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FABRICIO JOSÉ BENATI
Atividade inibitória da clorofilina (CHLN) na
replicação de poliovírus, rotavírus e
herpesvírus, in vitro
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Londrina
2006
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FABRICIO JOSÉ BENATI
Atividade inibitória da clorofilina (CHLN) na
replicação de poliovírus, rotavírus e herpesvírus, in
vitro
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Microbiologia da
Universidade Estadual de Londrina, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre.
Orientador: Prof. Carlos Nozawa
Londrina
2006
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FABRICIO JOSÉ BENATI
Atividade inibitória da clorofilina (CHLN) na replicação de
poliovírus, rotavírus e herpesvírus, in vitro
BANCA EXAMINADORA
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Dr. Alvaro Manuel Rodrigues Almeida
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Profa. Jacinta Sanchez Pelayo
_____________________________
Prof. Carlos Nozawa
Londrina, 24 de fevereiro de 2006.
DEDICATÓRIA
Para meus pais, Sinésio e Maria, pelos
ensinamentos da vida e pelo amor que
sentem por mim.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Carlos Nozawa, que me abrigou no seu laboratório durante 6 anos, e deu a
oportunidade desta dissertação. Agradeço pela sua paciência, pelo seus
ensinamentos e companheirismo durante todos estes anos.
Á Profª. Rosa Elisa C. Linhares, praticamente minha “mãe” em Londrina, puxou
minha orelha em vários momentos, mas sempre com bom intuito. Agradeço pela sua
vontade, disposição e orientação nestes anos.
Á Profª Jacinta Sanches Pelayo pela amizade, apoio e pelo seu espírito prestativo.
Ao Prof. Júlio Oliveira de Carvalho (EMA/UEL), pelo apoio nas análises estatísticas.
Ao Prof. Mário Sérgio Mantovani, do Departamento de Biologia Geral-CCB, UEL,
pelo constante apoio e incentivo.
À Profª Márcia C. Furlanetto, por compartilhar seus conhecimento e ceder seu
laboratório.
À Profª Maria Angélica Ehara Watanabe, do Departamento de Ciência Patológica,
por ceder seu laboratório, com grande companherismo.
À Dra Sirlei Luzia Z. Donegá da Divisão de Farmácia do HUNPR pela constante
prestimosidade.
A todos os professores do Programa de Mestrado em Microbiologia pelo
conhecimento transmitido.
À minha irmã Cristiane Ap. Benati, pelo carinho, braveza e dedicação.
À minha namorada Josy Neumann, pelo incentivo, amor, carinho e paciência em
todos os momentos que esteve ao meu lado.
Ao amigo Flávio Lauretti, pelo companheirismo em todos os momentos e pelas
discussões deste e de outros trabalhos, às vezes, até mais interessantes que este.
Aos colegas de Laboratório: Vinícius Rincão, Daniel Ferri, Bárbara Nodari,
Alessandra Cristina, Mariana Minari, Lígia Faccin, Newton Hashimoto, Fernando
Lucas (Frank) e Janaína Orlandi, por compartilharem seus conhecimentos e por me
agüentarem nos picos de mau humor.
Ao lado B da Micro: Sérgio Rocha, Tatiana, Jesi, Lígia, Narjara e Raíssa pelos
momentos mais engraçados do mestrado.
À Maria Yoshie Yoshikawa, por ceder seu tempo com carinho e dedicação.
À Valdelice dos Santos, pelo apoio técnico e momentos divertidos.
À CAPES, CNPq, Fundação Araucária e UEL pelos recursos financeiros.
“Deus nos fez perfeitos e não escolhe os
capacitados, capacita os escolhidos. Fazer
ou não fazer algo só depende de nossa
vontade e perseverança” (Albert Einsten)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 7
2 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 21
REFERÊNCIAS.................................................................................................... 26
ARTIGO: C
HLOROPHYLLIN INHIBITS THE REPLICATION OF POLIOVIRUS 1,
ROTAVIRUS (SA-11), AND BOVINE HERPESVIRUS 1, IN VITRO ........................ 34
7
1 INTRODUÇÃO
As doenças virais acompanham o homem, provavelmente, desde a
formação dos primeiros assentamentos. Provavelmente, o primeiro caso conhecido
de infecção viral foi o da varíola, relatado em 2000 a.C., na China e leste da Ásia,
sendo responsável pela morte de milhões de pessoas antes de ser erradicada,
contemporaneamente, no final da década de 70 (HENDERSON, 1987).
Doenças virais como a varíola e a poliomielite estão erradicadas ou
controladas pelo homem, no entanto, para várias outras infecções virais, as vacinas
ainda são indisponíveis. Esta situação propicia a ocorrência de viroses na população
humana, de grande importância na saúde pública. Cerca de 40 milhões de pessoas
estão infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), 170 milhões estão
infectadas pelo vírus da hepatite C (HCV), 300 milhões são portadoras do vírus da
hepatite B (HBV), 25-35% da população sexualmente ativa do ocidente estão
infectadas com herpes simplex genital (HSV-2) (UNAIDS/WHO 2003; JONES, 1998;
LAUER & WALKER, 2001).
WHITLEY & ALFORD, 1978 descreveram: “a quimioterapia antiviral
permanece sendo o maior desafio da ciência médica”. Passado quase 28 anos,
houve um considerado avanço na pesquisa de antivirais, principalmente com a
modernização das técnicas de cultivo de vírus in vitro. Apesar deste avanço, as
pesquisas ainda esbarram em uma característica fundamental dos vírus, são
parasitas intracelulares obrigatórios, assim dificultam o desenvolvimento de
compostos que atuem de forma específica na replicação viral, sem serem nocivos à
célula.
8
Nos últimos 50 anos, portanto, tem havido um grande empenho na
pesquisa e desenvolvimento de compostos antivirais, inicialmente a grande maioria
sintéticos, porém hoje, os compostos isolados de plantas também têm sido
explorados.
O primeiro composto antiviral usado foi a tiosemicarbazona, um
antimicrobiano usado para tratamento da tuberculose, com atividade contra o vírus
vacinia (HAMRE et al., 1950; BROWNLEE & HAMRE, 1951; THOMPSON et al.,
1951). A partir de 1960, a metisazona, derivado da tiosemicarbazona, passou a ser
usada na profilaxia e tratamento da varíola em humanos (JONES, 1998). Desde
então, as pesquisas se concentraram no desenvolvimento de medicamentos efetivos
contra as doenças virais, porém, inócuos ou de baixa toxicidade para o hospedeiro
(GALASSO, 1998).
A idoxiuridina, um análogo de nucleotídeo, foi testada contra o HSV
por HERMANN (1961) com excelentes resultados in vitro, tendo sido demonstrado
razoável seletividade. KAUFMAN et al. (1962) demonstraram que a idoxiuridina foi
eficiente no tratamento da ceratite herpética em humanos, mas devido a sua
toxicidade, só foi liberada para uso tópico (WEBER & CINATL, 1996). O primeiro
análogo nucleosídico liberado para uso sistêmico foi a vidarabina, que atua na
infecção do HSV e varicela-zoster (SCHABEL, 1968; BUCHANAN & HESS, 1985).
A partir da década de 80, segundo WIGG (2002), devido ao elevado
custo das pesquisas com agentes antivirais, os pesquisadores concentraram seus
esforços nas viroses de maior importância epidemiológica, tais como, viroses
respiratórias, doenças causadas por herpesvírus e a síndrome da imunodeficiência
adquirida (AIDS).
9
Atualmente, existem mais de 40 compostos liberados para uso clínico
e muitas drogas foram aprovadas nos últimos cinco anos. Pelo menos metade
destas drogas é usada para tratamento de infecção do HIV (zalcitabina, amprinavir,
zidovudina, didanosina, neviparina, ritonavir, indinavir, estavudina, abacavir,
lamivudina, emtricitabina, neviparina, disoproxil tenofovir, delavirdina, efavirenz,
saquinavir, nelfinavir, atazanavir, lopinavir e eufuvirtide). As outras, são usadas no
tratamento de infecções do HBV (dipivoxil adenofir, emtricitabina e lamivudina), do
HSV (aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, trifluridina, brivudina, e
idoxuridina) do citomegalovírus (CMV) (ganciclovir, valganciclovir, foscarnet,
formivirsen e cidofovir), do influenza (amantadina, rimantadina, zanamivir, oseltamivir
e ribavirina) (DE CLERQ, 2004).
Os mecanismos de ação destes antivirais referem-se à inibição dos
processos iniciais da replicação viral (ex., amantadina), inibição de proteases virais
(ex., indinavir) e inibição da enzima transcriptase reversa (ex., zidovudina) (DE
CLERQ, 2004).
