( PDF ) Contribuições ao estudo da histoplasmose experimental murina

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

CONTRIBUIÇÕES AO ESTUDO DA

HISTOPLASMOSE

EXPERIMENTAL MURINA

Anderson de Sá Nunes

Ribeirão Preto – SP

-2004-

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Anderson de Sá Nunes

CONTRIBUIÇÕES AO ESTUDO DA

HISTOPLASMOSE EXPERIMENTAL

MURINA

Tese Apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto, Universidade de São

Paulo, para Obtenção do Grau de Doutor em

Imunologia Básica e Aplicada.

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli

Ribeirão Preto – SP

- 2004-

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FICHA CATALOGRÁFICA

Nunes, Anderson de Sá

Contribuições ao

estudo da

histoplasmose

experimental murina.

Ribeirão Preto, 2004.

161 p. : il. ; 30cm

Tese de doutorado,

apresentada à Faculdade

de Medicina de Ribeirão

Preto/USP – Área de

Concentração: Imunologia

Básica e Aplicada.

Orientadora: Faccioli, Lúcia Helena.

1. Histoplasma capsulatum. 2. vacina. 3. neutrófilos. 4.

eosinófilos.

Não sou insensível à beleza natural,

mas minhas alegrias emocionais estão

centradas nas obras improváveis e

todavia às vezes maravilhosas, desse

minúsculo e acidental ramo evolutivo

chamado Homo sapiens

Stephen Jay Gould

em “Viva o Brontossauro”

Agradecimentos

“Uma pequena história na imunologia”

Minha relação com a ciência mantém uma íntima associação com os desenhos

animados e com os quadrinhos. Lembro que meu primeiro contato com a ciência, embora

empírico, foi após ter assistido um antigo desenho do Homem de Ferro da Marvel Comics.

Em um dos episódios, esse herói enfrentou um vilão capaz de congelar pessoas, animais e

objetos. Durante uma de suas experiências, o vilão congelou um gato e ao descongelá-lo,

percebeu que não somente o animal estava vivo, como não havia envelhecido. Mas como todos

os vilões, resolveu usar esse conhecimento para o “mal”. A partir daí, resolvi eu mesmo

fazer meus “experimentos”, congelando moscas vivas no congelador da geladeira de casa.

Até hoje lembro a surpresa de minha mãe quando, ao limpar essa mesma geladeira semanas

depois, encontrou um cemitério de moscas no congelador. Graças à sua compreensão

materna e a uma boa conversa, ela soube entender os motivos de uma criança de 6 anos e,

pacientemente, explicou-me que nem tudo que aparecia na televisão poderia e/ou deveria ser

reproduzido na vida real. E é claro, as moscas estavam mortas, para minha frustração! Meu

ímpeto pseudocientífico ficou latente até que descobri que a cera de uma vela derretida

poderia ser um bom conservante de insetos (havia criado meu próprio âmbar!), se não fosse

o pequeno inconveniente de matá-las também. Porém essa é uma outra história.

Anos depois, após uma tentativa frustrada no vestibular para medicina, resolvi

prestar a prova da VUNESP para o curso de Ciências Biológicas – Modalidade Médica da

UNESP de Botucatu, mesmo sem saber exatamente do que tratava tal curso e sequer onde

ficava essa cidade do interior (um mal de muitos paulistanos). Durante a matrícula, descobri

uma série de “rituais” pelos quais os calouros passam ao entrarem na universidade. Primeiro,

o “batizado” onde recebi de meu padrinho TG o nome de Homer Simpson, por meio do qual

muitas pessoas me conhecem. Segundo, ganhei o corte de cabelo característico do

personagem (corte este que está voltando naturalmente com a idade) e isso acabou sendo o

meu retorno aos quadrinhos e desenhos animados. Esse retorno foi tão intenso, que durante

o tempo em que participei do Centro Acadêmico “V de Junho” (CAVJ) criei os “Cavaleiros

Dionisíacos”, juntamente com os inesquecíveis amigos Magal, Rapel, Meleka e Prendado,

uma paródia ao desenho “Cavaleiros do Zodíaco”, televisionado nessa época. Nossos

personagens lutavam contra as “injustiças” dos departamentos do Instituto de Biociências

de Botucatu e renderam mais de dois anos de quadrinhos no Biossíntese o jornal do nosso

curso. Nos quatro anos de graduação, após uma fase inicial de difícil adaptação e pouco

dinheiro, não posso esquecer as grandes amizades que fiz tanto em minha turma, a XXX,

quanto em outras turmas. Puta, Flato, Baratox, Paula, Carol, Púbis, Traíra, Xenga,

Kanabis, Ploft e Baffo, Monócito, Sem-Noção, Boca, Sucrilhos, Xipoca, Trolho, Tança,

Simprão, Babão, Fosseta, Bozó, Broto, Suspiro, Dandão e Cipó, dentre outros, fizeram

parte do meu dia-a-dia, seja nas reuniões do “Centro Acadêmico V de Junho” (CAVJ) ou

da Congregação, seja nas comissões organizadoras da Semana da Bio ou nas Interbios,

seja na comissão de formatura ou nas festas. Nunca vou esquecer os momentos que

passamos juntos, estudando de madrugada, no Bar do Bigode, ou mesmo amanhecendo na

igrejinha de Rubião Jr., tomando café no Restaurante Universitário (Lessefer) e

almoçando com o mestre das sinapomorfias, Prof. Bernardi e com Seu Alônsio (

memorian

), após uma noitada de bebedeira. Também não posso esquecer as experiências

pessoais que tive durante esses anos de graduação, as conversas salvadoras com a Profa.

Irani, o estágio no Departamento de Educação como bolsista do Programa de Apoio ao

Estudante (PAE) e no Departamento de Física e Biofísica, as aulas que ministrei à noite

nas Escolas Estaduais “Sophia Grabiel” da COHAB e “Angelino de Oliveira” do Bairro e as

atividades do Programa Especial de Treinamento (PET) sob tutoria da Profa. Yuriko. Mas

meu despertar para a imunologia só aconteceu no final do segundo ano, após as aulas do

Prof. José Maurício Sforcin, que acabou se tornando meu orientador e amigo. Durante o

ano em que fiz minha monografia no Departamento de Microbiologia e Imunologia, tive o

prazer de conhecer os técnicos Lourdes, Luiz, e Tó, os alunos de pós-graduação Sueli,

Cristiane, Renata e alguns professores que muito me ensinaram e incentivaram a decidir

pela carreira acadêmica: Profs. Ângela, Silvão, Ramon, Teresinha, Ary, Eduardo Bagagli

e em especial, Profa. Alexandrina Sartori que me apresentou à Prof. Lúcia Helena

Faccioli, durante o congresso da Sociedade Brasileira de Imunologia no final de 1997, que

mais tarde viria a se tornar minha orientadora de mestrado e doutorado.

A transição de Botucatu para Ribeirão Preto, onde fiz minha pós-graduação, teve

altos e baixos. A incerteza inicial sobre a bolsa e a distância dos amigos pesou muito. Mas

felizmente nessa fase conheci as moradoras da república da grande amiga Andréia: Giziane,

Alessandra de Barretos, Carol e Luciana, minhas primeiras amigas nessa cidade. Mais

tarde, conheci a Alessandra Cecchini, Alessandra Herling e Tatiane Vargaftig, que

também se tornaram grandes amigas e que juntamente comigo, com a Giziane e com a

Andréia formamos o sexyteto, que mais tarde tornou-se o septyteto com a chegada da

Silvia. A recepção no laboratório também foi um fator decisivo à minha adaptação. A

compreensão, incentivo e respeito de minha orientadora, Profa. Lúcia Helena Faccioli, o

apoio da Adriana que conseguiu um lugar para eu morar, a Fernanda com seu jeito

descontraído de aproveitar a vida e a Lucinha com a qual até hoje discordo em quase tudo,

representaram um ótimo começo no laboratório. Nesses 6 anos e meio, muitas pessoas

chegaram e se foram no laboratório: Tito, Alexandre, Juliana, Márcia, Liandra, Gustavo,

Gláucia e Jorge. Outras chegaram e ficaram: Eleuza, Alexandre, Camila, Mix, Dani

Carlos, Rosane, Beto, Walter, Dani de Franca, Érica e Carlos. Com a transferência do

laboratório para a Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto conheci o

professor e amigo Auro Nomizo, com quem as discussões imunológicas e os elogios ao meu

desempenho como aluno e professor, nunca irei esquecer. E finalmente Alexandra Ivo de

Medeiros (Xan), uma pessoa que me acolheu em seu coração desde que nos conhecemos em

Mangaratiba no Congresso da SBI (quando você se “interessou” pelo meu pôster a pedido

da Lúcia). O tempo passa e continuo não encontrando palavras para descrever seu carinho,

amizade, conforto, compreensão e companhia em tudo que passamos juntos seja nos

momentos alegres, nos difíceis e é claro, na bancada quando trabalhamos a “4 mãos”. Você é

insubstituível minha segunda irmã!!! Do meu segundo laboratório, o Centro de Pesquisas em

Tuberculose, também tenho a agradecer o Prof. Célio Lopes Silva pela confiança, por me

acolher com carinho e permitir o uso da sala de biosegurança NSB3 (P3) onde se realizaram

os experimentos com o

Histoplasma capsulatum

. A todos que conheci nesse laboratório e no

laboratório da Profa. Vânia: Iza, Ana Paula Masson, Ana Paula Trombone, Sandra,

Eduardo, Rubinho, Rogério (Winby), Maristela, Carlos Rodrigo (Cacá), Ana Olívia,

Karla, Beraba e Zelão agradeço pela convivência.

A pós-graduação também se mostrou um lugar de muito aprendizado. A convivência

em meus primeiros anos com amigos que hoje são pós-doutorandos ou mesmo professores;

Marcelo Baruffi, Ademilson, Arlete, Vânia, Jeanne e Jane; foi essencial para a

consolidação do meu conhecimento científico e senso crítico. Tenho saudade das disciplinas

com Marquinhos, Diane, Tasso, Weber, Glauce, Marta, Bia, Fabiana e Homero, dos

“happy hour” com a Gabi, Ana Paula Campanelli e Laci e dos “Journal Club” com Trança,

Gustavo, Ita, Sérgio e outros. Tenho que agradecer duplamente aos professores Maria

Cristina Roque Antunes Barreira, José Elpídio Barbosa, Eduardo Antonio Donadi, Luisa

Karla de Paula Arruda, Vanderlei Rodrigues, Yara Maria Luciano Valim, Eurico Arruda

Neto, Francisco Juarez Ramalho Pinto e todos aqueles que convivi e participei das

disciplinas. A alguns de vocês, por serem um exemplo de humildade e de como ser e agir de

forma digna, correta e ética, me inspiram e me tornam uma pessoa melhor. Aos outros, por

me mostrarem que quanto mais intelectualizado um ser humano se torna, mais suscetível a

arrogância, a intransigência e a luta desenfreada pelo poder ele pode se tornar,

características das quais procuro me afastar. À área de Pós-graduação em Imunologia

Básica e Aplicada, gostaria de agradecer a oportunidade de ter sido aluno desse curso tão

respeitado. Particularmente, ao seu coordenador, Prof. João Santana da Silva agradeço

pela presença inspiradora em nossa pós-graduação, confiança em minha pessoa e auxílio

fundamental na busca por laboratórios para realização de meu pós-doutoramento no

exterior. Talvez para sua carreira minha defesa represente apenas 20 pontos, mas para

minha carreira que começa agora, sua pessoa representa muito mais do que uma publicação

na Nature Immunology (quem sabe um dia?). Em especial, gostaria de agradecer a querida

secretária Ana Cristine S. Ferreira pela competência e dedicação à nossa pós-graduação.

(quem sabe agora que estou me tornando doutor você me deixa namorar sua filha!!!).

Mas não somente de trabalho e estudo se vive. Pude desfrutar de muitas coisas boas

que a vida oferece e da companhia de muitos colegas e amigos. Os retornos a Botucatu,

primeiro para as iniciações dos bixos e outras festas e mais tarde como ministrante de

cursos na Semana da Bio, foram oportunidades de conhecer as novas gerações dos meus “bixos”,

dentre eles Sabão, Sula, Zero, Truta e outros, que de uma forma ou de outra, continuam nosso

trabalho com o mesmo entusiasmo e idealismo. Grandes amizades de infância se mantiveram em

São Paulo, como o Anselmo, Zuê, Juninho, Gustavo e Brito. Outras surgiram no ambiente da

Filô: Doidinho, Saulo, Winby, Peludo, Brunão, Fernandex, Leandrão e Carol, são

exemplos vivos de que há sempre um grupo de afinidade (e bebedeira) por onde quer que

passamos. E quando alguém de fora de Ribeirão me perguntar sobre o Pingüim, vou sempre

responder que você pelo preço de dois chopps, você pode tomar uma garrafa de Skol gelada

acompanhada de um

espetinho com farofa, mandioca e vinagrete no Bar do Silvão (e ainda

sobra umas moedas para tomar de pinga). E quando meus amigos contemporâneos (leia-se 30

anos) quiserem sair, vou dizer que no Geórgia há pessoas animadas da nossa idade e às

sextas sempre toca Pb Messias. Os companheiros da primeira república em Ribeirão,

André, Ricardo, Marcão, Nelsinho, Givanildo e Capiau serão sempre lembrados. Os anos

agradáveis dividindo apartamento, conversas científicas, não-científicas, bifes com

shoyu, feijão com linguiça, arroz queimado no fundo e um pouquinho de alface com o grande

amigo Sandro também nunca serão esquecidos. A forma como você, o amigo e companheiro

da noite Fábio Galetti e o mais novo amigo Matheus (Xuxa) me acolheram sua nova casa, me

mostra a cada dia que podemos realmente contar com os amigos (fiz uma média, hein

miguinhos?). Os apetitosos jantares temáticos com o septyteto, Gustavo e Alice, seu filho

João e nossos acompanhantes, também sempre me mostram o valor da amizade que dura ao

tempo. E esses “bares da vida” foram ocasiões onde tive o prazer de conhecer muitas

pessoas: Suzana (Med), Sirlei (RP), Carol (RP), Simone (FEA), Fabiana (JS), Isabela

(São Carlos), Juliana (Farma-71), Priscila (Farma-72), Karina (Farma-74), Daniela

(Farma-75), Denise (Chapinha), Camile (PG-Farma), Corinna, Drous (Filô), Loreal (Btu),

Calota (Btu), Thais (Psico), Érica (UNAERP), Shirlei (FeSBE), Pateta (Btu), Q (Btu),

Xakota (Btu), Ih-Fudeu (Btu), Christiane (Farmaco), Voltinha (Btu), Fabíola (Floripa),

Kelly (Btu).; e passar alguns momentos inesquecíveis com outras pessoas muito especiais:

Ana Luisa, Fabiani, Sueli, Jane, Karime, Célia, Elayne, Roberta (CCAA), Roberta (RJ),

Babete, Joana, Fernanda, Luciane, Fabíola, Luciana, Traíra, Carol, Andresa

(Piracicaba), Denise (Med), Paula, Valéria, Ana Lúcia, Alessandra (LT), Alessandra

(BT), Daniela e Giana.

Em alguns momentos da vida, o coração nos chama para uma conversa em particular.

Paula Carolina, eu lhe sou grato por mostrar que, independentemente do que passamos na

vida, é sempre possível gostar novamente. Desejo que você seja muito feliz. Daniele Aguiar,

você tem sido a surpresa boa e inesperada que me apóia nessa fase de tantas incertezas e

definições.

Minha família é o pilar que tem sustentado todo o peso do meu idealismo,

intransigências e das escolhas que fiz até o momento. Agradeço aos meus pais Adelino

Correia Nunes e Vera Lúcia de Sá Nunes pelo amor incondicional, por tudo que fizeram

por mim e pelos valores morais que aprendi (ou herdei) de vocês e que incorporei em minha

personalidade. Aos meus irmãos, Viviane Cristine de Sá Nunes e Alisson de Sá Nunes pela

união que a maturidade nos trouxe e por serem esses irmãos tão queridos que sempre me

perguntam “mas você gosta tanto de estudar, quando é que vai trabalhar?”. Minha sobrinha

Victória Cristina Nunes Gallindo, a coisa mais linda que existe, que me faz otimista e

acreditar num futuro melhor para esse mundo, apesar de todas as guerras e desigualdades.

Aos padrinhos, tios, tias, primos, primas e outros familiares, que são tantos que eu

necessitaria de outro volume somente para agradecer-lhes. E finalmente dedico essa tese

de doutorado que é a primeira de toda minha família, às minhas avós Máxima Correia Nunes

(

in memorian

) e Maria Gomes de Brito.

Este trabalho não poderia ter sido realizado sem o isolado clínico de

Histoplasma

capsulatum

cedido gentilmente pela Profa. Cláudia Maria Leite Maffei, sem a manutenção

da fase miceliana do fungo, realizado pela Marly de Castro, e sem os animais de altíssima

qualidade fornecidos pelo Júlio (Biotério do Depto de Genética da FMRP) e pelo biotério da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas, organizado pelo Irapuã. Devo o preparo dos cortes

histopatológicos a Ana Maria Rocha do laboratório do Prof. Édson Garcia Soares do

Depto de Patologia da FMRP e a análise do material ao amigo e Prof. Deilson Elgui de

Oliveira do Depto de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu. Muitos funcionários

também tornaram meu trabalho mais simples e menos cansativo; às técnicas Toninha e a

Tita (FCFRP) limpando os materiais usados, e os bioteristas dos biotérios de manutenção

da Imuno e da Farmácia, cuidando dos animais dos meus experimentos. Também foi

fundamental para minha manutenção a bolsa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado

de São Paulo - FAPESP (processo 00/01079-0) e a reserva técnica vinculada a bolsa, tão

preciosa para a compra de reagentes, materiais e financiamento das viagens aos congressos,

além dos auxílios da Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital

das Clínicas (FAEPA).

Essa tese, com exceção dos anexos, foi impressa em papel RECICLATO gramatura 75

g/m

, da Companhia Suzano de Papel e Celulose. Esse papel é o primeiro offset 100%

reciclado produzido em escala industrial no Brasil e pode ser comprado através do

telefone (16) 628-3038 ou em grandes papelarias.

SUMÁRIO

ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

CAPÍTULO 1:LINFÓCITOS, MACRÓFAGOS, CITOCINAS E ÓXIDO NÍTRICO NA

PROTEÇÃO CONTRA Histoplasma capsulatum - REVISÃO DA LITERATURA

1. Aspectos Gerais

2. Células e Proteção

3. Modulação da Resposta pelas Citocinas

4. Papel do Óxido Nítrico

Referências Bibliográficas

CAPÍTULO 2: USO DE EXOANTÍGENOS DE Histoplasma capsulatum NA INDUÇÃO

DE REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE DO TIPO TARDIA E NA

IMUNOPROTEÇÃO CONTRA A HISTOPLASMOSE

1. Introdução

2. Materiais e Métodos

3. Resultados

4. Discussão

5. Conclusões

Referências Bibliográficas

CAPÍTULO 3: PAPEL DOS EOSINÓFILOS NA HISTOPLASMOSE EXPERIMENTAL

MURINA

1. Introdução

2. Materiais e Métodos

3. Resultados

4. Discussão

5. Conclusões

Referências Bibliográficas

CAPÍTULO 4: PAPEL DOS NEUTRÓFILOS NA HISTOPLASMOSE EXPERIMENTAL

MURINA

1. Introdução

2. Materiais e Métodos

3. Resultados

4. Discussão

5. Conclusões

Referências Bibliográficas

124

129

130

ANEXOS

138

ABREVIATURAS

animal “knockout”: animal com disrupção em algum gene

ANOVA: análise de variância

BHI: infusão de coração e cérebro

BSA: albunina sérica bovina

Con A: concanavalina A

CSF: fator estimulador de colônia

CW/M: extrato de parede e membrana celular de Histoplasma capsulatum

: inóculo do fungo letal para 50% dos animais

ELISA: “enzyme-linked immunosorbent assay” (ensaio imuno-enzimático)

EPM: erro padrão da média

F1: fração polissacarídica da parede celular de H. capsulatum

FCFRP: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz

FMRP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

GM-CSF: fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos

GMS:”Grocott’s Methanemine Silver” (prata de Grocott)

HE: hematoxilina-eosina

HT: hipersensibilidade do tipo tardia

i.p.: intraperitonealmente

i.v.: intravenosamente

IFN-α, ...-β, ...-γ: interferon alfa, interferon beta, interferon gama

iNOS: óxido nítrico sintase induzível

interleucina-2, -4, -5, etc: IL-2; IL-4, IL-5, etc.

L-Arg: L-arginina

M-CSF: fator estimulador de colônia de macrófagos

N-MMA: NG-monometil L-Arg

nu/nu: camundongos congenitamente atímicos

PBS: salina tamponada com fosfato

RB6-8C5: anticorpo monoclonal anti-granulócitos

rHuIFN-γ: IFN-γ humano recombinante

rHuIL-2: IL-2 humana recombinante

RPMI-C: meio RPMI-completo

RPMI-I: meio RPMI-incompleto

Th1, Th2: T”helper” 1, T”helper” 2

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa

TNFR1

-/-

e TNFR2

-/-

: animais “knockout” para os genes dos receptores 1 e 2 do

TNF-α

TRFK-5: anticorpo monoclonal anti-IL-5

UFC: unidades formadoras de colônia

“A arte de concluir a partir da experiência e

observação consiste em avaliar probabilidades e

em estimar se elas são suficientemente elevadas

ou numerosas para constituírem prova. Esse tipo

de cálculo é mais complicado e mais difícil do

que se poderia pensar. Exige uma grande

sagacidade geralmente acima do poder das

pessoas comuns. O sucesso de charlatães,

feiticeiros e alquimistas - e de todos aqueles que

abusam da credulidade pública - está

fundamentado em erros nesse tipo de cálculo”.

Antoine Lavoisier

Resumo

RESUMO

A histoplasmose é uma doença crônica e granulomatosa, cujo

agente etiológico é o fungo dimórfico e zoopatogênico, Histoplasma

capsulatum. As vias aéreas superiores são sua porta de entrada nos mamíferos

e a inalação de microconídios leva a intensa reação inflamatória nos

bronquíolos e alvéolos pulmonares. Em pacientes imunocompetentes a

infecção é autolimitada e assintomática, mas em indivíduos

imunocomprometidos o fungo pode ou não se disseminar atingindo outros

órgãos, levando o paciente à morte.

A imunidade celular do hospedeiro determina o grau das

manifestações clínicas na histoplasmose, sendo a interação entre células T e

macrófagos, fundamental para o controle da infecção e erradicação do H.

capsulatum. Embora o papel efetor destas células na histoplasmose murina já

esteja bem determinado, ainda são escassas e contraditórias as evidências

quanto à participação das células polimorfonucleares, neutrófilos e eosinófilos,

nesta infecção. Outro aspecto relevante que vem sendo estudado é o

desenvolvimento de vacinas para o controle dessa doença. Embora diversos

estudos mostrem a viabilidade dessa abordagem, até o momento não existem

vacinas licenciadas contra a histoplasmose.

Nesse trabalho, inicialmente demonstramos que uma preparação

de exoantígenos de H. capsulatum é capaz de induzir intensa reação de

hipersensibilidade do tipo tardia em camundongos infectados. Esses antígenos

são capazes de avaliar o “status” imunológico desses animais tanto in vitro

quanto in vivo e quando usados como vacina, conferiram proteção total aos

animais infectados com inóculo letal do fungo. A participação de eosinófilos no

curso da infecção foi investigada através da neutralização da interleucina-5,

com o anticorpo monoclonal TRFK-5. Apesar desse anticorpo ser capaz de

inibir a migração de eosinófilos para a cavidade peritoneal induzida pela fração

polissacarídica da parede do H. capsulatum, a neutralização dessa citocina não

interferiu na sobrevivência nem na ativação da resposta imune celular dos

camundongos infectados. Finalmente, investigamos o papel dos neutrófilos

nessa infecção através da depleção dessas células pelo tratamento com o

anticorpo monoclonal RB6-8C5. Demonstramos que a ausência de neutrófilos

no início da infecção não muda o padrão de citocinas nem a polarização da

resposta, mas permite a exacerbação da infecção, com maior disseminação do

fungo e excessiva produção de IFN-γ, TNF-α e óxido nítrico.

Dessa forma, com esse trabalho, além de apresentarmos uma

ampla revisão da literatura sobre o papel dos linfócitos T CD4

, CD8

, células

NK, citocinas e do óxido nítrico nessa infecção, trazemos também importantes

contribuições quanto ao papel dos eosinófilos e neutrófilos na histoplasmose

experimental murina. Também descrevemos resultados empregando antígenos

com potencial para o desenvolvimento de vacinas contra essa infecção fúngica.

ABSTRACT

Histoplasmosis is a chronic and granulomatous disease caused by

the dimorphic and zoopathogenic fungus Histoplasma capsulatum. Infection

occurrs by upper airways and microconidia inhalation induces intense

inflammatory reaction into the bronquioles and lung alveoles. In

immunocompetent hosts the infection is autolimited and asymptomatic, but in

imunocompromised hosts the fungus can disseminate it or not, affecting other

organs and causing death.

The host cellular immunity determines the degree of clinical

manifestations of histoplasmose and the interaction between T cells and

macrophages is crucial for the control of infection and eradication of H.

capsulatum. If in one hand the effetor role of these cells in murine

histoplasmosis is determined, on the other hand the evidences for the role of

polymorphonuclear cells, neutrophils and eosinophils, in this infection are rare

and contradictory. Another relevant aspect studied is the vaccine development

to control this disease. Some works show the efficacy of this strategy but, until

the moment, it does not exist licensed vaccines against histoplasmosis.

In this work, we firstly demonstrated that a preparation of

exoantigens from H. capsulatum was able to induce intense delayed-type

hipersensitivity reaction in infected mice. These antigens were able to evaluate

the immunological status from these animals in both, in vitro and in vivo and to

confer protection against lethal inoculum of fungus in infected mice when used

as a vaccine. The participation of eosinophils was investigated by neutralization

of interleukin-5 with monoclonal antibody TRFK-5. Although this antibody has

been able to inhibit eosinophil migration to the peritoneal cavity induced by

polisacharidic fraction of cell wall from H. capsulatum, the neutralization of this

cytokine did interfere neither in survival nor in activation of cellular immune

response of infected mice. Finally, we also investigated the role of neutrophils in

histoplasmosis by neutrophil depletion using the monoclonal antibody RB6-8C5.

We demonstrated that the absence of neutrophils at the beginning of infection

did change neither the cytokine profile nor polarization of immune response, but

it permited exacerbation of infection, with fungal dissemination and over

production of IFN-γ, TNF-α and nitric oxide.

Thus, in the present work we presented a review showing the role

of CD4

and CD8

T cells, NK cells, cytokines and nitric oxide in histoplasmosis.

Addictionally, we demonstrated important contributions about the role of

eosinophils and neutrophils in murine experimental histoplasmosis. Also, we

described results using antigens with perspective to the development of

vaccines against this fungal infection.

“Antes de mais nada, aperfeiçoa a arte de

escutar, de prestar atenção, com o coração

quieto, com a alma receptiva, aberta, sem paixão,

sem desejo, sem preconceito, sem opinião”.

Herman Hesse

Capítulo 1

Linfócitos, macrófagos, citocinas e óxido nítrico na

proteção contra Histoplasma capsulatum:

Revisão da Literatura

1. ASPECTOS GERAIS

O patologista Samuel Darling foi o primeiro a descrever uma observação

microscópica do Histoplasma capsulatum há quase um século no Panamá

(DARLING, 1906). O nome foi baseado em sua presença no interior de

histiócitos (“Histo”), termo arcaico para macrófagos, sua semelhança a um

protozoário (“plasma”) e a presença aparente de uma cápsula (“capsulatum”).

Entretanto, apenas uma das três designações se mostrou verdadeira; de fato é

um patógeno intracelular de macrófagos, mas é um fungo e não é encapsulado.

O H. capsulatum é agente etiológico da histoplasmose, uma doença

crônica e granulomatosa de ampla distribuição pelo mundo. Este fungo possui

dimorfismo térmico, caracterizado pela forma miceliana quando à temperatura

ambiente (25

) e pela leveduriforme quando à temperatura corporal de seus

hospedeiros (37

) (SILVERMAN et al., 1955). A forma miceliana é composta por

conídios que são produzidos a partir das hifas do septo vegetativo. Os

macroconídeos possuem 8 a 9 μm, são esféricos e possuem uma extensa

parede celular revestida com finas protusões. Os microconídeos, de 2 a 5 μm,

são ovais e apresentam-se lisos quando analisados pela microscopia óptica

(GARRISON et al., 1970; GARRISON et al., 1971). A infecção é adquirida pela

inalação de fragmentos micelianos ou conidiais do fungo, encontrados no solo e

em fezes de aves e morcegos, que se alojam nos bronquíolos e alvéolos

pulmonares (ZHOU, 1997). Nestes locais, ocorre a conversão da forma

miceliana para a leveduriforme que induz uma série de eventos

imunopatológicos que se manifestam clinicamente como histoplasmose

(DEEPE, 1994). Uma vez estabelecida a infecção, ocorre um infiltrado de

células inflamatórias no local, constituído inicialmente de células

polimorfonucleares, seguido de células mononucleares e formação de

granulomas (DEEPE; BULLOCK, 1992, MEDEIROS et al., 1999). Na maioria

dos casos, a fase aguda da infecção resolve-se espontaneamente sem

sintomas ou com um quadro semelhante ao de uma gripe, demonstrando que

os mecanismos de defesa dos hospedeiros imunocompetentes controlam a

infecção (DEEPE, 1994). Entretanto, indivíduos imunocomprometidos e/ou com

a imunidade celular debilitada, desenvolvem uma doença crônica que pode ou

não se disseminar pela via hematogênica, atingindo outros órgãos como baço,

fígado, glândulas adrenais e sistema nervoso central (ZHOU, 1997).

