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CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
LABORATÓRIO DE ECOLOGIA MICROBIANA
LETÍCIA SAYURI MURATE
ATIVIDADE DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
BACTERIANOS NO CONTROLE DO CANCRO CÍTRICO
Londrina
2007
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LETÍCIA SAYURI MURATE
ATIVIDADE DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
BACTERIANOS NO CONTROLE DO CANCRO CÍTRICO
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia da Universidade
Estadual de Londrina como parte
dos requisitos para a obtenção do
título de Mestre em Microbiologia
Orientador:Prof.Dr.Galdino Andrade
Londrina
2007
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LETÍCIA SAYURI MURATE
ATIVIDADE DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
BACTERIANOS NO CONTROLE DO CANCRO CÍTRICO
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________________
___
Prof. Dr. Galdino Andrade Filho
_______________________________
___
Prof. Dr. João Carlos Palazzo de Mello
_______________________________
___
Prof. Dr. Martin Homechin
Londrina, 20 de abril de 2007.
DEDICATÓRIA
À minha família; aos amigos do
Laboratório de Ecologia Microbiana e
todos que de alguma forma me ajudaram
no desenvolvimento deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Carlos e Mivako por todo amor, carinho, apoio e incentivo, e por
todo o sacrifício e dedicação que tiveram com suas filhas; por serem espelhos
de vida e por acreditarem em mim.
As minhas irmãs Patrícia e Márcia pela amizade e paciência, as quais são
muito importantes para mim.
Ao meu namorado Wilson pelo amor, paciência, companheirismo e pelo
exemplo de dedicação que você me mostrou.
Aos meus familiares que também me apoiaram muito, em especial para Tia
Cristina, Melina e Yuna.
Ao Prof. Dr. Galdino Andrade, pela orientação e pela confiança no
desenvolvimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Marco Antônio Nogueira pelas preciosas informações e pelo
exemplo de competência profissional.
Ao Prof
.
Dr. João Carlos Palazzo de Mello por ajudar a fornecer condições para
o desenvolvimento deste trabalho, permitindo a utilização de alguns
equipamentos de seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Martin Homechin pelas valiosas sugestões, as quais foram muito
importantes nos resultados dos experimentos.
À Coordenação do Mestrado em Microbiologia, por fornecer condições para a
realização deste curso.
Ao técnico do laboratório, Márcio, por estar sempre disposto a me ajudar.
Aos companheiros de laboratório Lela, Camila, Cícera, Cristiane, Fabiana,
Flávia, Ivana, Luís Eduardo, Marina, Nathália, Rafael, Rebeca e Thaís pela
convivência; em especial Dafila e Admilton pela ajuda nos experimentos. .
Aos meus grandes amigos Andrea, Gisele, Graziela, Ricardo, Shoyu, Tici e
Wanner pela força e por todo carinho, principalmente nos momentos difíceis.
Ao Luís Gustavo de Lázaro Rampazo, do Instituto Agronômico do Paraná, pela
cooperação no desenvolvimento do trabalho.
A todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a realização deste
trabalho.
MUITO OBRIGADA!!!
LISTA DE TABELAS
Table 1. Effects of fraction derived from the supernatant of LN culture extracted
with methanol (AMF) and ethyl acetate (EAF), and fractions obtained from
vacuum liquid chromatography extracted with n-hexane (VLC1), dichloromethane
(VLC2), ethyl acetate (VLC3), methanol (VLC4), water: methanol mix vol:vol
(VLC5) and distilled water (VLC6) in ten-fold dilution on the growth of Xac 306 in
nutrient agar in Petri dishes…………………………………………………………...41
Table 2. Effects of fraction derived from the second extraction with ethyl acetate
(EAF) of supernatant of LN culture and fractions obtained from vacuum liquid
chromatography extracted with dichloromethane (VLC2), ethyl acetate (VLC3),
and methanol (VLC4) in two-fold dilution on the growth of Xac 306 cultured in 24-
well tissue culture plate. (+) growth inhibition and (-) no inhibition………………..42
LISTA DE FIGURAS
Figure 1. Correlation between rate of cell mortality and fractions concentrations. (A)
[EAF] Fraction from the second extraction with ethyl acetate of supernatant of bacterial
culture. (B) [VLC2] Fraction derived from de vacuum liquid chromatography extracted
with dichloromethane. (C) [VLC3] Fraction derived from de vacuum liquid
chromatography extracted with ethyl acetate……………………………………………..44
Figure 2. Control of citrus canker lesion formation by Xac 306 on leaf of orange trees
(C. sinensis pv. Valencia) by fractions derived from the second extraction with ethyl
acetate (EAF) of supernatant of LN culture and fractions obtained from vacuum liquid
chromatography extracted with dichloromethane (VLC2), ethyl acetate (VLC3) in a
concentration of 10 mg mL
-1
. Values are the means of 5 replicates. Means for each
treatment with the same letter are not significantly different of Tukey test (p
≤
0.05)……………………………………………………………………………………………45
SUMÁRIO
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA …………………………………………………….... 01
1.1 Origem e distribuição geográfica .................................................................... 01
1.2 Etiologia .......................................................................................................... 02
1.3 Sintomatologia ................................................................................................ 03
1.4 Epidemiologia do cancro cítrico ..................................................................... 04
1.5 Larva minadora dos citros .............................................................................. 06
1.6 Controle do Cancro Cítrico ............................................................................. 07
1.7 Controle Biológico .......................................................................................... 13
1.8 Metabólitos bacterianos com atividade antimicrobiana .................................. 16
2 OBJETIVOS …………………………………………………………………………. 17
2.1 Geral ............................................................................................................... 17
2.2 Específicos ..................................................................................................... 17
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………………. 18
ARTIGO: ACTIVITY OF BACTERIAL SECONDARY METABOLITES IN THE
CONTROL OF CITRUS CANKER ………………………………………
29
Abstract ………………………………………………………………………………... 30
1. Introduction ………………………………………………………………………… 31
2. Material and methods …………………………………………………………….. 32
2.1. Bacterial Strains and Growth Conditions ……………………………………….
32
2.2. Xac 306 inoculum ..........................................................................................
32
2.3. Antagonistic bacterial extract ........................................................................
33
2.4. Vacuum liquid chromatography (VLC) ..........................................................
33
2.5. Antimicrobial activity assay in Petri dishes …………………………………….
34
2.6. Antimicrobial activity assay in 24-well tissue culture plate …………………...
34
2.7. Citotoxicity assay ...........................................................................................
35
2.8. Antimicrobial activity test in orange trees ………………………………………
35
3. Results ……………………………………………………………………………… 35
3.1. Antimicrobial activity assay in Petri dishes …………………………………….
35
3.2. Antimicrobial activity assay in 24-well tissue culture plate …………………...
36
3.3. Citotoxicity assay ………………………………………………………………….
36
3.4. Antimicrobial activity test in orange trees ………………………………………
36
4. Discussion …………………………………………………………………………. 37
References …………………………………………………………………………….. 38
Figures legend ………………………………………………………………………... 43
MURATE, Letícia Sayuri. Atividade de metabólitos secundários bacterianos no
controle do cancro cítrico. Londrina, 2007. Dissertação (Mestrado em Microbiologia)
– Universidade Estadual de Londrina.
RESUMO
O desafio é encontrar novos métodos para o controle da doença do cancro. Atualmente,
o controle é feito através de erradicação ou uso de metais pesados (cobre) como
bactericidas. A bactéria LN foi cultivada em meio liquido e o sobrenadante,
centrifugado para retirada de células, foi tratado com metanol (AMF) e acetato de etila
(AEF), e posteriormente o extrato foi concentrado, filtrado, liofilizado; e fracionado por
cromatografia liquida a vácuo (CLV). Depois da CLV, oito frações foram obtidas:
FAM, FAE, CLV1, CLV2, CLV3, CLV4, CLV5 e CLV6. Todas as frações foram
testadas para atividade contra Xanthomonas axanopodis pv. citri (Xac 306) para nesaios
de atividade antimicrobiana, em placas de petri e placas de cultura com 24 poços, esse
método demonstrou efeito inibitório mas em diferentes concentrações. Efeito citotóxico
em todas as frações em 50 µg/mL
-1
. Em plantas somente CLV3 mostrou resultados
significantes (p<0,05), reduzindo a incidência de lesões de cancro.
MURATE, Letícia Sayuri. Activity of bacterial secondary metabolites in the control
of citrus canker. Londrina, 2007. Dissertação (Mestrado em Microbiologia) –
Universidade Estadual de Londrina.
