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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Bioquímica Médica- IBqM
Laboratório de Agregação Protéica e
Amiloidoses-LAPA
PRISCILA DOS SANTOS FERREIRA DA SILVA
ESTUDOS DE DISSOCIAÇÃO E AGREGAÇÃO COM OS
DÍMEROS ENGENHEIRADOS DA PROTEÍNA
AMILOIDOGÊNICA TRANSTIRRETINA
Rio de Janeiro-RJ
2008
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ii
PRISCILA DOS SANTOS FEREIRA DA SILVA
ESTUDOS DE DISSOCIAÇÃO E AGREGAÇÃO COM OS
DÍMEROS ENGENHEIRADOS DA PROTEÍNA
AMILOIDOGÊNICA TRANSTIRRETINA
Dissertação de mestrado apresentada ao programa em
Química Biológica do Instituto de Bioquímica Médica
da Universidade Federal do Rio de Janeiro visando a
obtenção de grau de mestre em Química Biológica.
Orientadora: Débora Foguel
Professora adjunta – UFRJ
Rio de Janeiro
2008
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iii
Ficha Catalográfica
Silva, Priscila dos Santos ferreira
Estudos de dissociação e agregação com os dímeros
engenheirados da proteína amiloidogênica transtirretina /
Priscila dos Santos Ferreira da Silva. Rio de Janeiro, 2008
xi, 98fls., 32 ils.
Dissertação de mestrado: Mestre em Bioquímica
Biológica
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Bioquímica Médica, 2008.
Orientador: Débora Foguel
I.Foguel, Débora (Orient.) II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Bioquímica Médica. III. Título
iv
PRISCILA DOS SANTOS FERREIRA DA SILVA
Rio de Janeiro, ........de......................... de 2008.
Banca examinadora:
Débora Foguel
Prof
a
. Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica-UFRJ (Orientadora)
Ronaldo da Silva Mohana Borges
Prof. Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ (Avaliador)
_____________________________________________
Maria Lúcia Bianconi
Prof
a
. Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica-UFRJ (Avaliador)
_____________________________________________
José Ricardo M. Pires
Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica-UFRJ (Avaliador)
_____________________________________________
Prof. Marcelo Torres Bozza
Professor Adjunto do Instituto de Microbiologia-UFRJ (Suplente externo)
_____________________________________________
Marcius da Silva Almeida
Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica-UFRJ (Revisor e Suplente Interno)
v
Dedico este trabalho a minha mãe,
minha maior incentivadora, que me
deu apoio pleno para que eu me
dedicasse inteiramente aos meus
objetivos.
vi
Agradecimentos
Gostaria de agradecer primeiramente a minha mãe, pois sem seu apoio não seria possível a
realização desse trabalho. Agradeço também a minha família, em especial minha tia Sandra
que me apoiou desde o “jardim de infância” e durante a minha graduação e a todos que me
incentivaram, nos momentos em que me sentia desanimada. Agradeço a minha querida
sobrinha Maria Júlia pelos momentos de felicidade que me proporcionou durante um ano e
meio de vida, fazendo com que meu dia a dia fosse melhor. Agradeço especialmente ao meu
irmão que esteve sempre ao meu lado durante esse tempo e me ajudou na realização desse
trabalho. Agradeço ainda a meu cachorro Rany, meu grande amigo e companheiro desde meu
segundo grau, que me acompanhou até o início desse ano, e que não está mais comigo e
infelizmente não poderei agradecer pessoalmente, mas agradeço em pensamento. Obrigada
também ao Frederico, meu papagaio amado, uma grande companhia que tenho em minha vida
para conversar sobre assuntos “aleatórios”. Gostaria também de agradecer enormemente a
minha orientadora Débora Foguel, pelo tempo dedicado ao meu ensino e a tirar minhas
dúvidas, apesar de estar sempre muito ocupada, pois sem ela essa dissertação não aconteceria.
Agradeço a ela também pelo meu projeto, no qual sinto um prazer enorme em trabalhar.
Agradeço a todos meus amigos do laboratório pela ajuda, em especial a Carol que me ajudou
na revisão da escrita desse trabalho e também ao Léo e ao Fernando, amigos prediletos nas
horas de dúvida sobre a TTR, obrigada por ajudarem e discutir sobre o meu projeto. Um
agradecimento especial as minhas amigas Mariana e Tuane com quem tiro dúvidas sobre meu
projeto de trabalho, meus projetos pessoais e sobre todas as coisas da vida.
Dedico um agradecimento especial ao Emerson Guedes, nosso querido técnico que ajudou
muito na realização desse trabalho, facilitando a realização dos meus experimentos, além de
ser a pessoa mais prestativa que já conheci.
Muito obrigada a todos que de alguma forma me ajudaram nesse importante momento da
minha vida e na realização de mais esse sonho.
Valeu!!!!
vii
Resumo
A transtirretina (TTR) é uma proteína plasmática tetramérica com 56 kDa, composta
de quatro subunidades idênticas com 127 resíduos de aminoácidos, encontrada no fluído
cerebroespinhal e no plasma humano. Produzida primariamente no fígado, olhos e plexo
coróide, suas funções são transportar o hormônio tireoidiano tiroxina e ligar o retinol através
da proteína ligadora de retinol. A estrutura nativa da TTR consiste em quatro subunidades
idênticas que formam uma extensiva estrutura em folha beta. A transtirretina é a proteína
precursora de duas importantes amiloidoses: a amiloidose sistêmica senil (ASS), causada pelo
tipo selvagem (WT-TTR) e a polineuropatia familiar amiloidogênica (PFA), causada por
diversos mutantes. Aproximadamente 90 mutações foram identificadas na TTR e a maioria
delas causa amiloidose. Estudos prévios mostram que a formação de fibras amilóides da TTR
depende da dissociação/desnaturação ácida parcial dos tetrâmeros da TTR que leva a
formação de um intermediário monomérico amiloidogênico. Entretanto, nosso grupo
demonstrou a existência de um tetrâmero estruturalmente modificado (T4*), que apresenta
alta propensão a formar fibras amilóides. No presente trabalho, nós investigamos a via de
dissociação de dois dímeros construídos da TTR, chamados BD-TTR e LD-TTR. O BD-TTR
foi construído através de duas mutações (Cys10Ala/Glu92Cys), cujos resíduos de cisteína
formam uma ponte dissulfeto entre as subunidades A-B e C-D, impedindo sua
monomerização. No LD-TTR foi inserido um peptídeo que liga as subunidades A-C e B-D,
que além de impedir sua monomerização, impede que o canal da tiroxina se desfaça.
Utilizamos nesse estudo o agente redutor DTT para checar as variações nas interações
diméricas que ocorreriam no BD-TTR sem a presença dessa ponte, no tratamento com alta
pressão hidrostática (APH) e variações de pH como agente desestabilizantes da estrutura
protéica. Utilizamos também o VBO que é uma droga que se liga ao canal da tiroxina a fim de
identificarmos que espécies estariam sendo formadas sob a APH, além da cromatografia por
gel filtração e ligação de bis-ANS. Neste estudo podemos verificar por cromatografia de gel
filtração que o BD-TTR e o LD-TTR apresentam peso molecular semelhante ao da WT-TTR,
o que indica que a mutação não foi capaz de alterar seu estado oligomérico. Além disso,
verificamos que os dímeros construídos possuem maior estabilidade que a proteína selvagem,
e que, sob ação da APH, o BD-TTR com DTT apresenta mudanças conformacionais. Nos
estudos de agregação pudemos perceber que o LD-TTR não agrega em nenhuma condição
testada, enquanto que o BD-TTR agrega em alguns pHs testados e também após o tratamento
com APH, o que indicaria que não é necessária a presença da formação de um monômero para
a agregação da TTR, conforme foi proposto até então. Através de cromatografia por gel
filtração isolamos as espécies formadas após o tratamento por APH, e verificamos que o BD-
TTR forma dímeros sob pressão, e que esses dímeros agregariam após a liberação da pressão.
viii
Abstract
Transthyretin (TTR) is a tetrameric plasmatic protein with 56 kDa, composed of four
identical 127-residue subunits, found in cerebral spinal fluid and blood plasma. Produced
primarily in the liver, eyes, and choroids plexus, TTR acts as a carrier of the thyroid hormone
thyroxin and retinol by holo-retinol binding protein. Native TTR consists of four identical
subunits that form an extensive β-sheet structure. Transtirethyn (TTR) is the precursor protein
of two important amyloid diseases: Senile Systemic Amyloidosis (SSA), caused by wild type
TTR (WT-TTR) and familial amyloidotic polyneuropathy (FAP), caused by mutations on this
protein. So far, nearly 90 mutations have been identified in TTR, most of which are
amyloidogenic. Previous studies have shown that TTR amyloid fibril formation is
dissociation/denaturation dependent, implying that amyloid formation results from the self-
assembly of a conformational intermediate. However, our group has described recently a
structurally modified tetramer (T4*) that has high fiber formation propensity. In the present
study we investigate the pathway by which two engineered dimers of TTR, called BD-TTR
and LD-TTR, dissociates. The BD-TTR was engineered by two mutations
(Cys10Ala/Glu92Cys), in which the cysteine residues confer to the protein a disulphide bridge
between the subunits A-B and C-D, hindering dissociation into monomers. In the LD-TTR, a
peptide was added between the subunits A-C and B-D, which maintains the tyroxin binding
channel intact. We used DTT as a reducing agent to evaluate the dimeric interactions in the
BD-TTR in the absence of the disulphide bridge, using the HHP and pH as structure
perturbing agents. The VBO, a fluorescent compound that binds in the thyroxin channel, was
used so as to investigate the oligomerization state of these dimers under pressure. In addition,
the size exclusion chromatography was used to show that the molecular weight of these
mutants are the same of WT-TTR, which indicates that mutation has not affected the
oligomerization state of these proteins. We observed that these dimers have a stronger
stability against HHP when compared to the wild type protein, and characterized the species
present after HHP by size exclusion chromatography. In our aggregation studies we verified
that LD-TTR dos not aggregate in any tested condition, however, BD-TTR does aggregate in
some pHs and after the HHP treatment, indicating for the first time, the aggregation of TTR
from a dimeric intermediate. By size exclusion chromatography we identified the species
trapped under pressure and that are prone to aggregate after the pressure release, and we
verified that BD-TTR has a dimeric population after decompressure that will be prone to
aggregate.
ix
Sumário (Índice)
1. Introdução..............................................................................................................
1
1.1 Enovelamento protéico................................................................................... 2
1.2 Desnaturação protéica..................................................................................... 5
1.3 Alta pressão hidrostática (APH) como agente desnaturante........................... 6
1.4 Agregação protéica e amiloidoses...................................................................
8
1.5 Transtirretina................................................................................................... 15
1.5.1 Transtirretina selvagem (WT-TTR) e seus mutantes pontuais................. 15
1.5.2 Transtirretina BD-TTR............................................................................. 21
1.5.3 Transtirretina LD-TTR..............................................................................
23
1.5.4 Estudos prévios do nosso grupo com a TTR.............................................
24
2. Objetivos................................................................................................................ 26
3. Material e Métodos............................................................................................... 28
3.1 Reagentes......................................................................................................... 28
3.1.1 VBO.......................................................................................................... 29
3.1.2 bis-ANS.................................................................................................... 30
3.1.3 Tioflavina T (ThT).................................................................................... 31
3.2 Alta pressão hidrostática.................................................................................. 32
3.3 Medidas espectroscópicas................................................................................ 34
3.3.1 Fluorescência............................................................................................ 35
3.3.2 Espalhamento de luz................................................................................. 36
3.3.3 Determinação da Concentração.................................................................
36
3.4 Cromatografia por gel filtração....................................................................... 37
3.5 Microscopia de Força Atômica (MFA) 37
3.6 Microscopia eletrônica de Transmissão (MET) 38
3.7 Material biológico........................................................................................... 38
3.7.1 Expressão e purificação de TTR em sistema E. coli................................. 38
4. Resultados.............................................................................................................. 39
4.1- Avaliação do estado de oligomerização do BD-TTR e LD-TTR pór
cromatografia líquida de gel filtração (SEC): Efeito do DT no BD-
TTR.................................................................................................................
40
4.2- Comparação da estabilidade do BD-TTR e LD-TTR em pH 7.5 à 1
0
C
frente à desnaturação por APH.......................................................................
