( PDF ) Estudo clínico e molecular de pacientes com displasia septo-óptica ou deficiência hormonal hipofisária (gene HESX1 e PROP1)

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Juliana de Barros Cruz

Estudo Clínico e Molecular de pacientes

com Displasia Septo-Óptica ou

Deficiência Hormonal Hipofisária

(gene HESX1 e PROP1)

Dissertação de mestrado apresentado ao

programa de pós-graduação Fisiopatologia em

Clínica Médica para obtenção do título de

mestre – Departamento de Clínica Médica da

Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP

Orientadora: Profa. Dra. Célia Regina Nogueira

Botucatu

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO

DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus

Cruz, Juliana de Barros.

Estudo clínico e molecular de pacientes com displasia septo-óptica ou

deficiência hormonal hipofisária (gene HESX1 e PROP1) / Juliana de Barros

Cruz. – Botucatu : [s.n.], 2008

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de

Medicina de Botucatu, 2008.

Orientadora: Célia Regina Nogueira

Assunto CAPES: 40101002

1. Hipófise 2. Hormônios da hipófise – Fisiologia 3.

Endocrinologia clínica - Aspectos genéticos

CDD 616.43

Palavras-chave: Deficiência hormonal hipofisária; Displasia septo-óptica;

Gene HESX1; Gene PROP1; Mutação

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Dedicatória

Ao meu noivo, Eduardo, pelo eterno companheirismo.

Aos meus pais, Paulo e Lea, por sempre estarem presentes e me

apoiando na minha trajetória pessoal e profissional.

Agradecimentos

Aos meus pais, Paulo e Lea, pelo exemplo de família, amor incondicional e

apoio constante em todas as etapas da minha vida.

Ao meu irmão, Marcos, à minha cunhada Juliana e à minha linda sobrinha

Júlia, por fazerem parte dessa família maravilhosa que temos.

Ao meu sogro e minha sogra, Edson e Bete, pelo acolhimento e apoio que

me deram todos estes anos.

À minha orientadora, Dra Célia Regina Nogueira, pessoa maravilhosa, que

sempre me estimulou e ajudou, tanto na parte científica, como em

momentos da vida pessoal.

À Dra Denise Perone, pela orientação dada e disponibilidade em me ajudar

sempre que precisei.

À Sueli Ap. Clara, pelo tempo e paciência ao me ajudar a formatar o texto.

À Elza Guedes, que me estimulou em momentos importantes da minha vida.

A toda equipe do laboratório de Biologia Molecular do Departamento de

Clínica Média, pela convivência e amizade.

Às médicas endocrinologistas Adriana Mendes, Bibiana Colenci, Gláucia

Mazeto e Walkíria Pimenta pelo apoio, carinho e convivência durante

todos esses anos.

Aos amigos Flávio Miano, Vânia Nunes, Nancy Bueno, Tricia Nunes e

Larissa Chambô, pelo afeto, companheirismo, amizade sincera e presença

em todos os momentos dessa trajetória.

Sumário

Resumo

Abstract

1. Introdução.............................................................................. 01

1.1. Embriogênese hipofisária................................................. 02

1.2. Gene HESX1........................................................................

1.3. Gene PROP1....................................................................... 09

2. Objetivo.................................................................................. 12

3. Pacientes e Métodos............................................................. 14

3.1. Avaliação Clínica................................................................ 15

3.2. Avaliação Hormonal........................................................... 24

3.3. Avaliação Radiológica....................................................... 26

3.4. Análise Molecular............................................................... 26

3.4.1. Extração do DNA............................................................. 26

3.4.2. Reação de Polimerização (PCR).................................... 26

3.4.3. Sequenciamento dos exons amplificados.................... 29

4. Resultados............................................................................. 30

4.1. Estudo molecular............................................................... 31

5. Discussão.............................................................................. 37

6. Conclusão.............................................................................. 46

7. Bibliografia.............................................................................

Anexos....................................................................................... 59

Lista de Figuras

Figura 1

Embriogênese Hipofisária......................................

Figura 2

Representação gráfica do gene HESX1................

Figura 3

Representação gráfica do modelo do efeito do

HESX1 mutante no desenvolvimento hipofisário

dependente do PROP1..........................................

Figura 4

Representação gráfica do gene PROP1................

Figura 5

Amplificação dos exons 1, 2,3 e 4 do gene HESX1......

Figura 6

Amplificação dos exons 1, 2 e 3 do gene PROP1........

Figura 7

Representação gráfica do sequenciamento

genético do paciente 2...........................................

Figura 8

Representação gráfica do sequenciamento

genético dos pacientes 4 e 5.................................

Figura 9

Representação gráfica do sequenciamento

genético do paciente 10.........................................

Figura 10

Representação gráfica do sequenciamento

genético dos pacientes 4,5 e 10............................

Figura 11

Mutações descritas no gene HESX1.....................

Lista de Tabelas

Tabela 1

Característica clínica, laboratorial e radiológica dos

pacientes estudados.....................................................

Tabela 2

Primers intrônicos utilizados – HESX1

.......................

Tabela 3

Primers intrônicos utilizados – PROP1

.......................

Tabela 4

Resultados encontrados no sequenciamento........

Tabela 5

Mutações descritas no gene HESX1.....................

