A
18
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 88
F
IGURA A
19
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 89
F
IGURA A
20
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 89
F
IGURA A
21
–
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO O ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
....................................................................................................... 89
F
IGURA A
22
-
BOX
-
PLOT PARA O IP HEPARANASE SEGUNDO A METÁSTASE LINFONODAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 89
F
IGURA A
23
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
.................................................................................................................. 90
F
IGURA A
24
-
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 91
F
IGURA A
25
-
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................... 91
F
IGURA A
26
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 91
F
IGURA A
27
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 91
F
IGURA A
28
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 91
F
IGURA A
29
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
Índice de Figuras xiii
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
..................................................................................... 92
F
IGURA A
30
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 92
F
IGURA A
31
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
....................................................................................................... 92
F
IGURA A
32
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE HEPARANASE SEGUNDO METÁSTASE LINFONODAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 92
F
IGURA A
33
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
.................................................................................................................. 94
F
IGURA A
34
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 94
F
IGURA A
35
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................... 94
F
IGURA A
36
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 94
FIGURA A
37
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 94
F
IGURA A
38
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 94
F
IGURA A
39
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 95
F
IGURA A
40
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 95
F
IGURA A
41
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
....................................................................................................... 95
F
IGURA A
42
–
BOX
-
PLOT PARA O IE HEPARANASE SEGUNDO METÁSTASE LINFONODAL EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 95
F
IGURA A
43
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
.................................................................................................................. 97
F
IGURA A
44
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 97
F
IGURA A
45
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
....................................................................................................... 97
F
IGURA A
46
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 97
F
IGURA A
47–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 97
F
IGURA A
48
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 97
F
IGURA A
49
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.............................................................................. 98
F
IGURA A
50
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................... 98
F
IGURA A
51
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO O ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
....................................................................................................... 98
F
IGURA A
52
–
BOX
-
PLOT PARA O IP SINDECAM SEGUNDO METÁSTASE LINFONODAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................... 98
F
IGURA A
53
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
................................................................................................................ 100
Índice de Figuras xiv
F
IGURA A
54
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 100
F
IGURA A
55
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................. 100
F
IGURA A
56
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 100
F
IGURA A
57–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 100
F
IGURA A
58
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 100
F
IGURA A
59
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 101
F
IGURA A
60
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................. 101
F
IGURA A
61
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO O ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
..................................................................................................... 101
F
IGURA A
62
–
BOX
-
PLOT PARA O ITE SINDECAM SEGUNDO METÁSTASE LINFONODAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................. 101
F
IGURA A
63
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O SEXO EM PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL
................................................................................................................ 103
F
IGURA A
64
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO A LOCALIZAÇÃO DO TUMOR EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 103
F
IGURA A
65
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O TIPO HISTOLÓGICO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
..................................................................................................... 103
F
IGURA A
66
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O GRAU DE DIFERENCIAÇÃO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 103
F
IGURA A
67–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O ASPECTO MACROSCÓPICO EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 103
F
IGURA A
68
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO DA PAREDE
(
SEROSA
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 103
F
IGURA A
69
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO ANGIOLINFÁTICA EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................ 104
F
IGURA A
70
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO A INVASÃO PERINEURAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................. 104
F
IGURA A
71
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO O ESTADIAMENTO EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL
..................................................................................................... 104
F
IGURA A
72
–
BOX
-
PLOT PARA O IE SINDECAM SEGUNDO METÁSTASE LINFONODAL EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL
............................................................................................. 104
Índice de Tabelas xv
ÍNDICE
DE
TABELAS
TABELA I
....................................................................................................................................
GENES ENVOLVIDOS NA CARCINOGÊNESE COLORRETAL
....................................................... 08
TABELA II
...................................................................................................................................
ESTADIAMENTO TNM
(
AJCC CANCER STAGING MANUAL
,
2002).............................................. 10
TABELA III
..................................................................................................................................
PRINCIPAIS MARCADORES TUMORAIS E TECIDOS COMPROMETIDOS
......................................
13
TABELA IV
..................................................................................................................................
COMPARAÇÃO ENTRE AS HEPARANASES
1
E
2..................................................................... 30
TABELA V
..................................................................................................................................
ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(
HPA
2)
EM INDIVÍDUOS
ACOMETIDOS OU NÃO POR CARCINOMA COLORRETAL
..........................................................50
TABELA VI
..................................................................................................................................
ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DO SINDECAM
-1
(
SYN
-1)
EM INDIVÍDUOS
ACOMETIDOS OU NÃO POR CARCINOMA COLORRETAL
.......................................................... 53
TABELA VII
.................................................................................................................................
PONTOS DE CORTE COM A MELHOR RELAÇÃO ENTRE SENSIBILIDADE E
ESPECIFICIDADE
...................................................................................................................59
TABELA VIII
................................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE
(
HPA
2)
DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS
.................................. 61
TABELA IX
..................................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DE SINDECAM
-1
(
SYN
-1)
DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS
..................................................... 62
TABELA X
..................................................................................................................................
COEFICIENTES DE CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS E O
TAMANHO DO TUMOR
.......................................................................................................
64
TABELA XI
..................................................................................................................................
COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE
HEPARANASE
(
HPA
2)
E SINDECAM
-1(
SYN
-1)...................................................................... 66
TABELA A I
.................................................................................................................................
MEDIDAS DOS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE HEPARANASE E SINDECAM
-1
PARA CADA
INDIVÍDUO
(
COM CARCINOMA COLORRETAL E SEM NEOPLASIA
*)
.........................................................................................................................................80
TABELA A II
................................................................................................................................
DADOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS
50
ESPÉCIMES DE TUMORES
COLORRETAIS
................................................................................................................... 82
TABELA A IIII
..............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA AS VARIÁVEIS EM PACIENTES SEM NEOPLASIA
*
(
NORMAL
*)
E COM
O TUMOR
............................................................................................................................84
Índice de Tabelas xvi
TABELA A IV
...............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DA HEPARANASE
(
IP
%)
DE ACORDO
COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
....................... 87
TABELA A V
................................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(
ITE
)
DE ACORDO
COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
....................... 90
TABELA A VI
...............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(
IE
)
DE ACORDO COM AS
VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
..................................
93
TABELA A VII
..............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DO SINDECAM
(
IP
%)
DE ACORDO COM
AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................... 96
TABELA A VIII
.............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DO SINDECAM
(
ITE
)
DE ACORDO
COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
........................99
TABELA A IX
...............................................................................................................................
MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DO SINDECAM
(
IE
)
DE ACORDO COM AS
VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.................................... 102
TABELA A X
................................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DA HEPARANASE
(
IP
%),
SEGUNDO O PONTO DE CORTE EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
............................105
TABELA A XI
...............................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(
ITE
)
EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.........................................................................107
TABELA A XII
..............................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(
IE
)
EM
TUMORES COLORRETAIS
.................................................................................................. 108
TABELA A XIIII
.............................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DO SINDECAM
(
IP
%)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
................................................................................109
TABELA A XIV
.............................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DO SINDECAM
(
ITE
)
EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
........................................................................... 111
TABELA A XV
..............................................................................................................................
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE EXPRESSÃO DO SINDECAM
(
IE
)
EM TUMORES
COLORRETAIS
................................................................................................................. 112
Abreviações
Lista de Abreviações xvii
Lista de Abreviações
CCR – Câncer colorretal;
MEC – Matriz extracelular;
HPA1 – Heparanase 1;
HPA2 – Heparanase 2;
Syn-1 – Sindecam 1;
DNA – Ácido desoxirribonucléico;
MB – Membrana Basal;
PAF – Síndrome da polipose adenomatosa familiar;
HNPCC – Câncer colorretal hereditário sem polipose;
VEGF – Fator de crescimento do endotélio vascular;
EGF – Fator de crescimento epidermal;
PDGF – Fator de crescimento derivado de plaquetas;
TGFα
αα
α - Fator de crescimento de fibroblasto transformação α;
TGFβ
ββ
β - Fator de crescimento de fibroblasto transformação β;
BFGF – Fator de crescimento de fibroblasto básico;
PCR – Reação de polimerase em cadeia;
PSA – Antígeno prostático específico;
HCG – Gonadotrofina coriônica humana;
GAGs – Glicosaminoglicanos;
AH – Ácido hialurônico;
C4S – Condroitim – 4 sulfato;
C6S – Condroitim – 6 sulfato;
DS – Dermatam Sulfato;
Hep – Heparina;
Lista de Abreviações xviii
HS – Heparam Sulfato;
QS – Queratam Sulfato;
PGHS – Proteoglicano de Heparam Sulfato;
GlcA – Ácido D-glucurônico;
GlcNAc – N-Acetil-D-glucosamina;
PAP´s – 3’ fosfadenosina 5’ fosfosulfato;
NDST – N-acetil-glucosaminil-N-desacetilase/-N-sulfotransferase;
GPI – Glicosil-fosfatidil-inusitol;
FGF2 – Fator de crescimento básico de fibroblasto;
KDa – Kilodalton;
PG – Proteoglicano;
Kb – Kilobase;
Pb – Pares de bases;
BSA – Abumina sérica bovina;
IP – Índice de Positividade;
ITE – Intensidade de Expressão;
IE – Índice de Expressão;
CEP – Comitê de ética e pesquisa;
UICC – União Internacional de Combate ao Câncer;
LSAB-HRP – Large streptavidin-avidin-biotin system peroxidase (sistema de
peroxidase streptavidina-avidina-biotina);
DAB – 3,3’ Diaminobenzamidina;
PBS – Tampão fosfato de sódio;
DOi – Densidade óptica de imunohistoquímica;
u.o – Unidade óptica;
µ
µµ
µm
2
– Micrômetro quadrado;
DOf – Densidade óptica do fundo;
DP – Desvio padrão;
pc – Ponto de corte;
n – Número de indivíduos;
Ic – Intervalo de confiança;
Introdução
Apresentação
1
Apresentação
O estudo do câncer é importante por ser uma das doenças que mais matam no
mundo, apesar dos avanços no diagnóstico precoce e de novas terapias. O câncer
colorretal representa uma das neoplasias de maior importância no ocidente, tanto
por sua prevalência como por sua incidência, sendo a terceira doença neoplásica
maligna mais freqüente em todo o mundo (Inca, 2005).
Diversas alterações fisiológicas são observadas com o aparecimento do câncer,
dentre elas o remodelamento tecidual e da matriz extracelular (MEC).
A identificação de grande número de proteínas, cuja ação influi na formação e
desenvolvimento da neoplasia, gerou a expectativa de que tais moléculas, por
apresentarem variação na sua expressão e por estarem freqüentemente alteradas
no tumor, poderiam ser analisadas como marcadores tumorais.
A heparanase (endo-beta-glucuronidase) é uma das enzimas responsáveis por
promover o remodelamento da MEC e sua expressão parece estar alterada em
neoplasias. A isoforma 1 da heparanase (HPA1), enzima que age sobre a cadeia
sacarídica do proteoglicano de heparam sulfato (PGHS), já vem sendo investigada
como novo marcador tumoral. (Freeman & Parish, 1998; Toyoshima & Nakajima,
1999; Vlodavsky et al., 1999). O PGHS constitui a maior classe de proteoglicanos
encontrados na matriz extracelular, membrana basal e na superfície celular
associado com a membrana celular. São macromoléculas formadas por um
esqueleto protéico ao qual estão covalentemente ligadas cadeias de
glicosaminoglicanos (heparam sulfato).
Recentemente foi descoberta a isoforma 2 da heparanase (HPA2), cujo
substrato ainda é desconhecido. Neste estudo busca-se comparar a expressão da
Apresentação
2
HPA2 em tecidos colorretais tumorais em diferentes estadiamentos e em tecidos
colorretais sem neoplasia* (normais*).
Estudos relatam que as células tumorais podem diminuir a expressão de PGHS
de superfície celular (sindecam), como forma de minimizar a adesão celular. Assim,
busca-se também verificar a expressão de sindecam-1, um PGHS de superfície
celular expresso preferencialmente na superfície basolateral de células epiteliais,
inclusive as do intestino.
Os resultados obtidos nesses estudos poderão corroborar com o entendimento
sobre o papel destes compostos no desenvolvimento de tumores e assim,
futuramente, servirem como possíveis marcadores para o diagnóstico de câncer
colorretal.
Introdução
3
Introdução
1 Neoplasias
Neoplasia ou tumor é qualquer proliferação anormal de células que pode ser
benigna ou maligna (literalmente significa “crescimento novo”). Câncer, termo
utilizado em referência aos “tumores malignos”, contém células capazes de invadir
os tecidos vizinhos, penetrar e sobreviver na corrente sangüínea ou linfática e
originar tumores secundários ou metástases.
Câncer é o resultado da perda da integridade dos mecanismos reguladores que
governam o comportamento normal das células. A proliferação e diferenciação
celulares tornam-se descontroladas, sendo importante a compreensão desta doença
nos níveis molecular e celular para o desenvolvimento de novas tecnologias de
diagnóstico precoce e terapias.
Todos os tumores, benígnos ou malígnos, contém dois componentes básicos:
(A) células neoplásicas proliferantes que constituem o parênquima, e (B) o estroma,
constituído de tecido conjuntivo e vasos sanguíneos. Apesar das células
parenquimatosas representarem o componente proliferativo das neoplasias,
determinando sua natureza, o crescimento celular e a evolução das neoplasias
dependem de componentes sinalizadores presentes no estroma (Liotta & Rao,
1984).
O desenvolvimento do câncer é reconhecido como um processo de múltiplos
passos, envolvendo mutações e seleções que geram células com capacidade
progressivamente aumentada para a proliferação, sobrevivência, invasão e
metástases. A maior causa de câncer é a mutação, alteração no DNA celular (ácido
desoxirribonucléico), por meio de agentes carcinogênicos que podem ser de
natureza química, física ou biológica (Rossi et al., 2005).
Introdução
4
A organização defeituosa da membrana basal (MB) em tumores malignos pode
ser decorrente da diminuição na síntese, ou desorganização de seus componentes e
aumento da síntese de proteases que promovem o remodelamento da matriz
extracelular (Liotta, 1986).
Ainda, as interações célula-célula e célula-matriz, das células neoplásicas,
apresentam-se alteradas quando comparadas com células normais (Bissell et al.,
2005).
Os tumores malignos podem ser classificados como carcinomas, sarcomas e
leucemias ou linfomas. Os carcinomas, que correspondem a aproximadamente 90%
das neoplasias em humanos, são derivados de células epiteliais; os sarcomas, mais
raros, são tumores sólidos de tecido conjuntivo e fibroso; leucemias e linfomas, que
representam cerca de 8% dos casos de câncer humano, originam-se de células
precursoras de células sangüíneas e do sistema imune, respectivamente.
2 Câncer Colorretal
O câncer colorretal (CCR) é o quarto tipo de neoplasia maligna mais
freqüentemente diagnosticada em homens, depois dos tumores de pulmão,
estômago e próstata, e o terceiro mais comum em mulheres, depois dos de mama e
colo uterino (Rossi et al., 2005).
No Brasil, o CCR é a terceira causa mais comum de morte por câncer,
possuindo maior incidência na faixa etária entre 50 e 70 anos, atingindo igualmente
homens e mulheres (Inca, 2005).
Estima-se que mais de 900.000 casos novos de CCR foram diagnosticados no
mundo, durante o ano de 2000, representando 9,4% do total de casos novos de
câncer. .
Introdução
5
2.1 Seqüência adenoma-carcinoma
No intestino grosso, podem ocorrer tanto neoplasias de origem benigna, os
adenomas, quanto de origem maligna, os carcinomas. Os adenocarcinomas
constituem quase a totalidade dos cânceres colorretais, e representam 70% de
todas as neoplasias malignas do trato gastrointestinal. São compostos de células
originadas do epitélio das glândulas intestinais que, após o acúmulo de mutações
em seu material genético, originam o CCR.
A associação entre carcinoma e pólipos colorretais foi descrita em 1978 por
Morison e colaboradores, baseada em observações clínicas, epidemiológicas e
anátomo-patológicas, sendo conhecida hoje como seqüência “adenoma-carcinoma”
(Hill et al., 1978).
Um pólipo representa uma massa tumoral protusa em direção à luz intestinal.
Inicia-se como uma pequena massa séssil que, a medida que aumenta de tamanho,
pode permanecer como séssil ou adquirir uma haste, tornando-se pediculado.
Nem todo pólipo tem característica neoplásica. Pólipos hiperplásicos,
inflamatórios e linfóides, são todos definidos como não-neoplásicos, não há atipia ou
displasia e, via de regra, suas histórias naturais não se relacionam com o surgimento
de neoplasias. Entretanto, pólipos epiteliais que resultam de proliferação anormal
numa mucosa displásica são denominados adenomas e representam as verdadeiras
lesões neoplásicas pré-malignas do intestino grosso. A prevalência dos adenomas
na população geral gira em torno de 20 a 30% abaixo de 40 anos de idade e entre
40 a 50% após os 60 anos (Robbins et al., 1998).
O risco da malignidade no pólipo adenomatoso correlaciona-se com três fatores
independentes: tamanho, arquitetura histológica e grau de displasia epitelial (Atkin
etal.,1992).
Introdução
6
Este conjunto de alterações reflete a perda do controle do crescimento celular
pelo acúmulo de mutações nos genes envolvidos com esta função. Admite-se que a
herança, mas sobretudo, a ação direta dos agentes carcinogênicos sobre a mucosa
colorretal, resulta no acúmulo de defeitos genéticos que concorrem para a
carcinogênese epitelial no intestino grosso. A Figura 1 (A e B) apresenta a diferença
entre uma mucosa colorretal normal e com adenocarcinoma.
Fonte: www.pathologyatlas.ro/ Colon%20Cancer.html
A.
Fonte: www.ncl.ac.uk/ihg/ research/molecular/cancer/
B.
FIGURA 1. DIFERENÇA ENTRE ADENOCARCINOMA COLORRETAL (A) E MUCOSA COLÔNICA NORMAL
(B); Coloração Hematoxilina e Eosina (aumento 100x); A Figura 1 A mostra a forte marcação nuclear da
hematoxilina (roxo) em células desorganizadas presente em toda a extensão colônica (mucosa, submucosa,
serosa e túnica muscular), típico de um tecido neoplásico. A figura 1B mostra a marcação nuclear da
hematoxilina em células ganglionares organizadas nas regiões da mucosa (M) e submucosa (IN) porém, menor
marcação ou ausência em regiões da serosa (S) e túnica muscular própria (ME), retratando uma mucosa
colônica normal.
Introdução
7
O CCR divide-se basicamente em dois grandes grupos: CCR esporádico, que
corresponde a 85% do total das neoplasias malignas colorretais; e o CCR hereditário
que corresponde aos restantes 15% dos CCR (Robbins et al., 1998). O CCR
hereditário apresenta duas subdivisões: a síndrome da polipose adenomatosa
familiar (PAF) que representa 5% dos CCR, e o câncer colorretal hereditário sem
polipose (HNPCC), que corresponde cerca de 10% do total dos casos de CCR.
A
d
e
s
ã
o
S
i
n
a
l
i
z
a
ç
ã
o
Fatores de crescimento
A
P
C
K
-
ras
A
n
g
i
o
g
ê
n
e
s
e
P
-
53
A
p
o
p
t
o
s
e
P
-
16
SMAD4
E-Caderina
hMSH2
hMLH1
Fonte: Cooper, 2001.
FIGURA 2. SEQÜÊNCIA DO DESENVOLVIMENTO ADENOMA-CARCINOMA.
Uma única célula alterada gera
uma população de células proliferativas, que progride de adenomas benignos de tamanho aumentado para
carcinoma maligno. As células cancerosas invadem o tecido conjuntivo subjacente e penetram nos vasos
sanguíneos e linfáticos, espalhando-se desta forma por todo o corpo O momento em que cada gene pode ser
afetado está indicado com a cor rosa. A indicação em verde indica que a ordem dos eventos genéticos é incerta.
As vias funcionais afetadas estão indicadas em azul. P-16 e SMAD4= proteínas que agem no controle do ciclo
celular; E-caderina= molécula de adesão; hMSH2 e hMSH1= genes de reparo do DNA; K-ras= oncogene; P53 e
APC= genes supressores tumorais;
2.2 Fatores de risco
Existem fatores que aumentam a oportunidade de aparecimento da doença:
idade; dieta com alto conteúdo de gordura e de carne, e baixo teor de cálcio;
Introdução
8
obesidade e sedentarismo. Também são fatores de risco o consumo exagerado de
bebidas alcóolicas, a retocolite ulcerativa, a doença de Cronh e a predisposição
genética.
O CCR possui duas vias genéticas de progressão histológica do adenoma: a via
da instabilidade cromossômica, que ocorre na PAF, onde o doente herda uma
mutação no gene supressor tumoral (APC) e a via da hipermutabilidade do DNA,
que ocorre no HNPCC, em que a alteração genética herdada é a inativação de um
dos alelos dos genes envolvidos no reparo do DNA (hMSH2 e hMLH1,
principalmente). Os genes envolvidos na carcinogênese colorretal e suas funções na
patogênese do câncer, estão descritos na Tabela I.
TABELA I. GENES ENVOLVIDOS NA CARCINOGÊNESE COLORRETAL.
Categorias Nome Função do gene
APC
Sua perda afeta a regulação do ciclo celular e da apoptose;
controla os níveis citoplasmáticos da proteína β-catenina, que
funciona como um ativador da transcrição de DNA.
Supressores
DCC
Molécula de adesão celular; perda de função é estímulo para
comportamento metastático.
Tumorais
p53
Regula o ciclo celular e a apoptose após dano ao DNA; perda
de função leva à replicação celular mesmo em face de
mutações do DNA.
MCC
Função desconhecida; efeito da perda de função
desconhecido.
K-ras
Proteína de ligação com GTP e intermediária na via de
sinalização de fatores de crescimento; mutação leva à sua
ativação constante e estimulação irrefreada à replicação do
DNA.
Oncogenes
src
Enzima tirosina quinase; tem atividade elevada em adenomas
e carcinomas, porém os mecanismos que levam à sua
ativação são desconhecidos.
c-myc
Ativador de transcrição; expressão aumentada em neoplasias
de colorretal, porém os mecanismos de amplificação são
desconhecidos.
hMsh2
Genes hMLH1 Fazem parte do sistema de reparo do DNA; perda leva ao
de reparo hMsh6 Fenótipo de instabilidade de microssatélites e à
do DNA hPMS1 Hipermutabilidade do DNA.
hPMS2
CD44v Glicoproteína de superfície celular; molécula de adesão celular
relacionada com doença metastática.
Outros
COX-2
Gene da enzima Cicloxigenase-induzível; inibe diferenciação
celular no epitélio intestinal e diminui apoptose.
Fonte: Cotti et al., 2000 (modificada).
Introdução
9
2.3 Estadiamento
O estudo do tecido neoplásico permite avaliar a extensão do tumor, as invasões
venosa, neural ou linfática e o comprometimento de linfonodos. O estudo anátomo-
patológico da peça cirúrgica e os exames de imagem permitem concluir o estádio da
doença. O sistema de estadiamento ideal para o CCR é definido como aquele com
características de simplicidade, reprodutibilidade, precisão em informar a extensão
da doença, sua agressividade, seu potencial de disseminação, e a sensibilidade à
terapêutica e, são importantes para o planejamento terapêutico, para a definição do
prognóstico, tratamento, além de permitir comparação entre estudos clínicos, por
estratificar pacientes em grupos ou subgrupos semelhantes.
O CCR pode ser estadiado pela classificação de Dukes, Astler Coller, ou TNM,
mais utilizada atualmente (detalhada na Tabela II). A Figura 3 apresenta o
estadiamento TNM e Astler & Coller.
Fonte: www.snfge.asso.fr/.../ faq/colon_cancer.htm
FIGURA 3. ESTADIAMENTO DO ADENOCARCINOMA COLORRETAL – Classificação TNM: T= região de
invasão celular (T1= submucosa (sm); T2= camada muscular (musc); T3= serosa (ser) e T4= órgãos adjacentes);
N= comprometimento ganglionar (N0= negativo, N+= positivo); M= presença de metástase (M+= presente, M0=
ausente). Astler e Coller: região de invasão celular sem comprometimento ganglionar (A= submucosa; B1=
camada muscular e B2= serosa / adjacências) e com gânglios comprometidos (C1= muscular e C2=
serosa/adjacências).
Órgãos
adjacentes
M+ =Metástase presente
M0 = Metástase ausente
N0 N+ Gânglios Gânglios
(g. negativo) (g. positivo) negativos positivos
Introdução
10
TABELA II. ESTADIAMENTO TNM (AJCC CANCER STAGING MANUAL, 2002)
Tumor Primário (T)
TX Tumor primário não pode ser avaliado
T0 Em evidência de tumor primário
Tis Carcinoma in situ: intra-epitelial ou invasão da lâmina própria*
T1 Tumor invade a submucosa
T2 Tumor invade a muscular própria
T3
Tumor invade além da muscular própria, sem ultrapassar a subserosa ou os
tecidos desperitonizados pericólicos ou perirretais.