41
4.3- Avaliação da dependência de concentração do BD-TTR no processo de
dissociação por APH.......................................................................................
42
4.4-Emprego do VBO para avaliar o estado de oligomerização do BD-*TR e
LD-TTR sob APH...........................................................................................
46
4.5-Caracteterização da espécie formada sob APH através da ligação de bis-
ANS ao BD-TTR e LD-TR.............................................................................
48
4.6- Estudos de agregação com os dímeros engenheirados da
TTR.................................................................................................................
56
4.7- Análise morfológica dos agregados formados pelo mutante BD-TTR.......... 70
5.0 Discussão.............................................................................................................. 72
5.1- Comparação da estabilidade dos dímeros versus proteína selvagem 75
5.4 Agregação protéica 78
6.0 Referências bibliográficas.................................................................................. 83
Anexo.......................................................................................................................... 96
x
Índice de ilustrações e tabelas
Introdução
Tabela 1- Classificação dos amilóides
9
Fig. 1- Organização estrutural de uma fibra amilóide.
11
Fig. 2- Os possíveis caminhos de interações de um polipeptídio recém sintetizado.........................................
12
Fig. 3- Intervenções terapêuticas nas amiloidoses.............................................................................................
14
Fig. 4 - Estrutura terciária do monômero da TTR..............................................................................................
16
Fig. 5- Estrutura tridimensional do dímero formado pelas subunidades A e B da TTR....................................
17
Fig. 6- Representação da estrutura tridimensional do tetrâmero da TTR..........................................................
17
Fig. 7- Representação da estrutura quaternária da TTR.....................................................................................
18
Fig. 8 - Representação esquemática da via de desnaturação/ formação de fibrilas da TTR..............................
20
Fig. 9- Representação da estrutura tridimensional do BD-TTR.........................................................................
22
Fig. 10-Representação da estrutura tridimensional do LD-TTR........................................................................
24
Fig. 11- Estrutura do bis-ANS...........................................................................................................................
30
Fig. 12- Estrutura da tioflavina T......................................................................................................................
32
Fig. 13- Esquema da célula de alta pressão hidrostática....................................................................................
33
Fig. 14- Esquema do sistema gerador de alta pressão hidrostática....................................................................
33
Resultados
Fig. 15- Cromatografia líquida de gel filtração do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR.........................................
42
Fig. 16 – Comparação da estabilidade à APH dos dímeros da TTR a 1°C.......................................................
45
Tabela 1 ............................................................................................................................................................
45
Fig. 17- Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR após um
ciclo de pressurização em pH 7.5 1
0
C.................................................................................................
47
Fig.18 – Avaliação da dependência de concentração do BD-TTR com DTT através da APH........................
49
Fig. 19- Ligação de VBO ao BD-TTR, LD-TTT e WT-TTR a pressão atmosférica.........................................
51
Fig. 20- Avaliação das espécies formadas sob APH através da ligação de VBO..............................................
52
Fig. 21- Influência no desvio de centro de massa espectral do BD-TTR e LD-TTR pela ligação de VBO......
54
Fig. 22-Ligação de bis-ANS sob pressão: Caracterização de intermediários nos variantes da TR em pH 7.5
a °C.....................................................................................................................................................
57
Fig. 23- Desnaturação ácida do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR em diferentes tempos de encubação a
37
0
C....
60
Fig. 24-Caracterização de intermediários formados pela acidificação pela ligação de bis-
ANS...................................................................................................................................................
58
Fig. 25- A APH induz a agregação dos variantes da TTR.................................................................................
63
Fig. 26- A APH induz a formação de agregados amilóides pelo BD-TTR........................................................
66
Fig. 27- Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular do BD-TTR após um ciclo de pressurização
em pH 5.0 37
0
C....................................................................................................................................
67
Fig. 28- Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular da TTR após um ciclo de pressurização em
pH 5.0 1
0
C............................................................................................................................................
69
Fig. 29- Microscopia eletrônica de transmissão e MFA do BD-TTR sem DTT após um ciclo de
pressurização em pH 5.0, 37°C............................................................................................................
71
Fig. 30-Possíveis mecanismos de dissociação da TTR de tetrâmeros em monômeros......................................
73
Fig. 31-Mecanismos proposto para agregação da TTR......................................................................................
76
xi
Lista de abreviaturas
ASS: Amiloidose Sistêmica Senil.
APH: Alta pressão hidrostática
CFA: Cardiomiopatia Familiar Amiloidogênica
DTT: Ditiotreitol
D.O.: Densidade óptica
HPLC: High Performance Liquid Cromatography
IPTG: Isopropil-β-D-tilgalactosídio
KCl: Cloreto de potássio
LB: Meio rico de cultura
MFA: Microscopia de Força Atômica
PFA: Polineuropatia Familiar Amiloidótica
T4: Tiroxina
TTR: Transtirretina
Tris: Tris (hidroximetil) aminometano
T4*: Transtirretina parcialmente desnaturada-Tetrâmero
SDS: Dodecil sulfato de sódio
VBO: Ácido benzóico 2 [(3, 5-Diclorofenil) amino]
LD-TTR: Transtirretina construída através da inserção de um peptídeo ligante
BD-TTR: Trantirretina construída através da inserção de uma ponte dissulfeto
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1. Introdução
1.1 Enovelamento Protéico
As proteínas são polímeros de aminoácidos constituintes de todos os seres vivos,
onde exercem as mais diferentes funções biológicas, que são definidas pela sua localização,
composição e estrutura tridimensional. A biossíntese protéica se dá nos ribossomos e depende
da colaboração de várias classes de moléculas de RNA podendo ser dividida em cinco etapas:
(1) ativação dos aminoácidos, que se dá pela ligação ao RNA transportador; (2) iniciação da
tradução propriamente dita; (3) elongação; (4) término e liberação da cadeia polipeptídica e
(5) enovelamento e processamento pós-traducional (LEHNINGER et al., 1993).
Conforme mostrado por Anfinsen na década de 1970, a estrutura tridimensional de
uma proteína é determinada pela sua seqüência primária, isto é, pela seqüência de
aminoácidos, que dependendo da composição, determina a estrutura secundária (α hélices,
folhas β e voltas), cuja organização tridimensional no espaço determinará a estrutura terciária.
Em alguns casos, a proteína pode possuir mais de uma subunidade e a interação entre estas
subunidades origina a estrutura quaternária. A conformação final adequada e funcional da
proteína chama-se de estrutura nativa (ANFINSEN, 1973). Tal estrutura é mantida pelo
somatório de interações fracas (ligação de hidrogênio, interações iônicas, interações
hidrofóbicas e forças de van der Waals), altamente específicas, que se estabelecem entre
diferentes resíduos de aminoácidos localizados em diferentes regiões da proteína. Além
dessas interações fracas, existem as pontes dissulfeto que são ligações covalentes e, portanto,
fortes, que se estabelecem entre dois resíduos do aminoácido cisteína (CREIGHTON, 1990).
Ao processo de formação destas interações e o estabelecimento da estrutura secundária,
Introdução
3
terciária e quaternária dá-se o nome de enovelamento protéico. Alterações na seqüência dos
aminoácidos são capazes de afetar o enovelamento protéico, o que pode ser evidenciado por
estudos de proteínas com mutações pontuais (WETZEL, 1994; FOGUEL et al., 1995;
BROWN et al., 1997; SEKIJIMA et al., 2003).
Um polipeptídio só enovelar-se-á quando a energia livre da estrutura nativa for
menor que as energias livres de todos os estados desnaturados acessíveis. As exceções a esta
regra são as proteínas com estados intermediários, onde a cadeia polipeptídica assume um
mínimo local de energia que não é o menor mínimo possível a ser alcançado (SOHL et al.,
1998)
No processo de enovelamento de uma proteína, o tempo também deve ser
considerado. Se uma cadeia polipeptídica de uma proteína desenovelada experimentasse todas
as posições possíveis dos ângulos de torção ϕ e ψ de sua estrutura, esta levaria um grande
tempo para alcançar a sua forma nativa. Este tempo foi calculado para uma proteína de 100
resíduos de aminoácidos e mostrou-se mais longo que o tempo de existência da vida em nosso
planeta. Esta problemática ficou conhecida como paradoxo de Levinthal (LEVINTHAL,
1968). Porém, se as posições e interações corretas, uma vez alcançadas, permanecerem
inalteradas, o tempo necessário neste processo seria drasticamente reduzido para menos que
uma dezena de segundos (ZWANZIG et al. 1992). Estudos demonstram que há uma tendência
das cadeias polipeptídicas comportarem-se desta forma, uma vez que os ângulos de torção e
as interações nativas são mais estáveis que as não-nativas, tornando-as mais persistentes e
permitindo, assim, que a cadeia polipeptídica ache sua estrutura de mais baixa energia em
tempos ínfimos (DOBSON, 2003).
Além disso, há indícios de que existam interações entre resíduos chave, que, uma vez
formadas, criariam uma conformação rudimentar próxima à nativa naquele segmento, fazendo
com que a conformação nativa seja alcançada mais rapidamente. O estabelecimento destas
Introdução
4
primeiras interações formaria o estado de transição que, uma vez alcançado, facilitaria todo o
resto do enovelamento (DOBSON, 2003; DOKHOLYAN, et al, 2002).
O estudo do enovelamento protéico tem algumas limitações, já que os experimentos
são feitos in vitro, e, portanto, não mimetizam perfeitamente as condições físicas e químicas
existentes nas células. É ignorada a presença de outras proteínas que auxiliariam no
enovelamento (chaperones) e outras características, como a alta concentração de
macromoléculas no citoplasma da célula (“molecular crowding”).
Os chaperones são, por definição, proteínas que previnem interações impróprias que
venham porventura ocorrer (ELLIS, 1989). Logo, os chaperones previnem que as proteínas
parcialmente enoveladas ou subunidades desmontadas façam interações de cadeias laterais
não nativas, que possam resultar, por exemplo, na agregação. Os chaperones aumentam a
eficiência do processo de enovelamento como um todo reduzindo a probabilidade de reações
competitivas, particularmente a agregação. Estudos mostram que alguns chaperones são
capazes não apenas por “proteger” a proteína durante o enovelamento, mas também por
resgatar proteínas desenoveladas e agregadas e as tornar capazes de retornar a via correta de
enovelamento. A estrutura nativa de uma proteína só é atingida quando todas as interações
foram formadas entre os possíveis domínios e quando todas as ligações são feitas em um
único arranjo empacotado e a água é excluída de dentro da estrutura protéica (DOBSON,
2003).
Nos últimos anos, a caracterização de intermediários que são formados durante o
processo de enovelamento foi muito importante. Muitas vezes esses intermediários dão
origem a agregados e podem estar envolvidos em doenças, conforme descrito mais a frente.
Introdução
5
1.2 Desnaturação Protéica
O processo de desnaturação ocorre naturalmente in vivo e tem em geral como
finalidade levar as proteínas a um estado conformacional que permita a ação de proteases,
degradando a proteína em pequenos peptídeos e aminoácidos livres, que serão reaproveitados
pelo organismo, seja para nutrição ou para a formação de novas proteínas.
Quando expostas à condições inóspitas, as proteínas podem desenovelar-se e
perderem parcial ou totalmente sua função, passando, então, de seu estado nativo para o
chamado estado desnaturado ou desenovelado.
Por muitos anos acreditou-se que as proteínas existiam apenas nesses dois estados:
estado nativo e funcional (N) e estado desnaturado (D) (BALDWIN, 1975).
D
N (eq. 1.1)
O caso extremo de desnaturação é a perda de todas as estruturas quaternária, terciária
e secundária, alcançando assim uma conformação espacial aleatória, chamada estrutura
randômica. As interações fracas são as principalmente afetadas no processo de desnaturação
(LEHNINGER et al., 1993).
A desnaturação pode ser reversível quando o agente perturbador é removido e, neste
caso, o equilíbrio pode ser atingido. Segundo o modelo de dois estados, na metade do
processo de desnaturação, 50% das moléculas estão na forma nativa (N) e 50% estão na forma
desenovelada (D). Neste caso, é possível calcular-se a extensão da reação em cada ponto da
curva de desnaturação por relações matemáticas. A desnaturação pode ainda ser irreversível
como no caso da ovoalbumina que, quando aquecida, desnatura e coagula (TANFORD, 1968,
1970).
