( PDF ) Avaliação da resposta fisiológica de girinos de rãs-touro (Rana catesbeiana) submetidos aos mecanismos estressores de captura, hipóxia e transporte

Download PDF

ads:

GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS

INSTITUTO DE PESCA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQÜICULTURA E PESCA

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA FISIOLÓGICA DE

GIRINOS DE RÃ-TOURO (Rana catesbeiana)

SUBMETIDOS AOS MECANISMOS ESTRESSORES DE

CAPTURA, HIPÓXIA E TRANSPORTE

Guilherme Casoni da Rocha

Orientador: Cláudia Maris Ferreira Mostério

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Aqüicultura e Pesca do

Instituto de Pesca – APTA - SAA, como

parte dos requisitos para obtenção do titulo

de Mestre em Aqüicultura e Pesca.

São Paulo

Outubro - 2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ads:

GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO

AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS

INSTITUTO DE PESCA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQÜICULTURA E PESCA

AVALIAÇÃO DA RESPOSTA FISIOLÓGICA DE

GIRINOS DE RÃ-TOURO (Rana catesbeiana)

SUBMETIDOS AOS MECANISMOS ESTRESSORES DE

CAPTURA, HIPÓXIA E TRANSPORTE

Guilherme Casoni da Rocha

Orientador: Cláudia Maris Ferreira Mostério

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-graduação em Aqüicultura e Pesca do

Instituto de Pesca – APTA - SAA, como

parte dos requisitos para obtenção do titulo

de Mestre em Aqüicultura e Pesca.

São Paulo

Outubro - 2007

Dedico aos meus pais, Ivete e José por tudo

o que fizeram por mim até hoje e por serem

responsáveis pela minha formação, aos meus

irmãos Gustavo e Mariana, à minha avó

Maria, ao meu avô Elvino (in memoriun),

aos meus avós João e Ana Auta, à minha

namorada Adriana, ao meu “amigão” Ozzy

e ao meu primo Gabriel Kimbão.

AGRADECIMENTOS

À Dra. Cláudia Maris Ferreira Mostério, pela oportunidade, orientação,

paciência e dedicação.

À Dra. Adriana Sacioto Marcantonio pelo auxílio na condução do experimento

no Ranário Experimental do Setor de Aqüicultura do Pólo Regional do Vale do Paraíba.

À Dra. Marta Verardino de Stéfani, da Unesp, Jaboticabal-SP, pelo fornecimento

dos girinos utilizados no experimento.

Aos amigos Patrícia, Antonio, Fernanda, Danielle e Sílvia.

À Flávia e à Tathiane, estagiárias do Pólo Regional do Vale do Paraíba, pelo

auxílio nas análises.

Ao Djanil, do Ranário Experimental de Pindamonhangaba, pela dedicação e

colaboração.

Ao Márcio do Ranário da Unesp Jaboticabal-SP, pelo auxílio.

Aos motoristas do Instituto de Pesca, especialmente ao João batista, pela grande

colaboração.

À Margareth e à Sônia da Gênese, pelo empréstimo dos equipamentos e apoio

técnico.

Ao Dr. Antenor da Unasp pela colaboração nas análises laboratoriais.

Ao Marcelo, estatístico, que auxiliou na interpretação dos resultados.

A todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a realização deste

trabalho.

Ao Instituto de Pesca, Pólo Regional do Vale do Paraíba, Caunesp e Unasp pelo

auxílio e colaboração.

À FAPESP pela bolsa e financiamento do projeto.

SUMÀRIO

Índice de Tabelas e Figuras..............................................................................iii

Resumo.............................................................................................................viii

Abstract...............................................................................................................ix

1 - Introdução......................................................................................................1

1.1 - Revisão Bibliográfica...................................................................................3

1.1.1 - Sangue de anfíbios..................................................................................3

1.1.2 - Estresse...................................................................................................5

1.1.3 - Estresse em anfíbios..............................................................................10

1.1.4 - Hipóxia...................................................................................................12

1.1.5 - Transporte..............................................................................................13

1.2 - Justificativa e Objetivos.............................................................................15

2 - Material e Métodos.......................................................................................17

2.1 - Experimento 1 - Captura e Hipóxia...........................................................18

2.1.1 - Amostragem Biológica e Local de Experimentação...............................18

2.1.2 - Alimentação e Manejo............................................................................19

2.1.3 - Tratamentos ..........................................................................................19

2.1.4 - Coleta de Sangue..................................................................................22

2.1.5 - Avaliação dos Parâmetros Fisiológicos (cortisol e glicose)...................23

2.1.6 - Avaliação dos Parâmetros Hematológicos............................................25

2.2 - Experimento 2 - Transporte......................................................................28

2.2.1 - Procedimentos Experimentais ..............................................................28

2.2.2 - Coleta de Sangue..................................................................................28

2.3 - Análise dos Resultados.............................................................................29

3 - Resultados e Discussão...............................................................................30

3.1 - Experimento 1 - Captura e Hipóxia...........................................................31

3.1.1 - Dados Biológicos e Variações Ambientais.............................................31

3.1.2 - Análise de Cortisol.................................................................................32

3.1.3 - Análise de Glicemia...............................................................................38

3.1.4 - Parâmetros Hematológicos....................................................................42

3.2 - Experimento 2 - Transporte......................................................................48

3.3 - Considerações Finais................................................................................50

4 - Conclusões..................................................................................................54

5 - Referências Bibliográficas............................................................................56

6 - Anexos ........................................................................................................69

iii

Índice de Figuras e Tabelas

FIGURA 1 - Girino de rã-touro (Rana catesbeiana) utilizado na experimentação

.....................................................................................................18

FIGURA 2 -Tanques de polipropileno (500 litros) adaptados com sistema

hidráulico para entrada e escoamento da água em fluxo contínuo

(A). Estufa agrícola coberta com polietileno e tela sombrite 50%

(B).................................................................................................19

FIGURA 3 - Esquema do delineamento amostral dos tanques contendo girinos

de R. catesbeiana, submetidos aos mecanismos estressores de

captura e hipóxia...........................................................................21

FIGURA 4 - Bandejas plásticas utilizadas para exposição aérea dos animais

.....................................................................................................22

FIGURA 5 - Material e Equipamentos utilizados para leitura de placas de Elisa e

glicemia, kit de cortisol e agitador (A), lavadora (B) e leitora placas

de Elisa (C); kit de glicemia (D), banho Maria (E) e

espectrofotômetro para leitura de glicemia (F)...............................25

FIGURA 6 - Câmara de Neubauer (A), esquema do retículo (B) para a contagem

de glóbulos vermelhos (R) e leucócitos (W); detalhe do retículo

central (C); microhematócrito e leitor (D), centrífuga de hematócrito

(E); cianometahemoglobina (F), centrífuga de tubos (G) e

espectrofotômetro para leitura da hemoglobina (H); confecção das

extensões sangüíneas (I), esquema do procedimento da Contagem

Diferencial e Total de Leucócitos e Total de Trombócitos

(J)....................................................................................................27

FIGURA 7 - Valores de cortisol plasmático (ng/mL) nos distintos tratamentos e

coletas realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25

e 75% da amostra, respectivamente .............................................34

FIGURA 8 - Valores de cortisol plasmático (ng/mL) obtidos a partir de animais

que foram privados (H) ou não (N) de oxigênio nas coletas

realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25

e 75% da amostra, respectivamente............................................. 35

FIGURA 9 - Valores de glicose plasmática (mg/dL) nos distintos tratamentos e

coletas realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25

e 75% da amostra, respectivamente..............................................39

FIGURA 10 - Valores de glicose plasmática (mg/dL) obtidos a partir de animais

que foram privados (H) ou não (N) de oxigênio nas coletas

realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25

e 75% da amostra, respectivamente...........................................40

FIGURA 11 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos

aos efeitos estressores de captura e hipóxia. T1 – captura

individual com puçá; T2 – captura em massa com puçá e T3 –

captura por escoamento. (N) Normóxia – coleta de sangue

imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue após 15 minutos de

exposição ao ar; Lf% - porcentagem de linfócitos; Nt% -

porcentagem de neutrófilos; Lf abs - número absoluto de linfócitos

e Nt abs - número absoluto de neutrófilos.....................................44

FIGURA 12 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos de girinos de rã-touro, R. catesbeiana,

submetidos aos efeitos estressores de captura e hipóxia. T1 –

captura individual com puçá; T2 – captura em massa com puçá e

T3 – captura por escoamento. (N) Normóxia – coleta de sangue

imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue após 15 minutos de

exposição ao ar; Bs% - porcentagem de basófilos; Es% -

porcentagem de eosinófilos; Bs abs - número absoluto de

basófilos e Es abs - número absoluto de

eosinófilos.................................................................................. 45

FIGURA 13 - Valores médios (X) e desvio padrão da média (EPM) da

quantificação de cortisol plasmático (ng/mL) de girinos de rã-

touro, R. catesbeiana, submetidos ao efeito estressor de

transporte. AN - antes do transporte; 0T - momento zero após

transporte; 15T - 15 minutos após transporte; 30T - 30 minutos

após transporte; 45T - 45 minutos após transporte; 60T - 60

minutos após transporte; 90T - 90 minutos após transporte; 24T

- 24 horas após transporte.......................................................49

TABELA 1 - Valores médios e desvio padrão da temperatura da água, oxigênio

dissolvido, pH e condutividade elétrica, obtidos nos tanques

durante realização do experimento................................................31

TABELA 2 - Valores médios (x) de cortisol plasmático (ng/mL) e desvio padrão

(DP) de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos

mecanismos estressores de captura e hipóxia, nos diferentes

tratamentos e períodos de coleta..................................................33

TABELA 3 - Análise de Variância (ANOVA) realizada com resultados da

quantificação de cortisol plasmático em girinos de rã-touro....... 33

TABELA 4 - Valores médios (X) de glicose plasmática (mg/dL) e desvio padrão

(DP) de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos efeitos

estressores de captura e hipóxia, nos diferentes tempos de

coleta..............................................................................................38

TABELA 5 - Valores de F e P dos resultados estatísticos obtidos pela análise de

variância (ANOVA) nos distintos tratamentos, coletas e animais

que foram ou não privados de oxigênio........................................ 38

TABELA 6 - Valores médios (X) de glicose plasmática de anuros do gênero

Rana........................................................................................... 41

TABELA 7 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos (Ht, Hb e Er) de girinos de rã-touro, R. catesbeiana,

submetidos aos efeitos estressores de captura e hipóxia............ 42

vii

TABELA 8 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos os índices

hematimétricos absolutos (VCM, HCM e CHCM) de girinos de rã-

touro, R. catesbeiana, submetidos aos efeitos estressores de

captura e hipóxia.......................................................................... 43

TABELA 9 - Valores médios (X) e erro padrão (EPM) de parâmetros

hematológicos de rã-touro, R. catesbeiana............................. 47

TABELA 10 - Valores médios (X) de cortisol plasmático (ng/mL) e desvio

padrão (DP) de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos

ao mecanismo estressor de transporte, nos diferentes tempos

de coleta ................................................................................. 48

viii

Resumo

A avaliação dos parâmetros fisiológicos de anfíbios anuros permite que,

através de seus resultados, sejam diagnosticados problemas de manejo que

podem ser oriundos de efeitos estressores de diversas origens. Este trabalho

teve como objetivo utilizar os marcadores biológicos de cortisol, glicemia e

dados hematológicos (número de eritrócitos (Er), hematócrito (Ht), taxa de

hemoglobina (Hb), contagem total e diferencial dos leucócitos e os índices

hematimétricos absolutos: VCM, HCM e CHCM), para avaliar a resposta de

girinos de rã-touro (Rana catesbeiana), no estágio de pró-metamorfose, aos

mecanismos estressores de captura, hipóxia e transporte. No 1º experimento

os animais foram submetidos a três tratamentos: estresse por captura

individual com puçá; estresse por captura em massa com puçá e estresse por

captura por escoamento, que são os manejos tradicionalmente empregados na

criação de rãs (ranicultura). Cada tratamento foi conduzido com três réplicas

simultâneas, dispostas de maneira aleatória, e de cada réplica foram

analisados 4 organismos (2 normóxia – coleta imediata de sangue, e 2 hipóxia

– coleta de sangue após exposição aérea por 15 minutos). Foram realizadas

duas coletas com intervalo de 5 dias. Para avaliar o estresse causado por

transporte colocaram-se os girinos em sacos plásticos com água que foram

transportados por um período de 4 horas. Após a chegada, os animais foram

aclimatados e divididos em aquários (1girino/L) de acordo com os diferentes

tempos a serem testados. Os tempos definidos para as coletas de sangue

(grupos) foram: M0 (coleta de sangue antes do transporte), 0T, 15, 30, 45, 60,

90 minutos e 24 horas após a chegada dos animais. Nos experimentos de

captura, hipoxia e transporte a análise estatistica demostrou não haver

diferenças significativas entre os parâmetros avaliados quando comparou-se os

tratamentos e a exposição ou não ao ar (hipóxia e normóxia). Os dados médios

variaram de 2,1 a 5,0 ng/mL de cortisol plasmático; 49,3 a 104,3 mg/dL de

glicose plasmática; Er: 49,66 ± 5,01 10

/mm

; Ht: 30,22± 3,41 %; Hb: 5,79 ±

0,36 g/100 mL; VCM: 732,10 ± 238,69 fL; HCM: 147,87 ± 47,52 pg/cel; CHCM:

18,88 ± 1,47 %; Lf: 91,85 ± 1,40 % ; Nt: 1,36 ± 0,94 % ; Bs: 5,18 ± 1,17 %; Es:

1,65 ± 0,50 % e Mn: não detectados. Atraves destes resultados pode-se

concluir que os marcadores biologicos de estresse utilizados (cortisol e glicose)

não foram alterados pelos manejos de captura testados, pela exposiçao aerea

e pelo procedimento de transporte. Recomenda-se que outros marcadores

sejam testados para quantificar o estresse causado por estas situaçoes.

Palavras-chave: rã, estresse, cortisol, glicose, hipóxia, transporte

Abstract

The evaluation of physiological parameters of anuran amphibians allows the

diagnosis of problems in their culture that can be due to stressor effects of

diverse origin. The aim of this work was to utilize the biological markers plasma

cortisol and glucose levels and hematological parameters (erythrocyte number

(Er), hematocrit (Ht), hemoglobin level (Hb), total and differential leukocyte

count and the RBC indices: MCV, MCH and MCHC), to evaluate the response

of bullfrog tadpoles (Rana catesbeiana), in the stage of pro-metamorphosis, to

stressor conditions of capture, hypoxia and transport. On the first part to

evaluate capture and hypoxia’s stressor, the animals were submitted the three

treatments: stress due to individual capture with a hand net; stress due to batch

capture with a hand net; and stress due to capture by emptying, traditional

handling methods used l in raising bullfrogs (frog farming). Each treatment was

carried out in triplicate in a random manner, and 4 organisms were analyzed for

each replicate (2 animals were sampled on normoxia – blood collected

immediately, and 2 animals were sampled on hypoxia – blood collected after 15

min exposure to air). Two samplings were performed with an interval of 5 days.

On the second part to evaluate transport’s stressor tadpoles were placed into

the plastic bags with water and carried out for 4 hours. After the arrival, the

animals had been acclimatized and distributed in aquariums (1 tadpole L

-1

) in

accordance with the different blood collection times to be tested: M0 (collection

of blood before the transport), 0T (immediately collection after arrived), 15, 30,

45, 60, 90 minutes and 24 hours after arrived. In the capture, hipoxia and

transport experiment the statistic analisys demostrated that were no differences.

The means for the physiological parameters varied of 2,1 a 5,0 ng mL

-1

for

plasma cortisol and 49,3 a 104,3 mg dL

-1

for plasma glucose, while the

hematological parameters were as follows: RBC, 49.66 ± 5.01 10

/mm

; Ht,

30.22± 3.41 %; Hb, 5.79 ± 0.36 g 100 mL

-1

; MCV, 732.10 ± 238.69 fL; MCH,

147.87 ± 47.52 pg/cell; MCHC, 18.88 ± 1.47 %; Lf: 91.85 ± 1.40 % ; Nt, 1.36 ±

0.94 % ; Bs, 5.18 ± 1.17 %; Es, 1.65 ± 0.50 %; and Mn, not detected. Through

of these results can be concluded that the biological markers of stress used

(cortisol and glucose) had not been modified by the tested handling of capture,

for air exposition until 15 minutes and for the transport procedure. One sends

regards that other markers are tested to quantify stress for these situations.

