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Universidade Federal de Juiz de Fora
ALICE BELLEIGOLI REZENDE
INFLUÊNCIA DO BAÇO, DA ASPLENIA E DO IMPLANTE
ESPLÊNICO AUTÓGENO NO METABOLISMO LIPÍDICO DE
CAMUNDONGOS
Juiz de Fora
2007
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ALICE BELLEIGOLI REZENDE
INFLUÊNCIA DO BAÇO, DA ASPLENIA E DO IMPLANTE
ESPLÊNICO AUTÓGENO NO METABOLISMO LIPÍDICO DE
CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação
em Saúde Brasileira, área de concentração Imunologia,
da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de
Juiz de Fora como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Saúde Brasileira.
Orientador: Prof. Henrique Couto Teixeira
Juiz de Fora
2007
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ALICE BELLEIGOLI REZENDE
INFLUÊNCIA DO BAÇO, DA ASPLENIA E DO IMPLANTE
ESPLÊNICO AUTÓGENO NO METABOLISMO LIPÍDICO DE
CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Saúde Brasileira, área
de concentração Imunologia, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal
de Juiz de Fora como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Saúde Brasileira. Aprovada pela Banca Examinadora composta por:
__________________________________________________________________
Prof. Dr. Henrique Couto Teixeira
Universidade Federal de Juiz de Fora
__________________________________________________________________
Profa. Dra. Ana Paula Ferreira
Universidade Federal de Juiz de Fora
__________________________________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Ibañez Nunes
Fundação José Bonifácio de Andrade (FUNJOB).
Juiz de Fora
__ / __ / __
Rezende, Alice Belleigoli
Influência do baço, da asplenia e do implante esplênico auto-
geno no metabolismo lipídico de camundongos / Alice Belleigoli
Rezende; orientador: prof. Dr. Henrique Couto Teixeira. -- 2007.
64f.
Dissertação (Mestrado Saúde Brasileira) – Faculdade de
Medicina, Universidade Federal de Juiz de Fora.
1. Baço. 2. Transplante autólogo. 3. Transtornos do metabo-
lismo dos lipídios. I. Teixeira, Henrique Couto. II. Título.
CDU 612.11
Dedico este trabalho a todos aqueles
que contribuíram para a sua realização.
Agradecimentos
Aos meus pais pelo apoio incondicional não só nesta, mas em todas as
realizações de minha vida.
Ao meu irmão pela sua compreensão e pelo seu otimismo nos momentos
mais difíceis.
A minha vó Andrelina, que apesar de não estar presente nesta conquista,
sempre foi uma grande incentivadora.
Aos meus amigos, tios e primos pela sua torcida.
Aos Profs. Drs. Henrique Couto Teixeira e Ana Paula Ferreira por me
acolherem no Laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Juiz de Fora
e permitirem a concretização deste sonho.
Aos amigos do Laboratório de Imunologia da Universidade Federal de Juiz
de Fora pelo carinho e auxílio na execução dos experimentos.
Ao Prof. Dr. Sérgio Ibañez Nunes pela ajuda fundamental na execução
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Andy Petroianu pelo suporte teórico e científico nos momentos
de dúvidas e discussões.
Ao Prof. Dr. Rogério Estevam Farias por sua contribuição na realização do
estudo histopatológico.
Ao Fernando Rocha Vieira pelo auxílio na análise bioquímica.
Ao Prof. Dr. Márcio José Martins Alves pela colaboração na realização da
análise estatística.
À CAPES, ao CNPq e à FAPEMIG pelo suporte financeiro fornecido ao
projeto.
Àqueles(as) cujos nomes involuntariamente omitimos.
Resumo
A função do baço como órgão importante do sistema imunológico já foi
estabelecida. Atualmente, uma nova função vem sendo associada a este órgão, a
participação no metabolismo lipídico. O objetivo deste estudo foi avaliar a
influência do baço, da asplenia e do implante esplênico autógeno no metabolismo
lipídico de camundongos. Foram utilizados 70 camundongos BALB/c distribuídos
em sete grupos: controle normal (CN); controle obeso (CO); operação simulada
(OS); esplenectomia total (ET); três grupos submetidos ao transplante autógeno
do baço: omento maior (OM), retroperitônio (RP), tecido subcutâneo da parede
abdominal (PA). Os animais, com exceção do grupo CN, foram submetidos a dieta
com 1,25% de colesterol. A intervenção cirúrgica foi realizada 30 dias após o início
da dieta. A coleta de sangue ocorreu no 60° dia pós-operatório. Foram dosados os
níveis de triglicérides, de colesterol total e de suas frações, bem como a glicemia.
O baço, os implantes esplênicos e o fígado foram submetidos a estudo histológico.
Entre os animais em uso da dieta, não houve diferença no lipidograma dos grupos
controles (CO e OS) quando comparados ao grupo esplenectomizado (ET), assim
como em relação aos animais submetidos ao transplante autógeno do baço (OM,
RP, PA). A preservação da arquitetura histológica esplênica foi semelhante nos
três locais de implante. De acordo com os resultados obtidos o baço não parece
participar da regulação dos níveis de lipídeos plasmáticos em camundongos
BALB/c.
Abstract
Currently studies suggest the splenic tissue influence on the lipid
metabolism. However, the relation between the spleen and lipid metabolism has
not been properly studied. This work verify the influence of the spleen and splenic
remmants on lipid metabolism, by evaluating the impact of splenectomy on
lipidogram of mice and by studying the effect of autogenous spleen tissue
implanted in different sites. 70 BALB/c mice were divided into seven groups:
normal control group, with no diet or surgery; fat control group, without surgery;
surgical procedure sham group; total splenectomy group and three groups with
implants in different sites: greater omentum, retroperitonium and abdominal
subcutaneous tissue. The animals, except the normal control group, received food
with 1,25% cholesterol. The surgical procedure was carried out 30 days after the
beginning of the food administration. Two months after the operations, serum
triglycerides, cholesterol and glycemia were studied. Histological assessments in
the spleen or implants and in the liver were carried out. No significant difference
was found in the lipidograms of the animals of the control groups when compared
with the splenectomized ones, as well as in the animals submitted to the
autogenous splenic tissue transplantation. The preservation of the splenic
histological architecture was similar on the three implantation sites. The spleen,
splenectomy and splenic implants do not influence lipidogram in BALB/c mice.
Lista de Abreviaturas e Símbolos
BALB/c - Linhagem de camundongos isogênicos - Mc Dowell em 1923
CN - Controle Normal
CO - Controle Obeso
g - Grama
HDL - High-density lipoproteins/Lipoproteínas de alta densidade
LDL - Low-density lipoproteins/Lipoproteínas de baixa densidade
ml - Mililitro
nº - Número
OS - Operação Simulada
OM - Omento Maior
p - Significância estatística
PA - Parede Abdominal
RP - Retroperitônio
VLDL - Very low density lipoproteins/Lipoproteínas de muito baixa
densidade
Lista de Figuras
01 – Técnica cirúrgica – (A) Pedículo vascular e vasos curtos esplênicos.
(B) Secção do baço para o transplante autógeno; aproximadamente 30%
do tecido esplênico é dividido em duas partes................................................. 16
02 – Transplante autógeno de baço em omento maior – (A) Transfixação
dos fragmentos. (B) Bolsa confeccionada com omento maior envolvendo
os fragmentos................................................................................................... 17
03 – Transplante autógeno de baço em retroperitônio - (A) Acesso ao
retroperitônio. (B) Colocação dos fragmentos sem fixação.............................. 17
04 – Transplante autógeno de baço em parede abdominal. Fragmentos
posicionados no tecido celular subcutâneo sem fixação.................................. 18
Artigo
01 – Implante de tecido esplênico (setas) em três locais diferentes. A:
Omento maior. B: Retroperitônio. C: Parede abdominal.................................. 55
02 - Estudo histopatológico do tecido esplênico e hepático. Hematoxilina-
eosina (x10). A: Tecido esplênico original (grupo OS). B: Implante esplênico
com estrutura compatível com o órgão original (grupo R.P). C: Implante
esplênico com pequenas alterações (grupo OM). D: Tecido hepático sem
alterações (grupo CN). E: Tecido hepático com esteatose de baixo grau
(grupo PA). F: Tecido hepático com esteatose de alto grau (grupo CO).......... 56
Lista de Tabelas
01 - Composição da dieta AIN-93G acrescida de 1,25% de colesterol............ 14
Artigo
01 - Valores de colesterol total e suas frações, triglicérides e glicemia
(média +
desvio padrão) nos camundongos dos diferentes grupos................. 58
Tabela Geral..................................................................................................... 61
Tabela Lipidograma.......................................................................................... 63
Tabela Histologia.............................................................................................. 65
SUMÁRIO
p.
