( PDF ) Ação protetora de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia contra infecção por Candida albicans através do aumento das funções de fagócitos

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WAGNER LOYOLA

AÇÃO PROTETORA DE EXTRATO DE SEMENTES DE

Artocarpus integrifolia L. CONTRA INFECÇÃO POR Candida

albicans ATRAVÉS DO AUMENTO DAS FUNÇÕES DE

FAGÓCITOS

Londrina

2008

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AGNER LOYOLA

AÇÃO PROTETORA DE EXTRATO DE SEMENTES DE

Artocarpus integrifolia L. CONTRA INFECÇÃO POR Candida

albicans ATRAVÉS DO AUMENTO DAS FUNÇÕES DE

FAGÓCITOS

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Microbiologia da Universidade Estadual de Londrina

como requisito parcial à obtenção do título de Doutor

em Microbiologia.

Orientadora: Profa. Dra. Ionice Felipe.

Londrina

2008

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WAGNER LOYOLA

AÇÃO PROTETORA DE EXTRATO DE SEMENTES DE

Artocarpus integrifolia L. CONTRA INFECÇÃO POR Candida

albicans ATRAVÉS DO AUMENTO DAS FUNÇÕES DE

FAGÓCITOS

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Prof. Dr.João Santana da Silva

________________________________________

Profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis

________________________________________

Prof. Dr.Luis Carlos Jabur Gaziri

________________________________________

Prof. Dr.Luciano Aparecido Panagio

________________________________________

Profa. Dra. Ionice Felipe

Londrina, 24 de março de 2008.

Maria Emilia e Gabriel com muito amor.

AGRADECIMENTOS

A Deus inteligência suprema, causa primária de todas as coisas. Por todos os presentes que tem

me dado durante a minha vida, inclusive as pessoas que estão ao meu lado sempre

À Profª. Drª. Ionice Felipe, pela oportunidade, orientação, paciência e dedicação. Pelo incentivo

nesse processo de formação científica, seu exemplo sempre estará em meus pensamentos e em

minhas atitudes

Ao prof. Dr. Luiz Carlos Jabur Gaziri, pela participação neste trabalho, e por toda orientação

durante minha vida acadêmica, “se enxerguei ao longe é por que estive sobre os ombros de

gigantes” (Isaac Newton).

Aos amigos Ivete Conchon Costa e Flavio Lauretti, “na vida não fazemos amigos, nós os

reconhecemos”, por todo incentivo e principalmente pela amizade sincera.

Aos amigos Pedro S. Raimundo Filho e Jesus Antonio Vargas, no auxílio constante e

principalmente pela amizade que foram além do compromisso profissional.

Aos amigos, Luiz Antonio Custódio e Eliana de Vito, pela participação e apoio durante esta

etapa.

Ao amigo Alexandre Saito pela constante colaboração nesta tese.

Aos estagiários Ana Carolina Vitor, Jean Alcântara de Freitas e Adriana Storer pelo apoio e

amizade.

À coordenação do curso de Pós-Graduação em Microbiologia, pelo constante apoio.

A Todos que de forma direta ou indireta me auxiliaram neste trabalho

LOYOLA, Wagner. Ação protetora de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia L.

contra infecção por Candida albicans através do aumento das funções de fagócitos. 2008.

52f. Tese (Doutorado em Microbiologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2008.

RESUMO

Este trabalho pesquisou os principais efeitos de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia

(EJ), na fagocitose e morte de Candida albicans, na produção de TNF-α e envolvimento com a

sobrevivência dos animais a um inóculo letal do fungo. Os macrófagos de animais pré-tratados

com EJ por 72 h foram co-incubados 1:5 leveduras de C. albicans (CR15) por 30 minutos a 37ºC.

A eficiência fagocítica foi de 68% de macrófagos fagocitantes na presença de soro, cuja atividade

fungicida reduziu 76% do inóculo de C. albicans. Esta ativação dos fagócitos pode ser explicada

pelo aumento significativo na produção de anion superóxido comparado ao de fagócitos de

animais controle (PBS). A atividade dos receptores foi pesquisada na presença de Manose (50

mM) e Manana (100µg) ou Laminarina (1mg). A eficiência da fagocitose aumentou

significativamente (52%) nos macrófagos de camundongos pré-tratados com JE 72 h antes dos

ensaios, contra 20% dos macrófagos controle. Este aumento foi reduzido a 34% na presença de

bloqueadores do receptor de manose (Manose mais Manana) e para 16% na presença de glucana

solúvel (laminarina), um inibidor do receptor Dectina-1. Os macrófagos pré-tratados com JE 72h

apresentaram aumento na produção de TNF-α após serem co-incubados com C. albicans, por 2h,

ação que foi inibida com a presença de laminarina durante os ensaios. Neste trabalho, avaliamos

também a ação do EJ na proteção contra candidíase, assim, animais pré-tratados 72h com o

extrato, apresentaram aumento na produção de TNF-α após 2h de infecção com C. albicans e

uma redução na concentração do fungo no exsudato peritoneal, fígado, baço e rim durante este

tempo. Estes resultados sugerem que EJ aumentou significativamente os níveis de TNF-α, a

atividade dos receptores de Manose, Dectina-1 e de Complemento, sendo estes processos

relacionados com maior atividade fagocítica e candidacida, o que possibilitou 90% dos animais

tratados com extrato sobreviverem a um inóculo letal de C. albicans versus 20% do controle.

Palavras-chave: Artocarpus. Testes microbiológicos. Fungos patogênicos. Microbiologia.

Candida albicans

LOYOLA, Wagner. Ação protetora de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia L.

contra infecção por Candida albicans através do aumento das funções de fagócitos. 2008.

52f. Tese (Doutorado em Microbiologia) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2008.

ABSTRACT

In this study we analysed the main receptors participating in phagocytosis of Candida albicans

and candidacidal mechanisms by macrophages from mice pretreated from Artocarpus integrifolia

seeds extract (jack extract). The animals’ macrophages pretreated with EJ for 72 h were co-

incubated 1:5 of C. albicans CR15 (yeast) for 30 minutes 37ºC. The phagocytic efficiency was

68% of macrophages from mice pretreated, in serum non-immune presence, whose fungicidal

activity reduced 76% C. albicans inoculum. This activation of phagocitic cells can be explained

by the significant increase in anion superoxide production comparative by animals control

phagocytes (PBS). The receptors activity was investigated in Mannose presence (50mM) and

Mannan (100mg) or laminarin (1mg). The phagocytosis efficiency increased significantly (52%)

in mice’s macrophages of pretreated with EJ 72 h before the assays, against 20% of the

macrophages control. This increase was reduced 34% in receptors presence of mannose

inhibitors, and from 16% in presence of Dectin-1 inhibitor laminarin. The macrophages

pretreated with EJ 72h had presented increase in production of TNF-α after be co-incubated with

C. albicans, for 2h, action that was inhibited with laminarin presence during the assays. In this

work, we also evaluate the EJ action in protection against candidiasis, thus, mice pretreated 72h

with extract before the infection, those had presented increase in production of TNF-α 2h of after

infection with C. albicans and a reduction in fungus concentration in exsudate peritoneal, liver,

spleen and kidney during this time. These results suggest that EJ increased significantly the TNF-

α levels, receptors Mannose activity, Dectin-1 and Complement, these processes related with

increased phagocytic and candidacidal activity and 90% of these mice survived versus 20% of the

control.

Keywords: Pathogenic fungi. Microbiology. Artocarpuses. Microbiological assay.

LISTA DE ABREVIATURAS

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana

SAPs – Aspartil proteinases

MAT – Matting locus

MTL – Like Matting locus

PMN – Leucócitos Polimorfonucleares

TLR – Receptores Toll Like

GM-CSF – Fator Estimulador de Colônia de Macrófagos e Granulócitos

MAPK – Proteína Mitógena Kinase

IFN-γ – Interferon gama

TNF-α – Fator de Necrose Tumoral alfa

PAF – Fator Ativador de Plaquetas

DTH – Hipersensibilidade do Tipo Tardia

JE – Extrato de Sementes de Artocarpus integrifolia (Jaca)

Con-A – Concanavalina A

IL-12, 10, 8, 1β, 6 – Interleucinas 10, 12, 8, 1β, 6

MHC II – Complexo de Histocompatibilidade Principal de classe II

MR – Receptor de Manose

VCAM – Moléculas de Adesão Celular Vascular

PRR – Receptor de Reconhecimento Padrão

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 10

1.1 C

ANDIDA ALBICANS E CANDIDÍASE

....................................................................................... 10

1.2 R

ESPOSTA IMUNE A CANDIDÍASE

......................................................................................... 15

1.2.1 Imunidade Inata .............................................................................................................. 15

1.2.2 Receptores da Resposta Imune Inata .............................................................................. 16

1.3 C

ÉLULAS

FETORAS

........................................................................................................... 18

1.3.1 Células Dendríticas......................................................................................................... 18

1.3.2 Neutrófilos...................................................................................................................... 19

1.3.3 Macrófagos ..................................................................................................................... 20

1.4 I

MUNIDADE

DAPTATIVA

................................................................................................... 22

1.5 E

XTRATO DE SEMENTES DE

RTOCARPUS INTEGRIFÓLIA

...................................................... 23

2 OBJETIVOS....................................................................................................................... 26

2.1 O

BJETIVO

ERAL

................................................................................................................ 26

2.2 O

BJETIVOS

SPECÍFICOS

..................................................................................................... 26

3 CONCLUSÃO..................................................................................................................... 27

REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 28

ARTIGO: Protection against Candida albicans infection by an extract of Artocarpus

integrifolia seeds through enhanced phagocyte functions.................................... 40

Abstract.................................................................................................................................... 40

Introduction ............................................................................................................................. 41

Materials and methods............................................................................................................. 41

Results ..................................................................................................................................... 43

Discussion................................................................................................................................ 44

References ............................................................................................................................... 45

Fig. 1........................................................................................................................................ 47

Fig. 2........................................................................................................................................ 48

Fig. 3........................................................................................................................................ 49

Fig. 4........................................................................................................................................ 50

Fig. 5........................................................................................................................................ 51

Table 1 ..................................................................................................................................... 52

1 INTRODUÇÃO

1.1 Candida albicans

E CANDIDÍASE

A importância das doenças fúngicas aumentou nas ultimas três décadas, devido

principalmente, ao aumento da população de indivíduos imunocomprometidos, incluindo

pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV), transplantados e portadores

de câncer (ROMANI, 2004; DAVIES et al., 2006).