ABSTRACT
The challenge is finding new methods to control citrus canker disease. Today the
control is making to cut plants or use heavy metal (cupper) as bactericide. The LN
bacteria strain was cultured in liquid medium and the supernatant free-cells was treated
with methanol (AMF) and ethyl acetate (AEF), respectively, and than the extract was
concentrated, filtrated, lyophilized; and fractionated by vacuum liquid chromatography
(VLC). After VLC, eight fractions were obtained: AMF, EAF, VLC1, VLC2, VLC3, VLC4,
VLC5 and VLC6. All fractions were tested its activity against Xanthomonas axonopodis
pv. citri (Xac 306) by antimicrobial activity assay, in Petri dishes and in 24-well tissue
culture plate method showed inhibitory effect but in different concentrations. Citotoxicity
effects were observed in all fractions in 50 µg mL
-1
concentration. In plants only VLC3
showed significant results (p<0.05), reducing the incidence of canker lesions.
1
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Origem e distribuição geográfica da doença
Cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri,
é um dos fatores importantes na produção de citros no mundo (Gottwald et al.,
2002). Sob condições de elevados níveis da doença, ocorre queda prematura
dos frutos, com conseqüente perda de produção. Não existem medidas de
controle capazes de eliminar a doença, e medidas como erradicação de plantas
doentes e das sob suspeitas de contaminação se torna a maneira mais eficaz
de controlar a doença (Gottwald et al., 2001), causando grandes danos
econômicos.
As primeiras indicações do cancro cítrico se deu na Índia, em folhas
herbarizadas de cidra (Citrus medica), coletadas entre 1827 e 1831 (Bitancourt,
1957; Fawcett e Jenkins, 1993). Originário do Sudeste Asiático, mesmo centro
de origem dos citros, o cancro cítrico atingiu várias regiões do mundo (Koizumi,
1985). A primeira constatação da bactéria causadora da doença no Hemisfério
Ocidental foi feita nos Estados Unidos por volta de 1910, em mudas de citros
provenientes do Japão (Stall e Seymour, 1983). Anos mais tarde, sua
ocorrência foi relatada na África do Sul, em 1916; na Austrália e Nova Zelândia,
em 1937; e nas Ilhas Fiji, em 1954 (Jones et al., 1984). Hoje está presente em
países localizados na Oceania, Ásia e América, infectando plantas da família
Rutaceae (Civerolo, 1984). Na América do Sul já havia sido relatada no Brasil,
Argentina, Paraguai e Uruguai (Feichtenberger, 1997; Leite Junior, 1990) e
recentemente na Bolívia (Braithwait et al., 2002). No Brasil, foi introduzida
provavelmente por volta de 1957 no município de Presidente Prudente em
material propagativo proveniente do Japão (Bitancourt, 1957). Disseminou-se
para outras regiões e Estados brasileiros, como nos Estados do Paraná, Santa
Catarina, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Minas Gerais
(Feichtenberger et al., 1997) e por último em Roraima (Nascimento et al.,
2003).
2
1.2 Etiologia
A Xanthomonas axanopodis pv. citri (Bactéria, Proteobacteria,
Subdivisão Gamma, Xanthomodales), agente causal do cancro cítrico, é um
bastonete gram-negativo, aeróbio estrito e apresenta um único flagelo polar.
Quando cultivada em meio ágar nutriente apresenta colônias amarelas, com
aspecto viscoso devido a produção de exopolissacarídeos, sendo visíveis após
24 e 72 horas de incubação a uma temperatura de 28
0
C (Brunnings e Gabriel;
2003).
Existem tipos distintos de doenças do cancro cítrico causados por
diferentes patovares ou variantes da bactéria Xanthomonas axanopodis; a
separação dessas formas é baseada conforme susceptibilidade de hospedeiros
e outras características fenotípicas e genotípicas das cepas. O cancro cítrico
asiático (cancrose A), causado pela cepa asiática X. axanopodis pv. citri, é a
forma mais mais severa da doença. Afeta várias espécies da família Rutácea e
encontra-se disseminado na Ásia, África, América e Oceania. A Cancrose B,
causada pela cepa B de X. axanopodis pv. aurantifolii, com maior importância
em limões verdadeiros (Citrus limon) e lima ácida “Galego” (Citrus aurantifolia),
sendo encontrada na Argentina, Paraguai e Uruguai. A Cancrose C, também
causada pela X. axanopodis pv. aurantifolii, foi isolada em 1970 de lima
mexicana no Estado de São Paulo, mas é raramente encontrada desde então.
O único hospedeiro natural conhecido dessa bactéria é o limão Galego. Outras
formas da bactéria do cancro cítrico têm sido relatadas, como os isolados A*
descobertos em Omã, Arábia Saudita, Irã e Índia que produzem lesões como
Cancro A somente em lima mexicana, mas aparentam ser distintas da cepa A
(Vernière et al., 1998; Mohammadi et al., 2001).
O processo infeccioso envolvendo bactérias do gênero Xanthomonas
compreende etapas, como penetração na planta através de ferimentos e
aberturas naturais, multiplicação nos espaços intercelulares até que estes se
tornem preenchidos pelas células bacterianas ou por seus exopolissacarídeos
(Rudolph, 1993), levando ao desenvolvimento de uma borda encharcada,
aumento da permeabilidade das células das plantas, com a perda de nutrientes
pelas células da planta. Em algumas espécies e patovares de Xanthomonas, a
bactéria invade o tecido vascular, onde se multiplica e se propaga através
deste. Durante o preocesso infeccioso nos tecidos foliares ou vasculares, as
3
células adjacentes as infectadas começam a se degradar. Ocorre degeneração
das organelas das plantas as quais se dilatam e fragmentam, e ao final as
células bacterianas penetram e se multiplicam dentro das células. Como
sintomas causados inclui cloroses, necroses, murcha, hipertrofia, podridão, e
cancros (Rudolph, 1993). Esse patógeno têm sido descritos como sendo
ambos biotrófico (i.e. alimentando-se no espaço intercelular do tecido
hospedeiro) uma vez que multiplicam-se consideravelmente antes de qualquer
dano visível e, necrogênicos por matar as células da planta causando necrose
(Alfano e Collmer, 1996). Entretanto, pode ser que várias são consideradas
como hemi-tróficas, isto é, bactérias que se alimentam inicialmente do espaço
intercelular do tecido hospedeiro, mas depois destroem e matam células
hospedeiras e utilizam os nutrientes das células mortas.
1.3 Sintomas
A doença pode ocorrer em toda a parte aérea da planta cítrica com
sintomas característicos os quais variam de acordo com o tipo e idade do órgão
infectado pela bactéria. A temperatura ideal para a infecção varia entre 20
0
e
30
0
C (Koizumi, 1977).
Inicialmente, na superfície de ramos, folhas e frutos jovens, aparecem
lesões eruptivas, levemente salientes, puntiformes, de cor creme ou parda, as
quais tornam-se esponjosas, esbranquiçadas e pardacentas e algumas vezes
circundadas por halo amarelo (Leite Junior, 1990; Rossetti, 2001).
A penetração do patógeno no tecido da planta hospedeira se dá através
dos estômatos (Graham et al., 1992 a, b) e/ou ferimentos nos tecidos (Koizumi
e Kuhara, 1982). Os primeiros sintomas nas folhas aparecem na forma de
pequenas pústulas após 9 dias de infecção. Com o aumento da idade das
lesões, estas se tornam claras, e após marrons, e surge uma borda
encharcada, freqüentemente circundada por halo clorótico. O tamanho das
lesões nas folhas depende muito da suscetibilidade do hospedeiro, podendo
atingir até 10 mm de diâmetro em cultivares suscetíveis de laranja e pomelo
(Leite Junior, 1990; Stall e Seymour, 1983). Quando a incidência da doença é
elevada, a doença provoca a desfolha prematura de ramos, comprometendo o
processo fotossintético, que por sua vez reflete em baixas produções e no
4
depauperamento generalizado da planta ( Gottwald et al., 1998; Leite Junior,
1990).
Quando as lesões atingem grandes áreas podem provocar a morte
prematura de ramos (Feichtenberger, 1997). Nos frutos, as lesões podem
atingir a parte interna da casca e geralmente são maiores do que em folhas
apresentando fissuras no centro (Feichtenberger, 1997; Leite Junior 1990).
