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LÍGIA CARLA FACCIN GALHARDI
Atividade antiviral dos extratos aquoso,
etanólico e do polissacarídeo isolado de
Agaricus brasiliensis para o poliovírus tipo1
_____________________________________________
Londrina
2006
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LÍGIA CARLA FACCIN GALHARDI
Atividade antiviral dos extratos aquoso, etanólico e
do polissacarídeo isolado de Agaricus brasiliensis
para o poliovírus tipo1
Dissertação apresentada como requisito para
a obtenção do título de mestre em
Microbiologia da Universidade Estadual de
Londrina.
Orientadora Profª. Dra. Rosa Elisa Carvalho
Linhares.
Londrina
2006
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LÍGIA CARLA FACCIN GALHARDI
Atividade antiviral dos extratos aquoso, etanólico e do
polissacarídeo isolado de Agaricus brasiliensis para o poliovírus
tipo1
BANCA EXAMINADORA
__________________________________
Profª. Dra. Tânia U. Nakamura
__________________________________
Prof. Dr. Mario Sergio Mantovani
__________________________________
Profª. Dra. Rosa Elisa C. Linhares
Orientadora
Londrina, 20 de fevereiro de 2006
Ao meu esposo Fábio com muito
amor.
AGRADECIMENTOS
• A Deus por estar sempre do meu lado, sem Você Senhor, eu nada seria.
• Ao Fábio pela compreensão, paciência, força, companheirismo e amor.
• À minha família, pelos ensinamentos de amor ao próximo, respeito e garra.
• Em especial, à minha orientadora, Professora Rosa Elisa Carvalho Linhares,
pelo incentivo, confiança, orientação, “paciência” e principalmente pela amizade e
compreensão em todos os momentos.
• Ao Professor Carlos Nozawa pela participação, colaboração e amizade.
• Aos Professores de microbiologia da Universidade Estadual de Maringá,
Celso e Tânia Nakamura, Benedito P. Dias Filho e Lourdes B. Garcia que abriram as
portas para esta realização e serão lembrados sempre, a todos vocês meus sinceros
agradecimentos.
• Aos meus amigos de mestrado, Fabrício, Jesiane, Narjara, Sergio, Tatiane e
Ariane pelas risadas, amizade e companheirismo durante este período.
• Aos meus colegas de laboratório, Flávio, Rafaela, Janaína, Alessandra,
Mariana, Bárbara, Vinícius e Daniel pelo apoio e pelos bons momentos que
passamos juntos.
• As minhas amigas de “dura vida” de república, Jesiane e Daliana, que
sempre lembrarei com carinho.
• Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia pelo
trabalho para a formação de profissionais qualificados.
• Aos funcionários do Departamento de Microbiologia, em especial a
Valdelice, pela disposição no suporte técnico.
• Ao Professor Dr. Mário Sérgio Mantovani pelo extrato gentilmente cedido
para a realização dos testes.
• A técnica Maria Yoshie Yoshikawa pela boa vontade em nos fornecer a
água de preparo do meio para o cultivo das células.
• A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pelo apoio financeiro parcial, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e Coordenadoria de Pesquisa e Pós-graduação da UEL.
• Por fim, agradeço a todas as pessoas que conviveram comigo durante estes
dois anos os quais, direta ou indiretamente, fizeram parte da minha vida e serão
lembradas com carinho.
“A sabedoria brilha, não fenece;
Deixa-se ver facilmente pelos que a amam,
Deixa-se encontrar pelos que a procuram.
Antecipa-se aos que a desejam,
Sendo a primeira a se dar a conhecer.
Quem parte cedo a sua procura não se afadigará,
Pois a encontrará sentada a sua porta.
Apaixonar-se por ela é a perfeição do discernimento,
E quem velar por sua causa estará em breve sem inquietações.
O princípio da sabedoria é o simples desejo de ser por ela educado;
Querer ser por ela educado é amá-la,
Amá-la é guardar suas leis,
Observar suas leis é estar seguro da incorruptibilidade,
E a incorruptibilidade aproxima de Deus.
Assim, o desejo da Sabedoria eleva até o reino do céu.”
Sabedoria 6, 12-20
Obrigada Senhor, por mais esta conquista. Peço que me mantenha firme na fé
para que eu não canse de buscar sempre a Vossa sabedoria.
‘Ninguém ignora tudo
Ninguém sabe tudo
Todos nós sabemos alguma coisa
Todos nós ignoramos alguma coisa
Por isso aprendemos sempre.’
‘Feliz é aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.’
RESUMO
Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei ss. Heinem), também conhecido como
Cogumelo do Sol, nativo do Sudeste do Brasil, é amplamente consumido,
principalmente na forma de chá, devido suas propriedades nutricionais e
farmacológicas. Neste trabalho nós avaliamos a atividade antiviral dos extratos
aquoso (EA) e etanólico (EE) bem como do polissacarídeo isolado (PLS) do corpo
de frutificação, de A. brasiliensis contra poliovírus tipo1 em células HEp-2. A
atividade antiviral foi monitorada pelo ensaio de redução de plaque e os compostos
foram adicionados, nas várias concentrações, antes (-2 e -1 h ), durante (0 h) e após
(1 e 2 h) a infecção viral. Os resultados mostraram que quando EA, PLS e EE foram
adicionados às células durante a infecção (tempo 0 h) ocorreu uma redução,
dependente de concentração, no número plaques de até 50,1 (EA); 67,3 (PLS) e 88
% (EE) com índices de seletividade (IS) de 5,4; 9,9 e 12,3, respectivamente. Os
compostos foram poucos efetivos na redução da adsorção viral e não apresentaram
efeito virucida, sugerindo uma ação no estágio inicial da replicação do poliovirus.