As espécies de Candida em condições predisponentes podem expressar fatores

de virulência causando doenças conhecidas como candidíases (HUBE & NAGLIK, 2001). As

doenças causadas por esse fungo, podem variar desde infecções superficiais de pele e mucosa até

formas sistêmicas chamada de candidemia, podendo atingir órgãos profundos (ODDS, 1988;

ODDS 1994; CALDERONE & FONZI, 2001).

Candida são microrganismos integrantes da microbiota bucal do homem desde

o nascimento. Esta condição microbiológica propicia comumente uma relação de equilíbrio entre

o fungo e o hospedeiro, diante da manutenção da integridade das barreiras teciduais, relação

harmônica da microbiota autóctone e funcionamento adequado do sistema imunológico humano,

havendo em contrapartida por parte do fungo permanência equilibrada da capacidade de

aderência e de produção de toxinas e enzimas (CALDERONE & FONZI, 2001).

Das espécies pertencentes ao gênero Candida, a que mais causa infecções é a C.

albicans. Este fungo é dimórfico oportunista, freqüentemente isolado na cavidade oral, sistema

digestório e vagina de humanos e vários mamíferos (DIGNANI et al., 2003). Pode variar sua

forma de leveduriforme para filamentosa, sendo que durante este processo pode apresentar as

formas intermediárias de tubo germinativo e pseudo-hifa. Outras espécies não C. albicans, como

C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata entre outras, também tem capacidade de se

tornarem patogênicas (ODDS, 1994; ROILIDES et al., 1999; PAUL et al., 2007). Tanto as

formas leveduriformes como as filamentosas estão presentes nos sítios de infecção, sugerindo que

ambas contribuem para a patogenicidade do fungo (MITCHELL, 1998; CLEMONS &

STEVENS, 2001; HUBE & NAGLIK, 2001; DIGNANI et al., 2003).

A maior freqüência das infecções ocorre no tegumento, como: da pele, das

unhas e das mucosas do trato gastrintestinal, oral ou a vaginal. Cerca de 70% das mulheres

saudáveis terão algum caso de candidíase vaginal durante a vida, e 5% terão infecções recorrentes

(SOBEL et al. 1988; SOBEL et al., 1992). Porém, nos indivíduos com resposta imune deprimida

por câncer, transplantados ou com procedimentos cirúrgicos, este fungo poderá causar candidíase

sistêmica, podendo levá-los à morte. Aproximadamente 85% dos pacientes portadores do vírus

HIV terão pelo menos um caso de candidíase orofaríngea (BORG-VON ZEPELIN et al., 1999).

A limitação de nutrientes no tecido hospedeiro é um fator importante para a

atividade do patógeno. O microrganismo deve estar apto a realizar suas reações de catabolismo e

anabolismo, para poder sobreviver como um saprófita ou como um patógeno, na superfície dos

tecidos do hospedeiro. Quanto maior a expressão de genes que regulam estas duas vias, mais

competente será o patógeno. Desta forma C. albicans é capaz de crescer em extremos fisiológicos

de pH. Devido a esta habilidade este fungo pode causar infecções tanto na corrente sanguínea,

onde o pH é neutro, como na superfície de mucosas com pH ácido (CALDERONE & FONZI,

2001). Portanto, C. albicans está constituída geneticamente para se adaptar e sobreviver em

diferentes locais do organismo hospedeiro, capacidade que envolve fatores essenciais, tais como

moléculas de aderência do fungo a matriz extracelular do tecido hospedeiro, a produção de

fosfolipase, protease e elastase que podem lesar e impedir as defesas do hospedeiro (ROMANI,

2004). Em principio, a principal ação do microrganismo é sobreviver e reproduzir, sendo que, a

morte ou danos severos ao hospedeiro, constitui efeitos colaterais (HUBE & NAGLIK, 2001).

A aderência às células do hospedeiro é um pré-requisito para a colonização e

um passo essencial no estabelecimento de infecções. Neste processo, ocorre a combinação de

mecanismos específicos (adesinas) e não específicos (forças eletrostáticas, agregação e

hidrofobicidade) (COTTER & KAVANAGH, 2000; ANDRE et al., 2004). De acordo com

Masuoka et al. (1999), leveduras com características mais hidrofóbicas aderem-se com mais

facilidade às células epiteliais, proteínas da matriz extracelular e plástico, e são mais resistentes à

fagocitose. A fração protéica das manoproteínas, provavelmente, determina o padrão de

hidrofobicidade da parede celular, como demonstrado em estudos com anticorpos. As formas

filamentosas de C. albicans têm superfície mais hidrofóbica que as leveduriformes.

A parede celular de C. albicans é uma estrutura complexa e responsável pela

manutenção da forma celular, gradiente osmótico e regulação da permeabilidade. É formada por

várias camadas, e seu peso seco compõe-se de 47-60% de beta glucanas (β1-3; β1-6) e 10% de

quitina, imersas em matriz amorfa de polímeros de manose, as mananas (aproximadamente 40%

do peso seco), associadas covalentemente a proteínas em ligações N e O glicosídicas. Além disso,

a parede celular contém proteínas (6 a 25%) e uma porcentagem de lipídios (1 a 7%).

A produção de aspartil proteinases (SAPs) constitui um importante fator de

virulência. Estas enzimas são codificadas por um grupo de dez genes, sendo que cada enzima

SAP é codificada por um par de genes desta família gênica. As diferentes SAPs são expressas em

diferentes condições de crescimento em laboratório e durante infecções experimentais in vivo e in

vitro. A contribuição das SAPs para a patogênese da C. albicans tem sido demonstrada

claramente com a utilização de mutantes deficientes nestas enzimas e de inibidores de proteinases

(HUBE & NAGLIK, 2001). O fungo utiliza estas enzimas como artifício para obtenção de

nutrientes degradando estruturas do hospedeiro (imunoglobulinas, colágeno, albumina,

queratina), além de utilizá-las na evasão da resposta imune (De ANDRADE & FELIPE, 1992;

BORG-VON ZEPELIN et al., 1998; KOELSCH et al., 2000; Dos SANTOS et al., 2002).

A deleção de genes que codificam SAP1, SAP2 ou SAP3, de isolados de C.

albicans resultou em menor dano ao organismo do hospedeiro (SCHALLER et al., 1999), menor

aderência às células epiteliais bucais (WATTS et al., 1998) e menor virulência no modelo de

vaginite em ratos DE BERNARDIS et al., 1999). Nas infecções de mucosas a SAP3 foi

considerada a mais importante, enquanto em infecções profundas este papel é desempenhado

pelas SAPs 4 e 6 , as SAPs 7 e 8 também são importantes durante as infecções (NAGLIK et al.,

2003).

A virulência do fungo C. albicans não depende apenas de seu repertório

genético, mas também da condição imunológica do hospedeiro o qual desempenha papel

fundamental na progressão da doença (MITCHELL, 1998; MARTINEZ-SANCHEZ & PEREZ-

MARTINS, 2001). Estudos epidemiológicos demonstraram que patógenos deste grupo passaram

de oitavo lugar em causas de infecções nosocomiais, para quarto lugar. Este fato se deve

principalmente ao aumento do número de pacientes imunocomprometidos ou submetidos a

processos invasivos tais como aidéticos, transplantados, pacientes com ventilação artificial, em

uso de cateter venoso central ou alimentação parenteral (SENET, 1997; HUBE & NAGLIK,

2001). O uso de drogas imunossupressoras tais como, corticosteróides e drogas citotóxicas,

utilizadas em pacientes leucêmicos, portadores de linfoma ou outros tumores, assim como o uso

prolongado e indiscriminado de antibióticos de amplo espectro e utilização de técnicas invasivas

que abrem brechas para a invasão do fungo são fatores predisponentes.