Quando o nível de doença é elevado, o desenvolvimento dessas lesões pode
acarretar a queda dos frutos antes de atingirem a maturação final e prejudicar a
qualidade dos frutos remanescentes na planta pela presença de lesões e/ou
deformações (Gottwald et al., 1997; Vernière et al., 2003).
1.4 Epidemiologia do cancro cítrico
Em folhas e ramos, a infecção natural ocorre até seis semanas após o
início do desenvolvimento desses órgãos e os frutos são suscetíveis até cerca
de 90 dias a partir da queda das pétalas, podendo ser mais prolongado na
ocorrência de ferimentos (Feichtenberger, 1997; Leite Junior, 1990; Zubrzycki,
1998). Folhas são mais suscetíveis até atingirem aproximadamente 85% do
tamanho normal (Goto, 1990) e tornam-se mais resistentes quando completam
total expansão (Graham; Gottwald, 1991). Estudos realizados por Graham e
Gottwald (1991) mostram que a maior suscetibilidade dos frutos ocorre quando
estes apresentam de 2 a 4 cm de diâmetro e se prolonga, porém de forma
menos acentuada, até o seu completo crescimento.
Stall et al. (1980) observaram que em condições de campo as lesões de
cancro apresentam a mesma quantidade de inóculo, independentemente do
seu tamanho, idade e do cultivar no qual a lesão foi produzida, podendo variar
de 10
5
a 10
6
UFC/lesão. A liberação de células bacterianas, no entanto, é mais
intensa em lesões novas (Timmer et al., 1991). Na presença de filme de água,
a exsudação é instantânea, liberando de 10
4
a 10
5
UFC/lesão (Bock; Parker;
Gottwald, 2001). Progressivamente, as lesões tornam-se suberizadas e a
liberação do inóculo ocorre lentamente (Timmer et al., 1991).
Segundo Canteros (2000), a intensidade do cancro cítrico nas plantas e
a severidade dos sintomas nos frutos variam com as estações do ano, sendo
menores em anos com índices pluviométricos reduzidos na primavera. Leite
Junior et al. (1987) constataram que precipitações elevadas e aumento da
5
temperatura no início da estação de maior fluxo de crescimento são favoráveis
ao desenvolvimento epidêmico de cancro cítrico. Isso provavelmente está
relacionado ao fato de que em condições de alta umidade as lesões de cancro
exsudam mais células bacterianas na superfície afetada. Alem disso,
observações feitas por Koizumi et al. (1996) indicam que as células bacterianas
são mantidas ativas por mais tempo quando a umidade do ar é elevada,
aumentando com isso viabilidade e conseqüentemente a amplitude de
dispersão do inóculo.
A bactéria se multiplica em lesões nas folhas, galhos e frutos. Ventos-
dirigidos com chuva é o principal agente condutor de dispersão. E ventos com
velocidade ≥ 8 m/s aumentam a penetração da bactéria através das aberturas
dos estômatos ou ferimentos causados pelas tempestades, insetos como a
larva minadora do citrus (Phyllocnistis citrella) e rajadas de areia. De acordo
com Gottwald et al. (2002), os incrementos dos níveis de cancro cítrico
normalmente são observados cerca de 100 dias após a ocorrência de chuvas
acompanhadas por ventos intensos.
Xanthomonas axanopodis pv. citri persiste em lesões velhas de uma
estação de crescimento para a outra, especialmente naquelas lesões formadas
depois da estação de crescimento (Koizumi, 1977). O inóculo bacteriano se
mantém viável tão longo quanto for à sobrevivência das células hospedeiras na
vizinhança da lesão, embora a população de bactérias decline rapidamente em
baixas temperaturas. Em condições tropicais não ocorre diminuição da
população, porque o crescimento das bactérias continua na margem de lesões
velhas até o surgimento de condições favoráveis (Pruvost et al., 2002). Um
polissacarídeo extracelular encapsula as células das bactérias exsudadas na
superfície da lesão e isto auxilia na sua dispersão e sobrevivência (Goto e
Hyodo, 1985). A persistência da Xanthomonas axanopodis pv. citri por várias
semanas em material de plantas não hospedeiras e na zona de raízes de
algumas gramíneas embaixo de árvores doentes foi reportado no Japão (Goto
et al., 1975) e no Brasil (Pereira et al., 1978). Graham et al. (2000) detectaram
bactérias sobrevivendo em varias superfícies inanimadas como metal, plástico,
roupas e madeira processada sob sombra, mas o inóculo exposto sob sol,
morre em 24-72 horas. Uma vez folhas doentes ou frutos tenham caído no
chão, a população de bactéria declina para um nível não detectável em 1-2
6
meses por causa do antagonismo e competição com organismos saprofíticos
(Graham et al., 1989).
Algumas células bacterianas podem sobreviver por vários anos nas
lesões de ramos de galhos (Goto, 1992). Bactérias que se depositam nas
superfícies de plantas morrem em poucas horas devido a dessecação e
exposição direta aos raios solares (Graham et a., 2000); sobrevivem por
poucos dias no solo, e alguns meses em restos de plantas que foram
incorporadas ao solo (Graham et al., 1989). Por outro lado, podem sobreviver
por vários anos em tecidos infectados que tinham sido guardados secos e
livres do solo (Goto, 1992).
1.5 Larva minadora dos citros
Com o surgimento da larva minadora dos citros houve um importante
aumento nos níveis de cancro cítrico e mudança no comportamento da doença
nos pomares da Brasil e da Flórida, onde o inseto também ocorre (Bergamin
Filho et al., 2001; Gottwald et al., 1997; Rodrigues et al., 1998). Até 1996, o
padrão de distribuição do cancro cítrico no pomar sempre foi muito agregado,
devido ao seu mecanismo de disseminação por respingos de chuva e ventos.
Este tipo de padrão fazia com que a erradicação de plantas fosse uma medida
eficiente de controle da doença. Com a introdução da larva minadora dos citros
a distribuição espacial do cancro vem sendo modificada, ocorrendo padrões de
agregação intermediários com numerosas infecções satélites e até distribuição
ao acaso de plantas afetadas.
A atividade de alimentação da larva minadora facilita a infecção
bacteriana de três maneiras: primeiro, o rompimento da cutícula abre o
mesófilo da folha para infecção bacteriana direta, aumentando as vias de
entrada da bactéria por contato ou chuvas com vento; segundo, a ferida da
larva minadora cicatriza mais lentamente que feridas mecânicas, permitindo um
longo período de exposição para infecção bacteriana; terceiro, a larva minadora
pode se tornar contaminada pela bactéria e transportá-la através das galerias
de alimentação. Esses processos resultam em uma proliferação da infecção do
mesófilo dentro das galerias (Bergamin-Filho et al. 2001; Graham et al. 1996).
As galerias formadas pela ação da larva minadora dos citros promovem
atraso no crescimento de mudas, prejudicam o ramo produtivo, provoca queda
7
prematura de folhas, que por sua vez levam à redução da produção (Gravena,
1994) e da taxa fotossintética da planta (Penteado Dias et al., 1997). Nos
Estados Unidos e Honduras também foi observado o ataque da larva minadora
dos citros em frutos (Gottwald et al., 1997). Vários autores vêm relacionando o
aumento de cancro cítrico com a presença de larva minadora dos citros (Cook,
1988; Gottwald et al., 1997; Rodrigues et al., 1998; Venkateswarlu e
Ramapandu, 1992). Feichtenberger (2000) relata que com a introdução deste
inseto no Brasil houve expressivo crescimento do número de focos da doença,
associados na sua maioria com as galerias. Observações realizadas no Paraná
e no Rio Grande do Sul evidenciaram que em pomares infectados com a
bactéria do cancro houve aumento do nível da doença, quando comparado aos
anos anteriores, devido à presença de galerias construídas pela larva minadora
dos citros (Rodrigues et al., 1998). Chagas e Parra (1998) observaram que as
galerias facilitam a penetração e o desenvolvimento do cancro. Experimentos
de laboratório demonstraram que lesões de cancro estavam presentes em
cerca de 85 a 100% das folhas danificadas pela larva minadora dos citros,
quando inoculadas com a bactéria (Chagas et al., 1998).
1.6 Controle do Cancro Cítrico
Xac é um patógeno de planta candidato a erradicação porque possui
características fundamentais: (i) a bactéria é incapaz de sobreviver fora da
lesão no hospedeiro por grandes períodos; (ii) a bactéria não tem um vetor
eficiente (além do homem); (iii) as lesões são facilmente identificáveis, o que
permite um diagnóstico relativamente rápido e preciso; (iv) a gama de
hospedeiros da bactéria inclui lavouras de árvores frutíferas perenes de alto
valor comercial; (v) muitas variedades comerciais de citros são moderadamente
a altamente susceptíveis, portanto, as medidas de controle da doença são
pouco eficazes e relativamente caras e (vi) a doença tem sido erradicada com
sucesso em campanhas na Florida, Austrália e África do Sul.