T4
Tumor invade diretamente outros órgãos ou estruturas, e/ou perfura o
peritônio visceral ** ***
Linfonodos Regionais (N)
NX N não pode ser avaliado
N0 Ausência de metástase linfonodal
N1 Metástase para 1 a 3 linfonodos
N2 Metástase para 4 ou mais linfonodos
Metástase (M)
MX M não pode ser avaliada
M0 Ausência de metástase
M1 Presença de metástase
Estádios
Estádio T N M Dukes
0 Tis N0 M0 -
I T1 N0 M0 A
T2 N0 M0 A
IIA T3 N0 M0 B
IIB T4 N0 M0 B
IIIA T1-T2 N1 M0 C
IIIB T3-T4 N1 M0 C
IIIC Qualquer T N2 M0 C
IV Qualquer T Qualquer N M1 -
*Tis inclui tumores confinados dentro da membrana basal glandular (intra-epitelial) ou lâmina própria
(intramucoso) sem extensão através da muscular da mucosa. ** Invasão direta em T4 inclui invasão de
outros segmentos colo retais através da serosa. *** Tumor aderido a outros órgãos ou estruturas é
classificado como T4 se a análise histopatológica confirmar aderência neoplásica.
Introdução
11
2.4 Metástase e CCR
Metástases, e não neoplasias primárias, são as responsáveis pela maioria das
mortes nos casos de câncer. Estudar como a metástase se desenvolve e suas
etapas são importantes alvos para prevenir essas mortes (Davies et al., 2005).
O crescimento de tumores e metástases são processos associados à
angiogênese, nos quais o vaso principal que suplementa o tumor é derivado de
vasos preexistentes.
Estudos mostraram a regulação da angiogênese em CCR por fatores de
crescimento: fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), fator de
crescimento epidermal (EGF), fatores de crescimento derivados de plaquetas
(PDGF), interleucina 8, angiopoetinas 1 e 2, fatores de crescimento de
transformação alfa e beta (TGF-α e TGF-β) e fator de crescimento de fibroblasto
básico (bFGF) (Holash et al., 1999; Novak et al., 2003).
Na circulação, as células de carcinoma colorretal são expostas a estresse
hemodinâmico que atua como força de seleção. Pequena fração dessas células
sobrevive e tem o potencial de originar metástase. O primeiro passo para a
formação de metástase é a parada da célula tumoral no leito vascular (sanguíneo ou
linfático) (Liotta et al.,1984).
O remodelamento da matriz extracelular é um dos fatores que levam ao
desenvolvimento da metástase. Dentre as várias alterações que ocorrem na matriz
extracelular, um dos eventos importantes observados, é a quebra das cadeias de
heparam sulfato do PGHS presente na superfície celular e dos proteoglicanos
presentes na matriz extracelular, os quais participam da interação célula-célula e
célula-matriz extracelular (Yamada, 1991; Bernfield et al., 1999; Franco et al.,
2001; Scott, 2001).
Introdução
12
Fonte: Lodish et al, 2000.
FIGURA 4: EVENTOS NO PROCESSO DE METÁSTASE.
Este esquema ilustra como um tumor se espalha de
um órgão para outro. As células tumorais devem entrar na corrente sangüínea, passando pela parede do vaso
sangüíneo, como representado na figura, ou como ocorre na maioria dos casos, a célula tumoral atravessa a
parede do vaso linfático, caindo na circulação sangüínea posteriormente. Geralmente as células tumorais ficam
aderidas nos linfonodos, gerando as metástases nos linfonodos.
3 Marcadores Tumorais
Marcadores tumorais são elementos que apresentam a característica de variar
sua concentração em determinado meio, seja este sangue, urina ou tecidos, de
forma proporcional ao volume de determinada neoplasia existente no organismo.
Podem ser medidos quantitativamente na corrente sangüínea, efusões, tecidos, por
métodos bioquímicos, imunohistoquímica, reação de polimerase em cadeia (PCR),
hibridização “in situ” por fluorescência (FISH), entre outros.
Os marcadores tumorais podem ser enzimas, hormônios, metabólitos ou
antígenos de superfície de células tumorais, que aumentam ou diminuem sua
concentração na presença do tumor.
Células crescendo no
pitélio como tumor
benigno.
Lâmina
basal
Células rompem a lâmina basal
Invadem o capilar
Viajam pela corrente
sangüínea (menos de 1 em
1000 sobreviverão para
formar as metástases)
capilar
Aderem à parede do vaso
sangüíneo do órgão secundário.
Proliferação para gerar a
metástase no órgão secundário
Entram no tecido secundário
(extravasamento)
Introdução
13
A busca por marcadores tumorais tem por objetivo permitir controle do
diagnóstico precoce da doença, obter informações sobre o prognóstico e avaliação
da resposta à terapia e monitorização de recidivas (Pinho, 2000).
Para que esses objetivos sejam alcançados é necessário que o marcador
tumoral tenha elevada especificidade, de forma que seus níveis oscilem
proporcionalmente ao volume de tecido tumoral presente, sem interferência de
outras doenças ou variações de qualquer natureza. A Tabela III, demonstra os
marcadores mais utilizados na detecção de neoplasias.
TABELA III. PRINCIPAIS MARCADORES TUMORAIS E TECIDOS COMPROMETIDOS
Marcadores Tecidos
Antígeno Prostático Específico (PSA)
Fosfatase Ácida Prostática Próstata
CA 125 Ovário
Antígeno Carcinoembriônico
Colorretal
Alfa feto proteína Fígado, células germinativas.
Gonadotrofina coriônica humana (HCG) Placenta
CA 19-9 Pâncreas, estômago,
ducto biliar, colorretal
CA 15-3
CA 27-29 Mama
Dehidrogenase láctica Testículo, Sarcoma de Ewing, etc.
Fonte: Pinho, 2000. Marcadores Tumorais em Câncer Colorretal. Fundação Antônio Prudente. (com
modificações).
Além desses, novos marcadores moleculares podem ser determinados tanto no
sangue, como nos tecidos e podem auxiliar no diagnóstico e prognóstico desta
doença.
Entre as várias formas de avaliar estas alterações, a técnica de
imunohistoquímica tem vantagem de permitir que se observe a expressão da
Introdução
14
proteína e sua localização e, além disso, permite a realização de estudos
retrospectivos de tecidos armazenados em blocos de parafina.
4
Transformação neoplásica e modulação pela matriz extracelular
A matriz extracelular (MEC) que estruturalmente está dividida em membrana
basal (MB), matriz conjuntiva e matriz sangüínea caracteriza-se por ser uma
estrutura complexa formada por proteínas secretadas e glicoconjugados que
interagindo tridimensionalmente originam uma rede molecular capaz de regular as
funções celulares, como a diferenciação e a expressão de genes específicos para
cada tecido e o controle da divisão e migração celular. A MEC é fundamental não
apenas como suporte, como se definia há anos, mas é funcionalmente importante
para a manutenção de tecidos e órgãos (Vlodavsky et al., 1990; Yurchenco &
Schittny, 1990; Iozzo, 1998).
Fonte: Alberts et al., 2004.
FIGURA 5. ESQUEMA GERAL DA MATRIZ EXTRACELULAR E SEUS CONSTITUINTES, REPRESENTADA
ABAIXO DA CAMADA EPITELIAL
.
As interações entre as células e a MEC podem ser total ou parcialmente
alteradas nas neoplasias, o que pode influenciar a proliferação e a invasão tumoral
(Yurchenco & Schittny, 1990; Vlodavsky et al., 1999; Wielenga et al., 2000; Zhao
& Newman, 2001; Vlodavsky et al., 2002).
F
ib
r
a
E
l
‡
s
t
ic
Camada Epitelial
Membrana Basal
Macrófagos
Fibroblastos
Glicosaminoglicanos,
proteoglicanos e
glicoproteínas
Colágeno
Capilar
Fibra Elástica
Mastócito
Introdução
15
Duas propriedades adicionais das células cancerosas afetam suas inter-
relações. Primeiro, as células malignas aumentam a secreção de enzimas que agem
degradando a MEC facilitando a invasão de tais células a tecidos adjacentes
normais. Segundo, as células cancerosas secretam fatores de crescimento que
promovem a angiogênese, importante não somente no suporte do crescimento do
tumor, mas também para a metástase.
Durante a transição do carcinoma invasivo in situ, as células tumorais penetram
na MB e atravessam o estroma, ganhando acesso aos vasos linfáticos e sangüíneos
e então, disseminam-se. Há três passos bem caracterizados nas células tumorais
que estão envolvidos nessa cascata metastática: 1) Perda da interação célula-célula,
que é efetuada principalmente pelas integrinas, proteínas constituintes de
membranas citoplasmáticas que possuem receptores específicos os quais se ligam
aos componentes da MEC, como laminina e fibronectina (Vlodavsky et al., 1990;
Tu et al., 2001); 2) Degradação da MEC pelas células tumorais pela ativação de
metaloproteínases, colagenases, plasmina, catepsinas, glicosidases e heparanase
(Vlodavsky et al., 1999; Vlodavsky et al., 2000; Vlodavsky et al., 2002; Zcharia et
al., 2004), enzimas associadas com a invasão, cuja principal característica é a
desorganização e fragmentação dos elementos do estroma e da MB; 3) Síntese dos
componentes da MEC pelas células tumorais que se locomovem para outros órgãos
após terem migrado através dos vasos sangüíneos (Tryggrason et al., 1987; Tu et
al., 2001).
Apesar da perda de inibição e da proliferação por contato, as células tumorais
precisam passar a barreira representada pela MB que apresenta características
moleculares bastante conservadas, sendo constituídas por quatro moléculas
principais: a laminina, colágeno tipo IV, entactina, e proteoglicanos de heparam
Introdução
16
sulfato (Yurchenco et al., 1990; Kjellén & Lindahl, 1991; Erickson & Couchman,
2000). A Figura 6 demonstra a organização da MB.
Fonte: Alberts et al., 1999.
FIGURA 6. MEMBRANA BASAL E MOLÉCULAS CONSTITUINTES: LAMININA, COLÁGENO, ENTACTINA E
PERLECAM. (Perlecam: um tipo de PGHS).
4.1 Glicosaminoglicanos e proteoglicanos
Os Glicosaminoglicanos (GAGs) são polímeros lineares de açúcar constituídos
por unidades dissacarídicas repetitivas formadas alternadamente por uma
hexosamina (glucosamina ou galactosamina), unida através de uma ligação
glicosídica a um ácido urônico (β-glucurônico ou α-idurônico) ou a um açúcar neutro
(L-Galactose). Os GAGs apresentam grupos sulfato (com exceção do ácido
hialurônico), que juntamente com os grupos carboxilas dos ácidos urônicos, confere
uma alta densidade aniônica a estes polímeros.
Os GAGs diferem entre si quanto ao tipo de hexosamina e açúcar não-
nitrogenado, quanto ao grau de sulfatação e quanto à posição em que são
sulfatados, bem como quanto ao tipo de ligação glicosídica inter ou intra-
dissacarídica (Dietrich et al., 1977; Dietrich et al., 1978; Poole, 1987).
Os monossacarídeos que compõem os GAGs estão representados na Figura 7.
colágeno tipo IV
laminina
perlecan
entactina
Introdução
17
SO
3
-
5
4
3
2
1
O
CH
2
OH
A
cetil
SO
3
-
O
CH
2
OH
N
1
2
3
4
5
SO
3
-
6
O
COO
-
5
4
3
2
1
SO
3
-
5
4
3
2
1
A
cetil
O
CH
2
OH
N
1
2
3
4
O
COO
-
5
6
SO
3
-
5
4
3
2
1
Acetil
O
CH
2
OH
N
SO
3
-
β
ββ
β
-D-Galactose
Ácido
β
ββ
β
-D-Glucurônico
Ácido
α
αα
α
–L-Idurônico
α
αα
α
-D- Glucosamina
β
ββ
β
-D-N-Acetil
Glucosamina
β
ββ
β
-D-N-Acetil
Galactosamina
Açúcares Não Nitrogenados
Hexosaminas
FIGURA 7. MONOSSACARÍDEOS QUE COMPÕEM OS GLICOSAMINOGLICANOS E POSIÇÕES DE
SULFATAÇÃO.
Essa variedade resulta nos seguintes tipos de glicosaminoglicanos: ácido
hialurônico (AH), condroitim 4-sulfato (C4S), condroitim 6-sulfato (C6S), dermatam
sulfato (DS), heparina (HEP), heparam sulfato (HS) e queratam sulfato (QS),
representados na Figura 8.
Introdução
18
CONDROITIM
6 - SULFATO
DERMATAM
SULFATO
OH
NAc
O
COOH
OH
O
O
O
OH
CH
2
OH
OH
O
OH
O
COOH
NAc
OH
O
CH
2
OH
ÁCIDO
HIALURÔNICO
R
1
= AC, SO
3
H
HEPARAM
SULFATO
O
OH
OH
O
OH
O
O
NAc
OH
O
OH
O
OH
O
NAc
CH
2
O-R
CH
2
O-R
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
QUERATAM
SULFATO
R = H, SO
3
H
CONDROITIM
4 - SULFATO
R
2
= H, SO
3
H
COOH
O
OH
OH
O
O
O
OH
OH
NSO
3
H
O
COOH
OH
O
OSO
3
H
O
OH
O
OSO
3
H
O
COOH
OH
O
O
CH
2
OSO
3
H
NSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
NSO
3
H
HEPARINA
n
OH
O
COOH
OH
OH
O
O
OH
O
OH
O
COOH
OH
O
O
N -R
1
CH
2
O-R
2
N -R
1
CH
2
O-R
2
...
...
...
...
...
...
OH
O
COOH
OH
O
NAc
O
O
OH
O
COOH
OH
O
NAc
O
HO
3
SO
CH
2
OH
CH
2
OH
HO
3
SO
...
...
O
COOH
OH
OH
NAc
O
OH
O
O
OH
O
COOH
OH
O
NAc
OH
O
CH
2
OSO
3
H
CH
2
OSO
3
H
...
...
OH NAc
OH
NAc
O
COOH
OH
O
O
O
CH
2
OH
HO
3
SO
O
COOH
OHO
O
HO
3
SO
CH
2
OH
... ...
Fonte: Dietrich et al., 1984.
FIGURA 8 - UNIDADE ESTRUTURAL DOS GLICOSAMINOGLICANOS.
A D-glucosamina é a hexosamina
constituinte da heparina, heparam sulfato, queratam sulfato e ácido hialurônico e a D-galactosamina está
presente em condroitim 4 e 6-sulfato e dermatam sulfato. O açúcar não nitrogenado é um ácido urônico β-D-
glucurônico ou α-L-idurônico), exceto no queratam sulfato que apresenta D-galactose. As posições dos
grupamentos sulfatos podem ser em C-2 e C-6 na hexosamina e C-2 no ácido urônico. A hexosamina está unida
ao ácido urônico por ligação α em heparina e heparam sulfato e β nos demais compostos
Com exceção do ácido hialurônico, esses polissacarídeos encontram-se ligados
covalentemente a um esqueleto protéico formando macromoléculas denominadas
Introdução
19
proteoglicanos (PG) constituintes da superfície celular, da MEC, da MB, bem como
de grânulos citoplasmáticos (Dietrich et al., 1984; Nader & Dietrich, 1989).
Os PG são proteínas que apresentam cadeias lineares de GAGs possuem uma
alta massa molecular e estão presentes em todos os tecidos e espécies do reino
animal, desempenhando diversas funções (Dietrich et al., 1977; Dietrich et al.,
1993; Porcionatto et al., 1994; Nader et al., 1996; Bernfield et al., 1999; Nader et
al., 1999; Porcionatto et al., 1999; Medeiros et al., 2000).
Há indícios que essas macromoléculas possam atuar como conectoras entre os
ambientes intra e extracelulares estando relacionadas com a transdução de sinais
biológicos. Outras funções relacionadas a estas macromoléculas são cicatrização,
divisão e crescimento celular e imunidade (Iozzo et al., 2001).
4.1.1 Proteoglicano de heparam sulfato e progressão tumoral
O PGHS constitui a maior classe de proteoglicanos encontrados na matriz
extracelular, membrana basal e na superfície celular associado com a membrana
plasmática. São macromoléculas formadas por um esqueleto protéico ao qual estão
covalentemente ligados cadeia(s) de glicosaminoglicanos (heparam sulfato)
(Gallagher et al., 1989; David, 1993).
O processo de síntese do PGHS ocorre no lúmem do retículo endoplasmático
rugoso e aparelho de Golgi. A cadeia inicial de heparam sulfato é construída pela
ação alternada de diferentes glicosiltransferases que adicionam resíduos de ácidos
glucurônicos (GlcA) e N-acetil-lucosamina (GlcNAc). Para o polímero composto de
unidades alternadas de GlcA e GlcNAc assumir a estrutura completa de heparam
sulfato, a primeira modificação envolve a N-desacetilação dos resíduos de GlcNAc e
subseqüente transferência de sulfato do 3’-fosfoadenosina 5’-fosfosulfato ao amino
grupo da mesma glucosamina, pela ação da enzima N-acetil-glucosaminil-N-
Introdução
20
desacetilase/N-sulfotransferase (NDST), processo que ocorre no lúmem do aparelho
de Golgi (Toma et al., 1998; Aikawa & Esko, 1999). A ação enzimática da NDST
pré-determina a estrutura final da cadeia de heparam sulfato, como a etapa de
modificação remanescente (epimerização e O-sulfatação de sítios selecionados)
limitada pela posição dos resíduos sulfatados (Pikas et al., 2000). A biossíntese do
PGHS está representada na Figura 9.
FIGURA 9. ESQUEMA DE BIOSSÍNTESE DO PGHS
.
O entendimento da atividade biológica dos PGHS baseia-se essencialmente na
diversidade estrutural de suas cadeias sacarídicas (Bernfield et al., 1999).
Assim, a determinação da seqüência das unidades dissacarídicas do heparam
sulfato em tecidos embrionários, adultos, normais e neoplásicos de diferentes
patologias, bem como de células normais e células mantidas em cultura fornecem
informação sobre a atividade biológica desses compostos (Dietrich et al., 1977;
Dietrich & Armelin, 1978; Dietrich et al., 1993; Pinhal et aI., 1994; Porcionatto et
aI., 1999).
Introdução
21
Portanto, na grande maioria das vezes, são as cadeias de heparam sulfato que
determinam o papel biológico dessa classe de macromoléculas, agindo no controle
de mecanismos fisiológicos normais e patológicos, tais como morfogênese, reparo de
tecidos, inflamação, vascularização, proliferação celular e metástases tumorais
(Sanderson, 2001). Porém, deve-se salientar que existem casos em que o esqueleto
protéico do proteoglicano também possui papel importante (Bernfield et al., 1999).
A penetração de células tumorais através da membrana basal, dos vasos
sangüíneos e dos vasos linfáticos é um passo crucial no processo de metástases.
(Kosir et al., 1999). Dentre as várias alterações que ocorrem na superfície da célula
e na matriz extracelular, um dos eventos importantes observados é a quebra das
cadeias de heparam sulfato do PGHS presente na superfície celular e daqueles
presentes na MEC, os quais participam da interação célula-célula, célula-MEC
(Bernfield et al., 1999; Franco et al., 2001).
Os PGHS podem potencializar a interação de fatores de crescimento solúveis
com seus receptores de superfície celular, como tem sido mostrado para o receptor
de fator de crescimento de fibroblasto básico, FGF-2 (Gambarini et al., 1993;
Zcharia et al., 2004). Tal atividade pode estar relacionada com a modulação da
ligação entre o fator de crescimento e o seu receptor ou proteger as proteínas da
quebra proteolítica deste fator, ou ambos.
Trabalhos da literatura demonstram que em célula tumorais em cultura ocorre um
aumento da expressão do PGHS presente na fração celular e secretado para o meio
de cultura (Lopes, 2004). Outros trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório
demonstraram a importância do heparam sulfato presente na superfície celular para o
reconhecimento e o controle da divisão celular e ciclo celular (Dietrich & Armelin,
1978; Porcionatto et aI., 1999).
Introdução
22
As cadeias de HS podem estar ligadas a diferentes esqueletos protéicos,
pertencentes às famílias do glipicam (ancorados por glicosil-fosfatidil-inositol),
perlecam (PGHS de membrana basal) e sindecam (presentes na superfície celular
ancorados através de uma porção transmembrânica hidrofóbica) (Kjellén &
Lindahl, 1991; Salmivirta & Jalkanen, 1995; Esko & Lindahl, 2001). A Figura 10
representa de forma esquemática a distribuição dos diferentes tipos de PGHS. Estes
compostos estão presentes na matriz extracelular, bem como na superfície das
células. Na matriz extracelular tem sido identificado como perlecam, colágeno XVIII e
agrim (não ilustrado na Figura). Na superfície celular, encontram-se as famílias dos
sindecans e dos glipicans.
Fonte: Iozzo & San Antonio, 2001.
FIGURA 10 – LOCALIZAÇÃO DE PROTEOGLICANOS DE HEPARAM SULFATO. As cadeias sacarídicas de
heparam sulfato estão representadas em esferas cor de rosa
Introdução
23
4.1.1.1 Sindecam
Algumas famílias de PGHS associadas a superfície celular já foram
reconhecidas como relatado anteriormente. Os PGHS presentes na superfície
celular, através de uma porção transmembrânica hidrofóbica do esqueleto protéico,
pertencem à família dos sindecans (Esko & Lindahl, 2001).
Fonte: Rosenberg et al.,1997 - http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/PGA02E.html
FIGURA 11. FAMÍLIA DOS SINDECANS. MEC= Matriz extracelular; GAG= Glicosaminoglicanos; PGHS=
Proteoglicano de Heparam Sulfato; PM= Peso molecular; kD= Kilodalton
O sindecam está envolvido em várias funções na superfície de células epiteliais
como adesão, organização do citoesqueleto, migração e proliferação celular.
Estudos demonstram que células tumorais estão menos aderidas e mais migratórias
que as células normais. Provavelmente, o sindecam também influencia na adesão à
matriz extracelular, na morfologia celular e na atividade tumorigênica de células
neoplásicas (Park et al., 2002).
O sindecam é expresso em diversos tecidos (Burbach, 2003). A família do
sindecam é dividida em 4 grupos: o sindecam-1, ou simplesmente sindecam, está
envolvido com o catabolismo da lipase lipoprotéica, ele é expresso
preferencialmente na superfície basolateral das células epiteliais (Rapraeger et al.,
HSPG:
Sindecam-1 Sindecam-2 Sindecam-3 Sindecam-4 Glipicam-1 Glipicam-2 Glipicam-3 Glipicam-4 Glipicam-5
(Sindecam) (Fibroglicam) (N-Sindecam) (Ruidocam) (Glipicam) ( Cerebroglicam) ( OCI-5) (K-Glipicam) (G CP5)
PM:
Mem brana
MEC
HSPG:
Sindecam-1 Sindecam-2 Sindecam-3 Sindecam-4 Glipicam-1 Glipicam-2 Glipicam-3 Glipicam-4 Glipicam-5
(Sindecam) (Fibroglicam) (N-Sindecam) (Ruidocam) (Glipicam) ( Cerebroglicam) ( OCI-5) (K-Glipicam) (G CP5)
PM:
Mem brana
MEC
Introdução
24
1993); o sindecam-2, ou fibroglicam, é expresso em coração, cérebro, rim, fígado e
baço além de hepatócitos e fibroblastos em cultura; o sindecam-3, também
denominado N-sindecam, está presente no coração, endotélio e musculatura lisa
vascular, epitélio estratificado, cartilagem e tecido neural e o sindecam-4, ou
riudocam, presente em fibroblastos, adipócitos, endotélio e musculatura lisa vascular
e em hepatócitos em cultura, o sindecam-4 mantém o fator de crescimento FGF-2
(fator de crescimento básico de fibroblastos) ligado ao seu receptor específico,
aumentando assim a resposta mediada por este fator e ativando a proliferação
celular.
Em queratinócitos humanos e células do colo uterino, em melanoma induzido
quimicamente em ratos a expressão de sindecam-1 aparece sendo suprimida pela
transformação maligna e perda da diferenciação celular (Inki & Jalkanen, 1996).
Estudos correlacionam uma diminuição na expressão de sindecam-1, sindecam-
3 e sindecam-4 em câncer colorretal. Em contraste, existe um aumento na
expressão de sindecam-2, comparando-se células tumorais com células normais,
evidenciando que as moléculas de sindecam-2 parecem mediar a adesão e
proliferação de células de carcinoma (Park et al., 2002).
5 Degradação de PGHS
As cadeias de heparam sulfato do PGHS podem ser degradadas por ação de
endoglicosidases e exoglicosidases que promovem, respectivamente, a quebra de
ligações glicosídicas a partir da extremidade não redutora da cadeia ou quebras de
ligações glicosídicas intracadeia, sendo que cada enzima possui sua especificidade.