2. CÉLULAS E PROTEÇÃO

O mecanismo de proteção do hospedeiro contra o H. capsulatum é

dependente da imunidade celular, modulada pelas citocinas produzidas durante

a resposta imune contra o fungo. Macrófagos e linfócitos T parecem ser

essenciais para o controle e erradicação da infecção pelo H. capsulatum. De

fato, há pelo menos duas décadas já se conhece a importância dos linfócitos na

histoplasmose murina. Camundongos congenitamente atímicos (nu/nu)

infectados com inóculo subletal de H. capsulatum desenvolvem uma infecção

disseminada e fatal, parcialmente contida quando esses animais recebem um

enxerto de tecido tímico (WILLIAMS et al., 1978). A transferência adotiva de

células totais de baço e de populações enriquecidas de linfócitos T derivados do

timo e de macrófagos da cavidade peritoneal de camundongos heterozigotos

(nu/+) imunizados com H. capsulatum, para camundongos nu/nu, confere

proteção a estes animais (WILLIAMS et al., 1981). Esses e outros estudos

levaram ao desenvolvimento e investigação de linhagens e clones de células T

antígeno-específicas, capazes de reconhecer antígenos de H. capsulatum, com

o objetivo de analisar as propriedades imunorregulatórias dessas células

(DEEPE et al., 1986a). Assim, demonstrou-se que essas células possuem um

fenótipo característico (Thy-1.2

Lyt-1

L3T4

Lyt-2

) de células T auxiliares (Th

– “T helper”), sendo capazes de proliferar e produzir citocinas como

interleucina-2 (IL-2) e interferon na presença do antígeno histoplasmina, além

de conferir resposta de hipersensibilidade do tipo tardia localmente quando

inoculadas com antígeno. Finalmente, o sobrenadante de cultura dessas células

estimuladas com antígeno também foi capaz de ativar macrófagos, inibindo o

crescimento intracelular de leveduras (DEEPE et al., 1986a). Estudos de

transferência adotiva dessas linhagens e de clones de células T antígeno-

específicas falhou em induzir proteção aos animais infectados, mas a

transferência de células CD4

provenientes de animais imunizados com H.

capsulatum para animais infectados, foi capaz de reduzir o número de unidades

formadoras de colônia (UFC) nos baços desses animais e transferir resposta de

hipersensibilidade do tipo tardia (DEEPE, 1988). A função das células CD4

(L3T4

) na histoplasmose também foi investigada através do tratamento de

animais infectados com anticorpos monoclonais contra essas células (anti-

L3T4

). Com esse tratamento a carga fúngica do baço aumentou e provocou a

morte de animais infectados com inóculo subletal do fungo, o que não ocorreu

com animais que não receberam esse anticorpo (GOMEZ et al., 1988).

Posteriormente, outros trabalhos mostraram que dentro da subpopulação de

células CD4

, células com rearranjos específicos do receptor de células T eram

as responsáveis pela proteção de camundongos infectados. Assim, identificou-

se que células CD4

com rearranjo Vβ4 eram as principais envolvidas na

imunidade protetora contra o fungo (GOMEZ et al., 1998) e que células com

rearranjo Vβ6 cooperam com essa função (GOMEZ et al., 2001).

Além das células CD4

, o papel das células CD8

na histoplasmose

também foi extensivamente estudado. DEEPE (1994), usando anticorpos

monoclonais contra essas células e também animais deficientes de β

microglobulina (e, portanto deficientes de células CD8

), demonstrou que essas

células são importantes para a contenção ótima do crescimento do fungo, mas

não são essenciais para a sobrevivência dos animais infectados. Entretanto, em

animais deficientes da molécula co-estimulatória ligante de CD40, a depleção

de células CD8

provocou a morte de camundongos infectados, o que não

ocorreu em animais deficientes que possuíam esse tipo de célula (ZHOU;

SEDER, 1998). O mesmo ocorreu quando as células CD8

foram depletadas de

animais deficientes de perforina, demonstrando que essas células podem

mediar a imunidade protetora contra o H. capsulatum através de mecanismos

dependentes e independentes de perforina (ZHOU et al., 2001). Finalmente,

também foi demonstrado que animais deficientes de células T CD4

são

capazes de desenvolver imunidade após infecção subletal com H. capsulatum,

mas nesse caso as células CD8

são necessárias tanto na fase de indução da

imunidade quanto na fase efetora da mesma (WÜTHRICH et al., 2003).

Embora seja atribuído importante papel na imunidade inata às células

matadoras naturais (NK), principalmente através de sua atividade citotóxica e

produção de citocinas como o interferon gama (IFN-γ), seu papel na

histoplasmose ainda é duvidoso. Animais que carregam a mutação “beige”

possuem atividade citotóxica de NK prejudicada e apresentam aumento da

susceptibilidade ao H. capsulatum em comparação com animais selvagens.

Entretanto, os macrófagos desses animais também têm sua função alterada,

não sendo possível atribuir às células NK um papel protetor nesse modelo

(PATINO et al., 1987). De fato, a depleção das células NK com anticorpo

monoclonal anti-asialo GM1 (ASGM1) em animais infectados com H.

capsulatum não alterou significativamente a recuperação de UFC nos diferentes

órgãos nem a mortalidade desses animais em comparação com animais que

não receberam esse anticorpo, sugerindo que as células NK não possuem

atividade relevante nesse tipo de infecção (SUCHYTA et al., 1988). Mas outros

trabalhos mostram que essa questão ainda não está completamente elucidada.

Células NK são encontradas no sítio inflamatório dos pulmões de animais

infectados intranasalmente com H. capsulatum e participam da produção de

IFN-γ, embora com participação menor do que as células CD4

e CD8

presentes nesse local (CAIN; DEEPE, 1998). Além disso, animais deficientes de

perforina são mais susceptíveis a infecção por H. capsulatum do que animais

selvagens (ZHOU et al., 2001). Esses trabalhos sugerem, portanto, que embora

não essenciais, as células NK podem participar de alguma forma da resposta

imune na histoplasmose.

3. MODULAÇÃO DA RESPOSTA PELAS CITOCINAS

A imunidade protetora na histoplasmose é um fenômeno complexo, uma

vez que além da participação de células, há ainda o papel dos mediadores

produzidos por elas durante a infecção. O desenvolvimento e regulação da

resposta imune são realizados por mediadores solúveis conhecidos como

citocinas. Citocinas são moléculas protéicas produzidas e secretadas por várias

células do hospedeiro, que podem agir de forma endócrina, parácrina ou

autócrina. Algumas citocinas também participam da resposta inflamatória e

granulomatosa, sendo sua liberação indiretamente responsável pela eliminação

dos microorganismos ou pela limitação de sua presença em um tecido

específico. Estudos sobre a liberação de citocinas em doenças micóticas vêm

sendo extensivamente explorados no sentido de avaliar as funções das

mesmas no recrutamento de células para o foco inflamatório, assim como seu

papel nos mecanismos de defesa do hospedeiro contra o H. capsulatum

(DEEPE, 1990; MURPHY, 1994). Neste contexto, os estudos mais consistentes

sobre o papel de citocinas na resposta imunológica contra o H. capsulatum

iniciaram-se na década de 80 do século passado. Inicialmente, demonstrou-se

que células de baço de camundongos infectados com H. capsulatum

apresentaram capacidade reduzida de produzir IL-1 e IL-2 quando estimuladas

com concanavalina A (Con A) nas 3 primeiras semanas de infecção, em

comparação com células de baço de animais controles (não infectados)

(WATSON et al., 1985). Como a supressão da resposta proliferativa e,

consequentemente, da imunidade celular nesse período de infecção era

atribuída a diminuição na produção de IL-2, DEEPE et al. (1986) tentaram

reestabelecer a resposta imune celular através do uso de IL-2 humana

recombinante (rHuIL-2) nesse modelo. Células de baço de camundongos

infectados, incubadas com Con A recuperaram a capacidade proliferativa na

presença de rHuIL-2 na terceira semana de infecção. Entretanto, o tratamento

dos animais infectados com essa citocina não alterou a recuperação de UFC no

baço nem afetou a resposta de hipersensibilidade tardia em relação aos

animais infectados que não receberam rHuIL-2. Assim, a despeito da atividade

imunoestimuladora in vitro, a IL-2 recombinante falhou em exercer efeitos

similares in vivo (DEEPE et al., 1986b). O IFN-γ foi a citocina que mudou

definitivamente o entendimento de como funciona a resposta imune protetora

durante a histoplasmose experimental murina. Paralelamente aos estudos

sobre o papel da IL-1 e IL-2, demonstrou-se que o sobrenadante de cultura de

hibridomas de células T estimulados com Con A continham uma linfocina capaz

de inibir o crescimento intracelular do H. capsulatum através da ativação de

macrófagos (WU-HSIEH et al., 1984). A mesma atividade foi observada quando

a linfocina era proveniente da cultura de células do baço de animais imunes

estimulados com antígeno de H. capsulatum (WU-HSIEH; HOWARD, 1984).

Em ambos os casos, os sobrenadantes possuíam atividade de interferon, sendo

pH ácido-sensíveis e resistentes ao calor, sugerindo tratar-se de IFN-γ, uma vez

que nem o IFN-α nem o IFN-β reproduziram tal fenômeno. Essa hipótese se

confirmou quando se demonstrou que anticorpos de coelho anti-IFN-γ murino

foram capazes de neutralizar a capacidade desses sobrenadantes em ativar

macrófagos para inibir o crescimento intracelular do fungo (WU-HSIEH;

HOWARD, 1987). Essa importante atividade do IFN-γ encontrada no modelo

murino foi questionada quando as células em questão eram humanas.

Macrófagos alveolares e peritoneais expostos in vitro ao IFN-γ recombinante

humano (rHuIFN-γ) em diferentes concentrações e por diferentes períodos de

tempo não foram capazes de inibir a multiplicação intracelular de leveduras de

H. capsulatum, indicando que rHuIFN-γ sozinho não é capaz de ativar

eficientemente macrófagos humanos contra o fungo (FLEISCHMANN et al.,

1990). Posteriormente demonstrou-se que para completa ativação de

macrófagos esplênicos murinos, os quais são mais exigentes nesse aspecto, foi

necessária a participação de LPS, sugerindo que células humanas talvez

também necessitem de um segundo fator para sua completa ativação (LANE et

al., 1993). Mas o grande salto na pesquisa sobre o papel das citocinas na

histoplasmose veio com o desenvolvimento e uso de anticorpos monoclonais

contra essas citocinas e também de animais que possuíam uma disrupção nos

genes (“knockout”) que codificam essas citocinas. Nesse sentido, demonstrou-

se que camundongos infectados com H. capsulatum tratados com anticorpos

monoclonais contra IFN-γ apresentaram maior susceptibilidade à infecção do

que animais que receberam anticorpo irrelevante. O mesmo fenômeno foi

observado após administração de anticorpos monoclonais contra IL-12 e nesse

caso, o papel dessa citocina na proteção dos animais infectados também foi

mediado pelo IFN-γ (ZHOU et al., 1995). Posteriormente esses achados foram

confirmados em animais “knockout” para o gene do IFN-γ (ALLENDOERFER;

DEEPE, 1997; CLEMONS et al., 2000).

Outra citocina que apresenta importante função durante a resposta

imunológica contra o H. capsulatum é o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).

Inicialmente demonstrou-se que o sobrenadante de cultura de macrófagos

peritoneais incubados com H. capsulatum apresentaram altos níveis de TNF-α.

O perfil tempo-dependente da produção dessa citocina in vitro reproduziu-se in

vivo no fluido do lavado broncoalveolar de animais infectados intranasalmente

com H. capsulatum (SMITH et al., 1990). Além disso, diversos trabalhos

demonstraram que animais infectados com o fungo e tratados com anticorpo

anti-TNF-α apresentaram mortalidade acelerada e aumento da carga fúngica

recuperada dos órgãos (SMITH et al., 1990; WU-HSIEH et al., 1992; WU-

HSIEH, 1993). O papel do TNF-α foi expandido ainda mais quando se

descobriu que esta citocina também era importante na resposta imune

secundária contra o H. capsulatum (ALLENDOERFER; DEEPE, 1998). No

mesmo ano mostrou-se que, mais do que importante, o TNF-α é essencial

durante a resposta imune secundária na histoplasmose, principalmente na

ausência de IFN-γ (ZHOU et al., 1998). Animais “knockout” para os genes dos

receptores 1 e 2 do TNF-α (TNFR1

-/-

e TNFR2

-/-

) infectados com H. capsulatum

também apresentaram aumento de mortalidade em relação a animais

selvagens, reforçando a importância dessa citocina. Além disso, animais

TNFR1

-/-

foram mais susceptíveis a infecção do que animais TNFR2

-/-

, além de

mostrarem-se também susceptíveis à infecção secundária, sugerindo ser este o

receptor de TNF-α responsável pela maior parte dos efeitos protetores dessa

citocina (ALLENDOERFER; DEEPE, 2000).

O papel de outras citocinas na histoplasmose também foi estudado.

Fatores estimuladores de colônia (CSFs) foram capazes de estimular atividade

fungistática, mas não fungicida, de monócitos humanos in vitro contra leveduras

de H. capsulatum (NEWMAN; GOOTEE, 1992). Contraditoriamente, o fator

estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) foi capaz de estimular a

atividade fungicida de macrófagos residentes contra leveduras de H.

capsulatum (BRUMMER; STEVENS, 1994). Macrófagos broncoalveolares

provenientes de animais tratados in vivo com M-CSF também apresentaram

atividade fungicida ex-vivo, embora essa atividade não tenha sido verificada nos

macrófagos peritoneais provenientes dos mesmos animais (KHEMANI et al.,

1995). A questão foi definitivamente fechada, pelo menos no modelo murino

quando se demonstrou que o tratamento de camundongos infectados com

anticorpo monoclonal anti-fator estimulador de colônias de granulócitos e

macrófagos (anti-GM-CSF) aumenta a mortalidade dos mesmos comparados

aos animais que não receberam esse anticorpo. Entretando o GM-CSF foi

importante somente para a imunidade protetora na infecção primária, não

exercendo nenhum papel na infecção secundária (DEEPE et al., 1999).

Algumas citocinas do padrão T”helper” 2 (Th2) também participam da

resposta imune contra o H. capsulatum, inibindo os efeitos das citocinas do

padrão Th1. Assim, um efeito protetor semelhante ao descrito após

administração de IL-12 recombinante também foi observado em animais

infectados com H. capsulatum que receberam anticorpos monoclonais contra

IL-4 (ZHOU et al., 1995). O aumento da mortalidade observado durante a

infecção em animais depletados de GM-CSF foi revertido quando esses animais

receberam simultaneamente anticorpos contra IL-4, ou contra IL-10 ou ambos

os anticorpos (DEEPE et al., 1999). Recentemente também se demonstrou que

animais transgênicos, apresentando expressão aumentada de IL-4 tiveram

maior dificuldade em conter a multiplicação do fungo, mas ainda assim foram

capazes de montar resposta imune protetora (GILDEA et al., 2003). Também,

animais “knockout” para a IL-10, apresentaram diminuição na carga fúngica

recuperada dos órgãos em comparação com os animais selvagens e esse

efeito protetor foi mediado por IFN-γ e TNF-α (DEEPE; GIBBONS, 2003).

4. PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO

Embora as citocinas participem da geração e da manutenção da

imunidade na histoplasmose, aparentemente o mecanismo pelo qual as

mesmas atuam é convergente e parece estar relacionado com a produção de

espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sendo o óxido nítrico o mais

importante. Quando se demonstrou que macrófagos da linhagem RAW 264.7

pré-tratados com IFN-γ recombinante foram capazes de inibir o crescimento

intracelular de H. capsulatum, verificou-se que essa atividade fungicida era

dependente do metabolismo de L-arginina (L-Arg) e que durante esse processo

houve aumento nos níveis de NO

. Na ausência desse aminoácido ou na

presença de NG-monometil L-Arg (N-MMA), um inibidor competitivo do

metabolismo da L-Arg, a atividade fungicida dessas células não ocorreu e os

níveis de NO

mantiveram-se basais (NAKAMURA et al., 1994). No mesmo

ano, demonstrou-se que após a estimulação das células dessa mesma

linhagem com IFN-γ recombinante, houve geração de óxido nítrico e também

aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e que a

linhagem de macrófagos P388D1 tratada com IFN-γ, não produziu óxido nítrico,

não apresentou expressão de iNOS nem foi capaz de conter o crescimento de

H. capsulatum (LANE et al., 1994). Resultados semelhantes foram encontrados

quando foram utilizados macrófagos broncoalveolares e peritoneais, onde a

atividade fungicida in vitro dessas células, quando estimuladas por IFN-γ + LPS,

foi bloqueada pelo N-MMA, mas não pelas enzimas catalase ou superóxido

dismutase (BRUMMER; STEVENS, 1995).

O mesmo N-MMA, capaz de inibir a atividade fungicida de macrófagos

broncoalveolares ativados por IFN-γ ou LPS, não foi eficiente quando essas

células foram ativadas por M-CSF, sugerindo um mecanismo adicional e

alternativo através do qual os macrófagos são capazes de matar o H.

capsulatum (KHEMANI et al., 1995). No mesmo ano demonstrou-se que a

enzima superóxido dismutase foi capaz de inibir a atividade fungicida de

macrófagos humanos ativados com M-CSF, sugerindo que o ânion superóxido

poderia ser essa molécula alternativa (DESAI et al., 1995).

O óxido nítrico também possui outras atividades sobre o sistema imune,

nem sempre positivas. A supressão da atividade linfoproliferativa de células do

baço de animais infectados nas primeiras semanas de infecção por H.

capsulatum (WATSON et al., 1985; DEEPE, et al., 1986) é uma conseqüência

da produção de óxido nítrico. A adição de um inibidor de óxido nítrico às

culturas de células de baço reverteu por completo a inibição da proliferação

induzida por mitógeno (ZHOU et al., 1995). Macrófagos do baço de

camundongos infectados com H. capsulatum expressam iNOS em grandes

quantidades e essa expressão se correlaciona com a severidade da infecção.

Além da atividade anti-linfoproliferativa do óxido nítrico, foi demonstrado que

essa molécula também é capaz de induzir apoptose em linfócitos do baço em

animais infectados com H. capsulatum. A responsividade dessas células a

mitógenos ou antígenos do fungo foi restaurada in vitro pela adição de N-MMA,

ou pela depleção de macrófagos ou ainda pela substituição dos macrófagos dos

animais infectados por outros provenientes de camundongos normais. Esses

dados confirmam o papel dos macrófagos e do óxido nítrico não somente na

proteção dos animais infectados, mas também na patologia estabelecida pelo

excesso de produção dessa molécula (WU-HSIEH et al., 1998).

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required for primary immunity to Histoplasma capsulatum. The Journal of

Immunology, v. 166, p. 1968-74, 2001.

“Mas como encontrar o equilíbrio? O compositor

não sabe tocar todos os instrumentos que usa.

Quem toca os instrumentos não necessariamente

compõe. Mas para compor uma música (letra,

melodia, acompanhamento, arranjos) é

necessário que se conheça a essência das partes,

suas potencialidades e funções”.

“É essa visão holística de ciência que a

sociedade moderna perdeu. Hoje temos a

formação maciça de técnicos especializados que,

com suas visões estreitas e poderes crescentes,

comprometem a sobrevivência de nossa espécie.

E o culpado não é a ciência, mas a prática

científica inadequada”.

Gilson Luiz Volpato

em “Ciência: da Filosofia à Publicação”

Capítulo 2

Uso de exoantígenos de Histoplasma capsulatum

na indução de reações de hipersensibilidade do tipo

tardia e na imunoproteção contra a histoplasmose

1. INTRODUÇÃO

A infecção com o fungo dimórfico Histoplasma capsulatum varia de um

quadro assintomático leve até uma doença progressiva e disseminada. A

resistência ao H. capsulatum em mamíferos é dependente da resposta imune

celular, mediada por células T CD4

e CD8

e fagócitos mononucleares (WU-

HSIEH; HOWARD, 1984; DEEPE, 1994; GOMEZ et al., 1988; GOMEZ et al.,

2001; WÜTHRICH et al., 2003). As células T em particular possuem um

importante papel no controle da doença que se correlaciona com a produção de

citocinas, especialmente interferon gama (IFN-γ), uma citocina chave envolvida

na resposta imune protetora contra o H. capsulatum em camundongos (ZHOU

et al., 1995; ALLENDOERFER & DEEPE, 1997; ZHOU et al., 1998).

A reação de hipersensibilidade do tipo tardia (HT) é importante parâmetro

da exposição prévia a um microorganismo e é usada para avaliar a intensidade

da resposta imune celular do hospedeiro contra uma grande variedade de

patógenos. Já foi demonstrado que células T CD4

reativas contra H.

capsulatum participam da reação de HT induzidas em camundongos (DEEPE et

al., 1986). Há alguns anos, STANDARD e KAUFMAN (1976 e 1977) produziram

extratos de H. capsulatum e Coccidioidis immitis, em solução aquosa de

mertiolate, diretamente a partir de culturas em ágar. Reações desses extratos

contendo antígenos livres de células (exoantígenos) com soro-padrão foram

capazes de diagnosticar essas micoses. Além disso, CAMARGO et al. (1991)

usaram uma preparação semelhante em testes sorológicos para o

imunodiagnóstico da paracoccidioidomicose. Desde então, alguns antígenos

foram testados com o mesmo propósito (FAVA et al., 1997; HAMILTON, 1998),

mas seu preparo e padronização envolvem fases demoradas e muitas vezes

caras. Os exoantígenos, entretanto, preparados de forma simples e rápida

nunca foram testados para a avaliação da resposta imune celular na

histoplasmose.

Muitas vacinas contra doenças humanas bacterianas e virais foram

licenciadas, mas até o presente momento não há vacinas licenciadas para

prevenção ou tratamento de infecções fúngicas humanas. A vacinação é capaz

de proteger contra uma série de fungos em modelos experimentais de Candida

albicans (HAN et al., 1999), Cryptococcus neoformans (MANDEL et al., 2000;

LEVITZ et al., 2001), Aspergillus fumigatus (RICHARD et al., 1982),

Blastomyces dermatitides (WÜTHRICH et al., 1998) e Coccidioides immitis

(KIRKLAND et al., 1998; LI et al., 2001). O grupo do pesquisador George Deepe

(University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, Ohio) conduziu uma

série de estudos para identificar imunógenos protetores de H. capsulatum para

o desenvolvimento de vacinas. Estes estudos apresentaram alguns antígenos

promissores como o extrato de parede e membrana celular (CW/M) da fase

leveduriforme, assim como proteínas isoladas da mesma, HIS-62 e HIS-80 que

são homólogas às proteínas de choque térmico (HSP) 60 e 70, respectivamente

(GOMEZ et al., 1991a; GOMEZ et al., 1991b; GOMEZ et al., 1992) e antígeno H

recombinante (DEEPE 1995 e 2001).

Assim, no presente trabalho, tivemos como objetivos:

- padronizar a produção dos exoantígenos de H. capsulatum para a

indução de reações de HT em camundongos infectados com esse fungo;

- comparar a reação de HT induzida pelos exoantígenos com a reação

induzida pela histoplasmina, verificando se há indução de reação

inespecífica em animais controles;

- determinar a capacidade dos exoantígenos de estimular a produção de

IFN-γ por células totais de baço in vitro

- desenvolver um protocolo de vacinação com os exoantígenos, capaz de

induzir resposta imune protetora contra o H. capsulatum em

camundongos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 machos, pesando

entre 15-21 gramas, provenientes do Biotério de Camundongos Isogênicos do

Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

(FMRP) e do Biotério II da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão

Preto (FCFRP). Esses animais foram mantidos no biotério do Departamento de

Bioquímica e Imunologia da FMRP, com livre acesso a água e alimento.

2.2. Cultivo e obtenção das leveduras de H. capsulatum

A cepa de H. capsulatum usada nesse trabalho foi isolada a partir do

sangue de um paciente com diagnóstico de histoplasmose, acompanhado

clinicamente no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo. Para obtenção de leveduras, os fungos

foram convertidos a partir da forma miceliana através do cultivo a 37

C em meio

sólido Müeller-Hinton-gema de ovo contendo, Caldo Müeller-Hinton (2,1%), ágar

(1,3%), dextrose (2%), L-cisteína (solução 1%) e 15 mL de gema de ovo para

cada 100 mL do meio. Após 10-14 dias de cultivo nesse meio, alíquotas do

fungo foram transferidas para um erlenmeyer contendo 50 mL de meio líquido

F-12 (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.) e incubadas por 3-5 dias sob agitação

(agitador orbital a 150 rpm) a 37°C (KLIMPEL; GOLDMAN, 1987). Alíquotas

desta amostra foram submetidas ao teste de viabilidade com diacetato de

fluoresceína e brometo de etídio (CORRÊA et al., 1990). Para efeito de

infecção, somente as culturas cuja viabilidade foi igual ou superior a 90% foram

utilizadas.

Para determinar a dose letal 50% (DL

), camundongos foram infectados

intravenosamente (i.v.) com 5 diferentes inóculos de H. capsulatum (variando

de 2.5×10

a 4×10

leveduras viáveis em um volume de 100 μL de PBS) e a

mortalidade de cada um dos grupos foi acompanhada diariamente por um

período de 90 dias. Animais controles, inoculados com o mesmo volume de

PBS foram incluídos em cada experimento. DL

dos períodos de 30, 45 e 60

dias de infecção foram calculadas através do Programa “Moving Average

Interpolation” (WELKOS; O’BRIEN, 1994).

Baseados nesses dados foram realizadas dois tipos de infecções para os

experimentos seguintes. A primeira, subletal, para gerar camundongos imunes

através da infecção i.v. com 5 × 10

leveduras. Com esse inóculo, não são

detectadas leveduras no baço ou no pulmão desses animais 60 dias após a

infecção. Na segunda, letal, camundongos foram infectados i.v. com 10

leveduras e a mortalidade foi avaliada em outros ensaios descritos a seguir.

2.3. Produção de exoantígenos

Os exoantígenos de H. capsulatum foram produzidos adaptando-se uma

metodologia já utilizada para Paracoccidioides brasiliensis (CAMARGO et al.,

1991). O H. capsulatum foi cultivado durante 10-15 dias e então 300 mg de

massa do fungo foram adicionados em 1mL de PBS. Essa suspensão foi

agitada em vórtex por 30 segundos e imediatamente centrifugada a 10.000 g. O

sobrenadante resultante, contendo os exoantígenos, foi coletado e armazenado

para dosagem de proteínas através do kit “Coomassie Protein Assay Reagent”

(Pierce, Rockford, Illinois).

2.4. Avaliação da reação de hipersensibilidade tardia em

camundongos infectados com H. capsulatum

Animais imunes, infectados subletalmente (5×10

leveduras i.v.),

receberam 0,2; 1 e 5 μg de exoantígeno em 50 μL no coxim plantar da pata

traseira esquerda. O resultado foi avaliado através da diferença entre a medida

da espessura da pata antes do desafio e 24 horas após o mesmo. Animais

controles (não-imunizados) receberam somente o inóculo de 5 μg/pata para

avaliar uma possível reação inespecífica do exoantígeno. A mensuração foi

realizada com um paquímetro para patas (Mitutoyo, Kawasaki, Japão).

A resposta de HT de animais imunes, infectados subletalmente, ao

exoantígeno foi comparada com a resposta induzida pela histoplasmina, o

antígeno clássico obtido de filtrado de cultura. Esse antígeno foi doado pela

Dra. Rosely Zancopé de Oliveira do Serviço de Micologia do “Instituto de

Pesquisa Clínica Evandro Chagas” – FIOCRUZ – RJ. Animais imunes

receberam 50 μL de histoplasmina numa diluição ótima de 1:50 e a

mensuração da reação de HT foi realizada como descrito acima.

Para avaliar a aquisição de reatividade aos exoantígenos (5μg/pata)

durante a infecção, grupos de 5 camundongos foram infectados i.v. com 5×10

5×10

e 10

leveduras de H. capsulatum e o desenvolvimento da imunidade

celular in vivo foi acompanhada através da reação de HT após 7, 15 e 30 dias

de infecção. Animais controles (não-infectados) receberam o mesmo inóculo

para avaliar reações inespecíficas produzida pelo inóculo.

Animais vacinados com exoantígenos (conforme descrito no item 2.6)

também foram desafiados com 5 μg dos exoantígenos em 50 μL no coxim

plantar da pata esquerda e com o mesmo volume de histoplasmina (1:50) no

coxim plantar da pata direita. O resultado foi avaliado como descrito acima.

2.5. SDS-PAGE do exoantígeno

Dez microgramas de exoantígeno foram submetidos a eletroforese em

gel de poliacrilamida 12% e corados por 5 minutos com Coomassie brilliant blue

0,15% (Sigma, St Louis, Mo.).

2.6. Imunização com exoantígenos de H. capsulatum e ensaio de

sobrevivência

Animais foram imunizados com os exoantígenos de acordo com o

seguinte protocolo: 50 μg de exoantígeno emulsificado em adjuvante completo

de Freund (v/v) subcutaneamente na primeira semana e 50 μg de exoantígeno

emulsificado em adjuvante incompleto de Freund (v/v) subcutaneamente na

segunda semana. Após 15 dias da segunda imunização, receberam um reforço

i.v. de 5 μg de exoantígeno em 100 μL de PBS estéril. Após 3 dias foram

infectados com 10

leveduras de H. capsulatum (inoculo letal). Um grupo foi

submetido ao mesmo procedimento, recebendo a mesma quantidade de

albumina sérica bovina (BSA) e como controle da infecção, outro grupo foi

apenas infectado com H. capsulatum. A sobrevivência foi acompanhada

diariamente durante 60 dias.

2.7. Recuperação de unidades formadores de colônia (UFC) do baço

e dos pulmões de animais infectados ou vacinados e infectados com H.

capsulatum

Animais infectados (não-imunizados, imunizados com exoantígeno ou

que receberam BSA) foram sacrificados após 7, 15 e 30 dias de infecção e

tiveram o baço e os pulmões retirados e pesados. A suspensão de células dos

baços foi obtida através de homogeneização do órgão em 5 mL de RPMI-

completo (RPMI-C: meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal

bovino, 2 mM de L-glutamina, 40 μg/mL de gentamicina, 20mM Hepes, 2,5x10

-5

M de 2-mercaptoetanol) em peneiras de nylon. Essas suspensões foram

diluídas (1:100 e 1:500) e, para recuperação das UFC, 200 μL foram

distribuídos em placas de Petri contendo meio BHI-agar suplementado com 5%

de hemácias de carneiro, em duplicata para cada baço. Após 15 dias de cultivo

a 37

C, o número de colônias foi contado e o valor corrigido para UFC por

grama de tecido.

Os pulmões foram cortados em pequenos fragmentos, colocados em

tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de meio RPMI incompleto (RPMI-I)

acrescido de solução de liberase (0,5 μg/mL) e incubados a 37

C, durante 30

minutos, sob agitação. Decorrido o tempo de incubação, a dispersão das

células pulmonares foi realizada com o auxílio de uma seringa de 10 mL. A

suspensão contendo as células e os fragmentos de pulmão foi centrifugada a

400 g, durante 5 minutos, e o precipitado foi ressuspendido em 5 mL de meio

RPMI-C para bloquear a ação da liberase. Diluições apropriadas foram feitas

(1:100 e 1:500) e a recuperação de UFC foi realizada de maneira semelhante à

descrita para o baço. Alíquotas de 200 μl foram retiradas para o ensaio de

recuperação de UFC, em duplicata para cada pulmão. Após 15 dias de cultivo a

C, o número de colônias foi contado e o valor corrigido para UFC por grama

de tecido.