Em 1972 foi regulamentada a Campanha Nacional de Erradicação do
Cancro Cítrico (CANECC), que estabeleceu a adoção de medidas de exclusão
e erradicação para o controle da doença. Com o objetivo de viabilizar o
restabelecimento da citricultura nas áreas anteriormente interditadas, iniciou-se
em 1978 um programa de pesquisa no Estado, com a finalidade principal de
8
estudar o cancro cítrico nas condições paranaenses e, dessa forma,
desenvolver e avaliar medidas apropriadas para a sua prevenção e controle.
Baseados nos resultados obtidos em pesquisas conduzidas no Instituto
Agronômico do Paraná (IAPAR) e também em informações adicionais
provenientes de outros países, foi desenvolvido um programa de manejo
integrado para efetivamente prevenir a ocorrência e controlar a doença em
novos plantios de citros (Leite Junior, 1990; Leite Junior e Moham, 1990). Entre
outras conseqüências, o manejo integrado da doença promoveu alterações
consideráveis nas medidas regulatórias anteriormente estabelecidas.
Até o início da década de 80, as medidas regulatórias de quarentena
eram aplicadas aos municípios. Assim, a constatação do cancro cítrico em
pomares de uma única propriedade implicava na interdição de todas as outras
propriedades do município para o cultivo de citros (Leite Junior, 1990). No
entanto, no final dos anos 80, os critérios adotados pela campanha de
erradicação foram revisados e as medidas regulatórias de quarentena e
erradicação passaram a ser aplicadas nas propriedades (Leite Junior e Moham,
1990). Inicialmente, essas medidas foram consideradas para todas as plantas
cítricas doentes ou não. Posteriormente, com o estabelecimento de
modificações dos critérios de erradicação, somente as plantas doentes e
aquelas adjacentes num raio de até 1 quilômetro passaram a ser eliminadas
(Hatschbach, 1986; Leite Junior e Moham, 1990). Nesta época, após a
erradicação, a propriedade deveria ficar em quarentena por no mínimo um ano;
período em que ficava proibido o cultivo ou a propagação de plantas cítricas na
área. Foi a partir de então que somente implantações de pomares com
cultivares de citros recomendados para o Estado passaram a ser permitidos
(Hatschbach, 1986; Leite Junior e Moham, 1990).
Alguns procedimentos para o manejo do cancro cítrico e o comércio de
frutas frescas e mudas foram adotados: (i) os viveiros devem ser localizados
em locais livres de cancro cítrico, (ii) os pomares são manejados para prevenir
ou reduzir o risco de epidemias de cancro cítrico através do estabelecimento de
quebra-ventos, pulverização preventiva com cobre, construção de cercas para
restringir o acesso aos pomares; (iv) pulverização de desinfetantes sobre a
maquinaria, equipamentos de colheita dos pomares e trabalhadores, bem como
a desinfecção de suas roupas e calçados; e (v) frutas frescas para comércio
9
interno e exportação são sujeitas a uma inspeção rigorosa para garantir a
isenção dos sintomas do cancro cítrico em frutas em pomares e tratamentos
sanitários nas câmaras de armazenagem de frutos.
Bactericidas à base de cobre são uma medida de controle padrão para o
cancro cítrico em todo o mundo (Koizumi, 1985; Leite Junior e Mohan, 1990).
Cobre reduz a população bacteriana na superfície das folhas e aplicações
múltiplas são necessárias para alcançar um controle adequado em hospedeiros
susceptíveis (Stall et al., 1980). A pulverização à base de cobre é efetiva por
um período de 2 a 4 semanas quando as taxas de formação e crescimento das
folhas se igualam (Graham et al., 1992a; Stall et al., 1982b). Os frutos são
susceptíveis conforme vão crescendo de 2-6 mm de diâmetro por um período
de 90-120 dias, dependendo da espécie de citrus (Graham et al., 1992b).
Quando a incidência da infecção do cancro no início da formação das folhas é
reduzido, a infecção subseqüente do fruto é reduzida. Assim, a prevenção de
lesões nos frutos será mais efetiva se for feito um tratamento das folhas no
verão, durante sua formação (Kuhara, 1978; Stall et al., 1982b). A eficiência
das pulverizações com cobre depende do seu contato com a bactéria na
superfície da folha. Por isso a ocorrência de chuvas com ventos pode
comprometer a eficiência desses programas de controle, visto que nesses
casos as bactérias são introduzidas diretamente nos estômatos (Gottwald e
Graham, 1992; Gottwald e Timmer, 1995). Após uso contínuo de bactericidas
as base de cobre pode haver desenvolvimento de resistência das populações
de Xanthomonas ao produto, o que compromete a eficiência do tratamento
(Rinaldi e Leite Junior, 2000). Além disso, o acúmulo do metal no solo pode
levar a efeitos tóxicos às plantas e ao ambiente (Alva et al., 1995). Outros
bactericidas de contato testados, incluindo antibióticos, não são tão eficientes
quanto os produtos à base de cobre (Leite Junior e Mohan, 1990; Timmer,
1988), além do fato de que tem ocorrido o desenvolvimento de resistência ao
antibiótico por populações de Xanthomonas (Ritchie e Dittspongpitch, 1991).
Para um microorganismo ter sucesso no processo infectivo é necessário
ocorrer adesão de suas células ao tecido da planta, transposição de barreiras
existentes, inativação dos genes de defesa encontrados no hospedeiro, e, em
alguns casos, produção de toxinas e enzimas extracelulares que possam
facilitar a entrada no tecido vegetal. Por sua vez, plantas podem produzir
10
moléculas conhecidas como elicitores, as quais podem induzir respostas de
defesa no tecido da planta. Dessas substâncias tóxicas, destacam-se as
fitoalexinas, substâncias antimicrobianas de largo espectro, que são
acumuladas em quantidades suficientes para restringir o desenvolvimento do
patógeno (Dixon e Lamb, 1990). Algumas respostas de defesa são limitadas ao
local de infecção, enquanto outras, como produção de inibidores de
proteinases, ocorrem sistemicamente em regiões distantes do local de estímulo
inicial (Bowles, 1990).
Várias linhagens bacterianas contêm determinantes de resistência a
metais pesados, como Cu
+2
, Hg
+2
, Ag
+2
, Ni
+2
, Cd
+2
, Co
+2
e Zn
+2
, localizados em
plasmídios e transposons. Genes responsáveis pela captura de íons são
expressos constitutivamente e, quando há aumento do nível desses íons
metálicos, este sistema de captura continua a atuar. Como estes cátions são
transportados para dentro das células, podem interferir nas funções normais de
outros cátions e, conseqüentemente, da própria célula (Nies, 1992). Desta
forma, a evolução de determinantes de resistência a metais pesados foi crucial
para a sobrevivência de diversas bactérias. Os principais mecanismos de
resistência podem assim serem enumerados: (1) seqüestro intra ou extracelular
por componentes que se ligam a metais; (2) sistema de efluxo de cátions ou de
ânions, através de um processo de transporte através da membrana,
codificados por plasmídios bacterianos; (3) conversão enzimática de uma forma
tóxica de um íon para uma forma menos tóxica e (4) diminuição da afinidade ao
metal no sítio reativo da célula. Segundo Nies (1992), o sistema de
componentes que se ligam a metais é mais comum em eucariotos, enquanto
em procariotos o efluxo de íons é mais encontrado.
Íons cobre são requeridos para a síntese de metaloproteínas que são,
na sua grande maioria, oxigenases e proteínas transportadoras de elétrons
(Brown et. al, 1992). Ao mesmo tempo em que as bactérias utilizam cobre em
baixas concentrações, elas precisam desenvolver um mecanismo de regulação
bem apurado, pois altos níveis de cobre podem ser tóxicos para as células. O
cobre pode formar radicais OH* altamente reativos através de reações redox,
podendo participar de reações deletérias como oxidação de proteínas,
rompimento de membranas, peroxidação de lipídios e alterações na estrutura
e/ou função de macromoléculas (Brown et al., 1992).
