ads:
A
LESSANDRA VALÉRIO NIMTZ
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE FATORES DE
VIRULÊNCIA, TIPAGEM MOLECULAR E GRUPOS
FILOGENÉTICOS DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI
ISOLADAS DE CRIANÇAS COM BEXIGA NEUROGÊNICA EM
LONDRINA – PR
Londrina
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
A
LESSANDRA VALÉRIO NIMTZ
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE FATORES DE
VIRULÊNCIA, TIPAGEM MOLECULAR E GRUPOS
FILOGENÉTICOS DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI
ISOLADAS DE CRIANÇAS COM BEXIGA NEUROGÊNICA EM
LONDRINA – PR
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia da Universidade
Estadual de Londrina, como requisito final para a
obtenção do título de Mestre em Microbiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Halha Ostrensky
Saridakis
Londrina
2008
ads:
ALESSANDRA VALÉRIO NIMTZ
CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE FATORES DE
VIRULÊNCIA, TIPAGEM MOLECULAR E GRUPOS
FILOGENÉTICOS DE CEPAS DE ESCHERICHIA COLI
ISOLADAS DE CRIANÇAS COM BEXIGA NEUROGÊNICA EM
LONDRINA – PR
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profa. Dra. Marilda Carlos Vidotto
________________________________________
Prof. Dr. Tomomasa Yano
________________________________________
Profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis
Londrina, 29 de abril de 2008.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a meus pais, por todo amor, apoio e incentivo e também por
todas as oportunidades oferecidas. Amo vocês por isso e muito mais!
À minha querida orientadora, Prof.
a
Dr.
a
Halha Ostrensky Saridakis, a quem tenho muita
admiração e um carinho enorme. Por ter ensinado tudo que aprendi nesses cinco anos
de laboratório, por ser essa pessoa especial e amiga e pela confiança que depositou
em mim. Ficará para sempre comigo!
À Prof.
a
Dr.
a
Marilda Carlos Vidotto, por aceitar o convite para participar da banca e por
ceder parte do material utilizado nesta dissertação.
Ao professor Dr. Tomomasa Yano, por participar da banca examinadora mesmo com
toda a distância.
À Prof.
a
Dr.
a
Jacinta Sanchez Pelayo, pelas dúvidas esclarecidas, por todos os almoços
juntas, pela amizade e por tantas risadas proporcionadas.
À Prof.
a
Dr.
a
Renata Katsuko Takayama Kobayashi, uma pessoa de quem gosto
muito, pela paciência, pelo esclarecimento de dúvidas, pela imensa ajuda e pela
amizade e simpatia.
Aos atuais e ex-companheiros de laboratório, que fizeram com que estes anos todos
fossem tão divertidos: Raquel Girardello, Paula I. P. L. Barbosa, Kathelin Lascowiski,
Carlos Alfredo S. Queiroz, Rafael O. Melo, Sílvia Cestari, Michele Siewert, Claci Sandra,
Ilmara Varotto, Eliana Vespero, Cláudia Ross, Bárbara Moriel e André Lengert.
À Tatiane Yumi, Eduardo Feniman e Rafael Penha pela ajuda direta neste trabalho,
mas principalmente pela amizade e diversão.
À companheira de laboratório e amiga especial Karen de Castro Bauab, pela ajuda,
apoio, conforto, amizade e por tantos momentos prazerosos.
À Galleger Ilhe pelas inúmeras impressões de artigos, pela ajuda oferecida, por tantas
palavras de conforto nas horas em que tive medo, por conseguir me acalmar e por ser
uma pessoa especial.
Aos amigos que agora estão distante, mas que percorreram todo o caminho comigo e
que torcem por mim: Ana Carolina M. Zidko, Bruno C. C. Passos, Eder Ayres, Fernanda
Shimabukuro, Rafael Ferraz, Sabrina Lisboa e Wagner Florindo. Vocês são muito
especiais em minha vida.
Enfim, a todos que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho
meu muitíssimo obrigada!
NIMTZ, Alessandra Valério. caracterização genotípica de fatores de virulência,
tipagem molecular e grupos filogenéticos de cepas de escherichia coli isoladas
de crianças com bexiga neurogênica em Londrina – PR. 2008. 65f. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2008.
RESUMO
A bexiga neurogênica pode ocorrer como conseqüência de diferentes fatores, como
doenças, traumas, causas congênitas, que afetam o funcionamento normal deste
órgão. Infecção do trato urinário (ITU) é a complicação mais freqüentemente encontrada
nos pacientes portadores de tal condição, sendo Escherichia coli o microrganismo mais
comumente isolado de tal infecção. Neste estudo, cepas de E. coli isoladas de urina e
regiões periuretral e perianal de 16 crianças portadoras de bexiga neurogênica foram
analisadas quanto a presença de genes codificantes para alguns fatores de virulência
relacionados a UPEC (E. coli uropatogênica) utilizando a técnica de PCR. Os fatores de
virulência estudados foram fímbria tipo 1 (fimH), fimbria P (papC e papG), hemaglutinina
termo-sensível (tsh), receptor de yersiniabactina (fyuA), receptor de aerobactina (iutA),
plasmídio ColV (cvaC), resistência aumentada ao soro (iss), hemolisina (hlyA) e fator
citotóxico necrotizante (cnf1). As cepas foram classificadas em grupos filogenéticos de
acordo com técnica descrita por Clermont e colaboradores (2000) e suas similaridades
genéticas foram analisadas utilizando a técnica de BOX-PCR. Foram encontradas altas
freqüências de fimH (100%), fyuA (95,6%) e iutA (91,3%) entre os isolados. cnf1, iss e
hlyA estiveram presentes em 56,5%, 39,1% e 36,2% das cepas, respectivamente.
Outros genes estudados foram encontrados em menos de 30% das cepas. A maioria
dos isolados foram classificados como pertencentes aos grupos filogenéticos
patogênicos B2 e D (37,7% e 30,4%, respectivamente). BOX-PCR confirmou a hipótese
de origem intestinal das cepas de E. coli causadoras de infecções do trato urinário, e
demonstrou a importância da colonização da periuretra por estes microrganismos.
Palavras-chave: Escherichia coli. Genética. Bexiga neurogênica.
NIMTZ, Alessandra Valério. caracterização genotípica de fatores de virulência,
tipagem molecular e grupos filogenéticos de cepas de escherichia coli isoladas
de crianças com bexiga neurogênica em Londrina – PR. 2008. 65f. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2008.
ABSTRACT
Neurogenic bladder occurs as consequence of different events that affect the normal
function of the organ. Urinary tract infection (UTI) is the most frequent complication
found in patients with such alteration, and Escherichia coli is the most commonly
microorganism isolated from this infection. In this study, E. coli strains isolated from
urine and periurethral and perianal regions of 16 children with neurogenic bladder were
analyzed for the presence of genes coding for some virulence factors related to UPEC
(uropathogenic E. coli) using PCR technique. Virulence factors studied were type 1
fimbriae (fimH), P fimbriae (papC and papG), temperature-sensitive hemaglutinin (tsh),
yersiniabactin receptor (fyuA), aerobactin receptor (iutA), ColV plasmid (cvaC),
increased serum survival (iss), hemolysin (hlyA) and cytotoxic necrotizing factor (cnf1).
Strains were assigned into phylogenetic groups according to Clermont et al. (2000) and
their genetic similarities were analyzed using BOX-PCR technique. We found a high
frequency of fimH (100%), fyuA (95,6%) and iutA (91,3%) among the isolates. cnf1, iss
and hlyA were present in 56,5%, 39,1% and 36,2% of the strains, respectively. The
other studied genes occurred in less than 30% of the strains. Most of the isolates were
classified as belonging to pathogenic groups B2 and D (37,7% and 30,4%, respectively).
BOX-PCR confirmed the hypothesis of intestinal origin of E. coli strains causing urinary
tract infections, and demonstrated the importance of periurethral colonization by these
microorganisms.
Keywords: Escherichia coli. Genetics. Neurogenic bladder.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO..........................................................................................................8
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.....................................................................................10
1 BEXIGA NEUROGÊNICA......................................................................................10
2 ESCHERICHIA COLI.............................................................................................11
3 INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO....................................................................12
4 FATORES DE VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI RELACIONADOS À
INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO...............................................................14
4.1 A
DESINAS .............................................................................................................15
4.2 S
IDERÓFOROS.......................................................................................................22
4.3 R
ESISTÊNCIA SÉRICA..............................................................................................25
4.4 T
OXINAS ...............................................................................................................26
5 GRUPOS FILOGENÉTICOS..................................................................................31
REFERÊNCIAS.........................................................................................................33
OBJETIVOS..............................................................................................................41
O
BJETIVO GERAL.........................................................................................................41
O
BJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................................41
ARTIGO ....................................................................................................................42
8
INTRODUÇÃO
Bexiga neurogênica é uma condição em que a função normal da bexiga
é perdida devido a uma lesão de parte do sistema nervoso. A bexiga neurogênica pode
ser decorrente alguma doença, de um trauma ou de um defeito congênito que afeta o
cérebro, a medula espinhal ou os nervos que se dirigem à bexiga, seu esfíncter ou a
ambos. A bexiga neurogênica pode ser hiperativa (espástica), esvaziando por reflexos
incontroláveis, ou hipoativa, isto é, não contrátil e incapaz de esvaziar adequadamente,
geralmente decorrente da interrupção dos nervos que a inervam. Nas crianças a causa
mais comum é um defeito congênito da medula espinhal como, por exemplo, a espinha
bífida ou a mielomeningocele.
Tais pacientes devem ser submetidos à cateterização a cada 4 horas,
aproximadamente, para que ocorra o esvaziamento da bexiga. As infecções são
comuns nestes pacientes, pois o acúmulo de urina residual na bexiga cria condições
que estimulam o crescimento bacteriano.
O agente etiológico mais implicado em infecções do trato urinário é
Escherichia coli, um bacilo Gram-negativo que faz parte da microbiota normal do
intestino humano e de outros animais de sangue quente e é responsável por cerca de
80% das infecções urinárias comunitárias.
As infecções do trato urinário são, geralmente, ascendentes, ou seja, a
bactéria primeiramente coloniza a uretra e depois atinge a bexiga, podendo então
atingir o rim causando pielonefrite, uma condição séria que pode levar à bacteremia e
perda de função renal.
Para causar infecção, Escherichia coli deve possuir alguns fatores que
favoreçam sua permanência e multiplicação na bexiga. Tais fatores são conhecidos
como fatores de virulência e incluem adesinas, capacidade de invasão das células
uroepiteliais, produção de toxinas e sideróforos.
As cepas de E. coli consideradas uropatogênicas podem ser agrupadas
no grupo filogenético B2 e em menor extensão no grupo D, classificação baseada nos
fatores de virulência albergados pelas cepas.
9
O objetivo do trabalho foi estudar cepas de Escherichia coli isoladas de
crianças com bexiga neurogênica, avaliar a presença de determinantes genéticos para
diferentes fatores de virulência pela técnica de PCR, assim como a classificação das
cepas nos diferentes grupos filogenéticos.
Também foi realizada a técnica de BOX-PCR, para avaliar a
similaridade genética entre cepas isoladas de um mesmo paciente, com a finalidade de
esclarecer a provável fonte de infecção.
10
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1 BEXIGA NEUROGÊNICA
Bexiga neurogênica ocorre como seqüela de várias doenças ou eventos
que afetam o sistema nervoso responsável pelo controle do trato urinário. Pode ser
decorrente de defeitos congênitos, traumas, doenças ou lesões neurológicas
periféricas. A disfunção resultante depende da localização e extensão da lesão
neurológica. Tanto na bexiga neurogênica congênita quanto na adquirida, diagnóstico
precoce e tratamento são essenciais para a prevenção de danos renais irreversíveis
(GUIDONI et al., 2006).
Pacientes portadores de tal condição freqüentemente são submetidos a
sondagem, para o esvaziamento adequado da bexiga. A cateterização intermitente é
considerada um método seguro e efetivo para o controle desta disfunção, melhorando o
tempo e a qualidade de vida dos pacientes. Entretanto, a bacteriúria é freqüente, sendo
encontrada em aproximadamente 70% dos pacientes (SCHLAGER et al., 2000).
Supõe-se que a bacteriúria assintomática seja conseqüência dos
mecanismos de defesa do hospedeiro capazes de controlar a infecção ou de uma
condição primária em que bactérias de baixo potencial de virulência colonizam o trato
urinário sem causar uma resposta sintomática (HOOTON, 2000).
Essa alta freqüência de bacteriúria parece relacionada às bactérias que
colonizam a região periuretral, e que são inoculadas diariamente na bexiga das
crianças submetidas à sondagem. Schlager e colaboradores (1995) identificaram
colonização bacteriana na periuretra de crianças com bexiga neurogênica que
produziram bacteriúria, durante um estudo longitudinal. Quando E.coli foi detectada na
periuretra, bacteriúria pela mesma bactéria ocorreu em 93% dos casos.
De acordo com Guidoni e colaboradores (2006), bacteriúria
assintomática e sua possível associação a danos renais são os maiores problemas
enfrentados nestas crianças. Infecção do trato urinário (ITU) é a complicação mais
11
comum entre pacientes portadores de bexiga neurogênica (WAITES et al., 2006),
acarretando grande morbimortalidade e podendo levar à condição de insuficiência renal
crônica e necessidade de terapia de substituição renal.
Escherichia coli é o microrganismo mais freqüentemente
responsabilizado por bacteriúria, podendo persistir na periuretra e/ou na urina por
semanas ou meses sem causar doença sintomática (SCHLAGER et al., 2000).
Ocasionalmente, entretanto, pode causar ITU sintomática (GUIDONI et al., 2006).
2 ESCHERICHIA COLI
Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbio facultativo, não
formador de esporos, geralmente móvel pela presença de flagelos peritríquios e
pertencente à família Enterobacteriaceae, sendo componente da microbiota normal
intestinal de humanos e maioria de animais de sangue quente.
Em termos de significância para humanos, E. coli são agrupadas em
três categorias: cepas comensais, que representam grande parte da microbiota
intestinal normal, cepas patogênicas intestinais, causadoras de diarréias (também
conhecidas como E. coli diarreiogênicas) e aquelas responsáveis por infecções
extraintestinais (ExPEC) (MAYNARD et al, 2004, DURANT et al., 2007). De acordo
com Durant e colaboradores (2007), ExPEC podem ser encontradas na microbiota
intestinal normal, atingindo 11% dos isolados de indivíduos saudáveis e tais cepas
apresentam a capacidade de colonizar sítios extraintestinais e causar infecção em
diversos orgãos em humanos, estando envolvidas principalmente em septicemias,
meningites e infecções do trato urinário.
Escherichia coli é o patógeno mais comumente isolado de infecções do
trato urinário (EMÖDY et al., 2003; JOHNSON and STELL, 2000; BONACORSI et al.,
2006; MYSOREKAR and HULTGREN, 2006; SOTO et al., 2006), e freqüentemente é
originário da microbiota intestinal normal do próprio paciente. Segundo Mysorekar e
Hultgren (2006), mais de 80% das infecções do trato urinário são causadas por E. coli.
12
3 INFECÇÕES DO TRATO URINÁRIO
Infecções do trato urinário (ITU) estão entre as infecções bacterianas
mais comuns, causando significativa morbidade e mortalidade e gerando altos custos
ao sistema de saúde pública (RIPPERE-LAMPE et al., 2001; JUSTICE et al., 2004;
RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; DAVIS et al., 2006).
Ocorrem com maior freqüência em indivíduos do sexo feminino, devido
à proximidade entre o ânus e a abertura da uretra e à facilidade de colonização da
vagina (HOOTON, 2000; OBATA-YASUOKA et al., 2002).
O trato gastrointestinal é comumente a via de infecção endógena em
peritonites, apendicites e infecções urinárias (MINSHEW et al., 1978; YAMAMOTO,
2007), enquanto o trato urinário é a fonte mais comum de bacteremia, fato que sugere
que o patógeno infectante interage e invade a circulação sangüínea através do epitélio
renal (TRIFILLIS et al., 1994).