Apesar do grande número de compostos antivirais disponíveis, os
efeitos tóxicos ainda continuam sendo uma barreira em muitos tratamentos. O
aciclovir e ganciclovir podem apresentar neurotoxicidade e pacientes tratados com
ganciclovir devem ter sua função renal monitorada (EMST & FRANEY, 1998;
WAUGH et al., 2002). Além disso, o uso contínuo de alguns compostos tem
favorecido a seleção de mutantes resistentes, como por exemplo, as drogas usadas
no tratamento de infecções por herpesvírus e pelo HBV. (KIMBERLIN & WHITLEY,
1995; WEBER & CINATL, 1996; ZOULIM, 2001).
10
Com o intuito de encontrar novas classes de antivirais que
apresentem uma menor toxicidade e que atuem de maneira alternativa aos antivirais
disponíveis, diversos extratos de plantas têm sido testados em todo o mundo.
De acordo com VLIETINCK & VANDER-BERGHE (1991) as espécies
de plantas a serem testadas podem ser selecionadas de acordo com três
metodologias: (1) seleção baseada em dados etnofarmacológicos, (2) baseadas em
dados da literatura ou (3) dados quimotaxonômicos e por final, aleatoriamente.
Comparações destes métodos têm mostrado que o método baseado em dados
etnofarmacológicos é 25% mais eficiente. Na maioria dos casos as plantas são
selecionadas com base na combinação destas informações.
O primeiro trabalho com extratos de plantas foi realizado na
Inglaterra, no qual avaliou-se a eficácia de 228 extratos contra o vírus influenza A,
sendo que destas 12 foram ativas (CHANTRILL et al., 1952). Na década de 70,
pesquisadores canadenses relataram que algumas frutas e seus respectivos sucos
apresentavam atividade contra o HSV, poliovírus 1, coxsackievírus B5 (Cox) e
echovírus 7 (KONOWALCHUK & SPEIR, 1976a, 1976b, 1978a, 1978b).
YIP et al. (1991) estudaram o extrato etanólico de 31 espécies de
planta medicinais utilizadas na província de Yanan, na China, dos quais 16 foram
ativas contra CMV murino e vírus Sindbis.
McCUTCHEON et al. (1995) avaliaram a atividade de 100 plantas
tradicionais da Columbia Britânica (Canadá) dentro as quais se destacaram
Amelanchier alnifolia, Rosa mutkana e Sambucus reacemosa, as duas primeiras
apresentaram atividade contra o coronavírus e a última contra o vírus respiratório
sincicial (RSV).
11
TAYLOR et al. (1996) estudaram plantas medicinais do Nepal, na
proteção contra as infecções pelos HSV, Sindbis e poliovírus, sendo que as
espécies Hypericum, Lygodium e Maesa apresentaram expressiva atividade.
MEYER et al. (1997) demonstram a atividade antiviral de um
composto isolado de brotos de Helichrysum aureonitens, contra o HSV-1, Cox B,
adenovirus (Ad) e reovirus (Reo), tendo sido ativo contra o HSV-1 e Cox, mas
ineficaz contra os demais.
Plantas historicamente utilizadas pela população aborígine
australiana foram testadas contra CMV humano, vírus Ross River e poliovírus-1.
Duas espécies apresentaram atividade contra poliovírus, duas contra o vírus Ross
River e duas contra o CMV humano (SEMPLE et al., 1998).
Estudando extratos de Geranium sanguineum, planta medicinal da
Bulgária, SERKEDJIEVA & IVANCHEVA (1999) demonstraram que as partes aéreas
e raízes eram eficazes contra o HSV-1. YOOSOOK, et al. (1999) estudaram plantas
nativas da Tailândia e atestaram a sua atividade contra o HSV-2.
BARRIO & PARRA (2000) avaliaram a atividade do extrato aquoso
de Phyllanthus orbicularis contra HSV-2, herpes vírus bovino tipo 1 (BHV-1), Ad tipo
5 e mengovirus, sendo que o extrato apresentou atividade contra o HSV-2 e BHV-1.
Os autores sugeriram a atuação do extrato diretamente na partícula viral ou na fase
de penetração.
SCHMITT et al. (2001) estudaram algumas espécies do gênero
Hypericum e verificaram atividade contra o vírus da imunodeficiência felina, pela
inibição do efeito citopático e diminuição da quantidade de ácido nucléico, detectado
por RT-PCR, no sobrenadante celular.
12
ESQUENAZI et al. (2002) estudaram o extrato de Cocos nucifera L.
(Palmae), uma espécie da região nordeste do Brasil, normalmente utilizada na
medicina popular contra diarréia e artrite, e demonstraram atividade contra o HSV-1
resistente ao aciclovir.
Dois compostos da Stylogne cauliflora foram testados contra o HCV e
apresentaram efeito inibidor sobre a protease NS3 do mesmo (HEGDE et al., 2003).
OOI et al. (2004) avaliaram a atividade dos extratos etanólico e
aquoso da Youngia japonica (L.) contra o RSV e influenza A, sendo que para o RSV
não houve atividade, mas, para o influenza A, ambos os extratos foram capazes de
reduzir o título viral em mais de 50%.
GEKKER et al. (2005) demonstraram que a própolis apresentou
atividade contra o HIV, inibindo 85% e 98% da expressão viral, em células CD
4
+
e
culturas de células microgliais, respectivamente.
POLIOVÍRUS
Os poliovírus são membros do gênero Enterovirus da família
Piconarviridae, cujo vírion apresenta simetria icosaédrica (26 a 30 nm de diâmetro),
sem envelope e o seu genoma é pequeno (do latim, pico significa pequeno),
constituído de RNA de fita simples de polaridade positiva. Os poliovírus são
considerados modelos da família Piconarviridae, a qual também pertence os
gêneros: Rhinovirus, Hepatovirus, Cardiovirus e Apthovirus (MUELLER et al., 2005).
É estimado que um bilhão de pessoas no mundo são acometidos
pelos membros do gênero Enterovirus, que, além do poliovírus, também apresenta
13
importantes patógenos, como Cox e Echovirus (OBERSTE et al., 2000;
PALLANSCH & ROSS, 2001).
A partícula icosaédrica é constituída por 60 cópias de proteínas que
formam o capsídeo constituído de VP1, VP2, VP3 e VP4. Existem três sorotipos de
poliovírus, (tipo 1, 2 e 3) e não há imunidade cruzada entre eles. Os humanos são
considerados os únicos hospedeiros naturais, embora, os primatas não humanos
possam ser infectados experimentalmente (MINOR, 1996).
A transmissão do vírus obedece a via fecal-oral e a multiplicação
inicial ocorre no intestino delgado e na garganta. Após a replicação inicial, o vírus
pode ser encontrado no sangue, por um breve período, e pode espalhar-se para
sítios distantes, incluindo o sistema nervoso central. Muitas infecções são
inteiramente assintomáticas ou apresentam sintomas clínicos moderados (MINOR,
1996).
A patogenia clássica do poliovírus é a poliomielite, caracterizada por
um quadro de paralisia flácida, acometendo em geral membros inferiores, de forma
assimétrica, tendo como principais características flacidez muscular, com
sensibilidade conservada e arreflexia no segmento atingido (PALLANSCH & ROSS,
2001). Estes sintomas acometem menos do que 1% dos indivíduos infectados por
poliovírus (NATHANSON & MARTIN, 1979), sendo que a poliomielite é considerada
um “acidente” nesta infecção entérica. De uma maneira geral, a poliomielite pode
apresentar-se de forma assintomática, ou com sintomas leves, tais como, febre, dor
de cabeça e de garganta (MUELLER et al., 2005).
A Organização Mundial da Saúde adotou um plano em 1988 para
erradicar os poliovírus selvagens no mundo, até o ano 2000. A campanha de
vacinação através do imunógeno constituído de vírus atenuado (Sabin), tem
14
proporcionado resultados eficazes, reduzindo a incidência de poliomielite de 350.000
casos em 1988 para 784 em 2003 (MUELLER et al., 2005). Atualmente, no entanto,
surtos endêmicos da doença ainda ocorrem em vários países do continente Africano
e Asiático (ROBERTS, 2005).
ROTAVÍRUS
O termo rotavírus é derivado da palavra latina rota, que significa roda,
e deve-se ao aspecto morfológico da partícula viral quando observada em
microscópio eletrônico (FLEWETT et al., 1974). A partícula viral íntegra tem
aproximadamente 75 nm de diâmetro, não possui envelope e o capsídeo, de
simetria icosaédrica, é constituído por três camadas (ESTES, 2001). O gênero
Rotavirus é um dos nove gêneros da família Reoviridae que apresentam
propriedades morfológicas e bioquímicas em comum (ICTV, 2004). São
caracterizados por apresentarem genoma composto por 11 segmentos de RNA fita
dupla. Cada segmento codifica uma proteína (monocistrônico) com exceção do
segmento 11 que codifica duas proteínas (policistrônico) (LUNDGREN &
SVENSSON, 2001; JAYARAM et al., 2004).
