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RENATA KATSUKO TAKAYAMA KOBAYASHI
ANÁLISE DA EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO
FUNCIONAL DA HEMAGLUTININA TEMPERATURA
SENSÍVEL DE Escherichia coli
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Londrina
2006
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R
ENATA KATSUKO TAKAYAMA KOBAYASHI
ANÁLISE DA EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO
FUNCIONAL DA HEMAGLUTININA TEMPERATURA
SENSÍVEL DE Escherichia coli
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Microbiologia da
Universidade Estadual de Londrina como
requisito final à obtenção do título de
Doutor em Microbiologia.
Orientador: Prof. Dr. Luis Carlos Jabur
Gaziri
Londrina
2006
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RENATA KATSUKO TAKAYAMA KOBAYASHI
ANÁLISE DA EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO
FUNCIONAL DA HEMAGLUTININA TEMPERATURA
SENSÍVEL DE Escherichia coli
COMISSÃO EXAMINADORA
______________________________________
Prof. Dr. Emerson José Venancio
__________________________________
Profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis
__________________________________
Profa. Dra. Ionice Felipe
__________________________________
Profa. Dra. Marilda Carlos Vidotto
__________________________________
Prof. Dr. Luis Carlos Jabur Gaziri
Londrina, 20 de fevereiro de 2006
DEDICATÓRIA:
Às minhas filhas, Giovanna e Giuliana, que
são a razão de tudo o que faço.
Ao meu marido, Claudio, pelo grande apoio,
companheirismo, paciência e dedicação
constante à nossa família.
Aos meus pais, Macoto e Litsuko, que, com
exemplos de vida, me ensinaram a força da
perseverança, da fé e do amor.
Aos meus irmãos, Guilherme e Thomaz, pelo
incentivo e companheirismo, apesar da
distância.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Luis Carlos Jabur Gaziri, pela orientação e dedicação.
À Profa. Dra. Marilda Carlos Vidotto, pela confiança depositada em
mim e pela acolhida em seu laboratório com dedicação, estímulo e oportunas
sugestões; e por ser exemplo fiel de pesquisadora. Minha sincera amizade e
admiração.
À Profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis, pelas valiosas sugestões e
constante apoio e amizade.
À Profa. Dra. Ionice Felipe, pelos ensinamentos, dedicação e
amizade.
Ao Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, por aceitar de maneira
desprendida participar da banca desta tese.
Ao Prof. Dr. Emerson José Venancio, pelos conselhos e
ensinamentos no decorrer deste trabalho.
À Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano, pela amizade e apoio constantes.
Aos professores do curso de Pós-Graduação em Microbiologia, Prof.
Dr. Carlos M. Nozawa, Prof. Dr. Galdino Andrade Filho, Profa. Dra. Jacinta S.
Pelayo, Profa. Dra. Márcia C. Furlaneto, Prof. Dr. Marco A. Nogueira, Profa. Dra.
Regina L. dos Santos, Profa. Dra. Rosa Elisa C. Linhares e Profa. Dra. Sueli F. Y.
Ogatta, pelos ensinamentos, apoio e amizade.
Aos eternos professores, Dra. Shiduca Itow Jankevicius e Dr. José
Vitor Jankevicius, pelos ensinamentos e por terem sido exemplos de dedicação na
vida profissional.
Ao Prof. Dr. Ivens G. Guimarães e sua equipe, pelo auxílio técnico,
ensinamentos e sugestões.
À funcionária Jussevânia S. Rubbo de Sá pelo competente apoio
técnico, incentivo e sincera amizade.
À secretária da Microbiologia, Nalva, pela eficiência e prontidão no
auxílio e amizade constante.
Aos demais funcionários do Departamento de Microbiologia e do
Departamento de Ciências Patológicas pelo apoio e amizade.
Ao funcionário Pedro S. R. Dionizio Filho, pelo auxílio prestado e
valiosas sugestões.
Aos colegas do curso de Pós-Graduação: Viviane, Claudia, Márcia,
Lauretti, Audrey, Fabiana, Ivete, Berenice, Wagner, Fabrício, pelos anos de convívio
e amizade.
Aos amigos vizinhos de Laboratório, Érica e Sasaki, pela amizade e
colaborações nos experimentos.
Às amigas do Laboratório NIP 3, as mestrandas Dóris, Kátia,
Michelle, Paula; as estagiárias Francielle, Geizecler, Marisa, Natália e veterinária
Juliana, pelas colaborações nos experimentos, e muito mais pelo carinho e amizade
sincera, fortalecidas durante estes anos de convívio.
À amiga Flora, pela sua amizade fraterna, por me ajudar nos
momentos difíceis e me incentivar na caminhada. Sem você, tudo seria muito mais
difícil, obrigada amiga.
Aos amigos Benito e Kely Cristina pela compreensão,
companheirismo e amizade.
Ao Sr. Motomu Okino e Júlia Okino, pelo apoio, amizade e valiosa
cooperação.
À Alessandra M. Okino, Arnaldo A. Okino e Áurea K. Okino, pela
amizade e incentivo constantes.
À Tereza Braz Teixeira e sua família, à quem confiei o cuidado de
minhas filhas, durante minha ausência, e sei que o fez com tanta ou mais dedicação
que eu. Obrigada.
Finalmente, um agradecimento muito especial àqueles que mais
contribuíram para a execução deste trabalho: meus pais Macoto e Litsuko, meu
marido Claudio e minhas filhas Giovanna e Giuliana.
Não só foram capazes de respeitar a minha vontade como aceitaram
meu afastamento de casa, e viveram de tal modo a não permitir que minha ausência
atrapalhasse o equilíbrio de nossas vidas.
RESUMO
Escherichia coli é um agente importante de infecções extraintestinais em humanos e
em animais. Em aves, é responsável por grandes perdas econômicas, sendo
conhecida como E. coli patogênica para aves (APEC), e causa a colibacilose, a qual
inicia como infecção do trato respiratório e evolui para aerosaculite, pericardite,
perihepatite e septicemia. Vários genes de virulência estão envolvidos, sendo tsh um
deles. O gene tsh codifica a proteína autotransportada hemaglutinina temperatura
sensível (Tsh), que tem atividade hemaglutinante e proteolítica. Tsh é sintetizada
como uma proteína precursora de 140 kDa, que é clivada, em um domínio
passageiro de 106 kDa (Tsh
s
) e um beta-domínio de 33 kDa (Tsh
β
). Em nosso
trabalho observamos que a presença destas proteínas é dependente da temperatura
e do meio de cultura utilizado para o crescimento bacteriano. Observamos ainda
que, tanto a Tsh recombinante (140 kDa) quanto o sedimento da amostra selvagem
APEC 13, que contém Tsh
β
(33 kDa), aglutinaram eritrócitos de galinha. Tanto a Tsh
recombinante (140kDa) quanto o sobrenadante da APEC 13, que contém Tsh
s
(106
kDa), causam proteólise da mucina. O anti-Tsh do soro de galinha inibiu a
hemaglutinação da APEC 13 e da recombinante E. coli BL21/pET101-tsh, e inibiu
também a atividade mucinolítica da proteína Tsh. A comprovação da atividade
mucinolítica da proteína Tsh, foi possível através de SDS-PAGE em géis
copolimerizados com mucinas de diferentes origens.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................8
2 OBJETIVOS...........................................................................................................22
3 CONCLUSÕES......................................................................................................23
REFERÊNCIAS ........................................................................................................24
ANEXOS...................................................................................................................34
ANEXO 1 ARTIGO1: EXPRESSION, HEMAGGLUTINATING AND
MUCINOLYTIC ACTIVITIES OF THE TSH PROTEIN FROM AN
AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI (APEC) STRAIN.................35
ANEXO 2 ARTIGO 2: DETECTION OF TSH PROTEIN MUCINOLYTIC
ACTIVITY BY SDS PAGE.........................................................................45
8
1 INTRODUÇÃO
Escherichia coli, é um bacilo Gram negativo, anaeróbio facultativo,
pertencente à família Enterobacteriaceae, componente da microbiota normal de
humanos e animais; e agente de infecções intestinais e extraintestinais em
diferentes hospedeiros. As amostras patogênicas de E. coli extraintestinal (ExPEC)
constituem grave problema para a saúde humana, uma vez que podem estar
envolvidas em infecções do trato urinário, meningites em recém-natos e septicemias.
ExPEC também afeta o setor de agronegócios, levando a perdas econômicas
significantes na criação de animais, especialmente na indústria avícola (Mokady et
al., 2005), onde é conhecida como E. coli patogênica para aves (APEC) .
Uma correlação entre APEC e ExPEC humana, principalmente E. coli
patogênica urinária (UPEC), tem sido extensivamente pesquisada. Estas amostras
de E. coli apresentam similaridades nos sorogrupos, nos grupos filogenéticos e nos
genes de virulência (Rodriguez-Siek et al., 2005b). Isso se deve, provavelmente, aos
desafios semelhantes enfrentados quando estabelecem uma infecção extraintestinal.