Lista de Abreviaturas

ACTH

Hormônio adrenocorticotrófico

BMP2

Bone morphogenetic protein 2

BMP4

Bone morphogenetic protein 4

CPHD

combined pituitary hormone deficiency

Dia embriônico do camundongo

DGH

DHHC

Deficiência de hormônio de crescimento

Deficiência hormonal hipofisária combinada

DNA

Desoxiribonucleotídeo

Desvio padrão

DSO

Displasia Septo óptica

Engrailed homology domain

FGF

Fibroblast growth factor

FSH

Hormônio foliculo estimulante

GALA 4

Galactosidase 4

GATA 2

Gata binding protein 2

hormônio de crescimento

GHRHR

Receptor do hormônio liberador de GH

Gro

Groucho

Hesx1

Homeobox embryonic stem cell - representação gene

camundongo

HESX1 Homeobox embryonic stem cell – representação gene

humano

HHA

Hipoplasia hipofisária anterior

HNO

Hipoplasia nervo óptico

IGFBP3

Insulin like growth factor binding protein 3

IGF1

Insulin like growth factor 1

ITT

Insulin tolerant test

Hormônio luteinizante

LHX3

Lim homeobox gene

LIM

3 homeodomínios de proteínas Lin-11, Islet-1 (ISL1),e Mec-3

Lista de Abreviaturas

MCC

má formação de corpo caloso

NHE

neurohipófise ectópica

NeuroD1

neurogenic differentiation 1

Pax6

Paired Box gene 6

PCR

Polimerase chain reaction

PIT 1

Pituitary specific transcription factor 1

Pitx1 / 2

Paired-like homeodomain transcription factor 1 / 2

PNA

prega neural anterior

PRL

Prolactina

PROP1

prophet of Pit-1

RNM

ressonância nuclear magnética

Rpx

Rathke pouch homeobox

Shh

Sonic hedgehog

SOD

Septo optic dysplasia

TLE1

Transducin-like enhancer of split 1

TSH

Hormônio tireotrófico

Resumo

A hipófise anterior compõe-se de cinco tipos celulares que

são definidos pelos hormônios que secretam. A diferenciação desses tipos

celulares resulta de uma cascata temporalmente regulada de fatores

transcricionais expressos no tecido hipofisário. Mutações de um desses

fatores podem resultar tanto em defeitos estruturais da glândula como em

deficiências hormonais, que podem ser isoladas (Déficit de hormônio do

crescimento - DGH) ou combinadas (DHHC), dependendo do papel do fator

transcricional mutado. A Displasia Septo – óptica (DSO) caracteriza-se pela

presença de hipoplasia hipofisária, hipoplasia de nervo óptico e/ou má

formações de estruturas da linha média. Foram avaliados 11 pacientes com

quadro clinico de SOD, DGH e DHHC e realizado o sequenciamento

genético do gene HESX1 desses indivíduos. Nos casos de DHHC foi feita

uma análise adicional do gene PROP1. A mutação missense em estado de

heterozigose A1772G levando a substituição N125S foi identificada em um

paciente portador de DSO, no gene HESX1. Essa troca já foi previamente

relatada como um polimorfismo na população Afro-Caribenha. Encontramos

três pacientes portadores da variante alélica A9A e N20S no exon 1 do gene

PROP1, já descritos previamente na literatura como polimorfismos.

Palavras chave: Deficiência hormonal hipofisária; Displasia septo-óptica;

Gene HESX1; Gene PROP1; Mutação

Abstract

The anterior pituitary is made of five types of cell defined

according to the hormones they secrete. Differentiation among such cell

types derives from a cascade of temporally regulated transcriptional factors

expressed in the pituitary tissue. Mutation in one of these factors may result

in both structural gland defects and hormonal deficiencies, which may be

either isolated (DGH – Growth Hormone Deficiency) or combined, depending

on the role of the mutated transcriptional factor. Septo-optic dysplasia (SOD)

is characterized by pituitary hypoplasia, optic nerve hypoplasia and/or

malformation of medium line structures. Eleven patients with a clinical state

of SOD, DGH and CPHD were assessed, and genetically sequenced for the

HESX1 gene. For CPHD cases, an additional analysis for the PROP1 gene

was also conducted. One SOD patient was found to have a missense

mutation in A1772G heterozygosis state, leading to the N125S replacement,

in HESX1 gene. Such replacement has already been reported as a

polymorphism in the Afro-Caribbean population. We found three patients

with the alelic variation A9S and N20A in exon 1 of PROP1 gene, previously

described as polymorphisms.

Key words: Pituitary hormone deficiency, Septo-optic dysplasia, HESX1

gene, PROP1 gene, mutation.

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1. Embriogênese Hipofisária

A glândula hipofisária é composta pela adeno-hipófise, a

qual compreende o lobo anterior e intermediário, e pela neuro-hipófise, que

consiste nas projeções dos neurônios magnocelulares hipotalâmicos,

também referida como hipófise posterior

O desenvolvimento do lobo anterior se inicia entre a terceira

e a sexta semanas de gestação. Aproximadamente na terceira semana, o

ectoderma oral se invagina para formar o primórdio pituitário rudimentar,

conhecido como bolsa de Rathke. Esta se prolifera em direção ao terceiro

ventrículo, onde se funde com o lobo posterior. A porção da bolsa em

contato com a neuro-hipófise forma o lobo intermediário, pouco evidente em

seres humanos, já que ocorre sobreposição com as células da hipófise

O lobo posterior tem origem neural, derivando de uma

evaginação do hipotálamo ventral e do terceiro ventrículo, sendo composto

pelos axônios e terminações nervosas de neurônios hipotalâmicos

A análise da embriogênese dos camundongos evidencia que

a parte anterior da placa neural (PNA), originará as estruturas não neurais

tais como hipófise anterior, ectoderma da cavidade nasal e a placa olfatória,

enquanto um tecido da placa neural imediatamente adjacente a PNA, dará

Introdução

origem às estruturas neurais anteriores como hipotálamo, hipófise posterior,

vesículas ópticas e porção ventral da região anterior do cérebro

4, 5

Ao nascimento, a hipófise anterior compõe-se de cinco tipos

celulares que são definidos pelos hormônios que secretam: corticotrofos

(secretam ACTH), tireotrofos (TSH), somatotrofos (GH), gonadotrofos (FSH

e LH) e lactotrofos (PRL).

Há uma série de fatores transcricionais tais como Pit1

(pituitary specific transcription factor 1), Prop1 (prophet of Pit1),

Hesx1(Homeobox embryonic stem cell), Lhx3 (Lim homeobox gene 3), Lhx4

(Lim homeobox gene 4), Pitx1/2 (Paired-like homeodomain transcription

factor 1/2),Tpit (T Box transcription factor), que atuam de um modo

temporalmente regulado para permitir a diferenciação progressiva desses

tipos celulares

(Figura 1).

Introdução

Figura 1. Adaptado de Asteria,C.- Embriogênese Hipofisária: fatores transcricionais

envolvidos, cascata temporalmente regulada da expressão desses fatores

Ptx1: Paired-like homeodomain transcription factor; Alfa-GSU: alfa unidade do hormônio

gonadotrófico; Pit1: pituitary specific transcription factor 1; NeuroD1: neurogenic

differentiation 1; GATA2: gata binding protein 2; Hesx1: homeobox embryonic stem cell; Tpit:

T Box transcription factor; Dax1: dosage-sensitive sex reversal congenital adrenal

hypoplasia critical region on the X chromosome-1; Lhx3/4: Lim homeobox gene; Prop1:

profeta do Pit1; ACTH: Hormônio Corticotrófico; LH: Hormônio Luteinizante; FSH: Hormônio

Folículo estimulante; TSH: Hormônio Tireotrófico; PRL: Prolactina; GH: Hormônio do

crescimento

Bolsa de Ratke

Ptx1

Lhx3

Ptx1

Six3

ACTH

Alfa-GSU

Neuro D1 Tpit

Prop 1

GATA2

Pit1

PRL

TSH

LH/FSH

Dax1

Introdução

A falência dessas células em se diferenciarem ou

proliferarem durante a embriogênese hipofisária, resulta em alterações

hipofisárias congênitas, que podem ser estruturais (Displasia Septo óptica -

DSO) ou deficiências hormonais. Esta por sua vez pode ser isolada, como o

déficit de hormônio de crescimento (DGH); ou combinada, dependendo do

fator transcricional mutado.

8, 9,10

1.2. Gene HESX1

O gene Hesx1 também conhecido como Rpx (Rathke pouch

homeobox gene) regula os estágios iniciais do desenvolvimento hipofisário.