O capsídeo externo é constituído por duas camadas de proteínas
estruturais, a VP4 e VP7, e o capsídeo interno pela VP6. O cerne viral é delimitado
por uma estrutura que consiste de 60 dímeros de VP2, com função ligante de RNA,
pela VP1 com função transcritase/replicase e VP3 com função guanililtransferase,
além dos 11 segmentos genômicos (ESTES, 2001).
15
A transmissão do vírus é feita por via fecal-oral (KAPIKIAN, 2001), no
entanto, há especulações que a transmissão possa ocorrer por via respiratória,
principalmente em países desenvolvidos. A detecção do antígeno viral na secreção
traqueal de crianças reforça essa hipótese (SANTOS, 2002). Os rotavírus infectam
as células epiteliais das vilosidades do intestino delgado (STARKEY et al., 1986),
onde realizam a sua replicação no citoplasma destas células, levando-as a morte
(ESTES, 2001).
A infecção produz um espectro de respostas que varia de diarréia
suave à severa, com intensa desidratação. As manifestações clínicas mais
freqüentes são diarréia, vômitos, febre, desidratação e dor abdominal (KAPIKIAN,
2001), sendo a tríade clássica da infecção febre, vômitos e diarréia (OFFIT, 1998).
Os rotavírus são os principais agentes etiológicos das gastroenterites
agudas em crianças por todo mundo e também importante patógenos em muitas
outras espécies de mamíferos (CLARE et al., 2000; ARIAS et al., 2002). É estimado
que eles causem cerca de 870.000 mortes de crianças abaixo de dois anos de
idade, por ano, nos países em desenvolvimento (ARIAS et al., 2002).
Devido aos altos índices de morbidade e mortalidade há um
considerável interesse no desenvolvimento de vacina efetiva e estratégias
terapêuticas contra os rotavírus (ARIAS et al, 2002).
Existem sete grupos de rotavírus (A-G), sendo que os vírus do grupo
A são subdividos em 14 sorotipos (G1 a G14) baseados na VP7 e 12 sorotipos
baseados na VP4 (P1 a P8). O grupo A, sorotipo G1, ocorre com maior freqüência
mundial e somente os grupos A, B e C foram diagnosticados em humanos
(TANIGUCHI & URASAWA, 1995).
16
Atualmente, diversas vacinas vêm sendo desenvolvidas,
principalmente, nos Estados Unidos, com o intuito de atenuar o quadro grave da
doença diarréica, e que apresentem padrão de segurança (SANTOS & HOSHINO,
2005). Uma das vacinas desenvolvidas, em 1998, foi a denominada Rotashield,
porém, devido a problemas de intussuscepção, foi retirada de uso em 1999. Outras
estão em fase avançada de desenvolvimento, como a Rotarix, Rotateq e UK-
recombinante, sendo que, algumas já estão liberadas para o uso, como o Rotarix,
com previsão de ser implementada no Brasil, no começo de 2006.
HERPESVÍRUS BOVINO
O Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), antigamente denominado Vírus
da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina ou Vulvovaginite Pustular Infecciosa é o agente
etiológico de uma série de enfermidades, incluindo a rinotraqueíte bovina (IBR), a
vulvovaginite pustular (IPV), conjuntivites, balanopostites, abortos e encefalites
(GIBBS & RWEYEMAMU, 1977; KAHRS, 1977).
O BHV pertence à família Herpesviridae, subfamília
Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. Apresenta simetria icosaédrica,
nucleocapsídeo de 95-110nm de diâmetro (partícula íntegra de 150-200nm),
envelope lipídico e seu genoma é constituído de DNA fita dupla. A sua replicação
ocorre no núcleo da célula infectada (ARMSTRONG et al., 1961, TIKOO et al.,
1995).
O BHV-1 é capaz de estabelecer latência nos neurônios sensoriais e
motores, sendo este o principal obstáculo às campanhas de erradicação da doença
17
através da vacinação. No caso de uso do vírus vacinal atenuado há a possibilidade
deste estabelecer infecções latentes, podendo, durante a reativação, sofrer
mudança para a forma patogênica (TIKOO et al., 1995).
O BHV-1 tem ampla distribuição mundial, estando presente em quase
todos os países de bovinocultura expressiva (GIBBS & RWEYEMAMU, 1977;
KAHRS, 1977), impondo grandes prejuízos. Nos Estados unidos, por exemplo, o
BHV-1 custa para a indústria de gado cerca de 500 milhões de dólares por ano
(BOWLAND & SHEWEN, 2000). No Brasil, o vírus foi isolado inicialmente por ALICE
(1978) e desde então, anticorpos anti-BHV-1 têm sido amplamente encontrados nos
rebanhos (CASTRO, 1988; LOVATO et al., 1995; VIDOR et al., 1995; MELO et al.,
1997; MELO et al., 1999,).
CLOROFILINA
A clorofila, molécula porfirínica planar, possui um anel, em cujo
centro é encontrado um átomo de magnésio. Contém uma cadeia de ácido
propiônico em ligação éster com o álcool diterpênico fitol, tornando o pigmento
solúvel em gorduras (ALLINGER et al., 1978). As clorofilas
a e b e seus derivados
são encontrados em muitos vegetais verdes e vêm sendo estudadas pela sua
atividade protetora aos danos à molécula do DNA causados por agentes químicos e
físicos (SARKAR et al., 1994; NEGISHI et al., 1997).
Devido à sua instabilidade e insolubilidade em água a clorofila vem
sendo substituída pela clorofilina (CHLN), um derivado sintético da clorofila, no qual
o átomo central de magnésio é substituído por cobre, ferro ou cobalto. Os grupos
18
éster fitil e metil são substituídos por sódio ou potássio, o que a torna solúvel em
água (Fig. 1) (KEPHART, 1955; ARIMOTO et al., 1993; SARKAR et al., 1994). Além
disso, o átomo de metal substituto no núcleo da CHLN confere uma maior
estabilidade quando comparado à da clorofila (SARKAR et al., 1994; NEGISHI et al.,
1997).
a- Clorofila b- Clorofilina
Fig. 1- Estrutura química da Clorofila (a) e a Clorofilina (b). O átomo central da clorofila, Mg,
é substituído pelo cobre e os grupamentos éster fitil e metil são substituídos por sódio ou
potássio (FAHEY et al., 2005, com modificações).
A CHLN tem sido alvo de amplos estudos uma vez que apresenta
propriedades de grande importância clínica, com ampla aplicação em seres
humanos.
NEGISHI et al. (1990) testaram a atividade antimutagênica da
clorofila (extraída de Chlorella vulgaris) e CHLN usando cepas de Drosophila
melanogaster e obtiveram redução na freqüência de indução de mutação provocada
pelo 3-amino-1 metil-5H-pirido[4,3-b] indol (Trp-p-2).
GENTILE & GENTILE (1991) constataram o potencial antimutagênico
da clorofila extraída de Gossypium hirsutum e da CHLN ao mutágeno 4-nitro-o-
fenilenodiamina (NOP) em Salmonella typhymurium cepa TA98.
19
ARIMOTO et al. (1995) demonstraram o efeito inibitório da CHLN na
mutagenicidade do composto benzo[a]pireno e seus metabólicos, relacionando este
efeito à capacidade da CHLN em formar um complexo com o composto e acelerar a
sua degradação.
PARK & SURH. (1996) demonstraram atividade quimioprotetora da
CHLN à indução de tumores de pele, em camundongos, por benzo[a]pireno,
relatando uma significativa redução da incidência e multiplicidade de tumores.
NEGISHI et al. (1997) apontaram intensa atividade antigenotóxica
das clorofilas naturais extraídas (extrato bruto e purificado) de espinafre e da alga
verde Chlorella vulgaris, além da clorofilina cúprica ao óxido de nitroquinolina
(4NQO), em larvas de Drosophila melanogaster.
DASHWOOD et al. (1998) realizaram experimentos em trutas e
caracterizaram as propriedades inibitórias da CHLN na mutagenicidade e
hepatocarcinogenicidade da aflotoxina B
1.
Efeitos similares foram descritos por
EGNER et al. (2003) em humanos submetidos à dieta com aflatoxina.
PIMENTEL et al. (1999) descreveram o efeito protetor da CHLN
sobre os danos provocados pela irradiação de raios gama em células somáticas de
Drosophila melanogaster. HAYATSU et al. (1999) mostraram que a CHLN prevenia o
efeito carcinogênico de compostos amino heterocíclicos, compostos que são
encontrados principalmente em carnes.
