ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA
Estudos sobre o processo de cristalização de
heme em Rhodnius prolixus
Renata Stiebler
Rio de Janeiro
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
II
LOMBADA
Renata Stiebler
E
s
t
u
d
o
s
s
o
b
r
e
o
p
r
o
c
e
s
s
o
d
e
c
r
i
s
t
a
l
i
z
a
ç
ã
o
d
e
h
e
m
e
e
m
R
h
o
d
n
i
u
s
p
r
o
l
i
x
u
s
UFRJ
V.I
ads:
III
Renata Stiebler
Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius prolixus
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Química
Biológica, Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Química
Biológica.
Orientador: Marcus Fernandes de Oliveira
Rio de Janeiro
2008
IV
FICHA CATALOGRÁFICA
STIEBLER, RENATA
Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius
prolixus / Renata Stiebler
Rio de Janeiro, 2008.
xiv, 82 f .: il
Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, 2008.
Orientador: Marcus Fernandes de Oliveira
1. Hemozoína.
2. Heme.
3. Rhodnius prolixus - Teses.
I. Oliveira, Marcus Fernandes.
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica
Médica.
III. Estudos sobre o processo de cristalização de heme.
V
FOLHA DE APROVAÇÃO
Renata Stiebler
Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius prolixus
Rio de Janeiro, 01 de abril de 2008.
(Marcus Fernandes de Oliveira, Professor adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – Centro de
Ciências da Saúde (CCS)- Universidade Federal do Rio de Janeiro).
(Mário Alberto Cardoso da Silva Neto, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica
Centro de Ciências da Saúde (CCS)- Universidade Federal do Rio de Janeiro).
(Patrícia de Azambuja Penna, Pesquisadora da Fundação Oswaldo Cruz - Fundação Oswaldo
Cruz).
(Márcia Cristina Paes, Professora Adjunta do Departamento de Bioquímica Médica, Universidade
Estadual do Rio de Janeiro).
(Marcos Henrique Ferreira Sorgine, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica -
Centro de Ciências da Saúde (CCS) - Universidade Federal do Rio de Janeiro).
(Ednildo de Alcântara Machado, Professor Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Centro de Ciências da Saúde (CCS) – Universidade Federal do Rio de Janeiro).
VI
AGRADECIMENTOS
Primeiramente ao Marcus, pela orientação, carinho, paciência e amizade ao longo de
todos estes anos. Obrigada por tudo, obrigada pela confiança, por acreditar em mim!
A Lili, pelo começo de tudo! Obrigada por, indiretamente, me mostrar um outro
caminho ali na Nutrição... Dizem que um bom filho a casa torna, será?? Obrigada também
pelas tantas conversas e incentivos!
A Angelica, pela paciência, por toda ajuda e amizade em todos esses anos!
A Helena e ao Hector, por todo carinho apoio e incentivo.
Ao Pedro, pelo espaço, pela competência.
A todos do Laboratório de Artrópodes Hematófagos e do LBM! Em especial ao Zé e
Tiago, por serem tão organizados! Por se preocuparem com todos e por tornarem nosso
ambiente de trabalho um pouco menos caótico. Um obrigada especial também a Renata,
Juliana, Clarinha, Elen, Liliane, Luiza, Joana, Kethleen, Chis, Milane, Ana Caroline, Donato,
aos professores Marcos (obrigada pela revisão e conselhos nesta tese) e Gabriela e a todos os
outros membros do laboratório! Obrigada pelo acolhimento em especial nestes últimos anos e
por tornarem o dia a dia de trabalho uma grande diversão, é muito bom trabalhar com vocês!
Obrigada pelas conversas na hora do almoço, pelas discussões sempre muito proveitosas,
pelos lanches no Bloco A entre um experimento e outro!
Ao Laboratório do Masuda e a todos do antigo GKM! Obrigada ao Masuda, por
permitir que eu ficasse em seu laboratório tanto tempo. Obrigada a Lílian, Helo, Lize, Denise,
Maya, Alan Brito, Alan Barbosa, Rachel, Raquelzinha, Petter e os professores Kátia, Geórgia
e Mário pelo companheirismo, discussões e festas de todos estes anos. Ta, obrigada a você
também David, por todo carinho e amizade.
A todos os membros da banca: Patrícia Azambuja, Márcia Paes, Mario Alberto e
Ednildo Machado.
VII
Aos “irmãos” da Nutrição: Fabi e Vagner! Meus grandes companheiros das primeiras
SBBqs da vida!
Aos eternos amigos do São Vicente: Lorenzo, Babu, Bruno, Palombo, e a tantos
outros. Um agradecimento especial a Fernanda, Vivian, Letícia e Júlia, por provarem que a
amizade é imutável ao tempo! Obrigada pelo carinho, conselhos e puxões de orelha! Vocês
são todos muito especiais.
Ao melhor que a Nutrição me deu: “o grupo do Mal”. Minhas queridas amigas Elisa,
Ellen, Marcela, Patty, Ana Paty e Júlia. Obrigada pelo convívio, brincadeiras e por segurarem
as pontas na época de faculdade enquanto eu matava aula no Laboratório! Obrigada pela
força, o resultado está aqui!
Obrigada a toda a minha querida família e agregados! Ao meu pai, mãe e Nanda por
todo amor, apoio e compreensão. As minhas avós Mary e Gilda, Vovô Ivan e Célia, meus tios
Bia, Chico, Meg e Cacá, minha prima Luiza, e a Marianne pelo carinho. Obrigada também ao
vovô Dino, vovô Nando e Magali, que de alguma maneira sei que olham por mim! Muito
obrigada por tudo!
Finalmente ao Daniel, por todo amor, carinho e companheirismo ao longo de todos
estes anos. Obrigada por todos os momentos que passamos juntos e pelo apoio incondicional.
VIII
Páginas
X
XI
XIII
XIV
1
6
11
20
27
28
28
28
29
29
30
30
30
31
31
31
32
ÍNDICE
ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
1) INTRODUÇÃO
1.1) O modelo de estudo: o inseto Rhodnius prolixus
1.2) A molécula de heme e a hematofagia
1.3) A formação do cristal de Hemozoína em organismos hematófagos
1.4) As drogas quinolínicas
2) OBJETIVOS
3) MATERIAIS E MÉTODOS
3.1) Animais
3.2) Obtenção de intestino total de R. Prolixus
3.3) Fracionamento do intestino total
3.4) Dosagem de proteína
3.5) Extração lipídica
3.6) Síntese de hemozoína in vitro
3.7) Extração de Hemozoína
3.8) Dosagem de Hemozoína
3.9) Dosagem de heme total
3.10) Análise por espectrofotometria das frações do gradiente de sacarose
3.11) Cinética da cristalização espontânea de heme in vitro catalisada por DMSO
3.12) Solubilização do heme em DMSO
IX
32
33
33
35
41
42
45
48
49
52
55
60
71
3.13) Ensaio in vivo com Azadiractina
3.14) Síntese de hemozoína in vitro em placa – método para o teste das drogas quinolínicas
3.15) Tratamento do intestino total de R. prolixus com condroitinase
4) RESULTADOS
4.1) A cristalização espontânea de heme in vitro é regulada pela polaridade do meio de reação
4.2) Quantificação de algun componentes do homogeneizado total do intestino de R. prolixus
4.3) A formação de Hz é induzida por diferentes componentes do intestino de R. prolixus
4.4) O tratamento com azadiractina diminui os níveis de heme intestinais e o eleva na
hemolinfa
4.5) Glicosaminoglicanos sulfatados presentes no intestino de Rhodnius prolixus estão
envolvidos no processo de cristalização de heme
4.6) O grau de solubilidade do heme depende da densidade das frações do homogeneizado
total do intestino de Rhodnius prolixus
4.7) As frações de baixa densidade do gradiente de sacarose são menos eficientes na
cristalização de heme de que nas frações de maior densidade
4.8) Drogas quinolínicas inibem a cristalização de heme em R. prolixus
5) DISCUSSÃO
6) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
X
Abreviaturas
CS – Condroitin Sulfato
DMSO – dimetilsulfóxido
GAGs – Glicosaminoglicanos
Hb – Hemoglobina
HRPs – proteínas ricas em histidina
Hz – Hemozoína
MM – membranas microvilares
MPMV – membranas perimicrovilares
nm – nanômetros
OH
•
– radical hidroxil
PBS – tampão fosfato em solução salina
PEG – polietilenoglicol
R
•
– radical alquil
RH – ácido graxo insaturado
RHBP – Rhodnius Heme Binding Protein
RO
•
– radical alcoxil
ROO
•
– radical peroxil
ROOH – hidroperóxido orgânico
ROS – espécies reativas de oxigênio
SDS – dodecil sulfato de sódio
TLC – cromatografia de camada fina
XI
Páginas
2
3
4
5
6
7
9
13
17
18
20
21
23
25
26
36
38
40
Lista de Figuras
Introdução
Figura 1: Rhodnius prolixus adulto.
Figura 2: Os diferentes estágios de desenvolvimento do R. prolixus.
Figura 3: R. prolixus antes e após alimentação.
Figura 4: Sistema digestivo do R. prolixus.
Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão do intestino de R. prolixus.
Figura 6: Representação esquemática da estrutura da molécula de heme.
Figura 7: Mecanismos pró-oxidantes do heme e do ferro.
Figura 8: Representação esquemática da estrutura dos cristais de β-hematina e Hz.
Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão de corte transversal do intestino de fêmeas
adultas de S. mansoni.
Figura 10: Porcentagem de conversão do heme em Hz na presença de uma camada
aquosa/lipídica.
Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura dos cristais de heme.
Figura 12: Padrões de Difração de raios-X dos cristais de heme isolados de S. mansoni, R.
prolixus e β-hematina.
Figura 13: Algumas das drogas quinolínicas utilizadas como antimaláricos e inibidoras da
formação de Hz.
Figura 14: Modelo proposto para ilustrar o mecanismo pelo qual a cloroquina interage com o
heme e inibe a formação de Hz
Figura 15: Inibição da formação de Hz por cloroquina in vivo.
Resultados
Figura 16: Efeito temporal do DMSO e PEG 6000 sobre a cristalização espontânea de heme.
Figura 17: A redução da polaridade do meio com diferentes concentrações de DMSO
aumenta a solubilização do heme em meio ácido.
Figura 18: A redução da polaridade do meio acelera a cristalização espontânea do heme in
vitro.
XII
42
44
44
46
49
51
54
56
57
59
41
Figura 19: Lipídeos isolados do intestino de R. prolixus são capazes de promover a
cristalização do heme in vitro de forma termo-sensível.
Figura 20: Cristais de Hz são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise.
Figura 21: A Hz é capaz de reduzir a solubilidade do heme in vitro.
Figura 22: A azadiractina interfere na cristalização de heme no inseto R. prolixus.
Figura 23: Condroitin sulfato desempenha um papel importante sobre a formação de Hz
induzida pelo homogeneizado total de intestino do R. prolixus.
Figura 24: As frações de menor densidade obtidas no gradiente de sacarose do fracionamento
do homogeneizado intestinal do R. prolixus possuem espectro típico de heme enquanto que as
frações mais densas apresentam características típicas de Hz.
Figura 25: As frações de maior densidade do intestino de R. prolixus apresentam maior
capacidade de formação de Hz.
Figura 26: Efeito de drogas quinolínicas na formação de Hz in vitro induzida pelos lipídeos
intestinais de R. prolixus.
Figura 27: Efeito da quinidina na formação de Hz in vivo em R. prolixus.
Figura 28: Novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente são eficientes na inibição da
formação de Hz in vitro induzida pelo homogeneizado total do intestino de R. prolixus.
Lista de Tabelas
Resultados
Tabela 1: Dosagem de componentes do intestino de Rhodnius prolixus.
XIII
Resumo
STIEBLER, Renata. Estudos sobre o processo de cristalização de heme. Rio de Janeiro, 2008.
Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
O inseto hematófago Rhodnius prolixus, um vetor da Doença de Chagas, ao ingerir
sangue e digerir a hemoglobina libera em seu trato digestivo grandes quantidades de heme.
Esta molécula quando livre, é extremamente tóxica pois gera espécies reativas de oxigênio,
leva a peroxidação lipídica e promove a lise celular. Assim, os organismos hematófagos
necessitam de mecanismos protetores para evitar sua toxicidade. A hemozoína (Hz) é um
cristal de heme produzido pelo parasito da malária, o Plasmodium falciparum, pelo inseto R.
prolixus e outros triatomineos e pelo helminto Schistosoma mansoni como um eficiente
mecanismo para a detoxificação do heme livre. A inibição da formação de Hz leva a
condições de estresse oxidativo e o uso de drogas quinolínicas, muito utilizadas ainda hoje no
tratamento da Malária, apresenta este fim. Estas drogas ligam-se à molécula de heme livre,
impedindo sua cristalização. No R. prolixus a cristalização de Hz ocorre por intermédio das
membranas perimicrovilares (MPMV) que recobrem as células intestinais. O objetivo da
presente tese foi investigar os mecanismos de cristalização de heme, química e
biologicamente, mais especificamente no intestino do R. prolixus. Em condições ácidas, a
redução da polaridade do meio com o uso de DMSO ou PEG promoveu uma aceleração da
cristalização do heme e o DMSO aumentou a solubilidade do heme, observada através do
incremento na absorção da relação das bandas de Soret/Q. Lipídeos totais e cristais de Hz
purificados do conteúdo intestinal do R. prolixus foram capazes de induzir a formação de Hz.
O fracionamento do conteúdo intestinal de fêmeas adultas em gradiente de sacarose resultou
no aparecimento de cinco frações, com diferentes espectros de absorção de luz. As frações de
menor densidade apresentaram um espectro similar ao heme e as frações mais densas tiveram
espectro característico de Hz. A solubilidade do heme presente nestas últimas frações era
menor do que nas primeiras, entretanto, as menos densas foram as mais eficientes em
cristalizar o heme, mesmo com uma menor capacidade em solubiliza-lo. Diversas quinolinas
comerciais e novas drogas sintéticas inibem a formação de Hz in vitro e in vivo. Podemos
concluir então que, apesar da solubilização do heme ser importante para a formação
espontânea de Hz, a MPMV do R. prolixus aparentemente utiliza mecanismos diferentes para
cristalização de Hz no processo de detoxificação do heme.
XIV
Abstract
STIEBLER, Renata. Studies on the heme crystallization process. Rio de Janeiro, 2008.
Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
The blood-sucking bug Rhodnius prolixus, a vector of Chagas Disease, during the
process of blood and hemoglobin digestion releases huge amounts of heme in the midgut.
Once in a free state, this molecule is very toxic because it is able to generate free radicals,
induce lipid peroxidation and cellular damage. Therefore, the hematophagous organisms
developed protective mechanisms to avoid heme toxicity. Hemozoin (Hz) is a heme crystal
produced by the malaria parasite, Plasmodium falciparum, the insect R. prolixus and others
triatomines and the helminth Schistosoma mansoni as a mechanism of free heme
detoxification. The inhibition of Hz formation leads to oxidative stress, and the use of
quinolines drugs, still used in the Malaria treatment, has this purpose. This drug acts by
binding to free heme, preventing its crystallization. In R. prolixus, Hz crystallization occurs in
the midgut and involves the perimicrovilar membranes (MPMV) that cover the midgut cells.
In the present work we aimed to investigate the mechanisms involved in chemical and
biological heme crystallization, specially in R. prolixus midgut. In acidic conditions, the
reduction of medium polarity, by the use of DMSO or PEG accelerated heme crystallization.
Moreover, DMSO increased heme solubilization in acidic milieu, assessed by the increment
of Soret/Q bands absorption ratio. Total lipids and Hz purified from the R. prolixus midgut
were able to induce Hz formation. The fractionation of midgut contents from adult females in
a sucrose gradient resulted in five fractions with distinct absorption spectra. The fractions that
showed the lower density presented a spectra more similar to heme, while the fractions with
higher density exhibited spectra typical of Hz. In addition, heme solubility on higher density
fractions was lower than in lower ones. Curiously, the lower density fractions revealed to be
more efficient in promoting heme crystallization, despite its lower capacity to solubilize heme
in acidic milieu. Several commercial quinolines and some new synthetic quinolines inhibited
Hz formation in vitro and in vivo. We can conclude that, although heme solubilization is
important to spontaneous Hz formation, the MPMV of R. prolixus midgut uses distinct
mechanisms to crystallize Hz and detoxification heme in this bug midgut.
1
1) Introdução:
1.1) O modelo de estudo: o inseto Rhodnius prolixus
A classe Insecta constitui aproximadamente 70% das espécies animais conhecidas e o
enorme sucesso evolutivo desse grupo deve-se a presença de asas e a possibilidade do vôo, que
permitiram não só a conquista dos mais variados ambientes mas também uma grande capacidade
de dispersão (Maranhão, 1977). A enorme diversidade deste grupo é resultado não só da
colonização bem sucedida, mas também da adaptação desses organismos aos mais diferentes
ecossistemas. Das mais de 1 milhão de espécies descritas de insetos, estima-se que
aproximadamente 14.000 sejam hematófagas (Lehane, 1991). O fato destes insetos hematófagos
serem vetores de diversos agentes etiológicos causadores de doenças como a malária, dengue,
leishmaniose, febre amarela e Doença de Chagas, torna este grupo extremamente importante
sobre o ponto de vista médico.
Assim como os outros insetos hematófagos, os insetos pertencentes à sub-família
Triatominae têm grande relevância do ponto de vista médico, uma vez que estes são vetores do
agente etiológico da Doença da Chagas, o protozoário Trypanosoma cruzi. O Rhodnius prolixus é
apontando como principal vetor dessa doença no norte da América do Sul e na América Central
(Lehane, 1991; Lent, 1999). No Brasil, esta espécie tem papel secundário como vetor, visto que o
Triatoma infestans é o principal responsável pela transmissão do Trypanosoma cruzi no país.
Quase um século após a descoberta da doença, que ocorreu em 1909 pelo pesquisador brasileiro
Carlos Chagas, a Doença de Chagas, que também é conhecida como Tripanosomiase Americana,
ainda representa um desafio internacional à saúde pública (WHO, 2006). Esta doença é
encontrada principalmente na América Latina, presente em 18 países, mas também já foi
2
detectada em paises não endêmicos como no Canadá, Estados Unidos e alguns paises da Europa.
Durante a década de 1980, a prevalência da doença estava em torno de 20 milhões de casos dos
quais 4,8 a 5,4 milhões exibiram sintomas clínicos (WHO, 2003). No momento, estima-se que a
prevalência de infecção seja de 13 milhões, com 3 a 3,3 milhões de casos sintomáticos e uma
incidência anual de 700 a 800 mil casos e 45 mil mortes em decorrência da doença (WHO,
2007b). Entretanto, apesar de ser altamente endêmica, a doença de Chagas permanece no grupo
das doenças negligenciadas.
Figura 1: Rhodnius prolixus adulto. (Obtido de www.jyi.org, 2007).