Infecções do trato urinário são classificadas de acordo com o sítio de
infecção: cistite (bexiga), pielonefrite (rim) e bacteriúria (urina). A colonização da urina
sem a presença de sintomas clínicos é denominada bacteriúria assintomática (ROOS et
al., 2006).
Segundo Yamamoto (2007), infecções do trato urinário geralmente são
ascendentes e normalmente ocorrem como conseqüência da colonização da região
periuretral pelo microrganismo, que então ganha acesso à bexiga, causando bacteriúria
ou ITU sintomática. Seu estudo demonstrou que cepas de E. coli isoladas de infecções
do trato urinário apresentaram os mesmos genótipos e sorotipos que E. coli da
microbita intestinal e que essas foram consideradas geneticamente idênticas quando
submetidas à técnica de PFGE (pulsed-field gel electrophoresis), indicando que o
intestino é reservatório de E. coli para ITU.
Entretanto, não há um consenso quanto à fonte de cepas urovirulentas
que habitam o cólon. Uma rota plausível de transmissão para qualquer bactéria que
coloniza o trato intestinal é a fecal-oral. Autores têm sugerido que aves constituem
veículos candidatos, já que APEC (avian pathogenic Escherichia coli) e UPEC
13
(uropathogenic Escherichia coli) apresentam grandes similaridades quanto a
sorogrupos, perfis genéticos de fatores de virulência e distribuição nos grupos
filogenéticos (RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; SKYBERG et al., 2006).
Uma vez na bexiga, o microrganismo pode invadir células epiteliais que,
em resposta, sofrem um processo semelhante a apoptose e são esfoliadas, liberando
bactérias na urina. Estudos demonstram que E. coli é capaz de persistir
intracelularmente por meses, em modelos experimentais de infecção em ratos, em uma
forma quiescente, que pode servir de reservatório para infecções recorrentes (JUSTICE
et al., 2004; MYSOREKAR et al., 2006).
Infecções sintomáticas do trato urinário ocorrem quando uropatógenos
presentes na bexiga ou nos rins estimulam liberação de citocinas, resultando em
resposta inflamatória e aparecimento de sintomas (HOOTON, 2000). Complicações em
longo prazo de ITU são raras, no entanto, uma infecção ascendente do trato urinário
pode resultar em pielonefrite (LE BOUGUENEC et al., 1992; DAVIS et al., 2005), que é
a complicação mais séria, podendo levar à septicemia (DAVIS et al., 2005) e
insuficiência renal crônica e conseqüente necessidade de tratamento dialítico.
Já em 1988, Johnson e colaboradores observaram que cepas de
Escherichia coli que causam infecções no trato urinário em pacientes sem
anormalidades urológicas tipicamente possuem fatores de virulência específicos, em
contraste com pacientes que apresentam condições urológicas predisponentes, nos
quais infecções do trato urinário são freqüentemente causadas por cepas que não
possuem tais fatores (JOHNSON e STELL, 2000).
Segundo Hooton (2000), fatores mecânicos ou fisiológicos que afetam o
esvaziamento da bexiga estão fortemente associados a infecções recorrentes. O
esvaziamento inadequado da bexiga provoca um acúmulo de urina residual, que provê
meio contínuo para o crescimento bacteriano. Esta condição é encontrada em
pacientes com bexiga neurogênica e, segundo Schlager e colaboradores (2000),
permite que E. coli sem determinantes de virulência cause ITU (SCHLAGER et al.,
2000).
14
4 FATORES DE VIRULÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI RELACIONADOS À
INFECÇÃO DO TRATO URINÁRIO
Virulência é definida como a habilidade de um organismo causar
doença em um hospedeiro (JOHNSON, 1991). Fatores de virulência são características
que proporcionam vantagens aos microrganismos quanto à sobrevivência no
hospedeiro além de lhes conferir potencial patogênico. Segundo Emödy e
colaboradores (2003), fatores de virulência capacitam E. coli a colonizar seletivamente
a mucosa uroepitelial, induzir reação inflamatória e eventualmente migrar para outros
tecidos.
Fatores de virulência conhecidos incluem diversas adesinas, toxinas,
sideróforos, cápsula e invasinas, os quais facilitam colonização e invasão do
hospedeiro, evasão dos mecanismos de defesa, injúrias teciduais e/ou estimulação de
resposta inflamatória exacerbada do hospedeiro (JOHNSON and STELL, 2000;
JOHNSON et al., 2001; YAMAMOTO, 2007).
Tais fatores em E. coli estão mais presentes em cepas isoladas de
infecções do que entre E. coli residentes na microbiota normal do hospedeiro
(MINSHEW et al., 1978; HULL et al., 1998; JOHNSON e STELL, 2000; SABATÉ et al.,
2006). Segundo Schlager e colaboradores (2000), clones de E. coli isolados de
mulheres com trato urinário normal e pielonefrite expressam com maior feqüência
aerobactina, hemolisina, adesinas e resistência ao soro do que clones isolados de
mulheres com cistite ou bacteriúria assintomática ou de amostras fecais.
Cepas isoladas do trato urinário comumente expressam múltiplos
fatores de virulência simultaneamente. A habilidade de ExPEC de acumular e expressar
múltiplos determinantes associados à virulência aumenta sua aptidão e determina seu
potencial de causar doença (BIELASZEWSKA et al., 2007).
Em algumas cepas essa expressão múltipla é conseqüência da
presença de blocos de determinantes genéticos interligados que codificam para
diversos fatores de virulência (JOHNSON, 1991; BINGEN-BIDOIS, 2002), conhecidos
como ilhas de patogenicidade.
15
Ilhas de patogenicidade (PAIs) são elementos genéticos flexíveis que
codificam para diversos fatores de virulência, como adesinas, toxinas, sistemas de
captação de ferro e cápsula. São regiões de DNA móveis, contendo de 10 a 200 kb,
freqüentemente localizadas adjacentes a genes de RNA transportador. PAIs são
instáveis, flanqueadas por seqüências repetitivas e diferem das demais regiões
cromossomais por sua concentração de G+C, o que indica que estas frações de DNA
foram adquiridas de outro microrganismo (OELSCHLAEGERet al., 2002; EMÖDY et al.,
2003; SCHMIDT e HENSEL, 2004; SABATÉ et al., 2006).
A identificação de fatores de virulência deve contribuir para diagnósticos
e dados epidemiológicos mais precisos (EMÖDY et al., 2003). Como o
comprometimento do hospedeiro pode diminuir a importância patogênica de certos
fatores de virulência, também se faz importante a identificação de fatores de virulência
que permanecem prevalentes entre hospedeiros comprometidos (JOHNSON and
STELL, 2000).
4.1 A
DESINAS
Adesinas podem ser subdivididas em duas categorias: fimbriais e
afimbriais, sendo, ambas, responsáveis por aderência a diferentes tecidos do
hospedeiro.
As propriedades de aderência de E. coli foram primeiramente
reconhecidas através da técnica de aglutinação de eritrócitos na presença de cepas
bacterianas, e esta técnica permite a distinção das fímbrias hemaglutinantes em dois
tipos: fímbria manose-sensível (tipo 1), cuja atividade hemaglutinante é inibida em
presença de D-manose; fímbrias manose-resistentes, que reconhecem carboidratos
presentes nos receptores de células eucarióticas, diferentes da D-manose e, portanto,
não têm suas atividades hemaglutinantes inibidas pela D-manose.
Uma das principais defesas do trato urinário do hospedeiro é a ação de
lavagem da urina. Portanto, para causar infecção as bactérias devem ser capazes de
16
se dividir rapidamente para se manter em número suficiente na bexiga ou aderir ao
epitélio (SALYERS e WHITT, 2001). A adesão é considerada o primeiro passo
necessário para colonização do tecido do hospedeiro, podendo levar a uma possível
infecção. Porém Roos e colaboradores (2006) estudaram a capacidade de colonização
da cepa de E. coli 83972 frente a cepas de UPEC isoladas de ITU. A cepa 83972 foi
isolada de uma jovem, portadora de bacteriúria assintomática, que a carregou por 3
anos. Esta cepa possui determinantes não funcionais para fímbria P e fímbria tipo 1 e
não adere a qualquer tipo celular presente no trato urinário, o que explica a ausência de
resposta inflamatória do hospedeiro. Porém, experimentos de coincubação da cepa,
juntamente com cepas isoladas de ITU, em urina humana e modelos experimentais em
ratos, demonstraram que E. coli 83972 é capaz de superar o crescimento de cepas de
UPEC, tornando-se predominante em cultura e infecção experimental, demonstrando
sua capacidade de causar bacteriúria sem aderir ao epitélio.
Cepas de UPEC comumente expressam múltiplas adesinas e podem
apresentar combinações de diferentes fímbrias ou combinações de diferentes sorotipos
da mesma adesina em suas superfícies, o que pode contribui para que a bactéria
ludibrie o sistema imune do hospedeiro. Essa multiplicidade de adesinas, necessária
para o reconhecimento de vários receptores ao longo do trato urinário, parece ser um
importante fator no desenvolvimento de infecções do trato urinário e no aumento da
patogenicidade de cepas de E. coli (LE BOUGUENEC et al., 1992).
Dentre as adesinas fimbriais, as mais comumente associadas a ITU são
fímbria tipo 1 e fímbria P, sendo a primeira manose-sensível e a segunda manose-
resistente.
Fímbria tipo 1 reconhece resíduos de manose naturalmente presentes
em glicoproteínas da superfície da célula hospedeira, e parece estar envolvida com
processos de adesão, invasão e formação de biofilme (OELSCHLAEGER, et al., 2002;
EMÖDY et al., 2003). Receptores para fímbria tipo 1 estão presentes em eritrócitos de
muitas espécies, células epiteliais bucais, vaginais e uroepiteliais (JOHNSON, 1991).
A fímbria tipo 1 foi reconhecida como sendo capaz de induzir
internalização. É o fator de virulência mais freqüentemente expresso por UPEC, embora
seja comumente encontrado também entre cepas não-UPEC, inclusive fecais
17
(JOHNSON, 1991; YAMAMOTO, 2007), fazendo com que a ação da fímbria tipo 1 como
fator de virulência tenha sido questionada. Porém, sabe-se que esta fímbria presente na
superfície bacteriana reconhece proteínas manosiladas na superfície celular do epitélio
da bexiga de ratos (JUSTICE et al., 2004), levando à ligação e invasão das células
epiteliais (MYSOREKAR e HULTGREN, 2006).
Segundo Johnson (1991), fímbria tipo 1 promove aderência a leucócitos
polimorfonucleares e fagocitose. Algumas cepas não são fagocitadas e promovem a
degranulação de leucócitos polimorfonucleares como conseqüência da ligação
bacteriana, o que, em casos de pielonefrite, pode levar a cicatrizes renais (HOLDEN et
al., 2006).
A produção da fímbria é codificada por um cluster que inclui genes para
a subunidade estrutural, uma adesina, várias proteínas acessórias e regulatórias.
Isolados clínicos tipicamente possuem uma única cópia do cluster para fímbria tipo 1
(JOHNSON,1991).
A expressão da fímbria tipo 1 é regulada em nível transcricional por um
promotor situado em um elemento invertível, que pode se apresentar em duas
orientações. A orientação que permite a transcrição gênica é denominada “on”, e a
posição contrária, na qual não ocorre transcrição, é denominada “off”. O elemento
invertível é controlado por duas recombinases: FimB, que promove inversão nas duas
direções, e FimE, que promove inversão de “on” para “off” (GUNTHER IV et al., 2002;
HOLDEN e GALLY, 2004; SNYDER et al., 2006).
Adesinas bacterianas são antigênicas, portanto, a expressão de muitas
adesinas fase variáveis, reflete um balanço entre a capacidade de aderir e a de ludibriar
o sistema imune do hospedeiro (HOLDEN and GALLY, 2004).
Segundo Snyder e colaboradores (2006), isolados de E. coli de
pacientes com cistite ou pielonefrite possuem padrões diferentes quanto à variação de
fase em tempos específicos durante ITU.
Gunther IV e colaboradores (2002) e Snyder e colaboradores (2006),
estudaram a influência da inversão de fase da fímbria tipo 1 em CFT073, cepa isolada
de pielonefrite, e F11, cepa isolada de cistite, respectivamente, para avaliar o papel da
fímbria tipo 1 em ITU. Para tanto, foram produzidos 2 mutantes de cada uma das duas
18
cepas, bloqueados na orientação “on” ou na orientação “off”. Tanto os mutantes quanto
as cepas selvagens foram testadas em um modelo de infecção ascendente do trato
urinário em ratos. Os resultados encontrados demonstraram que a ausência de fímbria
tipo 1 teve profundos efeitos na colonização da bexiga e que a expressão de fímbria
tipo 1 é mais requerida em estágios iniciais de infecção por cepas causadoras de
pielonefrite.
Cepas causadoras de cistite apresentam o elemento invertível na
orientação “on”, onde permanece, enquanto cepas de pielonefrite se apresentam na
orientação “on” no início da infecção e tendem a inverter para “off” (OELSCHLAEGER
et al., 2002; YAMAMOTO, 2007).
Alguns estudos demonstraram um mecanismo de regulação entre
fímbria tipo 1 e fímbria P. PapB, uma proteína regulatória da expressão de fímbria P,
diminui a expressão do gene que codifica para a subunidade estrutural da fímbria tipo 1.
Essa regulação é devida à inibição da recombinação do promotor de fim por FimB e
aumento da expressão de FimE (HOLDEN and GALLY, 2004; HOLDEN et al., 2006).
Essa regulação é demonstrada pelos fatos de que, na ausência de
fímbria P, a fímbria tipo 1 contribui para a colonização do trato urinário superior e
quanto maior a expressão de fímbria P, menor a expressão de fímbria tipo 1
(JOHNSON, 1991; HOLDEN et al., 2006).
A regulação apropriada das adesinas é necessária durante a infecção
para otimizar a colonização e prevenir a eliminação pelo sistema imunológico do
hospedeiro. Este sistema previne a coexpressão de certas adesinas e permite a
expressão seqüencial para a consolidação da colonização (HOLDEN e GALLY, 2004).
Fímbria P é a adesina mais reconhecidamente implicada na patogênese
de infecções do trato urinário superior, estando presente em cerca de 80% dos isolados
de E. coli de pacientes com pielonefrite (HOOTON, 2000; YAMAMOTO, 2007). Medeia
uma ligação específica com receptores Gal(α1-4)Gal (digalactose), expressos em
eritrócitos humanos do grupo P e também ao longo de todo o trato urinário humano
(JOHNSON et al., 1998; EMÖDY et al, 2003), facilitando infecção ascendente e
estimulando reação inflamatória do hospedeiro (JOHNSON et al., 2000).
19
De acordo com Johnson (1991), glicolipídios contendo Gal-Gal
compreendem pequena parte dos glicolipídios de células uroepiteliais, porém são
predominantes em células renais humanas, principalmente em células epiteliais do
túbulo proximal. A abundância de receptores para fímbria P no tecido renal humano, a
importância da fímbria P na colonização do trato urinário superior em ratos e a
associação de fímbria P com pielonefrite aguda em humanos sugere que fímbria P é
requerida para colonização e invasão do trato urinário superior humano. Porém sabe-se
que fímbria P também se liga a células epiteliais e musculares da bexiga e, na ausência
de fímbria tipo 1, é responsável pela colonização deste órgão.
Fímbria P é composta por subunidades polimerizadas helicoidalmente,
sendo que PapA é a subunidade estrutural. Três subunidades relacionadas à aderência
(PapE, PapF e PapG) estão presentes em pequenas quantidades na extremidade
fimbrial, sendo que PapG é a molécula aderente responsável pela especificidade Gal-
Gal. PapC, PapD e PapH são proteínas de processamento e montagem, enquanto
PapB e PapI são proteínas regulatórias. As proteínas fimbriais, assim como as
acessórias, são codificadas por um cluster gênico cromossomal denominado pap
(JOHNSON, 1991; SALYERS e WHITT, 2001).