1 Introdução.................................................................................................. 1
2 Metodologia............................................................................................... 11
2.1 Animais................................................................................................ 12
2.2 Dieta..................................................................................................... 13
2.3 Anestesia e Intervenção Cirúrgica....................................................... 14
2.4 Coleta de sangue................................................................................. 18
2.5 Avaliação dos níveis de lipídeos plasmáticos...................................... 19
2.6 Estudo Histopatológico........................................................................ 19
2.7 Análise Estatística............................................................................... 20
3 Referências Bibliográficas......................................................................... 21
4 Artigo.......................................................................................................... 31
5 Anexos....................................................................................................... 60
1. Introdução
O baço é um órgão do nosso corpo sobre o qual, até hoje, pouco se sabe.
Vários mistérios estão envolvidos em sua existência e o baço vem fascinando
desde os sábios antigos até os pesquisadores atuais. Por ter sua importância
pouco esclarecida e pelo fato de sua ausência ser compatível com a vida, durante
muito tempo o baço foi retirado indiscriminadamente. A esplenectomia total, até
pouco tempo atrás, era a única opção terapêutica independente do tipo e da
extensão da lesão esplênica. Este padrão de tratamento estava baseado em três
princípios: o baço é um órgão dispensável; qualquer procedimento menor que a
esplenectomia é quase sempre fatal e a sutura do órgão é trabalhosa e pouco
segura (AVENDAÑO, 1997; CHRISTO, 2001; PETROIANU, 2003a).
King e Schumacker Júnior, em 1952, ao publicarem um estudo sobre
complicações infecciosas pós-esplenectomia, despertaram as atenções da
comunidade científica para a importância do tecido esplênico na prevenção de
infecções graves. Os autores e, posteriormente, outros estudiosos, descreveram a
sepse fulminante pós-esplenectomia, uma situação clínica grave, 58 vezes mais
freqüente nos pacientes esplenectomizados do que na população em geral,
atingindo pessoas de qualquer idade, com uma freqüência maior na infância. Esta
síndrome pode ocorre até 40 anos após a cirurgia e tem uma mortalidade de 50 -
75% (HORAN e COLEBATCH, 1962; ALBERTI et al., 1986; CASANOVA et al.,
1994).
Uma vez iniciados os estudos sobre o baço, eles tornaram-se cada vez
mais freqüentes e, atualmente, importantes funções são associadas a este órgão.
A sua participação no sistema imunológico é evidente. O baço é um órgão linfóide
secundário, bastante organizado, no qual as células do sistema imune estão
2
presentes em grande número – 25% de todos os linfócitos estão no baço, sendo
um dos principais locais de interação e regulação do sistema imunológico
(PETROIANU, 2003a). Outra atribuição do baço é a fagocitose e depuração de
uma enorme variedade de partículas da corrente sanguínea, essencial para o
equilíbrio desse compartimento (TRAUB et al., 1987; PETROIANU, 2003b).
Recentemente, estudiosos tem apontado para uma nova função do baço, sendo a
ele atribuído papel importante na regulação do metabolismo lipídico (PAULO e
SILVA, 2001; JAMEL et al., 2002).
O baço é maciço, muito vascularizado e está situado à esquerda do
abdome, abaixo do diafragma. É o órgão mais lesado em traumatismo abdominal
fechado. É também susceptível a vários tipos de incidentes iatrogênicos,
principalmente em intervenções sobre o estômago, cólon e pâncreas (BUNTAIN e
GOULD, 1985; PISTERS e PACHTER, 1994; ABRANTES et al., 2002). As lesões
esplênicas são, portanto, extremamente freqüentes. Ainda hoje, é alta a incidência
de esplenectomias totais, apesar do conhecimento das alterações que ocorrem
após este procedimento, principalmente no sistema imunológico, como queda da
atividade fagocítica a antígenos, dos níveis séricos de IgM, do complemento, de
linfócitos T reguladores e aumento da atividade de auto-anticorpos (IZBICKI et al.,
1989; TORRES et al., 1993).
Considerando que a importância da preservação do tecido esplênico é bem
definida, é crescente a necessidade de se pensar em conduta mais conservadora
na abordagem cirúrgica das lesões esplênicas. São descritas técnicas como
esplenorrafia, hemiesplenectomia, esplenectomia subtotal, ligadura da artéria
esplênica (JAMEL, 1979; VADRA, 1989; REZENDE et al., 1990). São feitas todas
3
as tentativas de se conservar o baço em seu local anatômico, integral ou
parcialmente, mas em situações onde não é possível essa preservação, o
transplante autógeno de baço é a única maneira de ser obter a manutenção da
função esplênica (BUTAIN e GOULD, 1985; ALBERTI et al., 1986; TORRES et al.,
1993; CLAYER et al., 1994; RESENDE e PETROIANU, 2001). Há ainda situações
onde a esplenectomia total é a opção terapêutica, como na hipertensão porta, mas
a perda da função esplênica não é desejável (BRANDT et al., 1998; BRANDT et
al., 2001; FERRAZ, 2003).
A idéia de semear segmentos de baço em diferentes locais do abdome –
transplante autógeno de baço - fundamenta-se na esplenose, que é a implantação
natural de tecido esplênico oriundo de traumatismo (BUCHBINDER e LIPKOFF,
1939; CALDER; 1939). Os primeiros auto-implantes de tecido esplênico foram
realizados de maneira experimental. No homem, este procedimento começou a
ser utilizado por Albrecht em 1896, e depois por Schilling em 1907 (PETROIANU,
2003a). Acredita-se que para que os fragmentos implantados possam manter de
forma adequada as funções esplênicas são necessários pelo menos 25
- 30% da
massa tecidual do órgão original (VAN WYCK et al., 1980; TORRES et al., 1993;
RESENDE e PETROIANU, 2001). Outro aspecto a ser considerado é o local de
implante. Atualmente preconiza-se que para que os implantes cumpram
perfeitamente seu papel, a drenagem sanguínea deve seguir para o fígado,
através de veias do sistema porta. O omento maior por respeitar esta exigência e
por ser extremamente vascularizado é, hoje, o sítio de implante utilizado pela
maioria dos especialistas (PATEL et al., 1982; IINUMA et al., 1992; LIAUNIGG et
al., 1992).
4
Há na literatura evidências de que o enxerto transplantado é viável
(TAVASSOLI et al., 1973; KRASNA e THOMPSON, 1985; CASTELANI et al.,
2001). Sharma e colaboradores, em 1996, mostraram que os fragmentos
implantados são captantes à cintilografia, evidenciando um processo de
neovascularização e, conseqüentemente, a viabilidade do enxerto. Sugeriram que
o método descrito é uma excelente técnica de imagem para verificação do
sucesso do transplante autógeno de baço no menor tempo possível.
Vários autores já evidenciaram que a histologia dos enxertos autólogos é
semelhante a do baço normal (MARINE e MANLEY, 1920; PABST, 1999; GOMEZ
et al., 2000). Nunes e colaboradores (2005) descreveram que as principais
diferenças encontradas entre os baços originais e os transplantados são a perda
da cápsula verdadeira, espessamento desta cápsula e a presença de tecido de
granulação com macrófagos fagocitando pigmento hemossiderótico na periferia. O
tecido implantado apresenta discretas alterações: polpa branca presente
estruturalmente adequada, porém discretamente reduzida quanto ao seu volume;
polpa vermelha mais congesta; sinusóides com padrão ligeiramente mais dilatado
e com discreta desorganização e proliferação das fibras reticulínicas.
Estudos anteriores observaram que a alterações de parâmetros
imunológicos que previsivelmente ocorrem após uma esplenectomia, podem ser
prevenidas pelo transplante autógeno de baço. Properdina e tuftisina, peptídeos
envolvidos com a atividade e resposta migratória de células fagocíticas, assim
como os níveis de anticorpos circulantes, IgM e IgG, mantêm valores próximos da
normalidade no enxerto autólogo do baço (IZBICKI et al., 1989; WESTERMANN et
al., 1990; KOBAYASHI et al., 1996; RESENDE e PETROIANU, 2001).
5
Likhite, em 1978, relatou que camundongos esplenectomizados e
posteriormente infectados com Diplococcus pneumoniae tipo III estariam
protegidos da sepse fulminante pós-esplenectomia se fosse realizado o
transplante autógeno de baço, devido à manutenção dos níveis de anticorpos
opsonizantes. A capacidade fagocitária do enxerto autólogo frente a pneumococos
também foi verificada em seres humanos (SCHWARTZ et al., 1978; LEEMANS et
al., 1999). Foi relatada também a importância da preservação de tecido esplênico
para a fagocitose de outras bactérias, como a Escherichia coli (RODRIGUES
JÚNIOR et al., 1988; WESTERMANN e PABST, 1997; MARQUES e PETROIANU,
2003; SILVA et al., 2003). Os dois microorganismos descritos são importantes
agentes causadores da sepse fulminante pós-esplenectomia, sendo o Diplococcus
pneumoniae o principal, respondendo por aproximadamente 50% dos casos
(TORRES et al., 1993; NUNES et al., 1994).