Sumário
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................. 9
2 ANTIVIRAIS...................................................................................................... 11
3 PRODUTOS NATURAIS................................................................................... 13
3.1 B
ASIDIOMICETOS .............................................................................................. 15
4 AGARICUS BRASILIENSIS ............................................................................. 19
5 POLIOVÍRUS .................................................................................................... 21
6 OBJETIVOS...................................................................................................... 24
6.1 O
BJETIVOS GERAIS ........................................................................................... 24
6.2 O
BJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 24
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 25
ARTIGO: A
NTIVIRAL ACTIVITY OF AQUEOUS AND ETHANOL EXTRACTS AND OF AN
ISOLATED POLYSACCHARIDE FROM
AGARICUS BRASILIENSIS AGAINST
POLIOVIRUS TYPE
1. .................................................................................. 29
ANEXO................................................................................................................. 46
9
1 INTRODUÇÃO
As doenças virais acompanham o homem desde a formação das
primeiras populações. A varíola, por exemplo, matou milhares de pessoas pelo
mundo, durante séculos, até ser considerada erradicada (Jerome, 2005). O vírus do
sarampo foi responsável por epidemias que dizimaram rapidamente comunidades
não imunes. O vírus da poliomielite foi responsável por muitos casos de paralisia, em
1988 havia 350.000 crianças paralíticas pelo vírus da poliomielite em todo o mundo
(WHO, 2003).
Ainda hoje as doenças virais são responsáveis por inúmeras mortes
e afetam a qualidade de vida, ocasionando mudanças no comportamento das
pessoas. À medida que a população mundial aumentou e os meios de transportes
evoluíram, o impacto causado pelas doenças virais também aumentou, pois o
número de pessoas infectadas com algum vírus cresce a cada ano no mundo todo.
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) e as pandemias com o vírus
influenza podem demonstrar a conseqüência das doenças virais na população.
Atualmente, cerca de 40 milhões de pessoas estão infectadas com o vírus HIV,
porém esta doença representa apenas uma parte do problema, pois cerca de 25 a
35% da população sexualmente ativa do ocidente, estão infectados com o vírus
herpes genital (HSV-2) e mais de 30% dos Estados Unidos apresentam verrugas
genitais causadas pelo papilomavírus. Aproximadamente, 2% da população mundial
está infectada com o vírus da hepatite C e 350 milhões de pessoas são portadoras
do vírus da hepatite B, ocasionando milhares de mortes por cirrose hepática e
carcinoma hepatocelular (Jones, 1998; Jerome, 2005).
10
Um passo para prevenção e controle das doenças virais aconteceu
através do desenvolvimento das vacinas. A varíola e a poliomielite são dois
exemplos de doenças virais onde o uso da vacinação foi bem sucedido. Em 1980,
após décadas de trabalhos e conscientização, a varíola, foi erradicada. A prevenção
e o controle da poliomielite tem sido um dos maiores desafios para saúde pública e
espera-se que em breve a doença esteja erradicada no mundo. No Brasil a última
notificação de poliomielite foi em 1989 (WHO, 2003). Apesar dos benefícios das
vacinas nem todas as doenças virais podem ser controladas por elas, como, por
exemplo, a hepatite C e a imunodeficiência humana cujos vírus responsáveis sofrem
rápidas variações antigênicas e o vírus do herpes simples que tem um potente
mecanismo de escape, incluindo o estabelecimento de longo período de latência
(Jerome, 2005).
As doenças virais permaneceram sem tratamento durante muitos
anos. A falta de conhecimento sobre os ciclos de replicação dos vírus tornava difícil
a busca por qualquer terapia para essas doenças, mesmo assim vários métodos
foram empregados, na época, para tentar combatê-las. A descoberta dos agentes
antibacterianos abriu o caminho para o desenvolvimento de terapias direcionadas
aos agentes infecciosos, entre eles, os antivirais, porém, o desenvolvimento da
quimioterapia antibacteriana progrediu rapidamente. Existe, atualmente, no mercado
um enorme arsenal de quimioterápicos para o tratamento das infecções bacterianas,
o que não acontece com os antivirais e isso se deve, em parte, pelo fato de que os
vírus são parasitas intracelulares obrigatórios, dependendo dos processos
bioquímicos da célula para realizarem seu ciclo de replicação (Jerome, 2005).
11
2 ANTIVIRAIS
O estudo dos antivirais teve início na década de 1950 (Jones, 1998).
Devido ao pouco conhecimento sobre a biologia molecular dos vírus e à toxicidade
dos primeiros quimioterápicos utilizados no controle das infecções virais, pensou-se
que seria impossível obter um agente antiviral, que não interferisse com o
metabolismo celular. As primeiras drogas eram capazes de atuar na síntese do DNA
viral, mas também interferiam na síntese do DNA da célula. Assim o uso de novos
quimioterápicos antivirais esbarrava na dificuldade em se obter substâncias com
toxicidade seletiva (Wigg, 2002).
Por volta de 1960, um grupo de cientistas declarou que seria possível
desenvolver compostos seguros e seletivos para os vírus através do
desenvolvimento dos análogos de nucleotídeos. Os análogos 5’-iodo-2’-
desoxiuridina (IDU) e o trifluorotimidina (TFT) foram introduzidos no mercado para o
tratamento de ceratite herpética, porém seu uso era apenas tópico devido a sua
toxicidade quando utilizado via sistêmica (Kaufman e Heidelberger, 1964). Um outro
análogo de nucleotídeo desenvolvido e considerado como anti-herpético de primeira
geração foi a Vidarabina (anteriormente chamada Ara-A), bem tolerada para uso
sistêmico e durante muito tempo usada para tratamento de encefalite herpética,
herpes neonatal e varicela zoster (Whitley et al., 1980 e Whitley et al., 1992). As
pesquisas por novos compostos continuaram e no final da década de 70, todo este
esforço resultou na descoberta do primeiro antiviral com excelente índice de
seletividade, o Aciclovir, marcando o início da terapia dos antivirais e incentivando a
busca de novas drogas (Jones, 1998). O Aciclovir ainda hoje é o fármaco de escolha
para infecções herpéticas e tão grande é sua importância que além do uso clínico,
12
muitos cientistas usam esse composto como referência em pesquisas, em 2003,
mais de 9.000 artigos científicos foram publicados relacionando o Aciclovir e seu uso
(Jerome, 2005). Durante muitos anos, a pesquisa pelos análogos de nucleotídeos
predominou na terapia com antivirais.
Em 1981, com a descoberta da síndrome da imunodeficiência
adquirida (AIDS) e pouco mais tarde do vírus da imunodeficiência humana (HIV) fez-
se necessário um melhor entendimento no ciclo de vida dos vírus e principalmente
no processo de replicação viral para se avaliar novas armas de terapia antiviral. As
pesquisas adquiriram um novo perfil e foram enormemente beneficiadas com o
avanço da biologia molecular, permitindo que certos vírus não cultiváveis pudessem
ser possíveis alvos de terapias (Jones,1998).