A expressão do cluster pap também é controlada por variação de fase,
apresentando um mecanismo mais complexo do que aquele apresentado pela fímbria
tipo 1. O promotor de PapA está situado entre as regiões codificadoras das proteínas
regulatórias PapI e PapB, cujas expressões por promotores divergentes dependem do
estado de metilação de dois sítios (GATC) pela enzima desoxiadenosina metilase
(Dam). A variação de fase é determinada pela formação de complexos protéicos
alternativos que ativam ou suprimem a transcrição dos genes pap. A formação de cada
complexo protege um único sítio da ação de Dam. O estado de metilação dos sítios
determina se a ligação de ativadores críticos ocorre e, então, se a região está na
configuração “on” ou “off”. (BLOMFIELD, 2001; HOLDEN e GALLY, 2004).
PapG ocorre em três variantes moleculares (classes I, II e III) que são
codificadas por alelos distintos do gene papG. As diferentes especificidades de
receptores das três variantes de PapG provavelmente confere diferenças no espectro
de células hospedeiras ou capacidade de causar diferentes sintomas clínicos, sendo
20
que papG classe II parece estar mais relacionado com cepas causadoras de
pielonefrite, enquanto papG classe III está mais relacionado com infecções na bexiga
(JOHNSON et al., 1998).
Fímbria P ocorre em diversas variantes sorológicas, classificadas em
F7-1, F7-2 e F8 a F16. Essa diversidade antigênica é atribuída à variabilidade de
seqüência peptídica dentro de PapA. Cepas de E. coli podem conter mais de três
cópias do operon pap e, já que cada operon pap pode conter um alelo diferente de
papA, podem expressar mais de três tipos antigênicos de fímbria P (JOHNSON et al.,
2000).
O fato de cepas de E. coli podem apresentar mais que um determinante
para fímbria P foi confirmado por Holden e colaboradores (2006) que, utilizando a
técnica de Southern blotting, demonstraram a presença de duas ou mais cópias do
cluster pap em cepas de E. coli isoladas de pielonefrite e cistite. No teste de
hemaglutinação em presença de manose, algumas cepas isoladas de bacteriúria
assintomática não demonstraram uma hemaglutinação clara, o que sugere que nestas
a expressão de fímbria P é reprimida ou que mutações no operon impediram a
expressão. Essa diminuição de expressão é acompanhada pela falta de reação
inflamatória, o que é consistente com o estado assintomático dos pacientes.
Uma proteína, descrita pela primeira vez em cepas de APEC, Tsh, tem
demonstrado ser uma proteína bifuncional, apresentando propriedades proteolíticas e
também de aderência.
A proteína Tsh é uma hemaglutinina temperatura sensível responsável
por uma hemaglutinação manose resistente. É uma proteína de autotransporte, capaz
de um mecanismo autônomo para exportar seu domínio ativo através da membrana
externa (STATHOPOULOS et al., 1999, RESTIERI et al., 2007), pelo sistema de
secreção tipo V, que não requer gasto energético e nem proteínas adicionais durante o
processo de translocação.
Segundo Kostakioti e Stathopoulos (2004), proteínas de autotransporte
são fatores de virulência, pois seus domínios passageiros podem atuar como adesinas,
proteases, hemaglutininas, toxinas ou mediadoras de motilidade intracelular.
21
A proteína é codificada pelo gene tsh, caracterizado em E. coli de
origem aviária e localizado em plasmídio. Apresenta homologia às serinoproteases de
IgA de Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae, porém não clivam IgA e é
membro do grupo da serina protease autotransporte de Enterobacteriaceae (SPATE).
Tsh é sintetizada como uma proteína precursora de 140kDa, que sofre processos
proteolíticos resultando em ao menos 2 proteínas, sendo uma de 33kDa que se insere
na membrana externa e medeia a translocação do domínio secretado de 106kDa
(STATHOPOULOS et al., 1999), apresentando atividade proteolítica e de aderência
(KOSTAKIOTI and STATHOPOULOS, 2004).
A presença do gene tsh foi verificada por Heimer e colaboradores
(2004) que, analisando cepas de E. coli humanas de pielonefrite, cistite e fecais,
encontraram tsh em 61%, 65% e 33% das cepas, respectivamente; enquanto
Rodriguez-Siek e colaboradores (2005) encontraram o gene tsh em 39,5% de UPEC,
dados que demonstram que este gene faz parte do conjunto de genes de virulência
presentes em ExPEC.
Kostakioski e Stathopoulos (2004) demonstraram que a proteína Tsh é
capaz de se ligar a eritrócitos de carneiro, hemoglobina aviária, colágeno IV e
fibronectina, porém não houve ligação significativa com mucina, que é uma
glicoproteína presente no muco epitelial de diversos sistemas e possui papel
fundamental na lubrificação e proteção do hospedeiro.
O muco é uma secreção viscosa que cobre muitas superfícies epiteliais,
sendo encontrado também na bexiga. A degradação completa ou parcial das moléculas
de mucina por enzimas bacterianas é freqüentemente um passo fundamental na
transgressão das barreiras defensivas impostas pela mucosa. Ainda não está claro o
papel real da proteína Tsh na degradação da mucina no processo infeccioso.
Kobayashi e colaboradores (2007) usaram preparações de mucina
gástrica de porco, submaxilar de bovinos e traqueal de aves como substrato para testar
a atividade mucinolítica da proteína. A ação mucinolítica foi detectada nos três tipos de
muco, sendo inibida por anticorpos anti-Tsh.
No entanto o papel desta adesina em infecção do trato urinário ainda
não está elucidado.
22
4.2 S
IDERÓFOROS
O ferro é indispensável para o metabolismo celular bem como um fator
importante para o crescimento de bactérias patogênicas. E. coli utiliza o ferro para o
transporte de oxigênio, síntese de DNA, transporte de elétrons e metabolismo de
peróxidos. No hospedeiro, o ferro é encontrado predominantemente associado a
proteínas, estando uma quantidade muito baixa de ferro livre disponível. Portanto,
bactérias desenvolveram várias estratégias para captação e armazenamento deste
elemento presente no hospedeiro, tais como produção de receptores de sideróforos e
sistemas de captação de ferro envolvendo proteínas que liberam ferro de complexos
encontrados no hospedeiro (BEARDEN et al., 1998; PERRY et al., 1999; DURANT et
al., 2007).
Segundo Perry e colaboradores (1999), sideróforos são estruturas de
baixo peso molecular com alta afinidade por ferro secretadas no meio, onde ligam-se a
ferro precipitado ou retiram ferro de proteínas do hospedeiro. A entrada do complexo
ferro-sideróforo fornece à célula o ferro necessário para o crescimento. Em E. coli, o
sideróforo aerobactina é o mais efetivo dos vários sistemas de quelação empregados
por bactérias entéricas para a aquisição de ferro (JOHNSON, 1991).
Segundo Johnson et al. (1988) aerobactina é um sistema de seqüestro
e transporte de ferro para dentro da célula que permite que E. coli cresça em ambientes
pobres de ferro tais como urina, conferindo uma vantagem seletiva significativa para o
crescimento bacteriano em condições de estresse de ferro, que ocorre no organismo
durante a infecção.
Aerobactina é um composto formado a partir de duas moléculas de
lisina e uma de citrato, que compete pelo ferro ligado às proteínas do hospedeiro.
Aerobactina férrica liga-se a um receptor presente na membrana externa da bactéria, o
qual é induzido pelo estresse de ferro e codificado pelo gene iutA. O gene iucC codifica
a enzima responsável pela síntese da aerobactina.
Na maioria das cepas de E. coli, o sistema de aerobactina é codificado
por um operon de 5 genes, sendo que 4 são responsáveis por codificar enzimas
23
necessárias para a síntese da aerobactina e o quinto gene codifica para o receptor de
membrana externa (JOHNSON, 1991). A produção de aerobactina é regulada pela
concentração intracelular de ferro.
Determinantes para aerobactina são encontrados em plasmídios ou no
cromossoma bacteriano, sendo a localização cromossomal predominante nos isolados
clínicos humanos. Em cepas com sistema de aerobactina cromossomal, a região
codificante para aerobactina é idêntica àquela encontrada em plasmídios (JOHNSON,
1991).
Em um estudo de Johnson e colaboradores (1988) com cepas de E. coli
isoladas de pacientes com urosepse, foi verificado que determinantes para aerobactina,
em amostras positivas para o gene, estavam associadas a plasmídios em 27% das
cepas e em 73% a aerobactina era codificada por genes cromossomais. As cepas que
apresentaram aerobactina plasmidial foram encontradas exclusivamente em pacientes
comprometidos (anormalidades do trato urinário, instrumentação do trato urinário ou
doença), associadas a multirresistência a antimicrobianos. Os autores propuseram que
plasmídios com a combinação de aerobactina com resistência foram selecionados nos
pacientes comprometidos, talvez pelo tratamento profilático que estes pacientes
geralmente recebem.
Yersiniabactina (Ybt) é outro sideróforo encontrado amplamente
disseminado entre cepas de ExPEC (SCHUBERT et al., 2002). A molécula de Ybt é
composta de um grupo fenólico, provavelmente derivada do salicilato, assim como uma
tiazolidina e dois anéis de tiazolina derivados da condensação de três resíduos de
cisteína (PERRY et al., 1999), e foi primeiramente descrita em espécies de Yersinia
(SCHUBERT et al., 1998).
Ybt é codificada por um operon cromossomal, denominado “ilha de alta
patogenicidade” (HPI), por apresentar os critérios básicos de ilhas de patogenicidade,
tais como uma concentração atípica de G+C, presença de genes para virulência e de
mobilidade (elementos de inserção), associação com genes de tRNA e instabilidade,
sendo um elemento genético móvel que foi disseminado por transferência horizontal
entre diferentes gêneros da família Enterobacteriaceae (SCHUBERT et al., 1998) ,
24
especialmente em ExPEC causadoras de infecções do trato urinário, septicemia e
meningite em recém-nascidos (SCHUBERT et al., 2002).
Pelludat e colaboradores (1998) identificaram quatro genes, irp1, irp3,
irp4 e irp5, em um fragmento de DNA cromossomal de Y. enterocolitica. Estes genes
constituem o cluster gênico responsável pela produção de yersiniabactina, juntamente
com irp2. Os genes irp2 a irp5 representam a maquinaria de síntese de yersiniabactina,
com a seguinte organização: irp2-irp1-irp3-irp4-irp5. Os genes irp1 e irp2, que codificam
para as proteínas HMWP1 e HMWP2, estão envolvidos na biossíntese de
yersiniabactina, enquanto fyuA codifica para o receptor do sideróforo na membrana
externa da bactéria.
O estudo de Pelludat e colaboradores (1998) demonstrou que a
inativação de irp1 e/ou irp2 resulta em regulação negativa das proteínas envolvidas na
síntese e ligação de yersiniabactina. Inativação de irp1 foi seguida de considerável
redução das proteínas HMWP2 e FyuA, sugerindo que o operon de Ybt é sujeito a auto-
regulação por seu produto, o sideróforo.
Esta regulação também foi demonstrada pelo estudo de Perry e
colaboradores (1999), que demonstraram que Ybt purificada foi capaz de aumentar a
captação de ferro e expressão do gene fyuA, que codifica o receptor de membrana
externa de yersiniabactina, exercendo seu efeito regulatório em nível de transcrição
gênica. Os resultados sugeriram que yersiniabactina aparentemente possui um papel
regulatório no controle de sua própria síntese assim como na expressão de seu
receptor de membrana externa, sendo um ativador da transcrição gênica (SCHUBERT
et al., 2002).
Schubert e colaboradores (1998) sugeriram que cepas de E. coli que
carregam o operon de Ybt são capazes de produzir o sideróforo yersiniabactina, e que
este pode contribuir para a virulência destes isolados.
Em um trabalho posterior (SCHUBERT et al., 2000) testaram duas
cepas de ExPEC e seus respectivos mutantes irp1 para avaliar o efeito virulento de HPI
em ratos. As cepas foram inoculadas subcutaneamente, e os resultados mostraram que
as cepas selvagens estiveram significativamente mais associadas à letalidade em ratos
do que as cepas mutantes.
25
4.3 R
ESISTÊNCIA SÉRICA
Bactérias são mortas pelo soro humano normal pela atividade lítica do
sistema complemento. A resistência ao soro é resultado dos efeitos individuais ou
combinados de polissacarídeos capsulares, polissacarídeos O e proteínas de superfície
(JOHNSON, 1991).
Resistência sérica está associada a muitas cepas uropatogênicas,
especialmente àquelas que causam infecções renais e sistêmicas a partir do trato
urinário. Segundo Johnson (1991), cepas resistentes ao soro geralmente são mais
nefropatogênicas do que as sensíveis. Isolados de pacientes com pielonefrite e cistite
são mais resistentes ao soro do que cepas isoladas de pacientes com bacteriúria
assintomática ou amostras fecais. Porém, pacientes com pielonefrite são menos
passíveis de apresentarem uma cepa resistente ao soro quando anormalidades
urológicas estão presentes, o que se deve provavelmente a falhas no efeito do soro do
hospedeiro.
O plasmídio mais conhecidamente responsável pela resistência sérica é
o plasmídio ColV, que carrega determinantes para a produção de colicina V. Colicina V
(ColV) é comumente produzida por cepas de E. coli isoladas de bacteremias em
humanos e animais (MINSHEW et al., 1978) e trata-se de uma proteína antibacteriana,
cujo gene é transportado por plasmídios ColV (CARBONETTI e WILLIAMS, 1984), que
codificam tanto para produção quanto para resistência à colicina V (JOHNSON, 1991).
Segundo Williams e Warner (1980), a presença de plasmídios ColV
está associada com a habilidade aumentada de cepas bacterianas de sobreviver e
proliferar em tecidos e fluidos de animais infectados.
O efeito virulento dos plasmídios ColV não é mediado pela produção de
ColV, mas sim por vários fatores comumente carreados por estes plasmídios. Cepas
possuidoras de plamídios ColV podem expressar algumas propriedades fenotípicas que
podem contribuir para sua patogenicidade, tais como aderência, resistência aumentada
ao soro e sistema de captação de ferro (CARBONETTI and WILLIAMS, 1984;
JOHNSON, 1991).
26
A resistência ao soro conferida por plasmídios ColV em alguns casos é
atribuída à proteína Iss (increased serum survival), codificada pelo gene iss. Rodriguez-
Siek e colaboradores (2005) demonstraram que diferentemente do que acontece em
APEC, onde iss é encontrado em associação com cvaC, estes genes raramente estão
associados em cepas de UPEC, nas quais iss é mais encontrado em plasmídios não-
ColV ou em ilhas de patogenicidade cromossomais.
O gene iss codifica a proteína Iss, uma lipoproteína de 10-11 kDa da
membrana externa bacteriana (HORNE et al., 2000), e está localizado em um plasmídio
conjugativo R, com um tamanho aproximado de 100 kilobases, juntamente com outros
genes de virulência e de resistência a antimicrobianos. Este plasmídio pode ser
transferido, por conjugação para outras bactérias avirulentas, inclusive outras E. coli
(JOHNSON et al., 2002; JOHNSON et al., 2004).
O gene iss foi descrito pela primeira vez pelo seu papel na resistência
ao soro, associado ao plasmídio ColV em isolado de E. coli humana, e é responsável
pelo bloqueio do complexo terminal do sistema complemento que atua na membrana
celular causando a lise da célula. Portanto, ele confere à bactéria resistência ao
complemento, que é um mecanismo de defesa do hospedeiro e que atua contra
infecções, especialmente bacterianas, pois é capaz de promover opsonização e lise do
agente infeccioso (BINNS et al., 1982).