Nunes e colaboradores (2005) evidenciaram uma comprovação definitiva da
produção de anticorpos no desenvolvimento de resposta imune T-dependente pelo
tecido esplênico transplantado. As células do fragmento enxertado foram isoladas
e visualizadas na sua capacidade de produzir anticorpo após imunização com
hemácias de carneiro. Este estudo mostrou que o enxerto é imunologicamente
ativo.
A manutenção da homeostase sanguínea, pela retirada de uma enorme
variedade de partículas da circulação, é uma atribuição do baço que também é
preservada pela realização do enxerto autólogo. Nos pacientes submetidos ao
transplante autógeno de baço não foram encontrados corpúsculos de Howell-Jolly
nos esfregaços de sangue periférico (RESENDE e PETROIANU, 2001). Estes
6
corpos, constituídos por hemoglobina proveniente do processo de hemocaterese,
quando presentes no sangue periférico sugerem ausência ou prejuízo da atividade
esplênica e por isso são freqüentemente encontrados em pacientes
esplenectomizados. Outros autores já haviam descrito resultados semelhantes
(TRAUB et al., 1987; WITTE et al., 1988; BUDIHNA et al., 1991; HAKLAR et al.,
1997).
O papel do baço e do enxerto autólogo de baço no metabolismo lipídico,
diferentemente das funções imunológica e hematológica, já bastante exploradas,
ainda precisa ser esclarecido. Isto porque apenas recentemente é que se sugeriu
a participação do tecido esplênico na regulação dos lipídios plasmáticos. A
hipótese surgiu a partir de duas observações clínicas principais: o aumento dos
lipídios plasmáticos e da freqüência de doenças isquêmicas coronarianas
observados em indivíduos que sofreram esplenectomia por trauma e os baixos
níveis de colesterol encontrados em pacientes com hiperesplenismo (ROBINETE
e FRAUMENI JUNIOR, 1977; SUGIHARA et al., 1989).
Robinete e Fraumeni Júnior, em 1977, estudando a esplenectomia e sua
subseqüente mortalidade em veteranos que estiveram na 2
ª
Guerra Mundial
observaram uma alta incidência de infarto agudo do miocárdio. As alterações no
metabolismo lipídico que ocorreriam após a esplenectomia, principalmente nos
níveis de colesterol circulante, poderiam explicar, pelo menos em parte, esta
observação.
Pacientes com doenças mieloproliferativas demonstram um declínio das
concentrações plasmáticas de lipídios e este fenômeno está associado, à
princípio, a uma hiperfunção do baço. Aviram e colaboradores (1986) compararam
7
os lipídeos plasmáticos de pacientes com desordens mieloproliferativas antes e
depois da esplenectomia com os níveis apresentados por pacientes submetidos a
procedimentos ortopédicos e a colicistectomia. Após a esplenectomia houve um
acréscimo nos níveis de colesterol total e LDL-colesterol. Nos demais grupos
essas lipoproteínas, após um pequeno declínio inicial, retornaram às
concentrações pré-operatórias. Esses resultados sugerem que o baço participa da
regulação do metabolismo do colesterol nesses pacientes o que foi corroborado
por outros autores (SUGIHARA et al., 1989).
Trabalhos experimentais avaliaram o impacto da esplenectomia nos níveis
circulantes de lipoproteínas. Asai e colaboradores, em 1988, estudando dois
grupos de coelhos, observaram que os animais esplenectomizados apresentavam
aumento do colesterol total, triglicérides, fosfolipídios e redução do HDL-colesterol
quando submetidos a uma dieta enriquecida com 1% de colesterol, alterações que
não foram registradas no grupo controle. A percentagem de placas ateromatosas
na artéria aorta também foi maior no grupo submetido a esplenectomia. Esses
achados associam o tecido esplênico ao metabolismo lipídico e processo
aterosclerótico em coelhos, coincidindo com outros trabalhos experimentais
(FATOUROS et al., 1995) e com as observações previamente descritas em seres
humanos (AVIRAM et al., 1986; SUGIHARA et al., 1989).
Alguns mecanismos já foram propostos para explicar a participação do baço
no metabolismo lipídico. Acredita-se que o tecido esplênico agindo como um
grande filtro biológico produziria captação e destruição de LDL-colesterol, através
de receptores na membrana de macrófagos, controlando assim os seus níveis e
os de colesterol total (FATOUROS et al., 1995; SILVA, 2002). No entanto, foi
8
Caligiuri e colaboradores, 2002, que sugeriram a atuação dos linfócitos B no
controle das concentrações de LDL-colesterol. Segundo estes autores o linfócito B
produz anticorpos contra o LDL-colesterol oxidado, que é o principal responsável
pelo processo de ateromatose no endotélio vascular. O complexo antígeno-
anticorpo, ou seja, o LDL-colesterol oxidado-anticorpo, seria, então, retirado da
circulação através da fagocitose.
Alguns trabalhos procuraram avaliar o papel da conservação parcial do
tecido esplênico no perfil lipídico. Paulo e Silva (2001), em modelo experimental
em cães, compararam a esplenectomia total com a hemiesplenectomia e a
esplenectomia subtotal com preservação do pólo inferior do baço. Observaram
que a esplenectomia total aumentou significativamente os níveis de colesterol total
e LDL-colesterol. Essas alterações não foram relatadas nos demais grupos,
mostrando que o tecido esplênico conservado na hemiesplenectomia e na
preservação do pólo inferior do baço foi capaz de evitá-las.
Jamel e colaboradores, em 2002, realizaram pesquisa semelhante em ratos
Wistar, incluindo mais um grupo, o transplante autógeno de baço realizado em
omento maior. Relataram uma elevação significativa do LDL-colesterol e do
colesterol total no grupo esplenectomizado. O mesmo ocorreu nos grupos
hemiesplenectomia e transplante autógeno de baço, embora de forma muito mais
amena, evidenciando que o remanescente esplênico protegeu parcialmente contra
as mudanças provocadas no lipidograma pela retirada total do baço.
O papel do transplante autógeno de baço no metabolismo lipídico, atuando
na prevenção das supostas alterações no lipidograma induzidas pela
esplenectomia, precisa ser esclarecido. Outra dúvida que permanece é quanto a
9
localização do enxerto autólogo do baço. Acredita-se que para os implantes
cumprirem suas funções é necessário que a drenagem sanguínea siga para o
fígado como no órgão original. O omento maior é o local preconizado pela
literatura para a realização do transplante autógeno de baço, entretanto, o estudo
de outros sítios de implante é de grande importância (PATEL et al., 1982; IINUMA
et al., 1992; LIAUNIGG et al., 1992).
Atualmente, a preocupação com o metabolismo lipídico é crescente. Sabe-
se que os níveis plasmáticos de colesterol total e, principalmente de LDL-
colesterol, estão diretamente relacionados com a formação de placas de ateroma.
A doença ateromatosa é extremamente comum e manifesta-se através de eventos
isquêmicos de alta morbidade e mortalidade como o infarto agudo do miocárdio e o
acidente vascular cerebral (AMERICAN HEART ASSOCIATION, 2005).
Considerando que as doenças ateroscleróticas são, atualmente, uma das principais
causas de mortalidade no Brasil e no mundo e que a influência do baço no
metabolismo lipídico ainda é um assunto controverso, é de grande necessidade
que se verifique se a esplenectomia realmente predispõe a alterações no
lipidograma e se o transplante autógeno de baço poderia exercer papel protetor
contra essas intercorrências e suas conseqüências patológicas.
O objetivo deste trabalho foi estudar a função atribuída ao baço de
regulação do metabolismo lipídico, através da avaliação do impacto da
esplenectomia no perfil lipídico de camundongos BALB/c e da verificação do efeito
do transplante autógeno de baço em diferentes locais de transplantação.
1
0
2. Metodologia
2.1 Animais
Foram utilizados 70 camundongos isogênicos da linhagem BALB/c,
machos, a partir de quatro semanas de idade. Foram escolhidos camundongos
BALB/c porque o modelo experimental neste animal já havia sido padronizado
pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Juiz de Fora (NUNES et al., 2005). Além
disso, a modificação dos níveis de colesterol em camundongos através de dietas
enriquecidas já está estabelecida na literatura (JOHNSTON et al., 2002; ISHIMORI
et al., 2004). A opção por machos objetiva excluir as alterações no lipidograma
ocasionadas pelo ciclo reprodutivo das fêmeas. Os animais ficaram no setor de
experimentação do Laboratório de Imunologia e foram mantidos em estante
ventilada e gaiolas padrão. A alimentação foi baseada em dieta composta por
ração rica em colesterol e água. Os camundongos foram acompanhados, sendo
os procedimentos e as intercorrências registrados.