Seus transcritos são detectados inicialmente no 6,5 DE (dia embriônico) no

endoderma visceral anterior, coincidente com o inicio da gastrulação. No 7,5

DE a expressão é observada no ectoderma cerebral e no mesoderma axial

anterior subjacente. No 8,5 DE o Hesx1 se expressa no ectoderma neural

rostral e também é detectado no ectoderma oral e na região do intestino

anterior. No 9,5 DE sua expressão está restrita ao diencéfalo ventral e à

bolsa de Rathke. No 10,5 DE os transcritos são detectados apenas na bolsa

de Rathke. O Hesx1 continua a ser expresso no desenvolvimento da hipófise

anterior até o 11,5 DE, quando os transcritos desaparecem em uma

seqüência espaço-temporal que corresponde à diferenciação hipofisária.

Sua expressão se torna indetectável no 15,5 DE

Introdução

Em 1998 Dattani et al. publicaram o resultado de um modelo

com nocaute para o gene HESX1 em camundongos. Os homozigotos

apresentaram redução do tecido prosencefálico, anoftalmia ou microftalmia e

anormalidades do corpo caloso e septo pelúcido, a hipófise anterior pequena

e não conectada ao lobo posterior. Os defeitos de linha média cerebral no

mutante, caracterizado pela ausência de septo pelúcido e ausência de corpo

caloso e morfogênese anormal da hipófise anterior apresentam uma

semelhança fenotípica com a síndrome da displasia septo-óptica (DSO) no

homem

A Displasia Septo-óptica (DSO) é uma condição bastante

heterogênica, definida pela presença de pelo menos dois dos seguintes

critérios: hipoplasia do nervo óptico, anormalidades de linha média (como

agenesia de corpo caloso e ausência de septo pelúcido) e hipoplasia

hipofisária com deficiências hormonais. O fenótipo é bastante variável com

aproximadamente 30% dos casos apresentando a manifestação completa

Essa doença ocorre com maior freqüência em crianças que nascem de

mães muito jovens, e recentemente casos de hipoplasia de nervo óptico

isolada ou DSO tem sido descritos em áreas geográficas com alta taxa de

gravidez em adolescentes

Baseado nessa associação entre o fenótipo apresentado

pelos camundongos nocautedos para o gene Hesx1 e a DSO no homem,

Dattani et al. clonaram, sequenciaram e mapearam o gene HESX1

homólogo no ser humano a partir de uma biblioteca genômica, a fim de

analisar esse gene em pacientes com defeitos de linha média cerebral,

Introdução

malformação do sistema nervoso central, associado ou não às deficiências

hormonais hipofisárias. O gene foi mapeado, seqüenciado e localizado no

braço curto do cromossomo 3 na região 3p21.1-21.2. O lócus do gene

HESX1 tem 1.7Kb distribuídos em 4 exons que codificam uma proteína de

185 aminoácidos (aa) que possui na sua porção N-terminal um domínio com

7 aa (resíduos 21-27) altamente conservado nas espécies denominado eh-1

(engrailed homology domain), a região implicada na repressão da

transcrição, assim como um homeodomínio com 3 hélices, que se liga ao

DNA, onde foi mapeado um outro domínio repressor

(figura 2).

Figura 2. Representação gráfica do gene HESX1. O gene contém 4 exons, e seu

transcrito, uma proteína de 185 aa, que contém o domínio repressor na região eh-1

e o domínio paired (Prd) que contém 3 hélices de ligação ao DNA. Adaptado Parks,

A proteína Hesx1 e um segundo fator prd –like (Prop1) são

expressos em domínios temporalmente e espacialmente distintos. A

Exons

185

Repressor

Introdução

atenuação da expressão do Hesx1 na glândula hipofisária coincide com a

progressão da diferenciação celular dependente do Prop1

Figura 3: Modelo pelo qual o HESX1 mutante interfere no desenvolvimento

hipofisário PROP1 dependente. Adaptado Cohen, RN

15.

A proteína hesx1 age como repressora que pode suprimir a

ação de um ativador ao se ligar ao mesmo sítio de reconhecimento do DNA,

em um processo conhecido como repressão heterodimérica.

Conseqüentemente a proteína hesx1 pode agir no contexto do complexo

Hesx1/Prop1 para suprimir a atividade do PROP1. Alguns fatores adicionais

são necessários para essa repressão: receptor nuclear correpressor (Ncor),

mSin3A/B, deacetilases de histona (recrutados pelo homeodomínio) e

correpressores da família Groucho, como o TLE1 (recrutado pelo domínio

eh1)

Expressão HESX1

Expressão

PPROP1

HESX1

PROP1

Mut

HESX1

Mut

HESX1

Mut

HESX1

Mut

HESX1

Estimulação da expressão

gênica

Linhagens

celulares

dependentes do PROP1

Alteração no tempo do

programa celular dependente

do PROP1

Desenvolvimento hipofisário

anormal

Padrão de ex

pressão do

HESX1 e PROP1

durante o

desenvolvimento

hipofisário

Introdução

Atualmente são descritas onze mutações no gene HESX1

que podem levar a fenótipos variados, incluindo deficiência hormonal

hipofisária combinada, DSO e DGH

1.3. Gene PROP1

A proteína Prop1 é um fator transcricional paired-like,

expresso exclusivamente na glândula hipofisária embriônica. Sua expressão

é inicialmente detectada na porção dorsal da bolsa de Rathke murina, em

uma região que se sobrepõe à expressão do domínio do Hesx1. A

expressão máxima do Prop1 ocorre no 12 DE, tornando-se indetectável no

15,5 DE. O camundongo Ames dwarf abriga uma substituição natural da

serina por prolina (S83P) no homeodomínio do Prop1, resultando em uma

proteína anômala com afinidade oito vezes menor ao se unir no sitio de

ligação do DNA do que a proteína wild-type. Quando essa mutação ocorre

em homozigose, o camundongo se apresenta com grave nanismo,

hipotireoidismo e infertilidade, e apesar de o desenvolvimento hipofisário

inicial ser semelhante ao camundongo wild-type, a glândula hipofisária é

hipoplásica na vida adulta apresentando uma redução de aproximadamente

50% do seu tamanho com deficiência de GH, TSH e prolactina, além de

expressão reduzida dos gonadotrofos.

Após a identificação do Prop1 como o gene responsável

pelo fenótipo do camundongo ames dwarf , Wu et.al. descreveram a primeira

Introdução

mutação no gene PROP1 em pacientes humanos com déficit de GH, TSH,

PRL, LH e FSH

O gene foi mapeado, seqüenciado e localizado no braço

longo do cromossomo 5. O lócus do gene PROP1 tem 3 Kb distribuídos em

3 exons que codificam uma proteína de 223 aminoácidos (aa) cuja porção N-

terminal apresenta um domínio de ativação da transcrição gênica, assim

como um homeodomínio com 3 hélices, que se liga ao DNA

17.

(Figura 4).

Figura 4. Representação gráfica do gene PROP1. O gene contém 3 exons, e seu

transcrito, uma proteína de 223 aminoácidos, que contém o domínio ativador e o

domínio paired (Prd) com 3 hélices de ligação ao DNA. Adaptado Parks, JS

Até a atualidade, existem 22 mutações descritas no gene

PROP1, identificadas em mais de 170 pacientes com deficiência hormonal

hipofisária combinada. Mutações neste gene são responsáveis por

aproximadamente 50% dos casos familiares desta patologia.