O Rhodnius prolixus (Figura 1) é um inseto hematófago obrigatório da ordem Hemiptera,
família Reduviidae, e sub-família Triatominae, cujos representantes são popularmente conhecidos
como “barbeiros”. Esse inseto não tem hospedeiro preferencial, alimentando-se em qualquer
vertebrado de sangue quente. Assim como todos os outros hemípteros, o barbeiro é
hemimetábolo, ou seja, sofre metamorfose incompleta e durante o seu desenvolvimento passa por
cinco estágios de ninfa até atingir a fase adulta. Somente na fase adulta o inseto desenvolve as
asas propriamente ditas e está pronto para a reprodução (Figura 2). Cada muda é sincronizada por
uma alimentação hematófaga realizada tanto por machos quanto por fêmeas (Aldana et al., 2001),
3
na qual o inseto pode ingerir até 10 vezes o seu peso em sangue (Friend et al., 1965) (Figura 3).
A qualidade e quantidade de sangue que o inseto ingere na alimentação interferem diretamente no
desenvolvimento e produção de ovos do Rhodnius prolixus (Friend et al., 1965). Após a
alimentação, o animal segue um período de jejum prolongado, que pode chegar a alguns meses.
Por volta do terceiro dia após a alimentação, os ovários de fêmeas de Rhodnius prolixus já se
encontram repletos de ovócitos, e por volta do sexto dia após a alimentação, estes insetos iniciam
a postura. As ninfas eclodem cerca de 15 dias após a postura, e estas também se alimentam de
sangue.
Figura 2: Os diferentes estágios de desenvolvimento do R. prolixus. Ovo; 1 – ninfa de 1
o
estágio;
2 – ninfa de 2
o
estágio; 3 – ninfa de 3
o
estágio; 4 – ninfa de 4
o
estágio; 5 – ninfa de 5
o
estágio; 6 –
individuo adulto fêmea; 7 – individuo adulto macho. (Eizemberg, 2007).
5
4
3 2 1 ovo
6
7
4
Figura 3: R. prolixus antes (1) e após alimentação (2). (Franco, 2006).
O sistema digestivo do Rhodnius prolixus é dividido em duas partes principais: o
estômago e o intestino (Lehane et al., 1991). No caso do barbeiro e de todos os Hemípteros, a
função desses dois compartimentos é bem diferenciada, como mostrado na figura 4A. O sangue
ingerido a cada alimentação é armazenado no estômago e posteriormente digerido e absorvido
pelo intestino. Na parte anterior do tubo digestivo (estômago) ocorre uma grande absorção de
água seguida de uma grande diurese apresentada por esses insetos já nos primeiros momentos
após a alimentação. Com isso, há uma conseqüente concentração do bolo alimentar que é então
lentamente liberado para a parte posterior do tubo digestivo (intestino médio). Só então começa o
processo de digestão do sangue ingerido, que ocorre através da atividade de uma série de enzimas
digestivas secretadas pelo intestino, como as amilopeptidases, carboxipeptidases, aspartico-
proteinases, cisteino-proteinases alem de glicosidades e lipases, todas essas já caracterizadas no
Rhodnius prolixus (Ferreira et al., 1988; Terra et al., 1988).O processo de absorção dos produtos
de digestão começa logo em seguida à digestão e os nutrientes absorvidos principalmente no
intestino médio são transportados para a hemolinfa e dela para os demais tecidos do inseto.
1
2
5
(A) (B)
Figura 4: Sistema digestivo do R. prolixus. (A) Representação esquemática do sistema digestivo
do R. prolixus. a – glândulas salivares; b – estômago; c – intestino anterior; d – intestino médio; e
– intestino posterior; f – túbulo de Malpighian. (Obtido de Wigglesworth, 1943). (B) Diagrama
de célula epitelial do intestino de R. prolixus. MM – Membrana Microvilar; PMM – Membrana
Perimicrovilar; PMS – Espaço Perimicrovilar. (Obtido de Billingsley et al., 1999 Apud Biology
of the Insect Midgut).
O intestino dos insetos pertencentes à ordem hemíptera, como é o caso dos barbeiros,
diferem dos Dípteras (ordem esta que inclui por exemplo o mosquito Aedes Aegypti) por não
possuírem uma camada composta por mucopolissacarídeos chamado de matriz peritrófica, que
recobre o epitélio intestinal destes insetos. Os Hemípteras possuem ao invés de
mucopolissacarídeos, uma estrutura composta de bicamadas fosfolipídicas com poucas proteínas
integrais denominada de membrana perimicrovilar (MPMV), que é secretada pelas células
intestinais, conforme ilustrado na figura 4B. Esta membrana é produzida em conseqüência da
distensão do tubo digestivo, que ocorre ao longo do processo de repasto sanguíneo e digestão do
bolo alimentar. O processo de alimentação leva a alterações hormonais e a liberação de
6
hormônios como a ecdisona na hemolinfa do inseto estimulam o crescimento da MPMV
(Gonzáles et al., 1998). Esta membrana consiste na primeira barreira de proteção presente no
intestino dos Triatominae, e uma das primeiras funções propostas para esta estrutura foi a de
proteção das células epiteliais, em função da sua localização envolvendo estas células. (Figura 5).
No entanto, outras funções vem sendo descritas para as MPMV como a compartimentalização da
digestão e a detoxificação das moléculas de heme gerada através da hidrólise de Hb na luz
intestinal deste inseto (Oliveira et al., 1999; Billingslry et al., 2000).
Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão do intestino de R. prolixus. A seta aponta para
as MPMV que recobrem as células epiteliais do intestino. ag - lúmen intestinal; ec - células
epiteliais. (Obtido de Oliveira et al., 1999).
7
1.2) A molécula de heme e a hematofagia
Figura 6: Representação esquemática da estrutura da molécula de heme. (Obtido de
www.scientificpsychic.com).
A utilização do sangue como alimento é extremamente vantajosa nutricionalmente, uma
vez que o mesmo é composto de proteínas, lipídeos e poucos carboidratos, o que sob o ponto de
vista energético permite que processos anabólicos como a ovogênese, crescimento e
desenvolvimento possam acontecer (Lehane, 1991; Romoser, 1996). Entretanto, a degradação da
hemoglobina (Hb) no sistema digestivo desses animais hematófagos resulta na liberação de algo
em torno de 10 mM de heme, o grupo prostético da Hb (Graça-Souza et al., 2006). A molécula de
heme, ou Ferriprotoporfirina –IX (Figura 6), consiste em quatro anéis pirrólicos ligados por
grupos (-CH) com um átomo de ferro central.
O heme é uma molécula de vital importância para manter diversas funções celulares e a
homeostase do corpo, sendo sintetizado em eucariotos por uma via que utiliza enzimas presentes
tanto no citossol quanto na mitocôndria (Ponka, 1999). Como exemplo da importância central do
heme na fisiologia celular, pode-se destacar seu papel como grupamento prostético de diversas
8
proteínas envolvidas na respiração celular (citocromos), no transporte de oxigênio
(hemoglobina), na detoxificação de drogas (citocromo P450), nas defesas antioxidantes (catalase)
e na transdução de sinal (guanilato ciclase) (Ignarro et al., 1984; White et al., 1992; Ponka,
1999).
Entretanto, o heme, por ser uma molécula anfifílica e de baixo peso molecular pode
exercer uma série de efeitos deletérios para as células (Ryter e Tyrrell, 2000). Foi demonstrado
que, em concentrações milimolares, o heme tem a capacidade de associar-se às membranas
fosfolipídicas e alterar sua permeabilidade e seletividade, podendo culminar em lise celular
(Schmitt et al., 1993). Foi mostrado também que o heme é uma molécula pró-oxidante que pode
causar dano molecular como peroxidação lipídica, além de gerar radicais livres, particularmente
através da decomposição de peróxidos orgânicos gerando espécies altamente reativas como os
radicais alcoxil (RO
•
) e peroxil (ROO
•
) (Kalyanaraman et al., 1983; Van der zee et al., 1996). O
ferro livre ao reagir com H
2
O
2
pode contribuir para a geração de espécies radicalares como os
radicais hidroxil (OH
•
) através da reação de Fenton (Figura 7), onde o peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) reage com um metal de transição qualquer (no caso o ferro). A partir desta reação, pode-
se iniciar a cadeia de peroxidação lipídica pela captação de elétrons de outras moléculas, como
ácidos graxos insaturados (RH), gerando radicais alquil (R
•
) (Graça-Souza et al., 2006). Embora
o heme seja capaz de decompor o H
2
O
2
, a caracterização destes produtos de reação ainda é pouco
conhecida e não se sabe, por exemplo, se o radical OH
•
representa uma destas espécies.
(Kalyanaraman et al., 1983; Van der Zee et al., 1996; Graça-Souza et al., 2006). Todas essas
reações são demonstradas na figura 7.
9
Figura 7: Mecanismos pró-oxidantes do heme e do ferro. (Obtido de Graça-Souza et al., 2006).
Os radicais livres são espécies reativas caracterizadas por apresentarem um ou mais
elétrons desemparelhados e estáveis por um curto período de tempo. Esses elétrons
desemparelhados conferem a essas espécies químicas alta reatividade e por isso são
potencialmente tóxicas (Halliwell, 1993). Espécies reativas de oxigênio (ROS) abrangem todas as
formas reativas do oxigênio. Na realidade, o termo ROS compreende radicais livres onde os
elétrons desemparelhados localizam-se nos átomos de oxigênio e também moléculas não
radicalares dotadas também de alta reatividade como o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e
peróxidos orgânicos (ROOH) (Halliwell e Gutteridge, 2000; Halliwell, 1993). Entretanto, a
reação de oxigênio com íons de metais de transição e radicais livres resultam em uma variedade
de ROS, que podem efetivamente iniciar reações em cadeia e atacar biomoléculas. Estima-se que
cerca de 0,1% do oxigênio utilizado durante a respiração mitocondrial forma ROS, devido ao
“escape” dos elétrons dos complexos que compõem a cadeia respiratória. Várias biomoléculas
como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos podem sofrer oxidação promovida por radicais livres
(Fridovich, 1978; Mannervick, 1985; Richter et al., 1988; Dean, 1991). A reatividade das ROS
difere de espécie para espécie e depende do tipo de radical produzido e da molécula envolvida na
10
interação (Halliwell, 1993). O radical hidroxil (OH
•
) é considerado uma das espécies mais
reativas, sendo capaz de atacar rapidamente (em cerca de 10
-9
segundos) qualquer biomolécula
disponível (Halliwell e Gutteridge, 2000). Por este motivo acredita-se que a reação de Fenton seja
tão deletéria.
Sendo assim, diversos mecanismos de proteção contra os efeitos deletérios do heme livre
tornam-se necessários para os organismos hematófagos, pois a utilização do sangue como
nutriente representa um grande desafio oxidativo, uma vez que produtos gerados na digestão do
sangue, como o heme e ferro, são liberados no trato digestivo desses organismos.
Nesse contexto, organismos hematófagos como protozoários, helmintos, artrópodes e até
mamíferos representam um grupo altamente especializado. Com relação aos artrópodes, sabe-se
que a hematofagia surgiu independentemente ao longo de sua evolução (Ribeiro, 1995) e com
isso diferentes espécies desenvolveram uma série de mecanismos de defesa antioxidantes (Graça-
Souza et al., 2006), preventivas e supressoras. O intestino dos insetos que se alimentam de
sangue é o primeiro local destes animais a enfrentar um desafio oxidativo, já que a hidrolise da
Hemoglobina (Hb) libera grandes quantidades de moléculas de heme no interior de seu trato
digestivo. Sendo assim, diversos mecanismos adaptativos de defesa e detoxificação do heme
livre, decorrente da digestão de grande quantidade de sangue ingerida por diversos organismos
hematófagos, têm sido propostos. Em mamíferos, a maior parte da detoxificação do heme ocorre
através da reação catalisada pela enzima heme oxigenase, pela qual o heme sofre uma degradação
oxidativa gerando biliverdina, monóxido de carbono e íon ferroso (Tenhunen, 1969; Ryter et al.,
2000). Essa enzima também já foi descrita no barbeiro Rhodnius prolixus por Paiva-Silva et al.,
2006 e no mosquito Aedes aegypti por Pereira et al., 2007. Uma lipoproteína denominada Help
foi identificada no carrapato bovino Boophilus microplus como um mecanismo de detoxificação
do heme. A Help é capaz de ligar o heme na hemolinfa desses animais, diminuindo seus efeitos
11
pro-oxidantes (Maya-Monteiro et al., 2000; Maya-Monteiro et al., 2004). No caso do inseto
Rhodnius prolixus, outros mecanismos de detoxificação já foram descritos além da enzima heme
oxigenase. Assim como o carrapato Boophilus microplus, este inseto possui uma proteína
presente em sua hemolinfa e em seus ovos que é capaz de ligar o heme evitando assim com que
esta molécula exerça seus efeitos deletérios. No caso do Rhodnius prolixus, esta proteína é
denominada de Rhodnius Heme Binding Protein (RHBP) (Oliveira et al., 1995; Dansa-Petretski
et al., 1995). No entanto, no carrapato bovino Boophilus microplus, a maior parte do heme,
derivado da digestão da Hb, é detoxificado através da sua agregação em uma organela
especializada chamada de hemossomo (Lara et al., 2003). O Rhodnius prolixus, além destes
mecanismos já descritos, possui ainda uma outra adaptação bastante peculiar que visa minimizar
os efeitos tóxicos do heme. Assim como no carrapato, este inseto apresenta um mecanismo de
precipitação do heme, que consiste na cristalização desta molécula num pigmento conhecido
como Hemozoína (Hz), que é posteriormente eliminado nas fezes deste inseto (Oliveira et al.,
1999). No ano de 1849 este cristal de heme foi pela primeira vez associado ao pigmento da
malária no Plasmodium (Rudzinska et al., 1965; Sullivan, 2002). Por muito tempo, a Hz foi
considerada característica deste parasito, estando presente em seu vacúolo digestivo (Rudzinska
et al., 1965; Slater et al., 1991; Francis et al., 1997). No entanto, a partir de 1999, a Hz começou
a ser descrita em outros organismos hematófagos, como no inseto R. prolixus (Oliveira et al.,
1999) e outros triatomíneos (Oliveira et al., 2007) e no helminto Schistosoma mansoni, este
ultimo o causador da esquistossomose humana (Oliveira et al., 2000b), ambos pelo nosso grupo
de pesquisa. Além destes, ao menos outros dois organismos, o trematódeo Echinostoma trivolvis
e o protozoário Haemoproteus columbae também são capazes de produzir este cristal de heme.
Assim, o fenômeno de cristalização de heme na forma de Hz é recorrente na natureza, uma vez
12
que diversos organismos hematófagos fazem uso dessa estratégia como um mecanismo eficiente
de proteção contra a toxicidade do heme (Graça-Souza et al., 2006).
1.3) A formação do cristal de Hemozoína em organismos hematófagos
A Hemozoína (Hz), também conhecida como o pigmento da malária, foi descrita pela
primeira vez no começo do século XVIII por Lancisi. Em 1911 Brown observou que o heme
representava um componente dominante da Hz (Brown, 1911, Apud Egan, 2008), mas a forma
como as moléculas de heme interagiriam para formar a Hz ficou desconhecida por mais 80 anos.
Os estudos de Fitch e Kanjananggulpan publicados em 1987 mostraram que a Hz é formada
unicamente pelo heme (ferriprotoporfirina-IX), descartando a presença de qualquer componente
protéico ou lipídico no cristal (Fitch e Kanjananggulpan, 1987). Eles foram os primeiros a sugerir
que este pigmento era idêntico a β-hematina, até então um agregado insolúvel de heme produzido
sinteticamente em laboratório (1936). Em 1991 Slater e colaboradores demonstraram, por
experimentos de difração de raios-X, que, de fato, ocorre uma interação entre o ferro de uma
molécula de heme e o carboxilato de outra e que a Hz apresenta um caráter insolúvel,
características estas que a diferem do heme (Slater et al., 1991). Este estudo foi o primeiro a
caracterizar detalhadamente a estrutura da β-hematina e, através de diversas ferramentas
espectroscópicas, demonstraram que o grupo propionato de uma molécula de heme liga-se ao
átomo de ferro central da outra molécula de heme (Slater et al., 1991). Assim, foi proposto que a
β-hematina era na verdade um polímero formado por longas cadeias de heme unidas por
interações eletrostáticas do tipo ferro-carboxilato (Slater et al., 1991). No ano de 1997, Bohle e
13
colaboradores mostraram definitivamente que a estrutura sintética da β-hematina era idêntica ao
cristal de Hz presente no Plasmodium (Bohle et al., 1997). Por aproximadamente uma década
este conceito foi aceito. Entretanto, em 2000 a estrutura da β-hematina foi definitivamente
elucidada, com a utilização de espectroscopia de difração de raios-X gerado por radiação
Síncrotron (Pagola et al., 2000). Assim foi proposto que a β-hematina, e por conseguinte a Hz,
não se trata na verdade de um polímero, mas sim de um cristal formado por dímeros de heme que
interagem por ligações iônicas do tipo ferro-carboxilato e que esses dímeros ligam-se por pontes
de hidrogênio dos grupos carboxilato não-dissociados conforme mostrado na Figura 8 (Pagola et
al., 2000; Oliveira et al., 2005). Considerando que a Hz apresenta uma estrutura cristalina de
faces bem definidas, esta descoberta não foi exatamente uma surpresa (Egan, 2008).
(A) (B)
Figura 8: Representação esquemática da estrutura dos cristais de β-hematina e Hz. (A)
Representação esquemática da estrutura do cristal de β-hematina proposta por Pagola et al., 2000.
(B) Representação esquemática da estrutura da Hz isolada de R. prolixus e S. mansoni proposta
por Oliveira et al., 2005.
14
Em paralelo à descoberta da Hz em diferentes organismos, foram realizados diversos
estudos a fim de esclarecer quais os mecanismos estariam envolvidos na formação deste cristal. A
formação de Hz é favorecida por pH ácidos, próximos ao pK
a
do heme, medido entre 4,8 e 5,0, o
que condiz com as estimativas de pH encontradas tanto no vacúolo digestivo do Plasmodium
quanto no intestino do R. prolixus e do Schistosoma mansoni (Slater e Cerami, 1992; Terra et al.,
1988; Bogitsh e Davenport, 1991). Aparentemente, a estrutura do cristal de Hz parece ser a
mesma nesses três organismos, semelhante a mostrada na figura 5 (Oliveira et al., 2005). Outras
características do cristal são comuns, como a insolubilidade em meios levemente alcalinos e a sua
solubilização em pHs acima de 11, o que leva ao rompimento das ligações ferro-carboxilato e a
conseqüente geração de monômeros de heme. O espectro de absorção de luz na região do UV e
visível da Hz desses três organismos também é comum, com absorção característica em torno de
450 nm e outro pico em torno de 655 nm (Slater et al., 1991; Oliveira et al., 1999; Oliveira et al,
2000b). Em todos estes casos, a formação da Hz resulta na diminuição dos efeitos deletérios do
heme descritos acima (Oliveira et al., 2002). Entretanto, apesar desses pontos em comum entre os
organismos produtores de Hz, o mecanismo preciso pelo qual as moléculas de heme são
organizadas na forma de Hz in vivo ainda não é entendido sendo ainda um ponto controverso na
literatura (Ridley, 1996).