Introdução
6
Com o desenvolvimento de técnicas mais elaboradas ou mesmo de observações mais
cuidadosas por parte dos estudiosos, foi possível observar e descrever intermediários do
processo de enovelamento de diversas proteínas (BALDWIN, 1975). Então, à equação
apresentada anteriormente para descrever a via de enovelamento/desenovelamento de uma
proteína (equação 1.1) foram acrescentadas novas espécies, conforme mostrado a seguir:
N I
1
I
2
... I
n
D (eq. 1.2)
onde I
1
, I
2
e I
n
são intermediários conformacionais discretos. Estes intermediários
podem apresentar diferentes graus de estruturação (KING et al., 1996). Embora o estudo da
via de enovelamento protéico in vitro auxilie na compreensão da via fisiológica, é sabido que
estas vias não são idênticas. In vivo, uma proteína pode iniciar o seu enovelamento à medida
que é sintetizada no ribosoma. Além disso, muitas vezes o enovelamento in vitro não é
completamente bem sucedido ou toma um tempo incompatível com o previsto para a via
fisiológica (BALDWIN, 1975).
1.3 Alta Pressão Hidrostática (APH) como agente desnaturante
Estudos recentes têm demonstrado o potencial da APH para revelar mudanças na
estrutura protéica que são inacessíveis por métodos bioquímicos e biofísicos convencionais
(PACI, 2002). A estrutura nativa de uma proteína, a conformação que lhe dá atividade
biológica, é o resultado de um delicado balanço entre interações (fortes e fracas)
estabilizadoras e desestabilizadoras. As interações fracas são uma das chaves para entender os
efeitos da pressão nos biomateriais desde que esses materiais sejam afetados por ela. As
interações fracas estão envolvidas tanto em níveis intermoleculares como intramoleculares. A
Introdução
7
maioria das interações intramoleculares encontradas nas biomoléculas são iônicas,
hidrofóbicas, ligação de hidrogênio e hidratação (ligação de hidrogênio com moléculas de
água na primeira camada de solvatação e com água dentro das cavidades protéicas). As
interações intermoleculares são as feitas entre proteína-proteína, enzima-substrato ou enzima-
inibidor, proteína-ligante e interações da proteína com o solvente. Dependendo de sua
natureza, essas interações são afetadas pela pressão positiva ou negativamente (MARCHAL
et al., 2005).
A APH promove alterações pouco significativas na estrutura secundária das
proteínas, pois esta é estabilizada por ligações de hidrogênio, que são pouco afetadas, uma vez
que a variação de volume da quebra de uma ponte de hidrogênio é zero,
já que o resíduo
exposto pode passar a fazer ponte de hidrogênio com a água. No que diz respeito às interações
eletrostáticas (pontes salinas) e interações hidrofóbicas, sua quebra é acompanhada de uma
diminuição de volume, e no caso da primeira ocorre da eletrostricção e solvatação dos
resíduos expostos. Outras interações, como o alinhamento de anéis aromáticos e interações de
transferência de carga, por apresentarem uma pequena diminuição de volume
não são tão
afetadas pela APH (MOZHAEV, 1994). Ficam claras, portanto, as razões físicas para a
seletividade da APH em afetar majoritariamente as estruturas quaternária e terciária das
proteínas em detrimento da estrutura secundária.
Esta última é majoritariamente mantida por
pontes de hidrogênio sendo pouco afetadas pela APH. Esta peculiaridade faz com que a APH
seja uma excelente ferramenta para popular estados intermediários das proteínas, já que estes
se caracterizam por apresentar grande perda de estrutura terciária com pouco
comprometimento da estrutura secundária (SILVA et al., 1992; PENG et al., 1993; FOGUEL
et al., 1998; FOGUEL et al., 2003).
Podemos dizer que, com exceção da ligação de hidrogênio, todas as demais
interações fracas responsáveis por manter as proteínas em estado nativo são afetadas pela
Introdução
8
pressão. O formalismo matemático da relação destas interações com a pressão prediz que
qualquer equilíbrio onde a mudança de volume entre os reagentes e os produtos seja menor
que zero (∆V<0) será favorecido/acelerado com o emprego da pressão. Por outro lado,
qualquer equilíbrio onde a variação de volume seja maior que zero (∆V>0) será
desfavorecido/desacelerado com o aumento da pressão (GROSS, et al., 1994). Essa
característica contrasta com aquelas de outras perturbações como alta temperatura e agentes
desnaturantes, cujos efeitos dependem de vários fatores. Um aumento na temperatura produz
simultaneamente mudanças na energia e volume total, enquanto os efeitos da desnaturação
química dependem de propriedades de ligação das proteínas (SILVA, et al., 2001).
1.4 Agregação Protéica e Amiloidoses
A deposição de proteínas como agregados amilóides insolúveis nos tecidos é
uma característica comum em um grande número de doenças humanas importantes, incluindo
as doenças de Alzheimer, de Parkinson e de Huntington, o diabetes mellitus tipo II e as
encefalopatias espongiformes transmissíveis (STEFANI, 2004; DOBSON, 2005). Estes
depósitos amilóides são predominantemente extracelulares e de origem protéica, e resultam da
polimerização de peptídeos e ou proteínas que agregam formando folhas β-antiparalelas
cruzadas (PADRICK et al., 2001). Por mecanismos que não são ainda completamente
compreendidos, esta deposição amilóide pode conduzir a disfunções e à morte das células,
levando, com isto, a danos severos ao tecido a que a doença está relacionada, principalmente
quando o tecido alvo são aqueles que compõem as vísceras como coração e rins (LORENZO
et al., 1994).
Introdução
9
Em algumas amiloidoses a quantidade de agregado encontrado nos tecidos pode ser
quase indetectável e em outras encontram-se quantidades enormes de agregados. Nas
amiloidoses localizadas, o depósito de agregados amilóides está restrito a um órgão ou tecido.
Nas amiloidoses sistêmicas, os depósitos podem se apresentar em quaisquer ou todas as
vísceras bem como tecidos conectivos e paredes dos vasos sanguíneos. As amiloidoses
hereditárias são causadas por genes mutantes que codificam proteínas mutantes que
apresentam sua estabilidade estrutural alterada (PEPYS, 2001).
Conforme visto na Tabela 1, cada amiloidose envolve predominantemente a
agregação de uma proteína. Contudo, vários outros componentes protéicos e mesmo
carboidratos (proteoglicanas e glicosaminoglicanas) são incorporados aos depósitos amilóides
quando estes são formados in vivo.
Tabela 1-Classificação dos amilóides (modificado de H
AYDEN
,
M.,
R.,
et al
2001)
Proteína Amiloidose
Peptídeo Aβ, proteína Tau
Doença de Alzheimer
Proteína do prion Encefalopatia espongiforme
α- sinucleína
Doença de Parkinson
Polipeptídio Amilóide das Ilhotas (IAPP)
Diabetes do Tipo II
Calcitonina
Carcinoma Medular da Tireóide
Lipoproteínas, Apo-SAA, Apo-AI
Amiloidose Sistêmica de Cadeia Reativa
Trantirretina Amiloidose Sistêmica Senil
Mutantes da Transtirretina Polineuropatia Familiar Amiloidótica I
Cistatina C Angiopatia Amiloide Cerebral Hereditária
Huntingtina Doença de Huntington
Fator natriurético atrial Amiloidose Atrial
Imunoglobulina de cadeia leve Amiloidose Sistêmica Primária
Amilóide Sérica A Amiloidose Sistêmica Secundária
Lisozima Amiloidose Familiar não neuropática
Bril Demência Familiar Britânica
β
2
-microglobulina
Amiloidose realcionada a hemodiálise
Apolipoproteína A1 Polineuropatia Familiar Amiloidótica II
Gelsolina D187N ou Y Amiloidose Familiar
Lactotranferrina Amiloidose Familiar corneal subeptelial
Fibrinogênio Amiloidose Renal Hereditária
Prolactina Amiloidose da Glândula Ptuitária
Insulina Amiloidose de injeção localizada
Fator Natriurético Atrial (FNA) Amiloidose Atrial
Introdução
10
Uma das observações mais intrigantes acerca das doenças amiloidogências é o fato
de que as fibras amilóides podem se originar de proteínas solúveis tão distintas, seja a nível de
estrutura primária ou, mais curiosamente, secundária. A apolipoproteína é uma proteína
formada exclusivamente por α-hélices ao passo que a TTR é formada quase que
exclusivamente por folhas beta. Ambas essas proteínas são capazes de formar fibras amilóides
estando envolvidas em diferentes patologias (Tabela 1). De qualquer forma, as fibras
amilóides possuem apenas folhas beta e isso implica que a apoliporteína, por exemplo, para
assumir uma conformação capaz de ser encaixada numa fibra amilóide, precisa sofrer grandes
arranjos conformacionais ainda desconhecidos. Além disso, isso implica que uma mesma
seqüência de aminoácidos seja capaz de ser bem acomodada numa α-hélice, como no caso da
apolipoproteína solúvel, ou folha β, como no caso da apoliporteína agregada em fibra.
As características das formas solúveis das proteínas envolvidas nas amiloidoses bem
definidas são variadas. Estas variam de proteínas globulares intactas, a grandes moléculas de
peptídeo sem estrutura definida. Porém as fibras amilóides são estruturalmente similares, e
por isso são capazes de se ligar a corantes específicos, tais como o vermelho de congo e
tioflavina T (KREB et al., 2005)
. A estrutura fibrilar típica não apresenta ramificações
possuindo em torno de 7-10 nm de diâmetro e comprimento variáveis (Figura 1) (STEFANI,
2004).
Introdução
11
Figura 1- Organização estrutural de uma fibra amilóide. Os quatro protofilamentos estão
enrolados ao redor de cada um e o núcleo de sua estrutura é uma fileira de folhas-beta onde cada fita corre
perpendicularmente ao eixo da fibra (adaptado de STEFANI et al., 2004)
Tem sido demonstrado que a mudança para o estado amilóide de uma proteína nativa
envolve a desestabilização do seu estado nativo. Essa desestabilização se refere à diferença na
energia livre entre o estado nativo e o intermediário formado no mecanismo de
amiloidogênese. As mutações, por exemplo, diminuem a estabilidade termodinâmica
aumentando a energia livre do estado nativo. A estabilidade cinética (altura da barreira
energética entre o estado nativo e de transição), também é afetada da mesma forma pelas
mutações e também pelo decréscimo do estado de transição. Em muitos sistemas biológicos,
os efeitos termodinâmicos e cinéticos ocorrem simultaneamente com as mutações ou
mudanças nas condições. Sendo assim, a transformação do intermediário em fibras amilóides
requer a reformulação e reorganização de alguns elementos da estrutura secundária e terciária
(HORWICH, 2002).
A figura 2 demonstra alguns caminhos que um polipeptídio pode seguir ao ser
sintetizado.
Introdução
12
Figura 2- Os possíveis caminhos de interações de um polipeptídio recém sintetizado.
Modificações na estrutura protéica podem favorecer interações proteína-proteína que formam fibras. Essas
condições poderiam estar desestabilizando o equilíbrio (1) e levar ao aumento da população de moléculas
parcialmente enoveladas. Sob condições normais, elas são reenoveladas pelos chaperones ou eliminadas pela
maquinaria ubiquitina-proteassoma. O equilíbrio (2) é deslocado para direita e a nucleação de agregados
ordenados é cineticamente favorecida por mutações aumentando a hidrofobicidade ou a propensão à formação de
estrutura em folha beta ou reduzindo a relação das moléculas enoveladas/desenoveladas. A formação de pré-
fibrilas pode levar a formação de poros amilóides (equilíbrio 3) que pode estar diretamente relacionado aos
efeitos citotóxicos dos amilóides. O ponto de interrogação indica que não é sabido se os poros amilóides
(quando formados) estão envolvidos na patologia ou são os últimos intermediários na formação das fibrilas.
“
PERIGO!” Indica o processo que gera a pré-fibrila, atualmente consideradas mais associadas com os danos
celulares. Os chaperones moleculares (proteína do choque térmico e outras) podem suprimir o aparecimento dos
agregados pré-fibrilares reduzindo a população de moléculas de proteína desenoveladas e ajudando no seu
correto enovelamento ou favorecendo seu desenovelamento completo para degradação pelos proteossomas; eles
também podem, em alguns casos, limpar formações amilóides detectando monômeros e favorecendo o seu
desaparecimento (adaptado de STEFANI, 2004).
