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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PRÉ-CLINICA DO
LÁTEX E DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS
DE SYNADENIUM UMBELLATUM PAX.
FLAUBERTT SANTANA DE AZEREDO
Goiânia
2008
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FLAUBERTT SANTANA DE AZEREDO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PRÉ-CLINICA DO
LÁTEX E DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS
DE Synadenium umbellatum PAX.
Dissertação apresentada no Curso de Mestrado
do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Goiás, como requisito
final para a obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e
Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
Goiânia
2008
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FLAUBERTT SANTANA DE AZEREDO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PRÉ-CLINICA DO
LÁTEX E DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS E
DE Synadenium umbellatum PAX.
Exame de Defesa apresentado no Curso de Mestrado do Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de Goiás, como requisito final para a obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, aprovada em 12 de março de 2008 pela Banca
Examinadora constituída pelos seguintes professores:
_______________________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha - Presidente
_______________________________________________
Profa. Dra. Fabiane Hiratsuka Veiga de Souza - Titular
_______________________________________________
Prof. Dr. Ruy de Souza Lino Junior - Titular
_______________________________________________
Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara - Suplente
Aos meus pais adoráveis, Sebastião e
Sued, pelos apoio, esforço, incentivo e amor
investidos na minha existência;
Ao meu estimado filho Carlos Henrique,
pela ajuda, companheirismo, compreensão,
paciência e confiança, inclusive nos meus
momentos de ausência devido ao trabalho;
A eles, minha eterna gratidão!
AGRADECIMENTOS
• Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha, pelo incentivo à busca
constante da sabedoria, por toda ajuda, conselho e conhecimento dados a
mim e pela paciência em me atender e me suportar nas intempéries.
• A todos os colegas do NEPET-UFG (Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-
Farmacológicas da UFG), em especial ao bolsista de apoio técnico do CNPq,
MV Marcelo de Souza Vieira, pela preocupação com os animais e pela
colaboração e envolvimento total na realização dos experimentos.
• À aluna de iniciação científica Ana Carolina Vêncio por toda a ajuda técnica
na busca dos animais e na condução dos experimentos.
• A minha aluna voluntária, Sheila Galvão, pela colaboração, dedicação,
conselho e participação nos experimentos e encantamento com os animais.
• Aos colegas de mestrado, Liúba e Paulo César, e a acadêmica Raquel
Goloni, pelo auxilio no experimento, principalmente, durante a eutanásia e
coleta dos órgãos de todos os animais, dispondo gentilmente dos seus
valiosos tempo de descanso.
• A todos os colegas e professores do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da UFG, pela atividades
didáticas, amizade, companheirismo e apoio recebidos que, de alguma forma,
puderam contribuir para a realização deste trabalho.
• Aos colegas e amigos do seio da Faculdade, quer sejam ex-alunos ou
funcionários, bem como aqueles amigos externos e parentes que me
auxiliaram no cuidado diário com os animais e/ou atividades que, direta ou
indiretamente, possibilitaram o desenvolvimento e conclusão deste trabalho.
• Aos meus discentes, sejam da Universidade Federal de Goiás ou da
Faculdade Objetivo, pelo interesse, apoio e aproveitamento das atividades
deste trabalho, bem como pela paciência e compreensão da interferência
deste trabalho na vida didática.
"Quando a gente acha que tem todas as respostas,
vem a vida e muda todas as perguntas".
Luis Fernando Veríssimo
V
RESUMO
O uso de plantas medicinais tem sido muito significativo nos últimos anos, sendo
incentivado pela Organização Mundial de Saúde (OMS). Synadenium umbellatum
Pax, Euphorbiacea (vulgo cola-nota, cancerola, milagrosa) tem o látex usado
empiricamente como anti-tumoral e antiinflamatório. Por existir espécies tóxicas
nesta família e visando à segurança no uso de extratos vegetais, tal estudo avaliou a
toxicidade pré-clinica do látex e do extrato etanólico das folhas (EEF) de S.
umbellatum, por via oral, em ratas Wistar. O estudo seguiu diretrizes da OECD
(Organisation for Economic Cooperation and Development) para teste de toxicidade
aguda (Guideline 423) e de toxicidade subaguda (Guideline 407). Na toxicidade
aguda do látex e do EEF, não se observou, na dose de 2000 mg/kg, alterações
fisiológicas e comportamentais, e nem a morte dos animais. No entanto, o látex
ocasionou congestão e infiltrado leucocitário nos rins, fígado e pulmões, efeitos não
observados com o EEF. Na toxicidade subaguda, doses de 50, 100 e 200 mg/kg de
EEF não produziram alterações dose-dependentes significativas nos parâmetros
laboratoriais e nem alterações fisiológicas, macroscópicas e histopatológicas dos
órgãos. O EEF da S. umbellatum é praticamente atóxico em exposição aguda, já o
látex pode ocasionar alterações histopatológicas no fígado e pulmões. O uso crônico
da planta S. umbellatium merece mais estudos.
UNITERMOS: Synadenium umbellatum, toxicidade aguda, toxicidade subaguda,
toxicidade pré-clínica.
VI
ABSTRACT
Acute and subacute toxicity studies of the latex and of the ethanolic extract of
the leaves of Synadenium umbellatum Pax.
The use of medicinal plants has been being very significant in the last years, being
the use encouraged by WHO. Synadenium umbellatum Pax, Euphorbiacea
(popularly known as cola-note, cancerola, miraculous) has the latex used empirically
as anti-cancerous and anti-inflammatory. For there being toxic species in this family
and aiming at the safety in the use of vegetable extracts, such study evaluated the
pre-clinical toxicity of the latex and of the ethanolic extract of the leaves (EEL) of S.
umbellatum, administrated by oral pathway, in female rats Wistar. The study followed
OECD's Guidelines for test of acute toxicity (Guideline 423) and of subacute toxicity
(Guideline 407). In the acute toxicity of the latex and of EEL, behavioral and
physiological alterations were not observed neither animal’s death in the dose of
2000 mg/kg. However the latex caused congestion and infiltrated of leukocytes in the
kidneys, liver and lungs, effects not observed with EEL. In the subacute toxicity,
doses of 50, 100 and 200 mg/kg EEL's did not produced significant alterations dose-
dependents in the laboratory exams results, and neither physiologic, macroscopic
nor histological alterations of the organs. EEL of S. umbellatum is practically
poisonless in acute exposure; already the latex can cause histological damages. The
chronical use of S. umbellatum need more specific studies.
Keywords: Synadenium umbellatum, acute toxicity, subacute toxicity, pre-clinical
toxicity
VII
SUMÁRIO
RESUMO....................................................................................................................V
ABSTRACT ............................................................................................................... VI
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. IX
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. XI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................……… XIII
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................15
1.1. Contextualização do uso de produtos naturais...............................................15
1.2. Estudos toxicológicos com produtos naturais................................................17
1.3. Caracterização da Synadenium umbellatum ..................................................19
2. OBJETIVOS ........................................................................................................245
2.1. Objetivos gerais ..............................................................................................25
2.2.Objetivos específicos ......................................................................................25
3. MATERIAIS...........................................................................................................27
3.1. Material botânico ............................................................................................27
3.1.1. Coleta, identificação e herborização da planta.........................................27
3.2. Material químico .............................................................................................27
3.2.1. Drogas......................................................................................................27
3.2.2. Reagentes................................................................................................29
3.3. Animais...........................................................................................................29
3.3.1. Descrição dos animais .............................................................................29
3.3.2. Condições de Manutenção.......................................................................29
3.3.3. Dieta.........................................................................................................30
4. MÉTODOS ............................................................................................................33
4.1. Preparo do extrato etanólico das folhas (EEF) e do látex ..............................33
4.2. Métodos toxicológicos.....................................................................................35
4.2.1. Toxicidade aguda (Método de Classes – OECD 423)..............................35
VIII
4.2.1.1. Seleção dos animais..........................................................................35
4.2.1.2. Via e modo de administração ............................................................35
4.2.1.3. Descrição do método.........................................................................37
4.2.1.4. Observação dos sinais de toxicidade ................................................39
4.2.1.5. Duração do período de observação. .................................................40
4.2.2. Toxicidade subaguda (30 dias) - dose fixa...............................................41
4.2.2.1. Seleção dos animais..........................................................................41
4.2.2.2. Via e modo de administração ............................................................43
4.2.2.3. Duração e observação dos sinais de toxicidade................................44
4.2.2.4. Duração do período de observação e eutanásia ...............................45
4.2.2.5. Exames laboratoriais ........................................................................45
4.2.2.6. Procedimento para o exame histopatológico.....................................46
4.3. Análise estatística...........................................................................................47
5. RESULTADOS......................................................................................................50
5.1. Resultados fitoquímicos..................................................................................50
5.1.1.Preparação do extrato etanólico ...............................................................50
5.2. Resultados toxicológicos ................................................................................50
5.2.1. Toxicidade aguda (Método de Classes)...................................................50
5.2.2. Toxicidade subaguda ...............................................................................54
5.2.2.1. Evolução ponderal e massa relativa dos órgãos ...............................54
5.2.2.2. Parâmetros alimentares e fisiológicos ..............................................56
5.2.2.3 Observações comportamentais e clinicas ..........................................57
5.2.2.4. Alterações macroscópicas e histopatológicas ...................................57
5.2.2.5 Análise laboratorial .............................................................................64
6. DISCUSSÃO .........................................................................................................71
7. CONCLUSÕES .....................................................................................................80
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................82
9. ANEXOS ...............................................................................................................91
ANEXO I - Parecer do Comitê de Ética .................................................................92
ANEXO II - Ficha para toxicidade aguda ...............................................................94
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Synadenium grantii Hook.f., sinonímia heterótipo de Synadenium
umbellatum Pax (INPI 356712-1). Coleção “Ilustração original e
pranchas publicadas” da Curtis's Botanical Magazine (Disponível
em http://www.aluka.org, em 12 /12/ 2007......................................... 21
Figura 2...
Fotografias da Synadenium umbellatum Pax. (cola-nota) na Chácara
Vila Mariana, em Senador Canedo, GO. Foto tirada pelo Prof. Dr.
Luiz Carlos da Cunha, em novembro de 2005................................... 28
Figura 3 Visão geral do suporte com gaiolas semi-metabólicas suspensas
(25X15x17 cm), de aço inoxidável e fundo de grade, com coletores
de urina, comedouros e bebedouros individualizados, usadas para
estudo de toxicidade subaguda da Synadenium umbellatum, na
sala de manutenção do NEPET-UFG.…………………….................. 31
Figura 4 Etapas do preparo do extrato etanólico das folhas de S.
umbellatum. (A) Secagem a 40 ºC. (B) Folhas secas após 7 dias.
(C) Moagem em moinho de facas. (D) Pó das folhas trituradas.
(E,F,G) Extração por maceração a frio com etanol, repetida 3x:
diluição, agitação e filtração. (H) Evaporação do solvente para
obtenção do extrato etanólico concentrado........…………................ 34
Figura 5 Administração da S. umbellatum, p.o, por gavagem, na toxicidade
aguda e na toxicidade subaguda, cujo volume não excedeu 1
mL/100 g do animal. Observa-se o uso de cânula apropriada, feita
com a devida paramentação.............................................................. 36
Figura 6 Fluxograma do teste de toxicidade aguda, pelo método de classes,
iniciando com dose de 2000 mg/kg (Adaptado do Guia 423 –
OECD, 2001) ..................................................................................... 38
Figura 7 Gaiolas semi-metabólicas utilizadas no estudo de toxicidade
subaguda, devidamente identificadas. Visão frontal......................... 42
Figura 8 Animal individualizado na gaiola semi-metabólica, vista de cima.
Observa a possibilidade de monitorização dos parâmentros
alimentares (consumo de ração e de água) e fisiológicos (produção
de fezes e de urina) ........................................................................... 42
X
Figura 9 Prancha com dados histopatológicos da toxicidade aguda, dose
única, p.o., de 2000 mg/kg do látex e do extrato etanólico das
folhas (EEF) de Synadenium umbellatum, p.o., na dose de 2000
mg/kg.............................................................. 53
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Peso corpóreo final (g), pesos absoluto (g) e relativo (%) do fígado
e baço de ratas tratadas com dose única, p.o., de 2000 mg/kg do
extrato etanólico das folhas (EEF) e do látex do S. umbellatum.
Dados expressos em média ± desvio padrão ................................... 51
Tabela 2: Resultados obtidos no teste de toxicidade aguda, p.o., de
Synadenium umbellatum. (EEF= extrato etanólico das folhas) ......... 52
Tabela 3 Evolução ponderal e pesos absoluto e relativo dos órgãos (fígado e
baço) das ratas tratadas com extrato etanólico das folhas (EEF) do
S. umbellatum na toxicidade subaguda. Dados expressos em
Média ± DP. (n = número de animais) ............................................... 55
Tabela 4 Parâmetros alimentares e fisiológicos diários de ratas tratadas com
extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., na toxicidade
subaguda (Média ± DP; n = número de ratas) .............................. 57
Tabela 5 Resultados histopatológico do fígado, em porcentagem (%), de
ratas tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum,
p.o., por 30 dias. .............................................................................. 60
Tabela 6: Resultados histopatológicos dos rins, em porcentagem (%), de ratas
tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o.,
por 30 dias ...................................................................................... 61
Tabela 7: Resultados histopatológicos dos pulmões, em porcentagem (%), de
ratas tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum,
p.o., por 30 dias ................................................................................. 62
Tabela 8: Resultados histopatológicos de outros orgãos, em porcentagem (%),
de ratas tratadas com extrato etanólico das folhas de S.
umbellatum, p.o., por 30 dias. ......................................................... 63
Tabela 9: Valores bioquímicos das ratas tratadas com extrato etanólico de S.
umbellatum, via oral, na toxicidade subaguda por 30 dias (Média ±
DP) .................................................................................................... 65
Tabela 10: Hemograma e índices hematológicos de ratas tratadas com extrato
etanólico de S. umbellatum, via oral, na toxicidade subaguda
(Média ± DP) ..................................................................................... 67
XII
Tabela 11: Contagem total e diferencial de leucócitos e de plaquetas de ratas
tratadas com extrato etanólico de S. umbellatum, p.o, na toxicidade
subaguda (Média ± DP) .................................................................... 68
Tabela 12: Parâmetros bioquímicos da urina (Média ± DP) em ratas
submetidas a toxicidade subaguda por 30 dias, p.o., do extrato
etanólico da S. umbellatum
........................................................................................ 69
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância
ANVISA Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
cm centímetro (s)
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DL50 dose letal 50
DP desvio-padrão
Dr. doutor
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EEF Extrato etanólico das folhas de Synadenium umbellatum
FF-UFG Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás
fL fentolitro
g grama(s)
g/100g peso relativo (massa por 100 gramas de massa corpórea)
G1 grupo tratado com dose de 50 mg/kg de EEF de S. umbellatum.
G2 grupo tratado com dose de 100 mg/kg de EEF de S. umbellatum
G3 grupo tratado com dose de 200 mg/kg de EEF de S. umbellatum.
GC grupo controle, tratado com solução salina mais Tween 80.