Os animais foram divididos em sete grupos, assim distribuídos: Grupo 1:
Controle Normal (CN) - dez camundongos não esplenectomizados e não
submetidos à dieta com colesterol - único grupo que não receberá dieta
enriquecida; Grupo 2: Controle Obeso (CO) - dez camundongos não
esplenectomizados; Grupo 3: Operação Simulada (OS) - dez camundongos com
operação simulada; Grupo 4: Esplenectomia Total (ET) - dez camundongos
esplenectomizados; Grupo 5: Omento Maior (OM) - dez camundongos
esplenectomizados e submetidos ao transplante autógeno de baço em omento
12
maior; Grupo 6: Retroperitônio (RP) - dez camundongos esplenectomizados e
submetidos ao transplante autógeno de baço em retroperitônio; Grupo 7: Parede
Abdominal (PA) - dez camundongos esplenectomizados e submetidos ao
transplante autógeno de baço em parede abdominal.
O projeto está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação
Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e
foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da Pró-
Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Juiz de Fora (Protocolo nº
041/2005).
2.2 Dieta
Todos os animais, com exceção dos do grupo Controle Normal, foram
submetidos à dieta enriquecida com colesterol. A dieta foi iniciada após o
desmame, o que aconteceu com aproximadamente quatro semanas de idade.
Estudos prévios em roedores utilizaram rações enriquecidas com colesterol
em concentrações que variam de 1 - 2,5% (ASAI et al., 1988; ASAI et al., 1990;
PAULO et al., 2005). A ração utilizada neste trabalho foi a AIN-93G (RHOSTER
Indústria e Comércio Ltda) acrescida de 1,25% de colesterol (Tabela 1).
Os camundongos da linhagem BALB/c ingerem em torno de 5,8 a 6,0g de
ração por dia. Estes valores serviram como base para oferecer a quantidade de
alimento adequado a ser deixada em cada gaiola, de acordo com o número de
1
3
animais, garantindo que todos tivessem oferta satisfatória da ração qualitativa e
quantitativamente.
Produtos Peso (gramas)
Amido de Milho 7.122,24
Caseína 3.700,00
Amido Dextrinizado 2.442,00
Sacarose 1.850,00
Óleo de Soja 1.295,00
Celulose 925,00
Mix Mineral AIN-93G
647,50
Mix Vitamínico AIN-93 185,00
L-Cistina 55,50
Bitartarato de Colina 46,25
Colesterol
231,25
Tert-Butilhidroquinona 0,26
TOTAL
18.500,00
Fonte: RHOSTER Indústria e Comércio Ltda.
Todos os animais foram pesados antes do início da dieta, no momento da
intervenção cirúrgica e na coleta de sangue. Os valores obtidos foram registrados
e o ganho de peso neste período foi avaliado.
2.3 Anestesia e Intervenção Cirúrgica
A anestesia e a intervenção cirúrgica foram realizadas 30 dias após o início
da dieta. Os animais estavam com aproximadamente oito semanas de idade.
Tabela 1: Composição da dieta AIN-93G acrescida de 1,25% de colesterol.
14
Anestesia
Para a anestesia foi utilizada solução anestésica composta pelas seguintes
substâncias: quetamina (5%), xilazina (2%) e solução salina (0,9%). A proporção
entre elas foi de 3:1:8. Foi aplicado 0,1ml intraperitonialmente. O plano anestésico
desejado foi atingido em um minuto e mantido por aproximadamente 13 minutos.
Intervenção Cirúrgica
A intervenção cirúrgica foi realizada na capela de fluxo laminar e utilizou
material previamente esterilizado. Os animais dos grupos Controles Normal e
Obeso não foram submetidos a nenhum procedimento cirúrgico. Nos animais do
grupo Operação Simulada foram realizados laparotomia mediana, inventário da
cavidade abdominal, mobilização do baço e isolamento dos vasos esplênicos e
laparorrafia. Nos grupos esplenectomizados foram realizados laparotomia
mediana, esplenectomia total convencional, ligadura do pedículo vascular e dos
vasos do ligamento esplenogástrico com categute simples nº 5-0 em separado.
Nos grupos com implantes autógenos, 30% do tecido esplênico ressecado foi
individualizado, pesado e dividido em duas partes (Figura 1).
1
5
Os fragmentos obtidos foram implantados em um dos três locais de
transplantação, de acordo com o grupo estudado. No grupo Omento Maior, os
fragmentos foram colocados em um envelope de omento maior, onde foram
fixados com pontos de ácido poliglicólico nº 6-0, transfixados e envolvidos pelo
omento (Figura 2). No grupo Retroperitônio, o retroperitônio foi aberto por
dissecção romba, após tração do rim esquerdo, e os fragmentos foram colocados
próximo aos grandes vasos abdominais, sem fixação (Figura 3). No grupo Parede
Abdominal, os fragmentos foram colocados no tecido celular subcutâneo da
parede abdominal, sem fixação (Figura 4). A laparorrafia foi realizada em plano
único com poligalactina nº 4-0. Os tempos cirúrgicos e as intercorrências foram
registrados.
Figura 1 – Técnica cirúrgica – (A) Pedículo vascular e vasos curtos esplênicos.
(B) Secção do baço para o transplante autógeno; aproximadamente 30% do
tecido esplênico é dividido em duas partes.
AB
1
6
Figura 2 – Transplante autógeno de baço em omento maior – (A) Transfixação
dos fragmentos. (B) Bolsa confeccionada com omento maior envolvendo os
fragmentos.
Figura 3 – Transplante autógeno de baço em retroperitônio - (A) Acesso ao
retroperitônio. (B) Colocação dos fragmentos sem fixação.
AB
AB
1
7
2.4 Coleta de Sangue
Após o procedimento cirúrgico foi realizada a coleta de sangue no 60° dia
pós-operatório. Em todos os animais foram colhidos cerca de 2ml de sangue
através de punção do plexo axilar sob sedação. O volume retirado foi satisfatório
para a obtenção de uma fração de soro do sangue para análise bioquímica.
A coleta de sangue realizada no grupo Controle Normal estabeleceu os
valores normais do perfil lipídico dos camundongos. Os resultados foram
comparados com os valores obtidos nos demais grupos, sendo de grande
importância para a elaboração da análise estatística do estudo.
A coleta de sangue foi realizada em tubos próprios da linha BD
Vacutainer
TM
SST
TM
Gel & Clot Activator.
Figura 4 – Transplante autógeno de baço em parede abdominal. Fragmentos
posicionados no tecido celular subcutâneo sem fixação.
1
8
2.5 Avaliação dos níveis de lipídeos plasmáticos
Após a coleta, o material obtido foi mantido em uma temperatura de 4 - 8°C
e enviado para o Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário da
Universidade Federal de Juiz de Fora.
As frações do lipidograma dosadas foram os níveis de triglicérides,
colesterol total, HDL-colestrol, LDL-colesterol e VLDL-colesterol. A dosagem da
glicemia também foi efetuada. Os exames foram realizados no aparelho LABMAX
240 (LABTEST) que utilizou as seguintes metodologias: triglicérides e colesterol
total - Enzimático Trinder; HDL-colesterol - Inibição seletiva. As frações LDL-
colesterol e VLDL-colesterol foram calculadas pela fórmula de Friedwald. A
dosagem da glicemia utilizou a metodologia GOD-Trinder.
2.6 Estudo Histopatológico
Após a coleta de sangue, os animais mortos (exsanguinação sob anestesia)
foram submetidos a um inventário da cavidade abdominal. A retirada do baço,
implantes autógenos e do fígado foi realizada em cinco animais de cada grupo do
experimento selecionados aleatoriamente.
O material obtido foi enviado para análise histopatológica fixado em formol
a 10%. Todo material foi processado e então incluído em parafina. Foram
realizados cortes histológicos com cerca de três micrômetros de espessura
corados pela hematoxilina-eosina. O estudo histopatológico foi realizado no
1
9
Laboratório de Histologia - Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Juiz de Fora e o material foi avaliado pelo
mesmo patologista que analisou as seguintes estruturas:
• Baço/ fragmentos esplênicos: (i) estrutura geral do órgão e a presença de
cápsula; (ii) padrão morfológico da polpa branca, existência de folículos primários
e secundários; (iii) condições da polpa vermelha.
• Fígado: (i) estrutura geral do órgão e a presença de cápsula; (ii) presença
de esteatose hepática – acúmulo de lípides no interior do citoplasma dos
hepatócitos – e sua classificação em macrovesicular, microvesicular ou padrão
intermediário. Também foi realizada uma análise quantitativa: as lesões hepáticas
por esteatose foram classificadas em baixo grau (acometimento de até metade do
lóbulo hepático) e alto grau (acometimento de mais da metade do lóbulo hepático).