No Plasmodium, a formação de Hz ocorre dentro de uma organela intracelular chamada
vacúolo digestivo e postulou-se que uma proteína denominada ‘heme polimerase’ estivesse
envolvida na cristalização de heme neste organismo (Slater e Cerami, 1992). Esta hipótese foi
sustentada após a demonstração que proteínas ricas em histidina (HRPs) obtidas de Plasmodium
eram capazes de induzir a síntese de Hz in vitro, sugerindo que esta proteína fosse responsável
pelo processo de formação de Hz (Sullivan et al., 1996). A HRP II é uma proteína de 30KDa e
cerca de 85 % da sua estrutura consiste em repetições de domínios His-His-Ala-Ala-Asp e His-
15
His-Ala-His-His-Ala-Ala-Asp-Ala (Wellems e Howard, 1986; Panton et al., 1989). Já foi descrito
que esta proteína é capaz de ligar heme e promover a formação de Hz (Sullivan et al., 1996;
Ziegler et al., 1999). Subseqüentemente, Dorn e colaboradores mostraram que extratos lipídicos
de formas trofosoitas do Plasmodium promovem a formação de Hz da mesma forma que a β-
hematina purificada (Dorn et al., 1995). Portanto, duas hipóteses principais foram primeiramente
levantadas: a primeira considerou que a formação de Hz era dependente de HRPs e a segunda que
ela é dependente de lipídeos. Entretanto, diversas evidências começaram a questionar o
envolvimento das HRPs na formação de Hz (Egan, 2008). Utilizando técnicas de
imunofluorescência, mostrou-se que 97% da HRPII localiza-se nas hemácias, enquanto apenas
3% é localizado no vacúolo digestivo onde ocorre a formação de Hz (Papalexis et al., 2001;
Akompong et al., 2002). Alem disso, Pandey e colaboradores mostraram que a formação de Hz
na presença unicamente de HRPII, não era rápida o suficiente para a detoxificação do heme na
forma de Hz no parasito da malária, sugerindo que a presença de lipídeos é realmente
fundamental neste processo (Pandey et al., 2003). Entretanto, o argumento mais convincente
contra o papel de HRPs no processo de formação de Hz foi obtido com parasitos suprimidos para
os genes que codificam a HRPII e a HRPIII (Noland et al., 2003). Os parasitos cuja expressão
dos genes HRP foi suprimida são ainda assim capazes de produzir Hz (Apud Egan, 2008). Em
1999, Lynn e colaboradores mostraram que não as histidinas, mas sim os resíduos de ácido
aspártico das HRPs estão envolvidos na ligação de heme em pHs próximos aos do vacúolo
digestivo do Plasmodium, o que torna estes aminoácidos e não as histidinas importantes para a
formação de Hz (Lynn et al., 1999). Dorn e colaboradores também mostraram que a atividade de
formação de Hz presente no vacúolo digestivo do Plasmodium falciparum era resistente a
aquecimento e a tratamentos com proteinases (Dorn et al., 1995, Dorn et al., 1998) indicando que
16
mecanismos de autocatálise poderiam ser responsáveis pela produção dos cristais de Hz não
sendo necessário então a participação de nenhuma enzima neste processo (Dorn et al., 1995).
Com relação aos lipídeos, os estudos de Fitch e de Dorn mostraram que a cristalização do heme
estimulada por uma série de lipídeos, ácidos graxos e detergentes resultou na rápida formação de
Hz (Dorn et al., 1998; Fitch et al., 1999). A partir destes estudos, o papel dos lipídeos no
processo de formação de Hz passou a ser considerado com maior ênfase. Bendrat e colaboradores
descobriram que frações lipídicas purificadas do conteúdo do vacúolo digestivo do Plasmodium
também eram capazes de promover a cristalização de heme sob a forma de Hz (Bendrat et al.,
1995).
Em outros organismos hematófagos, tais como o inseto Rhodnius prolixus e o helminto
Schistosoma mansoni os lipídeos parecem estar de alguma forma envolvidos no processo de
cristalização de heme. Neste contesto, os dados do nosso laboratório demonstraram o
envolvimento das MPMV na cristalização de heme em R. prolixus (Oliveira et al., 2000a).
Curiosamente, foi observado a intima associação entre os cristais de Hz nascentes e as MPMV,
sugerindo que estas estruturas poderiam de alguma forma mediar a cristalização de heme
(Oliveira et al., 2005; Oliveira et al., 2007; Silva et al., 2007). Aparentemente, o componente
responsável pela formação de Hz no intestino de R. prolixus encontra-se na MPMV, é termo-
sensível (Oliveira et al., 2000a) e correlaciona-se com a atividade de alfa-glicosidade, uma
enzima marcadora das MPMV (Silva et al., 2007). No caso do S. mansoni, também foi
demonstrado pelo nosso grupo que a formação de Hz pode ser mediada por extratos totais de
parasitos, pela própria Hz isolada dos vermes e ainda por extratos lipídicos totais (Olliveira et al.,
2004). Estudos mais detalhados acerca do processo de formação de Hz em S. mansoni mostraram
a participação de gotículas lipídicas presentes no lúmen intestinal deste parasito (Soares et al.,
2007) (Figura 9). Curiosamente, a iniciação do processo de cristalização parece ocorrer na
17
superfície das gotículas lipídicas, indicando que a presença de interfaces hidrofílico-hidrofóbicas
parece ser determinante para a formação de Hz neste parasito.
Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão de corte transversal do intestino de fêmeas
adultas de S. mansoni. Gotículas lipídicas associadas aos cristais de Hz em diferentes etapas do
processo de cristalização, indicado pelos números. 1- gotícula lipídica com poucos cristais até 5 –
gotícula lipídica preenchida de cristais de Hz. (Obtido de Soares et al., 2007).
Recentemente Egan e colaboradores demonstraram que a água e o heme formam
espontaneamente um complexo em meio aquoso que depende da interação do grupamento
carboxila com o átomo central de ferro do heme (de Villiers et al., 2007). Eles demonstraram que
a formação de Hz ocorre através da solubilização do heme, onde a interação de dois dímeros de
heme rapidamente forma Hz pela interação da carga negativa do grupo propionato de uma
molécula de heme com a carga positiva do ferro central de outro heme e vice versa. Entretanto,
esses dímeros requerem o deslocamento da molécula de água axial da fase oposta da porfirina, e
concomitantemente ocorre a formação de uma ligação ferro - propionato para o aparecimento de
um dímero de Hz. Na presença de água este dímero precursor torna-se instável, já que o grupo
propionato desloca-se rapidamente e se afasta do ferro central, permitindo então a sua interação
18
com as moléculas de água. A remoção das moléculas de água axiais é facilitada pela presença de
outros ligantes como o acetato no meio da reação, permitindo o aumento da solubilidade do heme
em condições ácidas (Ncozaki e Egan, 2001).
Figura 10: Porcentagem de conversão do heme em Hz na presença de uma camada
aquosa/lipídica. Após 5 minutos de incubação da amostra com heme em pH 4,8 a 37
0
C na
presença desta camada aquosa/lipídica formada por diferentes lipídeos a porcentagem de
conversão foi mensurada. Siglas: MMG - monomiristoilglicerol; MOG - monooleilglicerol;
DMG - 1,3- dimiristoilglicerol; DOG - 1,3-dioleoilglicerol; TOG - triglicerideo trioleilglicerol;
DOPE – Fosfoglicerídeo 1,2-dioleil-glicerol-3-fosfoetanolamina; DMPC - 1,2-dimiristoil-glicerol
- 3-fosfocolina; DOPC - 1,2-dioleoil-glicerol-3-fosfocolina; DPPC - 1,2-dipalmitoil-glicerol-3-
fosfocolina; OGP - n-octil-b-D-glucopiranoside e CHL - colesterol
(Obtido de Egan et al., 2006).
Neste sentido, partindo-se das observações da íntima relação entre os cristais de Hz e
estruturas com ambientes hidrofóbicos e de que os lipídeos são catalisadores da formação de Hz,
vários trabalhos in vitro vêm sendo realizados no intuito de se estudar a interface água-lipídeo. Já
é bem conhecido que a formação espontânea de Hz é favorecida em temperatura fisiológica
(28
0
C em R. prolixus e 37
0
C em S. mansoni) e baixa força iônica, obtida na ausência de altas
19
concentrações de acetato (4,5M) (Dorn et al., 1998). No ano de 2007, Pisciotta e colaboradores
publicaram um trabalho mostrando pela primeira vez que a Hz localizada dentro da vacúolo
digestivo do P. falciparum é completamente encapsulada por corpúsculos lipídicos compostos
tanto por lipídeos neutros como por monoacilglicerois (Pisciotta et al., 2007). Os primeiros
estudos sobre esses lipídeos revelaram que monopalmitoilglicerol é um catalisador expressivo da
formação de Hz in vitro (Dorn et al., 1998; Fitch et al., 1999). Em paralelo aos trabalhos de
formação de Hz nos organismos hematófagos, um estudo biomimético de formação de β-
hematina demonstrou de que forma os lipídeos poderiam promover a cristalização de heme,
dando suporte aos estudos realizados com os animais (Egan et al., 2006; Pisciotta et al., 2007;
Soares et al., 2007). Estes estudos biomiméticos envolveram a presença de solventes orgânicos
(octanol ou pentanol) de forma a simular um ambiente lipídico e soluções aquosas ácidas de
modo a tentar gerar uma interface hidrofílico-hidrofóbico com características similares a uma
bicamada fosfolipídica ou a uma gota lipídica. (Egan et al., 2006) (Figura 10). O sistema
montado para observar a cristalização de heme na interface álcool-água em meio aquoso foi
capaz de formar Hz, mas sem a presença dos solventes orgânicos ela não foi observada (Egan et
al., 2006). Uma outra maneira mais fiel de mimetizar um sistema biológico foi realizada por este
mesmo grupo utilizando lipídeos dissolvidos em metanol/acetona na superfície da solução
aquosa. Este sistema foi capaz de produzir Hz rapidamente após a aplicação de heme nesta
interface (Egan et al., 2006).
20
Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura dos cristais de heme. Os materiais isolados de S.
mansoni (A), β-hematina
(B), R. prolixus (C) e Plasmodium falciparum (D). (Obtidos de
Sullivan et al., 2002; Oliveira et al., 2005).
Apesar de todas estas semelhanças observadas no processo de formação de Hz, a
localização e morfologia do cristal de heme exibem grandes diferenças entre os diversos
organismos hematófagos, como o P. falciparum, o R. prolixus e o S. mansoni. No parasito da
malaria, a digestão da Hb e a formação de Hz ocorrem intracelularmente, no interior do vacúolo
digestivo (Goldberg et al., 1990). Já no inseto e no helminto, esses processos ocorrem
extracelularmente na luz do intestino destes organismos. Existem também diferenças quanto à
morfologia dos cristais formados nesses organismos: no Plasmodium eles apresentam superfícies
lisas idênticas aos de β-hematina (Bohle et al., 1997). Já no R. prolixus e no S. mansoni, os
cristais são esféricos e ovais, compostos de unidades regulares (Oliveira et al., 2005) (Figura 11).
Entretanto, a estrutura molecular dos cristais em todos estes organismos é idêntica e apresentam a
D
B
C
A
100 nm
21
mesma estrutura, exibindo padrões idênticos (Oliveira et al., 2005) (Figura 12). Especula-se que
as diferenças morfológicas destes cristais podem ser resultado de distintas condições de
crescimento (Oliveira et al., 2005), já que, diferentemente dos outros organismos, no Plasmodium
ela ocorre intracelularmente. Entretanto, sabe-se que as menores faces do cristal apresentam
sempre um processo de crescimento mais rápido do que as faces maiores (Buller et al., 2002).
Figura 12: Padrões de Difração de raios-X dos cristais de heme isolados de S. mansoni, R.
prolixus e β-hematina. (Obtido de Oliveira et al., 2005).
1.4) As drogas quinolínicas
A malária é a doença parasitária tropical que mais mata no mundo, afetando entre 300 e
500 milhões de pessoas ao ano, sendo responsável por aproximadamente 1 milhão de óbitos,
sendo metade destes ocorridos com crianças de até 5 anos (WHO, 2007a). Embora quase um
terço da população mundial esteja sob risco de exposição à doença, cerca de 90% das infecções e
22
mortes ocorrem na África sub-saariana (Trigg e Wemsdorfer, 1999), onde, segundo dados da
Organização Mundial da Saúde, uma criança morre de malária a cada 30 segundos (WHO, 2007).
Entretanto, mesmo sendo um dos maiores problemas de saúde pública nos países tropicais, por
ser uma doença que atinge as populações mais pobres e em áreas igualmente pobres, a malária é
uma doença negligenciada, seja pela ausência de políticas publicas de saúde seja por desinteresse
econômico das indústrias farmacêuticas em pesquisar novos medicamentos.
A malária, que é causada por protozoários do gênero Plasmodium é transmitida pela
picada de fêmeas do mosquito do gênero Anopheles e atinge os seres humanos desde a
antiguidade. A primeira droga antimalárica utilizada para o tratamento desta doença foi a quinina,
descoberta nas florestas úmidas do Peru e do Equador e extraída da casca de uma planta chamada
Cinchona. Os missionários Jesuítas da América do Sul estudaram as propriedades terapêuticas
dessa planta e no século XVII a quinina foi levada para a Europa e Índia, onde foi amplamente
usada no tratamento da malária (Egan et al., 1999). Inúmeras outras drogas antimaláricas foram
desde então descobertas e utilizadas, e estas podem ser divididas em três grupos: as derivadas de
enxofre, representadas pela dapsona e sulfadiazina; as derivadas de endoperóxidos, representadas
pela artemisinina e a artemether e o terceiro grupo que inclui as drogas quinolinicas (Figura 13)
(O’ Neill et al., 1998). Este último, sub-grupo divide-se ainda em três outros grupos: (i) as 4-
aminoquinolinas e acridinas, como a cloroquina, amodiaquina e quinacrina; (ii) os derivados de
metanóis de quinolina que incluem a quinina, quinidina e mefloquina e por último (iii) as 8-
aminoquinolinas representadas pela primaquina e pamaquina (Egan, 2001). O grupo das drogas
quinolínicas tem sido o mais utilizado como antimaláricos, tanto no tratamento quanto na
profilaxia. Entretanto, ao longo dos anos diversas espécies de Plasmodium adquiriram grande
resistência a algumas dessas drogas, como é o caso da cloroquina e da quinina (Figura 13), que
apesar disto ainda estão em uso (O´Neill et al., 1998). Por esse motivo, é freqüente o uso de
23
coquetéis de vários destes fármacos, pois há parasitos resistentes a qualquer uma destas drogas
quando usadas isoladamente. A resistência torna a cura difícil e cara e por isso, existe uma grande
demanda para a descoberta de novas drogas antimaláricas, que substituam aquelas que
selecionaram cepas de Plasmodium já resistentes.
Cloroquina Quinina
Figura 13: Algumas das drogas quinolínicas utilizadas como antimaláricos e inibidoras da
formação de Hz. (Obtidas de O´Neill et al., 1998).
Apesar dos efeitos terapêuticos destas drogas sobre o Plasmodium já serem bastante
conhecidas (O’ Neill et al., 1998), o seu mecanismo exato de ação ainda é bastante controverso
na literatura. As hipóteses mais aceitas podem ser divididas em duas vertentes: os efeitos no
vacúolo digestivo do parasito e os que ocorrem fora desta organela (Egan, 2001). As hipóteses
extra-vacuolares incluem a ligação de quinolinas ao DNA do Plasmodium (Parker e Irving,
1952), a inibição do metabolismo de poliaminas (Konigk et al., 1981) e a inibição da síntese
protéica desse parasito (Suriola e Padmanaban, 1991). Com relação aos efeitos intra-vacuolares
as 4-aminoquinolinas, pelo fato de serem bases fracas, podem acumular-se em compartimentos
ácidos, como é o caso do vacúolo digestivo do Plasmodium (Egan, 2003). Este acúmulo gera
diversas conseqüências ao parasito, como o aumento do pH no vacúolo (Homewood et al., 1972),
24
inibição da atividade de proteases (Gyang et al., 1982) e lípases (Ginsburg e krugliak, 1992)
nesta organela, ocorrendo ainda a interação das drogas com o heme, tanto na forma dimérica
quanto com o cristal de Hz, levando a inibição do crescimento deste (Sullivan et al., 2006; Egan,
2006). Entretanto, a hipótese mais bem aceita e estudada na literatura propõe que as drogas
quinolínicas, interagem com o heme no vacúolo digestivo formando um complexo que inibe a
formação de Hz (Egan, 2008) (Figura 14). Essa hipótese foi levantada pela primeira vez na
década de 60 por Cohen e colaboradores (Cohen et al., 1964). Hoje já é bem estabelecido na
literatura que o heme é o alvo molecular da cloroquina e de outras 4-aminoquinolinas (Chou,
1980; Dorn et al., 1998; Vippagunta et al., 2000), mas como esta associação exerce seus efeitos
antimaláricos é ainda controverso (Egan, 2001). Evidências que suportam esta hipótese mostram
que existe uma forte correlação entre a capacidade das 4-aminoquinolinas inibirem a formação de
Hz e a atividade antimalárica dos mesmos (Egan e Ncozaki., 2005). O primeiro mecanismo de
ação proposto para as 4-aminoquinolinas sobre a formação de Hz sugeriu que estas drogas
inibiriam uma possível ‘heme polimerase’ responsável pela formação de Hz (Slater e Cerami,
1992). Entretanto, diversos trabalhos posteriores mostraram que várias 4-aminoquinolinas eram
capazes de inibir o processo de formação de Hz na ausência de qualquer tipo de proteína do
parasito (Dorn et al., 1995; Dorn et al., 1998; Egan et al., 1994; Egan et al., 1999; Sullivan et al.,
1996b; Sullivan et al., 1998). Atualmente postula-se que formação de um complexo entre as 4-
aminoquinolinas e o heme previne a incorporação deste ultimo ao cristal de Hz (Figura 14). Em
virtude disto, acredita-se que ocorra um aumento dos níveis de heme livre ou de heme associado
a 4-aminoquinolinas no interior do vacúolo digestivo, que leva o parasito a morte, seja pela
geração de radicais livres (Sugioka e Suzuki, 1991) seja pela interação do heme com membranas
biológicas, potencializando dessa forma os efeitos tóxicos desta porfirina (Orjih et al., 1981).
Evidências experimentais abtidas pelo grupo de Egan demontram o aumento dos níveis de ferro
25
no cristal de parasitos tratados com cloroquina (dados não publicados). Uma outra hipótese
também considerada propõe que as 4-aminoquinolinas interagem com a superfície das faces do
cristal (Sullivan et al., 1996; Dorn et al., 1998), influenciando sua morfologia e impedindo seu
crescimento (Egan e Ncokazi, 2005). Por fim, estudos sobre o mecanismo de inibição da síntese
de Hz pelas 4-aminoquinolinas sugerem que os complexos formados por essas drogas e o heme
bloqueiam a extensão do cristal de Hz através da captação das moléculas de heme, evitando desta
forma a cristalização de novas moléculas, resultando num aumento dos níveis de heme livre e por
conseguinte resultando num severo dano celular (Ridley, 1996; Sullivan et al., 1998; Graça-
Souza et al., 2006). Sendo assim, as 4-aminoquinolinas podem ser consideradas como inibidores
da cristalização de heme (Egan, 2001). No entanto, a participação de ROS no processo de morte
dos parasitos tratados com cloroquina parece ser mínima ou até mesmo ausente, uma vez que
mesmo em baixas concentrações de oxigênio (menos de 1%) estas drogas ainda assim são
efetivas contra o Plasmodium (Monti et al., 2002).