Ainda não foi comprovado que APEC serviria como fonte de ExPEC ou como
reservatório de genes de virulência para ExPEC, porém deve ser considerado que
APEC geralmente apresenta vários genes de virulência, insinuando alto grau de
risco zoonótico (Mokady et al., 2005; Rodriguez-Siek et al., 2005b). Para a
comprovação do risco zoonótico, ou mesmo para melhor compreensão de ExPEC, é
necessário maior esclarecimento a respeito do papel dos fatores de virulência
envolvidos no desenvolvimento de infecções por APEC.
Nas aves, Escherichia coli está presente como microbiota normal no
trato gastrointestinal, na proporção de 10
4
– 10
7
Unidades Formadoras de Colônia
(UFC) por grama de fezes. Essa bactéria também coloniza o trato respiratório
superior (faringe e traquéia), podendo ser isolada da pele e das penas, dependendo
do nível de contaminação do ambiente. No entanto, a presença de inúmeros fatores
de virulência envolvidos confere à APEC, capacidade de causar infecções
extraintestinais (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Infecções extraintestinais por APEC resultam em várias doenças,
sendo colibacilose a mais conhecida. Inicia-se com infecção do trato respiratório,
referido como aerosaculite, e se não tratada, pode evoluir para bacteremia, infecção
9
generalizada e morte. Esta síndrome acomete principalmente aves de 4 a 9
semanas, sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em frangos
e perus (Gross, 1994). O trato respiratório é o principal alvo de APEC, onde
geralmente atua como agente secundário após infecção inicial por vírus de
Newcastle (NDV), vírus da bronquite infecciosa (IBV) ou Mycoplasma gallisepticum
(Nakamura et al., 1992; Dho-Moulin & Fairbrother, 1999). A susceptibilidade das
aves à infecção por APEC é aumentada pela deciliação das células epiteliais do
trato respiratório superior seguida pela exposição à amônia e poeira (Dho-Moulin &
Fairbrother, 1999). Acredita-se que esta infecção inicia-se após inalação de
partículas de pó contaminadas com fezes (Gross, 1994).
O trato respiratório das aves é extremamente vulnerável à
colonização e invasão bacteriana, pois os sacos aéreos não possuem mecanismos
de defesa celular residentes, sendo os mecanismos de defesa do trato respiratório
ineficientes (Pourbakhsh et al., 1997a; Dho-Moulin & Fairbrother, 1999). Após
colonização e invasão do trato respiratório, as cepas de APEC podem atingir a
corrente sangüínea evoluindo para septicemias, pericardites ou perihepatites, pois a
região capilar pulmonar, assim como os sacos aéreos atuam como importantes
portas de entrada de APEC para a corrente sangüínea (Pourbakhsh et al., 1997a;
Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Pourbakhsh et al. (1997b), examinando a dinâmica da infecção em
frangos após a inoculação nos sacos aéreos de amostras de E. coli de alta virulência
e de baixa virulência, observaram que após 6h da inoculação, somente as amostras
de alta virulência eram encontradas no sangue, associadas a macrófagos nos sacos
aéreos e pulmões dos frangos inoculados. Este fato sugere que a resistência à
fagocitose é um importante fator de virulência que favorece o desenvolvimento da
colisepticemia aviária (Pourbakhsh et al., 1997b; Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Células fagocíticas tais como heterófilos e macrófagos funcionam
como defesa primária contra os microrganismos invasores. Porém amostras
capsuladas (K1), ou pertencentes ao sorogrupo O78, ou possuidoras da fimbria P
impedem a associação inicial com fagócitos e apresentam mecanismos protetores
contra os efeitos bactericidas destes após a ocorrência da associação (Mellata et al.,
2003a). Outro mecanismo de resistência à fagocitose, já descrito em amostras
APEC, é o processo de apoptose (Rodrigues et al., 1999), onde amostras de APEC
são capazes de induzir apoptose ou morte celular programada, em macrófagos
10
quando fagocitadas. Este processo, também descrito em outros patógenos como
Shigella flexneri, Bordetella pertussis, Salmonella sp, Leptospira sp, Mycobaterium
tuberculosis, pode ser importante fator de virulência, através do qual a APEC escapa
da defesa primária do sistema imune, visto que a morte celular e a subsequente
resposta inflamatória rompem as junções celulares e favorecem a translocação
bacteriana através das barreiras epiteliais (Finlay & Cossart, 1997).
A habilidade da bactéria em persistir em fluidos corpóreos (fluido
pericárdico e sangue) e órgãos internos como pulmão, fígado, baço e sacos aéreos,
está correlacionada à resistência à atividade lítica do soro, uma vez que as bactérias
sensíveis ao soro são incapazes de colonizar órgãos internos. Mellata et al. (2003b),
pesquisando cepas mutantes, demonstraram que lipopolissacarídeo O78 e cápsula
K1 estão envolvidos no processo patogênico e que a resistência sérica é um dos
mecanismos usados para alcançar os órgãos internos das aves testadas.
Outros fatores de virulência que tem sido relacionados à resistência
sérica são antígeno capsular K5, e proteínas de membrana externa TraT, OmpA e
Iss (Pfaff-McDonough et al., 2000).
Além de resistir às defesas imunológicas, APEC precisa ser capaz de
se multiplicar em líquidos fisiológicos do hospedeiro, os quais se caracterizam pela
baixa concentração de íons ferro, uma vez que estes estão complexados a
proteínas, como hemoglobina, transferrina e ovotransferrina. O ferro é essencial para
toda célula viva e E. coli utiliza o ferro para o transporte de oxigênio, síntese de
DNA, transporte de elétrons e metabolismo de peróxidos. Assim sendo, amostras
ExPEC, inclusive APEC e UPEC, possuem sistemas de captação de ferro adicionais.
Estes sistemas podem ser mediados por sideróforos aerobactina, enterobactina ou
outros, sendo aerobactina o mais frequente (La Ragione & Woodward, 2002;
Mokady et al., 2005).
Aerobactina se caracteriza por ser um composto formado a partir de
duas moléculas de lisina e uma de citrato, que compete pelo ferro ligado às
proteínas do hospedeiro. Aerobactina férrica liga-se a um receptor presente na
membrana externa da bactéria, de 74kDa, induzido pelo estresse de ferro e
codificado pelo gene iutA. O gene iuc codifica a enzima responsável pela síntese da
aerobactina. Estes genes estão localizados no plasmídio ColV ou em cromossomos.
O sistema aerobactina tem sido detectado em 73-98% das APEC (Dho-Moulin &
Fairbrother, 1999; Rodriguez-Siek et al., 2005a).
11
O passo fundamental para o desenvolvimento da colisepticemia
aviária é a colonização bacteriana do trato respiratório, a qual está associada a
adesinas fimbriais e afimbriais (Dho & Lafont, 1982; Maurer et al., 1998). As
propriedades de aderência de E. coli foram primeiramente reconhecidas através da
técnica de aglutinação de eritrócitos na presença de cepas bacterianas. Estas
observações foram posteriormente confirmadas e correlacionadas com a presença
de fímbrias, através do uso de microscopia eletrônica (Parry & Rooke, 1985).
Portanto, a atividade hemaglutinante tem sido um dos critérios de classificação das
fímbrias, permitindo classificá-las em três categorias: fímbrias manose-sensível (tipo
1), que reconhecem resíduos D-manose em eritrócitos de cobaio e cuja
hemaglutinação é inibida na presença da D-manose; fímbrias manose-resistentes
que se caracterizam por reconhecerem resíduos diferentes da D-manose, sem que a
hemaglutinação seja inibida em presença da mesma; e fímbrias não
hemaglutinantes (Morris, 1983; Babai et al., 2000).
As mais extensivamente estudadas são fímbria tipo 1 e fímbria P.
Fímbria tipo 1 é expressa por E. coli no trato respiratório, pulmões e sacos aéreos
das aves infectadas, indicando um possível papel durante o estágio inicial da doença
(Dozois et al., 1995). Já a fímbria P parece atuar num estágio posterior desta
infecção (Pourbakhsh et al., 1997c).
Vidotto et al. (1997), observando a aderência manose-sensível de
amostras APEC, na região de muco do epitélio traqueal de pintos, também
sugeriram que a fímbria tipo 1 é uma ferramenta importante na fixação da bactéria
ao epitélio traqueal das aves na fase inicial do processo de colonização.
Fímbria tipo 1 (F 1) apresenta-se como estrutura filamentosa de 7nm
de diâmetro e 0,5 a 2µm de comprimento, composta de unidade polipeptídica
repetida de 17kDa (Duguid & Old, 1980; Clegg & Gerlach, 1987), e consiste em uma
proteína maior (FimA), associada à subunidades menores FimF, FimG e a adesina
FimH. Estas são codificadas pelo grupo de genes cromossômicos fim, e
compreendem nove genes, sete dos quais estão presentes em um único operon
(Dho-Moulin & Fairbrother, 1999). Está freqüentemente presente em amostras
patogênicas, sendo porém, também encontrada em amostras comensais. McPeake
et al. (2005) encontraram o gene fimH da fímbria tipo 1 em 96,5% dos isolados de
colibacilose e em 92% das amostras de E. coli isoladas de aves saudáveis. O gene
fimC foi demonstrado em 90% das amostras APEC e em 27% das amostras isoladas
12
de hospedeiros saudáveis. Rodriguez-Siek et al. (2005b) encontraram o gene fimH
em 98% das amostras APEC, e em 99% das amostras UPEC.