4.4 T
OXINAS
As funções específicas das toxinas, como α-hemolisina (Hly) e fator
citotóxico necrotizante tipo 1 (CNF1), na patogênese de ITU mediada por UPEC são
pouco entendidas. Entretanto, estas duas toxinas são coexpressas por muitas cepas
(DAVIS et al., 2006), e são conhecidas por causarem citotoxicidade direta aos tecidos
do hospedeiro (YAMAMOTO, 2007).
A α-hemolisina é uma proteína secretada por cepas de E. coli e
representa um importante fator de virulência em infecções extraintestinais, como
27
infecções do trato urinário, meningite em neonatos, bacteremia e septicemia
(MANSSON et al., 2007).
Hly foi originalmente caracterizada por sua habilidade em lisar
eritrócitos, a qual está relacionada à formação de poros transmembrana nestas células
e é dependente de cálcio (MAY et al., 2000), embora lise na ausência de cálcio tenha
sido descrita (JOHNSON,1991).
Alfa-hemolisina é uma toxina formadora de poros, permitindo, assim, o
extravasamento do conteúdo citoplasmático da célula. Possui amplo espectro de
atuação, que inclui eritrócitos, leucócitos, células endoteliais e do epitélio renal (EMÖDY
et al., 2003), de maneira tal que provavelmente contribui para inflamação e injúria
tecidual. A exposição de leucócitos polimorfonucleares à hemolisina estimula
degranulação e liberação de leucotrienos e ATP, causa alterações morfológicas e
prejudica a quimiotaxia e fagocitose (JOHNSON, 1991).
A ação da hemolisina sobre eritrócitos tem como conseqüência a
liberação de hemoglobina e ferro, que atuam como adjuvantes para o crescimento
bacteriano (MAY et al., 2000).
A produção de hemolisina está associada a cepas de E. coli
patogênicas a humanos, especialmente àquelas causando formas mais severas de ITU.
Segundo May e colaboradores (2000), aproximadamente 50% dos isolados de E. coli
responsáveis por infecções extraintestinais em humanos são hemolíticas.
Esta citotoxina é produzida in vivo durante ITU por cepas
uropatogênicas. Em estágios iniciais de infecção, quando a bactéria ascende e coloniza
o trato urinário, Hly deve agir em células epiteliais, evocando resposta inflamatória
(MANSSON et al., 2007). É provável que a pró-virulência da hemolisina seja
multifatorial, incluindo a liberação de ferro dos eritrócitos, a interrupção da função
fagocitária e a toxicidade direta a tecidos do hospedeiro. Em modelos de ITU
ascendente em ratos, a produção de hemolisina esteve associada a maior colonização
da bexiga e nefropatogenicidade (JOHNSON, 1991).
A produção de hemolisina é codificada por um operon constituído por 4
genes (hlyA, hlyB, hlyC e hlyD), designado hly. O operon pode ser encontrado em
plasmídios ou no cromossomo (OROPEZA-WEKERLE et al., 1989). Segundo Johnson
28
(1991), hly está localizado no cromossoma bacteriano em isolados de humanos, em
contraste com a localização plasmidial do operon comumente encontrada em isolados
de animais.
Cepas de E. coli hemolíticas podem carregar mais de um determinante
de hemolisina integrado no cromossomo (KNAPP et al.,1984; JOHNSON, 1991), e é
geralmente codificada por ilhas de patogenicidade em UPEC (YAMAMOTO, 2007).
HlyA é a proteína estrutural e é secretada através da membrana
citoplasmática e da membrana externa sem causar lise celular e sem que haja a
clivagem de um peptídeo sinal. O primeiro passo na secreção da hemolisina é um
processo dependente de energia envolvendo HlyB, enquanto a liberação na membrana
externa é passiva e requer HlyD. Para ligar-se a eritrócitos e apresentar atividade
hemolítica, HlyA deve ser ativada pela proteína intracelular HlyC anteriormente a sua
secreção (OROPEZA-WEKERLE et a., 1989; JOHNSON, 1991). A produção de
hemolisina em algumas cepas parece ser regulada pela concentração de ferro, sendo
suprimida em condições de alta concentração intracelular de ferro e aumentada em
baixa concentração do mesmo (JOHNSON, 1991).
Em um estudo de Triffilis e colaboradores (1994), foi obeservada uma
significativa ação letal de cepas de E. coli hemolíticas incubadas em cultura de células
epiteliais renais de túbulo proximal (HRPTEC). Ocorreu morte rápida de HRPTEC,
reduzindo a poucas células viáveis em um período de incubação de 3 horas, em
contraste com a viabilidade de virtualmente todas as células incubadas com uma cepa
mutante, não produtora de hemolisina, no mesmo período de incubação. O efeito da
hemolisina como fator primário da citoletalidade é apoiado por duas linhas de evidência:
a presença de atividade citoletal no sobrenadante filtrado da cultura de E. coli, sendo
que hemolisina é uma das poucas proteínas secretadas no sobrenadante da cultura e
uma cepa mutante incapaz de expressar o operon hly foi significantemente menos letal
do que a cepa selvagem.
Segundo Mansson e colaboradores (2007), hemolisina exerce efeito
citolítico quando presente em altas concentrações, enquanto que em baixas
concentrações tem demonstrado induzir sinalização intracelular de cálcio, levando a
respostas pró-inflamatórias, como a produção de interleucinas 6 e 8.
29
Fator citotóxico necrotizante (CNF1) é uma toxina codificada pelo
cromossomo de UPEC. É uma proteína de aproximadamente 115kDa que catalisa a
deamidação de uma família de GTPases denominada Rho, que funcionam como
reguladoras da organização espacial do citoesqueleto de actina.
As moléculas da família Rho de GTPases, quando ligadas ao GTP, são
ativas e estimulam outras enzimas celulares. Depois que o GTP é hidrolisado a GDP,
estas GTPases ficam inativas. A deamidação destas enzimas pela ação de CNF1
previne a hidrólise de GTP a GDP, o que resulta na ativação constitutiva das GTPases
(DAVIS et al., 2005), levando à remodelação do citoesqueleto de actina e formação de
extensões de membrana na célula hospedeira, com um efeito geral de bloqueio da
citocinese e conseqüente formação de células gigantes multinucleadas (MILLS et al.,
2000; RIPPERE-LAMPE et al., 2001; DAVIS et al., 2005; KOUOKAM et al., 2006).
A reciclagem dos membros da família Rho de GTPases entre as formas
ativa e inativa é essencial para o funcionamento adequado de células eucarióticas, tais
como neutrófilos (DAVIS et al., 2006), que são responsáveis pela defesa do hospedeiro
a infecções bacterianas.
CNF1 apresenta-se como uma toxina A-B, na qual o domínio catalítico
A está localizado na região carboxi-terminal e o domínio B de ligação celular está na
região amino-terminal. Nenhum peptídio de sinalização típico é encontrado na
seqüência de CNF1, e o mecanismo de secreção desta toxina continua desconhecido
(KOUOKAM et al., 2006).
Kouokam e colaboradores (2006) demonstraram que CNF1 é secretado
por UPEC por um mecanismo que inclui vesículas de membrana externa. CNF1 foi
detectada no sobrenadante de cultura, indicando que é uma proteína secretada,
estando associada a vesículas de membrana externa, que fornecem um meio de
transporte seguro para a toxina. Esta associação de CNF1 a vesículas também foi
demonstrada por Davis e colaboradores (2006) que, estudando o efeito de CNF1 sobre
neutrófilos polimorfonucleares, demonstraram que as vesículas interagem com
neutrófilos, diminuindo sua atividade antimicrobiana. Também foi verificada uma
diminuição da resposta quimiotática de neutrófilos polimorfonucleares quando
incubadas com as vesículas contendo CNF1, porém quando estas células foram
30
expostas a CNF1 purificada, nenhum efeito na quimiotaxia foi verificado. Este resultado
demonstra a necessidade das vesículas para a interação com estas células, sugerindo
que tais vesículas devem atuar como um importante veículo para CNF1 durante
infecção por UPEC.
Para avaliar a contribuição de CNF1 para a uropatogênese, Mills e
colaboradores (2000) estudaram o efeito da intoxicação por CNF1 em culturas de
células de bexiga, ureter e rim. Foi demonstrado que cepas de UPEC produtoras de
CNF1 são capazes de matar células uroepiteliais da bexiga, e que esta morte ocorre
por um mecanismo apoptótico. Os autores propõe um modelo em que CNF1, assim
como fímbria tipo 1, promove descamação de células uroepiteliais infectadas por UPEC
por indução de apoptose nas mesmas. A morte celular causada por CNF1 ou danos
teciduais conseqüentes de resposta inflamatória intensa permitem à cepa infectante ter
acesso a tecidos mais profundos (RIPPERE-LAMPE et al., 2001).
Mills e colaboradores (2000) também demonstraram que CNF1 deve
promover captura de bactérias pelas células epiteliais do hospedeiro, devido a
observação de indução da fagocitose em células HEp-2 estimulada pela toxina. Ainda
neste estudo, foi observada ausência de formação de fibras de tensão de actina em
todos os tipos celulares testados, um fenômeno considerado essencial de intoxicação
por CNF1 em células HEp-2. O fenótipo típico de multinuclearidade anormal não foi
evidente em cortes de bexiga em modelo de infecção experimental em ratos realizado
por Rippere-Lampe e colaboradores (2001).
Neste estudo de Rippere-Lampe e colaboradores (2001), UPEC
expressando CNF1, quando comparada à sua mutante isogênica, causou maior
resposta inflamatória aguda na bexiga, colonizou mais extensivamente em experimento
de coinfecção e apresentou maior taxa de sobrevivência quando incubada com
neutrófilos humanos. Portanto, considera-se que CNF1 facilita a sobrevivência de
UPEC durante a resposta inflamatória aguda, modulando a função de leucócitos
polimorfonucleares, incluindo a regulação negativa de fagócitos (DAVIS et al., 2005).
31
5 GRUPOS FILOGENÉTICOS
Quatro grupos filogenéticos principais, A, B1, B2 e D, foram descritos
por Herzer e colaboradores (1990) usando a técnica de MLEE (multilocus enzyme
electrophoresis) em uma coleção de E. coli de referência (ECOR) (OCHMAN e
SELANDER, 1984). A coleção ECOR compreende 72 cepas de E. coli isoladas de
humanos e outros mamíferos de diversas áreas geográficas, e representa parte da
diversidade clonal de E. coli (RESTIERI et al., 2007).
A análise filogenética tem sido amplamente utilizada para caracterizar
cepas de E. coli que causam infecções extraintestinais em estudos epidemiológicos. Em
geral, ExPEC de maior potencial de virulência pertencem ao grupo filogenético B2 e,
em menor extensão, ao grupo D, enquanto cepas comensais ou de menor potencial
virulento pertencem aos grupos A e B1 (PICARD et al., 1999; CLERMONT et al., 2000;
DURIEZ et al., 2001; BINGEN-BIDOIS et al., 2002; MAYNARD et al., 2004).
Cepas de ExPEC do grupo B2 geralmente contêm numerosos
determinantes de virulência implicados em infecções extraintestinais (ZHANG et al.,
2002). As pertencentes ao grupo D geralmente apresentam menor número de fatores
de virulência do que as do grupo B2, porém também estão associadas a infecções
extraintestinais. Já cepas dos grupos A e B1 estão raramente associadas a infecções
extraintestinais (RESTIERI et al., 2007), e freqüentemente possuem menos fatores de
virulência e, portanto, seriam menos capazes de causar infecção, exceto na presença
de comprometimento significativo do hospedeiro (PICARD et al., 1999; JOHNSON et
al., 2001; BINGEN-BIDOIS, 2002).
Johnson e colaboradores (2001), estudando 182 cepas de E. coli
isoladas de pacientes com bacteremia, encontraram uma prevalência de 65% de cepas
pertencentes ao grupo B2. Zhang e colaboradores (2002), estudando cepas isoladas de
infecção de trato urinário, encontraram uma prevalência de 69% de grupo B2, enquanto
em um estudo de Restieri e colaboradores (2007), a porcentagem chegou a 87% em
cepas isoladas de ITU.
32
Atualmente, o grupamento filogenético pode ser realizado por MLEE ou
ribotipagem, porém ambas as técnicas são complexas e demoradas e requerem uma
coleção de cepas tipadas. A criação de uma biblioteca subtrativa de cepas de E. coli
pertencentes a diferentes grupos filogenéticos e a caracterização de um fragmento de
DNA de 14.9 kb fortemente associado a cepas causadoras de meningite neonatal
sugeriram que certos genes ou fragmentos de DNA devem ser marcadores específicos
dos grupos filogenéticos.
Com base nestes resultados, Clermont e colaboradores (2000)
desenvolveram um método, baseado em PCR, de identificação rápida e simples dos
grupos filogenéticos de E. coli. O método tem como alvo os genes chuA, requerido para
o transporte de heme em E. coli enterohemorrágica O157:H7, e yjaA, gene descrito
inicialmente em E. coli K12 com função desconhecida, e também um fragmento de DNA
denominado TSPE4.C2.
Fig. 1 – Chave dicotômica para determiner o grupo filogenético de cepas de E. coli
baseado em amplificações por PCR (CLERMONT et al., 2000).
33
REFERÊNCIAS
BIELASZEWSKA, M., DOBRINDT, U., GÄRTNER, J., GALLITZ, I., HACKER, J.,
KARCH, H., MÜLLER, D., SCHUBERT, S., SCHMIDT, M. A., SORSA, L. J.,
ZDZIARSKI, J. (2007). Aspects of genome plasticity in pathogenic Escherichia coli. Int.
J. Med. Microbiol. 297:625-639.
BINGEN-BIDOIS, M., CLERMONT, O., BONACORSI, S., TERKI, M., BRAHIMI, N.,
LOUKIL, C., BARRAUD, D., BINGEN, E. (2002). Phylogenetic analysis and prevalence
of urosepsis strains of Escherichia coli bearing pathogenicity island-like domains. Infect.
Immun. 70:3216-3226.
BINNS, M.M.; MAYDEN, J.; LEVINE, R.P. (1982). Further characterization of
complement resistance conferred on Escherichia coli by the plasmid genes traT of R100
and iss of ColV, I-K94. Infect. Imm. 35:654-659.
BLOMFIELD, I. C. (2001). The regulation of pap and type 1 fimbriation in Escherichia
coli. Adv. Microb. Physiol. 45:1-49.
BONACORSI, S., HOUDOUIN, V., MARIANI-KURKDJIAN, P., MAHJOUB-MESSAI, F.,
BINGEN, E. (2006). Comparative prevalence of virulence factors in Escherichia coli
causing urinary tract infection in male with and without bacteremia. J. Clin. Microbiol.
44:1156-1158.
CARBONETTI, N. H.; WILLIAMS, P. H. (1984). A cluster of five genes specifying the
aerobactin iron uptake system of plasmid ColV-K30. Infect. Immun. 46:7-12.
CLERMONT, O., BONACORSI, S., BINGEN, E. (2000). Rapid and simple determination
of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl. Environ. Microbiol. 66:4555-4558.
DAVIS, J. M., RASMUSSEN, S. B., O’BRIEN, A. D. (2005). Cytotoxic necrotizing factor
type 1 production by uropathogenic Escherichia coli modulates polymorphonuclear
leukocyte function. Infect. Immun. 73:5301-5310.
DAVIS, J. M., CARVALHO, H. M. RASMUSSEN, S. B., O’BRIEN, A. D. (2006).
Cytotoxic necrotizing factor type 1 delivered by outer membrane vesicles of
uropathogenic Escherichia coli attenuates polymorphonuclear leukocyte antimicrobial
activity and chemotaxis. Infect. Immun. 74:4401-4408.
34
DURANT, L., METAIS, A., SOULAMA-MOUZE, C., GENEVARD, J. M., NASSIF, X.,
ESCAICH, S. (2007). Identification of candidates for a subunit vaccine against
extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Infec.t Immun. 75:1916-1925.
DURIEZ, P., CLERMONT, O., BONACORSI, S., BINGEN, E., CHAVENTRÉ, A., ELION,
J., PICARD, B., DENAMUR, E. (2001). Commensal Escherichia coli isolates are
phylogenetically distributed among geographically distinct human populations.