Ativador

transcricional

Exons

223

Domínio

Protéico

Introdução

Considerando-se a escassez na literatura de estudos do

gene HESX1 e PROP1 em casos esporádicos, nosso trabalho tem por

finalidade avaliar a presença de mutação nesse perfil de paciente. Portanto,

indivíduos com deficiência hormonal hipofisária combinada são candidatos

para o rastreamento genético do gene HESX1 e PROP1, enquanto que

pacientes com DSO e DGH devem ser rastreados para mutações no

HESX1.

Objetivos

O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos clínicos, de

propedêutica armada e molecular de indivíduos com Displasia Septo óptica

(gene HESX1), déficit de GH (gene HESX1) e deficiência hormonal

hipofisária combinada (gene HESX1 e gene PROP1).

Pacientes e Métodos

3. PACIENTES E MÉTODOS

Estudamos 11 pacientes acompanhados no ambulatório de

crescimento, da disciplina de Endocrinologia e Metabologia do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, no período de

2005 e 2006. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética médica.

Após a assinatura do termo de consentimento informado livre e esclarecido,

os membros foram incluídos no estudo.

3.1. Avaliação clínica

Os dados clínicos dos pacientes foram obtidos

retrospectivamente do prontuário médico, e incluiu história de

consangüinidade, história familiar, parâmetros auxológicos e avaliação

hormonal.

Os critérios de inclusão foram:

 Déficit de hormônio de crescimento: Pacientes com altura menor que dois

desvios-padrão, com dois testes de estímulo confirmando a deficiência

de hormônio de crescimento. Em crianças com valores subnormais de

IGF-1 e IGFBP-3 associados à baixa velocidade de crescimento e

deficiência de outros hormônios hipofisários, os testes de estímulo não

foram realizados. Utilizamos como critérios de diagnóstico de deficiência

de GH, níveis de pico de GH após estímulo < 7.0 ng/mL no método de

radioimunoensaio.

Pacientes e Métodos

 Deficiência hormonal hipofisária combinada: déficit de dois ou mais

hormônios do eixo hipofisário comprovada laboratorialmente por exames

endocrinológicos específicos.

 Displasia Septo-óptica: duas ou mais das seguintes características:

1)hipoplasia do nervo óptico, 2) anormalidades de linha média (como

agenesia de corpo caloso e ausência de septo pelúcido, 3) hipoplasia

hipofisária com deficiências hormonais.

Foram estudados três pacientes com DSO (pacientes 1, 2 e

3), três pacientes com DGH (pacientes 6,7 e 8 – tabela 1) e cinco pacientes

com deficiência hormonal hipofisária combinada (pacientes 4,5,9, 10 e 11 –

tabela 1).

Paciente 1:

Deu entrada no ambulatório da disciplina de Endocrinologia

e Metabologia da FMUNESP aos 3 anos e 3 meses de idade. Apresentava

história de astenia, fraqueza, constipação intestinal e episódios de

hipoglicemia de repetição. Durante a avaliação endocrinológica, foram

observados déficit de cortisol, de IGF1 e de IGFBP3, bem como níveis

baixos de hormônio tireoidiano com níveis inapropriadamente normais de

tireotrofina. Com esses parâmetros foi diagnosticada insuficiência adrenal

secundária, hipotireoidismo central e déficit de GH. Apresentava hipoplasia

de nervo óptico esquerdo avaliado pela fundoscopia, e ressonância nuclear

magnética evidenciando hipoplasia de hipófise anterior e neuro-hipófise

Pacientes e Métodos

ectópica. Não tinha antecedente de consangüinidade ou casos semelhantes

na família.

Paciente 2:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço com 1ano e 3

meses de idade. Apresentava quadro de convulsões desde o nascimento,

além de astenia e fraqueza. Durante a avaliação endocrinológica foram

observados déficit de cortisol, níveis diminuídos de IGF1 e IGFBP3 bem

como déficit de hormônio tireoidiano. Com esses parâmetros foi

diagnosticada insuficiência adrenal secundária, hipotireoidismo central e

déficit de GH. Apresentava hipoplasia de nervo óptico esquerdo avaliado

pela fundoscopia, e ressonância nuclear magnética evidenciando hipoplasia

de hipófise anterior e neuro-hipófise ectópica. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 3:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 3 anos e 5

meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura, com parâmetros

auxológicos expressivos (desvio padrão para altura de –5,8). Além disso,

queixava-se de astenia e, durante o acompanhamento ambulatorial, foi

observado ausência de desenvolvimento puberal, foi diagnosticado déficit de

GH, hipotireoidismo e hipogonadismo central. Diagnosticou-se coloboma em

olho esquerdo, e a ressonância nuclear magnética evidenciou hipoplasia de

Pacientes e Métodos

hipófise anterior e má formação de corpo caloso. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 4:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 3 anos e 5

meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura, com desvio padrão

para altura de -3,48. Queixava-se também astenia, fraqueza, poliúria e

polidispsia. Após investigação endocrinológica específica, foram detectados

s déficits de GH, de hormônio tireoidiano, de cortisol e de hormônio

antidiurético. Com esses parâmetros foi feito o diagnóstico de déficit de GH,

hipotireoidismo central, insuficiência adrenal secundária e diabetes insípido

central. A ressonância nuclear magnética evidenciou hipoplasia hipofisária

anterior e neuro-hipófise ectópica. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 5:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 13 anos e

10 meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura significante

(desvio padrão para altura de –5,7), infantilismo sexual (estádio M1P1 de

Tanner), hipoglicemia de repetição, fadiga, desânimo, astenia. Após

investigação endocrinológica específica, foram detectados déficit de GH, de

hormônio tireoidiano, de cortisol e de gonadotrofinas. Com esses parâmetros

foi feito o diagnóstico de déficit de GH, hipotireoidismo central, insuficiência

adrenal secundária e hipogonadismo hipogonadotrófico. A ressonância

Pacientes e Métodos

nuclear magnética evidenciou hipoplasia hipofisária anterior. Não tinha

antecedente de consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 6:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 14 anos e 3

meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura (desvio padrão para

altura de –2,6), sem outras características relevantes. Após investigação

endocrinológica específica, foi detectado déficit isolado de GH, com os

demais eixos hipofisários preservados. Não apresentava alterações à

ressonância nuclear magnética. Não tinha antecedente de consangüinidade

ou casos semelhantes na família.

Paciente 7:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 18 anos e 5

meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura significante (desvio

padrão para altura de –6,4), sem outras características relevantes. Após

investigação endocrinológica específica, foi detectado déficit isolado de GH,

com os demais eixos hipofisários preservados. Não apresentava alterações

à ressonância nuclear magnética. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 8:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 14 anos e

10 meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura significante

Pacientes e Métodos

(desvio padrão para altura de –3,0), sem outras características relevantes.

Após investigação endocrinológica específica foi detectado déficit isolado de

GH, com os demais eixos hipofisários preservados. Não apresentava

alterações à ressonância nuclear magnética. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 9:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 16 anos e 9

meses de idade. Já apresentava diagnóstico de déficit de GH. Apresentava

quadro de baixa estatura significante (desvio padrão para altura de –6,0),

mesmo tendo feito uso prévio de hormônio de crescimento em outro serviço.