Formas de reprodução sexuadas não eram observadas em laboratório ou em

isolados clínicos. A população de C. albicans era vista como uma grande estrutura clonal,

indicando predominantemente um modo assexuado de reprodução. O locus do genoma do fungo

S. cerevisiae que continha os genes responsáveis pela reprodução sexuada foi chamado de

matting (MAT) lócus e a região homóloga em C. albicans foi chamada de matting-type-like

(MTL) (JOHNSON, 2003). O locus em C. albicans (9kb) é muito maior do que em S. cerevisiae

(0,7kb) e contém muito mais genes. Em princípio, este tipo de reprodução poderia gerar o

aumento da diversidade genética durante um processo infeccioso. Porém, nem todos os fungos

resultantes desta variação genética sobreviveriam às condições encontradas no hospedeiro. Esta

idéia pode contribuir para o entendimento da estrutura clonal e da alta taxa de reprodução

sexuada encontrada em laboratório (JOHNSON, 2003).

C. albicans ao longo da história tem sido descrita como agente de doenças em

humanos. Hipócrates, Galen e Samuel Pepys já descreviam sintomas semelhantes aos das

infecções por este fungo. Porém, não existia em qualquer língua um termo técnico que definisse a

candidíase, atestando e difundindo seu reconhecimento (ODDS, 1988; CALDERONE, 2002).

Depois de vários anos a confusão taxonômica foi resolvida pelo projeto de classificação

codificado em 1923, definindo como Candida albicans. O nome deriva de Toga Candida, do

latim a expressão do manto branco que identificava os candidatos ao senado romano, e albicans,

gramaticamente devido à cor branca das lesões provocadas pelo fungo (ODDS, 1988).

Nos últimos anos vem ocorrendo aumento no número de relatos das infecções

invasivas causadas por Candida ssp. Em 1963 conheciam-se apenas cinco espécies de Candida

como causadoras de doenças em humanos, incluindo C. parapsilosis, C.tropicalis, C.

stellatoidea, C. guilliermondii. Atualmente, são conhecidas em torno de vinte espécies

pertencentes ao gênero Candida, capazes de causar micoses, sendo estas espécies de maior

interesse clínico (DIGNANI, 2003).

O estudo da história natural de pacientes com candidemia mostra que parte dos

episódios de fungemia tem caráter transitório e autolimitado, particularmente em indivíduos não

neutropênicos. Entretanto, não há dados clínicos e laboratoriais que permitam identificar com

segurança, quais episódios serão apenas transitórios e quais acarretarão quadro de candidíase

hematogênica disseminada com invasão do tecido de vários órgãos e sepse (COLOMBO &

GUIMARÃES, 2003).

Segundo Colombo (2000), outro aspecto relevante é que em alguns pacientes as

complicações infecciosas, documentadas em vísceras, aparecem semanas ou meses após o

episódio de candidemia como acontece com rinites e meningite causadas por Candida ssp.

Quando presente, a disseminação aguda da candidemia para órgãos (fígado, rim e pulmões), pode

também acometer pele e globo ocular. O padrão clínico mais freqüente de apresentação da

candidemia em adultos, resulta na presença de febre em pacientes com antibioticoterapia. A febre

pode ter início insidioso, ou apresentar-se de forma súbita, acompanhada de calafrios, mialgia,

taquicardia e hipotensão (DIGNANI et al., 2003).

Endoftalmites podem ocorrer em cerca de 10 a 30% dos casos, sendo esta

variação dependente das condições do hospedeiro (DIGNANI et al., 2003). C. albicans pode

infectar as estruturas oculares por disseminação hematogênica ou por inoculação direta, durante

cirurgia ocular. Os sintomas incluem perturbações visuais, escotomas e dor bulbar. As

anormalidades são caracterizadas por lesões na retina e no humor vítrio, manchas de Roth e

uveíte. Todas as estruturas oculares podem ser afetadas, porém quando ocorrem endoftalmites a

terapia é difícil e a incidência de seqüelas é alta (DIGNANI, 2002).

Segundo Carstedt et al. (2002), existe uma prevalência de fungos do gênero

Candida na cavidade bucal de crianças e adolescentes com síndrome de Down. Nessas crianças,

além das alterações anatomico-fisiológicas bucais, macroglossia, estagnação salivar decorrente da

incompetência muscular da boca, dificuldades motoras, constantes doenças respiratórias e

comprometimento simultâneo das respostas imunológica inata e adquirida, estes fatores

adicionais às tornem mais suscetíveis a processos infecciosos, incluindo os fúngicos, sendo as

espécies de Candida são os agentes etiológicos mais preponderantes (RONCARIO et al., 2002).

Agrega-se ainda a esta situação, a resposta imune celular e humoral. Linfócitos T e células NK

possuem suas atividades funcionais afetadas, nessas crianças. Níveis baixos de imunoglobulinas

IgG

e IgG

favorecem infecções microbiológicas, além da irregularidade fisiológica da

peróxido-dismutase comprometendo a defesa orgânica contra microrganismos (RIBEIRO et al.,

2002).

O envolvimento de sistema nervoso central ocorre com grande freqüência em

prematuros que desenvolvem candidemia. Nesta população, a investigação de meningite em caso

de candidemia é prioritária. Em adultos, a meningite por Candida ssp é geralmente decorrente de

contaminação durante procedimento neurocirúrgico, sendo poucas vezes documentadas como

complicação de candidemia. Entretanto, segundo dados obtidos em série de necropsias, pacientes

com sepse por Cândida ssp que evoluem para óbito apresentam lesões fúngicas no sistema

nervoso central em até 20% dos casos (FILLER & KULLBERG, 2003).

A antibioticoterapia prolongada e a quimioterapia podem causar modificações

na microbiota das mucosas, além de diminuir o número de leucócitos circulantes levando à

proliferação de C. albicans (HUBE, 2004; DAVIES et al., 2006). Os corticoterápicos promovem

modificações na rede de citocinas podendo afetar polimorfonucleares (PMN), macrófagos e as

principais atividades das células T prejudicando assim, a atividade antifúngica (NOHMI et al.,

1994; DAVIES et al., 2006).

O cateterismo pode causar lesões no tegumento e promover um substrato para o

desenvolvimento do fungo. Uma vez dentro do vaso sangüíneo o patógeno pode ser rapidamente

recoberto por fibronectina, plaquetas e outros constituintes do sangue. Estes fatores se constituem

em suporte para a colonização e proliferação do microorganismo, podendo ainda formar

biofilmes sobre superfícies plásticas como próteses dentárias, cateteres e sondas urinárias,

impedindo a ação dos antifúngicos (SENNET, 1997, COLOMBO et al., 2006; PHALLER &

DIEKEMA, 2007), além de dificultar o reconhecimento do fungo pelo sistema imune inato

(STICKLER & McLEAN, 1995).

1.2 R

ESPOSTA IMUNE A CANDIDÍASE

1.2.1 Imunidade Inata

Os mecanismos de defesa do hospedeiro podem influenciar tanto na

manifestação, como na severidade das infecções fúngicas. Deste modo, a forma clínica da doença

dependerá da resposta imune do paciente. Os mecanismos e a capacidade de defesa dos

organismos multicelulares contra o fungo evoluíram de sistema mais simples (imunidade inata),

até mecanismos mais sofisticados (imunidade adaptativa) de defesa dos hospedeiros vertebrados

(ROMANI, 2004).

As defesas antifúngicas inatas dos mamíferos são mediadas por células,

receptores celulares e vários fatores humorais. Fagócitos profissionais como neutrófilos,

macrófagos e células dendríticas possuem papel fundamental nesta defesa. Porém células NK,

linfócitos T e células não hematopoiéticas, tais como células endoteliais e epiteliais, também

participam no combate ao fungo (ROMANI et al., 2002). Esta resposta possui dois papéis

principais: ação antifúngica efetora levando a destruição do patógeno, por uma resposta imediata

às partículas fúngicas ingeridas, ou secreção de mediadores pró-inflamatórios, influenciando a

resposta imune adaptativa (VILLAMÓN et al., 2004). A atividade das células do sistema imune

inato pode ser ampliada através das de quimiocinas e citocinas ou anticorpos (ROMANI, 2004;

AKIRA et al.; 2006).

1.2.2 Receptores da resposta imune inata

Os mecanismos de defesa do hospedeiro são ativados após a infecção, e sua

ativação depende de um grupo de moléculas expressas constitutivamente pelo patógeno, que são

reconhecidos por um grupo de receptores que fazem o reconhecimento de moléculas padrões e

incluem os receptores de manose, receptores tipo “Toll” e receptores Dectina-1 (ROMANI, 2004,

BROWN, 2006). Após as interações com as moléculas padrões do patógeno, as células do

sistema imune do hospedeiro iniciam um amplo espectro de mecanismos de defesa tais como a

produção de peptídeos antimicrobianos e a produção de uma rede de citocinas e quimiocinas, o

que resulta no desenvolvimento de uma resposta inflamatória e na resistência à infecção (AKIRA

et al., 2006).

Receptores de manose reconhecem grande variedade de carboidratos (manose,

fucose, N-acetilglucosamina e glucose) presentes na superfície de microrganismos. Estes

receptores são expressos principalmente em macrófagos e células dendríticas, sendo

especialmente importante na fagocitose de C. albicans e promovem uma ligação entre as

respostas imune inata e adaptativa. A expressão aumentada de receptores de manose ocorre

devido ao fator estimulador de colônia-macrófago (M-CSF) (KARBASSI et al., 1987) e

interferon-γ (IFN-γ) (MARÓDI & JOHNSTON, 1993), o que tem melhorado a capacidade

fagocítica e candidacida de macrófagos (APOSTOLOPOULOS & McKENZIE, 2001).