2.7 Análise Estatística
As diversas variáveis numéricas foram avaliadas nos diferentes grupos pelo
teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov para distribuição gaussiana dos
dados. Para as variáveis que possuíam distribuição normal e homocedasticidade,
a avaliação estatística foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA),
seguida pelo teste de Bonferroni de comparação múltipla. Caso contrário, foi
utilizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis. As variáveis nominais foram
analisadas por meio do teste não-paramético qui-quadrado. Os valores foram
considerados significativos para p < 0,05.
2
0
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30
4. Artigo
Considerações
O artigo “Influência do baço, da asplenia e do implante esplênico
autógeno no metabolismo lipídico de camundongos” dos autores Alice
Belleigoli Rezende, Sérgio Ibañez Nunes, Rogério Estevam Farias, Fernando
Rocha Vieira, Andy Petroianu e Henrique Couto Teixeira foi submetido à
apreciação dos revisores da Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões em
08/01/2007.
A revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões abrange trabalhos de clínica
cirúrgica e cirurgia experimental, sendo QUALIS A nestas áreas, segundo
classificação da CAPES. O artigo encontra-se no formato padronizado pela
Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões, sendo respeitadas todas as regras
estabelecidas pelo periódico.
3
2
INFLUÊNCIA DO BAÇO, DA ASPLENIA E DO IMPLANTE ESPLÊNICO
AUTÓGENO NO METABOLISMO LIPÍDICO DE CAMUNDONGOS.
INFLUENCE OF THE SPLEEN, ASPLENISM AND AUTOLOGOUS SPLENIC
IMPLANTS ON LIPID METABOLISM IN MICE.
Alice Belleigoli Rezende
1
, Sérgio Ibañez Nunes
2
, Rogério Estevam Farias
3
,
Fernando Rocha Vieira
4
, Andy Petroianu
5
, Henrique Couto Teixeira
6
1. Mestranda em Saúde Brasileira, Faculdade de Medicina, Universidade Federal
de Juiz de Fora.
2. Professor do Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina, Fundação
José Bonifácio de Andrade (FUNJOB). Doutor em Cirurgia.
3. Professor Adjunto do Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora. Doutor em Patologia
Experimental.
4. Bioquímico, Laboratório de Análises Clínicas, Hospital Universitário,
Universidade Federal de Juiz de Fora.
5. Professor Titular do Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina,
Universidade Federal de Minas Gerais. Docente Livre da UNIFESP-EPM e da
USP. Doutor em Fisiologia e Farmacologia. Pesquisador IA do CNPq.
6. Professor Associado do Departamento de Parasitologia, Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora.
Doutor em Imunologia. Pesquisador do CNPq.
33
RESUMO
Objetivo: Estudar a influência do baço, da asplenia e do implante esplênico
autógeno no metabolismo lipídico, por meio da avaliação do lipidograma sérico de
camundongos e da verificação do efeito do transplante autógeno de baço em
diferentes locais do abdome. Método: Foram utilizados camundongos BALB/c
distribuídos em sete grupos de 10 animais: controle normal (CN); controle obeso
(CO); operação simulada (OS); esplenectomia total (ET); três grupos submetidos
ao transplante autógeno do baço: omento maior (OM), retroperitônio (RP), tecido
subcutâneo da parede abdominal (PA). Os animais, com exceção do grupo CN,
foram submetidos a dieta com 1,25% de colesterol. A intervenção cirúrgica foi
realizada 30 dias após o início da dieta. A coleta de sangue ocorreu no 60° dia
pós-operatório. Foram dosados os níveis de triglicérides, de colesterol total e de
suas frações, bem como a glicemia. O baço, os implantes esplênicos e o fígado
foram submetidos a estudo histológico. Resultados: A dieta aumentou os níveis
plasmáticos de colesterol total, HDL e LDL dos camundongos (p < 0,05 versus
CN). Entre os animais em uso da dieta, não houve diferença no lipidograma dos
grupos controles (CO e OS) quando comparados ao grupo esplenectomizado
(ET), assim como em relação aos animais submetidos ao transplante autógeno do
baço (OM, RP, PA). A capacidade de preservação da arquitetura histológica
esplênica foi semelhante nos três locais de implante. Todos os animais que
utilizaram a dieta enriquecida apresentaram esteatose hepática. Conclusão: De
acordo com os resultados obtidos o baço não parece participar da regulação dos
níveis de lipídeos plasmáticos em camundongos BALB/c.
3
4
Descritores: Baço. Esplenectomia. Transplante autógeno de baço. Auto-implante
esplênico. Metabolismo lipídico. Colesterol. Triglicérides.
35
Introdução
Durante muito tempo as atribuições do baço permaneceram desconhecidas.
Por ter sua importância pouco esclarecida e pelo fato de sua ausência ser
compatível com a vida, até hoje este órgão vem sendo retirado
indiscriminadamente no trauma e em diversas doenças hematológicas
1
. A
esplenectomia total era considerada a única opção terapêutica
independentemente do tipo e da extensão da afecção esplênica
2,3
.
King e Schumacker Jr
4
, em 1952, ao descreverem a sepse fulminante pós-
esplenectomia, despertaram a atenção da comunidade científica para a
importância do tecido esplênico na prevenção de infecções graves. Uma vez
iniciados, os estudos sobre o baço tornaram-se progressivamente mais
freqüentes. A participação do baço no sistema imunológico é bem conhecida
5,6
. O
baço é o principal responsável pela fagocitose e pela depuração de partículas,
bactérias, vírus, fungos e parasitas da corrente sanguínea
7,8
. Uma nova função do
baço que vem sendo pesquisada é o sua participação na regulação do
metabolismo lipídico
9,10
. Apesar de alguns autores terem encontrado evidências de
hiperlipidemia associada à asplenia, o papel do baço no metabolismo lipídico
ainda não foi esclarecido
9,10
.
Observada a importância desse órgão, sua preservação total ou parcial
passou a ser realizada de forma mais freqüente. Entre os métodos de
conservação do baço destacam-se a esplenorrafia, a hemiesplenectomia, a
esplenectomia subtotal e a ligadura da artéria esplênica. Quando a esplenectomia
total é inevitável, o transplante autógeno de tecido esplênico é a única maneira de
obter a manutenção da função esplênica e evitar as complicações da asplenia
11-14
.
36
A participação do tecido esplênico na regulação dos lipídios plasmáticos foi
inicialmente apontada por Robinete e Fraumeni Jr
15
, que em 1977, estudaram a
mortalidade tardia de veteranos que foram esplenectomizados durante a Segunda
Guerra Mundial. A alta incidência de infarto agudo do miocárdio fez com que
esses autores atribuíssem à asplenia possíveis distúrbios lipídicos que
provocariam os incidentes vasculares
15
. Em pacientes com doenças
mieloproliferativas foi encontrada redução nas concentrações plasmáticas de
lipídios provavelmente decorrentes da hiperfunção esplênica
16,17
.
Trabalhos experimentais avaliaram o impacto da esplenectomia nos níveis
circulantes de lipoproteínas
18-20
. Asai et al
19
, em 1988, observaram que coelhos
esplenectomizados apresentavam aumento do colesterol total, dos triglicérides e
dos fosfolípides, enquanto a fração HDL era reduzida após dieta enriquecida com
colesterol. Paulo e Silva
20
observaram em modelo experimental em cães que a
esplenectomia total aumentou os níveis de colesterol total e de sua fração LDL.
Essas alterações também foram encontradas por Jamel et al
10
, em ratos.
Apesar dos vários trabalhos já descritos na literatura, os resultados
encontrados ainda são conflitantes e a participação do baço no metabolismo
lipídico ainda é um assunto controverso. Considerando que a hiperlipidemia está
diretamente associada à formação de placas de ateroma e que as doenças
ateroscleróticas são uma das principais causas de morte
21
, é pertinente verificar se
de fato a esplenectomia predispõe a alterações no lipidograma e se o transplante
autógeno de baço influencia nesse índice metabólico.
37
Método
Animais. Foram utilizados 70 camundongos isogênicos da linhagem
BALB/c, machos, a partir de quatro semanas de idade. Os animais foram alocados
no setor de experimentação do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências
Biológicas - UFJF e mantidos em gaiolas padrão sobre estantes ventiladas. Foram
estudados sete grupos de 10 animais, assim distribuídos: grupo controle normal
(CN) – nenhum procedimento cirúrgico; grupo controle obeso (CO) – nenhum
procedimento cirúrgico; grupo operação simulada (OS); grupo esplenectomia total
(ET); grupo omento maior (OM) - transplante autógeno de baço em omento maior;
grupo retroperitônio (RP) - transplante autógeno de baço em retroperitônio; grupo
parede abdominal (PA) - transplante autógeno de baço em parede abdominal.