Introdução
13
Recentemente, vários grupos têm se questionado quanto à toxicidade das diferentes
espécies presentes na rota de agregação de uma determinada proteína (ANDERSSON et al,
2002; REIXACH et al., 2004): seriam as fibras as espécies tóxicas ou outras espécies
agregadas que se acumulam antes da formação das fibras?
Resultados recentes demonstram que as estruturas quaternárias pré-amilóide
(oligômeros solúveis, protofibrilas) seriam mais tóxicos que a fibra madura (LASHUEL et al,
1998, LOOK et al, 2007). Além disso, estudos com linhagem celular de neuroblastoma
demonstram que monômeros e oligômeros não nativo seriam os maiores responsáveis pela
morte celular. Entretanto, os mecanismos responsáveis pela seletividade de tecido que ocorre
em algumas amiloidoses, e os mecanismos através dos quais a citotoxicidade é exercida são
ainda desconhecidos (REIXACH et al, 2004).
As formas de tratamento das amiloidoses utilizadas atualmente baseiam-se na
preservação da função do órgão afetado, transplante, utilização de drogas que sejam capazes
de estabilizar a estrutura da proteína impedindo a formação dos depósitos (PEPYS, 2005).
A figura 3 demonstra as principais intervenções terapêuticas nas amiloidoses.
Introdução
14
Figura 3- Intervenções terapêuticas nas amiloidoses.
Há várias maneiras de se intervir terapeuticamente com drogas nas amiloidoses, em diferentes passos da via de
agregação: (A) estabilização da estrutura nativa; (B) inibição do processamento enzimático que geraria peptídeos
propensos a agregar; (C) alteração da taxa de síntese da proteína envolvida na doença; (D) estimulação da
degradação proteasomal de proteínas enoveladas incorretamente ou peptídeos propensos a agregar; (E) inibição
da montagem das fibras; (F) prevenção do acúmulo de pré-fibrilas. (DOBSON, 2005)
Introdução
15
1.5 Transtirretina
1.5.1 Transtirretina selvagem (WT-TTR) e seus mutantes pontuais
A transtirretina (TTR - Trasporter of Tiroxine and Retinol) é uma proteína globular
plasmática, tetramérica de 55 kDa, composta por quatro subunidades idênticas de 127
resíduos de aminoácidos, arranjados em 8 fitas β, denominadas por letras de A a H (figura 4)
(BLAKE et al., 1978). Os monômeros de TTR associam-se em dímeros através de ligação de
hidrogênio entre as fitas HH’ e FF’, formando folhas -β antiparalelas (Figura 5) (DAMAS et
al., 2000). Estes dímeros associam-se para formar o tetrâmero através de interações mediadas
pelas voltas AB e GH (interface dímero-dímero) (Figuras 6 e 7) (JIANG et al., 2001),
assumindo formato de ampulheta. No tetrâmero, existem dois canais internos hidrofóbicos
onde ocorre a ligação de duas moléculas do hormônio tiroxina (T4), sendo uma molécula por
canal.
A TTR possui dois resíduos de triptofano por subunidade (posições 41 e 79) e cinco
resíduos de tirosina por subunidade (BLAKE et al., 1978; LASHEL et al., 1998), o que
permite o estudo desta proteína através do monitoramento de fluorescência intrínseca.
Os principais locais de produção da TTR confirmados por métodos de hibridização
in situ são o fígado e plexo coróide, e em menor escala o epitélio pigmentar da retina e o saco
vitelínico no endoderma (ANDO et al., 2005).
A TTR está presente no plasma em concentrações em torno de 0,2 mg/mL
(aproximadamente 3,5 µM) e de 0,017 mg/mL no fluído cérebro-espinhal (LAI et al.,1996).
Nestes locais, a TTR participa do transporte do hormônio tiroxina (T4) e também auxilia no
transporte de retinol, através da formação de um complexo com a proteína ligadora de retinol
Introdução
16
(RPB, do inglês “Retinol Binding Protein”). Este complexo evita que o retinol seja perdido
durante a filtração glomerular (COLON et al 1992; ALMEIDA et al., 1996).
No plasma, apenas 10-15% da tiroxina é transportada pela TTR, enquanto os outros
85-90% são transportados pela globulina transportadora de tiroxina. Já no fluído cérebro-
espinhal, a TTR é o transportador majoritário de tiroxina (BAURES et al., 1998).
Figura 4- Estrutura terciária do monômero da TTR. A figura foi gerada a partir das coordenadas estruturais
do cristal do tetrâmero. Cada fita β encontra-se representada por uma letra de A a H. A maioria das mutações
envolvidas em amiloidoses causadas por esta proteína abrange a região da fita β C – volta – fita β D, incluindo a
mutação mais letal, Leu 55 Pro
(adaptado de FOSS et al., 2005b).
Introdução
17
Figura 5 – Estrutura tridimensional do dímero formado pelas subunidades A e B da TTR. Representação
da formação das folhas beta através das ligações de hidrogênio laterais de cada monômero (adaptado de FOSS et
al., 2005b).
Figura 6 – Representação da estrutura tridimensional da TTR. A linha tracejada representa o eixo
cristalográfico de simetria, sobre o qual uma rotação de 180
0
do dímero A-B produzirá o dímero C-D. A estrela
azul demonstra a cisteína 10 da subunidade A e a estrela laranja demonstra o ácido glutâmico 127 da subunidade
C (adaptado de FOSS et al.., 2005b).
Introdução
18
Figura 7 – Representação da estrutura quaternária da TTR, com rotação de 90º sobre seu eixo vertical. A
rotação evidecia o canal de ligação da tiroxina, representado nas laterais do tetrâmero e expões a volta AB da
subunidade A . Esta volta interage através de ligações de hidrogênio com as subunidades C e D estabilizando a
interface quaternária A-B e C-D e ajudando a definir o canal de ligação da tiroxina (adaptado de FOSS et al.,
2005b).
A TTR está relacionada a quatro amiloidoses. A polineuropatia familiar
amiloidogênica (PFA) que é uma desordem autossômica dominante causada por uma das mais
de 90 mutações pontuais conhecidas. O acúmulo de fibras amilóides na PFA está geralmente
associado com neuropatia periférica, resultando em disrupção motora, sensorial, e de funções
autonômicas. Alguns variantes da TTR são capazes de agregar no sistema nervoso central,
causando a amiloidose leptomeningeal. Esses mutantes são encontrados majoritariamente no
líquor, e entre eles está o A25T, o mais instável mutante da TTR descrito até o momento. A
variante V112I está envolvida na cardiomiopatia familiar amiloidótica (CFA), que acomete 3-
4 % da população africana da América, enquanto a proteína selvagem está envolvida na
amiloidose sistêmica senil (ASS) (KARLSSON et al., 2005).
Introdução
19
A PAF afeta uma a cada 100.000 pessoas, sendo que os mutantes mais
amiloidogênicos conhecidos são o L55P e o V30M (MCCUTCHEN et al, 1993;
GUSTAVSSON et al, 1995; GOLDSTEIN et al, 1997). No Brasil, a PFA está associada, na
maioria dos casos, ao mutante V30M, segundo um estudo que analisou 32 pacientes de 24
famílias diferentes (PALÁCIOS et al., 1999). Contudo, pacientes com FAP são geralmente
heterozigotos, com quantidades aproximadamente iguais de TTR selvagem e variante
expressas. Tipicamente, esses pacientes exibem sintomas em torno dos 30 anos de idade com
morte ocorrendo de uma a duas décadas depois. Contudo, o tempo de duração da doença, o
órgão e sistema afetado diferem dependendo do mutante de TTR que compõem as fibrilas.
O único tratamento conhecido para a PFA é a terapia gênica obtida com o transplante
de fígado, uma vez que este órgão é o principal responsável pela produção de TTR (SUHR et
al, 2000). Muitos trabalhos pesquisam terapias menos invasivas e com menor propensão a
complicações do que o transplante de fígado.
Já a ASS é uma amiloidose que atinge 25% das pessoas acima de 80 anos de idade
(CORNWELL et al., 1998; WESTMARK et al., 1990; GUSTAVSSON et al., 1995). A
deposição de fibrilas da TTR selvagem é geralmente benigna, contudo em alguns indivíduos o
depósito amilóide no coração pode causar problemas significativos (PALÁCIOS et al., 1999).
Uma vez que a via de agregação da TTR prevê a dissociação das subunidades para
que haja formação de fibras amilóides. Uma abordagem terapêutica interessante seria o
desenvolvimento de drogas que estabilizassem a estrutura tetramérica, impedindo a
dissociação e, com isso, evitando a agregação.
Em 1992 surgiu a hipótese da desnaturação ácida parcial como fator necessário para
a agregação da TTR. Neste trabalho também foi levada em consideração a hipótese de que
esta desnaturação ocorreria dentro dos lisossomas, quando da degradação da TTR para sua
Introdução
20
reciclagem (COLON et al., 1992), hipótese esta que ainda não foi confirmada, uma vez que a
TTR não foi encontrada em compartimentos ácidos da célula.
Nesta proposta, a agregação da TTR teria como ponto de partida um intermediário
amiloidogênico que se acumula em função da acidificação do meio (LAI et al., 1996). Este
intermediário representaria, então, um ponto de bifurcação onde em um meio ainda mais
ácido poderia seguir pela via normal de desnaturação, gerando uma estrutura denominada
estado “A”. Este mesmo intermediário poderia, por outro lado, estabelecer contatos
interprotéicos gerando então agregados fibrilares, como mostrados na Figura 8 (COLON et
al, 1992; WETZEL, 1994; LAI et al., 1996; KELLY, 1997).
Figura 8 – Via proposta de desnaturação/ formação de fibrilas da TTR. O esquema demonstra o efeito de
condições ácidas na estrutura nativa da TTR que, mediante acidificação, formaria um tetrâmero rearranjado e
posteriormente um intermediário monomérico amiloidogênico responsável pela formação de fibrilas amilóides
(adaptado de MIRROY et al., 1996).
Outras hipóteses sobre o possível local de agregação da TTR surgiram, mostrando
uma estreita correlação entre o local de depósito precoce das fibras amilóides e a composição
da membrana basal de células do miocárdio de pacientes com ASS, onde se acredita que
constituintes da membrana propiciam a agregação. Sendo mostrado também, a presença de
componentes da membrana basal, como proteoglicanas de heparan sulfato (perlecan) e
Introdução
21
condroitin sulfato presente nas fibras de TTR retiradas do nervo periférico de um paciente
com PFA, causada pela variante V30M (INOUE et al., 1998).
A dissociação do tetrâmero da TTR em monômeros é necessária, mas não suficiente
para amiloidogênese. Esses monômeros devem sofrer desnaturação parcial para produzir o
intermediário amiloidogênico. Esse intermediário forma várias espécies, incluindo agregados
amorfos, agregados esféricos, espécies ricas em folha beta com baixo peso molecular,
incluindo protofilamentos e finalmente fibras amilóides (FOSS et al, 2005a).
Atualmente inúmeros estudos têm demonstrado que dímeros ou outras espécies
oligoméricas poderiam agregar formando fibras amilóides, sem a necessidade da dissociação
da proteína em monômeros (FERRÃO-GONZALES et al, 2000; SERAG et al, 2001;
OLOFSSON et al., 2001; KEETCH et al, 2005; CORREA et al, 2005; MATSUBARA, K., et
al., 2005)
1.5.2 Transtirretina BD-TTR
A TTR Bar-Dimer (BD-TTR) é um mutante da proteína transtirretina construído
através da inserção de duas mutações pontuais, onde um ácido glutâmico da posição 92 foi
trocado por uma cisteína, essa posição foi estrategicamente escolhida olhando-se a estrutura
de cristal da TTR onde verificou-se que a inserção de uma cisteína nessas posições conferiria
à proteína à formação de uma ponte dissulfeto naturalmente, que ligaria covalentemente as
subunidades A-B e C-D. Além disso, a proteína possui uma cisteína natural na posição 10,
que foi subtituída por uma alanina a fim de evitar formação de pontes disssulfeto entre
cadeias. Dessa forma, quando não tratada com agentes redutores essa proteína só é capaz de
ser dissociada até dímeros.