Yamamoto et al. (1997) demonstraram que a fagocitose de levedura de C. albicans através do

receptor de manose resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β, IL-6 e fator

estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), degradação do fungo e

estímulo de moléculas co-estimulatórias, moléculas do complexo de histocompatibilidade

principal II (MHC II) e ativação de resposta celular protetora Th1.

Os receptores TLR-2 (receptor para fosfolipomanana) e TLR-4 (receptor para

lipopolissacarídeo e manana) são proteínas de membrana expressas na superfície de muitas

células (ATHMAN e PHILPOTT, 2004), sendo os principais receptores envolvidos na defesa

antifúngica (LEVITZ, 2004; POULAIN & JOUAULT, 2004; VILLAMÓN et al., 2005). Durante

a fagocitose os receptores TLR-2 e TLR-4 são ativados, através da sua ligação com componentes

das paredes celulares dos microrganismos, e recrutados para os fagossomos (UNDERHILL et al.,

1999; BLANDER & MEDZHITOV, 2006). A maturação do endossomo é mediada por sinais

gerados por receptores TLR, e transmitido ao núcleo do fagócito através da proteína adaptadora

MyD88 e da proteína mitógena Kinase (MAPK) p38, que resultam na ativação do fator NF-κB e

subseqüente transcrição de genes de citocinas pro-inflamatórias e antiinflamatórias (GIL e

GOZALBO, 2006).

A diferença no padrão de citocinas sintetizadas pode ser explicada através da

falha no envolvimento do receptor Dectina-1 para o reconhecimento de hifa, uma vez que a β-

glucana encontra-se encoberta na forma filamentosa, enquanto que na forma leveduriforme

devido à cicatriz deixada exposta pelo brotamento, que é rica em β-glucana, ocorre a interação

com Dectina-1 (GANTNER et al., 2005). A cooperação entre receptores para β-glucanas

(Dectina-1) e resíduos manosilados pelo receptor TLR-2, é responsável pela síntese de citocinas

pró-inflamatórias tais como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ (NETEA et al., 2006). O receptor

Dectina-1 é expresso principalmente em células de linhagem mielóide e reconhece

especificamente resíduos de β-glucana (BROWN & GORDON, 2001; BROWN, 2002; TAYLOR

et al., 2002).

1.3 C

ÉLULAS

FETORAS

1.3.1 Células Dendríticas

A localização estratégica das células dendríticas nos tecidos, superfície de

mucosas e pele sugere que estas células são as primeiras a iniciar uma resposta protetora contra

C. albicans. Estas células possuem uma atividade de apresentação de antígenos maior que as do

macrófago (NEWMAN & HOLLY, 2001). Quando imaturas, capturam uma molécula estranha e

migram ao órgão linfóide secundário mais próximo onde fazem a apresentação do antígeno ao

linfócito específico, influenciando na diferenciação de células precursoras em linfócitos

Th1(AUSTYN, 1992; ROMANI, 2004).

As células dendríticas possuem a capacidade de internalizar diferentes tipos

morfológicos de fungos, tanto a forma leveduriforme como filamentosa de C. albicans. O

reconhecimento e fagocitose de leveduras ocorrem principalmente por meio de receptores de

manose (MR), DC-SIGN e em parte CR3. Por outro lado a fagocitose de hifas ocorre de um

modo mais convencional (tipo zíper) e envolve a ação cooperativa de FcγR e CR3 (ROMANI et

al., 2002; ROMANI, 2004). A fagocitose de ambas as formas pelas células dendríticas não requer

TLR-2, TLR-4, TLR-9 ou MYD88 (BELLOCCHIO et al., 2004).

A interação de células dendríticas e o fungo através de diferentes receptores

resultam em formas diferentes de sinalização e conseqüentemente diferentes perfis de citocinas.

O reconhecimento de leveduras de C. albicans através de MR promove a produção de citocinas

pró-inflamatórias, aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias e MHC de classe II. A

ligação de células dendríticas com hifas opsonizadas, através de C3b ou anticorpos, leva à

produção de citocinas IL-4 e IL-10, aumento da expressão de moléculas MHC II e ativação de

células Th2 (ROMANI, 2004).

1.3.2 Neutrófilos

Neutrófilos desempenham um importante papel na prevenção de doenças

fúngicas em hospedeiro vertebrados. Alterações nas funções deste fagócito facilitam a

disseminação de C.albicans (WALSH et al., 1990; FRADIN et al., 2005). Os neutrófilos

constituem a primeira linha de defesa contra microrganismos invasivos. Porém, in vivo, o papel

dos reagentes oxidativos produzidos por estes fagócitos não está bem determinado. A

mieloperoxidase (MPO) uma enzima produzida por neutrófilos, catalisa reações do peróxido de

hidrogênio com o íon cloro para produzir o ácido hipocloroso, que é utilizado pelos fagócitos

para matar microrganismos (PHAM, 2006). Animais nocaute em MPO (MPO-KO) apresentaram

uma redução significativa na sua atividade candidacida, indicando que o sistema oxidativo

dependente da MPO é um importante mecanismo de defesa. Loyola et al. (2002), demonstraram

que a adição de catalase, além de degradar H

impede a sua utilização pela MPO, diminuindo

consideravelmente a capacidade candidacida de neutrófilos e depuração do fungo dos órgãos

infectados.

Indivíduos com doença granulomatosa crônica apresentam sinais clínicos

precoce de candidíase (ARATANI, 2006). Neutrófilos possuem ainda mecanismos microbicidas

não dependentes de oxigênio. Estes mecanismos envolvem as enzimas lisossomais, que são muito

importantes nos tecidos onde a concentração de oxigênio é baixa e a cadeia respiratória não pode

funcionar efetivamente. Dentre as hidrolases lisossomais podemos citar as peroxidases como a

lactoperoxidase (TAYLOR et al., 2005).

Uma importante ação imunoregulatória tem sido atribuída aos neutrófilos,

células que estão envolvidas com a produção de citocinas tais como IL-10 e IL-12. Neutrófilos

podem produzir IL-12 bioativa, que é capaz de induzir a diferenciação de linfócitos precursores

em linfócitos do grupo Th1 com ação antifúngica (CASSONE et al., 1997; MENCACCI et al.,

1998 a; CENCI et al., 1998). Estudos demonstraram que a produção de IL-10 ocorre em infecção

por cepas virulentas, e a neutralização de IL-10 pode promover aumento na resistência a C.

albicans (ROMANI, 2004). Gasparoto et al. (2004), demonstraram que a infecção por C.

albicans (CR1) induziu a apoptose de fagócitos e promoveu aumento nos níveis de IL-10 depois

de 24 h de infecção, tempo em que ocorreu o aumento de neutrófilos no exudato peritoneal. O

tratamento de C. albicans com pepstatina (inibidor de proteinase) previniu o processo de

apoptose e reduziu significativamente a produção de IL-10, sugerindo que o aumento da

produção de citocina foi decorrente da ação de enzimas produzidas pelo fungo.

A presença de neutrófilos no local da infecção por pré-tratamento de

camundongos com Con-A 6 h antes da infecção com C. albicans, aumentou a população de

neutrófilos peritoneais, resultando em uma maior depuração do fungo na cavidade peritoneal,

confirmando a importância desta população de fagócitos na defesa contra infecções fungicas

(LOYOLA et al. 2002).

1.3.3 Macrófagos

As respostas anti fúngicas pelas células efetoras incluem morte e inibição de

crescimento do fungo. Em geral as células fagocíticas possuem atividade antifúngica intrínseca

que pode ser potencializada por opsoninas (anticorpos, C3b, iC3b) ou citocinas derivadas de

células T, o que indica que as respostas imune inata e adaptativa não funcionam de forma

independente, mas são reciprocamente reguladas (ROMANI, 2002; HUFFNAGLE, DEEPE,

2003).

A ativação dos macrófagos residentes confere ao hospedeiro maior resistência a

infecções. Um macrófago ativado difere do residente em vários aspectos, como mudanças

morfológicas, expressão de receptores na superfície celular, com aumento de reagentes oxidativos

, 0

, OH

) e nitrogenados (NO

), e consequentemente um aumento da atividade microbicida

e produção de citocinas. Em geral, macrófagos ativados fagocitam e matam microrganismos mais

eficientemente que macrófagos residentes. In vivo, a ativação de macrófagos ocorre

principalmente através da interação com linfócitos T e é mediado por citocinas tais como

interleucinas 1 (IL-1), 6 (IL-6) e 8 (IL-8), fator estimulador de colônias de macrófagos e

granulócitos (GM-CSF) e fator de necrose tumoral α (TNF-α) que podem estimular outras

células ou os próprios macrófagos em uma atividade autócrina (MARÓDI et al., 1991;

LANGERMANS et al., 1992; MURPHY et al., 1998).