Key words: frog, stress, cortisol, glucose, hypoxia, transport

1 - INTRODUÇÃO

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

A maior parte da carne de rã consumida no mundo é ainda proveniente

de caça, com conseqüente diminuição dos estoques naturais. Devido à

consciência ecológica atual e pressão de ambientalistas foram desenvolvidas

leis para proteger as espécies ameaçadas (TEIXEIRA et al., 2001). O controle

sobre a caça incentivou o consumo de carne provinda de animais criados em

cativeiro, e um dos favorecidos com esse consumo e pioneiro na tecnologia de

criação de rãs em cativeiro é o Brasil (FONTANELLO, 1994).

Segundo FERREIRA et al. (2002) a ranicultura no Brasil tem como

principal espécie de criação a rã-touro (Rana catesbeiana). Outras espécies,

nativas de nosso país, como a rã-pimenta, a rã-manteiga e a paulistinha,

também podem ser criadas, mas em comparação à rã-touro apresentam um

menor desempenho produtivo (baixa prolificidade), maiores dificuldades

técnicas (poucos estudos) e burocráticas (grande número de autorizações).

Praticamente toda a produção brasileira (400 ton/ano) é consumida pelo

mercado interno, apenas uma pequena parcela é exportada, tendo como

principal mercado os EUA (TEIXEIRA et al., 2001; FERREIRA et al., 2003).

Popularmente conhecida como rã-touro, a espécie R. catesbeiana,

natural do Canadá, após excelente adaptação ao clima predominante existente

no Brasil e aos diferentes manejos físicos e alimentares, foi adotada

nacionalmente pela ranicultura comercial. Os fatores predominantes desta

escolha foram suas características zootécnicas, tais como: rusticidade

(facilidade de manejo), precocidade (crescimento rápido) e prolificidade (alto

número de ovos por postura) e o fato de raramente serem acometidas por

patologias causadoras de morte em caráter epidêmico (FONTANELLO, 1994;

FERREIRA et al., 2002).

Ainda de acordo com os autores anteriormente citados, a produção e

desenvolvimento dessa espécie no Brasil apresentam-se superior a do seu

país de origem (EUA), ou seja, em média não ultrapassam sete meses de

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

duração para as fases de girino e engorda. Em algumas regiões da América do

Norte, este mesmo desempenho chega a durar cerca de quatro anos.

Com base nessas informações entendemos que estudos relacionados à

fisiologia de R. catesbeiana são necessários para dar subsídios às pesquisas

que produzam informações importantes e úteis, tanto para o meio acadêmico,

quanto para profissionais que trabalham com o cultivo comercial dessa

espécie.

1.1 - Revisão Bibliográfica

1.1.1 - Sangue dos Anfíbios

O sangue dos anfíbios é composto por plasma e elementos figurados

conhecidos como eritrócitos, leucócitos e trombócitos (DUELLMAN e TRUEB,

1986). Nos anfíbios anuros a volemia é de aproximadamente 9% do seu peso

corporal (WILSON, 1989), e existe uma diferenciação hematológica conforme o

sexo, espécie, fases da metamorfose, estado nutricional, estação sazonal e

temperatura (HARRIS, 1972). Em anfíbios, na fase larval, o eritrócito mede

aproximadamente 14 por 23 mm com 400.000 ou mais por mm

de sangue. São

células elípticas, achatadas e nucleadas (DUELLMAN e TRUEB, 1986).

Especificamente em rãs-touro os eritrócitos de girinos apresentam uma

vida mais curta do que a dos adultos; e durante a metamorfose, são capturados

por macrófagos do fígado e baço para serem destruídos (HASEBE et al.,

1999). Segundo DUELLMAN e TRUEB (1986) existem diferenças morfológicas

entre os glóbulos vermelhos de formas adultas e larvais de anuros.

Singularmente, os eritrócitos dos girinos são maiores que os de rãs

metamorfoseadas. Um dos fatores que contribui para esse processo é o fato

dessas células em girinos possuírem maior quantidade de retículo

endoplasmático. A seqüência de amadurecimento destes eritrócitos ocorre da

seguinte forma: eritróide precursor ou rubrócito ® eritroblasto ® eritroblasto

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

policromático ® reticulócito ® eritrócito normocromático (TURNER, 1988).

Segundo FORMAN e JUST (1976), o tempo de vida dos eritrócitos de girinos

de R. catesbeiana é de aproximadamente 100 dias. A hemoglobina (pigmento

respiratório) contida nos glóbulos vermelhos desta espécie semi-aquática tem

menor afinidade pelo oxigênio que em outras espécies (aquáticas) como

Necturus sp (HILL, 1980). O clima (mudanças estacionais), por sua vez,

provoca respostas de acomodação cardio–respiratória nos anfíbios (BICEGO e

BRANCO, 1999). A concentração de hemoglobina diminui durante a letargia

invernal e a hipóxia resultante induz hipotermia, provavelmente como

mecanismo de defesa (HILL, 1980).

DUELLMAN e TRUEB (1986) e TURNER (1988) citam que são

encontrados cerca de 7.000 leucócitos por mm

, divididos nas seguintes

categorias:

Linfócitos - com núcleo redondo, cromatina densa e citoplasma basofílico;

mais numerosos no sangue periférico de girinos do que de rãs adultas.

Neutrófilos – são as células de defesa primária e possuem núcleo quase

sempre segmentado.

Basófilos - também comumente encontrado no sangue periférico de

anuros larvais, inclusive em R. catesbeiana, mostram núcleo sem

segmentação e citoplasma com exuberantes grânulos basofílicos.

Eosinófilos - apresentam núcleo segmentado e numerosos grânulos

ovalados ou esféricos, fracamente acidófilos no citoplasma.

Monócitos - raramente encontrados, possuem um núcleo que ocupa

quase que totalmente a célula, possuindo um citoplasma levemente

vacuolado e fracamente basofílico.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

Os anuros possuem ainda trombócitos nucleados, com função

semelhante às plaquetas dos mamíferos.

É observando quali e quantitativamente estes elementos que se pode ter

idéia do estado de saúde dos animais, refletindo através de seu aumento ou

diminuição, problemas nutricionais (carências por alimentação inadequada em

quantidade e/ou qualidade), má absorção intestinal, parasitoses, infecções,

inflamações, estresse, distúrbios metabólicos, intoxicações, desidratações,

hipóxia e outras anomalias (RANZANI-PAIVA e SILVA SOUZA, 2004; COPPO

et al., 2005).

As variáveis da série vermelha, eritrograma, são de grande valia na

identificação de processos anemiantes (MAHONEY e McNULTY, 1992),

enquanto o leucograma pode ser empregado como auxílio no diagnóstico dos

processos infecciosos (RANZANI-PAIVA e EIRAS, 1992) e outros estados de

desequilíbrio homeostático.

Assim, o sangue constitui-se em uma excelente ferramenta biológica

dentro da patologia, e o estudo de sua morfologia e bioquímica pode fornecer

subsídios essenciais para elucidação do comportamento de diversos

hormônios, entre eles, aqueles ligados ao estresse (TEIXEIRA, 2007).

1.1.2 - Estresse

O estresse pode ser definido como uma condição na qual o equilíbrio

dinâmico do organismo do animal (homeostase) é quebrado, como resultado

de ações de um estímulo intrínseco e/ou extrínseco, chamado estressor

(PICKERING, 1981). Animais submetidos a condições estressantes sofrem

adaptações à quebra da homeostase (ADAMS, 1990). Mudanças fisiológicas

compensatórias e/ou adaptativas foram observadas por BONGA (1997) quando

os animais têm sua homeostase ameaçada.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

Segundo relato de VAL et al. (2004) os estressores podem ser de origem

química, física, biológica ou mesmo do manejo dos animais. Diversos fatores

podem levar a uma resposta fisiológica de estresse, como por exemplo,

temperatura e qualidade da água, idade, condições fisiológicas, fatores sociais,

características herdáveis ou adquiridas, linhagem e espécies diferentes,

mudanças abruptas ou extremas no ambiente físico, interações sociais

(predação, parasitismo, competição intensiva por alimento, espaço ou parceiros

sexuais) e interferência humana (incluindo o manejo) (BONGA, 1997). Esses

fatores individualmente ou em conjunto podem oferecer estresse ao sistema

fisiológico dos animais (ADAMS, 1990).

A resposta ao estresse em organismos aquáticos tem a participação do

sistema nervoso (nervos simpáticos e células cromafins) e do sistema

endócrino (eixo hipotálamo-hipófise-celulas inter-renais) e, segundo SUMPTER

(1993) e BONGA (1997) podem ser divididos em três etapas. Na 1ª etapa

ocorre a ativação dos centros cerebrais, o que culmina em uma intensa

liberação de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e corticóides

(principalmente cortisol). Na 2ª etapa há ações imediatas e efeitos destes

hormônios que foram liberados no sangue e nos tecidos como, por exemplo,

aumento dos batimentos cardíacos, consumo de oxigênio, alterações na

glicemia, no hematócrito e no número de leucócitos. A 3ª etapa é caracterizada

por ser um estágio de exaustão, que causa a queda de desempenho e a

diminuição da resistência a doenças e conseqüente contaminação dos animais

por bactérias e fungos oportunistas podendo levá-los à morte (IRWIN et al.,

1999; GOMES et al., 2003).

Corroborando os autores citados acima, MOBERG (2000) propõe um

modelo de resposta do animal ao estresse. Esse modelo sugere que a resposta

biológica ao estresse se dá a partir de três estágios gerais: 1º reconhecimento

de um estímulo estressante; 2º a defesa biológica contra o estímulo

estressante e 3º, as conseqüências das respostas ao estresse.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

A principal função do eixo que forma a resposta ao estresse em

mamíferos (eixo hipotálamo – glândulas pituitárias – supra-renais (adrenais)), e

em particular a resposta adrenocortical ao estresse agudo, é reduzir o impacto

causado pelo agente estressor ao animal e esta redução é feita através de

respostas comportamentais ou fisiológicas (BALM, 1999).

Nos vertebrados, uma resposta clássica ao estresse agudo é a liberação

de uma classe de hormônios, os glicocorticóides (principalmente cortisol).

Estes hormônios promovem mudanças fisiológicas e comportamentais tais

como uma rápida produção de glicose e a cessação provisória da reprodução

(SAPOLSKY et al., 2000).

De acordo com GOMES et al. (2003) e SUMPTER (1993) o cortisol

plasmático e a glicose são os marcadores biológicos mais utilizados e

apresentam uma boa resposta na avaliação de estresse.

O cortisol ou hidrocortisona é um glicocorticóide que está relacionado ao

metabolismo alimentar, as inflamações e ao estresse. Seu efeito mais

importante é estimular a conversão das proteínas em glicose e seu

armazenamento sob forma de glicogênio. Sua liberação ocorre quando há o

estimulo estressor e este estímulo leva à ativação da tríade CRH – ACTH –

Cortisol. O CRH (Hormônio Liberador de Corticotropina) é produzido e liberado

pelo hipotálamo, após sua liberação, atua sobre a glândula pituitária anterior,

estimulando a produção e liberação de ACTH (Corticotropina), o efeito que o

ACTH vai gerar sobre o córtex adrenal é a liberação de cortisol. O controle da

liberação de cortisol é realizado principalmente através de feedback negativo

(podendo ser um feedback de alça curta ou de alça longa), mas também possui

outras formas de regulação tais como: ciclo circadiano (diários),

ultracircadianos (dentro de um mesmo dia), estágios do sono, variação

sazonal, etapas de desenvolvimento (fetal, neonatal, puberal, etc.) e estresse

(VOET et al., 2000; GUYTON e HALL, 2002; HICKMAN et al., 2003).

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

As mudanças nas funções biológicas durante o estresse culminam em

uma troca de recursos biológicos, como por exemplo, a energia que seria

utilizada no crescimento do animal jovem vai ser utilizada no combate ao

estresse. Essa mudança na função biológica durante o estresse é definida por

MOBERG (1996) como “custo biológico de estresse”. Quando o estresse é

muito intenso, o custo biológico é significativo, e diante de um custo

significativo o animal pode apresentar os estágios pré-patológicos e

patológicos.

O cortisol exerce efeito em diversas funções do organismo, dentre elas

estão os efeitos sobre o metabolismo dos carboidratos, proteínas e gorduras e

processos inflamatórios. Segundo SUMPTER (1993) existem muitas

conseqüências de uma elevada taxa do mesmo, e apenas uma parte delas é

conhecida, portanto, representam uma luz para guiar as pesquisas. Algumas

dessas conseqüências em vertebrados (CELIS, 1998) são:

Músculos – níveis basais de cortisol são necessários para manter a

contratilidade e o trabalho máximo do músculo esquelético e do

cardíaco. O excesso provoca atrofia e fraqueza por causa do consumo

protéico.

Ossos – o principal efeito do cortisol é diminuir a formação óssea, em

casos de excesso, há uma grande redução da massa óssea e redução

do crescimento.

Tecidos Conjuntivos - torna a pele e a parede capilar mais delgada e em

conseqüência pode haver o rompimento facilmente.

Sistema Vascular – o cortisol é necessário para a manutenção da

pressão sangüínea normal e consequentemente alterações nos níveis

deste hormônio prejudicam a manutenção deste processo.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

Rins – o cortisol aumenta a filtração glomerular. Também é essencial

para a rápida excreção de uma carga de água.

Sistema Nervoso Central - ele modula de algum modo às funções de

percepção e de emoção. Sua falta ou excesso prejudica esses

processos. O excesso de cortisol interfere no sono normal.

A glicose é um composto orgânico, e tem como principal função

biológica servir de substrato energético para as células. A glicose também

participa da composição das glicoproteínas, dos glicopeptídos e glicolipídios

que desempenham funções estruturais e funcionais. Alguns destes compostos

são: colágeno da membrana basal, mucopolissacarídios, mielina das células

nervosas, hormônios e receptores hormonais (BERG et al., 2004).

Na forma de glicogênio, a glicose é armazenada no fígado e músculos

após a ocorrência da glicogênese (conversão de glicose em glicogênio). Em

situações que os níveis de cortisol estão altos, ocorre a gliconeogênese, ou

seja, as células hepáticas convertem proteínas e glicerol em glicose (FEDER e

BURGGREN, 1992; SCHMIDT-NIELSEN, 2002). O aumento (causado pelas

catecolaminas) e a manutenção do aumento (causado pelo cortisol) da glicemia

são importantes para proporcionar energia para a fuga ou enfrentamento de

uma situação adversa (BONGA, 1997) e segundo MOMMSEN et al. (1999)

para a resposta secundária ao estresse.

A glicose tem sido utilizada também para determinar o estresse por

hipóxia já que estudos demonstram que há um rápido aumento da glicose

quando o animal é submetido a hipóxia, como no caso de peixes (BARTON e

IWAMA, 1991; MCDONALD e MILLIGAN, 1992; RANDALL e PERRY, 1992;

ARENDS et al., 1999).

Em relação à manutenção dos níveis glicêmicos o cortisol é um

antagonista da insulina. O cortisol inibe a captação de glicose estimulada pela

insulina nos tecidos musculares e adiposos e bloqueia o efeito supressor da

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

insulina sobre a produção hepática de glicose. Os dois hormônios (cortisol e

insulina) favorecem o armazenamento hepático de glicogênio. O antagonismo

ocorre em relação à expressão dos genes para enzima gliconeogênica

(fosfoenolpiruvato carboxiquinase) e para a enzima de liberação da glicose

(glicose-6-fosfatase) e em consequência desses fatores, o cortisol favorece a

secreção de glicose pelo fígado enquanto a insulina a inibe. O resultado final

da exposição prolongada a excesso do cortisol consiste em elevação da

concentração plasmática e um aumento compensador dos níveis plasmáticos

de insulina. (HILL e WYSE, 1989; GUYTON e HALL, 2002).

1.1.3 - Estresse em Anfíbios

Em qualquer sistema de criação é inevitável o estresse aos animais e do

mesmo modo ocorre na aqüicultura. Geralmente as conseqüências são a

reduções do crescimento e ganho de peso, do desempenho reprodutivo e da

resistência a patógenos (IWAMA, 1993).

No que se refere ao estresse em anfíbios como a R. catesbeiana, não

existem muitos relatos científicos a este respeito, mas variações fisiológicas

como estas provavelmente também ocorrem com esta classe de animais.

Nos trabalhos experimentais de observação comportamental, realizados

por DUELLMAN e TRUEB (1986) relatou-se que rãs são animais que

facilmente se estressam.