Introdução
22
Estudos anteriores com esse mutante demonstram que o BD-TTR é sensível à ação
da guanidina, sendo resistente à uréia. Além disso, ele é capaz de realizar troca de
subunidades na ausência de DTT, indicando que a dissociação desse mutante é possível, e se
daria pelo eixo cristalográfico C
2
que seria a interface livre para a troca de subunidades no
BD-TTR (FOSS et al., 2005b). Contudo, nesse estudo, não foram realizados ensaios de
agregação com esses dímeros e essa questão ficou em aberto.
A Figura 9 mostra o diagrama de fitas do BD-TTR.
Figura 9 - Representação da estrutura tridimensional do BD-TTR. Construção dimérica da TTR, formada
pela subunidade A ligada à subunidade B. O resíduo de ácido glutâmico 92 foi substituído por uma Cisteína
permitindo a formação da ponte dissulfeto que mantém o dímero íntegro. A segunda vista da estrutura com
rotação 90
0
sobre o eixo de simetria C
2
mostra a ponte dissulfeto por uma vista lateral. (adaptado de FOSS et al,.
2005b).
A transtirretina é covalentemente modificada tanto em humanos saudáveis como em
pacientes com amiloidose. A cisteína 10 (Cys-10), a única cisteína isolada em cada
subunidade da TTR, é geralmente o sítio de modificação. De todas as modificações da Cys-10
Introdução
23
a cisteinilação é a modificação predominante, encontrada em mais de 50% das subunidades
do plasma. Modificações menos prevalentes incluem oxidação, S-sulfonação, glutationilação,
cisteinilglicilação e homocisteinilação (ZHANG et al., 2005).
Embora o dímero BD-TTR seja engenheirado, recentemente, foi descrito um mutante
da TTR encontrado em pacientes com PAF (Ser112Ile). Esse variante natural forma apenas
dímeros. O quadro clínico da amiloidose causada por esse mutante se caracteriza por
neuropatia sensomotora, seguida por aparente desautonomia, cardiomiopatia severa e falência
crônica renal. Tal mutante forma agregados esféricos insolúveis que se mostraram tóxicos em
culturas de neuroblastomas (MATSUBARA et al., 2005).
1.5.3Transtirretina LD-TTR
A TTR Linker-Dimer (LD-TTR) é uma transtirretina mutante construída através da
inserção de um peptídeo que liga covalentemente as subunidades A e C e as subunidades
simetricamente equivalentes B e D, através da interface do canal da tiroxina (Figura 9). Essa
proteína quando dissociada só é capaz de gerar dímeros (AC e BD).
Estudos anteriores com esse mutante demonstram que sua desnaturação é dependente
do agente empregado, sendo o mesmo desnaturado por guanidina e resistente à desnaturação
por uréia
. Além disso esse mutante não é capaz de trocar subunidades com a TTR selvagem,
em condições próximas as fisiológicas, indicando que ele não é capaz de liberar monômeros
(FOSS et al., 2005a).
Sabe-se que moléculas que se liguem ao canal da tiroxina estabilizam a estrutura
tetramérica da TTR. Essas moléculas, ao se ligarem ao canal da tiroxina conectam as
superfícies hidrofóbicas das subunidades A-C e B-D, através de ligações hidrofóbicas. (FOSS
Introdução
24
et al, 2005a). Os estudos com os mutantes BD-TTR e LD-TTR têm por objetivo analisar a
estabilidade dessas duas estruturas quaternárias sob condições desnaturantes, podendo, dessa
forma, evidenciar os passos iniciais do processo pelo qual a TTR dissocia e qual a sua
influência no processo de agregação e formação de fibras.
Figura. 10 - Representação da estrutura tridimensional do LD-TTR. Construção dimérica da TTR formada
pela subunidade A ligada a subunidade C. A alça vermelha representa a ligação covalente na forma de um
peptídeo que mantém a estrutura íntegra. A seqüência de aminoácidos usada para a ligação covalente está
evidenciada na figura. (adaptado de FOSS et al., 2005b).
1.5.4 Estudos prévios com a TTR
Já há muitos anos temos estudado o efeito da APH sobre a dissociação/desnaturação,
bem como a agregação da TTR. Para isso, temos mantido uma colaboração com o grupo do
Dr. J. W. Kelly (Scripps Research Institute), que nos mandou os plasmídios de diversas
formas da TTR (WT-TTR, os mutantes V30M, T119M, L55P, V112I, M-TTR, LD-TTR e
BD-TTR), o que nos permitiu purificá-las em nosso laboratório.
Introdução
25
Estudos prévios de nosso laboratório revelaram que, após um ciclo de compressão-
descompressão, a WT-TTR forma um tetrâmero modificado, visto por gel filtração, que
apresenta uma grande propensão a formar fibras amilóides, conforme visto por ligação de
vermelho de congo ou tioflavina T. Esta agregação pós-pressão é extremamente dependente
de pH, ocorrendo em pH 5,0 a 5,6. Acima deste valor de pH, não observamos agregação da
TTR selvagem, nem dos seus variantes. Os dados de ligação de bis-ANS, que é uma sonda
hidrofóbica que se liga a proteína parcialmente desenovelada, mostraram que, sob pressão, há
ligação desta sonda, o que sugere que a proteína não esteja completamente desnaturada, mas
sim na forma de um intermediário de enovelamento, que, conforme mencionado
anteriormente é bastante favorecido sob pressão (FERRÃO-GONZALES, 2003).
Nossos dados mostraram também que o variante altamente amiloidogênico, L55P,
apresenta-se menos estável frente ao emprego da APH, ao passo que o variante T119M-TTR,
mostrou-se insensível frente a este agente perturbador (FERRÃO-GONZALES, 2000).
A seqüência de estabilidade termodinâmica observada por nós foi:
L55P<V30M<WT<<<T119M
Por outro lado, observamos que após um ciclo de pressão-descompressão, a
propensão a sofrer agregação foi contrária à seqüência anterior, onde o L55P foi o mais
amiloidogênico, seguido pelo V30M e por último o WT.
De certa forma, um dos achados mais significativos dos nossos estudos foi a
descrição de um tetrâmero amiloidogênico, não descrito anteriormente, e que amplia a
hipótese proposta para explicar a agregação da TTR, que pressupõe a existência de um
monômero amiloidogênico que se formaria nos lisossomas.
OBJETIVOS
Objetivos
27
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Esta dissertação de mestrado teve como objetivo geral estudar o processo de
dissociação/desnaturação dos dímeros engenheirados BD-TTR e LD-TTR, buscando-se com
isso uma melhor compreensão da via de enovelamento. Além disso, esses dímeros foram
construídos para melhor caracterizar as interações da interface dimérica e sua importância no
processo da dissociação da TTR.
Utilizamos esses mutantes para tentar compreender melhor a via de agregação dessa
proteína e o papel de determinadas espécies presentes na via.
2.2 Objetivos específicos
Estudar a dissociação e desnaturação dos mutantes engenheirados da TTR por
APH através do uso de técnicas espectroscópicas;
Caracterizar conformacionalmente o BD-TTR e LD-TTR tratado com APH através
de ligação de bis-ANS;
Estudar o processo de dissociação dos dímeros utilizando um marcador
fluorescente de tetrâmero (VBO);
Verificar os efeitos da desnaturação ácida e da desnaturação por APH sobre a
agregação desses mutantes;
Caracterizar o estado oligomérico das espécies formadas sob APH, através de
cromatografia por gel filtração.
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
29
3. Material e Métodos
3.1 Reagentes
Todos os reagentes usados foram de grau analítico. O ditiotreitol (DTT) foi
comprado da Invitrogen. A água destilada e deionizada foi obtida a partir de sistema de
purificação Milli-Q (Millipore Corp., Bedford, MA).
A sonda tioflavina T também foi adquirida
da empresa Sigma-Aldrich. O composto bis-ANS (4,4’-dianilino-1,1’-binaftil-5,5’-sulfonato) foi
obtido da empresa Molecular Probes Inc. (EUGENE, OR, EUA).
Os experimentos foram feitos
nos seguintes tampões Tris–HCL 50 mM, KCl 100 mM, pH 7,5; MES 50 mM, KCl 100 mM,
pH 5,0 e Citrato-fostato 200 mM, pHs 2,6, 3.0, 3.8 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 6.2, 6.6, 7.0.
Enfatizamos que os tampões Tris e MES foram os únicos usados nos experimentos que
envolvem o uso de APH, uma vez que estes mantêm a estabilidade de seus pHs em altas
pressões hidrostáticas. Todos os experimentos foram realizados com TTR recombinante,
obtida por expressão em sistema de E. coli, purificada em nosso laboratório com pureza >
95% atestada por gel filtração em HPLC e espectrometria de massa.
3.1.1 VBO
O 2-[(3,5-Dichlorophenil) amino] ácido benzóico é um análogo sintetizado do
diclofenaco, que é um a droga anti-inflamatória não esteroidal. Esse composto foi sintetizado
com o intuito de servir como estabilizador da estrutura da TTR, impedindo sua agregação ao
ligar-se ao canal da tiroxina da TTR, analogamente ao T4 e ao diclofenaco.
Estudos com o VBO demonstraram que ele é um potente inibidor da agregação da
TTR in vitro (VIBHA et al., 2002). Esse composto difere do diclofenaco pela posição 3,5 do
Material e Métodos
30
cloro e pela presença de um ácido metanóico na posição 2 ao invés de um ácido etanóico,
como ocorre no diclofenaco. A solução estoque foi diluída em DMSO. Os espectros de
emissão de fluorescência da sonda foram coletados excitando-se as amostras em 320 e
coletando-se a emissão de fluorescência entre 440 e 600 nm.
3.1.2 bis –ANS
Os experimentos de fluorescência extrínseca com a sonda bis-ANS foram utilizados
como indicador de mudanças conformacionais em proteínas.
A solução estoque da sonda é preparada em água destilada e a concentração aferida
pela diluição em metanol, através da densidade ótica em 395 nm, utilizando-se o coeficiente
de extinção molar de 23.000 M
-1
cm
-1
.
Os espectros de emissão de fluorescência da sonda foram coletados excitando-se as
amostras em 360 nm e coletando-se a emissão de fluorescência entre 400 e 600 nm. A área
desses espectros foi utilizada para avaliar se o bis-ANS estava ligado ou não à proteína.
Nos experimentos nos quais o efeito da alta pressão estava sendo monitorado, a
sonda era incubada junto com a proteína. A concentração de proteína utilizada foi 1 µM e a
concentração de bis-ANS foi de 10 µM. Estas concentrações estão especificadas nas legendas
das figuras.
Figura. 11 –Estrutura do bis-ANS.
Material e Métodos
31
3.1.3 Tioflavina T (ThT)
A sonda tioflavina T é bastante utilizada para a identificação de fibras amilóides, que são ricas em
folhas-β. Esta sonda possui grande afinidade por este tipo específico de estrutura e, quando está
ligada a ela, nota-se um considerável incremento em seu espectro de emissão de fluorescência em
482 nm
(KREBS et al.,2005).
A sonda fluorescente ThT foi utilizada nessa dissertação como marcador de fibra
amilóide. A solução estoque é preparada em tampão glicina-NaOH5 mM, pH 8.5, através da
densidade ótica em 412 nm, utilizando-se o coeficiente de extinção molar de 22.000 M
-1
cm
-1
.
Nos experimentos nos quais o efeito da alta pressão estava sendo monitorado, a sonda era
incubada junto com a proteína. A concentração de proteína utilizada foi 3.5 µM e a
concentração de ThT foi de 35 µM.
Já foi mostrado que a ligação de ThT ocorre de maneira específica e regular, de
forma paralela ao seu eixo maior, em canais existentes ao longo do comprimento das folhas.
A especificidade da ThT para as fibras amilóides baseia-se no fato de que interações estéricas
entre as cadeias laterais e as moléculas da sonda fariam com que esta permanecesse sempre
em uma conformação planar, sendo esta portanto a razão para o aumento de sua fluorescência.
Quando em solução, a sonda não permanece nesta conformação, fluorescendo com menor
intensidade (KREBS et al., 2005).
Os espectros de emissão de fluorescência da sonda foram coletados excitando-se as
amostras em 450 nm e coletando-se a emissão de fluorescência entre 465 e 520 nm. A área
desses espectros foi utilizada para avaliar a presença ou não de fibras amilóides.
Material e Métodos
32
Figura 12- Estrutura da Thioflavina T.