GS grupo satélite
GHS Globally Harmonised System (Sistema Global Harmonizado)
h hora(s)
i.p. via intraperitoneal
kg quilograma(s)
L litro(s)
m metro (s)
mg miligrama(s)
mg/kg relação massa por peso do animal
mg/mL relação massa por volume da solução
XIV
min minuto(s)
mL mililitro(s)
mL/100 g relação volume por peso do animal
mm milímetro
MS Ministério da Saúde
n número de animais da amostra
NaCl cloreto de sódio
OECD Organization for Economic Co-operation and Development
p nível de significância (intervalo de confiança)
p.o. via oral
PGs prostaglandinas
pH potencial hidrogeniônico
RDC Resolução de Diretoria Colegiada
S. umbellatum Synadenium umbellatum
SNA sistema nervoso autônomo
SNC sistema nervoso central
UFG Universidade Federal de Goiás
val. validade
VCM volume corpuscular médio
HCM hemoglobina corpuscular média
MCHC concentração de hemoglobina corpuscular média
RDW distribuição da largura dos eritrócitos
µg micrometro (s)
NEPET-UFG Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-farmacológicas da UFG
ºC grau centígrados
ºGL graduação alcoólica (grau Gay Lussac)
< menor (que)
< menor ou igual a
> maior (que)
Introdução
IntroduçãoIntrodução
Introdução
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONTEXTUALIZAÇÃO DO USO DE PRODUTOS NATURAIS
A utilização de espécies vegetais pelo homem para os mais diversos
propósitos parece ser uma atividade atávica da espécie. Em todas as fases de
desenvolvimento das diversas civilizações sempre prevaleceu uma estreita relação
entre o homem e as plantas. Por meio de tentativa e erro, o homem primitivo teve de
adquirir conhecimentos (biológicos), que foram usados para determinar quais
plantas eram valiosas como alimentos, medicamentos e quais deveriam ser evitadas
por serem venenosas. Com o passar do tempo, o poder curativo de certas plantas,
mesmo naquelas atividades que foram descobertas por acaso, tornou-se muito
importante para ser esquecido; o homem então começou a sistematizar os seus
usos (DAVID & DAVID, 2002).
O uso da fitoterapia ficou restrito à abordagem leiga durante a primeira
metade do século XX, devido ao desenvolvimento de fármacos sintéticos que se
mostraram mais eficazes no combate às doenças da época, bem como pela falta de
pesquisas com plantas medicinais. Então, nas últimas décadas do século XX,
ocorreram fatos importantes que produziram mudanças fundamentais na atitude da
população e dos cientistas em relação à fitoterapia tais como: os leigos descobriram
a utilidade dos medicamentos de origem vegetal (ou ervas medicinais como
costumam chamá-los); a insatisfação com a eficácia e o custo da medicina moderna,
aliada à admiração pelas coisas “naturais” e “orgânicas”, levou milhões de pessoas
em todo o mundo a apreciarem melhor o uso dos fitoterápicos clássicos para o
tratamento de muitas doenças; a revolução “verde”, em termos de medicina natural,
atingiu incrível popularidade nos Estados Unidos (ROBBERS et al., 1997).
Diante da grande importância dos medicamentos fitoterápicos, vários
países da Europa estão intensificando esforços para unificar a legislação referente
aos medicamentos fitoterápicos, amplamente comercializados nestes países (em
especial na Alemanha e França) (WHO, 1993).
Por outro lado, nos Estados Unidos, as preparações à base de plantas
são classificadas como suplementos nutricionais, não sendo necessário submeter
dados de segurança e eficácia ao Food and Drug Administration (FDA) para a
comercialização destes produtos (TUROLLA & NASCIMENTO, 2006).
16
Apesar da falta de compreensão e de incentivo por parte da Food and
Drug Administration (FDA) - impondo severas restrições ao registro dos fitoterápicos
como medicamento - não há dúvida de que a demanda dos consumidores fará
crescer cada vez mais o interesse pelas plantas medicinais. As principais indústrias
farmacêuticas reconheceram que certas plantas que o povo sempre considerou
“remédio”, provavelmente eram as melhores fontes de componentes para novos
medicamentos ou talvez pudessem servi-lhes de protótipo (ROBBERS et al., 1997).
Mesmo com a preferência das grandes indústrias farmacêuticas pelo
desenvolvimento de medicamentos pela via sintética, nas últimas décadas observa-
se ainda um grande interesse do mercado pelo potencial terapêutico das plantas
medicinais (CALIXTO et al., 2000; KOEHN & CARTER, 2005). Tal fato é
comprovado pela evidência de que hoje cerca de 25% das drogas prescritas no
mundo são obtidas direta ou indiretamente de plantas. Além disso, cerca de 49%
das drogas desenvolvidas entre 1981 a 2002 foram obtidas a partir de produtos
naturais, ou análogos semi-sintéticos ou ainda compostos sintéticos baseados em
produtos naturais (KOEHN & CARTER, 2005).
Como exemplos relevantes de medicamentos obtidos de plantas, podemos
mencionar a morfina (Papaver somniferum), a digoxina (Digitalis sp.), o taxol (Taxus
brevifolia), o quinino (casca da Cinchona sp.), a vincristina e a vinblastina
(Catharanthus roseus), dentre outros (RATES, 2001). Assim, na terapêutica
moderna, as plantas medicinais fornecem o substrato para a produção de
compostos biologicamente ativos ou compostos passíveis de modificações e
otimizações estruturais que dão origem às entidades químicas. Considerando-se os
diversos metabólitos secundários presentes nas plantas, as principais categorias de
medicamentos derivados de plantas são os terpenóides, glicosídeos, alcalóides,
flavonóides e outros tipos (LAPA et al., 2001).
Neste contexto, o Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o primeiro
lugar dentre os 17 países mais ricos do mundo em biodiversidade, detendo cerca de
23% do total de espécies existentes no planeta (RATES, 2001). A imensa variedade
de espécies de plantas, animais e microrganismos existentes no ecossistema
brasileiro apresenta, sem dúvida, um importante diferencial para o desenvolvimento
de medicamentos (KATO, 2001).
17
Várias empresas nacionais vêm empregando matéria-prima vegetal
diretamente na elaboração de seus medicamentos. Os fitoterápicos têm sido, no
caso do Brasil e de muitos países, o suporte da indústria farmacêutica genuinamente
nacional de pequeno e médio porte. No Brasil, o crescimento do mercado de
medicamentos fitoterápicos é da ordem de 15% ao ano, enquanto o crescimento
anual do mercado de medicamentos sintéticos gira em torno de 3 a 4%. Contudo em
nível nacional, apenas 20% da população é responsável por 63% dos medicamentos
sintéticos disponíveis, sendo que o restante encontra nos produtos de origem
natural, especialmente as plantas medicinais, a principal ou a única fonte de
recursos terapêuticos. Aproximadamente 60 milhões de pessoas não têm acesso à
maior parte dos medicamentos no país, apesar de se gastar cerca de 8 bilhões de
dólares em medicamentos por ano (SIMÕES et al., 2003).
No Brasil, a legislação para medicamentos fitoterápicos vem sofrendo
modificações nos últimos anos. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
vem elaborando normas para a regulamentação destes medicamentos, desde a
Portaria nº 123, de 1994, que estabelece normas para o registro de produtos
fitoterápicos, passando pela Portaria n. 6, de 1995, que estabeleceu prazos para que
as indústrias farmacêuticas apresentassem dados de eficácia e segurança dos
medicamentos fitoterápicos, passando pela RDC n. 17 de 2000, e a Resolução RDC
n. 48 de 16 de março de 2004, atualmente em vigor, que dispõe sobre o registro de
medicamentos (BRASIL, 2004a)
1.2. ESTUDOS TOXICOLÓGICOS COM PRODUTOS NATURAIS
As plantas medicinais são freqüentemente utilizadas com o intuito de
substituir ou auxiliar as terapias convencionais no tratamento de várias doenças.
Entre outros fatores, a preferência na utilização das plantas medicinais decorre da
facilidade de obtenção e do baixo custo. Porém, sabe-se que as plantas medicinais
apresentam ampla diversidade de metabólitos secundários com diferentes atividades
biológicas (FARNSWORTH et al., 1985; SIMÕES et al., 2003), justificando a
necessidade de um aprofundamento no conhecimento das propriedades
farmacológicas e toxicológicas das espécies vegetais e sua utilização na formulação
de medicamentos.
18
Ainda que os medicamentos derivados de plantas tenham uma boa aceitação
pela população e estejam presentes no mercado farmacêutico, apenas uma
pequena parcela das plantas medicinais possui dados científicos que comprovem
sua eficácia e seu espectro toxicológico, assim como garantia de qualidade do
produto. (TUROLLA & NASCIMENTO, 2006)
A fitoterapia, como alternativa, é utilizada tanto dentro de um contexto cultural,
na medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos. Entretanto, o uso popular, e
mesmo o tradicional, não são suficientes para validar eticamente as plantas
medicinais como medicamentos eficazes e seguros (MONTES, 2003). Nesse
sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico
sintético e sua preconização, ou autorização oficial do seu uso medicamentoso,
deve ser fundamentada em evidências experimentais comprobatórias de que os
riscos a que se expõe aqueles que as utilizam é suplantado pelos benefícios que
possam advir. Do ponto de vista toxicológico, deve-se considerar que uma planta
medicinal ou um fitoterápico não tem somente efeitos imediatos e facilmente
correlacionados com a sua ingestão, mas lembrar, principalmente, os efeitos que se
instalam a longo prazo e de forma assintomática, como os carcinogênicos,
hepatotóxicos e nefrotóxicos (SIMÕES et al., 2003).
Os estudos toxicológicos têm a finalidade de avaliar a idéia errônea de que
produtos fitoterápicos, por serem naturais, são isentos de efeitos tóxicos ou
adversos, e que o uso popular de plantas medicinais serve como validação da
eficácia destes medicamentos (LAPA, 1999; SHARAPIN, 1996).
Além disto, sabe-se que muitas plantas medicinais apresentam substâncias
que podem desencadear reações adversas, seja por seus próprios componentes,
seja pela presença de contaminantes ou adulterantes presentes nas preparações
fitoterápicas, exigindo um rigoroso controle de qualidade desde o cultivo, coleta da
planta, extração de seus constituintes, até a elaboração do medicamento final
(TUROLLA & NASCIMENTO, 2006).
Faz-se então necessário o estudo detalhado dos produtos naturais, a fim de
que se descubram seus potenciais efeitos colaterais e principais indicações. Desse
modo, oferecer-se-á, à população, opções adicionais e acessíveis no combate às
várias moléstias. Além disso, as ervas medicinais constituem grande esperança para
o tratamento de enfermidades de causa desconhecida, muitas vezes ainda sem
19
tratamento. Estima-se que existam no planeta cerca de 250.000 espécies botânicas.
Destas, apenas um inexpressivo percentual foi investigado quanto à sua
farmacologia e toxicologia (CUNHA, 2003).
1.3. CARACTERIZAÇÃO DA SYNADENIUM UMBELLATUM
A espécie botânica Synadenium umbellatum Pax. (nome em alusão as
glândulas do ciátio concrescidas), é um arbusto lactescente e ornamental que atinge
de 2 a 5 metros, de origem africana e pertence à ordem Geraniales e à família
Euphorbiaceae (JOLY, 1977).
A família Euphorbiaceae compreende cerca de 290 gêneros e
aproximadamente 7500 espécies e tem como maiores centros de dispersão, os
trópicos dos continentes africano e americano. São plantas de hábito variado,
existindo ervas, subarbustos, árvores e também trepadeiras, com folhas alternadas
inteiras ou partidas, em geral com estípulas, latescentes ou não. Flores sempre de
sexo separado: flores masculinas, em geral monoclamídeas, de simetria radial com
tépalas em número de 5-6; flores femininas mono ou diclamídeas, em geral
pentâmeras, ovário sempre súpero, caracteristicamente tricarpelar e trilocular (cada
lóculo contendo 1 ou 2 óvulos). O látex, quando presente, pode ser incolor ou leitoso
com grãos de amido, em forma femurosa, muito característico (JOLY, 1977).
O gênero Synadenium Boss (1862), pertencente à família Euphorbiaceae,
possui mais de 20 espécies (e subespécies), sendo a Synadenium umbellatum uma
delas. Esta espécie, uma dicotiledônea suculenta, é considerada sinonímia
heterótipo da Synadenium grantii Hook.f e homótipo da Euphorpia pseudograntii Pax
(EGGLI, 2002). Distribui-se pela África tropical e tem como habitat solos rochosos,
ladeiras rochosas de escarpas e desfiladeiros ou bosque ou florestas abertas,
decíduas e mescladas, presentes numa atitude de 950-2100 m (LEBRUN & STORK,
2006).
Synadenium umbellatum é uma potencial planta medicinial, catalogada por
Ferdinand Pax, em 1894, cuja enxicata está depositada no Royal Botanic Gardens
(Kew). Seu Index Internacional de Nomes de Plantas (INPI) é 356712-1, estando
citada, portanto, na lista global do Catálogo da Lista Global de Plantas Selecionadas,
do Royal Botanic Garden, Kew. Cada lista de família compilada neste catálogo visa
20
fornecer o nome científico correto e incluir todos os conhecimentos publicados e
espécies aceitas e taxa infra-especifica com seus sinônimos. As listas incluem a
distribuição global além da forma de narrativa e dos códigos botânicos dos paises,
ambos tal como definidos pelos bancos de dados pertinentes e outros comentários
como também formas de vida são incluídas (GOVAERTS, 2007) (Figura 1).
Synadenium umbellatum possue a seguinte descrição taxonômica: arbustos
com 2–3 m ou árvores pequenas com até 5 m de altura, com galhos e talos
cilíndricos e carnosos, ramificados da base, contendo látex lácteo copioso. As
estípulas consistem em glândulas marrons escuras distintas pequenas. As folhas
são alternadas e carnosas simples com 11–18 × 5–8 cm, de formato obovado por
amplamente obovado, obtuso para brevemente apiculado no ápice ou afilado para
uma base subséssil, pubescente ou afinalada nas superfícies superiores das folhas
maduras saindo pelo menos no mais baixo terço e ao longo das margens.
Inflorescência composta de ciátio séssil em ramos axilares de 2-6 folhas, com
pedúnculo pubescente de 2,5–4 cm longo, dicotomizados 1 a 2 vezes no cimo,
normalmente pseudo-umbelada no ápice da ramificação. O cume dos galhos tem 1–
2 cm longos, pubescentes. Brácteas formando par persistente, de tamanho 4 × 4
mm, subquadrada, dentada, finamente peluda. Ciátio com margem glandular inteira
e 5 lóbulos digitiformes, sendo o ciátio de dimensão 3.5 × 6 mm, em forma de funil
envolto, pubescente na metade inferior, a espessura da margem glandular é de 0.5
mm, enrugada, amarela e os lóbulos com 2 × 2 mm, arredondados, denticulados.
Flores em 5 grupos, bracteoladas, com 2 mm de comprimento, plumosa. Estames
com 3 mm de comprimento. Flor com talo curto, prolongando no fruto. Ovário
pubescente de 3 lóculos; Estilos em 3, com 1,75 mm de comprimento, unidos em um
terço da altura e com ápices bífidas. Cápsula com 6.5 × 6 mm, profunda e
inteiramente lobada, finamente pubescente; Pedicelo com 2 mm de comprimento.
Fruto com 3 lóbulos, deiscente, na forma de cápsula. Sementes com 2.8 × 2.2 mm,
ovoide, densamente e minuciosamente verrucosa (com carúncula), séssis,
freqüentemente rudimentares, amarelada (CARTER & LEACH, 2001).
21
Figura 1 - Synadenium grantii Hook.f., sinonímia heterótipo de Synadenium
umbellatum Pax (INPI 356712-1). Coleção “Ilustração original e pranchas
publicadas” da Curtis's Botanical Magazine (http://www.aluka.org, em 12/12/07).
22
Várias espécies de Synadenium são conhecidas, mundialmente, pelo seu uso
como antiinflamatório, anti-cancerígeno e analgésico. Jager et al. (1996) demonstrou
que algumas espécies do gênero Synadenium são potentes inibidores da síntese de
PGs, como por exemplo, a espécie Synadenium cupulare, o que justifica o uso
destas plantas como anti-inflamatório. No centro-oeste, o látex do Synadenium
umbellatum tem sido utilizado popularmente para o tratamento de várias
enfermidades, tais como, alergia, câncer, doença de Chagas, diabetes, gripe,
hemorragias internas, impotência sexual, lepra, obesidade, úlcera nervosa, cólicas
menstruais e dores no corpo (ORTÊNCIO, 1997; HOEHNE, 1946).