Microbiology. 147:1671-1676.
EMÖDY, L., KERÉNYI, M., NAGY, G. (2003) Virulence factors of uropathogenic
Escherichia coli. Int. J. Antimicrob. Agents. 22:29-33.
GUIDONI, E. B. M., DALPRA, V. A., FIGUEIREDO, P. M., LEITE, D. S., MÍMICA, L. C.,
YANO, T., BLANCO, J. E., TOPOROVSKI, J. (2006). E. coli virulence factors in children
with neurogenic bladder associated with bacteriuria. Pediatr. Nephrol. 21:376-381.
GUNTHER IV, N. W., SNYDER, J. A., LOCKATELL, V., BLOMFIELD, I., JOHNSON, D.
E., MOBLEY, H. L. T. (2002). Assessment of virulence of uropathogenic Escherichia coli
type 1 fimbrial mutants in which invertible element is phase-locked on or off. Infect.
Immun. 70:3344-3354.
HEIMER, S. R., RASKO, D. A., LOCKATELL, C. V., JOHNSON, D. E., MOBLEY, H. L.
(2004). Autotransporter genes pic and tsh are associated with Escherichia coli strains
that cause acute pyelonephritis and are expressed during urinary tract infection. Infect.
Immun. 72:593-597.
HERZER, P. J., INOUYE, S., INOUYE, M., WHITTAM, T. S. (1990). Phylogenetic
distribution of branched RNA-linked multicopy single-stranded DNA among natural
isolates of Escherichia coli. J Bacteriol. 172:6175-6181.
HOLDEN, N. J., GALLY, D. L. (2004). Switches, cross-talk and memory in Escherichia
coli adherence. J. Med. Microbiol. 53:585-593.
HOLDEN, N. J., TOTSIKA, M., MAHLER, E., ROE, A. J., CATHERWOOD, K.,
LINDNER, K., DOBRINDT, U., GALLY, D. L. (2006). Demonstration of regulatory cross-
talk between P fimbriae in uropathogenic Escherichia coli. Microbiology. 152:1143-
1153.
35
HORNE, S.M.; MCDONOUGH, J.P.; GIDDINGS, C.W.; NOLAN, L.K. (2000). Cloning
and sequencing of iss gene from virulent avian Escherichia coli. Avian Dis. 44:179-184.
HOOTON, T. M. (2000). Pathogenesis of urinary tract infections: an update. J
Antimicrob. Chemother. 46:1-7.
HULL, R. A., RUDY, D. C., WIESER, I. E., DONOVAN, W. H. (1998). Virulence factors
of Escherichia coli isolates from patients with symptomatic and asymptomatic bacteriuria
and neuropathic bladders due to spinal cord and brain injuries. J. Clin. Microbiol.
36:115-117.
JOHNSON, J. R.; MOSELEY, S. L.; ROBERTS, P. L.; STAMM, W. E. (1988). Aerobactin
and other virulence factor genes among strains of Escherichia coli causing urosepsis:
association with pacient characteristics. Infect. Immun. 56:405-412.
JOHNSON, J. R. (1991). Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection.
Clin. Microbiol. Rev. 4:80-128.
JOHNSON, J. R., RUSSO, T. A., BROWN J. J., STAPLETON, A. (1998). papG alleles of
Escherichia coli strains causing first-episode or recurrent acute cystitis in adult women.
J. Infect. Dis. 177:97-101.
JOHNSON, J. R., STELL, A. L. (2000). Extended virulence genotypes of Escherichia coli
strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise. J.
Infect. Dis. 181:261-272.
JOHNSON, J. R., STELL, A. L., SCHEUTZ, F., O’BRYAN, T. T., RUSSO, T. A.,
CARLINO, U. B., FASCHING, C., KAVLE, J., VAN DIJK, L., GAASTRA, W. (2000).
Analysis of the F antigen-specific papA alleles of extraintestinal pathogenic Escherichia
coli using a novel multiplex PCR-based assay. Infect. Immun. 68:1587-1599.
JOHNSON, J. R., O’BRYAN, T. T., KUSKOWSKI, M., MASLOW, J. N. (2001). Ongoing
horizontal and vertical transmission of virulence genes and papA alleles among
Escherichia coli blood isolates from patients with diverse-source bacteremia. Infect.
Immun. 69:5363-5374.
36
JUSTICE, S. S., HUNG, C., THERIOT, J. A., FLETCHER, D. A.,ANDERSON, G. G.,
FOOTER, M. J., HULTGREN, S. J. (2004). Differentiation and development pathways of
uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. PNAS. 101: 1333-1338.
KNAPP, S., HACKER, J., THEN, I., MÜLLER, D., GOEBEL, W. (1984). Multiple copies
of hemolysin genes and associated sequences in the chromosomes of uropathogenic
Escherichia coli strains. J. Bacteriol. 159:1027-1033.
KOBAYASHI, R. K., GAZIRI, L. C., VENÂNCIO, E. J., VIDOTTO, M. C. (2007).
Detection of Tsh protein mucinolytic activity by SDS-PAGE. J. Microbiol. Methods. 68:
654-655.
KOSTAKIOTI, M., STATHOPOULOS, C. (2004). Functional analysis of the Tsh
autotransporter from an avian pathogenic Escherichia coli strain. Infect. Immun.
72:5548-5554.
KOUOKAM, J. C., WAI, S. N., FÄLLMAN, M., DOBRINDT, U., HACKER, J., UHLIN. B.
E. (2006). Active cytotoxic necrotizing factor 1 associated with outer membrane vesicles
from uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 74:2022-2030.
LE BOUGUENEC, C., ARCHAMBAUD, M., LABIGNE, A. (1992). Rapid and specific
detection of the pap, afa, and sfa adhesion-encoding operon in uropathogenic
Escherichia coli strains by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30:1189-1193.
MANSSON, L. E., KJÄLL, P., PELLETT, S., NAGY, G., WELCH, R. A., BÄCKHED, F.,
FRISAN, T., RICHTER-DAHLFORS, A. (2007). Role of lipopolysaccharide-CD14
complex for the activity of hemolysin from uropathogenic Escherichia coli. Infect.
Immun. 75:997-1004.
MAY, A. K., GLEASON, T. G., SAWYER, R. G., PRUETT, T. L. (2000). Contribution of
Escherichia coli alpha-hemolysin to bacterial virulence and to intraperitoneal alterations
in peritonitis. Infect. Immun. 68:176-183.
MAYNARD, C., BEKAL, S., SANSCHAGRIN, F., LEVESQUE, R. C., BROUSSEAU, R.,
MASSON, L., LARIVIÈRE, S., HAREL. J. (2004). Heterogeneity among virulence and
antimicrobial resistance gene profiles of extraintestinal Escherichia coli isolates of
animal and human origin. J. Clin. Microbiol. 42:5444-5452.
37
MILLS, M., MEYSICK, K. C., O’BRIEN, A. D. (2000). Cytotoxic necrotizing factor type 1
of uropathogenic Escherichia coli kills cultured human uroepithelial 5637 cells by an
apoptotic mechanism. Infect. Immun. 68:5869-5880.
MINSHEW, B. H.; JORGENSEN, J.; COUNTS, G. W.; FALKOM, S. (1978). Association
of hemolysin production, hemagglutination of human erythrocytes, and virulence for
chicken embryos of extraintestinal Escherichia coli isolates. Infect. Immun. 20:50-54.
MYSOREKAR, I. U., HULTGREN, S. J. (2006). Mechanisms of uropathogenic
Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. PNAS. 103:14170-
14175.
OBATA-YASUOKA, M., BA-THEIN, W., TSUKAMOTO, T., YOSHIKAWA, H., HAYASHI,
H. (2002). Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes
and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148:2754-2752.
OCHMAN, H., SELANDER, R. K. (1984). Standard reference strains of Escherichia coli
from natural populations. J. Bacteriol. 157:690-693.
OELSCHLAEGER, T. A., DOBRINDT, U., HACKER, J. (2002). Virulence factors of
uropathogens. Curr. Opin. Urol. 12:33-38.
OROPEZA-WEKERLE, R. L., MÜLLER, E., KERN, P., MEYERMANN, R., GOEBEL, W.
(1989). Synthesis, inactivation, and localization of extracellular and intracellular
Escherichia coli hemolysins. J. Bacteriol. 171:2783-2788.
PELLUDAT, C., RAKIN, A., JACOBI, C. A., SCHUBERT, S., HEESEMANN, J. (1998).
The Yersiniabactin Biosynthetic Gene Cluster of Yersinia enterocolitica: Organization
and Siderophore-Dependent Regulation. J. Bacteriol. 180:538-546.
PERRY, R. D., BALBO, P. B., JONES, H. A., FETHERSON, J. D., DEMOLL, E. (1999).
Yersiniabactin from Yersinia pestis: biochemical characterization of the siderophore and
its role in iron transport and regulation. Microbiology. 145:1181-1190.
PICARD, B., GARCIA, J. S., GOURIOU, S., DURIEZ, P., BRAHIMI, N., BINGEN, E.,
ELION, J., DENAMUR, E. (1999). The link between phylogeny and virulence in
Escherichia coli extraintestinal infection. Infect. Immun. 67:546-553.
38
RESTIERI, C., GARRISS, G., LOCAS, M. C., DOZOIS, C. M. (2007). Autotransporter-
Encoding Sequences Are Phylogenetically Distributed among Escherichia coli Clinical
Isolates and Reference Strains. Appl. Environ. Microbiol. 73:1553-1562.
RIPPERE-LAMPE, K. E., O’BRIEN, A. D., CONRAN, R., LOCKMAN, H. A. (2001).
Mutation of the gene encoding cytotoxic necrotizing factor type 1 (cnf(1)) attenuates the
virulence of uropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 69:3954-3964.
RODRIGUEZ-SIEK, K. E., GIDDINGS, C. W., DOETKOTT, C., JOHNSON, T. J.,
FAKHR, M. K., NOLAN, L. K. (2005). Comparison of Escherichia coli implicated in
human urinary tract infection and avian colibacillosis. Microbiology. 151:2097-2110.
ROOS, V., ULETT, G. C., SCHEMBRI, M. A., KLEMM, P. (2006). The asymptomatic
bacteriuria Escherichia coli strain 83972 outcompetes uropathogenic E. coli strains in
human urine. Infect. Immun. 74:615-624.
SABATÉ, M., MORENO, E., PÉREZ, T., ANDREU, A., PRATS, G. (2006). Pathogenicity
island markers in commensal and uropathogenic Escherichia coli isolates. Clin.
Microbiol. Infect. 12: 880-886.
SALYERS, A. A., WHITT, D. D. (2001). Escherichia coli extraintestinal infections. In
Bacterial pathogenesis - A molecular approach. 2nd. ed. Washington,
D.C.: ASM Press.
p. 422-436.
SCHLAGER, T. A., DILKS, M. D. S., TRUDELL, R. N., WHITTAM, T. S., HENDLEY, M.
D. (1995). Bacteriuria in children with neurogenic bladder treated with intermittent
catheterization: natural history. J. Pediatr. 126(3): 490-495.
SCHLAGER, T. A., WHITTAM, T. S., HENDLEY, J. O., WILSON, R. A., BHANG, J.,
GRADY, R., STAPLETON, A. (2000). Expression of virulence factors among
Escherichia coli isolated from the periurethra and urine of children with neurogenic
bladder on intermittent catheterization. Pediatr. Infect. Dis J. 19:37–41.
SCHMIDT, H., HENSEL, M. (2004). Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis.
Clin. Microbiol. Rev. 17:14-56.
39
SCHUBERT, S., RAKIN, A., KARCH, H., CARNIEL, E., HEESEMANN, J. (1998).
Prevalence of the “high-pathogenicity island” of Yersinia species among Escherichia coli
strains that are pathogenic to humans. Infect. Immun. 66:480-485.
SCHUBERT, S., PICARD, B., GOURIOU, S., HEESEMANN, J., DENAMUR, E. (2002).
Yersinia high-pathogenicity island contributes to virulence in Escherichia coli causing
extraintestinal infections. Infect. Immun. 70:5335-5337.
SKYBERG, J. A., JOHNSON, T. J., JOHNSON, J. R., CLABOTS, C., LOGUE, C. M.,
NOLAN, L. K. (2006). Acquisition of avian pathogenic Escherichia coli plasmids by
commensal E. coli isolate enhances its abilities to kill chicken embryos, grow in human
urine, and colonize the murine kidney. Infect. Immun. 74:6287-6292.
SNYDER, J. A., LLOYD, A. L., LOCKATELL, C. V., JOHNSON, D. E., MOBLEY, H. L. T.
(2006). Role of phase variation of type 1 fimbriae in a uropathogenic Escherichia coli
cystitis isolate during urinary tract infection. Infect Immun. 74:1387-1393.
SOTO, S. M., SMITHSON, A., HORCAJADA, J. P., MENSA, J. P., VILA, J. (2006).
Implication of biofilm formation in the persistence of urinary tract infection caused by
uropathogenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Infect. 12:1034-1036.
STATHOPOULOS, C., PROVENCE, D. L., CURTISS III, R. (1999). Characterization of
the avian pathogenic hemagglutinin Tsh, a member of the immunoglobulin A protease-
type family of autotransporters. Infect. Immun. 67:772-781.
TRIFILLIS, A. L., DONNENBERG, M. S., CUI, X., RUSSELL, R. G., UTSALO, S. J.,
MOBLEY, H. L. T., WARREN, J. W. (1994). Binding to and killing of human renal
epithelial cells by hemolytic P-fimbriated E. coli. Kidney International. 46:1083-1091.
WAITES, K. B., CANUPP, K. C., ROPER, J. F., CAMP, S. M., CHEN, Y. (2006).
Evaluation of 3 methods of bladder irrigation to treat bacteriuria in persons with
neurogenic baldder. J. Spinal Cord Med. 29:217-226.
WILLIAMS, P. H., WARNER, P. J. (1980). ColV plasmid-mediated, Colicin V-
independent iron uptake system of invasive strains of Escherichia coli. Infect. Immun.
29:411-416.
40
YAMAMOTO, S. (2007). Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. J.
Infect. Chemother. 13:68-73.
ZHANG, L., FOXMAN, B., MARRS, C. (2002). Both urinary and rectal Escherichia coli
isolates are dominated by strains of phylogenetic group B2. J. Clin. Microbiol. 40:3951-
3955.
41
OBJETIVOS
O
BJETIVO GERAL
Caracterizar genotipicamente as amostras de Escherichia coli isoladas
de crianças com bexiga neurogênica de Londrina, Paraná quanto à presença de fatores
de virulência relacionados a infecções do trato urinário, agrupar as amostras nos
diferentes grupos filogenéticos e estudar a similaridade genética entre os isolados de
diferentes sítios de cada paciente.
O
BJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Estudar a freqüência de diferentes genes que codificam para adesinas,
sideróforos, fatores de resistência sérica e toxinas relacionadas a UPEC.
2. Classificar as cepas isoladas nos diferentes grupos filogenéticos pela técnica
de PCR.
3. Correlacionar a presença de genes para fatores de virulência com grupos
filogenéticos.
4. Realizar tipagem molecular das cepas por BOX-PCR para possível avaliação
da via de infecção.
42
Detection of virulence genes, distribution in phylogenetic groups and genetic
similarities among Escherichia coli strains isolated from urine, periurethral and
perianal regions of children with neurogenic bladder.