Segundo FERREIRA et al. (2001) o estresse pode ser a causa de um

dos principais problemas da ranicultura, as patologias. Os agentes estressores

neste caso podem ser resultantes de sistemas de criação não apropriados,

manejos inadequados (físico, profilático, sanitário e alimentar), alterações

ambientais como temperatura e luminosidade, problemas na qualidade física e

química da água, bem como presença de outros animais, pessoas, dentre

outros.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

Nas diversas fases de desenvolvimento das rãs, são observadas

características em conseqüência da exposição a fatores estressantes. Em

girinos destaca-se a falta de apetite, apatia e nado desnorteado, entre outras

características. Na fase de pré-engorda e engorda os animais se empilham nos

cantos das baias, saltam de forma irregular, nas áreas úmidas são observados

excesso de pele, por vezes foi observado muco na forma de espuma. No

período reprodutivo, fêmeas estressadas abortam e produzem gritos

característicos enquanto os machos deixam de coaxar. Neste período os

animais tendem a ficarem escondidos tanto embaixo da água, quanto nos

abrigos (LIMA e AGOSTINHO, 1992; FERREIRA et al., 2001).

Os corticóides ou corticosteróides regulam processos metabólicos nos

anfíbios e se elevam em resposta à estresses agudos como manipulação e/ou

confinamento (LICHT et al., 1983; ZERANI et al., 1991).

O efeito do cortisol em relação aos hormônios tireoidianos é dependente

do estágio de desenvolvimento do girino e também muda durante a

metamorfose. Na pré-metamorfose há uma inibição da tireóide e na pró-

metamorfose há um estimulo. No clímax o efeito estimulador do cortisol sob a

tireóide diminui e o cortisol contribui para o declínio de tiroxina (T4) no plasma

dos girinos (WRIGHT et al., 1999).

Alguns dos momentos em que esses hormônios atuam são: na

regulação hormonal da metamorfose, antagonizando com as mudanças

induzidas pelos hormônios tireoidianos durante alguns estágios do

desenvolvimento, e mais tarde junto com os níveis elevados desses hormônios

aceleram a metamorfose (HAYES et al., 1993; KIKUYAMA et al., 1993;

WRIGHT et al., 1994); o crescimento dos membros em girinos de R.

catesbeiana é inibido pelo cortisol, assim como por outros corticóides, e

estimulado mais tarde na metamorfose quando os corticóides sinergizam com

níveis do clímax ou próximo aos níveis do clímax de T4 (WRIGHT et al., 1994).

O cortisol em sinergia com hormônios tireoidianos induz a queratinização da

pele das larvas (MILLER, 1996). Os glicocorticóides induzem apoptoses em

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

linfócitos larvais para efetuar uma reorganização do sistema imune dos girinos

na metamorfose (ROLLINS-SMITH et al., 1997).

O desenvolvimento, comportamento, e a morfologia de girinos podem

ser alterados em função de respostas às circunstâncias ambientais. Por

exemplo, o retardo do desenvolvimento de girinos na presença de concorrentes

(espaço e alimento) e a alteração do comportamento e da morfologia da cauda

na presença de predadores (BERVEN e CHADRA, 1988; SCOTT, 1990;

SMITH e VAN BUSKIRK, 1995; MCCOLLUM e VAN BUSKIRK, 1996).

Exemplos de alterações fisiológicas em função de circunstâncias

ambientais puderam ser observados por DENVER (1998) quando as taxas de

corticosteronas aumentaram em girinos de Scaphiopus hammondii quando o

nível da água em que os animais eram mantidos diminuiu. Da mesma forma

GLENNEMEIER e DENVER (2002) observaram estas alterações em Rana

pipiens quando os girinos foram expostos á concorrentes de intra-espécie.

Esses estudos demonstram a corticosterona como sendo um potencial

mediador fisiológico de respostas de girinos a variações em seus ambientes.

1.1.4 - Hipóxia

A hipóxia pode ser definida como a diminuição da pressão de oxigênio

(PO

) disponível, diferente do termo anóxia que significa “sem oxigênio”

(SWENSON e REECE, 1993).

Quatro tipos de hipóxia são descritos pelos autores citados acima:

- Hipóxia ambiental: o sangue arterial é insuficientemente saturado com

oxigênio por causa de uma PO

baixa no ambiente onde

se respira.

- Hipóxia anêmica: há um decréscimo no volume de oxigênio do sangue por

causa da diminuição do funcionamento da hemoglobina.

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

- Hipóxia estagnante ou hipóxia isquêmica: o fluxo de sangue está diminuído,

seja no corpo todo ou somente em

um tecido.

- Hipóxia histotóxica: as células são incapazes de utilizar o oxigênio que é

fornecido.

Observou-se que os peixes sofrem ajustes hematológicos a hipóxia tais

como: aumento do hematócrito (Ht), hemoglobina (Hb) e células vermelhas no

sangue (VAL et al., 1990; VAL e ALMEIDA VAL, 1995; VAL, 2000). Estes

valores resultam no aumento da capacidade de captar O

nas brânquias e

maior conteúdo de O

no sangue em peixes expostos a hipóxia (WEBER et al.,

1975; JENSEN et al., 1993). A utilização de variáveis hematológicas com Hb e

Ht pode indicar respostas dos peixes frente a situações de estresse como, por

exemplo, a hipóxia ambiental (DETHLOFF e BAIMAIER, 2001).

1.1.5 - Transporte

O transporte gera um conjunto de agentes estressores aos organismos

aquáticos que podem causar injúrias aos animais, tais como: manipulação

direta, vigorosa atividade muscular (o que pode diminuir o oxigênio das

células), exposição à baixa qualidade de água durante o transporte e a

movimentação constante das embalagens (MCDONALD e MILLIGAN, 1997;

BARTON et al., 1998).

O transporte é de extrema severidade aos animais como foi constatado

em matrinxãs (Brycon cephalus) em estudo realizado por INOUE (2003) que

observou uma excessiva perda de muco e escamas e agressões entre os

peixes durante o transporte.

Durante o transporte, o principal precursor do estresse é a abrasão

mecânica causada pelo inevitável contato entre os animais quando a

densidade é elevada (ROSS e ROSS, 1999).

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

GOMES (2002) cita que embora o transporte seja uma das operações

mais importantes da aqüicultura, pouca atenção tem sido dada ao assunto no

Brasil. O transporte como prática de manejo em piscicultura intensiva pode ter

duração variada dependendo da finalidade. Os peixes vivos são transportados

para diversos destinos, incluindo a indústria e os estabelecimentos voltados à

pesca esportiva, no caso de peixes adultos, e estabelecimentos de criação de

engorda, no caso de larvas e juvenis. Em todos os casos, os animais devem

chegar apresentando boas condições fisiológicas para satisfazer os critérios

exigidos pelo comprador (URBINATI e CARNEIRO, 2004).

KUBITZA (1997) descreve como sendo comum a mortalidade de peixes

devido à manipulação e ao transporte. Estes procedimentos rotineiros na

aqüicultura podem ser uma fonte importante de estresse á muitas espécies

(WEIRICH e TOMASSO, 1993; CARNEIRO e URBINATI, 2001). A resposta

dos peixes é parecida com a dos vertebrados terrestres, tendo como principal

característica à liberação de adrenalina e cortisol em um primeiro instante,

seguida por um quadro de hiperglicemia, diminuição de íons no sangue e

aumento dos níveis de água nos tecidos, assim como aumento da taxa

metabólica em peixes de água doce (MAZEAUD et al., 1977; EDDY, 1981).

Esse aumento da taxa metabólica é induzido por duas necessidades dos

animais, a primeira é uma requisição por uma demanda maior de energia para

lidar com o distúrbio, e a segunda é para corrigir o desequilibro iônico que

acompanha essa maior liberação de energia (BARTON e IWAMA, 1991).

Os efeitos deste tipo de estresse agudo prejudicam o desempenho dos

animais trazendo alterações no sistema imune, na osmoregulação, no

metabolismo e na reprodução (PICKERING, 1981; BONGA, 1997; IWAMA et

al., 1997).

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

1.2 - Justificativa e Objetivos

Diante do fato de que o Brasil é um produtor potencial de carne de rã em

cativeiro, existe a necessidade de se adequar ao máximo o confinamento às

necessidades dos animais.

RIBEIRO FILHO (1998) afirma que problemas de manejo, deficiência

alimentar, instalações inadequadas, má qualidade da água e doenças

provocadas por fungos causa a morte de girinos. Este acontecimento nesta

fase interfere negativamente na criação e pode ser decisivo no insucesso de

um empreendimento comercial (CASTRO e PINTO, 2000).

Com base nestas e outras bibliografias consultadas, que se referem à

produtividade dos ranários comerciais, entende-se que seria de grande

importância o estudo da resposta de girinos de rã touro (R. catesbeiana),

submetidos a tipos comuns de estresse que acontecem neste segmento da

aqüicultura (hipóxia, captura e transporte).

Uma das maneiras de alcançar esse objetivo e conseqüentemente maior

produção é conhecer os mecanismos de combate ao estresse e suas respostas

biológicas, que são importantes para a manutenção da saúde e bem-estar dos

animais.

Para tanto, analisou-se os seguintes marcadores biológicos:

ü Cortisol

ü Glicemia

ü Respostas hematológicas (Er, Ht, Hb, contagem total e diferencial dos

leucócitos, total de trombócitos e os índices hematimétricos absolutos:

VCM, HCM e CHCM)

Guilherme Casoni da Rocha Introdução

Dissertação

Através da mensuração destes marcadores biológicos pretendeu-se

avaliar o nível de estresse desenvolvido pelos animais diante de estressores

como hipóxia, diferentes métodos de captura e transporte.

2 – MATERIAL E MÉTODOS

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

2.1 - Experimento 1 – Captura e Hipóxia

2.1.1 - Amostragem Biológica e Local de Experimentação

Foram utilizados 2.700 girinos de rã-touro, R. catesbeiana (Figura 1), no

estágio 31 a 39 de GOSNER (1960), pró-metamorfose, dos quais 72 foram

amostrados para a coleta de sangue. Os animais foram provenientes do

Ranário Experimental do Centro de Aqüicultura da UNESP de Jaboticabal

(CAUNESP).

FIGURA 1 - Girino de rã-touro (Rana catesbeiana) utilizado na experimentação

Os animais foram aclimatados por 7 dias em tanques de polipropileno

(500 litros), na densidade de 1 girino/litro no Ranário Experimental do Pólo

Regional de Desenvolvimento Tecnológico dos Agronegócios do Vale do

Paraíba, em Pindamonhangaba-SP (PRDTAVP). Tais tanques contendo 300

girinos cada, foram acondicionados sob proteção de uma estufa agrícola, tendo

sua superfície coberta com plástico polietileno e suas laterais com sombrite

50% (Figura 2).

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

FIGURA 2 - Tanques de polipropileno (500 litros) adaptados com sistema hidráulico

para entrada e escoamento da água em fluxo contínuo (A). Estufa

agrícola coberta com polietileno e tela sombrite 50% (B)

2.1.2 - Alimentação e Manejo

Os animais foram alimentados com ração comercial marca Polinutri

(45% de proteína bruta, 6% FB e 9% EE), uma vez ao dia, na quantidade de

1% do peso vivo. A água dos tanques foi trocada, em sua totalidade, várias

vezes ao dia (sistema de fluxo contínuo). A temperatura ambiente, a umidade

relativa do ar e os parâmetros físicos e químicos da água (temperatura,

condutividade elétrica, pH, oxigênio) foram monitorados diariamente. A amônia

total e o nitrito foram medidos semanalmente com o uso de kit MERCK

, e a

amônia não ionizada (NH

) foi estimada através de fórmula (APHA, 1998). Os

eventuais animais mortos durante o período de experimentação foram retirados

diariamente dos tanques (período da manhã) para que não prejudicassem a

qualidade da água.

2.1.3 - Tratamentos

O experimento teve como controle, dados obtidos do sangue de animais

(n = 10) que não sofreram nenhum tipo de tratamento. Foram retirados do

tanque e imediatamente houve a coleta de sangue, este procedimento ocorreu

em Jaboticabal antes mesmo do transporte dos animais à Pindamonhangaba.

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

Os tratamentos conduzidos foram: estresse por captura individual com

puçá (Tratamento 1); estresse por captura em massa com puçá (Tratamento 2)

e, estresse por captura por escoamento (Tratamento 3), que são os manejos

tradicionalmente empregados na ranicultura. Cada tratamento foi conduzido

com três réplicas simultâneas, ordenadas de maneira aleatória

Após o período de aclimatação os animais foram sorteados para compor

os tratamentos de forma que cada tanque (réplica) abrigou 300 girinos. De

cada réplica foram analisados 4 indivíduos (2 normóxia – coleta imediata de

sangue, e 2 hipóxia – coleta de sangue após 15 minutos de exposição aérea).

Foram realizadas duas coletas com intervalo de 5 dias entre as mesmas

(totalizando 72 girinos em todo o experimento). Após serem submetidos aos

mecanismos estressores e antes da coleta de sangue os animais voltaram à

água por 30 minutos (Figura 3).

O tempo de 15 minutos para hipóxia foi escolhido após realização de

testes preliminares. Após este período fora da água os animais não

sobreviviam quando retornavam ao meio aquático (Figura 4, Anexo 2).

Puçá utilizado no tratamento 1 = 15 x 12 cm

Puçá utilizado no tratamento 2 = 30 x 24 cm

Cano de escoamento do tratamento 3 = 2 polegadas

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

FIGURA 3 - Esquema do delineamento amostral dos tanques contendo girinos de R.

catesbeiana, submetidos aos mecanismos estressores de captura e

hipóxia

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

2 2 2 2 2 2

12 animais

Tanque

Tratamento 1 (T1)

Captura individual com

puçá

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

2 2 2 2 2 2

12 animais

Tanque

Tratamento 2 (T2)

Captura em massa com

puçá

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

Normoxia

Hipóxia

2 2 2 2 2 2

12 animais

Tanqu

e A

Tanqu

e B

Tanqu

e C

Tratamento 3 (T3)

Captura por escoamento

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

FIGURA 4 – Bandejas plásticas utilizadas para exposição aérea dos animais

2.1.4 - Coleta de sangue

Para a coleta de sangue os animais eram retirados dos tanques e

submetidos a hipóxia em bandejas plásticas secas por 15 minutos (Figura 4) e,

em seguida, retornavam a água por mais 30 minutos. Os animais em normóxia

tinham o sangue coletado logo após a captura. Independente do método de

captura (individual com puçá, em massa com puçá ou por escoamento) o

procedimento após a saída do tanque era o mesmo. Uma alíquota de sangue

foi retirada por punção do vaso caudal com auxílio de agulhas descartáveis e

micropipetas com ponteiras heparinizadas. As coletas foram realizadas sempre

no período da manhã, respeitando-se o ritmo circadiano dos animais. O sangue

foi utilizado imediatamente após a coleta para a realização da avaliação dos

parâmetros hematológicos, o restante foi armazenado em microtubos de

polipropileno heparinizados e mantido sob resfriamento até a centrifugação

para a obtenção do plasma para a realização dos testes de quantificação de

cortisol e glicose.

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

2.1.5 - Avaliação dos Parâmetros Fisiológicos

As alíquotas de sangue (cerca de 100 mL/animal) utilizadas para as

análises fisiológicas de dosagem dos marcadores biológicos foram

centrifugadas a 5.000 rpm, por 5 minutos para a obtenção do plasma que foi

congelado (-20 ºC) até a realização das análises. Parte do plasma obtido foi

destinada aos testes para determinação do cortisol plasmático através do

método Elisa (Active – Cortisol EIA DSL10 – Diagnostic System Labs USA) e, a

outra parte, foi destinada aos testes de glicemia, determinados com kit

LABTEST

Cortisol

O procedimento seguiu o princípio básico do imunoensaio enzimático,

onde existe competição entre um antígeno não marcado e um antígeno

marcado com enzima por um número fixo de sítios de ligação no anticorpo. A

quantidade de antígeno marcado com enzima ligada ao anticorpo é

inversamente proporcional à concentração da substância não marcada que

está sendo analisada na amostra. O material não ligado é removido por

decantação e lavagem das cavidades (Princípio do Ensaio).

Inicialmente foi aguardado até que todos os reagentes e amostras

atingissem a temperatura ambiente (aprox. 25

C). Preparou-se então a

Solução de Conjugado Enzimático diluindo o Concentrado de Conjugado com o

Diluente de Conjugado (1 parte de Concentrado: 50 partes de Diluente). Em

seguida pipetou-se 25 mL de Padrões, Controles e Amostras nas cavidades

apropriadas e adicionou 100 mL de Solução de Conjugado Enzimático diluído a

cada cavidade utilizando um dispensador semi-automático. Bateu-se

suavemente no suporte de cavidades por 5-10 segundos. Adicionaram-se

ainda 100 mL de Anti-soro de Cortisol a cada cavidade utilizando dispensador

semi-automático.

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

Após um período de incubação à temperatura ambiente (aprox. 25

por um período de 45 minutos com auxílio de agitador ajustado para 500-700

rpm, aspirou-se e lavou-se cada cavidade 5 vezes com a solução de lavagem

diluída utilizando uma lavadora de microplacas semi-automática e em seguida

drenou-se a placa invertendo-a sobre material absorvente. Adicionou-se então

100 mL de Solução de Cromógeno TMB a cada cavidade, incubando

novamente as cavidades por mais 10 a 15 minutos à temperatura ambiente no

mesmo agitador.