Apresentava infantilismo sexual (estádio M1P1 de Tanner), fadiga,

desânimo, astenia. Após investigação endocrinológica específica, além do

diagnóstico prévio de DGH, apresentava diminuição de hormônio tireoidiano,

cortisol e gonadotrofinas. Com esses parâmetros foi feito o diagnóstico de

déficit de GH, hipotireoidismo central, insuficiência adrenal secundária e

hipogonadismo hipogonadotrófico.

A ressonância nuclear magnética evidenciou hipoplasia

hipofisária anterior. Não tinha antecedente de consangüinidade ou casos

semelhantes na família.

Paciente 10:

Iniciou acompanhamento em nosso serviço aos 9 anos e 3

meses de idade. Apresentava quadro de baixa estatura significante (desvio

Pacientes e Métodos

padrão para altura de –4,49), infantilismo sexual (estádio M1P1 de Tanner),

fadiga, desânimo, astenia. Após investigação endocrinológica específica, foi

detectado déficit de GH, de hormônio tireoidiano, de cortisol e de

gonadotrofinas. A ressonância nuclear magnética evidenciou hipoplasia

hipofisária anterior e neuro-hipófise ectópica. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Paciente 11:

Iniciou seguimento em nosso serviço aos 14 anos.

Apresentava história de criptorquidia bilateral e hipospádia, com correção

cirúrgica previamente. Apresentava também baixa estatura, com desvio

padrão para altura de – 2, 91, infantilismo sexual (estádio G1P1 de Tanner),

com micropênis (pênis tracionado menor que 2,5 desvio-padrão). Após

investigação endocrinológica específica, foram confirmados os déficits de

GH, hormônio tireoidiano e gonadotrofinas. A ressonância nuclear magnética

evidenciou hipoplasia hipofisária anterior. Não tinha antecedente de

consangüinidade ou casos semelhantes na família.

Pacientes e Métodos

Tabela 1. Características clínica, laboratorial e radiológica dos pacientes

estudados

Paciente Sexo Idade

Score Z

(altura)

Livre

(ng/dL)

(0,8-1,9)

TSH

(uU/mL)

(0,4-4)

PRL

(ng/mL)

M:2,5-17

F:1,9-25

1 M

3 anos e

3 meses

-0,4 0,77 6,05 24,2

2 F

1 ano e 3

meses

-0,85 0,55 6,47 6,5

3 M

3 anos e

5 meses

-5,8 1,00 2,69 64,5

4 M

3 anos e

5 meses

-3,48 0,7 1,9 15,9

5 F

13 anos e

10 meses

-5,7 0,535 6,5 13,3

6 M

14 anos e

3 meses

-2,6 1,3 2,6 4,13

7 M

18 anos e

5 meses

-6,4 1,13 2,88 6,7

8 M

14 anos e

3 meses

-3,0 1,65 3,74 18,1

9 F

16 anos e

9 meses

-6,0 0,71 3,02 #

10 F

9 anos e

3 meses

-4,49 0,63 0,005 22

11 M 14 anos -2,9 0,71 1,33 8,77

Pacientes e Métodos

Paciente

FSH/LH

(mUi/mL)

Cortisol

(ug/dL)

Testosterona

livre

(pg/mL)

IGF1/

IGFBP3

(ng/mL)

Pico do

GH no

ITT

(ng/mL)

RNM

0,52/0,17

3,52 15,07

27/1610

HHA/NH

E/HNO

2 # 5,8 #

8,8/1086

HHA/NH

E/HNO

3 <0,1/0,1 7,74 0,01 # #

HHA/MC

C/Colobo

<1,0/0,6

3,9 0,7 # 0,5

HHA

0,32/0,1

1,89 # # 0,54

Normal

4,13

10,98 0,34 # 6,5 Normal

7 6,7 18,6 9,74 # 0,33 Normal

8 18,1 14,5 0,96 # 0,73 Normal

9 # 2,57 # # #

HHA

10 22 <1 # # <0,25

HHA/NH

11 8,77 15,5 0,84 # 5,6

HHA

# : Dados não disponíveis no prontuário médico

M: sexo masculino

F: sexo feminino

HHA: hipoplasia de hipófise anterior

NHE: neuro hipófise ectópica

HNO: hipoplasia de nervo óptico

MCC: Má formação de corpo caloso

Parâmetros de Normalidade: LH: M: 0,8-7,6 mUi/mL, F: 1,1-11 mUi/mL, FSH: M: 0,7-11,1 mUi/mL, F: 2,8-11,3

mUi/mL, Cortisol: 5-25 ug/dL, Testosterona livre: 8,8-27 pg/mL, IGF1: 20-200, IGFBP3: 1400-4250ng/ml, pico do

GH no ITT<7ng/ml.

Pacientes e Métodos

3.2. Avaliação Hormonal

Os seguintes exames e testes endocrinológicos foram

usados para confirmar o diagnóstico clinico dos pacientes:

 Para acessar a função da hipófise anterior, dosagens hormonais basais

foram realizadas (TSH, T4 livre, PRL, LH, FSH, GH, IGF-1, IGFBP3,

Cortisol, Testosterona).

 Dosagem de TSH, T4 livre, PRL, LH, FSH, Cortisol –

Quimioluminescência, aparelho Immolite 2000 (Kits DPC, Los Angeles,

CA).

Os valores de referência utilizados foram:

 TSH → 0,4 – 4 uUI/mL

 T4 livre → 0,8-1,9 ng/dL

 Prolactina

→ Sexo feminino: 1,9-25 ng/mL

→ Sexo masculino: 2,5-17 ng/mL

 LH

→ Sexo feminino: 1,1-11,6 mUI/mL

→ Sexo masculino: 0,8-7,6 mUI/mL

 FSH

→ Sexo feminino: 2,8-11,3 mUI/mL

→ Sexo masculino: 0,7-11,1 mUI/mL

 Cortisol → 5-25 ug/dL

Pacientes e Métodos

 Dosagem de IGF-I: Ensaio imunorradiométrico após extração do etanol

utilizando anticorpos monoclonais específicos (kit da Diagnostic Systems

Laboratories Inc (DSL), Webster, TX, EUA).

O seguinte valor de referência foi utilizado para crianças até 6 anos: 20-

200 ng/mL.

 Dosagem de IGFBP3 – Ensaio imunorradiométrico (Kit da DSL, Webster,

TX, EUA).

O seguinte valor de referência foi usado para crianças de 3-4 anos: 1400-

4250 ng/mL.

 Dosagem de GH e testosterona livre - Radioimunoensaio (RIE).

Para a dosagem de GH no teste de estímulo, foi considerado um valor

menor do que 7 ng/mL como não responsivo.

Para a testosterona livre o valor de referência utilizado foi: 8,8-27 pg/nL

(20-39 anos).

 Teste da clonidina: (administrado 100 ug/m

de superfície corporal, vo)

com coletas de sangue para dosagem de GH no tempo basal, e nos

tempos 30, 60, 90 e 120 minutos após administração da clonidina.