Figura 14: Modelo proposto para ilustrar o mecanismo pelo qual a cloroquina interage com o
heme e inibe a formação de Hz (Obtido de Dorn et al., 1998).
26
Como observado no Plasmodium, a formação de Hz em Rhodnius e Schistosoma também
é inibida por cloroquina, tanto in vitro como in vivo (Oliveira et al., 2000a, Oliveira et al., 2004).
No caso do Schistosoma mansoni, as drogas não só causam uma drástica redução da viabilidade
dos parasitos mas também uma redução do conteúdo de Hz nos vermes, bem como uma forte
redução do número de ovos do parasito depositados no fígado (Oliveira et al., 2004). No caso do
Rhodnius prolixus, a alimentação com sangue enriquecido com cloroquina resultou numa drástica
redução da formação de Hz no intestino (Figura 15), resultando num grande aumento dos níveis
de heme na hemolinfa e por fim numa elevada peroxidação lipídica neste fluido (Oliveira et al.,
2000a).
Figura 15: Inibição da formação de Hz por cloroquina in vivo. Fêmeas adultas de R. prolixus
foram alimentadas com sangue suplementado com diferentes concentrações de cloroquina. Após
4 dias a quantidade de Hz presente no intestino foi medida. (Obtido de Oliveira et al., 2000a).
27
2) objetivos:
Objetivo geral:
Esta tese teve como objetivo investigar os mecanismos envolvidos na cristalização de
heme química e biologicamente, utilizando o inseto Rhodnius prolixus como modelo de estudo.
Objetivos específicos:
•
Observar a cristalização espontânea de heme influenciada pela polaridade do meio de reação.
•
Estudar componentes do intestino de R. Prolixus envolvidos na cristalização de heme.
•
Analisar a inibição da formação de Hemozoína no intestino de R. prolixus por diferentes
drogas quinolínicas.
28
3) Material e métodos:
3.1) Animais
Para a realização deste trabalho, foram utilizadas fêmeas adultas de Rhodnius prolixus de
primeira ou terceira alimentação, 4 ou 10 dias após o repasto sanguíneo. Estes insetos foram
mantidos em uma colônia a 28
0
C e 80 % de umidade relativa, no Laboratório de Bioquímica de
Insetos coordenado pelo Professor Hatisaburo Masuda no Instituto de Bioquímica Médica
(IBqM) da UFRJ. Os insetos foram alimentados com sangue de coelho mantidos no biotério do
IBqM da UFRJ.
3.2) Obtenção de intestino total de R. Prolixus
Dez dias após alimentação, fêmeas adultas de primeira alimentação foram dissecadas para
a remoção do intestino total, o que compreende o intestino e o conteúdo intestinal. Os órgãos
coletados foram mantidos a 4
0
C em um tubo Falcon com PBS, pH 7,4 e Coquetel Inibidor de
Protease de uso geral (Sigma P 2714), composto de AEBSF 2 mM, EDTA 1 mM, Bestatina 130
µM, E-64 14 µM, leupeptina 1 mM e Aprotinina 0,3 µM diluído 30X. As amostras foram
mantidas no gelo durante todo o processo de dissecção, sendo então estocadas a -80
0
C para
análises posteriores.
3.3) Dosagem de proteína
A concentração de proteína das amostras de intestino de R. prolixus, assim como das
frações obtidas através do gradiente de sacarose, foi determinada pelo método de Lowry (Lowry
et al., 1951), sendo utilizado como padrão albumina sérica bovina.
29
3.4) Fracionamento do intestino total
Cerca de 600 µL de intestino total de fêmeas adultas de R. prolixus foi aplicado no topo
de um gradiente descontínuo de sacarose formado pelas concentrações de 20 % (p/v), 40 % (p/v)
e 60 % (p/v) diluídos em PBS pH 7,4 utilizando 3,6 mL de cada concentração. Em seguida, as
amostras foram centrifugadas a 16,000 x g (Optimo LE 80K, Beckman) no rotor SW40 por 1
hora a 4
0
C. As cinco frações produzidas (Topo, 1, 2, 3 e 4) foram coletadas e guardadas a –80
0
C
para análises futuras.
3.5) Extração de lipídeos totais
O método utilizado para extração e quantificação de lipídeos foi baseado no artigo de
Bligh & Dyer, 1959. Ao volume de cerca de 1 mL de conteúdo intestinal de fêmeas adultas de R.
prolixus foi acrescentado 2,5 mL de metanol e 1,25 mL de clorofórmio. O tubo de extração
lipídica foi agitado a cada 5 minutos durante 2 horas e em seguida centrifugado a 1000 x g por 20
minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e mantido a 4
0
C. Ao precipitado,
foi adicionado mais 2,5 mL de metanol, 1,25 mL de clorofórmio e 1 mL de água Mili Q. Esta
preparação foi novamente agitada a cada 5 minutos por 1 hora e posteriormente centrifugada a
1000 x g por 20 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e armazenado
junto com a alíquota anterior. A este sobrenadante foi então adicionado 1,25 mL de clorofórmio e
1,25 mL de água Mili Q, agitado e então centrifugado a 1000 x g por 20 minutos em temperatura
ambiente. A fase orgânica foi coletada, seca em N
2
e a quantidade de lipídeos foi medida
gravimetricamente (Bligh & Dyer, 1959). Os lipídeos secos foram então mantidos a –80
0
C para
futura utilização, quando eram ressuspendidos em clorofórmio:metanol (1:1).
30
3.6) Síntese de hemozoína in vitro
Quantidades conhecidas de proteína (50 a 100 µg), lipídeos (20 a 100 µg) ou ainda Hz
(equivalentes a 20 nmoles de heme) foram incubados com tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8
e hemina (Sigma) (diluída em NaOH 0,1 N) nas concentrações de 50 ou 100 µM, obtendo um
volume final de 1 mL de reação. Os tubos foram então agitados e mantidos por até 24 horas em
um banho a 28
0
C (Oliveira et al., 2000). Após a incubação foi realizado o processo de extração
da Hz produzida na reação.
3.7) Extração de Hemozoína
A hemozoína obtida das incubações in vitro ou isolada do intestino total de R. prolixus foi
extraída através de um processo de solubilização diferencial baseado no método de purificação de
Hz descrito por Sulivan et al. (1996). A amostra foi inicialmente centrifugada a 15000 x g por 10
minutos a 25
0
C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi então lavado três vezes com 1
mL de tampão bicarbonato de sódio 0,1 M + SDS 2,5 % (p/v) pH 9,1 para retirada de heme livre
não cristalizado, lipídeos e proteínas solúveis da amostra. Na presença deste tampão, a amostra
foi agitada por 10 minutos e centrifugada como descrito anteriormente. Após cada centrifugação
o tampão era trocado. Posteriormente à última lavagem, foi adicionado 1 mL de água Mili Q ao
precipitado que então foi novamente agitado e centrifugado por duas vezes.
3.8) Dosagem de Hemozoína
Para a dosagem de Hz do intestino de R. prolixus ou de suas frações, uma pequena
quantidade de amostra equivalente a 1mg de proteína foi solubilizada em 1 mL de NaOH 0,1 N,
condição na qual o cristal de Hz é completamente dissociado produzindo moléculas de heme no
31
estado monomérico (Fitch e Kanjanagulpa, 1987). No caso da Hz obtida através de síntese in
vitro, todo o precipitado de Hz obtido foi solubilizado em NaOH 0,1 N. A quantificação de heme
(derivado da Hz) nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a 400 nm em
um espectrofotômetro GBC UV-920. Foi utilizado como referência uma curva padrão de hemina
(sigma) produzida em NaOH 0,1 N.
3.9) Dosagem de heme total
Para a dosagem de heme total do intestino de R. prolixus ou de suas frações, uma pequena
quantidade de amostra equivalente a 100 µg de proteína foi solubilizada em 1 mL de NaOH 0,1
N. A quantificação de heme nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a
400 nm em um espectrofotômetro GBC UV-920. Foi utilizado como referência uma curva padrão
de hemina (sigma) produzida em NaOH 0,1 N.
3.10) Análise por espectrofotometria das frações do gradiente de sacarose
Cerca de 100 µg de proteína das frações obtidas do gradiente em sacarose foram diluídas
em aproximadamente 1 mL de tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8. A concentração de
sacarose foi normalizada em todas as frações e a amostra foi agitada por 10 minutos. Em seguida,
o espectro de absorção de luz entre os comprimentos de onda de 300 e 800 nm foram analisadas
no espectrofotômetro GBC UV-920 para a obtenção do espectro de absorção nessas condições.
3.11) Cinética da cristalização espontânea de heme in vitro catalisada por DMSO
A cinética de cristalização de heme na qual utilizou-se como catalisador o DMSO foi
realizada nos tempos de 0, 3, 7, 10, 12, 15, 18, 20, e 24 horas. Para tal, foram utilizadas cinco
32
concentrações distintas de DMSO (0 %, 4,6 %, 8,3 %, 15,1 % ou 27,7 %) (v/v) em tampão
acetato de sódio 0,5 M, com pH ajustado em todas as amostras para 4,8 com ácido acético 0,5 M.
As amostras foram incubadas com hemina 100 µM no banho a 28
0
C e nas horas determinadas
eram retiradas e congeladas para posterior extração e dosagem de Hz, como descrito previamente.
3.12) Solubilização do heme em DMSO
Cinco concentrações de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v) foram
incubadas com hemina em tampão acetato de sódio 0,5 M, pH 4,8, com pH ajustado com ácido
acético 0,5 M. As amostras foram agitadas por 10 minutos e centrifugadas a 10000 x g, ou não,
por mais 10 minutos. A concentração de hemina utilizada foi de 10 µM para as amostras não
centrifugadas e de 100 µM para as que foram centrifugadas. O espectro de absorção de luz entre
300 a 800 nm foi então obtido para estas amostras através da análise no espectrofotômetro GBC
UV-920. O grau de solubilização de cada amostra foi estimado através da razão entre a absorção
da banda de Soret (em torno de 400 nm) e a banda Q (em torno de 600 nm), onde valores desta
razão próximos de 1.0 inferem uma baixa solubilidade do heme. (Huy et al., 2007).
3.13) Ensaio in vivo com Azadiractina
Fêmeas adultas de 3ª alimentação de R. prolixus foram alimentadas com sangue contendo
1 µg/mL de Azadiractina diluída em etanol. Um controle foi realizado alimentando os insetos
com sangue acrescentado de etanol na concentração final de 0.02% (v/v). Quatro dias após a
alimentação, os insetos foram dissecados e os seguintes parâmetros foram analisados: níveis de
Hz e heme total no intestino e níveis de heme na hemolinfa do inseto.
33
3.14) Síntese de hemozoína in vitro em placa – método para o teste das drogas quinolínicas
O efeito de novas drogas quinolínicas antimaláricas sobre a formação de Hz in vitro foi
avaliado de acordo com o protocolo de Ncokazi e Egan, 2005, especialmente descrito para a
varredura de compostos num ensaio de placa de 96 poços. O ensaio utilizou o tampão acetato de
sódio 0,5 M pH 4,8, 50 µg de proteína de intestino total de R. prolixus, 100 µM de heme e 10 µM
de diferentes drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente pelo Professor Timothy J. Egan na
Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul, com o qual nosso grupo mantem colaboração.
As amostras foram incubadas em uma placa de fundo cônico num volume final de 170 µL por 24
horas a 28
0
C em uma estufa com umidade controlada. Após as 24 horas de incubação, foi
adicionado ao meio um volume de piridina para a concentração final de 30 % (v/v) em Hepes 20
mM pH 7,5. Em seguida, a placa foi incubada por mais 30 minutos e 38 µL do sobrenadante foi
transferido para uma outra placa de fundo reto com mais 250 µL de piridina 30 % (v/v). A
quantificação de heme nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a 400
nm em um espectrofotômetro GBC UV-920 utilizando-se como referência uma curva padrão de
hemina (sigma) preparada em NaOH 0,1 N.
3.15) Tratamento do intestino total de R. prolixus com condroitinase
Previamente à incubação do intestino total de R. prolixus com heme para avaliar a
formação de Hz, uma alíquota correspondente à 100 µg de proteína deste material foi incubada
por 8 horas a 28
0
C com 100 µL da enzima condroitinase ABC liase 1 UI/mL diluída no tampão
Etilenodiamino 50 mM e Ácido Acético 82 mM pH 4,8. Após este pré-tratamento, a amostra foi
centrifugada e o pellet ressuspendido em acetato de sódio 0,5 M, pH 4,8. Em seguida, realizamos
34
a incubação em placa de 96 poços, com 50 µM de heme de acordo com o método descrito no
item anterior.
35
4) Resultados:
4.1) A cristalização espontânea de heme in vitro é regulada pela polaridade do meio de
reação
Trabalhos anteriores da literatura levantaram a hipótese de que a etapa limitante do
processo de cristalização de heme, sob o ponto de vista termodinâmico, é a solubilização do heme
em meio ácido (Egan e Ncozaki, 2001; Huy et al., 2007). Sendo assim, catalisadores deste
processo devem ser capazes de aumentar a solubilidade do heme em condições ácidas. Alguns
solventes como o etanol e o ácido benzóico aumentam a velocidade de formação de β-hematina e
essa formação se assemelha a vários processo de biomineralização como ocorre na formação de
hidroxiapatita nos ossos de organismos vertebrados (Egan et al., 2001; Bauer e Akkami, 2002).
Neste sentido, os trabalhos de Egan e colaboradores também indicam que a lenta conversão de
precipitados amorfos de heme em meio ácido em β-hematina ocorre graças a solubilização do
heme supostamente através da remoção da molécula de água axial ligada ao átomo de ferro
central do heme pelo acetato presente no meio de reação (Egan et al., 2001).
No intuito de entender melhor o processo de associação de heme e levando em
consideração as informações da literatura, investigamos se a diminuição da polaridade do meio
de reação, pela adição de compostos como DMSO ou polietilenoglicol (PEG) 6000 poderia afetar
a cristalização espontânea de heme (Figura 16). Podemos observar que os dois grupos
experimentais (DMSO e PEG 6000) foram bastante eficientes em estimular a cristalização
espontânea de heme in vitro. No caso das reações induzidas por DMSO, observamos o perfil
sigmóide da curva. Esta é característica do processo de formação de Hz com duas faces bem
36
discriminadas, sendo uma de indução em que ocorre o processo de nucleação seguida de uma
rápida fase de reação em que ocorre o crescimento do cristal. Após esta fase, o processo torna-se
constante, como já demonstrado por Egan et al., 2001. O aumento da velocidade do crescimento
do cristal ocorre provavelmente pela diminuição da quantidade de moléculas de água disponíveis
no meio reacional capazes de se associarem ao heme através de uma das valências axiais do
átomo de ferro central e também pela reação autocatalítica promovida pelos cristais de heme
nascentes.
Figura 16: Efeito temporal do DMSO e PEG 6000 sobre a cristalização espontânea de heme. As
amostras continham 100 µM de hemina na presença de PEG 1% (azul) ou DMSO 5% (vermelho)
em tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8 e foram incubados à 28
0
C por até 24 dias. A curva
induzida por heme (em preto) representa o controle da reação.
Baseado nestes resultados, nossa próxima abordagem foi investigar o efeito da redução da
polaridade do meio de reação sobre a solubilidade do heme in vitro em condições ácidas. Para
isso, cinco concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v) foram
incubadas na presença de 10 µM ou 100 µM de hemina em tampão acetato de sódio 0,5 M de
modo a avaliarmos se a redução da polaridade do meio de reação favoreceria a solubilização do
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
heme+NaAc
heme+NaAc+DMSO 5%
heme+NaAc+PEG 1%
Tempo (dias)
Hz (nmoles de heme)
37
heme em meio ácido. O pH das soluções foi corrigido para 4,8, pH ótimo para a formação de Hz
e próximo aos valores de pH encontrados no intestino de R. prolixus, de modo a evitar-se
qualquer efeito do pH sobre a reação de cristalização. Nas figuras 17A e 17B podemos observar
os espectros de absorção de luz do heme entre 300 nm e 800 nm nas amostras não centrifugadas
(figura 17A) e centrifugadas (figura 17B).Observa-se claramente na figura 17A um aumento da
absorção de luz próximo a 400 nm (banda de Soret) com o aumento da concentração de DMSO.
Este dado sugere por si só um aumento da solubilidade do heme em condições de menor
polaridade do meio. No entanto, de modo a confirmarmos se de fato a presença de DMSO
promoveu a solubilização do heme em condições ácidas, incubamos heme (100 µM) em
diferentes concentrações de DMSO por 10 minutos e posteriormente centrifugamos estas
amostras por 10 minutos, coletando o sobrenadante que foi posteriormente analisado por
espectrofotometria de absorção de luz. Podemos observar na figura 17B que, de fato, o aumento
da concentração de DMSO da mesma forma que as amostras não centrifugadas na figura 17A,
resultou num aumento da absorção da banda de Soret (em torno de 400 nm), indicando
fortemente o aumento da solubilidade do heme em condições ácidas. Uma outra forma de avaliar
a solubilidade do heme consiste na medida da razão da absorção de luz da banda de Soret (em
torno de 400 nm) e a banda Q (em torno de 640 nm). A razão dos valores de absorção destas duas
bandas fornece indiretamente o grau de solubilidade de cada amostra. Quanto maior for esta
razão mais solúvel o heme está no meio de reação da amostra analisada. Sendo assim, as figuras
17C e 17D mostram que o aumento da concentração de DMSO leva a um aumento dos valores da
razão Soret/Q, tanto nas amostras não centrifugadas (figura 17C) e centrifugadas (figura 17D). As
linhas em vermelho representam uma regressão linear. Portanto, observando-se a figura 17, pode-
38
se concluir que o aumento da concentração de DMSO em meio ácido proporciona uma maior
solubilidade do heme.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 17: A redução da polaridade do meio com diferentes concentrações de DMSO aumenta a
solubilização do heme em meio ácido. (A e B) espectros de absorção do heme entre 300 nm e 800
nm obtidos em tampão acetato de sódio 0,5 M e concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%,
8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v). A e C – amostras contendo 10 µM de hemina e não centrifugadas;
B e D – amostras contendo 100 µM de hemina e centrifugadas por 10 minutos a 10000 x g. (C e
D) Grau de solubilização do heme nas amostras medidas indiretamente através da razão de
absorção entre as bandas de Soret e a banda Q. A banda de Soret foi medida a 400 nm e a banda
Q em torno de 640 nm. As linhas em vermelho representam uma regressão linear.
DMSO 0%
DMSO 4,6%
DMSO 8,3%
DMSO 15,1%
DMSO 27,7%
0 5 10 15 20 25 30
0
5
10
15
20
Concentração de DMSO (%) (v/v)
Razão Soret/Q
0 5 10 15 20 25 30
0
5
10
15
20
Concentração de DMSO (%) (v/v)
Razão Soret/Q
0 5 10 15 20 25 30
4
6
8
10
12
Concentração de DMSO (%) (v/v)
Razão Soret/Q
0 5 10 15 20 25 30
4
6
8
10
12
Concentração de DMSO (%) (v/v)
Razão Soret/Q
300 400 500 600 700 800
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
nm
Abs.