Por final adicionou-se 100 mL de Solução de Interrupção a cada

cavidade, agitou-se suavemente com as mãos por 5-10 segundos e realizou-se

a leitura de absorbância da solução presente nas cavidades (30 minutos)

utilizando-se um leitor de microplacas ajustado para 450nm (Figura 5).

O resultado foi expresso em mg/dL e posteriormente transformado em

ng/mL.

Glicose

Da mesma forma aguardou-se até que todos os reagentes e amostras

atingissem a temperatura ambiente (aprox. 25

C). Tomou-se então um tubo

como “branco”, um como “padrão” e outros como “teste”. No branco foi

adicionado 1,0 mL do “Reagente 1”, no “padrão” foi adicionado 1 mL de

“Reagente 1” mais 10,0 mL de “Solução Padrão”, e nos tubos testes foram

adicionados 1,0 mL de “Reagente 1” mais 10,0 mL de soro.

Misturou-se vigorosamente o conteúdo dos tubos e em seguida estes

foram levados para o banho-maria a 37

C, durante 15 minutos, tomando-se o

cuidado de manter o nível da água acima do conteúdo dos tubos. Após o

tempo de incubação procedeu-se à leitura em absorbância das amostras em

espectrofotômetro a 505 nm acertando o zero com o branco (Figura 5). A

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

glicose foi estimada pela fórmula: Glicose (mg/dL) = absorbância do teste x

100/absorbância do padrão.

FIGURA 5 - Material e Equipamentos utilizados para leitura de placas de Elisa e

glicemia, kit de cortisol e agitador (A), lavadora (B) e leitora placas de

Elisa (C); kit de glicemia (D), banho Maria (E) e espectrofotômetro para

leitura de glicemia(F)

2.1.6 - Avaliação dos Parâmetros Hematológicos

Os parâmetros hematológicos avaliados e a metodologia seguiram as

recomendações internacionais, a saber: número total de eritrócitos (Er),

contados em câmera de Neubauer, utilizando-se a solução de Hayem como

diluente; hematócrito (Ht), pelo método do microhematócrito, segundo

GOLDENFARB et al. (1971); hemoglobina (Hb), pelo método da

cianometahemoglobina, segundo COLLIER (1944); contagem total e diferencial

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

dos leucócitos e total de trombócitos, em extensões sangüíneas coradas por

método de ROSENFELD (1947). Ainda, com os resultados do número de

eritrócitos, hematócrito e taxa de hemoglobina foram calculados os índices

hematimétricos absolutos: Volume Corpuscular Médio (VCM = Ht x 10/Er em

fentonlitros), Hemoglobina Corpuscular Média (HCM = Hb x 100/Er em

picogramas/célula), e Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média

(CHCM = Hb x 100/Ht em gramas/dL), segundo WINTROBE (1934). A

metodologia utilizada nestas análises encontra-se descrita no Anexo 1 e o

material utilizado pode ser visualizado na Figura 6.

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

FIGURA 6 - Câmara de Neubauer (A), esquema do retículo (B) para a contagem de

glóbulos vermelhos (R) e leucócitos (W); detalhe do retículo central (C);

microhematócrito e leitor (D), centrífuga de hematócrito (E);

cianometahemoglobina (F), centrífuga de tubos (G) e espectrofotômetro

para leitura da hemoglobina (H); confecção das extensões sangüíneas

(I), esquema do procedimento da Contagem Diferencial e Total de

Leucócitos e Total de Trombócitos (J)

F G H

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

2.2 - Experimento 2 - Transporte

2.2.1 - Procedimentos Experimentais

Foram utilizados girinos de rã-touro, R. catesbeiana, no estágio de pró-

metamorfose, estágio 31 a 39 da tabela de GOSNER (1960), provenientes do

Ranário Experimental do Centro de Aqüicultura da UNESP de Jaboticabal

(CAUNESP).

Inicialmente coletou-se sangue de 9 girinos logo após a retirada dos

animais dos tanques (momento zero). Em seguida os animais foram

acondicionados em sacos plásticos de polietileno (1,00 X 0,60 m) na densidade

de 3 girinos/litro, preenchidos com 2/3 de água oriunda de caixas d’água de

abastecimento do setor de aqüicultura e 1/3 de oxigênio. Estes sacos foram

transportados de carro de Jaboticabal a São Paulo, em uma viagem com

duração de 4 horas. Todo o procedimento (captura, embalagem e transporte)

teve a duração de 6 horas (02:00 às 08:00h). Após a chegada, os animais

foram aclimatados e divididos em aquários (1girino/L) de acordo com os

diferentes tempos a serem testados. Os tempos definidos para as coletas de

sangue (grupos) foram: 15, 30, 45, 60, 90 minutos e 24 horas após a chegada

dos animais do ponto de partida.

2.2.2 - Coleta de sangue

A coleta de sangue foi realizada no Laboratório de Patologia de

Organismos Aquáticos do Instituto de Pesca em São Paulo. Dez animais de

cada grupo foram retirados dos aquários, respeitando-se os tempos amostrais.

De cada indivíduo extraiu-se uma alíquota que foi armazenada em microtubos

de polipropileno heparinizados e mantidos sob resfriamento até a centrifugação

para a obtenção do plasma e realização dos testes de quantificação de cortisol,

que seguiram a mesma metodologia descrita anteriormente.

Guilherme Casoni da Rocha Material e Métodos

Dissertação

2.3 - Análise dos Resultados

Para verificar as diferenças entre os resultados dos dados das variações

ambientais, dos parâmetros fisiológicos e hematológicos e dos diferentes

tratamentos, foi realizada a análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de

Tukey. Os resultados foram considerados significativos quando p< 0,05 (ZAR,

1996).

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

3.1 - Experimento 1 - Captura e Hipóxia

3.1.1 - Dados biológicos e variações ambientais

Durante toda a experimentação a mortalidade foi mínima representando

1,57% dos animais (41 dos 2.700 girinos). Os organismos utilizados nas

coletas apresentaram peso médio de 9,5 ± 1,05 g e comprimento médio de

11,96 ± 1,31 cm.

Em relação à temperatura ambiente, podemos observar, com termômetros

de máxima e mínima, uma variação de 17,0 a 35,9 ºC e a umidade relativa do

ar, apresentou média de 75%.

Os resultados referentes ao monitoramento dos parâmetros físicos e

químicos da água não apresentaram diferença estatisticamente significativa

entre os tanques dos diversos tratamentos, que pudessem interferir na

experimentação. Esses resultados estão dispostos na Tabela 1.

TABELA 1 - Valores médios e desvio padrão da temperatura da água, oxigênio

dissolvido, pH e condutividade elétrica, obtidos nos tanques durante

realização do experimento

T O. D. pH C. E.

24,03 ± 0,70 3,18 ± 0,89 6,85 ± 0,12 54,97 ± 4,48

23,98 ± 0,78 3,09 ± 0,83 6,89 ± 0,17 55,03 ± 4,07

24,07 ± 0,79 3,31± 0,81 6,86 ± 0,10 53,71 ± 3,55

T1 - tratamento 1 (captura individual com puçá)

T2 - tratamento 2 (captura em massa com puçá)

T3 - tratamento 3 (captura por escoamento)

T - temperatura (ºC); O.D. - oxigênio dissolvido (mg/L); pH – potencial hidrogeniônico e

C.E. - condutividade elétrica (µS/cm)

Os parâmetros medidos semanalmente apresentaram resultados

semelhantes (sem diferença estatisticamente significante), em todos os

tanques independentemente do tratamento aplicado aos animais. A análise da

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

amônia total teve como resultado médio 0,05 mg/L, enquanto nitrito não foi

detectado em nenhum dos tanques. Com os resultados de amônia total,

temperatura e pH estimou-se a amônia não ionozável (NH

) que apresentou

resultado médio de 0,19 mg/L.

A presença de altas quantidades de amônia seria extremamente maléfica

aos animais do experimento, tendo em vista que, ela se transforma em nitrito e

em nitrato por ação de bactérias nitrificantes. Esse processo de transformação:

amônia (NH

- tóxica) - nitrito (NO

- tóxico) - nitrato (NO

- tóxico somente em

altas quantidades) é uma das causas mais comuns de mortalidade em tanques

de girinos (FERREIRA, 2003).

Os parâmetros físicos e químicos da água apresentados durante o

presente experimento satisfazem os padrões mínimos exigidos para criação de

organismos aquáticos, exceto o baixo nível de oxigênio dissolvido, que

segundo SAMPLE (1994) não deveria ser (para piscicultura) inferior a 5 mg/L,

fato que, aparentemente, não causou mortalidade nos tanques experimentais.

3.1.2 - Análise de Cortisol

Os valores médios de cortisol plasmático do grupo controle e dos

diferentes tratamentos durante a 1ª e 2ª coleta encontram-se na Tabela 2.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

TABELA 2 - Valores médios (X) de cortisol plasmático (ng/mL) e desvio padrão (DP) de

girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos mecanismos

estressores de captura e hipóxia, nos diferentes tratamentos e períodos de

coleta (n = 82)

T1 T2 T3

Coleta

N H N H N H

Controle

1ª

2,20 ± 0,50

3,00 ± 2,70

3,20 ± 1,90

3,80 ± 2,20

3,30 ± 1,30

2,50 ± 1,10

2ª

3,71 ± 1,46

2,35 ± 1,20

3,60 ± 1,20

5,00 ± 2,30

2,50 ± 2,20

3,10 ± 1,60

2,14 ± 1,32

T1 – captura individual com puçá; T2 – captura em massa com puçá e T3 – captura por

escoamento

(N) Normóxia – coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue após 15

minutos de exposição ao ar

Não foi constatada diferença estatisticamente significativa entre os

distintos tratamentos testados, na 1ª e 2ª coleta (Tabela 3). Quando os dados

foram ordenados (estabelecimento de postos) estas diferenças significativas

não foram evidenciadas (Figuras 7 e 8).

TABELA 3 – Análise de Variância (ANOVA) realizada com resultados da

quantificação de cortisol plasmático em girinos de rã-touro.

Fonte de

Variação

Grau de

Liberdade

Soma dos

Quadrados

Quadrado Médio

Tratamentos

5 19,964 3,327

Residuais

50 140,64 2,813

Total

56 160,61

F = 1,183

p = 0,330

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 7 - Valores de cortisol plasmático (ng/mL) nos distintos tratamentos e

coletas realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25 e

75% da amostra, respectivamente

T1 - tratamento 1 (captura individual com puçá)

T2 - tratamento 2 (captura em massa com puçá)

T3 - tratamento 3 (captura por escoamento)

Nível de Cortisol (ng/mL)

0 2 4 6

T1 T2 T3 T1 T2 T3

1ª coleta 2ª coleta

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 8 - Valores de cortisol plasmático (ng/mL) obtidos a partir de animais que

foram privados (H) ou não (N) de oxigênio nas coletas realizadas

durante a experimentação com girinos de R. catesbeiana. O gráfico é

expresso em Box-plot onde as barras representam as medianas, as

bases e os topos dos retângulos 25 e 75% da amostra,

respectivamente

Nível de Cortisol (ng/mL)

Condição dos animais

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

O cortisol é um hormônio necessário para a sobrevivência de

organismos estressados (HILL e WYSE, 1989). GUYTON e HALL (2002)

afirmam que estresses significativos estimulam acentuadamente a tríade de

liberação seqüencial de hormônio liberador de corticotropina (CRH), hormônio

adrenocorticotrópico (ACTH) e cortisol. Fisiologicamente o CRH liberado no

hipotálamo estimula a produção de ACTH, que por sua vez estimula a liberação

de cortisol no córtex-supra-renal. No presente trabalho, valores de cortisol

obtidos não evidenciaram quaisquer diferenças entre os três métodos de

manejo testados, (captura individual com puçá, captura em massa com puçá ou

captura por escoamento). Em outras palavras, sob este ponto de vista, todos

estes métodos poderiam ser utilizados sem causar substanciais alterações na

concentração de cortisol circulante e, conseqüentes danos à saúde dos girinos

de R. catesbeiana. Como o método de captura por escoamento é mais rápido e

eficiente ele seria o mais indicado para as criações comerciais de rãs.

Na literatura, encontram-se valores de cortisol com grande variação, fato

que pode ser atribuído a eventos que afetam a liberação do mesmo pelo

organismo, tais como o estágio de desenvolvimento e maturação sexual,

estação do ano, temperatura, ritmo circadiano e o método utilizado para a

coleta do plasma (PANKHURST e SHARPLES, 1992; IWAMA, 1993).

Os valores médios de cortisol plasmático para girinos de rã-touro obtidos

durante esta experimentação variaram de 2,1 a 5,0 ng/mL, mais altos dos que os

encontrados por WRIGHT et al. (2003) que variam de 0,8 a 1,08 ng/mL.

Provavelmente nossos resultados foram influenciados pela baixa quantidade de

oxigênio dissolvido nos tanques, e os reportados pelos autores acima, são

provenientes de experimentos realizados em laboratório, com fotoperíodo e

condições físicas e químicas da água controladas, além de suas determinações

terem sido feitas por radioimunoensaio. Já os valores detectados por KRUG et

al. (1983) variaram de 12 e 22,3 ng/mL, no período de pró-metamorfose e

clímax, respectivamente. Entretanto, eles reportaram incertezas qualitativas

sobre o material mensurado denominando estas substâncias quantificadas de

“material cortisol-like”.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

BARTON e IWAMA (1991) atestam que o padrão de resposta do cortisol,

na maioria das espécies de peixes, após distúrbios agudos consiste em rápida

elevação (minutos) seguida de declínio lento (horas ou dias). Além dos

diferentes tipos de captura testados neste estudo, o mecanismo estressor

empregado foi, 15 minutos de hipóxia, seguido de 30 minutos de repouso na

água, antes da extração de sangue, com a intenção de seguir-se o modelo

padrão de liberação de cortisol em vertebrados, que é de 30 minutos após o

evento estressor (BARCELLOS et al., 2000; SLOMAN et al., 2001). Contudo,

este tempo para a amostragem não foi suficiente para evidenciar uma elevação

nos valores plasmáticos deste hormônio, sugerindo que estudos adicionais com

quantificações em série temporal de cortisol em R. catesbeiana fossem

realizados.

Com base nesta necessidade TEIXEIRA (2007) trabalhando com girinos da

mesma espécie e fase de desenvolvimento, quantificou os valores de cortisol

plasmático em diferentes tempos (0, 15, 30, 45, 60, 90 minutos), após exposição

aérea de 15 minutos. Seus resultados indicaram não haver diferenças

estaticamente significativas entre os valores de cortisol encontrados, sendo que

o valor médio desse hormônio obtido nessa experimentação foi de 3,38 ng/mL.

Entretanto, estudos realizados com peixes (Oncorhynchus mykiss)

submetidos a estresse por exposição ao ar durante 30 segundos e com coleta

de sangue 30 minutos após este procedimento, evidenciaram que os níveis de

cortisol foram significantemente maiores nos animais que foram expostos ao ar

quando comparados aos níveis dos indivíduos não expostos (SLOMAN et al.,

2001). Já BARCELLOS et al. (2000) observaram que exemplares de Rhamdia

quelen submetidos a procedimentos de captura e transferência de tanque,

apresentaram um pico de cortisol uma hora após o procedimento. POTTINGER

(1998) em seus estudos simulou distúrbios naturais que ocorrem durante a

pesca (captura e exposição aérea) de Cyprinus carpio, provocando aumento

nos níveis plasmáticos de cortisol e retorno aos valores basais 24 horas mais

tarde.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

3.1.3 – Análise da Glicemia

Os valores de glicemia dos diferentes tratamentos durante s 1ª e 2ª

coleta encontram-se na Tabela 4.

TABELA 4 - Valores médios (X) de glicose plasmática (mg/dL) e desvio padrão (DP) de

girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos efeitos estressores de

captura e hipóxia, nos diferentes tempos de coleta

T1 T2 T3

Coleta

N H N H N H

1ª

67,67 ± 24,16

99,80 ± 19,46

62,00 ± 30,82

55,80 ± 42,58

68,50 ± 43,04

49,33 ± 7,61

2ª

80,00 ± 34,42

92,40 ± 19,71

56,67 ± 32,72

89,00 ± 17,35

104,33 ± 22,30

87,33 ± 35,35

T1 –captura individual com puçá; T2 – captura em massa com puçá e T3 – captura por

escoamento(N) Normóxia – coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue

após 15 minutos de exposição ao ar

Assim como nos resultados das determinações de cortisol não foram

constatadas diferenças estatisticamente significativas entre os distintos

tratamentos testados, entre os dados da 1ª e 2ª coleta (Tabela 5). Quando os

dados foram ordenados (estabelecimento de postos) estas diferenças não

evidenciadas (Figura 9 e 10).