 Teste combinado para avaliar função hipofisária: inclui a hipoglicemia

induzida pela administração iv de 0,1U/Kg de peso de insulina (ITT) +

200ug de TRH + 100 ug de GnRH com coletas de sangue periférico para

dosagem de glicemia, GH, cortisol, TSH, PRL, LH e FSH nos tempos -15,

0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos após a administração da medicação.

Pacientes e Métodos

3.3. Avaliação Radiológica

A região hipotálamo-hipofisária foi avaliada por ressonância

magnética obtendo-se cortes coronais e sagitais em T1 com TR 350 ms e

TE=20 ms utilizando-se um aparelho Tesla 0,5 (Sigma GE, Milwaukee,

Wiscosin, USA).

3.4. Análise Molecular

3.4.1. Extração de DNA

A extração, amplificação, sequenciamento do DNA e análise

dos resultados foram realizados no laboratório Experimental da Clinica

Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP.

O DNA foi extraído pelo método de Salting out

3.4.2. Reação de Polimerização (PCR)

O exon 1 do HESX1 dos onze pacientes em estudo, foi

amplificado por PCR utilizando-se primers intrônicos previamente descritos

enquanto que o exon 2, exon 3 e exon 4 foram amplificados utilizando-se

primers intrônicos desenhados em nosso laboratório, após padronização da

reação com DNA controle (tabela 2).

Pacientes e Métodos

Tabela 2: Primers intrônicos utilizados – HESX1

Exon

Seqüência 5´-3´

Exon 1

1F 5´-AGCTGTTGCTCTGTGCAGACCACGAGA-3´

1R 5´-ACAAAGAATTGAAACAATTAAGCTGTGGCA-3´

Exon 2

2F 5´-TTGACCATCTAAGACAGGGC-3´

2R 5´-AAGTGAGTGGGCTTTTGCTC-3´

Exon 3/4

3F 5´-GAGCAAAAGCCCACTCACTT-3´

4R 5´-CCACTGATTCTTCATGCTCT-3´

Exon 1 (primer sense -1F e anti sense -1R); Exon 2 (primer sense -2F e anti sense -

2R); Exon 3 e 4 (primer sense -3F e anti sense -4R)

A reação foi realizada utilizando-se 300ng do DNA genômico

em um volume final de 50 µLcontendo: 20mmol/L Tris-HCL (ph 8,3);

50mmol/L KCL; 0,2 mmol/L de deoxy-NTP; 1,5mmol/L MgCl

; 1,75 U Taq

DNA polimerase e 20 pmol/L de cada primer específico (Invitrogen, São

Paulo, Brasil).

As condições da PCR usadas para amplificação do HESX1

foram: 94 C° por 5 minutos, seguido de 30 ciclos a 94C° por 30 segundos,

55 por 30 segundos, 72C° por 30 segundos com extensão final de 72C° por

10 minutos. Os produtos de PCR foram inicialmente purificados utilizando-se

o Kit Rapid PCR Purification Systems (Marligen Bioscience).

Pacientes e Métodos

Os exons 1,2 e 3 do gene PROP1 dos cinco pacientes com

deficiência hormonal hipofisária combinada foram amplificados utilizando-se

primers intrônicos previamente descritos (tabela 3)

Tabela 3. Primers intrônicos utilizados – PROP1

Exon

Seqüência 5´-3´

Exon 1

1F 5´-ACCTACACACACATTCAGAGACAG -3´

1R 5´-TGGAGCCTATGCTTTCAGC -3´

Exon 2

2F 5´-AAAGACTGGAGCAGCACAGGACGCA- 3´

2R 5´-CTCAATGCAGTTGCTCTGATG -3´

Exon 3

3F 5´-GCCTTGTGGAAGAGCTTTACTCC 3´

4R 5´-ATTTCTAATCGCTGAGCTGACCC -3´

Exon 1 (primer sense -1F e anti sense -1R); Exon 2 (primer sense -2F e anti sense -

2R); Exon 3 (primer sense -3F e anti sense -3R)

A reação foi realizada utilizando-se 300ng do DNA genômico

em um volume final de 50 µL contendo: 20mmol/L Tris-HCL (ph 8,3);

50mmol/L KCL; 0,2 mmol/L de deoxy-NTP; 1,5mmol/L MgCl

; 1,75 U Taq

DNA polimerase e 15 pmol/L de cada primer específico (Invitrogen, São

Paulo, Brasil).

As condições da PCR usadas para amplificação do PROP1

foram: 95C° por 3 minutos, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95C°, 30

segundos a 60C°, 2 minutos a 72C, ° e cinco minutos a 72C°. Os produtos

Pacientes e Métodos

de PCR foram inicialmente purificados utilizando-se o Kit Rapid PCR

Purification Systems (Marligen Bioscience).

3.4.3. Seqüenciamentos dos Exons Amplificados

Para a reação de sequenciamento foi utilizado o seguinte

protocolo: 1µL de sense primer a 1,6 pmol/µL, 2 µL de Big Dye TM

Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (Applied Biosystems Foster City, CA,

EUA), 1 µL de tampão Save Money, 1,5 µL de amostra, 4,5 µL de água.

O termociclador foi programado da seguinte forma: um ciclo

de 10 segundos à temperatura de 96˚C, um ciclo de 5 segundos à

temperatura de 50˚C e um ciclo de 4 segundos à temperatura de 60˚C;

repetido 25 vezes todas as etapas anteriores, terminando com a temperatura

de 4˚C. Para atingir as várias temperaturas desejadas, foi realizado um

escalonamento de 1˚C por 1 segundo.

Após a reação de sequenciamento, os produtos foram

submetidos à precipitação alcoólica e lidos no seqüenciador ABI Prism 3100

Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA).

As seqüências de DNA obtidas dos pacientes foram

comparadas com as dos indivíduos normais (PROP1 geneID: 5626 e HESX1

geneID: 8820).

Resultados

4. Resultados

Os 11 pacientes portadores de deficiência de GH

isolada, deficiência hormonal hipofisária combinada ou displasia septo-óptica

foram divididos em 3 grupos de acordo com o quadro clinico.

1. Displasia septo-óptica (pacientes 1,2,3)

2. Deficiência isolada de GH (pacientes 6,7,8)

3. Deficiência hormonal hipofisária combinada (pacientes 4,5,9,10,11)

4.1. Estudo molecular

Todos os exons do gene HESX1 dos 11 pacientes

estudados foram adequadamente amplificados nos tamanhos esperados.

A B

Figura 5. A: Amplificação dos exons 2 e 3 - 4 do gene HESX1

B: Amplificação do exon 1 do gene HESX1

pb: pares de base

Exon 2 e Exon 3 - 4 gene

HESX1

Exon 1 gene

HESX1

Exon 2

(315 pb)

Exon ¾

(556 pb)

Exon 1

(219 pb)

Resultados

Todos os exons do gene PROP1 dos cinco pacientes

estudados foram adequadamente amplificados nos tamanhos esperados.