Normalmente, os proteoglicanos são endocitados, inicialmente sofrem a ação de
proteases em endossomos primários, e nos lisossomos sofrem ação das exo e
endoglicosidases. A Figura 12 representa a degradação de um proteoglicano.
Introdução
25
Exoenzimas
e endoenzimas
Exoenzimas
e endoenzimas
Lisossomo
Endossomo
PG parcialmente
degradado
A
PROTEASE
Terminal não
redutor
ENDOGLICOSIDASE
Terminal não
redutor
EXOGLICOSIDASE (URONIDASE)
+
EXOGLICOSIDASE (SULFATASE)
+
EXOGLICOSIDASE
(N-AC HEXOSAMINIDASE))
+
B
- AU
- HEX
FIGURA 12: ESQUEMA DE DEGRADAÇÃO DE PROTEOGLICANOS
.
A: representação dos locais onde ocorre
o processamento dos proteoglicanos 1: ação de proteases onde ocorre a liberação de proteoglicanos
parcialmente degradados e 2: lisossomo. B: representação das etapas gerais de clivagem dos proteoglicanos
dentro dos lisossomos.
Ainda, ocorre a degradação das cadeias de heparam sulfato por ação de uma
endoglicosidase denominada heparanase na matriz extracelular e superfície celular
(Vlodavsky et al. 1999). Maiores detalhes sobre essa enzima, tais como sua
especificidade e função biológica, serão discutidos a seguir. A Figura 13 apresenta o
principal dissacarídeo do Heparam Sulfato.
FIGURA 13: DISSACARÍDEO DE HEPARAM SULFATO
Heparam Sulfato
Ácido Glucurônico e/ou
Idurônico
N-acetil ou N-sulfo-D-
glucosamina
Introdução
26
É importante ressaltar que a ação da heparanase sobre as cadeias de HS do
PGHS da matriz extracelular ou da superfície celular geram oligossacarídeos que
podem apresentar atividades biológicas muito importantes, como, por exemplo, foi
demonstrado que tais oligossacarídeos apresentam maior afinidade por fatores de
crescimento e fatores angiogênicos presentes no meio extracelular, facilitando assim
a apresentação de tais fatores a receptores específicos na superfície celular,
desencadeando assim proliferação celular, diferenciação celular e angiogênese com
maior intensidade, quando comparado com a atividade normalmente desempenhada
pelas cadeias de heparam sulfato intactas presentes no proteoglicano (Vlodavsky &
Friedmann, 2001). A Figura 14 demonstra a especificidade da enzima heparanase
durante a degradação das cadeias de heparam sulfato.
Fonte: Dempsey et al. 2000
FIGURA 14. ESPECIFICIDADE DA ENZIMA HEPARANASE SOBRE A CADEIA DE HEPARAM SULFATO.
R= radical, pode ser um grupo acetil (H
3
C-C=O
-
) ou sulfato (SO
3
-
). Radical sulfato importante para a ação da
heparanase.
Introdução
27
6 Heparanase
A heparanase é uma endo-beta-glucuronidase que quebra ligações glicosídicas
intrassacarídicas do heparam sulfato entre a hexosamina (glucosamina-N-acetilada)
e o ácido glucurônico (Klein & Von, 1976; Freeman & Parish, 1997; Freeman &
Parish, 1998; Toyoshima & Nakajima, 1999; Dempsey et al., 2000; Vlodavsky el
al., 2002).
O gene da heparanase (isoforma denominada heparanase 1, HPA1) é formado
por 40 Kb (40.000 pares de bases), composto por 12 exons e 11 introns, localizados
no cromossomo 4 humano (4q21,3) (Baker et al., 1999; Vlodavsky et al., 1999;
Kussie et al., 1999). O gene da heparanase codifica para uma seqüência de 1629
pares de bases que corresponde a uma proteína de 543 resíduos de aminoácidos
(61,2 kDa). Entretanto, a proteína madura, isolada de cultura de células e tecidos
apresenta 50 kDa, sugerindo um processamento na porção N-terminal. Há ainda
evidências de que um peptídeo de 8,2 kDa resultante da clivagem proteolítica que
ocorre durante o processamento pós-transcripcional seja importante para a formação
de um heterodímero com a porção 50 kDa para que a heparanase apresente-se
totalmente ativa, porém, tal evidência ainda não é totalmente comprovada
(Vlodavsky et al., 2002). Existem seis sítios possíveis de N-glicosilação, os quais
encontram-se essencialmente agrupados na região dos primeiros 80 resíduos de
aminoácidos da região de 50 kDa. É importante ser observado que a remoção da N-
glicosilação da heparanase não reduz sua atividade enzimática (Dong et al., 2000;
Mckenzie et al., 2000; Simizu et al., 2004). A Figura 15 apresenta uma
representação esquemática do gene da heparanase 1.
Introdução
28
Fonte: Friedmann et al., 2000
FIGURA 15. REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO GENE COMPLETO DA HEPARANASE-1
CROMOSSOMO 4Q21,3
.
A primeira linha do esquema acima representa o gene da heparanase de
aproximadamente 40 Kb. Em seguida temos a representação da forma da pré-pró-enzima, contendo o peptídeo
sinal na porção amino terminal, o própeptídeo de 8 kDa e o segmento ativo da enzima de 50 kDa com seus
respectivos sítios de glicosilação. Abaixo temos a representação da heparanase após o processamento pós-
transcripcional
Recentemente foi reportado a clonagem de um segundo cDNA que codifica para
uma nova heparanase, designada heparanase 2 humana (HPA2), com alta
homologia com a heparanase já clonada e identificada HPA1. Foi observado
também que existe três formas de “splicing alternativo” que transcrevem três
diferentes RNA mensageiros que codificam proteínas de 480, 534 e 592 resíduos de
aminoácidos. As análises dessas proteínas evidenciam que todas são proteínas
intracelulares, associadas à membrana. Estudos comparativos demonstraram que
enquanto a heparanase-1 apresenta-se altamente expressa em linfonodos e
placenta de tecidos normais, e pouco expressa em outros tecidos normais, a HPA2
encontra-se altamente expressa em cérebro, glândula mamária, próstata, intestino
delgado, testículo e útero e pouco foi observada em outros tecidos normais,
Gene da Heparanase: cromossomo 4q21.3
Tamanho do gene: ~40kb
Proteína Heparanase
P
re
-
pro heparanase
50kDa
Heparanase
Peptídio Sinal
Pró-peptídeo
Região Transmembrânica
Sítios de Glicosilação
Possíveis sítios de
atividade: resíduos Glu
225
e Glu 343.
Gln
36
8 kDa
Glu
109
Lys
158
Pro
515
Ile
534
Ile
543
Met
1
Ala
35
Glu
157
Introdução
29
incluindo placenta e linfonodos. Outra diferença interessante entre as heparanases
HPA1 e HPA2 é o fato de que a HPA2 não apresenta a seqüência de peptídeo sinal.
Portanto, parece haver duas isoformas de heparanases, sendo que tais enzimas
apresentam distribuição diferente e possivelmente localização intracelular também
diferente, porém maiores estudos precisam ser realizados para caracterizar tais
enzimas.
A HPA1 encontra-se expressa em uma variedade de tecidos benignos e
malignos. É encontrado em células endoteliais, queratinócitos, plaquetas,
mastócitos, neutrófilos, macrófagos, linfócitos T e B, linfomas, melanoma e
carcinomas (Vlodasky et al., 2002).
Dados da literatura, por imunohistoquímica, descrevem a presença da HPA1 na
superfície celular e no citoplasma em adenocarcinoma colorretal humano e
esofágico (Friedmann et al., 2000; Tang et al., 2002; Waterman et al., 2004). Nas
células epiteliais de tumores malignos de mama a HPA1 apresenta localização
citoplasmática. Uma marcação bastante intensa é encontrada no local do tumor e
em tecidos que se encontram invadindo tecidos sadios a partir de ductos mamários,
bem como em glândulas lobulares onde originou-se o tumor primário (Zcharia et al.,
2001; Zetser et al., 2004).
Dados ainda não publicados, mas citados na literatura (Zcharia et al., 2001),
descrevem que na urina e no soro de pacientes com câncer de mama a atividade da
HPA1 encontra-se aumentada, entretanto, estudos estão sendo realizados para
desenvolver uma metodologia que possa com maior precisão quantificar a atividade
da HPA1 em soro e na urina de pacientes com câncer através da técnica de ELISA.
A Tabela IV apresenta uma comparação entre a HPA1 e HPA2.
Introdução
30
TABELA IV: COMPARAÇÃO ENTRE AS HEPARANASE 1 E 2.
O mecanismo pelo qual a HPA1 está envolvida com o câncer envolve a
formação dos oligossacarídeos com atividade biológica resultantes da degradação
das cadeias de heparam sulfato que estão envolvidos com a intensificação
proliferação celular, angiogênese e diferenciação celular (Gingis-Velitski et al.,
2004).
A Figura 16 representa o mecanismo de ação da HPA1.
Propriedades Heparanase 1 Heparanase 2
Substrato Heparam sulfato Desconhecido.
Distribuição Celular
Intracelular, granular pode estar
ligado a membrana; como é
liberado não é conhecido
Intracelular, ligado a
membrana.
Ativação
Sintetizado com uma pro-enzima. A
proteína ativa é heterodímera, ou
seja, necessita de 2 subunidades
(8 e 50Kda) para ser ativa.
Desconhecido.
Tecidos que
expressam heparanase
(fisiológico)
Plaquetas, linfócitos T (ativados),
macrófagos, monócitos, neutrófilos,
células endoteliais, células
musculares lisas, neurônios, baço,
nódulos linfáticos, timo, medula
óssea, placenta.
Cérebro, próstata,
intestino, testículos e
útero.
Tumores que
expressam heparanase
Próstata, pulmão, mama, pâncreas,
fígado, ovário, cólon, linhagens de
células tumorais metastáticas.
Pâncreas.
Papel fisiológico
Reparo tecidual, recirculação do
linfócito, defesa imunológica,
proliferação celular.
Desconhecido.
Papel Fisiopatológico
Doenças autoimunes e
inflamatórias, crescimento tumoral e
metástase.
Desconhecido.
Introdução
31
Fonte:Friedmann et al. 2000
FIGURA 16. MECANISMO DE AÇÃO DA HEPARANASE1
.
As setas indicam o sítio de clivagem da
heparanase1 sobre as cadeias de heparam sulfato dos PGHS da matriz extracelular, liberando oligossacarídeos
que seqüestram moléculas tornando-as biologicamente ativas como fatores angiogênicos, fatores de
crescimento, moléculas de adesão e lipoproteínas.
6.1 Heparanase 1 e proteoglicanos de heparam sulfato
A HPA1 está envolvida com a degradação das cadeias de heparam sulfato dos
PGHS, essencialmente presentes na superfície celular (sindecam) e na matriz
extracelular, como membrana basal (perlecam) (Cohen et al., 1994). Como já
discutido, os níveis elevados de expressão da HPA1 em células de mamíferos,
parecem estar relacionados com o desenvolvimento de tumores e metástases
(Hullet et al., 1999; Vlodavsky et al., 2000).
Especificamente o sindecam-1 (syn-1), encontra-se presente na superfície de
todas as células epiteliais de mamíferos e sua relação com o desenvolvimento de
tumor parece depender de sua degradação por ação da HPA1 (Reiland et al.,
2004).
Foi demonstrado que a HPA1 degrada o HS do syn-1 presente na superfície de
células metastáticas de melanoma (Reiland et al., 2004) e que embora syn-1 inibe
Perleca
m
Molécula de
adesão celular
Citocina
Fatores
angiogênicos e
anti-angiogênicos
Fatores de
coagulação
Fatores de
crescimento
Clivagem pela Heparanase
Enzima
s
Morfogênese
Lipoproteína
s
Fatores de
remodelamento
tecidual
Clivagem pela
Heparanase
Clivagem pela
Heparanase
MEC
Introdução
32
a invasão de células de melanoma em ensaios "in vitro", a atividade da HPA1 não
foi inibida em presença desse PG. Porém, nesses mesmos ensaios foi demonstrado
que a invasão de células de melanoma dependente de HPA1, foi revertida em
presença de syn-1.
Todos esses resultados comprovaram que a expressão de syn-1 na superfície
de células de melanoma e sua degradação pela HPA1 são determinantes para o
controle da invasão de células tumorais e que o syn-1 pode regular a atividade
enzimática da HPA1 (Reiland et al., 2004).
Um outro PGHS constituinte de membrana basal importante é o perlecam. Há
evidências de que existe um aumento expressivo de perlecam em diversos tipos de
tumores e que esta super-expressão ocorre anteriormente à produção de HPA1,
que também degrada as cadeias de heparam sulfato deste proteoglicano (Cohen et
al., 1994; Whitelock et al., 1996).
Foi demonstrado na literatura que a diminuição na expressão de perlecam
impede a invasão de células neoplásicas "in vitro" e inibe o crescimento do tumor e
angiogênese "in vivo" (Reiland et al., 2004).
Portanto, é bastante evidente a correlação entre a expressão de PGHS, a
expressão da heparanase e desenvolvimento de tumores.
6.2 Heparanase e relação com tumor e metástase.
Como já discutido, a HPA1 promove a degradação de cadeias de heparam
sulfato dos PGHS que são componentes da superfície celular, da matriz extracelular
e da membrana basal. Acredita-se que o papel biológico dessa enzima "in vivo"
possa ser: 1) facilitar a invasão de células tumorais e metástases através da
degradação da membrana basal vascular e MEC pela HPA1 sintetizada pelas
Introdução
33
células tumorais (Staquicini
et aI., 2003); 2) liberar e ativar fatores de crescimento.
Foi demonstrado que a HPA1 promove a formação de fragmentos de heparam
sulfato capazes de se ligarem com maior afinidade ao FGF-2 (fator de crescimento
básico de fibroblastos) (Vlodavsky et al., 1990; Maxhimer et al., 2002; Maxhimer
et al., 2005). Tais fragmentos de heparam sulfato são também capazes de promover
a invasão de células endoteliais, ou seja, angiogênese (Vlodavsky & Friedmann,
2001; Vlodavsky et al., 2002); 3) os oligossacarídeos gerados por ação da HPA1
são capazes de ativarem fatores angiogênicos (Vlodavsky & Friedmann, 2001;
Vlodavsky et al., 2002).
Portanto, a HPA1 é uma enzima que apresenta um papel importante na
invasão tumoral e no desenvolvimento do tumor (Hullet et al., 1999; Vlodavsky &
Friedmann, 2001; Vlodavsky et al., 2002; Goldshmidt et al., 2003; Watanabe et
al., 2003; Byod & Nakajima, 2004; Edovitsky et al., 2004).
A degradação das cadeias de heparam sulfato pela HPA1 pode desorganizar a
membrana basal e favorecer a migração de células tumorais através do endotélio
vascular e também facilitar o extravasamento de leucócitos. Portanto, a ação da
HPA1 também está relacionada com a inflamação (Nurcombe et al., 2000).
A Figura 17 apresenta a ação da HPA1 produzida por células tumorais.
Introdução
34
Fonte: Simizu et al.,2004.
FIGURA 17: AÇÃO DA HEPARANASE 1.
A - Heparanase produzida pelas células tumorais. A heparanase
secretada pode hidrolisar cadeias de HS e/ou ativar moléculas que estejam ligadas ao HS, como o FGF. B -
Estrutura do HS. C - Heparanase é uma endo-β-glucuronidase que produz oligossacarídeos de HS contendo
ácido glucurônico no N-terminal redutor (seta vermelha). Regiões altamente sulfatadas são importantes para o
reconhecimento da enzima. Nos círculos amarelos estão representados grupos que precisam ser reconhecidos
para que a heparanase clive o HS. HS: heparam sulfato FGF: fator de crescimento de fibroblastos.
A enzima HPA1 tem sido identificada, também, em plaquetas e neutrófilos e
apresenta sua atividade aumentada na forma de grânulos (Haimov-Kochman et al.,
2002).
Alguns estudos fisiopatológicos mostram como a HPA1 pode contribuir para as
metástases tumorais e inflamações, mas pouco se sabe como essa enzima age nas
células normais e nas funções dos tecidos (Nurcombe et al., 2000; Maxhimer et al.,
2002). Essa enzima deve mesmo ser essencial para a implantação embrionária,
onde sua expressão é maior em estágios de invasão (Irimura et al., 1986; Hullet et
al., 1999; Zhang et al., 2003).
Fator de crescimento
Ligaçã
o
Heparam Sulfato
Heparam Sulfato
Degradado pela
Heparanase
Esquel.
protéico
Ácidos
Urônicos
Glucosa
mina
Introdução
35
A função da HPA1 no indivíduo adulto pode ser: reparo de feridas (cicatrização),
regeneração de tecidos e imunidade, e seguramente será esclarecida pela
apresentação de fenótipos pelos animais que possuem a expressão desta enzima
alterada (Elkin et al., 2001; Zcharia et al., 2004).
Estudos realizados com câncer de mama demonstraram que existe uma
correlação direta da expressão da HPA1 com metástases, com o estadio do tumor e
com o tamanho do tumor, essencialmente tumores maiores que 1 cm (Maxhimer et
al., 2002), lembrando que o potencial metastático do carcinoma de mama esta
intensamente relacionado com o tamanho do tumor. Por outro lado, Koliopanos e
colaboradores não identificaram correlação entre expressão da HPA1 e o estadio de
adencarcinoma pancreático (Koliopanos et al., 2001).
Dados do nosso laboratório estudando carcinóides pulmonares e HPA2
demonstraram uma correlação direta da expressão da HPA2 com o tamanho do
tumor, entretanto, não foi observada uma correlação entre a expressão da HPA2
com metástases ou estadio da doença.
Diante dos dados descritos até o momento pode-se dizer que a HPA1 é uma
enzima que pode servir não apenas como um marcador tumoral, mas também como
um marcador de prognóstico de metástases tumorais para determinados tipos de
tumores, já a isoforma HPA2 precisa ainda ser muito investigada (Goldshmidt et al.,
2003; Zhen-Zhen et al., 2004).
A enzima heparanase merece estudos mais detalhados tanto para auxiliar no
diagnóstico do câncer, como para ajudar na terapêutica, através da criação de
possíveis drogas anti-heparanase (Hulett et al., 1999; Zcharia et al., 2001;
Vlodavsky et al., 2002; Byod & Nakajima, 2004; Simizu et al., 2004).
Objetivos
Objetivos
36
Objetivos
Os objetivos do presente estudo são:
-Quantificar a expressão da enzima heparanase-2 (isoforma HPA2), que será
denominada heparanase, e do sindecam-1, em tecido de indivíduos com carcinoma
colorretal e não acometidos pela doença (controle), por quantificação digital da
técnica imunohistoquímica;
-Avaliar os índices de expressão tecidual da heparanase e de sindecam-1
comparando indivíduos sem neoplasia com os acometidos por carcinoma colorretal;
-Determinar a especificidade e sensibilidade dos índices imunohistoquímicos de
expressão de heparanase e sindecam-1, avaliando-os como possíveis marcadores
tumorais;
-Correlacionar a expressão da enzima heparanase com a de sindecam-1;
-Avaliar a relação dos índices imunohistoquímicos com variáveis clínicas e
patológicas de indivívuos com carcinoma colorretal;
Material e Método
Material e Método
37
Material e Método
1 Casuística
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Universidade Federal de São Paulo PROCESSO NÚMERO: 0311/05. Esse estudo
foi realizado de acordo com os padrões éticos aceitos pela Declaração de Helsinki
da Associação Médica Mundial, adotado em 1964 e emendado em 1996.
Trata-se de um estudo transversal onde foram analisados 50 doentes com
carcinoma colorretal, operados com intenção curativa, entre junho de 2002 e julho
de 2005. Trinta e um (62%) eram homens e dezenove (38%) mulheres. A média de
idade foi de 63 anos (mínima 31 e máxima 86 anos). As amostras de tecidos
tumorais foram obtidas do Laboratório de Patologia Cirúrgica Ferdinando Costa, São
Paulo, SP, Brasil. O grupo controle consistiu de 20 indivíduos não portadores de
câncer colorretal que forneceram amostras de tecidos não neoplásicos obtidas após
realização de biópsias por colonoscopia realizada no Hospital Estadual “Mario
Covas”, Santo André, SP, Brasil.
As informações clínicas e morfológicas dos pacientes com carcinoma colorretal
foram obtidas por consultas em prontuários hospitalares ou por entrevista com os
doentes ou familiares nos retornos ambulatoriais.
O termo curativo foi utilizado para designar ausência de doença residual
neoplásica macroscópica ao final da operação, constatada pelo estadiamento pré-
operatório e pela avaliação intra-operatória do cirurgião, além da presença de
margens cirúrgicas livres no laudo do exame anatomopatológico da peça operatória
extirpada.
Foram considerados critérios de inclusão: presença de carcinoma do intestino
grosso (confirmada pelo estudo histopatológico da lesão extirpada com intenção
Material e Método
38
curativa); obtenção de margens cirúrgicas livres; ausência de carcinomatose no
inventário da cavidade abdominal realizado durante a extirpação da lesão neoplásica
e ausência de doença neoplásica extra-hepática inextirpável.
Foram considerados critérios de exclusão: presença de lesões metastáticas
inextirpáveis; disseminação peritoneal e/ou a extirpação incompleta do carcinoma
colorretal; presença de neoplasia sincrônica ou metacrônica; histórico de operações
paliativas ou co-morbidades que tornavam o risco operatório proibitivo.
Todos os doentes tiveram seu diagnóstico histológico de carcinoma colorretal
confirmado pela revisão das lâminas coradas pelo método da hematoxilina-eosina
(HE) e analisadas por patologista. Quando necessário, cortes adicionais dos blocos
de parafina foram realizados.
O estadiamento clínico pré-operatório consistiu no exame clínico e proctológico,
colonoscopia, determinação do nível sérico do CEA, ultra-sonografia abdominal,
tomografia computadorizada do abdomem e pelve e radiografias torácicas em
incidência póstero-anterior e perfil.
A classificação das neoplasias colorretais primárias foi realizada pelo
estadiamento de Dukes modificado e pela classificação TNM da União Internacional
de Combate ao Câncer.
Em relação ao estadiamento de Dukes, foi considerado como Dukes A, as
neoplasias confinadas à mucosa; como Dukes B, as que se estendiam por toda a
parede, atingindo inclusive o tecido adiposo adventício, como Dukes C, aquelas com
comprometimento de linfonodos, independentemente da profundidade da invasão
parietal e, como Dukes D, a presença de metástases hepáticas na apresentação
clínica ou no achado no inventário da cavidade abdominal durante a extirpação do
carcinoma colorretal primário.
Material e Método
39
No tocante a classificação TNM, foi considerado como T1 quando o tumor
invadia a submucosa; T2 quando invadia a muscular própria; T3 quando invadia até
subserosa ou os tecidos pericólicos ou perirretais e T4 quando o tumor perfurava o
peritônio visceral ou invadia outros órgãos ou estruturas. Considera-se N0, a
ausência de metástase em linfonodos regionais; N1, a presença de metástase em
um a três linfonodos pericólicos ou perirretais; N2, a presença de metástase em
quatro ou mais linfonodos pericólicos ou perirretais e N3, a presença de metástase
em qualquer linfonodo ao longo de um dos troncos vasculares conhecidos. Os
doentes foram classificados com M0 na ausência de metástases à distância e M1 na
presença de metástases à distância.
Em relação ao estadiamento pela classificação TNM, foi considerado estádio I a
associação de T1N0M0 ou T2N0M0; estádio II, a associação de T3N0M0 ou
T4N0MO; estádio III, a associação T1 a T4N1M0 ou T1 a T4N2M0 ou T1a T4N3M0
e estádio IV, a associação de T1 a T4, N0 a N3 e M1. Foram considerados como
estadiamento inicial os estádios I e II e considerados como estadiamento tardio os
estádios III e IV.
No tocante às variáveis biodemográficas foram estudados o sexo e a idade. Em
relação ao carcinoma colorretal primário foram estudadas as seguintes variáveis:
localização da lesão no intestino grosso (colo direito, colo esquerdo ou reto),
tamanho do tumor, tipo histológico (adenocarcinoma, carcinoma mucinoso ou
carcinoma mucossecretor), grau de diferenciação celular (bem diferenciado ou
moderadamente diferenciado), aspecto macroscópico (úlcero-infiltrativo, ulcerado,
úlcero-vegeto-infiltrativo, vegetante, úlcero-vegetante ou végeto-infiltrativo), invasão
angiolinfática (presente ou ausente), invasão perineural (presente ou ausente),
invasão da serosa (sim ou não), metástase linfonodal (presente ou ausente), além
Material e Método
40
do estadiamento inicial ou tardio.