TABELA 5 - Valores de significância (F e P) dos resultados estatísticos obtidos pela

análise de variância (ANOVA) nos distintos tratamentos, coletas e

animais que foram ou não privados de oxigênio

F p

Tratamentos 1ª coleta

1,73 0,16

Tratamentos 2ª coleta

0,93 0,48

1ª coleta e 2ª coleta

1,52 0,20

Normóxia e Hipóxia

1,03 0,44

p – nível de significância

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 9 - Valores de glicose plasmática (mg/dL) nos distintos tratamentos e

coletas realizadas durante a experimentação com girinos de R.

catesbeiana. O gráfico é expresso em Box-plot onde as barras

representam as medianas, as bases e os topos dos retângulos 25 e

75% da amostra, respectivamente

T1 - tratamento 1 (captura individual com puçá)

T2 - tratamento 2 (captura em massa com puçá)

T3 - tratamento 3 (captura por escoamento)

Nível de Glicose (mg/dL)

20 40 60 80 100 120

T1 T2 T3 T1 T2 T3

1ª coleta 2ª coleta

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 10 - Valores de glicose plasmática (mg/dL) obtidos a partir de animais que

foram privados (H) ou não (N) de oxigênio nas coletas realizadas

durante a experimentação com girinos de R. catesbeiana. O gráfico

é expresso em Box-plot onde as barras representam as medianas,

as bases e os topos dos retângulos 25 e 75% da amostra,

respectivamente

Nível de Glicose (mg/dL)

20 40 60 80 100 120

Condição dos animais

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

WIJAYAN et al. (1991; 1994) afirmam que a elevação da glicemia em

peixes, como resposta ao estresse, deve-se a ação das catecolaminas que

estimulam a glicogenólise, enquanto que a manutenção destes altos níveis de

glicemia é mantida pelo cortisol, que age após a adrenalina.

A hiperglicemia é, em geral, observada em animais expostos a algum

tipo de estímulo adverso (POTTINGER et al., 1999). Entretanto, da mesma

maneira que o cortisol, não se sabe ao certo em quanto tempo ocorreria um

pico de glicose, após um estímulo de estresse, para R. catesbeiana.

Os valores médios encontrados para este parâmetro na literatura são

bem distintos e encontram-se resumidos na Tabela 6.

TABELA 6 - Valores médios (X) de glicose plasmática de anuros do gênero Rana

Autor / Espécie Variação de glicemia

Presente trabalho / R. catesbeiana 49,33 a 104,33 mg/dL

SMITH (1954) / R. temporaria

38 ± 1,4 mg%

WRIGHT (1959) / R. catesbeiana 13,51 mg%

BYRNE e WHITE (1975) / R. catesbeiana 40 e 50 mg%

HUTCHISON e TURKEY (1975) / R. pipiens

24,5 ± 3,0 mg%

WANG e CHANG (1994) / R. catesbeiana 20 a 64 mg/dL

STÉFANI (1996) / R. catesbeiana 48,97 a 55,86 mg%

COPPO et al., 2005 / R. catesbeiana

50 ± 12 mg/dL

TEIXEIRA 2007 / R. catesbeiana 9,31 a 30,87 mg/dL

Segundo HERMAN (1977) as diferenças nos níveis de glicose

sangüínea, entre as espécies, podem ser atribuídas às diferenças de manejo,

procedimento de amostragem e/ou método analítico utilizado. A mesma

hipótese pode ser aplicada aos distintos valores encontrados dentro da espécie

em estudo, devendo-se levar em consideração ainda, a questão do estágio de

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

desenvolvimento (girino X rã adulta) e a presença ou não de um estímulo

estressor.

3.1.4 - Parâmetros hematológicos

Os resultados dos parâmetros hematológicos (Ht, Hb e Er) obtidos nas

duas coletas estão descritos na Tabela 7. Com os resultados do número de

eritrócitos, hematócrito e taxa de hemoglobina foram calculados os índices

hematimétricos absolutos: Volume Corpuscular Médio (VCM = Ht x 10/Er em

fentonlitros), Hemoglobina Corpuscular Média (HCM = Hb x 100/Er em

picogramas/célula), e Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média

(CHCM = Hb x 100/Ht em gramas/dL) (Tabela 8).

TABELA 7 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos (Ht, Hb e Er) de girinos de rã-touro, R. catesbeiana,

submetidos aos efeitos estressores de captura e hipóxia

Ht Hb Er

X ± EPM X ± EPM X ± EPM

1ª coleta

T1 (N) 22,70±6,03 6,52±0,45 44,42±3,38

T1(H) 29,70±1,69 5,43±0,37 55,00±7,07

T2 (N) 33,82±2,88 6,25±0,45 53,00±4,05

T2(H) 30,15±2,56 5,76±0,38 55,50±8,62

T3(N) 32,74±1,71 6,17±0,32 46,92±12,6

T3(H) 25,94±2,66 5,40±0,04 46,92±5,33

2ª coleta

T1 (N) 34,83±0,96 5,75±0,29 50,33±6,69

T1(H) 32,13±0,76 5,35±0,36 44,33±9,79

T2 (N) 30,78±2,19 5,65±0,46 58,17±11,4

T2(H) 32,18±2,13 5,92±0,42 42,25±12,2

T3(N) 28,60±4,23 5,62±0,53 48,17±7,60

T3(H) 29,03±1,96 5,70±0,36 50,92±6,59

1,06

0,55

0,33

Ht - hematócrito (%); Hb – taxa de hemoglobina (g/100 mL); Er – número de eritrócitos

(10

/mm

)

T1- Tratamento 1 – captura individual com puçá; T2- Tratamento 2 – captura em massa

com puçá; T3- Tratamento 3 – captura por escoamento

(N) Normóxia - coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue no tempo de

15 minutos de exposição ao ar

– não significativo

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

TABELA 8 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos os índices

hematimétricos absolutos (VCM, HCM e CHCM) de girinos de rã-touro,

R. catesbeiana, submetidos aos efeitos estressores de captura e hipóxia

VCM HCM CHCM

X ± EPM X ± EPM X ± EPM

1ª coleta

T1 (N) 529,04±156,24 152,94±10,38 19,69±0,42

T1(H) 564,18±94,40 102,35±7,70 19,39±2,28

T2 (N) 658,55±85,42 120,41±14,09 17,75±0,28

T2(H) 573,94±36,59 110,59±8,38 19,89±1,82

T3(N) 988,56±248,27 242,77±51,17 19,32±0,15

T3(H) 599,14±80,27 130,81±18,17 21,86±2,27

2ª coleta

T1 (N) 694,69±55,99 106,62±7,13 16,99±1,00

T1(H) 1158,61±402,04 197,17±71,46 16,62±1,05

T2 (N) 750,37±278,25 150,38±50,29 18,44±2,36

T2(H) 1273,65±365,5 220,44±72,30 17,84±1,00

T3(N) 757,87±236,79 133,10±29,46 20,13±2,27

T3(H) 651,14±129,14 106,90±15,20 18,67±0,74

0,93

0,97

0,53

VCM- volume corpuscular médio (ft); HCM – hemoglobina corpuscular média (pg/cel);

CHCM – concentração de hemoglobina corpuscular média (%)

T1- Tratamento 1 – captura individual com puçá; T2- Tratamento 2 – captura em massa

com puçá; T3- Tratamento 3 – captura por escoamento

(N) Normóxia - coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia – coleta de sangue no tempo de

15 minutos de exposição ao ar

– não significativo

Após a análise de variância não foram evidenciadas diferenças

significativas entre os parâmetros hematológicos dos animais submetidos ao

estresse dos distintos tratamentos testados, da 1ª e 2ª coletas e entre os

animais que foram ou não privados de oxigênio.

Os resultados da contagem diferencial de leucócitos (linfócitos,

neutrófilos, basófilos, eosinófilos e monócitos) realizada nas extensões

sangüíneas em microscópio de luz são representados pelas Figuras 11 e 12.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 11 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos

efeitos estressores de captura e hipóxia. T1 –captura individual com

puçá; T2 – captura em massa com puçá e T3 – captura por

escoamento. (N) Normóxia – coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia

– coleta de sangue após 15 minutos de exposição ao ar; Lf% -

porcentagem de linfócitos; Nt% - porcentagem de neutrófilos; Lf abs -

número absoluto de linfócitos e Nt abs - número absoluto de

neutrófilos

Linfócitos

H N

Tratamentos

Lf %

-5000

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Lf Abs

Lf % 1ª coleta Lf % 2ª coleta

Lf Abs 1ª coleta Lf Abs 2ª coleta

Neutrófilos

-1

N H N H N H

T1 T2 T3

Tratamentos

Nt %

-100

100

200

300

400

500

600

700

800

Nt Abs

Nt % 1ª coleta Nt % 2ª coleta

Nt Abs 1ª coleta Nt Abs 2ª coleta

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 12 - Valores médios (X) e erro padrão da média (EPM) dos parâmetros

hematológicos de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos aos

efeitos estressores de captura e hipóxia. T1 –captura individual com

puçá; T2 – captura em massa com puçá e T3 – captura por

escoamento. (N) Normóxia – coleta de sangue imediata; (H) Hipóxia

– coleta de sangue após 15 minutos de exposição ao ar; Bs% -

porcentagem de basófilos; Es% - porcentagem de eosinófilos; Bs abs

- número absoluto de basófilos e Es abs - número absoluto de

eosinófilos

A análise de variância não evidenciou diferenças significativas entre os

parâmetros hematológicos dos animais submetidos ao estresse dos distintos

tratamentos testados, da 1ª e 2ª coletas e entre os animais que foram ou não

privados de oxigênio.

Trabalhos na mesma linha realizados por PICKERING et al. (1982)

utilizando truta (Salmo trutta) e ELLSAESSER e CLEM (1986) utilizando catfish

(Ictalurus punctalus), também não observaram diferenças significativas quanto

ao número de eritrócitos e demais parâmetros hematológicos. Entretanto,

KEBUS et al. (1992) e IWAMA (1993) afirmam que a imunodeficiência

resultante da resposta ao estresse apresenta correlação negativa com a

elevação do cortisol plasmático, levando a diminuição do número de linfócitos

circulantes. Ainda, PICKERING et al. (1982) observaram que um simples

Basófilos

N H N H N H

T1 T2 T3

Tratamentos

Bs %

500

1000

1500

2000

Bs Abs

Bs % 1ª coleta Bs % 2ª coleta

Bs Abs 1ª coleta Bs Abs 2ª coleta

Eosinófilos

0,5

1,5

2,5

N H N H N H

T1 T2 T3

Tratamentos

Es %

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Es Abs

Es % 1ª coleta Es % 2ª coleta

Es Abs 1ª coleta Es Abs 2ª coleta

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

estresse de manejo de 2 animais causou linfopenia em Salmo trutta após 8

horas e que foram necessárias 72 horas para recuperação aos níveis basais.

FERREIRA (2002) e MARCANTÔNIO (2005) relatam que os leucócitos

mais abundantes no sangue de girinos de R. catesbeiana são os linfócitos.

Este mesmo resultado foi encontrado no presente trabalho: Lf = 91,85 ± 0,57%.

Os demais leucócitos quantificados foram: NT = 1,36 ± 0,38 %; Bs = 5,18 ±

0,48 % e Es = 1,65 ± 0,20 %, não foram detectados monócitos. Os resultados

obtidos na contagem de leucócitos estão muito próximos aos de FERREIRA

(2002): Lf = 88,0 ± 1,4%; NT = 3,8 ± 0,9%; Bs = 5,8 ± 0,7%; Es = 2,0 ± 0,3% e

Mn = 0,4 ± 0,1% e também se assemelham com os de FRANÇA (2007) que

trabalhou com imagos recém metamorfoseados: Lf = 82,64 ± 2,86%; Nt = 8,61

± 1,98%; Bs = 6,38 ± 1,45%; Es = 1,82 ± 0,41% e Mn = 0,56 ± 0,24%.

Para efeitos comparativos os resultados de FRANÇA (2007), DIAS

(2006) e COPPO (2003) relatando valores médios encontrados em indivíduos

de R. catesbeiana em diferentes estágios de desenvolvimento são

apresentados na Tabela 9.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

TABELA 9 - Valores médios (X) e erro padrão (EPM) de parâmetros hematológicos de

rã-touro, R. catesbeiana

AUTOR/ESTÁGIO DE

DESENVOLVIMENTO

PARÂMETRO HEMATOLÓGICO

Ht Hb Er VCM HCM CHCM

PRESENTE

TRABALHO (girino)

30,22 ±

1,39

5,92 ±

0,15

49,66 ±

2,05

732,1 ±

97,44

147,87 ±

19,40

18,88 ±

0,60

COPPO (2003)

(adulto)

30,10 6,80 ±

1,48

42,00 709,00 157,00 23,30

DIAS (2006) (adulto)

30,17 ±

1,92

9,73 ±

0,34

47,67 ±

8,96

713,59 ±

9,46

234,77 ±

0,33

32,72 ±

1,72

FRANÇA (2007)

(girino)

15,94 ±

1,87

3,20 ±

0,43

29,53 ±

6,02

584,5 ±

87,4

117,0 ± 14,0

20,23 ±

2,93

FRANÇA (2007)

(imago)

19,76 ±

1,93

5,33 ±

0,25

28,38 ±

3,09

688,2 ±

49,9

191,24 ±

10,0

28,01 ±

2,80

TEIXEIRA (2007)

(girino)

18,33 ±

2,51

3,67 ±

0,49

25,43 ±

3,68

816,05 ±

111,71

158,89 ±

23,99

22,81 ±

3,76

Ht - hematócrito (%); Hb – taxa de hemoglobina (g/100 mL); Er – número de eritrócitos

(10

/mm

); VCM – volume corpuscular médio (fL); HCM – hemoglobina corpuscular

média (pg/cel); CHCM – concentração de hemoglobina corpuscular média (%)

Comparando-se os valores de hematócrito e hemoglobina encontrados

no presente trabalho (Ht = 30,22 ± 1,39 % e Hb = ± 0,15 g/dL) com o de outros

trabalhos podemos observar que nossos valores são semelhantes aos

encontrados por CATHERS (1997) e COPPO (2003) em R. catesbeiana (Ht =

22,00 ± 5,00 % e Hb = 4,7±0,9 g/dL) e (Ht = 30,10 % e Hb = 6,80 ± 1,48 g/dL)

respectivamente. Quando comparamos nossos resultados com outras

espécies, Rana tigrina (Ht = 19,5 – 31,8 % e Hb = 3,87–6,22 g/dL) estudado

por SINGH (1978) e Bufo sp. (Ht = 36 – 44 %) por COPPO (2001) também

apresentam resultados próximos.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

Já TEIXEIRA (2007) trabalhando com girinos da mesma espécie e do

mesmo estágio de desenvolvimento, e submetendo estes organismos ao

estresse por densidade (1, 5 e 10 girinos/L) e hipóxia, reportou uma redução no

número de linfócitos, neutrófilos e eosinófilos aos 12 dias de experimentação,

mas sem prejuízo à saúde dos animais.

Mesmo não tendo sido modificada pelos mecanismos estressores

testados as informações coletadas são valiosas para análise e composição dos

valores hematológicos basais, ou considerados normais, para organismos

desta espécie. Trata-se de um ponto de partida para futuras comparações com

animais submetidos a condições adversas. Entretanto, a partir destes dados

pouco se pode inferir sobre animais em situação de estresse, pois trabalhos

nesta linha de pesquisa ainda são escassos.

3.2 - Experimento 2- Transporte

Os valores médios de cortisol plasmático dos animais submetidos ao

estresse causados por transporte (4 horas), nos diferentes tempos de coleta

estão apresentados na Tabela 10 e na Figura 13.