3.2 Alta pressão hidrostática
Nos experimentos de alta pressão, as amostras de proteína foram acondicionadas
dentro de uma cubeta de quartzo em forma de garrafa que foi vedada com um tubo de
polietileno compressível capaz de equalizar a pressão entre o meio hidrostático (etanol
absoluto) e a amostra. Esta cubeta, (Figura 13 B) era acomodada em uma célula de alta
pressão (Figura 13 A) constituída de aço vascomax temperado para esta utilização com três
janelas de safira (Figura 13 D), que permitem o acompanhamento das amostras por medidas
de espectroscopia de fluorescência mesmo durante a aplicação da pressão) (PALADINI, A. A.
JR. et al., 1981). Esta célula era acoplada a um gerador de pressão formado por um pistão,
duas válvulas e um manômetro (Figura 14) por onde se pode regular a pressão exercida sobre
a amostra.
A pressão foi aumentada em passos de~260 bar. A cada passo, a amostra foi
incubada para atingir o equilíbrio durante 10 minutos antes de qualquer medida
espectroscópica.
Nos experimentos de agregação induzida por APH, a amostra foi pressurizada a ~
2895 bar por 30 minutos. Após esse tempo, a pressão foi retirada e acompanhou-se o
espalhamento de luz da amostra.
Material e Métodos
33
Figura 13- Esquema da célula de alta pressão hidrostática.
Os componentes da célula estão designados no texto acima.
Figura 14 - Esquema do sistema gerador de alta pressão hidrostática.
O sistema é composto pela bomba (a), pelo gerador de pressão (b), o pistão (c), a linha de etanol (d), o
reservatório de etanol (e), duas válvulas (f) e o manômetro (g).
Este equipamento foi comprado da ISS (Champaign, IL).
Material e Métodos
34
3.3 Medidas espectroscópicas
O processo de enovelamento protéico tem sido estudado através da utilização de
agentes caotrópicos, variações de pH ou agentes físicos como temperatura e alta pressão
hidrostática (TANFORD, 1970). As alterações estruturais promovidas por estes agentes têm
sido monitoradas através de técnicas espectroscópicas, como fluorescência intrínseca e
extrínseca, dicroísmo circular, ressonância magnética nuclear, entre outras (PACE, 1990; LAI
et al., 1996). Em nosso trabalho, utilizamos principalmente a fluorescência intrínseca de
triptofano.
A fluorescência intrínseca das proteínas resulta da emissão de resíduos aromáticos, a
saber: triptofano, tirosina e fenilalanina. Esses resíduos, quando excitados em um determinado
comprimento de onda, absorvem energia e emitem fluorescência, que é medida a um ângulo
de 90º, sendo que a emissão dos triptofanos é a que mais contribui. Além disso, o grupamento
indol dos resíduos de triptofano é bastante sensível às mudanças de polaridade do meio em
que se encontra. Assim, o máximo de emissão de fluorescência do resíduo de triptofano
depende diretamente da polaridade do ambiente em que o mesmo se encontra, podendo variar
de 320 nm a 355 nm. Quando o resíduo de triptofano se encontra em um meio mais
hidrofóbico, como o interior das proteínas, o máximo de emissão fica em torno de 320 nm.
Entretanto, quando o triptofano fica mais exposto ou em ambiente mais polar, ou seja, em
maior contato com o solvente, o máximo de emissão se desloca para valores próximos a 355
nm (WEBER, 1987).
Material e Métodos
35
3.3.1 Fluorescência
Os espectros de fluorescência foram obtidos em um espectrofluorímetro modelo ISS
K2 (ISS Inc., Champaign, IL). Os espectros de emissão de fluorescência do triptofano foram
obtidos excitando-se a amostra em 280 nm e coletando a emissão na faixa de 300-400 nm. Os
espectros foram analisados e comparados pela quantificação do centro de massa (ν), que é o
ponto que divide o espectro em duas áreas iguais. O centro de massa de uma amostra em
determinada pressão (p), quando expresso em número de ondas, é diretamente proporcional à
energia de emissão, sendo calculado de acordo com a seguinte equação:
<ν
p
>= ∑ νi . Fi/ ∑ Fi (eq. 3.2)
onde Fi é a fluorescência emitida em um número de onda νi, e o somatório calculado a partir
de valores apreciáveis de F.
O grau de dissociação (α) é relacionado ao centro de massa (ν) a partir da expressão:
α = (<ν
p
> - <ν
i
>)/(<ν
i
> - <ν
f
>) (eq. 3.3)
onde <ν
i
> e <ν
f
> são os valores iniciais e finais de centro de massa espectral.
Todos os experimentos foram feitos no mínimo duas vezes com diferentes lotes de
proteínas.
Material e Métodos
36
3.3.2 Espalhamento de luz
As medidas de espalhamento de luz foram realizadas excitando-se as amostras em
320 nm e varrendo-se a emissão entre 315-325 nm. A área do espectro correspondente aos
valores de intensidade obtidos neste intervalo foi calculada e comparada ao valor de
espalhamento de luz inicial (EL
0
). A razão EL/EL
0
foi utilizada para se avaliar a extensão da
agregação das amostras.
3.3.3 Determinação da concentração da TTR
A concentração dos estoques de amostras foi determinada espectofotometricamente
através da lei de Lambert-Beer, que enumera que:
Abs= ε q c (eq. 3.4)
onde Abs é a absorbância em determinado valor de comprimento de onda, ε é o coeficiente de
extinção molar, q é o caminho ótico e c é a concentração de proteína. Usamos medidas de
absorbância a 280 nm, caminho ótico de 1 cm, sendo o coeficiente de extinção para o BD-
TTR, LD-TTR e WT-TTR igual a 77600.
Material e Métodos
37
3.4 Cromatografia por gel filtração
Os experimentos de gel filtração em HPLC (Shimadzu SPD-10A) permitiram avaliar
a pureza das amostras, bem como o estado de oligomerização das proteínas principalmente
após o tratamento com APH.
As colunas utilizadas foram a Superdex 75 HR (SD 75), TSK 3000 e GPC 300,
acoplada a um sistema de HPLC, contendo detectores de UV-Visível e fluorescência
(Shimadzu, Japão).
As colunas foram pré-equilibradas nos pHs desejados. A eluição das amostras foi
acompanhada por emissão de fluorescência a 330 nm (excitação em 280 nm) e absorbância a
280 nm, simultaneamente. As amostras foram injetadas na concentração de 1,0 µM e 3,5 µM.
O fluxo utilizado foi 1 mL/min ou 0.3 mL/min, dependendo da coluna. A quantificação das
espécies separadas por HPLC foi feita pela comparação das áreas dos picos obtidos.
3.5 Microscopia de Força Atômica (MFA).
As amostras foram diluídas em tampão Mês 50 mM KCl 100 mM e então colocadas
diretamente na mica recentemente clivada por 10 minutos num volume de 50 µl. As amostras
foram lavadas 5 vezes com 200 µl de água ultra pura e secaram ao ar livre overnight.Tapping-
mode AFM em ar foi feita usando um Asylum MFP-3D BIO AFM (Asylum Research, Santa
Barbara, CA). Foi usado um Cantilever retangular de silicone da Olympus com freqüência de
ressonância de 70 kHz e com constante de mola de 2 N/m. As amostras foram fotografada
com uma taxa de scaneamento de 0.5-1.0 Hz, e 512 x 512 pixels foram coletados por imagem.
Material e Métodos
38
Pelo menos 3 regiões de cada superfície foram investigadas em cada amostra. O tratamento
das imagens foi feito usando IGOR PRO (Wavemetrics, OR) .
3.6 Microscopia eletrônica de transmissão(MET).
As amostras foram diluídas para concentração final de 1 µM em tampão Mês 50 mM
KCl 100 mM pH 5.0, e foram aderidas a uma grade de filme de carbono, lavadas para
remover o excesso de material e foi contrastado com solução 2% de acetato de uranila
preparado em água. As imagens foram coletadas digitalmente em um microscópio eletrônico
ZEISS EM 900 (Carl Zeis Inc., Alemanha).
3.7 Material biológico
3.7.1 Expressão e purificação de TTR em sistema E. coli.
Todos os plasmídios usados para a transformação de bactérias e posterior purificação
de TTR selvagem e seus mutantes foram gentilmente cedidos pelo Dr. Jeffery Kelly (The
Scripps Research Institute). O protocolo de expressão e purificação encontra-se no Anexo
desta dissertação.
RESULTADOS
Resultados
40
4.
Resultados
4.1- Avaliação do estado de oligomerização do BD-TTR e LD-TTR por
cromatografia líquida de gel filtração (SEC): Efeito do DTT no BD-TTR.
A proteína TTR selvagem (WT-TTR) em sua forma nativa apresenta-se no estado
tetramérico. Tal estado é mantido principalmente por interações fracas, isto é, não covalentes.
Essas interações estão relacionadas à estrutura tridimensional das proteínas o que está
relacionado à sua seqüência de aminoácidos. Como tanto o BD-TTR quanto o LD-TTR são
mutantes construídos, decidimos inicialmente, confirmar o estado tetramérico das duas
proteínas engenheiradas aqui utilizadas, mas, principalmente, avaliar seu estado de
oligomerização na presença de uma agente redutor, o DTT Para isso aplicamos 3,5 µM de
cada uma das proteínas em uma coluna de gel filtração, a Superdex-75.
Conforme observadona Figura 15 (painel A) tanto o BD-TTR (linha azul) quanto o
LD-TTR (linha verde) eluem em 11 minutos nesta coluna, apresentando o mesmo tempo de
retenção que a WT-TTR (linha preta), sugerindo, conforme esperado, que estas proteínas se
encontram no estado tetramérico em solução. Avaliamos também se na presença de DTT
(ditiotreitol), um agente redutor capaz de desfazer as pontes dissulfeto, o BD-TTR continuaria
eluindo como um tetrâmero. Assim, incubamos 3,5 µM de BD-TTR com 10 mM de DTT por
10, 30 ou 60 minutos e avaliamos seu estado oligomérico através da eluição na mesma coluna
de gel filtração (inserto da Figura 15). Em todas as condições testadas, a proteína elui como
um único pico em 11 minutos, sugerindo que, ou a ponte dissulfeto não estaria acessível ao
DTT ou que, as pontes dissulfeto seriam rompidas, mas mesmo assim, o BD-TTR manteria
sua estrutura tetramérica graças a soma das interações fracas entre as subunidades.
Resultados
41
Em gel de poliacrilamida SDS-PAGE, o BD-TTR tratado com DTT forma bandas
correspondentes ao monômero e uma pequena banda relativa ao dímero também pode ser
observada (Figura 15 painel, B). Esse perfil se assemelha ao da proteína selvagem conforme
esperado. Já o LD-TTR, forma uma banda com massa molecular equivalente a um dímero, já
que, devido à presença do segmento que une as subunidades AC e BD, esta proteína jamais
pode ser convertida em monômeros.
Resultados
42
Tempo (min)
0 5 10 15
Intensidade de Fluorescência (u.a.)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Tempo (min)
5 10 15 20
Intensidade de Fluorescência (u. a.)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A
Figura 15 – Cromatografia líquida de gel filtração do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR. (A): (
▬)BD-TTR;
(▬) LD-TTR e (▬) WT-TTR. O BD-TTR e LD-TTR foram diluídos para a concentração final de 3,5 µM,
assim como o WT-TTR. Foram aplicados 250 µL de amostra em cada corrida. A coluna foi equilibrada com
tampão Tris-HCL 10 mM, KCl 100 mM, pH 8.0 num fluxo de 1 mL/min. A eluição foi seguida pela
fluorescência emitida em 330 nm tendo sido a excitação ajustada em 280 nm. (B): Gel SDS-PAGE 15% do LD-
TTR (linha 1), BD-TTR com 10 mM DTT (linha 2) e WT-TTR (linha 3).
WT
-
TTR
BD
-
TTR+
DTT
LD-TTR
Monômero
Dímero
B
Resultados
43
4.2- Comparação da estabilidade do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR em
pH 7.5 a 1ºC frente à dissociação por APH.
Conforme descrito na Introdução, a dissociação-desntauração do BD-TTR e LD-TTR já
havia sido avaliada pelo grupo do Dr. Jeffery Kelly utilizando para tal agentes químicos como
uréia e cloreto de guanidina (FOSS et al., 2005a). Curiosamente, enquanto essas proteínas
foram poucos sensíveis a uréia, o cloreto de guanidina foi muito eficiente desnaturando-as
completamente. Tendo em vista esse comportamento dúbio dos dímeros de TTR, decidimos
utilizar APH para avaliar seu comportamento frente a um agente perturbador de natureza
física.