O papel da fímbria tipo 1 na infecção por APEC não está claro. Marc
et al. (1998), usando mutantes com o operon fim deletado, mostraram que a
expressão da fímbria tipo 1 não é necessária para a colonização da traquéia e sacos
aéreos, não descartando seu envolvimento na colonização dos pulmões. A
expressão da fímbria tipo 1 parece depender das condições ambientais, uma vez
que é expressa na traquéia, pulmões e sacos aéreos, mas não é expressa em outros
órgãos, e no sangue (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999). A presença de outros fatores
parece ser importante; Wooley et al. (1998) observaram que a colonização inicial
pode requerer a presença de fímbria tipo 1, mas a colonização é mais eficiente
quando APEC são móveis e produzem ColV, comprovando mais uma vez o caráter
multifatorial das amostras APEC.
Fímbria tipo 1 também participa da interação de APEC com o
sistema imune. Pourbakhsk et al. (1997b) mostraram que cepas virulentas são mais
resistentes aos efeitos bactericidas dos macrófagos quando não expressam fímbria
tipo 1. Outros autores tem mostrado que a fímbria tipo 1 está envolvida na fagocitose
da bactéria pelos macrófagos, induzindo uma resposta imune através da ativação
de mastócitos, liberação de histamina e TNF alfa e recrutamento de neutrófilos ao
sítio de infecção (Marc et al., 1998). Mellata et al. (2003a e b) estudando amostras
selvagens e mutantes, observaram a atuação da fímbria tipo 1 na associação com
fagócitos e na manutenção da viabilidade da bactéria nesta associação, em
contrapartida, não a detectaram na resistência sérica.
A expressão de fímbria tipo 1 aumenta a virulência de E. coli
uropatogênica (UPEC), pois a adesina Fim H da fímbria tipo 1 pode mediar a
invasão de UPEC nas células epiteliais da bexiga, por desencadear a cascata de
sinalização das células do hospedeiro (Martinez et al., 2000). Boudeau et al. (2001)
observaram que a aderência da fímbria tipo 1 tem papel fundamental na habilidade
invasiva das amostras de E. coli isoladas de pacientes com doença de Crohn,
doença intestinal de caráter inflamatório e etiologia desconhecida.
Mais estudos são necessários para elucidar a participação da fímbria
tipo 1 na virulência de APEC.
13
As fímbrias manose-resistentes (MR) compreendem um grupo
heterogêneo de estruturas bacterianas que se ligam a carboidratos presentes nos
receptores das células eucarióticas, diferentes da D-manose.
A fímbria tipo P é uma fímbria MR importante, que reconhece
glicopeptídios contendo especificamente o dissacarídeo α-D-galactose (1-4) β - D –
galactose (Källenius et al., 1980). Foi inicialmente encontrada em amostras de E. coli
que causam infecções do trato urinário em humanos, é responsável pela aderência
bacteriana às células uroepiteliais e está envolvida no desenvolvimento de
pielonefrite (Johnson, 1991). Consiste de uma subunidade fimbrial maior
denominada PapA e de adesina fimbrial terminal denominada PapG. Apresenta onze
sorotipos, designados F7 a F16, sendo estes caracterizados através das diferenças
antigênicas da proteína estrutural codificada pelo gene estrutural PapA (Hacker,
1992).
Algumas amostras de APEC também expressam fímbrias P, mas em
baixa proporção (Dozois et al., 1992, 1995; Van Den Bosch et al., 1993; Vidotto et
al., 1997; Bell et al., 2002). O operon Pap C foi detectado através da PCR somente
em 14% das amostras APEC (Vidotto et al., 1997). Entretanto, a fímbria P, sorotipo
F11, foi detectada em 78% das amostras, em vários sorotipos de amostras de APEC
(de Ree et al., 1985; Van Den Bosch et al., 1993; Dozois et al., 1996), sendo mais
freqüente nas amostras com sorotipos O1:K1, O2:K1, O78:K80 e sorogrupo O35
(Van Den Bosch et al., 1993).
O papel da fímbria P na patogenicidade de APEC não está bem
elucidado. Esta adesina não parece estar envolvida na aderência às células da
traquéia ou nasofaringe in vitro (Van Den Bosch et al., 1993; Vidotto et al., 1997). A
expressão de fímbria P in vivo foi sugerida quando frangos inoculados com amostra
APEC produtora de fímbria P-F11, via intra traqueal e sacos aéreos, produziram
anticorpos anti F11 (Pourbakhsh et al., 1997c). Contudo, a amostra expressando
esta fímbria colonizou sacos aéreos, pulmões e órgãos internos, mas não a traquéia
em frangos inoculados, sugerindo a variação de fase para fímbria P, com respeito a
sua localização, não mostrando atuação na colonização inicial, mas sim nos últimos
estágios da infecção (Dho-Moulin & Fairbrother, 1999).
Algumas fímbrias não hemaglutinantes, como exemplo a fímbria
designada AC/I (avian E. coli I), com 18 kDa, são descritas em amostras de E. coli
aviária, sendo responsáveis pela adesão às células de traquéia, não aglutinando
14
qualquer dos tipos de eritrócitos testados (galinha, coelho, peru, cavalo,
camundongo, cobaio e humano) na presença de manose (Yerushalmi et al., 1990),
sua frequência, no entanto, é baixa (Delicato et al., 2003).
Adesinas fímbriais e não fímbriais, importantes em infecções
causadas por E. coli em mamíferos, tem sido pesquisadas em APEC. Stordeur et al.
(2002) analisando amostras isoladas de órgãos internos e intestinais de aves
(galinhas, perus e patos) encontraram as adesinas AFA-VIII, F17 , S e intimina
(Eae), concluindo que estas podem representar fatores de colonização de algumas
APEC, ao lado da bem descrita adesina fimbrial P.
Outros exemplos de adesinas bacterianas manose resistentes são os
curli e a hemaglutinina temperatura-sensível (TSH). Curlis são estruturas
filamentosas finas e encaracoladas de aproximadamente 2nm de diâmetro
encontradas na superfície bacteriana de E. coli e Salmonella spp. O papel da fímbria
curli em infecções em aves por E. coli permanece não esclarecido, embora tenha
sido demonstrado que in vitro elas medeiam ligação com fibronectina, laminina,
plasminogênio, proteína ativadora de plasminogênio e colágeno tipo 1 (Olsen et al.,
1989). Utilizando mutantes para a presença de curli foi observada maior adesão das
amostras selvagens (curli+) que das mutantes (curli-) em diferentes tipos celulares
(La Ragione et al., 2000).
A hemaglutinina temperatura sensível (Tsh) é responsável pela
hemaglutinação manose resistente (MRHA) em eritrócitos de galinha, que ocorre
quando a bactéria é cultivada a 26
o
C em meio de baixa osmolaridade, mas ocorre
em culturas a 42
o
C e em anaerobiose. É codificada pelo gene tsh, que foi
caracterizado pela primeira vez de APEC
χ
7122 (O78:K80:H9), isolada de aves com
aerosaculite e colissepticemia (Provence & Curtiss, 1992, 1994). O gene tsh está
localizado em um plasmídio conjugativo associado à produção de colicina V,
plasmídio este que frequentemente também carrega genes para o operon
aerobactina (Dozois et al., 2000).
O gene tsh foi encontrado em alta frequência em amostras APEC
(34% a 49,7%), mas não em isolados de E. coli a partir de fezes de aves saudáveis
(Maurer et al., 1998; Dozois et al., 2000; Delicato et al. 2002). Rodriguez-Siek et al.
(2005b) comparando os fatores de virulência presentes em APEC e UPEC,
encontraram o gene tsh em 63% de APEC e 39,5% de UPEC. Heimer et al. (2004),
analisando amostras humanas encontraram o gene tsh em 63% de UPEC e em 33%
15
de E. coli isolada de fezes. Esses dados demonstram que o gene tsh faz parte do
conjunto de genes de virulência presentes em ExPEC.
As amostras de APEC possuem vários fatores de virulência
associados (Vidotto et al., 1990). Delicato et al. (2003), estudando 200 amostras
verificaram que o gene tsh é um dos 7 genes mais frequentes em APEC, e que
outros genes são iutA, iss, cvaC, papC, papG e felA. Dados semelhantes foram
obtidos por Ngeleka et al. (2002) e Rodriguez-Siek et al. (2005a), e esses autores
sugeriram que este grupo de genes poderia ser útil na definição de patótipos de
APEC.
Infecção experimental nos sacos aéreos utilizando linhagem
selvagem ou mutante tsh isogênico demonstrou que Tsh contribui para o
desenvolvimento das lesões nos sacos aéreos e deposição de fibrina, mas não está
associado a infecções generalizadas como pericardite, perihepatite e septicemia,
sugerindo a paticipação da Tsh nos estágios iniciais da colonização e infecção do
trato respiratório (Dozois, et al., 2000).
Tsh não é um fator de virulência essencial, sendo possível a
presença de adesinas alternativas substituindo-o (Tivendale et al., 2004), entretanto
parece contribuir para a virulência de APEC. Dozois et al. (2000), estudando 300
amostras isoladas de aves, observaram que dentre as amostras tsh positivas, 90.6%
foram classificadas como de alta patogenicidade; de Brito et al. (2003), observaram
a presença do gene tsh em amostras de intermediária e alta patogenicidade, não
sendo encontrado em amostras de baixa patogenicidade e não patogênicas.