Posteriormente, algumas variáveis tiveram suas categorias reagrupadas, devido
ao número reduzido de pacientes em cada categoria, a fim de possibilitar a
realização da análise estatística. Foram elas: localização da lesão (colo ou reto), tipo
histológico (adenocarcinoma ou outros), aspecto macroscópico (ulcerado, vegetante
ou infiltrativo).
2 Material
2.1 Amostras de Tecidos
As amostras de tecidos tumorais humanos foram obtidas do Laboratório de
Patologia Cirúrgica Ferdinando Costa, São Paulo, SP, Brasil, após ressecção
cirúrgica e análise anátomo patológica, totalizando 50 espécimes.
O controle histológico foi realizado a partir de tecidos colorretais humanos não
comprometidos pela neoplasia obtidos do Hospital Municipal Mario Covas, Santo
André, SP, Brasil, de biópsias pós exame colonoscópico de 20 indivíduos.
Para a realização do estudo imunohistoquímico, todos os tecidos foram
previamente fixados em formalina (formaldeído 10%) por tempo determinado de
acordo com o tamanho da biópsia (8mm/h), incluídos em blocos de parafina,
seccionados a 3 µm de espessura e montados sobre lâminas silanizadas da
empresa DAKO Co. (Carpinteria Califórnia, USA);
Utilizou-se lamínulas para microscopia – adquiridas do laboratório Glasstécnica
Import. Com. de Vidros Ltda (São Paulo, SP, Brasil), para montar o corte histológico
após finalização da técnica de imunohistoquímica .
Material e Método
41
2.2 Reagentes
Os reagentes utilizados para a análise imunohistoquímica, foram:
- Eosina, etanol, citrato de sódio, xileno, paraformaldeído, parafina,
formaldeído, peróxido de hidrogênio, entelan – Merck (Darmstadt, Alemanha);
- Hematoxilina de Harris - Sigma Diagnostics (St. Louis, MO, USA);
- Albumina sérica bovina (BSA) – Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA);
- Leite desnatado em pó – Molico® (São Paulo, Brasil);
- Anticorpo policlonal anti-heparanase humana produzido em cabra – HPA2
(C-17), produto sc-14900 da empresa Santa Cruz Biotechnology Inc, (Califórnia,
USA);
- Anticorpo monoclonal anti-sidecam-1 humano produzido em camundongo -
MCA 681-CD138 (Sindecan-1 clone BB4) do fabricante Serotec, distribuído por
Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY, USA) ;
- LSAB-HRP - Large Streptavidin-Avidin-Biotin – System Peroxidase; k-0690;
Dako A/S
®
, (Copenhagen, Denmark);
- 3,3’diaminobenzamidina (DAB) – 100mg em 70 ml de PBS + 3 ml de água
oxigenada; Sigma Diagnostics
®
, (St. Louis, MO, USA).
2.3 Equipamentos
Além dos equipamentos comuns de laboratório, utilizou-se os equipamentos
descritos abaixo para a esterilização de materiais e preparação de tecidos, bem
como para análise das lâminas após imunomarcação.
- Autoclaves vertical e horizontal – Soc. FABBE Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Banhos e estufa de temperatura constante – FANEM Ltda. (São Paulo, SP,
Brasil);
Material e Método
42
- Navalha para corte de tecido – Lupe Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Micrótomo Spencer – American Optical (USA);
- Microscópio óptico invertido Nikon Eclipse
®
TS100 (Tókio, Japão)
- Câmera digital Nikon Coolpix
®
4300 (Tókio, Japão)
2.4 Programas
O programa utilizado para a quantificação da expressão de heparanase (HPA2)
e sindecam-1 foi o Sistema de Processamento e Análise de Imagem ImageLab
®
(Softium Informática
®
, São Paulo, Brasil).
Para a realização da análise estatística utilizou-se o programa SPSS versão 13.0
(SPSS, Inc; IIinois, USA).
3 Método
3.1 Imunohistoquímica para a heparanase:
Os cortes histológicos foram montados em lâminas silanizadas, DAKO Co.
(Carpinteria Califórnia, USA);
Primeiramente o tecido foi desparafinizado em xileno (3 incubações por 5
minutos), hidratado em álcool etílico, Merk (Darmstadt, Alemanha), com diferentes
graduações: 95%, 80%, 70% e 50% respectivamente, e em água destilada por 5
minutos. O próximo passo foi a recuperação antigênica em panela a vapor com
solução de citrato de sódio 10 mM, pH 6,0 a 95-100ºC por 30 minutos. Realizou-se o
bloqueio da peroxidase endógena com a lavagem em peróxido de hidrogênio 10V
(3%) (7x por 5minutos) e, a seguir, o bloqueio de sítios inespecíficos com leite
desnatado
Molico®
2% em tampão fosfato de sódio (PBS) 0,05M, pH 7,2 - 7,4.
Material e Método
43
Incubou-se o material por 18 horas a 4ºC com anticorpo policlonal (classe IgG
produzido em cabra) anti-heparanase humana (HPA2 (C-17) produto sc-14900 da
empresa Santa Cruz Biotechnology Inc, Califórnia – USA), na diluição 1:100 em
albumina sérica bovina (BSA) – Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA) 1% em
PBS 0,05M (trata-se de um anticorpo policlonal que tem afinidade contra um
peptídeo localizado próximo à porção carboxiterminal da heparanase -2 de origem
humana).
Após esse período, as lâminas foram lavadas em PBS 0,05M, pH 7,2 - 7,4, e
incubadas com o anticorpo secundário biotinilado anti IgG de cabra por 40 minutos e
com a estreptavidina carregada com peroxidase do kit LSAB-HRP “Large
Streptavidin-Avidin-Biotin – System Peroxidase”, k-0690, Dako A/S
®
(Copenhagen,
Denmark) por 30 minutos. Procedeu-se então a revelação por 1 minuto com o
cromógeno 3-3’-diaminobenzamidina (DAB) – 20µL do cromógeno em 1 mL do
diluente (PBS + água oxigenada) - da Sigma Diagnostics
®
(St. Louis, MO,USA) e a
contra coloração com hematoxilina de Harris por 30 segundos, Sigma Diagnostics
(St. Louis, MO, USA).
Como controle das reações utilizou-se cortes histológicos de carcinóide
pulmonar. Como controle interno negativo foram consideradas hemáceas não
coradas, e positivo a coloração de macrófagos.
A coloração castanha foi considerada como uma evidência da expressão
citoplasmática positiva de HPA2.
3.2 Imunohistoquímica para o sindecam-1:
Seguiu-se o mesmo método relatado anteriormente para a imunomarcação da
heparanase. Utilizou-se o anticorpo primário monoclonal anti-sidecam-1 humano
(classe IgG produzido em camundongo) - MCA 681-CD138 (sindecan-1, clone BB4)
Material e Método
44
do fabricante Serotec, distribuído por Accurate Scientific (BURBACH et al., 2003)
na concentração de 1:500, incubado por 18 horas, a 4°C.
Utilizou-se o anticorpo biotinilado anti-IgG de camundongo como anticorpo
secundário (40 minutos de incubação a temperatura ambiente) e a estreptavidina
carregada com peroxidase, (30 minutos de incubação a temperatura ambiente)
ambos do kit LSAB-HRP (Large Streptavidin-Avidin-Biotin – System Peroxidase; k-
0690; Dako A/S
®
, Copenhagen, Denmark).
Utilizou-se como controles positivos e negativos tecidos de carcinóide pulmonar
humano e o mesmo padrão de controles internos anteriormente relatados.
3.3 Quantificação digital da Imunomarcação Citoplasmática
Inicialmente, as lâminas foram analisadas em microscópio óptico Nikon Eclipse
®
TS100 sob a mesma intensidade de luz e altura do condensador. A área que melhor
representava a marcação estudada (hot spots) foi escolhida em aumento
microscópico de 40 e 100x. Para análise digital da imunoexpressão, em aumento de
400x, foram realizadas fotomicrografias de 640x480 pixels, em campos consecutivos
e não coincidentes com câmera digital Nikon Coolpix
®
4300 em “zoom” óptico
máximo, abertura de condensador F13.4 e tempo de exposição de 1/250, com
“flash” desligado. As imagens obtidas foram transferidas para um computador
Pentium 4
®
com sistema operacional Windows XP
®
e analisadas através do Sistema
de Processamento e Análise de Imagem ImageLab
®
(Softium Informática
®
, São
Paulo, Brasil), calibrado para utilizar a escala em micrômetro (µm).
Foram determinados, através do método de quantificação digital o Índice de
Positividade (IP
DIG
), Intensidade de Expressão (ItE
DIG
) e Índice de Expressão (IE
DIG
).
A padronização da quantificação digital através de tais índices imunohistoquímicos
Material e Método
45
foi determinado individualmente e a metodologia foi determinada por Matos et al.,
2006.
3.3.1 Cálculo do Índice de Positividade (IP
DIG
)
As células positivas e negativas foram individualmente selecionadas em cada
fotomicrografia digital. Sua contagem foi feita simultaneamente pelo programa
ImageLab
®
, até o mínimo de 1000 células tumorais de origem epitelial. Caso o último
campo analisado não fossem atingidas 1000 células, realizava-se a análise total do
próximo campo. Assim, determinou-se o total de imagens a serem analisadas em
cada caso e o Índice de Positividade (IP
DIG
), expresso em porcentagem (%),
segundo a equação:
IP
DIG
= número de células positivas x 100 → [%]
número total de células contadas
3.3.2 Cálculo da Intensidade de Expressão (ItE
DIG
):
A intensidade da coloração castanha expressa foi objetivamente determinada
com o emprego do programa de análise de imagem. Para tanto, selecionou-se
manualmente uma região da área do citoplasma de 12 células positivas distribuídas
homogeneamente nas mesmas fotomicrografias utilizadas no cálculo do IP
DIG
.
A densidade óptica de imunoexpressão (DOi) dessas áreas foi calculada
automaticamente e representa a média de composição das cores vermelha, verde e
azul (RGB), e a área total selecionada, expressa em unidades ópticas por
micrômetro quadrado (u.o./µm
2
).
O mesmo procedimento foi aplicado para obtenção da densidade óptica do
fundo (DOf) em uma área com ausência de tecido ou espaço vascular, com intuito
de equalizar as cores das imagens capturadas. A delimitação de apenas uma área é
suficiente uma vez que o fundo é homogêneo em cada fotomicrografia.
Material e Método
46
É importante ressaltar que os valores de densidade óptica calculados pelo
programa compõem uma escala decrescente na qual altos valores correspondem a
cores visualmente claras. Isso se deve ao fato de que a cor branca absoluta, que
corresponde ao máximo da densidade óptica (320,7 u.o./µm
2
), é composta pela
totalidade de vermelho, verde e azul; e o preto, a ausência delas.
A equação abaixo foi aplicada para o cálculo do Índice de Intensidade de
Expressão (ItE
DIG
), cujos valores compõem uma escala crescente, equalizados pela
DOf, proporcional à densidade óptica do branco absoluto.
ItE
DIG
= 320,7 – 320,7 x Σ DO
i
→ [u.o./µm
2
]
Σ DO
f
Na qual, “Σ DO
i
” representa a somatória da Densidade Óptica da
imunomarcação, “Σ DO
f
” a somatória da densidade óptica do fundo e “ItE
DIG
” a
Intensidade de Expressão em unidades ópticas por micrômetro quadrado.
3.3.3 Cálculo da Índice de Expressão (IE
DIG
):
O Índice de Expressão Imunohistoquímico (IE
DIG
) é proporcional à fração de
células positivas e à intensidade de expressão, segundo a equação abaixo:
IE
DIG
= IPDIG x ItE
DIG
→ [u.o./µm
2
]
100
Na qual, “IP
DIG
” representa o Índice de Positividade, “ItE
DIG
” a Intensidade de
Expressão e “IE
DIG
“ o Índice de Expressão em unidades ópticas por micrômetro
quadrado.
Material e Método
47
4 Análise Estatística
Para avaliar se os índices imunohistoquímicos (IP, ItE, IE) de heparanase e
sindecam-1 são variáveis semelhantes em indivíduos com presença o ausência de
neoplasia, utilizou-se o teste t-Student.
Para avaliar se os valores desses índices poderiam ser utilizados como um teste
diagnóstico para determinar se um paciente estava doente ou não, fez-se necessário
determinar, para cada índice, um “valor de referência” ou “ponto de corte” a partir do
qual o teste é classificado como positivo ou negativo. Ou seja, foi preciso
estabelecer o valor “limite” que determina se o paciente é classificado como sadio ou
doente. Este ponto de corte foi escolhido de forma a produzir a combinação mais
desejável de sensibilidade e especificidade, parâmetros classicamente utilizados
para determinar a qualidade de um teste diagnóstico. Para tanto foram construídas e
analisadas curvas de operação característica (em inglês, ROC, a abreviação para
receiver operator characteristic).
Considerando apenas os pacientes com carcinoma, procedeu-se a análise
exploratória para avaliar se os índices imunohistoquímicos estavam associados às
variáveis clínicas e patológicas observadas.
Para as variáveis sexo e localização do tumor utilizou-se o teste t-Student para
comparação de médias. No caso da variável aspecto macroscópico, utilizou-se a
análise de variância com um fator fixo (ANOVA).
Para avaliar se havia relação entre os índices imunohistoquímicos com a idade e
o tamanho do tumor, foram construídos diagramas de dispersão e calculados
coeficientes de correlação de Pearson.
Adotou-se um nível de significância de 5% em todas as análises.
Resultados e Discussão
Result
ados e Discussão
48
Resultados e Discussão
1 Expressão da heparanase em câncer colorretal.
A Figura 18 (A, B, C e D) apresenta a imagem obtida por câmera digital da
microscopia óptica, característica para a reação de imunohistoquímica da
heparanase (HPA2) revelada com peroxidase e DAB, em um dos indivíduos do
estudo portador de carcinoma colorretal e outro não acometido pela doença,
evidenciando a forte marcação da HPA2 no tecido tumoral em relação ao não
neoplásico.
FIGURA 18. MICROSCOPIA ÓPTICA DEMONSTRANDO A EXPRESSÃO POSITIVA DA HEPARANASE. A.
Carcinoma colorretal (corte transversal); B. Tecido colorretal não neoplásico (corte transversal); C. Carcinoma
colorretal (corte longitudinal) D. Tecido colorretal não neoplásico (corte longitudinal). Barra de aumento: 20,8 µm
Através da microscopia óptica verificou-se a expressão positiva da HPA2, pela
presença de citoplasma com áreas intensamente marcadas (acastanhadas) em
A.
B.
C.
D
.
Result
ados e Discussão
49
células epiteliais neoplásicas malignas, quando comparadas com células epiteliais
não neoplásicas.
Dado a função da heparanase, seria esperado que a localização de tal enzima
fosse na matriz extracelular e superfície celular, porém verificamos intensa marcação
intracelular. A catepsina B, uma protease de matriz extracelular, também relacionada
com processos de invasão tumoral, apresenta-se localizada no interior das células,
entretanto, em células de câncer de mama sua localização muda dos lisossomos
para a membrana plasmática, aumentando assim o potencial metastático da célula
(Sloane et al., 1994; Goldshmidt et al., 2002), o mesmo ocorre com células
epiteliais no câncer de bexiga, pâncreas e adenocarcinoma colorretal (Friedmann et
al., 2000; Kim et al., 2002; Nobuhisa et al., 2005). Podemos hipotetizar que
fenômeno semelhante possa estar ocorrendo com a enzima heparanase, que
passaria a ser expressa intracelularmente em condições de super-expressão. Assim,
a localização celular de tais enzimas poderia variar dependendo do estado fisiológico
da célula, em condição normal ou patológica.
Através da análise quantitativa, realizada pelo Sistema de Processamento e
Análise de Imagem ImageLab
®
(Softium Informática
®
, São Paulo, Brasil), foi possível
determinar os Índices Imunohistoquímicos: Índice de Positividade (IP), Intensidade
de Expressão (ItE) e Índice de Expressão (IE).
A Tabela A I, do anexo, contém as medidas dos índices imunohistoquímicos da
HPA2 para cada indivíduo do estudo. A Tabela A II, do anexo, contém as medidas
das demais variáveis em indivíduos com tumor colorretal (dados clínicos e
patológicos). A Tabela A III, do anexo, apresenta as medidas descritivas dos índices
imunohistoquímicos em indivíduos sem neoplasia e com tumor colorretal. As Figuras
Result
ados e Discussão
50
A1, A3 e A5 do anexo, apresentam o Box-plot das variáveis imunohistoquímicas (IP,
ItE e IE respectivamente) para a HPA2 em indivíduos com e sem neoplasia.
A Tabela V, abaixo, apresenta a média e o desvio padrão das variáveis de
expressão da HPA2 em indivíduos sem neoplasia e com tumor colorretal.
TABELA V – ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DA HEPARANASE
(HPA2) EM INDIVÍDUOS ACOMETIDOS OU NÃO POR CARCINOMA COLORRETAL.
Tecidos analisados IP(%)
ItE (u.o./µm
2
) IE (u.o./µm
2
)
Não neoplásico (n=20)
30.1
(
12.3)
91.4 (10.8) 27.9 (12.2)
Carcinoma (n=50) 77.2 (11.1) 168.4 (17.1) 131.1 (24.9)
Nível descritivo < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001
Os números indicam a média e o desvio padrão (entre parêntesis) dos IP= Índice de
Positividade; ItE= Intensidade de Expressão; IE= Índice de Expressão da heparanase;
n= número de indivíduos; Nível descritivo: “t” de Student significância < 0.05;
Nota-se que a expressão da HPA2 foi maior nos tecidos neoplásicos do que nos
tecidos sem neoplasia para todos os índices (IP, ItE e IE). Em particular, nota-se que
a média da variável IP para a HPA2 em tecidos tumorais foi 2,6 vezes maior do que
a média de IP em tecidos sem neoplasia. O ItE médio em tecidos colorretais foi 1,8
vezes maior comparado aos tecidos não neoplásicos, e o IE, índice que relaciona IP
e ItE, foi 4,7 vezes maior em tecidos com carcinoma colorretal do que em tecidos
sem neoplasia. Essas diferenças foram estatisticamente significantes (p<0,0001;
teste t-Student) para todas as variáveis.
A Figura 19 (A, B e C), apresenta o intervalo de confiança (95%) para a média
das variáveis de expressão da HPA2 em indivíduos sem neoplasia e com tumor
colorretal.
Result
ados e Discussão
51
A. B.
TumorNormal
90
80
70
60
50
40
30
20
IC (95%) para a média de IP Heparanase (%)
TumorNormal
180
160
140
120
100
80
IC (95%) para a média de ItE Heparanase
C.
TumorNormal
140
120
100
80
60
40
20
IC (95%) para a média de IE Heparanase
FIGURA 19. INTERVALO DE CONFIANÇA (95%) PARA A MÉDIA DAS VARIÁVEIS DE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE (HPA2). A. Ìndice de Positividade (IP%); B. Intensidade de expressão (ItE u.o./µm
2
); C. Índice
de Expressão (IE u.o./µm
2
). Normal= tecido colorretal não neoplásico; Tumor= tecido colorretal neoplásico.
A maior expressão da HPA2 em tecidos com carcinoma colorretal observada
neste estudo corrobora com dados da literatura que demonstram um aumento da
enzima heparanase em tecidos neoplásicos (Zcharia et al., 2001; Zetser et al.,
2004). Portanto, a HPA2 até o momento não foi descrita como marcador para
diagnóstico de tumores. Sendo assim, é possível que a HPA2, assim como a HPA1
conforme descrito em literatura, seja utilizada como marcador para diagnóstico de
carcinoma colorretal (Nobuhisa et al., 2005).
Result
ados e Discussão
52
2 Expressão do sindecam-1 em câncer colorretal.
A Figura 20 (A, B, C e D) abaixo, apresenta a imagem obtida por câmera digital
da microscopia óptica, característica para a reação de imunohistoquímica do
sindecam-1 (syn-1) revelada com peroxidase e DAB, em um dos indivíduos do
estudo portador de carcinoma colorretal e outro não acometido pela doença. Note
que, ao contrário da HPA2, o corte tecidual do indivíduo portador da neoplasia
apresenta menor intensidade de marcação comparado ao tecido não neoplásico.
FIGURA 20. MICROSCOPIA ÓPTICA DEMONSTRANDO A EXPRESSÃO POSITIVA DO SINDECAM-1 (syn-
1). A. Carcinoma colorretal (corte transversal); B. Tecido colorretal não neoplásico (corte transversal); C.
Carcinoma colorretal (corte longitudinal) D. Tecido colorretal não neoplásico (corte longitudinal). Barra de
aumento= 20,8µm.
Através da microscopia óptica verificou-se a expressão positiva do syn-1, pela
presença de citoplasma com áreas intensamente marcadas (acastanhadas) em
Result
ados e Discussão
53
células epiteliais não neoplásicas malignas comparadas com células epiteliais
neoplásicas.
Os índices imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) para a expressão do syn-1 foram
determinados identicamente aos da HPA2, conforme descrito anteriormente, através
da análise quantitativa, realizada pelo sistema de processamento e análise de
imagem ImageLab
®
.
A Tabela A I, do anexo, contém as medidas dos índices imunohistoquímicos de
syn-1 para cada indivíduo em estudo. A Tabela A III, do anexo, apresenta as
medidas descritivas dos índices imunohistoquímicos de syn-1 em indivíduos normais
e com tumor colorretal. As Figuras A7, A9 e A11, do anexo, apresentam o Box-plot
das variáveis imunohistoquímicas (IP, ItE e IE respectivamente) para o syn-1 em
indivíduos com e sem neoplasia.
A Tabela VI, abaixo, apresenta a média e o desvio padrão das variáveis de
expressão do syn-1 em indivíduos acometidos ou não por carcinoma colorretal.
TABELA VI – ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE EXPRESSÃO DO SINDECAM-1
(syn-1) EM INDIVÍDUOS ACOMETIDOS OU NÃO POR CARCINOMA COLORRETAL.
Tecidos analisados
IP(%)
ItE (u.o./µm
2
) IE (u.o./µm
2
)
Não neoplásico (n=20)
86.4 (11.3)
117.6 (20.8) 102.2 (25.2)
Carcinoma (n=50)
65.7 (28.5) 59.6 (14.6) 39,2 (17.8)
Nível descritivo =0.004 < 0.0001 < 0.0001
Os números indicam a média e o desvio padrão (entre parêntesis) dos IP= Índice de
Positividade; ItE= Intensidade de Expressão; IE= Índice de Expressão do sindecam-1;
n= número de indivíduos; Nível descritivo: “t” de Student significância < 0.05;
Em particular, observa-se que a média da variável IP para o syn-1 em tecidos
não neoplásicos foi 1,3 vezes maior do que em tecidos com carcinoma colorretal. O
ItE médio em tecidos sem neoplasia foi 1,9 vezes maior, enquanto que a média de
IE foi 2,6 vezes maior em tecidos sem neoplasia comparado com carcinomas
Result
ados e Discussão
54
colorretais. Essas diferenças foram estatisticamente significantes para todas as
variáveis.
A Figura 21 (A, B e C), abaixo, representa estatisticamente o intervalo de
confiança (95%) para a média das variáveis de expressão do syn-1 em indivíduos
sem neoplasia e com tumor colorretal.
A. B.
TumorNormal
90
80
70
60
IC (95%) para a média de IP Sindecam (%)
TumorNormal
120
100
80
60
IC (95%) para a média de ItE Sindecam
C.
TumorNormal
120
100
80
60
40
20
IC (95%) para a média de IE Sindecam
FIGURA 21. INTERVALO DE CONFIANÇA (95%) PARA A MÉDIA DAS VARIÁVEIS DE EXPRESSÃO DO
SINDECAM-1 (syn-1). A. Ìndice de Positividade (IP%); B. Intensidade de expressão (ItE u.o./µm
2
); C. Índice de
Expressão (IE u.o./µm
2
). Normal= tecido colorretal não neoplásico; Tumor= tecido colorretal neoplásico.
Result
ados e Discussão
55
Nota-se que a expressão do syn-1 foi menor em tecidos com carcinoma
colorretal do que em tecidos não neoplásicos para todos os índices (IP, ItE e IE).
Estas diferenças foram estatisticamente significantes para todas as variáveis (teste t-
Student).
A diminuição da expressão do syn-1 em carcinomas colorretais comparados a
tecidos normais indica uma diminuição na expressão do PGHS, visto que a
quantificação do syn-1 foi através de anticorpo que reconhece o esqueleto protéico
do proteoglicano. Este dado também foi observado em outras neoplasias por outros
autores (Reiland et al., 2004).
Por outro lado, “a diminuição da cadeia de HS durante o desenvolvimento de
tumores” já foi descrito na literatura (Dietrich et al.,1993), bem como “a diminuição
da sulfatação das cadeias de HS” (Dietrich et al.,1983). Portanto, na transformação
neoplásica, podemos observar alteração não apenas quantitativa, mas também
alterações estruturais nas cadeias de HS e no esqueleto protéico do PGHS.