BOLOOR et al. (2000) observaram que as membranas mitocondriais
das células de fígado de rato pré-tratadas com CHLN, não sofriam danos ou
apresentavam danos reduzidos quando expostas à radiação gama, demonstrando o
efeito radioprotetor da CHLN. KAMAT et al. (2000) verificaram o efeito antioxidativo
da CHLN nestas membranas.
20
BEZ et al. (2001) estudaram a antigenotoxicidade das clorofilas
a e b
e CHLN aos danos induzidos ao DNA por metil metanosulfonado (MMS) em
fibroblasto de pulmão de hamster chinês (V79). A hipótese foi confirmada pela
redução do número de células com micronúcleo em relação ao controle positivo.
SUGIYAMA et al. (2002) estudaram o efeito protetor da CHLN em
camundongos submetidos a um composto hepatocarcinogênico, 2-amino-1-metil-5H-
pirido[4,3-b]indol (Trp-2). Constataram a formação do complexo CHLN-Trp-2 e
conseqüentemente a diminuição da absorção do Trp-2 pelo organismo dos
camundongos, funcionando desta forma como um agente anticarcinogênico.
NEGRAES et al. (2004) pré-trataram células de mamíferos com
CHLN e as submeteram ao composto clastogênico, etil-metano-sulfonato.
Concluíram que a droga apresentou potencial anticlastogênico com redução
significativa do efeito.
NEGISHI et al. (1997); DASHWOOD et al. (1998); OLVERA, et al.
(2000); TORRES-BEZAURI et al. (2002) sugeriram os possíveis mecanismos de
ação da CHLN, dentre os quais, inibição da ativação do mutágeno, degradação do
carcinógeno ou formação de complexo molecular com o pró-mutágeno.
BOTELHO et al. (2004) explorando a interação da CHLN com a
infecção viral in vitro demonstraram que a droga protegeu células HEp-2 da
fragmentação nuclear induzida pelo poliovírus.
Embora os potenciais efeitos antimutagênico e anticarcinogênico da
CHLN a vários agentes genotóxicos tenham sido demonstrados, poucos trabalhos
têm sido relacionados aos efeitos causados pelos vírus e/ou os efeitos do composto
sobre a replicação viral (DUNHAM, 1954; MEKLER et al., 1969; DRZENIEK, et al.,
1971, BOTELHO, et al., 2004). Assim sendo, este trabalho visa estudar a interação
da CHLN na replicação do poliovírus, rotavírus e herpesvírus bovino.
21
2 MATERIAIS E MÉTODOS
CÉLULAS
As culturas de células MA-104 (rim fetal de macaco Rhesus-ATCC-
CRL-2378.1) e HEp-2 (carcinoma de laringe humana-ATCC-CCl-23) foram
cultivadas em Meio Mínimo Essencial modificado por Dulbecco (DMEM- Gibco-BRL-
USA), acrescido de 10% de soro fetal bovino (Gibco-BRL, EUA), 100µg/ml de
estreptomicina (Sigma, Chem. Co., EUA), 100 UI/ml de penicilina (Sigma, Chem.
Co.) e 2,5µg/ml de fungizona (Bristol Myers-Squibb, Brasil).
DROGA
A CHLN (Sigma Chem. Co., USA) foi preparada na forma de solução
estoque a 250 µg/ml em tampão fosfato-salina (PBS) pH 7.4, alicotada e mantida a -
20ºC protegida da luz.
VÍRUS
O rotavírus símio (cepa SA-11) é da coleção do Laboratório de
Virologia, do Departamento de Microbiologia da UEL. O BHV-1 foi cedido pelo Prof.
Amauri Alfieri, do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva-UEL e o
poliovírus foi obtido da American Type and Culture Collection (ATCC, VR-58).
O estoque de rotavírus foi preparado em cultura de células MA-104,
enquanto que os estoques de poliovírus e BHV-1 foram preparados em HEp-2,
posteriormente congelados a -80ºC até o momento de uso.
22
TESTE DE CITOTOXICIDADE
Células MA-104 e HEp-2 cultivadas em microplacas de 96
escavações foram submetidas ao tratamento com concentrações variadas de CHLN
(450µg/ml, 380µg/ml, 300µg/ml, 200µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml e 20µg/ml) em meio
DMEM, (doze escavações por concentração da droga) a 37ºC, em ambiente com
tensão de 5% de CO
2
, sendo a viabilidade celular avaliada pelo método do
dimetilthiazol difenil brometo de tetrazólio (MTT-Sigma Chem. Co., USA). Após 72h,
o reagente MTT foi adicionado e as células incubadas novamente a 37ºC por 2
horas, após o qual, a leitura da absorbância foi realizada em 490 e 630nm.
ÍNDICE DE SELETIVIDADE
O índice de seletividade (IS) foi calculado através da concentração
considerada 50% tóxica (CC
50
) para as células MA-104 e HEp-2, dividida pela
concentração considerada capaz de inibir 50% da atividade viral (IC
50
)
TRATAMENTO COM A DROGA
Três protocolos foram utilizados para avaliar a interação da CHLN na
replicação viral:
No primeiro, as células foram tratadas com a CHLN por uma e duas
horas, a 37ºC, antes da infecção (atividade profilática - uma hora e duas horas). No
segundo, as cepas virais foram tratadas com a CHLN por uma hora a 37Cº antes da
infecção (atividade virucida), e no terceiro, a CHLN foi adicionada no meio de cultura
celular, no momento da infecção (terapêutico 0 hora), após uma hora e duas horas
de infecção (terapêutico uma hora e duas horas, respectivamente).
23
ATIVIDADE ANTIVIRAL POR ENSAIO DE PLAQUE
As células foram cultivadas em placas de fundo chato com 24
escavações, e após confluência de 90%, foram tratadas com variadas
concentrações da droga (tratamentos profiláticos e terapêuticos). Posteriormente,
inoculadas com multiplicidade de infecção (MOI) igual a um, seguido de incubação a
37ºC por 1h. Após lavagens das células, foi adicionado meio DMEM 2 vezes
concentrado, livre de SFB, adicionado de antibióticos e agarose 1% (previamente
fundida e mantida em banho maria a 46 ºC). Após a solidificação da agarose
nutriente, as placas foram incubadas invertidas a 37ºC em ambiente com 5 % de
CO
2
. Após 48 horas, a agarose nutriente foi retirada, as células fixadas com
formalina a 10% e coradas com solução alcoólica de cristal violeta a 0,5%.
Paralelamente, foram feitos os controles de célula, de vírus e da substância. A
atividade antiviral, definida pela porcentagem de inibição de plaque (I), foi calculada
pela fórmula:
I = [1 – (Nº de plaques no teste/Nº de plaques no controle de vírus) x
100].
Para o tratamento virucida, 10
8
e 10
7
unidades formadoras de
plaques (UFP), respectivamente, de poliovírus e BHV-1 foram previamente tratadas
com as respectivas concentrações da droga por uma hora, a 37 ºC, e posteriormente
avaliadas pelo ensaio de plaque, similarmente ao processo descrito anteriormente.
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)
Culturas de células HEp-2 e MA-104 foram cultivadas em tubos de
Leighton com lamínulas, infectadas e tratadas conforme protocolos citados
anteriormente. Após, aproximadamente, 24 horas, as culturas foram coletadas,
24
lavadas com PBS e fixadas com acetona gelada (-20ºC), durante 20 minutos.
Posteriormente, foram tratadas com soro de camundongo anti-rotavírus
(DMVP/UEL), soro de coelho anti-herpesvirus bovino tipo 1 (DMVP/UEL) ou soro de
coelho anti-poliovírus tipo 1 (cedidos pelo Dr. E.C.Leal, INCQS/FIOCRUZ, RJ) por 30
minutos em câmara úmida a 37ºC, seguido de 3 lavagens com PBS. Posteriormente,
foram tratadas com soro de carneiro anti-imunoglobulina de camundongo (rotavírus)
ou soro de cabra anti-imunoglobulina de coelho (poliovírus e herpesvirus)
conjugados com isotiocianato de fluoresceína (Sigma Chem. Co., USA), por 30
minutos em câmara úmida e escura, a 37ºC. As células foram, novamente, lavadas
por três vezes com PBS, montadas em lâminas de vidro, com 50% glicerina-
tamponada (pH 7.3), e observadas ao microscópio de luz ultravioleta.
QUANTIFICAÇÃO DO RNA VIRAL DE ROTAVÍRUS
Culturas de células MA-104 cultivadas em tubos 13X100mm foram
inoculadas com rotavírus símio SA-11, a uma MOI de aproximadamente um. Em
seguida, foi acrescentado meio com CHLN em variadas concentrações.