O projeto está de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação
Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e
foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da Pró-
Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de Juiz de Fora (Protocolo nº.
041/2005).
Dieta. A alimentação foi constituída por ração rica em colesterol e água. A
ração utilizada neste trabalho foi a AIN-93G (RHOSTER Indústria e Comércio
Ltda.) acrescida de 1,25% de colesterol. Todos os animais, com exceção dos do
grupo controle normal, foram submetidos à dieta enriquecida com colesterol. A
dieta foi iniciada após o desmame, com quatro semanas de idade. Foi observado
que camundongos da linhagem BALB/c ingerem em torno de 5,8 a 6,0 g de ração
por dia. Esses valores serviram como base para a quantidade de alimento
38
adequada a ser colocada em cada gaiola. O ganho de peso foi acompanhado
durante todo o experimento.
Procedimento cirúrgico. A anestesia e a intervenção cirúrgica foram
realizadas 30 dias após o início da dieta. Para a anestesia foi utilizada solução
anestésica composta pelas seguintes substâncias: quetamina (5%), xilazina (2%)
e solução salina (0,9%), na proporção de 3:1:8, por via intraperitoneal, na dose de
0,005 ml/g de peso corporal. A intervenção cirúrgica foi realizada na capela de
fluxo laminar e utilizou material previamente esterilizado.
Nos animais do grupo operação simulada realizou-se laparotomia mediana,
inventário da cavidade abdominal, mobilização do baço, isolamento dos vasos
esplênicos e laparorrafia.
Nos grupos esplenectomizados realizou-se laparotomia mediana,
esplenectomia total convencional, ligadura do pedículo vascular e dos vasos
curtos esplênicos com categute simples 5-0.
Nos grupos com implantes autógenos, 30% do tecido esplênico ressecado
foi individualizado, pesado e dividido em duas partes, conforme a técnica já
descrita por Nunes et al
22
. No grupo omento maior, os fragmentos foram
colocados em um envelope de omento maior, onde foram fixados com pontos de
ácido poliglicólico 6-0 e envolvidos pelo omento. No grupo retroperitônio, o
retroperitônio foi aberto por dissecção romba, após tração do rim esquerdo, e os
fragmentos foram colocados próximo aos grandes vasos abdominais, sem fixação.
No grupo parede abdominal, os fragmentos foram colocados no tecido celular
subcutâneo da parede abdominal, sem fixação. A quantidade de tecido esplênico
implantado nos grupos submetidos ao transplante autógeno de baço foi
39
semelhante. O peso médio e o desvio padrão do tecido implantado foram de 0,056
+ 0,009 g no grupo OM, 0,054 + 0,009 g no grupo RP e 0,053 + 0,009 g no grupo
PA (p = 0,78). A laparorrafia foi realizada em plano único com poliglactina 4-0
(Figura1).
Coleta de sangue e análise bioquímica. A coleta de sangue foi realizada
no 60° dia pós-operatório. Foram colhidos cerca de 2 ml de sangue através de
punção do plexo axilar sob sedação. A coleta de sangue foi realizada em tubos de
4 ml (BD Vacutainer
TM
SST
TM
Gel & Clot Activator). Após a coleta, o material obtido
foi mantido em uma temperatura de 4 a 8°C. As frações do lipidograma dosadas
foram os níveis de triglicérides, colesterol total, HDL-colestrol, LDL-colesterol e
VLDL-colesterol. A dosagem da glicemia também foi efetuada. Os exames foram
realizados no aparelho LABMAX 240 (LABTEST). O triglicérides, colesterol total e
o HDL-colesterol foram dosados pelo método colorimétrico enzimático. As frações
LDL e VLDL foram calculadas pela fórmula de Friedwald.
Estudo Histopatológico. Após a coleta de sangue, os animais mortos
(exsanguinação sob anestesia) foram submetidos a um inventário da cavidade
abdominal. A retirada do baço, implantes autógenos e do fígado foi realizada em
cinco animais de cada grupo selecionados aleatoriamente. O material obtido para
análise histopatológica foi fixado em formol a 10%. Foram realizados cortes
histológicos com cerca de três micrômetros de espessura corados pela
hematoxilina e eosina. O material foi avaliado pelo mesmo patologista que
analisou o padrão histológico do baço, implantes esplênicos e do fígado. Neste
último foi verificada também a presença de esteatose hepática, sua classificação e
4
0
grau de comprometimento. As lesões hepáticas por esteatose foram classificadas
em baixo grau (acometimento de até metade do lóbulo hepático) e alto grau
(acometimento de mais da metade do lóbulo hepático).
Análise Estatística. As diversas variáveis numéricas foram avaliadas nos
diferentes grupos pelo teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov para
distribuição gaussiana dos dados. Para as variáveis que possuíam distribuição
normal e homocedasticidade, a avaliação estatística foi realizada por meio de
análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Bonferroni de comparação
múltipla. Caso contrário, foi utilizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis. As
variáveis nominais foram analisadas por meio do teste não-paramético qui-
quadrado. Os valores foram considerados significativos para p < 0,05.
Resultados
A sobrevida dos camundongos envolvidos no estudo foi de 97,1% (68/70).
Foram registrados dois óbitos no pós-operatório, um no grupo ET e um no grupo
PA, por causas não identificadas mesmo após exame das cavidades abdominal e
torácica.
A cavidade abdominal não apresentou alterações em nenhum dos animais.
O aspecto macroscópico do baço foi normal nos grupos CN, CO e OS. Nos
camundongos submetidos ao transplante autógeno de baço, no omento e no
retroperitônio, foram observadas aderências nas proximidades dos implantes. O
fígado dos animais que estavam em uso da dieta enriquecida com 1,25% de
colesterol mostrou alterações macroscópicas sugestivas de esteatose em 65,5%
(38/58) dos casos.
41
A dieta AIN-93G + 1,25% de colesterol foi eficaz para aumentar os lipídios
plasmáticos dos camundongos BALB/c. O colesterol total e suas frações HDL e
LDL dos animais que fizeram uso da dieta especial foram maiores do que os dos
animais em uso da dieta padrão, grupo CN (p < 0,002). Não foram observadas
diferenças nos níveis séricos de VLDL-colesterol e triglicérides, assim como de
glicemia, entre os animais que utilizaram e os que não utilizaram a dieta
enriquecida com colesterol. O ganho de peso durante o experimento também foi
similar entre todos os grupos (p = 0,51).
As dosagens de colesterol total foram semelhantes entre o grupo CO e
todos os grupos submetidos à intervenção cirúrgica, independentemente do
procedimento realizado ter sido a operação simulada, a esplenectomia ou a
esplenectomia seguida de transplante autógeno do baço (p = 0,20) (Tabela 1).
As frações do colesterol total também foram equivalentes entre os grupos
em uso da dieta enriquecida. Não foram registradas diferenças nos níveis séricos
de HDL-colesterol entre os grupos (p = 0,27). Também não houve diferenças entre
os valores encontrados para a fração LDL-colesterol nos diferentes grupos em uso
da dieta acrescida de 1,25% de colesterol (p = 0,39). Os resultados da fração
VLDL-colesterol também não foram diferentes entre os grupos em uso da dieta
especial (p = 0,77) (Tabela 1). Os níveis séricos de triglicérides, assim como o
colesterol total e suas frações, também não tiveram diferença entre os grupos que
fizeram uso da dieta AIN-93G + 1,25% de colesterol (p = 0,76). Não foram
registradas diferenças nos níveis plasmáticos de glicose entre os grupos (p = 0,12)
(Tabela 1).
42
Os implantes esplênicos, em 18/30 dos casos, apresentaram estrutura
compatível com o baço normal. O tecido esplênico implantado dos outros 12
camundongos apresentou alterações nas polpas branca e vermelha que reduziram
suas espessuras (Figura 2). Em 80% dos animais dos grupos RP e PA os
implantes mantiveram a estrutura normal, enquanto apenas 20% dos
camundongos do grupo OM não tiveram hipotrofia parenquimatosa (p = 0,01).
Esteatose hepática foi encontrada em 30 dos 35 fígados avaliados, sendo
que apenas os camundongos do grupo CN não tiveram alteração do tecido
hepático. O padrão histológico identificado em todos os casos foi o de esteatose
microvesicular de graus variados (Figura 2).
Discussão
A importância incontestável do baço na resposta imunitária orgânica e a
descoberta de outras atribuições desse órgão trouxeram uma nova orientação no
tratamento das afecções esplênicas
23-29
. Tanto a indicação quanto a abordagem
cirúrgica tornaram-se cada vez mais conservadoras
30,31
.