A S. umbellatum (popularmente chamado de “cola-nota”, “avelós”,
“milagrosa”, “cancerola”, “leitosa-do-amazonas”) contém látex de cor leitosa com pH
± 5,0, obtido das folhas ou do caule. O látex é empiricamente utilizado na forma de
solução aquosa, como segue: “Colocar 18 gotas do látex em 1 (um) litro de água e
guardar na geladeira. Tomar pela manhã, à tarde e à noite um cálice de licor ou uma
xicarazinha de café. Ou substituir a água pela solução bebendo várias vezes ao dia.
Usar sempre para cura e prevenção” (ORTÊNCIO, 1997).
Revisando a literatura, foram encontrados estudos a cerca da composição do
látex (UZABAKILIHO et al., 1987; MRINALINI et al., 2002) e das atividades
antiinflamatórias de espécies do gênero Synadenium (JÄGER et al., 1996) e da
família Euphorbiaceae, como Emblica officinalis, Mallotus spodocarpus e Phyllantus
sp. (KUPCHAN et al., 1976; SCHRODER et al., 1980; HUBERT et al., 1982; ABO et
al., 1988; XIA, et al., 1997 INTAHPHUAK et al., 2004; PERIANAYAGAM et al.,
2004).
Há, inclusive, relatos de toxicidade dérmica da Synadenium grantii Hoof,
sinonímia da S. umbellatum, cujo látex contem ésteres diterpenos (BAGAVATHI et
al., 1988). Devido a planta ser de uso ornamental, ela pode ocasionar intoxicação
em crianças (SPOERKE et al., 1985). No entanto, estudos acerca das propriedades
toxicológicas sistêmicas do Synadenium umbellatum Pax não foram encontrados.
Além do mais, dentro da família Euphorbiaceae há muitas plantas com
elevada toxicidade. Em levantamento do Centro de Informação Toxicológica de
Goiás (CIT-GO), citado por Cunha (2003), constatou-se que, dentre as 18 espécies
botânicas relatadas como responsáveis por ocorrências de intoxicações por plantas
tóxicas no Estado, cinco delas (28%) pertenciam à família Euphorbiaceae, sendo
23
elas: Euphorbia milii (coroa de cristo, cristo gigante), Euphorbia tirucalli (graveto do
cão, figueira do diabo, dedo do diabo), Jatropha curcas (pinhão de purga, pinhão
paraguaio, pinhão bravo, purgão de cavalo), Ricinus communis (carrapateira, rícino,
mamoeira, palma de cristo, carrapato) e Manihot utilíssima (mandioca amarga,
mandioca branca, mandioca anaçunipeba).
Sabe-se, também, que as euforbiáceas podem produzir albuminóides e
tóxicos, sendo a ricina o mais conhecido (QUER, 1962). A ricina é uma proteína
classificada dentro de um grupo especial de proteínas denominadas RIPs (do inglês
Ribosome-Inactivating-Proteins), ou proteínas inativadoras de ribossomos. As
proteínas desse grupo são capazes de entrar nas células e se ligar a ribossomos,
paralisando a síntese de proteínas e causando morte da célula (LORD et al., 1994).
Assim, motivos etnofarmacológicos (como conhecimento acerca do uso
popular do Synadenium umbellatum), evidências de toxicidade de plantas
pertencentes ao mesmo gênero e família e a falta de pesquisa para determinar as
propriedades toxicológicas desta espécie, tornam-se evidente e necessário à
realização de estudos toxicológicos pré-clínicos a fim de estabelecer os níveis de
segurança para uso desta promissora espécie botânica.
Objetivos
ObjetivosObjetivos
Objetivos
25
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GERAIS
Averiguar informações toxicológicas (dose e efeitos) para estabelecer níveis
de segurança quanto ao uso da Synadenium umbellatum pela população,
propiciando, assim, dados para a avaliação de risco da mesma.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar a avaliação da toxicidade pré-clínica da Synadenium umbellatum
Pax, por meio dos testes de:
• Toxicidade aguda, pelo método de classes, de dose única do látex e do
extrato etanólico das folhas de Synadenium umbellatum;
• Toxicidade subaguda, por 30 dias, do extrato etanólico das folhas de
Synadenium umbellatum..
Materiais
MateriaisMateriais
Materiais
27
3. MATERIAIS
3.1. MATERIAL BOTÂNICO
3.1.1. Coleta, identificação e herborização da planta
As folhas e látex de Synadenium umbellatum Pax foram coletadas na
Chácara Vila Mariana, Senador Canedo-GO, Brasil (781 m de altitude, 16º 40’ 15,5”
sul e 49º 14’ 13,6” oeste), no verão de 2005/2006 (Figura 2).
O material botânico foi identificado morfologicamente pelo professor Dr. José
Realino de Paula (Prof. Adjunto de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Goiás (UFG). Uma exsicata, para comprovação da
identidade botânica, foi depositada no Herbário da UFG, sob o número UFG-27160.
A identificação morfológica baseou-se na taxonomia (família, gênero e
espécie e respectivos nomes populares), na morfologia floral e na anatomia
fitoquimica da planta. Foram verificados, também, presença de caracteres
secundários que favorecem o reconhecimento da espécie tais como: habito da
planta, tamanho e forma da planta, cor, estrutura e aspecto das folhas, frutos e
sementes e presença de látex (MARCHIORI, 1995; MONTES, 2003)
3.2. MATERIAL QUÍMICO
3.2.1. Drogas
Para todos os ensaios, foi preparada, imediatamente antes dos experimentos,
uma solução salina de extrato etanólico de S. umbellatum cujo volume variou
conforme tipo de estudo e peso corpóreo dos animais.
Para auxiliar na solubilização utilizou-se tween-80, cuja quantidade não
ultrapassou 5% do volume final da solução preparada.
A solução de látex, usada apenas na toxicidade aguda, foi preparada na dose
de 2000 mg/kg usando apenas salina (NaCl 0,9%) para solubilizá-la.
As drogas utilizadas durante a anestesia, foram o cloridrato de cetamina 10%,
do laboratório Syntec (Cetamin
®
, val. abr./08, partida 001/06), e a xilazina 20%, do
laboratório Calier (Dopaser®, val. abr./08, partida 008/05).
28
Figura 2 - Fotografias da Synadenium umbellatum Pax. (cola-nota) na Chácara Vila
Mariana, em Senador Canedo, GO. Foto tirada pelo Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
em novembro de 2005.
29
3.2.2. Reagentes
Cloreto de sódio, etanol, eosina, formaldeído 37%, fostato de sódio dibásico,
fostato de sódio monobásico, tween 80, hematoxilina, xilol e parafina.
3.3. ANIMAIS
3.3.1. Descrição dos animais
Foram utilizados ratos fêmeas albinas Wistar (Rattus norvergicus), com peso
de 150 a 260 g, não-isogênicos, nulíparas, provenientes de colônias em perfeitas
condições de saúde, cedidas, gratuitamente, pelo biotério da UniCEUB (Centro
Universitário de Brasilia). Foram utilizados, no total, 52 (cinqüenta e dois) animais,
sendo 12 (doze) para o teste de toxicidade aguda e 40 (quarenta) para o teste de
toxicidade subaguda.
3.3.2. Condições de manutenção
A sala de manutenção, localizada no Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-
Farmacológicas da Faculdade de Farmácia da UFG (NEPET-UFG) foi provida de um
sistema de barreiras (divisórias e portas e janelas vedadas), de modo a garantir
condições sanitárias adequadas para os estudos toxicológicos e isolamento dos
animais.
Os animais foram aclimatados, pelo período mínimo de cinco dias, em
ambiente com temperatura de 22 ± 3
o
C e umidade relativa do ar de 30–70%, tendo
o controle natural do ciclo claro/escuro (12 h claro e 12 h escuro), adaptado de
BRITO, 1994. A aclimatação foi importante para a adaptação e averiguação do
comportamento, dos hábitos alimentares e fisiológicos e das condições sanitárias
dos animais em estudo.
Os animais foram acondicionados, confortavelmente, em tipos de gaiolas
diferentes conforme o teste a ser realizado. Para o estudo da toxicidade aguda, as
ratas foram acondicionadas em gaiolas de polipropileno (42 x 34 x 17 cm) em
número de três por gaiola. Nas gaiolas, utilizou-se maravalha de pinho-branco (ou
30
equivalente) para acomodar os animais, tendo o cuidado com a inocuidade, usando-
a seca e retirando todo o pó por meio de peneiração.
No estudo de toxicidade subaguda, as ratas foram mantidos, isoladamente,
em gaiolas semi-metabólicas suspensas (25 X 15 x 17 cm), de aço inoxidável e
fundo de grade, nas quais foi possível monitorar, individualmente, os parâmetros
fisiológicos dos animais (Figura 3).
A higienização das gaiolas era feita após o término do registro dos
parâmetros fisiológicos, a cada dois ou três dias, por meio de lavagem com água
corrente, detergente neutro e hipoclorito de sódio e troca da maravalha (no caso do
ensaio de toxicidade aguda).
O manuseio dos animais foi feito utilizando-se vestimenta composta de luvas,
avental e máscara. Todos os experimentos foram desenvolvidos seguindo normas
que envolvem cuidados com animais de laboratório (COBEA, 2003).
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e
Animal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás
(CEPMHA/HC/UFG), cujo protocolo é 162/06, de 30/11/2006, atendendo resolução
do Conselho Nacional de Saúde (BRASIL, 1988) e do Ministério da Saúde (BRASIL,
2004) (Anexo I).
3.3.3. Dieta
A alimentação ocorreu com ração comercial Purina Labina®, sendo esta de
boa qualidade e adequada às necessidades nutritivas dos ratos, cujos nutrientes
estavam de acordo com a quantidade preconizada pela literatura (NAS, 1978a;
KNAPKA, 1997). A ração continha laudo de controle de qualidade, com a devida
garantia do fabricante, inclusive da isenção ou observação dos níveis tolerados de
contaminantes recomendados pela National Academy of Science (NAS, 1978b) e
pelo National Center for Toxicological Research (USA, 1979).
A água utilizada, obtida da central de abastecimento da Empresa de
Saneamento de Goiás S.A, era devidamente tratada por autoclavagem. Devido
haver a possibilidade de interferir nos ensaios, não foi realizada a acidificação da
água até pH 3,0, usando uma parte de HCl para cada três partes de água, na
finalidade de evitar o crescimento de algas e bactérias. (ANDRADE et al, 2002).
31
As ratas tiveram acesso a um consumo de água ad libitum. No caso da ração,
houve interrupção do fornecimento apenas no período necessário para a
adminstração da amostra (jejum de administração), variável para cada tipo de ensaio
(Ver período em cada teste adiante). Fora este jejum de administração, o acesso a
ração é garantido ad libitum.
Figura 3 – Visão geral do suporte com gaiolas semi-metabólicas suspensas (25
x 15 x 17 cm), de aço inoxidável e fundo de grade, com coletores de urina,
comedouros e bebedouros individualizados, usadas para estudo de toxicidade
subaguda da Synadenium umbellatum, na sala de manutenção do NEPET-UFG.
4. Métodos
4. Métodos4. Métodos
4. Métodos
33
4. MÉTODOS
4.1. PREPARO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FOLHAS (EEF) E DO LÁTEX
As folhas foram dessecadas a 40°C em estufa com circulação de ar, por uma
semana (Figura 4A, 4B). Após a secagem, as folhas foram trituradas em um moinho
de facas, do tipo WILLYE (Figura 4C, 4D).
O extrato etanólico bruto foi obtido por maceração a frio segundo metodologia
adaptada de Ferri (1996), da seguinte maneira:
A amostra seca e triturada foi extraída por maceração álcool etílico 96 °GL em
volume correspondente a cinco vezes o peso da amostra (Figura 4E), e deixados
sob agitação mecânica por um período de 5 horas (Figura 4F). Após o fim deste
período procedeu-se a filtragem (Figura 4G). Logo após, reservou-se o resíduo da
filtragem e o filtrado foi concentrado em evaporador rotatório MARCONI modelo MA-
120, a pressão reduzida (Figura 4H).
Este primeiro extrato concentrado (1ºEC) obtido foi deixado em um balão de
fundo redondo e o etanol recuperado do evaporador rotatório foi adicionado ao
resíduo da primeira filtragem. Completou-se o volume para cinco partes do resíduo
com etanol 96 ºGL (Fig. 4E), e deixou-se mais 5 horas sob agitação (Fig. 4F). Filtrou-
se (Fig. 4G). O filtrado foi adicionado ao balão que continha o 1ºEC e o resíduo foi
novamente reservado. Concentrou-se os filtrados em evaporador rotatório (Fig. 4H)
Obteve-se, assim, o segundo extrato concentrado (2ºEC) que foi deixado no
mesmo balão de fundo redondo. O etanol recuperado do evaporador rotatório foi
adicionado ao resíduo da segunda filtragem. Completou-se o volume para cinco
partes do resíduo com etanol 96 ºGL (Fig. 4E), deixando-se, pela última vez, sob
agitação por 5 horas (Fig. 4F). Fez-se a terceira e última filtragem (Fig. 4G). O
filtrado foi adicionado ao balão que continha o extrato concentrado (1º e 2º EC) e
procedeu-se à concentração do filtrado em evaporador rotatório (Fig. 4H).
O processo de extração só foi repetido por mais duas vezes, num total de três
extrações, a fim de se garantir o esgotamento das substâncias extraíveis pelo álcool
etílico 96 ºGL, sempre misturando e concentrando os filtrados em cada etapa.
O etanol recuperado e o resíduo desta filtragem foram descartados. O extrato
etanólico bruto concentrado obtido como descrito anteriormente foi devidamente
armazenados e identificados para posterior uso em cada ensaio.
34
A B
C D
E F
G H
Figura 4. Etapas do preparo do extrato etanólico das folhas de S. umbellatum. (A)
Secagem a 40 ºC. (B) Folhas secas após 7 dias. (C) Moagem em moinho de facas.
(D) Pó das folhas trituradas. (E,F,G) Extração por maceração a frio com etanol
repetidas 3x: diluição, agitação e filtração. (H) Evaporação do solvente para
obtenção do extrato etanólico concentrado.
35
Para todos os ensaios, imediatamente antes da administração, o extrato
etanólico seco concentrado foi solubilizado com solução salina para o preparo das
doses utilizadas. A massa utilizada do extrato etanólico concentrado variava
conforme tipo de estudo e peso corpóreo dos animais. As doses foram de 2000
mg/kg (para a toxicidade aguda) e de 50, 100 e 200 mg/kg (para a toxicidade
subaguda).
Em todas as administrações, a solubilização foi realizada, de modo a alcançar
um volume final máximo de 1mL/100 g de peso do animal.
Para auxiliar na solubilização do extrato, foi utilizado Tween 80® em
quantidade inferior a 5% do volume final da solução do extrato.
O látex foi coletado do caule e das folhas da planta em um tubo de ensaio,
pesado e solubilizado com solução salina no estado in natura.
4.2. MÉTODOS TOXICOLÓGICOS
4.2.1. Toxicidade aguda (Método de Classes – OECD 423)
4.2.1.1. Seleção dos animais:
Os grupos experimentais de ratas foram compostos ao acaso, com animais
de diferentes ninhadas, não-isogênicos, com o cuidado de que a variação de peso
entre eles não excedesse a 20% do peso médio. As ratas foram agrupadas em 3
(três) animais por gaiolas de polipropileno, forradas com maravalha de pinho-branco.