Atualmente, cerca de 40 compostos encontram-se aprovados para a
utilização e outros estão sendo avaliados. A maioria destes compostos liberados são
para o tratamento de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana
(HIV), vírus da hepatite B e C, herpesvírus, varicela zoster, citomegalovírus e vírus
influenza (De Clerq, 2004).
Existe uma variedade de fármacos utilizados como antivirais, porém,
são focados para um número pequeno de vírus; novos vírus continuam emergindo;
muitos vírus estabelecidos já estão satisfatoriamente controlados, porém tem
aumentado o aparecimento de cepas virais resistentes. Uma linha de pesquisa que
vem se destacando intensamente é o uso de produtos naturais para o
desenvolvimento de antivirais. Extratos ou substâncias encontradas em plantas,
fungos, bactérias, fauna e flora marinha apresentam uma enorme variedade de
constituintes químicos o que torna essa área muito atrativa aos pesquisadores.
13
3 PRODUTOS NATURAIS
O uso dos produtos naturais como fonte de tratamento para os
diversos males é utilizado desde o início dos tempos. De acordo com Halberstein,
(2005) evidências arqueológicas indicam que as plantas, com fins medicinais
representam a mais velha forma de medicação desde os tempos pré-históricos. No
Papiro de Ebers, escrito por volta de 1550 a.C. e descoberto em meados do século
passado em Luxor, no Egito, são mencionadas cerca de 700 drogas diferentes,
incluindo, principalmente, extratos de plantas, metais (chumbo e cobre) e veneno de
animais. Até o século XIX, os recursos terapêuticos eram constituídos
predominantemente por plantas e extratos vegetais, o que pode ser ilustrado pelas
Farmacopéias da época. Na Farmacopéia Geral para o Reino e Domínios de
Portugal, de 1794, havia 30 produtos de origem mineral, 11 produtos de origem
animal e cerca de 400 espécies vegetais, ou seja, as plantas medicinais e seus
extrativos constituíam a maioria dos medicamentos, que naquela época pouco se
diferenciavam dos remédios utilizados na medicina popular (Schenkel et al., 2001).
Atualmente várias pesquisas vêm sendo realizadas para verificar a
ação medicinal dos produtos naturais. Estes produtos são fontes importantes de
substâncias biologicamente ativas que constituem em modelos para a síntese de um
grande número de fármacos, entre eles os antivirais.
Kujumgiev et al. (1999) investigaram amostras de própolis de
diferentes origens geográficas quanto às suas atividades antibacteriana (contra
Staphylococcus aureus e Escherichia coli), antifúngica (contra Candida albicans) e
antiviral (contra o vírus da influenza aviária). Todas as amostras foram ativas contra
fungos e bactérias gram-positivas testadas e a maioria apresentou atividade antiviral.
14
Semple et al. (2001) verificaram que o ácido crisofânico extraído das
sementes de uma planta medicinal da Austrália, Dianella longifolia R. Br. (família
Liliaceae) inibiu a replicação do poliovírus em células de rim de macaco verde
(Vero), célula de rim de macaco verde Búfalo (BGM) e célula de pulmão embrionário
humano (HEL).
Lipipun et al. (2003) avaliaram 20 extratos de plantas medicinais para
atividade anti-herpesvírus tipo-1. Onze dos extratos mostraram-se eficientes em
reduzir a formação de plaques em 50% utilizando-se uma concentração de
100µg/ml. Alguns extratos foram também efetivos reduzindo o desenvolvimento das
lesões de pele.
Zhu et al. (2004) pesquisando a atividade antiviral do polissacarídeo
sulfatado SP2, isolado da alga Sargassum patens, observaram que o composto
inibia a replicação do vírus HSV-2 em células Vero pela inibição da adsorção ou
inativação direta do vírus.
Li et al. (2005) demonstraram que o ácido cafeoilquínico obtido de
uma planta de uso popular do sudeste da China, Schefflera heptaphylla apresentou
atividade contra o vírus respiratório sincicial (RSV).
Yang et al. (2005) verificaram que os extratos obtidos da planta
Phyllanthus urinaria com os solventes etanol, metanol e acetona, inibiram a infecção
do HSV-2 e foram efetivos apenas quando adicionados concomitantemente com a
infecção.
15
3.1 BASIDIOMICETOS
Os Basidiomicetos, popularmente conhecidos como cogumelos, têm
sido muito estudados devido as suas propriedades nutricionais e por serem
extremamente adaptados para habitar substratos sólidos encontrados no ambiente.
Desde muitos anos, as propriedades nutricionais, tônicas e medicinais de alguns
cogumelos são conhecidas pelos homens, sendo utilizados na dieta normal como
chá e alimento nutricional.
Pesquisadores, na busca de novas alternativas terapêuticas, vêm
estudando uma variedade de basidiomicetos que tem apresentado diversas
atividades medicinais como anticarcinogênica, antiinflamatória, imunossupressora,
antimicrobiana entre outras.
Certas escrituras antigas mencionam a importância medicinal de
alguns cogumelos. Na Roma antiga, os romanos os consideravam como “alimento
dos deuses”, já os chineses como “elixir da vida” (Mattila et al., 2000). Na medicina
tradicional oriental, os cogumelos têm uma história estabelecida, Ganoderma
lucidum (Reish), Lentinus edodes (Shiitake), Inonotus obliquus (Chaga) e muitos
outros têm sido utilizados por milhares de anos na Koreia, China, Japão e Rússia
(Lull et al., 2005).
Os cogumelos são constituídos de 90% de água e quando
desidratados apresentam de 10-40% de proteínas, 3-28% de carboidratos, 2-8% de
lipídios e 3-32% de fibras. Além destas substâncias são encontradas quantidades
importantes de enzimas, sais, minerais e vitaminas, entre elas tiamina, riboflavina,
ácido ascórbico e vitamina D
2
(Breene, 1990; Mattila et al., 2000).
16
Várias pesquisas demonstraram que extratos e metabólitos
secundários obtidos dos basidiomicetos foram capazes de estimular ou suprimir
componentes específicos do sistema imune. Algumas substâncias isoladas como
polissacarídeos, triterpenos, lipídeos e fenóis apresentaram essas funções (Lull et
al., 2005).