2.8. Detecção de IFN-γ produzido por células totais de baço de

animais imunes, após seis meses de infecção

Células totais de baço de animais imunes, infectados subletalmente

(5×10

leveduras i.v.) seis meses antes e que não apresentavam mais UFC

detectáveis em seu organismo, foram utilizadas em ensaio de estímulo de in

vitro com exoantígenos e concanavalina A (Con A). Células de baço de animais

não infectados de mesma idade foram usadas como controle. Os baços dos

animais foram coletados e homogeneizados em 5 mL de RPMI-C. Após a lise das

hemácias, as células foram lavadas 3 vezes em RPMI-C e ressuspendidas em 1

mL do mesmo meio. A suspensão celular foi acertada para 5x10

células/mL e

distribuída em placas de 96 poços, em volume de 100 μL/poço, em duplicata. As

células foram incubadas in vitro com 100 μL/poço de RPMI-C somente e

exoantígenos (50 μg/mL) ou Con A (4 μg/mL) diluídos em RPMI-C. Após 72 horas,

as placas foram centrifugadas, os sobrenadantes de cultura coletados e estocados

a -70

C até o momento do ensaio.

Os níveis de IFN-γ foram quantificados através de Ensaio Imuno-

enzimático (ELISA). Anticorpos de captura foram diluídos em tampão carbonato

(100 µL/poço) e após incubação das placas durante uma noite à 4°C, as

mesmas foram lavadas 3 vezes com solução tamponada com fosfato contendo

0,05% de Tween (tampão de lavagem). Após as sucessivas lavagens e

secagem da placa, foi realizada a reação de bloqueio adicionando 300 µL/poço

de uma solução tamponada com fosfato contendo 1% de soro fetal bovino,

seguido de incubação à temperatura ambiente pelo período mínimo de 1 hora.

Após o bloqueio, os poços foram novamente lavados 3 vezes com o tampão de

lavagem, e então adicionados 100 μL das amostras para a quantificação da

citocina. A curva-padrão realizada com IFN-γ recombinante (Pharmingen, San

Diego, CA) variou de 9,6 a 2500 pg/mL. Após nova incubação de uma noite à

4°C, foi repetido o procedimento de lavagem e adicionado 100 μL/poço dos

anticorpos de detecção anti-IFN-γ biotinilados, diluídos em tampão de bloqueio

com 0,05 % de Tween durante 2 horas. Após a incubação foi repetido novo

ciclo de lavagem, e em seguida feita a amplificação da reação pela adição de

100 µL/poço de estreptoavidina/biotina, diluída em tampão de bloqueio com

0,05% de Tween, na concentração de 1,25 mg/mL. Após incubação por 60

minutos à temperatura ambiente foi adicionado 100 μL/poço da solução de

substrato (OPD), seguido de 20-30 minutos de incubação à temperatura

ambiente. A reação foi bloqueada adicionando 50 µl/poço de ácido sulfúrico

(1M) e a densidade óptica dos poços determinada em leitor de placas, usando

filtro de 490 nm.

2.9. Análise estatística dos resultados

A análise estatística das diferenças entre as médias dos grupos

experimentais foi feita utilizando-se análise de variância (ANOVA) e teste t de

Student, com significância mínima estabelecida em P<0,05. Os dados estão

apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Dados de

sobrevivência foram analisados usando o teste log-rank.

3. RESULTADOS

3.1. DL

da cepa de H. capsulatum

Como a cepa de H. capsulatum usada nesse trabalho foi isolada de

paciente e ainda não está caracterizada, nós determinamos sua DL

de 30, 45

e 60 dias para a infecção intravenosa. A sobrevivência dos camundongos

infectados com diferentes inóculos de H. capsulatum (de 2.5×10

a 4×10

leveduras) está apresentada na Figura 1. Animais infectados com 2×10

4×10

leveduras apresentaram uma curva de mortalidade progressiva à partir

do 18

dia de infecção, atingindo 100% de morte após 42 e 32 dias

respectivamente. Parte dos animais do grupo infectado com 1x10

leveduras

morreu no 22

dia de infecção (20%). Outra parte morreu entre o 52

e o 59

dia

de infecção (60%) e somente 20% dos animais sobreviveu até o final do

período de avaliação (90 dias). Não foram observadas mortes no grupo

infectado com 5x10

leveduras até o 48

dia de infecção, quando 40% dos

animais morreram. Os demais (60%) sobreviveram até o final do período

observado. No grupo infectado com 1×10

leveduras todos os animais

sobreviveram. Partindo desses dados, calculamos a DL50 teórica de 30, 45 e

60 dias de infecção (×10

leveduras): 1,68±0,14; 1,23±0,06 e 0,62±0,09,

respectivamente. Os experimentos subseqüentes usaram inóculos baseados

nesses resultados.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

2.5 x 10

5 x 10

1 x 10

2 x 10

4 x 10

Dias após infecção

Sobrevivência (%)

Figura 1. Perfis de sobrevivência de camundongos C57BL/6 infectados i.v. com

diferentes inóculos de leveduras viáveis de H. capsulatum. Camundongos com

18-20 gramas receberam inóculos de 2.5×10

a 4×10

leveduras e tiveram sua

sobrevivência acompanhada diariamente por 90 dias. (n=5)

3.2. Padronização da reação de HT e caracterização eletroforética

dos exoantígenos de H. capsulatum

Os exoantígenos foram produzidos a partir de culturas de H. capsulatum,

conforme descrito em materiais e métodos. Realizamos um estudo para

determinar a quantidade ideal dos exoantígenos capaz de induzir uma resposta

adequada nos ensaios de HT em animais imunes. Animais infectados

intravenosamente com uma dose subletal de H. capsulatum (5×10

leveduras)

foram utilizados para os ensaios, após 60 dias de infecção. Animais controles

não-infectados foram utilizados para avaliação de reações inespecíficas aos

exoantígenos.

O aumento da espessura da pata observado 24 horas após o inóculo é

demonstrado na Figura 2. Os exoantígenos induziram aumento dose-

dependente na espessura da pata. Nesses animais, o inóculo de 0,2 μg/pata

não produziu resposta significativa (0,03 ± 0,01 mm). Já nos animais que

receberam 1 μg/pata, houve aumento significativo (P < 0,01) da espessura da

pata após 24 horas (0,25 ± 0,05 mm). Os animais que receberam 5 μg/pata

apresentaram um aumento ainda maior na espessura da pata (0,44 ± 0,18 mm).

Em animais controles (não-infectados/não imunes), o inóculo de 5 μg/pata de

exoantígeno não induziu aumento expressivo na espessura da pata após 24

horas (0,02 ± 0,02 mm). Valores menores do que 0,05 mm foram considerados

negativos na avaliação da reação de HT. Comparamos a reação de HT induzida

pelos exoantígenos com a reação induzida pela histoplasmina, utilizada em

uma diluição ótima de 1:50. Esse inóculo de histoplasmina induziu aumento

significativo (P < 0,01) na espessura da pata (0,23 ± 0,03 mm), embora esse

valor represente aproximadamente metade do valor encontrado nos animais

que receberam 5 μg/pata de exoantígeno (P < 0,01).

Uma vez determinada a quantidade ideal dos exoantígenos para indução

de reação de HT, utilizamos essa preparação para acompanhar o

desenvolvimento da imunidade celular in vivo, dos camundongos infectados

com diversos inóculos de H. capsulatum (Figura 3). Em todos os grupos

infectados, os resultados da reação de HT foram bastante semelhantes no 7

dias após a infecção. Entretanto, no 30

dia de infecção, os grupos

infectados com 5×10

e 5×10

leveduras apresentaram reação de HT

significativamente superior (0,24±0,19 e 0,25±0,1 mm, respectivamente - P <

0,05) a reação dos outros grupos. O grupo infectado com 10

leveduras

apresentou resposta semelhante aos dos controles (0,04±0,03 versus 0,02 ±

0,01 mm, respectivamente). Isso provavelmente deve-se ao fato desses

animais estarem com a imunidade suprimida nessa fase da infecção e coincide

com o período de maior mortalidade nesse grupo (80%).

Surpreendentemente, os exoantígenos também foram capazes de

discriminar o status imunológico individual dos animais infectados, antecipando

quais animais iriam morrer ou sobreviver à infecção. A Tabela 1 apresenta os

resultados individuais da reação de HT de animais infectados i.v. com 10

leveduras de H. capsulatum. Todos os 5 animais infectados cuja reação de HT

foi inferior a 0,1 mm morreram, enquanto os animais que apresentaram uma

reação superior a 0,1 mm sobreviveram até o final do período de observação.

Para comprovar que a diferença entre a reação de HT induzida pelos

exoantígenos e pela histoplasmina não foi um fenômeno decorrente da

quantidade insuficiente de histoplasmina utilizada, utilizamos um protocolo de

imunização com os exoantígenos (descrito em materiais e métodos) e testamos

a capacidade de ambos os antígenos induzirem reação de HT nesses animais.

A Figura 4 mostra que não houve diferença entre as reações induzidas pelos

exoantígenos em comparação com a histoplasmina (0,198±0.032 versus

0,18±0,033 mm, respectivamente) nesses animais.

Para caracterizar o perfil eletroforético do exoantígeno fizemos um SDS-

PAGE (12%). Pudemos perceber que a composição do exoantígeno é simples,

apresentando 5 bandas coradas mais fortemente com massas moleculares

aparentes de 80, 70, 57, 31 e 9-12 kDa (Figura 5).

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Exoantígeno 0.2 μg

Exoantígeno 1 μg

Exoantígeno 5 μg

Histoplasmina 1:50

Controle Imune

Grupos

Aumento de espessura da

pata (mm)

Figura 2. Reação de HT induzida pelos exoantígenos (0,2, 1 e 5 μg μg/pata) e

histoplasmina (diluição ótima de 1:50) em animais controles e imunes (60 dias

após infecção subletal com 5 × 10

leveduras de H. capsulatum). O resultado foi

avaliado através da diferença entre a espessura da pata antes do inóculo e 24

horas após o mesmo. *P < 0.001 versus respectivo controle (Exoantígeno 5μg

ou Histoplasmina 1:50);

P < 0.01 versus Exoantígeno 5 μg (n=5-8).

0 7 14 21 28

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Controle

5x10

1x10

Dias após infecção

Aumento de espessura

da pata (mm)

Figura 3. Cinética da reação de HT induzida pelos exoantígenos durante a

infecção com H. capsulatum. Animais não infectados (Controle) e infectados i.v.

com diferentes inóculos de leveduras H. capsulatum receberam 5 μg/50μL de

exoantígenos na pata após 7, 15 e 30 dias de infecção. O resultado foi avaliado

através da diferença entre a espessura da pata antes do inóculo e 24 horas

após o mesmo. *P < 0.01 versus Controle;

P < 0.05 versus 5×10

e 5×10

(n=5-

Tabela 1. Reação de HT individual, induzida pelos exoantígenos em

camundongos controles e infectados i.v. com 5×10

leveduras de H.

capsulatum.

Grupos Dias após infecção

7 15 28 60

Controle

0,05 0,00 0,06 0,00

0,05 0,00 0,03 0,05

0,00 0,04 0,05 0,00

0,02 0,06 0,00 0,03

0,03 0,05 0,06 0,01

Média ± EPM 0,018 ± 0,012 0,025 ± 0,015 0,040 ± 0,010 0,018±0,010

Infectados

0,12 0,12 0,37 0,58

0,02 0,09 0,06

Morreu

0,13 0,12 0,35 0,64

0,08 0,18 0,47 0,62

0,00

Morreu Morreu Morreu

0,11 0,08 0,26 0,60

0,08 0,03

Morreu Morreu

0,08 0,19 0,26 0,49

0,16 0,14 0,08

Morreu

0,09 0,06 0,09

Morreu

Média ± EPM 0,08 ± 0,02 0,11 ± 0,02 0,24 ± 0,05 0,59 ± 0,03

Camundongos receberam 5 μg/50 μL de exoantígenos por pata. O resultado foi

avaliado através da diferença entre a espessura da antes do inóculo e 24 horas após o

mesmo.

exoantígenos histoplasmina

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Aumento de espessura da

pata (mm)

Figura 4. Reação de HT induzida pelos exoantígenos ou histoplasmina em

animais imunizados com exoantígenos (conforme descrito em Materiais e

Métodos). Os animais receberam exoantígenos (5 μg) ou histoplasmina (1:50)

em 50μL por pata. O resultado foi avaliado através da diferença entre a

espessura da pata antes do inóculo e 24 horas após o mesmo. (n=5)

Figura 5. SDS-PAGE dos exoantígenos de H. capsulatum. As proteínas de uma

preparação de exoantígenos reduzidas com 2-mercaptoetanol foram separadas

em SDS-PAGE (12%). O gel foi corado pelo azul de Coomassie.

3.3. Proteção mediada pelos exoantígenos de H. capsulatum

Como os exoantígenos mostraram-se promissores durante as avaliações

das reações de HT, investigamos o potencial protetor dos mesmos em animais

infectados. Desenvolvemos um protocolo de vacinação empregando os

exoantígenos e infectamos os camundongos com 10

leveduras i.v., uma dose

superior a DL

de 60 dias. A sobrevivência dos animais foi acompanhada

durante 60 dias (Figura 6). Como houve 100% de proteção, não sendo

observadas mortes no grupo imunizado com os exoantígenos e infectado com

H. capsulatum, determinamos outros parâmetros imunológicos associados à

proteção. Realizamos a recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC)

do baço e pulmões de animais infectados com H. capsulatum, imunizados ou

não com exoantígenos e avaliamos a produção de IFN-γ por células totais do

baço durante o período de infecção.

A vacinação com os exoantígenos foi eficiente na indução de imunidade

protetora, resultando na diminuição da carga fúngica tanto no baço (Figura 7A)

quanto nos pulmões (Figura 7B) dos animais infectados, em comparação com

aqueles que receberam BSA ou que não receberam nada antes da infecção. No

baço dos animais vacinados, o número de UFC recuperadas foi

estatisticamente menor (P < 0,01) desde o 7

dia de infecção, sendo a maior

diferença (P < 0,001) observada no 30

após infecção, em comparação com os

dois outros grupos infectados. Nos pulmões dos animais vacinados, a

recuperação foi significativamente menor (P < 0,01) somente a partir do 15

dia

de infecção, sendo mantido o mesmo padrão até o final do período analisado.

No 30

dia de infecção, não determinamos a UFC no grupo infectado que não

recebeu nenhum tratamento prévio, pois a recuperação de UFC desse grupo foi

semelhante ao grupo que recebeu BSA no 7

e 15

dia de infecção.

Avaliamos também a produção de IFN-γ por células totais de baço

estimuladas com meio somente, com Con A (ativação policlonal) ou com

exoantígenos (ativação específica), após 7, 15 e 30 dias de infecção (Figura 8).

Na primeira semana de infecção, a produção de IFN-γ por células de baço de

animais infectados, incubadas com exoantígenos ou com Con A, esteve

suprimida em comparação com a produção dessa citocina por células de baço

provenientes de animais controles incubadas com Con A. No 15

dia após a

infecção, as células do baço dos animais infectados responderam ao estímulo

não específico (Con A) da mesma forma que o controle, demonstrando que

houve reversão da imunossupressão causada pela infecção. Somente as

células de baço de animais imunizados com exoantígenos foram capazes de

produzir quantidades significativas de IFN-γ quando estimuladas in vitro com

esses mesmos antígenos. No 30

dia de infecção, a produção de IFN-γ pelas

células do grupo infectado que recebeu BSA estimuladas com Con A, diminuiu

em relação ao 15

dia. Essa supressão coincidiu com o período de maior

mortalidade dos animais desse grupo. Nessa fase da infecção, as células de

baço de animais imunizados com exoantígeno não somente mantiveram a

produção de IFN-γ induzida pela Con A, como também foram capazes de

responder ao exoantígeno in vitro na mesma intensidade, produzindo níveis

semelhantes dessa citocina. Estes resultados possuem correlação direta com

os ensaios de sobrevivência apresentados na Figura 1.

Também avaliamos a produção de IFN-γ em células de baço de animais

imunes, após 6 meses de infecção, como uma forma de avaliar a resposta de

células de memória (Figura 9). Esses animais não apresentavam UFC

detectáveis no baço e no pulmão, indicando completa cura da infecção (dados

não mostrados). Mesmo após esse tempo, os exoantígenos foram capazes de

estimular células específicas de longa vida a produzirem IFN-γ em quantidades

equivalentes ao estímulo policlonal (Con A).

0 10 20 30 40 50 60

100

BSA + Hc

EXO + Hc

Dias após infecção

Sobrevivência (%)

Figura 6. Proteção contra inóculo letal de H. capsulatum mediada pelos

exoantígenos do fungo. Animais foram imunizados com EXO (Ο) ou receberam

BSA (▲ ) conforme descrito em Materiais e Métodos e desafiados i.v. com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum. Um grupo não imunizado e que não

recebeu BSA (g) foi infectado com o mesmo inóculo do fungo. A sobrevivência

foi acompanhada diariamente por 60 dias. (n=6)

71530

###

UFC/grama tecido (log

)

71530

BSA + Hc

EXO + Hc

Dias após infecção

UFC/grama tecido (log

)

Figura 7. Carga fúngica nos baços (A) e pulmões (B) de animais não-

imunizados (Hc), imunizados com exoantígeno (EXO+Hc) ou que receberam

BSA (BSA+Hc), desafiados com 10

leveduras de H. capsulatum. Nos períodos

indicados, os baços foram removidos, pesados e as UFC recuperadas. O

procedimento de imunização e recuperação foi realizado como descrito em

Materiais e Métodos. *P<0,05 e **P<0,01 versus Hc;

P < 0,05;

P < 0,01 e

###

P <

0,001 versus BSA + Hc. (n=4-5)

71530

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Controle (Con A)

BSA + Hc (Con A)

BSA + Hc (EXO)

EXO + Hc (Con A)

EXO + Hc (EXO)

Dias após infecção

IFN-

(pg/mL)

Figura 8. Produção de IFN-γ por células totais de baço de camundongos não-

imunizados e não-infectados (controle) e de animais imunizados com BSA (BSA +

Hc) ou com exoantígenos (EXO + Hc), infectados i.v. com 10

leveduras de H.

capsulatum. Nos períodos indicados, 5x10

células em 100 μL de RPMI-C foram

incubadas in vitro com o mesmo volume de meio contendo 0,4 μg de

Concanavalina A (Con A) ou 5 μg de exoantígenos (EXO). Após 72 horas de

incubação, os sobrenadantes foram coletados e a produção de IFN-γ determinada

por ELISA. *P<0,05 versus Controle;

P < 0,05 versus respectivo grupo estimulado

com Con A (n=3-5)

RPMI-C EXO Con A

25000

50000

75000

Controle

Imune

IFN-

(pg/mL)

Figura 9. Produção de IFN-γ por células totais de baço de camundongos não-

infectados (controle) e imunes (180 dias após infecção subletal com 5x10

leveduras de H. capsulatum). Baços dos animais foram retirados e 5x10

células

em 100 μL de RPMI-C foram incubadas in vitro com o mesmo volume de meio

contendo 0,4 μg de Concanavalina A (Con A) ou 5 μg de exoantígenos (EXO).

Após 72 horas de incubação, os sobrenadantes foram coletados e a produção de

IFN-γ determinada por ELISA. *P<0,001 versus respectivo RPMI-C;

P < 0,001

versus respectivo Controle. (n=3-5)

4. DISCUSSÃO

Testes intradérmicos usando histoplasmina, um antígeno filtrado de

natureza polissacarídica, são utilizados na clínica e a padronização de seu

preparo foi feito em 1945 (EMMONS et al., 1945). Entretanto, até hoje ninguém

havia testado exoantígenos de H. capsulatum, preparados de forma simples e

rápida, em reações de HT. A reação de HT é um importante parâmetro para

avaliação da exposição prévia de um indivíduo a uma série de infecções, sendo

também utilizada para avaliar a intensidade da resposta imune celular do

hospedeiro. No presente trabalho, inicialmente nós produzimos os exoantígenos

e o utilizamos para a padronização da reação de HT em camundongos

infectados com H. capsulatum. Além disso, comparamos a resposta desses

animais aos exoantígenos com a resposta induzida pela histoplasmina, nosso

controle positivo de reação de HT na histoplasmose. Assim, inicialmente nós

demonstramos a antigenicidade e imunogenicidade do exoantígeno no modelo

de histoplasmose sistêmica. Os resultados foram muito satisfatórios, sendo os

exoantígenos capazes de induzir intensa reação de HT em animais imunes,

aproximadamente duas vezes superior a da histoplasmina. Esse aumento foi

considerado extremamente significativo, superando inclusive resultados

descritos na literatura utilizando outras preparações para avaliação da reação

de HT (DEEPE, 1994; ALLENDOERFER; DEEPE, 1997). Outra vantagem

relevante do uso dos exoantígenos é que não foram observadas reações

inespecíficas nos animais controles (não-infectados). Adicionalmente, a reação

de HT induzida pelos exoantígenos foi capaz de indicar a cinética de

aumento/diminuição do “status” imunológico dos animais infectados. Quando

analisados individualmente, camundongos infectados que apresentaram

respostas negativas ou baixas (até 0,1 mm), morreram poucos dias após as

avaliações terem sido efetuadas. Por outro lado, camundongos infectados que

apresentaram respostas médias e altas (superiores a 0,1 mm) sobreviveram a

infecção. Dessa forma, os exoantígenos parecem ser mais eficientes do que a

histoplasmina na avaliação da resposta imune celular in vivo de animais

infectados com H. capsulatum.

A análise do perfil eletroforético dos exoantígenos revelados por análise

em SDS-PAGE revelaram a presença de pelo menos 5 bandas. A banda de

aproximadamente 80 kDa parece ser semelhante à isolada do extrato de

membrana e parece cellular (CW/M) de H. capsulatum. Esse antígeno, que

possui homologia com hsp 70, foi capaz de induzir resposta humoral e celular

em camundongos infectados com H. capsulatum (GOMEZ et al., 1992). A

banda de aproximadamente 70 kDa parece ser semelhante àquela detectada

no soro de pacientes com histoplasmose através de ELISA e Western blotting

(GOMEZ et al., 1997; GOMEZ et al., 1999). As outras três bandas possuem

massas moleculares aparentes de 57, 31 e 9-12 kDa. A natureza dos antígenos

do H. capsulatum que induzem resposta humoral ou mediada por células não

está totalmente esclarecida até o momento. O antígeno H, presente na

histoplasmina é reconhecido pelo soro de pacientes com histoplasmose

(HEINER, 1958) e deve ser um dos constituintes ativos no filtrado de cultura

capaz de induzir reação de HT em indivíduos expostos ao H. capsulatum

(REEVES et al., 1972; REEVES et al., 1974; PINE, 1977). É provável que haja

uma semelhança parcial nas bandas da histoplasmina e dos exoantígenos que

contribuem para a indução da reação de HT em animais infectados. Essa

possibilidade se confirma quando analisadas as reações de HT contra esses

antígenos em animais que foram imunizados com os exoantígenos. Nesses

animais, ao contrário dos animais infectados, a histoplasmina e os

exoantígenos foram capazes de induzir uma reação de HT de mesma

amplitude. Isso sugere que existem bandas compartilhadas entre as duas

preparações e que a diferença na reação de HT induzida em animais

imunizados pela infecção não são decorrentes da falta de antígenos na

preparação de histoplasmina. A maior ou menor amplitude da reação nesse

caso pode ser decorrente da diferença na geração dos epítopos reconhecidos

pelas células T em cada tipo de imunização.

A intensa resposta de HT induzida pelos exoantígenos nos estimulou a

avaliar a capacidade desses antígenos em gerar proteção nos animais

infectados, quando administrados na forma de vacina. Após sucessivos testes,

chegamos ao protocolo de vacinação descrito em Materiais e Métodos. Embora

diversas vacinas tenham sido licenciadas para uso contra doenças humanas

virais e bacterianas, até o momento nenhuma foi liberada para o tratamento ou

a prevenção de infecções fúngicas, embora as mesmas tenham se mostrado

eficientes contra uma série de modelos experimentais de doenças fúngicas

(RICHARD et al., 1982; KIRKLAND et al., 1998; WUTHRICH et al., 1998; HAN

et al., 1999; MANDEL et al., 2000; LEVITZ et al., 2001; LI et al., 2001). A

despeito do fato de as leveduras representarem a forma patogênica do H.

capsulatum, até 15 anos atrás a maioria dos trabalhos envolvendo resposta de

células T contra esse fungo tiveram como foco a histoplasmina, que é um

antígeno produzido pela fase miceliana do mesmo (DEEPE et al., 1986;

HARRIS et al., 1988; HARRIS et al., 1989). Mais recentemente, foram

conduzidos uma série de estudos para identificar imunógenos protetores

presentes em leveduras do H. capsulatum para o desenvolvimento de vacinas

contra a histoplasmose. Estes estudos apresentaram muitos antígenos

promissores, como CW/M de leveduras (GOMEZ et al., 1991a), as proteínas

isoladas desse antígeno HIS-62 and HIS-80 que são homólogas às hsp 60 and

70, respectivamente (GOMEZ et al., 1991b; GOMEZ et al., 1992) e antígeno H

recombinante (DEEPE, 1995 e 2001). Embora alguns destes tenham

apresentado resultados interessantes, sua completa eficácia depende da

linhagem de camundongos usada, da via de infecção e em alguns casos,

nenhum estudo de sobrevivência foi conduzido. Nós utilizamos o desafio

intravenoso por se tratar da via de infecção mais agressiva (DEEPE, 1993) e a

linhagem C57BL/6 por ser uma das linhagens susceptíveis a histoplasmose

(CHICK; ROBERTS, 1979; WU-HSIEH, 1989). Interessantemente, a imunização

com exoantígenos foi capaz de induzir uma imunidade protetora, reduzindo a

carga fúngica presente nos pulmões e nos baços e protegendo os

camundongos contra o inóculo letal de H. capsulatum. Também, camundongos

imunizados através de infecção subletal (que não apresentaram leveduras

detectáveis em seus órgãos após 60 dias), apresentaram potente reação de HT

aos exoantígenos. Além disso, as células de baço desses animais foram

capazes de produzir IFN-γ quando incubadas in vitro com exoantígenos,

mostrando que esses antígenos são capazes de estimular células específicas

de longa vida, provavelmente de memória. Essa citocina é fundamental durante

o curso da histoplasmose, sendo responsável pela ativação de macrófagos e

consequentemente pela imunidade protetora nessa infecção fúngica (ZHOU et

al., 1995; ALLENDOERFER; DEEPE, 1997; ZHOU et al., 1998).

Nessa primeira parte do trabalho, portanto, produzimos exoantígenos

para avaliação a reação de HT em camundongos infectados com H.

capsulatum. Estes antígenos não induziram reações inespecíficas nos testes

intradérmicos. Posteriormente, nós demonstramos a capacidade desses

antígenos em induzir a produção de IFN-γ por células de baço in vitro e a

proteção de camundongos infectados com o fungo. Isso sugere o potencial

desse antígeno na avaliação da resposta imune celular durante o curso da

infecção e como fonte de antígenos para o desenvolvimento de uma vacina

contra a histoplasmose.

5. CONCLUSÕES

Concluímos com esse trabalho que os exoantígenos produzidos a partir de

leveduras de H. capsulatum:

- são capazes de induzir intensa reação de HT em camundongos

infectados com o fungo, superior à reação induzida pela histoplasmina;

- são capazes de avaliar o “status” imunológico dos animais infectados;

- não induzem reações inespecíficas em animais não infectados;

- estimulam células totais de baço de camundongos infectados a

produzirem IFN-γ in vitro;

- induzem proteção em animais infectados com dose letal do fungo,

quando administrados na forma de vacina.

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role in maintaining secondary immunity in the absence of IFN-γ. The Journal of

Immunology, v. 160, p. 1359-68, 1998.

“Toda vez que um trabalho científico apresenta

um conjunto de dados, ele é acompanhado por

uma barra de erro – uma lembrança silenciosa,

porém insistente de que nenhum conhecimento é

completo ou perfeito”.

Carl Sagan

Capítulo 3

Papel dos eosinófilos na

histoplasmose experimental murina

1. INTRODUÇÃO

Eosinófilos são células que foram observadas pela primeira vez por

Warton Jones em 1846 em preparações não coradas de sangue periférico, mas

somente em 1879 foram nomeadas por Paul Erlich pela intensa marcação de

seus grânulos com o corante ácido eosina (GLEICH; ADOLPHSON, 1986).

Desde então, eosinófilos são objetos de extensiva investigação e sua

ocorrência é observada principalmente em infecções parasitárias e na fase

tardia de reações de hipersensibilidade imediata (FINKELMAN et al., 1991;

CALHOUN et al., 1991). Durante anos nosso grupo tem investigado os

mecanismos envolvidos no recrutamento de eosinófilos, tendo desenvolvido e

estudado um sistema para medir o acúmulo de eosinófilos radiomarcados com

111

In em pele de cobaias in vivo (FACCIOLI et al., 1991). Usando este método,

foram demonstrados a atividade quimioatraente da IL-8 (COLLINS et al., 1993)

e o acúmulo de eosinófilos induzida pelo LPS (WEG et al., 1995). Mais

recentemente foram investigados os fatores envolvidos na migração de

eosinófilos em diferentes modelos experimentais indutores de eosinofilia.

Usando um modelo murino de toxocaríase, uma infecção nematódea, foi

demonstrado o papel da IL-5 no direcionamento de eosinófilos da medula óssea

para o sangue e para os tecidos, tão bem como a modulação da IL-5 sobre a

produção de IL-8 durante a inflamação eosinofílica (FACCIOLI et al., 1996;

FACCIOLI et al., 1998). Dados recentes de nosso laboratório mostraram que

tanto micélio e levedura de H. capsulatum, um fungo dimórfico e patogênico,

quanto a fração polissacarídica álcali-insolúvel (F1) de sua parede, rica em

quitina e β-glucana promoveram o recrutamento de neutrófilos e eosinófilos

quando injetados na cavidade peritoneal, fenômeno este parcialmente

dependente de leucotrienos (MEDEIROS et al., 1999).

Até o presente não foi descrita a função dos eosinófilos na

histoplasmose. No entanto, aumento do número de eosinófilos tem sido descrito

na infecção humana e experimental. Em um paciente com fungemia massiva,

observou-se que 59% dos eosinófilos do sangue periférico continham leveduras

de H. capsulatum (BRYAN; DISALVO, 1979). Estudos em cães com

histoplasmose disseminada demonstraram a presença de leveduras em

neutrófilos e eosinófilos circulantes (VANSTEENHOUSE; DENOVO, 1986;

CLINKENBEARD et al., 1988). Além disso, BULLOCK et al. (1979)

descreveram intensa eosinofilia em pacientes com a forma disseminada da

histoplasmose, onde estas células representavam de 15 a 20% do total de

leucócitos. Estes autores sugeriram que funcionalmente, os eosinófilos atuariam

como células efetoras, uma vez que eles possuem em sua superfície,

receptores para a porção Fc de imunoglobulinas. As imunoglobulinas, quando

presentes recobrindo as leveduras do fungo, facilitariam o processo de

fagocitose e destruição do fungo pelos eosinófilos. Também, eosinófilos e

neutrófilos foram encontrados ao redor de leveduras em glândulas adrenais de

pacientes com histoplasmose disseminada (REEDY et al., 1970).