Para administrar o extrato, no estudo de toxicidade oral, os animais ficaram
privados de ração por 8 horas. O alimento foi restituído 3 a 4 h após a administração
da droga. O consumo de água foi ad libitum.
4.2.1.2. Via e modo de administração
Por ser a via preconizada para uso humano, o extrato etanólico e o látex
foram administrados por via oral na rata, por gavagem, através de cânula
apropriada. O volume administrado não excedeu a 1 mL/100 g de peso corporal e,
para manter o volume constante, ajustaram-se as concentrações da solução de
acordo com a dose e peso do animal (Figura 5). Para tal, antes da administração da
droga, o animal foi pesado para fazer o ajuste do volume a ser administrado.
36
Figura 5 – Administração da S. umbellatum, p.o, por gavagem na toxicidade aguda
e na toxicidade subaguda, cujo volume não excedeu 1 mL/100 g do animal.
Observa-se o uso de cânula apropriada, feita com a devida paramentação.
37
4.2.1.3. Descrição do método
Para a avaliação da toxicidade aguda do látex e do EEF da S. umbellatum foi
utilizada a metodologia descrita nas diretrizes da Organisation for Economic
Cooperation and Development (OECD, 2001b), observando itens presentes no Guia
da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), publicado pela Resolução RE
90/04 (BRASIL, 2004b). O procedimento procurou atender as exigências da RDC 48,
de 16 de março de 2004 da ANVISA/MS, que dispõe sobre o registro de
medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2004a).
A base da técnica consistiu em se administrar em grupos de três animais,
doses seqüenciais de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg. A seqüência das doses só é
obedecida caso se observar a morte de mais de 1 animal com a dose escolhida.. A
administração da dose de 5000 mg/kg só é recomendada quando extremamente
necessário. Isto possibilita a estimativa de uma faixa de DL50 conforme os padrões
da Globally Harmonised System (GHS), propiciando a classificação por classe
toxicológica da substância administrada de acordo com o GHS. Uma das três ações
é requerida: parar no teste que atribui à classificação do risco apropriado; testar uma
dose fixa maior ou uma dose fixa menor. Dependendo da mortalidade ou do estado
moribundo dos animais, outras doses intermediárias podem ser necessárias para
que se admita um critério da toxicidade aguda na sustância–teste (OECD, 2001b).
A dose inicial selecionada foi aquela mais propensa a produzir mortalidade
com base em relatos de dose com toxicidade evidente, quando possível, ou através
de relatos evidenciados com base na estrutura química (OECD, 2001b). Conforme
experiências e resultados já obtidos com outras plantas no NEPET–UFG, e
considerando a baixa concentração de princípios ativos em plantas decidiu-se por
iniciar o teste de toxicidade aguda pelo método de classes com a dose de 2000
mg/kg, da seguinte forma (Figura 6):
Fez-se a administração a três ratas da dose de 2000 mg/kg,
preferencialmente pela manhã. A ocorrência da morte de 0-1 animal induz a
repetição da mesma dose administrada em outros três animais. Obtendo a morte de
até um animal a amostra não é considerada tóxica ou entra na Classe 5, cuja faixa
de DL50 varia até 5000 mg/kg sendo maior que 2000 mg/kg (DL50 > 2000 mg/Kg).
No entanto, caso ocorra a morte de 2 ou 3 animais, isto implicaria na administração
de uma dose seqüencial inferior, correspondente a 300 mg/kg.
38
Figura 6 – Fluxograma do teste de toxicidade aguda, pelo método de classes, iniciando com dose de 2000 mg/kg (Adaptado do
Guia 423 - OECD, 2001b)
- Teste c/ inicio na
dose 2000 mg/kg
peso corporal. Quando no teste desta dose
nenhum dos animais tratados morrerem e não mostrarem sinais clínicos deve-se
assumir a DL > 2000mg/kg de peso corporal (Classe 5 ou indeterminada).
morte
morte
Inicio
5 mg/kg
3 animais
2000 mg/Kg
3 animais
300 mg/Kg
3 animais
50 mg/Kg
3 animais
2
-
3
0
-
1
2
-
3
0
-
1
2
-
3
0
-
1
2
-
3
0
-
1
5 mg/Kg
3 animais
50 mg/Kg
3 animais
300 mg/Kg
3 animais
2000 mg/kg
3 animais
2
-
3
0
-
1
0
-
1
0
-
1
0
-
1
2
-
3
2
-
3
2
-
3
>3 em
300
<3 em 300
<3 em 2000
<3 em 2000
1 ou 2 em 2000
0 em 2000
5 25 50
200 300
500
2000 X
2500 5000
Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4 Classe 5 X
> 0 – 5 > 5 – 50 > 50 – 300 > 300 – 2000 > 2000 - 5000
* 0,1,2,3: número de animais moribundos ou mortos por dose
* GHS: Sistema de classificação harmonizado globalmente
* X: não classificado
Cut-off
DL50
(
mg/kg)
39
A sobrevivência de todos os animais ou mesmo a morte de apenas um deles
ao administrar a dose de 300 mg/kg, inclusive na repetição da dose, levaria a
classificação da substância na Classe 4, cuja faixa de DL50 está entre 300 mg/kg e
2000 mg/kg (300 mg/kg <DL50 ≤ 2000 mg/kg). A morte de pelo menos 2 (dois)
animais requeriria a administração de uma terceira dose no valor de 50 mg/kg.
Administrando 50 mg/kg e ocorrendo a morte de, no máximo, um animal,
mesmo após a repetição da dose, provocaria a classificação da substância na
Classe 3, cuja DL50 é maior que 50 mg/kg e no máximo 300 mg/kg (50 mg/kg <
DL50 ≤ 300 mg/kg). Caso dois ou mais animais viesse a morrer nesta dose,
administrar-se-ia a quarta e última dose de 5 mg/kg .
Se ao administrar a dose de 5 mg/kg, e obtiver a morte de um ou nenhum
animal, ficaria determinado uma DL50 maior de 5 mg/kg e máximo de 50 mg/kg (5
mg/kg < DL50 ≤ 50 mg/kg), classificando a substância na Classe 2. A morte de 2
ou 3 animais levaria a classificá-la na classe 1, sendo que a DL50 equivale a no
máximo 5 mg/kg (DL50 ≤ 5 mg/kg), o que a caracterizaria como altamente tóxica.
O tempo de intervalo entre o tratamento com a substância teste de cada
grupo por dose é determinado pelo início, duração e gravidade dos sinais tóxicos. O
tratamento de animais com a próxima dose é esperado até que a confirmação da
sobrevivência do animal que recebera a outra dose (OECD, 2001b).
Assim, as ratas foram observadas por um período mínimo de 24 h e, mantidas
sob observação por, no mínimo de 14 dias, levando em consideração a necessidade
de remover por segurança, para estudo ou sacrifício ético, algum animal moribundo
ou que esteja apresentando sofrimento durante o estudo (COBEA, 2003).
4.2.1.4. Observação dos sinais de toxicidade
Foram realizadas observações comportamentais sistemáticas para avaliar o
screening hipocrático, o qual fornece uma estimativa geral da toxicidade da
substância sobre: I) o estado de consciência e disposição geral, (II) atividade e
coordenação do sistema motor, (III) reflexos, (IV) atividades sobre o sistema nervoso
central (SNC) e (V) sobre o sistema nervoso autônomo (SNA) (MALONE &
ROBICHAUD, 1983). Os parâmetros avaliados foram: atividade geral, frêmito vocal,
irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição trem
posterior, endireitamento postural, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia, reflexo
40
auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia,
lacrimação, ptose, micção, defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose,
hiperemia, morte. As alterações encontradas na observação comportamental e
exame clínico sistemático dos animais foram registrados em lista impressa contendo
a relação de sinais ou parâmetros a serem investigados e o devido tempo
preconizado, lista adaptada do modelo proposto por Malone (1977). A avaliação de
todos os parâmetros do screening hipocrático foi feita nos intervalos regulares de 15
min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h e 8 h após a administração e, a partir de então,
diariamente, até o décimo quarto dia (Anexo IIb).
O momento (latência) e modo da morte, se ocorrer e os sinais de toxicidade, e
seu momento do aparecimento, a intensidade, a duração e a progressão dos
mesmos foram registrados e tabulados numa escala que dependerá se o evento
normal estiver ausente ou presente no início do estudo. Se o evento estiver ausente,
o evento é considerado normal e recebe escala 0 (zero). Assim, os valores da escala
variar-se-ão de 0 a 4 correspondendo, respectivamente, a: ausente, raro, pouco,
moderado, intenso. Se o evento estiver presente, o valor normal será 4 (quatro) e a
escala variará de de 0 a 8 sendo, respectivamente, ausente, raro, pouco, diminuído,
presente (normal), aumentado, moderado, elevado, intenso. (Anexo IIc)
Após o décimo-quarto dia, os animais foram sacrificados e os seus órgãos
foram avaliados macroscopicamente para detecção de alguma alteração anatômica.
Fígado e baço foram extirpados e pesados para determinar suas massas
relativas. A massa relativa é determinada pela proporção entre o peso do órgão e o
peso corpóreo do animal correspondendo à porcentagem que a massa do órgão
representa na massa total do animal. É expressa como peso do órgão por 100 g do
peso corpóreo ou em porcentagem.
As integridades teciduais do fígado, rins e pulmões foram observadas e
avaliadas a intensidade de ocorrência (discreta - < 25%, moderada e acentuada) de
lesões celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e apoptose),
infiltração de leucócitos, congestão, extravasamento de sangue e fibrose..
4.2.1.5. Duração do período de observação.
O período total de observação foi de 14 dias a partir da administração da
droga. No décimo quarto dia, os animais foram anestesiados com solução de
41
xilazina e cetamina, sacrificados por deslocamento cervical e necropsiados. Caso os
sinais de toxicidade fossem aparentes nesta época (tais como perda de peso e
inibição do crescimento), o período de observação poderia ser estendido, desde que
isto não implicasse em prolongar desnecessariamente o sofrimento do animal. Se
acontecesse algo que deixasse o animal moribundo antes do término da
observação, o animal deveria ser sacrificado e registrado todos os dados (causa e
período) para contabilização no estudo.
A escolha e preparo da solução anestésica de xilazina–cetamina seguiu
protocolo para anestesia de ratos do Cornell’s Institutional Animal Care and Use
Committee (IACUC) e Cornell Center for Animal Resources and Education (CARE).
Para o preparo da solução anestésica, agitou-se bem num frasco estéril de 10 mL,
3,75 mL de cetamina (100 mg/mL), 0,5 mL de xilazina (100 mg/mL) e 5,75 mL da
água estéril. Administrou-se uma injeção intraperitoneal com 0,2 mL/100g de peso
do animal e se necessário, após trinta minutos, repetia-se de um terço a metade da
dose inicial (FLECKNELL, 1996; KOHN, 1997).
Todos os animais passaram por eutanásia realizada por um profissional
capacitado, de acordo com “Os Princípios Éticos de Experimentação Animal”,
proposta pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA, 2003).
4.2.2. TOXICIDADE SUBAGUDA (30 DIAS) - DOSE FIXA.
4.2.2.1. Seleção dos animais
Os grupos experimentais de ratos fêmeas foram compostos ao acaso, com
animais de diferentes ninhadas, não-isogênicos, com o cuidado de que a variação
de peso entre as ratas do mesmo grupo não excedesse a 20% do peso médio. Tal
cuidado foi observado também com o peso médio entre os grupos.
As ratas jovens, num total de 40 animais (agrupados em 5 grupos de 8
animais), foram mantidas, isoladamente, em gaiolas semi-metabólicas suspensas
(25 X 15 x 17 cm), de aço inoxidável e fundo de grade, devidamente identificadas
(Figura 7).
Tais gaiolas permitem monitorar parâmetros alimentares como o consumo de
água e ração, e parâmetros fisiológicos como a variação de peso e a produção de
fezes e de urina de cada animal do grupo. Estes parâmetros alimentares e
42
fisiológicos foram comparados com o grupo controle, visando averiguar alterações
significativas de toxicidade (Figura 8).
Figura 7 – Gaiolas semi-metabólicas utilizadas no estudo de toxicidade subaguda,
devidamente identificadas. Visão frontal
Figura 8 – Animal na gaiola semi-metabólica, vista de cima. Observa a possibilidade
de monitorização dos parâmetros alimentares (consumo de ração e de água) e
fisiológicos (produção de fezes e urina).
43
Os grupos foram formados por aquelas ratas que receberam três doses
diferentes (grupo 1 ou G1 - 50 mg/kg; grupo 2 ou G2 – 100 mg/kg; grupo 3 ou G3 –
200 mg/kg), e também por um grupo controle (grupo 4 ou GC) e um grupo satélite
(grupo 5 ou GS), descritos com melhores detalhes mais adiante.
Os animais foram familiarizados com as gaiolas semi-metabólicas por 10
(dez) dias, antes do início do experimento (período de aclimatação). Previamente à
administração da substância-teste ou do veículo, durante três dias, todos os animais
foram observados e examinados clinicamente.
4.2.2.2. Via e modo de administração
Os grupos receberam, por um período de 30 dias, diariamente, no período
matutino, doses de 50, 100 e 200 mg/kg do extrato etanólico das folhas do S.
umbellatum. A escolha da dose máxima levou em consideração a dose diária
utilizada empiricamente pela população (em torno de 10 vezes a dose estimada para
humanos, conforme uso empírico) assim como a DL50 determinada na toxicidade
aguda (10% da DL50). As outras doses foram espaçadas proporcionalmente para
que possam determinar efeitos tóxicos dose-dependentes.
A mesma rotina foi realizada com os animais do grupo controle e do grupo
satélite. Só que grupo controle recebeu por trinta dias solução salina e tween 80®.
Já o grupo satélite recebeu a mesma dose do grupo 3, ou seja, a maior dose de 200
mg/kg do EEF. A diferença é que os animais do grupo satélite permanecem vivos
após o término do período de administração por mais 30 dias, sem receber a
substância-teste. A função do grupo satélite é observar se as alterações tóxicas
dimimuem, aumentam ou permanecem estáveis após a suspensão da substância-
teste.
A finalidade deste estudo é obter informações a respeito da toxicidade da
substância quando administrado repetidamente ao indivíduo para efeito
farmacológico. A duração de exposição (30 dias) foi definida em função do que se
pretende em termos de uso clínico da substância de estudo, de acordo com as
diretrizes de estudo da Toxicidade Oral de Doses Repetidas de substâncias
químicas (OECD; 2006; BRASIL,2004b; BRITO, 1994).
Não foi realizado o teste com o látex, que é a substância utilizada pela
população, devido à composição fitoquímica do látex ser semelhante a das folhas e
44
pela falta de estabilidade do látex que “coagula” rapidamente, o que atrapalharia a
administração diária por trinta dias.
Como é preconizado administrar pela mesma via usada pelo ser humano, as
doses do EEF do S. umbellatum (e a solução de salina mais Tween 80® do grupo
controle) foram administrados nos animais pela via oral, por gavagem, através de
cânula apropriada (Figura 5). O volume administrado não excedeu a 1 mL/100 g de
peso corporal e, para manter o volume constante, ajustou-se as concentrações da
solução de acordo com o nível de dose e peso do animal, que era pesado três vezes
na semana, para evitar estresse adicional ao animal.
Vale frisar que, para melhor administração do extrato e evitar a regurgitação
da droga, os animais ficaram privados de alimento por 2 (duas) horas antes da
administração. O alimento era restituído logo após a administração da droga por via
oral. Os animais sempre tinham acesso à água ad libitum. O acesso a ração só era
interrompido durante este período de jejum de administração.