NIMTZ, A. V.; TAVARES, M. S., PELOI, H. M., VIDOTTO, M. C., KOBAYASHI, R. K., SARIDAKIS,
H. O.
ABSTRACT
Neurogenic bladder occurs as consequence of different events that affect the normal
function of the organ. Urinary tract infection (UTI) is the most frequent complication found in
patients with such alteration, and Escherichia coli is the most commonly microorganism
isolated from this infection. In this study, E. coli strains isolated from urine and periurethral
and perianal regions of 16 children with neurogenic bladder were analyzed for the presence
of genes coding for some virulence factors related to UPEC (uropathogenic E. coli) using
PCR technique. Virulence factors studied were type 1 fimbriae (fimH), P fimbriae (papC and
papG), temperature-sensitive hemaglutinin (tsh), yersiniabactin receptor (fyuA), aerobactin
receptor (iutA), ColV plasmid (cvaC), increased serum survival (iss), hemolysin (hlyA) and
cytotoxic necrotizing factor (cnf1). Strains were assigned into phylogenetic groups
according to Clermont et al. (2000) and their genetic similarities were analyzed using BOX-
PCR technique. We found a high frequency of fimH (100%), fyuA (95,6%) and iutA (91,3%)
among the isolates. cnf1, iss and hlyA were present in 56,5%, 39,1% and 36,2% of the
strains, respectively. The other studied genes occurred in less than 30% of the strains. Most
of the isolates were classified as belonging to pathogenic groups B2 and D (37,7% and
30,4%, respectively). BOX-PCR confirmed the hypothesis of intestinal origin of E. coli
strains causing urinary tract infections, and demonstrated the importance of periurethral
colonization by these microorganisms.
KEY WORDS: E. coli, neurogenic bladder, virulence genes, urinary tract infection, phylogenetic
groups.
43
INTRODUCTION
Neurogenic bladder may be caused by many diseases or events affecting the
nervous system responsible for controlling the urinary tract and bacteriuria is present in
approximately 70% of patients with this condition (GUIDONI et al., 2006). Urinary tract
infections (UTIs) are among the most common human infections and Escherichia coli is
responsible for at least 80% of these infections (KOUOKAM et al., 2006; ROOS et al.,
2006). The severity of the UTI depends both on the virulence of the infecting bacteria
and on susceptibility of the host (JOHNSON, 1991; LE BOUGUENEC et al., 1992).
To achieve pathogenicity, uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains produce
several virulence factors such as adhesins, hemolysin, aerobactin siderophore system,
capsule and cytotoxic necrotizing factor type 1 (KOUOKAM et al., 2006; YAMAMOTO,
2007). Virulence factors are traits that allow bacteria to adhere, colonize, cause tissue
invasion or destruction and alter host inflammatory response (MAY et al., 2000).
Strains causing UTI in patients with anatomically and functionally normal urinary
tracts often harbor several virulence factors. In contrast, patients with urinary tract
abnormalities are more susceptible to colonization of the urinary tract by conventional E.
coli lacking these traits (LE BOUGUENEC et al., 1992; JOHNSON and STELL, 2000).
According to Schlager et al. (2000), inadequate bladder emptying, a condition found in
patients with neurogenic bladder, may be one of the facts that allow E. coli without
known virulence determinants to cause UTI.
Picard et al. (1999) reported that the status of the host may be critical to the
development of an infection, independent of the presence or absence of virulence
factors, and, thus, the “virulent” or “nonvirulent” character of a strain cannot be
44
systematically inferred from the circumstances in which the strain was isolated
(asymptomatic or symptomatic) or phylogenetic group to which strain is assingned into.
We undertook the present study to gain an understanding of the prevalence of
virulence genes and phylogenetic distribution E. coli isolates from children with
neurogenic bladder. For this purpose, we decided to study not only bacteria present in
urine of these patients, but also strains of E. coli that were carried by these patients
colonizing the periurethral and perianal regions, which constitute the main source of
bacteria to urinary tract infections. We also submitted the strains to BOXA1R technique,
to study the genetic similarity among the strains and, possibly, define the major source
of UTI.
The characterization and comparison of virulence genotypes and affiliation into
phylogenetic groups with the help of BOXA1R technique may lead to a comprehensive
picture of the origins and spread of virulence factors within the population of the isolates.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. Samples for this study were collected from periurethra and
perianal regions and urine of children with neurogenic bladder attended at the
Ambulatory of Neurogenic Bladder of the Universidade Estadual de Londrina. The first
sampling was performed when children presented no symptons of UTI. The second one
was realized when the symptons of UTI were present.
Samples from periurethra and perianal regions were collected with sterile swabs
and grown in MacConkey agar. Urines were cultured in CLED and MacConkey. The
bacterial species were identified following the methods described by Toledo et al. (1982
a/b).
45
Determination of antibiotic susceptibility. Susceptibility of the strains to 9
antimicrobial agents was determined by disk diffusion technique (Bauer et al., 1966;
CLSI, 2005). The following antibiotics were used: nalidixic acid, amicacin, cephalotin,
ceftazidime, ceftriaxone, ciprofloxacin, cotrimoxazole (sulfamethoxazole-trimethoprim),
nitrofurantoin and the association of piperacilin and tazobactam.
DNA extraction. The DNA extraction was realized as previously described by
Kaschuk et al. (2006). To confirm the density and purity of the DNA, samples were
submitted to eletrophoresis in 1% agarose gel for 40 minutes at 80V and visualized in
Vilber Lourmat ETX 20.M transilluminator.
Virulence factors. E. coli isolates were tested for 10 virulence genes of UPEC,
including adhesins such as type 1 fimbriae (fimH), fimbriae P (papC and papG);
temperature-sensitive hemagglutinin (tsh); siderophore yersiniabactin receptor (fyuA)
and receptor for aerobactin (iutA); factors associated with complement resistance such
as ColV plasmid (cvaC) and increased serum survival (iss) and toxins as hemolysin
(hlyA) and cytotoxic necrotizing factor type 1 (cnf1). Primer sequences are presented in
table 1. Amplification was done as described by Delicato et al. (2003), with some
modifications. Reactions mixtures were heated to 94
o
C for 5 min to activate Taq DNA
polymerase. This was followed by 30 cycles of denaturation at 94
o
C for 1 min, annealing
for 1 min (temperatures in Table 1), extension at 72
o
C for 2 min and a final extension at
72
o
C for 7 min. The amplicons were eletrophoresed in 1.5% agarose gels and stained
with ethidium bromide. A 1Kb plus DNA Ladder
TM
was used as standard.
46
Table 1.Oligonucleotides sequences, annealing temperatures, MgCl
2
concentrations and sizes of amplified fragments
Genes Sequences (5’ – 3’)
Fragment
sizes
[MgCl
2
]
Annealing
temperatures
References
fimH TGC AGA ACG GAT AAG CCG TGG
GCA GTC ACC TGC CCT CCG TGG
508 pb 2.5mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
papC GAC GGC TGT ACT GCA GGG TGT GGC G
ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AAT A
328 pb 1.5mM 65
o
C Le Bouguenec et al. (1992)
papG CTG TAA TTA CGG AAG TGA TTT CTG
ACT ATC CGG CTC CGG ATA AAC CAT
1070 pb 1.5mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
tsh
GGT GGT GCA CTG GAG TGG
AGT CCA GCG TGA TAG TGG
620 pb 1.5mM 55
o
C Dozois et al. (2000)
fyuA TGA TTA ACC CCG CGA CGG GAA
CGC AGT AGG CAC GAT GTT GTA
780 pb 2.5mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
iutA GGC TGG ACA TGG GAA CTG G
CGT CGG GAA CGG GTA GAA TCG
300 pb 2.0mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
cvaC CAC ACA CAA ACG GGA GCT GTT
CTT CCC GCA GCA TAG TTC CAT
680 pb 2.0mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
iss
GTG GCG AAA ACT AGT AAA ACA GC
CGC CTC GGG GTG GAT AA
760 pb 2.0mM 61
o
C Delicato et al. (2003)
hlyA AAC AAG GAT AAG CAC TGT TCT GGC T
ACC ATA TAA GCG GTC ATT CCC GTC A
1177 pb 2.5mM 63
o
C Johnson and Stell (2000)
cnf1 AGG AAG TTA TAT TTC CGT AGG
GTA TTT GCC TGA ACC GTA A
498 pb 2.5mM 60
o
C Johnson and Stell (2000)
Phylogenetic groups. The classification of the E. coli isolates in phylogenetic
groups was performed following the PCR based method described by Clermont et al.
(2000). The reaction was carried out in a final volume of 20µL containing 2.0mM of
MgCl
2
, 0.2mM of each dNTP, 1X PCR buffer, 20pmol of each primer, 2.5U of Taq
polymerase and 3 µL of DNA.
The primers used were chuA.1 (5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3 ') and chuA.2 (5'-
TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3'), yjaA.1 (5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3') and
yjaA.2 (5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3'), and TspE4C2.1 (5'-
GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3') and TspE4C2.2 (5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-
3'), which generate 279 -, 211 - and 152-pb fragments respectively. A two-step triplex
47
polymerase reaction was assessed, as follows: denaturation for 4 minutes at 94
o
C, 30
cycles of 5 s at 94
o
C and 10 s at 59
o
C, and a final extension step of 5 min at 72
o
C.
To determine the phylogenetic group of each strain, the following d
ichotomous tree
was used (Figure 1).
Fig. 1. Dichotomous tree to determine the phylogenetic group of E. coli strains using the results of PCR
amplification (CLERMONT et al., 2000).
BOX A1R-PCR. The amplification of the repetitive regions of the DNA was carried
out with the primer BOXA1R (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’) (Versalovic et
al., 1994). The reaction with a final volume of 25µL, contained 2.4mM of MgCl
2
, 0.3mM
of each dNTP, 1X PCR buffer, 20pmol of primer and 1U of Taq polymerase. PCR
conditions were as follows: initial denaturation at 95
o
C for 7 min, 35 cycles of
denaturation at 94
o
C for 1 min, annealing at 52
o
C for 1 min and extension at 65
o
C for 8
min, followed by a final extension at 65
o
C for 16 min. The amplicons were
eletrophoresed in 1.5% agarose gel (230 mm X 200 mm) at 120V for 6 hours. A 1Kb
plus DNA Ladder
TM
was used as standard.
Gel was stained with ethidium bromide, distained with distilled water, observed
and photographed by use of an ultraviolet transilluminator and capture system.
48
Band patterns obtained were analyzed by Bionumerics (Applied Mathematics,
Kortrijk, Belgium 3.50 version) and for the aggroupment analysis the UPGMA algorithm
(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean) was used (Sneath & Sokal,
1973) and Jaccard coefficient with 2% of tolerance.
RESULTS
Bacterial strains. We isolated 69 E. coli strains from 16 children. Ten children
were submitted to two samplings, resulting 52 strains, of which 24 were from the first
and 28 from the second sampling. The other 6 children did not present signs of UTI
during the period of this study and so were submitted to only one sampling, resulting in
17 E. coli strains.
Table 2. Distribution of resistance profiles, virulence genes and phylogenetic groups among the isolates.
Strains Drug resistance fimH papC papG
tsh
fyuA iutA cvaC
iss
hlyA cnf1
Phylogenetic
group
1UR CFL + - - - + + - - - + B1
1PU NAL + - - - + + - - - - B1
1PA - + - - - + + - - - - B1
1-2
nd
UR NAL + - - - + + - - - - B1
1-2
nd
PU NAL + - - - + + - - - - B1
1-2
nd
PA NAL + - + - + + - - - - A
4UR CFL-CRO + - - - + - - - - - D
4PU CFL-CRO + - - - + + - - - - D
6PA CFL-CRO + - - - + + - - + - D
6-2
nd
UR NAL-CIP-SUT + - - - - - - - - - B1
6-2
nd
PA - + - - - + - - - - - A
7UR SUT + + + - + - - - - - D
7PU CFL-SUT + + + - + + - - - - D
7PA CFL-SUT + + + - + + - - + - D
8PA - + - - - + + - - - - D
8-2
nd
UR CFL + - - - + + - - + + B2
8-2
nd
PU CFL + - - - + + + + + + B2
8-2
nd
PA CFL + - - - + + + + + - B2
11UR SUT + - - - + + - - + + B2
11PU SUT + - - - + + - + + + B2
11PA SUT + - - - + + - + + + B2
13UR NAL + - - - - + + - - + A
13PU NAL-CFL + - - - + + + + + + B2
13PA NAL + - - - + + + + - + A
13-2
nd
UR NAL-SUT + - - - + + + + - + B1
13-2
nd
PU NAL-SUT + - - - + + + + - + B1
13-2
nd
PA NAL-SUT + - - - + + + + - + B1
14UR SUT + - - - + + - - + + B2
14PU SUT + + + - + + - - - + D
14PA SUT + + + - + + - - + + B2
15UR SUT + - - - + + - - - + B2
15PU SUT + - - - + + - - - - B2
49
15PA SUT + - - - + + - - - - B2
15-2
nd
UR SUT + - - - + + - - - - B2
15-2
nd
PU SUT + - - - + + - - - + B2
15-2
nd
PA - + - - - - + - - - + D
18UR SUT + - - - + + - + - - D
18PU SUT + - - - + + - + - - D
18PA SUT + - - - + + - + - - D
18-2
nd
UR - + - - - + + - - - - D
18-2
nd
PA - + - - - + + - - - - D
20UR CFL-SUT + - - - + + - - - - A
20PU SUT + - - - + + - - - + A
20PA SUT + - - - + + - - - + A
23UR CFL-SUT + - - - + - - - - - D
23PU CFL-SUT + - - - + + - - + + B2
23PA CFL-SUT + - - - + + + - - - B2
23-2
nd
UR - + - - - + - - - - - A
23-2
nd
PU CFL-SUT + - - - + + - - + + B2
23-2
nd
PA - + - - - + + - - - - A
30UR NAL + - - + + + - + + + D
30PU NAL + - - + + + - + + + D
30PA NAL + - - + + + - + - + D
30-2
nd
UR NAL + - - + + + - + - + D
30-2
nd
PU CFL + - - - + + - - - + B1
30-2
nd
PA - + - - - + + - - + + B2
34UR - + + + - + + - + + + B2
34PU SUT + + + - + + - - + + B2
34PA SUT + - - - + + - + + + A
38UR NAL-CFL-CRO + - - + + + + + - - D
38PU NAL-CFL-CRO-SUT-NIT + - - + + + + + + + B2
38PA - + - - - + + + + - - A
38-2
nd
UR - + - - + + + + + + + B2
38-2
nd
PU - + - - + + + + + + + B2
38-2
nd
PA - + - + - + + + + - + D
43PA SUT + - - - + + + + - + B1
43-2
nd
UR - + - - - + + - - + + B2
43-2
nd
PU - + - - - + + + + + + B2
43-2
nd
PA SUT-NIT + - - - + + + + + + B2
CFL=cephalotin, NAL=nalidixic acid, SUT=cotrimoxazole (sulfamethoxazole + trimethoprim), CRO=ceftriaxone, NIT=nitrofurantoin, CIP=ciprofloxacin.
Drug Resistance. The 69 E. coli isolates presented no resistance to the following
antimicrobial drugs: amicacin, ceftazidime and the association of piperacilin and
tazobactam. Out of the isolates, 16 (23,2%) were susceptible to all antibiotics tested.
Among the 53 resistant strains, 33 (62,26%) were resistant to cotrimoxazole, 18
(33,96%) to cephalotin and 17 (32,07%) to nalidixic acid. Resistance to ceftriaxone,
nitrofurantoin and ciprofloxacin was found in 5, 2 and 1 strain, respectively. Thirty five
strains were resistant to only one antibiotic, 15 to a combination of 2 drugs, 2 were
resistant to 3 drugs and one strain presented resistance to 5 drugs (NAL-CFL-CRO-
50
SUT-NIT) (Table 2). No difference was observed in antimicrobial resistance between
strains isolated from children with UTI and those not associated with UTI .
Virulence genes and phylogenetic groups. Among the 69 isolates, 10 virulence
gene regions ranged in prevalence from 10,1% (papC) and 100% (fimH). The most
frequent virulence genes found were fimH (100%), fyuA (95,6%) and iutA (91,3%).
Some other genes, like cnf1 (56,5%), iss (39,1%) and hlyA (36,2%), were also present in
high percentage of the isolates. The other genes were present in less than 30% of the
strains (Table 3).