LIVRAMENTO et al. (1993) observaram número elevado de neutrófilos e

eosinófilos no líquido céfalo-raquidiano de pacientes com histoplasmose aguda.

Assim, tivemos como objetivos nesse trabalho, avaliar o papel dos

eosinófilos na resposta imune na histoplasmose murina. Para tanto iremos:

- confirmar atividade do anticorpo monoclonal anti-IL-5 (TRFK-5) no

modelo de eosinofilia aguda induzida pela inoculação de F1 na cavidade

peritoneal de camundongos;

- determinar o efeito da neutralização de IL-5 sobre a sobrevivência dos

animais infectados com H. capsulatum;

- avaliar o efeito da neutralização da IL-5 sobre a resposta imune celular in

vivo dos animais infectados com H. capsulatum, através da reação de

hipersensibilidade do tipo tardio (HT).

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 machos, pesando

entre 15-21 gramas, provenientes do Biotério de Camundongos Isogênicos do

Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

(FMRP) e do Biotério II da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão

Preto (FCFRP). Esses animais foram mantidos no biotério do Departamento de

Bioquímica e Imunologia da FMRP, com livre acesso a água e alimento.

2.2. Purificação do anticorpo monoclonal anti-IL-5

O anticorpo monoclonal TRFK-5 (IgG1) foi purificado a partir do

sobrenadante de cultura do respectivo hibridoma, doado pela Dra. Ises A.

Abrahamsohn do Departamento de Imunologia, Instituto de Ciências

Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo. Este hibridoma foi

cultivado em RPMI-completo (RPMI-C: meio RPMI 1640 suplementado com

10% de soro fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 40 μg/mL de gentamicina,

20mM Hepes, 2,5x10

-5

M de 2-mercaptoetanol), com troca de meio a cada 3

dias. O meio coletado a cada troca foi centrifugado e os sobrenadantes

ultrafiltrados e concentrados para 1/10 do volume inicial, em AMICON utilizando

membrana YM-30. O conteúdo protéico desse concentrado foi precipitado em

solução de sulfato de amônio saturado na proporção de 55% da amostra para

45% da solução saturada. O precipitado foi centrifugado a 5000 g por 30

minutos. O resíduo foi ressuspendido em PBS e dialisado por 4 dias em PBS,

com trocas a cada 24 horas. Antes da purificação, amostras foram dialisadas

contra tampão fosfato 0,02M por 24 horas, com trocas a cada 12 horas. Após a

diálise, os anticorpos foram purificados através de cromatografia de troca

iônica, onde o pico correspondente às imunoglobulinas foi isolado a partir de

leitura das frações coletadas por espectrofotometria com filtro de 280nm. A

quantificação dos anticorpos foi realizada através do kit “Coomassie Protein

Assay Reagent” (Pierce, Rockford, Illinois). Os anticorpos foram aliquotados e

armazenados -70

C até o momento do uso.

2.3. Cultivo e obtenção das leveduras de H. capsulatum

A cepa de H. capsulatum usada nesse trabalho foi isolada a partir do

sangue de um paciente com diagnóstico de histoplasmose, acompanhado

clinicamente no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo. Para obtenção de leveduras, os fungos

foram convertidos à partir da forma miceliana através do cultivo a 37

C em meio

sólido Müeller-Hinton-gema de ovo contendo, Caldo Müeller-Hinton (2,1%), ágar

(1,3%), dextrose (2%), L-cisteína (solução 1%) e 15 mL de gema de ovo para

cada 100 mL do meio. Após 10-14 dias de cultivo nesse meio, alíquotas do

fungo foram transferidas para um erlenmeyer contendo 50 ml de meio líquido F-

12 (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.) e incubadas por 3-5 dias sob agitação

(agitador orbital a 150 rpm) a 37°C (KLIMPEL; GOLDMAN, 1987). Alíquotas

desta amostra foram submetidas ao teste de viabilidade com diacetato de

fluoresceína e brometo de etídio (CORRÊA et al., 1990). Para efeito de

infecção, somente as culturas cuja viabilidade foi igual ou superior a 90% foram

utilizadas.

2.4. Obtenção de F1 da parede celular de H. capsulatum

Leveduras de H. capsulatum foram mortas por autoclavagem e a massa

celular lavada diversas vezes em água destilada para retirada de resíduos.

Posteriormente essa massa foi seca a 37

C em estufa e macerada em

almofariz até obtenção de massa celular do fungo. Após a secagem dessa

massa em temperatura ambiente, o resíduo (massa seca) foi tratado com

clorofórmio/metanol (1:1) para retirada dos lipídios da parede celular. O resíduo

livre de lipídeos foi tratado quatro vezes com hidróxido de sódio (NaOH) 1N sob

leve agitação durante duas horas e posteriormente centrifugado à 5000 g por 5

minutos. Os resíduos álcali-insolúveis de cada centrifugação foram reunidos e

lavados com água destilada até neutralização do pH. A seguir, o resíduo celular

total foi lavado sucessivamente com etanol absoluto, acetona, éter etílico e

posteriormente seco à temperatura ambiente. Este resíduo, composto

principalmente por quitina e β-glucanas foi denominado de fração álcali-

insolúvel ou F1 (SILVA; FAZZIOLI, 1985; CARARETO-ALVES et al.¸1987).

Esse material foi ressuspendido em PBS até obtenção de uma solução

homogênea. Após duas autoclavagens para garantir esterilidade do material, o

mesmo foi armazenado à 2-8

C até o momento do uso.

2.5. Avaliação da atividade do anticorpo monoclonal anti-IL-5 (TRFK-5)

A eficiência do anticorpo monoclonal anti-IL-5 (TRFK-5) foi testada em um

modelo de eosinofilia aguda induzida pela inoculação da fração F1 da parede de

H. capsulatum (MEDEIROS et al., 1999). Essa fração é capaz de recrutar

eosinófilos quando inoculada na cavidade peritoneal de camundongos. Os

animais foram tratados i.p. com 100 μg de TRFK-5 ou IgG de rato e após 24

horas, receberam i.p. 300 μg da fração F1 em 1 mL de PBS. Animais controles

receberam PBS i.p. no dia do tratamento e no dia do estímulo. Após 48 horas, as

células foram obtidas pela lavagem da cavidade peritoneal com 3 mL de PBS-

citrato. As amostras dos lavados foram diluídas em solução de Turk (diluição 1:20)

e a contagem do número total de células presentes nos lavados foi realizada em

câmara de Neubauer. A contagem diferencial das células presentes nos lavados

foi feita em esfregaços preparados em citocentrífuga e corados com Rosenfeld

(FACCIOLI et al., 1996).

2.6. Avaliação da sobrevivência de animais infectados com H.

capsulatum e tratados com anticorpos monoclonais anti-IL-5 (TRFK-5)

Para avaliar a participação da IL-5 e, conseqüentemente dos eosinófilos,

na infecção com H. capsulatum, dois protocolos de tratamento foram conduzidos.

No primeiro, grupos de camundongos receberam i.p. 100 μg de TRFK-5 ou IgG de

rato e após 24 horas foram infectados i.v. com 10

leveduras de H. capsulatum.

No segundo protocolo, os animais receberam 500 μg dos anticorpos (TRFK-5 ou

IgG de rato), foram infectados com 10

leveduras após 24 horas e receberam

reforços quinzenais de 100 μg dos respectivos anticorpos, no primeiro mês após a

infecção. A sobrevivência dos animais de ambos os experimentos foi

acompanhada diariamente durante 90 dias.

2.7. Avaliação da reação de HT em camundongos infectados com H.

capsulatum depletados ou não de IL-5

Os exoantígenos de H. capsulatum foram produzidos adaptando-se uma

metodologia já utilizada para Paracoccidioides brasiliensis (CAMARGO et al.,

1991). O H. capsulatum foi cultivado durante 10-15 dias e então 300 mg de

massa do fungo foram adicionados em 1mL de PBS. Essa suspensão foi

agitada em vórtex por 30 segundos e imediatamente centrifugada à 10.000 g.

O sobrenadante resultante, contendo os exoantígenos, foi coletado e

armazenado para dosagem de proteínas através do kit “Coomassie Protein

Assay Reagent” (Pierce). A resposta imune celular in vivo de animais controles

e infectados com H. capsulatum, depletados ou não de IL-5 foi acompanhada

através da reação de HT, utilizando os exoantígenos. Após 7, 15 e 30 dias de

infecção, os animais receberam 5 μg/50 μL de exoantígenos no coxim plantar

da pata traseira esquerda. O resultado foi avaliado através da diferença entre a

espessura da pata antes do inóculo e 24 horas após o mesmo. Animais

controles (não-infectados) receberam somente o inóculo de 5 μg/pata para

avaliar reações inespecíficas aos exoantígenos. A mensuração foi realizada

com um paquímetro para patas (Mitutoyo, Kawasaki, Japão).

2.8. Análise estatística dos resultados

A análise estatística das diferenças entre as médias dos grupos

experimentais foi feita utilizando-se análise de variância (ANOVA) e teste t de

Student, com significância mínima estabelecida em P < 0,05. Os dados estão

apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Dados de

sobrevivência foram analisados usando o teste log-rank.

3. RESULTADOS

3.1. Efeito da neutralização de IL-5 sobre a migração de eosinófilos

para a cavidade peritoneal induzida por F1 de H. capsulatum

Como a citocina IL-5 é o principal mediador envolvido na maturação final,

sobrevivência e saída de eosinófilos da medula óssea (FACCIOLI et al., 1996),

utilizamos o modelo de inoculação i.p. de F1 da parede de H. capsulatum para

avaliar a efeito do anticorpo monoclonal anti-IL-5 (TRFK-5) sobre a migração de

eosinófilos. Nesse modelo há uma cinética de migração característica de

neutrófilos e células mononucleares e um pico na migração de eosinófilos 48

horas após a inoculação dessa fração (MEDEIROS et al., 1999). Reproduzindo

resultados prévios do nosso laboratório, 48 horas após a inoculação i.p. de 300

μg de F1 induziu um significativo (P < 0,001) recrutamento celular (8,3 ± 0,8 x

células/mL) em comparação com os controles (5,5 ± 0,3 x 10

células/mL). A

Figura 1 mostra que o pré-tratamento dos animais com TRFK-5 não afetou

significativamente o recrutamento celular total para a cavidade peritoneal

induzido por F1 nesse período (7,5 ± 0,7 x 10

células/ml). Entretanto, quando

as populações celulares presentes na cavidade peritoneal são analisadas

separadamente, observa-se que o pré-tratamento de animais com TRFK-5

inibiu seletivamente a migração de eosinófilos, sem alterar o recrutamento dos

outros tipos celulares (Figura 2).

PBS/PBS IgG/F1 TRFK-5/F1

Tratamento/Estímulo

Células totais (x 10

/mL)

Figura 1: Efeito da neutralização de IL-5 sobre o recrutamento celular total para

a cavidade peritoneal de camundongos induzido pela inoculação de F1 da

parede celular de H. capsulatum. Os animais receberam i.p. 100 μg dos

anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) ou IgG de rato (IgG) e após 24 horas, receberam

i.p. 300 μg de F1. Após 48 horas foi realizado o lavado da cavidade peritoneal.

Animais controles receberam PBS i.p. durante o tratamento e no estímulo. *P <

0,001 em relação a PBS/PBS. (n=6)

PBS/PBS IgG/F1 TRFK-5/F1

Eosinófilos X 10

/ml

PBS/PBS IgG/F1 TRFK-5/F1

Neutrófilos X 10

/ml

PBS/PBS IgG/F1 TRFK-5/F1

Tratamento/Estímulo

Células mononucleares x 10

/ml

Figura 2: Efeito da neutralização de IL-5 sobre o recrutamento de eosinófilos

(A), neutrófilos (B) e células mononucleares (C) para a cavidade peritoneal de

camundongos, induzido pela inoculação de F1 da parede celular de H.

capsulatum. Os animais receberam i.p. 100 μg dos anticorpos anti-IL-5 (TRFK-

5) ou IgG de rato (IgG) e após 24 horas, receberam i.p. 300 μg de F1. Após 48

horas foi realizado o lavado da cavidade peritoneal. Animais controles

receberam PBS i.p. durante o tratamento e no estímulo. *P < 0,01 em relação a

PBS/PBS;

P < 0,05 em relação a IgG/F1 (n=6).

3.2. Efeito da neutralização de IL-5 na sobrevivência de

camundongos infectados com H. capsulatum

Para avaliar o papel da IL-5 e dos eosinófilos no curso da histoplasmose

experimental murina, acompanhamos a sobrevivência de animais infectados e

previamente tratados com TRFK-5 ou IgG de rato, utilizando dois protocolos

diferentes. No primeiro protocolo, os animais receberam i.p. 100 μg de TRFK-5

ou IgG de rato e após 24 horas foram infectados i.v. com 10

leveduras viáveis

de H. capsulatum. Com esse regime de tratamento, a curva de sobrevivência de

ambos os grupos foi semelhante e no final do período de observação (90 dias)

apenas 17% (1/6) dos animais haviam sobrevivido em ambos os grupos (Figura

3). No segundo protocolo, os animais receberam i.p. 500 μg dos anticorpos e

após 24 horas foram infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum.

Os animais receberam reforços quinzenais i.p. de 100 μg dos respectivos

anticorpos no primeiro mês após a infecção. Esse protocolo também não

alterou significativamente a curva de sobrevivência dos animais que receberam

TRFK-5 em relação aos animais que receberam isotipo controle (Figura 4).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

TRFK-5 + Hc

IgG + Hc

Dias após infecção

Sobrevivência (%)

Figura 3. Efeito da neutralização de IL-5 sobre a sobrevivência de

camundongos infectados com H. capsulatum. Os animais receberam i.p. 100 μg

dos anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) ou IgG de rato (IgG) e após 24 horas foram

infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum (Hc). Sobrevivência foi

acompanhada diariamente por 90 dias. (n=6)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

IgG + Hc

TRFK-5 + Hc

Dias após infecção

Sobrevivência (%)

Figura 4. Efeito da manutenção da neutralização de IL-5 sobre a sobrevivência

de camundongos infectados com H. capsulatum. Os animais receberam i.p. 500

μg dos anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) ou IgG de rato (IgG) e após 24 horas

foram infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum (Hc), recebendo

reforços quinzenais i.p. de 100 μg dos respectivos anticorpos no primeiro mês

após a infecção. Sobrevivência foi acompanhada por 90 dias. (n=6-7).

3.3. Efeito da neutralização de IL-5 sobre a resposta imune celular in

vivo de animais infectados com H. capsulatum

Para descartar a possibilidade de que o ensaio de mortalidade não

estivesse refletindo o papel da IL-5 e dos eosinófilos no curso da infecção,

induzimos a reação de HT durante a infecção, nos animais do segundo

protocolo de tratamento. Os resultados da Tabela 1 demonstram que não houve

diferenças significativas entre a espessura das patas dos grupos controles

(animais não-infectados) e dos animais infectados que receberam TRFK-5 ou

IgG de rato, em todos os períodos analisados. Adicionalmente realizamos uma

infecção com um inóculo subletal (5x10

leveduras), mantendo o mesmo regime

de tratamento com os anticorpos e observamos o desenvolvimento de

imunidade nesses animais, também através da reação de HT. Os resultados

descritos na Tabela 2 mostram que nesse caso, os animais de ambos os

grupos infectados (tratados com TRFK-5 e IgG de rato) desenvolveram reação

de HT significativamente maior do que os controles já a partir do 15

dia de

infecção, reação essa que foi mais intensa aos 30 dias de infecção. Entretanto

não houve diferença significativa entre a reação de HT do grupo infectado e

pré-tratado com TRFK-5 e do grupo infectado e pré-tratado com IgG de rato.

Tabela 1. Efeito da neutralização de IL-5 sobre a reação de HT após infecção

letal com H. capsulatum.

Dias após

infecção

Aumento da espessura

da pata em mm (média ± EPM)

Controle

IgG + Hc

TRFK-5 + Hc

0,013 ± 0.001

0,026 ± 0,006

0,022 ± 0,008

0,035 ± 0,007

0,060 ± 0,007

0,085 ± 0,015

0,008 ± 0,005

0,038 ± 0,012

0,012 ± 0,006

Os animais receberam i.p. 100 μg dos anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) ou IgG de rato (IgG) e após

24 horas foram infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum (Hc), recebendo reforços

quinzenais i.p. de 100 μg dos respectivos anticorpos no primeiro mês após a infecção. Animais que

não receberam anticorpos e não foram infectados (Controle) foram incluídos no experimento. A

reação de HT foi avaliada após 7, 15 e 30 dias de infecção através da administração de 5 μg/50

μl de exoantígenos por pata. O resultado foi avaliado através da diferença entre a espessura da

pata antes do inóculo e 24 horas após o mesmo. (n=5-6)

Tabela 2. Efeito da neutralização de IL-5 sobre a reação de HT após infecção

subletal com H. capsulatum.

Dias após

infecção

Aumento da espessura

da pata em mm (média ± EPM)

Controle

IgG + Hc

TRFK-5 + Hc

0,002 ± 0.002

0,046 ± 0,012

0,024 ± 0,015

0,018 ± 0,009

0,068 ± 0,013 *

0,095 ± 0,012 **

0,012 ± 0,007

0,353 ± 0,036 **

0,438 ± 0,060 ***

Os animais receberam i.p. 500 μg dos anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) ou IgG de rato (IgG) e após

24 horas foram infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum (Hc), recebendo reforços

quinzenais i.p. de 100 μg dos respectivos anticorpos no primeiro mês após a infecção. Animais que

não receberam anticorpos e não foram infectados (Controle) foram incluídos no experimento. A

reação de HT foi avaliada após 7, 15 e 30 dias de infecção através da administração de 5 μg/50

μl de exoantígenos por pata. O resultado foi avaliado através da diferença entre a espessura da

pata antes do inóculo e 24 horas após o mesmo. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (n=5-7)

4. DISCUSSÃO

Eosinófilos vêm sendo alvo de extensiva investigação, principalmente por

sua ocorrência associada a infecções parasitárias e na fase tardia das reações

de hipersensibilidade imediata (FINKELMAN et al., 1991; CALHOUN et al.,

1991). Nosso grupo demonstrou previamente que eosinófilos participam da

resposta inflamatória induzida na cavidade peritoneal pela inoculação de H.

capsulatum ou da fração álcali-insolúvel (F1) isolada da parede celular desse

fungo (MEDEIROS et al., 1999). Verificamos então o efeito da neutralização da

IL-5 com o anticorpo monoclonal TRFK-5, utilizando o modelo de inflamação

eosinofílica induzida por F1 na cavidade peritoneal. Observamos que o

tratamento prévio com TRFK-5 de animais que receberam F1 inibiu

completamente o recrutamento de eosinófilos para a cavidade peritoneal. A

citocina IL-5 dirige especificamente a diferenciação terminal e proliferação de

precursores de eosinófilos, assim como ativa essas células após seu

amadurecimento (SANDERSON et al., 1985; YAMAGUCHI et al., 1988;

COEFFIER et al., 1991). Além disso, IL-5 mobiliza eosinófilos da medula óssea

para o sangue periférico e é capaz de primá-los a responder mais rapidamente

a outros estímulos quimiotáticos como quimiocinas e mediadores lipídicos

(COLLINS et al., 1995; FACCIOLI et al., 1996). Diversos quimioatraentes estão

envolvidos na migração de eosinófilos in vivo e in vitro, dentre eles eotaxina,

PAF e leucotrieno B

(LTB

) (COLLINS et al., 1995; OKADA et al., 1996). Muitos

investigadores já haviam demonstrado uma correlação direta entre eosinofilia

crônica e IL-5 em infecções helmínticas humanas e em modelos experimentais

com Toxocara canis, Nippostrongylus brasiliensis e Schistosoma mansoni

(COFFMAN et al., 1989; SHER et al., 1990; PARSONS et al., 1993; FACCIOLI

et al., 1996). Nosso grupo já havia demonstrado que o recrutamento de

eosinófilos para a cavidade peritoneal induzido por F1 é parcialmente

dependente de leucotrienos, utilizando MK-886, um inibidor da síntese dessas

moléculas (MEDEIROS et al., 1999). Esse trabalho foi o primeiro a demonstrar

a participação da IL-5 em um modelo de inflamação eosinofílica aguda e, em

conjunto com os resultados prévios, sugere que há uma associação entre

leucotrienos e IL-5 na migração de eosinófilos. Esses resultados mostram a

eficácia do anticorpo TRFK-5 e foram publicados no Brazilian Journal of Medical

and Biological Research (Sá-Nunes et al., 2004).

Investigamos também o papel dos eosinófilos durante a infecção por H.

capsulatum, uma vez que alguns autores apresentaram uma associação entre

estas células e o fungo (BULLOCK et al.,1979; CLINKENBEARD et al., 1988).

O mesmo não se pode dizer da participação da IL-5 e consequentemente dos

eosinófilos na histoplasmose experimental murina. Nenhum dos dois regimes

de tratamento com TRFK-5 foi capaz de alterar a curva de sobrevivência dos

animais. Procuramos por outros parâmetros que pudessem demonstrar a

participação desses elementos da resposta imunológica contra o H.

capsulatum. Através de reações de HT induzidas por exoantígenos do fungo,

observamos o desenvolvimento da resposta imune celular in vivo após infecção

letal e subletal. Entretanto, novamente não observamos quaisquer diferenças

entre o grupo que recebeu TRFK-5 e IgG de rato. Após esses experimentos,

podemos afirmar que nem a citocina IL-5, nem os eosinófilos são relevantes na

resposta imunológica contra o H. capsulatum. Dois pontos principais fortalecem

essa conclusão. Primeiramente, utilizamos doses suficientemente altas de

TRFK-5 para neutralizar a IL-5 endógena dos animais. Isso se confirma pelo

fato de que 100 μg desse anticorpo por animal foram suficientes para bloquear

a eosinofilia peritoneal aguda induzida por F1 da parede do H. capsulatum.

Essa dose é de 5 a 40 vezes maior do que a usada em outros modelos de

neutralização da IL-5 e bloqueio de eosinofilia (KUNG et al., 1995; EGAN et al.,

1997; MENEZES-DE-LIMA-JUNIOR et al., 1997). Em segundo lugar, utilizamos

um outro protocolo com 500 μg de TRFK-5 mais reforços quinzenais, que

também não alterou a sobrevivência dos animais. Esse protocolo foi realizado

apenas para uma confirmação final dos resultados obtidos, visto que uma única

dose de TRFK-5 é capaz de inibir a eosinofilia no lavado broncoalveolar de

macacos e camundongos por pelo menos três meses (MAUSER et al., 1995;

EGAN et al., 1997).

5. CONCLUSÕES

Concluímos que a neutralização da IL-5 com o anticorpo monoclonal TRFK-

- bloqueia a eosinofilia aguda induzida na cavidade peritoneal pela

inoculação de F1 de H. capsulatum

- não afeta a sobrevida dos animais infectados

- não altera o perfil de desenvolvimento da imunidade celular in vivo após

infecção letal ou subletal

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“Não subestime seus ouvintes. Tente inspirá-los

com a poesia da ciência, faça com que suas

explicações sejam simples e não negligencie o

difícil. Dedique esforços extras às explicações a

leitores atentos, que estão preparados para

esforçar-se para entendê-las”.

Richard Dawkins

em “A escalada do Monte Improvável”

Capítulo 4

Papel dos neutrófilos na

histoplasmose experimental murina

1. INTRODUÇÃO

Neutrófilos são conhecidos como células predominantes durante a

inflamação aguda e em resposta a muitos tipos de infecção. Eles contribuem

para a proteção do hospedeiro através de atividades como fagocitose,

mecanismos oxidativos e produção de citocinas e quimiocinas

imunorreguladoras durante o início de infecções microbianas. Estudos sobre a

atividade funcional dos neutrófilos na patogênese dessas infecções ganharam

impulso após a disponibilização do anticorpo monoclonal RB6-8C5, o qual é

altamente eficiente na depleção de granulócitos (TEPPER et al., 1992). A

depleção de neutrófilos com RB6-8C5 tem sido associada com aumento da

susceptibilidade de camundongos a uma ampla gama de microorganismos

como vírus herpes simplex (TUMPEY et al., 1996), vírus Junin (GONZALEZ et

al., 1987); as bactérias Mycobacterium tuberculosis (PEDROSA et al., 2000;

SEILER et al., 2000), M. bovis (FULTON et al., 2002), Legionella pneumophila

(TATEDA et al., 2001), Listeria monocytogenes (CZUPRYNKSI et al., 1994); os

parasitas Entamoeba hystolytica (SEYDEL et al., 1997), Leishmania major

(TACCHINI-COTTIER et al., 2000), Toxoplasma gondii (SAYLES et al., 1996) e

outros.

Nas doenças fúngicas, a contribuição dos neutrófilos é controversa. Por

um lado, neutrófilos são importantes para a defesa do hospedeiro contra

Candida albicans (JENSEN et al., 1994; ROMANI et al., 1997a; ROMANI et al.,

1997b) e Aspergillus fumigatus (MEHRAD et al. 2000). Por outro, neutropenia

reduz a susceptibilidade de camundongos infectados com Cryptococcus

neoformans (MEDNICK et al., 2003). Histoplasmose é uma doença fúngica

altamente prevalente, principalmente na América do Norte e Central (CANO;

HAJJEH, 2001), causada pelo fungo dimófico Histoplasma capsulatum. A

infecção inicia-se com a inalação de fragmentos micelianos e conidiais que se

convertem em leveduras, a forma patogênica, quando à temperatura dos

hospedeiros mamíferos (37

C). A magnitude da exposição e o “status” imune do

hospedeiro influenciam as manifestações clínicas da histoplasmose, sendo que

a manifestação sintomática, severa e disseminada ocorre comumente em

pacientes imunodeficientes principalmente como resultado da infecção pelo

HIV, quimioterapia contra o câncer e transplante de órgãos (WOODS, 2002). A

resposta imune protetora contra H. capsulatum é a imunidade celular, mediada

por macrófagos e células T CD4

e CD8

(NEWMAN et al., 1992;

ALLENDOERFER et al., 1993; DEEPE, 1994; ZHOU et al., 1995; ZHOU et al.,

2001). Embora seja atribuído aos neutrófilos importante papel na fagocitose e

destruição inicial de microorganismos, os estudos referentes a sua participação

na histoplasmose ainda não são claros. Diversos estudos in vitro têm sugerido

que neutrófilos apresentam atividade fungicida contra leveduras de H.

capsulatum. HOWARD et al. (1965), demonstraram que em presença de soro,

neutrófilos peritoneais de cobaia são capazes de destruir leveduras de H.

capsulatum após 3 horas de incubação. Estudos in vitro têm estabelecido que

neutrófilos são capazes de englobar e matar fragmentos micelianos, mas não

leveduras (SCHAFFNER et al., 1986). Mais recentemente demonstrou-se que

neutrófilos humanos e murinos exibem atividade fungistática contra leveduras

de H. capsulatum (BRUMMER et al., 1991; KURITA et al., 1991).

Posteriormente, NEWMAN et al. (1993) também demonstraram que neutrófilos

humanos possuem potente atividade fungicida sobre leveduras in vitro, sendo

que esta atividade foi evidenciada nas primeiras 24 horas de incubação. Um

estudo prévio demonstrou aumento da mortalidade em camundongos

depletados de neutrófilos quando infectados com H. capsulatum em

comparação com camundongos não-depletados (ZHOU et al., 1998).

Assim, tivemos como objetivos nesse trabalho avaliar o papel dos

neutrófilos na resposta imune na histoplasmose murina. Para tanto iremos:

- confirmar a capacidade de depletar granulócitos do anticorpo monoclonal

RB6-8C5 no sangue de animais normais (não-infectados);

- determinar o efeito da depleção de granulócitos sobre a sobrevivência de

animais infectados com H. capsulatum;

- avaliar o efeito da depleção de granulócitos sobre a resposta imune

celular in vitro e in vivo dos animais infectados com H. capsulatum,

através de linfoproliferação, e reação de hipersensibilidade do tipo tardia

(HT);

- determinar o perfil de citocinas e óxido nítrico em sobrenadante de

cultura de células totais de baço, homogeneizado pulmonar e soro de

animais controles e infectados, depletados ou não depletados de

neutrófilos.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Animais

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 machos, pesando

entre 15-21g, provenientes do Biotério de Camundongos Isogênicos do

Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

(FMRP) e do Biotério II da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão

Preto (FCFRP). Esses animais foram mantidos no biotério do Departamento de

Bioquímica e Imunologia da FMRP, com livre acesso a água e alimento.

2.2. Cultivo e obtenção das leveduras de H. capsulatum

A cepa de H. capsulatum usada nesse trabalho foi isolada a partir do

sangue de um paciente com diagnóstico de histoplasmose, acompanhado

clinicamente no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo. Para obtenção de leveduras, os fungos

foram convertidos à partir da forma miceliana através do cultivo a 37

C em meio

sólido Müeller-Hinton-gema de ovo contendo, Caldo Müeller-Hinton (2,1%), ágar

(1,3%), dextrose (2%), L-cisteína (solução 1%) e 15 mL de gema de ovo para

cada 100 mL do meio. Após 10-14 dias de cultivo nesse meio, alíquotas do

fungo foram transferidas para um erlenmeyer contendo 50 ml de meio líquido F-

12 (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.) e incubadas por 3-5 dias sob agitação

(agitador orbital a 150 rpm) a 37°C (KLIMPEL & GOLDMAN, 1987). Alíquotas

desta amostra foram submetidas ao teste de viabilidade com diacetato de

fluoresceína e brometo de etídio (CORRÊA et al., 1990). Para efeito de

infecção, somente as culturas cuja viabilidade foi igual ou superior a 90% foram

utilizadas.

2.3. Purificação do anticorpo monoclonal anti-granulócitos (RB6-

8C5)

O anticorpo monoclonal RB6-8C5 (IgG2a) foi purificado a partir do

sobrenadante de cultura do respectivo hibridoma, doado pelo Dr. Mário Mariano

(Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade

Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil). Este hibridoma foi cultivado em

RPMI-completo (RPMI-C: meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro

fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 40 μg/mL de gentamicina, 20mM Hepes,

2,5x10

-5

M de 2-mercaptoetanol) com troca de meio a cada 3 dias. O meio

coletado a cada troca foi centrifugado e os sobrenadantes ultrafiltrados e

concentrados para 1/10 do volume inicial, em AMICON utilizando membrana

YM-30. O conteúdo protéico desse concentrado foi precipitado em solução de

sulfato de amônio saturado na proporção de 55% da amostra para 45% da

solução saturada. O precipitado foi centrifugado a 5000 g por 30 minutos. O

resíduo foi ressuspendido em PBS e dialisado por 4 dias em PBS, com trocas a

cada 24 horas. Antes da purificação, amostras foram dialisadas contra tampão

fosfato 0,02M por 24 horas, com trocas a cada 12 horas. Após a diálise, os

anticorpos foram purificados através de cromatografia de troca iônica, onde o

pico correspondente às imunoglobulinas foi isolado partir de leitura das frações

coletadas por espectofotometria com filtro de 280nm. A quantificação dos

anticorpos foi realizada através do kit “Coomassie Protein Assay Reagent”

(Pierce, Rockford, Illinois). Os anticorpos foram aliquotados e armazenados -70

C até o momento do uso.