4.2.2.3. Duração e observação dos sinais de toxicidade.
Após o início da administração do extrato, todos os animais eram observados
diariamente, registrando seus dados fisiológicos (evolução ponderal, consumo de
água e de ração, produção de fezes e de urina) e alterações comportamentais e
clínicas anormais durante todo o estudo.
Ao final do experimento, após 30 dias, sob o efeito da anestesia com solução
de xilazina-cetamina, os animais tiveram o sangue colhido por punção cardíaca para
realizar os exames bioquímicos e hematológicos. Logo após, o médico veterinário
fez a eutanásia por deslocamento cervical e a necropsia para avaliação à vista
desarmada sempre observando “Os Princípios Éticos de Experimentação Animal”
(COBEA, 2003). Assim sendo, mesmo os animais estando acima de 200 g, a
eutanásia foi realizada por deslocamento cervical porque além do animal estar
anestesiado, o sangue do animal foi praticamente todo colhido na punção cardíaca,
o que praticamente já garante a sua morte. Deste modo, o deslocamento cervical
assegurou a morte rápida do animal antes da necropsia.
O preparo e uso da solução anestésica já fora descrito anteriormente (vide
item 4.2.1.5 - Duração e observação dos sinais de toxicidade aguda).
45
Os animais do grupo satélite permaneceram vivos por mais 30 dias após o
término do período da administração, sendo observados semanalmente. Findo este
prazo, os animais do grupo satélite sofreram o mesmo procedimento para a
eutanásia e necropsia. sendo anteriormente já citados.
Todos estes procedimentos foram sempre acompanhados pelo pesquisador
que realizou as observações clínicas para registro das alterações macroscópicas.
Fez-se também a extirpação de fragmentos de órgãos para o estudo
histopatológico com fixação em formalina tamponada dos seguintes órgãos: fígado,
pulmões, coração, rins, baço, intestino, esôfago, estômago e cérebro. Qualquer
massa de tecido ou tumoração anormal que o animal apresentasse também era
coletada. Antes da fixação, procedeu-se a pesagem inicial do fígado e do baço para
determinar suas massas relativas (peso do órgão por 100 g do peso corpóreo).
Tecidos de todos os animais permanecerão guardados em blocos de parafina
ou em lâminas, feita por profissional habilitado, por pelo menos cinco anos à partir
do término dos experimentos.
4.2.2.4. Duração do período de observação e eutanásia
No trigésimo dia, os animais sobreviventes de todos os grupos, exceto o do
grupo satélite, foram anestesiados, submetidos à punção cardíaca - para coleta de
sangue, sacrificados por deslocamento cervical e, depois, necropsiados, avaliados à
vista desarmada e extirpados fragmentos de órgãos para o estudo histopatológico.
Os animais do grupo satélite foram observados por mais 30 dias sem
adminstração da substância-teste, sendo sacrificados após 60 dias do início do
estudo.
4.2.2.5.Exames laboratoriais:
A análise laboratorial consistiu de exame hematológico completo,
determinação do perfil bioquímico e uranálise.
Para a execução dos dois primeiros exames, foram coletados de cada animal,
amostras de sangue até a exaustão, por punção cardíaca, de aproximadamente 5
mL de sangue usando para tal uma seringa de 10 mL. Parte do sangue foi
transferida para um tubo contendo 2 gotas de anticoagulante universal, o ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), a fim de serem realizados os exames
46
hematológicos; outra parte foi transferida para um tubo seco, para as análises
bioquímicas. Para a contagem diferencial de leucócitos e verificação das plaquetas
foi feito um esfregaço sangüíneo, antes da adição de EDTA.
O exame hematológico constou-se de: contagem total de hemácias,
contagem total e diferencial de leucócitos, contagem total de plaquetas,
concentração de hemoglobina (HB), hematócrito (HT), sendo calculados os
seguintes índices hematológicos: VCM (volume corpuscular médio), HCM
(hemoglobina corpuscular média), MCHC (concentração de hemoglobina
corpuscular média) e RDW (amplitude de distribuição dos eritrócitos).
O exame bioquímico de sangue consistiu na análise de alanina-
aminotransferase (ALT ou TGP), aspartato-amininotransferase (AST ou TGP),
fosfatase alcalina, gama-glutamiltransferase (gama GT), creatinina, uréia, proteínas
totais, colesterol total, triglicérides, albumina, glicemia.
Na uranálise observou-se pesquisa de: cor, densidade, pH, nitrito, proteínas
totais, glicose, corpos cetônicos, urobilinogênio, bilirrubina, células epiteliais,
piócitos, hemáceas e presença de cristais.
Os exames bioquímicos e hematológicos do sangue foram realizados em
equipamento automatizado (Autolab®). Já o exame bioquímico de urina (uranálise)
foi realizado através do uso de tiras reagentes. Todos os exames realizados por
laboratório de análises clínicas acreditado por sistema de qualidade.
4.2.2.6. Procedimento para o exame histopatológico.
Ao final do experimento, foram colhidas amostras de fígado, pulmão, coração,
rim, baço, intestino, estômago, esôfago e cérebro dos animais.
As amostras teciduais colhidas foram fixadas, por no mínimo 24 horas, em
solução de formaldeído tamponado, na proporção de 20 vezes o volume do fixador
em relação ao volume das peças. Para preparo de 1 L da solução dissolveu 4,0 g de
fosfato de sódio monobásico e 6,5 g de fosfato de sódio dibásico (anidro) a 10% em
900 mL de água destilada e acrescentou 100 mL de formaldeido 37%. Após as 24 h
de imersão, trocou-se a solução de formol até a etapa seguinte.
Após a fixação, os fragmentos foram lavados em água corrente por cinco
minutos, iniciando-se assim o processo de desidratação em álcool etílico, em série
crescente desde 70% até álcool absoluto. Posteriormente procedeu-se a clarificação
47
com xilol e a infiltração em parafina histológica com ponto de fusão a 56 ºC, por 24
horas e, então, a inclusão nela (JUNQUEIRA et al., 1983).
Na etapa seguinte, as amostras colhidas foram seccionadas com uma
espessura de três a cinco µm, em micrótomo rotativo (American Optical, modelo
Spencer 820 – EUA), utilizando-se de navalhas descartáveis (Leica Instruments,
modelo 818 – EUA). Então, os cortes obtidos foram corados pela técnica de
hematoxilina e eosina de acordo com técnica preconizada por Luna (1968) e
modificada por Junqueira et al. (1983).
O processamento e análise histopatológicos foram realizados com o auxílio
da Profa. Ms. Ângela A. S. Sena, da Faculdade de Ciências Biológicas da
Universidade de Rio Verde.
A leitura foi realizada em microscópio de luz de campo claro (Carl Zeiss,
modelo Jenaval – Alemanha Oriental) localizado no NEPET-UFG.
A principal finalidade da análise histopatológica era avaliar a integridade
tecidual dos seguintes órgãos extipados: pulmões, coração, rins, intestino, esôfago,
estômago, cérebro. Dentre os principais parâmetros investigados estão lesões
celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e apoptose), infiltração
de leucócitos, congestão, extravasamento de sangue e fibrose.
4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados numéricos, expressos através de média ± desvio-padrão
(Média + DP), foram organizados e resumidos na forma de gráficos, tabelas e
quadros. Todas as variáveis sob estudo foram testadas para a hipótese de
normalidade.
As diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas
pela análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida, quando detectada diferença
significativa entre os grupos pelo teste de comparação múltipla de Tukey, por meio
de software validado (GraphPad Prism4®). Para tal, considerando-se a princípio, a
hipótese nula de que todas as amostras seriam iguais, utilizou-se o Intervalo de
Confiança (IC) de 95%, com nível de significância estatística (p) menor que 5% (p <
0,05) para rejeitar a hipótese (CENTENO, 1990; SACHS, 1984).
48
Os resultados das observações clínica, bioquímica, hematológica, uranálise e
histopatológica, relativos à toxicidade aguda e subaguda, foram analisados e
apresentados conforme descrito anteriormente.
5. Resultados
5. Resultados5. Resultados
5. Resultados
50
5. RESULTADOS
5.1. RESULTADOS FITOQUÍMICOS
5.1.1. Preparação do extrato etanólico
Foram coletados 17 kg de folhas de S. umbellatum. Após secagem, o peso
das folhas foi de 1,3 kg, o que gerou 90 g de extrato, cuja coloração era verde
intenso. Isso corresponde a um rendimento de 6,9%.
5.2. RESULTADOS TOXICOLÓGICOS
5.2.1. TOXICIDADE AGUDA (MÉTODO DE CLASSES)
A dose de 2000 mg/kg, tanto do látex quanto do extrato etanólico das folhas
(EEF) de Synadenium umbellatum não ocasionou a morte das ratas Wistar durante o
estudo de toxicidade aguda pelo método de classes. Sinais de toxicidade (como
perda de peso e inibição do crescimento) e alterações comportamentais e clínicas
anormais graves não foram observados nem com o látex e nem com o EEF da S.
umbellatum.
O peso corpóreo médio inicial das ratas tratadas com látex (259 g ± 6,9) foi
maior que as ratas tratadas com EEF (171,3 g ± 4,0), apresentando variação do
peso superior a 20%. No entanto, a variação de peso (desvio padrão) das ratas do
mesmo grupo permaneceu bem inferior a 20% (Tabela 1).
Já as massas relativas (porcentagem do peso do órgão em relação ao peso
corpóreo) do fígado e do baço não apresentaram diferença estatística significativa
entre as ratas tratadas com o látex e com o extrato etanólico das folhas (EEF) do S.
umbellatum. Conforme podemos notar na Tabela 1, o peso relativo médio do fígado
dos animais tratados com EEF foi de 3,8% (± 0,29), enquanto que o peso dos
animais tratados com látex foi de 4,4% (± 0,02), uma diferença de seis décimos
percentuais. Já em relação ao peso relativo do baço, esta diferença é desprezivel
(0,2 % para o EEF e para o látex). Ao fazer uma comparação entre do peso do baço
em relação ao do fígado, nota-se uma diferença a mais de 1,5% para o látex (EEF
5,3% ± 0,38 e látex 6,8 ± 0,41).
51
Tabela 1: Peso corpóreo final (g), pesos absoluto (g) e relativo (%) do fígado e baço
de ratas tratadas com dose única, p.o., de 2000 mg/kg do extrato etanólico das
folhas (EEF) e do látex do S. umbellatum. Dados expressos em média ± DP.
Peso inicial Fígado Baço
Baço/fígado
Grupos
Corpóreo
(g)
P. absoluto
(g)
P. relativo
(g/ 100g)
P. absoluto
(g)
P. relativo
(g/100g)
(%)
EEF
(n=6)
171,3 + 4,0 6,491 +
0,653
3,78 ± 0,29
0,364 +
0,024
0,21 +
0,01
5,63% ± 0,38
Látex
(n=5)
259 + 6,9
11,417 ±
0,350
4,41 ± 0,02
0,773 +
0,070
0,30 +
0,02
6,76% ± 0,41
Sem significância estatística (p < 0,05) entre os grupos EEF e Látex.
Pelo screening hipocrático, 80% (ou quatro de cinco) das ratas tratadas com
látex e 33% (ou dois de seis) das tratadas com EEF da S. umbellatum mostraram-se
com moderada letargia (atividade geral com escore 2) durante a primeira hora
analisada (nos tempos de 30 min e de 1 h). O estado de consciência e disposição
geral normalizou-se duas horas após a administração (escore 4) permanecendo
assim até o 14º dia. Os outros parâmetros relacionados com o estado de
consciência (frênito vocal e irritabilidade) mantiveram-se sempre normais (escore 4).
Os itens relacionados com a atividade e coordenação do sistema motor e tônus
muscular – como resposta ao toque e ao aperto da cauda, endireitamento postural,
força para agarrar e tônus do corpo – e os relacionados com os reflexos – auricular e
corneal – apresentaram-se também normais (escore 4) durante todo o período de
tempo avaliado (Anexo IIb).
Os parâmetros relacionados com atividades sobre o SNC (tremores,
convulsões, straub ou influência na movimentação espontânea, hipnose, anestesia)
e sobre o SNA (lacrimação, respiração, cianose, ptose, salivação, micção,
defecação, piloereção, hipotermia), também não se alteraram nos tempos avaliados,
estando sempre normais (escore zero quando ausentes e escore 4 quando
presentes), conforme ficha do Anexo IIb e IIc.
Como sinais de toxicidade não foram aparentes durante os 14 dias, não
precisou ser prolongado o período de observação. Como a planta não ocasionou a
morte de animais, transcorridos 14 dias após a administração, fez-se a eutanásia e
52
necropsia de todos os animais e, macroscopicamente, não foram observadas
alterações anatômicas anormais nos órgãos.
A análise histopatológica qualitativa dos órgãos detectou congestão e
infiltrado leucocitário no fígado, nos rins e nos pulmões dos animais tratados com
látex (2000 mg/kg), enquanto, os órgãos dos animais que receberam o EEF não
apresentaram alterações (Figura 9).
O resumo dos resultados obtidos no teste de toxicidade aguda por via oral, na
dose única de 2000 mg/kg do látex e do extrato etanólico das folhas de S.
umbellatum estão listados na tabela 2.
Tabela 2: Resultados do teste de toxicidade aguda, p.o., de Synadenium
umbellatum. (EEF: extrato etanólico das folhas)
Paramêtros EEF 2000 mg/kg Látex 2000 mg/kg
Letalidade
AUSENTE AUSENTE
Screening hipocrático
33% (2 de 6)
letargia leve (nível 2) na 1ª h
60% (4 de 5)
letargia leve (nível 2) na 1ª h
Alterações clínica e
comportamental anormais
AUSENTE AUSENTE
Alteração macroscópica
AUSENTE AUSENTE
Alteração peso relativo de
orgãos (fígado e baço)
AUSENTE AUSENTE
Alteração histopatológica
AUSENTE
Congestão e infiltração
leucocitária no fígado, nos
rins e nos pulmões.
53
Figura 9 - Análise histopatológica da toxicidade aguda, dose única, p.o., de 2000
mg/kg, do látex e do extrato etanólico das folhas (EEF) de Synadenium umbellatum.
(Coloração: hematoxilina-eosina. Aumento: A: 100x; B: 40x; C: 40x; D: 40x; E: 40x;
F: 40x).
(A) Fígado de animal testado com látex, mostrando leucócitos (seta) e congestão
sinusoidal (c).
(B) Fígado de animal testado com EEF mostrado integridade tecidual.
(C) Rins do grupo testado com látex mostrando hemorragia (h).
(D) Rins do grupo testado com EEF sem nenhuma alteração histológica.
(E) Pulmão das ratas com látex apresentando intensa congestão (c com detalhe a
esquerda).
(F) Pulmão das ratas submetidas ao EEF mantiveram a integridade dos alvéolos.
54
5.2.2. TOXICIDADE SUBAGUDA
5.2.2.1. Evolução ponderal e massa relativa dos órgãos
Para a avaliação da toxicidade subaguda com doses repetidas por 30 dias,
utilizou-se apenas o extrato etanólico das folhas de S. umbellatum em três dosagens
diferentes. No decorrer do experimento, houve perda de dois animais por erro de
administração: um animal do grupo 2 (100 mg/kg) e outro do grupo 3 (200 mg/kg),
ficando com 7 animais cada um para cálculo das médias. Os outros (G1 – 50 mg/kg,
G4 – controle, e G5 – satélite) permaneceram com 8 animais.
Os dados sobre a evolução ponderal e os pesos relativos do fígado e do baço
dos animais tratados com EEF estão listados na Tabela 3. Observou-se que os
animais de todos os grupos tratados tiveram uma evolução ponderal média entre 20
% a 31 %, mas sem diferenças significativas em comparação ao grupo controle.