Compostos antibacterianos e antifúngicos também têm sido
pesquisados a partir dos basidiomicetos, entre eles estão alguns esteróides isolados
de Ganoderma applanatum e o ácido oxálico no Lentinus edodes. Geralmente os
cogumelos apresentam compostos com atividade antibacteriana e antifúngica devido
à necessidade de sobrevivência em seu meio natural de desenvolvimento
(Lindequist et al., 2005).
Outra propriedade farmacológica dos basidiomicetos, que vem sendo
amplamente estudada, é a atividade antiviral. O aparecimento de vírus resistentes
aos medicamentos de escolha, principalmente em pacientes imunocomprometidos e
a elevada toxicidade de algumas destas drogas, tem despertado o interesse de
muitos pesquisadores na busca de novos agentes antivirais, de origem natural, como
por exemplo, os obtidos a partir dessa classe de fungos.
Na Ásia, a população consome regularmente os cogumelos na
alimentação para prevenção e tratamento da gripe, além de outros motivos. O
cogumelo Shiitake é utilizado no tratamento da gripe há centenas de anos.
Entretanto, a melhora no quadro sintomático ainda é apenas subjetiva uma vez que
não há evidencias científicas que o uso dos cogumelos, como parte da dieta normal,
possa prevenir ou curar a gripe pelo vírus influenza e outras doenças virais (Mattila
et al., 2000).
17
De acordo com Lindequist et al (2005) o efeito antiviral dos
basidiomicetos pode ser encontrado tanto nos extratos como também em compostos
isolados e os compostos isolados podem atuar ainda de forma direta ou indireta
dependendo do peso molecular. Segundo os autores compostos com baixo peso
molecular atuam diretamente pela inibição de enzimas virais, inibição da síntese de
ácidos nucléicos virais, da adsorção e da penetração dos vírus na célula e
compostos com alto peso molecular, como os polissacarídeos e outras moléculas
complexas atuam de forma indireta pela ativação de células do sistema imune.
Os polissacarídeos, constituídos principalmente de cadeias de β-
glucanas do tipo 1-3, 1-4 e 1-6, apresentam atividades biológicas como atividade
antiviral, atividade mitogênica, ativação da via alternativa do complemento,
estimulação da produção de anticorpos, e principalmente como antitumoral. Os
polissacarídeos sulfatados têm sido amplamente testados contra os vírus HIV, HSV-
1 e 2 e outros vírus envelopados e sua ação antiviral pode estar relacionada com as
cargas aniônicas, ou seja, as cargas negativas dos polissacarídeos sulfatados
podem interagir com as cargas positivas das glicoproteínas do envelope viral
impedindo assim a ligação, a fusão ou ambos os estágios iniciais da infecção (Eo et
al., 2000; Lee et al., 2002; Liu et al., 2004; Zhang et al., 2004).
Eo et al (1999) isolaram duas substâncias solúveis em água e oito
substâncias solúveis em metanol a partir do basidiomiceto Ganoderma lucidum e
testaram contra cinco vírus: HSV-1 e 2, influenza A e vírus da estomatite vesicular
(VSV) indiana e de New Jersey, cinco destas substâncias inibiram significativamente
os efeitos citopáticos de HSV e VSV. Em 2000, Eo et al, verificaram que uma
proteína ácida ligada ao polissacarídeo isolado do mesmo basidiomiceto Ganoderma
lucidum inibiu a ligação e a penetração dos vírus HSV-1 e 2 em células Vero. Em
18
2004, Liu et al, isolaram uma proteoglicana do micélio também de Ganoderma
lucidum e observaram que esta substância inibiu o efeito citopático induzido por
HSV-1 e 2 em células Vero.
Piraino e Brandt (1999) mostraram a inibição da replicação do
herpesvírus simples tipos 1 e 2, varicela-zoster, influenza A e vírus respiratório
sincicial pela proteína designada RC-183, purificada do cogumelo Rozites caperata.
Mothana et al (2003) mostraram que os compostos ganodermadiol e
lucidadiol, isolados do basidiomiceto europeu Ganoderma pfeifferi, apresentaram
atividade antiviral contra os vírus influenza tipo A e HSV-1.
Awadh ali et al (2003) verificaram a atividade antiviral dos extratos
etanólicos do corpo de frutificação e culturas miceliais de Inonotus hispidus contra o
vírus da influenza tipos A e B.
Wang e Ng (2004) isolaram a enzima lacase do corpo de frutificação
de Tricholoma giganteum e mostraram que esta proteína de baixo peso molecular foi
capaz de inibir a transcriptase reversa do HIV-1.
19
4 AGARICUS BRASILIENSIS
O cogumelo Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei ss. Heinem),
também conhecido como Cogumelo do Sol, Cogumelo de Deus e “Himematsutake” é
um basidiomiceto natural do interior de São Paulo, Brasil, mais precisamente da
cidade de Piedade. O estudo sobre o A. brasiliensis iniciou-se com o Dr. Takatoshi
Furumoto que observou que os habitantes da região de Piedade eram
estatisticamente mais saudáveis do que a média populacional, com uma baixa
ocorrência de doenças geriátricas, assim como, uma baixa incidência de câncer.
Desde 1965 as amostras são exportadas para o Japão onde são cultivadas e
estudadas (Menoli et al., 2001).
O cogumelo Agaricus brasiliensis é freqüentemente consumido na
alimentação e na forma de chá, em diferentes partes do mundo devido a seus
efeitos medicinais e afrodisíacos, sendo utilizado em casos de estresse físico e
emocional, redução do colesterol, diabetes, distúrbios gástricos, osteoporose, como
anticarcinogênico e antimutagênico, antioxidante, estimulador do sistema
imunológico entre outros. Entretanto, o que os cientistas conhecem sobre suas
propriedades biológicas ainda é insuficiente para explicar todos os efeitos citados na
medicina popular (Menoli et al., 2001; Bellini et al., 2003).