Provence & Curtiss (1994), através da construção de uma biblioteca
genômica de APEC, e pesquisa de mutantes originados pela inserção de
transposon, isolaram e caracterizaram o gene tsh. Demonstraram que uma região de
4.4 Kb era requerida para hemaglutinação e após transcrição/tradução de proteína in
vitro observaram que esta região codifica um polipeptídio de aproximadamente 140
kDa, e pela análise da seqüência de DNA encontraram uma única fase aberta de
leitura (ORF-open reading frame) de 4.134 nucleotídios, a qual codifica uma proteína
com peso molecular deduzido de 148.226. Analisando a seqüência deduzida de
aminoácidos desta proteína observaram significante homologia com serinoproteases
do tipo IgA1 produzidas por Haemophilus influenzae e Neisseria gonorrhoeae, as
quais são secretadas para o espaço extracelular por um mecanismo altamente
16
eficiente e receberam a denominação de proteínas autotransporte (Henderson et al.,
1998).
Tsh foi a primeira proteína autotransporte descrita em
enterobactérias, caracterizando-se por ser uma serina protease que contém uma
sequência de 7 aminoácidos altamente conservada, onde está presente o sítio ativo
serina, GD
SGSPL (Brenner, 1988), e que faz parte da família serina protease
autotransporte de Enterobacteriaceae (SPATE - serine protease autotransporters of
the Enterobacteriaceae) (Provence and Curtiss, 1994).
Proteína autotransporte é uma proteína secretada pelo sistema de
secreção tipo V, o único em que não há gasto de energia e nem proteínas adicionais
durante o processo de translocação (Stathopoulos et al., 2000).
Bactérias Gram negativas tem desenvolvido diversos sistemas de
transporte para translocação de suas proteínas para a membrana externa ou
ambiente extracelular, uma vez que possuem dois sistemas de membrana a serem
ultrapassados, membrana citoplasmática, e a membrana externa, com o
peptidoglicano e o espaço periplásmico entre elas, contrastando com as bactérias
Gram positivas que possuem apenas a membrana citoplasmática, seguida por uma
espessa peptidoglicana.
A proteína a ser secretada cruza a membrana citoplasmática de
ambas, Gram negativas e positivas, normalmente envolvendo a via Sec-dependente.
Contudo, uma vez cruzada a membrana citoplasmática, os destinos das proteínas
translocadas divergem. Em bactérias Gram positivas, as proteínas são liberadas
para o ambiente extracelular ou incorporadas à parede bacteriana. Em Gram
negativas, resulta na liberação da proteína para o espaço periplásmico, e
consequentemente, proteínas que são destinadas para a superfície da célula ou
ambiente extracelular devem cruzar também a barreira adicional formada pela
membrana externa. Para conseguir translocar estas proteínas para a superfície da
célula e além dela, a bactéria gram negativa desenvolveu 5 mecanismos de
secreção de proteínas (Henderson et al., 2004).
O protótipo da secreção tipo I é a secreção de alfa-hemolisina de E.
coli, que ocorre de maneira sec-independente e em um processo contínuo que cruza
as membranas interna e externa (Gentschev et al., 2002). As proteínas não são
processadas durante a secreção e não formam intermediários no periplasma. Este
sistema consiste de 3 proteínas: uma proteína de membrana externa formadora de
17
poros, uma proteína de fusão de membrana (MFP), e um grupo de proteínas (ABC)
ligadas ao ATP na membrana interna. Na secreção da alfa-hemolisina, estas
proteínas são representadas por TolC, HlyD e HlyB, respectivamente. O processo de
secreção começa quando um sinal de secreção localizado no C-terminal final da
molécula efetora secretada interage com a proteína transportadora ABC. Uma vez
ligada à molécula efetora, a interação da HlyD(MFP) com a proteína de membrana
externa TolC é ativada, seguido da secreção da molécula efetora para o meio
externo. A ponte formada por MFP e proteína de membrana externa se desfaz
depois da molécula efetora ser exportada. A hidrólise do ATP pelo transportador
ABC fornece o impulso para guiar a secreção da molécula efetora pela parede da
célula para o ambiente externo (Henderson et al., 2004).
A via de secreção tipo II é considerada a principal ramificação da via
de secreção geral - GSP (general secretory pathway) sec-dependente. É
exemplificada pela secreção da pullulanase de Klebsiella oxytoca, mas tem sido
identificada em inúmeras outras espécies bacterianas que exportam uma gama de
proteínas com diversas funções, inclusive a toxina da cólera e a exotoxina de
Pseudomonas aeruginosa. A secreção ocorre em dois passos Sec-dependentes. A
proteína secretada via secreção tipo II é sintetizada com uma sequência sinal N-
terminal que direciona a proteína através da via de secreção pela membrana interna
através da Sec. A maquinaria Sec é composta de ATPase, Sec A, várias proteínas
integradas à membrana interna (SecD, SecE, SecF, SecG e SecY, e uma peptidase
sinal). Sec B, uma chaperona citoplasmática, não reconhece a sequência sinal, mas
reconhece a parte madura da proteína direcionada para secreção e
subsequentemente dirige a proteína para o translocon Sec. SecA fornece energia
para o transporte do translocon, e a peptidase sinal cliva a sequência sinal, liberando
o resto da proteína para o periplasma, uma vez no periplasma a proteína restante
adota um estado quase nativo que é facilitado por certas chaperonas como
isomerases que ligam dissulfetos (DsbA). O transporte através da membrana
externa requer 12 a 16 proteínas adicionais, dentre elas estão proteínas
responsáveis pela interação espécie-específica definindo o transporte do substrato
protéico, proteínas de membrana externa, quinases que regulam o processo de
secreção por suprir energia para promover translocação, enfim, vários componentes
que interagem para formar um complexo multiprotéico que atravessa a membrana
interna e externa (Sandkvist, 2001; Henderson et al., 2004).
18
O sistema de secreção tipo III foi primeiro identificado em Yersinia
spp na secreção de proteínas Yop, e posteriormente foi observado em muitos
patógenos, incluindo Salmonella spp, Shigella flexneri, E. coli, Pseudomonas
syringae, e Chlamydia trachomatis. Recentemente, tem sido objeto de considerável
interesse devido ao seu papel primário na virulência destes patógenos. O
mecanismo de secreção tipo III é altamente conservado, mas as moléculas
transportadas são distintas e desenvolvem diferentes funções. Genes que codificam
componentes requeridos para a secreção tipo III são geralmente localizados em um
único plasmídio ou locus cromossômico (Plano et al., 2001; Henderson et al., 2004).
Como no sistema de secreção tipo I, o sistema de secreçaõ tipo III
transloca suas moléculas efetoras através das membranas interna e externa,
independente de Sec. Uma vez guiada para o lado citoplásmico, a secreção da
molécula efetora pode ocorrer sem a formação de intermediários periplásmicos, pois
ocorre através de uma estrutura semelhante a uma agulha que atravessa a
membrana interna e externa, composta de 20 diferentes proteínas. Talvez a
característica mais notável desta secreção seja sua habilidade para guiar as
proteínas efetoras diretamente para a célula eucariótica. A analogia a uma seringa
hipodérmica, junto com a habilidade do sistema de injetar proteínas diretamente
dentro do citosol do hospedeiro, nomeou este sistema de secreção como injeção
(Plano et al., 2001; Henderson et al., 2004).
O tipo IV (TFSS) é o menos conhecido das vias de secreção de Gram
negativos. O sistema é relacionado com a maquinaria da conjugação bacteriana,
sendo o protótipo o sistema de transferência da nucleo-proteína T-DNA do
Agrobacterium tumefaciens. Contudo, já foi observado em Bordetella pertussis,
Legionella pneumophila, e Helicobacter pylori. A. tumefaciens secreta muitas
moléculas efetoras (Vir D, Vir E e VirF) no citosol da célula hospedeira. Vir D é
secretada como um complexo nucleoprotéico e a proteína permanece
covalentemente ligada à copia do T-DNA fita simples. Uma vez no citosol, vir E
interage com virD, mediando a entrega do T-DNA para o núcleo da célula do
hospedeiro resultando na formação de tumor (Lai & Kado, 2000; Henderson et al.,
2004).
O sistema de secreção de proteína tipo V, talvez seja o mais simples
de todos. A primeira proteína autotransporte descrita foi uma IgA1 protease de
Neisseria gonorrhoeae (Pohlner et al., 1987), e recebeu o nome de autotransporte,
19
pois ao contrário dos tipos I a IV, não há gasto de energia e fatores adicionais
durante o processo de translocação.
A estrutura primária da proteína autotransporte consiste de 3
domínios: sequência amino terminal, domínio passageiro e beta-domínio. A
sequência amino terminal (também chamada peptídeo líder) está presente na
porção final N-terminal da proteína e permite guiar a proteína para a membrana
interna visando sua exportação para o periplasma, que pode ocorrer através da via
sec. O domínio passageiro, que possui diversas funções. O domínio localizado na
porção final C-terminal da proteína, é a unidade de translocação (também chamada
de Beta domínio), que consiste em uma estrutura curta com forma de beta barril
quando embutida na membrana externa e facilita a translocação do domínio
passageiro para a membrana externa (Henderson et al., 2004).