360 380 400 420
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
nm
Abs .
300 400 500 600 700 800
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
nm
Abs.
360 380 400 420
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
nm
Abs .
300 400 500 600 700 800
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
nm
Abs.
360 380 400 420
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
nm
Abs .
300 400 500 600 700 800
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
nm
Abs.
360 380 400 420
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
nm
Abs .
39
De modo a verificar se o aumento da solubilidade do heme de fato promoveria a
cristalização espontânea do heme, incubamos heme (100 µM) em tampão acetato de sódio 0,5 M
nas mesmas concentrações de DMSO utilizadas nos experimentos da figura 17. Como podemos
observar na figura 18A, a dosagem de Hz de cada reação revelou que o aumento da concentração
de DMSO no meio de reação acelerou o processo de cristalização espontânea de heme. De modo
a tentarmos estabelecer uma relação entre a solubilização inicial e a posterior cristalização do
heme realizamos uma regressão linear entre os valores da razão da banda de Soret/banda Q das
amostras obtidas na figura 17A e a quantidade de Hz produzida em 24 horas de incubação nas 5
diferentes concentrações de DMSO, obtida da figura 18A. A figura 18B mostra que de fato a
cristalização espontânea do heme in vitro, depende fortemente da solubilização prévia desta
molécula em meio ácido (R
2
= 0,9121).
40
(A)
(B)
Figura 18: A redução da polaridade do meio acelera a cristalização espontânea do heme in vitro.
(A) Cinética de cristalização espontânea de heme com 100 µM de hemina em tampão acetato de
sódio 0,5 M e concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v). Os
tempos de incubação a 28
0
C utilizados na cinética foram de zero hora, 3 horas, 7 horas, 12 horas,
15 horas, 18 horas, 20 horas e 24 horas. (B) Correlação da quantidade de Hz produzida em 24
horas na cinética de cristalização espontânea de heme nas cinco concentrações de DMSO com a
razão entre as bandas de Soret e da banda Q obtida pela análise da figura 17A. A regressão linear
do gráfico fornece um valor de R
2
= 0,9121 e P<0,0001. Esta medida nos fornece uma estimativa
da solubilidade do heme nas distintas concentrações de DMSO.
0 4 8 12 16 20 24
0
2
4
6
0%DMSO
4.6% DMSO
8.3% DMSO
15.1% DMSO
27.7% DMSO
10
30
50
70
Tempo (horas)
Hz (nmoles heme)
0 10 20 30 40 50 60
4
6
8
10
12
R
2
=0,9121
P<0,0001
Hz (nmoles Heme)
Razão Soret/Q
41
4.2) Quantificação de alguns componentes do homogeneizado total do intestino de R.
prolixus
Já é conhecido na literatura que tanto as MPMV presentes no intestino de R. prolixus
(Oliveira et al., 1999; Oliveira et al 2000; Silva et al., 2007) quanto as gotículas lipídicas
presentes no intestino do S. mansoni desempenham um papel central no processo de cristalização
de heme (Soares et al., 2007). Sendo assim, é possível imaginar que os lipídeos presentes na
membrana intestinal do inseto R. prolixus devam exercer um papel catalítico importante no
processo de cristalização de heme neste organismo. Com o intuito de se identificar qual ou quais
substâncias presentes no intestino de R. prolixus estão envolvidos no processo de cristalização de
heme, determinamos os níveis de heme, Hz, proteínas totais e lipídeos no homogenato total do
intestino deste inseto. Estes valores são mostrados na tabela 1, com os respectivos valores de
média, desvio padrão e número de repetições (N) de cada dosagem.
Média Desvio Padrão N
Heme (nmoles/intestino)
638,37 123,72 6
Hemozoina (nmoles/intestino)
196,53 14,67 6
Proteína (mg/intestino)
1,44 0,20 7
Lipídeo (µ
µµ
µg/intestino)
204,03 34,63 3
Tabela 1: Dosagem de componentes do intestino de Rhodnius prolixus. Valores de média, desvio
padrão e número de repetição (N) de diversos componentes do intestino de fêmeas adultas de R.
prolixus de 1ª alimentação, 10 dias após alimentação.
42
4.3) A formação de Hz é induzida por diferentes componentes do intestino de R. prolixus
Fêmeas adultas de Rhodnius prolixus de 1ª alimentação, 10 dias após alimentação, foram
dissecadas, e o intestino total retirado. De modo a investigarmos a contribuição de alguns destes
componentes envolvidos na cristalização de heme no intestino de R. prolixus, realizamos ensaios
de formação de Hz in vitro induzido por lipídeos totais e Hz isolados do intestino de R. prolixus.
Podemos observar na figura 19, que a incubação de 40 µg de lipídeos com heme é capaz de
formar Hz de maneira bastante eficiente. Inesperadamente, constatamos que a capacidade destes
lipídeos em catalizar a formação de Hz é termo-sensível, uma vez que o aquecimento por 30
minutos a 100
0
C destas amostras levou a uma redução significativa da atividade responsável pela
cristalização de heme (teste t P<0,001).
Figura 19: Lipídeos isolados do intestino de R. prolixus são capazes de promover a cristalização
do heme in vitro de forma termo-sensível. 40 µg de lipídeos totais isolados do homogeneizado
total do intestino de R. prolixus foram previamente fervidos ou não por 30 minutos a 100
0
C e
incubados em tampão acetato de sódio 0,5 M na presença de 100 µM de heme por 24 horas a
28
0
C. O resultado do experimento acima segue uma distribuição normal e assim significância
estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,001
#
. (n = 10).
Lipídeo 40 µ
µµ
µg Lipídeo 40 µ
µµ
µg fervido
0
4
8
12
16
20
24
28
Hz (nmoles de heme)
#
43
Uma outra abordagem foi realizada para estudar o processo de autocatálise já conhecido
na literatura, onde cristais de β-hematina são capazes de aumentar de tamanho na presença
unicamente de hemina. Para isto, dois experimentos foram realizados: no primeiro, diferentes
concentrações de cristais de Hz sintética (β-hematina) foram incubadas unicamente na presença
de hemina. Da mesma forma, diferentes concentrações de cristais de Hz previamente purificados
do intestino de R. prolixus foram incubadas com hemina. Como esperado, na figura 20 podemos
observar que ambos foram capazes de induzir significativamente (ANOVA e Tukey P<0,01
#
e
P<0,05*) a formação de cristais de heme por autocatálise. Portanto, pode-se concluir que a Hz
isolada de R. prolixus é capaz de estender os cristais por autocatálise a partir de um pequeno
cristal já formado.
44
(A) (B)
Figura 20: Cristais de Hz são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise. (A)
Diferentes concentrações (1, 2, 5, 10 e 20 µM) de cristais de Hz sintética (β-hematina) foram
incubadas na presença de hemina. (B) Diferentes concentrações (1, 2, 5, 10 e 50 µM) de Hz
previamente isolada do intestino de R. prolixus foram incubadas com hemina. A quantidade de β-
hematina ou Hz adicionadas ao meio de reação foi subtraída do valor total medido. A
significância estatística dos experimentos acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a
posteriori obtendo-se valores de P<0,05* (na figura A 1 vs 20 e na figura B 10 vs 50) e valores
de P<0,01
#
(na figura B 50 vs 1 ou 2 ou 5). (n=4).
Como observado nos primeiros resultados apresentados nesta tese, a cristalização
espontânea do heme in vitro depende fortemente da solubilização prévia desta molécula em meio
ácido. Para testarmos a solubilização do heme nas estruturas presentes no intestino do R. prolixus,
realizamos um experimento no intuito de se observar a capacidade de Hz previamente extraída do
conteúdo intestinal deste inseto em interferir com a solubilidade do heme em meio ácido. Para
isto, incubamos diferentes quantidades de Hz (50, 100 e 200 µmoles) com 50 µM de heme em
tampão acetato de sódio 0,5 M e avaliamos a razão entre as absorções das bandas de Soret e da
banda Q já descrita anteriormente. Podemos observar na figura 21 que na presença de Hz ocorre
uma redução da razão Soret/Q nas amostras de heme incubadas com Hz, que nos leva a sugestão
# # #
*
1 2 5 10 50
0
3
6
9
12
Hz (µ
µµ
µM)
Hz (nmoles de heme)
1 2 5 10 20
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
β
ββ
β-hematina (µ
µµ
µM)
Hz (nmoles de heme)
*
45
de que a presença de cristais de heme promovem a redução da solubilidade desta molécula em
condições ácidas. Sendo assim, o cristal de heme previamente formado no intestino parece
desempenhar uma função importante neste processo.
Figura 21: A Hz é capaz de reduzir a solubilidade do heme in vitro. Quantidades diferentes de
Hz (50, 100 e 200 nmoles) foram incubadas com 50 µM de heme em tampão acetato de sódio 0,5
M e por espectrofotometria foi medida a razão banda de Soret / Q. A significância estatística do
experimento acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valores de
P<0,001
#
(D vs A ou B ou C) e valores de P<0,01* (A vs C). (n = 6).
4.4) O tratamento com azadiractina diminui os níveis de heme intestinais e o eleva na
hemolinfa
A azadiractina é uma droga conhecida por causar a desorganização da ultraestrutura das
células do epitélio intestinal e inibir a formação da MPMV no intestino de R. prolixus (Garcia et
al., 1991; Nogueira et al., 1997; Gonzales et al., 1998). Sendo assim, nossa próxima abordagem
foi estudar o efeito desta droga na cristalização de heme no intestino de R. prolixus, pois,
A B C D
Hemozoína nmoles 50 100 200 ----
Heme nmoles 50 50 50 50
0
1
2
3
4
5
Razão Soret/Q
# # #
*
46
partindo-se do princípio que esta droga inibe a formação de MPMV e esta é importante no
processo de cristalização de heme, talvez esta droga conseqüentemente poderia inibir a formação
de Hz no intestino deste inseto. Para isso, fêmeas adultas de 3ª alimentação foram alimentadas
com sangue suplementado com azadiractina na concentração final de 1 µg/mL. Quatro dias após
a alimentação três parâmetros foram analisados: a quantidade de Hz no intestino do inseto
(Figura 22A), a quantidade de heme total neste mesmo tecido (figura 22B) e a quantidade de
heme circulante na hemolinfa (figura 22C). Analisado-se a figura 22 podemos constatar que esta
droga tende a diminuir a quantidade de Hz presente no intestino do inseto, diminui
significativamente (P<0,0019
#
) a quantidade de heme total nesse tecido e por sua vez aumenta
significativamente (P<0,0118*) a quantidade de heme circulante na hemolinfa, provavelmente
causada pela diminuição deste no intestino.
47
(A) (B)
(C)
Figura 22: A azadiractina interfere na cristalização de heme no inseto R. prolixus. Fêmeas
adultas de 3ª alimentação foram alimentadas com sangue suplementado com azadiractina na
concentração final de 1 µg / mL. Quatro dias após a alimentação os insetos foram dissecados. (A)
Dosagem da quantidade de Hz no intestino do inseto. (B) Dosagem da quantidade de heme total
no mesmo tecido. O resultado deste experimento segue uma distribuição normal e assim a
significância estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,0019
#
. (C) Dosagem
da quantidade de heme circulante na hemolinfa. Dosagem da quantidade de heme total no mesmo
tecido. O resultado deste experimento segue uma distribuição normal e assim significância
estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,0118*.
Controle Azadiractina
0
100
200
300
Hz (nmoles de heme)
0
250
500
750
1000
Heme (nmoles)
Controle Azadiractina
#
0
20
40
60
80
Heme (
µ
µ
µ
µ
M)
Controle Azadiractina
*
48
4.5) Glicosaminoglicanos sulfatados presentes no intestino de Rhodnius prolixus estão
envolvidos no processo de cristalização de heme
Entre os anos de 2001 e 2004, um grupo de pesquisadores do Instituto de Bioquímica
Médica da UFRJ liderado pelo professor Luiz Cláudio observou a presença de
Glicosaminoglicanos (GAGs), um açúcar sulfatado, em vários tecidos do Rhodnius prolixus
(Costa-Filho, et al., 2001; Costa-Filho, et al., 2004). Especificamente no intestino deste inseto,
foi detectada a presença de grandes quantidades do GAG condroitin sulfato (CS) (Costa-Filho, et
al., 2004). A função biológica deste GAG ainda é desconhecida neste tecido. Sendo assim,
testamos se o CS poderia de alguma forma estar envolvido no processo de formação de Hz no
intestino de R. prolixus. Para isto, realizamos um experimento em colaboração com o grupo do
Professor Luiz Cláudio que consistiu na incubação do homogeneizado total do intestino de R.
prolixus com a enzima condroitinase de modo a remover os resíduos de CS desta amostra.
Posteriormente, incubamos por 24 horas este mesmo material na presença de 50 µM de heme
para observar a atividade de cristalização de heme. Podemos observar na figura 23 que o
tratamento com condroitinase diminuiu significativamente a capacidade do intestino em
cristalizar o heme (ANOVA e Tukey P<0,001
#
). Sendo assim, podemos dizer que a presença de
CS no intestino de R. prolixus parece desempenhar um papel na cristalização de heme no
intestino de Rhodnius prolixus pois, apesar de haver a formação de Hz mesmo na ausência deste
GAG, esta ocorre em menores quantidades.
49
Figura 23: Condroitin sulfato desempenha um papel importante sobre a formação de Hz induzida
pelo homogeneizado total de intestino do R. prolixus. Foi realizado um pré-tratamento do
intestino com esta enzima e em seguida uma incubação de 24 horas deste mesmo material na
presença de 50 µM de heme. Como controle, realizamos um pré-tratamento do intestino apenas
com o tampão da condroitinase e um outro controle que não foi pré-tratado. A significância
estatística do experimento acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-
se valor de P<0,001
#
(controles vs condroitinase). (n = 8).
4.6) O grau de solubilidade do heme depende da densidade das frações do homogeneizado
total do intestino de Rhodnius prolixus
Como observamos que diferentes estruturas do intestino de Rhodnius prolixus eram
capazes de cristalizar o heme de maneiras distintas, nosso próximo passo foi realizar o
fracionamento do homogeneizado total do intestino deste inseto, de modo a determinar os níveis
de heme total, Hz e proteína em cada fração do gradiente. Este fracionamento foi realizado com a
aplicação deste homogeneizado em um gradiente descontinuo de sacarose nas concentrações de
20%, 40% e 60 % (v/v) diluídos em PBS pH 7,4. Na figura 24A podemos observar que após a
centrifugação do gradiente, o homogeneizado do intestino total foi separado em cinco frações
distintas (Topo, 1, 2, 3 e 4). Estas cinco frações foram coletadas e a concentração de proteína
Controle Condroitinase Controle
0
1
2
3
4
5
Branco: pre-tratados
Cinza: não pre-tratado
Hz (nmoles de heme)
#
50
aferida apresentando valores semelhantes nas frações de 1 a 4 e uma concentração um pouco
maior na fração de topo.
Uma vez de posse das frações isoladas, buscamos identificar se as moléculas de heme
presentes nestas frações poderiam se encontrar em distintos estados de cristalização. A figura
24B mostra o espectro de absorção de luz visível entre os comprimentos de onda de 300 a 800
nm das cinco frações do gradiente de sacarose e, de maneira geral, todas elas possuem um
espectro muito semelhante ao do heme exibindo uma banda de Soret entre 390 nm e 450 nm. Na
figura 24C podemos observar espectros típicos de heme e o cristal de heme sintético β-hematina,
obtido de Oliveira et al., 2007. Comparando-se estas duas figuras, podemos constatar que os
espectros de absorção de luz visível das frações de menor densidade (topo e 1) são mais
semelhantes ao espectro de heme, com banda de Soret em torno de 390 nm, enquanto as frações
mais densas (2, 3 e 4) apresentam um espectro típico de Hz, com picos de absorção
característicos em 450 nm e 660 nm. Assim, concluímos que as frações de maior densidade
(frações 2, 3 e 4) possuem a maior parte do heme sob a forma de Hz. De fato, dados preliminares
mostram que o conteúdo de Hz é maior quanto maior forem as densidades das frações (dado não
mostrado). Com estas mesmas frações, buscamos entender o grau de solubilidade das moléculas
de heme presentes em cada fração. Como demonstrado na figura 24D, as moléculas de heme
presentes nas frações de menor densidade (Topo e 1) encontram-se significativamente (ANOVA
e Tukey P<0,001
#
) num maior grau de solubilidade comparado com as frações de maior
densidade.
51
(A) (B)
(C) (D)
Figura 24: As frações de menor densidade obtidas no gradiente de sacarose do fracionamento do
homogeneizado intestinal do R. prolixus possuem espectro típico de heme enquanto que as
frações mais densas apresentam características típicas de Hz. (A) Fracionamento do
homogeneizado de intestinal do R. prolixus em um gradiente descontínuo de sacarose nas
concentrações de 20%, 40% e 60 % (v/v) diluídos em PBS pH 7,4. (B) Espectro de absorção das
cinco frações do gradiente de sacarose. (C) Espectros de heme (cinza) e de b-hematina (preto)
obtido de Oliveira et al., 2006. (D) Solubilidade do heme em cada uma das cinco frações do
gradiente. A significância estatística deste último experimento foi avaliada pelos testes ANOVA
e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001
#
(Topo ou Fração 1 vs Fração 2 ou 3 ou 4) e
P<0,05* (Fração 2 vs Fração 3). (n = 4).
300 400 500 600 700 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Fração 1
Fração 2
Fração 3
Fração 4
Topo
nm
Abs.
Top
o
Fraçã
o
1
Fraçã
o
2
Fração 3
Fração 4
0
1
2
3
Razão Soret/Q
# # #
#
*
Topo
Fração 1
Fração 2
Fração 3
Fração 4
52
4.7) As frações de baixa densidade do gradiente de sacarose são menos eficientes na
cristalização de heme do que as frações de maior densidade
Após o estudo detalhado de cada fração formada no gradiente descontinuo de sacarose
realizado com o homogeneizado total do intestino de R. prolixus, fomos observar a atividade de
cada uma dessas frações em formar Hz. Para isto, inicialmente realizamos uma cinética de
formação de Hz nos tempos de zero, 12, 18 e 24 horas. A figura 25A mostra esta cinética na
presença de 50 µg de proteína de cada fração com 100 µM de heme a 28
0
C. Nela podemos
observar que todas as frações são capazes de promover a cristalização do heme com diferentes
eficiências. Na figura 25B temos o resultado dessa incubação no período de 24 horas, onde
observamos que as frações de maior densidade (2, 3 e 4), frações estas que apresentam menor
capacidade em solubilizar o heme, são as frações que, curiosamente, cristalizaram uma maior
quantidade de heme. Houve um aumento significativo (ANOVA e Tukey P<0,001
#
, P<0,01*, e
P<0,05
+
) das frações 2, 3 e 4 (em torno de 7 a 13 vezes) em produzir Hz quando comparado com
as frações de topo e 1. Ao realizarmos uma correlação entre o estudo de solubilização do heme
nestas frações (razão soret/Q mostrada na figura 24D) com os valores da quantidade de Hz
absoluta formada por cada uma das cinco frações em 24 horas de incubação (figura 25B),
observamos, na figura 25C que esta correlação é negativa, ou seja, quanto maior o estado de
solubilização do heme, menor é a quantidade de heme cristalizado (R = 0,95836, P < 0,0037).