11
Tanto no Estado de São Paulo como na Flórida, as duas maiores
regiões produtoras de citrus do mundo, o controle do cancro cítrico baseia se
principalmente em medidas de exclusão e erradicação (Barbosa et al., 2001;
Gottwald et al., 2001). A erradicação é uma prática de controle adotada depois
do patógeno ser introduzido em uma nova área, mas que não tenha ainda se
estabelecido permanentemente, eliminado-se o hospedeiro doente ou que
tenha sido exposto ao patógeno (Kimati e Bergamin Filho; 1995). A erradicação
só é tecnicamente recomendável quando o patógeno tem poucos hospedeiros
e baixa capacidade de disseminação, sendo economicamente viável quando a
presença do patógeno ainda se restringe a uma área geográfica relativamente
reduzida (Kimati e Bergamin Filho; 1995). De maneira particular, algumas
características epidemiológicas do cancro cítrico possibilitam seu controle pela
erradicação de plantas infectadas e circunvizinhas. Trata-se de uma doença de
fácil reconhecimento dos sintomas em condições de campo, permitindo uma
rápida diagnose; apresenta disseminação relativamente lenta; possui grupo
restrito de hospedeiros cultivados. Além disso, seu agente causal apresenta
baixa capacidade de sobrevivência fora do hospedeiro (Schubert et al., 2001).
No entanto, a erradicação é uma medida drástica de controle que pode
culminar com a eliminação de milhares de plantas em pomares e viveiros, com
uma conseqüente elevação dos custos (Leite Junior, 1990).
No Estado de São Paulo onde a erradicação de plantas doentes é a
principal forma de controle do cancro cítrico, a legislação determina a
eliminação das plantas doentes e das demais suspeitas de infecção. Em
talhões com incidência de até 0,5% as plantas doentes e aquelas dentro de um
raio de 30 m a partir das plantas doentes são erradicadas. Incidências
superiores a 0,5% implicam na eliminação total do talhão afetado. Neste caso,
a área é mantida por no mínimo dois anos sem ser cultivada com plantas
cítricas. Esse método passou a ser adotado em 1999 quando o padrão de
progresso espacial do cancro cítrico foi alterado em função da larva minadora
dos citros (Fundecitrus, 2007).
O manejo integrado de qualquer doença envolve a adoção de uma série
de medidas que em conjunto visam eliminar ou reduzir os níveis de ocorrência
do patógeno em determinada área ou região. Considerando que medidas
isoladas não têm demonstrado eficiência para prevenir a introdução e o
12
estabelecimento da doença em novas áreas e nem a sua erradicação total em
várias regiões, no Paraná o controle do cancro cítrico vem sendo realizado pela
integração de medidas que envolvem principalmente, além de práticas de
erradicação e quarentena, medidas regulatórias, uso de cultivares resistentes,
desfolha química de plantas suspeitas, poda de órgãos de plantas
sintomáticas, escolha de áreas adequadas para estabelecimento de novos
pomares, produção e uso de material propagativo sadio, controle da larva
minadora dos citros e controle químico e cultural da doença (Leite Junior e
Mohan, 1990; Leite Junior et al., 1987).
O emprego de cultivares resistentes é fundamental no manejo integrado
do cancro cítrico, pois é o meio mais econômico e eficiente no controle da
doença. A identificação de cultivares apresentando características agronômicas
e comerciais desejáveis, com níveis adequados de resistência à doença,
consituti um fator de grande importância para diminuir os riscos de
contaminação nas áreas indenes, em novos plantios localizados em áreas
livres desta doença ou em áreas onde ocorreu erradicação e liberação para
replantio (Leite Junior; Santos, 1988; Leite Junior, 1990).
O controle da larva minadora dos citros é uma medida de prevenção
importante. Normalmente recomenda-se a intervenção utilizando controle
químico quando o talhão apresentar 50% de plantas com brotações novas, ou
ainda quando a incidência de ramos com larva minadora dos citros vivas atingir
de 10 a 30% em pomares jovens e adultos, respectivamente (Rossetti, 2001).
A utilização de quebra-ventos é uma das práticas eficientes para a
prevenção e controle do cancro cítrico (Kuhara, 1978; Leite Junior e Mohan,
1990). Esta medida cultural de controle promove a redução da ação direta das
correntes de ar sobre o pomar, proporcionando condições menos favoráveis
para a disseminação e penetração da bactéria no tecido hospedeiro (Leite
Junior, 1990). Por conseqüência, promove a redução de ferimentos nos tecidos
da planta, causados pelo vento e abrasão de aerossóis, que servem de porta
de entrada para a bactéria (Leite Junior, 1990). Além disso, áreas protegidas
por quebra-ventos perdem menor quantidade de água, devido à redução da
evapotranspiração e, conseqüentemente, favorecer ao aumento da
produtividade dos pomares (Leal, 1986).
13
Os quebra-ventos arbóreos não devem constituir em uma barreira
compacta. Devem ser implantados perpendicularmente à direção dos ventos
dominantes (Rossetti, 2001) ou em sistemas de compartimentação, em áreas
onde não ocorra direção predominante de incidência dos ventos (Leal, 1986). A
distância entre as linhas de quebra-ventos depende da topografia do terreno e
da espécie arbórea utilizada (Finch, 1988).
As espécies utilizadas como quebra-ventos devem apresentar menor
competição com as plantas cítricas, crescimento rápido e uniforme, copa
densa, resistência a pragas e doenças e não serem hospedeiras de patógenos
que afetam a cultura. Entre as espécies recomendadas com quebra-ventos
estão a casuarina (Casuarina equisetifolia e C. cunninghamiana), a grevilha
(Grevillea robusta), a leucena (Leucaena leucocephala), o pinus (Pinus spp.), o
sansão-do-campo (Mimosa caesalpiniifolia), o jambolão (Eugenia spp.) e o
eucalipto (Eucalyptus spp.) (Leite Junior, 1990; Rossetti, 2001).
1.7 Controle Biológico
O combate a doenças é altamente dependente de produtos químicos,
que são de modo geral, eficazes para o controle dos agentes causais, mas
apresentam, por sua vez, conseqüências indesejáveis. Essas substâncias, em
alguns casos, são altamente venenosas, se acumulam no organismo e são
capazes de causar câncer e mutações genéticas em descendentes (Lima et al.
2000).
O desafio dos produtores para controle de doenças tem aumentado cada
vez mais com a demanda por produtos livres de resíduos químicos tóxicos e
pela percepção do público em geral sobre o impacto potencial das práticas
utilizadas no controle de doenças, como o uso de agrotóxicos, sobre a saúde
dos seres humanos e o ambiente. Tais pressões exercidas pela sociedade
promovem estabelecimento de políticas governamentais que restringem a
utilização de agrotóxicos (Gullino e Kujipers, 1994; Ragsdale e Sisler, 1994).
Desta forma, agricultores, bem como os pesquisadores começaram a
considerar o uso de métodos alternativos no combate às doenças (Punja e
Utkhede, 2003).
O controle alternativo no contexto da proteção de plantas contra
fitopatógenos engloba o controle biológico e indução de resistência. Alguns
14
autores, no entanto, classificam a indução de resistência como um tipo de
controle biológico (Pascholati, 1998). O controle biológico tem com premissa
básica, manter a densidade populacional das espécies de pragas associadas à
agricultura, em níveis economicamente e ecologicamente aceitáveis (Lima et
al., 2000). Cook e Baker (1983) redefiniram o controle biológico como sendo a
“redução da soma do inóculo ou das atividades determinantes da doença
provocada por um patógeno, realizada por ou através de um ou mais
organismo que não o homem”.
Dentre os 200 produtos biológicos disponíveis no mercado, os
biopesticidas, que possuem microrganismos como ingrediente ativo,
representaram em 1995, apenas 0,7% do mercado mundial de pesticidas, mas
com crescimento entre 10 a 25% ao ano, enquanto que os pesticidas químicos
tem crescido em percentuais entre 1 a 2%. A maior parte do mercado de
biopesticidas (cerca de 80%) é representada por produtos à base da bactéria
Bacillus thuringiensis no controle de insetos. Outros exemplos de
microrganismos comercializados são a Agrobacterium radiobacter no controle
da galha da coroa causada por A. tumefaciens, vírus Baculovirus anticarsia
contra a lagarta desfolhadora (Anticarsia gemmatalis) em soja, Colletotrichum
gloeosporioides f.sp. aeschynomene utilizado com bioherbicida em culturas de
arroz e soja, Trichoderma harzianum no controle de Sclerotium rolfsii e a
levedura Candida oleophila no controle de fitopatógenos em pós-colheita
(Nardo e Capalbo, 2000).