TABELA 10 – Valores médios (X) de cortisol plasmático (ng/mL) e desvio padrão (DP)

de girinos de rã-touro, R. catesbeiana, submetidos ao mecanismo

estressor de transporte, nos diferentes tempos de coleta

MZ 0T 15T 30T 45T 60T 90T 24h

Cortisol

(ng/mL)

3,71 ±

1,46

2,67 ±

1,40

4,71 ±

2,15

4,53 ±

2,45

2,95 ±

1,29

2,35 ±

2,40

2,89 ±

0,45

2,29 ±

0,59

MZ- antes do transporte; 0T- momento zero após transporte; 15T- 15 minutos após

transporte; 30T- 30 minutos após transporte; 45T- 45 minutos após transporte; 60T- 60

minutos após transporte; 90T- 90 minutos após transporte; 24T- 24 horas após

transporte

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

FIGURA 13 - Valores médios (X) e desvio padrão da média (EPM) da

quantificação de cortisol plasmático (ng/mL) de girinos de

rã-touro, R. catesbeiana, submetidos ao efeito estressor

de transporte. MZ - antes do transporte; 0T - momento

zero após transporte; 15T - 15 minutos após transporte;

30T - 30 minutos após transporte; 45T - 45 minutos após

transporte; 60T - 60 minutos após transporte; 90T - 90

minutos após transporte; 24T - 24 horas após transporte

A análise estatística indicou não haver diferenças significativas nos

valores de cortisol plasmático dos animais expostos ao estresse por transporte

nos diferentes tempos de coleta, nem mesmo quando comparados aos de

animais que não sofreram esse tipo de estresse.

Apesar de o transporte representar um grande problema à piscicultura,

onde são observadas alterações na liberação de cortisol e glicose (ARENDS et

al., 1999; GOMES et al., 2003; BRANDÂO et al., 2006), esse fato não ocorreu

com girinos de rã–touro, submetidos a esta situação de estresse neste último

experimento.

Singularmente, para estes organismos é provável que, as diferenças

entre a os parâmetros físicos e químicos da água (pH, condutividade elétrica,

alcalinidade e dureza total, amônia, nitrito, nitrato, fósforo, cloretos, ferro, entre

outros), do ponto de origem e o destino, e condições inadequadas de

24h

Tempo

Cortisol (ng/mL)

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

aclimatação representem maiores prejuízos aos animais do que o próprio

transporte (FERREIRA, 2003).

Dados de qualidade de água de ranários comerciais analisadas por este

mesmo autor demonstram que girinos de rã-touro são mais resistentes do que

a maioria dos peixes, em relação às condições da água em que vivem. Essa

condição fisiológica faz com que alguns anfíbios sejam conhecidos como

"homebodies", termo que faz referência à grande capacidade adaptativa

desses animais a condições adversas (SCHUYTEMA et al., 1991; BUENO-

GUIMARÃES, 1999 e FERREIRA, 2002). Essa capacidade de adaptação foi

observada no decorrer dos experimentos, durante todo o tempo em que os

animais foram mantidos nos tanques de polipropileno no Ranário Experimental,

pois o nível de oxigênio dissolvido da água (3,20 ± 0,20 mg/L) foi abaixo do

recomendado (5,00 mg/L) para criação de organismos aquáticos e não foi

observada mortalidade.

3.3 - Considerações Finais

A maior parte dos anfíbios e répteis reage aos agentes estressores com

um aumento dos níveis dos hormônios corticosteróides no plasma (LANCE,

1990; GUILLETTE JR. et al., 1995; TYRRELL e CREE, 1998). Contudo, uma

variação de reações ao mesmo estímulo pode ocorrer em relação ao tipo de

resposta, às taxas apresentadas e ao tempo de duração dessas respostas.

Essas variações da ativação adrenocortical demonstram uma sensibilidade

diferente no eixo hipotálamo – glândulas pituitárias – supra-renais (adrenais)

aos estressores e são denominadas modulação adrenocortical (WINGFIELD e

ROMERO, 2001).

Diferenças fisiológicas entre indivíduos, sexo, idade, estado reprodutivo,

doenças, status social podem interferir na modulação adrenocortical dos

animais (GRASSMEN e HESS, 1992; DUNLAP e SCHALL, 1995; KNAPP e

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

MOORE, 1996). O efeito do estresse pode variar também de acordo com a

carga genética do animal.

Variações de temperatura, umidade (diferentes nas estações do ano),

disponibilidade de alimento, qualidade da água, e condições gerais podem

resultar em diferenças na modulação adrenocortical em populações distintas de

uma mesma espécie (DUNLAP e WINGFIELD, 1995; MOORE e JESSOP,

2003). Em relação à minimização dos efeitos das variantes acima citadas,

desenvolveu-se o experimento do presente estudo, sob a proteção de uma

estufa agrícola, tendo sua superfície coberta com plástico polietileno e suas

laterais com sombrite, a fim de evitar grandes variações de temperatura e

umidade relativa do ar. Não houve diferenças na oferta de alimento entre os

tanques, e a qualidade da água se manteve semelhante entre todos os

tratamentos e suas réplicas. Dessa forma, tentou-se reduzir alguns dos fatores

ambientais que poderiam interferir nos resultados.

Variações significativas nos valores de cortisol e glicose, que foram

observados em outros estudos com organismos aquáticos (peixes), não foram

observadas neste trabalho, o que seria esperado como reações frente às

situações estressantes de captura, hipóxia e transporte.

Estes estímulos estressores já foram testados em outros trabalhos

(BARTON e IWAMA, 1991; WIJAYAN et al. 1991; 1994; BARCELLOS et al.,

2000; SLOMAN et al., 2001), e os animais submetidos a eles apresentaram

diferenças significativas em relação aos parâmetros analisados, mostrando-os

eficientes em provocar estresse com conseqüente liberação de cortisol seguido

de hiperglicemia. Em girinos de R. catesbeiana nenhum experimento testando

estes estressores havia sido realizado. A maior parte das conclusões relativas

à modulação adrenocortical nestes organismos são baseados em observações

comportamentais (DUELLMAN e TRUEB, 1986; LIMA e AGOSTINHO, 1992;

FERREIRA et al., 2001) e, por esse motivo, utilizou-se outras classes de

vertebrados (peixes, répteis), além de outras espécies de anfíbios para

comparação de resultados.

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

Uma possível causa para a falta de aumento dos parâmetros testados

seria uma opção fisiológica do organismo (“recurso”) que ao invés de promover

uma resposta adrenocortical imediata, mantém os níveis hormonais estáveis,

como no exemplo estudado por JESSOP et al. (1999; 2000) com tartarugas

verdes (Chelonia mydas); e VALVERDE et al. (1999a), que observou em

tartarugas marinhas (Lepidochelys olivacea) em período reprodutivo essa falta

de resposta. Os animais em período de desova morriam sem apresentar

respostas adrenocorticais ao agente estressor a que estavam sendo

submetidos (superaquecimento). Uma resposta adrenocortical imediata iria

promover sua sobrevivência naquele momento, mas provavelmente iria

prejudicar a reprodução, e por esse motivo a resposta adrenocortical foi inibida

não permitindo uma maior sobrevida ao animal, mas permitindo que ele

pudesse reproduzir-se mesmo na presença do superaquecimento (VALVERDE

et al., 1999b).

Ainda, VALVERDE et al. (1999a; 1999b) verificaram que tartarugas

verde-oliva (Lepidochelys olivacea) apresentaram uma resposta adrenocortical

baixa quando o agente estressor foi a captura e exibiram níveis muito altos de

corticosterona quando foram expostas a um desafio com ACTH evidenciando

rotas fisiológicas distintas para estas situações.

Os girinos do experimento não apresentaram a resposta adrenocortical

clássica, talvez em função dos prejuízos que essas respostas poderiam lhe

trazer durante o desenvolvimento, já que os produtos desta resposta

interfeririam diretamente nos processos de crescimento e metamorfose, como

citado anteriormente.

Um exemplo da atuação fisiológica do estresse em anfíbios é a

possibilidade de alterações na formação cutânea dos girinos, tendo em vista

que, os corticóides atuam em antagonismo com os hormônios tireoidianos nos

estágios larvais iniciais, mas depois sinergizam com estes mesmos hormônios

na aceleração da metamorfose e em especial na queratinização, e nas últimas

fases, na diferenciação da pele dos girinos (MILLER, 1996). Outras ações que

Guilherme Casoni da Rocha Resultados e Discussão

Dissertação

se destacam e que poderiam sofrer interferência dos produtos do estresse

seriam: a capacidade dos glicocorticóides destes animais em induzir apoptose

em linfócitos larvais durante a reorganização do sistema imune próximo à

metamorfose (ROLLINS–SMITH et al., 1997) e o fato de terem sua

metamorfose adiantada em casos de estresse causados por privação de

alimento e grande manipulação (ROSENKILDE, 1985). Este último processo

também apresenta relação direta com o custo benefício e a produtividade das

criações comerciais.

4 – CONCLUSÕES

Guilherme Casoni da Rocha Conclusões

Dissertação

De acordo com os resultados do presente trabalho pode-se concluir que:

A quantificação de cortisol plasmático por Elisa (DSL10) é apropriada

para anuros da espécie Rana catesbeiana.

Os marcadores biológicos de estresse avaliados (cortisol, glicemia e

parâmetros hematológicos) não apresentaram alterações estatisticamente

significativas em seus valores, tanto para o estresse provocado por captura e

hipóxia quanto por transporte, o que seria esperado para outras classes de

organismos aquáticos.

Entretanto, deve-se ressaltar, que o fato de não haver diferenças

significativas nos parâmetros avaliados pode indicar: que os estímulos

estressores testados não foram adequados para elevar os valores plasmáticos

dos marcadores biológicos (cortisol e glicose), ou talvez que o padrão de

resposta a estes estímulos estejam expressos tissularmente (cortisol tecidual),

pois o aumento extremo do hormônio cortisol ou em outro nível hormonal

(corticosterona) interfere diretamente na metamorfose destes animais.

Devido à falta de pesquisas definindo quais os níveis basais de cortisol e

glicose nas diferentes fases de vida de girinos de R. catesbeiana, o presente

trabalho contribui também neste sentido, sendo importante para futuras

comparações. Ratifica-se que outros estudos mensurando estes e outros

marcadores biológicos devam ser realizados para complementar as

informações sobre estresse ligado ao manejo físico em criações comerciais de

rã-touro.

6 – REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

ADAMS, S.M. 1990 Status and use of biological indicators for evaluating the

effects of stress on fish. In: ADAMS, S.M. (Ed.) Biological indicators of

stress in fish. Bethesda: American Fisheries Society. p.1-9. (American

Fisheries Symposium, 8).

APHA; AWWA; WPCF. 1998 Standard Methods for the Examination of Water

and Wastewater, 17 ed. Washington, D.C.: APHA – American Public Health

Association, AWWA – American Water WORKS Association, and WPFC –

Water Pollution Control Federation.

ARENDS, R.J.; MANCERA, J.M.; MUNOZ, J.L.; BONGA, S.E.W.; FLIK, G.

1999 The stress response of the gilthead sea bream (Sparus aurata L.) to

air exposure and confinement. Journal of Endocrinology, Stanford, 163:

149–157.

BALM, P.H.M. 1999 Stress Physiology in Animals. Sheffield: Sheffield

Academic Press, 296p.

BARCELLOS, L.J.G.; SOUZA, S.M.G.; WOEHL, V.M. 2000 Estresse em

peixes: fisiologia da resposta ao estresse, causas e conseqüências

(Revisão). Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, 26 (1): 99-111.

BARTON, B.A. e IWAMA, G.K. 1991 Physiological changes in fish from stress

in aquaculture with emphasis on the response and effects of

corticosteroids. Annual Review Fish Disease, Vancouver, 10: 3-26.

BARTON, B.A.; RAHN, A.B.; FEIST, G.; BOLLIG, H.; SCHRECK, C.B. 1998

Physiological stress responses of the freshwater chondrostean paddlefish

(Ployodon spathula) toe cute physical disturbances. Comparative

Biochemistry and Physiology A, Oxford, 120 (2): 355-363.

BERG, J.M.; TYMOCZKO, J.L.; STRYER, L. 2004 Bioquímica. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan. 1059p.

BERVEN, K.A. e CHADRA, B.G. 1988 The relationship among egg size,

density, and food level on larval development in the wood frog (Rana

sylvatica). Oecologia, Berlin, 75: 67–72.

BICEGO, K.C. e BRANCO, L.G. 1999 Seasonal changes in the cardio

respiratory responses to hypercardia and temperature in the bullfrog, Rana

catesbeiana. Comparative Biochemistry and Physiology, Oxford, 124: 221-

229.

BONGA, S.E.W. 1997 The stress response in fish. Physiological Reviews,

Bethesda, 77: 591-625.

BRANDÃO, F.R.; GOMES, L.C.; CHAGAS, E.C. 2006 Respostas de estresse

em pirarucu (Arapaima gigas) durante práticas de rotina em piscicultura.

Acta Amozonica, Manaus, 36(3): 349 –-356.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

BUENO-GUIMARÃES, H. M. 1999 Avaliação da resposta da Rana

catesbeiana frente as variações ambientais: determinação das condições

ideais de manutenção em biotério e da resposta aos poluentes aquáticos.

São Paulo. 180p. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo.

BYRNE, J.J.; e WHITE, R.J. 1975 Cyclic changes in liver and muscle glycogen

tissue lipid and blood glucose in a naturally occurring population of Rana

catesbeiana. Comparative Biochemistry and Physiology, Oxford, 50A: 709-

715.

CARNEIRO, P.C.F. e URBINATI, E.C. 2001 Salt as a stress response

mitigator of matrinxã Brycon cephalus (Günther) during transport.

Aquaculture Research, Oxford, 32: 297–304.

CASTRO, J.C. e PINTO, A.T. 2000 Qualidade de água em tanques de girinos

de rã-touro, Rana catesbeiana, Shaw, 1802, cultivadas em diferentes

densidades de estocagem. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, 29(6):

1903-1911.

CATHERS, T. 1997 Serum chemistry and hematology for anesthetized

american bullfrogs. Journal of Zoology & Wildlife Medicine, Lowrence, 28:

171–174.

CELIS, M.E. 1998 Fisiologia Humana- Sistemas Nervioso y Endócrino,

Córdoba: Ed. Rerer Milênio. 635p.

COLLIER, H.B. 1944 The standardization of blood haemoglobin

determinations. Canadian Medical Assistance Journal, Ottawa, 50: 550-552.

COPPO, J.A. 2001 Fisiología Comparada del Medio Interno, Buenos Aires:

Dunken. 297 p.

COPPO, J.A. 2003 El médio interno de la rana toro Rana catesbeiana, Shaw

1802. Revista Veterinaria, Corrientes, 14(1): 25-41.

COPPO, J.A.; MUSSARNB, T.; FIORANELLI, S.A.; ZEINSTEGER, P.A. 2005

Blood and urine physiological values in captive bullfrog, Rana catesbeiana

(Anura: Ranidae). Analecta Veterinária, Buenos Aires, 25 (1): 15-17.

DENVER, R.J. 1998 Hormonal correlates of environmentally induced

metamorphosis in the western spade foot toad, Scaphiopus hammondii.

General and comparative endocrinology, New York, 110: 326–336.

DETHLOFF, G.M. e BAIMAIER, K.L. 2001 Effects of dissolved copper on

select hematological, biochemical and immunological parameters of wild

rainbow trout (Orchorynchus mykiss). Archives of environmental

contamination and toxicology, New York, 40: 371-380.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

DIAS, D.C. 2006 Influência de probióticos no desempenho produtivo e

fisiológico de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw, 1802). Jaboticabal. 80p.

(Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Agrárias, Centro de

Aqüicultura, Universidade Estadual Paulista).

DUELLMAN, W.E. e TRUEB, L. 1986 Biology of amphibians. Baltimore –

Marylan: The Johns Hopkins University Press. 613 p.

DUNLAP, K.D. e SCHALL, J.S. 1995 Hormonal alterations and reproductive

inhibition in male fence lizards (Sceloporus occidentalis) infected with the

malarial parasite Plasmodium mexicanum. Physiological Zoology, Chicago,

68: 608– 621.

DUNLAP, K.D. e WINGFIELD, J.C. 1995 External influences on indices of

physiological stress I. Seasonal and population variation in adrenocortical

secretion of free-living lizards, Sceloporus occidentalis. The Journal of

Experimental Zoology, New York, 271: 36–46.

EDDY, F.B. 1981 Effects of stress on osmotic and ionic regulation in fish. In:

PICKERING, A.D. (Ed.). Stress and Fish. London: Academic Press. p.77-

102.

ELLSAESSER, C.F. e CLEM, L.W. 1986 Haematological and immunological

changes in channel catfish stressed by handling and transport. Journal of

Fish Biology, London, 28: 511-521.

FEDER, M.E. e BURGGREN, W.W. 1992 Environmental physiology of the

amphibians. Chicago: The University of Chicago Press. p. 40-54.

FERREIRA, C.M. 2002 Avaliação da toxicidade do cobre e do uso de girinos

de rã-touro (Rana catesbeiana) como animais sentinelas. São Paulo. 109p.

(Tese de Doutoramento. Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo).

FERREIRA, C.M. 2003 A importância da água e sua utilização em ranários

comerciais. Panorama da Aqüicultura, 79(13):15-17.