Sendo assim, ao contrário do que ocorre in vitro com o uso de DMSO, estes experimentos
mostraram que, aparentemente, o maior grau de solubilização do heme em meio ácido parece ser
menos relevante para a eficiência catalítica do processo de cristalização de heme no inseto
Rhodnius prolixus. Sabendo que os cristais de heme são capazes de promover a extensão dos
53
mesmos através de autocatálise, podemos sugerir que a maior quantidade de Hz produzida pelas
frações de maior densidade possa ser gerada essencialmente por autocatálise induzida pela Hz
pré-existente nestas frações, como mostrado na figura 24 B.
54
(A)
(B)
(C)
Figura 25: As frações de maior densidade do intestino de R. prolixus apresentam maior
capacidade de formação de Hz. (A) Cinética de formação de Hz na presença de 50 µg de proteína
de cada fração incubada em tampão acetato de sódio 0,5 M com 100 µM de heme a 28
0
C. (B)
Incubação no período de 24 horas. A significância estatística deste experimento foi avaliada pelos
0 4 8 12 16 20 24
0
5
10
15
20
25
Topo
Fração 1
Fração 2
Fração 3
Fração 4
Intestino Total
Tempo (horas)
Hz (nmoles de heme)
Top
o
Fr
a
çã
o
1
Fr
a
çã
o
2
Fra
ção 3
Fr
a
ç
ão
4
0
3
6
9
12
15
Hz (nmoles de heme)
#
*
+
#
0 4 8 12 16
0
1
2
3
4
R = 0,9583
P = 0,0037
Hz (nmoles de Heme)
Razão Soret/Q
0 4 8 12 16
0
1
2
3
4
R = 0,9583
P = 0,0037
Hz (nmoles de Heme)
Razão Soret/Q
55
testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001
#
(Topo ou Fração 1 vs Fração 3
ou 4) P<0,01* (Topo ou Fração 1 vs Fração 2) e P<0,05
+
(Fração 2 vs Fração 4). (C) Correlação
da quantidade de Hz formada pelas frações em 24 horas de incubação (figura 25B) com o poder
de solubilização do heme presente nas mesmas, obtido através da razão da banda de Soret / banda
Q, da figura 24D.
4.8) Drogas quinolínicas inibem a cristalização de heme em R. prolixus
Já é bem conhecido na literatura o papel de drogas quinolínicas como inibidoras do
processo de cristalização de heme (Cohen et al., 1964; Chau, 1980; Dorn et al., 1998; Vippagunta
et al., 2000). Nosso grupo já demonstrou que a formação de Hz no intestino de R. prolixus
também é inibida por cloroquina em experimentos realizados in vivo (Oliveira et al., 2000a).
Levando em consideração estas informações, decidimos investigar se a cristalização de heme no
intestino de R. prolixus pode ser inibida por outras drogas antimaláricas. Nossa primeira
abordagem foi investigar se a cristalização de heme induzida por lipídeos intestinais de R.
prolixus também seria afetada por duas diferentes drogas quinolinicas: a Cloroquina e a Quinina.
Para isto, incubamos 40 µg de lipídeos totais extraídos do intestino de R. Prolixus por 24 horas a
28
0
C na presença de 100 µM de hemina comercial e testamos o poder de inibição destas duas
drogas nas concentrações de 50 µM, 100 µM e 300 µM. A figura 26 mostra que a Cloroquina foi
capaz de inibir significativamente (ANOVA e Tukey P<0,001
#
) a cristalização de heme já na
menor concentração testada, de 50 µM, mas o composto Quinina foi capaz de abolir
completamente (ANOVA e Tukey P<0,001
#
) a formação de Hz. Portanto, podemos concluir que
a capacidade de cristalização do heme apresentada pelos lipídeos intestinais de R. prolixus é
56
sensível a drogas quinolínicas, sendo que a quinina exerce um efeito mais potente do que a
cloroquina.
Figura 26: Efeito de drogas quinolínicas na formação de Hz in vitro induzida pelos lipídeos
intestinais de R. prolixus. 40 µg de lipídeos foram incubadas por 24 horas a 28
0
C na presença de
100 µM de heme e 50 µM, 100 µM ou 300 µM de Cloroquina (CLO) ou Quinina (QUI). A
significância estatística deste experimento foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori
obtendo-se valor de P<0,001
#
(Lipídeo 40 µg vs CLO 50 µM ou CLO 100 µM ou CLO 300 µM
ou QUI 50 µM ou QUI 100 µM ou QUI 300 µM). (n = 6).
Paralelo ao estudo in vitro, realizamos também testes in vivo no barbeiro com algumas
drogas quinolínicas. Para tal, fêmeas adultas de 2ª alimentação foram alimentadas com sangue
suplementado com sete concentrações diferentes de quinidina: 50 µM, 70 µM, 100 µM, 150 µM,
200 µM, 250 µM e 500 µM. Observando-se a figura 27 vemos que a suplementação da droga em
concentrações a partir de 100 µM da droga é capaz de inibir significativamente (ANOVA e
Tukey P<0,001
#
) a formação de Hz no intestino deste inseto. Outras drogas antimaláricas como a
Li
p
ídeo 40
µµ
µ
µg
M
µµ
µ
µ
5
0
M
µµ
µ
µ
1
00
M
µµ
µ
µ
300
M
µµ
µ
µ
50
M
µµ
µ
µ
1
0
0
M
µµ
µ
µ
3
00
0
4
8
12
16
20
24
28
Hz (nmoles de heme)
CLO QUI
# # #
# # #
57
quinina e clotrimazol também foram testados e ambos apresentaram um potente efeito inibitório
sobre a cristalização de heme in vivo (dados não mostrados).
Figura 27: Efeito da quinidina na formação de Hz in vivo em R. prolixus. Fêmeas adultas de 2ª
alimentação foram alimentadas com sangue suplementado com 50 µM, 70 µM, 100 µM, 150 µM,
200 µM, 250 µM e 500 µM da droga. Quatro dias após a alimentação os insetos foram dissecados
e foi realizada dosagem da quantidade de Hz no intestino do inseto. A significância estatística
deste experimento foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de
P<0,001
#
(Controle ou 50 µM ou 70 µM ou 100 µM vs 150 µM ou 200 µM ou 250 µM ou 500
µM). (n = 8).
Em colaboração com o grupo do Professor Timothy Egan do Departamento de Química
da Universidade da Cidade do Cabo (África do Sul) avaliamos o efeito de novas drogas
quinolínicas sintetizadas quimicamente por este grupo na formação de Hz induzida por
homogeneizados de intestino de R. prolixus. Este mesmo grupo na África do Sul também
desenvolveu uma nova metodologia para o teste da atividade de inibição da formação de Hz in
vitro destas drogas (Ncokazi e Egan, 2005). Este método tornou o teste de potenciais drogas
controle
50
µµ
µ
µ
M
70
µµ
µ
µ
M
10
0
µµ
µ
µ
M
150
µµ
µ
µ
M
2
00
µµ
µ
µ
M
250
µµ
µ
µ
M
500
µµ
µ
µ
M
0
25
50
75
100
125
Hz (nmoles de heme/ intestino)
# # # # #
58
antimaláricas bem mais rápido, podendo ser realizado em série, como descrito no item 3.14 do
materiais e métodos desta tese. Sendo assim, testamos o poder de inibição da cristalização de
heme de quatro destes novos compostos sintéticos: compostos 1, 3, 7 e 10 (Figura 28A). Todos
os compostos foram utilizados na concentração de 10 µM e a Quinina 10 µM foi utilizada como
controle do novo método, pois já é bem conhecida a capacidade desta droga em inibir a formação
de Hz. Assim, utilizamos 50 µg de proteína do homogeneizado total do intestino de R. prolixus
que foi incubado por 24 horas a 28
0
C na presença de 100 µM de heme e de diferentes drogas.
Podemos observar na figura 28B que os compostos 1 e 10 foram significativamente (ANOVA e
Tukey P<0,001
#
) tão eficazes quanto a quinina, inibindo 100% a cristalização de heme. A droga 7
apresentou menor inibição sobre a cristalização do heme. Entretanto, a droga 3 não foi capaz de
diminuir a formação de Hz induzida pelo intestino do inseto. Pretendemos dar continuidade a
caracterização da relação estrutura-função destas drogas sobre a cristalização de heme em
Rhodnius prolixus. Tais estudos serão desenvolvidos em colaboração com o grupo de Professor
Egan.
59
(A) (B)
Figura 28: Novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente são eficientes na inibição da
formação de Hz in vitro induzida pelo homogeneizado total do intestino de R. prolixus. (A)
Estrutura molecular dos quatro novos compostos quinolínicos (compostos 1, 3, 7 e 10). (B)
Inibição da formação de Hz pelas novas drogas quinolínicas. Homogeneizado total do intestino
de R. prolixus (50 µg de proteína) foi incubado por 24 horas a 28
0
C na presença de 100 µM de
heme e 10 µM de diferentes drogas. A significância estatística deste experimento foi avaliada
pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001
#
(Intestino + heme vs
Quinina ou Composto 1 ou Composto 10). (n = 6).
Composto 1
N
NH
2
Cl
N
NH
Cl
OH
Composto 3
N
NH
Cl
N
CH
3
CH
3
Composto 7
N
NH
Cl
N
CH
3
CH
3
N
NH
Cl
N
CH
3
CH
3
N
NH
Cl
N
CH
3
CH
3
N
NH
Cl
N
CH
3
CH
3
Composto 10
In
t
es
ti
no
+ Heme
Qui
n
in
a
Co
m
p
o
st
o
1
Co
m
po
s
to
3
Co
m
p
o
st
o
7
Composto 10
0
1
2
3
4
5
6
Hz (nmoles de heme)
# # #
60
5) Discussão:
Os organismos hematófagos, ao ingerirem a cada alimentação grandes quantidades de
sangue e ao digerirem especialmente a hemoglobina liberam em seu trato digestivo grandes
quantidades de heme, que, na forma livre, é extremamente tóxico e danoso aos sistemas
biológicos (Schmitt et al., 1993, Ryter et al., 2000). Por este motivo, ao longo da evolução estes
organismos desenvolveram uma série de mecanismos de defesa para a detoxificação do heme. No
inseto Rhodnius prolixus, já foi demonstrado que a detoxificação do heme ocorre basicamente
por três mecanismos distintos: através de uma proteína capaz de ligar o heme denominada RHBP
(Oliveira et al., 1995; Dansa-Petretski et al., 1995), através de uma enzima que degrada o heme,
denominada heme oxigenase (Paiva-Silva et al., 2006) e principalmente através de um agregado
cristalino de heme conhecido como Hemozoína (Oliveira et al., 1999). A formação deste cristal
de heme representa a primeira defesa antioxidante preventiva para este organismo (Oliveira et al.,
2002), sendo posteriormente liberado nas fezes do barbeiro. Este cristal de heme antes de ser
descoberto no Rhodnius prolixus foi descrito no parasito da Malária, o Plasmodium falciparum
(Slater et al., 1991). Posteriormente, nosso grupo demonstrou a presença deste mesmo cristal no
helminto Schistosoma mansoni (Oliveira et al., 2000b).
Já é bem conhecido o fato do heme ser extremamente insolúvel em meio ácido.
Entretanto, trabalhos mais recentes na literatura sugerem que a etapa limitante do processo de
cristalização do heme, sob o ponto de vista termodinâmico, é a solubilização desta molécula em
meio ácido (Egan e Ncozaki, 2001; Huy et al., 2007). Sendo assim, imaginamos que substâncias
capazes de solubilizar o heme em condições ácidas sejam potenciais catalisadores do processo de
formação de Hz. Egan e colaboradores acreditam que esta solubilização possa ser facilitada pela
61
remoção das moléculas de água axiais que encontram-se ligadas ao átomo de ferro central do
heme. Esta remoção ocorre na presença de outros ligantes como o acetato no meio de reação
(Egan et al., 2001; Ncozaki e Egan, 2001). Alguns trabalhos demonstram que determinados
solventes como o etanol e o ácido benzóico aumentam a velocidade de formação de Hz (Blauer e
Akkami, 2002; Huy et al., 2007), assim como diversos lipídeos (Egan et al., 2006). Portanto, a
cristalização de heme parece estar associada a ambientes hidrofóbicos. Sendo assim, decidimos
investigar se a diminuição da polaridade do meio reacional através do uso de solventes como o
DMSO ou polietilenoglicol (PEG) 6000 poderia afetar a cristalização espontânea de heme. De
fato, estes dois solventes aumentaram a velocidade de cristalização espontânea de heme na
ausência de qualquer catalisador (Figura 16). Este resultado sugere que a presença de um
ambiente de menor polaridade seja um pré-requisito importante para a formação de um cristal
sintético de Hz (β-hematina). Os resultados mostrados nas figuras 17 suportam as evidências
neste sentido. A análise desta figura indica que a redução da polaridade do meio pelo uso de
diferentes concentrações de DMSO proporciona um aumento da solubilidade do heme em
condições ácidas. Esses resultados corroboram os dados já mencionados de Egan e colaboradores
que mostraram que altas concentrações de acetato de sódio são também capazes de estimular a
formação de Hz (Egan et al., 2001). Ainda neste contexto, analisamos se este aumento da
solubilidade do heme em ambiente ácido e hidrofóbico estaria relacionado com a cristalização
desta molécula. Nós observamos que a redução da polaridade do meio de fato acelerou a
cristalização espontânea do heme in vitro (figura 18). Estes resultados estão de acordo com dados
da literatura, em que se sabe que a formação de Hz é estimulada na presença de álcool e lipídeos
(Huy et al., 2007; Egan et al., 2006), compostos estes que diminuem a polaridade do meio.
62
O intestino do inseto Rhodnius prolixus contém uma membrana que envolve todo o
epitélio intestinal. Esta membrana, chamada de Membrana Perimicrovilar (MPMV), rica em
lipídeos, está envolvida no processo de cristalização de heme (Oliveira et al., 1999; Oliveira et
al., 2000a; Oliveira et al., 2005). Trabalhos prévios da literatura têm demonstrado que o processo
de cristalização de heme em Plasmodium está associado a membranas do vacúolo digestivo deste
parasito (Hempelmann et al., 2003). Nosso grupo também já demonstrou que no lúmen intestinal
do helminto Shistosoma mansoni existem gotículas lipídicas (Oliveira et al., 2005) e que a
formação de Hz neste organismo ocorre na superfície destas gotículas (Soares et al., 2007).
Discute-se que, in vivo, a formação de Hz possa ocorrer por três maneiras distintas: por
autocatálise, induzida por lipídeos ou induzida por proteínas. Entretanto, não se sabe ainda qual o
principal mecanismo indutor para a formação de Hz no intestino de R. prolixus. O que já se sabe
é que um importante componente responsável pela formação de Hz neste inseto encontra-se na
MPMV (Oliveira et al., 2000a). Esta membrana apresenta seu desenvolvimento regulado pela
alimentação do inseto, e o seu pico de formação, medido através da atividade de uma enzima
marcadora da MPMV chamada alfa-glicosidade, correlaciona-se com o pico de formação do
cristal de Hz (Silva et al., 2007). Acreditamos que, assim como no Plasmodium e no Schistosoma
mansoni, os lipídeos presentes na MPMV do intestino deste inseto, estão intimamente
relacionados com a cristalização do heme. Nossos resultados mostram que, de fato, os lipídeos
isolados do intestino total de R. prolixus são capazes de promover a formação de Hz, de maneira
muito eficaz (figura 19). Entretanto, e de maneira inesperada, esta atividade de formação de Hz
demonstrada por estes lipídeos mostrou-se muito termo-sensível (figura 19). Dansa-Petretski e
colaboradores sugerem que proteínas isoladas da MPMV estejam envolvidas no processo de
formação de Hz no intestino deste inseto (Silva et al., 2007). Sendo assim, especulamos que o
fato de os lipídeos terem se mostrado termo-sensíveis se deva ou a contaminantes protéicos na
63
amostra ou que estes lipídeos envolvidos na cristalização de heme sejam lipoproteínas, sensíveis
a altas temperaturas. Pretendemos em breve elucidar esta dúvida através de quantificação de
proteínas totais nas frações de lipídeos para detectarmos possíveis contaminantes protéicos e
realizaremos também cromatografias de camada fina para analisarmos mais detalhadamente quais
os tipos de lipídeos presentes na MPMV deste inseto.
Como mencionado, um dos mecanismos que promovem a cristalização de heme é a
autocatálise, onde cristais de β-hematina (Hz sintética) são capazes de aumentar de tamanho na
presença unicamente de heme. Este mecanismo está presente no vacúolo digestivo do
Plasmodium falciparum (Dorn et al., 1995). No intuito de elucidarmos este conceito, estudamos
se este processo autocatalítico de formação de Hz estava presente no intestino de R. prolixus.
Nossos resultados indicam que, assim como a autocatálise que ocorre in vitro com a incubação de
β-hematina e heme (figura 20A), os cristais de Hz isolados do conteúdo intestinal de R. prolixus
são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise (figura 20B). Portanto, nossos
resultados mostram que, no intestino deste inseto, ao menos dois processos distintos estão
envolvidos na cristalização de heme: a catálise induzida por lipídeos e a autocatálise.
Demonstramos no começo desta tese e já discutimos anteriormente, a importância da
solubilização do heme em meio ácido no processo de formação de Hz. Entretanto, este fato ainda
não havia sido estudado no intestino de Rhodnius prolixus. Com este intuito, observamos se a
presença de cristais de Hz previamente isolados do intestino deste inseto seriam capazes de
alterar as propriedades de solubilidade do heme in vitro. Na figura 21 podemos observar que
aparentemente os cristais de heme presentes no intestino do inseto promovem a redução da
solubilidade desta molécula em condições ácidas.
64
Como já mencionado, a MPMV está intimamente relacionada com a formação de Hz
(Oliveira et al., 2000a). De acordo com a literatura, o desenvolvimento completo desta membrana
no epitélio intestinal depende da distensão abdominal, de componentes do sangue, em especial a
hemoglobina, e de fatores humorais. Este último, ativa o sistema neuroendócrino, levando a
liberação dos hormônios protoracicotrópicos (PTTH) pelas células neurosecretoras do cérebro.
Estes hormônios por sua vez induzem a secreção de Ecdisona (Hormônio da muda) pelas
glândulas protorácicas, o que aumenta o crescimento do epitélio e conseqüentemente o
desenvolvimento da MPMV (Albuquerque-Cunha et al., 2005). O desenvolvimento desta
membrana pode ser inibido por um composto chamado de Azadiractina, o que leva inclusive a
alterações na capacidade de adesão do Tripanosoma cruzi ao intestino do inseto tratado com este
composto (Garcia, et al. 1989; Garcia et al., 1991; Nogueira et al., 1997; Gonzales et al., 1998).