É importante ressaltar que o PGHS atua no mecanismo de adesão celular,
portanto, a diminuição de sua expressão durante o processo neoplásico favorece o
processo de migração celular diminuindo assim a adesão de células tumorais
(Bernfield et al., 1999; Franco et al., 2001).
3 Expressão da heparanase e sindecam-1 correlacionados à variável sexo.
Houve interesse em avaliar se as variáveis de expressão eram semelhantes
para os dois gêneros (masculino e feminino), para os indivíduos normais e com
tumor. As Figuras A6 e A12, do anexo, apresentam o Box-plot para o índice de
expressão, índice que relaciona IP e ItE, da HPA2 e syn-1 de indivíduos com e sem
Result
ados e Discussão
56
carcinoma colorretal. As Figuras 22 e 23, abaixo, contém o Intervalo de Confiança
(95%) para a média do índice de expressão, de HPA2 e syn-1 segundo o gênero
(sexo), para indivíduos normais e com tumor.
TumorNormal
150
120
90
60
30
0
IC (95%) para a média de IE Heparanase
FemininoMasculino
Sexo
TumorNormal
140
120
100
80
60
40
20
IC (95%) para a média de IE Sindecam
FemininoMasculino
Sexo
FIGURA 22. MÉDIA PARA O ÍNDICE DE
EXPRESSÃO DE HEPARANASE (HPA2) EM
RELAÇÃO AO SEXO DE INDIVÍDUOS COM E
SEM CARCINOMA COLORRETAL.
FIGURA 23. MÉDIA PARA O ÍNDICE DE
EXPRESSÃO DE SINDECAM-1 (syn-1) EM
RELAÇÃO AO SEXO DE INDIVÍDUOS COM E SEM
CARCINOMA COLORRETAL.
As médias dos índices de expressão (IE) da HPA2 e do syn-1, foram
semelhantes nos dois gêneros, tanto em pacientes sem neoplasia quanto em
pacientes com carcinoma colorretal, assim como as médias dos demais índices
imunohistoquímicos IP e ItE (dado demonstrado nas Figuras A2 e A4, do anexo
respectivamente, para a HPA2 e Figuras A8 e A10, do anexo respectivamente, para
o syn-1, isto é, o sexo parece não determinar ou interferir na expressão das
substâncias em estudo.
4 Valores de referência (ou pontos de corte) dos índices
imunohistoquímicos para classificar um paciente como sadio ou doente
A Figura 24 (A, B e C) apresenta a curva ROC contendo a representação
gráfica da sensibilidade (eixo vertical) e do complementar da especificidade (eixo
Result
ados e Discussão
57
horizontal) para diversos pontos de corte nos índices imunohistoquímicos (IP, ItE e
IE) da HPA2.
A. B.
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
C.
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
FIGURA 24. CURVA ROC PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DA HEPARANASE (HPA2).
A. pc(IP) =56.87%; B. pc(ItE) =117.00 u.o./µm
2
; C. pc(IE)= 61.90 u.o./µm
2
. u.o = unidade óptica.
Para cada índice, foi determinado o valor de referência, ou ponto de corte (pc),
que produziu a melhor relação entre a especificidade e sensibilidade, com base na
análise da representação gráfica da curva ROC e das Tabelas AX, AXI e AXII, do
anexo.
Result
ados e Discussão
58
A Figura 25 (A, B e C) apresenta a curva ROC para diversos pontos de corte
dos índices imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) do syn-1.
A. B.
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
C.
1,00,80,60,40,20,0
1 - Specificity
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sensitivity
ROC Curve
FIGURA 25. CURVA ROC PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE SINDECAM-1 (syn-1).
A. pc (IP)=76.24%; B. pc (ItE)=84.95 u.o./µm
2
; C. pc (IE)=72.75 u.o./µm
2
.
Para cada índice (IP, ItE e IE) de syn-1, foi determinado o ponto de corte (pc),
que produziu a melhor relação entre a especificidade e sensibilidade, baseado na
análise da representação gráfica da curva ROC e das Tabelas AXIII, AXIV e AXV, do
anexo.
A Tabela VII apresenta o ponto de corte escolhido para cada índice
imunohistoquímicos, segundo as curvas ROC apresentadas anteriormente.
Result
ados e Discussão
59
TABELA VII. PONTOS DE CORTE COM A MELHOR RELAÇÃO ENTRE SENSIBILIDADE
E ESPECIFICIDADE
Ponto de Corte (pc)
1-
Teste positivo se valor maior ou igual a
sensibilidade
especificidade
HPA2
IP (%) 56.87 0.96 0.00
ItE (u.o./µm2) 117.00 1.00 0.00
IE (u.o./µm2) 61.90 0.98 0.00
Ponto de Corte (pc)
Teste positivo se valor menor ou igual a
Syn-1
IP% 76.24 0.52 0.20
ItE (u.o./µm2) 84.95 0.98 0.00
IE (u.o./µm2) 72.75
0.98 0.05
Sensibilidade é a probabilidade do teste ser positivo quando o paciente de fato
tem a doença e especificidade é a probabilidade do teste ser negativo quando o
paciente não tem a doença. O melhor ponto de corte que relaciona especificidade e
sensibilidade deve apresentar sensibilidade próxima de 1 e especificidade próxima
de 0.
Observa-se que, os índices imunohistoquímicos da HPA2 para classificar o
paciente como sadio ou doente, com base nesses pontos de corte de sensibilidade e
especificidade, seguem padrões que permitem sua utilização como marcador. Em
particular, a intensidade de expressão (pc ItE =117,00 u.o./µm
2
, ou seja, pacientes
com ItE ≥ 117,00 u.o./µm
2
serão considerados doentes), obtém-se sensibilidade
igual a um e especificidade igual a zero. Isto sugere que um teste diagnóstico com
base neste índice é excelente para diferenciar pacientes sadios de doentes.
Utilizando-se o índice de positividade (IP ≥ 56.87%), obtém especificidade igual a
zero e sensibilidade 0.96. Analisando o índice de expressão (IE, índice que relaciona
IP e ItE), obtém especificidade igual a zero e sensibilidade 0.98 . Ou seja, a
Result
ados e Discussão
60
probabilidade do teste ser negativo quando o paciente não tem a doença é zero e a
probabilidade do teste ser positivo quando o paciente de fato tem a doença é 0.98,
muito próximo de um.
O índice de positividade do syn-1 não apresenta resultado tão satisfatório quanto
ao da HPA2 (onde a melhor combinação sensibilidade-especificidade, IP ≤ 76.24%,
produz valor inferior de sensibilidade 0,52, quando comparado ao do IP da HPA2).
Analisando a intensidade de expressão (ItE ≤ 84.95 u.o./µm
2
) e o índice de
expressão (IE ≤ 72.75 u.o./µm
2
) observa-se que embora os valores de especificidade
e sensibilidade para ambos os índices tenham chegado próximos aos valores de
referência (0 e 1 respectivamente), esses também foram inferiores aos índices da
HPA2. Portanto, nas condições deste estudo, foi possível verificar que a HPA2 seria
melhor marcador para diagnosticar câncer colorretal do que o syn-1. É importante
ser observado que a HPA2 até o momento não foi descrita como marcador para
diagnóstico de câncer colorretal.
O método quantitativo utilizado neste estudo permitiu a observação dos
resultados com alta sensibilidade e especificidade tendo em vista ser um método
digital menos subjetivo e experimentalmente, mais rápido, quando comparado ao
método convencional de quantificação por reticulócito (Matos et al., 2006).
5 Relação entre a expressão da heparanase e de sindecam-1 com as
variáveis patológicas de pacientes com carcinoma colorretal.
A Tabela VIII mostra os valores da média e desvio padrão dos parâmetros
imunohistoquímicos da HPA2 (IP, ItE e IE) segundo as variáveis clínicas e
patológicas e o nível descritivo do teste de comparação entre as médias dos índices
imunohistoquímicos da HPA2 nas categorias das variáveis clínicas e patológicas.
Result
ados e Discussão
61
TABELA VIII: MEDIDAS DESCRITIVAS PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE
EXPRESSÃO DA HEPARANASE (HPA2) DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS
EXPLICATIVAS.
IP Heparanase
ItE Heparanase
IE Heparanase
n
média
desvio
padrão
p valor
média
desvio
padrão
p valor
média
desvio
padrão
p valor
Sexo
Masculino
31
75.8
13.1
0.24
169.0
37.7
0.76
129.4
50.6
0.45
Feminino
19
79.6
6.6
167.5
39.0
134.0
53.9
Localização do Tumor
Reto
44
79.4
6.0
0.13
169.1
16.4
0.48
134.7
18.8
0.17
Colo
6
61.7
23.9
163.8
22.5
104.7
45.5
Tipo Histológico
Adenocarcinoma
44
77.7
11.4
0.35
169.3
17.5
0.40
132.7
25.6
0.23
Outro
6
73.6
9.0
162.4
13.4
119.5
15.6
Grau de diferenciação
Bem
8
76.6
7.8
0.87
182.6
30.3
0.16
141.2
35.7
0.21
Moderado
42
77.4
11.7
165.7
12.0
129.2
22.3
Aspecto macroscópico
Ulcerado
4
67.4
15.5
0.71
161.7
14.1
0.13
109.2
29.4
0.93
Infiltrativo
41
78.5
10.7
168.9
18.1
133.7
25.0
Vegetante
5
75.1
8.1
169.7
9.4
127.4
11.1
Invasão da serosa
Não
15
78.2
8.1
0.69
169.7
11.1
0.74
133.1
16.4
0.72
Sim
35
76.8
12.3
167.9
19.2
130.3
27.9
Invasão angiolinfática
Ausente
28
75.5
13.9
0.19
167.4
14.3
0.63
127.7
27.2
0.28
Presente
22
79.4
5.5
169.7
20.3
135.5
21.3
Invasão perineural
Ausente
35
76.4
12.7
0.45
167.6
13.8
0.59
129.4
25.0
0.45
Presente
15
79.1
6.1
170.4
23.5
135.2
24.9
Estadiamento
Inicial
29
76.1
12.7
0.42
170.2
20.4
0.39
131.2
29.8
0.98
Tardio
21
78.7
8.5
165.9
10.9
131.0
16.4
Metástase linfonodal
Não
30
76.5
12.7
0.57
170.2
20.0
0.36
131.7
29.5
0.83
Sim
20
78.3
8.5
165.7
11.2
130.2
12.8
A Tabela IX mostra os valores da média e do desvio padrão para as variáveis
explicativas em estudo, dos doentes com tumor colorretal, além do nível descritivo
da análise comparativa das médias dos índices imunohistoquímicos do syn-1 nas
categorias das variáveis clínicas e patológicas.
Result
ados e Discussão
62
TABELA IX: MEDIDAS DESCRITIVAS PARA OS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE
EXPRESSÃO DE SINDECAM-1 (syn-1) DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS
EXPLICATIVAS.
IP Sindecam-1
ItE Sindecam-1
IE Sindecam-1
n
Média
desvio
padrão
p valor
média
desvio
padrão
p valor
média
desvio
padrão
p valor
Sexo
Masculino
31
61.7
29.2
0.21
59.5
16.3
0.97
37.4
16.3
0.38
Feminino
19
72.2
26.6
59.7
11.6
42.0
11.6
Localização do Tumor
Reto
44
64.7
29.8
0.29
59.7
15.1
0.91
38.5
18.2
0.48
Colo
6
73.3
15.5
59.0
10.5
44.1
14.6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma
44
65.0
27.6
0.63
60.4
12.3
0.59
38.2
16.8
0.30
Outro
6
71.0
36.5
54.0
27.0
46.2
24.9
Grau de diferenciação
Bem
8
69.7
22.8
0.67
60.9
12.8
0.78
42.4
17.9
0.58
Moderado
42
64.9
29.6
59.3
15.0
38.5
17.9
Aspecto macroscópico
Ulcerado
4
65.2
45.0
46.9
32.3
40.1
27.1
Infiltrativo
41
64.5
28.0
0.57
61.4
12.2
0.37
38.7
17.6
0.45
Vegetante
5
75.9
20.6
55.1
10.6
42.0
14.7
Invasão da serosa
Não
15
69.0
26.8
0.59
63.8
11.1
0.18
45.7
20.7
0.09
Sim
35
64.3
29.2
57.8
15.6
36.4
15.9
Invasão angiolinfática
Ausente
28
70.1
27.6
0.22
56.7
16.4
0.11
41.6
19.1
0.27
Presente
22
60.1
29.2
66.3
11.2
36.0
15.8
Invasão perineural
Ausente
35
68.8
28.0
0.24
58.0
16.4
0.15
40.7
18.4
0.34
Presente
15
58.4
29.2
63.3
8.5
35.5
16.2
Estadiamento
Inicial
29
71.6
26.3
0.09
56.7
15.8
0.10
42.6
18.6
0.10
Tardio
21
57.6
30.0
63.5
12.0
34.3
15.9
Metástase linfonodal
Não
30
70.3
26.8
0.16
56.8
15.5
0.09
41.8
18.7
0.19
Sim
20
58.8
30.2
63.8
12.2
35.1
15.9
IP= índice de positividade (%); ItE= intensidade de expressão (u.o./µm
2
); IE= índice de expressão (u.o./µm
2
).
Maiores detalhes, como valores máximo, mínimo e mediana dos índices
imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) de HPA2 e syn-1, estão descritos nas Tabelas A IV
à A IX, do anexo.
Result
ados e Discussão
63
Não houve indícios de diferenças estatisticamente significantes nas médias dos
índices imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) para HPA2 e syn-1 segundo as categorias
das variáveis estudadas (localização do tumor, grau de diferenciação, invasão da
serosa, invasão angiolinfática, invasão perineural, estadiamento e aparecimento de
metástases). As Figuras A 13 à A 72 do anexo, apresentam os Box-plot para os
índices imunohistoquímicos da HPA2 e syn-1 segundo as variáveis clínicas e
patológicas, em indivíduos com tumor colorretal.
Também foi investigada a existência da relação entre os índices
imunohistoquímicos da HPA2 e syn-1 com as variáveis idade e tamanho do tumor
por meio do coeficiente de correlação de Pearson.
A média de idade dos indivíduos em estudo foi de 63 ± 13 anos (mínimo 28 e
máximo 86 anos). A Figura 26 (A e B) apresenta o diagrama de dispersão entre o
índice de expressão (IE) da HPA2 e de syn-1 e a idade dos indivíduos acometidos
ou não pela neoplasia.
A. B.
9080706050403020
Idade
250
200
150
100
50
0
IE Heparanase
TumorNormal
9080706050403020
Idade
150
100
50
0
IE Sindecam
TumorNormal
FIGURA 26. DIAGRAMA DE DISPERSÃO ENTRE IDADE E ÍNDICE DE EXPRESSÃO. O diagrama mostra o
Índice de Expressão da heparanase (A) ou sindecam-1 (B) e a idade em indivíduos que apresentam (círculos
verdes) ou não (círculos azuis) carcinoma colorretal.
Não houve correlação significativa entre o índice de expressão da HPA2 e do
syn-1 e a idade dos indivíduos em estudo, ou seja, a idade não interferiu na
expressão dessas substâncias.
Result
ados e Discussão
64
A média do tamanho (diâmetro) do tumor do grupo em estudo foi de 4,6 ± 2,3 cm
(diâmetro mínimo 2,0 e máximo 15,0 cm). A Tabela X apresenta os coeficientes de
correlação de Pearson entre os índices imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) da HPA2 e
do syn-1 e o tamanho do tumor.
TABELA X. COEFICIENTES DE CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE OS ÍNDICES
IMUNOHISTOQUÍMICOS E O TAMANHO DO TUMOR
Índices
Imunohistoquímicos
HPA2
Coeficiente de correlação
índice imunohistoquímico
x
tamanho do tumor
IP (%) - 0.26
ItE (u.o./µm2)
0.38*
IE (u.o./µm2) 0.08
*p<0.01
Índices
Imunohistoquímicos
syn-1
Coeficiente de correlação
índice imunohistoquímico
x
tamanho do tumor
IP% 0.11
ItE (u.o./µm2) -0.21
IE (u.o./µm2) 0.02
*p<0.01
A Figura 27 (A e B) contém os diagramas de dispersão entre o índice de
expressão (IE) da HPA2 e do syn-1 e o tamanho do tumor.
Result
ados e Discussão
65
A. B.
16,014,012,010,08,06,04,02,0
Tamanho do Tumor (cm)
200,0
150,0
100,0
50,0
IE Heparanase
16,014,012,010,08,06,04,02,0
Tamanho do tumor (cm)
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
IE Sindecam
FIGURA 27. DIAGRAMA DE DISPERSÃO ENTRE TAMANHO DO TUMOR E ÍNDICE DE EXPRESSÃO. O
diagrama mostra o Índice de Expressão da heparanase (A) ou sindecam-1 (B) e o tamanho do tumor de
indivíduos com carcinoma colorretal.
Não foi observada correlação significante entre os índices imunohistoquímicos
da HPA2 e do syn-1 e o tamanho do tumor. A significância observada para o ItE da
HPA2 verificada na Tabela X foi obtida em decorrência de resultados de um único
doente, apresentando 15 cm de diâmetro tumoral, o que impossibilita maiores
conclusões.
De acordo com resultados observados neste estudo, pode-se concluir que a
isoforma heparanase-2, bem como o proteoglicano sindecam-1, não seriam bons
marcadores para prognóstico, ao contrário da heparanase-1, onde sua utilização
como marcador para diagnóstico, metástase além de prognóstico de carcinoma
colorretal é comprovada em literatura (Nobuhisa, et al,. 2005).
Result
ados e Discussão
66
6 Relação entre índices imunohistoquímicos de expressão da
heparanase e do sindecam-1
Também foi investigada a existência de relação entre os índices
imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) da HPA2 com os de syn-1 por meio do coeficiente
de correlação de Pearson.
A Tabela XI contém os coeficientes de correlação de Pearson entre os índices
imunohistoquímicos de HPA2 e syn-1.
TABELA XI. COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO DE PEARSON ENTRE OS ÍNDICES
IMUNOHISTOQUÍMICOS DE HEPARANASE E SINDECAM-1
HPA2
IP ItE IE
IP
-0,47
ItE
0,23
IE
0,22
Syn
-
1
*p<0.05;
IP= Índice de Positividade, ItE= Intensidade
de expressão; IE= Índice de Expressão.
A Figura 28 (A, B e C) mostra o diagrama de dispersão dos índices
imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) de sindecam-1 em função dos índices da
heparanase em indivíduos acometidos ou não pela neoplasia.
Result
ados e Discussão
67
A. B.
100,0080,0060,0040,0020,000,00
IP Heparanase (%)
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0
IP Sindecam (%)
TumorNormal
Tumor
250,0200,0150,0100,050,0
ItE Heparanase
150,0
100,0
50,0
0,0
ItE Sindecam
TumorNormal
Tumor
C.
250,0200,0150,0100,050,00,0
IE Heparanase
150,0
100,0
50,0
0,0
IE Sindecam
TumorNormal
Tumor
FIGURA 28. DIAGRAMA DE DISPERSÃO RELACIONANDO EXPRESSÃO DE HEPARANASE (HPA2) E
SINDECAM-1 (syn-1).
Os diagramas mostram a relação entre os IP= índice de positividade (A), ItE= intensidade de
expressão (B) e IE= índices de expressão (C) da heparanase e sindecam-1 em indivíduos que apresentam (círculos verdes)
ou não (círculos azuis) carcinoma colorretal.
A tabela e os diagramas não permitiram caracterizar relação linear entre os
índices imunohistoquímicos (IP, ItE e IE) de heparanase e sindecam-1.
Esse dado pode ser explicado de duas maneiras: 1) a heparanase analisada
neste estudo foi a isoforma 2 (HPA2) que possui 35% de homologia com a
heparanase-1 (HPA1) e sua atividade enzimática ainda não foi totalmente
esclarecida (Mckenzie et al., 2000); 2) O sindecam-1 foi analisado através de um
anticorpo monoclonal que reconhece o esqueleto protéico do PGHS, portanto, não
foi possível observar se as cadeias de HS poderiam estar degradadas por ação da
HPA2 altamente expressa no carcinoma. Assim, não foi observado correlação HPA2
versus syn-1, pois não foram visualizadas as cadeias de HS deste proteoglicano.
Conclusões
Conclusões
68
Conclusões
Nas condições deste estudo, os resultados obtidos permitiram as seguintes
conclusões:
- A expressão tecidual da enzima heparanase-2 (HPA2) e do proteoglicano de
heparam sulfato sindecam-1, de indivíduos com carcinoma colorretal e sem
neoplasia, foi quantificada por técnica digital a partir da obtenção dos índices
imunohistoquímicos: índice de Positividade (IP), Intensidade de Expressão (ItE) e
Índice de Expressão (IE), de maneira específica, sensível e menos subjetiva do que
a técnica de quantificação convencional.
-A expressão da heparanase-2 foi significativamente maior nos tecidos
neoplásicos do que em tecidos sem neoplasia, ao contrário da expressão do
sindecam-1 que foi significativamente menor em tecidos neoplásicos do que em
tecidos sem neoplasia.
-
Os índices imunohistoquímicos obtidos para heparanase-2 (IP, ItE e IE) e
sindecam-1 (ItE e IE) podem ser utilizados em testes diagnósticos para avaliar a
presença de câncer colorretal, produzindo valores de sensibilidade e especificidade
próximos de 1 o que sugere que essas moléculas podem ser futuramente utilizadas
como marcadores tumorais, porém, nas condições deste estudo, a heparanase-2 foi
melhor marcador para carcinoma colorretal comparada ao sindecam-1.
-Não houve correlação entre a expressão tecidual de heparanase-2 e sindecam-
1 em indivíduos que apresentavam ou não carcinoma colorretal.
-Considerando apenas os pacientes com tumor, não foi identificado relação
entre os índices imunohistoquímicos de expressão de heparanase-2 e sindecam-1
com as variáveis clínicas e patológicas avaliadas.
Sumário
Sumário
69
Sumário
O câncer colorretal (CCR) é a terceira doença neoplásica mais freqüente no
mundo e, no Brasil, a terceira causa mais comum de morte por câncer (Inca, 2005).
O remodelamento da matriz extracelular (MEC) é uma das alterações observadas
com o aparecimento da neoplasia. A heparanase-1 (endo-β-glucuronidase) é uma
das enzimas responsáveis por este remodelamento, ela está envolvida na
degradação das cadeias de heparam sulfato dos proteoglicanos dentre eles do
sindecam-1 (syn-1), presente na superfície de células epiteliais (Cohen et al., 1994).
A heparanase-2 (HPA2) é membro da família da heparanase expressa no intestino.
Os objetivos deste estudo foram: quantificar a expressão de HPA2 e Syn-1 em
tecidos de indivíduos com câncer colorretal e sem neoplasia e avaliar se há
variações nos níveis de expressão destes compostos em relação a variáveis clínicas
e patológicas; Neste estudo foram analisados 50 indivíduos com tumor colorretal
operados e 20 normais. Utilizou-se a técnica de imunohistoquímica para analisar a
expressão de HPA2, utilizando anticorpo policlonal HPA2 - C17 (Santa Cruz
Biotecnology, Ca, USA), e Syn1 (utilizando anticorpo monoclonal MCA681 – CD138,
Serotec, Accurate Scientific, USA). Ambos os anticorpos primários foram revelados
com peroxidase e DAB. O sistema de imagem ImageLab (Softium Informática, São
Paulo, Brasil) foi utilizado para quantificar a imunoexpressão. Para a análise
estatística utilizou-se o programa SPSS versão 13.0 (Ilinois, USA). A expressão de
HPA2 e syn-1 foi determinada a partir de índices imunohistoquímicos: índice de
positividade (IP), intensidade de expressão (ItE) e índice de expressão (IE). Foi
possível observar que a enzima HPA2 encontra-se super-expressa em tecidos com
tumor colorretal (131.1 ± 24.9u.o./µm
2
) comparados à tecidos não neoplásicos
(IE=27.9 ± 12.2u.o./µm
2
) (p<0.0001). Por outro lado, o Syn-1 foi menos expresso em
tecidos com tumor colorretal (39.2 ± 17.8u.o./µm
2
) do que em tecidos sem neoplasia
(IE=102.2 ± 25.2u.o./µm
2
). Não foram encontradas correlações significativas entre a
expressão de HPA2 e Syn-1 com variáveis clínicas e patológicas (sexo, idade,
localização do tumor, tipo histológico, grau de diferenciação celular, metástase e
estadiamento TNM). Foi possível determinar o ponto de corte para especificidade e
sensibilidade para cada variável imunohistoquímica e foi observado que a HPA2 foi
melhor marcador para carcinoma colorretal comparada ao Syn-1. Dados da literatura
relatam o aumento da expressão de HPA1 em vários tumores, portanto, este
trabalho sugere que a ambas isoformas da enzima heparanase seja importante no
diagnóstico e potencialmente importante alvo a ser estudado como terapia anti-
tumoral.