De acordo com Kawagishi et al (1989) os polissacarídeos extraídos
dos fungos basidiomicetos apresentam em sua maioria cadeias compostas de D-
glicose com ligações do tipo β-1,3, entretanto os polissacarídeos obtidos do A.
brasiliensis apresentam cadeia de D-glicose com ligações apenas do tipo β-1,6
insubstituíveis e estes resíduos de ligações estão associados com a atividade
antitumoral. Várias pesquisas vêm sendo realizadas para identificar a estrutura e
20
natureza química desses polissacarídeos e esclarecer sua relação com a atividade
antitumoral. (Gonzaga et al., 2005).
O corpo de frutificação do A. brasiliensis consiste de 85-87% de
água. Quando desidratado, é rico em proteínas (40-45%), apresenta de 3-4% de
carboidratos, 6-8% de fibras dietéticas, 3-4% de lipídios, vitaminas, especialmente
B1, B2 e niacina. Ergosterol (0,1-0,2% peso seco) e ácido linoléico (70-80% de
lipídios totais) são os lipídios predominantes. Compostos aromáticos não voláteis
como açúcares solúveis, mais comumente a arabinose, glicose e trialose, também
são encontrados (Bellini et al., 2003). O potássio é o principal componente mineral
do Agaricus brasiliensis (Oliveira et al., 2002). De acordo com Kawagishi et al (1989)
e Kawagishi et al (1990) a partir dos resíduos solúveis em água, do corpo de
frutificação do A. brasiliensis foi isolado um complexo proteína-polissacarídeo
(proteína-β-1,6-D-glucana) constituído de 50,2% de carboidrato e 43,3% de proteína
e a análise dos aminoácidos dessas proteínas apresentaram grandes quantidades
de alanina (11,9%) e tirosina (2,4%).
A atividade antiviral do A. brasiliensis foi pouco estudada. Sorimachi
et al (2001) verificaram que frações obtidas da precipitação do extrato aquoso do
micélio de A. brasiliensis com 44 e 50% de etanol, inibiram completamente a
ocorrência de efeito citopático (ECP) induzido pelo vírus da encefalomielite eqüina
do oeste (WEE), outras frações com diferentes concentrações de etanol também
apresentaram efeito de inibição, porém, menor. O extrato obtido do corpo de
frutificação não mostrou efeito significativo na formação do ECP causado por este
vírus. As frações obtidas com 44 e 50% de etanol do micélio de A. brasiliensis
inibiram pouco, a ocorrência do ECP induzido pelo vírus herpes simples (HSV).
Frações obtidas com concentrações de 29, 38, 44 e 50% de etanol do corpo de
frutificação inibiram levemente a ocorrência do ECP induzido por poliovírus.
21
5 POLIOVÍRUS
Os poliovírus estão classificados no gênero Enterovirus (vírus cuja
replicação ocorre principalmente no trato gastrointestinal) pertencentes à família
Picornaviridae, onde se encontram diversos vírus importantes para o homem e para
a agropecuária, como por exemplo, os rinovirus, vírus da hepatite A e o da febre
aftosa (Gonçalves et al 2002). No gênero Enterovirus, os coxsackievirus e echovirus
compreendem a maioria, seguidos do vírus da poliomielite 1 a 3 e enterovirus que
infectam o homem e ainda enterovirus de espécies não humanas (Mueller et al.,
2005).
A família Picornaviridae é constituída de vírus pequenos ‘Pico’ e o
genoma de ácido ribonucléico ‘rna’. O vírion apresenta simetria icosaédrica (26 a 30
nm de diâmetro) não possui envelope, o genoma de RNA de fita simples é de
polaridade positiva e sua biossíntese ocorre inteiramente no citoplasma (Mueller et
al., 2005). A composição química dos poliovírus é de 30% de ácido nucléico e 70%
de proteína. O capsídeo é formado por quatro proteínas estruturais, VP1 – VP4,
sendo que VP1, VP2 e VP3 são superficiais, e responsáveis pela diversidade
antigênica entre poliovírus. VP4 se localiza mais internamente no capsídeo
associando-se ao ácido nucléico. A molécula de RNA é linear, possui cerca de 7500
bases e funciona diretamente como RNA mensageiro (RNAm). A região terminal 3’
possui resíduos de adenina (Poli-A) e na região terminal 5’a proteína VPg. O RNAm
viral é traduzido primeiramente em uma poliproteína que mais tarde é clivada em
proteínas menores originando as proteínas estruturais, proteína VPg, RNA
polimerase e proteases (Madigan et al., 2004).
22
Os poliovírus tipos 1, 2 e 3 são os agentes etiológicos da Poliomielite,
doença caracterizada por um quadro clássico de paralisia flácida de início súbito.
Acomete em geral os membros inferiores, de forma assimétrica, tendo como
principais características: flacidez muscular, com sensibilidade conservada e
arreflexia no segmento atingido. A poliomielite pode apresentar-se ainda de maneira
abortiva, que é a forma mais comum da doença, e não paralítica (meningite
asséptica) (Pallansch e Ross, 2001).
Em 1988 os países membros da Organização Mundial da Saúde
(OMS) resolveram propor medidas para erradicação da poliomielite, desde então
progressos consideráveis têm sido obtidos na luta contra a doença. Em 1988, o
número de países endêmicos chegava a 125 e o número de casos de poliomielite
era de 350.000, em 2003 passou para sete o número de países endêmicos e cerca
de 1900 notificações da doença. O Brasil não apresenta casos desta doença desde
1989 (WHO, 2003). Em 2005, a luta contra a poliomielite continuou em vários países
da África e da Ásia (Mueller et al., 2005).
A vacinação é o principal método para levar à erradicação e ao
controle da poliomielite no mundo. Os programas e as campanhas de vacinação
para crianças menores de cinco anos têm sido cada vez mais reforçados, utilizando
a vacina com vírus atenuado pela maior facilidade de administração, custo mais
barato para a aplicação, capacidade de induzir anticorpos séricos e secretores e
pela rapidez com que a vacina induz o aparecimento de imunidade duradoura
(Gonçalves et al., 2002).
Apesar da tentativa de erradicação e do controle do vírus na maioria
dos países, podemos encontrar alguns casos da doença, principalmente em países
subdesenvolvidos como os do continente africano. O poliovírus é um dos modelos
23
virais mais estudados e bem conhecidos, a estabilidade do capsídeo, a fácil
purificação do vírion, a obtenção de altos títulos virais e a segurança para trabalhar
em nível laboratorial (cepas vacinais) fazem com que seja alvo de várias pesquisas.