Ao observarmos a figura 22, na qual os animais foram alimentados com sangue enriquecido com
Azadiractina, concluímos que a inibição da formação da MPMV tende a: diminuir a quantidade
de Hz presente no intestino deste inseto, diminui significativamente a quantidade de heme neste
mesmo tecido e aumenta a quantidade de heme presente na hemolinfa. Portanto, uma formação
deficiente da MPMV resulta em um aumento de heme circulante e é possível que este composto
afete também a digestão do sangue, talvez pela ausência da MPMV. Este dado indica que, de
fato, a formação de Hz no intestino de Rhodnius prolixus é dependente da presença das MPMV e
representa uma importante defesa antioxidante para este inseto, uma vez que a inibição deste
processo pode levar a um aumento dos níveis de heme circulante, e pode resultar em estresse
oxidativo para o animal (Oliveira et al., 2000a). Este resultado está de acordo com outros dados
do nosso grupo no qual insetos tratados com cloroquina, inibidora da cristalização de heme,
apresentaram uma forte inibição da formação de Hz no intestino e um maior grau de peroxidação
lipídica na hemolinfa (Oliveira et al., 2000a).
65
Em uma outra abordagem, estudamos se um composto presente no intestino do inseto
Rhodnius prolixus poderia estar envolvido na cristalização de heme. Estes compostos,
identificados como Glicosaminoglicanos (GAGs), foram identificados no R. prolixus, e mais
especificamente o GAG sulfatado condroitin sulfato (CS), foi localizado na MPMV do intestino
do inseto (Costa-Filho, et al., 2004). Entretanto, a função deste CS neste tecido ainda é
desconhecida. Neste sentido, tentamos observar se estes (GAGs), poderiam estar envolvidos no
processo de cristalização de heme. Nossos resultados demonstram que a ausência de CS, retirado
através do tratamento do intestino com a enzima condroitinase ABC, resultou em uma inibição na
formação de Hz neste tecido (figura 23). Portanto, podemos concluir que, aparentemente, o CS
presente no intestino de R. prolixus, GAG cujo papel fisiológico neste tecido é ainda
desconhecida (Costa-Filho, et al., 2004), pode estar envolvido de alguma maneira no processo de
cristalização de heme.
Após a observação de que diversos componentes do intestino de R. prolixus são capazes
de cristalizar o heme, realizamos, para uma melhor análise da natureza do conteúdo intestinal
deste inseto, um gradiente descontínuo de sacarose (figura 24A). Este gradiente resultou em cinco
frações distintas, assim como observado no gradiente do regurgitado total de fêmeas de
Shistosoma mansoni (Soares et al., 2007). O espectro de absorção de luz visível de todas as cinco
frações revelou que todas elas continham heme, já que apresentavam absorções características
entre 390 e 450 nm (banda de Soret) (figura 24B). Entretanto, as frações de menor densidade,
representadas pelas frações de topo e fração 1 exibiram um espectro similar ao do heme livre,
com banda de Soret próxima a 400 nm, enquanto as frações com maiores densidades,
representadas pelas frações 2, 3 e 4 exibiram um espectro típico de Hz, com banda de Soret em
torno de 450 nm além de um pico de absorção em torno de 650 nm. Estes espectros estão de
acordo com os espectros de heme e β-hematina (Hz sintética) observados em Oliveira et al., 2007
66
e representados na figura 24C. Este resultado também está de acordo com os espectros das
frações do gradiente do regurgitado total de fêmeas de Schistosoma mansoni (Soares et al., 2007).
Estas análises nos levam a concluir que, no intestino de R. prolixus, o heme encontra-se em
diferentes estágios de cristalização. Assim como realizado nos primeiros resultados desta tese,
estudamos também o grau de solubilidade do heme presente em cada uma das frações do
gradiente de sacarose. Ao observarmos a figura 24D podemos concluir que a solubilidade do
heme nas frações de maior densidade (frações 2, 3 e 4) é significativamente menor que nas
frações menos densas (frações de Topo e fração 1). A análise da solubilidade do heme foi medida
de forma indireta, através da razão da banda de Soret e da banda Q, assim como nos primeiros
resultados desta tese com o uso do DMSO (figura 17). Este resultado está de acordo com Huy e
colaboradores, já que este grupo mostrou que valores da razão destas duas bandas próximos a 1
refletem uma baixa solubilidade do heme (Huy et al., 2007).
Para o estudo mais detalhado de cada uma das cinco frações produzidas neste gradiente
descontínuo de sacarose com o conteúdo intestinal de R. prolixus, partimos para a observação da
capacidade de cada uma destas frações de cristalizar o heme. A análise de nossos resultados
apresentados na figura 25 indica que, surpreendentemente, as frações mais densas que
apresentam um menor grau de solubilidade do heme (frações 2, 3 e 4) tiveram uma maior
capacidade de cristalizar heme. Esta observação foi bastante inesperada e contradiz alguns
resultados da literatura. Nosso grupo já mostrou que, em S. mansoni, as frações menos densas de
um gradiente similar com o regurgitado total deste verme são as mais eficientes em cristalizar o
heme (Soares et al., 2007). Entretanto, as nossas frações mais densas são capazes de produzir
grandes quantidades de Hz, como demonstrado na figura 24. Os experimentos foram realizados
normalizando-se a quantidade de proteína, mas as quantidades de Hz e lipídeos totais presentes
em cada grupo experimental não foram normalizadas de grupo para grupo. Portanto, podemos
67
especular que este aumento da quantidade de cristal formado pelas frações mais densas pode ter
ocorrido em decorrência da maior quantidade de Hz presente nestas frações, o que poderia nos
indicar que o processo autocatalítico predomina em relação aos outros processos, levando a uma
maior produção de Hz. Experimentos controlando estes parâmetros serão realizados em breve. A
figura 25C ainda mostra que, nestas condições, as frações com maior capacidade em solubilizar o
heme são as menos eficientes em cristalizar esta molécula.
Uma outra abordagem realizada nesta tese diz respeito a drogas quinolínicas. Este grupo
de drogas vem sendo usado há centenas de anos no tratamento e profilaxia da Malária (Egan et
al., 2003). Entretanto, muitas espécies de Plasmodium apresentam resistência a várias destas
drogas, diminuindo a eficácia do tratamento (Egan, 2001). Existem fortes evidências sugerindo
que o efeito antimalárico das drogas quinolínicas depende da interação destas com o heme ou
com o cristal de Hz (Cohen et al., 1964; Egan, 2008), conseqüentemente resultando na inibição
da formação de Hz no vacúolo digestivo deste parasito, levando-o a morte.
Após a descoberta deste cristal de heme no intestino de R. Prolixus (Oliveira et al., 1999)
e posteriormente no helminto S. mansoni (Oliveira et al., 2000b) nosso grupo começou a
investigar o efeito da inibição da formação de Hz nestes organismos pelo uso de drogas
quinolínicas. Foi demonstrado que a interferência deste processo in vivo em S. mansoni através
do uso de cloroquina resultou em uma grande redução das manifestações clínicas da
esquistossomose (Oliveira et al., 2004). Resultados ainda não publicados do nosso grupo
mostram que tanto a quinina quanto a amodiaquina, duas outras drogas quinolínicas, inibiram o
processo de cristalização de heme induzido tanto pelo regurgitado total de fêmeas de S. mansoni
quanto pelos lipídeos extraídos deste regurgitado. Outros resultados ainda mostram que o
tratamento com quinina de camundongos infectados com S. mansoni leva a uma inibição do
processo de cristalização de heme nos vermes e a uma diminuição da parasitemia, com
68
diminuição do número de ovos no fígado e intestino do hospedeiro (Soares et al., dados não
publicados). Em estudos realizados com R. prolixus, nosso grupo já demonstrou que a
alimentação destes insetos com sangue enriquecido com cloroquina resultou em uma grande
inibição da formação de Hz no intestino e um conseqüente aumento da peroxidação lipídica na
hemolinfa do mesmo, em decorrência do aumento dos níveis de heme livre neste fluido (Oliveira
et al., 2000a).
Levando em conta o mencionado acima, decidimos investigar nesta tese o efeito de duas
drogas quinolínicas (cloroquina e quinina) no processo de formação de Hz induzido pelos
lipídeos totais extraídos do inseto Rhodnius prolixus. Como podemos observar na figura 26, as
duas drogas foram capazes de inibir a cristalização de heme in vitro, sendo que a quinina
mostrou-se mais potente que a cloroquina. Também realizamos experimentos in vivo, através da
alimentação destes insetos com sangue enriquecido com uma outra droga quinolínica: a
quinidina. Este experimento mostrou que, assim como a cloroquina (Oliveira et al., 2000a), esta
droga também é capaz de inibir a formação de Hz no intestino de R. prolixus de forma dose-
dependente (figura 27). Outros dados não mostrados nesta tese, utilizando outras drogas
antimaláricas como a quinina e clotrimazol, indicam que estas também são potentes inibidoras da
cristalização de heme in vivo. Todos estes resultados apresentados estão perfeitamente de acordo
com os dados da literatura expostos acima e reforçam o conceito de que as drogas quinolínicas
afetam a cristalização de heme.
Por fim, através de uma colaboração firmada com o grupo do professor Timothy Egan do
Departamento de Química da Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul, começamos os
testes de novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente por este grupo. Estas drogas
visam, no futuro, a substituição do uso das drogas quinolínicas antimaláricas no qual diversas
espécies de Plasmodium já apresentam resistência (O´Neill et al., 1998). Nossos resultados in
69
vitro já indicam que algumas destas drogas (compostos 1 e 10) inibem a formação de Hz induzida
pelo intestino de R. prolixus com a mesma eficiência que a quinina (figura 28).
Pela sua fácil manutenção e principalmente pela grande eficiência no processo de
cristalização de heme, o inseto Rhodnius prolixus representa um excelente modelo de estudo para
entendermos não apenas quais as moléculas que estão envolvidas no processo de formação de Hz
mas também o impacto da inibição da cristalização do heme na fisiologia deste inseto, vetor da
Doença de Chagas, uma doença endêmica na América Latina.
Já é bem conhecido na literatura a importância da manutenção dos níveis de heme para a
sobrevivência e proliferação da forma epimastigota do Trypanosoma cruzi no intestino de R.
prolixus e que este parasito utiliza o heme oriundo da alimentação de seu vetor para o seu
desenvolvimento (Lara et al., 2007). Por isso, acreditamos que a formação de Hz neste vetor
também esteja intimamente ligada à sobrevivência deste parasito, já que por este mecanismo os
níveis de heme livre são bem controlados, mantendo-se assim concentrações de heme adequadas
para o parasito. Experimentos neste sentido já foram iniciados.
Portanto, a partir dos resultados expostos nesta tese, podemos concluir que a cristalização
espontânea do heme é estimulada pela redução da polaridade do meio. Outros resultados indicam
que a importância da solubilidade do heme em meio ácido parece ser diferente nos diferentes
organismos que sintetizam Hz, assim como para a Hz produzida sinteticamente (β-hematina).
Além disso, no intestino de Rhodnius prolixus, o heme encontra-se em diferentes estados de
cristalização e a formação de Hz neste inseto parece ser induzida por pelo menos dois
mecanismos distintos: por autocatálise ou por lipídeos presentes no intestino. A presença de
GAGs sulfatados localizados neste tecido parece também ser importante no processo de
cristalização de heme. Podemos concluir ainda que diferentes drogas quinolínicas (comerciais e
70
novas drogas sintéticas) são capazes de inibir a formação de Hz no intestino de Rhodnius
prolixus.
71
6) Referências Bibliográficas:
1. Aft, R.L., Mueller, G.C. (1983). Hemin - mediated DNA strand scission. J.Biol. Chem.
258, 12069-12072.
2. Aft, R.L., Mueller, G.C. (1984). Hemin - mediated oxidative degradation of proteins.
J.Biol. Chem. 259, 301- 305.
3. Akompong T, Kadekoppala M, Harrison T, Oksman A, Goldberg DE, Fujioka H, Samuel
BU, Sullivan D, Haldar K. (2002). Trans expression of a Plasmodium falciparum
histidine-rich protein II (HRPII) reveals sorting of soluble proteins in the periphery of the
host erythrocyte and disrupts transport to the malarial food vacuole. J Biol Chem. 277,
28923-33.
4. Albuquerque-Cunha, J.M., Mello, C.B., Garcia, E.S., Azambuja, P., Souza, W., Gonzalez,
M.S., Nogueira, N.F. (2005). Effect of blood components, abdominal distension, and
ecdysone therapy on the ultrastructural organization of posterior midgut epithelial cells
and perimicrovillar membranes in Rhodnius prolixus. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 99, 815-
22.
5. Aldana, E., Lizano, E., Valderrama, A. (2001). Effects of human blood feeding on the
fecundity, fertility and biological cycle of Rhodnius prolixus (Hemiptera:Reduviidae).
Rev. Biol. Trop. 49:689-691.
6. Bendrat, K., Berger, B.J., Cerami, A. (1995). Haem polymerization in malaria. Nature.
378, 138.
7. Blauer, G., Akkawi, M. (2002). Alcohol-water as a novel medium for beta-hematin
preparation. Arch Biochem Biophys 398, 7-11.
8. Bligh, E.G., Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification.
Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-913.
9. Billingsley et al. (1999). Em: Biology of the insect midgut. Lehane, M.J. e Billingsley P.F.
72
10. Bogitsh BJ, Davenport GR. (1991). The in vitro effects of various lysosomotropic agents
on the gut of Schistosoma mansoni. J Parasitol. 77, 187-93.
11. Bohle, D.S., Dinnebier, R.E., Madsen, S.K., Stephens, P.W. (1997). Characterization of
the products of the heme detoxification pathway in malarial late trophozoites by X-ray
diffraction. J Biol Chem. 272, 713-716.
12. Brown, W.H. (1911). Malarial pigment (so called melanin): its nature and mode of
production. J. Exp. Med., 15, 579-597. Apud Egan, 2007.
13. Buller, R., Peterson, M.L., Almarsson, O., Leiserowitz, L. (2002). Quinoline binding site
on malaria pigment crystl: va rational pathway for antimalaria drug design. Cryst.
Growth. 2, 553-562.
14. Chen, M.M., Shi, L., Sullivan, D.J. Jr. (2001). Haemoproteus and Schistosoma synthesize
heme polymers similar to Plasmodium hemozoin and beta-hematin. Mol Biochem
Parasitol 113, 1-8.
15. Chou, A.C., Chevli, R., Fitch, C.D. (1980). Ferriprotoporphyrin IX fulfils the criteria for
identification as the chloroquine receptor of malaria parasites. Biochemistry 19, 1543-
1549.
16. Cohen, S.N., Phifer, K.O., Yielding, K.L. (1964). Complex formation between
chloroquine and ferrihaemic acid in vitro, and its effect on the antimalarial action of.
Nature 202, 805-806.
17. Costa-Filho A, Souza ML, Martins RC, dos Santos AV, Silva GV, Comaru MW, Moreira
MF, Atella GC, Allodi S, Nasciutti LE, Masuda H, Silva LC. (2004). Identification and
tissue-specific distribution of sulfated glycosaminoglycans in the blood-sucking bug
Rhodnius prolixus (Linnaeus). Insect Biochem Mol Biol. 34, 251-60.
18. Costa-Filho A, Werneck CC, Nasciutti LE, Masuda H, Atella GC, Silva LF. (2001).
Sulfated glycosaminoglycans from ovary of Rhodnius prolixus. Insect Biochem Mol Biol.
31, 31-40.
19. Dansa-Petretski, M., Ribeiro, J.M., Atella, G.C., Masuda, H., Oliveira, P.L. (1995).
Antioxidant role of Rhodnius prolixus heme-binding protein. Protection against heme-
induced lipid peroxidation. J. Biol. Chem. 270, 10893–10896.
73
20. de Villiers, K.A., Kaschula, C.H., Egan, T.J., Marques, H.M. (2007). Speciation and
structure of ferriprotoporfphyrin IX in aqueous solution: spectroscopic and diffusion
measurements demonstrate dimerization, but nor u-oxo dimer formation. J. Biol. Inorh.
Chem. 12, 101-117.
21. Dorn, A., Stoffel, R., Matile, H., Bubendorf, A., Ridley, R.G. (1995). Malarial
haemozoin/beta-haematin supports haem polymerization in the absence of protein. Nature
374, 269–271.
22. Dorn, A., Vippagunta, S.R., Matile, H., Jaquet, C., Vennerstrom, J.L., Ridley, R.G.
(1998). An assessment of drug-haematin binding as a mechanism for inhibition of
haematin polymerisation by quinoline antimalarials. Biochemical Pharmacology. 55, 727-
736.
23. Egan, T.J. (2001). Quinoline antimalarials. Exp. Ther. Patents 11, 185-209.
24. Egan, T.J. (2002) Physico-chemical aspects of hemozoin (malaria pigment) structure and
formation. J. Inorg. Biochem 91, 19–26.
25. Egan, T.J. (2003). Haemozoin (malaria pigment): A unique crystalline drug target.
Targets. 2, 115-124.
26. Egan, T.J. (2006). Interactions of quinoline antimalarials with hematin in solution. J
Inorganic Biochem 100, 916-926.
27. Egan, T.J. (2008). Haemozoin formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 157,
127-136.
28. Egan, T.J., Ncokazi, K.K. (2005). Quinoline antimalarials decrease the rate of beta-
hematin formation. J Inorg Biochem. 99, 1532-1539.
29. Egan, T.J., Mavuso W.W., Ncokazi, K.K. (2001). The mechanism of β-hematin formation
in acetate solution. Parallels between hemozoin formation and biomineralization
processes. Biochemistry 40, 204-213.
30. Egan, T.J., Rossa, D.C.; Adamsb, P.A. (1994). Quinoline anti-malarial drugs inhibit
spontaneous formation of p-haematin (malaria pigment). FEBS Letters 352, 54-57.
74
31. Egan, T.J., Hempelmann, E., Mavusso, W.W. (1999). Caracterisation of synthetic b-
hematin and effects of the antimalarical drogs quinidine, halofantrine,
desbutylhalofantrine and mefloquine on its formation. J. Inorg. Biochem. 73, 101-107.
32. Egan T.J., Chen, J.Y-J., de Villiers, K.A., Mabotha, T.E., Naidoo, K.J., Ncokazi, K.K.,
Langforf, J.S., MsNaughton, D., Pandiancherri, S., Wood, B.R. (2006). Haemozoin (b-
hematin) biomineralization occurs by self-assembly near the lipid-water interface. J. Cell.
Sci. 119, 1019-1025.
33. Ferreira, C., Ribeiro, A.F., Garcia, E.S., Terra, W.R. (1988). Digestive enzimes trapped
between and associated with the double plasma membranes of Rhodnius prolixus
posterior midgut cells. Insect Biochem. 18, 521-530.
34. Fitch, C.D., Cai, G.Z., Chen, Y.F., Shoemaker, J.D. (1999). Involvement of lipids in
ferriprotoporphyrin IX polymerization in malaria. Biochim Biophys Acta. 1454, 31-37.
35. Francis, S.E., Sulliven, D.J., Goldberg, D.E. (1997). Hemoglobin metabolism in the
malaria parasite Plasmodium falsiparum. Annu. Rev. Microbiol. 51, 97-121.
36. Fridovich, I. (1989). Superoxide dismutase: An adaptation to a paramagnetic gas. J. Biol.
Chem. 264, 7761-7764.
37. Friend, W.G. The gorging response in Rhodnius prolixus. Stal. Can. J. Zool. 43:125-132,
1965.
38. Garcia, E.S., Gonzales, M.S., Azambuja, P. (1991). Effects of azadirachtin in Rhodnius
prolixus: data and hypotheses. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 86, 107-11.