Paralelamente, foram mantidos controles de células infectadas com
vírus sem tratamento com a droga e controle de células não infectadas, na ausência
e presença da CHLN. Após, aproximadamente, 24 horas, as respectivas culturas de
células foram congeladas e descongeladas por 3 ciclos e submetidas à extração do
RNA viral (HERRING et al., 1982). Os extratos previamente tratados com tampão
dissociante (0,065M Tris/HCL, pH 6.8; 5M uréia; 5% 2-mercaptoethanol; 3% SDS;
0,01% azul de bromofenol e 10% de glicerol), a 60ºC por 30 minutos, foram
submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) (HERRING et al., 1982).
O DNA do fago Lambda digerido com Hind III (Gibco- BRL, EUA), em concentração
25
definida, foi utilizado como padrão. Após a coloração com nitrato de prata, o gel foi
analisado pelo sistema de vídeo documentação (Pharmacia) e as bandas de RNA
quantificadas pelo software Pharmacia Image Master 1D Prime.
INIBIÇÃO DAS CEPAS VIRAIS COM INTERFERON E ARA-C
Poliovírus, BHV-1 and rotavírus foram submetidos ao ensaio antiviral
com 100.000U/ml, 10.000 U/ml e 1000U/ml de interferon humano alfa B-2 (Meizler-
Com. Intern. SA, Brazil). Adicionalmente, o BHV-1 foi também testado com
arabinosideo citosina (Ara-C) (Pharmacia NV/SA-Bélgica) na concentração de
50µg/ml. Ambos composto virais foram monitorados por plaque, exceto rotavírus que
foi monitorado por IFI.
ESTATÍSTICA
Todos os experimentos foram avaliados em quadruplicata. Os dados
foram analisados por ANOVA, seguido do teste de Dunnett. Os valores com P ≤ 0,05
foram considerados significativos. O CC
50
e o IC
50
foram calculados por regressão
linear.
26
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34
CHLOROPHYLLIN INHIBITS THE REPLICATION OF POLIOVIRUS 1, ROTAVIRUS (SA-11),
AND BOVINE HERPESVIRUS 1, IN VITRO
Fabricio J. Benati
a
, Flávio Lauretti
a
, Lígia C. Faccin
a
, Bárbara Nodari
a
, Daniel V.
Ferri
a
, Mário S. Mantovani
b
, Rosa Elisa C. Linhares
a
, Carlos M. Nozawa
a*
.
a
Departamento de Microbiologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Londrina, Caixa Postal 6001, CEP 86051-970, Londrina-Pr, Brasil.
b
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Estadual de Londrina, Caixa Postal 6001, CEP 86051-970, Londria-Pr, Brasil.
* To whom correspondence should be addressed.
Prof. Carlos Nozawa
Departamento de Microbiologia. CCB.UEL.
Caixa Postal 6001
CEP 86051-970
Londrina-Pr. Brasil.
Phone: 55-43-33714617/ fax: 55-43-33714465
e-mail: [email protected]
35
Abstract
Chlorophyllin (CHLN) was assayed in poliovirus (PV), bovine herpesvirus (BHV-1)
and rotavirus (R) in HEp-2 and MA-104 cell cultures. Three protocols were used: I)
Cells were treated with CHLN for 1h and 2h, before infection (prophylactic activity, -
1h and -2h). II) Virus strain was treated with the drug for 1h, before infection (virucide
activity). III) CHLN was added to the culture at the moment of infection (therapeutic,
zero h), and 1h and 2h after infection, therapeutic 1h and 2h, respectively. Effects
were monitored by plaque assay (PFU) and inhibition of fluorescent cell (IFA) for PV
and BHV-1, and viral nucleic acid quantification (RNA) and IFA for R. Virucide activity
demonstrated: a) Inhibition of R replication in 100% and 70% by RNA and IFA,
respectively, representing selectivity indexes (SI) of 33.6 and 22.5, respectively. b)
Inhibition of PV and BHV-1 in 62% (SI=22.4) and 66% (SI=22.0) by PFU,
respectively. By IFA, inhibition were 57.7% (SI=32.1) and 66% (SI=33.1) for PV and
BHV-1, respectively. The time-of-addition study demonstrated: for PV, the highest
inhibition, 70% (SI=57.0) was observed under therapeutic protocol 1h (IFA). For
BHV-1, the maximum percent of inhibition was found in prophylactic activity -2h
(IFA), 77% (SI=18.7). Under therapeutic protocol 0h (PFU), high rate was also found,
66,5% (SI=33,1). For R, the highest percentage was 60% (SI=11.8) in therapeutic
protocol 0h (IFA). CHLN activity is possibly on virus particles and/or on virus-receptor
sites. We suggest that drug complexation with virion and/or receptors seem to be one
of the mechanisms.
Keywords: chlorophyllin, poliovirus, bovine herpesvirus, rotavirus, antiviral
36
1 INTRODUCTION
Although search for drugs against viral diseases has increased significantly,
viruses still pose a challenge in development and the use of these compounds
clinically, partially, due to their toxicity (Emst and Franey, 1998; De Clercq, 2004) as
well as for the occurrence of drug resistant strains (Gilbert et al., 2002; Zoulim, 2001).
These are the underlying aspects that have stimulated the research for new
substances either synthetic or natural with antiviral activity (Field, 2001).
Chlorophyllin (CHLN) is a synthetic derivative of chlorophyll (CHL) in which the
phytyl and methyl groups are substituted by sodium or potassium, making it water
soluble and, therefore, more useful than CHL which is only soluble in organic
solvents (Arimoto et al., 1993). CHLN has been used as a coloring agent and shows
a potent antimutagenic agent against a variety of mutagens in vitro and in vivo (Ong
et al., 1986; Waters et al., 1996; Chernomorsky et al., 1997; Egner et al., 2001). It
was also shown to exhibit anticarcinogenic activity in animal models (Young and
Bergei, 1980; Guo et al., 1995; Hasegawa et al., 1995; Park and Surh, 1996). Oral
feeding of CHLN to humans reduced aflotoxin-DNA adduct formation significantly
with no side effects (Egner et al., 2001). It has been recommended for controlling
body, fecal and urinary odors in geriatric patients and as an accelerant in wound
healing (Young and Bergei, 1980). As antiviral compound, it was shown that CHLN
protected HEp-2 cells from nuclear fragmentation induced by poliovirus (Botelho et
al., 2004).
Rotavirus (RV), a member of the family Reoviridae, is a nonenveloped
icosahedral particle, constituted with six proteins organized into three concentric
layers and a genome of 11 segments of double-stranded RNA (Estes, 2001). Human
rotaviruses are the major etiologic agents of severe dehydrating gastroenteritis in
children worldwide (Kapikian et al., 2001). The global mortality associated to
rotavirus infections has been estimated in 325 000 – 592 000 deaths annually
(median 440 000 deaths) (Parashar et al., 2003).
Bovine herpesvirus (BHV), a member of the family Herpesviridae and
subfamily Alphaherpesvirinae, possess a double-stranded DNA genome, which is
involved by an icosahedric capsid and a lipidic envelope with glicoproteins spikes on
it (Hinkley et al., 1998). BHV causes economically important diseases of cattle. The
diseases are known as infectious bovine rhinotracheitis/infectious pustular
37
vulvovaginitis (IBR/IPV) (Köppel et al., 1997). BHV has been associated with
respiratory, ocular, reproductive, central nervous system, enteric, neonatal and
dermal infections. The distribuition of the virus is worldwide (Gibbs and Kweyemamu,
1977; Kahrs, 1977).
Poliovirus (PV), is a member of the genus Enterovirus of the family
Picornaviridae, a large family of small (Latin, pico) nonenveloped, plus stranded RNA
viruses. It is the causative agent of poliomyelitis. Although no longer a major public
health threat in the developed world, PV continues to be one of most thoroughly
studied and best understood model of virus to date. The very stable capsid and ease
of virion purification, along with high virus titers and the low bio-safety level
requirements make PV a favored target for investigations. (Mueller et al., 2005).
In spite of the antimutagenic and anticarcinogenic potential of CHLN against
several genotoxic agents has been demonstrated, a few studies on its antiviral
activity have been carried out (Dunham, 1954; Mekler et al., 1969; Drzeniek, et al.,
1971). For instance, underlying genoprotection process, nuclear fragmentation was
preserved after PV infection (Botelho et al., 2004). Therefore, the aim of the present
study was to determine the effect of CHLN in the replication of poliovirus, rotavirus
and herpesvirus.
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Cell lines and viruses
HEp-2 (human larynx cells-ATCC CCl-23) and MA-104 (monkey kidney cells-
ATCC CRL-2378.1) cell lines were grown in DMEM (Gibco, BRL, USA),
supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, BRL, USA), 100µg/ml of
streptomycin (Sigma Chem. Co., USA), 100UI/ml of penicillin (Sigma Chem. Co.,
USA), and 2.5µg/ml of amphotericin B (Bristol Myers-Squibb, Brazil). The strain of
bovine herpes virus type 1 (BHV-1) was supplied by Prof. A.A. Alfieri (DMVP/UEL).