Após a descoberta inicial, o desenvolvimento de agentes de controle
biológico da fase laboratorial até a obtenção do produto comercial é uma tarefa
difícil. Sendo necessário obter informações com relação à eficácia, modo de
ação do agente, a sobrevivência, colonização e potencial de toxicidade para
espécies não-alvo. Além disso, estudo com relação à formulação, estabilidade
e vida de prateleira também são necessários (Lumsden, 1996; Mathre et al.,
1999; Harmam, 2000).
No Brasil, centros de pesquisas, universidades e indústrias vêm
realizando estudos para desenvolver novos produtos biológicos que poderiam
ser utilizados no controle de doenças e pragas. Nos programas de controle
biológico de fitopatógenos, está incluída a prática de manejo favorecendo
15
antagonistas nativos e adição de microrganismo previamente estudados (Melo,
1998).
Os produtos utilizados no controle biológico, quando comparados aos
defensivos agrícolas, apresentam baixo custo e toxicidade e são menos
agressivos ao meio ambiente, devido à redução de aplicação de produtos
químicos utilizados no controle de doenças, como os antibióticos e fungicidas.
O sucesso nos programas de controle biológico está relacionado com as
propriedades antagônicas e mecanismo de ação do antagonista. Há vários
fungos e bactérias que inibem os fitopatógenos por meio de competição por
nutrientes, oxigênio e espaço, parasitismo direto ou produção de metabólitos
secundários que degradam a parede celular como enzimas líticas e
biosurfactantes. Além disso, várias espécies de bactérias, principalmente
Pseudomonas e Streptomyces, produzem vários tipos de antibióticos, os quais
podem ser utilizados também pela indústria farmacêutica (Gomes et al., 2000).
Muitos pesquisadores vêm trabalhando na área de biocontrole,
entretanto, poucos produtos biológicos foram introduzidos no mercado. O
sucesso do controle biológico em condições de campo está relacionado ao
melhor entendimento sobre a ecologia dos agentes antagonistas e do
patógeno. É necessário o conhecimento sobre espectro de ação, produção de
antibióticos, resistência a fatores ambientais estressantes e instabilidade
genética dos agentes de biocontrole (Melo, 1998).
No contexto de controle biológico, Baker (1985), Bettiol e Ghini (1995)
definem que os mecanismos das interações entre os microrganismos
patogênicos e antagônicos podem ser divididos em: (i) antibiose: interação
onde um ou mais metabólitos produzidos por um organismo tem ação danosa
sobre outro; (ii) competição: ocorre quando dois ou mais organismos
concorrem entre si, principalmente por nutrientes, oxigênio e espaço; (iii)
parasitismo: quando um microorganismo vive sobre e/ou alimenta-se de outro
(ex: parasitas que atacam hifas e estruturas de reprodução e sobrevivência de
patógeno, reduzindo seu inóculo); (iv) predação situação onde um
microrganismo obtém seus nutrientes a partir do patógeno (ex: predação por
amebas e Bdellovibrio bacteriovorum); (v) hipovirulência: diz respeito à
introdução de uma linhagem menos agressiva ou não patogênica comparada
ao patógeno, a qual pode, ainda que raramente, transmitir esta característica
16
às linhagens patogênicas; (vi) indução de defesa do hospedeiro: ação
direcionada ao hospedeiro por meio dos próprios organismos ou seus
metabólitos.
1.8 Metabólitos bacterianos com atividade antimicrobiana
Os antibióticos são metabólitos secundários que se acumulam no meio
de cultura no fim da fase de crescimento exponencial. Esses produtos não são
essenciais para o crescimento e reprodução dos microrganismos que os
produzem. No entanto, em termos competitivos, os microrganismos produtores
de antibióticos são favorecidos em relação aos não produtores. Esses tipos de
substâncias químicas matam ou inibem o crescimento de outras espécies
microbianas, mesmo em pequenas quantidades.
Algumas bactérias do gênero Pseudomonas são produtoras de
compostos antifúngicos, tais como, antibióticos e enzimas líticas. Enzimas
líticas (quitinase, β-1,3-glucanase, protease) são responsáveis pela lise e
hiperpasitismo dos antagonistas contra fungos patogênicos (Gupta et a.l,
2006). Neste mesmo contexto, pode-se destacar espécies do gênero Bacillus
com produção de metabólitos secundários com atividade antagonista contra
fungos e algumas bactérias antagonistas (Krebs et al., 1998). Muitos desses
antibióticos produzidos por Bacillus têm sido caracterizados como dipeptideos
ou peptídeos cíclicos com baixo peso molecular (Nakano e Zuber, 1990). Estes
ajudam no crescimento e resistência da planta hospedeira, e possuem
atividade antagonista direta contra o patógeno (Dolej e Bochow, 1996).
17
2 OBJETIVOS
2.1 Geral:
Obtenção de substâncias com propriedades antagonistas para o controle
de Xac a partir da bactéria LN.
2.2 Específicos:
a) Obter os metabólitos secundários produzidos durante o crescimento
da bactéria antagonista LN;
b) Avaliar na condição de in vitro e in vivo em (Citrus sinensis cv.
Valência) a ação dos metabólitos secundários;
c) Realizar teste de citotoxicidade com metabólitos secundários
18
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29
Activity of bacterial secondary metabolites in the control of citrus canker 1
2
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Letícia Sayuri Murate
a
, Admilton Gonçalves de Oliveira Junior
a
, Marco Antonio Nogueira
a
,
Marcio Ferreira Cruz
a
, Dafila Santos Lima
a
, João Carlos Palazo de Mello
b
, Carlos Mitihiko
Nozawa
c
, Martin Homechin
d
, and Galdino Andrade
a∗
a
Laboratório de Ecologia Microbiana, Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual
de Londrina, Caixa Postal 6001, Londrina, PR, 86051-990. Brazil
b
Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade
Estadual de Maringá, PR. Brazil
c
Laboratório de Virologia, Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de
Londrina, PR. Brazil
d
Laboratório de Fitopatologia, Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de
Londrina, PR, Brazil
∗
Corresponding author: Tel/Fax: +55 43 3371 4791
E-mail adress: [email protected] (G.Andrade)
30
Abstract 1
2
3
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25
The challenge is finding new methods to control citrus canker disease. Today the control
is making to cut plants or use heavy metal (cupper) as bactericide. The LN bacteria strain
was cultured in liquid medium and the supernatant free-cells was treated with methanol
(AMF) and ethyl acetate (AEF), respectively, and than the extract was concentrated, filtrated,
lyophilized; and fractionated by vacuum liquid chromatography (VLC). After VLC, eight
fractions were obtained: AMF, EAF, VLC1, VLC2, VLC3, VLC4, VLC5 and VLC6. All
fractions were tested its activity against Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac 306) by
antimicrobial activity assay, in Petri dishes and in 24-well tissue culture plate method showed
inhibitory effect but in different concentrations. Citotoxicity effects were observed in all
fractions in 50 µg mL
-1
concentration. In plants only VLC3 showed significant results
(p<0.05), reducing the incidence of canker lesions.
Key words: Xanthomonas axonopodis pv. citri, antibiosis, biological control, citotoxicity.
31
1. Introduction 1
2
3
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Citrus canker (CC), caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a
serious disease for worldwide in citrus production (Gottwald et al., 2002). The pathogen
causes necrotic lesions on leaves, stems and fruits. Severe infections can cause defoliation,
blemished fruits, premature fruit drop, twig dieback, general tree decline (Schubert and Sun,
2003), and consequent yield decrease. The losses can reach hundreds of million of dollars
per year. Only in Florida, US$ 200 millions had been spent until 2001, not including the
losses with the elimination of contaminated trees and plantlets (Schubert et al., 2001).
The infective process begins with the entrance of Xac through natural openings (stomata)
or wounds. Inside the plant, cells of Xac multiply in intracellular space until the spaces
become filled with bacteria or exopolysaccharide (Rudolph, 1993). The earliest symptoms on
leaves appear, under optimum conditions, as slightly raised tiny blister-like lesions about 4-7
days after inoculation (Koizumi, 1985). As the lesion ages, they turn brown, and a water-
soaked margin appears surrounded by a chlorotic halo.
The methods used to control CC in areas of the world where it is endemic, involves use of
resistant varieties of citrus, windbreaks to hinder inoculum dispersal and timely applications
of copper-containing bactericides (Schubert and Sun, 2003). However, the bacterium can
develop resistance to the products, thus demanding an increase of copper application
frequency. In addition, there is an increasing concern about the accumulation of such
substances in food and in environment (Quimby et al., 2002). For these reasons, the use of
antagonist bacteria or their metabolites has been proposed as a promising strategy for plant
protection (Földes et al., 2000).