Neste estudo, a mortalidade observada após o procedimento cirúrgico foi de
aproximadamente 2,9%, valor muito inferior ao registrado por outros autores
32
. É
possível que o controle rigoroso das condições de manutenção e manuseio dos
animais tenha contribuído para esse resultado favorável. Em relação ao
procedimento cirúrgico, a quantidade de tecido esplênico implantado,
independentemente do local de implante, seguiu a orientação da literatura, que
definiu serem 25% do tecido esplênico o mínimo necessário para a manutenção
das funções desse órgão
33
.
4
3
No presente trabalho, em concordância com achados anteriores, a análise
histopatológica do tecido esplênico implantado foi semelhante nos três locais de
implante e evidenciou em todos os casos arquitetura característica de baço
34,35
. As
pequenas alterações encontradas foram decorrentes do trauma operatório e são
previstas em todas as operações esplênicas
22,36
. Por outro lado, é importante
ressaltar que o aspecto morfológico não tem necessariamente correspondência
funcional. Portanto, o tecido pode ser viável e aparentar normalidade mesmo sem
funcionar adequadamente. Tal fato justificou o estudo funcional do tecido
esplênico no metabolismo lipídico.
Outro aspecto relevante é o uso de uma dieta enriquecida, com o objetivo
de induzir hiperlipidemia e enfatizar as possíveis alterações no lipidograma. Esse
método já foi utilizado em outros trabalhos
10,19
e, de fato, a dieta utilizada foi eficaz
em aumentar os níveis de lipídeos plasmáticos nos camundongos BALB/c. Cabe
ressaltar a ausência de diferenças nos níveis de lipídios plasmáticos entre os
grupos avaliados. Dessa maneira, o trauma cirúrgico e a esplenectomia, com ou
sem os auto-implantes, não interferiram nos valores do lipidograma dos
camundongos estudados. Morfologicamente, a esplenectomia total também não
predispôs os animais a esteatose hepática maior.
Asai et al
37
, em 1990, observaram aumento de triglicérides, de colesterol
total e da fração HDL em coelhos esplenectomizados, porém não foram
encontradas diferenças na fração LDL
37
. Todavia, o principal mecanismo proposto
para a participação do baço no metabolismo lipídico é a produção de anticorpos
anti-LDL-colesterol oxidado
10,32
. Por outro lado, Paulo et al
32
, em 2005,
descreveram que a esplenectomia induz uma elevação dos níveis de triglicérides,
44
de colesterol total e das frações HDL, LDL e VLDL em ratos. Petroianu et al
38
, em
2006, verificaram que após a esplenectomia em ratos os níveis de colesterol total
e da fração LDL elevam-se, enquanto que a fração HDL diminui.
Este trabalho não encontrou que a esplenectomia influencia nos níveis
plasmáticos de lipídeos de camundongos BALB/c. Este resultado pode ser
explicado em parte pelo modelo experimental utilizado. Resultados semelhantes
foram publicados por Caligiuri et al
39
que também não encontraram alterações nos
níveis de colesterol em camundongos esplenectomizados. Segundo esses autores
o baço influencia no metabolismo lipídico por meio de linfócitos B capazes de
produzir anticorpos anti-LDL-colesterol oxidado. Esse complexo antígeno-
anticorpo seria retirado da circulação por macrófagos teciduais, incluindo os
esplênicos. O baço participaria não apenas da depuração dos imunocomplexos,
mas também da produção de anticorpos anti-LDL-colesterol oxidado, por conter a
maior parte dos linfócitos B de memória e por ser o principal local de apresentação
antigênica e produção de anticorpos
40
.
Alguns estudos experimentais identificaram que as alterações lipídicas
induzidas pela esplenectomia total podem ser prevenidas por técnicas
conservadoras do baço
32,38
. No entanto, este trabalho não mostrou alterações no
lipidograma, mesmo com preservação esplênica mediante transplante autógeno
de baço em três locais, cujas drenagens venosas são distintas e ocorrem,
respectivamente, para a circulação porta, para a circulação sistêmica ou para
ambas. É fundamental ressaltar que apenas o lipidograma não é suficiente para
estabelecer a influência do tecido esplênico no metabolismo lipídico de
camundongos. Novas pesquisas relacionadas aos anticorpos anti-LDL-colesterol
4
5
oxidado e ao desenvolvimento de lesões ateroscleróticas são necessários para
conhecer melhor o papel do baço no metabolismo lipídico.
4
6
ABSTRACT
Background: This work verify the influence of the spleen and splenic remnants on
lipid metabolism, by evaluating the impact of splenectomy on lipidogram of mice
and by studying the effect of autogenous spleen tissue implanted in different sites.
Methods: 70 BALB/c mice were divided into seven groups of 10 animals: normal
control group, with no diet or surgery; fat control group, without surgery; surgical
procedure sham group;
total splenectomy group and three groups with implants in
different sites: greater omentum, retroperitonium and abdominal subcutaneous
tissue. The animals, except the normal control group, received food with 1,25%
cholesterol. The surgical procedure was carried out 30 days after the beginning of
the food administration. Two months after the operations, serum triglycerides,
cholesterol and glycemia were studied. Histological assessments in the spleen or
implants and in the liver were carried out. Results: The enriched food increased
the plasmatic levels of total cholesterol, HDL, and mainly LDL of the mice (p<0.05).
No significant difference was found in the lipidograms of the animals of the control
groups when compared with the splenectomized ones, as well as in the animals
submitted to the autogenous splenic tissue transplantation. The preservation of the
splenic histological architecture was similar on the three implantation sites. All the
animals received enriched food presented liver steatosis. Conclusion: The spleen,
splenectomy and splenic implants do not influence lipidogram in BALB/c mice.
Key Words: Spleen. Splenectomy. Splenic autoimplants. Lipid metabolism.
Cholesterol. Triglycerides.
4
7
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53
Endereço para correspondência:
Dr. Henrique Couto Teixeira
Laboratório de Imunologia - Departamento de Parasitologia, Microbiologia e
Imunologia
Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal de Juiz de Fora
36036-900 - Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil
Fone/fax: (32) 3229-3214
E-mail: henrique.teixeira@ufjf.edu.br
5
4
Ilustrações
Figura 1
55
Figura 2
56
Legendas
Figura 1 – Implante de tecido esplênico (setas) em três locais diferentes. A:
Omento maior. B: Retroperitônio. C: Parede abdominal.
Figura 2 – Estudo histopatológico do tecido esplênico e hepático. Hematoxilina-
eosina (x10). A: Tecido esplênico original (grupo OS). B: Implante esplênico com
estrutura compatível com o órgão original (grupo RP). C: Implante esplênico com
pequenas alterações (grupo OM). D: Tecido hepático sem alterações (grupo CN).
E: Tecido hepático com esteatose de baixo grau (grupo PA). F: Tecido hepático
com esteatose de alto grau (grupo CO).
57
Grupo Colesterol Triglicérides Glicemia
Total HDL LDL VLDL
Controle Normal 103+15* 62+07* 09+04* 32+12 161+58 167+21
Controle Obeso 114+07 69+03 22+07 23+05 113+24 166+28
Operação Simulada 121+11 74+05 21+04 27+08 131+38 188+33
Esplenectomia Total 112+11 67+06 21+06 25+08 123+39 191+26
Omento Maior 125+20 72+12 27+09 26+10 132+52 194+37
Retroperitônio 118+13 68+08 22+06 28+11 142+56 164+16
Parede Abdominal 113+11 69+12 21+07 23+06 114+31 185+10
* p < 0,002 em relação aos animais em uso da dieta.
Tabela 1 – Valores de colesterol total e suas frações, triglicérides e glicemia (média
+ desvio padrão) nos camundongos dos diferentes grupos.
58
Outras informações:
Agradecimentos: Agradecemos a Márcio José Martins Alves (Departamento de
Saúde Coletiva, Faculdade de Medicina, UFJF) por auxiliar na análise estatística
dos resultados.
Suporte financeiro: Agências FAPEMIG (CDS 255/03) e CNPq (471696/2004-8).