Após a passagem pela membrana interna através das proteínas Sec,
o peptídeo sinal é clivado e a proteína liberada no periplasma. Durante o trânsito
periplásmico é questionável a ocorrência de modificações estruturais. Em seguida,
ocorre a translocação do domínio passageiro do periplasma para a superfície da
célula, através do beta domínio, inserido na membrana externa como beta barril,
com um poro hidrofílico central. Uma vez na superfície bacteriana, há caminhos
alternativos, o domínio passageiro pode ser processado e libertado para o ambiente
extracelular ou permanece em contato com a superfície bacteriana por interações
não covalentes com o beta domínio. (Henderson et al., 2004).
A árvore filogenética das proteínas autotransporte, derivada da
análise do domínio C-terminal, apresenta 11 grupos, sendo um deles o grupo da
serina protease autotransporte de Enterobacteriaceae (SPATE) (Henderson et al.,
2004). Membros da família SPATE são proteínas de E. coli e Shigella spp., que
apesar de possuírem uma sequência de aminoácidos altamente conservada, onde
está presente o sítio ativo serina, semelhante à IgA1 protease; não clivam IgA1, não
foram encontradas em microrganismos não patogênicos, são de alto peso molecular
e altamente imunogênicas (Henderson et al., 2004).
Tsh é uma proteína autotransporte sintetizada como uma proteína
precursora de 140kDa, que durante a maturação sofre processos proteolíticos
resultando em ao menos 2 proteínas, domínio C-terminal de 33kDa (resíduo 1101 a
1377 do precursor) que se insere na membrana externa, para mediar a translocação
do domínio passageiro para o exterior da célula, e o domínio secretado de 106kDa
20
(resíduo 53 a 1100 do precursor). A presença da proteína precursora de 140kDa e
do domínio C-terminal de 33kDa não foi confirmada em amostras selvagens
(Stathopoulos et al., 1999).
Tsh se caracteriza por conferir o fenótipo de hemaglutinação em
eritrócitos de galinha, quando a bactéria é cultivada a 26ºC. Curiosamente, o
aumento na temperatura de incubação, de 26ºC para 37ºC, levou a uma diminuição
do título de hemaglutinação, mas a um aumento na expressão da proteína de 106
kDa. Também foi observado que somente células totais, e não o sobrenadante,
foram capazes de conferir o fenótipo de hemaglutinação. Diante destes resultados,
Stathopoulos et al. (1999) sugeriram que baixos níveis da proteína de 140 kDa
estavam presentes e seriam responsáveis pela hemaglutinação. Os mesmos autores
sugeriram ainda que a expressão da hemaglutinina Tsh, em baixas temperaturas,
permitiria aderência ao trato respiratório durante contato inicial com o hospedeiro,
enquanto a temperatura corpórea do hospedeiro levaria à expressão de adesinas ou
outros fatores importantes na virulência, e reduziria a expressão do fenótipo de
hemaglutinação.
Depois da descrição do Tsh, muitas proteínas SPATE tem sido
identificadas, como por exemplo, SepA, uma proteína extracelular (Benjelloun-
Touimi et al., 1995) e Pic, proteína envolvida na colonização intestinal em amostras
de Shigella spp. (Henderson et al., 1999). SAT, uma toxina de E. coli uropatogênica
(Guyer et al., 2000); EspC, proteína secretada por E. coli enteropatogênica (Stein et
al., 1996); EspP proteína secretada por E. coli enterohemorrágica (Brunder et al.,
1997) e Pet, toxina de E. coli enteroagregativa (Eslava et al., 1998), também
pertencem ao grupo SPATE. Todas estas proteínas possuem alto nivel de
homologia, mas demonstram especificidade a substratos distintos (Dutta et al.,
2002). Algumas das SPATEs, como EspC, EspP, Sat e Pet, tem sido reportadas
como citotoxinas para diferentes tipos de células. EspC e Pet podem clivar
espectrina, pepsina e fator V de coagulação humana. Pepsina e fator V da
coagulação são também processados por EspP. Sat, por outro lado, cliva espectrina
e fator V da coagulação humana. As proteínas Tsh e Pic tem sido descritas como as
únicas SPATE capazes de clivar mucina, sendo esta capacidade importante para
patógenos de mucosa (Dutta et al., 2002).
Kostakioti & Stathopoulos (2004) demonstraram que a Tsh
s
purificada
é capaz de se ligar a eritrócitos de carneiro, hemoglobina aviária, colágeno IV e
21
fibronectina, mas nenhuma ligação significante foi detectada com mucina e laminina.
Demonstraram também que Tsh
s
é capaz de degradar caseína, sendo crítica a
porção serina para atuação da proteína como protease. O sítio responsável pela
aderência parece ser independente da porção serina, ou seja, as atividades
proteolítica e de aderência pertencem à diferentes domínios da proteína.
A atividade proteolítica da proteína Tsh sobre os substratos mucina
submaxilar de boi, caseína e fator V de coagulação sangüínea sintético (Dutta et al.,
2002), indicam uma possível ação da Tsh sobre um número limitado de substrato
específico. Mucinas são glicoproteínas presentes no muco epitelial de diversos
sistemas, entre eles o sistema respiratório de aves. Devido à sua alta viscosidade,
possuem papel fundamental na lubrificação e na proteção contra substâncias
nocivas e infecciosas (Lillehoj & Kim, 2002; Kawakubo et al., 2004). A degradação
completa ou parcial de moléculas de mucina por enzimas microbianas constitui o
passo fundamental para a quebra de defesa da barreira mucosa. Inúmeros
patógenos tem desenvolvido fatores de virulência, como mucinases, proteases ou
glicosidases, para a degradação da barreira mucosa, ou simplesmente como fonte
de nutrientes (Crowther et al., 1987; Dutta, et al., 2002; Aristoteli & Willcox, 2003;
Roberton et al., 2005). Ainda não está claro o papel real da proteína Tsh na
degradação da mucina no processo infeccioso, para tanto seria necessário
caracterizar a expressão da proteína em amostras selvagens, avaliando as melhores
condições ambientais para esta expressão.
Muitos métodos para avaliar a capacidade mucinolítica de uma
bactéria foram descritos. Entre eles, incubação da bactéria ou da proteína em ágar
contendo mucina e visualização da atividade mucinolítica após coloração com negro
de amido, SDS-PAGE corado com reagente de Schiff (PAS) e cromatografia por
exclusão de tamanho, utilizando bactéria ou proteína incubada com mucina,
comparada à mucina não tratada (Henderson et al., 1999; Dutta et al., 2002.,
Aristoteli & Willcox, 2003). Uma vez que, nenhum desses métodos é capaz de
avaliar a massa molecular da proteína envolvida no processo mucinolítico, nenhum
deles poderá detectar a proteína mucinolítica em amostras selvagens.
Devido à elevada incidência da colibacilose, que acarreta perdas
econômicas significativas, e a busca crescente por novas informações que
auxiliariam no controle desta patologia na indústria avícola, o presente trabalho tem
como objetivo a análise da expressão e a caracterização funcional da proteína
autotransporte Tsh de E. coli.
22
2 OBJETIVOS
1. Análise do efeito da temperatura e dos meios de cultivo na
expressão da hemaglutinina temperatura sensível (Tsh) em amostras selvagens de
APEC.
2. Caracterização funcional das duas porções protéicas da proteína
autotransporte Tsh em amostras selvagens de APEC.
3. Avaliação da capacidade mucinolítica da proteína Tsh frente à
mucina de diferentes origens, inclusive mucina de traquéia de ave.
4. Determinação da massa molecular da proteína Tsh envolvida no
processo mucinolítico.
23
3 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho podemos
concluir que:
A proteína Tsh em amostras selvagens de E. coli se
apresenta predominantemente em duas formas, na forma de uma proteína de
membrana externa (OMP) com 33kDa (Tsh
β
)
e na forma secretada com 106kDa
(Tsh
s
).
A produção do Tsh
β
é independente das condições
ambientais (temperatura e meio de cultura), sendo expressa quando a bactéria foi
cultivada em LB, CFA ou Mucina, à 26ºC, 37ºC ou 42ºC. Em contrapartida, a
produção do Tsh
s
não ocorreu à 26ºC, e foi expressa melhor quando a bactéria foi
cultivada em presença de mucina.
Tsh
β
tem função hemaglutinante e Tsh
s
tem função
mucinolítica. A Tsh recombinante (r-Tsh) possui ambas as funções.
A r-Tsh é capaz de degradar mucina de estômago de
porco, glândula submaxilar de boi e de traquéia de ave.
SDS PAGE copolimerizado com mucina é um método que
possibilita avaliar a massa molecular da proteína envolvida no processo mucinolítico.
24
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32
Fig.1. Expression of the 140 kDa protein by clone E. coli/pET101-tsh and
immunological response of this protein in chickens. (A) SDS-PAGE 8% stained with
Coomassie brilliant blue. (B) Western blot with anti-Tsh antibody and anti-chicken
IgG conjugated with peroxidase. Lane 1, E. coli BL21; lane 2, clone BL21/pET101-
tsh induced with IPTG 1mM; lane 3, eluted Tsh. The band of approximately 140 kDa
corresponds to Tsh protein.