A citocina IFN-γ é essencial para a resistência a infecções fúngicas. Pode ativar

as funções fungicidas de macrófagos, restabelecendo a resposta imune celular em indivíduos

imunodeprimidos (VÁSQUEZ-TORRES & BALISH, 1997). Macrófagos e neutrófilos ativados

por IFN-γ podem produzir a interleucina 12 (IL-12), que é indicadora da resposta protetora contra

infecções fúngicas, além de ser necessária para uma resposta celular eficiente (CENCI et al.,

1998; KASHINO et al., 2000). A adição de anticorpo monoclonal anti-IFN-γ inibiu a produção

de NO

, diminuindo a atividade anti-fúngica dos macrófagos (ROACH & BLACKWELL,1992;

NASCIMENTO et al., 2002; FILLER et al., 2005).

TNF-α desempenha papel importante na defesa do hospedeiro contra infecções

por C. albicans. Esta citocina é produzida em resposta a infecções fúngicas, principalmente por

macrófagos, e estimula a síntese de quimiocinas e moléculas de adesão por estes fagócitos (as

quais são essenciais para o recrutamento de neutrófilos), além de possuir ação estimuladora sobre

a atividade candidacida destas células. Em camundongos o aumento na produção de TNF-α

ocorre durante as primeiras 12 h após a infecção e está correlacionado ao acúmulo de grande

número de leucócitos no sítio da infecção (CANNOM et al., 2002; FILLER et al., 2005).

Camundongos deficientes em TNF-α e linfotoxinas desenvolvem uma resposta Th2 para as

infecções por C. albicans e apresentam altos níveis de IL-4 e IL-10 (MARINO et al., 1997;

MENCACCI et al., 1998). A sobrevivência dos animais TNF/LT

-/-

foi menor e correlacionada a

um aumento do fungo nos órgãos (NETEA et al., 1998), enquanto os camundongos heterozigotos

(TNF/LT

+/-

) com fenótipo intermediário tiveram uma taxa de mortalidade de 60% em 20 dias de

infecção. Em outros estudos a neutralização do TNF-α através da utilização de anticorpos

policlonais anti-TNF-α murino causou o crescimento do fungo no rim e baço e acelerou a morte

após infecção endovenosa (LOUIE et al., 1994; FILLER et al., 2005).

Conchon-Costa e colaboradores (2007), demonstraram que camundongos pré-

tratados com Con-A apresentaram aumento na produção de TNF-α 2 h após a infecção por via

intraperitoneal, quando comparado aos animais controle. A elevação precoce na produção de

TNF-α demonstra o aumento da capacidade de síntese de citocinas pró-inflamatórias pelos

fagócitos peritoneais tratados com a lectina, fato que aumentou a resistência à infecção fúngica.

Esta ativação resultou na taxa de sobrevivência de 100% dos animais pré-tratados em relação aos

controles, quando expostos a um inóculo letal e diminuiu a concentração de C.albicans nos

órgãos (baço fígado e rim) no decorrer da infecção.

A citocina TNF-α pode estimular também a expressão de outras moléculas

envolvidas na defesa do hospedeiro contra infecções por C. albicans. Entre estas moléculas

incluem-se as moléculas de adesão E-selectinas e VCAM-1, IL-8, fator ativador de plaquetas

(PAF) que estão relacionadas à adesão e do recrutamento de leucócitos. IL-8 além de ser um

potente fator quimiotático para neutrófilos, que inicia a ativação destes fagócitos aumentando a

sua capacidade candidacida (FILLER et al., 2005, OROZCO et al., 2000).

A atividade fagocítica de macrófagos e neutrófilos podem ser estimuladas

também pela ação de lectinas de origem vegetal. É o caso da concanavalina A (Con-A), que atua

sobre linfócitos aumentando sua secreção de IFN-γ (BERTRAM et al., 1997) e da KM

, obtida da

semente de jaca (Artocarpus integrifólia), que atua diretamente sobre as células fagocíticas

aumentando a secreção de IL-12 (PANUNTO-CASTELO et al., 2001).

Estudos demonstraram que o pré-tratamento com lectinas aumentou

significativamente o número de fagócitos na cavidade peritoneal de camundongos, e da

capacidade candidacida dessas células, além da expressão de receptores de manose (FELIPE et

al., 1995; GAZIRI et al., 1999; LOYOLA et al., 2002; CONCHON-COSTA et al., 2007). A

associação destas ações sobre os fagócitos peritoneais de camundongos pré-tratados com Con-A

96 h antes da infecção resultou na eliminação de 80% do inóculo de C. albicans e na expressão

máxima dos receptores de manose (LOYOLA et al., 2002). A fagocitose foi inibida em 50% após

a adição de manana (50µg) e manose (50mM), sugerindo que esta atividade teve a participação

dos receptores de manose (GAZIRI et al., 1999).

1.4 I

MUNIDADE ADAPTATIVA

A resistência a candidíase está correlacionada com a detecção de resposta

imune celular e a presença de hipersensibilidade tardia (DTH). Observações clínicas sugerem que

citocinas Th2 podem ser produzidas em resposta a antígenos de C. albicans em diferentes

estágios da doença, incluindo infecções sintomáticas e doenças imunológicas. Este fato implica

que a produção de citocinas do padrão Th1 está associada a indivíduos sadios e portadores de

leveduras saprófitas, enquanto que a produção de citocinas Th2, está correlacionada com a

manifestação da doença fúngica.

Os linfócitos com fenótipo 1 (Th1) produzem as citocinas pró-inflamatórias

como interleucina 2 (IL-2) e IFN-γ, e os linfócitos com fenótipo 2 (Th2) produzem citocinas

antiinflamatórias como interleucinas (IL)-4, 5, 10 e 13. Pacientes com infecção disseminada

apresentam uma resposta imune celular diminuída, anergia de DTH e níveis aumentados de

citocinas Th2 (IL-4 e IL-5), IgE IgG4 e IgA e eosinofilia a qual é um marcador característico

para micoses disseminadas. As citocinas Th2 como IL-10 possuem uma relação inversa na

produção de citocinas Th1 tais como IL-12 e IFN-γ. Altos níveis de IL-10 estão associados com o

bloqueio na produção de IFN-γ e aumento na suscetibilidade a candidíase sistêmica (CALICH et

al., 1998).

O predomínio de células Th1 pode resultar na produção de citocinas que

estimulam a atividade citotóxica das células efetoras, enquanto que as células Th2 produzem

citocinas que desativam tais atividades e estimulam a produção de anticorpos. Entretanto, a

combinação de citocinas dos diferentes grupos como IFN-γ e IL-4, ou IL-10 e IL-12 é necessária

para que ocorra uma proteção eficiente contra a infecção por fungos, indicando a existência de

um complexo circuito imunoregulatório (ROMANI et al., 1997; STEVENS, 1998; SPELLBERG

& EDWARD Jr, 2001; SU et al., 2007).

1.5 E

XTRATO DE SEMENTES DE

Artocarpus integrifólia

As interações proteína-carboidrato são utilizadas para a comunicação

intracelular. As lectinas são proteínas inicialmente identificadas em vegetais, e que se ligam

especificamente a uma grande variedade de carboidratos presentes na superfície de células de

mamíferos. Devido a esta alta afinidade as lectinas vegetais são utilizadas para identificação,

purificação e estimulação de glicoproteínas específicas na superfície de células humanas. A

compreensão das bases moleculares da interação lectina-carboidrato e as sinalizações

intracelulares envolvidas neste processo prometem o desenvolvimento de novas drogas para o

tratamento de infecções, processos inflamatórios e doenças malignas (SHANMUGHAM et al.,

2005).

e jacalina são lectinas extraídas da semente de jaca (Artocarpus

integrifolia), estruturalmente relacionadas, porém apresentam distintas ações biológicas e

especificidade na ligação aos carboidratos. A jacalina liga-se à D-galactose e possui alta

afinidade por glicoproteínas que possuam resíduos α-D-galactosil (HORTIN & TRIMP, 1990).

liga-se a D-manose e exibem alta afinidade a trissacarídeos presentes no centro de cadeias

de oligossacarídeos de glicoproteínas (Manα1-3[Manα1-6] Man) (RANI et al., 1999). Rosa et al.

(1999) estudaram esta especificidade na ligação a carboidratos apresentada pelas lectinas da

semente de A. integrifólia, e demonstraram que jacalina e KM

compartilham 52% de homologia.

Porém, KM

não sofre clivagem pós-transcricional em duas cadeias, em contraste com a jacalina,

conservando um ligante rico em glicina, o qual consegue discriminar a ligação entre manose e

galactose. Em termos de ação biológica, jacalina induz a secreção de IL-6 por células

monocíticas U937 (TAIMI et al., 1994) e potencializa a resposta humoral a trinitrofenol e

Trypanosoma cruzi em ratos (ALBUQUERQUE et al., 1999). KM

, por sua vez tem sido usado

com instrumento para estudar a haptotaxia da migração de neutrófilos em ratos (SANTOS-DE-

OLIVEIRA et al., 1994).

A jacalina (JCA) presente no extrato bruto das sementes de A. integrifolia

possui forte ação mitogênica sobre monócitos e linfócitos T CD4

humanos, porém esta ação não

foi observada em células B (BUNN-MORENO & CAMPOS-NETO, 1981). Esta lectina é

utilizada como diagnóstico e purificação de IgA devido a sua capacidade de ligação específica

com cadeias pesadas presentes neste tipo de imunoglobulina (AUCOUTURIER et al., 1981). JCA

é uma lectina multimérica capaz de se ligar a moléculas CD4 presentes nas superfícies de células

T humanas, sendo que esta ação pode bloquear a ligação do HIV aos linfócitos através da

glicoproteína (gp) 120 presente na superfície do vírus (CORBEAU et al., 1990).