59
5. Anexos
5.1 Tabela Geral
Nº
Grupo
Peso 1* Peso 2* Peso 3* Tempo Cirúrgico** Peso 1/3 baço*
01 RP 21,4 26,4 28,2 5,05 0,049
02 RP 21,6 26,8 29,2 5,41 0,054
03 RP 20,9 25,5 28,2 6,02 0,061
04 RP 17,6 22,4 26,0 5,10 0,063
05 RP NR 21,5 25,1 7,20 0,035
06 RP 20,6 24,0 27,9 5,41 0,055
07 RP 17,8 23,6 27,7 4,54 0,057
08 RP 22,4 27,2 29,3 5,44 0,066
09 RP 17,1 25,1 27,5 6,19 0,054
10 RP NR 24,6 26,1 6,10 0,043
11 PA 18,2 21,5 28,8 4,42 0,039
12 PA 20,8 26,5 27,8 4,20 0,049
13 PA 19,9 24,4 27,4 4,51 0,045
14 PA 20,3 26,1 28,7 5,06 0,052
15 PA 20,6 25,0 NR 4,40 0,066
16 PA 19,7 26,4 31,9 5,04 0,062
17 PA 22,2 27,4 30,7 4,38 0,062
18 PA 20,1 26,4 31,5 4,54 0,049
19 PA 20,8 26,3 29,8 4,04 0,048
20 PA 21,0 27,2 29,2 4,30 0,061
21 OM 16,8 22,8 24,3 6,18 0,047
22 OM 21,2 26,7 29,3 6,58 0,057
23 OM 19,9 25,4 29,7 6,50 0,070
24 OM 16,7 23,8 26,3 7,40 0,041
25 OM 18,2 24,2 26,0 7,20 0,055
26 OM 16,7 26,5 28,8 7,48 0,052
27 OM 18,1 30,2 37,7 5,26 0,067
28 OM 19,5 26,4 29,3 5,14 0,049
29 OM 17,8 23,9 26,4 6,19 0,067
30 OM 18,1 23,5 26,7 6,08 0,055
31 ET 20,5 27,6 29,8 4,43 NR
32 ET 18,5 25,1 29,3 3,52 NR
33 ET 19,7 24,4 27,9 4,18 NR
34 ET 19,8 26,9 30,1 3,44 NR
35 ET NR 20,5 26,2 4,05 NR
36 ET 19,9 24,6 27,2 4,01 NR
37 ET 21,0 25,9 NR 3,59 NR
38 ET 19,1 25,5 29,6 3,46 NR
39 ET 18,3 25,7 28,8 3,52 NR
40 ET 19,8 25,5 31,3 4,30
NR
6
1
41 OS 19,8 24,2 28,8 2,04 NR
42 OS 22,7 28,2 33,9 2,30 NR
43 OS 20,3 23,2 26,9 1,58 NR
44 OS 20,0 27,4 35,0 2,03 NR
45 OS 19,7 24,9 31,0 2,11 NR
46 OS 21,6 26,1 31,1 2,03 NR
47 OS 19,2 26,5 31,1 2,10 NR
48 OS 21,7 26,6 31,1 2,20 NR
49 OS 17,4 22,2 27,1 2,09 NR
50 OS 21,5 27,3 32,1 2,50 NR
51 CO 18,4 NR 29,3 NR NR
52 CO 18,8 NR 26,8 NR NR
53 CO 16,8 NR 25,5 NR NR
54 CO 19,8 NR 28,0 NR NR
55 CO 19,6 NR 28,1 NR NR
56 CO 19,2 NR 29,5 NR NR
57 CO 20,4 NR 29,1 NR NR
58 CO 20,6 NR 27,4 NR NR
59 CO 18,5 NR 26,2 NR NR
60 CO 20,5 NR 29,5 NR NR
61 CL 21,9 NR 31,0 NR NR
62 CL 19,8 NR 30,9 NR NR
63 CL 23,4 NR 33,8 NR NR
64 CL 18,7 NR 26,1 NR NR
65 CL 22,5 NR 31,4 NR NR
66 CL 15,3 NR 31,4 NR NR
67 CL 21,5 NR 22,2 NR NR
68 CL 21,7 NR 31,1 NR NR
69 CL 18,9 NR 27,8 NR NR
70 CL 19,0 NR 29,3 NR NR
Tabela Geral: pesos dos camundongos em três momentos (início da dieta –
peso1, intervenção cirúrgica – peso 2, coleta de sangue – peso 3); tempo cirúrgico
e peso do tecido esplênico implantado.
* Pesos: gramas
** Tempo cirúrgico: minutos
NR Não realizado
62
5.2 Tabela Lipidograma
Nº
Grupo Colesterol Total HDL LDL VLDL Triglicérides Glicemia
01 RP 120 73 15 32 160 185
02 RP 132 77 21 34 169 160
03 RP 135 75 20 40 201 173
04 RP 129 66 12 51 257 175
05 RP 132 77 29 26 130 185
06 RP 104 59 30 16 78 153
07 RP 100 53 24 23 117 152
08 RP 103 62 21 20 102 140
09 RP 113 65 32 17 85 149
10 RP 116 71 20 24 121 168
11 PA 100 57 22 21 103 203
12 PA 103 57 28 17 87 181
13 PA 118 63 33 21 107 182
14 PA 99 59 22 18 91 176
16 PA 110 65 13 32 164 NR
17 PA 114 75 17 22 113 NR
18 PA 129 80 26 24 118 180
19 PA 126 76 17 33 165 NR
20 PA 116 90 10 16 78 186
21 OM 145 68 49 29 143 138
22 OM 112 70 25 17 87 244
23 OM 123 77 23 23 113 205
24 OM 109 70 25 14 72 167
25 OM 127 81 30 15 76 168
26 OM 90 48 20 22 110 181
27 OM 163 92 24 46 229 247
28 OM 133 79 23 31 157 219
29 OM 132 74 19 39 196 160
30 OM 119 65 27 28 140 209
31 ET 125 68 26 32 158 159
32 ET 129 79 13 37 186 158
33 ET 107 69 16 22 110 187
34 ET 109 62 33 15 75 224
35 ET 120 67 20 33 163 NR
36 ET 96 58 13 25 125 181
38 ET 114 72 22 20 102 228
39 ET 98 62 21 15 76 186
40 ET 113 68 22 23 114 203
63
41 OS 111 69 22 20 100 172
42 OS 118 71 24 23 114 249
43 OS 129 79 28 22 112 157
44 OS 103 65 17 21 103 NR
45 OS 119 77 17 25 127 NR
46 OS 114 71 27 16 82 157
47 OS 127 77 20 30 152 183
48 OS 113 69 15 29 146 187
49 OS 134 77 20 37 168 NR
50 OS 139 81 17 42 208 214
51 CO 110 67 23 20 99 155
52 CO 103 67 11 25 126 164
53 CO 111 67 20 25 124 196
54 CO 113 68 23 22 112 118
55 CO 110 71 20 19 95 177
56 CO 110 66 13 31 153 193
57 CO 128 75 26 28 139 194
58 CO 120 71 29 19 97 140
59 CO 119 70 34 14 71 136
60 CO 115 71 21 23 114 183
61 CL 91 58 03 31 153 187
62 CL 104 68 06 30 150 148
63 CL 102 63 08 31 157 152
64 CL 76 45 10 21 105 144
66 CL 100 67 06 26 130 198
67 CL 92 55 13 24 122 144
68 CL 108 67 13 28 139 181
69 CL 93 53 14 26 129 142
70 CL 102 66 12 24 119 165
Tabela Lipidograma: dosagens de colesterol total e suas frações HDL, LDL e
VLDL, triglicérides e glicemia dos camundongos (mg/dl).
NR: Não realizado.
OBS: Os camundongos 15 e 37 foram a óbito no pós-operatório.
64
5.3 Tabela Histologia
Nº
Grupo Histologia Esplênica* C** Histologia Hepática C***
01 RP PV: pouco desenvolvida
PB: idem, folículos linfóides menores
DA Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
02 RP PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
03 RP PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
04 RP PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
05 RP PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
16 PA PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
17 PA PV: pouco desenvolvida
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
DA Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
18 PA PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
19 PA PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
20 PA PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
21 OM PV: pouco desenvolvida
PB: idem, folículos linfóides menores
DA Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
22 OM PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
23 OM PV: congesta
PB: folículos linfóides menores
DA Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
24 OM PV: congesta
PB: folículos linfóides menores
DA Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
25 OM PV: congesta
PB: folículos linfóides menores
DA Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
32 ET NR
Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
33 ET NR Esteatose microvesicular
Focal e leve
BG
34 ET NR Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
35 ET NR Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
38 ET NR Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
40 SH PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/3 do lóbulo hepático
BG
41 SH PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
Focal e leve
BG
65
43 SH PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
44 SH PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
1/2 do lóbulo hepático
BG
46 SH PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes (CG)
EN Esteatose microvesicular
Focal e leve
BG
51 CO PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
2/3 do lóbulo hepático
AG
52 CO PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
2/3 do lóbulo hepático
AG
53 CO PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
2/3 do lóbulo hepático
AG
54 CO PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
2/3 do lóbulo hepático
AG
55 CO PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Esteatose microvesicular
2/3 do lóbulo hepático
AG
61 CN PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Ausência de esteatose NR
62 CN PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Ausência de esteatose NR
63 CN PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Ausência de esteatose NR
64 CN PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Ausência de esteatose NR
65 CN PV: congesta
PB: folículos linfóides proeminentes
EN Ausência de esteatose NR
Tabela Histologia: aspecto histológico esplênico e hepático de 05 camundongos por grupo.
* PB: polpa branca; PV: polpa vermelha.
** Classificação - EN: estrutura normal; DA: discretas alterações.
*** Classificação - BG: esteatose de baixo grau; AG: esteatose de alto grau.
NR Não realizado
66
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