2.4. Avaliação da atividade do anticorpo monoclonal anti-

granulócitos (RB6-8C5) no sangue de camundongos controles (não-

infectados)

A eficiência do anticorpo monoclonal anti-granulócitos (RB6-8C5) foi

determinada através da cinética de depleção de neutrófilos e eosinófilos

presentes no sangue periférico de camundongos normais. Os animais

receberam i.p. 250 μg de RB6-8C5 ou IgG de rato e após 1, 3, 5 e 10 dias

tiveram alíquotas de sangue retiradas. As amostras de sangue foram diluídas

em solução de Turk (diluição 1:100) e a contagem do número total de células

presentes foi realizada em câmara de Neubauer. A contagem diferencial das

células presentes no sangue foi feita em esfregaços preparados em lâminas e

corados com Rosenfeld (FACCIOLI et al., 1996).

2.5. Efeito da depleção de granulócitos sobre a sobrevivência de

animais infectados com H. capsulatum

Para avaliar a participação da neutrófilos durante a infecção com H.

capsulatum, grupos de camundongos receberam i.p. uma única dose de 250 μg/1

mL de RB6-8C5 ou IgG de rato e após 24 horas foram infectados i.v. com 10

leveduras de H. capsulatum. A sobrevivência dos animais foi acompanhada

durante 60 dias.

2.6. Efeito da depleção de granulócitos sobre a reação de

hipersensibilidade tardia (HT) durante a infecção com H. capsulatum

A resposta imune celular in vivo de animais controles e infectados com

H. capsulatum, depletados ou não de granulócitos, foi monitorada através da

reação de hipersensibilidade do tipo tardia (HT), utilizando exoantígenos do

fungo. Após 7, 15 e 30 dias de infecção, os animais receberam 5 μg/50 μL dos

exoantígenos no coxim plantar da pata traseira esquerda. O resultado foi

avaliado através da diferença entre a espessura da pata antes do inóculo e 24

horas após o mesmo. Animais controles (não-infectados) também receberam o

inóculo de 5 μg/pata para avaliar reações inespecíficas aos exoantígenos. A

mensuração foi realizada com um paquímetro para patas (Mitutoyo, Kawasaki,

Japão).

2.7. Efeito da depleção de granulócitos sobre a recuperação de

unidades formadoras de colônia (UFC) do baço e dos pulmões de animais

infectados com H. capsulatum

Camundongos infectados, depletados ou não de granulócitos foram

sacrificados após 7 e 15 dias de infecção e tiveram o baço e os pulmões

retirados e pesados. A suspensão de células dos baços foi obtida após

homogeneização em 5 mL de RPMI-C. Após a lise das hemácias, as células

foram lavadas 3 vezes em RPMI-C e ressuspendidas em 1 mL do mesmo meio.

Essas suspensões foram diluídas (1:100 e 1:500) e, para recuperação das

UFC, 200 μL foram distribuídos em placas de Petri contendo BHI-agar

suplementado com 5% de hemácias de carneiro, em duplicata para cada baço.

Após 21 dias de cultivo a 37

C, o número de UFC nas placas foi determinado e

os valores de UFC por órgão, transformado para escala logarítmica.

O lóbulo superior (maior) do pulmão esquerdo de cada animal foi cortado

em pequenos fragmentos colocados em tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL

de meio RPMI incompleto acrescido de solução de liberase (0,5 μg/mL) e

incubados a 37

C, durante 30 minutos, sob agitação. Decorrido o tempo de

incubação, a dispersão das células pulmonares foi realizada com o auxílio de

uma seringa de 10 mL. A suspensão contendo as células e os fragmentos de

pulmão foi centrifugada a 400 g, durante 5 minutos, e o precipitado foi

ressuspendido em 5 mL de meio RPMI-C para bloquear a ação da liberase.

Diluições apropriadas foram feitas (1:100 ou 1:500) e a recuperação de UFC foi

realizada de maneira semelhante à descrita para o baço. Alíquotas de 200 μl

foram retiradas para o ensaio de recuperação de UFC, em duplicata para cada

pulmão. Após 21 dias de cultivo a 37

C, o número de UFC nas placas foi

determinado e os valores de UFC por grama de órgão, transformados para

escala logarítmica.

2.8. Linfoproliferação de células totais de baço estimuladas in vitro

A resposta imune celular in vitro foi avaliada através da resposta

linfoproliferativa de células esplênicas de animais controles e infectados com H.

capsulatum, depletados ou não de granulócitos. Baços de animais controles e

infectados com H. capsulatum, tratados com RB6-8C5 ou IgG de rato, foram

retirados após 7 e 15 dias de infecção. A suspensão de células dos baços foi

obtida através de homogeneização do órgão em peneiras de nylon, com 5 mL

de RPMI-C. Após a lise das hemácias, as células foram lavadas 3 vezes em

RPMI-C e ressuspendidas em 1 mL do mesmo meio. As suspensões foram

acertadas para 5x10

células/mL e cultivadas em placas de 96 poços de fundo

chato, em volume de 100 μL/poço, em triplicata. As células foram estimuladas in

vitro com 100 μL/poço de concanavalina A (Con A - 4 μg/mL) ou exoantígenos de

H. capsulatum (50 μg/mL) em RPMI-C. Células incubadas com RPMI-C somente

foram usadas como controle (linfoproliferação basal). As culturas foram

incubadas a 37

C em estufa com tensão de 5% de CO

, por 72 horas. Dezoito

horas antes do término da incubação foi adicionado 1μCi de

H-timidina (6,7

μCi/mol), em cada poço. Após esse período, as culturas foram recuperadas

através de um coletor de células (Cell Harvester, Cambridge Technology, UK)

em papéis de fibra de vidro e a incorporação de

H-timidina nas células

determinada em contador de cintilação beta, sendo os resultados expressos

em contagem por minuto (cpm). Os dados foram expressos na forma de índice

de estimulação que é o resultado da divisão da média da cpm das células

estimuladas in vitro com o exoantígeno ou com a Con A, pela média da cpm

das células que ficaram apenas em presença de RPMI-C.

2.9. Quantificação de citocinas através de ELISA

Semelhantemente a metodologia descrita no item anterior, foi realizada a

cultura de células totais do baço provenientes de animais controles e de animais

infectados, depletados ou não depletados de neutrófilos, mas sem a adição de

H-

timidina, durante 72 horas. As placas foram centrifugadas e os sobrenadantes

de cultura armazenados em freezer –70

C até o momento do uso.

No 7

e 15

dia de infecção, o lóbulo inferior (menor) do pulmão esquerdo

e os dois primeiros lóbulos superiores do pulmão direito de animais controles e

infectados, depletados ou não depletados de granulócitos, foram retirados e

homogeneizados em 2 mL de RPMI-C. Esse material foi centrifugado e os

sobrenadantes armazenados em freezer –70

C até o momento do uso.

O sangue de animais controles e infectados, depletados ou não

depletados de neutrófilos, foi retirado após 1, 3, 5 e 7 dias de infecção. O soro

foi separado e armazenado em freezer –70

C até o momento do uso.

O material produzido nesses três procedimentos foi utilizado para a

quantificação das citocinas IL-4, IL-10, IFN-γ e TNF-α através de Ensaio Imuno-

Enzimático (ELISA). Anticorpos de captura foram diluídos em tampão carbonato

(100 µL/poço) e após incubação das placas durante uma noite à 4°C, as

mesmas foram lavadas 3 vezes com solução tamponada com fosfato contendo

0,05% de Tween (tampão de lavagem). Após as sucessivas lavagens e

secagem da placa, foi realizada a reação de bloqueio adicionando 300 µL/poço

de uma solução tamponada com fosfato contendo 1% de BSA, seguido de

incubação à temperatura ambiente pelo período mínimo de 1 hora. Após o

bloqueio, os poços foram novamente lavados 3 vezes com o tampão de

lavagem, e então adicionado 100 μL das amostras para a quantificação da

citocina. A curva-padrão realizada com citocinas recombinantes (Pharmingen,

San Diego, CA) variaram de 9,6 a 2500 pg/mL. Após nova incubação de uma

noite à 4°C, foi repetido o procedimento de lavagem e adicionado 100 μL/poço

dos anticorpos de detecção anti-citocinas biotinilados, diluídos em tampão de

bloqueio com 0,05 % de Tween durante 2 horas. Após a incubação foi repetido

novo ciclo de lavagem, e em seguida feita a amplificação da reação pela adição

de 100 µL/poço de estreptoavidina/biotina, diluída em tampão de bloqueio com

0,05% de Tween, na concentração de 1,25 mg/mL. Após incubação por 60

minutos à temperatura ambiente foi adicionado 100 μL/poço da solução de

substrato (OPD), seguido de 20-30 minutos de incubação à temperatura

ambiente. A reação foi bloqueada adicionando 50 µl/poço de ácido sulfúrico (1

M) e a densidade óptica dos poços determinada em leitor de placas, usando

filtro de 490 nm.

2.10. Quantificação de nitrito (NO

) pela reação de Griess

A produção de nitrito (NO

) nos mesmos sobrenadantes de cultura de

células totais de baço e de homogeneizado pulmonar, descritos no item

anterior, foi determinada através da reação de Griess, descrita previamente

(LANE et al., 1994). Cem microlitros dos sobrenadantes foram incubados com o

mesmo volume do reagente de Griess (mistura 1:1 de uma solução de NEED

0,1% em água destilada e de uma solução de sulfanilamida 1% em H

5%)

a temperatura ambiente. A concentração de NO

foi determinada usando uma

curva-padrão de 1 a 200 µM NaNO

. Os dados estão apresentados como

micromoles de NO

por mL.

2.11. Histopatologia dos pulmões e dos fígados

O processamento histopatológico dos órgãos foi feito em colaboração

com o Dr. Édson Garcia Soares do Departamento de Patologia da FMRP-USP.

Para tanto, lóbulos de pulmões dos diferentes grupos experimentais foram

removidos após 7 e 15 dias de infecção. Os tecidos foram fixados em tampão

de Millonig (10% de formaldeído-Sigma St. Louis, MO, USA) 1,86% de fosfato

de potássio monobásico e 0,42% de hidróxido de sódio (MERCK, Montreal,

Canadá, pH=7.4) e inclusos em parafina. Cortes histológicos, com 5 μm de

espessura, foram corados com hematoxilina-eosina (HE) ou prata (prata de

Grocott, GMS) e analisados comparativamente os componentes celulares,

organização tecidual (granulomas) e leveduras de H. capsulatum no

parênquima pulmonar dos animais dos diferentes grupos experimentais.

2.12. Análise estatística dos resultados

A análise estatística das diferenças entre as médias dos grupos

experimentais foi feita utilizando-se análise de variância (ANOVA) e teste t de

Student, com significância mínima estabelecida em P<0,05. Os dados estão

apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Dados de

sobrevivência foram analisados usando o teste log-rank.

3. RESULTADOS

3.1. Depleção de leucócitos circulantes pelo anticorpo monoclonal

anti-granulócitos (RB6-8C5)

Estudamos o efeito do anticorpo monoclonal RB6-8C5, caracterizado na

literatura para a depleção de granulócitos, verificando seu efeito diretamente no

sangue de animais controles. Os animais foram tratados com RB6-8C5 ou IgG

de rato e, em diferentes dias após o tratamento, coletamos alíquotas de sangue

e determinamos o número total e diferencial dos leucócitos.

A administração i.p. de RB6-8C5 (250 μg/animal) diminuiu

significativamente (P < 0,01) o número de células totais do sangue após 24

horas (Figura 1). A redução no número total de células sanguíneas refletiu

principalmente a depleção de mais de 80% dos neutrófilos (Figura 2A) e dos

eosinófilos (Figura 2B). Houve também uma diminuição não significativa no

número de células mononucleares nesse período (Figura 2C). O número de

células totais do sangue dos animais que receberam RB6-8C5 manteve-se

significativamente menor até o 3

dia após a administração do anticorpo em

comparação com os animais que receberam isotipo controle. A partir do quinto

dia após a administração do anticorpo, todos os tipos celulares retornaram aos

níveis normais, semelhantes aos dos animais que receberam IgG de rato.

Embora o número total de células estivesse restabelecido no 7

dia após a

administração de RB6-8C5, nesse ponto houve uma pequena redução no

número de células mononucleares (P < 0,05) que coincidiu com o aumento de

neutrófilos, em relação aos animais que receberam IgG de rato. No entanto,

todos os tipos celulares no sangue estavam semelhantes no 10

dia após a

administração dos anticorpos.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

IgG

RB6-8C5

Dias após administração

Células totais (x10

ml)

Figura 1. Células totais no sangue de camundongos normais, após

administração i.p. de 250 μg do anticorpo monoclonal anti-granulócitos (RB6-

8C5) ou IgG de rato (IgG). Nos períodos indicados, uma alíquota de sangue foi

retirada e o número de células determinado. *P < 0,01. (n=6)

0 2 4 6 8 10

IgG

RB6-8C5

Neutrófilos (x10

ml)

0 2 4 6 8 10

IgG

RB6-8C5

Eosinófilos (x10

ml)

0 2 4 6 8 10

IgG

RB6-8C5

Dias após administração

Células mononucleares (x10

ml)

Figura 2. Neutrófilos (A), eosinófilos (B) e células mononucleares (C) no

sangue de camundongos normais, após administração i.p. de 250 μg do

anticorpo monoclonal anti-granulócitos (RB6-8C5) ou IgG de rato (IgG). Nos

períodos indicados, uma alíquota de sangue foi retirada e o número de células

determinado. * P < 0,01, ns= não significativo. (n=6)

3.2. Efeito da depleção de granulócitos sobre a sobrevivência de

animais infectados com H. capsulatum

Após confirmar a eficiência do anticorpo monoclonal RB6-8C5 em

animais normais, realizamos a depleção de granulócitos em animais infectados

com 10

leveduras de H. capsulatum e avaliamos a sobrevivência dos animais

em comparação com animais infectados que receberam IgG de rato. A Figura 3

mostra que animais infectados e depletados de granulócitos começaram a

morrer à partir do 13

dia de infecção, sendo que todos os animais morreram

até o 23

dia após a infecção. No grupo que recebeu IgG de rato, apenas 1

camundongo morreu no 22

dia e outro no 23

dias de infecção. O restante dos

animais sobreviveu até 60 dias após a infecção, período final de observação.

Grupos semelhantes aos do experimento anterior, mas mantidos

separadamente, foram sacrificados durante o curso da infecção e foram

recuperadas UFC dos baços e pulmões desses animais. No 7

dia após a

infecção, foram recuperadas mais UFC (P < 0,05) nos baços de animais

depletados de granulócitos do que daqueles de animais que receberam IgG de

rato (Figura 4). No 15

dia após a infecção, a carga fúngica recuperada dos

baços e dos pulmões do grupo infectado e depletado de granulócitos foi

significativamente maior (P < 0,05) do que a carga fúngica recuperada do grupo

infectado que recebeu IgG de rato (Figura 4A e B).

0 10 20 30 40 50 60

100

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

Dias após infecção

Sobrevivência (%)

Figura 3. Efeito da depleção de granulócitos sobre a sobrevivência de

camundongos infectados i.v. com inóculo letal de H. capsulatum. Os animais

receberam i.p. 250 μg do anticorpo anti-granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou IgG de

rato (IgG + Hc) e após 24 horas foram infectados com 10

leveduras viáveis de

H. capsulatum. A sobrevivência foi acompanhada diariamente por 60 dias.

(n=10).

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

UFC/baço (log

)

715

Dias após infecção

UFC/ grama pulmão (log

)

Figura 4. Carga fúngica do baço (A) e pulmões (B) de animais infectados com

leveduras de H. capsulatum, depletados ou não de granulócitos. Os animais

receberam i.p. 250 μg do anticorpo anti-granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou IgG de

rato (IgG + Hc) e após 24 horas foram infectados com 10

leveduras viáveis de

H. capsulatum. Nos períodos indicados, os baços e os pulmões foram

removidos e as UFC recuperadas. *P < 0,05 (n=4-5)

3.3. Efeito da depleção de granulócitos sobre a resposta imune

celular in vivo e in vitro

Avaliamos a resposta celular dos animais in vivo acompanhando o

desenvolvimento da reação de HT induzida pelos exoantígenos (Tabela 1). No

dia após a infecção, animais de ambos os grupos infectados (depletados ou

não de granulócitos) apresentaram reação de HT significativamente maior (P <

0,05) do que a reação apresentada pelo grupo controle (animais não-

infectados) que também receberam os exoantígenos. No 15

dia após a

infecção, o grupo infectado com H. capsulatum que recebeu IgG de rato,

apresentou reação significativamente maior (P < 0,001) nesse período de

infecção (0,114 ± 0.009 mm) do que o grupo infectado e depletado de

granulócitos (0,034 ± 0,011 mm), que por sua vez, não foi estatisticamente

diferente da reação apresentada pelos animais controles (0,010 ± 0,006 mm).

No 30

dia após a infecção, todos os animais infectados e depletados de

granulócitos haviam morrido, enquanto somente 20% dos animais do grupo

infectado que recebeu IgG de rato morreram. Nos 80% dos animais que

sobreviveram, houve desenvolvimento de reação de HT bastante significativa (P

< 0,001) em relação ao controle (Tabela 1).

A resposta linfoproliferativa in vitro das células de baço dos animais

infectados foi avaliada no 7

e 15

dias após a infecção, mediante estímulo com

mitógeno (ativação policlonal) ou exoantígenos (ativação específica). Na Figura

5 apresentamos os resultados da linfoproliferação, representados na forma de

índice de proliferação (conforme descrito em materiais e métodos). Em ambos

os períodos, células de animais controles não-infectados foram também

estimuladas com Con A e o índice de estimulação das mesmas, usado como

parâmetro de proliferação para as células do baço dos animais infectados. No

dia após a infecção, as células dos animais depletados de granulócitos

apresentaram um índice de estimulação significativamente menor (P < 0,05) do

que as células dos animais que receberam IgG de rato (1,52 ± 0,26 versus 0,67

± 0,20 respectivamente) quando estimuladas com Con A. Porém, células do

baço de ambos os grupos infectados apresentaram proliferação muito abaixo da

observada em células de animais controles estimuladas com esse mitógeno

(15,42 ± 5,55). As células dos animais de nenhum grupo responderam à

estimulação in vitro com os exoantígenos nessa fase da infecção (dado não

apresentado). No 15

dia após a infecção, a supressão da proliferação celular

observada no período anterior nas células dos animais infectados foi

parcialmente revertida, sendo que nas células dos animais que receberam RB6-

8C5, essa reversão foi menos evidente (3,88 ± 0,30) do que nos animais que

receberam IgG de rato (11,54 ± 1,71). Porém, esses valores ainda foram

significativamente menores (P < 0,001 e P < 0,05, respectivamente) do que o

índice de estimulação das células provenientes dos animais controles,

estimulados in vitro com Con A (17,56 ± 1,93). Nessa fase da infecção, também

não foi possível detectar proliferação significativa induzida pelos exoantígenos

in vitro em nenhum dos três grupos (dado não apresentado).

Tabela 1. Efeito da depleção de granulócitos sobre a reação de HT em animais

infectados com H. capsulatum.

Dias após

infecção

Aumento da espessura

da pata em mm (média ± EPM)

Controle

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

0,018 ± 0.012

0,083 ± 0,016 *

0,087 ± 0,021 *

0,025 ± 0,015

0,114 ± 0,009 **

0,034 ± 0,011

0,040 ± 0,010

0,360 ± 0,050 **

Os animais receberam i.p. 250 μg dos anticorpos anti-granulócitos (RB6-8C5) ou IgG de rato

(IgG) e após 24 horas foram infectados i.v. com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum (Hc).

Animais que não receberam anticorpos e não foram infectados (Controle) foram incluídos no

experimento. A reação de HT foi avaliada após 7, 15 e 30 dias de infecção através da

administração de 5 μg/50 μl de exoantígenos por pata. O resultado foi avaliado através da

diferença entre a espessura da pata antes do inóculo e 24 horas após o mesmo. *P<0,05 e

**P<0,001 versus Controle;

P < 0,05 versus IgG + Hc. (n=4-6)

715

Controle

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

Dias após infecção

Indice de estimulação

Figura 5. Proliferação de células totais de baço, obtidas de animais não

infectados (Controle) e de animais infectados com H. capsulatum, depletados

de granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou não depletados (IgG + Hc). Os animais

receberam i.p. 250 μg dos anticorpos e 24 horas após, foram infectados com

leveduras viáveis de H. capsulatum. Após 7 e 15 dias de infecção os baços

foram retirados e uma suspensão de 5x10

células/100 μL foi incubada com o

mesmo volume de RPMI-C, Con A (4 μg/mL) ou exoantígenos (50 μg/mL).

Dezoito horas antes do término da incubação foi adicionado 1μCi/poço de

H-

timidina. A proliferação está apresentada como índice de estimulação das

triplicatas estimuladas com Con A versus RPMI-C. Nessa fase da infecção não

houve diferença significativa na proliferação induzida pelos exoantígenos versus

RPMI-C. *P < 0,01 versus Controle;

P < 0,05 versus IgG + Hc. (n=5)

3.4. Histopatologia de fígados e pulmões

As Figuras 6 e 7 apresentam, respectivamente, a histopatologia geral do

fígado após 7 e 15 dias de infecção dos animais depletados ou não de

granulócitos. Na primeira semana de infecção o fígado dos animais infectados e

tratados com IgG de rato apresentou áreas focais de infiltrados inflamatórios,

com presença de neutrófilos e de alguns macrófagos e linfócitos. Notamos a

presença poucas áreas necróticas. Os fígados dos animais infectados que

receberam RB6-8C5 apresentaram lesões mais numerosas, mas ainda assim

esparsas e sem confluência. Em ambos os grupos, esses infiltrados estão

dispersos pelos lóbulos hepáticos, e também aparecem próximos à veia centro

lobular. A coloração por prata, que identifica o fungo, mostrou que há presença

de leveduras no interior desses infiltrados (Figura 6G e H). Após 15 dias de

infecção, no fígado do grupo infectado e que recebeu IgG de rato os infiltrados

celulares confluíram, mas ainda apresentam aspecto circular e delimitado. Não

há presença de neutrófilos nos infiltrados, mas há uma grande quantidade de

linfócitos e macrófagos. Alguns desses macrófagos já apresentam

características de células epitelióides, sugerindo o início da formação de

granulomas. Também há inflamação intersticial (entre os cordões de

hepatócitos), mas poucas áreas de necrose foram observadas. Outras áreas

apresentam fibrose e há presença do fungo tanto nos infiltrados celulares em

organização quanto nas áreas fibróticas. Já o fígado dos animais infectados que

receberam RB6-8C5 apresentam lesões numerosas, confluentes e

disseminadas, com grande inflamação intersticial. Tanto a veia centro-lobular

quando o espaço porta, formado pela artéria hepática e pelos dutos hepáticos,

apresentam-se comprometidos, o que não aconteceu com tanta intensidade no

fígado do grupo infectado que recebeu IgG de rato. Algumas áreas apresentam

necrose caseosa e o fungo está presente em virtualmente todo o órgão. (Figura

7E e F), o que está de acordo com os dados de recuperação de UFC nessa

fase da infecção.

As Figuras 8 e 9 apresentam, respectivamente, a histopatologia geral do

pulmão após 7 e 15 dias de infecção dos animais depletados ou não de

granulócitos. A análise dos pulmões no 7

dia após a infecção mostrou uma

inflamação intersticial difusa, com espessamento dos septos alveolares e sem

exsudação, nos animais que receberam IgG de rato. Há também áreas sólidas

constituídas de linfócitos e macrófagos, alguns dos quais assumindo aspecto de

células epitelióides, mas a distribuição dessas áreas é aleatória e não há

necrose. Alguns vasos apresentam-se congestos. O grupo infectado que

recebeu RB6-8C5 também apresenta espessamento dos septos, sem

exsudação e todo o infiltrado inflamatório intersticial é constituído

principalmente de linfócitos. Também há áreas sólidas, com predominância de

macrófagos, mas pouca necrose. Há também presença de regiões

hemorrágicas. Em ambos os grupos, há fungos presentes tanto nas lesões

sólidas, quanto esparsos pelo parênquima (Figura 8G e H). Após 15 dias de

infecção, a inflamação nos pulmões se intensificou e os infiltrados

disseminaram-se deixando poucas áreas preservadas. Entretanto, nos pulmões

dos animais infectados que receberam IgG de rato, as lesões estavam mais

estruturadas, com muitos macrófagos, alguns dos quais assumindo aspecto

epitelióide e há também um infiltrado linfocitário intersticial exuberante. Os

pulmões dos animais infectados que receberam RB6-8C5, apresentaram lesões

sólidas confluentes sem áreas preservadas, com muitas células epitelióides nas

lesões, além de um infiltrado intersticial disseminado. Não foram observadas

áreas necróticas ou com exsudação, mas há presença de hemorragia extensa

em várias regiões do parênquima. A coloração por prata revelou que os

pulmões de ambos os grupos infectados estavam repletos de leveduras nessa

fase da infecção, embora nos animais que receberam anticorpo RB6-8C5, a

disseminação do fungo pelo pulmão tenha sido maior (Figura 9E e F),

observação esta confirmada pela recuperação de UFC desses órgãos.

Figura 6. Fotomicrografia de cortes de fígado de camundongos não infectados ou após 7

dias de infecção com H. capsulatum, tratados com anticorpo monoclonal RB6-8C5 ou

isotipo controle. A e B: não infectado; C, E e G: infectado, tratado com isotipo; D, F e H:

infectado, tratado com RB6-8C5. Coloração: Hematoxilina-eosina (HE) e Prata de Grocott

(GMS). Aumentos: 100 x (A, B, C e D); 400 X (E, F, G e H). Leveduras presentes no corte

estão indicadas por setas.

HE HE

GMSGMS

GMS

Figura 7. Fotomicrografia de cortes de fígado de camundongos não infectados ou após 15

dias de infecção com H. capsulatum, tratados com anticorpo monoclonal RB6-8C5 ou

isotipo controle. A, C e E: infectado, tratado com isotipo; B, D e F: infectado, tratado com

RB6-8C5. Coloração: Hematoxilina-eosina (HE) e Prata de Grocott (GMS). Aumentos: 100

x (A e B); 400 X (C, D, E e F). Leveduras presentes no corte estão indicadas por setas.

HE HE

GMS

Figura 8. Fotomicrografia de cortes de pulmões de camundongos não infectados ou após

7 dias de infecção com H. capsulatum, tratados com anticorpo monoclonal RB6-8C5 ou

isotipo controle. A e B: não infectado; C, E e G: infectado, tratado com isotipo; D, F e H:

infectado, tratado com RB6-8C5. Coloração: Hematoxilina-eosina (HE) e Prata de Grocott

(GMS). Aumentos: 100 x (A, B, C e D); 400 X (E, F, G e H). Leveduras presentes no corte

estão indicadas por setas.

HE HE

HEHE

GMS

Figura 9. Fotomicrografia de cortes de pulmões de camundongos não infectados ou após

15 dias de infecção com H. capsulatum, tratados com anticorpo monoclonal RB6-8C5 ou

isotipo controle. A, C e E: infectado, tratado com isotipo; B, D e F: infectado, tratado com

RB6-8C5. Coloração: Hematoxilina-eosina (HE) e Prata de Grocott (GMS). Aumentos: 100

x (A e B); 400 X (C, D, E e F). Leveduras presentes no corte estão indicadas por setas.

HE HE

HEHE

GMS GMS

3.5. Produção de citocinas e NO

por células totais de baço e em

sobrenadante de homogeneizado pulmonar

Analisamos também alguns parâmetros imunológicos que pudessem

explicar as diferenças descritas entre os grupos infectados. O perfil de produção

de citocinas e NO

foi avaliado após 7 e 15 dias de infecção. Na Figura 10,

estão apresentadas as dosagens das citocinas IL-4 e IL-10 (padrão Th2) em

sobrenadantes de cultura de células totais do baço. Tanto no 7

quanto no 15

dia após a infecção, não foram observadas diferenças na produção de IL-4

entre as células de animais não-infectados (controle) e as células dos grupos

infectados, depletados ou não depletados de granulócitos, quando estas células

foram incubadas com meio somente (Figura 10A e B). Por outro lado, quando

células do baço de animais infectados que receberam IgG de rato, foram

incubadas com exoantígenos no 7

dia após a infecção, as mesmas produziram

significativamente mais IL-4 (P < 0,05) do que as células do grupo controle

incubadas com o mesmo antígeno. Porém, essa diferença não foi significativa

em comparação com a produção de IL-4 pelas células do grupo infectado e

depletado de granulócitos. (Figura 10A).

Quanto a produção de IL-10, no 7

dia após a infecção as células de

ambos os grupos infectados (que receberam IgG de rato ou RB6-8C5)

incubadas com meio somente, produziram mais IL-10 do que as células do

grupo controle também incubadas com meio, embora somente no grupo que

recebeu IgG de rato essa diferença tenha sido significativa (P < 0,01). Por outro

lado, somente as células do grupo infectado e depletado de neutrófilos

produziram significativamente mais IL-10 (P < 0,01) quando incubadas com

exoantígenos do que quando incubadas com meio somente e em comparação

com as células dos animais do grupo controle (Figura 10C). No 15

dia após a

infecção somente as células do grupo infectado e depletado de neutrófilos

produziram níveis consideráveis de IL-10. Mesmo assim, essa diferença foi

significativa somente entre as células desse grupo incubadas com meio e entre

as células do grupo controle e do grupo infectado que recebeu IgG de rato

também incubadas com meio (Figura 10D).