Além da ação bloqueadora da ligação de lectina como JCA e moléculas co-

estimulatórias CD4, estudos recentes têm demonstrado que a ligação JCA-CD4 pode disparar a

sinalização intracelular levando a síntese de citocinas como a interleucina 6 (IL-6) (LAFONT et

al., 1997). Taimi et al. (1994) demonstraram, utilizando linhagens de células

promielomonocíticas (U937), que a estimulação destas células por JCA produziu dez vezes mais

IL-6, do que a estimulação por lipopolissacarídeos bacterianos.

As lectinas são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular como a

laminina. A ligação da KM

à laminina promove o processo de haptotaxia em modelo in vivo, ou

seja, promove a atração de leucócitos da corrente sangüínea para os tecidos. Diferente da

quimiotaxia, na qual os sinais que atraem os leucócitos estão na forma solúvel, na haptotaxia

estes sinais permanecem ligados à superfície de células endoteliais, membrana basal e tecido

conjuntivo. A interação de lectinas com laminina pode contribuir para a formação de um

gradiente haptotático requerido para a indução da migração dos neutrófilos (PEREIRA-DA-

SILVA et al., 2006).

Estudos demonstraram que KM

exerce ação estimulatória na indução da

migração de neutrófilos, através do reconhecimento de resíduos de manose presentes nos

receptores para quimiocinas CXCR2, expressos na superfície de neutrófilos e monócitos

inflamatórios, porém não em macrófagos residentes. Esta interação resulta na ativação de

neutrófilos é demonstrado, pelas mudanças morfológicas destas células, acompanhadas da

internalização do complexo KM

/ligante. A participação de açucares como ligantes a receptores

na superfície de neutrófilos abre novos caminhos para potencializar ou inibir reações

inflamatórias (PEREIRA-DA-SILVA et al., 2006), induzindo efeitos protetores contra patógenos

que são susceptíveis a resposta imune mediada por citocinas Th1 (PANUNTO-CASTELO et al.,

2001).

Uma complexa cooperação de diversos receptores PRR é necessário para a

defesa do hospedeiro contra infecção fúngica, envolvendo diversas moléculas na superfície dos

fungos que são reconhecidas por receptores na superfície de células da resposta imune inata e que

disparam a produção de citocinas e ativação de linfócitos T. Baseado nos conhecimentos prévios

utilizamos o modelo de candidíase experimental, para esclarecimento de mecanismos protetores

induzidos por lectinas (KM+ e jacalina), presentes no extrato de semente de Artocarpus

integrifolia.

2 OBJETIVOS

2.1 O

BJETIVO

ERAL

Ação de extrato de sementes de Artocarpus integrifolia na resposta imune de

camundongos Swiss, no curso de infecção com Candida albicans.

2.2 O

BJETIVOS

SPECÍFICOS

Subgrupos de camundongos Swiss tratados com PBS ou extrato de sementes de

Artocarpus integrifolia foram analisados com relação aos seguintes aspectos:

1- Efeito do tempo de tratamento com extrato de sementes de Artocarpus

integrifolia sobre a atividade fagocítica e candidacida de fagócitos peritoneais;

2- Produção de anion superóxido por fagócitos após fagocitose de C. albicans;

3- Atividade de receptores de manose, complemento e receptor Dectina-1 na

fagocitose de C. albicans e sinalização para a síntese de TNF-α;

4- Concentração de TNF-α produzida por fagócitos peritoneais em ensaios

fagocíticos in vitro e no sobrenadante de células da cavidade peritoneal e de fígado no curso da

infecção.

5- Unidades formadoras de colônia (UFC) no fígado, baço, rim e exsudato

peritoneal no curso da infecção com C. albicans;

6- Sobrevivência dos animais infectados com dose letal de C. albicans;

7- Análise de atividade de alanina aminotransferase (ALT) no plasma de

animais infectados.

3 CONCLUSÃO

O extrato de sementes de Artocarpus integrifolia foi eficiente em ativar

macrófagos peritoneais murinos aumentando sua capacidade fagocítica e candidacida, sendo que

esta ação foi significativamente aumentada nos macrófagos de animais pré-tratados por 48 a 96 h

antes dos ensaios fagocíticos. Este aumento está correlacionado com a expressão dos receptores

de manose, Dectina-1 e para frações C3b e iC3b do sistema complemento, indicado pelo aumento

da porcentagem de células fagocitantes comparado ao controle. Dentre os receptores estudados o

receptor para β-glucana (Dectina-1) foi o mais importante no reconhecimento e na internalização

de leveduras, o bloqueio deste receptor resultou na diminuição da produção de TNF-α e na

porcentagem de macrófagos fagocitantes. Estes resultados sugerem que o receptor Dectina-1

além de fazer o reconhecimento do patógeno, pode estar também relacionado com a sinalização

para a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Além desta ação, os fagócitos peritoneais

demonstraram maior capacidade de produzir substâncias microbicidas tais como anion

superóxido, resultando em menor concentração do fungo nos órgãos tais como fígado, baço, rim

além da cavidade peritoneal, o que poderia explicar 90% de sobrevivência destes animais ao

inoculo letal de C. albicans versus 20% do grupo tratado com PBS. Infecções oportunistas são

mais freqüentes em pacientes imunocomprometidos, grupo de indivíduos que vem aumentando

muito nos últimos anos. A ativação das células efetoras não só aumenta o reconhecimento e a

destruição do patógeno, mas também a síntese de citocinas pró-inflamatórias, demonstrando uma

ação imunoregulatória de macrófagos e neutrófilos, sendo que este grupo de citocinas pode

induzir a diferenciação de linfócitos T precursores em células do tipo Th1, o que resultaria no

aumento da resistência do hospedeiro às infecções fúngicas.

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ARTIGO

Protection against Candida albicans infection by an extract of Artocarpus integrifolia seeds through enhanced

phagocyte functions.

Wagner Loyola

, Ivete Conchon-Costa

, Jean Alcantara Freitas

, Luis Carlos Jabur Gaziri

, Auro Nomizo

, João Santana

Silva

, Ionice Felipe

. Departments of Pathological Sciences

and Physiological Sciences

, Londrina State University,

São Paulo State University

, Brazil.

Abstract

Macrophage activation by an Artocarpus intergrifolia seed extract protected mice against experimental Candida albicans

infection. Regarding this protective effect, the receptors for phagocytosis and candidacidal mechanisms was investigated.

Peritoneal macrophages were coincubated with C. albicans (yeast) for 30 min. Phagocytosis efficiency by macrophages

from mice pretreated for three days with jack extract was significantly enhanced, achieving 68% in presence of serum.

Phagocytosis in absence of serum was reduced from 52% to 34% (P<0.05) in the presence of mannose plus mannan and

from 52% to 16% (P<0.01) in the presence of dectin-1 inhibitor, laminarin, whereas only 20% of control macrophages

phagocytozed yeast cells. TNF-α production was significantly greater both in vitro and in vivo in mice pretreated with

jack extract, in relation to assays conducted in the presence of laminarin or controls. C. albicans clearance was faster in

mice pretreated with jack extract and 90% of these mice survived an otherwise lethal inoculum of this fungus. These data

indicate that jack extract enhanced macrophage functions, as shown by the greater participation of complement, dectin-1

and mannose receptors on phagocytosis, the improved capacity to kill the pathogen by triggering TNF-α production and

superoxide anion secretion and reducing the fungal burden in organs.

Key words: Artocarpus intergrifolia, Candida albicans, lectin receptors, phagocytosis, TNFα.

Correspondence: Ionice Felipe, Departamento de Ciências Patológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina,

Paraná, Brazil, 86051-990. Tel:+51 43 3371-4267; e-mail:[email protected]

Introduction

Candida albicans causes infection ranging from mucocutaneous to systemic infection in immunocompromised hosts and

in patients who undergo major surgical procedures (Garber, 2001). Under such conditions, C. albicans express several

virulence factors that contribute to pathogenesis, such as adherence to host cells, the ability to form germ-tubes and

hyphae, secreted aspartyl proteases and phospholipases and phenotypic switching (Soll, 2002; Calderone & Fonzi,

2001;Vargas et al., 2000).

Neutrophils are extremely important against systemic infection caused by C. albicans, as shown by the fact that

neutropenic patients are highly susceptible to fungal infection; macrophages also play an important role in the cellular

defenses against candidiasis (Lilic et al., 2003;Roilides & Walsh, 2004). Strategies that promote an increase in phagocytic

functions have been used. Thus, GM-CSF increases the fungicidal activity of human neutrophils against pseudohyphae

and of human monocytes against C. albicans blastoconidia and has been used in patients presenting neutropenia after

chemotherapy for acute myelogenous leukemia (Buchner et al., 1991). Several proinflammatory cytokines, such as TNF-

α, IL-1β, IL-6, and IFN-γ are produced by neutrophils, monocytes and macrophages after recognition of molecular

patterns on the surface of C. albicans. It has been suggested that mannan from C. albicans can be recognized by mannose

receptors or by TLR4 and that phospholipomannan interacts with TLR2, whereas β-glucans are recognized by a complex

of dectin-1 and TLR2, which triggers the induction of microbial killing and constitutes the first step in the activation of

the innate immune response (Brown & Gordon, 2003; Gantner et al., 2003; Netea et al., 2006)

Certain biological response modifiers, such as plant lectins, induce cytokine production, among these are those

related to the Th1 response, such as interferon-γ (IFN-γ ) (Panunto-Castelo et al., 2001) and IL-12 (Muraille et al., 1999).