Poliovirus type 1 was obtained from American Type and Culture Collection (ATCC,
VR-58), and rotavirus, strain SA-11, belonged to the collection of the Laboratório de
Virologia (DM/UEL). Virus strains were propagated in HEp-2 cells (poliovirus and
herpesvirus), and MA-104 cells (rotavirus), and stored at -80°C.
38
2.2 Citotoxicity assay
Cell lines grown in 96-well plates for 48 hours, at 37°C at 5% CO
2
were treated
with varying concentrations (450µg/ml, 380µg/ml, 300µg/ml, 200µg/ml, 100µg/ml,
50µg/ml e 20µg/ml) of CHLN (Sigma Chem Co., USA). The cell viability was
evaluated by MTT kit assay, (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium
bromide) (Sigma Chem Co., USA) according to the manufacturer’s recommendation.
2.3 Selectivity Index
The selectivity index (SI) of CHLN is represented by the ratio of the drug
cytotoxic concentration 50% (CC
50
) for MA-104 or HEp-2 cell cultures by the drug
inhibitory concentration 50% (IC
50
).
2.4 Drug treatment
Three protocols were used: A) Cultured cells were treated with CHLN for 1h
and 2h, at 37ºC before infection (prophylactic activity -1h and -2h); B) Virus strains
were treated with the drug for 1h at 37ºC before infection (virucide activity), and C)
CHLN was added to the culture medium at the moment the infection (therapeutic
zero h), 1h after infection (therapeutic 1h), and 2h after infection (therapeutic 2h).
2.5 Plaque forming unit (PFU)
Cell lines were grown for 48 h in 24-well culture plates to 95% confluence,
approximately. Cells were treated with varying drug concentrations and infected
(therapeutic and prophylactic activities) at a multiplicity of infection (MOI) of 1, and
incubated at 37ºC for 1h. Cells were overlaid with nutrient agarose (2x DMEM/1,5%
agarose, vol:vol), additionally supplemented with 25mM MgCl
2
, for poliovirus assay,
and incubated at 37ºC for 48h. The nutrient agarose was removed and cells were
fixed with 10% formalin and stained with 1% crystal violet. The antiviral activity was
defined as the percentage of plaque inhibition, as follows: % Plaque inhibition = [1 –
(number of plaque in test/ number of plaque in control) x 100].
For virucide activity, approximately 10
8
PFU of poliovirus and 10
7
PFU of BHV-
1 were incubated for one hour at 37 ºC with the drug at varying concentrations and
plaque reduction calculated, as previously described.
39
2.6 Indirect immunofluorescence assay (IFA)
Cell cultures grown in Leighton tubes were infected and treated according to
the protocols, previously cited. After 24 h, the cultures were collected, washed with
PBS and fixed with cold acetone (-20°C) for 20 minutes. Briefly, cell cultures were
overlaid with polyclonal bovine anti-HBV antibodies (supplied by DMVP/UEL); rabbit
anti-poliovirus antibodies (supplied by INCQS/FIOCRUZ, RJ) and mouse anti-pig
rotavirus policlonal antibodies (supplied by DMVP/UEL), at appropriate dilutions, and
incubated at 37°C for 30 minutes. After washings, goat anti-bovine IgG; goat anti-
rabbit IgG or sheep anti-mouse IgG conjugated with FITC (Sigma Chem. Co., USA)
were used at appropriate dilutions and maintained at 37°C for 30 minutes. Cover
glasses were mounted in slides with 50% buffered-glycerol and cells were observed
in a UV light microscope. Experiments were done in quadruplicates and 50 cells
were counted by cover glass.
2.7 Quantification of rotavirus RNA
MA-104 cell cultures grown in 13X100 tubes were infected with rotavirus at
MOI of 1 and treated with the drug, according to previous protocols. After 24 h,
approximately, cultures were submitted to three cycles of freeze and thaw, and virus
RNA extracted according to Herring et al. (1982). The extracts were treated with
dissociation buffer (0,065M Tris/HCL, pH 6.8; 5M urea; 5% 2-mercaptoethanol; 3%
SDS; 0,01% bromophenol blue and 10% glicerol) at 60ºC for 30 minutes, and
submitted to polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (Herring et al., 1982).
Lambda phage DNA HindIII digest (Gibco BRL, USA) was used as quantitative
standard. After staining with silver nitrate, RNA quantification was performed with
Pharmacia Image Master VDS 1D Prime software.
2.8 Virus strains inhibition by interferon and cytosine arabinoside (Ara-C)
Poliovirus, BHV-1 and rotavirus were submitted to antiviral assay with 1 000
U/ml, 10 000 U/ml and 100 000 U/ml human alfa-2 B interferon (Meizler Com. Intern.
SA, Brazil). Additionally, BHV-1 was also assayed with Ara-C (Pharmacia NV/SA-
Belgium) at the concentration of 50µg/ml. Both antiviral compounds were also
monitored by plaque assay, except for rotavirus that IFA was used.
40
2.9 Statistics
The data were analysed by ANOVA followed by Dunnett´s test. P ≤ 0,05
values were considered significant. The CC
50
and IC
50
were calculed by linear
regression analysis of the dose-response curves generated. All experiments were
performed in quadruplicate.
3 RESULTS
Cytotoxicity of CHLN evaluated by cellular viability demonstrated that
concentrations equal to 285 µg/ml and 180µg/ml of the drug reduced HEp-2 and MA-
104 cell viability in 50%, respectively.
Interferon inhibited 100% PFU of poliovirus and BHV-1, and ninety-eight
percent of rotavirus-infected fluorescent cells. Ara-C inhibited 60% PFU of BHV-1.
Fig. 1 illustrates the activity of CHLN in the replication poliovirus, at the
indicated concentrations. It is shown that when CHLN was added, at the
concentration of 2.5µg/ml, two hours and one hour prior infection (prophylactic
protocol-2h and -1h, respectively) the inhibition of virus replication, monitored by
plaque assay, was 13.7% and 1.8%, respectively. At the same concentration, and
time zero (therapeutic protocol 0h), the addition of the drug at the moment of the
infection resulted in inhibition of 12%. However, when the drug was added 1h and 2h
post-infection (therapeutic 1h and 2h) the inhibitions were none and 3.2%,
respectively. Prophylactically, at the concentration of 5.0µg/ml, the inhibitions were
14% and 13.1% -1h and -2h, respectively. In therapeutic protocol at the time zero the
inhibition was 36.6%, however, the addition of the drug 1h and 2h after infection
resulted in none and 15.2% inhibition, respectively. At the drug concentration of
10µg/ml, under prophylactic treatment -1h and -2h, the inhibitions detected were 11%
and 16%, respectively. Therapeutically, at time zero, 34% inhibition was found, while,
under the same protocol at 1h and 2h, inhibitions of 13.9% and 32% were observed,
respectively. When CHLN was used at the concentration of 20µg/ml, maximum
inhibition of 51% was observed, under the therapeutic protocol, at time zero and 2h.
Similarly, 1h post-infection an inhibition of 33.9% was observed. While, in
41
prophylactic treatment, -1h and -2h, there were inhibitions of 18.4% and 13%,
respectively.
The inhibition of poliovirus-infected fluorescent cells is shown in fig. 2. At
CHLN concentration of 2.5µg/ml in prophylactic treatment, -1h and -2h, inhibitions of
25.2% and 30% were observed, respectively. In therapeutic protocol, 1h and 2h,
inhibitions of 34.6% and 30.9% were detected, respectively, while at zero hour it was
24%. At 5.0µg/ml, the inhibition determined in the prophylactic treatment, -1h and -
2h, were 44% and 39.6%, respectively. Under therapeutic protocol (1h and 2h) the
values found were 51% and 35%, respectively, while, at the time zero hour the value
was 26.6%. For 10µg/ml, the inhibition of the viral replication, in prophylactic
treatments, -1h and -2h, were 32% and 42%, respectively. While, in therapeutic
treatment, 1h and 2h, the inhibitions were 59.1% and 42%, respectively, however, at
time zero it was 51.1%. The maximum percent of virus inhibition in this assay was
also found in the therapeutic treatment 1h, at the drug concentration of 20µg/ml,
where the inhibition was 70%. At time zero the inhibition was of 64.4% and, still, at 2h
the inhibition was 43.6%. Under prophylactic protocol, -1h and -2h, at the same drug
concentration, the inhibitions were 53% and 33%, respectively.
The direct effect of CHLN in poliovirus particle (virucide protocol), monitored
by IFA (inhibition of the number of fluorescent cells – FC) and plaque assay (PFU) is
demonstrated in fig. 3. The inhibition of FC at the drug concentration of 2.5µg/ml was
8.8%, while, for PFU it was 34%. At 5.0µg/ml, the inhibitions were 37.7% and 38.7%
to FC and PFU, respectively. For 10µg/ml, the inhibitions were 53.3% and 44% for
CF and PFU, respectively. The highest percentage of inhibition for CF and PFU
occurred at the drug concentration of 20µg/ml, 57.7% and 62%, respectively.