Determinamos também a produção de IFN-γ (padrão Th1) e de NO

nos

sobrenadantes de cultura de células do baço (Figura 11). No 7

dia após a

infecção, as células de ambos os grupos infectados (que receberam IgG de rato

ou RB6-8C5) produziram níveis significativamente maiores (P < 0,01) de IFN-γ

do que as células do grupo controle, quando incubadas com meio somente ou

quando incubadas com exoantígenos. Entretanto, somente as células do grupo

infectado que recebeu IgG de rato responderam aos exoantígenos produzindo

maiores níveis de IFN-γ (P < 0,01). Células do baço dos animais infectados e

depletados de neutrófilos liberaram quantidades semelhantes dessa citocina

quando estimuladas com meio somente ou com exoantígenos (Figura 11A). No

dia após a infecção, novamente as células dos animais de ambos os grupos

infectados incubadas somente com meio ou com exoantígenos foram capazes

de produzir níveis significativamente maiores de IFN-γ (P < 0,05) do que as

células dos animais controles. Além disso, somente as células dos animais

infectados que receberam IgG de rato produziram mais IFN-γ (P < 0,05) quando

incubadas com exoantígenos do que quando incubadas com meio (Figura 11B).

A produção de NO

no 7

dia após a infecção refletiu a produção de IFN-

γ no mesmo período, sendo significativamente maior nos sobrenadantes de

células provenientes de ambos os grupos infectados (que receberam IgG de

rato ou RB6-8C5) incubadas tanto com meio quanto com exoantígenos.

Semelhantemente ao que foi descrito para a produção de IFN-γ, as células dos

animais infectados que receberam IgG de rato foram as únicas a produzirem

maiores níveis de NO

em resposta ao estímulo com exoantígenos em

comparação com essas mesmas células incubadas com meio somente.

Aparentemente as células do grupo infectado e depletado de neutrófilos

alcançam sua produção máxima de óxido nítrico quando incubadas com meio,

pois não houve alteração na produção desse mediador na presença de

exoantígenos (Figura 11C). Após 15 dias de infecção, o mesmo fenômeno foi

observado quanto a produção de NO

, embora de forma mais intensa. As

células dos animais de ambos os grupos infectados incubadas somente com

meio produziram três vezes mais NO

nessa fase do que no 7

dia de infecção.

Entretanto, somente as células dos animais infectados que receberam IgG de

rato produziram mais óxido nítrico quando incubadas com exoantígenos do que

quando incubadas com meio. Novamente, as células dos animais infectados e

depletados de neutrófilos responderam com máxima produção de NO

durante

a incubação com meio, não alterando sua produção quando estimuladas pelos

exoantígenos (Figura 11D).

Determinamos também a produção das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-

10, assim como de NO

nos sobrenadantes do homogeneizado pulmonar dos

mesmos animais. O perfil de IFN-γ e de TNF-α nesses sobrenadantes foi

exatamente o mesmo no 7

e no 15

dias após a infecção. Nos sobrenadantes

do homogeneizado pulmonar do grupo controle, níveis muitos baixos (quase

indetectáveis) de ambas as citocinas foram encontrados. No 7

dia após a

infecção, os sobrenadantes do homogeneizado pulmonar de ambos os grupos

infectados (que receberam IgG e rato ou RB6-8C5) apresentaram níveis

semelhantes das duas citocinas (Figura 12A e B). No 15

dia de infecção, os

sobrenadantes do homogeneizado pulmonar do grupo infectado que recebeu

IgG de rato apresentaram níveis semelhantes de IFN-γ e de TNF-α aos

apresentados no 7

dia após a infecção. Entretanto, os sobrenadantes do

homogeneizado pulmonar do grupo infectado e depletado de granulócitos

apresentaram níveis 2,2 e 3,6 vezes maiores de IFN-γ e de TNF-α,

respectivamente, do que os sobrenadantes do homogeneizado pulmonar do

grupo infectado que recebeu IgG de rato (Figura 12A e B).

Não foram encontradas diferenças significativas nos níveis de IL-4

presentes nos sobrenadantes do homogeneizado pulmonar dos três grupos nos

períodos analisados (Figura 12C). Quanto a citocina IL-10, os sobrenadantes do

homogeneizado pulmonar do grupo infectado que recebeu IgG de rato

apresentou quantidades significativamente maiores dessa citocina em relação

ao grupo controle (11 vezes) e em relação ao grupo infectado e depletado de

neutrófilos (5 vezes) após 7 dias de infecção. No 15

dia após a infecção, os

sobrenadantes do homogeneizado do grupo infectado que recebeu IgG de rato

apresentaram diminuição de IL-10, mas que foi significativa somente quando

comparada com o grupo infectado e depletado de neutrófilos (P < 0,05 – Figura

12D).

Não foram observadas diferenças entre os níveis de NO

presentes

nesses sobrenadantes no 7

dia após a infecção. No 15

dia após a infecção,

entretanto, os sobrenadantes do homogeneizado pulmonar do grupo infectado e

depletado de neutrófilos apresentou aproximadamente três vezes mais NO

que os sobrenadantes do homogeneizado pulmonar do grupo controle e do

grupo infectado que recebeu IgG de rato (Figura 13).

7 dias após a infecção

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

Meio

Exoantígenos

IL-4 (pg/mL)

15 dias após a infecção

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

IL-4 (pg/mL)

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

500

1000

1500

2000

IL-10 (pg/mL)

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

500

1000

1500

2000

IL-10 (pg/mL)

Figura 10. Produção de IL-4 e IL-10 por células totais de baço, obtidas de

animais não infectados (Controle) e animais infectados com H. capsulatum

depletados de granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou não depletados (IgG + Hc). Os

animais receberam i.p. 250 μg dos anticorpos e 24 horas após, foram

infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum. Após 7 (A, C) e 15 (B,

D) dias de infecção, 5x10

células/100 μL foram incubadas com o mesmo

volume de meio ou de exoantígenos (50 μg/mL). Após 72 horas, os

sobrenadantes de cultura foram retirados e as citocinas determinadas através

de ELISA. *P < 0,01 versus mesmo grupo incubado com meio;

P < 0,01 versus

Controle;

P < 0,05 versus grupo indicado. (n=5)

7 dias após a infecção

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

2000

4000

6000

8000

10000

Meio

Exoantígenos

IFN-

(pg/mL)

15 dias após a infecção

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

2000

4000

6000

8000

10000

IFN-

(pg/mL)

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

(

M/mL)

Controle IgG + Hc RB6-8C5 + Hc

(

M/mL)

Figura 11. Produção de de IFN-γ e NO

por células totais de baço, obtidas de

animais não infectados (Controle) e animais infectados com H. capsulatum

depletados de granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou não depletados (IgG + Hc). Os

animais receberam i.p. 250 μg dos anticorpos e 24 horas após, foram

infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum. Após 7 (A, C) e 15 (B,

D) dias de infecção, 5x10

células/100 μL foram incubadas com o mesmo

volume de meio ou de exoantígenos (50 μg/mL). Após 72 horas, os

sobrenadantes de cultura foram retirados, sendo o IFN-γ determinado através

de ELISA e o NO

determinado através da reação de Griess. * P < 0,01 versus

mesmo grupo incubado com meio;

P < 0,01 versus Controle;

P < 0,01 versus

grupo indicado. (n=5)

715

400

800

1200

1600

2000

IFN-

(pg/mL)

715

400

800

1200

1600

2000

TNF-

(pg/mL)

715

Controle

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

Dias após infecção

IL-4 (pg/mL)

715

150

300

450

600

750

Dias após infecção

IL-10 (pg/mL)

Figura 12. Determinação de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes do

homogeneizado pulmonar de animais não-infectados (Controle) e animais

infectados com H. capsulatum depletados de granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou

não depletados (IgG + Hc). Os animais receberam i.p. 250 μg dos anticorpos e

24 horas após, foram infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum.

Após 7 e 15 dias de infecção os pulmões foram retirados, homogeneizados em

2 mL de RPMI-C e centrifugados. As citocinas foram determinadas no

sobrenadante através de ELISA. *P < 0,01 versus Controle;

P < 0,05 versus

IgG + Hc. (n=5)

715

100

150

Controle

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

Dias após infecção

(

M/mL)

Figura 13. Determinação de NO

nos sobrenadantes do homogeneizado

pulmonar de animais não-infectados (Controle) e animais infectados com H.

capsulatum depletados de granulócitos (RB6-8C5 + Hc) ou não depletados (IgG

+ Hc). Os animais receberam i.p. 250 μg dos anticorpos e 24 horas após, foram

infectados com 10

leveduras viáveis de H. capsulatum. Após 7 e 15 dias de

infecção os pulmões foram retirados, homogeneizados em 2 mL de RPMI-C e

centrifugados. O NO

foi determinado nos sobrenadantes através da reação de

Griess. * P < 0,01 versus Controle;

P < 0,01 versus IgG + Hc (n=5)

3.6. Efeito da depleção de granulócitos sobre a produção de

citocinas na fase inicial da infecção

Para verificar se a depleção de granulócitos afetou a produção de

citocinas na fase inicial da infecção, determinamos os níveis de IFN-γ, IL-4 e IL-

10 durante os primeiros 7 dias de infecção, no soro dos animais não infectados

(controle) e dos animais infectados que receberam IgG de rato ou RB6-8C5

(Figura 14). No 1

e 3

dias após a infecção não foram observadas diferenças

nos níveis de IFN-γ detectados no soro dos três grupos. No 5

dia após a

infecção, os soros de ambos os grupos infectados (depletados ou não de

granulócitos) apresentaram níveis significativamente maiores de IFN-γ (P <

0,001) do que o soro do grupo controle. Esse aumento foi de aproximadamente

7 vezes no grupo infectado que recebeu IgG de rato e de 5 vezes no grupo

infectado e depletado de neutrófilos em comparação ao grupo controle, embora

não tenha sido observada diferença significativa entre esses dois grupos. No 7

dia após a infecção, houve um aumento ainda maior nos níveis dessa citocina

detectada nos soros dos grupos infectados, de aproximadamente 10 vezes no

grupo que recebeu IgG de rato e de 12 vezes no grupo depletado de neutrófilos,

em comparação com o grupo controle (Figura 14A).

De forma geral os três grupos apresentaram níveis semelhantes de IL-10

em todo o período analisado, com algumas exceções. No 1

dia após a

infecção, o soro do grupo infectado que recebeu IgG de rato apresentou níveis

aproximadamente 80% maiores de IL-10 do que o soro do grupo controle e 55%

maiores do que o soro do grupo infectado e depletado de neutrófilos (P < 0,05).

No 5

dia após a infecção, o soro dos animais infectados e depletados de

neutrófilos apresentou níveis 50% maiores de IL-10 do que o soro do grupo

controle 77% maiores do que o soro do grupo infectado que recebeu IgG de

rato (P < 0,05). No 7

dia após a infecção, o soro do grupo infectado que

recebeu IgG de rato apresentou uma diminuição de 60% no nível de IL-10 em

comparação com o soro do grupo controle (P < 0,05) e de 67% em relação ao

soro do grupo infectado e depletado de neutrófilos (P < 0,05 – Figura 14B).

O perfil de IL-4 presente no soro dos três grupos também foi, no geral,

semelhante. As diferenças foram observadas somente no 1

dia após a

infecção onde o soro do grupo infectado e depletado de neutrófilos apresentou

aproximadamente 2 vezes mais IL-4 do que o soro dos demais grupos (P <

0,05) e no 7

dia após a infecção, onde o soro de ambos os grupos infectados

apresentaram aproximadamente 2 vezes mais IL-4 do que o soro do grupo

controle (P < 0,05 – Figura 14C).

1357

250

500

750

1000

1250

1500

IFN-

(pg/mL)

1357

100

200

300

400

500

600

Controle

IgG + Hc

RB6-8C5 + Hc

IL-10 (pg/mL)

1357

100

Dias após infecção

IL-4 (pg/mL)

Figura 14. Níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 no soro de animais não-infectados

(Controle) e animais infectados com H. capsulatum depletados de granulócitos (RB6-

8C5 + Hc) ou não depletados (IgG + Hc). Os animais receberam i.p. 250 μg dos

anticorpos e 24 horas após, foram infectados com 10

leveduras viáveis de H.

capsulatum. Após 1, 3,

5 e 7 dias de infecção, alíquotas de sangue foram retiradas

dos animais e as citocinas foram determinadas no soro através de ELISA. *

P <

0,05 versus Controle;

P ≤ 0,05 versus IgG + Hc. (n=5)

44. DISCUSSÃO

Em um estudo prévio, foi demonstrado que a depleção de granulócitos

no momento da infecção, com uma simples dose de RB6-8C5, resultou em

aumento da mortalidade de camundongos infectados com H. capsulatum

(ZHOU et al., 1998). O mesmo foi observado por nós quando uma dose única

de RB6-8C5 foi administrada a camundongos um dia antes da infecção. Assim,

nós apresentamos que a depleção de granulócitos na fase inicial da

histoplasmose aumenta a gravidade dessa doença. A discussão de nossos

resultados será realizada exclusivamente sobre os neutrófilos por três motivos.

Primeiro, porque das três populações de granulócitos presentes no sangue, os

basófilos estão em uma quantidade muito pequena (0-0,2%), não chegam ao

tecido e existem poucos trabalhos mostrando o seu papel em infecções outras

que não as helmínticas. Segundo porque, os eosinófilos, que compõem a outra

população de granulócitos do sangue, foram estudados no capítulo anterior e

não participam, pelo menos de forma mensurável, da resposta imune na

histoplasmose. Em terceiro lugar, porque a discussão de todos os trabalhos que

usaram o anticorpo RB6-8C5 nos mais diferentes modelos experimentais de

infecção por patógenos foi feita levando em consideração apenas os neutrófilos

(CZUPRYNKSI et al., 1994; JENSEN et al., 1994; TUMPEY et al., 1996;

SAYLES et al., 1996; ROMANI et al., 1997a; ROMANI et al., 1997b; SEYDEL et

al., 1997; MEHRAD et al. 2000; PEDROSA et al., 2000; SEILER et al., 2000;

TACCHINI-COTTIER et al., 2000; TATEDA et al., 2001; FULTON et al., 2002;

MEDNICK et al., 2003).

Neutrófilos são células capazes de secretar grandes quantidades de IL-

12 e TNF-α em diferentes infecções (ROMANI et al., 1997; BLISS et al., 1999),

além de produzir IFN-γ em resposta ao estímulo com LPS, IL-12 e TNF-α

(YEAMAN et al., 1998) e serem ativados por esta última citocina, apresentando

aumento de sua capacidade fagocítica e da liberação de óxido nítrico,

estimulando dessa forma suas funções antimicrobianas (MURRAY, 1996).

Estes dados sugerem que essas células possuem, potencialmente, um

importante papel nas infecções de origem fúngica, como a histoplasmose,

pressupondo sua participação como células efetoras na fase inicial da infecção

e na liberação de citocinas responsáveis pelo direcionamento do padrão da

resposta imune desenvolvida subsequentemente. Contudo, o exato papel

dessas células na imunopatologia da histoplasmose ainda precisa ser

investigado. Embora neutrófilos sejam encontrados na resposta inflamatória

induzida pela infecção i.p. e i.v. com H. capsulatum (MEDEIROS et al., 1999;

MEDEIROS et al., 2004), não há um consenso sobre o papel protetor dos

neutrófilos in vivo nesses modelos até o momento. Resultados publicados

anteriormente por SCHAFFNER et al. (1986) mostraram que a forma miceliana

do H. capsulatum é susceptível à morte pelos neutrófilos in vitro, mas leveduras

são resistentes. Esses autores propuseram que a susceptibilidade à morte

pelos neutrófilos é um fator determinante, capaz de discriminar se um fungo é

patogênico ou oportunista. Resultados semelhantes foram encontrados em

estudos utilizando leveduras de Paracoccidioides brasiliensis que apresentam

dimorfismo similar ao H. capsulatum (SCHAFFNER et al., 1986). Neutrófilos

humanos fagocitam eficientemente o P. brasiliensis, mas apresentam um

defeito na capacidade de digerí-lo (GOIHMAN-YAHR et al., 1980; GOIHMAN-

YAHR et al., 1989). Além disso, estes dados são consistentes com outros

estudos mostrando a resistência do H. capsulatum à morte pelos neutrófilos, os

quais possuem apenas atividade fungistática contra leveduras (BRUMMER et

al., 1991; KURITA et al., 1991; NEWMAN et al., 1993). Analisados em conjunto

nossos resultados e os resultados da literatura, nós aventamos a hipótese de

que os neutrófilos participam da resposta immune protetora contra o H.

capsulatum, não através de alterações significativas na produção de citocinas e

óxido nítrico, mas através da capacidade de restringir o crescimento do fungo

nos primeiros dias de infecção, diminuindo sua disseminação para outros

órgãos. Isso poderia explicar a diferença de 40 vezes na carga fúngica

encontrada no baço e de 20 vezes na carga fúngica dos pulmões após 15 dias

de infecção.

A despeito de sua incapacidade de matar leveduras, os neutrófilos

provavelmente conseguem conter a proliferação do H. capsulatum e isso deve

ser suficiente até a ativação e migração dos linfócitos para os locais de infecção

e conseqüentemente, ativação dos macrófagos nesses sítios inflamatórios. A

produção exacerbada de óxido nítrico pelas células do baço parece ser

decorrente do aumento na carga fúngica nesse órgão, uma vez que as células

totais do baço de animais que receberam IgG de rato produziram menos óxido

nítrico e reverteram parcialmente a capacidade proliferativa após 15

dia de

infecção. Isso não ocorreu com as células dos animais que receberam o

anticorpo RB6-8C5, onde a inibição da capacidade proliferativa das células do

baço após 15

dia de infecção coincidiu com os altos níveis de óxido nítrico

produzidos basalmente por essas células. A supressão da resposta

linfoproliferativa observada no início da infecção já está bem documentada na

literatura (WATSON et al., 1985; DEEPE et al., 1986; ISLAS-RODRIGUEZ et

al., 1991) e provavelmente reflete a produção de óxido nítrico pelas células da

cultura. Essa supressão, demonstrada in vitro durante a infecção pelo H.

capsulatum, foi revertida pelo o uso de aminoguanidina (inibidor de óxido

nítrico) ou de anticorpos anti-IFN-γ na cultura, restaurando a capacidade

proliferativa das células que foram estimuladas com Con A ou com o próprio

fungo morto pelo calor (ZHOU et al., 1995). O óxido nítrico é responsável pela

inibição da síntese de DNA em diversos tipos celulares (DRAPIER et al., 1986),

promove citostase em células tumorais (STUEHR; NATHAN, 1989; KWON et

al., 1991; PERVIN et al., 2001) e suprime proliferação de células T em

diferentes modelos experimentais, inclusive de infecções fúngicas (HOFFMAN

et al., 1990; ZHOU et al., 1995; BOCCA et al., 1998). Além disso, o IFN-γ

provoca aumento da produção de óxido nítrico (DING et al.¸1988; GREEN et al.,

1990; MELLOUK et al., 1991) que, se por um lado promova a morte do H.

capsulatum intracelular através da ativação de macrófagos, por outro afeta a

proliferação celular. Além da atividade anti-linfoproliferativa do óxido nítrico, foi

demonstrado que essa molécula também é capaz de induzir apoptose em

linfócitos do baço em animais infectados com H. capsulatum (WU-HSIEH et al.,

1998). Embora não tenhamos avaliado se houve ou não maior apoptose das

células do baço dos animais infectados e depletados de neutrófilos, nossos

dados sugerem o papel do óxido nítrico não somente na proteção dos animais

infectados, mas também na patologia estabelecida pelo excesso de produção

dessa molécula, aspecto esse confirmado em outros trabalhos (WU-HSIEH et

al., 1998; HIRUNPETCHARAT et al., 1999).

Os altos níveis de IFN-γ, TNF-α e óxido nítrico também presentes nos

sobrenadantes de homogeneizado pulmonar dos animais infectados e

depletados de neutrófilos, provavelmente é uma conseqüência da ativação

excessiva do sistema imune em decorrência da excessiva carga fúngica nesse

órgão e não necessariamente da ausência de neutrófilos. Como já foi dito,

alguns trabalhos apresentam uma estreita relação entre a produção exagerada

desses mediadores com o dano tecidual e morte, em modelos experimentais de

algumas doenças e mesmo na histoplasmose (WU-HSIEH et al., 1998;

HIRUNPETCHARAT et al., 1999). O mecanismo pelo qual os neutrófilos

participam da resposta immune protetora durante a infecção pelo H. capsulatum

parece não ser através do desvio imunológico de uma resposta Th1 para uma

resposta Th2 ou mesmo através da exacerbação da resposta Th1 no início da

infecção, uma vez que o perfil de produção de IL-4, IL-10 e IFN-γ encontrado no

soro dos animais infectados, depletados ou não de granulócitos, foi semelhante

na primeira semana de infecção. Este fato é reforçado pela análise da aquisição

de reatividade aos exoantígenos na reação de HT, a qual se apresentou muito

semelhante na primeira semana de infecção em ambos os grupos infectados.

O impacto da depleção de neutrófilos na infecção secundária não foi

investigado nesse trabalho, uma vez que ZHOU et al. (1998) já haviam

demonstrado que após o desenvolvimento de uma resposta adquirida efetiva,

os neutrófilos não são essenciais para a manutenção da imunidade. Mas

adicionalmente, a investigação do papel dos eosinófilos na sobrevivência de

camundongos infectados com H. capsulatum, apresentada no Capítulo 3 dessa

tese, comprova que os efeitos da administração de RB6-8C5 apresentados aqui

são exclusivamente decorrentes da ausência de neutrófilos e não de

eosinófilos. Vale ressaltar que alguns trabalhos demonstraram que outras

células são também afetadas por esse anticorpo. Nesse aspecto, HESTDAL et

al. (1991) descreveram que, embora pouco frequentes, linfócitos (<5%) e

macrófagos (<1%) fazem parte da população RB6

, embora a marcação de

linfócitos pelo mAb RB6-8C5 não tenha sido confirmada em todos os estudos

publicados (CONLAN; NORTH, 1994). De fato, nós observamos uma pequena

diminuição não-significativa das células mononucleares do sangue no dia

seguinte à administração do anticorpo. A necessidade de se rever a

interpretação dos estudos que utilizaram o anticorpo RB6-8C5 para a depleção

de neutrófilos, levou a produção de uma dissertação de mestrado avaliando o

papel imunomodulador das células RB6

na inflamação crônica induzida pelo

BCG (ALONSO, 2002). Entretanto até o momento, a discussão de todos os

trabalhos da literatura usando o anticorpo RB6-8C5 centraliza-se basicamente

nos granulócitos, particularmente nos neutrófilos. Adicionalmente, como nossa

depleção é realizada uma única vez e no estágio inicial da histoplasmose, isso

descarta a possibilidade de ausência dessas células estarem influenciando nos

resultados observados a partir do 7

dia de infecção, quando o número de

células no sangue já está restabelecido.

5. CONCLUSÕES

Concluímos que a depleção de granulócitos com o anticorpo monoclonal

RB6-8C5 no início da infecção com H. capsulatum,:

- aumenta a susceptibilidade dos animais infectados;

- não influencia na aquisição de reatividade aos exoantígenos durante a

reação de HT;

- facilita a proliferação e disseminação do fungo, que por sua vez promove

a exacerbação da resposta imune;

- não provoca desvio da resposta imunológica nem influencia na

polarização da mesma para o padrão Th1.

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“Não basta ensinar ao homem uma especialidade,

porque se tornará assim uma máquina utilizável e

não uma personalidade. É necessário que adquira

um sentimento, um senso prático daquilo que vale

a pena ser empreendido, daquilo que é belo, do

que é moralmente correto”.

Albert Einstein

Anexos

343

Braz J Med Biol Res 37(3) 2004

F1-induced peritoneal eosinophilia is IL-5 dependent

Interleukin-5 mediates peritoneal

eosinophilia induced by the F1 cell wall

fraction of Histoplasma capsulatum

Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas,

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil

A. Sá-Nunes,

A.I. Medeiros and

L.H. Faccioli

Abstract

An alkali-insoluble fraction 1 (F1), which contains mainly ß-glucan

isolated from the cell wall of Histoplasma capsulatum, induces eosin-

ophil recruitment into the peritoneal cavity of mice. The present study

was carried out to determine the participation of interleukin-5 (IL-5) in

this process. Inbred C57BL/6 male mice weighing 15-20 g were

treated ip with 100 µg of anti-IL-5 monoclonal antibody (TRFK-5, N

= 7) or an isotype-matched antibody (N = 7), followed by 300 µg F1 in

1 ml PBS ip 24 h later. Controls (N = 5) received only 1 ml PBS. Two

days later, cells from the peritoneal cavity were harvested by injection

of 3 ml PBS and total cell counts were determined using diluting fluid

in a Neubauer chamber. Differential counts were performed using

Rosenfeld-stained cytospin preparations. The F1 injection induced

significant (P < 0.01) leukocyte recruitment into the peritoneal cavity

(8.4 x 10

cells/ml) when compared with PBS alone (5.5 x 10

cells/

ml). Moreover, F1 selectively (P < 0.01) induced eosinophil recruit-

ment (1 x 10

cells/ml) when compared to the control group (0.07 x 10

cells/ml). Treatment with TRFK-5 significantly (P < 0.01) inhibited

eosinophil recruitment (0.18 x 10

cells/ml) by F1 without affecting

recruitment of mononuclear cells or neutrophils. We conclude that the

F1 fraction of the cell wall of H. capsulatum induces peritoneal

eosinophilia by an IL-5-dependent mechanism. Depletion of this

cytokine does not have effect on the recruitment of other cell types

induced by F1.

Correspondence

L.H. Faccioli

Departamento de Análises Clínicas,

Toxicológicas e Bromatológicas

FCFRP, USP

Av. do Café, s/n

14040-903 Ribeirão Preto, SP

Brasil

Fax: +55-16-633-1936

E-mail: [email protected]

Presented at the XVIII Annual

Meeting of the Federação de

Sociedades de Biologia Experimental,

Curitiba, PR, Brazil, August 27-30,

2003.

Research supported by FAPESP

(No. 95/9691-6), CNPq and FAEPA.

Received May 8, 2003

Accepted November 13, 2003

Key words

• Eosinophils

• Histoplasma capsulatum

• Inflammation

• Interleukin-5

• Anti-IL-5 monoclonal

antibody

The eosinophil granulocyte, although

probably first observed by Warton Jones in

1846 in unstained preparations of peripheral

blood, was so named by Paul Erlich in 1879

because of the intense staining of its granules

with the acidic dye eosin (1). Eosinophils

have been the subject of extensive investiga-

tion since then and their occurrence is ob-

served mainly in parasite infections and in

the late phase of immediate hypersensitivity

reactions (2,3). For several years we have

investigated the mechanisms involved in eo-

sinophil recruitment. We have developed and

studied a system to measure the accumula-

tion of radiolabeled

111

In-eosinophils in guin-

ea pig skin in vivo (4). Using this same

method, we have demonstrated the eosino-

phil chemoattractant activity of interleukin-

8 (IL-8) (5) and eosinophil accumulation

induced by LPS (6). More recently we have

Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2004) 37: 343-346

ISSN 0100-879X Short Communication

344

Braz J Med Biol Res 37(3) 2004

A. Sá-Nunes et al.

investigated the factors involved in eosino-

phil migration in different experimental mod-

els of eosinophilia. Using a murine model of

toxocariasis, a nematode infection, we dem-

onstrated the role of IL-5 in driving eosino-

phils from bone marrow to blood and tissues

and in modulating IL-8 production in eosi-

nophilic inflammation (7,8). In addition, we

demonstrated that leukotrienes play a role in

the leukocyte recruitment to the peritoneal

cavity induced by the alkali-insoluble frac-

tion 1 (F1), which contains mainly ß-glucan,

from the cell wall of Histoplasma capsula-

tum, a dimorphic pathogenic fungus (9). In

the present study we investigated the partici-

pation of IL-5 in eosinophil recruitment to

the peritoneal cavity induced by the F1 cell

wall fraction of H. capsulatum.

All experiments were approved and con-

ducted in accordance with the guidelines of

the Animal Care Committee of the Univer-

sity.

Inbred C57BL/6 male mice weighing 15-

20 g were purchased from the animal house

of the Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto, SP, Brasil, and were main-

tained under standard laboratory conditions.

The F1 polysaccharide of H. capsulatum

was prepared as described (10). Briefly, yeast

forms of the fungus were cultured at 37ºC in

BHI-agar medium (Difco Laboratories,

Sparks, MD, USA) and supplemented with

5% sheep blood for 15 days. Yeasts were

harvested, formalin-killed and washed sev-

eral times with distilled water. The cell walls

of the dead yeast were disrupted by ultra-

sonic vibration and washed three times with

distilled water by centrifugation at 5000 g

for 5 min. Lipids were extracted by repeated

soaking of the walls in chloroform/methanol

(2:1, v/v) at room temperature for 2 h with

shaking. The extracts were separated by cen-

trifugation at 5000 g for 5 min and the in-

soluble residue was extracted three more

times as described above. The resulting in-

soluble cell wall residue was suspended in 1

N NaOH and gently stirred at room temper-

ature for 1 h. After centrifugation at 5000 g

for 10 min, the supernatants were collected

and the procedure was repeated four times.

The alkali-insoluble sediment was washed

with ethanol followed by acetone and di-

ethyl ether. After drying, the resulting white

powder was designated as F1 from the dead

yeast form of H. capsulatum.

In order to induce leukocyte recruitment

into the peritoneal cavity, 300 µg F1 was

suspended in 1 ml PBS and was injected ip in

mice (N = 14). Control mice received only 1

ml PBS (N = 5). This protocol induces time-

dependent leukocyte migration with charac-

teristic kinetics among neutrophils, eosino-

phils, and mononuclear cells (9). Twenty-

four hours prior to F1 injection, one group of

mice (N = 7) received an ip injection of 100

µg TRFK-5, an anti-IL-5 monoclonal anti-

body (mAb), and the other group (N = 7)

received an isotype-matched mAb. This treat-

ment was given in order to determine the

participation of IL-5 in eosinophil recruit-

ment. Forty-eight hours after F1 injection

the animals were sacrificed by excess anes-

thesia because 48 h corresponds to the peak

of eosinophil recruitment in this model (9).

Cells from the peritoneal cavities were har-

vested by injection of 3 ml PBS containing 5

U/ml heparin. The abdomens were gently

massaged and a blood-free cell suspension

was carefully withdrawn with a syringe.

Abdominal washings were placed in plastic

tubes and total cell counts were performed

immediately in a Neubauer chamber. Differ-

ential counts were obtained using Rosenfeld-

stained cytospin preparations (7). Statistical

differences were analyzed by the Student t-

test. Two-way ANOVA was used to calcu-

late the differences of significance among

the groups. A P < 0.05 value was considered

to be statistically significant.