Abstract
70
Abstract
Colorectal cancer (CRC) is the third neoplasic disease more frequent in the world
and in Brazil it is the third most frequent cause of cancer death (Inca 2005).
Extracellular matrix remodeling is one of the modifications observed during tumor
development. Heparanase, an endo-beta-glucuronidase is one of the enzymes
involved into this remodeling process, that degrades heparan sulfate chains at
proteoglycans such as syndecan-1 (Syn-1), present at epithelial surface cells (Cohen
et al., 1994). Heparanse-2 (HPA2) is a member of heparanase expressed at
intestine. The objectives of this studies were: quantify the expression of HPA2 and
Syn-1 at non neoplasic and colorectal carcinoma tissues and evaluate if the level of
expression of these molecules change with clinical and pathological variables. It was
analyzed 50 tissues from colorectal carcinoma patients and 20 non neoplasic tissues,
using immunohistochemistry assay to identify and quantify the expression of HPA2
(polyclonal antibody HPA2 C-17, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) and Syn-1
(monoclonal antibody, MCA681- CD138, Serotec Accurate Scientific, USA). Both
primary antibodies were developed with peroxidase. ImageLab (Softium, São Paulo,
Brazil) was used to quantified the immunoexpression. Statistical Analysis were
performed using SPSS version 13.0 (Illinois, USA). HPA2 and syn-1 expression were
determined using immunohistochemical indexes PLC (positive label cells), ITI
(immunostaining intensity) and EI (Expression index). It was shown that HPA2 was
over expression at colorectal cancer (131.1 ± 24.9 u.o/µm
2
) compared to non
neoplasic tissues (27.9 ± 12.2 u.o//µm
2
). On the other hand, Syn-1 was under
expressed at colorectal tissues (39.2 ± 17.8 9 u.o/µm
2
) compared to non neoplasic
tissues (102.2 ± 25.2 9 u.o/µm
2
). It was not found significant correlation between
HPA2 and Syn-1 expression and clinical and pathological variables (sex, age, tumor
localization, size of the tumor, grade of tumor differentiation, tumor metastasis and
TNM). It was defined the cut off point by sensibility and specificity curve by each
immunohistochemistry variable and it was observed that HPA2 was the best marker
for colorectal carcinoma compared to Syn-1. Literature data had shown over
expression HPA1 at many tumors. However, this study suggest that the isoform 2 is
also important at the colorectal carcinoma diagnosis. Therefore, both HPA1 and
HPA2 could be potentially important targets as anti-tumoral therapy.
Referências
Bibliográficas
Referências Bibliográficas
71
Referências Bibliográficas
AJCC Cancer Staging Manual (2002) - Sixth Edition, American Joint Committee on
Cancer, New York, Spring-Verlag.
Aikawa, J., Esko, J.D. (1999). “Molecular cloning and expression of a third member of
the heparan sulfate/heparin GlcNAc N-deacetylase/ N--sulfotransferase family”. J.
Biol Chem. 274(5):2690-2695.
Alberts, B., Bray, D.; Lewis, J., Martin, R., Roberts, K., Watson, JD. (1999).
Biologia Molecular da Célula, Artmed.
Alberts, B., Bray, D.; Lewis, J., Martin, R., Roberts, K., Watson, JD. (2004). Biologia
Molecular da Célula, Artmed.
Atkin, W.S., Morson, B.C., Cuzick, J. (1992). “Long term risk of colorectal câncer
after escision of retossigmoid adenomas”. N. Engl J. Med.326:658-62.
Baker, E.; Crawford, J., Sutherland, G.R.; Freeman, C.; Parish, C.R.; Hulett, M.D.
(1999). "Human HPA endoglycosidase heparanase. Map position 4q21.3."
Chromosome Res. 7 (4): 319.
Bernfield, M.; Götte, M.; Park, P.W.; Reizes, O.; Fitzgerald, M.L.; Lincecum, J.; Zako,
M. (1999). "Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans." Annu. Rev.
Biochem. 68: 729-777.
Bissell, M.J.; Kenny, P.A.; Radisky, D.C. (2005). "Microenvironmental regulators of
tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the
role of extracellular matrix and its degrading enzymes." Cold Spring Harb Symp
Quant Biol. 70: 1-14.
Byod, D.D.; Nakajima, M. (2004). "Involvement of heparanase in tumor metastases: a
new target in cancer therapy?" J Natl Cancer Inst 96(16): 1194-1195.
Burbach, B.J., Friedl, A., Mundhenke, C., Rapraeger, A.C.(2003). “ Syndecan-1
accumulates in lysosomes of poorly differentiated breast carcinoma cells”.
Matrix Biol. 22(2):163-77.
Cohen, I.R., Murdoch, A.D., Naso, M.F., Marchetti, D., Berd, G., Iozzo, R.V. (1994).
“Abnormal expression of perlecan proteoglycan in metastatic melanoma”. Cancer
Research. 54(22):5771-5774.
Cooper, G. M. (2001). A Célula - Uma Abordagem Molecular, Ed. Artmed. Porto
Alegre.
Cotti, G.C.C.; Santos, F.P.S.S.; Sebastianes, F.M.; Habr-Gama, A.; Seid, V.E.;
Martino, R.B. (2000). “Genética do Câncer Colorretal”. Ver Méd. 79 (2/4): 45-64.
Referências Bibliográficas
72
David, G. (1993). “Integral membrane heparan sulfate proteoglycans”. Faseb J.
7(11):1023-1030.
Davies, R.J., Mileller, R., Coleman, N. (2005) – “Colorectal Canver Screening :
Prospects for moleular stool analysis”. Nature Review, 5: 199-209.
Dempsey, L.A.; Brunn, C.; Platt, J.L. (2000). "Heparanase, a potential regulator of
cell-matrix interactions." TIBS. 25(349-351).
Dietrich, C.P. (1984). "A model for cell-cell recognition and control of cell growth
mediated by sulfated glycosaminoglycans." Braz J Med Biol Res 17(1): 5-15.
Dietrich, C.P.; Armelin, H.A. (1978). "Sulfated mucopolysaccharides from normal
3T3cells and its tumorigenic variant ST1: Possible role of chondroitin sulfates in
neoplastic transformation." Biochem and Biophisl Res Commu 84: 794-801.
Dietrich, C.P.; Martins, J.R.; Sampaio, L.O.; Nader, H.B. (1993). "Anomalous
structure of urinary chondroitin sulfate from cancer patients. A potencial new
marker for diagnosis of neoplasias." Lab Investig 68(4): 439-445.
Dietrich, C.P.; Nader, H.B.; Straus, A.H. (1983). "Structural differences of heparan
sulfates according to the tissue and species of origin." Biochem Biophys Res
Commun 111(3): 865-871.
Dietrich, C.P.; Sampaio, L.O.; Toledo, O.M.; Cassaro, C.M. (1977). "Cell recognition
and adhesiveness: a possible biological role for the sulfated
mucopolysaccharides”. Biochem Biophys Res Commun 75(2): 329-336.
Dietrich, C.P., Martins, J.R.M., Sampaio, L.O., Nader, H. B. (1993). “Anomalous
structure of urinary chondroitin sulfate from cancer patients. A potencial new
marker for diagnosis of neoplasias”. Laboratory Investigation 68 (4):439-445.
Dong, J., Kukula, A.K., Toyoshima, M., Nakajima, M. (2000). “Genomic organization
and chromosome localization of the newly identified human heparanase gene”.
Gene. 253 (2):171-178.
Edovitsky, E.; Elkin, M.; Zcharia, E.; Peretz, T.; Tamar, J.; Vlodavsky, I. (2004).
"Heparanase gene silencing, tumor invasiveness, angiogenesis and metastasis."
Journal of the National Cancer Institute 96(16): 1219-1230.
Elkin, M., IIan, N., Ishai-Michaeli, R., Friedmann, Y., Pappo, O., Pecker, I.,
Vlodavsky, I. (2001). “Heparanase as mediator of angiogenesis mode of action”.
FASEB J. 15(9):1661-1663.
Erickson, A.C.; Couchman, J.R. (2000). "Still more complexity in mammalian
basement membranes." J Histochem Cytochem 48:1291-1306.
Esko, J.D.; Lindahl, U. (2001). "Molecular diversity of heparan sulfate." J Clin Invest
108: 169-173.
Referências Bibliográficas
73
Franco, C. R.; Rocha, H. A.; Trindade, E. S.; Santos, I. A.; Leite, E. L.;. Veiga, S. S;.
Nader, H. B; Dietrich, C. P. (2001). "Heparan sulfate and control of cell division:
adhesion and proliferation of mutant CHO-745 cells lacking xylosyl transferase."
Braz J Med Biol Res. 34(8): 971-5.
Freeman, C.; Parish, C. R. (1997). "A rapid quantitative assay for the detection of
mammalian heparanase activity." Biochem J. 325 ( Pt 1): 229-37.
Freeman, C.; Parish, C. R. (1998). "Human platelet heparanase: purification,
characterization and catalytic activity”. Biochem J. 330 ( Pt 3): 1341-50.
Friedmann, Y.; I. Vlodavsky; H. Aingorn; A. Aviv; T. Peretz; I. Pecker; O. Pappo
(2000). "Expression of heparanase in normal, dysplastic, and neoplastic human
colonic mucosa and stroma. Evidence for its role in colonic tumorigenesis." Am J
Pathol. 157(4): 1167-75.
Gallagher, J.T. (1989). “ The extended family of proteoglycans: social residents of the
pericellular zone”. Curr Opin Cell Biol. 1(6):1201-1218.
Gambarini, A.G.; Miyamoto, C.A.; Lima, G.A.; Nader, H.B.; Dietrich, C.P. (1993).
"Mitogenic activity of acidic fibroblast growth factor is enhanced by highly sulfated
oligosaccharides derived from heparin and heparan sulfate." Mol Cell Biochem.
124(2): 121-129.
Gingis-Velitski, S.; Zetser A.;Kaplan, V.; Ben-Zaken, O.; Cohen, E.; Levy-Adam, F.;
Bashenko, Y.; Flugelman, M.Y.; Vlodavsky, I.; Ilan, N. (2004). "Heparanase
uptake is mediated by cell membrane heparan sulfate proteoglycans." J Biol
Chem 279(42):44084-44092.
Goldshmidt, O.; Nadav, L.; Aingorn, H.; Irit. C.; Feinstein, N.; Ilan, N.; Zamir. E.;
Geiger. B.; Vlodavsky, I.; Katz, B.Z. (2002). "Human heparanase is localized
within lysosomes in a stable form." Exp Cell Res 281: 50-62.
Goldshmidt, O.; Zcharia, E.; Cohen, M.; Aingorn, H.; Cohen. I.; Nadav. L.; Katz,
B.Z.;Geiger, B.; Vlodavsky, I. (2003). "Heparanase mediates cell adhesion
independent of its enzymatic activity." FASEB Jl 17: 1015-1025.
Goldshmidt, O.; E. Zcharia; R. Abramovitch; S. Metzger; H. Aingorn; Y. Friedmann;
V. Schirrmacher; E. Mitrani; I. Vlodavsky (2002). "Cell surface expression and
secretion of heparanase markedly promote tumor angiogenesis and metastasis”.
Proc Natl Acad Sci USA 99(15): 10031-6.
Haimov-Kochman, R.; Friedmann, Y.; Prus, D.; Goldman-Wohl, D.S.; Greenfield, C.;
Anteby, E.Y.; Aviv, A.; Vlodavsky. I.; Yagel, S. (2002). "Localization of
heparanase in normal and pathological human placenta." Mol Human Repr 8(5):
566-573.
Hill, M.J., Morson, B.C., Bussey, H.J. (1978). “Aetiology of adenoma--carcinoma
sequence in large bowel”. Lancet 1(8058):245-247
Referências Bibliográficas
74
Holash, J., Wiegand, S.J., Yancopoulos, G.D. (1999) - New model of tumor
angiogenesis: Dynamic balance between vessel regression and growth mediated
by angiopoietins and VEGF. Oncogene, 18 (38): 5356-5362.
Hulett, M.D.; Freeman, C.; Hamdorf, B.J.; Baker, R.T.; Harris, M.T.; Parish, C.R.
(1999). "Cloning of mammalian heparanse, an important enzyme in tumor
invasion and metastasis." Nat Med 5(7): 803-809.
Inca (2005). www.inca.br (acessado em Dez/2005).
Inki, P., Jalkanen, M. (1996). “The role of syndecan-1 in malignancies”. Ann Med.
28(1):63-67.
Iozzo, R.V.; San Antonio, J.D. (2001). "Heparan sulfate proteoglycans: heavy hitters
in the angiogenesis arena." J Clin Invest 108: 349-355.
Iozzo, R.V. (1998). "Matrix proteoglycans: from molecular design to cellular
function."Annu Rev Biochem. 67: 609-652.
Irimura, T., Nakajima, M., Nicolson, G.L. (1986). “Chemically modified heparins as
inhibitors of heparan sulfate specifc endo-beta-glucuronidase (heparanase) of
metastatic melanoma cells”. Biochemistry. 25(18):5322-5328.
Kim, A.W.; Xu, X.; Hollinger, E.F.; Gattuso, P.; Godellas, C.V.; Prinz, R.A. (2002).
"Human heparanase-1 gene expression in pancreatic adenocarcinoma." J
Gastroints Sur 6(2): 167-172.
Kjellén, L.; Lindahl, U. (1991). "Proteoglycans: Strutctures and Interactions." Annu.
Rev. Biochem 60: 443-475.
Klein, U..; Von, K. (1976). "Partial purification and characterization of heparan sulfate
specific endoglucuronidase." Biochem Biophys Res Commun. 73(3): 569-576.
Koliopanos, A., Friess, H., Kleeff, J., Shi, X., Liao, O., Pecker, I., Vlodavsky, I.,
Zimmermann, A., Burchler, M.W. (2001). “Heparanase expression im primary and
metastastic pancreatic cancer”. Cancer Research. 61(12):4655-4659.
Kosir, M.A., Wang, W., Zukowiski, K.L., Tromp, G., Barber, J. (1999). “Degradation of
basement membrane by prostate tumor heparanase”. Journal of Surgical
Research. 81 (1): 42-47.
Kussie, P.H.; Hulmes, J.D.; Ludwig, D.L.; Patel, S.; Navarro, E.C.; Seddon, A.P.;
Giorgio, N.A.; Bohlen, P. (1999). "Cloning and functional expression of a human
heparanase gene." Biochem Biophys Res Commun. 261: 183-187.
Liotta, L.A. (1986). "Tumor invasion and metastases: role of the basement
membranes." Warner-Lambert Parke-Davis Award Lecture 117(3): 339-346.
Liotta, L.A.; Rao, C.N. (1984). "Tumor Invasion and Metastasis." Monogr Pathol
27(183-92).
Referências Bibliográficas
75
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, L. S., Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. E.
(2000). Mol Cell Biol.
Lopes, CC. (2004). Transfecção com oncogene EJ-ras afeta adesão, migração, ciclo
celular e expressão do proteoglicano de heparam sulfato (sindecam 4) de células
endoteliais. Bioquímica - Biologia Molecular. São Paulo, UNIFESP: 145.
Matos, L.L.; Stabenow, E.; Tavares, M.R.; Ferraz, A.R.; Capelozzi, V.L.; Pinhal,
M.A.S. (2006). Immunohistochemistry quantification by digital computer-assisted
method compared to semiquantitative analysis. CLINICS [in press].
Maxhimer, J.B.; Pesce, C.E.; Stewart, R.A.; Gattuso, P.; Prinz, R.A.; Xu, X. (2005).
"Ductal carcinoma in situ of the breast and heparanase-1 expression: a molecular
explanation for more aggressive subtypes." J Am Coll Surg 200(3): 328-335.
Maxhimer, J.B.; Quiros, R.M.; Stewart, R.; Dowlatshahi, K.; Gattuso, P.; Fan, M.;
Prinz, R.A.; Xu, X. (2002). "Heparanase-1 expression is associated with the
metastatic potential of breast cancer." Surgery 132: 326-333.
McKenzie, E; Tyson, K.; Stamps, A.; Smith, P.; Turner, P.; Barry, R.; Hircock, M.;
Patel, S.; Barry, E.; Stubberfield, C.; Terrett, J.; Page, M. (2000). "Cloning and
expression profiling of Hpa2, a novel Mammalial heparanase family member."
Biochem Biophys Res Commun. 276(3):1170-7.
Medeiros, G.F.; Mendes, A.; Castro, R.A.; Baú, E.C.; Nader, H.B.; Dietrich, C.P.
(2000). "Distribution of sulfated glycosaminoglycans in the animal kingdom:
widespread occurrence of heparin-like compounds in invertebrates." Biochim
Biophys Acta. 1475(3): 287-294.
Nader, H.B.; Chavante, S.F.; dos-Santos, E.A.; Oliveira, T.W.; de-Paiva, J.F.;
Jerônimo, S.M.; Medeiros, G.F.; de-Abreu, L.R., Leite, E.L.; de-Sousa-Filho JF,
Castro, R.A.; Toma, L.; Tersariol, I.L.; Porcionatto, M.A.; Dietrich, C.P. (1999).
"Heparan sulfates and heparins: similar compounds performing the same
functions in vertebrates and invertebrates?" Braz J Med Biol Res 32(5): 529-38.
Nader, H.B.; Oliveira, F.W.; Jerônimo, S.M.; Chavante, S.F.; Sampaio, L.O.; Dietrich,
C.P. (1996). "Synchronized order of appearance of hyaluronic acid (or acidic
galactan) --> chondroitin C-6 sulfate --> chondroitin C-4/C-6 sulfate, heparan
sulfate, dermatan sulfate --> heparin during morphogenesis, differentiation and
development." Braz J Med Biol Res 29(9): 1221-1226.
Nader, HB.; Dietrich, C.P. (1989). “Natural occurrence and possible biological role of
heparin. Heparin: chemical and biological properties”. D. A. L. U. Lindahl. London,
Edward Arnold Ltda.
Nobuhisa, T.; Naomoto, Y.; Ohkawa, T.; Takaoka, M.; Ono, R.; Murata, T.; Gunduz,
M.; Shirakawa, Y.; Yamatsuji, T.; Haisa, M.; Matsuoka, J.; Tsujigiwa, H.;
Nagatsuka, H.; Nakajima, M.; Tanaka, N. (2005). "Heparanase expression
correlates with malignant potential in human colon cancer." Journal of Cancer
Research and Clinical Oncology. 131: 229-237.
Referências Bibliográficas
76
Novak, E.M.; Metzger, M.; Chammas, R.; Da Costa, M.; Dantas, K.; Manabe, C. et.
al. (2003) - Downregulation of TNF-alpha and VEGF expression by Sp1 decoy
oligodeoxynucleotides in mouse melanoma tumor. Gene. 10 (23): 1992-7
Nurcomb, V., Smart, C.E., Chipperfield, H., Cool, S.M., Boilly, B., Hondermarck, H.
(2000). “The proliferative and migratory activies of breast cancer cells can be
differentially regulated by heparan sulfates”. The Journal of Biological
Chemistry. 275(39):30009-30018.
Park, D.M. (2000) “Global cancer statistics in the year”. Lancet Oncol. 2(9):533-43
PARK, E. B., Emmons, K.M., Malloy, N.W., Seifer, E., (2002). “A qualitative
exploration of health perceptions and behaviors among adult survivors of
childhood cancers.” J Cancer Educ. 17(4):211-5
Pikas, D. S., Eriksson, I., Kjellen, L. (2000). “Overexpression of different isoforms of
glucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase results in distinct heparan sulfate
n-sulfation patterns” Biochemistry. 39: 4552–4558.
Pinhal, M.A.S., Silva I.F., Dietrich, C.P., Nader, H.B. (1994) “Binding of heparin and
compound to endothelial cells for stimulation of the synthesis of na antithrombotic
heparan sulfate proteoglycan. Braz J Med Biol Res. 27 (9): 2191-2195.
Pinho, M. (2000). “Marcadores Tumorais em Câncer Colorretal”. Fundação Antônio
Prudente.(4):87
Poole, A.R. (1987). "Proteoglycans in health and disease: structures and functions."
Biochem J. (236): 1.
Porcionatto, M.A.; Nader, H.B.; Dietrich, C.P. (1999). "Heparan sulfate and cell
division." Braz J Med Biol Res 32: 539-544.
Porcionatto, M.A.; Pinto, C.R.; Dietrich, C.P.; Nader, H.B. (1994). "Heparan sulfate
proteoglycan and control of cell proliferation: enhanced synthesis induced by
phorbol ester (PMA) during G(1)-phase." Braz J Med Biol Res 27: 2185-2190.
Rapraeger, A.C. (1993). “The coordinated regulation of heparan sulfate, syndecans
and cell behavior”. Curr Opin Cell Biol. 5(5):844-53.
Reiland, J.; Sanderson, R.D.; Waguespack, M.; Barker, S.A.; Long, R.; Carson, D.D.;
Marchetti, D. (2004). "Heparanase degrades Syndecan-1 and Perlecan Heparan
Sulfate." J Biol Chem 279(9): 8047-8055.
Robbins, S.L., Cotran, R.S., Kumar, V. (1998). “Pathologic basis of disease”.
Philadelphia: W.B. Saunders. 6 th ed
Rosenberg RD, Schworak NW, Lui J, Schwartz JJ, Zhang L: Heparan sulfate
proteoglycans of the cardiovascular system. Specific structures emerge but how
is synthesis regulated ? J. Clin. Invest., 99:2062-2070, 1997.
Referências Bibliográficas
77
Rossi, B.M., Nakagawa, W.T., Ferreira, F.O., Junior, S.A., Lopes, I (2005) - Câncer
de Cólon, Reto e Ânus, Livraria Editora Marina & TecMedd.
Salmivirta, M., Jalkanen, M. (1995). “Syndecan family of cell surface proteoglycans:
developmentally regulated receptors for extracellular effector molecules”.
Experientia 51(9-10): 863-872.
Sanderson, R.D, (2001). "Heparan sulfate proteoglycans in invasion and metastasis."
Dev Biol 12: 89-98.
Scott, J.E. (2001). "Structure and function in extracellular matrices depend o
interactions between anionic glycosaminoglycans." Pathol. Biol 49: 284-289.
Simizu, S.; K. Ishida; H. Osada (2004). "Heparanase as a molecular target of cancer
chemotherapy." Cancer Sci 95(7): 553-8.
Simizu, S.; K. Ishida; MK. Wierzba; H. Osada (2004). "Secretion of heparanase
protein is regulated by glycosylation in human tumor cell lines." J Biol Chem
279(4): 2697-2703.
Sloane, B.F., Moin, K., Sameni, M., Tait, L.R., Rozhin, J., Ziegler, G. (1994).
“Membrane association of cathepsin B can be induced by transfection of human
of reast epithelial cells with c-Ka-ras oncogene”. J Cell Sci. 107(2):373-384.
Staquicini, F.I., Moreira, C.R., Nascimento, F.D., Tersariol, I.L., Nader, H.B., Dietrich,
C.P., Lopes, J.D. (2003). “ Enzyne and integrin expression by high and low
metastatic cell lines”. Melanoma Res. 13(1):11-18.
Tang, W., Nakamura, Y., Tsujimoto, M., Sato, M., Wang, X., Kurozumi, K., Nakahara,
M., Nakao, K., Nakamura, M., Mori, I., Kakudo, K. (2002). "Heparanase: a key
enzyme in invasion and metastasis of gastric carcinoma." Mod pathol 15(6): 593-
598.
Toma, L., Berninsone, P., Hirschberg, C.B. (1998). “The putative heparin-specific N-
acetylglucosaminyl N-Deacetylase/N-sulfotransferase also occurs in non-heparin-
producing cells”. J Biol Chem. 273(35):22458-22465.
Toyoshima, M., Nakajima, M., (1999). "Human Heparanase: purification,
characterization, cloning and expression." J Biol Chem 274(34): 24153-24160.
Tryggvason, K., Hoyhtya, M., Salo, T. (1987). "Proteolytic degradation of extracellular
matrix in tumor invasion." Biochim Biophys Acta. 907(3): 191-217.
Tu, Y., Huang, Y., Zhang, Y., Wu, C.A. (2001). “A new focal adhesion protein that
interacts with integrin-linked kinase and regulated cell adesion and spreading”.
The Journal Cell Biology 153 (3): 585-589.
Referências Bibliográficas
78
Vlodasky, I., Friedmann, Y., Elkin, M.; Aingorn, H., Atzmon, R., Ishai-Michaeli, R.,
Bitan, M., Pappo, O., Peretz, T., Michal, I., Spector, L., Pecker, I. (1999).
"Mammalian heparanase: gene cloning, expression and function in tumor
progression and metastasis." Nat Med 5(7): 793-802.
Vlodavsky, I., Elkin, M., Pappo, O., Aingora, H., Atzmon, R., Ishai-Michaeli, R., Avi,
A., Pecker, I., Friedman, Y. (2000). “Mammalian heparanase as mediator of tumor
metastasis and angiogenesis”. Isr Med Assoc J (2): 37-45.