Genes encoding for P fimbriae (papC and papG) were found in few strains
(10,1% and 13%, respectively); papC, was found only in strains from the first sampling
group (asymptomatic), always combined with papG, whereas papG was found alone in 2
strains isolated from perianal region (1-2
nd
PA and 38-2
nd
PA), suggesting the presence of
partial copies or deletions in pap operon. Genetic determinants for fimbriae P were not
found in any case of symptomatic UTI.
Gene encoding for the autotransporter protein Tsh was found in 8 isolates
(11,6%). These strains belonged to two patients (30 and 38), and occurred in only one
strain from perianal region.
Iron acquisition systems occurred in most of the isolates; fyuA and iutA were the
second and third most prevalent genes found, respectively (95,6% vs. 91,3%; all strains
harbored fimH). Only three strains did not present fyuA, 2 urine isolates (1 from the first
and 1 from the second sampling) and 1 strain from perianal region (2
nd
sampling) and
these strains were isolated from different patients (6, 13 and 15). The genetic
determinant iutA (receptor for aerobactin) was absent in 6 strains, 5 of them isolated
51
from urine (3 from the first and 2 from the second sampling) and 1 of perianal region (2
nd
sampling).
Genetic determinant for colicin V production and also a marker for colV plasmid,
cvaC, was present in 18 strains, 12 of them were collected from only 2 patients (13 and
38 - 6 strains from each). Gene for increased serum survival, iss, was found in 27
strains. In 16 (59,26%) of these strains, cvaC was also found, while in the other 11
strains cvaC was not present.
Genetic determinant for Hly was found in 25 (36,2%) of the isolates. Cytotoxic
necrotizing factor gene-enconding cnf1 was present in 39 strains (56,5%).
Most of the isolates were assigned into phylogenetic groups B2 and D, 37,7%
and 30,4%, respectively. The other isolates were equally distributed between A and B1
groups (15,95%). There was little variation in the distribution of phylogenetic groups
among the sites of isolation, with group A strains being more often isolated from perianal
region. Isolates from urine and periurethra showed a slight predominance of B2 and D
phylogenetic groups. Two strains of group A and 1 strain of B1 were found causing
asymptomatic bacteriuria, and one and three strains of each group, respectively, were
isolated from UTI (2
nd
sampling). Strains belonging to phylogenetic groups B2 and D
were responsible for 77% of the asymptomatic bacteriuria cases and 60% of UTI cases.
Table 3. Frequency of virulence genes detected by PCR in strains of Escherichia coli isolated from urine,
periurethra and perianal regions.
1
st
sampling 2
nd
sampling
Virulence genes
UR
(n=13)
PU
(n=13)
PA
(n=15)
UR
(n=10)
PU
(n=8)
PA
(n=10)
Total
(n=69)
fimH
13 (100%) 13 (100%) 15 (100%) 10 (100%) 8 (100%) 10 (100%) 69 (100%)
papC
2 (15,4%) 3 (23,1%) 2 (13,3%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 7 (10,1%)
papG
2 (15,4%) 3 (23,1%) 2 (13,3%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (20%) 9 (13%)
tsh
2 (15,4%) 2 (15,4%) 1 (6,7%) 2 (20%) 1 (12,5%) 0 (0%) 8 (11,6%)
fyuA
12 (92,3%) 13 (100%) 15 (100%) 9 (90%) 8 (100%) 9 (90%) 66 (95,6%)
iutA
10 (76,9%) 13 (100%) 15 (100%) 8 (80%) 8 (100%) 9 (90%) 63 (91,3%)
cvaC
2 (15,4%) 2 (15,4%) 4 (26,7%) 2 (20%) 4 (50%) 4 (40%) 18 (26,1%)
iss
3 (23,1%) 5 (38,5%) 7 (46,7%) 3 (30%) 4 (50%) 4 (40%) 27 (39,1%)
hlyA
4 (30,8%) 6 (46,1%) 5 (33,3%) 3 (30%) 4 (50%) 3 (30%) 25 (36,2%)
52
cnf1
7 (53,8%) 8 (61,5%) 7 (46,7%) 5 (50%) 7 (87,5%) 5 (50%) 39 (56,5%)
Phylogenetic groups
A
2 (15,4%) 1 (7,7%) 4 (26,7%) 1 (10%) 0 3 (30%) 11 (15,95%)
B1
1 (7,7%) 1 (7,7%) 2 (13,3%) 3 (30%) 3 (37,5%) 1 (10%) 11 (15,95%)
B2
4 (30,8%) 6 (46,1%) 4 (26,7%) 4 (40%) 5 (62,5%) 3 (30%) 26 ( 37,7%)
D
6 (46,1%) 5 (38,5%) 5 (33,3%) 2 (20%) 0 3 (30%) 21 (30,4%)
UR= urine, PU= periurethral region, PA= perianal region.
The distribution of the 10 virulence genes among the four phylogenetic groups
was examined (Table 4).
Table 4. Distribution of virulence genes among phylogenetic groups.
Phylogenetic groups
Virulence genes
A
(n=11)
B1
(n=11)
B2
(n=26)
D
(n=21)
fimH 11 (100%) 11 (100%) 26 (100%) 21 (100%)
papC 0 (0%) 0 (0%) 3 (11,5%) 4 (19,0%)
papG 1 (9,1%) 0 (0%) 3 (11,5%) 5 (23,8%)
tsh
0 (0%)
0 (0%) 3 (11,5%) 5 (23,8%)
fyuA 10 (90,9%) 10 (90,9%) 26 (100%) 20 (95,2%)
iutA 9 (81,8%) 10 (90,9%) 26 (100%) 18 (85,7%)
cvaC 3 (27,3%) 4 (36,4%) 9 (34,6%) 2 (9,5%)
iss
3 (27,3%)
4 (36,4%) 11 (42,3%) 9 (42,8%)
hlyA 1 (9,1%) 0 (0%) 20 (76, 9%) 4 (19,0%)
cnf1 5 (45,4%) 6 (54,5%) 21 (80,8%) 7 (33,3%)
The various virulence genes studied exhibited distinctive associations with
phylogenetic groups. Among the phylogenetic groups, three subgroups of associated
virulence genes were apparent. The first subgroup included virulence genes fimH, fyuA,
iutA, cvaC and iss, which did not present association with any of the groups and were
scattered among the strains. A second subgroup included papC, papG and tsh, which
were present only in phylogenetic groups B2 and D (with exception of 1-2
nd
PA that
harbored papG and lacked papC and tsh, which was classified as A group). Groups B2
and D typically include uropathogenic strains, suggesting that these genes occur only in
virulent strains. The third subgroup included those genes that were found in higher
percentage in phylogenetic group B2, like hlyA and cnf1, what suggests that these
genes confer a high virulence potencial to strains carrying them, as group B2 is the most
53
implicated in extraintestinal infections. Hly determinant differed greatly in frequency
between the pathogenic groups (B2 and D), being more associated with phylogenetic
group B2 (76,9% vs. 19,0%, respectively), and was found outside the pathogenic groups
in only one strain belonging to phylogenetic group A, encountered in perianal region of
patient 34.
Genes that were absent from only few samples (fyuA and iutA) were never
absent from phylogenetic group B2.
Virulence genotypes. The isolates differed greatly from one another based on the
presence of virulence genes, so that the number of virulence genes found in each strain
ranged from 1 to 8, performing twenty seven virulence genotypes among the strains
(Table 5).
Table 5. Genes profiles found among Escherichia coli isolates.
1
st
sampling 2
nd
sampling
Virulence Genotypes found (n
of strains)
UR PU PA UR PU PA
fimH (1) - - - 1 - -
fimH / fyuA (4) 2 - - 1 - 1
fimH / fyuA / iutA (13) 1 3 3 3 1 2
fimH / iutA / cnf1 (1) - - - - - 1
fimH / fyuA / iutA / cnf1 (6) 2 1 1 - 2 -
fimH / fyuA / papG / iutA (1) - - - - - 1
fimH / fyuA / iutA / hlyA (1) - - 1 - - -
fimH / fyuA / papC / papG (1) 1 - - - - -
fimH / cvaC / iutA / cnf1 (1) 1 - - - - -
fimH / fyuA / iss / iutA (3) 1 1 1 - - -
fimH / fyuA / cvaC / iutA (1) - - 1 - - -
fimH / fyuA / papC / papG / iutA (1) - 1 - - - -
fimH / fyuA / iutA / hlyA / cnf1 (7) 2 1 - 2 1 1
fimH / fyuA / cvaC / iss / iutA (1) - - 1 - - -
fimH / fyuA / cvaC / iss / iutA / hlyA (3) - 1 2 - - -
fimH / fyuA / iss / iutA / hlyA / cnf1 (5) - - 2 1 1 1
fimH / fyuA / cvaC / iss / iutA / cnf1 (1) - - 1 - - -
fimH / fyuA / papC / papG / iutA / hlyA (1) - 1 - - - -
fimH / fyuA / papC / papG / iutA / cnf1 (2) - - 1 1 - -
fimH / fyuA / tsh / iss / iutA / cnf1 (1) 1 - - - - -
fimH / fyuA / tsh / cvaC / iss / iutA (1) - - - - - 1
fimH / fyuA / cvaC / iss / iutA / hlyA / cnf1 (4) - 1 - - 2 1
fimH / fyuA / papC / papG / iutA / hlyA / cnf1 (2) - 1 1 - - -
54
fimH / fyuA / tsh / iss / iutA / hlyA / cnf1 (2) 1 1 - - - -
fimH / fyuA / papG / cvaC / iss / iutA / cnf1 (1) - - - - - 1
fimH / fyuA / papC / papG / iss / iutA / hlyA / cnf-1 (1) 1 - - - - -
fimH / fyuA / tsh / colV / iss / iutA / hlyA / cnf-1 (3) - 1 - 1 1 -
UR= urine, PU= periurethral region, PA= perianal region.
The profile fimH / fyuA / iutA was the most frequent, occurring in 13 strains. We
observed a predominance of strains harboring several virulence genes in phylogenetic
groups B2 and D, mainly in B2 group. This finding suggests that strains belonging to
these groups harbor more traits which confer virulence potential to the strains.
Four strains harbored 8 different virulence genes each, and were classified as
belonging to phylogenetic group B2. Nine strains presented combinations of 7 virulence
genes simultaneously, 6 of them were classified as belonging to phylogenetic group B2
and 3 as group D. Fourteen strains harbored 6 different virulence genes, and were
scattered among the phylogenetic groups. A combination of five genes occurred in nine
strains, 7 of which belonged to B2 group and 1 to D group. Strains harboring 4 virulence
factor genes showed a predominant classification in phylogenetic groups B2 and D (9 of
14).
Fourteen strains harbored 3 virulence genes, and showed no predominance in
any phylogenetic group or site of isolation. Genotypic profile harboring 2 virulence genes
occurred in 4 strains, 2 of them were classified as A and 2 as D.
One strain harbored only fimH gene (present in 100% of the samples), this
strain was classified as belonging to B1 phylogenetic group and was isolated from urine
of a UTI case (2
nd
sampling).
55
BOXA1R. BOXA1R analysis was used to further examine the genetic similarities
of isolates within each patient. It was possible to observe that, in most of the cases,
strains present in periurethra belong to the same clone of the urinary strains, showing
that the colonization of this region is a source for bacteria to enter into the bladder, and
therefore bacteria able to colonize urine may be also able to colonize periurethral region.
Strains from the periurethra often were identical to the isolated from perianal region,
confirming that this colonization generally begins with bacteria present in the normal
microbiota of the patient’s intestine (Figure 2).
Fig. 2. Band patterns observed by BOXA1R technique. A: patient 1, B: patient 7, C: patient 8, D: patient 11, E: patient 13, F:
patient 14, G: patient: 15, H: patient 18, I: patient 30, J: patient 38.
56
DISCUSSION
In this study we analyzed the presence of several properties, such as
determinants for virulence factors and antimicrobial resistance in a collection of 69 E.
coli strains isolated from urine and periurethral and perianal regions of 16 children with
neurogenic bladder.
It was observed some inconsistence between the presence of virulence genes or
phylogenetic groups and clonality. The virulence genes that showed discrepant results
have been encountered both in plasmids or in chromosomal DNA (with the exception of
cnf1), suggesting that either BOXA1R may not amplify plasmidial DNA or a fail of the
technique to demonstrate small variations in the chromosome.
Drug resistance was found in 76,8% of the isolates; this high frequency of
resistance may be due to the selection exerted by the pressure of prophilatic antibiotic
use in these patients. It was observed a great number of strains resistant to cotrimoxazol
(sulfamethoxazole plus trimethoprim), which was present in 33 of the 53 resistant
strains, and associated with at least another drug in 13 strains. That is a concerning
result, since cotrimoxazole is one of the major antibiotics used for the treatment of these
patients. Resistance did not show correlation with any of the sites or condition of
isolation (1
st
or 2
nd
sampling), and resistant strains were carried by these patients also in
their normal intestinal microbiota.
The presence of virulence factors, as observed for drug resistance, showed no
correlation to the sites or conditions of isolation. However, some results are worthy to
argue.
All of the studied strains harbored fimH gene. This finding is consistent with that
described by Johnson & Stell (2000), who also found fimH present in 100% of urosepsis
57
strains. Hull et al. (1998) demonstrated a frequency of 96% of strains carrying
determinantes for type 1 pili in E. coli isolates from asymptomatic bacteriuria and UTI in
patients with spinal cord injuries. Other studies showed a similar high percentage of this
gene in ExPEC isolates (RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; YAMAMOTO, 2007). fimH is
responsible for coding adhesin subunit of type 1 fimbriae, which has been stated by
many authors to be an important trait for adhesion and invasion of uroepithelial cells,
mainly the bladder (OELSCHLAEGER et al., 2002; JUSTICE et al., 2004; MYSOREKAR
et al., 2006). According to Johnson (1991) and Yamamoto (2007), type 1 fimbria is the
most encountered virulence factors either in ExPEC or commensal strains,
demonstrating the dissemination of this virulence factor among Escherichia coli. E. coli
strains isolated from urine and periurethral region of children with neurogenic bladder
studied by Schlager et al. (2000) demonstrated 100% of expression of type 1 fimbriae,
independently of the site of isolation and whether symptoms were present or not. This
finding led the authors to propose that type 1 fimbriae may be a marker for colonization
but not infection of the abnormal urinary tract.
P fimbriae are adhesins primarily associated with strains that cause
pyelonephritis, and recognize Gal(α1-4)Gal residues present in membrane glycolipids of
human uroepithelial cells, predominantly in renal tissue (JOHNSON, 1991). Genes
encoding for P fimbriae were present in low percentage (10,1% papC and 13% papG),
always associated with phylogenetic groups B2 or D, considered as pathogenic groups.
This finding agrees with the fact that P fimbriae are associated primarily with UPEC
strains and are not found in nonpathogenic strains (SALYERS & WHITT, 2001). This low
percentage of strains harboring P fimbriae determinants may be due to the fact,
proposed by other authors, that requeriment for these fimbriae is decreased in isolates
58
from patients with compromising condition, such as urinary tract abnormalities
(SANDBERG et al., 1988; JOHNSON, 1991).
These findings suggest that P fimbria is not essential to bladder colonization and
cystitis in patients with neurogenic bladder, since it was found in few strains and never
associated to UTI.
Tsh is an autotransporter protein primarily described in APEC strains which
presents adhesive and proteolitic properties, exhibiting a mucinolitic function
(KOBAYASHI et al., 2007). All the isolates harboring tsh were assigned into B2 or D
groups, suggesting that this gene is not very common in nonpathogenic or commensal
strains. Two patients carried strains harboring tsh, and the presence of these strains in
urine was associated with both asymptomatic bacteriuria and UTI; both patients also
presented periurethral colonization by these strains. In one of these patients (patient
30), the same clone was encountered in both urine samples. These findings suggest
that this protein could help for long-term colonization. The gene tsh was found in UPEC
strains with greater frequencies (11,6% in this study vs. 63% vs. 39,5%) in others
studies (HEIMER et al., 2004; RODRIGUEZ-SIEK, 2005), although its real function in
UTI is still unknown. Further studies with this protein in UPEC strains are necessary to
determine its role in uropathogenicity.