The effect of CHLN in rotavirus replication was evaluated by IFA and data are
presented in fig. 4. It was found that at the concentration of 2.5µg/ml, in prophylactic
protocol -1h and -2h, inhibitions of 17% and 10.5% were observed, respectively. For
therapeutic treatment, in the time 0h the inhibition was 18%, while, 1h and 2h the
values were 20% and 12.9%, respectively. When the concentration tested was
5.0µg/ml, the inhibitions in prophylactic tests, -1h and -2h, were 20% and 16.8%,
respectively. However, for the therapeutic treatment, 0h, 1h and 2h, the inhibitions
were, respectively, 35%, 30% and 32%. At the concentration of 10µg/ml, the
inhibition of the viral replication in prophylactic protocol, -1h and -2h, were 20% and
42
15.7%, respectively. Therapeutically, 0h, 1h and 2h, there were respective inhibitions
of 37%, 27.5% and 37.1%. The inhibition of 60% was the highest score found in this
assay, in therapeutic protocol 0h, at the concentration of 20µg/ml, while, at the time
1h and 2h were 24.2% and 37%, respectively. At the same concentration, inhibition
of the viral replication, in prophylactic tests -1h and- 2h were 42% and 29.4%,
respectively.
The fig. 5 illustrates the inhibitions of rotavirus nucleic acid and rotavirus-
infected fluorescent cells when virus was submitted to drug treatment for 1h, before
infection (virucide activity). At the concentration of 2.5µg/ml the inhibitions were
45.3% for RNA and 41% for FC, while, at 5µg/ml 49.3% (RNA) and 44% (FC). With
10µg/ml the inhibitions were 56.6% (RNA) and 45% (FC). At 20µg/ml, the value of
inhibition was so high that virus RNA could not be quantified, therefore, being
considered inhibition of 100%, while, 70,8% (FC).
The fig. 6 shows the inhibitory effect of CHLN in BHV-1 replication
demonstrated by IFA. At 2.5µg/ml, under prophylactic protocol, -1h and -2h,
inhibitions of 12% and 30% were observed, respectively. Therapeutically, in time 0h
the inhibition was null (0%), while, at 1h and 2h were 11.8% and 27.1%, respectively.
When drug was used at 5.0µg/ml, the inhibition found under prophylactic protocol, -
1h and -2h, were 30% and 34%, respectively. For therapeutic treatment, 0h, 1h and
2h, the inhibitions were 25%, 21.5% and 23%, respectively. At the concentration of
10µg/ml, prophylactic test, -1h and -2h, presented inhibitions of 28.7% and 30.9%,
respectively. However, for therapeutic protocol, 0h, 1h and 2h, the inhibitions were,
respectively, 30%, 22.5% and 38%. When drug concentration was increased to
20µg/ml, the highest grade of inhibition was observed, 77%, under the prophylactic
test -2h, and 43% for -1h. For therapeutic treatment, 0h, 1h and 2h, the inhibitions
were 45%, 23.6% and 36%, respectively.
The effect of CHLN in the replication of BHV-1 (virucide activity) evaluated by
IFA and PFU is demonstrated in fig. 7. The inhibition of FC, at 2.5µg/ml, was 16%,
while, for PFU the inhibition was 28%. At the concentration of 5.0µg/ml the inhibition
of FC was of 37.2% and for PFU 32.5%. However, for 10µg/ml, the inhibition of FC
reached 45.2% and for PFU 42%. When drug concentration was increased to
20µg/ml maximum reduction for both FC and PFU was detected, 66.6% and 66.4%,
respectively.
43
The effect of the drug in the replication of BHV-1, under prophylactic and
therapeutic protocols, by PFU, is illustrated in fig. 8. For 2.5µg/ml in prophylactic
tests, -1h and -2h, inhibitions were 4.1% and 5.6%, respectively. But, for therapeutic
protocol, 0h, 1h and 2h, there were values from 5.7%, 18.2% and 15.7%,
respectively. For 5.0µg/ml, the inhibition demonstrated in the prophylactic protocol, -
1h and -2h, were 10.3% and 13.2%, respectively. However, for therapeutic treatment,
0h, 1h and 2h, the inhibitions were, respectively, 33.5%, 36.5% and 13.2%. At
10µg/ml, in the prophylactic situation, -1h and- 2h, the inhibitions were 12.4% and
22.2%, respectively. At the time 0h, 1h and 2h in therapeutic treatment there were
inhibitions of 56.6%, 33.5% and 45%, respectively. At 20µg/ml, the most expressive
values were found in therapeutic process, 0h, in that inhibition was 66,5%. Similarly,
prophylactic protocol, -1h and -2h, presented inhibitions, respectively, of 21% and
35.5%, while, for therapeutic test, 1h and 2h, inhibitions of 45% and 46% were found,
respectively.
The SI was established at maximum antiviral activity, respectively to the
protocol used, and data are shown in table 1. For poliovirus the highest SI, 57, was
demonstrated for therapeutic protocol 1h by IFA. For the same assay, virucide
treatment resulted in a SI of 32.1. Under therapeutic time zero and virucide protocols
the SI were, respectively, 15.2 and 22.4, by PFU. For BHV-1 the highest SI were
attained for therapeutic time zero (PFU) and virucide (IFA) protocols similarly, 33.1.
For prophylactic -2h (IFA) and virucide (PFU) treatments, SI were 18.7 and 22,
respectively. Concerning rotavirus, the highest SI found was 33.6 for virucide
protocol, evaluated by the inhibition of nucleic acid, but, for therapeutic time zero and
virucide protocols (IFA) the SI were 11.8 and 22.5, respectively.
4 DISCUSSION
Chlorophyll and its derivatives are widely found in nature mainly in green
plants, however, green algae and some bacteria also possess them. These
compounds have been studied for their protecting activity against DNA molecule
damage by physical and chemical agents (Sarkar et al., 1994; Negishi et al., 1997).
Nevertheless, due to chlorophyll chemical structure it is soluble in lipids only (Allinger
et al., 1978) precluding even studies on bioavailability. Alternatively, a synthetic
44
derivative of chlorophyll, CHLN, was developed with increased water solubility and
stability. It is also known that CHLN possesses antimutagenic/anticarcinogenic
activities against several natural and synthetic compounds (Young and Bergei, 1980;
Ong et al., 1986; Guo et al., 1995; Hasegawa et al., 1995; Park and Surh, 1996;
Waters et al., 1996; Chernomorsky et al., 1997; Egner et al., 2001), however, almost
nothing is known about its antiviral effect.
Presently, it was demonstrated in vitro that CHLN inhibited poliovirus, BHV-1
and rotavirus.
Poliovirus replication was inhibited at highest score in therapeutic and virucide
protocols. This inhibitory effect is strengthened by SI for therapeutic 1h and virucide
treatments, respectively, 57 and 32.1, by IFA. Since prophylactic protocol
demonstrated low activity it is suggested that drug effect in poliovirus receptor sites,
in the host cell, might not be the case. Rather, drug effect was most effective on virus
particles (virucide activity) and during virus replication process (therapeutic activity).
Concerning rotavirus, CHLN was an efficient virucide. Total inhibition was
observed at 20 µg/ml when monitored by virus nucleic acid synthesis, with SI of 33.6.
Under the same protocol and the same drug concentration, albeit, by IFA, inhibition
was also high, and a SI 22.5. This result is in accordance with therapeutic protocol,
time zero, in that inhibition was also high, however, a SI of 11.8 was found. Under
this circumstance, virus particles are placed in contact with the drug at the moment of
infection. Less efficiency was demonstrated in therapeutic and prophylactic
treatments, meaning little effect on virus receptor and during virus replication.
The action of the drug in BHV-1 demonstrated efficiency in prophylactic and
virucide treatments. At the concentration of 20 µg/ml the inhibition was circa of 70%
in virucide treatment, when monitored by PFU and IFA, with SI 22.0 and 33.1,
respectively. Under therapeutic 0h (PFU), where virus is placed in contact with the
drug, at the moment of infection, the inhibition was equal, 70% (SI=33.1). Similarly, in
prophylactic treatment -2h, at the same concentration, maximum inhibition of 77%
(SI=18.7) was demonstrated. In this case, it is speculated that drug inhibited BHV-1
replication mostly interfering on virus particles itself and on virus-binding cell
receptor. Therapeutically, drug demonstrated insignificant results. The summation of
the results demonstrated different possibilities. For poliovirus, virucide and
therapeutic treatments were more efficient, however, for rotavirus and BHV-1 virucide
45
and prophylactic protocols were most significant. It seems that, independently of the
virus, virucide effect is a common event, reflecting the action of the drug on virion
itself, but, whether virion receptor sites, on the host cells, and the effect in the
replication process are involved depends on different mechanisms. It was
demonstrated elsewhere that CHLN binds noncovalently to mutagens and
carcinogens to protect cells from harmful effects of related compounds (Negishi et al.,
1997; Dashwood et al., 1998; Olvera et al., 2000). Additionally, Torres-Bezauri et al.