É utilizado, por exemplo, como modelo de vírus RNA na investigação de novas
drogas antivirais (Mueller et al., 2005).
24
6 OBJETIVOS
6.1 G
ERAL
Avaliar a atividade antiviral dos extratos aquoso e etanólico e do
polissacarídeo purificado de Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei ss. Heinem)
contra poliovírus em cultura de células HEp-2.
6.2 E
SPECÍFICOS
• Avaliar a citotoxicidade do polissacarídeo purificado e dos extratos aquoso e
etanólico de Agaricus brasiliensis em células HEp-2.
• Avaliar a atividade antiviral do polissacarídeo purificado e dos extratos aquoso
e etanólico de Agaricus brasiliensis contra poliovírus tipo 1 utilizando
diferentes tratamentos pelo ensaio de plaque e imunofluorescência indireta,
com o intuito de identificar em que etapa da replicação as substâncias
estariam atuando.
25
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29
ARTIGO
ANTIVIRAL ACTIVITY OF AQUEOUS AND ETHANOL EXTRACTS AND OF AN ISOLATED
POLYSACCHARIDE FROM
AGARICUS BRASILIENSIS AGAINST POLIOVIRUS TYPE 1.
Lígia Carla Faccin
a
, Fabricio Benati
a
, Vinicius Pires Rincão
a
, Mario Sergio
Mantovani
b
, Sandra de Aguiar Soares
c
, Maria Leônia da Costa Gonzaga
c
, Carlos
Nozawa
a
, Rosa Elisa Carvalho Linhares
a*
.
a
Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina,
Paraná, Brazil
b
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina,
Paraná, Brazil
c
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade federal do Ceará,
Fortaleza, Ceará, Brazil
*
Corresponding author:
Prof
a
. Dra. Rosa Elisa Carvalho Linhares
E-mail address: [email protected]
Depto. de Microbiologia/CCB
Universidade Estadual de Londrina
Caixa Postal 6001
CEP 86051-990
Londrina-PR, Brazil
Phone: 55-4333714617
Fax: 55-4333714192
30
Abstract
Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei ss. Heinem), also known as the sun
mushroom is native to Southeast Brazil, and is widely consumed, mainly in the form
of tea, due its nutritional and pharmacological properties. In this study, we tested
aqueous (AE) and ethanol (EE) extracts and an isolated polysaccharide (PLS) from
the fruiting body of A. brasiliensis, for antiviral activity against poliovirus type 1 in
HEp-2 cells. The assay for time of addition showed that when AE, PLS and EE were
added to cells during infection (time 0 h), there was a concentration-dependent
reduction in the number of plaques up to 50.1, 67.3 and 88%, respectively, with a S.I.
of 5.4, 9.9 and 12.3, respectively. The test substances had little effect on reducing
viral adsorption and did not show any virucidal effect, suggesting activity at the initial
stage of replication of poliovirus.
Keywords: Agaricus brasiliensis; Antiviral activity; Poliovirus; Time of addition.
1. Introduction
The basidiomycete Agaricus brasiliensis (= Agaricus blazei ss. Heinem), also known
as the sun mushroom, God’s mushroom and “Himematsutake,” is a species native to
the southeast region of Brazil. It is frequently consumed as food and in the form of
tea, in different parts of the world, where it is used in traditional medicine. It is used
for medicinal purposes, for example, in cases of physical and emotional stress, high
cholesterol, diabetes, gastric and digestive disturbance, and osteoporosis. This
mushroom is also used as an anticarcinogenic and antimutagenic agent and
31
antioxidant, and to stimulate the immune system. However, there is little known about
its biological properties (Menoli et al., 2001; Bellini et al., 2003).
The fruiting body of A. brasiliensis consists of 85-87% water. When desiccated, it is
rich in protein (40-45%), and also contains 3-4% carbohydrates, 6-8% dietary fiber, 3-
4% lipids, and vitamins, especially B1, B2 and niacin. Ergosterol (0.1-0.2% dry
weight) and linoleic acid (70-80% of total lipids) are the predominant lipids. Aromatic,
non-volatile compounds such as the common soluble sugars arabinose, glucose and
trehalose are also found (Bellini et al., 2003). Potassium is the main mineral
component in Agaricus brasiliensis (Oliveira et al., 2002). In accordance with
Kawagishi et al. (1989) and Kawagishi et al. (1990), a (1 → 6)-β-
-glucan-protein
complex was isolated from the water-soluble residue derived from the fruiting body of
A. brasiliensis, which consisted of 50.2% carbohydrate and 43.3% protein, and an
amino acid analysis of these proteins showed large amounts of alanine (11.9%) and
tyrosine (2.4%).
Studies with extracts of A. brasiliensis showed that some of these exhibited
antimutagenic, anticarcinogenic and immuno-stimulatory activities (Delmanto et al.,
2001; Menoli et al., 2001; Nakajima et al., 2002).
The antiviral activity of extracts and compounds isolated from mushrooms has been
described by various authors, but the antiviral activity of A. brasiliensis has been
studied little. Sorimachi et al. (2001) demonstrated that the aqueous extract obtained
from A. Brasiliensis was capable of blocking the cytopathic effect of western equine
encephalitis virus (WEE). Ngai and Ng (2003) described the activity of a lentin
isolated from shiitake mushroom, Lentinus edodes, against human immunodeficiency
virus (HIV). A glycoprotein isolated from the fruiting body of the mushroom Pleurotus
ostreatus also showed anti HIV activity (Wang and Ng, 2000). The phenolic
32
compounds hispolon and hispidin and the ethanol extract obtained from the fruiting
body of the basidiomycete Inonotus hispidus inhibited the replication of influenza A
and B viruses (Awadh Ali et al., 2003).
Poliovirus, belonging to the genus Enterovirus and family Picornaviridae, is the
etiologic agent of poliomyelitis, a disease characterized by a classic manifestation of
flaccid paralysis with sudden onset (Pallansch and Ross, 2001). Despite the control
of the virus in the majority of countries, this disease still occurs in African countries.
Poliovirus is one of the most studied and best understood viral models; it replicates
efficiently in various types of cultured cells achieving high viral titers (Mueller et al.,
2005). In the present study, we used poliovirus as a model of an RNA virus in the
investigation of the antiviral activity of aqueous and ethanol extracts and of a
polysaccharide derived from the basidiomycete Agaricus brasiliensis at various
stages of the viral replication cycle.