Genes related to iron capture system were found in most of the isolates and
comprises two of the most frequent genes. fyuA and iutA were the second and third
most prevalent genes found in our strains, respectively (95,6% vs. 91,3%; all strains
harbored fimH). Similar results were found by Johnson & Stell (2000), who verified 93%
and 80% fyuA and iutA, respectively, in strains isolated from urosepsis. Bonacorsi et al.
(2006) also found 96% and 84% prevalence of fyuA and iutA in UTI isolates. These
59
findings are expected since it has been demonstrated that genes encoding for iron
acquisition systems are upregulated during urinary tract infections (SNYDER et al.,
2004; ALTERI & MOBLEY, 2007), demonstrating that urine is an iron poor environment,
and UPEC strains overcome this limiting condition by the production of iron acquisition
systems.
Most of the isolates belonged to phylogenetic groups B2 or D (37,7% and 30,4%,
respectively), although phylogenetic groups did not present a clear correlation with sites
of isolation, with the exception of group A strains that, as expected, were more isolated
from perianal region. In most of the cases when group D strains were present in urine,
they were causing asymptomatic bacteriuria.
A study of Sabaté et al. (2006) indicated that E. coli from group B2 are
uncommon among commensal intestinal microbiota, however, when present, they are
highly virulent. In our study we observed that 15 (60%) of 25 perianal isolates were
assigned into phylogenetic groups B2 and D (28% and 32%, respectively), suggesting
intestinal microbiota as a potential source of virulent bacteria. A great carriage of
pathogenic group’s strains was also observed by ZHANG et al. (2002), who found
47,7% of fecal strains belonging to phylogenetic group B2 and 19,3% to group D.
It has been reported by Restieri et al. (2007) that strains belonging to
phylogenetic groups A and B1 are nonpathogenic, and are rarely associated to
extraintestinal infections, including urinary tract infection. However, in our study, two
strains of group A and 1 strain of B1 were found causing asymptomatic bacteriuria, and
one group A and three group B1 strains were isolated from UTI (2
nd
sampling).
In our study, strains belonging to the pathogenic phylogenetic groups often
harbored more genetic determinants for virulence factors than groups A and B1, since
60
77% of strains harboring 7 or more virulence genes at once were assigned into B2 or D
groups.
Strains belonging to phylogenetic groups B2 and D were responsible for 77% of
asymptomatic bacteriuria cases and 60% of UTI cases, and B2 group had a
predominance of five virulence genes (papC, papG, tsh, hlyA and cnf1) studied over
groups A and B1. Our results are consistent with the previous evidence that E. coli
phylogenetic group B2 predominates among UPEC and is the main repository of many
extraintestinal virulence genes (PICARD et al., 1999; JOHNSON and STELL, 2000).
Bielaszewska et al. (2007) also reported that about two thirds of the isolates from
asymptomatic bacteriuria belonged to groups B2 and D, which typically include ExPEC.
It is interesting to observe that, in one patient (patient 6), E. coli belonging to B1
group and harboring only fimH of the studied virulence genes, was responsible for
urinary tract infection. This finding indicates that, in neurogenic bladder patients,
bacteria do not need to harbor several virulence genes to be able to cause urinary tract
infections, and therefore changes in the host defense mechanisms may be more
important in the establishment of a symptomatic infectious process than the presence of
virulence factors. In fact, according to Johnson (1991), debilitating conditions in the host
are associated with a decreased expression of virulence factors in strains causing UTI.
Other studies in which the presence of virulence genes and/or the expression of
virulence factors in isolates from patients with neurogenic bladder were analyzed led the
authors to the same conclusion (SCHLAGER et al., 2000; GUIDONI et al., 2006).
We could not differentiate between fecal and urine strains in relation to virulence
genes and phylogenetic groups, and the fecal origin of the strains encountered in
periurethra and urine was proved in this study. This is in agreement with Triffilis et al.
61
(1994), who stated that E. coli from patients with acute pyelonephritis and abnormalities
of the urinary tract are frequently indistinguishable from commensal fecal isolates.
Thus, as stated by Picard et al. (1999), the barrier between commensalism and
virulence results from the complex balance between the status of the host and the
presence and expression of virulence factors in the strain.
Our results demonstrated a great variability among the isolates, with 27 different
virulence gene profiles being observed. Strains isolated from both asymptomatic
bacteriuria and urinary tract infection (1
st
and 2
nd
sampling, respectively) did not present
a defined pattern, differing greatly from each other. This finding is in agreement with
Bielaszweska et al. (2007), who reported that UPEC genomes are extremely dynamic
and differ considerably from each other due to horizontal gene transfers.
Many virulence factors are known to be associated with urinary tract infections,
and bacteria are able to adapt to different environments, requiring different virulence
genes in each situation. Thus, it is not surprising that the isolates differed from each
other in relation to the virulence genes combinations presented.
The use of BOXA1R technique confirmed the hypothesis that the gastrointestinal
tract is the source of bacteria responsible for urinary tract infections (SALYERS and
WHITT, 1994; RODRIGUEZ-SIEK et al., 2005; YAMAMOTO, 2007), as demonstrated by
similarities between strains isolated from perianal region and periurethra and/or urine.
Our results suggest that the ability to colonize the periurethra is often decisive for the
passage of intestinal strains to the bladder. In some cases we could observe that the
same strain was responsible for asymptomatic bacteriuria and UTI in the same patient in
different time points, finding that supports the idea that changes in host defenses are
62
more important than the presence of virulence factors to uropathogenicity in patients
with neurogenic bladder.
Recurring UTIs by the same E. coli strain have been proposed to be due to the
establishment of intracellular reservoirs of bacteria or biofilm formation in the bladder
(JUSTICE et al., 2004; MYSOREKAR and HULTGREN, 2006; SOTO et al., 2006), and
these two properties are attributed to type 1 fimbria. Moreover, the results found by
Mysorekar et al. (2006) suggest a correlation between the increased formation of
intracellular reservoirs and the presence of a damaged epithelium, which occurs in
patients with spinal cord injury.
In conclusion, we suggest that strains causing asymptomatic bacteriuria or UTI in
patients with neurogenic bladder do not differ from those found colonizing the
periurethral and perianal regions in relation to their possession of virulence genes or
phylogenetic groups. We suggest the importance of immune status of the host over the
presence of virulence determinants in strains causing UTI and also confirmed the fecal-
periurethral-bladder sequence of ascending urinary tract infections by BOX-PCR.
REFERENCES
ALTERI, C. J., MOBLEY, H. L. T. (2007).
Quantitative profile of the uropathogenic
Escherichia coli outer membrane proteome during growthin human urine. Infect. Immun.
75:2679-2688.
BAUER, A.W.; KIRBY, W.M.M.; CHERRIS, J.C.; TURCK, M. (1966)
Antibiotic
susceptibility testing by standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496.
BIELASZEWSKA, M., DOBRINDT, U., GÄRTNER, J., GALLITZ, I., HACKER, J.,
KARCH, H., MÜLLER, D., SCHUBERT, S., SCHMIDT, M. A., SORSA, L. J.,
ZDZIARSKI, J. (2007).
Aspects of genome plasticity in pathogenic Escherichia coli. Int J Med
Microbiol. 297:625-639.
63
BONACORSI, S., HOUDOUIN, V., MARIANI-KURKDJIAN, P., MAHJOUB-MESSAI, F.,
BINGEN, E. (2006). Comparative prevalence of virulence factors in Escherichia coli causing
urinary tract infection in male with and without bacteremia. J. Clin. Microbiol. 44:1156-1158.
CLERMONT, O., BONACORSI, S., BINGEN, E. (2000). Rapid and Simple Determination of
the Escherichia coli Phylogenetic Group. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4555-4558.
CLSI - MANUAL CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE (2005)
Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana:15º Suplemento
Informativo. Clin. Lab. Stand. Inst./NCCLS. M100-S15 Vol. 25 No. 1
DELICATO, E. R., BRITO, B. G., GAZIRI, L. C., VIDOTTO, M. C. (2003). Virulence-
associated genes in Escherichia coli isolates from poultry with colibacillosis. Vet.
Microbiol. 94, 97-103.
DOZOIS, C. M., DHO-MOULIN, M., BRÉE, A., FAIRBROTHER, J. M., DESAUTELS, C.,
CURTISS III, R. (2000).
Relation between the Tsh autotransporter and pathogenicity of avian
Escherichia coli and localization and analysis of the tsh genetic region. Infect. Immun. 68, 4145-
4154.
GUIDONI, E. B. M., DALPRA, V. A., FIGUEIREDO, P. M., LEITE, D. S., MÍMICA, L. C.,
YANO, T., BLANCO, J. E., TOPOROVSKI, J. (2006).
E. coli virulence factors in children
with neurogenic bladder associated with bacteriuria. Pediatr. Nephrol. 21:376-381.
HEIMER, S. R., RASKO, D. A., LOCKATELL, C. V., JOHNSON, D. E., MOBLEY, H. L.
(2004).
Autotransporter genes pic and tsh are associated with Escherichia coli strains that
cause acute pyelonephritis and are expressed during urinary tract infection. Infect. Immun.
72:593-597.
HULL, R. A., RUDY, D. C., WIESER, I. E., DONOVAN, W. H. (1998). Virulence factors of
Escherichia coli isolates from patients with symptomatic and asymptomatic bacteriuria and
neuropathic bladders due to spinal cord and brain injuries. J. Clin. Microbiol. 36:115-117.
JOHNSON, J. R. (1991). Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection. Clin.
Microbiol. Rev. 4:80-128.
JOHNSON, J. R., STELL, A. L. (2000). Extended virulence genotypes of Escherichia coli
strains from patients with urosepsis in relation to phylogeny and host compromise. J. Infect. Dis.
181:261-272.
JUSTICE, S. S., HUNG, C., THERIOT, J. A., FLETCHER, D. A.,ANDERSON, G. G.,
FOOTER, M. J., HULTGREN, S. J. (2004).
Differentiation and development pathways of
uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. PNAS. 101: 1333-1338.
KASCHUK, G., HUNGRIA, M., ANDRADE, D. S., CAMPO, R. J.( 2006). Genetic diversity
of rhizobia associated with common bean (Phaseolus vulgaris L.) grown under no-tillage and
conventional systems in southern Brazil. Appl. soil Ecol. 32, 210-220.
64
KOBAYASHI, R. K., GAZIRI, L. C., VENÂNCIO, E. J., VIDOTTO, M. C. (2007).
Detection
of Tsh protein mucinolytic activity by SDS-PAGE. J. Microbiol. Methods. 68: 654-655.
KOUOKAM, J. C., WAI, S. N., FÄLLMAN, M., DOBRINDT, U., HACKER, J., UHLIN. B.
E. (2006).
Active cytotoxic necrotizing factor 1 associated with outer membrane vesicles from
uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 74:2022-2030.
LE BOUGUENEC, C., ARCHAMBAUD, M., LABIGNE, A. (1992). Rapid and specific
detection of the pap, afa and sfa adhesion-encoding operons in uropathogenic Escherichia coli
strains by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30, 1189-1
.
MAY, A. K., GLEASON, T. G., SAWYER, R. G., PRUETT, T. L. (2000). Contribution of
Escherichia coli alpha-hemolysin to bacterial virulence and to intraperitoneal alterations in
peritonitis. Infect. Immun. 68:176-183.
MYSOREKAR, I. U., HULTGREN, S. J. (2006). Mechanisms of uropathogenic Escherichia
coli persistence and eradication from the urinary tract. PNAS. 103:14170-14175.
OELSCHLAEGER, T. A., DOBRINDT, U., HACKER, J. (2002). Virulence factors of
uropathogens. Curr. Opin. Urol. 12:33-38.
PICARD, B., GARCIA, J. S., GOURIOU, S., DURIEZ, P., BRAHIMI, N., BINGEN, E.,
ELION, J., DENAMUR, E. (1999).
The link between phylogeny and virulence in Escherichia
coli extraintestinal infection. Infect. Immun. 67:546-553.
RESTIERI, C., GARRISS, G., LOCAS, M. C., DOZOIS, C. M. (2007). Autotransporter-
Encoding Sequences Are Phylogenetically Distributed among Escherichia coli Clinical Isolates
and Reference Strains. Appl. Environ. Microbiol. 73:1553-1562.
RODRIGUEZ-SIEK, K. E., GIDDINGS, C. W., DOETKOTT, C., JOHNSON, T. J.,
FAKHR, M. K., NOLAN, L. K. (2005).
Comparison of Escherichia coli implicated in human
urinary tract infection and avian colibacillosis. Microbiology. 151:2097-2110.
ROOS, V., ULETT, G. C., SCHEMBRI, M. A., KLEMM, P. (2006). The asymptomatic
bacteriuria Escherichia coli strain 83972 outcompetes uropathogenic E. coli strains in human
urine. Infect. Immun. 74:615-624.
SABATÉ, M., MORENO, E., PÉREZ, T., ANDREU, A., PRATS, G. (2006). Pathogenicity
island markers in commensal and uropathogenic Escherichia coli isolates. Clin Microbiol
Infect. 12:880-886.
SALYERS, A. A., WHITT, D. D. (2001). Escherichia coli extraintestinal infections. In Bacterial
pathogenesis - A molecular approach. 2nd. ed. Washington,
D.C.: ASM Press. p. 422-436.
SANDBERG, T., KAIJSER, B., LIDIN-JANSON, G., LINCLON, K., ORSKOV, F.,
ORSKOV, I., STOKLAND, E., SVANBORG-EDÉNS, C. (1988).
Virulence of Escherichia
coli in relation to host factors in women with symptomatic urinary tract infection. J. Clin.
Microbiol. 26:1471-1476.
65
SCHLAGER, T. A., WHITTAM, T. S., HENDLEY, J. O., WILSON, R. A., BHANG, J.,
GRADY, R., STAPLETON, A. (2000). Expression of virulence factors among Escherichia coli
isolated from the periurethra and urine of children with neurogenic bladder on intermittent
catheterization.
Pediatr. Infect. Dis J. 19:37–41.
SNEATH, P. B. A., SOKAL, R. R. (1973). Numerical Taxonomy- the Principles and Practice
of Numeral Classification. W.H. Freeman, San Francisco, 573 pp. 193.
SNYDER, J. A., HAUGEN, B. J., BUCKLES, E. L., LOCKATELL, C. V., JOHNSON, D.
E., DONNENBERG, M. S., WELCH, R. A., MOBLEY, H. L. T. (2004).
Transcriptome of
uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infection. Infect. Immun. 72:6373-6381.
SOTO, S. M., SMITHSON, A., HORCAJADA, J. P., MENSA, J. P., VILA, J. (2006).
Implication of biofilm formation in the persistence of urinary tract infection caused by
uropathogenic Escherichia coli. Clin Microbiol Infect. 12:1034-1036.
TOLEDO, M.R.F., FONTES, C.F., TRABULSI, L.R. (1982
a
) EPM: modificação do meio de
Rugai e Araújo para realização simultânea dos testes de produção de gás a partir da glicose,
H
2
S, uréase e triptofano-desaminase. Rev. Microbiol. 13, 309-315.
TOLEDO, M.R.F., FONTES, C.F., TRABULSI, L.R. (1982
b
) MILi: um meio para realização
dos testes de motilidade, indol e lisina-descarboxilase. Rev. Microbiol. 13, 230-235.
TRIFILLIS, A. L., DONNENBERG, M. S., CUI, X., RUSSELL, R. G., UTSALO, S. J.,
MOBLEY, H. L. T., WARREN, J. W. (1994).
Binding to and killing of human renal epithelial
cells by hemolytic P-fimbriated E. coli. Kidney International. 46:1083-1091.
VERSALOVIC, J., SCHNEID, M., BRUJIN, F. J., LUPSKI, J. R (1994).
Genomic
fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods
Mol. Cell Biol. 5,25–40.
YAMAMOTO, S. (2007). Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. J. Infect.
Chemother. 13:68-73.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