Notou-se, também, que houve um equilíbrio de peso corpóreo final entre os animais
do mesmo grupo, visto que na maioria dos grupos ocorreu um decréscimo no
desvio-padrão da média do peso corpóreo inicial e final, excetuando apenas os
animais do G1, que receberam a dose de 50 mg/kg. Este grupo teve um aumento
não significativo no seu desvio-padrão entre os pesos de 6,6 (passando de 10,3 para
16,9). O grupo G3 (que recebeu a dose de 200mg/kg) foi o que apresentou uma
melhor equiparação entre os pesos corpóreos finais apresentando um desvio-padrão
final de 8,5 (declive de 9,4).
O grupo que ganhou mais peso durante os trinta dias de tratamento foi o G3
(200 mg/kg), cuja evolução ponderal foi de 31 % ± 14. A menor evolução ponderal foi
a do G1, na dose de 50 mg/kg, que foi de 20 % ± 5. Notou-se de que a evolução
ponderal do grupo satélite (GS) foi bem inferior (em torno de 7 vezes menor) nos
trinta dias após o término da administração (3 % ± 2) do que durante os trinta dias da
administração do EEF (24 % ± 20). Outro fato observado, é que o grupo satélite (GS)
tinha a maior média de peso no início do tratamento (180,8 g ± 27,3) e, após os trinta
dias de administração do EEF, teve a penúltima média de ganho de peso (24 % ±
20). Já o G3, que recebeu a mesma dose de 200 mg/kg do GS, tinha o menor peso
médio inicial (165,7 ± 17,9) e foi o que mais ganhou peso durante o tratamento (31
% ± 14). No entanto, tais dados não têm diferença estatisticamente significativa com
o grupo controle, nem entre os grupos tratados
55
Tabela 3: Evolução ponderal e pesos absoluto e relativo dos órgãos (fígado e baço) das ratas tratadas com extrato etanólico das
folhas (EEF) do S. Umbellatum, p.o., na toxicidade subaguda. Dados expressos em Média ± DP. (n = número de animais)
Peso corpóreo Peso do fígado Peso do baço
inicial (g) final (g)
Ganho
ponderal
(%)
absoluto
(g)
relativo
(g/100g)
absoluto
(g)
relativo
(g/100g)
Peso baço
/ fígado
(%)
Controle (n=8)
176,5 ± 16,3 218,3 ± 13,9 24 ± 8 9,64 ± 0,98 3,9 ± 1,6 0,55 ± 0,07 0,3 ± 0,03 5,8 ± 1,0
50 mg/kg (n=8)
175,4 ± 10,3 211,4 ± 16,9 20 ± 5 9,02 ± 2,22 4,3 ± 0,6 0,51 ± 0,07 0,2 ± 0,02 5,7 ± 0,9
100mg/kg (n=7)
172,1 ± 12,4 213,7 ± 11,7 24 ± 7 8,92 ± 0,60 4,2 ± 0,3 0,52 ± 0,04 0,2 ± 0,02 5,8 ± 0,6
200mg/kg (n=7)
165,7 ± 17,9 215,0 ± 8,5 31 ± 14 9,90 ± 0,93 4,6 ± 0,3 0,54 ± 0,08 0,3 ± 0,03 5,5 ± 0,5
Satélite (n=8)
180,8 ± 27,3 220,9 ± 19,1
227,9 ± 18,7
*
24 ± 20
3 ± 2
*
8,39± 1,21
3,8 ± 0,3
0,51± 0,05
0,2 ± 0,03
6,1 ± 0,9
* Resultado final, após trinta dias do término da administração.
Sem significância estatística dos grupos testados com o grupo controle (p < 0,05).
56
Ao avaliar os pesos relativos do fígado e do baço em relação ao peso
corpóreo, também não se verificou variação significativa entre os grupos tratados e o
grupo controle. Percebe-se que a variação do peso relativo do fígado varia de 3,8 %
± 0,3 (do GS - satélite) a 4,6 % ± 0,3 (do G3 – 200 mg/kg). O peso relativo do baço
foi mais homogêneo variando de 0,2 % ± 0,02 a 0,3 % ± 0,03. Quando se faz a
comparação relativa entre a massa do baço sobre a do fígado, a variação fica entre
5,5 % ± 0,5 (no grupo de 200 mg/kg) e 6,1 % ± 0,9 (no grupo satélite). De modo
geral, o G3, que recebeu a maior dose de 200 mg/kg, ganhou a maior massa
corpórea, hepática e esplênica, enquanto o GS (que recebeu a mesma dose) perfez
evolução inversa (menor massa corpórea, hepática e esplênica), contudo sem
significância estatística.
5.2.2.2. Parâmetros alimentares e fisiológicos
Os parâmetros alimentares (consumo de ração e de água) e os parâmetros
fisiológicos (produção de fezes e de urina) foram registrados periodicamente e
depois analisados estatisticamente.
Foi observado que tais parâmetros diários dos grupos tratados não
apresentaram variação significativa em relação ao grupo controle, conforme Tabela
4. Contudo, nota-se uma tendência dos animais do grupo controle (GC) mostrarem
consumo de água e produção de fezes médias, por dia, maiores que os outros
grupos (43,5 mL e 5,2 g respectivamente).
Outra tendência notada, sem significância estatística, foi que a maior
produção média diária de urina ocorreu com os animais que receberam a dose de
200 mg/kg, do G3 (14,6 mL) e o maior consumo de ração foi dos animais que
receberam a dose de 100 mg/kg, do G2 (17,9 ± 0,9). Os menores consumos de água
e de ração assim como as menores produções de urina e de fezes foram realizados
todos pelos animais do grupo satélite (GS), sendo as respectivas médias diárias,
32,5 mL, 15,7 mL, 7,9 mL e 4,5 mL.
.
57
Tabela 4: Parâmetros alimentares e fisiológicos diários de ratas tratadas com extrato
etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., na toxicidade subaguda (Média ± DP; n
= número de ratas)
Grupos Consumo de
água (mL)
Produção de
urina (mL)
Consumo de
ração (g)
Produção de
fezes (g)
Controle (n=8) 43,5 ± 11,2 12 ± 6,5 17,6 ± 2,8 5,2 ± 1,1
50 mg/kg (n=8) 35,9 ± 7,4 10,3 ± 7,6 17,2 ± 9,3 5,0 ± 3,5
100mg/kg (n=7) 38 ± 8,6 10,6 ± 6,7 17,9 ± 5,0 4,7 ± 0,9
200mg/kg (n=7) 39,2 ± 13,9 14,6 ± 14 16,8 ± 3,3 4,7 ± 1,0
Satélite (n=8) 32,5±10,1 7,9±7,1 15,7±3,4 4,5±1,0
Sem significância estatística dos grupos tratados com o grupo controle (p < 0,05).
5.2.2.3 Observações comportamentais e clínicas
Nenhum dos grupos teve animais que demonstraram mudanças
comportamentais anormais durante o estudo, tais como: autofagia, cropofagia,
irritabilidade, instabilidade comportamental, piloereção, distúrbios durante os ciclos
claro e escuro. Durante a avaliação clínica, notou-se a presença de exoftalmia
unilateral esquerda temporária (em um dia apenas) em um animal do grupo 5
(satélite), mas sem relevância estatística. Assim, não foi observada alteração clínica
durante os trinta dias de observação nos animais.
5.2.2.4. Alterações macroscópicas e histopatológicas
Após o trigésimo dia, foi feita a eutanásia dos animais e não se observou,
durante a avaliação macroscópica dos órgãos, alterações anatômicas relevantes nos
órgãos dos animais dos grupos tratados. Salvo contrário, e sem significância
estatística, apenas um animal do grupo 3 (tratado com 200 mg/kg) apresentou
hiperemia intestinal intensa.
Os achados histopatológicos observados nos órgãos das ratas estão
descritas na Tabela 5, 6, 7 e 8. Vale ressaltar que a análise histopatológica teve foco
qualitativo e não quantitativo.
58
Não foi observada alteração histopatológica dose-dependente significante em
relação ao controle. No entanto, em todos os grupos, teve órgãos que apresentaram
alterações na integridade tecidual, sendo eles, fígado, rins e pulmões (Tabela 5, 6 e
7). Coração e cérebro não tiveram alterações anormais enquanto baço intestino e
estomago apresentaram alterações isoladas. (Tabela 8).
Pode-se observar uma tendência da S. umbellatum ocasionar hiperemia
tecidual com o aumento da dose, principalmente no fígado (Tabela 5). Na dose de
200 mg/kg, todas as ratas apresentaram alterações histopatológicas hepáticas,
sendo a hiperemia o principal achado. Sua intensidade nos tecidos variou de
discreta a acentuada, sendo a hiperemia moderada o principal achado em todas as
doses, inclusive controle. Outros achados histopatológicos isolados relacionados
com alterações cardiovasculares também foram visualizados nas ratas como:
congestão moderada dos vasos sanguíneos em 12,5 % das ratas tratadas com 100
mg/kg e em 14,3 % das tratadas com 200 mg/kg; aumento discreto no número de
leucócitos polimorfonucleares (PMN) no interior dos sinusóides de 28,5 % das ratas
tratadas com 50 mg/Kg e inflamação discreta dos vasos (vasculite) em 28,6 % das
ratas com dose de 200 mm/kg. A degeneração hidrópica foi observada em 28,6 %
das ratas que receberam a dose de 200 mg/kg assim como no grupo satélite.
(Tabela 5)
A análise realizada nos rins permitiu a observação de hiperemia renal de
intensidade discreta em quase todos os grupos, exceto o grupo satélite. O grupo
com maior freqüência de hiperemia foi o G1 (50 mg/kg), presente em 66,7 % (ou 4
de 6) das ratas. Dentre estas, apenas uma (25 %) apresentou hiperemia moderada,
sendo todas as outras de intensidade discreta. Observou-se cilindros protéicos
intratubulares em 28,6 % (ou 2 de 7) das ratas do G2 (100 mg/kg), sendo que uma
rata apresentou intensidade discreto e a outra, moderada. Degeneração hidrópica
das células epiteliais do túbulo contorcido distal (TCD) foi observado com
intensidade discreta em 12,5 % das ratas (1 de 8) tratadas com 200 mg/kg e, com
intensidade moderada em 42,9 % (3 de 7) das ratas do grupo satélite (Tabela 6).
Nos pulmões, foram observadas lesões teciduais em 100 % dos animais de
todos os grupos, inclusive grupo controle, sendo a broncopneumonite a principal
alteração (Tabela 7). Outras lesões observadas em poucos animais de grupos
isolados foram: edema (em 12,5 % do grupo controle e 14,3 % do G2,
respectivamente); hemorragia difusa que variou de discreta a acentuada nos animais
59
do G2, G3 e satélite; Em 12,5 % do grupo controle e em 28,7 % do G2 foram
encontrados células mononucleares e espumosas, especialmente organizadas em
focos próximos de tecidos linfóides associado aos bronquíolos, conhecidos como
BALT, além de presença de fibrina na pleura (pleurite fibrinosa) em 14,3 % do G3
(Tabela 7).
O cérebro de todos os animais não apresentram alterações histopatológicas.
Intestino, esôfago, estômago e baço apresentaram alterações isoladas em todos os
grupos experimentais, incluindo perda integridade das vilosidades nos três primeiros
órgãos e congestão, no terceiro. O coração também estava, na maioria das vezes,
sem integridade em todos os grupos devido à punção cardíaca (Tabela 8).
60
Tabela 5: Resultados histopatológico do fígado, em porcentagem (%), de ratas
tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., por 30 dias.
Achados hepáticos (%)
Controle
(n=7)
50 mg/kg
(n=7)
100 mg/kg
(n=8)
200 mg/kg
(n=7)
Satélite
(n=8)
Normal 57,1 14,3 37,5 0 28,6
Hiperemia 42,9 85,7 50 71,4 28,6
discreta 83,3 75
moderada 100 16,7 25 60 100
acentuada 40
Congestão dos vasos
moderada
0 0 12,5 14,3 28,6
Infliltrado de leucócitos
discreto
28,6
Vasculite discreta 0 0 0 28,6 0
Degeneração hidrópica
(discreta a acentuada)
0 0 0 28,6 28,6
Análise qualitativa, sem análise estatística.
61
Tabela 6: Resultados histopatológicos dos rins, em porcentagem (%), de ratas
tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., por 30 dias.
Achados renais (%)
Controle
(n=8)
50 mg/kg
(n=6)
100 mg/kg
(n=7)
200 mg/kg
(n=8)
Satélite
(n=7)
Normal 62,5 33,3 42,9 75 57,1
Hiperemia 37,5 66,7 28,6 12,5 0
discreta 100 75 100 100
moderada 25
Degeneração hidrópica do
TCD discreta a moderada
12,5
discreto
42,9
modera
Cilindros hialinos tubulares
discretos a moderados
28,6
Análise qualitativa, sem análise estatística.
62
Tabela 7: Resultados histopatológicos dos pulmões, em porcentagem (%), de ratas
tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., por 30 dias.
Achados pulmonares
Controle
(n=8)
50 mg/kg
(n=8)
100 mg/kg
(n=7)
200 mg/kg
(n=7)
Satélite
(n=7)
Normal 0 0 14,3 0 0
Broncopneumonite 87,5 100 42,9 85,8 100
discreta 12,5 12,5 28,6 28,6 85,7
moderada 50 50 14,3 28,6 14,3
acentuada 25 37,5 0 28,6 0
Edema 12,5 0 14,3 0 0
Hemorragia difusa 0 0 28,6 M/A 14,3 A 57,1 D/M
Infiltrado PMN moderado 12,5 0 0 0 0
Células espumosas 12,5 0 28,7 0 0
Pleurite fibrinosa 0 0 0 14,3 0
Análise qualitativa, sem análise estatística.
63
Tabela 8: Resultados histopatológicos de outros orgãos, em porcentagem (%), de
ratas tratadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, p.o., por 30 dias.
Controle
(n=7)
50 mg/kg
(n=7)
100 mg/kg
(n=8)
200 mg/kg
(n=7)
Satélite
(n=8)
Achados intestinais (%)
Normal 100 100 85,7 57,1 50
Infiltrado PMN discreto a
moderado
0 0 0 42,6 50
Hipotrofia da mucosa 0 0 14,3 0 0
Achados estomacais (%)
Normal 100 100 85,7 87,5 100
Hipotrofia da mucosa 0 0 14,3 0 0
Infiltrado PMN 0 0 0 12,5 0
Achados no baço (%)
Normal 100 85,7 100 100 100
Congestão 0 14,3 0 0 0
Achados no cérebro (%)
Normal 100 100 100 100 100
Achados no coração (%)
Normal 100 100 100 100 100
Análise qualitativa, sem análise estatística.
64
5.2.2.5 Análise laboratorial
Quase a totalidade dos resultados bioquímicos dos grupos tratados não
apresentou diferenças significativas com o grupo controle, excetuando os resultados
do grupo satélite (Tabela 6). A fostatase alcalina foi o único parâmetro bioquímico
que apresentou diferença significativa aumentada entres os grupos G1 (50 mg/kg),
G3 (200 mg/kg) e GS (satélite) em relação ao grupo controle (GC). Contudo, a
variação estatística significativa não foi notada em relação ao G2 (100 mg/kg). Os
resultados da fostatase alcalina, portanto, não apresentaram relação dose-
dependente nem seqüência óbvia de resultado, o que se pode observar na
seqüência crescente de valores: GC (9 ± 6 U/L), G2 (21 ± 16 UL), G3 (83 ± 92 U/L),
G1 (99 ± 85 U/L) e GS (119 ± 113 U/L).