A estrutura enovelada de uma proteína é altamente dependente da solvatação e da
distribuição de cavidades excluídas de água. Ambos os fatos podem ser explorados usando a
alta pressão hidrostática (SILVA et al., 1992).
Trabalhos anteriores do nosso grupo mostram que a WT-TTR é dissociada pela APH e,
este efeito é mais pronunciado a 1
0
C, devido ao enfraquecimento das interações hidrofóbicas
que ocorre devido ao abaixamento da temperatura (FERRÃO-GONZALES et al., 2003). A
investigação do mecanismo de desenovelamento da TTR em baixas temperaturas é
interessante uma vez que, além de desestabilizar a proteína, a baixa temperatura também
previne a agregação. Sendo assim, avaliamos a estabilidade dos dímeros utilizados frente à
APH. Comparamos também, a estabilidade do BD-TTR na presença ou ausência de DTT. A
quantidade de energia de emissão do triptofano (centro de massa espectral) foi usada como
um sensor das mudanças conformacionais induzidas pela APH (Figura 2 A-D). A partir do
espectro de emissão de fluorescência do triptofano, podemos obter informações sobre o grau
de exposição ao solvente dos resíduos de triptofano e, indiretamente, sobre a estrutura
quaternária-terciária da TTR (LAKOWICZ, 1999; LAI et al., 1996). O pH 7,5 foi escolhido
Resultados
44
por ser o valor em que a TTR está em sua conformação nativa, além de ser o pH do sangue
onde a TTR passa a maior parte de seu tempo.
Os painéis A a D da Figura 16 mostram os espectros de emissão de fluorescência do
triptofano com o incremento da pressão para as quatro proteínas estudadas aqui.
Conforme observado na Figura 16, o centro de massa espectral da WT-TTR
(círculos pretos) apresentou uma variação maior de 440 cm
-1
(Tabela 1), quando sob pressão,
um desvio maior do que o observado para os mutantes estudados aqui. Esta sensibilidade à
APH foi seguida pelo BD-TTR na presença de DTT (círculos vermelhos) e pelo BD-TTR na
ausência de DTT (círculos azuis). O LD-TTR (círculos verdes) não parece ser dissociado pela
APH, nem mesmo a 1
○
C, condição na qual as interações hidrofóbicas estariam sendo
desfavorecidas. Na verdade, este mutante apresenta uma estabilidade similar a do variante
natural da TTR, o T119M, que é o variante mais estável e não amiloidogênico (FERRÃO-
GONZALES et al., 2003).
Conforme observado, o centro de massa do triptofano foi completamente
restabelecido completamente após o retorno à pressão atmosférica para todas as proteínas
(símbolos vazios à esquerda no painel E), sugerindo que o processo de dissociação por
pressão é reversível. A maior estabilidade do BD-TTR na ausência de DTT e do LD-TTR
frente à APH estaria diretamente relacionada às mutações em questão que impedem a
dissociação dos dímeros em monômeros, fazendo com que a ação da APH seja menos
pronunciada.
A partir dos desvios nos valores de centro de massa foi possível calcular a extensão
da reação para cada um dos mutantes ficando mais fácil a comparação da estabilidade dessas
proteínas (Figura 16 F).
Resultados
45
Comprimento de onda (nm)
300 350 400
Intensidade de fluorescência (u. a.)
0
100000
200000
300000
WT-TTR
300 350 400
Intensidade de fluorescência (u. a.)
0
30000
60000
90000
120000
LD-TTR
Comprimento de onda (nm)
300 350 400
BD-TTR + DTT
300 350 400
BD-TTR - DTT
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Extensão da reação (α
α
α
α
)
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
E
F
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Centro de massa espectral (cm
-1
)
28600
28800
29000
29200
29400
A
B
C D
Figura 16 – Comparação da estabilidade frente à APH dos dímeros da TTR a 1
o
C.
Painéis (A) a (D): Espectros de emissão de fluorescência do triptofano em função do aumento da pressão. Painel
(E) Variação do centro de massa espectral do triptofano em função do aumento da pressão em pH 7.5, 1 °C. Os
símbolos vazios a esquerda representam o valor de centro de massa obtido após a liberação da pressão. (F)
Extensão da reação (α) em função da pressão, calculado conforme Equação (3.3). (●) WT-TTR; (
●) BD-TTR
sem DTT; (
●) BD-TTR com DTT e (●) LD-TTR. A concentração final de proteína foi 1 µM em todos os casos.
A excitação foi fixada em 280 nm e a emissão coletada de 300 a 400 nm. A concentração final de DTT foi 10
mM.
A tabela 2 apresenta os valores de centro de massa obtidos à pressão atmosférica
(estado nativo) e sob pressão (estado desnaturado) para as proteínas estudadas nessa
dissertação, bem como os valores de p
1/2
obtidos.
Tabela 2
Centro de massa inicial
(cm
-1
)
Desvio do centro de massa espectral
sob pressão (cm
-1
)
P
1/2
(bar)
WT-TTR 29140 460 1450
BD-TTR na presença de DTT 29110 380 2070
BD-TTR na ausência de DTT 29050 290 2700
LD-TTR 29150 135 ND
p
1/2
=
Valor de pressão quando a extensão da reação é 50%.
Resultados
46
A comparação dos valores de p
1/2
evidencia a maior estabilidade dos mutantes frente
à APH, se comparados com a WT-TTR. Com a adição de DTT, o BD-TTR mostra-se mais
sensível a APH devido à quebra da ponte dissulfeto, evidenciando que a estabilidade
conferida a esse mutante é proveniente da inserção da ponte.
Após o retorno à pressão atmosférica, as proteínas foram aplicadas na coluna de gel
filtração TSK 3000 para verificarmos o estado oligomérico das proteínas após o tratamento
por pressão (Figura 17).Verificamos que todas as proteínas estudadas retornam ao estado
tetramérico.
Resultados
47
WT-TTR
Intensidade de Fluorescência (u. a.)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
BD-TTR - DTT
Tempo (min)
0 5 10 15 20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
LD-TTR
0 5 10 15 20
BD-TTR + DTT
A
B
C
D
Figura 17 – Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR
após um ciclo de pressurização em pH 7.5, 1
0
C. (A) WT-TTR (▬); (B) BD-TTR na presença de DTT (▬);
(C) BD-TTR na ausência de DTT (
▬); (D) LD-TTR (▬).As linhas cheias representam as proteínas antes de um
ciclo de pressão e as linhas tracejadas depois da descompressão. A eluição foi acompanhada pela emissão de
fluorescência em 330 nm com excitação fixa em 280 nm. Concentração de proteína: 1µM; Coluna TSK 3000,
equilibrada com tampão Tris-HCL 10 mm, KCl 100 mm, pH 8.0; Fluxo: 1 mL/min
.
Resultados
48
4.3- Dependência de concentração na dissociação do BD-TTR
induzida por APH.
Oligômeros em geral apresentam uma mudança em sua estabilidade dependente da
concentração de proteína utilizada nos experimentos, enquanto que para monômeros o mesmo
não ocorre (SILVA et al.,2001). A dependência de concentração ocorre devido à lei da ação
das massas. No entanto, vários estudos mostraram a perda de dependência de concentração
para diversos oligômeros estudados (SILVA et al., 1989). Essa perda de dependência de
concentração parece estar relacionada à heterogeneidade das subunidades protéicas, onde cada
subunidade passa a responder ao agente perturbador de forma independente (WEBER et al.,
1993; SUAREZ et al., 2001).
Em estudos anteriores, foi demonstrado que o processo de dissociação/desnaturação
do WT-TTR induzido por APH não apresenta dependência de concentração (FERRÃO-
GONZALES et al., 2003). Dessa forma, resolvemos avaliar como seria o comportamento do
BD-TTR tratado com DTT quanto à dependência de concentração em seu processo de
dissociação/desnaturação induzido por pressão. Para tal, submetemos o BD-TTR a APH na
presença de DTT nas concentrações de 1 µM e 10 µM.
A Figura 18 mostra os valores do centro de massa espectral (painel C) e os valores de
α calculado como descrito na equação 3.3 em Material e Métodos, frente ao incremento da
pressão (painel D). Os painéis (A) e (B) mostram os espectros de triptofano em função do
aumento da pressão, nas concentrações de proteína utilizadas.
Conforme observado, não existe dependência de concentração significativa no
processo de dissociação/desnaturação do BD-TTR com DTT, da mesma forma que descrito
anteriormente para a proteína selvagem. A partir das curvas de extensão da reação (α), é
Resultados
49
possível calcular o p1/2 que foi de 1990 bar, na concentração de 1 µM e 2035 bar para a
concentração de 10 µM.
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Extensão da reação (
α
α
α
α
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
C
D
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Centro de massa espectral (cm
-1
)
28400
28600
28800
29000
29200
Comprimento de onda (nm)
300 350 400
Intensidade de fluorescência (u. a.)
0
40000
80000
120000
1 µ
µµ
µM
Comprimento de onda (nm)
300 350 400
0
50000
100000
150000
10 µ
µµ
µM
A
B
Figura 18 – Avaliação da dependência de concentração do BD-TTR com DTT através da APH. (A) Painéis
(A) e (B): Espectros de emissão de fluorescência do triptofano em função do aumento da pressão. Painel (C)
Variação do centro de massa espectral do triptofano em função do aumento da pressão em pH 7.5, 1
o
C. (D)
Extensão da reação (α) em função da pressão calculado conforme Equação (3.3). (
●) BD-TTR 1 µM com DTT;
(
○) BD-TTR 10 µM com DTT. A excitação foi fixada em 280 nm e a emissão coletada de 300 a 400 nm. A
concentração final de DTT foi 10 mM.
Resultados
50
4.4- Emprego do VBO para avaliar o estado de oligomerização do BD-
TTR e LD-TTR sob APH.
O VBO é um composto fluorescente, análogo sintético do diclofenaco que, assim como
o hormônio tireoidiano pode se ligar ao canal da tiroxina inibindo a agregação da TTR.
Quando ligado ao canal, sua fluorescência é bastante alta, ao passo que livre apresenta
fluorescência diminuída. Dessa forma, o VBO pode ser utilizado como um marcador da
presença de tetrâmeros. Quando o BD-TTR se dissocia, o canal da tiroxina é perdido, ao
contrário do que acontece com o LD-TTR, que dissocia em dímeros, mantendo as
subunidades AC e BD juntas e, por conseguinte o canal formado. Sendo assim, se o BD-TTR
dissocia o VBO passa a estar livre, tendo sua fluorescência diminuída.
Inicialmente, avaliamos se havia diferenças na ligação de VBO nos tetrâmeros
nativos das proteínas aqui estudadas (Figura 19). Para esse experimento realizamos uma curva
de saturação para o VBO. Podemos observar que há diferenças na ligação de VBO, onde o
BD-TTR parece ligar menos VBO que a WT-TTR, seja na ausência, seja na presença de DTT.
Curiosamente, o LD-TTR liga pouco VBO, o que pode ser explicado pela presença do
peptídeo que liga os monômeros AC e BD que pode estar obstruindo o acesso do composto ao
canal da tiroxina. Entretanto, não conseguimos explicar porque o BD-TTR apresentou menos
ligação a este composto e estudos adicionais se fazem necessários para saber se a introdução
da ponte dissulfeto de alguma forma deforma o canal de tiroxina.
Resultados
51
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
WT-TTR
BD-TT R - DTT
BD-TT R + DT T
LD-TT R
Intensidade de Fluorescência (u. a.)
Figura 19-Ligação de VBO ao BD-TTR, LD-TTT e WT-TTR a pressão atmosférica.
(■) WT-TTR; (
■) BD-TTR sem DTT; BD-TTR com DTT (■) e (■) LD-TTR. A concentração de proteína foi 2
µM e a de VBO 5 µM em todos os casos. O pH utilizado foi 7.5 e a temperatura 25°C. A excitação foi fixada em
320 nm e a emissão foi coletada de 440 a 600 nm. A concentração final de DTT foi 10 mM. O experimento foi
feito a pressão atmosférica.