39. Garcia, E.S., Gonzales, M.S., Azambuja, P., Rembold, H. (1989). Chagas' disease and its
insect vector. Effect of azadirachtin A on the interaction of a triatomine host (Rhodnius
prolixus) and its parasite (Trypanosoma cruzi). Z Naturforsch. 44, 317-22.
40. Ginsburg, H., krugliak, M. (1992). Quinoline-containing antimalarials-mode of action,
drug resistance and its reversal. An update with unresolved puzzles. Biochem. Pharmacol.
43, 63-70.
75
41. Goldberg, D.E., Slater, A.F., Cerami, A., Henderson, G.B. (1990). Hemoglobin
degradation in the malaria parasite Plasmodium falciparum: an ordered process in a
unique organelle. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 2931-2935.
42. Gonzales, M.S., Nogueira, N.F.S., Feder, D., de Souza, W., Azanbuja, P., Garcia, E.S.
(1998). Role of the head in the ultrastructural midgut organization in Rhodnius prolixus
larvae: evidence from head transplantation experiments and ecdysone therapy. Journal of
Insect Physiology. 44, 553-560.
43. Graça-Souza, A.V., Maya-Monteiro, C., Paiva-Silva, G.O., Braz, G.R., Paes, M.C.,
Sorgine, M.H., Oliveira, M.F., Oliveira, P.L. (2006). Adaptations against heme toxicity in
blood-feeding arthropods. Insect Biochem Mol Biol. 36, 322-335.
44. Gutteridge, J.M.C., Smith, A. (1988). Antioxidant protection by haemopexin of heam-
stimulated lipid peroxidation. Biochem. J. 256, 861-865.
45. Gyang, F.N., Poole, B., Trager, W. (1982). Peptidases from Plasmodium falciparum
cultured in vitro. Mol. Biochem. Parasitol. 5, 263-273.
46. Halliwell, B. (1993). The biochemistry of oxigen free radicals. Em: Free radicals in
tropical diseases, Harwood Academic Publishers, United Kingdom, 1-12.
47. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (2000). Oxigen is poisonous-an introduction to oxigen
toxicity and free radicals. Em: free radicals in Biology and Medicine, 2ª Edição.
Clarendon Press-Oxford, United Kingdom.
48. Hempelmann, E., Motta, C., Hughes, R., Ward, S.A., Bray, P.G. (2003). Plasmodium
falciparum: sacrificing membrane to grow crystals? Trends Parasitol. 19, 23–26.
49. Homewood, C.A., Warhurst, D.C., Peters, W., Baggaley, V.C. (1972). Lysosomes, pH
and the anti-malarial action of chloroquine. Nature 235,50-52.
50. Huy, N.T., Maeda, A., Uyen, D.T., Trang, D.T.X., Shiono, M.T., Oida, T., Harada, S.,
Kamei, K. (2007). Alcohols induce beta-hematin formation via the dissociation of
aggregated heme and reduction in interfacial tension of the solution. Acta Tropica. 101,
130–138.
76
51. Ignarro, L.J., Ballot, B., Wood, K.S. (1984). Regulation of soluble guanylate cyclase
activity by porphyrins and metalloporphyrins. J. Biol. Chem. 259, 6201-6207.
52. Konigk. E., Mirtsch, S., Putfarken, B., Abdel-Rasoul, S. (1981). Plasmodium chabaudi-
infection of mice: effects of chloroquine and mefloquine. Inhibition of ornithine
decarboxilase activity. Tropenmed. Parasitol. 32, 73-76.
53. Lara, F.A., Lins, U., Paiva-Silva, G., Almeida, I.C., Braga, C.M., Miguens, F.C., Oliveira,
P.L., Dansa-Petretski, M. (2003). A new intracellular pathway of haem detoxification in
the midgut of the cattle tick Boophilus microplus: aggregation inside a specialized
organelle, the hemosome. J. Exp. Biol. 206, 1707–1715.
54. Lara, F.A., Sant'anna, C., Lemos, D., Laranja, G.A., Coelho, M.G., Reis Salles, I., Michel,
A., Oliveira, P.L., Cunha-E-Silva, N., Salmon, D., Paes, M,C. (2007). Heme requirement
and intracellular trafficking in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Biochem Biophys Res
Commun. 355, 16-22.
55. Lehane, M.L. (1991). Em: Biology of blood-sucking insect. Harper Collins. Academic,
United Kindom.
56. Lent, H. (1999) Evolução dos conhecimentos sobre vetores da doença de Chagas 90 anos
após sua descoberta. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94:89-92.
57. Lowry,O.H., Rosenbrough,M.J., Farr, A.R., Randall, R.J. (1951). Protein measurements
with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.
58. Lynn, A., Chandra, S., Malhorta, P., Chauhan, V.S. (1999). Heme binding and
polymerization by Plasmodium falciparum histidine rich protein II: influence of pH on
activity and conformation. FEBS Lett. 459, 267-271.
59. Maya-Monteiro, C.M., Alves, L.R., Pinhal, N., Abdalla, D.S., Oliveira, P.L. (2004).
HeLp, a heme-transporting lipoprotein with an antioxidant role. Insect Biochem Mol Biol
34, 81-88.
60. Maya-Monteiro, C.M., Daffre, S., Logullo, C., Lara, F.A., Alves, E.W., Capurro, M.L.,
Zingali, R., Oliveira, P.L. (2000). HeLp, a heme lipoprotein from the hemolymph of the
cattle tick, Boophilus microplus. J. Biol. Chem. 275, 36584–36589.
77
61. Maranhão, Z.G. (1977). Entomologia Geral. 2ª Edição, Nobel, São Paulo, 1977.
62. Monti, D., Basilico, N., Parapini, S., Pasini, E., Olliaro, P., Taramelli, D. (2002). Does
chloroquine really act through oxidative stress? FEBS Letters. 522, 3-5.
63. Nicokazi, K.K., Egan, T.J. (2005). A colorimetric hith-throughput b-hematin inhibition
screening assay for use in the search for antimalarial compounds. Anal. Biochem. 338,
309-319.
64. Nogueira, N.F., Gonzales, M., Garcia, E.M., de Souza, W. (1997). Effect of azadirachtin
A on the fine structure of the midgut of Rhodnius prolixus. J Invertebr Pathol. 69, 58-63.
65. Noland, G.S., Briones, N., Sullivan, D.J. (2003). The shape and size of hemozoin crystals
distinguishes diverse Plasmodium species. Mol. Biochem. Parasitol. 130, 91-99.
66. Oliveira, M.F., D’Avila, J.C.P., Tempone, A.J., Corrêa Soares, J.B.R., Rumjanek, F.D.,
Ferreira-Pereira, A., Ferreira, S.T., Oliveira, P.L. (2004) Inhibition of heme aggregation
by chloroquine reduces Schistosoma mansoni infection, J. Infect. Dis. 190, 843–852.
67. Oliveira, M.F., D’Avila, J.C.P., Torres, C.R., Oliveira, P.L., Tempone, A.J., Rumjanek,
F.D., Braga, C.M.S., Silva, J.R., Petretski, Oliveira, M.A., Souza, W., Ferreira, S.T.
(2000b). Haemozoin in Schistosoma mansoni, Mol. Biochem. Parasitol. 111, 217–221.
68. Oliveira, M.F.,Kycia, S.W., Gómez, A., Kosar, A.J., Bohle, D.S., Hempelmann, E.,
Menezes, D., Vannier-Santos, M.A., Oliveira, P.L., Ferreira, S.T. (2005). Structural and
morphological characterization of hemozoin produced by Schistosoma mansoni and
Rhodnius prolixus. FEBS Lett. 579, 6010-6.
69. Oliveira, P.L., Kawooya, J.K., Ribeiro, J.M.C., Meyer, T., Poorman, R., Alves, E.W.,
Walker, F.A., Machado, E.A., Nussenzveig, R.H., Padovan, G.J., Masuda, H. (1995). A
heme-binding protein from hemolymph and oocytes of the blood-sucking insect,
Rhodnius prolixus. J. Biol. Chem. 270, 10897–10901.
70. Oliveira, M.F., Silva, J.R., Dansa-Petretski, M., De Souza, W., Lins, U., Braga, C.M.,
Masuda, H., Oliveira, P.L. (1999). Haem detoxification by an insect. Nature 400, 517–
518.
78
71. Oliveira, M.F., Silva, J.R., Dansa-Petretski, M., De Souza, W., Lins, U., Braga, C.M.,
Masuda, H., Oliveira, P.L. (2000a). Haemozoin formation in the midgut of the blood-
sucking insect Rhodnius prolixus. FEBS Lett. 477, 95-98.
72. Oliveira, M.F., Timm, B.L., Machado, E.A., Miranda, K., Attias, M., Silva, J.R., Dansa-
Petretski, M., de Oliveira, M.A., de Souza, W., Pinhal, N.M., Sousa, J.J., Vugman, N.V.,
Oliveira, P.L.(2002). On the pro-oxidant effects of haemozoin. FEBS Lett 512, 139-144.
73. Oliveira, M.F.; Gandara, A.C.P.; Braga, C.M.S.; Silva, J.R.; Mury, F.B.; Dansa-Petretski,
M.; Menezes, D.; Vannier-Santos, M.A.; Oliveira, P.L. (2007). Heme Crystalization in the
midgut of triatomine insects., Comparative Biochemistry and Physiology. 146, 168-174.
74. O
,
Neil, P.M.,Bray, P.G., Hawley, S.R., Ward, S.A., Park B.K. (1998). 4-aminoquinolines-
past, present and future: a chemical perspective. Pharmacol Ther 77, 29-58.
75. Orjih, A.U., Banyal, H.S., Chevli, R., Fitch, C.D. (1981) Hemin lyses malaria parasites.
Science. 214, 667-669.
76. Pagola, S., Stephens, P.W., Bohle, D.S., Kosar, A.D., Madsen, S.K .(2000). The structure
of malaria pigment b-haematin. Nature 404, 307–310.
77. Paiva-Silva, G.O., Cruz-Oliveira, C., Nakayasu, E.S., Maya-Monteiro, C.M.,
Dunkov,B.C., Masuda, H., Almeida, I.C., Oliveira, P.L. (2006). A heme-degradation
pathway in a blood-sucking insect. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8030-8035.
78. Pandey, A.V., Babbarwal, V.K., Okoyeh, J.N., Joshi, R.M., Puri, S.K., Singh, R.L.,
Chauhan, V.S. (2003). Hemozoin formation in malaria: a two-step process involving
histidine-rich proteins and lipids. Biochem Biophys Res Commun. 308, 736-743.
79. Panton, L.J., McPhie, P., Maloy, W.L., Wellems, T.E., Taylor, D.W., Howard, R.J.
(1989). Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodiun
falciparum: histidine-rich protein II. Mol. Biochem. Parasitol. 35, 149-160.
80. Papalexis, V., Siomos, M-A., Campanele, H. (2001). Histidine-rich protein 2 of the
malaria parasite, Plasmodium falciparum, is involved in detoxification of the by-products
of haemoglobin degradation. Mol. Biochem. Parasitol. 115, 77-86.
79
81. Parker, F.S., Irvin, J.L. (1952). The interaction of chloroquine with nucleic acids and
nucleoproteins. J.Biol. Chem. 199, 897-909.
82. Pereira, L.O.R.; Oliveira, P.L.; Almeida, I.C., Paiva-Silva, G.O. (2007). Biglutaminyl-
Biliverdin IX Alpha as a Heme Degradation Product in the Dengue Fever Insect-Vector
Aedes aegypti. Biochemistry. 46, 6822-6829.
83. Pisciotta, J.M., Coppens, I., Tripathi, A.K. (2007). The role of neutrl lipid nanospheres in
Plasmodium falciparum heme crystalization. Biochem. J. 402, 197-204.
84. Ponka, P. (1999). Cell biology of haem. Am. J. Med. Sci. 318, 241-256.
85. Ribeiro, J.M. (1995). Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate
pharmacologists? Infect. Agent. 4, 143-152.
86. Ridley, R.G. (1996). Haemozoin formation in malaria parasites: is there a heam
polymerase? Trends Microbiol. 4, 253-254.
87. Romoser, W.S. (1996). The vector alimentary system. Em: The biology of Desease
Vectors. 1ª Edição. Editado por Beaty, B.J. e Marquardt, W.C. Colorado, University Press
of Colorado.
88. Ryter, S.W., Tyrrell, R.M. (2000). The heme synthesis and degradation pathways: role in
oxidant sensitivity. Heme oxygenase has both pro- and antioxidant properties. Free Radic
Biol Med. 28, 289-309.
89. Schaub, G.A., Eichler, S. (1998). The effects of aposymbiosis and of an infection with
Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) on the tracheal system of the reduviid bugs
Rhodnius prolixus and Triatoma infestans. J Insect Physiol. 44, 131-140.
90. Schmitt, T.H., Frezzatti Jr. Wa., and Schereier, S. (1993). Heme-induced lipid membrane
disorder and increased permeability: a molecular model for the mechanism of cells lysis.
Arch. Biochem. Biophys. 307, 96–103.
91. Silva, J.R.; Mury, F.B.; Marcus F. Oliveira, M.F.; Oliveira, P.L.; Silva, C.P.; Dansa-
Petretski, M. (2007). Perimicrovillar membranes promote hemozoin formation into
Rhodnius prolixus midgut. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37, 523-31.
80
92. Slater, A.F., Cerami, A. (1992). Inhibition by chloroquine of a novel haem polymerase
enzyme activity in malaria trophozoites. Nature. 355, 167-169.
93. Slater, A.F., Swiggard, W.J., Orton, B.R., Flitter, W.D., Goldberg, D.E., Cerami, A.,
Henderson, G.B., (1991). An iron–carboxylate bond links the heme units of malaria
pigment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 325–329.
94. Soares, J.B.R.C.; Maya-Monteiro, C.M.; Bittencourt-Cunha, P.R.B.; Atella, G.C.; Lara.,
F.A.; d’Avila, J.C.P.; Menezes, D.; Vannier-Santos, M.A.; Oliveira, P.L.; Egan, T.J.;
Oliveira, M.F. (2007). Extracellular lipid droplets promote hemozoin crystallization in the
gut of the blood fluke Schistosoma mansoni. FEBS Letters. 581, 1742–1750.
95. Sugioka, Y., Suzuki, M. (1991). The chemical basis for the ferriprotoporphyrin IX-
chloroquine complex induced lipid peroxidation. Biochim. Biophys. Acta. 1074, 19-24.
96. Sullivan, D.J. (2002). Theories on malarial pigment formation and quinoline action. Int J
Parasitol. 32, 1645-1653.
97. Sullivan, D.J., Gluzman, I.Y., Russell, D.G., Goldberg, D.E. (1996b). On the molecular
mechanism of chloroquine
,
antimalarial action . Proc Natl. Acad. Sci. USA. 93, 11865-
11870.
98. Sullivan, D.J., Gluzman, I.Y., Goldberg, D.E. (1996a). Plasmodium hemozoin formation
mediated by histidine-rich proteins. Science. 271, 219-222.
99. Sullivan, D.J., Matile, H., Ridley, R.G., Goldberg, D.E. (1998). A common mechanism
for blockade of heme polymerization by antimalarial quinolines. J. Biol. Chem. 273,
31103-31107.
100. Surolia, N., Padmanaban, G. (1991). Chloroquine inhibits heme-dependent protein
synthesis in Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 88, 4786-4790.
101. Tappel, A.L. (1955). Unsaturated lipid oxidation catalyzed by hematin
compounds. J. Biol. Chem. 217, 721-733.
102. Tenhunen, R., Marver, H.S., Schmid, R. (1969). Microsomal heme oxygenase.
Characterization of the enzyme. J. Biol. Chem. 244, 6388-6394.
81
103. Terra, W.R., FerreiraC., Garcia, E.S. (1988). Origen, distribution, properties and
functions of the major Rhodnius prolixus midgut hydrolases. Insect. Biochem. 18, 423-
434.
104. Terra e Ferreira (1994). Em: Biology of the insect midgut. 1ª Edição. Editado por
Lehane, M.J. e Billingsley P.F.
105. Trigg, P.I., and Wernsdorfer, W.H. (1999). Malaria control priorities and
constraints. Parassitologia 41, 329–332.
106. Valle, D., Lima Gomes, J.E.P., Goldemberg, S., Garcia, E.S. (1987). Rhodnius
prolixus vitellogenesis: Dependence upon the blood source. J. Insect Physiol. 33, 249-
254.
107. Van der Zee, J., Barr, D.P., Mason, R.P. (1996). ESR spin trapping investigation
of radical formation from the reaction between hematin and tert-butyl hydroperoxide.
Free Radic Biol Med. 20,199-206.
108. Vippagunta, S.R., Dorn, A., Ridley, R.G., Cennerstrom, J.L. (2000).
Characterization of chloroquine-hematin mu-oxo demer binding by isothermal titration
calorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1475, 133-140.
109. Wellems, T.E., Howard, R.J. (1986). Homologous genes encode two distinct
histidine-rich proteins in a cloned isolate os Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 83, 6065-6069.
110. White, K.A., Marletta, M.A. (1992). Nitric oxide synthase is a cytochome p-450
type hemoprotein. Biochemistry. 31, 6627-6631.
111. WHO, 2007a. Disponível em: http://www.un.org/av/radio/portuguese/ .
112. WHO, 2007b. Disponível em:
http://www.who.int/mediacentre/news/notes/2007/np16/en/.
113. WHO, 2003. Disponível em: http://www.who.int/tdr/dw/chagas2003.htm.
82
114. WHO, 2006. Disponível em: http://www.who.int/tdr/diseases/chagas/default.htm.
115. Wigglesworth, V.B. (1943). The fate of haemoglobin in Rhodnius prolixus
(Hemiptera) and other blood-sucking arthropods. Proc. R. Soc. London. 131, 313-339.
116. www.jyi.org, 2007.
117. www.scientificpsychic.com.
118. Ziegler, J., Chang, R.T., Wright, D.W. (1999). Multiple-antigenic peptides of
histidine-rich protein II of Plasmodium falciparum: dendrimeric biomineralization
templates. J. Am. Chem. Soc. 121, 2394-2400.
83
Curriculum Vitae
DADOS PESSOAIS
Nome: Renata Stiebler
Data de Nascimento: 13/06/1983
Naturalidade: Rio de Janeiro
FORMAÇÃO ACADÊMICA
♦ Ensino Superior:
Graduação em Nutrição na Universidade Federal do Rio de Janeiro
Período: primeiro semestre de 2002 a primeiro semestre de 2006
♦ Pós-Graduação:
Mestrado em Química Biológica na Universidade Federal do Rio de Janeiro
Período: Agosto de 2006 a março de 2008
Bolsista CNPq
PREMIAÇÕES:
2ª colocada no Prêmio Bioresearch de Iniciação Científica pelo trabalho
apresentado na XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia
Molecular – SBBq.
ARTIGOS PUBLICADOS:
Angelica Nakamura, Renata Stiebler, Marcelo R. Fantappié, Eliane Fialho,
Hatisaburo Masuda, Marcus F. Oliveira. Effects of retinoids and juvenoids on moult and
on phenoloxidase activity in the blood-sucking insect Rhodnius prolixus. Acta Tropica
2007; 103: 222–230.
* Obs.: Neste artigo a primeira autoria foi compartilhada entre Angelica Nakamura e
Renata Stiebler.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