Vlodavsky, I., Friedman, Y. (2001). “Molecular properties and involvement of
heparanase in cancer metastasis and angiogenesis”. The Journal of Clinical
Investigation. 108(3):341-347.
Vlodasky, I.; Goldshmidt, O.; Zcharia, E.; Atzmon, R.; Rangini-Guatta, Z.; Elkin, M.;
Peretz, T.; Friedmann, Y. (2002). "Mammalian heparanase: involvement in cancer
metastasis, angiogenesis and normal development." Cancer Biol 12: 121-129.
Vlodavsky, I., Korner, G., Ishai-Michaeli, R., Bashkin, P., Bar-Shavit, R., Fuks, Z.
(1990). "Extracellular matrix-resident growth factors and enzymes: possible
minvolvement in tumor metastasis and angiogenesis." Cancer Metastasis Rev.
9(3): 203-226.
Watanabe, M.; Aoki, Y.; Kase, H.; Tanaka, K. (2003). "Heparanase expression and
angiogenesis in endometrial cancer." Gynecol and obst invest 56(2): 77-82.
Waterman, T.A., Hagen, J.A., Peters, J.H., DeMeester, S.R., Taylors, C.R.,
DeMeester, T.R. (2004). “The prognostic importance of immunohistochemically
detected node metastasis in resected esophageal adenocarcinoma”. Ann Thorac
Surg. 78 (4):1161-1169.
Wielenga, V.J.M., Van Der Voort, R., Taher, E.I.T., Smit, T., Beuling, B., Krimpen, C.,
Spaargaren, M., and Pals, S.T. “Expression of c-Met and heparan sulfate
proteoglycan forms of CD44 colorectal cancer”. American Journal of Pathology
(2000); 157 (5): 1563-1573.
Whitelock, J.M., Murdoch, A.D., Iozzo, R.V., Underwood, P.A. (1996). “The
degradation of human endothelial cell-derived perlecan and release of bound
fibroblast growth factor by stromelysin, collagenase, plasmin, and heparanases”.
The Journal of Biological Chemistry. 271(17):10079-10086.
www.pathologyatlas.ro/ Colon%20Cancer.html (acessado em Mai/2006)
www.ncl.ac.uk/ihg/ research/molecular/cancer/ (acessado em Mai/2006)
www.snfge.asso.fr/.../ faq/colon_cancer.htm (acessado em Mai/2006)
http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/proteoglycan/PGA02E.html (acessado em
Mai/2006)
Referências Bibliográficas
79
Yamada, K.M. (1991). “Fibronectin and other cell interactive glycoproteins”. Cell
biology of extracellular matrix. Hay ED. New York, Plenum Press: 111-146.
Yurchenco, P.D.; Schittny, J.C. (1990). "Molecular architecture of basement
membranes." FASEB J 4(6): 1577-1590.
Zcharia, E.; Metzger, S.; Chajek-Shaul, T.; Friedmann, Y.; Pappo, O.; Aviv,A.;
Elkin,M.; Pecker, I.; Peretz, T.; Vlodavsky, I. (2001). "Molecular properties and
involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland
morphogenesis." J Mammary Gland Biol Neoplasia 6(3): 311-22.
Zcharia, E.; Metzger, S.; Chajek-Shaul, T.; Aingorn, H.; Elkin, M.; Friedmann, Y.;
Weinstein, T.; Li, J.P.; Lindahl, U.; Vlodavsky, I. (2004). "Transgenic expression of
mammalian heparanase uncovers physiological functions of heparan sulfate in
tissue morphogenesis, vascularization, and feeding behavior." FASEB J 18: 252-
263.
Zcharia, E.; Metzger, S.; Chajek-Shaul, T.; Aingorn, H., Elkin, M., Friedmann, Y.;
Weinstein, T., Li, J., Lindahl, U., Vlodavsky, I. (2004). "Transgenic expression of
mammalian heparanase uncovers physiological function of heparan sulfate in
tissue morphogenesis, vascularization and feeling behavior." The Journal
FASEB 18(2): 252-263.
Zhang, Y.L., Fu, Z.R., Zhang, J., Shen, Y.H. (2003). “Inhibition of invasiveness of
human mammary carcinoma cell line MDA435 by heparanase antisense
oligonucleotide”. ZhonghuaYi Xue Za Zhi. 83(3):204-207.
Zhao, T., Newman, P.J. (2001) “Integrin activation regulated dimerization of
heparanase to angiogenesis and prognosis of breast cancer”. Chinese journal of
Cancer. 23 (11): 1342-1345.
Zhen-Zhen, L., Heng-Wei, Z., Bing, W., Shu-De, C. (2004). “Correlation of expression
heparanase to angiogenesis and prognosis of breast cancer”. (2004). Chinese
journal of Cancer. 23(11):1342-1345.
Zetser, A.; Levy-Adam, F.; Kaplan, V.; Gingis-Velitski, S.; Bashenko, Y.; Schubert, S.;
Flugelman, M.Y.; Vlodavsky, I.; Ilan, N. (2004). "Processing and activation of
latent heparanase occurs in lysosomes." J Cell Sci 117(11): 2249-2258.
Anexos
Anexos
80
Anexo
TABELA A I: MEDIDAS DOS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE HEPARANASE E
SINDECAM-1 PARA CADA INDIVÍDUO (COM CARCINOMA COLORRETAL E SEM
NEOPLASIA*).
Tumor
HEPARANASE SINDECAM-1
n IP (%) ItE (u.o./µm
2
)
IE (u.o./µm
2
) IP (%) ItE (u.o./µm
2
)
IE (u.o./µm
2
)
1
65,63 141,60 92,90 0,00 0,00 0,00
2
88,14 245,80 216,60 66,64 62,20 41,40
3
87,40 195,50 170,80 90,19 82,70 74,60
4
74,95 160,70 120,40 42,61 51,80 22,10
5
75,67 162,00 122,50 92,89 61,00 56,70
6
21,74 120,50 26,20 62,50 44,30 27,70
7
68,26 169,60 115,70 96,50 75,30 72,60
8
73,00 173,40 126,60 73,12 41,50 30,30
9
71,55 168,70 120,70 86,62 62,00 53,70
10
73,25 163,10 119,50 93,86 63,40 59,50
11
83,68 173,90 145,50 96,65 51,90 50,10
12
65,28 182,22 120,00 69,53 60,90 42,30
13
70,75 194,30 137,50 91,86 60,80 55,80
14
46,93 168,30 79,00 70,23 72,20 50,70
15
72,20 176,60 127,50 87,73 38,00 33,30
16
69,65 163,70 114,00 96,06 64,30 61,70
17
75,63 187,80 142,00 84,67 61,30 51,90
18
87,58 167,10 146,40 86,75 63,90 55,50
19
67,11 171,10 114,80 79,35 78,30 62,10
20
77,88 143,60 111,90 29,24 68,40 20,00
21
81,00 173,20 140,30 88,76 52,70 46,80
22
85,67 175,50 150,30 95,96 39,20 37,60
23
68,54 167,20 114,60 7,77 42,90 3,30
24
77,47 163,60 126,80 86,46 54,40 47,10
25
77,65 157,30 122,10 78,52 66,20 52,00
26
79,53 171,80 136,60 90,63 51,00 46,20
27
83,45 162,70 135,80 80,35 40,20 32,30
28
83,15 151,90 126,30 97,50 47,50 46,30
29
81,87 162,80 133,30 74,24 64,20 47,70
30
87,25 152,80 139,40 95,84 65,10 62,40
31
78,70 159,30 125,30 74,24 64,20 47,70
32
81,96 160,80 131,80 90,84 56,60 51,40
33
85,21 164,80 140,40 87,01 61,50 53,50
34
87,77 164,80 144,60 69,47 69,60 48,40
35
85,24 177,60 151,40 29,75 61,10 18,20
36
82,42 178,40 157,70 32,23 89,80 28,90
37
86,21 164,00 141,40 9,08 76,40 6,90
38
76,61 152,00 116,40 33,52 70,20 23,50
39
88,26 159,60 140,80 92,76 62,50 58,00
40
78,98 180,80 142,80 54,47 48,50 26,40
41
78,09 176,10 137,50 82,58 43,00 35,50
42
82,94 167,40 138,80 25,90 60,80 15,70
43
86,90 170,20 147,90 32,44 58,40 18,90
44
80,34 162,60 130,60 27,50 78,80 21,70
45
80,15 167,50 134,20 39,72 62,50 24,80
46
80,49 176,10 141,80 58,86 49,10 28,90
47
79,42 175,40 139,30 50,13 73,60 36,90
48
80,15 181,00 145,10 30,17 72,20 21,80
49
81,33 164,40 133,70 50,52 64,20 32,40
50
78,95 150,30 118,50 20,56 69,10 14,20
Anexos
81
TABELA A I: MEDIDAS DOS ÍNDICES IMUNOHISTOQUÍMICOS DE HEPARANASE E
SINDECAM PARA CADA INDIVÍDUO (COM CARCINOMA COLORRETAL E SEM
NEOPLASIA*). (CONT).
Normais*
HEPARANASE SINDECAM
n IP (%) ItE (u.o./µm
2
)
IE (u.o./µm
2
) IP (%) ItE (u.o./µm
2
)
IE (u.o./µm
2
)
1
44,41 100,90 44,80 80,98 146,70 118,80
2
34,84 99,30 34,60 82,70 146,10 120,80
3
32,40 98,70 32,00 86,68 121,60 100,50
4
36,82 92,40 34,00 73,10 112,00 81,90
5
34,08 75,90 25,90 80,21 109,80 88,10
6
44,96 96,90 43,60 85,84 117,60 101,00
7
1,97 75,50 1,50 67,81 112,30 76,10
8
9,72 95,10 9,20 75,57 96,40 72,90
9
26,49 105,40 27,90 76,90 99,90 76,80
10
48,46 87,80 42,60 62,56 98,80 61,80
11
32,55 113,50 36,90 88,99 106,30 94,60
12
36,66 97,00 35,60 94,73 145,70 138,10
13
17,80 88,50 15,80 96,04 98,10 94,20
14
26,70 87,40 23,30 91,31 92,60 84,50
15
34,71 94,10 32,60 100,00 149,50 149,50
16
29,61 81,70 24,20 100,00 154,80 154,80
17
10,65 91,40 9,70 99,30 122,70 121,90
18
40,63 87,00 35,30 95,40 118,00 112,50
19
35,40 92,60 32,80 93,23 116,30 108,50
20
22,65 67,40 15,30 100,00 87,20 87,20
Normais= indivíduos sem neoplasia; n= número de indivíduos; IP= índice de positividade; ItE=
intensidade de expressão; IE= índice de expressão.
Anexos
82
TABELA AII: DADOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS 50 ESPÉCIMES
DE TUMORES COLORRETAIS.
n Idade
Sexo Local Tipo
Histológico
Grau de
Diferenciação
Aspecto
Macroscópico
Invasão da
Serosa
1 68 M Reto Outro Moderado Ulcerado Sim
2 67 M Reto Adenoc Bem
Vegetante Sim
3 58 M Reto Adenoc Bem
Infiltrativo Sim
4 73 F Reto Outro Bem
Ulcerado Sim
5 82 F Reto Outro Moderado Ulcerado Sim
6 48 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
7 80 M Reto Outro Moderado Infiltrativo Não
8 80 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
9 70 F Colo Adenoc Bem
Infiltrativo Não
10 49 M Reto Adenoc Moderado Ulcerado Não
11 65 M Reto Adenoc Moderado Vegetante Não
12 65 F Colo Adenoc Bem
Vegetante Não
13 70 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
14 38 M Colo Adenoc Moderado Vegetante Sim
15 47 M Reto Adenoc Bem
Vegetante Sim
16 49 F Colo Adenoc Moderado Infiltrativo Não
17 64 F Reto Adenoc Bem
Infiltrativo Sim
18 76 F Colo Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
19 54 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
20 66 M Reto Adenoc Bem
Infiltrativo Sim
21 75 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
22 65 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
23 28 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
24 68 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
25 73 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
26 73 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
27 86 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
28 43 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
29 71 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
30 61 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
31 50 M Reto Outro Moderado Infiltrativo Sim
32 46 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
33 44 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
34 57 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
35 79 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
36 77 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
37 80 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
38 61 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
39 73 F Reto Outro Moderado Infiltrativo Sim
40 59 F Colo Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
41 63 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
42 31 F Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
43 79 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
44 55 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
45 65 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
46 64 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
47 61 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
48 64 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
49 69 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Sim
50 78 M Reto Adenoc Moderado Infiltrativo Não
Anexos
83
TABELA AII: DADOS CLÍNICOS E PATOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS 50 ESPÉCIMES
DE TUMORES COLORRETAIS (CONT).
n Invasão
Angiolinfática
Metástase
Linfonodal
Invasão Perineural
Estádio
1 Não Sim Não Tardio
2 Sim Sim Sim Tardio
3 Não Não Não Inicial
4 Não Sim Não Tardio
5 Não Não Não Inicial
6 Não Sim Não Tardio
7 Não Sim Não Tardio
8 Sim Sim Não Tardio
9 Sim Sim Sim Tardio
10 Sim Sim Sim Tardio
11 Não Não Não Inicial
12 Sim Não Sim Inicial
13 Não Não Não Inicial
14 Não Sim Não Tardio
15 Não Sim Não Tardio
16 Não Não Não Inicial
17 Sim Sim Não Tardio
18 Não Não Não Inicial
19 Não Não Não Inicial
20 Sim Sim Sim Tardio
21 Não Sim Não Tardio
22 Não Não Não Inicial
23 Não Não Não Inicial
24 Não Sim Não Tardio
25 Não Não Não Inicial
26 Sim Não Sim Inicial
27 Não Sim Não Tardio
28 Sim Sim Não Tardio
29 Sim Sim Não Tardio
30 Não Não Não Inicial
31 Sim Sim Não Tardio
32 Não Não Não Inicial
33 Sim Sim Sim Tardio
34 Não Não Não Inicial
35 Não Não Não Inicial
36 Sim Sim Não Tardio
37 Sim Sim Não Tardio
38 Sim Sim Sim Tardio
39 Sim Sim Sim Tardio
40 Não Não Não Inicial
41 Sim Sim Sim Tardio
42 Sim Sim Sim Tardio
43 Não Não Não Inicial
44 Sim Sim Sim Tardio
45 Sim Sim Sim Tardio
46 Não Sim Não Inicial
47 Não Não Não Inicial
48 Sim Sim Sim Tardio
49 Não Não Não Inicial
50 Sim Sim Sim Tardio
n= número de índivíduos
Anexos
84
TABELA AIII. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA AS VARIÁVEIS EM PACIENTES SEM
NEOPLASIA* (NORMAL*) E COM O TUMOR.
Normal*
(n=20)
Tumor
(n=50)
IP Heparanase (%)
Média 30,08 77,24
Desvio Padrão 12,31 11,14
Mínimo 1,97 21,74
Mediana 33,32 79,48
Máximo 48,46 88,26
ItE Heparanase
(u.o./µm
2
)
Média 91,43 168,43
Desvio Padrão 10,75 17,06
Mínimo 67,40 120,50
Mediana 92,50 167,30
Máximo 113,50 245,80
IE Heparanase
(u.o./µm
2
)
Média 27,88 131,12
Desvio Padrão 12,16 24,87
Mínimo 1,50 26,20
Mediana 32,30 133,95
Máximo 44,80 216,60
IP Sindecam (%)
Média 86,37 65,70
Desvio Padrão 11,32 28,46
Mínimo 62,56 0,00
Mediana 87,42 74,24
Máximo 100,00 97,50
ItE Sindecam (u.o./µm
2
)
Média 117,62 59,59
Desvio Padrão 20,76 14,58
Mínimo 87,20 0,00
Mediana 114,30 61,75
Máximo 154,80 89,80
IE Sindecam (u.o./µm
2
)
Média 102,23 39,15
Desvio Padrão 25,69 17,79
Mínimo 61,80 0,00
Mediana 97,55 41,85
Máximo 154,80 74,60
Anexos
85
Figura A1. Box-plot para o IP (%) Heparanase. Figura A2. Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo o sexo
TumorNormal
100
80
60
40
20
0
IP Heparanase (%)
TumorNormal
100
80
60
40
20
0
IP Heparanase (%)
FemininoMasculino
Sexo
Figura A3. Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase.
Figura A4. Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo o sexo
TumorNormal
250
200
150
100
50
ItE Heparanase
TumorNormal
250
200
150
100
50
ItE Heparanase
FemininoMasculino
Sexo
Figura A5. Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase.
Figura A6. Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo o sexo
TumorNormal
250
200
150
100
50
0
IE Heparanase
TumorNormal
250
200
150
100
50
0
IE Heparanase
FemininoMasculino
Sexo
Anexos
86
Figura A7. Box-plot para o IP (%) Sindecam. Figura A8. Box-plot para o IP (%) Sindecam,
segundo o sexo
TumorNormal
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
TumorNormal
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
FemininoMasculino
Sexo
Figura A9. Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam.
Figura A10 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam, segundo o sexo
TumorNormal
150
100
50
0
ItE Sindecam
TumorNormal
150
100
50
0
ItE Sindecam
FemininoMasculino
Sexo
Figura A11 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam.
Figura A12 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam, segundo o sexo.
TumorNormal
150
100
50
0
IE Sindecam
TumorNormal
150
100
50
0
IE Sindecam
FemininoMasculino
Sexo
Anexos
87
TABELA A IV. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DA
HEPARANASE (IP%) DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL.
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo n
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 75.8 13.1 21,7 79,0 88,1 31
0.24
Feminino 79.6 6.6 65,3 81,9 88,3 19
Localização do Tumor
Reto 79.4 6.0 65.6 80.2 88.3 44
0.13
Colo 61.7 23.9 21.7 67.5 87.6 6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 77.7 11.4 21.7 80.2 88.1 44
0.35
Outro 73.6 9.0 65.3 72.0 88.3 6
Grau de diferenciação
Bem 76.6 7.8 65.3 75.3 88.1 8
0.87
Moderado 77.4 11.7 21.7 80.2 88.3 42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 67.4 15.5 46.9 69.4 83.7 4
0.71
Infiltrativo 78.5 10.7 21.7 80.2 88.3 41
Vegetante 75.1 8.1 65.3 75.0 87.6 5
Invasão da serosa
Não 78.2 8.1 65.3 79.0 87.8 15
0.69
Sim 76.8 12.3 21.7 80.2 88.3 35
Invasão angiolinfática
Ausente 75.5 13.9 21.7 79.2 87.8 28
0.19
Presente 79.4 5.5 65.3 79.8 88.3 22
Invasão perineural
Ausente 76.4 12.7 21.7 79.4 87.8 35
0.45
Presente 79.1 6.1 65.3 79.5 88.3 15
Estadiamento
Inicial 76.1 12.7 21.7 79.0 88.1 29
0.42
Tardio 78.7 8.5 46.9 80.2 88.3 21
Metástase linfonodal
Não 76.5 12.7 21.7 79.2 88.1 30
0.57
Sim 78.3 8.5 46.9 79.8 88.3 20
Anexos
88
Figura A13 Box-plot para o IP (%) Heparanase
segundo o sexo, em pacientes com tumor
colorretal .
Figura A14 Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo a localização do tumor, em pacientes
com tumor colorretal.
FemininoMasculino
Sexo
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
coloreto
Localização do tumor
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
Figura A15 Box-plot para o IP (%) Heparanase
segundo o tipo histológico, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A16 Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo o grau de diferenciação, em pacientes
com tumor colorretal.
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
moderadobem
Grau de diferenciação
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
Figura A17 Box-plot para o IP (%)Heparanase
segundo o aspecto macroscópico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A18 Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo a invasão da parede (serosa), em
pacientes com tumor colorretal.
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
Anexos
89
Figura A19 Box-plot para o IP (%) Heparanase
segundo a invasão angiolinfática, em pacientes
com tumor colorretal .
Figura A20 Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo a invasão perineural, em pacientes
com tumor colorretal.
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
PresenteAusente
Invasão perineural
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
Figura A21 Box-plot para o IP (%) Heparanase
segundo o estadiamento, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A22 Box-plot para o IP (%) Heparanase,
segundo a metástase linfonodal, em pacientes
com tumor colorretal.
TardioInicial
Estadiamento
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
SimNão
Metástase linfonodal
90
80
70
60
50
40
30
20
IP Heparanase (%)
Anexos
90
TABELA A V. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE
(ITE=u.o./µm
2
) DE
ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo N
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 169.0
20.5
120.5
168.3
245.8
31
0.76
Feminino 167.5
9.6
151.9
164.8
187.8
19
Localização do Tumor
Reto 169.1
16.4
141.6
167.3
245.8
44
0.48
Colo 163.8
22.5
120.5
167.7
182.2
6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 169.3
17.5
120.5
167.5
245.8
44
0.40
Outro 162.4
13.4
141.6
160.8
182.2
6
Grau de diferenciação
Bem 182.6
30.3
143.6
179.4
245.8
8
0.16
Moderado 165.7
12.0
120.5
166.0
194.3
42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 161.7
14.1
141.6
165.7
173.9
4
0.13
Infiltrativo 168.9
18.1
120.5
167.4
245.8
41
Vegetante 169.7
9.4
160.7
167.1
182.2
5
Invasão da serosa
Não 169.7
11.1
152.8
167.2
195.5
15
0.74
Sim 167.9
19.2
120.5
167.4
245.8
35
Invasão angiolinfática
Ausente 167.4
14.3
120.5
167.8
195.5
28
0.63
Presente 169.7
20.3
143.6
166.1
245.8
22
Invasão perineural
Ausente 167.6
13.8
120.5
167.2
195.5
35
0.59
Presente 170.4
23.5
143.6
167.4
245.8
15
Estadiamento
Inicial 170.2
20.4
120.5
167.2
245.8
29
0.39
Tardio 165.9
10.9
143.6
167.4
187.8
21
Metástase linfonodal
Não 170.2
20.0
120.5
168.4
245.8
30
0.36
Sim 165.7
11.2
143.6
166.1
187.8
20
Anexos
91
Figura A23 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o sexo, em pacientes
com tumor colorretal .
Figura A24 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a localização do tumor,
em pacientes com tumor colorretal.
FemininoMasculino
Sexo
250
200
150
100
50
ItE Heparanase
ColoReto
Localização do Tumor
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
Figura A25 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o tipo histológico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A26 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo o grau de diferenciação,
em pacientes com tumor colorretal.
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
ModeradoBem
Grau de diferenciação
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
Figura A27 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o aspecto macroscópico,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A28 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a invasão da parede
(serosa), em pacientes com tumor colorretal.
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
Anexos
92
Figura A29 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo a invasão angiolinfática,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A30 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a invasão perineural, em
pacientes com tumor colorretal.
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
PresenteAusente
Invasão perineural
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
Figura A31 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o estadiamento, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A32 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo metástase linfonodal,
em pacientes com tumor colorretal.
TardioInicial
Estadiamento
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
SimNão
Metástase linfonodal
260
240
220
200
180
160
140
120
ItE Heparanase
Anexos
93
TABELA A VI. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE
(IE=u.o./µm
2
) DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS
EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
.
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo N
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 129.4
30.4
26.2
131.8
216.6
31
0.45
Feminino 134.0
11.2
114.0
136.6
157.7
19
Localização do Tumor
Reto 134.7
18.8
92.9
135.0
216.6
44
0.17
Colo 104.7
45.5
26.2
117.0
146.4
6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 132.7
25.6
26.2
136.2
216.6
44
0.23
Outro 119.5
15.6
92.9
121.3
140.8
6
Grau de diferenciação
Bem 141.2
35.7
111.9
124.1
216.6
8
0.21
Moderado 129.2
22.3
26.2
135.0
157.7
42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 109.2
29.4
79.0
106.2
145.5
4
0.93
Infiltrativo 133.7
25.0
26.2
136.6
216.6
41
Vegetante 127.4
11.1
120.0
122.5
146.4
5
Invasão da serosa
Não 133.1
16.4
114.6
131.8
170.8
15
0.72
Sim 130.3
27.9
26.2
134.2
216.6
35
Invasão angiolinfática
Ausente 127.7
27.2
26.2
134.8
170.8
28
0.28
Presente 135.5
21.3
111.9
133.8
216.6
22
Invasão perineural
Ausente 129.4
25.0
26.2
133.7
170.8
35
0.45
Presente 135.2
24.9
111.9
134.2
216.6
15
Estadiamento
Inicial 131.2
29.8
26.2
133.7
216.6
29
0.98
Tardio 131.0
16.4
79.0
134.2
157.7
21
Metástase linfonodal
Não 131.7
29.5
26.2
134.8
216.6
30
0.83
Sim 130.2
16.3
79.0
133.8
157.7
20
Anexos
94
Figura A33 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o sexo, em pacientes
com tumor colorretal .
Figura A34 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a localização do tumor,
em pacientes com tumor colorretal.