The authors previously observed that pretreatment with concanavalin-A (Con-A) protected the experimental animals

against a lethal C. albicans inoculum by increasing phagocytosis through complement and mannose receptors (Gaziri et

al., 1999; Moresco et al., 2002; Loyola et al., 2002). This process of macrophage activation was dependent on Th1 cells

releasing IFN-γ, because Con-A binds directly to carbohydrates in MHC molecules and T cell receptors on T helper cells

(Bertranm et al 1997) and presents no direct action on macrophages. TNF-α production was observed after infection with

C. albicans in the peritoneal cavity, liver and spleen and correlated with decreased fungal burden in the organs, a finding

not observed in control mice. Moreover, 100% of mice infected three days posttreatment survived versus 20% of the

control group (Conchon-Costa et al., 2007).

In contrast, information concerning immune system activation by an A. integrifolia extract is not completely

understood. A. integrifolia extract is known to contain two lectins, jacalin and KM+. Jacalin induces IL-6 secretion by

U937 monocytic cells (Taimi et al., 1994) and potentiates mouse humoral immune response to Trypanosoma cruzi

(Albuquerque et al., 1999). KM+ has been reported as tool for multiple biomedical applications, including the induction

of neutrophil migration (Pereira da Silva et al., 2006) and the induction of IL-12 production by macrophages, which then

stimulate IFN-γ by lymphocytes (Panunto-Castelo et al., 2001). However, advances in these studies are often limited by

the difficulty in obtaining sufficient quantities of jacalin-free KM+ through direct seed extraction. Studies regarding

cDNA cloning and the functional expression of KM+ are in progress. In this work, the protective mechanisms of jack

extract against a lethal infection with C. albicans was investigated by analyzing receptors for phagocytosis, fungicidal

mechanisms, TNF-α production and Candida

clearance from mouse organs.

Materials and Methods

Candida albicans culture

C. albicans strain CR15 was isolated from the oral mucosa of an HIV-infected individual at the Londrina State University

hospital and maintained on Sabouraud dextrose agar; the isolate was used after two serial animal passages. After growth

in Sabouraud dextrose broth for 24h at 28°C, C. albicans yeast cells were cytospun, washed with phosphate-buffered

saline (PBS) and resuspended at 2 X 10

, 10

or 10

cells ml

-1

RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, MO, USA). The yeast

cells were also inactivated by heating for 1 h at 60°C, for evaluation of TNF-α in phagocytic assays.

Extract from Artocarpus integrifolia seeds

A. integrifolia aqueous extract was prepared in the following manner: the seeds of jackfruit were collected, washed in

water, and dried for 24 h at 37°C. Five hundred grams of dried seeds were ground and added to five liters of phosphate

buffered saline (PBS) 0.01M, pH 7.2.The mixture was incubated for 24 h at 4ºC, followed by centrifugation at 2000x G

for 20 min in a Sorvall RC2B centrifuge. The supernatant was collected and dialysed against several changes of PBS for

48 h. This crude extract that contains the lectins (jacalin and artocarpin/KM+) was sterilized by Millipore filtration and

stored in aliquots in a -70ºC freezer. The protein concentration was measured by Bradford method using bovine serum

albumin as standard.

Treatment and infection of mice

Subgroups of four male Swiss mice, each weighing 28-32g, received extract from A. integrifolia seeds (jack extract)

containing 500 µg protein ml

-1

PBS intraperitoneally (ip) or PBS only and after 6 to 72 h were sacrificed to obtain

peritoneal phagocytic cells. Mice (10 per group) received jack extract or PBS ip and the survival of mice postinfection

with a lethal dose of C. albicans (10

-1

PBS) ip was observed for a follow-up period of 28 days.

Phagocytosis assays

Mice were sacrificed after pretreatment with jack extract or PBS and the exudate cells were immediately diluted to 4 x10

cells ml

-1

in RPMI containing 5% fetal calf serum and 70µg of gentamicin (CM) and incubated on coverslips for 1h at

37°C. After washing the cells to remove nonadherent cells, 2 X 10

-1

phagocytes in CM were coincubated with 2 X

-1

C. albicans in CM for 30min at 37°C. Opsonization was performed by adding 2.5% of fresh nonimmune mice

serum to C. albicans for 5 min at 37°C before coincubation with phagocytes. A total of 200 phagocytes were analyzed for

each preparation and the percentage of phagocytes that phagocytozed Candida were counted after staining the cells with

May-Grunwald-Giemsa.

Quantification of superoxide anion (O

) production

Superoxide generation by phagocytes was quantified by SOD-inhibitable reduction of ferrocytochrome c (type III;

Sigma) as previously described by Schnur & Newman (1990). Phagocytes (2 X10

) were incubated for 1h at 37°C with

opsonized or nonopsonized Candida cells 1:1, in Krebs Ringer phosphate buffer with 0.2% dextrose containing 80 µM

cytochrome c. Control wells contained cytochrome c without Candida (resting cells) or Candida plus 40 µg of SOD/ml.

The supernatants were collected by centrifugation at 4°C at the end of incubation. Absorbance of the supernatants at

550nm was measured in a Varian spectrophotometer, and the background absorbance in control tubes containing only

buffer and cytochrome was subtracted. All experiments were performed in triplicate and the results were calculated as

nanomoles of O

using E550= 2.1x10

-1

. The results are expressed as nanomoles of reduced cytochrome c per

2x10

cells per hour.

Candidacidal assays

Phagocyte candidacidal activity was assayed as previously described by Loyola et al. (2002). Briefly, 4 X 10

exudate

cells were plated (0.2ml /well) for 1h at 37°C and coincubated with 2 X 10

yeast cells in 0.8ml of CM for 30 min at

37°C. Sterilized double-distilled water (1ml) containing 0.5% triton X 100 (Pharmacia) was added to the wells for 10

min. Serial 10-fold dilutions from each well were realized in PBS. Aliquots (100µl) were plated on Sabouraud agar and

the number of colony forming units (CFUs) was determined 24h after incubation at 37°C. The percentage of CFU

reduction (mean ± S.D.) was determined as follows: percentage of CFU reduction = 100- (CFUs experimental

group/CFUs control cultures) x 100. C. albicans incubated with no effector cells were used as controls. The results

represent the average of four independent experiments and two replicates per mouse.

Receptor analysis

To study dectin-1, a receptor that binds β-glucans from yeast cell bud scars, the method used by Gantner et al. (2003) was

followed; peritoneal macrophages were preincubated with laminarin (Sigma) 1mg ml

-1

CM for 30min. To study mannose

receptors, the macrophages were preincubated with 9µg mannose plus 100µg mannan (Loyola et al., 2002). The

inhibitors were maintained in the medium and 2 X 10

C. albicans were added for 30min at 37°C. A total of 200

phagocytes were analyzed for each preparation and the percentage of phagocytes that presented phagocytozed Candida

were counted after staining the cells with May-Grunwald-Giemsa. The mice received 500µg ml

-1

jack extract in PBS or

PBS alone 72 h before phagocytic assays.

Quantification of viable C. albicans in exudate and organs

The liver, spleen, and kidneys of infected mice were each homogenized with 10, 5 and 5 ml of PBS

respectively. Samples (100µl) were collected after dilutions for each organ or exudate and were plated on Sabouraud

dextrose agar plates (Conchon-Costa et al., 2007). The colonies were counted after 24 h of incubation at 37°C and

CFUs were calculated per organ or milliliter of exudate.

TNF-α assays

Supernatants from peritoneal exudate and homogenized organs were collected by centrifugation of samples from each

mouse from all groups and submitted to capture enzyme–linked immunosorbent assay (ELISA) using purified antimouse

TNF-α (IF3F3D4, from Bioscience). The cytokine concentration was determined with reference to a standard curve for

serial two–fold dilutions of mouse recombinant TNF-α; optical absorbance was measured at 492nm.

Determination of alanine aminotransferase

Alanine aminotransferase (ALT) activity was determined with the kinetic UV test recommended by the

International Federation of Clinical Chemistry. The test was first described by Bergmeyer et al. (1978). ALT activity

was determined with the Dade Flex cassette System (Dade Behring Inc, Newark, USA) using a Dade Behring

Dimension Clinical Chemistry System.

Statistical analysis

Statistical differences were determined using the Student t test. Survival rates were estimated by Kaplan-Meier curves

and analyzed by the log rank test. P values <0.05 were considered statistically significant.

Results

Effect of jack extract administration on the activities of phagocytic cells

The percentage of peritoneal macrophages phagocytozing C. albicans through complement receptors increased from day

2 to day 4 posttreatment (ip) with jack extract and returned to near control values afterwards (Fig. 1A). In the absence of

added serum, the percentage of phagocytozing macrophages was also greater, suggesting that jack extract increased both

opsonic and lectin-like receptor activities (Fig. 1 A).