(2002) demonstrated that without CHLN interaction with those compounds CHLN
protecting effect is also absent. Experimental data on the activity of CHLN in virus
infections is almost inexistent (Dunham, 1954; Mekler et al., 1969; Drzeniek, et al.,
1971). However, Botelho et al. (2004) demonstrated that, underlying the
genoprotecting effect, CHLN protected cells from DNA fragmentation induced by
poliovirus. Moreover, protection was best attained in virucide treatment, secondly by
therapeutic protocol, and lesser in prophylactic protocol. Although, in the present
work different tools were used to evaluate CHLN antiviral activity, there was an
agreement between the results. Therefore, drug complexation with virion or receptor
on host cells seems to be one of the mechanisms of action, nevertheless,
interference on virus replication can not be ruled out. It shows, therefore, that CHLN
is a promising compound with such versatile effects, however, much has to be
understood even on the scope of virus infections.
Acknowledgements
The authors wish to tank to CNPq, CAPES and UEL for financial support. This
work is part of FJB M.Sc. manuscript and he was recipient of CNPq scholarship.
Gratitude is also expressed to Prof. J.O. de Carvalho (EMA/UEL) for helping in
statistical analysis and to Dr. S.L.Z.Donegá (DF/HUNPR/UEL).
46
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49
Figures Captions
Fig. 1
Fig. 1. The effect of CHLN in the replication of poliovirus monitored by plaque assay
in HEp-2 cell cultures. The drug was used at the indicated concentrations added
before (prophylactic protocol, -2h and -1h) and after (therapeutic protocol, 0h, 1h and
2h) the infection. Percent of virus inhibition is indicated with the respective standard
deviations from experiments performed in quadruplicate (n=4). P≤0.05, except for
prophylactic protocol (-1h), 2.5µg/ml, prophylactic protocol (-2h), 2.5µg/ml and 5.0
µg/ml and therapeutic protocol (1h), 2.5µg/ml.
Fig. 2
Fig. 2. The evaluation of CHLN in poliovirus-infected HEp-2 fluorescent cells treated
with the drug, at the indicated concentrations by immunofluorescence assay (IFA).
The values represent inhibition in the number of treated cells in relation to control
nontreated cells, with the respective standard deviations. The experiments were
performed in quadruplicate (n=4). P≤0.05.
Fig. 3
Fig. 3. The direct effect of CHLN in poliovirus particles (virucide protocol) monitored
by IFA (inhibition of the number of virus-infected fluorescent cells -CF) and plaque
assay (PFU) in HEp-2 cell cultures. Virus was placed in contact with the drug at the
indicated concentrations for 1 hour at 37ºC, before the infection. The values with the
respective standard deviations represent: a) the inhibition of the number of
fluorescent cells in comparison to control nontreated cells, and b) inhibition of the
number of plaques. (n=4). P≤0.05.
Fig. 4
Fig. 4. The effect of CHLN in the replication of rotavirus in MA-104 cell cultures
monitored by IFA. CHLN was used at the indicated concentrations and added before
(-2h and -1h) and after (0, 1h and 2h) infection. The values represent the inhibition of
the number of virus-infected fluorescent cells in comparison to control nontreated
cells (n=4) and their respective standard deviations. P≤0.05.
50
Fig. 5
Fig. 5. The virucide action of CHLN in the replication of rotavirus monitored by the
synthesis of virus RNA and IFA. Virus was treated at the indicated concentrations,
during 1 h at 37ºC, before the infection. Virus RNA was resolved by polyacrylamide
gel electrophoresis. The values represent inhibition of the number of virus-specific
fluorescent cells in comparison to nontreated cells (n=4) with the respective standard
deviations and inhibition of viral nucleic acid. P≤0.05
Fig. 6
Fig. 6. The effect of CHLN in BHV-1- infected HEp-2 cell cultures monitored by IFA.
CHLN was used at the indicated concentrations and added before (-2h and -1h) and
after (0h, 1h and 2h) infection. The values represent inhibition of the number of virus-
specific fluorescent cells in comparison to nontreated cells (n=4) with the respective
standard deviations. P≤0.05.
Fig. 7
Fig. 7. The action of CHLN in BHV-1-infected HEp-2 cell cultures (virucide activity)
monitored by IFA (inhibition of the number of fluorescent cells - FC) and plaque
assay (PFU). Virus was submitted to drug treatment at the indicated concentrations,
during 1 hour at 37ºC, before infection. The values, with the respective standard
deviations (n=4), represent: a) Inhibition of the number of virus-specific fluorescent
cells in comparison to nontreated cells, and b) Inhibition of the number of plaques.
P≤0.05.
Fig. 8
Fig. 8. The effect of CHLN in the replication of BHV-1 monitored by plaque assay in
HEp-2 cell cultures. The drug used at the indicated concentrations was added before
(-2h and -1h) and after (0, 1h and 2h) infection. The values correspond to inhibition of
the number of plaques with the respective standard deviations (n=4). P≤0.05, except
for prophylactic protocol (-1h), 2.5 µg/ml and 5.0µg/ml and prophylactic protocol (-
2h), 2.5µg/ml.
51
Table caption
Table 1
Table 1: Cytotoxic concentration (CC
50
) and virus inhibitory concentration (IC
50
) of
CHLN for poliovirus and BHV-1 in HEp-2 and for rotavirus in MA-104 cell cultures.
52
0
10
20
30
40
50
60
-2 -1 0 1 2
Time of CHLN addition (h)
Virus inhibition (%
)
2.5µg/ml
5.0µg/ml
10µg/ml
20µg/ml
FIGURE 1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-2 -1 0 1 2
Time of CHLN addition (h)
Virus inhibition (%
)
2. l5µg/m
5. l0µg/m
10µg/ml
20µg/ml
FIGURE 2
53
0
10
20
30
40
50
60
70
02.55.01020
CHLN (µg/ml)
Virus inhibition (%
)
FC inhibition
PFU inhibition
FIGURE 3
0
10
20
30
40
50
-
Ti
60
70
2-1012
me of CHLN addition (h)
Virus inhibition (%
)
2.5µg/ml
5.0µg/ml
10µg/ml
20µg/ml
FIGURE 4
54
FIGURE 5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
irus inhibition (%
-2 -1 0 1 2
Time of CHLN addition (h)
V
)
2.5µg/ml
5.0µg/ml
10µg/ml
20µg/ml
0
20
40
02
C
virus inhi
60
80
100
.55.01020
HLN (µg/ml)
bition (%)
FC inhibition
RNA inhibition
FIGURE 6
55
FIGURE 7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
-2 -1 0 1 2
Time of CHLN addition (h)
Virus inhibition (%
)
2. l5µg/m
5. l0µg/m
10µg/ml
20µg/ml
0
10
20
30
40
50
60
70
80
.05.01020
N (µg/ml)
Virus inhibition (%
02
CHL
)
FC inhibition
PFU inhibition
FIGURE 8
56
TABLE 1
Virus Cell Protocol CC
50
a
IC
50
b
SI
c
T 2h (PFU)
285µg/ml 18.7µg/ml
15.2
Poliovirus HEp-2 T 1h (IFA)
285µg/ml 5.0µg/ml
57.0
Virucide (IFA)
Virucide (PFU)
285µg/ml
285µg/ml
8.8µg/ml
12.7µg/ml
32.1
22.4
P-2h (IFA)
285µg/ml 15.2µg/ml
18.7
BHV-1 HEp-2 T 0h (PFU)
285µg/ml 8.6µg/ml
33.1
Virucide (IFA)
Virucide (PFU)
285µg/ml
285µg/ml
8.6µg/ml
12.9µg/ml
33.1
22.0
T 0h (IFA)
180µg/ml 15.2µg/ml
11.8
Rotavirus MA-104 Virucide (IFA)
180µg/ml 8.0µg/ml
22.5
Virucide (PAGE)
180µg/ml 5.3µg/ml
33.6
a
CHLN cytotoxic concentration (CC
50
) was determined by MTT kit assay and
represents the minimum toxic concentration capable to inhibit cell viability in 50%.
b
CHLN antiviral concentration (IC
50
) was evaluated by plaque assay (PFU),
immunofluorescence assay (IFA) or polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and
represents the minimum inhibitory concentration 50%.
c
Ratio CC
50
/IC
50
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