The response of mice to ip administra-

tion of F1 after 48 h was the recruitment of

8.4 ± 1.25 x 10

cells/ml compared to 5.5 ±

0.31 x 10

cells/ml obtained with PBS (P <

345

Braz J Med Biol Res 37(3) 2004

F1-induced peritoneal eosinophilia is IL-5 dependent

0.01). The numbers of neutrophils, eosino-

phils, and mononuclear cells after F1 injec-

tion were also determined and the effect of

TRFK-5 on the recruitment of these cells is

shown in Figure 1. No differences in mono-

nuclear cell counts were observed between

control mice and mice injected with F1, who

were treated with either TRFK-5 or with the

isotype antibody (Figure 1C). However, F1

induced significantly greater (P < 0.01) neu-

trophil recruitment (4.4 x 10

cells/ml) when

compared to PBS (0.6 x 10

cells/ml). Treat-

ment of mice with TRFK-5 increased neu-

trophil recruitment induced by F1 (Figure

1B). In addition, eosinophil recruitment by

F1 (1 x 10

cells/ml) was 14-fold higher (P <

0.01) compared to the PBS control group

(0.07 x 10

cells/ml). Treatment with TRFK-

5 significantly (P < 0.01) inhibited eosino-

phil recruitment into the peritoneal cavity by

more than 80% (Figure 1A).

Both granulocyte-macrophage colony-

stimulation factor and IL-3 stimulate the re-

cruitment of eosinophils as well as other

leukocytes, whereas IL-5 specifically sup-

ports the terminal differentiation and prolif-

eration of eosinophil precursors as well as

the eosinophil activation effect (11-13). Sev-

eral chemoattractants are involved in both in

vitro and in vivo eosinophil migration. Many

investigators have demonstrated a direct cor-

relation between eosinophilia and IL-5 in

human helminth infection and in experimen-

tal animal models. It has also been demon-

strated that anti-IL-5 mAb treatment inhibits

eosinophilia in mice infected with Toxocara

canis,

Nippostrongylus brasiliensis and

Schistosoma mansoni (14-16). In addition,

IL-5 plays an important role in mobilizing

eosinophils from bone marrow to peripheral

blood and in priming eosinophils to respond

easily to other chemotactic stimuli such as

chemokines and lipid mediators (7,17). When

a low dose of IL-5 is administered intrave-

nously, it rapidly and dramatically enhances

the eosinophil accumulation induced by in-

tradermally injected eotaxin and leukotriene

(17), suggesting a link between chemoat-

tractant factors and IL-5. It has been demon-

strated that the chemotactic activity of eosino-

phils in bronchoalveolar lavage fluid ob-

tained from rats infected with T. canis was

significantly reduced after treatment with

either a specific leukotriene B

receptor an-

tagonist (ONO-4057), a platelet aggregating

factor receptor antagonist (TCV-309), and

an anti-IL-5 mAb (TB13) (18). This suggests

that these three factors contribute to the ac-

cumulation of eosinophils in the lungs of rats

infected with T. canis. More recently, it was

shown that antigen-induced eosinophilia in

the lung is indirectly dependent on cysteinyl

leukotrienes through IL-5 production in a

model of late asthmatic response (19). We

Eosinophils x 10

/ml

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0.0

PBS/PBS Isotype/F1 TRFK-5/F1

Neutrophils x 10

/ml

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0.0

Mononuclear cells x 10

/ml

PBS/PBS Isotype/F1 TRFK-5/F1

Treatment/stimuli

Figure 1. Effect of pretreatment

with TRFK-5 on mononuclear

cell, neutrophil, and eosinophil

recruitment. C57BL/6 mice re-

ceived 300 µg polysaccharide

fraction 1 (F1) isolated from the

cell wall of Histoplasma capsu-

latum, ip. Cell numbers are re-

ported as the mean ± SEM for

5-7 mice per group. *P < 0.01

and **P < 0.001 vs PBS/PBS

group;

P < 0.01 vs isotype/F1

group (two-way ANOVA).

346

Braz J Med Biol Res 37(3) 2004

A. Sá-Nunes et al.

demonstrated that leukotrienes are involved

in leukocyte recruitment induced by F1 of H.

capsulatum. Treatment of mice with the MK-

886 compound, an inhibitor of leukotriene

synthesis, partially blocked neutrophil, eo-

sinophil, and mononuclear cell recruitment

(9).

Interestingly, there was an increase in

neutrophil recruitment to the peritoneal cav-

ity induced by F1 in the group treated with

TRFK-5. We have demonstrated that TRFK-

5 suppressed eosinophilia and increased IL-

8 levels in guinea pigs infected with T. canis,

a nematode parasite (8). Probably the same

phenomena occurred in F1 TRFK-5-treated

mice. The decrease in IL-5 by TRFK-5 treat-

ment should up-regulate the KC chemokine

(murine IL-8) levels, and F1 should recruit

more neutrophils to the peritoneal cavity,

since this molecule is chemotactic for neu-

trophils (20).

Finally, in the present study we demon-

strated that F1-induced eosinophil recruit-

ment, but not the recruitment of other cell

types, is IL-5-dependent within a specific

time window, i.e., 48 h after F1 injection.

We suggest that the eosinophil recruitment

induced by ip injection of F1 is mediated by

an interaction between at least two eosino-

philic mediators, leukotrienes and IL-5.

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Anderson Sá-Nunes et al., 2004

Trabalho submetido a Microbes and Infection

Efficacy of cell-free antigens to evaluate cell immunity and

to induce protection in a murine model of histoplasmosis

Anderson Sá-Nunes

, Alexandra I. Medeiros

, Roberto Nicolete

, Fabiani G. Frantz

Ademilson Panunto-Castelo

, Célio L. Silva

, and Lúcia H. Faccioli

Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Av. do Café s/no., Ribeirão Preto, São Paulo 14040-903, Brazil

Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-900, Brazil

Centro de Pesquisas em Tuberculose, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Instituto do Milênio Rede-TB,

Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto, São Paulo 14049-900, Brazil

Abstract

Histoplasma capsulatum is a dimorphic pathogenic fungus that causes a wide spectrum of disease when

mycelial fragments are inhaled. Resistance to H. capsulatum is dependent on a cellular immunity mediated by T cells and

macrophages. Here we standardized the production of extracts containing cell-free antigens (CFAgs) and observed their

efficacy in evaluating cell-immunity during murine histoplasmosis. CFAgs induced a more potent DTH response in H.

capsulatum-infected mice than did histoplasmin - a classical antigen. This DTH response to CFAgs is able to determine

the immune status of infected mice and to predict their death. Moreover, CFAgs stimulated in vitro splenocytes from

immune mice to produce high amounts of gamma interferon (IFN-γ). Finally, the immunization with CFAgs protected

against a lethal inoculum of H. capsulatum. These results demonstrate that CFAgs may be useful for the evaluation of

cellular immune response and as a potential source for the development of a vaccine against histoplasmosis.

Keywords: Histoplasma capsulatum, cell-free antigens, vaccine, interferon-γ

1. Introduction

Infection with the dimorphic fungus Histoplasma

capsulatum ranges from a mild asymptomatic illness to

a progressive and disseminated disease. Resistance to H.

capsulatum in mammals is dependent on a cellular

immune response mediated by CD4

and CD8

T cells

and mononuclear phagocytes [1-5]. Particularly, T cells

play a key role in controlling the disease that correlates

with the production of cytokines, especially gamma

interferon (IFN-γ) a critical cytokine involved in the

protective immune response in mice against H.

capsulatum [6-8].

Delayed-type hypersensivity (DTH) response is an

important determinant of prior exposure and is often

used to evaluate the degree of host cellular immune

response to a wide range of pathogens. It has been

demonstrated that H. capsulatum-reactive CD4

T cells

can induce DTH responses in mice [9]. Several years

ago, Standard & Kaufman [10, 11] produced extracts

directly from agar-slanted cultures of H. capsulatum

_____________________________________________

* Corresponding author. Tel: +55-16-602-4303, Fax: +55-16-

633-1936.

E-mail address: [email protected] (L.H. Faccioli)

and Coccidioidis immitis in aqueous solutions of

merthiolate. Reactions of these extracts containing cell-

free antigens (CFAgs) with standard sera were able to

identify clinical isolates of those fungi. Also, Camargo

et al. [12] used a similar preparation in serological tests

for the immunodiagnosis of paracoccidioidomycosis.

Since these years, some antigens were tested with the

same purpose [13, 14] but their preparation and

standardization are time-consuming phases.

Nevertheless, CFAgs, which are prepared by a simple

and rapid method from H. capsulatum yeast cultures

were never tested to evaluate cellular immunity in

histoplasmosis.

Many vaccines have been licensed for viral and

bacterial human diseases but at the present time, there

are no licensed vaccines for the prevention or treatment

of human fungal infections. Vaccination is able to

protect against several fungal pathogens in experimental

models of Candida albicans [15], Cryptococcus

neoformans [16, 17], Aspergillus fumigatus [18],

Blastomyces dermatitides [19] and Coccidioides immitis

[20, 21]. Deepe et al. carried out a series of studies to

identify protective immunogens from H. capsulatum for

the vaccine development. These studies have show

several promising antigens such as the extract of the

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

cell wall and cell membrane (CW/M) of the yeast

phase and its isolated proteins, HIS-62 and HIS-80 that

are homologous to heat shock proteins 60 and 70,

respectively [22-24] and recombinant H antigen [25,

26].

In the present work we produced CFAgs to elicit

DTH responses in H. capsulatum-infected mice and

compared these responses to that induced by

histoplasmin. We also tested the CFAgs ability to

induce IFN-γ production by spleen cells in vitro and to

elicit a protective immune response in H. capsulatum-

infected mice when used as a vaccine.

2. Materials and methods

2.1. Mice

Male C57BL/6 mice, 6-8 weeks old, were purchased

from the Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil. All

experiments were approved and conducted in

accordance with the guidelines of the Animal Care

Committee of the University. Infected animals were

kept in biohazard facilities and housed in cages within a

laminar flow safety enclosure under standard

conditions.

2.2. Preparation of H. capsulatum and infection of mice

The H. capsulatum strain was isolated from a patient

at the Hospital Universitário, Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Preparation

of H. capsulatum yeast cells was performed as

previously described [27]. Yeast cells were used when

fluorescein diacetate and ethidium bromide staining

revealed their viability to be ≥ 90% [28].

To determine the lethal dose 50% (LD

) animals

were intravenously (i.v.) infected with five different

doses of H. capsulatum (ranging 2.5 × 10

to 4 × 10

viable yeast cells in a volume of 100 μl) and mortality

was scored daily over a 60-day period. A control group,

inoculated with PBS, was included in each experiment.

was calculated using the Moving Average

Interpolation Program [29]. Immune mice were

obtained after 60-day of infection with i.v. inoculation

of 5 × 10

yeast cells (sublethal inoculum). Lethal

challenge (10

yeasts, i.v.) was used to evaluate

mortality rates and cellular immunity in subsequent

experiments (described later).

2.3. Preparation of CFAgs

CFAgs were produced according to Camargo et al.

[12] with minor modifications. Briefly, about 300 mg of

H. capsulatum yeasts growth on BHI-agar-blood slants

was collected and suspended in 1 ml of PBS, mixed for

60 s on a Vortex-mixer and centrifuged at 10,000 g for

60 s. The supernatant fluid was collected and the

procedure was repeated. This material was filtrated and

its protein content estimated using Coomassie Protein

Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, Illinois), using

albumin standard curves prepared according

manufacturer’s instructions.

2.4. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) of CFAgs

Two hundred micrograms of CFAgs were

electrophoresed in 12% polyacrylamide gel and stained

for 5 min with 0.15% Coomassie brilliant blue (Sigma,

St Louis, Mo.).

2.5. Induction and measurement of DTH response to

histoplasmin and CFAgs

The optimal protein concentration of CFAgs to DTH

reactions was obtained in experiments using immune

mice infected i.v. with 5 × 10

yeasts (sublethal

inoculum) of H. capsulatum. Sixty days post infection,

groups of mice received 0.2, 1 and 5 μg of CFAgs in a

volume of 50 μl into the left hind footpad. Uninfected

mice submitted to the footpad test with 5 μg of CFAgs

were used as control for unspecific reactions. DTH

response was evaluated during the course of infection

with the optimal concentration of CFAgs (5 μg/footpad).

Also, DTH response to cell-free antigens was compared

with that induced by histoplasmin, a classical culture

filtrate antigen which was a gift from Dr. Rosely

Zancopé-Oliveira from Serviço de Micologia, Instituto

de Pesquisa Clínica “Evandro Chagas” – FIOCRUZ –

Rio de Janeiro. DTH reactions to histoplasmin were

induced with 50 μl of the antigen in an optimal dilution

of 1:50. The footpad thickness was measured using a

calliper (Mitutoyo, Kawasaki, Japan) immediately before

and 24h after antigen inoculation, and the results are

expressed as the mean of difference between the

measures.

2.6. Splenocyte preparation and cytokine determination

Spleens from the survival-infected mice (6 months

post infection) and aged-matched uninfected control

were aseptically removed and minced, and the released

cells were washed three times in RPMI 1640 (Gibco

BRL, Grand Island, N.Y.). Cells were suspended at 5 ×

cells/ml in RPMI supplemented with 10% fetal

bovine serum (Gibco BRL), penicilin (100 U/ml – Gibco

BRL), streptomycin (100 μg/ml – Gibco BRL) and

dispensed into 96-well flat bottom microtiter plates in a

volume of 0.1 ml. Concanavalin A (2 μg/ml – Sigma, St.

Louis, Mo.) and CFAgs (50 μg/ml) were added to

triplicate wells (0.1 ml) and cultured for 72 h at 37

Commercially available ELISA antibodies were used to

measure IFN-γ (PharMingen, San Diego, CA).

Sensitivities were > 10 pg/ml.

2.7. Immunization with CFAgs

The first immunization was performed with CFAgs

emulsified in complete Freund’s adjuvant (v/v) at a

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

iii

st cells) and survival was scored

r 60 days (n = 5 per group).

e immunizations and 0.1 ml of PBS in the booster.

.8. Organ culture for H. capsulatum

was assessed as

ean CFUs per gram of tissue ± SEM.

.9. Statitics

nk test was used to analyze differences in survival.

. Results

.1. LD of H. capsulatum

t experiments used doses chosen

ased on these results.

Fig. 2. DTH response to CFAgs and histoplasmin in

uninfected controls and immune mice. Immune mice were

obtained after 60-day of infection with i.v. inoculation of 5

× 10

yeast cells (sublethal inoculum). The footpad

thickness was measured immediately before and 24h after

antigens inoculation, and the results are expressed as the

mean of difference between the measures. *P < 0.001

versus respective control;

P < 0.01 versus CFAgs 5 μg (n

= 5-8 per group).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

2.5 x 10

5 x 10

1 x 10

2 x 10

4 x 10

Days post infection

Percent Survival

viable H. capsulatum) were challenged

intradermally with 0.2, 1 and 5 μg of cell-free

antigens. Fig. 2 shows a dose-dependent increase in

footpad swelling and the inoculum of 5 μg induced

the strongest response (0.47 ± 0.054 mm) that

represented an increase of approximately 30% in

the footpad thickness. CFAgs are able to elicit a

potent DTH response in immune mice (P < 0.01),

approximately 2-times greater than histamine (0.23

± 0.031 mm).

Fig. 1. Survival profiles of mice infected with different H.

capsulatum inoculi. Mice were infected i.v. with H. capsulatum

(from 2.5 × 10

to 4 × 10

yea

final concentration of 250 μg/ml. Mice were injected

subcutaneously with 0.2 ml of emulsion (50 μg of

protein). One week later, mice received the same

amount of cell-free antigens emulsified in incomplete

Freund’s adjuvant. After two weeks, mice received a i.v.

booster of 5 μg of cell-free antigens in 0.1 ml. Control

group received an equal amount of bovine serum

albumin (BSA) suspended in the same adjuvants duri

3.3. Electrophoretic analysis of CFAgs

CFAgs were separated by SDS-PAGE under

reducing conditions by using a 12% gel. Separation

of CFAgs by electrophoresis produced a pattern

with 5 bands with molecular mass of 9-12, 31, 57,

70 and 80 kDa (Fig. 3).

Recovery of H. capsulatum was performed as

previously described [6]. Fungal burden

Two-way analyses of variance (ANOVA) and

Student’s t test were employed to analyze differences in

DTH responses and cytokine production and the log

Once the H. capsulatum strain used in this work was

isolated from a patient and it is not characterized, we

have determined its LD

after i.v. inoculation. Survival

of mice infected with H. capsulatum (ranging from 2.5

× 10

to 4 × 10

) is shown in Fig. 1. LD

calculated to 3

periods of infection was (× 10

): 1.68 ± 0.14, 1.23 ±

0.06 and 0.62 ± 0.09 for 30, 45 and 60 days,

respectively. Subsequen

Fig. 3. SDS-PAGE analysis of CFAgs with a 12%

polyacrylamide gel stained with Coomassie brilliant blue.

Molecular weight markers (10

) are depicted on the left of

he gel. t

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

CFAgs 0.2 μ g

CFAgs 1 μg

CFAgs 5 μg

Histoplasmin 1:50

Control Immune

Groups

Footpad swelling (mm)

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

I DTH response to CFAgs in mice infected with 5 × 10

yeas m

roups tion

Table 1

ndividual t cells of H. capsulatu

G Days post infec

7 1 28 60

infected

ean ± SEM

0.018 012 0.025 015 0.040 010 0.018 009

ected

05 0 0.06 0

0 0 0.03 05

0 0.04 05 0

0.02 0.06 0 0.03

0.03 0.05 0.06 0.01

± 0. ± 0. ± 0. ± 0.

Inf

0.12 0.12 0.37 0.58

0.02 0.09 0.06

Died

0.13 0.12 0.35 0.64

08 0.18 0.47 0.62

Died Died Died

0.11 0.08 0.26 0.60

0.08 0.03

Died Died

0.08 0.19 0.26 0.49

0.16 0.14 0.08

Died

0.09 0.06 0.09

Died

Mean ± SEM

0.08 ± 0.02 0.11 ± 0.02 0.24 ± 0.05 0.59 ± 0.03

Mice received 5 μg of CFAgs in 50 μl per footpad. The footpad thickness was measured immediately before and 24h after antigen

oculation.

sponse in H. capsulatum-

fected mice using CFAgs

action (higher than 0.1 mm) and these mice survived.

able to stimulate last-long specific cells in

mune mice

ter 6 months of infection. CFAgs stimulated spleen

IFN-γ similar to those

stimulated with Con A (Fig. 5).

the measures. *P < 0.01 versus control

= 5-8 per group).

gs confers protection in

. capsulatum-infected mice

whereas 100% of those immunized with CFAgs

3.4. Evaluating cellular re

CFAgs were also used to accompany the degree of

cellular immunity using different inoculi of H.

capsulatum. On the first 2 weeks post infection, there

was no significant DTH response observed in any

infected group. However, at 30 days post infection,

there was a supression in the DTH response from mice

infected with 10

yeast cells in association with

mortality induced by this inoculum. Mice infected with

5 × 10

and 5 × 10

yeast cells showed significant DTH

reaction (P < 0.01) when compared to uninfected

control animals (Fig. 4). Moreover, CFAgs are able to

discriminate individually the immunological status of an

animal during infection, predicting which mouse will

die or will survive. Table 1 shows the individual results

of DTH response of mice infected with 5 × 10

yeast

cells of H. capsulatum. In five infected mice, DTH

response to CFAgs appeared lower than 0.1 mm and

these mice died as soon as the reaction was determined.

The other five infected mice showed strong DTH

3.5. CFAgs are

Splenocytes from immune mice (previously infected

with H. capsulatum sublethal inoculum) and from

uninfected control animals were tested for their capacity

to respond in vitro to CFAgs (specific stimulation) or

Con A (polyclonal stimulation). IFN-γ production by

spleen cells from these immune mice was determined

cells produced high amounts of

0 7 14 21 28

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Control

5x10

1x10

Footpad swelling (mm)

Days post infection

Fig. 4. Kinetics of DTH response to CFAgs during H.

capsulatum infection. Mice were infected i.v. with different

doses of H. capsulatum and after 7, 15 and 30 days post

infection received 5 μg of CFAgs in the footpad. The footpad

thickness was measured immediately before and 24h after

antigen inoculation, and the results are expressed as the mean

of difference between

3.6. Immunization with CFA

Mice were immunized with CFAgs or BSA and i.v.

challenged with 10

H. capsulatum yeasts two weeks

later and we determined whether the immunization

with CFAgs is protective in mice infected with H.

capsulatum. All mice that were immunized with BSA

succumbed to infection until 45 days post infection,

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

from control

roup incubated with the same stimuli (CFAgs or Con A).

from control

roup incubated with the same stimuli (CFAgs or Con A).

Fig. 5. IFN-γ production by splenocytes from immune and uninfected

control mice. The data represent the mean ± SEM of cytokines

produced by splenocytes from five or six mice per group. *P < 0.01

versus cells incubated with medium;

P < 0.05 versus cells cells

survived until the end of observation period of 60 days post

infection (Fig. 6A). On the 7

, 15

and 30

days post infection,

mice were sacrificed and fungal recovery from lungs and

spleens was determined. Organs from mice immunized with

CFAgs contained significantl wer CFU than those from mice

decreased yeast CFU in 0.45, 1.00 and 1.87

log

(P < 0.01) on the 7

, 15

and 30

days

post infection, respectively, in comparison with

BSA immunization (Fig. 6B). In lungs, CFAgs

immunization decreased yeast CFU in 4.13 and

4.21 log

(P < 0.01) on the 15

and 30

days

post infection, respectively, in comparison with

BSA immunization (Fig. 6C).

survived until the end of observation period of 60 days post

infection (Fig. 6A). On the 7

, 15

and 30

days post infection,

mice were sacrificed and fungal recovery from lungs and

spleens was determined. Organs from mice immunized with

CFAgs contained significantly fewer CFU than those from mice

decreased yeast CFU in 0.45, 1.00 and 1.87

log

(P < 0.01) on the 7

, 15

and 30

days

post infection, respectively, in comparison with

BSA immunization (Fig. 6B). In lungs, CFAgs

immunization decreased yeast CFU in 4.13 and

4.21 log

(P < 0.01) on the 15

and 30

days

post infection, respectively, in comparison with

BSA immunization (Fig. 6C).

Medium CFAgs Con A

20000

40000

60000

80000

Control

Immune

Stimuli

IFN-

(pg/ml)

y fe

unized with BSA. In spleens, CFAgs immunization unized with BSA. In spleens, CFAgs immunization imim

4. Discussion 4. Discussion

The nature of antigens that induces cell-

mediated or humoral responses by H.

capsulatum is not totally clear until the moment.

Intradermal tests using a filtrate antigen,

histoplasmin, are carried out all over the world

and its preparation and standardization were set

up in 1945 [30]. The H antigen, present in

histoplasmin (used here as a control of DTH

reaction) is recognized in sera of patients with

histoplasmosis [31] and may be one of the

active constituents in the culture filtrate able to

elicit DTH response in individuals exposed to

H. capsulatum

The nature of antigens that induces cell-

mediated or humoral responses by H.

capsulatum is not totally clear until the moment.

Intradermal tests using a filtrate antigen,

histoplasmin, are carried out all over the world

and its preparation and standardization were set

up in 1945 [30]. The H antigen, present in

histoplasmin (used here as a control of DTH

reaction) is recognized in sera of patients with

histoplasmosis [31] and may be one of the

active constituents in the culture filtrate able to

elicit DTH response in individuals exposed to

H. capsulatum

0 10 20 30 40 50 60

100

PBS + Hc

EXO + Hc

Days post infection

Percent survival

71530

BSA

CFAgs

Days post infection

CFU/g spleen (log

)

71530

CFU/g lung (log

)

Days post infection

Fig. 6. Protective efficacy of CFAgs in H. capsulatum-infected mice. Mice immunized with CFAgs or BSA were challenged 2

weeks later with 10

H. capsulatum yeast cells. (A) The survival of immunized mice was monitored during 60 days. Lung (A)

and spleen (B) CFU were recovered at 7, 15 and 30 days post infection. The data represent the mean ± SEM log

CFU. (n = 5

er group in each point) *P < 0.001

Fig. 6. Protective efficacy of CFAgs in H. capsulatum-infected mice. Mice immunized with CFAgs or BSA were challenged 2

weeks later with 10

H. capsulatum yeast cells. (A) The survival of immunized mice was monitored during 60 days. Lung (A)

and spleen (B) CFU were recovered at 7, 15 and 30 days post infection. The data represent the mean ± SEM log

CFU. (n = 5

er group in each point) *P < 0.001 pp

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

[32-34]. In this study we have reported the antigenicity

and immunogenicity of CFAgs from H. capsulatum in a

model of systemic histoplasmosis. These antigens

elicited a potent DTH response in immune mice and did

not show nonspecific reactions in control mice. The

footpad increase induced by histoplasmin showed here

is in agreement with a previous work using this same

antigen [9]. However, we observed that CFAgs induced

a stronger response than histoplasmin. Additionally,

CFAgs were able to accompany the kinetics of

increase/decrease in immune status of infected mice.

When individually analyzed, infected mice that present

low-to-no responses died few days after evaluations

while mice presenting medium-to-high responses

survived to the infection. SDS-PAGE analysis of CFAgs

revealed the presence of ~70-kDa and ~80-kDa bands.

The band of 70 kDa seems to be similar to that detected

in serum of histoplasmosis patients by ELISA and

Western blotting [35, 36]. The band of 80 kDa seems to

be similar to that isolated from the extract of the cell

wall and cell membrane (CW/M) of H. capsulatum,

which showed homology with hsp70, it was able to

induce cellular and humoral immune response in H.

capsulatum-infected mice [24]. In addition, CFAgs

showed three bands on gels with masses of 57, 31 and

9-12 kDa. Therefore, the biological activities presented

here can be related to one or more bands and future

investigations will be carry out to elucidate this point.

In spite of the fact that yeast cells of H. capsulatum

represent the tissue phase of the fungus, until 15 years

ago most papers concerning T cell responses against the

fungus were focused on histoplasmin, a filtrate antigen

produced in mycelial phase [9, 37, 38]. More recently,

results showing several antigens secreted or present in

the yeast phase of H. capsulatum have been tested for

the development of a vaccine against histoplasmosis.

Potential candidates are CW/M [22], HIS-62 and HIS-

80 that are homologous to heat shock proteins 60 and

70, respectively [23, 24] and recombinants HSP60 [39]

and H antigen [25, 26]. Although some of them can be

promising, the use of isolated active components as

described seems not to be as efficient as administration

of antigen total extracts. Moreover, their complete

efficacy depends upon the strain of mice used, the route

of infection and in some cases, there were no mortality

studies conducted. We used intravenous challenge

because it seems to be the most aggressive route of

infection [40] and C57BL/6 mice because it is a

susceptible strain to histoplasmosis [41]. Recent results

obtained in our laboratory demonstrated that the same

vaccination protocol is also able to mediate protection to

lethal intratracheal infection with H. capsulatum (data

not shown). Immune mice (without detectable yeasts

after 60-day post infection) presented a strong DTH

response to CFAgs after 6 months of infection.

Splenocytes from these mice presented IFN-γ

production to CFAgs. The potent in vitro and in vivo

responses of infected mice to cell-free antigens

stimulate us to investigate the possibility that these

antigens could confer protection when used as a possible

vaccine. Interestingly, immunization with CFAgs was

able to induce a protective immunity reducing fungal

burden in lung and spleen and protecting infected mice

from a H. capsulatum lethal inoculum. Thus, CFAgs

contain molecules recognized by T cells that can

stimulate both in vivo and in vitro responses and

protective immunity.

The major points of this work are the aspects

concerning about the ability of the CFAgs to stimulate a

cell-mediated response in mice infected with H.

capsulatum. First, CFAgs induce a potent DTH reaction

in infected mice and this response reflects the degree of

immunity developed by individual mouse. Second,

CFAgs activate in vitro long-lasting H. capsulatum-

specific cells to produce IFN-γ, an essential cytokine for

a protective immunity. Third, CFAgs immunization is

able to protect mice against a lethal inoculum of H.

capsulatum and significantly reduce fungal burden in the

lungs and spleens from infected mice. In conclusion,

these findings support the potential protective efficacy of

CFAgs and further studies exploring the

proteins/fragments involved in this response are under

ay in our laboratory. w

cknowledgements A

This study was supported by grants from the Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

- 95/9691-6 and 00/01079-0), the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico, and the

Fundação de Amparo ao Ensino, Pesquisa e Assistência

do Hospital das Clínicas da FMRP-USP, Brazil. The

authors thank Dr. Claudia M.L. Maffei from

Departmento de Biologia Celular e Molecular e

Bioagentes Patogênicos – FMRP for graciously

providing the H. capsulatum strain and Dr. Rosely

Zancopé-Oliveira from Serviço de Micologia, Instituto

de Pesquisa Clínica “Evandro Chagas” – FIOCRUZ for

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i; cu

aeroso

of Blastomyces dermatitidis

mycosis in

, from the cell

protein 70 induces cell-mediated immune

unobiological activity of

atum in a murine model of

i, Blockade of endogenous leukotrienes

to study the viability of

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of the

on of a new soluble antigen from the yeast phase of

ion of a new soluble antigen complex prepared from

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osis patients: correlation between antigenemia

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om Histoplasma

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Anderson Sá-Nunes et al., 2004

Manuscrito em preparação

The Role of Granulocytes in Histoplasma capsulatum Infection

Anderson Sá-Nunes,* Alexandra I. Medeiros,* Edson G. Soares,† Cláudia M. Maffei,‡

Célio L. Silva,§ and Lúcia H. Faccioli

Recent studies have improved the understanding of granulocyte participation in many types of infection. Although

granulocyte-depletion has been associated with increased susceptibility of mice to a wide range of microbes, the

role of neutrophils and eosinophils in immune response against fungal pathogens is controversial. In this work we

investigated the neutrophil and eosinophil contribution in protective immune response against H. capsulatum.

Granulocyte depletion increased the severity of disseminated experimental histoplasmosis in mice and lately

affected the development of protective immune response. Moreover, lung and spleen fungal recovery was higher in

granulocyte-depleted mice than in non-depleted mice and, associated with this increased fungal burden, there was

an exacerbation of Th1 response in these mice. However, no differences in polarization or intensity of immune

response were observed at the beginning of infection. Nevertheless, IL-5 depletion did not alter the mortality of

infected mice or the acquisition of cellular immunity, suggesting that eosinophils did not participate in the changes

observed in granulocyte-depleted mice. Taken together, these results showed that neutrophil depletion at the

beginning of infection allows yeast multiplication and increases mortality of infected mice apparently by

exacerbation of Th1 response. A fungistatic mechanism more than production of cytokines seems to be responsible

for the protective immunity mediated by neutrophils in H. capsulatum-infected mice. This study improves the

understanding of innate immune response contribution on the protective immunity in histoplasmosis.