Os resultados bioquímicos de glicemia, colesterol total, proteínas totais e
albumina do GS (satélite) apresentaram elevados e com diferença estatística
significativa com o grupo controle e demais grupos tratados. Houve diferença com
significância estatística para a albumina (p < 0,01) e proteínas totais (p < 0,001). Os
resultados de proteínas totais do grupo satélite foi bem discrepante, visto que os
outros grupos apresentaram resultados bem homogêneos, inclusive com dois grupos
diferindo apenas em um décimo. Os valores de proteínas totais, medidos em g/dL,
em ordem crescente são: GC (5,6 ± 0,4); G1 ≅ G3 (5,8 ± 0,3), G2 (6,0 ± 0,3) e GS
(9,3 ± 2,2).
Vale citar que o grupo satélite possui outros quatro parâmetros bioquímicos,
cujos resultados estão entre os maiores em relação aos demais grupos, porém sem
significância estatística. São eles: triglicérides, ALT, uréia e creatinina. Por fim, o
grupo satélite não apresentou nenhum resultado sendo o menor de todos. Em
apenas dois parâmetros (AST e gama-GT), seus resultados são os segundos
menores.
65
Tabela 9: Valores bioquímicos de ratas testadas com extrato etanólico das folhas de S. umbellatum, via oral, na toxicidade
subaguda por 30 dias (média ± DP).
Exames
-----------
Grupos
ALT
(U/L)
AST
(U/L)
Fosfatase
alcalina
(U/L)
Gama GT
(U/L)
Creatinina
(mg/dL)
Uréia
(mg/dl)
Colesterol
total
(mg/dl)
Triglicéri-
deos
(mg/dl)
Glicemia
(mg/dl)
Proteínas
totais
(g/dL)
Albumina
(mg/dL)
Controle
69 ± 13 201 ± 68 9 ± 6 7 ± 3 0,6 ± 0,1 63 ± 6 62 ± 6 96 ± 40 129 ± 35 5,6 ±0,4 3,5 ± 0,1
50 mg/kg
76 ± 11 253 ± 48
99 ± 85*
14± 21 0,7 ± 0,1 80 ± 28 55 ± 5 83 ± 32 145 ± 34 5,8 ± 0,3 3,5 ± 0,1
100 mg/kg
54 ± 38 175 ± 79 21 ± 16 3 ± 3 0,6 ± 0,1 68 ± 9 62 ± 9 71 ± 19 127 ± 46 6,0 ± 0,3 3,6 ± 0,1
200 mg/kg
73 ± 41 209 ± 174
83 ± 92*
7 ± 5 0,6 ± 0,0 63 ± 4 65 ± 5 82 ± 24 129 ± 24 5,8 ± 0,4 3,6 ± 0,7
Satélite
82 ± 20 195 ±196
119 ± 113*
3 ± 5 0,7 ± 0,2 85 ± 27
84 ± 26*
100 ± 29
185 ±30* 9,3 ± 2,2
*2
4,3 ± 0,5
*1
* Grupos com diferença significativa com o GC (controle) - ANOVA seguido de Teste Tukey, p < 0,05. *1 = p < 0,01; *2 = p < 0,001
66
A tabela 9 apresenta os resultados hematológicos relacionado com a série
eritrocitária (contagem total de hemácias e índices hematológicos). Nota-se que,
apenas dois parâmetros apresentam significância estatística com o controle (GC): o
volume corpuscular médio (VCM) e a amplitude de distribuição dos eritrócitos
(RDW). O VCM do GC apresentou valores maiores (60,3 ± 1,1 fL) com quase todos
os grupos tratados, tendo variação estatística significativa os resultados
apresentados pelo G1 (58,4 ± 1,0 fL), com p < 0,05, e os do GS (57,3 ± 1,9), com p <
0,001. O RDW, segundo e último parâmetro hematológico estatisticamente
significativo, apresentou diminuído no grupo controle (11,9 ± 0,7 %) em relação ao
grupo satélite (13,1 ± 0,7%), com p < 0,001. O grupo satélite ainda apresentou
diferença significativa maior em relação ao G1 e ao G2. O resultado de VCM do
grupo satélite, além de ser menor significantemente que o do grupo controle, é
também com o G3 (59,9 ±1,0 fL).
Os restantes dos parâmetros e índices eritrocitários (contagem diferencial de
hemácias, hematócrito, concentração de hemoglobina, HCM, CHCM) não tiveram
diferenças estatisticamente significantes nem com o controle nem entre os outros
grupos tratados.
A tabela 11 traz os resultados hematológicos relacionados com a série
leucocitária. Observa-se que não houve nenhuma variação significativa na contagem
total e diferencial de leucócitos e de plaquetas entre os grupos tratados com o
controle nem entre si.
A análise dos parâmetros bioquímicos da urina observou-se que não houve
variação com significância estatística entre o grupo controle e demais grupos
tratados em todos os parâmetros analisados (Tabela 12)
67
Tabela 10: Hemograma e índices hematológicos de ratas testadas com extrato etanólico de S. umbellatum, p.o., na toxicidade
subaguda (média ± DP).
Exames
-----------------
Grupos
Hemácias
(x10
6
/mm
3
)
HT
(%)
HB
(g/dL)
VCM
(fL)
HCM
(pg)
CHCM
(g/dL)
RDW
(%)
Controle (n=8) 6,4 ± 0,9 38,8 ± 5,6 13,0 ± 1,7 60,3 ± 1,1 20,2 ±0,7 33,5 ± 1,3 11,9 ± 0,7
50 mg/kg (n=8) 6,7 ± 0,5 39,2 ± 2,8 13,1 ± 1,0 58,4 ± 1,0 * 19,5 ± 0,9 33,4 ± 1,4 12,2 ± 0,4
100 mg/kg (n=7)
6,6 ± 0,3 39,7 ± 2,1 13,3 ± 0,7 59,9 ± 1,0 20,1 ± 0,2 33,5 ± 0,5 12,2 ± 0,5
200 mg/kg (n=7)
6,73 ± 0,57 39,4 ± 3,6 13,4 ± 1,2 58,5 ± 0,7 19,9 ± 0,6 34,1 ± 0,6 12,4 ± 0,3
Satélite (n=8) 6,63 ± 0,62 38,1 ± 4,4 12,9 ± 1,2 57,3 ± 1,9** 19,5 ± 0,8 34,0 ± 1,8 13,1 ± 0,7**
* - Diferença significativa com o grupo controle (ANOVA seguido de Teste Tukey): * p < 0,05; ** p < 0,001.
Legenda: HT = Hematócrito; HB = hemoglobina; VCM = volume corpuscular médio; HCM = hemoglobina corpuscular média;
CHCM = concentração de hemoglobina corpuscular média; RDW = amplitude de distribuição dos eritrócitos
68
Tabela 11: Contagem total e diferencial de leucócitos e de plaquetas de ratas testadas com extrato etanólico de S. umbellatum,
p.o, na toxicidade subaguda (média ± DP).
Exames
Grupos
LEUC TOT
(mm
3
)
NEUT
(%)
EOSI
(%)
LINF
(%)
MON
(%)
PLAQ
(10
3
/mm
3
)
Controle (n=8)
6600 ± 1559 9 ± 3 0 ± 0 85 ± 3 6 ± 1 504 ± 144
50 mg/kg (n=8)
5388 ± 1528 11 ± 4 0 ± 0 84 ± 4 6 ± 1 528 ± 158
100 mg/kg (n=7)
6886 ± 1451 10 ± 4 0 ± 0 84 ± 5 6 ± 1 584 ± 79
200 mg/kg (n=7)
5886 ± 2055 10 ± 3 0 ± 0 84 ± 4 6 ± 1 627 ± 101
Satélite (n=8) 5100 ± 2100 8 ± 2 0 ± 0 86 ± 2 6 ± 1 504 ±141
* Sem diferença estatística dos grupos tratados com o grupo controle (p < 0,05)
Legenda:LEUC TOT = leucócitos totais; NEUT = neutrófilos; EOSI = eusinófilos; LINF = linfócitos; MON = monócitos; PLAQ =
plaquetas
69
Tabela 12 – Parâmetros bioquímicos da urina (Média ± DP) em ratas submetidas a toxicidade subaguda por 30 dias, p.o., do
extrato etanólico da S. umbellatum.
Grupos
Cor Densidade
(mg/L)
pH Cels epiteliais
(%)
Nitritos Piócitos
(%)
Hemáceas
(%)
Controle (n=8) A. citrino 1011 ± 4 7,0 ± 0,0 938 ± 547 ausente 1063 ± 665 825 ± 620
50 mg/kg (n=8) A. citrino 1013 ± 6 7,1 ± 0,4 1813 ± 3372 ausente 2031 ± 1892 1531 ± 2157
100 mg/kg (n=7) A. citrino 1012 ± 4 7,2 ± 0,4 625 ± 411 ausente 917 ± 645 500 ± 387
200 mg/kg (n=7) A. citrino 1009 ± 4 7,0 ± 0,6 1714 ± 756 ausente 1143 ± 1019 750 ± 645
Satélite (n=8) A. citrino 1011 ± 3 7,6 ± 0,5 1031 ± 839 ausente 1844 ± 2159 469 ± 339
* Sem diferença estatística dos grupos tratados com o grupo controle (p < 0,05)
Discussão
DiscussãoDiscussão
Discussão
71
6. DISCUSSÃO
O extrato etanólico das folhas (EEF) e o látex de Synadenium umbellatum
possuem baixa toxicidade aguda, evidenciada pela ausência de sinais clínicos e
comportamentais anormais no screening toxicológico, bem como ausência de morte
das ratas durante todo o período de observação com a dose de 2000 mg/kg. Pelo
método de classes proposto no Guia 423 (OECD, 2001b), a S. umbellatum se
enquadra na Classe 5 (droga com DL50 superior a 2000 mg/kg e menor que 5000
mg/kg), sendo considerada praticamente atóxica.
Somente em casos excepcionais que existe justificativa do uso da dose de
5000 mg/kg (OECD, 2001b; BRASIL, 2004). O próprio guia 423 não aconselha a
realização do teste de toxicidade aguda utilizando a dose de 5000 mg/kg, visando à
proteção da vida do animal e por dificuldades técnicas de solubilização e
administração, a não ser que tal teste seja necessário em um estudo para garantir a
qualidade da saúde humana. O látex é utilizado em doses muito baixas pela
população (aproximadamente 140 mg/dia). Oliveira (2007) demonstrou que o extrato
das folhas da S. umbellatum possui atividades antiinflamatórias com doses inferiores
a 100 mg/kg, sendo, a dose farmacológica em torno de 10% do limite inferior da
DL50 por nós determinada. Por tudo isso, resolveu-se, então, por não testar a dose
máxima já que não é uma necessidade imperiosa, tornando o resultado bastante
satisfatório.
Vale ressaltar que o teste de toxicidade aguda deve priorizar a via utilizada
pelos humanos. Pela via intraperitoneal, em camundongos, a S. umbellatum
demonstrou possuir DL50 entre 150 a 160 mg/kg (OLIVEIRA et al., 2005). Mesmo
sendo espécies diferentes, é notório que a resposta dos animais frente à
administração por gavagem não será a mesma daquela observada quando utilizada
a via intraperitoneal, devido às diferenças existentes entre os perfis de absorção
estomacal e intestinal como pH, superfície de absorção, motilidade intestinal,
irrigação sanguínea (KLAASSEN & WATKINS, 2001). Por esse motivo, o teste de
toxicidade aguda foi realizado utilizando a via oral já que não há relato do uso da S.
umbellatum por outra via de administração.
O uso de apenas um sexo de animais, usualmente ratos fêmeas, é defendido
pelo novo Guia 423, revisado e adotado em dezembro de 2001, pela OECD. Este
guia – que surgiu em 1996 e está em constante revisão (a penúltima foi em 1999) –
72
veio como alternativa ao Guia 401, teste convencional da toxicidade aguda, já
descartado pela OECD (2001b). Por já pré-estabelecer, no máximo 5 doses
diferentes a serem utilizadas, tal método prima pela utilização de pequena
quantidade de animais.
Existe uma tendência mundial para reavaliar a utilização de animais em
experimentos como forma de reduzir custos, tempo, e o mais preconizado: seguir a
bioética diminuindo o sofrimento desnecessário de animais de laboratório. Várias
alternativas foram sugeridas com base no princípio do programa dos 3 Rs:
Reduction (redução do número de espécies e animais utilizados nos procedimentos),
Refinement (refinamento da técnica utilizada) e Replacement (substituição de
cobaias por modelos fabricados sem, no entanto, prejudicar os resultados). Existem
outros métodos propostos para determinação da DL50 que não há como prever a
quantidade de animais a ser utilizados, culminando na morte de vários animais ou
até mesmo, atrapalhando a aprovação do projeto por comitês de ética de pesquisas
com animais. Dentre eles, pode-se citar alguns propostos pela própria OECD na
Guia 420, chamado método de dose fixa (OECD, 2001a) e na Guia 425, chamado
processo modificado “Up-and-Down” (OECD, 2001c), além de outros tipos propostos
por outros pesquisadores: Dose Letal Aproximada (KENNEDY et al., 1986;
DEICHMANN & BLANC, 1943), Método Grafical por Próbitos (TURNER, 1965) ou
pelo método de Litchfield & Wilcoxon (1949), que pode chegar a um total de 250
animais mortos (apud LUCIO et al., 2000).
O screening hipocrático é um ensaio bastante útil e comumente usado na
triagem preliminar de plantas para detectar atividades farmacológicas e toxicológicas
(LUCIO et al., 2000). O EEF e o látex de S. umbellatum demonstraram influenciar a
atividade geral e consciência dos animais, que ficaram mais quietos durante a
primeira hora de observação. A planta não influenciou na coordenação motora nem
nos reflexos, além de não influenciar outras atividades fisiológicas relacionadas com
SNC (como tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia) ou com o SNA (como
lacrimação, respiração, cianose, ptose, salivação, micção, defecação, piloereção,
hipotermia). A falta de agitação na primeira hora pode está relacionada a saciedade,
resposta fisiológica normal do animal à administração da planta por gavagem.
Porém não se pode descartar que a planta possua uma ação ansiolítica seletiva ou
até mesmo ação como relaxante muscular, as quais merecem estudo
73
(KANJANAPOTHI et al., 2004; OLIVEIRA, 2007). Oliveira (2007) demonstrou que a
atividade de letargia não está relacionada com ação sobre os receptores opióides.
Na toxicidade subaguda, os sinais de toxicidade sistêmica são definidos
considerando a redução na massa corporal dos animais experimentais (TOFOVIC &
JACKSON, 1999; RAZA et al.., 2002; TEO et al.., 2002). Além da redução do
desenvolvimento ponderal, a toxicidade sistêmica se manifesta através da redução
nos consumos de água e ração, alterações de comportamento, apatia e má
condição da pelagem, como a presença de pêlos arrepiados (MELLO, 2001). Outros
sinais de toxicidade podem se expressar pela alteração da massa relativa dos
órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas sangüíneas (GONZALEZ & SILVA,
2003). O EEF de S. umbellatum, nas diferentes doses espaçadas adequadamente,
não produziu alteração significativa nos parâmetros corpóreos, fisiológicos,
histopatológicos, hematológicos, bioquímicos e uranálise entre os grupos tratados
por 30 dias nem entre estes e o controle, com raras exceções (Tabelas 3 a 12).
Aliás, mostrou-se um equilíbrio de peso entre os animais do mesmo grupo
(diminuição do desvio-padrão) e um ganho ponderal de no mínimo 20% em todos os
grupos
A fim de assegurar a significância entre as doses, as mesmas foram
espaçadas de uma dose subseqüente para a outra com diferença de, no mínimo,
50% da concentração. Assim sendo, os grupos tratados com doses de 50, 100 e 200
mg/kg apresentaram poucos parâmetros laboratoriais com diferença
estatisticamente significativa quando comparado aos do grupo controle e até entre
eles. No entanto, o grupo satélite foi o grupo que apresentou algumas alterações
bioquímicas e hematológicas isoladas quando comparados ao grupo controle e até
com os outros grupos tratados (Tabela 9 e 10).