FERREIRA, C.M.; DIAS, D.C.; FRANÇA, F.M.; BARBOSA, C.J.S. 2001

Estresse e sistemas de criação. In: ENCONTRO NACIONAL DE

RANICULTURA 11. Bragança Paulista, 16-19/jul 2001. Anais... São Paulo:

Academia Brasileira de Estudos Técnicos em Ranicultura. p.37-40.

FERREIRA, C.M.; PIMENTA, A.G.C.; PAIVA-NETO, J.S. 2002 Introdução à

Ranicultura. Boletim Técnico do Instituto de Pesca, São Paulo, 33: 1-14.

FERREIRA, C.M.; RANZANI-PAIVA, M.J.T.; TEIXEIRA, P.C.; DIAS, D.C.;

FRANÇA, F.M. 2003 I Simpósio Brasileiro de Ranicultura e II Ciclo de

Palestras sobre Ranicultura do Instituto de Pesca. Boletim Técnico do

Instituto de Pesca, 34: 95.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

FONTANELLO, D. 1994 Histórico da Ranicultura Nacional. In: LIMA, S.L.;

FIGUEIREDO, M.R.C.; MOURA, O.M. (Eds) Diagnóstico da Ranicultura:

problemas, propostas de soluções e pesquisas prioritárias. Viçosa:

ABETRA. p. 3-6.

FORMAN, L.J. e JUST, J.J. 1976 The life span of red blood cells in the

amphibian larvae, Rana catesbeiana. Developmental Biology, Orlando,

50(2): 537-540.

FRANÇA, F.M. 2007 Efeito da utilização de probióticos no desempenho,

resposta imune e hematológica de girinos e imagos de rã-touro (Rana

catesbeiana). São Paulo. 92p. (Dissertação de Mestrado, Instituto de

Pesca, SP).

GLENNEMEIER, K.A. e DENVER, R.J. 2002 Role for corticoids in mediating

the response of Rana pipiens tadpoles to intraspecific competition. The

Journal of Experimental Zoology, New York, 292: 32–40.

GOLDENFARB, P.B.; BOWYER, F.P.; HALL, E.; BROSIUS, E. 1971

Reproducibility in the hematology laboratory: the microhematocrit

determination. American Journal Clinic Pathology, Philadelphia, 56: 35-39.

GOMES, L.C. 2002 Transporte de juvenis de tambaqui Colossoma

macropomum (CUVIER 1818) (Teleostei, Characidade). Tese de

Doutorado, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/ Fundação

Universidade do Amazonas. Manaus, 101p.

GOMES, L.C.; ARAUJO-LIMA, C.A.R.M.; ROUBACH, R.; URBINATI, E.C.

2003 Avaliação dos efeitos da adição de sal e da densidade no transporte

do tambaqui. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasilia, 38(2): 283-290.

GOSNER, K.L. 1960 A simplified table for standing anuran embryos and

larvae with notes on identification. Herpetologica, Johnson, 16: 183-190.

GRASSMEN, M. e HESS, D.L. 1992 Sex differences in adrenal function in the

lizard Cnemidophorus sexlineatus: II Responses to acute stress in the

laboratory. The Journal of Experimental Zoology, New York, 264: 183–188.

GUILLETTE JR., L.J.; CRAIN, D.A.; ROONEY, A.A.; WOODWARD, A.R. 1995

Effect of acute stress on plasma concentrations of sex and stress hormones

in juvenile alligators living in control and contaminated lakes. Journal of

Herpetology, Bethesda, 31: 347–353.

GUYTON, A.C. e HALL, J.E. 2002 Tratado de Fisiologia. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan. p. 818-823 e 875-877.

HARRIS, J.A. 1972 Seasonal variations in some hematological characteristics

of Rana pipens. Comparative Biochemistry and Physiology, Oxford, 43(A):

975-989.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

HASEBE, T.; OSHIMA, H.; KAWAMURA, K.; KIKUYAMA, S 1999 Rapid and

selective removal of larval erythrocytes from systemic circulation during

metamorphosis of the bullfrog, Rana catesbeiana. Development, Growth &

Differentiation, Nagoya, 41: 639–643.

HAYES, T.; CHAN, R.; LICHT, P. 1993 Interactions of temperature and

steroids on larval growth, development, and metamorphosis in a toad (Bufo

boreas). The Journal of experimental zoology, New York, 266: 206–215.

HERMAN, C.A. 1977 Comparative effects of epinephrine and norepinephrine

on plasma glucose and hematocrit levels in the American bullfrog (Rana

catesbeiana). General and Comparative Endocrinology, Duluth, 32: 321-

329.

HICKMAN, C.P.; ROBERTS, L.S.; LARSON, A. 2003 Princípios Integrados de

Zoologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. p.722-723.

HILL, R.W. 1980 Fisiología Animal Comparada, Reverté, Barcelona, 512 p.

HILL, R.W. e WYSE, G.A. 1989 Fisiologia Animal. Ed. Akal Madrid. p. 598-

608.

HUTCHISON, V.H.; TURKEY, L.D. 1975 Glucose and lactate concentrations

during activity in the leopard frog, Rana pipiens. Journal of Comparative

Physiology B: Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology, Berlin,

99: 287-295.

INOUE, L.A.K.A. 2003 Clove oil as anesthetic for juveniles of matrinxã Brycon

cephalus (Gunther, 1869). Ciência Rural, Santa Maria, 33(5): 943-947.

IRWIN, A.; KENNY, A.P.; O’ HALLORAN, J.; FITZGERALD, R.D.; DUGGAN,

P.F. 1999 Adaptation and validation of radioimmunoassay kit for measuring

plasma cortisol in turbot. Comparative Biochemistry and Physiology,

London, 124: 27-31.

IWAMA G.K.; PICKERING, A.D.; SUMPTER, J.P.; SCHRECK, C.B. 1997 Fish

stress and health in aquaculture. Cambridge University Press, Society for

Experimental Biology Seminar Series 62, Cambridge, UK.

IWAMA, G.K. 1993 Intensive Fish Production: Course Manual UBC Access

Guided Independent Study. Vancouver: The University of British Columbia.

p.130.

JENSEN, F.B.; NIKINMAA, M.; WEBBER, R.E. 1993 Environmental

perturbations of oxygen transport in teleost fishes: causes consequences

and compensations. In: RANKIN, J.C E JENSEN,F.B. (eds)Fish

Ecophysiology..., London: Chapman e Hall. p.161-179.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

JESSOP, T.S.; HAMANN, M.; READ, M.A.; LIMPUS, C.J. 2000 Evidence for a

hormonal tactic maximizing green turtle reproduction in response to a

pervasive ecological stressor. General and Comparative Endocrinology,

New York, 118: 107–117.

JESSOP, T.S.; LIMPUS, C.J.; WHITTIER, J.M. 1999 Plasma steroid

interactions during high-density green turtle nesting and associated

disturbance. General and Comparative Endocrinology, New York, 115: 90–

100.

KEBUS, M.J.; COLLINS, M.T.; BROWNFIELD, M.S.; AMUNDSON, C.H.;

KAYES, T.B.; MALISON, J.A. 1992 Effects of rearing density on stress

response and growth of rainbow trout. Journal of Medicine and Biology

Research., São Paulo, 22: 1019-1022.

KIKUYAMA,S.; KAWAMURA, K.; TANAKA, S.; YAMAMOTO, K. 1993 Aspects

of amphibian metamorphosis: Hormonal control. International Review of

Cytology, San Diego, 145: 105-148.

KNAPP, R. e MOORE, M.C. 1996 Male morphs in tree lizards, Urosaurus

ornatus, have different delayed hormonal responses to aggressive

encounters. Animal Behaviour, London, 52: 1045–1055

KRUG, E.C.; HONN, K.V.; BATTISTA, J.; NICOLL, C.S. 1983 Corticosteroids

in serum of Rana catesbeiana during development and metamorphosis.

General and Comparative Endocrinology, San Diego, 52: 232-241.

KUBITZA, F. 1997 Transporte de peixes vivos. Parte 1. Panorama da

Aqüicultura, Rio de Janeiro, 7: 20–26.

LANCE, V.A. 1990 Stress in reptiles. In: EPPLE, A., SCANES, C.G.;

STETSON, M.H. (Eds.), Prospects in Comparative Endocrinology, New

York: Wiley-Liss, p.461–466.

LICHT, P.; MCCREERY, B.R.; BARNES, R.; PANG, R. 1983 Seasonal and

stress related changes in plasma gonadotropins, sex steroids, and

corticosterone in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative

Endocrinology, New York, 50:124–145.

LIMA, S.L. e AGOSTINHO, C.A. 1992 A tecnologia da criação de rãs. Viçosa:

Imp. Universitária. p.168.

MAHONEY, J.B. e MCNULTY, J.K. 1992 Disease-associated blood changes

and normal seasonal hematological variation in winter flounder in the

Hudson-Raritan estuary. Transactions of the American Fisheries Society,

Grosvenor Lane, 121: 261-268.

MARCANTÔNIO, A.S. 2005 Toxicidade do sulfato de cobre e do sulfato de

zinco para rã-touro (Rana catesbeiana Shaw, 1802): toxicidade aguda e

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

crônica e parâmetros hematológicos. Jaboticabal. 94p. (Tese de

Doutoramento. Faculdade de Ciências Agrárias, Centro de Aqüicultura,

Universidade Estadual Paulista).

MAZEAUD, M.M.; MAZEAUD, F.; DONALDSON, E.M. 1977 Primary and

secondary effects of stress in fish: some new data with a general review.

Transactions of the American Fisheries Society, Grosvenor Lane, 106: 201-

212.

McCOLLUM, S.A. e VAN BUSKIRK, J. 1996 Costs and benefits of a predator-

induced polyphenism in the gray tree frog Hyla chrysoscelis. Evolution,

Lawrence, 50: 583–593.

MCDONALD, D.G. e MILLIGAN, C.L. 1992 Chemical properties of the blood.

In HOAR, W.S.; RANDALL, D.J.; FARELL A.P., Fish Physiology, Vol XII,

San Diego: Academic Press p. 55–133.

McDONALD, G. e MILLIGAN, L. 1997 Ionic, osmotic and acid-base regulation

in stress. In: IWANA, G.W.; PICKERING, A.D.; SUMPTER, J.P.; SCHRECK,

C.B. (Eds.) Fish stress and health in aquaculture. Cambridge: University

Press, p. 119-144.

MILLER, L. 1996 Hormone-induced changes in keratin gene expression during

amphibian skin metamorphosis. In: GILBERT, L.I.; TATA, J.R.; ATKINSON,

B.G. (Eds.), Metamorphosis: Postembryonic Reprogramming of Gene

Expression in Amphibian and Insect Cells. New York, Academic Press,

p.599–624.

MOBERG, G.P. 1996 Suffering from stress: an approach for evaluating the

welfare of an animal. In: Sandoe, P. and Hurnik, T. (eds) Proceedings of

Welfare of Domestic Animals Concepts, Theories and Methods of

Measurement. Acta Agriculture Scandinavica, Sect. A. Animal Science,

London, 27: 46-49.

MOBERG, G.P. 2000 Biological responses to stress: implications for animal

welfare. In: Moberg, G.P. and Mench, J.A. (eds) The biology of animal

stress: basic principals and implications for animal welfare. CABI Pllishing,

1-22.

MOMMSEN, T.P.; VIJAYAN, M.M.; MOON, T.W. 1999 Cortisol in teleosts:

dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation. Reviews in Fish

Biology and Fisheries, New York 9: 211-268.

MOORE, I.T. e JESSOP, T.S. 2003 Stress, reproduction, and adrenocortical

modulation in amphibians and reptiles. Hormones and Behavior,

Amsterdam, 43: 39–47.

PANKHURST, N.W. e SHARPLES, D.F. 1992 Effects of capture and

confinement on plasma cortisol concentrations in the snapper Pagrus

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

auratus. Australian Journal of Marine and Freshwater Research, Melbourne,

43: 345-356.

PICKERING, A.D. 1981 Stress and fish. Introduction; the concept of biological

stress. London: London Academic Press. p.1-7.

PICKERING, A.D.; POTTINGER, T.G.; CHRISTIE, P. 1982 Recovery of the

trout, Salmo trutta L., from acute handling stress: A time-course study.

Journal of Fish Biology, London, 24: 731-740.

POTTINGER, T.G. 1998 Changes in blood cortisol, glucose and lactate in carp

retained in angler's keepnets. Journal of Fish Biology, London, 53: 728-742.

POTTINGER, T.G.; YEOMASN, W.E.; CARRICK, T.R. 1999 Plasma cortisol

and 17b-oestradiol levels in roach exposed to acute and chronic stress.

Journal of Fish Biology, London, 54: 525-532.

RANDALL, D.J. e PERRY, S.F. 1992 Catecholamines. In Fish Physiology, Vol

XIIB, Eds WS Hoar, DJ Randall & AP Farell. San Diego, CA: Academic

Press. p. 255–300.

RANZANI-PAIVA, M.J.T. e EIRAS, A.C. 1992 Células sangüíneas e contagem

diferencial de leucócitos de 13 espécies de teleósteos do Rio Paraná – PR.

In: 7º SIMPÓSIO BRASILEIRO DE AQÜICULTURA E 2º ENCONTRO

BRASILEIRO DE PATOLOGIA DE ORGANISMOS AQUÁTICOS, Peruíbe.

Anais...São Paulo, Associação Brasileira de Aqüicultura e Associação

Brasileira de Patologistas de Organismos Aquáticos, p.173-182.

RANZANI-PAIVA, M.J.T. e SILVA-SOUZA, A.T. 2004 Hematologia de Peixes

Brasileiros. In: RANZANI-PAIVA, M.J.T.; TAKEMOTO, R.M.; LIZAMA, M.de

los A.P. (Ed.) Sanidade de Organismos Aquáticos. São Paulo: Varela. p.89-

120.

RIBEIRO-FILHO, O.P. 1998 Reprodução induzida de rã-touro (Rana

catesbeiana Shaw, 1802) com uso de extrato bruto hipofisário, Revista

Brasileira de Zootecnia, Viçosa, 27(4): 658-663.

ROLLINS-SMITH, L.A.; BARKER, K.S.; DAVIS, A.T. 1997 Involvement of

glucocorticoids in the reorganization of the amphibian immune system at

metamorphosis. Developmental Immunology, London, 5: 145–152.

ROSENFELD, G. 1947 Corante pancrômico para hematologia e citologia

clínica. Nova constituição dos componentes do May Grunwald e do Giemsa

num só corante de emprego rápido. Memórias do Instituto do. Butantan, 20:

329-334.

ROSENKILDE, P. 1985 The role of hormones in the regulation of amphibian

metamorphoses. In: BALLS, M.; BOWENES, M. Metamorphoses. Oxford:

Clarendon press, p. 221-259.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

ROSS, L.G. e ROSS, B. 1999 Anesthetic and sedative techniques for aquatic

animals. Oxford: Blackwell Science. 159 p.

SAMPLE, W.D. 1994 Water quality is essential in holding fish in vats and

hauling tanks. Aquaculture Magazine, Litte Rock, 20(3): 68-72.

SAPOLSKY, R.M.; ROMERO, L.M.; MUNCK, A.U. 2000 How do

glucocorticoids influence stress responses? Integrating permissive,

suppressive, stimulatory, and preparative actions. Endocrine Reviews,

Baltimore, 21: 55–89.

SCHMIDT-NIELSEN, K. 2002 Fisiologia Animal, Adaptação e Meio Ambiente.

. Ed., São Paulo: Livraria Santos. 600p.

SCHUYTEMA, G.S.; NEBEKER, A.V.; GRIFFIS, W.L.; WILSON, K.N. 1991

Teratogenesis, Toxicity, and Bioconcentration in Frogs Exposed to Dieldrin.

Archives Environmental Contamination and Toxicology, 21: 332-350.

SCOTT, D.E. 1990 Effects of larval density in Ambystoma opacum: an

experiment in large-scale field enclosures. Ecology, Washington. 71: 296–

306.

SINGH K. 1978. Hematology of the common Indian frog Rana tigrina. III.

Hemoglobin and hematocrit. Annals of anatomy, New York, 143: 161–166.

SLOMAN, K.A.; METCALFE, N.B.; TAYLOR, A.C.; GILMOUR, K.M. 2001

Plasma cortisol concentrations before and after social stress in rainbow trout

and brown trout. Physiology and Biochemistry Zoological, Chicago, 74: 383-

389.

SMITH, C.L. 1954 The relation between seasonal hyperglycaemia and thyroid

activity in the frog (Rana temporaria). Journal of Endocrinology, Bristol, 10:

184-191.

SMITH, D.C. e VAN BUSKIRK, J. 1995 Phenotypic design, plasticity, and

ecological performance in two tadpole species. The American Naturalist,

Chicago, 145: 211–233.