The purpose of the present study was to evaluate antibacterial secondary metabolites
produced by bacteria strain LN on the severity of citrus canker lesion caused in Citrus
sinensis cv. Valencia, by isolate 306 of Xac (Xac 306); whose genome had been sequenced
(Da Silva et al., 2002) and their citotoxicity in vitro.
32
2. Material and methods 1
2
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25
26
27
2.1. Bacterial Strains and Growth Conditions
The pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri strain 306 (Xac 306) was used in all
experiments. These bacteria was stored in 40% (v/v) glycerol at – 20
o
C. The renovation of
the cells was made each 6 months on nutrient agar, at 28
o
C during 48 h; to maintenance of
biological viability.
The non-pathogenic antagonist bacteria strain LN (patent pandeing) was isolated from
leaves with citrus canker lesions collected in Astorga, PR, Brazil (Rampazo, 2004). The
procedure of storing and cell maintenance was the same as for Xac 306, except the culture
medium that was tripytic soil agar (TSA) plus copper chloride (0.1 g.L
-1
). Cain et al. (2000)
suggests that some bacteria isolated from culture media added copper might produce
antagonistic substances.
2.2. Xac 306 inoculum
The antagonist bacterium inoculum was prepared from cultures grown for 48 h at 28
o
C on
TSA plus copper chloride. Cells were removed from the surface of the growth medium with a
sterile loop and suspended in sterile phosphate buffer (KH
2
PO
4
1 g; K
2
HPO
4
1.5 g; distilled
water 1000 mL, pH 7.0). Inoculum concentration was determined spectrophotometricaly
(λ=590nm) and adjusted to a final density of 10
8
CFU mL
-1
using sterile phosphate buffer.
Pathogen inoculum was prepared from cultures of Xac 306 grown on nutrient agar for 48
h at 28
o
C. Xac 306 was prepared as described above, and the pathogen final concentration
was adjusted to 10
12
CFU mL
-1
.
2.3. Antagonistic bacterial extract
Bacteria strain LN (patent pandeing) was grown in TSB plus copper (Cain et al., 2000)
(1500 mL) and incubated in a shaker at 28
o
C and 100 rpm, during 15 days. After bacterial
33
growth, the medium was centrifuged in a refrigerated centrifuge (9,000 g at 4
o
C), to obtain
the secondary metabolites in the supernatant. The solid residue was discarded.
1
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28
Aliquots of 500 mL were extracted with ethyl acetate (500 mL) in separation filler. This
process was repeated five times. The organic phase, called acetate fraction (AF 0.031g) was
concentrated in rotatory evaporator and lyophilized. The lyophilized was suspended in
methanol and filtrated; these filtrated was lyophilized originated the acetate methanol fraction
(AMF 0.022g). The AMF was suspended in ethyl acetate, filtrated and the filtrated was
lyophilized; originating the acetate- ethyl acetate fraction (AEF 0.020g).
2.4. Vacuum liquid chromatography (VLC)
VLC was performed using a glass column (20 mm φ x 140 mm height), silica gel 60 (0.063
– 0.200 mm, Merck), air compressor at 51 kPa (~380 mm Hg) and the organic solvents were
hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol, methanol plus distilled water 1:1 (v/v),
and distilled water; in this order (Mello and Petrovick, 2000). Nine grams of silica gel were
packaged in the glass column; afterwards in the top of the column 1.55 g of AEF fraction was
added. Twenty milliliters of each solvent was added fours times. The respective organic
phases were collected and dried originating the fractions hexane (VLC1 0.0014g),
dichloromethane (VLC2 0.1541g), ethyl acetate (VLC3 0.5659g), methanol (VLC4 0.7217g)
water: methanol mix vol:vol (VLC5 0.0197g) and distilled water (VLC6 0.0022g). All organic
phases were concentrated in rotatory evaporator and lyophilized.
2.5. Antimicrobial activity assay in Petri dishes
The experiments were performed by four replication per treatment (fractions). Petri plates
containing nutrient agar were inoculated with a suspension of 10
12
CFU of Xac 306 in pour
plate. An 150 μL aliquot of AMF, EAF and all fractions of VLC were tested in a concentration
of 0.01 at 0.0001 mg.mL
-1
in wells of 9 mm diameter. The plates were incubated at 28
o
C
during 48 h and control was used distilled water for each tested fraction.
34
2.6. Antimicrobial activity assay in 24-well tissue culture plate 1
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In this step the experiments was performed in duplicate. The fractions which showed more
antimicrobial activity against Xac 306 (EAF, VLC2, VLC3 and VLC4) in the item 2.3 were
selected to the next step. In this test a 24-well tissue culture plate containing 1.9 mL of
nutrient broth was inoculated with of Xac 306 (10
12
CFU mL
-1
) per well. Two-fold dilution of
fractions concentration such as 5,000 ; 2,500 ; 1,250 ; 625 ; 312.5 ; 156.25 ; 78.12 ; 39.06 ;
19.53 ; and 9.76 µg mL
-1
were tested. Distilled water as used as control for each fraction
tested. The minimal inhibitory concentration was defined as the lowest concentration of FAM,
FAE and VLC fractions which had non-bacterial growth after incubation. To determine the
minimal inhibitory concentration, 50 µL of each wells with no visible growth were picked up
from each well, and inoculated on nutrient agar and incubated at 28
o
C during 48 h to check
viable cells of Xac 306 cells observing the presence or absence of Xac 306 colony in Petri
dishes.
2.7. Citotoxicity assay
Epithelial cells of human larynx carcinoma ATCCL CCL-23 (HEp-2) were grown in DMEN
(GiBco™), supplemented with 10% fetal bovine serum and treated with 100 µg/mL of
streptomycin, 100 units mL
-1
of penicillin and 2.5 µg mL
-1
of fungizone. Cells were kept at -80
o
C.
The fractions effects on cell viability were analyzed using the colorimetric MTT (3-[4, 5-
dimethilthiazol-2-yl]-2, 5-diphenil tetrazolium bromide) method (MTT-based assay kit, Sigma
Chem. Co.) according to the manufacturer’s instructions. Cells were grown in microplates
with 96-wells for 48 h. After attachment to plates, the supernatant of each well was removed
carefully and replace with 100 µL of fresh DMEN containing different concentrations of EAF,
VLC2, and VLC3. All the fractions were tested in the same concentration (50; 10; 5; 1; 0.5
and 0.05 µg.mL
-1
). The plates were incubated for 72 h at 37
o
C in a 5% CO
2
chamber with
humidified atmosphere. The absorbance of each well was measured in a microplate reader
at 490 nm and 630 nm. The experiment was performed in four replicate per fraction.
35
2.8. Antimicrobial activity test in orange leaves 1
2
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Plants of Citrus sinensis cv. Valencia were used in the greenhouse experiments under the
following conditions: 28
o
C/22
o
C and 10 h/14 h day/night respectively and 80% relative
humidity. Plants were watered three times at each seven days and fertilized twice a month
with Hewitt solution for non-legume (Hewitt, 1966).
Orange leaves with 15 days-old were treated with EAF, VLC2, and VLC3 fractions which
showed high antimicrobial activity against Xac 306 in a microdilutium experiment. All the
fractions were applied at the concentration 0.01 g.mL
-1
diluted in distillated water and applied
with a hand-sprayer in the abaxial and adaxial leaf surface. The application was realized
before or after leaves inoculation with Xac 306.
Plants were covered with black plastic bags for 24 h before and after each application, to
form wet and dark chambers in order to stimulate the stomata opening and improve the
efficiency of bacterial infection and the action of the treatments. Control plants were sprayed
with distilled water. The plants were watered tree times a week. The number of citrus canker
lesions per leaf was determined 21 days after inoculation to harvest 18 leafs per plant. The
average number of lesions was calculated by the equation: ∑n
o
lesions in 18 leaves /∑area of
18 leaves. The treatments with the fractions were done before (pre-treatment) and after
(post-treatment) the pathogen spraying, in five replications. Analysis of variance was
performed on root square-transformed data and means were compared by Tukey multiple
range test at p < 0.05. Data were transformed by √y+0,5 – SQRT(y+0,5).