Neutrophils are well known as predominant cells

during acute inflammation and in many types of

infection. They contribute to host protection through

activities such as phagocytosis, oxidative mechanisms

and production of immunoregulatory cytokines and

chemokines during microbial infection. Studies on the

functional activities of neutrophils during microbial

pathogenic infections were improved by the

availability of the mAb RB6-8C5 which is highly

efficient at granulocyte depletion (1). Granulocyte-

depletion with RB6-8C5 has been associated to

increased susceptibility of mice to a wide range of

microbes, such as herpes simplex virus (2), Junin virus

(3); the

bacteria____________________________________

* Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e

Bromatológicas,

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto, †Departamento de Patologia, and

‡Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes

Patogênicos and §Departamento de Bioquímica e Imunologia,

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo, São Paulo, Brazil

This work was supported by Grants 95/09691-6 from

Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP) and Grants from Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Anderson Sá-Nunes is recipient of a fellowship from

FAPESP (00/01079-0).

Address correspondence: Dr. Lúcia H. Faccioli, Depto.

Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, FCFRP-

USP, Av. do Café s/no., Ribeirão Preto, SP 14040-903,

Brazil. Tel: +55-16-602-4303, Fax: +55-16-633-1936, E-mail

address: [email protected]

Mycobacterium tuberculosis (4, 5), M. bovis (6),

Legionella pneumophila (7), Listeria monocytogenes (8);

the parasites Entamoeba hystolytica (9), Leishmania

major (10), Toxoplasma gondii (11) and others. The

contribution of neutrophils in immune response against

fungal pathogens is controversial. In the one hand

neutrophils are important for host defense against

Candida albicans (12-14) and Aspergillus fumigatus

(15). On the other hand, neutropenia reduces

susceptibility of mice to Cryptococcus neoformans

infection (16). One previous publication had reported an

increased mortality in neutrophil-depleted mice infected

with Histoplasma capsulatum in comparison with non-

depleted mice (17).

Eosinophils have been the subject of extensive

investigation and its occurrence is observed mainly in

parasite infections and late phase of immediate

hypersensitivity diseases (18, 19). Many investigators

have demonstrated a direct correlation between

eosinophilia and IL-5 in human infections and

experimental animal models. It has been demonstrated

that neutralization of IL-5 using the treatment with mAb

TRFK-5 (anti-IL-5) inhibits eosinophilia in mice

infected with Toxocara canis,

Nippostrongylus

brasiliensis and Schistosoma mansoni (20-22). In

addition, IL-5 plays an important role in mobilizing

eosinophils from bone marrow to the peripheral blood

and for priming eosinophils to easier respond to other

chemotactic stimuli such as chemokines and lipidic

factors (23, 24). Eosinophils have been associated with

some human fungal infections, such as

coccidioidomycosis (25), aspergillosis (26),

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

paracoccidioidomycosis (27). We have demonstrated

eosinophil recruitment to the peritoneal cavity

induced by the dead or live H. capsulatum and by the

alkali-insoluble fraction (F1) from the cell wall of

the fungus (28). The eosinophil migration was

partially dependent of leukotrienes and blocked by

TRFK-5 administration (28, 29).

Histoplasmosis is a highly prevalent fungal

disease, mainly in Central and North America (30).

The disease caused by H. capsulatum initiates with

inhalation of the conidial or mycelial fragments that

convert into the pathogenic yeast form at the body

temperature of hosts (37

C). The magnitude of

exposure and the immune status of the host influence

the clinical manifestations of histoplasmosis and the

severe symptomatic disseminated histoplasmosis

occurs mostly in immunodeficient patients mainly as

the result of HIV infection, cancer chemotherapy and

transplantation (31). The protective response against

H. capsulatum is the cellular immunity mediated by

macrophages, CD4

and CD8

T cells (32-38).

However, the role of neutrophils and eosinophils in

host defense against H. capsulatum is not well

understood. In vitro studies have established that

neutrophils are able to engulf and kill mycelial

fragments, but not yeast cells (39). Also, it was

identified H. capsulatum organisms in circulating

eosinophils of a dog (40). Nevertheless, there is no

information concerning the granulocyte functions in

this fungal infection.

Based on these evidences, we investigated here

the role of granulocytes in protective immune

response against H. capsulatum. To determine their

contribution in this fungal infection we have

analyzed the effect of a single dose of mAb RB6-

8C5 and two treatment protocols with mAb TRFK-5

in a model of experimental disseminated

histoplasmosis.

Materials and Methods

Mice and infection

Male 6-week-old C57BL/6 mice were obtained from the

animal facilities of the Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto, campus of the

Universidade de São Paulo. Infected animals were kept in

biohazard facilities and housed in cages within a laminar

flow safety enclosure under standard condition. Mice were

inoculated i.v. with 10

H. capsulatum yeast cells in 0.1 ml

of sterile PBS. Control mice were inoculated i.v. with PBS

only. All experiments were approved and conducted in

accordance with guidelines of the Animal Care Committee

of the University.

Preparation of H. capsulatum

The H. capsulatum strain was isolated from a patient at the

Hospital Universitário, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo. The live mycelial phase

was obtained by culturing fungi at 25

C on Sabouraud

dextrose agar (Difco, Detroit, MI). H. capsulatum yeast cells

were grown at 37

C in Ham’s F12 medium (Gibco-BRL,

Grand Island, N.Y.) for 36 h. Yeast cells were washed three

times and suspended in balanced salt solution. Yeast cells were

used when fluorescein diacetate and ethidium bromide staining

revealed their viability to be over 95% (41).

Treatment of mice with mAb RB6-8C5 and TRFK-5

The hybridoma that secretes the anti-granulocyte mAb RB6-

8C5 was a gift from Dr. M. Mariano (Departamento de

Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Universidade

Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil). The hybridoma that

secretes the anti-IL-5 mAb TRFK-5 was a gift from Dr. I. A.

Abrahamsohn (Departamento de Imunologia, Instituto de

Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo,

Brazil). Antibodies were obtained from the culture supernatant

of respective hybridomas and purified by using a protein G-

agarose column (Gibco). Mice were injected i.p. with a single

dose of 300 μg of RB6-8C5 or rat IgG (Sigma, St Louis, MO) in

0.5 ml of PBS, 24 h before H. capsulatum infection. In control

mice, the same concentration of rat IgG was administered.

To exclude the participation of eosinophils in the effects

observed by the administration of RB6-8C5, the anti-IL-5 mAb

TRFK-5 was used. Two treatments were used. First, mice were

i.p. injected with a single dose of 100 μg of TRFK-5 in 0.5 ml

of PBS 24 h before H. capsulatum infection. In the second

protocol mice were i.p. injected with 500 μg of TRFK-5 24 h

before infection and received i.p. boosters of 100 μg after 7 and

15 days post infection.

Induction and measurement of delayed-type

hypersensitivity (DTH) reaction

Infected mice depleted or non-depleted of neutrophils were

challenged intradermally with an optimal inoculum of 5 μg cell-

free antigens of H. capsulatum in a volume of 0.05 ml at 7, 15

and 30 days post infection. Footpad swelling was measured with

a micrometer (Mitutoyo Sul Americana, Suzano, Brazil). The

DTH response was expressed as the mean ± SEM of the

difference in footpad thickness immediately before antigen

challenge and 24 h later in millimeters. As a control, DTH to

cell-free antigens was measured in uninfected mice at the same

periods.

Organ culture for H. capsulatum

Recovery of H. capsulatum was performed as described

previously (42) with minor modifications. Briefly, spleens from

infected mice were homogenized in 1ml of complete medium

(RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum,

penicilin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), L-glutamine (2

mM), and 2-ME (0.05 mM)- Gibco), and appropriately diluted.

Two hundred-microliters were plated in BHI-agar-blood

medium (Difco) in duplicates and after 21 days, fungal burden

was assessed as mean CFUs per whole organ ± SEM. The left

lungs from infected mice were weight and homogenized in 2 ml

of complete medium and appropriately diluted as previously

described (43). Two hundred-microliters were plated in BHI-

agar-blood medium in duplicates and after 21 days, fungal

burden was assessed as mean CFUs per organ grams ± SEM.

The limit of detection was 5x10

CFU.

Cytokine measurement

Splenocytes from depleted or non-depleted infected mice at 7

and 15 days post infection were suspended at a concentration of

5×10

cells in 0.1 ml of complete medium in 96-well plates.

Cells were incubated with the same volume of medium or 5

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

iii

μg/well of cell-free antigens of H. capsulatum in medium.

Cells were incubated at 37

C for 72 h and the culture

supernatants were collected and stored at – 70

. The left lungs

from uninfected and infected mice, depleted or non-depleted

of neutrophils were removed at 7 and 15 days post infection

and homogenized in 2 ml of complete medium, centrifuged at

1500 × g, filter sterilized, and stored at –70

C. At various

times post infection different groups of uninfected and

infected mice were bled and serum was collected and stored

at –70

C. The spleen cells culture supernatants, lung

homogenates and serum concentrations of IL-4, IL-10, TNF-

α and IFN-γ were determined by commercially available

ELISA kits using references standards curves (Pharmingen,

San Diego, CA). Sensitivities were >10 pg/ml.

Measurement of nitrite concentration

The concentration of nitrite (NO

) in spleen cells

supernatants and lung homogenates was measured at 7 and 15

days post infection by Griess reaction as previously described

(44). Briefly, 100 µl of the supernatants

were incubated with

an equal volume of the Griess reagent at

room temperature.

The NO

concentration

was determined using a standard

curve of 1 to 200 µM NaNO

. The data are presented as

micromoles of NO

per ml (mean ± SEM).

Histology

The right lungs and livers were removed on days 7 and 15

post infection and tissues fixed in 10% formalin and

embedded in paraffin blocks. For fungal elements, 5 μm

sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) or

Grocott’s methanemine silver (GMS). Analysis of the

sections was performed in a “blinded” fashion.

Statistics

Each experiment was repeated twice with similar results.

Statistical variations were determined by analyses of variance

and Student’s t test. The log-rank was used for statistical

analysis of mortality. A value of p < 0.05 was considered to

be significant.

Results

Neutrophils, but not eosinophils, are the essential

granulocytes in immune response against H.

capsulatum

As RB6-8C5 mAb depletes all blood granulocytes, we

separately investigated the participation of neutrophils

and eosinophils in murine histoplasmosis. All H.

capsulatum-infected mice treated with a single dose of

anti-granulocyte RB6-8C5 mAb died (17.6 ± 3.2 days

post infection) while in infected group that received rat

IgG only 20% (p < 0.01) of mice died during the

period of observation (Fig. 1A). To deplete

eosinophils, two protocols of treatment with TRFK-5

mAb were used, as described in Material and methods.

In both of them, no differences in mortality between

IL-5-depleted or non-depleted infected mice were

observed (Fig. 1B and 1C).

To evaluate if granulocyte depletion could affect

the development of a cellular immune response in

vivo, acquisition of DTH reactivity was evaluated in

H. capsulatum-infected mice at 7, 15 and 30 days post

infection. In infected group received only rat IgG, there

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Rat IgG+Hc

RB6-8C5+Hc

Survival (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Rat IgG+Hc

TRFK-5+Hc

Survival (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Rat IgG+Hc

TRFK-5+Hc

Days post infection

Survival (%)

FIGURE 1. Effect of granulocyte depletion and IL-5

neutralization on survival of naïve C57BL/6 mice after

i.v. infection with 10

H. capsulatum yeast cells. Mice

received i.p.: 250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-

granulocytes) or rat IgG (A); 100 μg of mAb TRFK-5

(anti-IL-5) or rat IgG (B); 500 μg of mAb TRFK-5 (anti-

IL-5) or rat IgG (C). After 24 h, mice were infected i.v.

with 10

yeast cells of H. capsulatum and survival was

monitorated. Mice from (C) received a booster of

antibodies at each 15 days in the first month of infection.

(n = 6-10)

was a significant increase in DTH response during the

course of infection when compared with uninfected

mice. Granulocyte-depleted infected group had a similar

increase of DTH response at the 7 days post infection.

Nevertheless, at 15 days post infection, infected group

depleted of granulocytes showed an inhibition of DTH

response to cell-free antigens (p < 0.05) when compared

with non-depleted group and did not show differences

when compared with uninfected control mice. At 30 days

post infection, DTH response was not evaluated in

granulocyte-depleted group since there was no mice

survival in this group (Table I). We also analyzed the

acquisition of DTH response to cell-

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

Table I. Neutrophil and eosinophil participation on acquisition of DTH response in experimental disseminated

histoplasmosis

Footpad swelling (mm)

Experiment 1

7 days p.i.

15 days p.i.

30 days p.i.

Control

0,018 ± 0.012

0,025 ± 0,015

0,040 ± 0,010

Rat IgG+Hc

0,083 ± 0,016*

0,114 ± 0,009**

0,360 ± 0,050**

RB6-8C5+Hc

0,087 ± 0,021*

0,034 ± 0,011†

Experiment 2

Control

0,002 ± 0.002

0,018 ± 0,009

0,012 ± 0,007

Rat IgG+Hc

0,046 ± 0,012

0,068 ± 0,013*

0,353 ± 0,036**

TRFK-5+Hc

0,024 ± 0,015

0,095 ± 0,012**

0.438 ± 0.060**

Mice i.p. received 250 μg of RB6-8C5 or rat IgG and 24 h before were i.v. infected with 10

viable yeasts of H. capsulatum.

Mice i.p. received 500 μg of TRFK-5 or rat IgG and 24 h before were i.v. infected with 5×10

viable yeasts of H. capsulatum. At 7

and 15 days post infection (p.i.) they received a booster of 100 μg of respectives mAb.

Mice were i.d. challenged with 5 μg of cell-free antigens of H. capsulatum in a volume of 0.05 ml. DTH response was expressed as

mean ± SEM of the difference in footpad thickness immediately before antigen challenge and 24 h later (n = 4-8).

*, p < 0,05 and ** p < 0,001 vs Control

†, p < 0,05 vs Rat IgG+Hc

free antigens in IL-5-depleted mice. Similarly to

mortality studies, no differences were observed in

DTH response of both infected groups, IL-5-depleted

or non-depleted (Table I).

In addition, fungal burden in the lungs and spleen

was assessed at 7 and 15 days post infection. On day

7, CFU in lungs of granulocyte-depleted mice did not

differ (p > 0.05) from those of non-depleted mice. At

the same period, CFU was increased 0.63 log

(p <

0.05) in livers of granulocyte-depleted mice in

comparison with non-depleted mice (Fig. 2A). On day

15, lungs and spleens of granulocyte-depleted mice

respectively contained 2.59 and 1.72 log

more CFU

(p < 0.05 and p < 0.01) compared with non-depleted

mice (Fig. 2A and 2B). No statistical significant

differences were observed in fungal burden in the

lungs and spleens between IL-5-depleted or non-

depleted mice at 7 and 15 days post infection (data not

shown).

Cytokines and NO

production in lung homogenates

and supernatants of spleen cells

Since eosinophils did not play any important role in

murine histoplasmosis, we examined only the effect

of neutrophil depletion on immunity development

during H. capsulatum infection. Spleen cells from

mice at 7 and 15 days post infection were in vitro

incubated with medium or cell-free antigens of H.

capsulatum for 72 h. Production of IL-4, IL-10, IFN-γ

and NO

was determined. Lung homogenates from the

same mice had their cytokines and nitric oxide content

also determined in the same periods of infection.

No significant differences were observed in IL-4

production by spleen cells incubated with medium at 7

or 15 days post infection between non-infected group

and both infected groups, depleted or non-depleted of

granulocytes (Fig. 3A and 3B). Stimulation of these cells

with cell-free antigens induced a slight increase of IL-4

production but only in infected non-depleted group (p <

0.05) at 7 days post infection (Fig. 3A). Spleen cells

from both infected groups incubated with medium

produced similar increased levels of IL-10 in

comparison with spleen cells from non-infected group at

7 days post infection, but only in the infected group

depleted of granulocytes these cells produced

significantly more IL-10 (p < 0.05) when stimulated

with cell-free antigens (Fig. 3C). At 15 days post

infection, spleen cells from granulocyte-depleted

infected group produced more IL-10 than the other

groups, which showed almost undetectable levels of this

cytokine (Fig. 3D). Spleen cells from non-infected mice

showed almost undetectable levels of IFN-γ and NO

On the other hand, spleen cells from both infected mice

produced high amounts of IFN-γ at 7 and 15 days post

infection (p < 0.01). However, only spleen cells from

infected group non-depleted of granulocytes produced

more IFN-γ (p < 0.05) when stimulated with

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

715

Rat IgG+Hc

RB6-8C5+Hc

Days post infection

UFC/spleen (log

)

715

Days post infection

UFC/ lung g (log

)

FIGURE 2. Recovery of H. capsulatum CFU from spleens and lungs of granulocyte-depleted or non-depleted

infected mice. Mice received 250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-granulocytes) or rat IgG and 24 h later, were infected

i.v. with 10

yeast cells of H. capsulatum. Organs were removed and cultured at 7 and 15 days post infection. One

representative experiment of two is shown. * p < 0.05 and ** p < 0.01 (n = 4-5).

cell-free antigens (Fig. 3E and F). In the same way, spleen cells

from both infected group produced nitric oxide when incubated

only with medium at 7 and 15 days post infection, but spleen

cells from granulocyte-depleted infected mice produced

significantly more NO

in this condition than did spleen cells

from non-depleted infected mice. On the other hand, spleen

cells from granulocyte-depleted infected mice were able to

increase the nitric oxide production when stimulated with cell-

free antigens, but this did not occur with spleen cells from non-

depleted infected group in the same condition (Fig. 3G and H).

No differences were observed in IL-4 content in lung

homogenates from non-infected and both infected groups at 7

and 15 days post infection (Fig. 4A). At 7 days post infection,

granulocyte-depleted infected group showed significantly more

IL-10 in lung homogenate than non-infected and non-depleted

infected mice (p < 0.05). At 15 days post infection, lung

homogenate from infected mice showed more IL-10 than did

non-depleted infected group (p < 0.05), but this content were

not different from that observed in non-infected group (Fig.

4B). Similar kinetic of IFN-γ and TNF-α content was observed

in lung homogenates from both infected groups, which showed

similar and significant levels of IFN-γ and TNF-α in

comparison with non-infected group. However, at 15 days post

infection, lung homogenates from granulocyte-depleted

infected group showed increased levels of these cytokines in

comparison with non-depleted infected group (Fig. 4C and D).

Related to this increase of IFN-γ and TNF-α levels in lung

homogenates from granulocyte-depleted infected mice, NO

content was 2-fold increased in this group, in comparison with

non-infected and non-depleted infected mice (p < 0.01) at 15

days post infection (Fig. 4E).

Histopathological analyses of livers and lungs

At 7 days post infection, livers of non-depleted infected mice

showed focal inflammatory infiltrates without necrotic areas

(Fig. 5B). Livers of granulocyte-depleted

infected mice showed an increased number of

these focal lesions (Fig. 5D). In both infected

groups, these inflammatory infiltrates are

present in all hepatic lobule and also associated

with centrilobular vein. The silver stain showed

yeasts presence inside of these infiltrates (Fig.

5C and E). At 15 days post infection there are

more, but focal cellular infiltrates in livers of

non-depleted infected group, with the presence

of lymphocytes and macrophages. The yeasts

are present in these lesions (Fig. 4F and G).

However, liver of infected mice depleted of

granulocytes showed disseminated and

confluent lesions with interstitial inflammation,

compromising both, the centrilobular vein and

the portal areas (Fig. 5H).

Histopathological lung analyses of both

infected groups at 7 days post infection showed

a similar non-exsudative diffuse interstitial

inflammation, with swelling of interalveolar

septa and presence of solid lesions with

macrophage predominance (Fig. 6C and E).

Yeasts are present in the lesions and in

parenchyma (Fig. 6D and F). At 15 days post

infection, there was dissemination of

inflammatory infiltrates but there were solid and

structured lesions with macrophages assuming

epithelioid cells aspect in infected group non-

depleted of granulocytes (Fig. 6G). The lung of

granulocyte-depleted infected group showed

confluent solid lesions with presence of

epithelioid cells. No necrotic areas were

observed, but there were extensive hemorrhagic

areas in parenchyma (Fig. 6I). Yeasts are

present in all organs, but there was increased

dissemination in lung of granulocyte-depleted

infected mice in comparison with non-depleted

infected group (Fig. 6H and 6J).

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

7 days post infection

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

Medium

ExoAgs

IL-4 (pg/ml)

15 days post infection

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

IL-4 (pg/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

500

1000

1500

2000

IL-10 (pg/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

500

1000

1500

2000

IL-10 (pg/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

6000

12000

18000

24000

30000

IFN-

(pg/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

6000

12000

18000

24000

30000

IFN-

(pg/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

***

Groups

(

M/ml)

Control Rat IgG+Hc RB6-8C5+Hc

***

Groups

2− (μ

M/ml)

FIGURE 3. IL-4, IL-10, IFN-γ, and NO

production by spleen cells of non-infected (Control) and H. capsulatum-

infected mice, depleted (RB6-8C5+Hc) or non-depleted (Rat IgG+Hc) of granulocytes. Mice received 250 μg of mAb

RB6-8C5 (anti-granulocytes) or rat IgG and 24 h later, were infected i.v. with 10

yeast cells of H. capsulatum. Spleen

cells were obtained at 7 and 15 days post infection and incubated with medium or 50 μg/ml of cell-free antigens for 72

h. . Cytokine levels were determined by ELISA and NO

was determined by Griess reaction. One representative

experiment of two is shown. * p < 0.05 and ** p < 0.01 versus same group incubated with medium;

p < 0.05 and

p <

0.01 versus Control;

p < 0.05 versus indicated group (n = 4-5)

FIGURE 3. IL-4, IL-10, IFN-γ, and NO

production by spleen cells of non-infected (Control) and H. capsulatum-

infected mice, depleted (RB6-8C5+Hc) or non-depleted (Rat IgG+Hc) of granulocytes. Mice received 250 μg of mAb

RB6-8C5 (anti-granulocytes) or rat IgG and 24 h later, were infected i.v. with 10

yeast cells of H. capsulatum. Spleen

cells were obtained at 7 and 15 days post infection and incubated with medium or 50 μg/ml of cell-free antigens for 72

h. . Cytokine levels were determined by ELISA and NO

was determined by Griess reaction. One representative

experiment of two is shown. * p < 0.05 and ** p < 0.01 versus same group incubated with medium;

p < 0.05 and

p <

0.01 versus Control;

p < 0.05 versus indicated group (n = 4-5)

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

vii

715

IL-4 (pg/ml)

715

150

300

450

600

750

IL-10 (pg/ml)

715

400

800

1200

1600

2000

***

IFN-

(pg/ml)

715

400

800

1200

1600

2000

***

Days post infection

TNF-

(pg/ml)

715

100

125

150

control

Rat IgG+Hc

RB6-8C5+Hc

Days post infection

(

M/ml)

FIGURE 4. IL-4, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α and NO

production in lung tissue of non-infected (Control) and H.

capsulatum-infected mice, depleted (RB6-8C5+Hc) or non-depleted (Rat IgG+Hc) of granulocytes. Mice received

250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-granulocytes) or rat IgG and 24 h later, were infected i.v. with 10

yeast cells of H.

capsulatum. Lungs were removed at 7 and 15 days post infection and homogenized in RPMI-C. Cytokine levels

were determined by ELISA and NO

was determined by Griess reaction. One representative experiment of two is

shown. * p < 0.05; ** p < 0.01 and *** p < 0.001 versus Control;

p < 0.05 and

p < 0.01 versus Rat IgG+Hc (n

= 4-5)

Absence of neutrophils did not alter serum cytokine

polarization during early stages of H. capsulatum infection

The determine whether neutrophil depletion is associated with

changes in Th1 and Th2 cytokine profile during histoplasmosis,

IFN-γ, IL-4 and IL-10 were determined in serum of infected

mice at 1, 3, 5 and 7 days post infection (Fig. 7). No significant

changes were observed in cytokine profile except for IL-4 and

IL-10 in the first day post infection. On this day IL-4 was 2-fold

higher in depleted group (p < 0.05), but did not differ from the

uninfected mice values (Fig. 7A). On the other

hand, IL-10 was 2-fold higher (p < 0.05) in non-

depleted group at the same day but, newly, it

did not differ from the uninfected group (Fig.

7B). No differences were observed for IFN-γ

during the period in which it was observed an

increased production of this cytokine at 5 and 7

days in both infected groups (Fig. 7C).

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

viii

A B

HE GMS

FIGURE 5. Photomicrographs of liver from uninfected mice (A, B) and H. capsulatum-infected mice, depleted (C, E, G)

or non-depleted (D, F, H) of granulocytes. Mice received 250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-granulocytes) or rat IgG and 24

h later, were infected i.v. with 10

yeast cells of H. capsulatum. Livers were removed at 15 days post infection, fixed in

10% formalin and embedded in paraffin blocks.Sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) or Grocott’s

methanemine silver (GMS). H. capsulatum yeast cells are indicated by the arrows.

GMS

E F

HE HE

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

FIGURE 6. Photomicrographs of lungs from uninfected mice (A, B) and H. capsulatum-infected mice, depleted

(C, E, G) or non-depleted (D, F, H) of granulocytes. Mice received 250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-granulocytes)

or rat IgG and 24 h later, were infected i.v. with 10

yeast cells of H. capsulatum. Lungs were removed at 15 days

post infection, fixed in 10% formalin and embedded in paraffin blocks. Sections were stained with hematoxylin

and eosin (HE) or Grocott’s methanemine silver (GMS). H. capsulatum yeast cells are indicated by the arrows and

interstitial haemorrhagic areas are indicated by arrows head.

HE HE

E F

HE HE

GMS GMS

G H

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

FIGURE 7. Time course of IL-4, IL-10 and IFN-γ

production in serum of uninfected (Control) and H.

capsulatum-infected mice, depleted (RB6-8C5+Hc) or

non-depleted (Rat IgG+Hc) of granulocytes. Mice

received 250 μg of mAb RB6-8C5 (anti-granulocytes) or

rat IgG and 24 h later, were infected i.v. with 10

yeast

cells of H. capsulatum. Blood were collected in the

indicated periods and sera was extracted. Cytokine levels

were determined by ELISA. One representative

experiment of two is shown. * p < 0.05; and ** p <

0.001 versus Control;

p < 0.05 versus Rat IgG+Hc (n =

4-5)

Discussion

In a previous study, it was demonstrated that depletion

of granulocytes with a single dose of mAb RB6-8C5 at

the time of infection resulted in accelerated mortality of

H. capsulatum-infected mice, but the mechanisms

involved in this increased susceptibility was not

investigated (17). The same was observed for us when a

single dose of mAb RB6-8C5 was administered to mice

one day before infection. Additionally, we investigated a

possible role of eosinophils in survival of H.

capsulatum-infected mice because some works have

shown an association between these cells and

histoplasmosis (40, 45). Moreover, eosinophils

participate of inflammatory response after i.p. injection

of H. capsulatum or an alkali-insoluble fraction (F1)

isolated from its cell wall (28) and TRFK-5 is able to

block this peritoneal eosinophilia (29). Despite of these

evidences eosinophils did not participate in the

immunological features observed in mice treated with

RB6-8C5 mAb since mortality of mice received TRFK-

5 mAb or rat IgG was similar.

1357

250

500

750

1000

1250

1500

Days post infection

IFN-

(pg/ml)

1357

100

200

300

400

500

600

IL-10 (pg/ml)

1357

100

control

Rat IgG+Hc

RB6-8C5+Hc

IL-4 (pg/ml)

Thus, we showed that early depletion of neutrophils

increases the severity of disseminated experimental

histoplasmosis in mice. Although granulocyte-depleted

mice has produced more IL-4 than control and non-

depleted mice in the first day of infection, the

mechanism by which neutrophils participate of H.

capsulatum infection seems not to be by immune

deviation from Th1 to Th2 pattern since the same

profile of IL-4, IL-10 and IFN-γ production was found

in serum of depleted and non-depleted H. capsulatum-

infected mice at the first week of infection. This fact is

reinforced by analysis of acquisition of DTH reactivity,

used to access the cellular immune response in vivo.

The results presented here demonstrated that cellular

immunity is lately affected by granulocyte depletion

since both infected groups, granulocyte-depleted and

non-depleted showed similar footpad swelling during

the first week of infection and, once more IL-5 (and

consequently, eosinophil) depletion did not influence

the acquisition of immunity in histoplasmosis.

Earlier results showed that H. capsulatum mycelia

are susceptible to killing by human neutrophils in vitro,

but H. capsulatum yeasts are not (39). The authors

proposed that the in vitro susceptibility to killing by

neutrophils is the determinant factor with discriminates

if a fungus is pathogenic or opportunistic. Similar

results are found using yeasts from Paracoccidioides

brasiliensis that presents similar dimorphism to H.

capsulatum (39). Human neutrophils efficiently ingest

P. brasiliensis, but show a deffect of digestive ability

(46 ,47). Furthermore, these data are consistent with

other studies showing that H. capsulatum shows

resistance to killing by neutrophils, which have only a

fungistatic activity against yeast cells (48-50). Taken

together the literature and our results, we hypothesized

that neutrophils participate in protective immune

response against H. capsulatum not by significant

changes in cytokine or nitric oxide production, but by

the ability to restrain growth of fungus at the first week

of infection. These results suggest that in absence of

neutrophils, immunocompetent hosts are susceptible to

histoplasmosis and maybe could explain some human

H. capsulatum infections in apparently

immunocompetent hosts (51-54).

Despite of their incapacity to kill yeast cells,

neutrophils can be found in the inflammatory response

induced by i.p. and i.t. H. capsulatum infection (28,

55). Although there is no evidence concerning a

protective role of neutrophils on these infection models

until the moment, neutrophils probably contain the H.

capsulatum proliferation and this is sufficient until

activation of lymphocyte and macrophage mediated

Anderson Sá-Nunes et al., 2004

immune response. This in turn could explain the increase

of 50- and 380-fold in fungal recovery of spleens and

lungs respectively, from neutrophil-depleted mice at 15

days post infection. As a consequence, the excessive

fungal burden in organs led to an enhanced

inflammatory response and consequently to an over

activation of immune system and exacerbation of Th1

response, demonstrated by IFN-γ, TNF-α and nitric

oxide production in lung homogenates of neutrophil-

depleted mice. Several works had shown the relationship

between over production of these cytokines and nitric

oxide with tissue damage and death in experimental

models of infection (56, 57). Further studies using

neutrophil-depletion in iNOS knockout mice will carried

out in our laboratory to test this hypothesis. The impact

of neutrophil depletion in secondary infection was not

investigated for us, since Zhou et al. (17) had already

demonstrated that after the development of an effective

acquired response, neutrophils are not essential for the

maintenance of immunity.

We showed here that administration of granulocyte-

depleting RB6-8C5 mAb during experimental

disseminated histoplasmosis enhanced the multiplication

of yeasts and the mortality of infected mice apparently

by exacerbation of Th1 response. Maybe a fungistatic

mechanism more than production of cytokines seems to

mediate this protective immunity of neutrophils during

histoplasmosis. Eosinophils are not involved in this

phenomenum. In conclusion, this study is useful to

improve our understanding of the immune response in

histoplasmosis and providing further evidences about

the role of neutrophils on the fungal diseases,

particularly on disseminated histoplasmosis.

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