Figura 6. Amplificação dos exons 1, 2 e 3 do gene PROP1

pb: pares de base

Grupo 1. Pacientes com DSO

No estudo molecular dos três pacientes com DSO

estudados, encontramos a mutação missense A1772G com a substituição

de uma asparagina por uma serina na posição 125 (N125S) em estado de

heterozigose no paciente 2 (figura 7).

Exon 1, 2, 3 gene PROP1

Exon 1

(369 pb)

Exon 2

(492 pb)

Exon 3

(605 pb)

Resultados

Figura 7: Resultado do sequenciamento da fita antisense do Exon 3 do gene

HESX1 do paciente 2. A seta assinala a troca do nucleotídeo T pelo C em

heterozigose, levando a substituição de uma asparigina por serina no códon 125

(tabela 4)

Grupo 2. Pacientes com DGH

Não encontramos alterações no estudo molecular do gene

HESX1 dos três pacientes estudados.

Grupo 3. Pacientes com Deficiência hormonal hipofisária combinada

Nos cinco pacientes com deficiência hormonal hipofisária

combinada estudados, não encontramos mutações do gene HESX1.

No estudo genético do PROP1, encontramos a variante

alélica T27C em heterozigose nos pacientes 4 e 5 (figura 7) e em

homozigose no paciente 10 (figura 8). Essa troca de nucleotídeos pode ser

Resultados

considerada uma mutação silenciosa, já que não leva alteração do

aminoácido codificado, que se mantém como alanina (A9A).

Figura 8: Resultado do sequenciamento da fita sense do Exon 1 do gene PROP1

dos paciente 4 e 5. A seta assinala a troca do nucleotídeo T pelo C em

heterozigose, sem promover alteração do aminoácido alanina no códon 9 (tabela 4).

Figura 9: Resultado do sequenciamento da fita sense do Exon 1 do gene PROP1

do paciente 10. A seta assinala a troca do nucleotídeo T pelo C em homozigose,

sem promover alteração do aminoácido alanina no códon 9 (tabela 4).

Resultados

Encontramos a variante alélica A59G em homozigose no

códon 20 do exon 1 , caracterizada pela substituição de uma asparagina por

serina, também nos pacientes 4,5 e 10 (figura 8).

Figura 10: Resultado do sequenciamento da fita sense do Exon 1 do gene PROP1

dos pacientes 4, 5 e 10. A seta assinala a troca do nucleotídeo A pelo G em

homozigose, levando a substituição de uma asparagina por serina no códon 20

(tabela 4).

Resultados

Tabela 4. Resultados encontrados no sequenciamento

DSO: Displasia septo-óptica, DHHC: deficiência hormonal hipofisária combinada, N:

asparagina, S: serina, A: alanina.

Paciente Quadro Clínico Gene Estudo Molecular

DSO HESX1 N125S

DHHC PROP1 A9A/N20S

Discussão

5. Discussão

Devido a grande variabilidade fenotípica relacionada às

mutações no gene HESX1, estudamos pacientes com DGH isolado,

deficiência hormonal hipofisária combinada e DSO.

A incidência descrita de DSO é 1/10. 000 nascidos vivos, e é

igualmente prevalente no sexo feminino e masculino. Apesar de a condição

ser geralmente esporádica, casos familiares têm sido descritos. Até a

atualidade, Dattani et al., rastrearam mais de 800 pacientes com DSO e

deficiência hormonal hipofisária e identificaram mutações em menos de 1%

dos indivíduos, confirmando a raridade de mutações no HESX1

Atualmente são descritas onze mutações do gene, que

podem levar a fenótipos variados, incluindo defeitos de linha média,

hipoplasia do nervo óptico, neuro-hipófise ectópica e hipoplasia hipofisária

associada a deficiências hormonais

(tabela 5 e figura 4). Indivíduos

homozigotos para mutação recessiva Arg160Cys apresentam displasia

septo-óptica (DSO/síndrome de Morsier) com agenesia do corpo caloso e

deficiência hormonal hipofisária combinada

. Já indivíduos com mutação

heterozigótica dominante exibem fenótipos mais brandos, consistentes com

haploinsuficiência da proteína hesx1

Discussão

Tabela 5. Mutações descritas no gene HESX1

Mutação Fenótipo RNM Referência

Arg160Cys DHHC/HNO MCC/HHA 11

Gln6His DHHC HHA/NHE 21

Ser170Leu DGH/HNO Normal ou HHA

e NHE

Thr181Ala DGH HHA 21

Ile26Thr DHHC HHA/NHE 14

306/307 ins AG DHHC/HNO HHA/NHE 20

1684delG DHHC MCC 15

Alu insertion exon 3 DHHC/coloboma HHA 22

C.449_450delAC

DHHC/Hipoglicemia

e insuficiência

respiratória grave

Aplasia

Hipofisária

C, 357 + 2Tb>C

DHHC/Hipoglicemia

e insuficiência

respiratória grave

Aplasia

Hipofisária

Glu149Lys

DHHC/ Dedos

supranumerários

HHA 13

HHA: Hipoplasia Hipofisária Anterior, NHE: Neurohipófise Ectópica.

HNO: Hipoplasia Nervo Óptico, MCC: Má Formação de Corpo Caloso

DHHC: Deficiência hormonal hipofisária combinada, DGH: déficit de hormônio de

crescimento, DSO: displasia septo óptica.

Discussão

Figura 11. Adaptado Kelberman, D. Mutações descritas no gene HESX1

A freqüência de mutações no gene HESX1 é baixa,

sugerindo que mutações em outros genes, tais como SOX3 e SOX2

associados a fatores ambientais tais como crianças que nascem de mães

muito jovens, contribuem para o surgimento da DSO. Além disso, mutações

em outros fatores transcricionais, como o PROP1

24,

contribuem para o

fenótipo de deficiência hormonal hipofisária combinada familiar enquanto

que mutações no gene GH-1 ou no gene que codifica o receptor GHRH

(GHRHR) são responsáveis pela maioria dos casos de DGH

Até a atualidade, existem 22 mutações descritas no gene

PROP1, identificadas em mais de 170 pacientes, sugerindo que mutações

neste gene sejam as causas mais comuns de deficiência hormonal

hipofisária combinada, contribuindo com aproximadamente 50% dos casos

familiares. A incidência de mutações em casos esporádicos é muito menor

Mutações dominantes

Mutações

Polimorfismos

Q6H

I26T

c.449_450delCA

C.306_307insAG

C.357+2T>C

E149K

Alu insertion

R160C

S170L

T181

g.1684delG

c.183T>C

H61H

c.219C>T

S73S

N125S c.525G>A

A175A

Domínio

engrailed homology

Homeodomínio

paired

Discussão

Em 2005, Dattani et al., realizaram um screening mutacional em uma coorte

de pacientes com deficiência hormonal hipofisária combinada, incluindo 189

casos esporádicos e 44 casos familiares. A prevalência de mutação no gene

PROP1 nos casos esporádicos foi muito baixa (1,1%), quando comparados

aos casos familiares (29,5%)