2. Materials and methods
2.1 Preparation of aqueous and ethanol extracts and polysaccharide
The basideocarp of Agaricus brasiliensis (Agaricus blazei Murill ss. Heinem), strain
99/26, desiccated and pulverized, was kindly provided by the Faculty of Agricultural
Sciences, UNESP/Botucatu – SP, Brazil. To obtain the aqueous extract, 20g of the
basideocarp were resuspended in 200 ml of distilled water, at ambient temperature
(approximately 25ºC), under agitation for one hour. To obtain the ethanol extract, 10
g were dissolved in 100 ml of 46 % ethanol at ambient temperature, with mixing for
33
one hour. The extracts obtained were then pre-filtered with filter paper and then
submitted to sterilization by ultra-filtration utilizing a 0.2-µm membrane (MFS-USA).
The isolated polysaccharide (PLS) (Gonzaga et al., 2005) was provided by the
Polymer Laboratory of the Department of Organic and Inorganic Chemistry, Federal
University of Ceará, Fortaleza-Ce, Brazil. To determine antiviral activity, the
polysaccharide was dissolved in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM), filter-
sterilized and kept at 4ºC for a maximum of 72 h.
2.2.Cells and virus
HEp-2 cells (epithelial cells of human larynx carcinoma, ATCC CCL-23) were grown
at 37ºC in DMEM, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL) and
treated with 100 µg/ml streptomycin (Sigma, Chem. Co. U.S.A.), 100 IU/ml of
penicillin (Sigma, Chem. Co.U.S.A.) and 2.5 µg/ml of fungizone (Bristol Myers-
Squibb).
The sample of poliovirus type 1 (P1) (ATCC VR-58), was donated by the Department
of Virology of IMPPG- UFRJ, RJ, Brazil. The virus stock was prepared in HEp-2 cells
and maintained at –80ºC . The virus titer was determined by the plaque assay.
2.3. Cytotoxicity assay
The evaluation of the test substances for cytotoxicity was carried out using the MTT
method (MTT-based in vitro toxicology assay kit, Stock No. TOX-1, Sigma, Chem.
Co.) according to the manufacturer’s instructions. HEp-2 cells were grown in 96-well
microplates at 37ºC and in 5% CO
2.
After the formation of a monolayer, the medium
34
was replaced with fresh medium containing different concentrations of the test
substances (62.5 – 10000 µg/ml for AE and EE and 25 – 4000 µg/ml for PLS). Cells
grown without test substances and in the presence of medium with and without
ethanol were used as controls. The plates were incubated for three days at 37ºC and
cell viability was then determined. The 50% cytotoxic concentration (CC
50
) was
calculated as the concentration of the test substance capable of reducing the optical
density of the MTT product by 50% in relation to the controls by regression analysis.
2.4. Time of addition assay
The effect of time of addition of the substances on the replication of poliovirus was
determined according to the method described by Yang et al. (2005), but with some
modifications. HEp-2 cells were cultivated in 24-well plates and incubated at 37ºC for
48 h in 5% CO
2
. DMEM containing twofold serial concentrations of AE (125-1000
µg/ml), EE (125-1000 µg/ml) and PLS (25-200 µg/ml) were added at different times:
before (-1 and -2 h), during (0 h) and after (1 and 2 h) viral infection at a multiplicity of
infection (MOI) of 1. After infection, a plaque assay was carried out by adding to each
well a layer of DMEM containing 1.5% agarose and 25mM MgCl
2
. The cells were
then incubated for 40 h, fixed with 10% formaldehyde in phosphate-buffered saline
(PBS), pH 7.3, for 24 h and stained with 0.5% crystal violet in 20% ethanol, to
determine the number of plaques. The percent viral inhibition (% V.I.) was calculated
by following formula: [1-(number of plaques with drug/number of plaques in control)] x
100. The 50% inhibitory concentration (IC
50
) was determined as the concentration
capable of reducing the number of PFU by 50% . The selectivity index (S.I.) was
expressed as the ratio of CC
50
/IC
50
.
35
Concomitantly, interferon was used as the positive control for inhibition of viral
replication at a concentration of 1000 U/ml.
2.5. Virucidal activity
The direct effect of AE, EE and PLS on the replication of poliovirus was determined
by mixing equal volumes of virus suspension (10
7
PFU/ml) and DMEM containing
different concentrations of the test substances, followed by incubation for 1 h at 37ºC.
After this period, the residual viral titer was determined by the plaque assay.
2.6. Viral adsorption assay
AE, EE and PLS were examined for their inhibitory effect on virus adsorption by HEp-
2 cells according to Zhu et al. (2004) with some modifications. HEp-2 cells were
grown in 24-well plates and incubated at 37ºC for 2 days in 5% CO
2
. After the
formation of the cell monolayer, the plates were infected with poliovirus in the
presence and absence of different concentrations of the test substances. After a viral
adsorption period of 60 min at 4ºC, the cells were washed with PBS to remove the
non-adsorbed virus and the plaque assay was performed.
2.7. Indirect immunofluorescence reaction (IIF)
HEp-2 cells were grown in 24-well plates containing cover slips and incubated for 2
days at 37ºC in 5% CO
2
. After the formation of a cell monolayer, the culture medium
was removed and the cells were inoculated with virus at an MOI of approximately 1.
36
Different concentrations, of the test substances, as used before, were added at zero
hour of infection (0 h). Cell cultures inoculated but not treated and cell cultures not
inoculated maintained in the absence or presence of the test substances and
ethanol, served as controls. At 24 h post-infection (p.i.), the cells were washed with
PBS and fixed with acetone (-20ºC) for 20 min. The IIF reaction was performed using
rabbit serum anti-poliovirus type 1 (supplied by Dr. E.C. Leal, INCQS/FIOCRUZ, RJ)
and sheep serum anti rabbit IgG conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC)
(Sigma Chem. Co., USA). The cells were examined with a Zeiss fluorescence
microscope, and 100 cells/cover slip were scored. The experiments were carried out
in triplicate.