FemininoMasculino
Sexo
250
200
150
100
50
0
IE Heparanase
ColoReto
Localização do Tumor
200
150
100
50
IE Heparanase
Figura A35 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o tipo histológico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A36 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo o grau de diferenciação,
em pacientes com tumor colorretal.
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
200
150
100
50
IE Heparanase
ModeradoBem
Grau de diferenciação
200
150
100
50
IE Heparanase
Figura A37 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o aspecto macroscópico,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A38 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a invasão da parede
(serosa), em pacientes com tumor colorretal.
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
200
150
100
50
IE Heparanase
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
200
150
100
50
IE Heparanase
Anexos
95
Figura A39 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo a invasão angiolinfática,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A40 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo a invasão perineural, em
pacientes com tumor colorretal.
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
200
150
100
50
IE Heparanase
PresenteAusente
Invasão perineural
200
150
100
50
IE Heparanase
Figura A41 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase segundo o estadiamento, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A42 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Heparanase, segundo metástase linfonodal,
em pacientes com tumor colorretal.
TardioInicial
Estadiamento
200
150
100
50
IE Heparanase
SimNão
Metástase linfonodal
200
150
100
50
IE Heparanase
Anexos
96
TABELA A VII. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE DO
SINDECAM (IP%) DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL.
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo N
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 61.7
29.2
0.0
69.5
96.7
31
0.21
Feminino 72.2
26.6
9.1
84.7
97.5
19
Localização do Tumor
Reto 64.7
29.8
0.0
76.4
97.5
44
0.29
Colo 73.3
15.5
54.5
69.9
96.1
6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 65.0
27.6
7.8
73.7
97.5
44
0.63
Outro 71.0
36.5
0.0
83.5
96.5
6
Grau de diferenciação
Bem 69.7
22.8
29.2
77.1
90.2
8
0.67
Moderado 64.9
29.6
0.0
74.2
97.5
42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 65.2
45.0
0.0
82.0
96.7
4
0.57
Infiltrativo 64.5
28.0
7.8
74.2
97.5
41
Vegetante 75.9
20.6
42.6
86.8
92.9
5
Invasão da serosa
Não 69.0
26.8
7.8
78.5
96.5
15
0.59
Sim 64.3
29.4
0.0
74.2
97.5
35
Invasão angiolinfática
Ausente 70.1
27.6
0.0
79.9
96.7
28
0.22
Presente 60.1
29.2
9.1
71.3
97.5
22
Invasão perineural
Ausente 68.8
28.0
0.0
78.5
97.5
35
0.24
Presente 58.4
29.2
20.6
66.6
93.9
15
Estadiamento
Inicial 71.6
26.3
0.0
79.4
96.7
29
0.09
Tardio 57.6
30.0
9.1
70.2
97.5
21
Metástase linfonodal
Não 70.3
26.8
0.0
78.9
96.7
30
0.16
Sim 58.8
30.2
9.1
72.2
97.5
20
Anexos
97
Figura A43. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo o sexo, em pacientes com tumor
colorretal .
Figura A44 Box-plot para o IP(%) Sindecam
segundo a localização do tumor, em pacientes
com tumor colorretal .
FemininoMasculino
Sexo
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
ColoReto
Localização do Tumor
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
Figura A45. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo o tipo histológico, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A46. Box-plot para o IP(%) Sindecam
segundo o grau de diferenciação, em pacientes
com tumor colorretal .
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
ModeradoBem
Grau de diferenciação
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
Figura A47. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo o aspecto macroscópico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A48. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo invasão da parede (serosa), em
pacientes com tumor colorretal .
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
Anexos
98
Figura A49. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo a invasão angiolinfática, em pacientes
com tumor colorretal .
Figura A50. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo a invasão perineural, em pacientes
com tumor colorretal .
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
PresenteAusente
Invasão perineural
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
Figura A51. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo o estadiamento, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A52. Box-plot para o IP (%) Sindecam
segundo a metástase linfonodal, em pacientes
com tumor colorretal .
TardioInicial
Estadiamento
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
SimNão
Metástase linfonodal
100
80
60
40
20
0
IP Sindecam (%)
Anexos
99
TABELA A VIII. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA A INTENSIDADE DE EXPRESSÃO DO
SINDECAM
(ITE=u.o./µm
2
)
DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL.
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo N
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 59.5
16.3
0.0
62.5
82.7
31
0.97
Feminino 59.7
11.6
40.2
61.3
89.8
19
Localização do Tumor
Reto 59.7
15.1
0.0
61.8
89.8
44
0.91
Colo 59.0
10.5
44.3
62.4
72.2
6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 60.4
12.3
38.0
61.8
89.8
44
0.59
Outro 54.0
27.0
0.0
61.8
75.3
6
Grau de diferenciação
Bem 60.9
12.8
38.0
61.7
82.7
8
0.78
Moderado 59.3
15.0
0.0
62.0
89.8
42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 46.9
32.3
0.0
57.7
72.2
4
0.37
Infiltrativo 61.4
12.2
39.2
62.2
89.8
41
Vegetante 55.1
10.6
38.0
60.9
63.9
5
Invasão da serosa
Não 63.8
11.1
42.9
63.9
82.7
15
0.18
Sim 57.8
15.6
0.0
61.5
89.8
35
Invasão angiolinfática
Ausente 56.7
16.4
0.0
59.6
82.7
28
0.11
Presente 63.3
11.2
41.5
62.5
89.8
22
Invasão perineural
Ausente 58.0
16.4
0.0
61.0
89.8
35
0.15
Presente 63.2
8.5
43.0
62.5
78.8
15
Estadiamento
Inicial 56.7
15.8
0.0
60.9
82.7
29
0.10
Tardio 63.5
12.0
38.0
62.5
89.8
21
Metástase linfonodal
Não 56.8
15.5
0.0
60.9
82.7
30
0.09
Sim 63.8
12.2
38.0
63.4
89.8
20
Anexos
100
Figura A53 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o sexo, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A54 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a localização do tumor, em
pacientes com tumor colorretal .
FemininoMasculino
Sexo
150
100
50
0
ItE Sindecam
ColoReto
Localização do Tumor
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
Figura A55 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o tipo histológico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A56 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o grau de diferenciação,
em pacientes com tumor colorretal .
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
ModeradoBem
Grau de diferenciação
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
Figura A57 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o aspecto macroscópico,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A58 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão da parede
(serosa), em pacientes com tumor colorretal .
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
Anexos
101
Figura A59 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão angiolinfática,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A60 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão perineural, em
pacientes com tumor colorretal .
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
PresenteAusente
Invasão perineural
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
Figura A61 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o estadiamento, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A62 Box-plot para o ItE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a metástase linfonodal, em
pacientes com tumor colorretal .
TardioInicial
Estadiamento
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
SimNão
Metástase linfonodal
100
80
60
40
20
0
ItE Sindecam
Anexos
102
TABELA A IX. MEDIDAS DESCRITIVAS PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO DO
SINDECAM-1 (IE=u.o./µm
2
)
DE ACORDO COM AS VARIÁVEIS EXPLICATIVAS EM
PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL.
Média Desvio Mínimo Mediana
Máximo N
Nível
Padrão
Descritivo
Sexo
Masculino 37.4
16.3
0.0
62.5
82.7
31
0.38
Feminino 42.0
11.6
40.2
61.3
89.8
19
Localização do Tumor
Reto 38.5
18.2
0.0
39.5
74.6
44
0.48
Colo 44.1
14.6
26.4
46.5
61.7
6
Tipo Histológico
Adenocarcinoma 38.2
16.8
3.3
37.3
74.6
44
0.30
Outro 46.2
24.9
0.0
52.2
72.6
6
Grau de diferenciação
Bem 42.4
17.9
20.0
41.9
74.6
8
0.58
Moderado 38.5
17.9
0.0
41.9
72.6
42
Aspecto macroscópico
Ulcerado 40.1
27.1
0.0
50.4
59.5
4
0.45
Infiltrativo 38.7
17.6
3.3
37.6
74.6
41
Vegetante 42.0
14.7
22.1
42.3
56.7
5
Invasão da serosa
Não Serosa 45.7
20.7
3.3
51.4
74.6
15
0.09
Serosa 36.4
15.9
0.0
35.5
61.7
35
Invasão angiolinfática
Ausente 41.6
19.1
0.0
47.0
74.6
28
0.27
Presente 36.0
15.8
6.9
38.5
59.5
22
Invasão perineural
Ausente 40.7
18.4
0.0
46.8
74.6
35
0.34
Presente 35.5
16.2
14.2
35.5
59.5
15
Estadiamento
Inicial 42.6
18.6
0.0
46.8
74.6
29
0.10
Tardio 34.3
15.9
6.9
33.3
58.0
21
Metástase linfonodal
Não 41.8
18.7
0.0
44.6
74.6
30
0.19
Sim 35.1
15.9
6.9
34.4
58.0
20
Anexos
103
Figura A63 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o sexo, em pacientes com
tumor colorretal .
Figura A64 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a localização do tumor, em
pacientes com tumor colorretal .
FemininoMasculino
Sexo
150
100
50
0
IE Sindecam
ColoReto
Localização do Tumor
80
60
40
20
0
IE Sindecam
Figura A65 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o tipo histológico, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A66 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o grau de diferenciação,
em pacientes com tumor colorretal .
OutroAdenocarcinoma
Tipo Histológico
80
60
40
20
0
IE Sindecam
ModeradoBem
Grau de diferenciação
80
60
40
20
0
IE Sindecam
Figura A67 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o aspecto macroscópico,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A68 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão da parede
(serosa), em pacientes com tumor colorretal .
VegetanteInfiltrativoUlcerado
Aspecto macroscópico
80
60
40
20
0
IE Sindecam
SerosaNão Serosa
Invasão da parede
80
60
40
20
0
IE Sindecam
Anexos
104
FiguraA69 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão angiolinfática,
em pacientes com tumor colorretal .
Figura A70 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo a invasão perineural, em
pacientes com tumor colorretal .
PresenteAusente
Invasão angiolinfática
80
60
40
20
0
IE Sindecam
PresenteAusente
Invasão perineural
80
60
40
20
0
IE Sindecam
Figura A71 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo o estadiamento, em
pacientes com tumor colorretal .
Figura A72 Box-plot para o IE (u.o./µm
2
)
Sindecam segundo metástase linfonodal, em
pacientes com tumor colorretal .
TardioInicial
Estadiamento
80
60
40
20
0
IE Sindecam
SimNão
Metástase linfonodal
80
60
40
20
0
IE Sindecam
Anexos
105
TABELA A X. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE POSITIVIDADE
DA HEPARANASE (IP%), SEGUNDO O PONTO DE CORTE EM PACIENTES COM
TUMOR COLORRETAL.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade
1 – Especificidade
0,97 1,00 1,00
5,85 1,00 0,95
10,19 1,00 0,90
14,23 1,00 0,85
19,77 1,00 0,80
22,20 0,98 0,80
24,57 0,98 0,75
26,60 0,98 0,70
28,16 0,98 0,65
31,01 0,98 0,60
32,48 0,98 0,55
33,32 0,98 0,50
34,40 0,98 0,45
34,78 0,98 0,40
35,14 0,98 0,35
36,05 0,98 0,30
36,74 0,98 0,25
38,73 0,98 0,20
42,52 0,98 0,15
44,69 0,98 0,10
45,95 0,98 0,05
47,70 0,96 0,05
56,87 0,96 0,00
65,46 0,94 0,00
66,37 0,92 0,00
67,69 0,90 0,00
68,40 0,88 0,00
69,10 0,86 0,00
70,20 0,84 0,00
71,15 0,82 0,00
71,88 0,80 0,00
72,60 0,78 0,00
73,13 0,76 0,00
74,10 0,74 0,00
75,29 0,72 0,00
75,65 0,70 0,00
76,14 0,68 0,00
77,04 0,66 0,00
77,56 0,64 0,00
77,77 0,62 0,00
77,99 0,60 0,00
78,40 0,58 0,00
78,83 0,56 0,00
78,97 0,54 0,00
79,20 0,52 0,00
79,48 0,50 0,00
79,84 0,48 0,00
80,25 0,44 0,00
Anexos
106
TABELA A X. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INDICE DE POSITIVIDADE
DA HEPARANASE (IP%) EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL (CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a) Sensibilidade
1 – Especificidade
80,42 0,42 0,00
80,75 0,40 0,00
81,17 0,38 0,00
81,60 0,36 0,00
81,92 0,34 0,00
82,19 0,32 0,00
83,05 0,28 0,00
83,30 0,26 0,00
83,57 0,24 0,00
84,45 0,22 0,00
85,23 0,20 0,00
85,46 0,18 0,00
85,94 0,16 0,00
86,56 0,14 0,00
87,08 0,12 0,00
87,33 0,10 0,00
87,49 0,08 0,00
87,68 0,06 0,00
87,96 0,04 0,00
88,20 0,02 0,00
89,26 0,00 0,00
TABELA A XI. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE
EXPRESSÃO DA
HEPARANASE (ITE=u.o./µm
2
) EM PACIENTES
COM TUMOR
COLORRETAL.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade
1 – Especificidade
66,40 1,00 1,00
71,45 1,00 0,95
75,70 1,00 0,90
78,80 1,00 0,85
84,35 1,00 0,80
87,20 1,00 0,75
87,60 1,00 0,70
88,15 1,00 0,65
89,95 1,00 0,60
91,90 1,00 0,55
92,50 1,00 0,50
93,35 1,00 0,45
94,60 1,00 0,40
96,00 1,00 0,35
96,95 1,00 0,30
97,85 1,00 0,25
99,00 1,00 0,20
100,10 1,00 0,15
103,15 1,00 0,10
109,45 1,00 0,05
Anexos
107
TABELA A XI. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE
EXPRESSÃO DA
HEPARANASE (ITE=u.o./µm
2
) EM
PACIENTES COM TUMOR
COLORRETAL (CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a) Sensibilidade
1 – Especificidade
117,00 1,00 0,00
131,05 0,98 0,00
142,60 0,96 0,00
146,95 0,94 0,00
151,10 0,92 0,00
151,95 0,90 0,00
152,40 0,88 0,00
155,05 0,86 0,00
158,30 0,84 0,00
159,45 0,82 0,00
160,15 0,80 0,00
160,75 0,78 0,00
161,40 0,76 0,00
162,30 0,74 0,00
162,65 0,72 0,00
162,75 0,70 0,00
162,95 0,68 0,00
163,35 0,66 0,00
163,65 0,64 0,00
163,85 0,62 0,00
164,20 0,60 0,00
164,60 0,58 0,00
165,95 0,54 0,00
167,15 0,52 0,00
167,30 0,50 0,00
167,45 0,48 0,00
167,90 0,46 0,00
168,50 0,44 0,00
169,15 0,42 0,00
169,90 0,40 0,00
170,65 0,38 0,00
171,45 0,36 0,00
172,50 0,34 0,00
173,30 0,32 0,00
173,65 0,30 0,00
174,65 0,28 0,00
175,45 0,26 0,00
175,80 0,24 0,00
176,35 0,20 0,00
177,10 0,18 0,00
178,00 0,16 0,00
179,60 0,14 0,00
180,90 0,12 0,00
181,61 0,10 0,00
185,01 0,08 0,00
191,05 0,06 0,00
194,90 0,04 0,00
220,65 0,02 0,00
246,80 0,00 0,00
Anexos
108
TABELA A XII. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE (IE=u.o./µm
2
) EM TUMORES
COLORRETAIS.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a) Sensibilidade
1 – Especificidade
0,50 1,00 1,00
5,35 1,00 0,95
9,45 1,00 0,90
12,50 1,00 0,85
15,55 1,00 0,80
19,55 1,00 0,75
23,75 1,00 0,70
25,05 1,00 0,65
26,05 1,00 0,60
27,05 0,98 0,60
29,95 0,98 0,55
32,30 0,98 0,50
32,70 0,98 0,45
33,40 0,98 0,40
34,30 0,98 0,35
34,95 0,98 0,30
35,45 0,98 0,25
36,25 0,98 0,20
39,75 0,98 0,15
43,10 0,98 0,10
44,20 0,98 0,05
61,90 0,98 0,00
85,95 0,96 0,00
102,40 0,94 0,00
112,95 0,92 0,00
114,30 0,90 0,00
114,70 0,88 0,00
115,25 0,86 0,00
116,05 0,84 0,00
117,45 0,82 0,00
119,00 0,80 0,00
119,75 0,78 0,00
120,20 0,76 0,00
120,55 0,74 0,00
121,40 0,72 0,00
122,30 0,70 0,00
123,90 0,68 0,00
125,80 0,66 0,00
126,45 0,64 0,00
126,70 0,62 0,00
127,15 0,60 0,00
129,05 0,58 0,00
131,20 0,56 0,00
132,55 0,54 0,00
133,50 0,52 0,00
133,95 0,50 0,00
135,00 0,48 0,00
136,20 0,46 0,00
Anexos
109
TABELA A XII. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE EXPRESSÃO DA
HEPARANASE (IE=u.o./µm
2
) EM TUMORES
COLORRETAIS (CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a) Sensibilidade
1 – Especificidade
137,05 0,44 0,00
138,15 0,40 0,00
139,05 0,38 0,00
139,35 0,36 0,00
139,85 0,34 0,00
140,35 0,32 0,00
140,60 0,30 0,00
141,10 0,28 0,00
141,60 0,26 0,00
141,90 0,24 0,00
142,40 0,22 0,00
143,70 0,20 0,00
144,85 0,18 0,00
145,30 0,16 0,00
145,95 0,14 0,00
147,15 0,12 0,00
149,10 0,10 0,00
150,85 0,08 0,00
154,55 0,06 0,00
164,25 0,04 0,00
193,70 0,02 0,00
217,60 0,00 0,00
TABELA A XIII. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE
POSITIVIDADE DO SINDECAM (IP%) EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade 1 – Especificidade
-1,00 0,00 0,00
3,89 0,02 0,00
8,43 0,04 0,00
14,82 0,06 0,00
23,23 0,08 0,00
26,70 0,10 0,00
28,37 0,12 0,00
29,50 0,14 0,00
29,96 0,16 0,00
31,20 0,18 0,00
32,34 0,20 0,00
32,98 0,22 0,00
36,62 0,24 0,00
41,17 0,26 0,00
46,37 0,28 0,00
50,33 0,30 0,00
52,50 0,32 0,00
56,67 0,34 0,00
60,68 0,36 0,00
62,53 0,38 0,00
64,60 0,38 0,05
Anexos
110
TABELA A XIII. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE
POSITIVIDADE DO SINDECAM (IP%) EM PACIENTES COM TUMOR COLORRETAL
(CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade
1 – Especificidade
67,23 0,40 0,05
68,64 0,40 0,10
69,50 0,42 0,10
69,88 0,44 0,10
71,67 0,46 0,10
73,11 0,46 0,15
73,68 0,48 0,15
74,91 0,52 0,15
76,24 0,52 0,20
77,71 0,52 0,25
78,94 0,54 0,25
79,78 0,56 0,25
80,28 0,56 0,30
80,67 0,58 0,30
81,78 0,58 0,35
82,63 0,60 0,35
82,69 0,60 0,40
83,69 0,60 0,45
85,26 0,62 0,45
86,15 0,62 0,50
86,54 0,64 0,50
86,69 0,66 0,50
86,88 0,68 0,50
87,37 0,70 0,50
88,25 0,72 0,50
88,88 0,74 0,50
89,59 0,74 0,55
90,41 0,76 0,55
90,74 0,78 0,55
91,08 0,80 0,55
91,59 0,80 0,60
92,31 0,82 0,60
92,83 0,84 0,60
93,06 0,86 0,60
93,55 0,86 0,65
94,30 0,88 0,65
95,07 0,88 0,70
95,62 0,88 0,75
95,90 0,90 0,75
96,00 0,92 0,75
96,05 0,92 0,80
96,28 0,94 0,80
96,58 0,96 0,80
97,08 0,98 0,80
98,40 1,00 0,80
99,65 1,00 0,85
101,00 1,00 1,00
Anexos
111
TABELA A XIV. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE
EXPRESSÃO DO SINDECAM
(ITE=u.o./µm
2
) EM PACIENTES
COM TUMOR
COLORRETAL.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade 1 – Especificidade
-1,00 0,00 0,00
19,00 0,02 0,00
38,60 0,04 0,00
39,70 0,06 0,00
40,85 0,08 0,00
42,20 0,10 0,00
42,95 0,12 0,00
43,65 0,14 0,00
45,90 0,16 0,00
48,00 0,18 0,00
48,80 0,20 0,00
50,05 0,22 0,00
51,40 0,24 0,00
51,85 0,26 0,00
52,30 0,28 0,00
53,55 0,30 0,00
55,50 0,32 0,00
57,50 0,34 0,00
59,60 0,36 0,00
60,85 0,40 0,00
60,95 0,42 0,00
61,05 0,44 0,00
61,20 0,46 0,00
61,40 0,48 0,00
61,75 0,50 0,00
62,10 0,52 0,00
62,35 0,54 0,00
62,95 0,58 0,00
63,65 0,60 0,00
64,05 0,62 0,00
64,25 0,68 0,00
64,70 0,70 0,00
65,65 0,72 0,00
67,30 0,74 0,00
68,75 0,76 0,00
69,35 0,78 0,00
69,90 0,80 0,00
71,20 0,82 0,00
72,90 0,86 0,00
74,45 0,88 0,00
75,85 0,90 0,00
77,35 0,92 0,00
78,55 0,94 0,00
80,75 0,96 0,00
84,95 0,98 0,00
88,50 0,98 0,05
91,20 1,00 0,05
94,50 1,00 0,10
Anexos
112
TABELA A XIV.
SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE
EXPRESSÃO DO SINDECAM (ITE=u.o./µm
2
) EM PACIENTES
COM TUMOR
COLORRETAL (CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a) Sensibilidade 1 – Especificidade
97,25 1,00 0,15
98,45 1,00 0,20
99,35 1,00 0,25
103,10 1,00 0,30
108,05 1,00 0,35
110,90 1,00 0,40
112,15 1,00 0,45
114,30 1,00 0,50
116,95 1,00 0,55
117,80 1,00 0,60
119,80 1,00 0,65
122,15 1,00 0,70
134,20 1,00 0,75
145,90 1,00 0,80
146,40 1,00 0,85
148,10 1,00 0,90
152,15 1,00 0,95
155,80 1,00 1,00
TABELA A XV. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA O ÍNDICE DE EXPRESSÃO
DO
SINDECAM (IE=u.o./µm
2
) EM PACIENTES
COM TUMOR COLORRETAL.
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade 1 – Especificidade
-1,00 0,00 0,00
1,65 0,02 0,00
5,10 0,04 0,00
10,55 0,06 0,00
14,95 0,08 0,00
16,95 0,10 0,00
18,55 0,12 0,00
19,45 0,14 0,00
20,85 0,16 0,00
21,75 0,18 0,00
21,95 0,20 0,00
22,80 0,22 0,00
24,15 0,24 0,00
25,60 0,26 0,00
27,05 0,28 0,00
28,30 0,30 0,00
29,60 0,34 0,00
31,30 0,36 0,00
32,35 0,38 0,00
32,85 0,40 0,00
34,40 0,42 0,00
36,20 0,44 0,00
37,25 0,46 0,00
Anexos
113
TABELA A XV. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE PARA A INTENSIDADE DE
EXPRESSÃO DO
SINDECAM (IE=u.o./µm
2
) EM PACIENTES
COM TUMOR
COLORRETAL (CONT).
Ponto de corte (Positivo
se maior ou igual a)
Sensibilidade 1 – Especificidade
39,50 0,48 0,00
41,85 0,50 0,00
44,25 0,52 0,00
46,25 0,54 0,00
46,55 0,56 0,00
46,95 0,58 0,00
47,40 0,60 0,00
48,05 0,64 0,00
49,25 0,66 0,00
50,40 0,68 0,00
51,05 0,70 0,00
51,65 0,72 0,00
51,95 0,74 0,00
52,75 0,76 0,00
53,60 0,78 0,00
54,60 0,80 0,00
55,65 0,82 0,00
56,25 0,84 0,00
57,35 0,86 0,00
58,75 0,88 0,00
60,60 0,90 0,00
61,75 0,92 0,00
61,95 0,92 0,05
62,25 0,94 0,05
67,50 0,96 0,05
72,75 0,98 0,05
73,75 0,98 0,10
75,35 1,00 0,10
76,45 1,00 0,15
79,35 1,00 0,20
83,20 1,00 0,25
85,85 1,00 0,30
87,65 1,00 0,35
91,15 1,00 0,40
94,40 1,00 0,45
97,55 1,00 0,50
100,75 1,00 0,55
104,75 1,00 0,60
110,50 1,00 0,65
115,65 1,00 0,70
119,80 1,00 0,75
121,35 1,00 0,80
130,00 1,00 0,85
143,80 1,00 0,90
152,15 1,00 0,95
155,80 1,00 1,00
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