Fig. 2. Western blot of fractions from APEC 13 grown under different media and
temperatures. (A) Supernatant fractions, lanes (1) as control, recombinant E. coli BL
21 Star
TM
(DE3)/tsh; (2) LB medium, 26ºC; (3) CFA, 26ºC; (4) CFA, 37ºC; (5) CFA,
42ºC; (6) Mucin, 26ºC; (7) Mucin, 37ºC; (8) Mucin, 42ºC. (B) Pellet fractions, lanes
(1) E. coli BL 21 Star
TM
(DE3)/tsh; (2) LB, 26ºC; (3) LB, 42ºC; (4) CFA, 26ºC; (5)
CFA, 37ºC; (6) CFA, 42ºC; (7) Mucin, 26ºC; (8) Mucin, 37ºC; (9) Mucin, 42ºC. The
positions of molecular mass markers (kDa) are shown at the left.
33
Fig. 3. Mucinolytic activity of the Tsh protein, evidenced on gels containing added
mucins as substrates. (A) Bovine submaxillary mucin; (B) chicken tracheal mucus;
(C) Porcine Gastric Mucin; Lanes (1) pellet from E. coli BL 21 Star
TM
(DE3); (2) pellet
from recombinant E. coli BL 21 Star
TM
(DE3)/tsh; (3) purified r-TSH protein; (4)
lyophylized supernatant from APEC 13 grow in mucin broth at 37ºC; (5) concentrated
supernatant from APEC 13 grown in mucin broth at 37ºC. The positions of molecular
mass markers are indicated at the left.
Fig.4. Inhibition of mucinolytic activity of the Tsh protein by anti-Tsh antibody. Lanes A:
purified r-TSH protein; B: purified r-TSH protein incubated with 5 µl of anti-Tsh; C:
purified r-TSH protein incubated with 10 µl of anti-Tsh. The positions of molecular mass
markers are indicated at the left.
34
ANEXOS
35
ANEXO 1
ARTIGO1: EXPRESSION, HEMAGGLUTINATING AND MUCINOLYTIC ACTIVITIES
OF THE TSH PROTEIN FROM AN AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA
COLI (APEC) STRAIN
36
Expression, hemagglutinating and mucinolytic activities of the Tsh protein from an avian
pathogenic Escherichia coli (APEC) strain
Authors: Renata K. T. Kobayashi, Luis Carlos J. Gaziri and
Marilda C. Vidotto*
Universidade Estadual de Londrina, Departamento de
Microbiologia, Campus Universitário, Caixa postal 6001, 86051-970 Londrina,
Paraná, Brazil.
Key Words: Avian Escherichia coli, temperature-sensitive
hemagglutinin (Tsh), virulence factor, functional characterization
*Universidade Estadual de Londrina, Depto de Microbiologia -
CCB
Campus Universitário, Caixa Postal 6001, 86051-970 –
Londrina, Pr- Brazil.
Fone: 55- 021 43 3371 4396. Fax: 55- 021 43 33274207
Email:[email protected]
37
Abstract
The temperature sensitive hemagglutinin (Tsh) expressed by strains of avian pathogenic
Escherichia coli (APEC) has both agglutinin and protease activities. Tsh is synthesized as a 140
kDa precursor protein, whose processing results in a 106 kDa passenger domain (Tsh
s
) and a 33
kDa β-domain (Tsh
β
). Both r-Tsh (140 kDa) and pellets from wild APEC13, which contain
Tsh
β
(33 kDa), agglutinated chicken erythrocytes. Both r-Tsh and supernatants from APEC13,
which contain Tsh
s
(106 kDa), caused proteolysis of chicken tracheal mucins. Chicken anti-Tsh
serum inhibited the hemagglutinating activity of strains APEC13 and recombinant E. coli
BL21/pET101-tsh, and it also inhibited the mucinolytic activity of Tsh protein.
1 Introduction
The temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) expressed by avian pathogenic
Escherichia coli (APEC) confers the phenotype mannose-resistant hemagglutination (MRHA) of
chicken erythrocytes to bacteria grown at 26°C on low-osmolarity solid medium (Provence and
Curtiss, 1992, 1994). The tsh gene was detected in APEC, but not in E. coli isolated from the
faeces of healthy chickens, which suggests that it possibly has a role in the pathogenicity of
APEC (Maurer et al., 1998; Dozois et al, 2000). The deduced sequence of 4.4 kb of Tsh
presented homology to the serine-type immunoglobulin A (IgA) proteases of Neisseria
gonorrhoeae and Haemophilus influenzae (Provence and Curtiss, 1994), and as Tsh is secreted
similarly to type IgA serine-proteases, it was classified into the subfamily of autotransporter
proteins denominated “SPATE” (“serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae”)
(Henderson et al., 1998; Stathopoulos et al., 1999; Dozois et al. 2000).
Maturation of Tsh produces two proteins, a 106 kDa extracellular protein (Tsh
s
), and a 33
kDa outer membrane protein (Tsh
β
). The 106 kDa protein contains the serine-protease motif,
which is also found in secreted IgA proteases, but it did not cleave human IgA, or chicken IgA
(Stathopoulos et al., 1999), although Tsh did cleave bovine submaxillary gland mucin and
coagulation factor V (Dutta et al., 2002). Tsh
s
adheres to red blood cells, hemoglobin, and the
extracellular matrix proteins fibronectin and collagen IV, but does not adhere to mucin. It was
also demonstrated that Tsh
s
exerts proteolytic activity against casein (Kostakioti & Stathopoulos,
2004).
APEC isolated in Brazil often carry the tsh gene (Delicato et al., 2002), whereas non-
pathogenic strains do not carry it, which strengthens the contention that it is an important
38
virulence factor and a possible target for vaccine development. We previously cloned the tsh
gene (R. C. Simões, R. K. T. Kobayashi, L. C. J. Gaziri, and M. C. Vidotto, submitted for
publication), and in this study we investigated expression and functional characteristics of Tsh
from a brazilian isolate of APEC.
2 Material and Methods
Bacterial strains and growth conditions
APEC 13 strain, serotype O2: H9; APEC 27 strain, serotype O36:H35; APEC 35,
serotype O153:H17 (Moura et al., 2001) were isolated from colibacillosis lesions. The E. coli BL
21 Star
TM
(DE3) strain (Invitrogen) was used as receptor of recombinant plasmid pET 101-tsh,
which allows high-level expression of T7-regulated genes. The strains E. coli BL21 Star
TM
(DE3)
and E. coli HB101 were used as negative controls.
Bacteria were routinely grown in Luria-Bertani (LB) broth or agar; E. coli BL21
Star(DE3)/tsh was grown in media containing added ampicillin (100µg/ml). The wild strain
APEC 13 was grown in agar colonization factor antigen (CFA), and in agar mucine (10ml
5XM9; 0.5g Porcine Gastric
Mucin - PGM, Type III; Sigma, St Louis, Mo.; 1g agar; 50ml dH
2
O).
Mucin solutions were previously autoclaved at 121ºC for 15 min. Strains grown in broth were
cytospun (5000 rpm, 10 min., 4ºC), the pellet was frozen, and the supernatant was filtered and
lyophylized. Strains grown in agar were suspended in 2 ml of 0.85% NaCl, spun (14000 rpm, 40
min., 4ºC), the pellet was frozen, and the supernatant filtered (0.8µm and 0.45µm Millipore
filters).
TSH protein purification
The strain E. coli BL 21 Star
TM
(DE3)/tsh was grown in 50ml of LB broth, at 37ºC, and
1mM of IPTG (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) was added when the culture
reached OD
600
equal to 0.6, followed by further 4h of incubation. The protein was purified, as
directed by the manufacturers of ProBond (Invitrogen).
Antibody production and purification
The purified r-Tsh protein (100
µ
g) was resolved by SDS-PAGE (8% gels), the 140kDa
protein was removed and intramuscularly inoculated together with Freund's adjuvant into
chickens. Four days after the second boost, chickens were bled, and the serum was separated,
39
inactivated, and adsorbed on E. coli BL 21 Star
TM
(DE3). Control sera were obtained from non-
immunised chickens.
Analysis of Tsh by SDS PAGE and Western Blotting
Cell lysates and purified protein were suspended in electrophoresis sample buffer (0.025M
Tris-HCl, 2% SDS, 15% glycerol, 2.5% 2-mercaptoethanol, pH 6.8), boiled for 5 min, and
electrophoresed on SDS 5-12% polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Gels were either stained with
Comassie blue or set up for Western blot. Proteins were transferred onto nitrocellulose
membranes (Pharmacia Biotech) and the membranes were blocked in blocking buffer (PBS +
0.1% Tween 20 + 5% nonfat dry milk) for 1 h at room temperature under agitation. The
membranes were washed in PBS-T (PBS + 0.1% Tween 20) and incubated for 1 h in a 1:40000
dilution of serum Anti-Tsh. The membranes were then washed and the protein Tsh was detected
by means of enhanced chemioluminescence (ECL) Western Blotting System (Amersham
International, Amersham, United Kindom). Protein molecular weight markers (BenchMark
TM
Pre-Stained Protein Ladder, Invitrogen) were used as standards.