STÉFANI, M.V. 1996 Metabolismo e crescimento da rã-touro (Rana

catesbeiana Shaw, 1802) alimentada com níveis crescentes de

carboidratos. Jaboticabal. 92p. (Tese de Doutoramento. Faculdade de

Ciências Agrárias, Centro de Aqüicultura, Universidade Estadual Paulista).

SUMPTER, J.P. 1993 The deleterious effect of stress and their significance to

aquaculture. Production, environment and quality. Ghent: Europen

Aquaculture Society. Oostende, p.157-165.

SWENSON, M.J. e REECE, W.O. 1993 Dukes: Fisiologia dos animais

domésticos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 267p.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

TEIXEIRA, P.C. 2007 Valores de Cortisol, Glicemia e perfil sangüíneo de

girinos de Rã-touro (Rana catesbeiana) em Diferentes Densidades e

Exposição Aérea. Jaboticabal. 86p. (Dissertação de Mestrado. Faculdade

de Ciências Agrárias, Centro de Aqüicultura, Universidade Estadual

Paulista).

TEIXEIRA, R.D.; PEREIRA MELLO, S.D.R.; LIMA DOS SANTOS, C.A.M. 2001

The world market for frog legs. Rome: FAO/GLOBEFISH, 68.44p

TURNER, R.J. 1988 Amphibians. In: ROWLEY, A.F.; RATCLIFFE, N. N.A.,

Vertebrate Blood Cells, New York: Cambridge University Press, p. 129-209.

TYRELL, C.L. e CREE, A. 1998 Relationships between corticosterona

concentration and season, time of day and confinement in a wild reptile

(tuatara, Sphenodon punctatus). General and Comparative Endocrinology,

New York, 110: 97–108.

URBINATI, E.C. e CARNEIRO, P.C.F. 2004 Práticas de manejo e estresse

dos peixe em piscicultura. In: Cyrino, J.E.P.; Urbinati, E.C.; Fracalossi, D.M.;

Castagnolli, N. (Eds.). Tópicos especiais em piscicultura de água doce

tropical intensiva. Sociedade Brasileira de Aqüicultura e Biologia Aquática.

Editora Tecart, São Paulo, p. 171-193.

VAL, A.L. 2000 Organic phosphates in the red blood cells of fish. Comparative

Biochemistry and Physiology, New York, 125(A): 417-435.

VAL, A.L.; ALMEIDA-VAL, V.M.F.; AFFONSO, E.G. 1990 Adaptative features

of Amazon fishes: Hemoglobins, hematology, intraerythrocytic phosphates

and whole blood Bhor effect of Pterygoplichthys multiratus (Siluriformes).

Comparative Biochemistry and Physiology, New York, 97: 435-440.

VAL, A.L. e ALMEIDA-VAL, V.M.F. 1995 Fishes of Amazon and their

environments. Physiological and biochemical Aspect,. Berlin: Springer-

Verlag, 223p.

VAL, A.L.; SILVA, M.N.P.; ALMEIDA-VAL, V.M.F. 2004 Estresse em peixes –

ajustes fisiológicos e distúrbios orgânicos. In: RANZANI-PAIVA, M.J.T.;

TAKEMOTO, R.M.; LIZAMA, M.de los A.P. (Ed.) Sanidade de Organismos

Aquáticos. São Paulo: Varela.p.75-88.

VALVERDE, R.A.; OWENS, D.W.; MACKENZIE, D.S.; AMOSS, M.S. 1999a

Basal and stress-induced corticosterone levels in olive Ridley sea turtles

(Lepidochelys olivacea) in relation to their mass nesting behavior. The

Journal of experimental zoology, New York, 284: 652–662.

VALVERDE, R.A.; OWENS, D.W.; MACKENZIE, D.S.; AMOSS, M.S. 1999b

Adrenal responsiveness during nesting of the olive ridley sea turtle

(Lepidochelys olivacea). American Zoologist, Utica, 32(A): 21-30.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

VOET, D.I.; VOET, J.G.I.; PRATT, C.W. 2000 Fundamentos de Bioquímica.

São Paulo: Artmed. p.229.

WANG, J.H. e CHANG, M.H. 1994 Studies on hematology of captive bullfrog,

Rana catesbeiana. Coa Fish, Taipei, 46: 69-87.

WEBER, R.E.; LYKKEBOE, G.; JOHANSEN, K. 1975 Biochemical aspects of

the adaptation of hemoglobin affinity of eels to hypoxia. Life Sciences,

Oxford, 17: 1345-1350.

WEIRICH, C.R.; TOMASSO, J.R.; SMITH, T.I.J. 1993 Toxicity of ammonia and

nitrite to sunshine bass in selected environments. Journal of Aquatic Animal

Health, Grosvenor Lane, 5: 64–72.

WIJAYAN, M.M.; BALLANTYNE, J.S.; LEATHERLAND, J.F. 1991 Cortisol

induced changes in some aspects of the intermediary metabolism of

Salvelinus fontinalis. General and Comparative Endocrinology, Duluth, 82:

476-486.

WIJAYAN, M.M.; REDDY, P.K.; LEATHERLAND, J.F.; MOON, T.W. 1994 The

effects of cortisol on hepatocyte metabolism in rainbow trout: a study using

the steroid analogue RU 486. General and Comparative Endocrinology,

Duluth, 96: 75-84.

WILSON, J.A. 1989. Fundamentos de Fisiología Animal, México: Limusa.

p.984.

WINGFIELD, J.C. e ROMERO, L.M. 2001 Adrenocortical responses to stress

and their modulation in free-living vertebrates, In: MCEWEN, B.S.;

GOODMAN, H.M. (Eds.), Handbook of Physiology: The Endocrine System,

Vol. IV, Section 7, New York : Oxford University Press, p. 211–234.

WINTROBE, M.M. 1934 Variations on the size and hemoglobin content of

erythrocytes in the blood various of vertebrates. Folia Haematologica,

Leipzig , 51: 32-49.

WRIGHT, M.L.; CYKOWSKI, L.J.; LUNDRIGAN, L.; HEMOND, K.L.; KOCHAN,

D.M.; FASZEWSKI, E.E. 1994 Anterior pituitary and adrenal cortical

hormones accelerate or inhibit tadpole hind limb growth and development

depending on stage of spontaneous development or thyroxin concentration

in induced metamorphosis. The Journal of Experimental Zoology, New York,

270: 175–188.

WRIGHT, M.L.; GUERTIN, C.J.; DUFFY, J.L.; SZATKOWSKI, M.C.; VISCONTI,

R.F.; ALVES, C.D. 2003 Developmental and diel profiles of plasma

corticosteroids in the bullfrog, Rana catesbeiana. Comparative Biochemistry

and Physiology, London, 135(A): 585-595.

Guilherme Casoni da Rocha Referências Bibliográficas

Dissertação

WRIGHT, M.L.; RZASA, B.A.; WEIR, R.J.; BABSKI, A.M. 1999 Influence of

Cortisol on the Larval Bullfrog Thyroid Axis in Vitro and in Vivo and on

Plasma and Ocular Melatonin. General and Comparative Endocrinology,

Duluth, 116: 249–260.

WRIGHT, P.A. 1959 Blood sugar studies in the bullfrog, Rana catesbeiana.,

Endocrinology, Menasha, 64: 551-558.

ZAR, J.H. 1996 Biostatical Analysis. New Jersey: Pretice Hall 3ª ed.

ZERANI, M.; AMABILI, F.; MOSCONI, G.; GOBBETTI A. 1991 Effects of

captivity stress on plasma steroid-levels in the green frog, Rana esculenta,

during the annual reproductive cycle. Comparative Biochemistry and

Physiology. A Physiology, Oxford, 98: 491–496.

6 – ANEXO

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

Anexo 1

Contagem de Eritrócitos (Er)

O método utilizado para a contagem dos eritrócitos foi o visual, em

câmara hematimétrica de Neubauer. Esta câmara consiste em uma lâmina

retangular de vidro espesso contendo dois retículos na porção central,

separados longitudinalmente por um sulco profundo sobre a lâmina.

Transversalmente, quatro sulcos limitam três plataformas. A central, onde estão

os retículos, encontram-se deprimida 0,1mm em relação às laterais, dando a

profundidade da câmara, limitada superiormente por uma lamínula especial

adaptada firmemente sobre as plataformas laterais. O retículo, na câmara

melhorada de Neubauer, é um quadrado de 3mm de lado e 9mm

superfície, dividido em 9 áreas de 1mm

, exceto quatro laterais e o da área

central, está dividida em 25 quadrados de 1/25mm

, sendo cada um destes

subdividido em dezesseis quadradinhos de 1/400mm

totalizando 400

quadradinhos e 0,1mm

na área central.

Inicialmente foram colocados 400 µL do diluente Hayen em tubo

eppendorf. A este conteúdo foram adicionados 2 µL de sangue, resultando em

uma diluição final de 1:200. Em seguida agitou-se por dois minutos e, então,

com auxilio de micropipeta, preencheu-se cada retículo da câmara de

Neubauer. A contagem foi feita no aumento de 40x. Após a contagem em cada

retículo, foi calculada a média do número de células e o resultado foi expresso

em nº células x 10

/mm

de sangue.

Obs. Solução de Hayen

0,6 g de bicloreto de mercúrio

5,0 g de sulfato de sódio

1,0 g de cloreto de sódio

200,0 mL de água destilada

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

٭Conservar em geladeira a 4ºC

Determinação do Hematócrito (Ht)

A determinação do hematócrito (Ht) foi feita através da técnica de

microhematócrito, segundo GOLDENFARB et al. (1971). Foi preenchido um

tubo capilar com sangue, em seguida vedado em uma das extremidades com

massa de modelar e levado à centrífuga a 12.500 rpm, durante cinco minutos.

Na centrifugação, os eritrócitos foram compactados na parte inferior do tubo e

mostrados o volume por eles ocupado em relação ao sangue total. A seguir, foi

feita a leitura com auxílio do cartão padrão. O resultado foi dado em

porcentagem ou volume.

Determinação da Taxa de Hemoglobina (Hb)

A determinação da taxa da hemoglobina (Hb) é uma dos meios mais

simples e usual como indicador de anemias e foi realizada pelo método da

cianometahemoglobina, segundo COLLIER (1944). Com pipeta automática

foram colocados 5 mL de cianometahemoglobina em tubo de ensaio e em

seguida adicionou-se 20 µL de sangue. Depois de homogeneizado, aguardou-

se por um período de 15 minutos. A amostra foi então levada à centrífuga a

3.500 rpm, durante 5 minutos. Em seguida, a amostra foi colocada em cubetas

de cristal e levada ao espectrofotômetro (a 540 nm), para ser realizada a

leitura. O aparelho foi previamente calibrado com solução padrão (branco). O

valor encontrado em transmitância foi transformado em absorbância pela

seguinte fórmula:

2-logX x fator de correção, onde:

X= valor encontrado por espectrofotometria

Fator de correção= 40,86 previamente calculado pela curva de

calibração

O resultado final foi dado em g/dL

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

Índices Hematimétricos Absolutos

Em hematologia existem três índices hematimétricos absolutos que

servem para avaliar e classificar morfologicamente o sangue dos animais em

geral. Com os valores do número de eritrócitos, hematócrito e taxa de

hemoglobina foram calculados os seguintes índices hematimétricos, segundo

WINTROBE (1934):

- Volume Corpuscular Médio (VCM) permite avaliar o volume dos

eritrócitos;

VCM = Hematócrito x 10 = fL

nº Eritrócitos

Hemoglobina Corpuscular Média (HCM) permite medir o peso da

hemoglobina existente nos eritrócitos;

HCM = taxa de hemoglobina x 10 = pg/célula

nº Eritrócitos

Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) permite

medir o peso da hemoglobina em100 ml de sangue;

CHCM = Taxa de hemoglobina x 100 = %

Hematócrito

Obs. Solução de Cianometahemoglobina

0,2 g de fericianeto de potássio

1,0 mg de bicarbonato de sódio

0,05 g de cianeto de potássio

1000,0 mL de água destilada

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

٭Conservar em geladeira a 4ºC

Confecção das extensões sangüíneas

Para cada animal foram feitas duas lâminas de extensões sangüíneas.

Previamente, as lâminas foram lavadas com água e sabão, enxaguadas com

água e colocadas em álcool/éter (1:1). Procedeu-se em seguida a secagem

dessas lâminas com papel absorvente.

As primeiras alíquotas de sangue destinadas à avaliação dos

parâmetros hematológicos foram colocadas em uma das extremidades da

lâmina, em seguida com outra lâmina, com os cantos recortados, colocada em

frente à gotícula e em ângulo de 45

sobre a lâmina inferior, fez-se um

movimento para frente de modo a deslizar e espalhar a gotícula de sangue

(Figura 5). Depois de prontas, as extensões foram coradas com o corante de

ROSENFELD (1947), sendo cobertas por 10 gotas deste corante, ficando de

três a cinco minutos em repouso. Em seguida, foi colocada a mesma

quantidade de água destilada e homogeneizado com um bastão. Após 10

minutos as lâminas foram lavadas com água corrente, e secas a temperatura

ambiente.

Contagem Total de Leucócitos (CTL) e Contagem Total de Trombócitos

(CTT)

A Contagem Total de Leucócitos (CTL) e a Contagem Total de

Trombócitos (CTT) foi realizada nas extensões sanguíneas, em microscópio de

luz comum, com objetiva de imersão (100x) onde foram contadas 2.000 células

(englobando eritrócitos, leucócitos e trombócitos) das quais marcou-se a

quantidade de leucócitos e trombócitos. A contagem foi feita em todo o corpo

da extensão, movimentando-se a lâmina em “zig-zag”, contando um campo e

em seguida o campo aleatório seguinte. Através de uma regra de três,

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

considerando-se o número total de células contado na câmara de Neubauer,

calculou-se o número total de leucócitos e de trombócitos. A partir deste

cálculo, calculou-se os valores absolutos de cada leucócito, baseado em sua

porcentagem (HRUEB e SMITH, 1998).

Contagem Diferencial de Leucócitos (CDL)

A Contagem Diferencial de Leucócitos (CDL) foi realizada nas extensões

sanguíneas em microscópio de luz comum, com objetiva de imersão (100X)

onde foram contados 200 leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos,

linfócitos e monócitos) dos quais marcou-se a proporção existente entre as

distintas variedades de leucócitos. A contagem foi feita em todo o corpo da

extensão, movimentando-se a lâmina em “zig-zag”, contando um campo e em

seguida o campo logo seguinte. O número de cada elemento foi expresso em

porcentagem, obtendo-se, desta forma, o valor relativo. O valor absoluto foi

calculado por uma regra de três, partindo-se da contagem total de leucócitos e

do valor relativo de cada elemento.

Obs. Corante Rosenfeld

A técnica de coloração ROSENFELD (1947) é uma mistura de corantes:

0,97 g Giemsa em pó

0,53 g May-Grünwald em pó

1.000 mL Metanol

Obs. Solução de heparina:

1,0 mL de solução de heparina (5.000 UI) ( Liquemini

)

50,0 mL de solução salina 0,7%

٭ Conservar em geladeira a 4ºC

Guilherme Casoni da Rocha Anexo

Dissertação

Anexo 2

Ensaios Preliminares para determinação do tempo da exposição aérea

Segundo BARCELLOS et al. (2000) 60 segundos de hipóxia são

suficientes para a liberação de cortisol em tilápia do Nilo (Oreochromis

niloticus), organismos cuja respiração dá-se por via branquial. Para girinos de

R. catesbeiana que além da respiração branquial apresentam 30% de

respiração cutânea, houve a necessidade de se trabalhar com um intervalo

maior. Este intervalo de tempo foi definido a partir de testes preliminares

realizados pela equipe de trabalho, onde se avaliou a sobrevivência e

performance dos animais (grupos de 10 girinos) submetidos a hipóxia em

intervalos de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. Cada grupo de animal era

colocado sobre uma superfície úmida (plástico com uma lâmina d’água) e seca

(folha de papel). Após os intervalos de tempo pré-estabelecidos, os animais

eram reconduzidos aos aquários para recuperação. Observou-se que os girinos

colocados em superfície seca quando submetidos a 5 minutos de hipóxia já

não mais respondiam quando recolocados na água, ou seja, apresentavam-se

moribundos e/ou com movimentos natatórios lentos. Quanto aos animais

colocados em superfície úmida a recuperação passou a não ocorrer a partir de

20 minutos de hipóxia, com óbito de 70% após 1 hora de recuperação.

Baseado nos resultados deste ensaio estabeleceu-se 15 minutos de hipóxia

para os girinos a serem testados, acreditando-se que este intervalo seja

suficiente para a liberação de cortisol mediante o estímulo agudo estabelecido,

e posterior recuperação do animal para a retirada de sangue e processamento

das análises.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 