3. Results
3.1. Antimicrobial activity assay in Petri dishes
In this experiment antimicrobial activity as tested in all fraction obtained from supernatant
of LN culture extracted by ethyl acetate (EAF and AMF) and obtained from EAF fractionation
in vacuum liquid chromatography extracted with n-hexane (VLC1), dichloromethane (VLC2),
36
ethyl acetate (VLC3), methanol (VLC4), water: methanol mix vol:vol (VLC5), and distilled
water (VLC6). In this experiment only EAF, VLC2, VLC3, and VLC4 showed antimicrobial
activity against Xac 306 (Table 1). However different effects were observed. EAF and VLC2
fractions had the highest antimicrobial effect were found halo with 30 mm of diameter on 0.01
mg mL
1
2
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-1
, in the same concentration VLC3 presented halo with 20 mm, and VLC4 10 mm.
The 0.001 mg mL
-1
the EAF, VLC2 and VLC3 showed the same antimicrobial effect, and
VLC4 did not have any effect (Table 1).
3.2. Antimicrobial activity assay in 24-well tissue culture plate
In this experiment was tested the bactericidal effect only a fractions which showed
antimicrobial effect against Xac 306. EAF fraction showed bactericidal effect in concentration
of 5000 until 312.5 µg mL
-1
. On the other hand in VLC2 and VLC3 the bactericidal effect was
observed also in 156.25 µg mL
-1
. However VLC4 showed bactericidal effect only in 5000 and
2500 µg mL
-1
(Table 2)
3.3. Citotoxicity assay
In this assay the citotoxicity capacity of EAF, VLC2 and VLC3 fractions were tested. In the
ten-fold dilutions curves the three fractions showed similar citotoxity effects on the different
concentrations evaluated (Figure 1). Similar results were obtained for CC
50
which was
calculated using the regression equation from each one, and the three fractions EAF, VLC2
and VLC3 showed CC
50
values approximated 36.98; 30.09 and 32.22 µg.mL
-1
, respectively.
3.4. Antimicrobial activity test in orange leaves
The fractions EAF, VLC2, and VLC3 were tested in the greenhouse experiments to check
its capacity to reduce the area of citrus canker lesions formed on leaves. The strategies used
to treat the leaves with fractions before or after infestation with Xac 306 did not show any
inhibitory effect (data not show). However, the leaves treated with CLV3 fraction had 40%
37
less lesions area when compared with control. The fractions EAF and VLC2 did not differed
significantly to the control (Figure 2).
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4. Discussion
The results shows that antibiosis of fractions from secondary metabolites extracted with
different organic solvents against Xac 306 population in vitro, really exist as well as its ability
to control the severity of citrus canker in planta. EAF, VLC2 and VLC3 had highest
antimicrobial efficiency to the control of Xac 306 in vitro, when compared with the others
fractions tested (AMF, EAF, VLC1, VLC4, VLC5 and VLC6). The highest effect observed was
obtained from compounds soluble first at all in ethyl acetate (EAF). After that when the EAF
fraction was fractionated by vacuum liquid chromatography the bactericidal effect also was
observed in another fraction obtained from dichloromethane (VLC2). However the highest
bactericidal effect against Xac 306 after chromatography assay still was found in ethyl-
acetate fraction.
The concentrations of EAF, VLC2, and VLC3 fractions considered non-citotoxic were far
below the concentrations was found bactericidal effects in the three assays carried out in the
paper. The maximum non-citotoxic concentrations observed for mammals cell was 10 µg mL
-
1
and to Xac 306 was 156.25 µg mL
-1
in vitro, and in planta the amount which was observed
antimicrobial effect was 10,000 µg mL
-1
. However the leaves treated did not have any
aspects of toxicity; like color changes or morphological aspects.
The application (before or after sprayed Xac 306) of the fractions did not affect the
occurrence of citrus canker lesions. After one day on the leaf Xac 306 is not fully established
(Koizumi, 1988). Despite the fact that the fraction VLC3 decreased significantly the citrus
canker lesions when compared with control, and showing a possibility to control the severity
of citrus canker. However, the level of this control is not enough to justify the solution of citrus
canker disease, before a field experiment will not carried out to verify that in this
38
experimental conditions we can observed the same effects that was observed in a
greenhouse experiment, that is the challenge for the future.
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28
In conclusion, AEF, VLC2, VLC3 and VLC4 fractions had antagonistic effect against Xac
306 in vitro. AEF, VLC2 and VLC3 demonstrated non-citotoxic effect in concentration of 10
µg.mL
-1
on HEp-2 cells. VLC3 had significant results in the control of foliar citrus canker
lesions caused in Citrus sinensis cv. Valencia in greenhouse conditions.
On the other hand, others studies need to carry to determine the best conditions for
application to get the high efficiency of the bactericidal effect of the VLC3 fraction also
including EAF and VLC3 as well as the identification and purification secondaries metabolites
extracted from the LN supernatant. These determinations are very important to evaluate the
possible impact of these metabolites on the environment, given that the biological nature of
the secondary metabolites not necessarily assures that they are not hazardous to the
environment (Cook et al., 1996).
5. References
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41
Table 1. Effects of fraction derived from the supernatant of LN culture extracted with
methanol (AMF) and ethyl acetate (EAF), and fractions obtained from vacuum liquid
chromatography extracted with n-hexane (VLC1), dichloromethane (VLC2), ethyl acetate
(VLC3), methanol (VLC4), water: methanol mix vol:vol (VLC5) and distilled water (VLC6) in
ten-fold dilution on the growth of Xac 306 in nutrient agar in Petri dishes.
1
2
3
4
5
6
Fraction
Concentration
(mg mL
-1
)
Halo diameter
(mm)
0.01
0.001
AMF
0.0001
no effect
0.01 30
0.001 12
AEF
0.0001 ---
0.01
0.001
VLC1
0.0001
no effect
0.01 30
0.001 12
VLC2
0.0001 ---
0.01 20
0.001 10
VLC3
0.0001 ---
0.01 10
0.001 ---
VLC4
0.0001 ---
0.01
0.001
VLC5
0.0001
no effect
0.01
0.001
VLC6
0.0001
no effect
42
Table 2. Effects of fraction derived from the second extraction with ethyl acetate (EAF)
of supernatant of LN culture and fractions obtained from vacuum liquid chromatography
extracted with dichloromethane (VLC2), ethyl acetate (VLC3), and methanol (VLC4) in
two-fold dilution on the growth of Xac 306 cultured in 24-well tissue culture plate. (+)
growth inhibition and (-) no inhibition.
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2
3
4
5
6
5000 2500 1250 625 312.5 156.25 78.12 39.06 19.53 9.76
Fractions
(µg mL
-1
)
EAF + + + + + - - - - -
VLC2 + + + + + + - - - -
VLC3 + + + + + + - - - -
VLC4 + + - - - - - - - -
43
Figures legend 1
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Figure 1. Correlation between rate of cell mortality and fractions concentrations. (A)
[EAF] Fraction from the second extraction with ethyl acetate of supernatant of bacterial
culture. (B) [VLC2] Fraction derived from de vacuum liquid chromatography extracted
with dichloromethane. (C) [VLC3] Fraction derived from de vacuum liquid
chromatography extracted with ethyl acetate.
Figure 2. Control of citrus canker lesion formation by Xac 306 on leaf of orange trees
(C. sinensis pv. Valencia) by fractions derived from the second extraction with ethyl
acetate (EAF) of supernatant of LN culture and fractions obtained from vacuum liquid
chromatography extracted with dichloromethane (VLC2), ethyl acetate (VLC3) in a
concentration of 10 mg mL
-1
. Values are the means of 5 replicates. Means for each
treatment with the same letter are not significantly different of Tukey test (p
≤
0.05).
44
Figure 1
EAF CONCENTRATION (mg mL
-1
)
0.05 0.5 1 5 10 50
RATE MORTALITY (%)
0
20
40
60
80
100
A
y = 1.352 x
R
2
= 0.97
p < 0.01
VLC2 CONCENTRATION (mg mL
-1
)
0.05 0.5 1 5 10 50
RATE MORTALITY (%)
0
20
40
60
80
100
120
B
y = 1.661 x
R
2
= 0.99
p < 0.01
VLC3 CONCENTRATION (mg mL
-1
)
0.05 0.5 1 5 10 50
RATE MORTALITY (%)
0
20
40
60
80
100
C
y = 1.552 x
R
2
= 0.97
p < 0.01
1
2
45
Figure 2
EXTRACT FRACTIONS
Control EAF VLC2 VLC3
LESIONS AREA (cm
2
)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
a
ab
ab
b
1
46
1
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