To verify the location of the Tsh protein, APEC 13 strain was grown on CFA broth at 26°C
to induce Tsh protein synthesis. The OMPs were purified as previously described (Griffiths et
al., 1983) and analysed by SDS-PAGE, and transferred onto nitrocellulose membrane for
Western blotting.
Hemagglutination assay
Hemagglutination activity was tested by microhemagglutination (Provence and Curtiss,
1992). Bacteria grown on CFA (colonisation factor antigen) agar plates at 26
o
C for 48 h were
harvested and suspended in 0.85% NaCl. When cells were assayed for hemagglutination activity,
the suspension of cells was serially diluted in 0.85% NaCl containing methyl-α-
D-
mannopyranoside (1%) (Sigma, St. Louis, USA) to inhibit hemagglutination by type1 fimbriae
and then was added to each well of a 96-well round-bottom microplate containing a suspension
of fresh chicken erythrocytes. The reactions were incubated for 1 h on ice. Wells containing an
even sheet of erythrocytes across the well were considered positive, whereas those containing a
small erythrocyte pellet at the bottom of the well were considered negative. To test the presence
of inhibitory antibodies in the immune serum, APEC 13, BL21/pET101-tsh and BL21 strains
were incubated with anti-Tsh serum and control serum for 30 min on ice, and then tested by the
micro-hemagglutination assay.
40
Extraction of mucine from chicken trachea
Chicken tracheal mucin was obtained from 10 bled roosters. Their tracheas were removed
under asseptic conditions, slit lengthwise, and their mucus collected by gently scraping the
surface with a sterile spatula. The mucus was homogenized, filtered, concentrated on
Centriprep® YM-10
Centrifugal Filter Units (Millipore), and further filtered on 0.45µm filters
(Millipore). Samples of this preparation were plated on LB agar to test for bacterial
contamination. Protein content was assayed by Lowry's method (Miller, 1959).
Assay of Tsh mucinase activity
Polyacrylamide gels (8%) copolimerized with 10mg (1.25mg/ml) of mucin were used to
assay the mucinase activity of r-Tsh protein and cellular preparations. Porcine gastric mucin
(
Type III; Sigma, St Louis, Mo.), bovine submaxillary mucin (Type I, Sigma Chemical Co.), and
chicken tracheal mucin preparation were used as substracts.
After electrophoresis, the gels were treated with 1% Triton X-100 for 1h, rinsed, and
incubated for 40h in mucinase buffer (0.05M Tris-HCl, pH 8.0; 0.01M CaCl
2
; 0.15M NaCl). The
gel was then fixed, rinsed for 24h in several solutions of isopropanol and acetic acid, and stained
by Schiff's periodic acid technique. Inhibition of the mucinolytic activity was tested by
incubation of 5 µl or 10 µl anti-Tsh antibody (42mg/ml) with 10 µl of Tsh (67µg/ml) for 30min
at room temperature.
Proteolytic activity of APEC 13 was also tested in agar plates containing either albumin,
or casein, or mucin, which were incubated for 24h at 37ºC and stained with amido black.
3 Results
Purification of recombinant Tsh protein and localization of Tsh protein on APEC
Expression and purification of Tsh was tested on recombinant E. coli BL21/pET 101-tsh)
and APEC 13, in the supernatants and pellets of strains grown in several media and at different
temperatures.
The profile of bands on SDS-PAGE shows the presence of induced Tsh (Fig. 1A, lane 2)
by comparison with strain E. coli BL21 (Fig. 1A, lane 1). The recombinant Tsh (r-Tsh) was
effectively purified from resin ProBond and presents approximately 140 kDa (Fig. 1A, lane 3).
The reactivity of r-Tsh with the anti-Tsh serum on Western blot is shown on lane (Fig 1B, lanes
2 and 3).
41
The anti-Tsh antibody also recognized, by Western blot, a 106 kDa protein in the
supernatants from APEC 13 culture (Fig. 2A) and a 33 kDa protein in the pellet from APEC13
(Fig. 2B). Extracts of outer membrane proteins (OMP) of APEC 13 also presented the 33 kDa
protein that reacted with anti-Tsh antibody.
Supernatants from APEC 13 cultures presented a protein of about 106 kDa when the
bacteria were grown at either 37ºC or 42ºC in CFA agar (Fig. 2 A, lane 4 and 5), although this
protein was more evident when the bacteria were grown at 37ºC in mucin agar (Fig 2A, lane 7).
This 106 kDa protein was not detected when the bacteria were grown at 26ºC in any of the
culture media used in this study (Fig.2A, lane 2 and 3). A 106 kDa protein was also detected in
the supernatants when the bacteria were grown in mucin broth at 37ºC for 48h. The 140 kDa
protein was not found in the supernatants from APEC 13 cultures. Supernatants from APEC 27
and APEC 35 also presented the 106 kDa protein when grown at 37ºC in mucine-agar, and the
33 kDa protein in the pellet, when grown at 26ºC in CFA.agar.
Pellets from APEC 13 cultures presented a protein of about 140 kDa, when the bacteria
were grown at 26ºC in LB agar or CFA agar (Fig. 2 B, lanes 2 e 4). When the bacteria were
grown in either LB agar, CFA agar, or mucin agar, at either 26ºC, 37ºC, or 42ºC, the culture
pellets also presented a 33 kDa protein. Pellets from cultures of bacteria grown in liquid medium
presented proteins of about the same relative molecular masses as those detected after growth in
agar.
Tsh hemagglutinating activity
Both the recombinant E. coli BL21/pET 101-tsh and APEC13 agglutinated chicken
erythrocytes, and this hemagglutination was inhibited by the anti-Tsh antibody, whereas the
BL21 strain (tsh
-
) was non-agglutinating, indicating that pET101-tsh contains the structural gene
that codifies the hemagglutinin Tsh. Supernatants from APEC 13 cultures grown in CFA broth at
37ºC did not cause hemagglutination. OMP extracts from APEC 13 grown at either 26ºC or 37ºC
caused hemagglutination, which was inhibited by the anti-Tsh antibody. The 140 kDa purified r-
Tsh protein caused agglutination of chicken erythrocytes, which was inhibited by the anti-Tsh
antibody.
Tsh mucinolytic activity
Both the recombinant E. coli BL21/pET 101-tsh and the protein r-Tsh cleaved bovine
submaxilary mucin (Fig. 3A, lanes 2 and 3), chicken tracheal mucin (Fig 3B, lanes 2 and 3 ) and
42
pig gastric mucin (Fig. 3C, lanes 2 and 3). The wild strain BL21 did not cleave any of those
mucins (Fig. 3A, B, C; lane 1).
Concentrated supernatants from APEC 13 cultures presented mucinolytic activity (Fig.
3A, lane 4 and 5), whereas its pellets did not present mucinolytic activity (picture not shown). A
clear halo of protein degradation was observed around colonies of APEC 13 grown in agar
mucine; this was not observed when the bacteria were grown in either albumin agar or casein
agar, nor when it was grown in mucin agar supplemented with glucose (pictures not shown).
The anti-Tsh antibody also inhibited the mucinolytic activity of Tsh recombinant protein
(Fig.4).
4 Discussion
Chicken anti-Tsh sera recognized r-Tsh protein, but did not recognize any protein from
recipient strain E. coli BL21, showing that it was highly specific for Tsh. This sera recognized a
106 kDa protein in supernatants from APEC 13 grown at 37ºC and a 33 kDa in the culture
pellets, showing that the 140 kDa protein was cleaved into those smaller proteins. This
conclusion is corroborated by the observation that supernatants from APEC 13 cultures grown at
37ºC did not contain detectable 140 kDa protein, whereas the pellets from cultures grown at
26ºC did contain the 140 kDa protein. Thus, those observations suggest that wild APEC 13
processes Tsh in a temperature dependent way which parallels the original findings in
recombinant E. coli K-12 (Provence and Curtiss III, 1994; Stathopoulos et al., 1999)
Purified r-Tsh agglutinated chicken erythrocytes, and this agglutination was inhibited by
anti-Tsh antibody, showing that in aqueous solution the 140 kDa Tsh carries an active agglutinin
domain. Since supernatants from APEC 13 cultures, which contain the 106 kDa protein, but do
not contain the 140 kDa protein, did not cause hemagglutination, whereas OMP extracts of
bacteria grown at either 26ºC or 37ºC, which contain the 33 kDa protein, did cause agglutination,
it seems that APEC directed proteolysis of the 140 kDa protein occurred at both growth
temperatures. However, an alternative interpretation of these data cannot be excluded. Since
APEC 13 cells grown at 26ºC caused hemagglutination and presented the 140 kDa protein,
whereas their supernatants did not contain detectable amounts of 106 kDa protein, and given that
purified r-Tsh caused agglutination, it is also possible that agglutination caused by cells grown at
26ºC was due to native membrane-bound 140 kDa protein, and that the presence of the 33 kDa
protein in their OMP extracts was caused by cleavage during cell disruption and membrane
pelleting procedures. This latter alternative implies that APEC directed release of Tsh
s
occurrs
43
preferentially at 37ºC, and not at 26ºC, which could represent an interesting adaptation to release
proteolytic activity in a medium where it would be useful for bacterial growth.