Vale ressaltar que o grupo satélite recebeu a mesma dose do grupo 3, ou
seja, 200 mg/kg. A diferença é que o satélite permaneceu por mais trinta dias em
observação, sem receber o tratamento. E, por obstante, a evolução ponderal do
grupo satélite durante os 30 dias sem administração foi 7 vezes inferior ao que
conseguira durante o tratamento. Além disso, foi o grupo que apresentou menor
desenvolvimento dos hábitos fisiológicos e alimentares, ou seja, menor produção de
urina e de fezes e menor consumo de ração e fezes, mesmo tendo sido o grupo com
maior peso médio no início do estudo. O G3 (que recebeu a mesma dose do satélite)
teve os maiores resultados na evolução ponderal e hábitos fisiológicos, mesmo
74
sendo o grupo com menor média de peso no inicio do estudo. A explicação para
isso, é que o desenvolvimento fisiológico dos animais do grupo satélite está reduzido
já que os animais eram bem crescidos no início, enquanto o G3 tinha o organismo
menor e estava em fase de crescimento mais acelerado.
Outro fato relacionado aos hábitos fisiológicos é que o grupo controle foi o
que teve uma maior média de consumo de água e de produção de fezes, contudo,
não apresentou as maiores médias de produção de urina e de consumo de ração.
Com isso, percebe-se que não há uma relação direta e estrita entre consumo de
água X produção de urina e entre consumo de ração X produção de fezes,
reafirmando que tais parâmetros fisiológicos dependem da variação metabólica,
genética e fisiológica de cada animal.
Conforme já citado anteriormente, o grupo satélite foi o que apresentou mais
parâmetros alterados com níveis de significância estatística. Ao analisar os
parâmetros bioquímicos isso pode ser comprovado. Houve aumento nos valores da
glicemia, albumina, colesterol total e proteínas totais do grupo satélite, que
mostraram diferença significativa com o controle e demais grupos. Isto pode ser
explicado pela diminuição do estresse que era ocasionado pela administração diária
do produto, bem como o incômodo das observações dos parâmetros fisiológicos.
Tais atitudes do pesquisador podem ocasionar alterações metabólicas e fisiológicas
que interferem nos parâmetros alterados, grande parte relacionada com hábitos
alimentares. Corroborando isso, nota-se que, mesmo sem variância significativa,
apresentaram as maiores médias dos parâmetros triglicerídeos, uréia, creatinina e
ALT. Além do mais, a não causalidade com o produto fica corroborado pela ausência
de diferença significativa entre o controle e a dose de 200 mg/kg (mesma dose do
satélite).
A fosfatase alcalina mostrou-se aumentada significativamente nos demais
grupos em relação ao controle, exceto no grupo de 100 mg/kg. A fosfatase alcalina
(ALP) está presente em vários tecidos, principalmente ósseo, no sistema
hepatobiliar e na mucosa gastrointestinal e é indicadora da ocorrência de colestase
(i.e., fluxo biliar prejudicado), que pode levar a um incremento dos níveis séricos em
até 10 vezes (SCHEFFER & GONZÁLEZ, 2003). No entanto, não observou
alterações em outros parâmetros relacionados com a função hepática e o aumento
alterado da fosfatase não teve significância clínica. Possivelmente, a variabilidade
biológica dos animais pode estar relacionada com este achado.
75
O tratamento por trinta dias consecutivos com EEF, de forma geral, não
induziu modificações significativas no perfil hematológico das ratas do grupo
controle, exceto para os valores de volume corpuscular médio (VCM) e para a
amplitude da distribuição dos eritrócitos (RDW). Estes se apresentaram,
respectivamente, diminuídos e aumentados com significância estatística no grupo
satélite em relação a todos os demais grupos (Tabela 10).
As análises dos índices hematimétricos são importantes indicadores na
determinação do tipo morfológico das anemias. O VCM informa o tamanho da
hemácia e quando baixo, fornece indícios de anemia microcítica. O RDW reflete a
heterogeneidade do tamanho dos eritrócitos, sendo o mais sensível para determinar
o grau de anisocitose, e auxilia na diferenciação das anemias microcíticas.
Alterações em tais parâmetros podem sugerir deficiência na ingestão de nutrientes
como o ferro (HOFFMANN et al., 2007). Como o grupo satélite apresentou tais
parâmetros alterados, tal fato pode estar relacionado com a variabilidade biológica
dos animais. O espaçamento do tempo de reposição dos alimentos no grupo satélite
pode ter influenciado tais alterações, sem, contudo, ser o determinante delas, haja
vista que as ratas ingeriam menor quantidade de alimentos durante os 30 dias sem
tratamento do que durante o mesmo período de tratamento. Como o grupo que
recebeu a mesma dose do grupo satélite não apresentou tais alterações
hematológicas, pode-se afirmar que elas não foram devido a planta
Nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, o extrato etanólico das folhas não
produziu alterações dose-dependentes na análise histopatológica, somente
tendências em grupos isolados de alterações cardiovasculares e inflamatórias. Tais
alterações consistiram, principalmente, na hiperemia, congestão e infiltração
leucocitária nos fígado, pulmões e rins.
Trabalhos demonstram que a Synadenium. grantii (sinonímia heterótipo da S.
umbellatum) possui glicoproteínas complexas, denominadas lectinas, encontradas
principalmente no látex, que são potentes aglutininas para eritrócitos humanos
(RAJESH et al. 2006; SOUZA et al., 2005; MRINALINI et al., 2002; UZABAKILIHO et
al., 1987, PREMARATNA et al., 1981). Assim, a presença das lectinas pode
influenciar a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMN) e o acúmulo de
sangue nos vasos sanguíneos dos órgãos mais irrigados, culminando nos efeitos
histopatológicos supracitados na toxicidade aguda do látex e na toxicidade
76
subaguda das folhas, principalmente a tendência de hemorragia observada nos
órgãos mais perfundidos: fígado, pulmões e rins.
Apesar do perfil leucocitário não demonstrar diferença significativa alguma na
contagem diferencial dos leucócitos no sangue, foi observado, no fígado e pulmões
de ratas isoladas, infiltrado inflamatório discreto a moderado. Isso mostra que o
processo inflamatório agudo ocorreu e sugere a participação dos leucócitos - células
que contém muitos mediadores biologicamente ativos e lesivos, como os radicais
livres (ABBAS et al., 2002), - nas outras alterações histopatológicas reveladas
nestes órgãos, tais como a degeneração hidrópica nos rins e fígado e células
espumosas e pleurite fibrinosa nos pulmões (KUMAR et al, 2005).
A maioria dos leucócitos na fase inicial da inflamação é do tipo PMN,
enquanto que os monócitos predominam durante a fase mais tardia (RITTNER et al.,
2001). A facilitação da diapedese tissular pelas lectinas pode propiciar um processo
inflamatório agudo, sem, no entanto levar à cronicidade com o uso por 30 dias, já
que houve reversibilidade das lesões e nem se verificou necrose tecidual, lesões
vasculares e fibrose nos órgãos.
O fígado é um órgão muito susceptível a agressões químicas que podem
resultar em processos inflamatórios ou necrosantes. O grau da lesão hepática
provocada por dano químico ou biológico pode variar, podendo levar a alterações
leves das enzimas hepáticas sem desenvolvimento de sintomas clínicos, até casos
mais graves de insuficiência hepática aguda ou crônica. Em fase inicial, a lesão
hepática pode ser detectada a partir do aumento dos níveis de enzimas hepáticas no
sangue. Esse aumento pode ser devido à necrose celular ou pelo aumento da
permeabilidade da membrana celular. Algumas das enzimas que podem ser
utilizadas como indicadoras de injúria hepática são alanina-aminotransferase (ALT),
também denominada transaminase glutâmico-pirúvica (TGP); aspartato-
aminotransferase (AST), também denominada transaminase glutâmico-oxaloacética
(TGO); gama-glutamiltransferase (GGT), também denominada gama-
glutamilpeptidase (GGP) e fosfatase alcalina (ALP) (COLES, 1986). Nenhuma delas
mostrou alterações dose-dependentes significativas com o controle (Tabela 6).
Como mostrado anteriormente, apenas a fosfatase alcalina (ALP) dos grupos
testados mostrou-se aumento significativo em relação ao controle, excetuando o G2
(dose de 100 mg/kg). Na análise histopatológica deste, observou tendência de
hiperemia devido a presença de lectinas na composição da planta.
77
A avaliação da nefrotoxicidade induzida quimicamente deve incluir a análise
de urina, a sorologia bioquímica e a análise histopatológica, para fornecer um perfil
razoável dos efeitos funcionais e morfológicos de um composto sobre o rim. A
análise da urina fornece uma avaliação relativamente fácil e não invasiva da
integridade da função renal, fornecendo alguns elementos sobre a natureza da
agressão renal. (KLAASSEN & WATIKINS, 2001). Ao avaliar os parâmetros da
uranálise e os bioquímicos relacionados à função renal (uréia e creatinina) não se
observou diferença significativa dos resultados entre controle e grupos testados. Na
histopatológica, houve tendência de hiperemia renal reversível. No entanto, a
degeneração hidrópica ocorreu e permaneceu em altas doses. Sabe-se que o que
acontece em primeiro lugar é a alteração bioquímica, depois a morfológica. Uma
possível explicação para tal acontecimento é que a análise histopatológica foi
qualitativa e as análises da bioquímica renal e uranálise foram quantitativas, assim
sendo, estas não refletiram a tendência não majoritária daquela.
A avaliação histopatológica dos pulmões observou-se que todos os animais
apresentaram alterações teciduais inflamatórias, principalmente broncopeneumonite.
Esta se caracteriza pela presença de hiperemia, hemorragia e espaçamento dos
septos alveolares com presença de polimorfonucleares no seu interstício (ZAMORA,
1992). Outras alterações hemato-inflamatórias como edema, hemorragia difusa,
infiltrado leucocitário e células espumosas foram observadas em alguns animais de
grupos isolados. A presença de lectina, potente aglutinina, poderia justificar tal fato
nos grupos tratados, se não fosse a ocorrência bem freqüente de tais alterações
também no grupo controle. Como este grupo não recebeu a planta, e somente teve
em comum o modo de administração (por gavagem) e a presença do Tween, estes
podem ter sido os desencadeantes de tais alterações freqüentes em todos os
grupos.
A avaliação da toxicidade da S. umbellatum, principalmente a toxicidade
subaguda e crônica, tem relevância para a saúde pública, considerando que a planta
pode ser usada empiricamente como antiinflamatória e antitumoral. Assim como tais
distúrbios patológicos se apresentam na forma de quadro crônico que,
conseqüentemente, faz com que a ingestão da planta medicinal seja em regime de
uso constante e duradouro, faz-se necessários estudos mais prolongados
(toxicidade sub-crônica e crônica) para averiguar o desenrolar dos danos hepático,
renais e pulmonares apresentados pela planta. No entanto, a realização de estudo
78
de toxicidade crônica é muito dispendioso e complicado no que refere a estrutura,
tempo, técnica de administração, recursos humanos e financeiros entre outros.
Por fim, o protocolo de avaliação do potencial toxicológico aqui utilizado é um
ensaio amplo, fazendo necessários estudos adicionais prolongados para verificar o
desfecho das alterações histopatológicas aqui apresentadas. Os mecanismos
envolvidos nas alterações observadas devem ser estudados utilizando também
outros modelos mais específicos, como testes in vitro, testes de mutagenicidade e
teratogenicidade, testes de toxicocinética, entre outros.
Assim, este estudo não respalda ainda o uso desta planta na terapêutica
empírica.
Conclusões
ConclusõesConclusões
Conclusões
80
7. CONCLUSÕES
Pode-se concluir que o extrato etanólico de folhas de Synadenium
umbellatum tem baixa toxicidade em altas doses em curto prazo, sendo classificada
como praticamente atóxica.
Ao testar várias doses do extrato alcoólico de Synadenium umbellatum em
ratas Wistar, por um curto período de tempo (30 dias), notou-se que as diferentes
concentrações do extrato etanólico não produziram intensas alterações
comportamentais, fisiológicas, bioquímicas, hematológicas e histopatológicas dose-
dependentes.
O látex de S. umbellatum apresentou baixa toxicidade sendo praticamente
atóxico, mas é mais propício a provocar alterações teciduais hemorrágicas e
inflamatórias no fígado, rins e pulmões.
O uso da planta na terapêutica empírica ainda não foi respaldado.
Referências
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ANEXOS
ANEXOSANEXOS
ANEXOS
92
9. ANEXOS
9.1. ANEXO I: PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA
93
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas
(NEPET-UFG)
Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
Fone/Fax: 055 21 62 3209 6044/ 3521 1821
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Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Goiás
Praça Universitária Esq. lª. Avenida S/N Setor Universitário
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94
9.2. ANEXO II: FICHA PARA TOXICIDADE AGUDA
Toxicidade aguda oral - Método de Classes: OECD 423
Projeto:
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PRÉ-CLINICA DA SYNADENIUM UMBELLATUM
Droga:_Synadenium umbellatum (extrato etanólico das folhas)
_______
Animal: ( X ) Rato ( ) Camundongo Sexo: ( ) M ( X ) F
Via ADM: p.o. (gavagem) Vol. Fixo: _1 mL / 100 g animal__
Solução (diluente):__salina + tween 80 ®___ _ Dose: 2000 mg/kg_____
Data/horário:__16/02/07 – 10 h_____________________________________
Animal
Peso animal
(g)
Dose fixa
(mg/kg)
Massa produto
(mg)
Vol. Adm.
(mL)
Observações
1
176
2000
352 1,7
2
167
2000
334 1,7
3
171
2000
342 1,7
Media 171 342 1,7
Comentários:
Responsável (Identificação, data e assinatura)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas
(NEPET-UFG)
Prof. Dr. Luiz Carlos da Cunha
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95
FICHA PARA SCREENING HIPOCRÁTICO – TOXICIDADE AGUDA
Experimento:_________________________________________________________
ANIMAIS: Sexo: F Via Adm.: p.o .; Dose: 2000 mg/kg
Parâmetros avaliados
0 h 15` 30` 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 48h 3 d ... 7 d ... 14 d
Atividade geral
4 4 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Frênito vocal
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
I - Disp geral
Irritabilidade
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Resposta ao toque
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Resposta aperto cauda
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Contorção
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Posição trem posterior
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Reflexo Endireitamento
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Tonus do corpo
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Força para agarrar
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
II – Atividade e coordenação motora
Ataxia
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Reflexo Auricular
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
III
Reflexo Corneal
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Tremores
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Convulsões
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Straub
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Hipnose
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
IV - SNC
Anestesia
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Salivação
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lacrimejamento
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Ptose
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Micção
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Defecação
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Piloereção
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Hipotermia
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Respiração
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Cianose
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
V - SNA
Hiperemia
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Morte
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Data: _____________________ Assinatura: ________________________
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96
ESCALA (ESCORE) DOS EVENTOS –
SCREENING HIPOCRÁTICO
Intensidade do Evento
(NORMAL = 0)
Valor Atribuído
Ausente 0
Raro 1
Discreto (pouco) 2
Moderado 3
Acentuado (intenso) 4
Intensidade do Evento
(NORMAL = 4)
Valor Atribuído
Ausente 0
Raro 1
Pouco 2
Diminuído 3
Normal (presente) 4
Aumentado 5
Moderado 6
Elevado 7
Intenso 8
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