. No mesmo ano, Kirk et.al., estudaram o

gene PROP1 em 27 crianças de 26 famílias com deficiência hormonal

hipofisária combinada (apenas 3 famílias com mais de 1 membro afetado), e

encontraram apenas um aumento da incidência do polimorfismo A9A, e não

detectaram mutação no gene. Os autores atribuem esse achado às

diferenças étnicas dos grupos estudados, e pela provável presença de efeito

fundador em determinadas regiões com grande número de pacientes

afetados

Nos casos familiares, todos os indivíduos afetados

apresentam herança recessiva, e a maioria das mutações descritas até o

momento ocorre no sitio de ligação do DNA, no homeodominio, que é uma

região altamente conservada nos camundongos e seres humanos,

apresentando em torno de 91% de homologia entre os nucleotídeos. Como

conseqüência dessas mutações, ocorre a perda da função da proteína,

decorrente da incapacidade de ligação ao DNA e ativação da transcrição

gênica. A mutação mais comum no gene PROP1, e que corresponde a 50-

72% de todos os casos familiares, é a deleção de 2 pares de base no exon

2, resultando em uma mutação frameshift no códon 101 e introdução de um

códon de parada na posição 109

Discussão

Em 2005 Reynaud et al. descreveram a primeira mutação no

gene PROP1 downstream ao homeodominio, levando a substituição de um

resíduo de triptofano e introdução de um códon de parada na posição 194 no

domínio de transativação, dando origem a uma proteína mutada

apresentando apenas 34% da atividade quando comparada com a wild-

type

O modo de herança recessivo das mutações no gene se

associa a deficiências hormonais combinadas, de GH, TSH, PRL e

gonadotrofinas, apesar de serem variáveis o grau de severidade e o

momento de aparecimento das deficiências. A maioria dos pacientes

apresenta um quadro precoce de déficit de GH com atraso do crescimento,

entretanto crescimento normal na infância já foi descrito em um paciente que

atingiu estatura normal sem a reposição hormonal

O déficit de TSH também é bastante variável, e em alguns

casos já foi descrito como manifestação inicial, enquanto que em outros,

como uma manifestação tardia

30, 31,32

Indivíduos com mutação no PROP1 apresentam o eixo

ACTH/cortisol preservado na infância, mas geralmente evoluem com

deficiência do cortisol no decorrer da vida, se correlacionando positivamente

com o aumento da idade

32-36

Apesar de o fator Prop1 ser essencial para a diferenciação

dos gonadotrofos na vida fetal, o espectro da deficiência de gonadotrofinas é

Discussão

bastante variável, podendo variar de hipogonadismo com ausência completa

do desenvolvimento puberal até casos com início puberal tardio e incompleto

evoluindo com deficiência hormonal posterior com necessidade de reposição

hormonal

30, 31, 37,38

A morfologia hipofisária nos pacientes com mutação no

PROP1 também é bastante variável, a maioria dos pacientes apresenta

haste hipofisária e lobo posterior com desenvolvimento normal, e o lobo

anterior hipoplásico

Entretanto, já foi descrito em alguns pacientes o

aumento hipofisário detectado por ressonância nuclear magnética, com

posterior regressão e involução desse aumento glandular

32, 35, 38, 39,40

O aumento hipofisário descrito consiste de uma massa que

se interpõe entre o lobo anterior e posterior, originando-se possivelmente do

lobo intermediário

Até a atualidade o mecanismo de involução dessa

massa permanece incerto, existe apenas um caso descrito de biópsia dessa

massa, e a histologia evidenciou a presença de material amorfo sem sinais

de apoptose

41, 42

Conseqüentemente a esta grande variabilidade fenotípica

associada às mutações no gene PROP1, não pode ser identificada

correlação genótipo-fenótipo nos pacientes afetados

Não encontramos mutação no gene PROP1 nos 5 pacientes

com deficiência hormonal hipofisária combinada estudados. Nosso

resultado está de acordo com a literatura, já que a incidência de mutação em

casos esporádicos é muito baixa. Verificamos três pacientes portadores da

Discussão

variante alélica A9A e N20S, já descritos previamente na literatura como

polimorfismos

Nos pacientes com DSO, encontramos um paciente portador

da variante alélica N125S em heterozigose, descrita previamente como

polimorfismo Afro-Caribenho. Brickman et al. analisando o DNA de 461

pacientes encontraram 5 pacientes com quadros variáveis de SOD

portadores dessa variante alélica, todos de descendência Afro-caribenha

Nesse mesmo estudo, analisando o DNA de 42 indivíduos normais de

ascendência Afro-caribenha encontraram 5 indivíduos homozigotos para o

alelo normal, 17 indivíduos homozigotos e 20 heterozigotos para a variante

alélica. Embora seja considerada um polimorfismo, Brickman et al. sugerem

que essa variação pode não ser inteiramente silenciosa, já que a

substituição de uma serina por prolina na posição 18 análoga no

homeodomínio do Prop1 tem sido implicada no fenótipo de camundongos

Ames dwarf

A ausência de mutação nos pacientes com DSO está de

acordo com as outras séries de screening mutacional no gene HESX1,

sugerindo que os fatores ambientais possam contribuir de forma importante

para a patogênese da DSO, e que provavelmente outros genes ainda não

descritos, estejam envolvidos nessa patogênese.

Os polimorfismos podem atuar como marcadores genéticos,

já que são transmitidos associados a outros genes localizados na região

cromossômica próxima a eles (linkage). Desta forma, se um gene próximo a

Discussão

um marcador causa uma doença, todos os indivíduos afetados na família

recebem tanto o marcador como o gene causador da doença. Embora o

determinante genético para uma determinada patologia seja identificado

através de uma mutação com herança mendeliana simples, os

determinantes para a idade de início da doença e a variabilidade clínica

existente entre indivíduos com a mesma mutação ainda são ignorados. Uma

explicação possível seria que fatores ambientais, ou uma segunda mutação

ou polimorfismo estaria interferindo na evolução da doença. Existe uma

hipótese de que a troca de base na molécula do DNA cause a criação de um

splicing alternativo levando a uma proteína alterada, ou então que o

nucleotídeo modificado esteja em desequilíbrio de ligação com uma variante

funcional ainda não conhecida

Conclusões

6. Conclusão

Na análise do gene HESX1 em 11 pacientes portadores de

deficiência de GH, deficiência hormonal hipofisária combinada e DSO,

encontramos em 1 paciente a variante alélica N125S, já descrita

previamente como polimorfismo em pacientes Afro-Caribenhos.

Não verificamos mutação no gene PROP1 nos 5 pacientes

com deficiência hormonal hipofisária combinada estudados. Nosso resultado

está de acordo com a literatura, já que a incidência de mutação em casos

esporádicos é muito baixa. Encontramos três pacientes portadores da

variante alélica A9A e N20S, já descritos previamente na literatura como

polimorfismos.

A teoria de que o nucleotídeo modificado no polimorfismo

esteja em desequilíbrio de ligação com uma variante funcional ainda não

conhecida, favorece a hipótese de que essa alteração possa interferir na

evolução da doença.

* International Committee of Medical Journal Editors. Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical

Journal: sample references. [homepage on the Internt]. Bethesda: U. S. National Library of Medicine; 2003 [last update 2003

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