Both r-Tsh protein and supernatants from APEC 13 cultures (which contain the 106 kDa
protein) presented mucinolytic activity. APEC 13 grown in agar mucine also presented
proteolytic activity, which was not observed when the bacteria were grown in some other agar
protein media or in mucine-agar supplemented with glucose. This suggests that the mucinolytic
activity of Tsh might be important for the colonization of the avian tracheal mucous environment
by APEC.
Acknowledgments
This work was supported by “Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico”
(CNPq) and “Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior” (CAPES).
References
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3. Dozois CM, Dho-Moulin M, Brée A, Faribrother JM, Desautels C, Curtiss III R (2000)
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6. Henderson IR, Navarro-Garcia F, Nataro JP (1998) The great scape: structure and function of
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44
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9. Miller GL Protein determination for large numbers of samples (1959). Analytical Chemistry,
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10. Moura AC, Irino K, Vidotto MC (2001) Genetic Variability of avian Escherichia coli
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11. Provence DL, Curtiss III, R (1992) Role of crl in avian pathogenic Escherichia coli: a
knockout mutation of crl does not affect hemagglutination activity, fibronectin binding or
curli production. Infect. Immun 60: 4460-4467.
12. Provence DL & Curtiss III R (1994) Isolation and characterization of a gene involved in
hemagglutination by avian pathogenic Escherichia coli strain. Infect. Immun 62: 1369-1380.
13. Stathopoulos, C., Provence, D., Curtiss III, R., 1999. Characterization of the avian
pathogenic Escherichia coli hemagglutinin Tsh, a member of the immunoglobulin A protease-
type family of autotransportes. Infect. Immun. 67, 772-781.
45
ANEXO 2
ARTIGO 2: DETECTION OF TSH PROTEIN MUCINOLYTIC ACTIVITY BY SDS
PAGE
46
Detection of Tsh protein mucinolytic activity by SDS PAGE
Authors: Renata K. T. Kobayashi, Luis Carlos J. Gaziri and Marilda C. Vidotto
*Universidade Estadual de Londrina, Depto de Microbiologia - CCB
Campus Universitário, Caixa Postal 6001, 86051-970 – Londrina, Pr- Brazil.
Fone: 55- 021 43 3371 4396. Fax: 55- 021 43 33274207
Email: [email protected]
47
Abstract
Mucins are glycoproteins present in epithelial mucous secretions, which exert a
protective function due to their high viscosity. Some bacteria produce mucinolytic proteins,
such as the temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) secreted by Escherichia coli. In this
work we detected the mucinolytic activity of Tsh by SDS-PAGE in gels containing mucins as
substrates.
Mucus is a thick secretion that coats many epithelial surfaces (oral cavity, respiratory
tract, eyes, gastrointestinal tract, bladder and cervix); it is mainly composed by glycoproteins
termed mucins. Mucins plays an important role in animal and human health, as it lubricates
those epithelial surfaces and protects them against noxious substances and infections (Lillehoj
and Kim, 2002; Kawakubo et al., 2004). Partial or complete degradation of mucin molecules
by microbial enzymes is often a fundamental step in disruption of defensive mucosal barriers.
Microbial pathogens developed virulence mechanisms, such as mucinases, proteases and
glycosidases that disrupt the mucin barrier (Crowther et al., 1987; Dutta et al., 2002; Aristoteli
and Willcox, 2003; Roberton et al., 2005).
The temperature-sensitive hemagglutinin (Tsh) is a bi-functional protein with both
adhesive and proteolytic properties, which is secreted by some pathogenic strains of
Escherichia coli. Native Tsh (140 kDa) is cleaved into a 33 kDa outer membrane and a 106
kDa extracellular protein (Provence & Curtiss, 1992, 1994; Stathopoulos et al., 1999; Dutta et
al., 2002; Kostakioti and Stathopoulos, 2004). Since methods currently used for the detection
of mucinolytic activity (Henderson et al., 1999; Dutta et al., 2002; Aristoteli & Willcox, 2003)
do not allow immediate evaluation of the molecular mass of the proteolytic Tsh fragment, in
this study we characterized the mucinolytic fragment by SDS-PAGE in gels containing
diverse mucins as substrates.
Strain E. coli BL21 Star (DE3)/tsh recipient of the recombinant plasmid pET 101-tsh
was used for expression of the Tsh protein (R. C. Simões, R. K. T. Kobayashi, L. C. J. Gaziri,
and M. C. Vidotto, submitted for publication). The wild strain APEC13, serotype O2:H9
harboring tsh gene, and strain E. coli BL21 Star
TM
(DE3) were used as controls.
The strain E. coli BL 21 Star
TM
(DE3)/tsh was grown in Luria-Bertani (LB) broth
containing added ampicillin (100µg/ml), at 37ºC, and induced by the addition of IPTG (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). The protein was purified, as directed by the
manufacturers of ProBond (Invitrogen). The wild strain APEC 13 was grown in mucin broth
(10ml 5XM9; 0.5g Porcine Gastric Mucin - PGM, Type III; Sigma, St Louis, Mo.; 50ml dH
2
O).
48
Mucin solutions were previously autoclaved at 121ºC for 15 min. (Aristoteli and Willcox,
2003). Samples were cytospun (5000 rpm, 10 min., 4ºC), the pellet was frozen, and the
supernatant was filtered and lyophylized.
To test Tsh mucinolytic activity, porcine gastric mucin (
Type III; Sigma, St Louis, Mo.),
bovine submaxillary mucin (
Type I, Sigma Chemical Co.), and chicken tracheal mucin
preparation were used as substrates. Chicken tracheal mucin was obtained from 10 bled
roosters. Their tracheas were removed under aseptic conditions, slit lengthwise, and their
mucus collected by gently scraping the surface with a sterile spatula. The mucus was
homogenized, filtered, concentrated on Centriprep® YM-10
Centrifugal Filter Units
(Millipore), and further filtered on 0.45µm filters (Millipore). Samples of this preparation
were plated on LB agar to test for bacterial contamination. Protein content was assayed by
Lowry's method.
The polyacrylamide gels (8%) copolymerized with 10mg (1.25mg/ml) of mucin were
treated with 1% Triton X-100 for 1h, rinsed, and incubated for 40h in mucinase buffer (0.05M
Tris-HCl, pH 8.0; 0.01M CaCl
2
; 0.15M NaCl). The gel was then fixed and. rinsed in solution
containing isopropanol 25% and acetic acid 10% for 2h, isopropanol 10% and acetic acid 10%
for 12h and lastly, acetic acid for 10h with several washings. The gel was stained by Schiff's
periodic acid technique; the coloration phase was started by the oxidation with periodic acid
1% and acetic acid 3% for 1h. The gel was washed 6 times, each washing with distilled water
lasting 10min, and placed into Schiff reagent, protected from light for 50 min, then bleached
with sodium metabisulphite 0.5% and visualized.
Inhibition of the mucinolytic activity was tested by incubation of 5µl anti-Tsh
antibody (42 mg/ml) with 10µl of Tsh (67µg/ml) for 30 min at room temperature.
Both the recombinant E. coli BL21/pET 101-tsh and the protein r-Tsh cleaved bovine
submaxilary mucin (Fig. 1A, lines 2 and 3), chicken tracheal mucin (Fig 1B, lines 2 and 3 )
and pig gastric mucin (Fig. 1C, lines 2 and 3). The wild strain BL21 did not cleave any of
those mucins (Fig. 1A, B, C; line 1). The gel allowed detection of 0.5µg of mucinolytic
protein. The anti-Tsh antibody inhibited the mucinolytic activity of Tsh recombinant protein
(Fig. 2).
Concentrated supernatants from APEC 13 cultures, which contain the secreted 106
kDa protein, presented mucinolytic activity (Fig. 1A, lines 4 and 5).
Tsh has currently received great attention, both for its bi-functional characteristics and
for its potential as a target for the development of a vaccine against colibacillosis (Stewart-
49
Tull et al, 2004), which is a disease that causes important worldwide economic losses to the
poultry industry. In this study we developed a simple and fast method that allows direct
detection of the mucinolytic activity of r-Tsh (140 kDa) and of its secreted portion (106
kDA), which could be useful in the preparative steps of further Tsh studies.
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and proteinase. Vaccine. 22(17-18), 2137-2145.
51
Fig. 1. Mucinolytic activity of the Tsh protein, evidenced on gels containing added
mucins as substrates. (A) Bovine submaxillary mucin; (B) chicken tracheal mucus;
(C) Porcine Gastric
Mucin. Lanes (1) pellet from E. coli BL 21 Star
TM
(DE3); (2) pellet
from recombinant E. coli BL 21 Star
TM
(DE3)/tsh; (3) purified r-TSH protein; (4)
lyophylized supernatant from APEC 13 grow in mucin broth at 37ºC; (5) concentrated
supernatant from APEC 13 grown in mucin broth at 37ºC. The positions of molecular
mass markers are indicated at the left.
52
Fig. 2. Inhibition of mucinolytic activity of the Tsh protein by anti-Tsh antibody. Lanes A:
purified r-TSH protein; B: purified r-TSH protein incubated with 5 µl of anti-Tsh; C:
purified r-TSH protein incubated with 10 µl of anti-Tsh. The positions of molecular mass
markers are indicated at the left.
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