3. Results
3.1. Cytotoxicity assay
The test substances affected the viability of cells at different concentrations. CC
50
for
the aqueous and ethanol extracts and polysaccharide was 5000, 2302 and 969
µg/ml, respectively. The ethanol did not show any toxic effect on the cells at the
dilution utilized to obtain the extract.
3.2. Effect of time of addition of the test substances obtained from Agaricus
brasiliensis on viral inhibition
The results obtained from the plaque assay showed a greater activity of viral
inhibition when the substances were added at the same time as the virus (time 0h),
37
for EE, where the % V.I. was 88% for 1000 µg/ml (Fig. 1A); 50.1% for AE at the same
concentration (Fig. 1B) and 67.3% for PLS at 200 µg/ml (Fig. 1C). When the
substances were added before or after infection occurred, there was a decrease in
viral inhibition. The IC
50
calculated based on the results obtained for time 0 h was
922.89 (S.I. 5.4), 187.6 (S.I. 12.3) and 97.2 µg/ml (S.I. 9.9) for AE, EE and PLS,
respectively (Table 1). Interferon, utilized as a control, at a concentration of 1000
U/ml, inhibited replication of the virus by 100%. The IC
50
value was calculated by
regression analysis of the dose-response curve generated from the data.
3.3.Virucidal test
The results obtained in the test for virucidal activity showed that none of the test
substances (EE, AE and PLS) was capable of interfering with the infectiousness of
poliovirus, and therefore these substances had no direct action on the virus.
3.4. Viral adsorption assay
The effect of the test substances on the adsorption of virus by HEp-2 cells,
determined by the plaque assay, resulted in a slight %V.I. of 36% for EE, 8% for AE
and 12% for PLS at higher concentrations tested.
38
3.5 Indirect immunofluorescence reaction
The results obtained by indirect immunofluorescence, after treatment with the test
substances at time 0 h of infection, showed a dose-dependent response (table 2). A
maximum % V.I. of 58.6% for EE, 14% for AE and 28.5% for PLS was observed at
higher concentrations.
4. Discussion
In this work, we tested an aqueous and ethanol extract and an isolated
polysaccharide of Agaricus brasiliensis for antiviral activity against poliovirus type 1.
We found that these substances showed activity that was dependent on
concentration and the time point of exposure. Both the aqueous and the ethanol
extract, along with the polysaccharide, were more effective when added to cultures
during the infection period (time 0 h). EE induced the greatest %V.I., followed by
PLS and AE, and this finding is in accordance with the S.I. obtained which was also
greatest for EE, followed by that for PLS and EA. The results of IIF test showed
maximum reduction of fluorescent cells for EE, similarly when compared with plaque
assay, albeit in lower percentage of inhibition. This could be justified by the earlier
time IIF was performed. Sorimachi et al. (2001) showed that fractions obtained from
an aqueous extract of A. brasiliensis mycelium with 44 and 50% ethanol, inhibited
completely the cytopathic effect (CPE) induced by western equine encephalomyelitis
virus (WEE). Fractions obtained with ethanol concentrations of 29, 38, 44 and 50%,
from the fruiting body, added after viral adsorption (1 h) inhibited slightly the CPE
induced by poliovirus. Some authors have reported an antiviral activity for
39
polysaccharides isolated from fungi. Zhang et al. (2004) tested fractions obtained
from B-glucan isolated from Pleurotus tuber-regium for antiviral activity against
herpes simplex type 1 and 2 viruses and found that all the fractions were more
effective when added simultaneously with the virus at the time of viral infection,
concurring thus with the results of our study. AE, EE and PLS did not show virucidal
activity, and all three substances had a weak influence on viral adsorption. We
suggest therefore that these substances derived from the fruiting body of A.
brasiliensis interfere in the initial stage of the replication of poliovirus.
Acknowledgemets
We thanks Dr.Tulio Oliveira de Carvalho for helping on statistical analysis. This work
was partially supported by CNPq, CAPES and Fundação Araucária and it is part of
L.C.Faccin M.Sc. manuscript.
40
References
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42
Table 1. Antiviral activities of the aqueous extract (AE), ethanol extracts (EE) and
isolated polysaccharide (PLS) from Agaricus brasiliensis against poliovirus type 1 in
HEp-2 cells by the plaque assay.
Fig.1. Time-of addition effect of aqueous extract (E.A.) (a), ethanol extract (E.E.) (b)
and polysaccharide (PLS) (c) of Agaricus brasiliensis on poliovirus replication in
HEp-2 cells by the plaque assay. The extracts were added at various concentrations
before (-2 and –1 h) during (0 h) or after (1 and 2 h) virus infection. The values
represent the mean ± SD of three independent experiments.
Table 2. Effect of AE, EE and PLS of Agaricus brasiliensis on poliovirus replication
in Hep-2 cells by immunofluorescence assay. The substances were added at zero
hour of infection. The percentage of inhibition was calculated with respect to
untreated infected cells. The experiments were carried out in triplicate.
43
Table 1
CC
50
a
(µg/ml) IC
50
b
(µg/ml) SI
c
AE 5000 922.9 5.4
EE 2302 187.6 12.3
PLS 969.4 97.2 9.9
a
50% cytotoxic concentration
b
50% inhibitory concentration
c
Selectivity index = (CC
50
/IC
50
)
44
Fig.1
Aqueous Extract
0
20
40
60
80
-2 -1 0 1 2
Time (hours)
% viral inhibition
1000ug/ml
500ug/ml
250ug/ml
125ug/ml
(a)
(b)
Ethanol Extract
0
20
40
60
80
100
-2 -1 0 1 2
Time (hours)
% viral inhibition
1000ug/ml
500ug/ml
250ug/ml
125ug/ml
(c)
Polysaccharide
0
20
40
60
80
-2 -1 0 1 2
Time (hours)
% viral inhibition
200ug/ml
100ug/ml
50ug/ml
25ug/ml
45
Table 2
Aqueous extract Ethanol extract Polysaccharide
Concentration
(µg/ml)
%
inhibition*
Concentration
(µg/ml)
%
inhibition
Concentration
(µg/ml)
%
inhibition
125 0 125 0 25 0
250 0 250 20.6 50 0
500 7 500 31 100 13
1000 14 1000 58.6 200 28.5
* % of inhibition of fluorescent cells number in comparison with control
46
ANEXO
Basideomiceto Agaricus blazei Murill ss. Heinem
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