The migration of phagocytes to the peritoneal cavity and the efficiency in killing Candida was time-dependent on

treatment. A predominance of neutrophils (58.7 ± 8.1 %) occurred after 6 h, these cells were able to kill the pathogen, and

a predominance of macrophages (96.0 ±4.5 %) between days 2 and 4. The macrophages were considered activated due to

greater spreading and the ability to ingest and to kill yeast compared to control macrophages (Fig. 1B).

Opsonized yeast cells stimulated significantly greater quantities of superoxide anion by macrophages 72 h posttreatment

with jack extract compared to nonopsonized yeast or by control phagocytes (

P<0.01). Moreover, macrophages from

mice pretreated with jack extract released significant quantities of superoxide anion compared to controls (*P<0.05). In

the presence of SOD, the quantity of superoxide anion was reduced (P<0.05; Fig. 2).

The influence of jack extract on the activities of dectin-1 and mannose receptors and TNF-α production

Only 20% of control macrophages phagocytozed C. albicans, whereas 52% of macrophages collected after treatment

with jack extract were able to ingest C. albicans (Fig. 3A). The addition of mannan plus mannose to assays reduced

phagocytosis from 52% to 34% (P<0.05). In presence of dectin-1 inhibitor, laminarin phagocytosis was reduced from

52% to 16% (P<0.001).

Fig. 3B shows significantly greater TNF-α production after phagocytosis of C. albicans by activated macrophages and

this increase was inhibited in presence of laminarin (Fig. 3C).

Effect of jack extract on TNF-α levels and C. albicans clearance

A significant increase in the content of TNF-α in supernatants from peritoneal exudate cells and from liver cells of mice

pretreated with jack extract for three days was observed 2 h postinfection with C. albicans (Fig. 4A). To correlate TNF-α

production with C. albicans clearance, samples of homogenized organs were plated in Sabouraud dextrose agar; CFUs

were significantly reduced in all the organs studied and in the peritoneal cavity (Fig. 4B).

Influence of jack extract on liver injury and the survival of mice infected with C.albicans

Jack extract prevented liver injury, as confirmed by normal alanine aminotransferase activity (48.0±15.2), in contrast

with the control group (239.3±80.5) one day after inoculum of 5 X 10

yeast cells (Table 1). C. albicans CR15 was highly

pathogenic and 60% of mice that received 1 X 10

blastoconidia ip died 6 days postinfection; this increased to 80% after

14 days of the course of infection; whereas 100% of mice pretreated for 72h with jack extract survived for 14 days and

10% died due to the inoculum during the follow-up period of 28 days (Fig. 5).

Discussion

The present study showed that jack extract was able to increase the migration of phagocytes to the peritoneal cavity with

increased phagocytic and candidacidal activities and these processes depended on the time of administration.

Phagocytosis mediated by complement receptors and by mannose receptors or by dectin-1 receptors was increased three

days posttreatment, as shown by specific inhibitors. Thus, mannan plus mannose reduced phagocytosis from 52% to 34%.

The enhanced phagocytosis was also strongly inhibited by soluble β-glucans (laminarin), with the reduction in

phagocytosis diminishing from 52% to 16%. According to Gantner et al. (2003), microbial components are directly

recognized by both dectin-1 and TLRs and these receptors trigger independent and cooperative inflammatory responses.

In this study, it was shown that macrophages from mice pretreated for three days with jack extract were able to produce

the inflammatory cytokine TNF-α in vitro after 2 h of incubation with C. albicans killed by heating; a process inhibited

in the presence of laminarin (Fig. 3). These macrophages were also effective at producing significant quantities of

superoxide anion in the presence of opsonized or nonopsonized C. albicans compared to controls. Corroborating these

results, after binding with particulate β-glucans, such as zymozan, dectin-1 can induce the production of various

cytokines and chemokines, including TNF-α and CXC-chemokine ligand 2; it can also induce a respiratory burst, as

reported by Brown (2006).

However, experimental infection with Candida is more complex than in vitro assays. Whereas jack extract

stimulated the migration of neutrophils and macrophages and these were coincubated with C. albicans in vitro to study

the receptors involved in phagocytosis and TNF-α release, the outcome of experimental infection is influenced by

multiple mechanisms, including pattern recognition and the production of several cytokines, as well as pathogen

virulence factors. Interestingly, peritoneal and liver cells from mice pretreated with jack extract and challenged by an

intraperitoneal inoculum of C. albicans presented a significant increase in TNF-α production and these mice cleared the

fungal infection faster than control mice (Fig. 4). The authors previously demonstrated similar results by administration

of Con-A (Conchon-Costa et al., 2007). The proinflammatory cytokine TNF-α mediates a variety of biological responses,

among them improved phagocyte functions (Netea et al., 1999; Ohmura et al., 2001; Gantner et al ., 2005; Filler, 2006;

Murciano et al., 2007; Conchon-Costa et al., 2007), which suggest that TNF-α secretion might be related to the onset of

protective immunity.

As expected, due to the increase in TNF-α production and the increase in phagocytic and candidacidal activities of

phagocytes through of stimulation with jack extract, 90% of mice pretreated with jack extract for three days survived to

the lethal C. albicans inoculum. In contrast, only 20% of the control group survived the 28 day follow-up period. The

effective protection afforded by jack extract was confirmed by measuring the activity of alanine aminotransferase (ALT)

in the plasma of mice infected with C. albicans. An inoculum of 5 X 10

yeast cells caused a significant increase in ALT

activity in control mice. In contrast, mice pretreated with jack extract for three days and receiving the same Candida

inoculum presented unaltered ALT activity, suggesting that jack extract protected the mice against C. albicans infection

and that jack extract alone was not toxic for mice.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. Jair Aparecido Oliveira of the Londrina State University hospital, for

his technical assistance during the kinetic UV test. This work was funded by grants from the CNPq, CAPES and

Fundação Araucária.

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Figure 1. Effect of jack extract administration on phagocytosis and candidacidal activities.

The phagocytes are from mice pretreated with PBS only (control) or jack extract. A. Percentage of macrophages

phagocytozing in absence of serum (closed); in the presence of nonimmune mouse serum (open); in the presence of heat-

inactivated serum (shadowed) B. Percentage of C. albicans killed by phagocytes in absence of serum (closed); in the

presence of nonimmune mouse serum (open). *P<0.05 for jack extract vs. PBS group.

Figure 2. Influence of jack extract on the phagocytes to superoxide anion production.

Superoxide generation by phagocytes was quantified by SOD-inhibitable reduction of ferrocytochrome c. Macrophages

(2X10

) were co-incubated with opsonized (op) or unopsonized Candida (1X10

) either in the absence or presence of

SOD (50µg/ml). Control (closed), jack extract 6-h (shadow) and jack extract 72h before assays (open). The data are

means ± SEM of 6 experiments.

**P<0.01 and *P< 0.05 compared to control.

Figure 3. Mannose receptors and dectin-1 activities and TNF-α production.

Control macrophages (closed) or macrophages from mice pretreated with jack extract for 3 days (open) were

preincubated with inhibitors (mannan plus mannose) or laminarin, or medium only, for 30 min and then C. albicans was

added for 30 min at 37°C (A). The supernatants were collected, and TNF-α was determined by ELISA. Production of

TNF-α in the absence (B) or presence of laminarin (C).

* P< 0.05 and **P < 0.01 compared to control.

Figure 4. TNF-α production and C. albicans clearance postinfection.

Mice were pretreated with PBS (closed bars) or jack extract (open bars) 3 days before inoculation ip with 10

C.albicans.

A. TNF-α production in supernatants from exudate peritoneal cells and liver. B. CFU (log) from organs infected. Data

are reported from 4 experiments. *P<0.05 for jack extract vs. PBS group.

Figure 5. Effect of jack extract on the survival of mice after infection with C. albicans.

Mice (10 per group) received jack extract (500 µg) or PBS before ip infection with 10

C. albicans. * P < 0.05 (vs. PBS

group) in log-rank test for survival rates

Table 1: Determination of plasma alanine aminotransferase activities (IU L

-1

) from mice infected with C. albicans

after pretreatment with Jack extract (JE).

JE 500µg ml

-1

PBS or PBS alone were administered i.p. 6h or 72h before infection with C. albicans.Values are

reported as means ±S.D. for 6 mice in each group. * Statistically significant at P< 0.05 for PBS vs. JE.

Alanine aminotransferase activity (IUL

-1

)

Inoculum

1x10

5x10

Treatment Control 24h 24h 72h

PBS 52.3 ± 19.6 48.8 ± 18.4 239.3 ± 80.5* 369.75 ± 51.1*

JE 6h 46.0 ± 11.9 30.0 ± 4.6 55.8 ± 11.7 139.5 ± 33.9*

JE 72h 47.7 ± 6.6 38.5 ± 10.4 48.0 ± 15.2 43.0 ± 7.5

Table 1. Determination of plasma alanine transferase activities (IUL

-1

) from mice infected with Candida albicans after

pretreatment with jack extract.

Jack extract 500µg mL

-1

PBS or PBS only was administered ip 6 h or 3 days before infection with 10

C. albicans. Values

are reported as means ± SD for 6 mice in each group. * Statistically significant at P<0.05 for PBS vs. jack extract.

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