A Figura 20 mostra os espectros de emissão do VBO frente ao incremento da pressão
(painéis A-D) para as proteínas aqui estudadas. As áreas desses espectros foram calculadas
para cada valor de pressão e estão expressas no painel E ou normalizadas para porcentagem
de tetrâmeros no painel F. Observamos que, no caso da WT-TTR (círculos pretos), a
fluorescência do VBO diminui cerca de 50% com o aumento da APH, sugerindo que está
havendo dissociação de parte dos tetrâmeros em monômeros e, por conseguinte, o canal da
tiroxina está sendo desfeito. No entanto, a variação da intensidade de fluorescência do VBO
com o incremento da pressão foi bem menor para os mutantes do que a observada para a WT-
TTR. Na verdade, mesmo o BD-TTR na presença de DTT parece ligar uma grande
quantidade de VBO sob pressão e, segundo nossa estimativa, existiriam cerca de 85% de
tetrâmeros sob pressão (painel F). Sem DTT não houve mudanças no sinal do VBO sob
pressão. O cálculo da porcentagem de tetrâmeros para o LD-TTR (círculos verdes) mostrou
uma pequena redução, no entanto, essa análise pode estar comprometida pela baixa ligação
que esse mutante apresenta ao VBO quando na forma nativa (painel D e Figura 20). De certa
forma, esperávamos observar um comportamento mais definido para esta sonda, o que não foi
Resultados
52
observado. Esses experimentos foram repetidos mais de três vezes e esse mesmo perfil foi
sempre observado.
450 500 550 600
0
4000
8000
12000
16000
WT-TTR
450 500 550 600
Intensidade de fluorescência (a. u.)
0
20000
40000
60000
BD-TTR - DTT
Comprimento de onda (nm)
450 500 550 600
0
20000
40000
60000
LD-TTR
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Área do espectro (u. a.)
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
% de Tetrâmero
40
60
80
100
120
140
A
C
D
E
F
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
450 500 550 600
10000
20000
30000
40000
BD-TTR + DTT
B
Figura 20- Avaliação das espécies formadas sob APH através da ligação de VBO.
Os painéis (A) a (D) mostram os espectros de VBO para todas as proteínas em função da pressão. O painel (E)
mostra a área do espectro de emissão de fluorescência do VBO e painel (F) mostra a porcentagem de tetrâmero.
Condições: (●) WT-TTR; (
●) BD-TTR sem DTT; (●) BD-TTR com DTT e (●) LD-TTR. A concentração de
proteína foi 2 µM e a de VBO 5 µM em todos os casos. O pH utilizado foi 7.5 e a temperatura 1
0
C. A excitação
foi fixada em 320 nm e a emissão foi coletada de 440 a 600 nm. A concentração final de DTT foi 10 mM.
Resultados
53
Uma vez que os dados com VBO não foram exatamente como esperado, nos
perguntamos se esse composto poderia estar estabilizando as proteínas e, com isso, impedindo
sua dissociação. Para tal, resolvemos acompanha a emissão de fluorescência intrínseca dos
triptofanos das proteínas em questão na presença do VBO (Figura 21, painéis A a D) com o
emprego da alta pressão. A partir destes espectros, calculamos os valores de centro de massa
espectral em cada valor de pressão (Figura 21 painel E) a fim de compararmos a estabilidade
destas proteínas frente à APH na presença desse composto e na sua ausência (Figura 16). Ao
analisarmos os dados da Figura 21, primeiramente observamos que o LD-TTR (círculos
verdes) apresenta um perfil de variação de centro de massa espectral muito similar na
presença ou na ausência de VBO (ver painel E da Figura 16, símbolos verdes), sugerindo,
mais uma vez, que o VBO parece não estar se ligando satisfatoriamente a esta proteína devido
ao impedimento estérico causado pelo peptídeo inserido. No caso da WT-TTR (círculos
pretos), apesar de termos verificado que a alta pressão parece ser capaz de deslocar o VBO do
canal da tiroxina resultando na diminuição da emissão de fluorescência deste composto
(painéis E e F da Figura 20), observamos que ainda assim ocorre uma estabilização da
proteína na presença do VBO, já que o centro de massa do triptofano variou apenas 80 cm
-1
na presença do VBO (painel F), ao passo que na sua ausência essa variação foi de 460 cm
-1
(Figura 16 e Tabela 2). Para o BD-TTR sem DTT (símbolos azuis), percebemos que a droga
também foi capaz de estabilizar a proteína e o centro de massa também não se alterou sob
pressão. Esse dado vem ao encontro dos dados de VBO que mostram que a fluorescência
dessa sonda se mantém elevada sob pressão sugerindo existência de tetrâmeros (Figura 20).
No caso do BD-TTR com DTT, observamos um desvio de 240cm
-1
na presença de VBO e
380 cm-1 na ausência. Isso sugere que o VBO estabiliza essa proteína levemente, porém,
surpreendentemente, se mantém ligado à mesma sob pressão.
Resultados
54
WT-TTR
Comprimento de onda (nm)
300 350 400
Intensidade de fluorescência (u. a.)
0
40000
80000
120000
160000
300 350 400
0
40000
80000
300 350 400
0
10000
20000
30000
40000
BD-TTR - DTT
LD-TTR
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Centro de massa espectral (cm
-1
)
28800
28850
28900
28950
29000
29050
29100
29150
29200
Pressão (bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
∆
CM (cm
-1
)
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
A
F
B
D
E
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
BD-TTR + DTT
300 350 400
0
50000
100000
150000
C
Comprimento de onda (nm)
Figura 21-Influência no desvio de centro de massa espectral do BD-TTR e LD-TTR pela ligação de VBO.
Painéis (A) a (D): Espectros de emissão de fluorescência do triptofano em função do aumento da pressão. Painel
(E) Variação do centro de massa espectral do triptofano em função do aumento da pressão em pH 7.5, 1
o
C. (F)
Extensão da reação (α) em função da pressão calculado conforme Equação (3.3). (●) WT-TTR; (
●) BD-TTR
sem DTT; (
●) BD-TTR com DTT e (●) LD-TTR. A concentração final de proteína foi 1 µM em todos os casos.
A excitação foi fixada em 280 nm e a emissão coletada de 300 a 400 nm. A concentração final de DTT foi 10
mM.
Resultados
55
4.5- Caracterização da espécie formada sob APH através da ligação de
bis- ANS ao BD-TTR e LD-TTR.
A ligação de ANS e bis-ANS tem sido utilizada para identificar a presença de
intermediários de enovelamento uma vez que esses intermediários, por ainda possuírem
resquícios de estrutura terciária, são capazes de se ligarem a essas sondas resultando num
grande aumento de sua fluorescência. Estruturas protéicas desenoveladas não ligam ANS ou
bis-ANS e isso nos permite discernir esses dois estados protéicos, ou seja, o estado
intermediário e o estado desenovelado. Dessa forma, realizamos experimentos na presença de
bis-ANS para avaliar a persistência de contatos terciários, quando sob pressão.
A transtirretina liga bis-ANS na forma nativa no canal de tiroxina (Figure 22 A-D)
(NILSSON et al., 1975; LAI et al., 1996).
A ligação de ANS tem sido inclusive, utilizada para
medir a afinidade da proteína a esse hormônio.
A Figura 22 (A-F) mostra a variação da ligação de bis-ANS quando a WT-TTR e os
mutantes construídos são submetidos à alta pressão. Conforme observado, a ligação de bis-
ANS foi mais pronunciada para a WT-TTR (símbolos pretos) e para o BD-TTR tratado com
DTT (símbolos vermelhos) onde se nota um aumento de três vezes na ligação a bis-ANS
quando na pressão máxima. Esses dados sugerem que, tanto a WT-TTR, quanto o BD-TTR
quando tratado com DTT adotam uma conformação parcialmente desenovelada que retém
parte da estrutura terciária capaz de alojar o bis-ANS.
Podemos verificar que tanto para o BD-TTR sem DTT como para o LD-TTR não houve
aumento na ligação a esta sonda sob pressão. Na verdade, observamos uma queda até
aproximadamente 1.000 bar na ligação de bis-ANS que poderia significar a saída do bis-ANS
do canal da tiroxina, que estaria sendo perturbado pela pressão. Já em pressões mais altas,
observa-se um discreto aumento na ligação de bis-ANS, indicando que a proteína não está
Resultados
56
assumindo uma conformação completamente desenovelada, mas, certamente, a presença da
ponte dissulfeto no BD-TTR e a ligação das subunidades AC e BD no LD-TTR impedem que
estas proteínas assumam a conformação de intermediário observada no WT-TTR ou no BD-
TTR quando na presença de DTT. Na verdade, podemos observar na Figura 8-F que, a
exceção da WT-TTR, todos os mutantes apresentaram um desligamento do bis-ANS em
pressões baixas que se manifesta pela queda em sua fluorescência e isto pode ser atribuído ao
efeito da pressão no canal da tiroxina.
A
esquerda da Figura 22, painel E estão mostrados os sinais de fluorescência do bis-
ANS após descompressão mostrando que, embora não tenha havido completo retorno a
posição incial, os valores observados foram próximos sugerindo que o processo seria
reversível.
Resultados
57
Pressao( bar)
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Área do espectro (u. a.)
0
20000000
40000000
60000000
80000000
100000000
120000000
Pressão ( bar)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
A/A
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
BD-TTR + DTT
400 450 500 550 600
BD-TTR - DTT
400 450 500 550 600
LD-TTR
400 450 500 550 600
0
300000
600000
900000
WT-TTR
400 450 500 550 600
Intensidade de fluorescencia (u. a.)
0
100000
200000
300000
A B C
D
E F
Comprimento de onda (nm)
Comprimento de onda (nm)
Figura 22- Ligação de bis-ANS sob pressão: Caracterização da presença de intermediários nos variantes
da TTR em pH 7.5 a 1
o
C. Painéis (A) a (D): espectros de bis-ANS em função do aumento da pressão. (E e F)
(●) WT-TTR; (
●) BD-TTR sem DTT; (●) BD-TTR com DTT e (●) LD-TTR. A concentração de proteína foi 1
µM e a de bis-ANS 10 µM em todos os casos. A excitação foi fixada em 360 nm e a emissão foi coletada de 400
a 600 nm. A área de cada espectro de bis-ANS foi dividida pela área inicial a pressão atmosférica (A/A
0
). A
concentração final de DTT foi 10 mM.
Resultados
58
4.6- Estudos de agregação com os dímeros engenheirados da TTR.
Uma das principais características da TTR, que a levou a ser estudada intensamente
nos últimos anos é a sua capacidade de agregar, resultando na formação de fibras amilóides
que estão presentes em amiloidoses causadas pela TTR (GUSTAVSSON et al., 1991). Com
isso, inúmeros trabalhos vêm sendo realizados no sentido de determinar o papel de fatores que
interferem na cinética de agregação do WT-TTR, bem como de seus diversos variantes.
Alguns dos fatores já investigados são a temperatura, o pH, ligantes que potencializam ou
inibem a agregação, a alta pressão hidrostática, constituintes da membrana basal, entre outros
(MIRROY et al., 1996; KLABUNDE et al., 2000; FERRÃO-GONZALES et al., 2000;
JIANG et al., 2001; WHITE et al., 2001; SAWABE et al., 2003).
Conforme mencionado na literatura, a hipótese mais aceita para explicar a agregação
da TTR pressupõe a formação de um intermediário monomérico amiloidogênico (COLON et
al, 1992; WETZEL, 1994; LAI et al. 1996; KELLY, 1997), como mostrado na Figura 8 da
introdução. No caso da WT-TTR, a agregação é bastante maciça em pHs próximos a 4,0, um
pouco abaixo do lisosomal (próximo de 5,0). Além disso, in vitro em pH 5,0, o WT-TTR
agrega pouco, o que seria um contraponto à hipótese da via lisossomal como sítio para o
início da agregação da TTR. Entretanto, trabalhos do nosso grupo mostram que o tratamento
com APH em pHs entre 5,0 e 5,5 converte a WT-TTR num intermediário amiloidogênico
tetramérico denominado T
4
*, que apresenta grande tendência a formar fibras amilóides
(FERRÃO- GONZALES et al., 2000).
Sendo assim, resolvemos verificar se os mutantes utilizados por nós neste trabalho
agregariam nas mesmas condições que a WT-TTR, seja pela incubação em condições ácidas,
seja após o tratamento com APH. Cabe ressaltar que o grupo do Dr. Kelly, que caracterizou a
Resultados
59
dissociação-denaturação do BD-TTR e LD-TTR, não investigou suas propriedades
amiloidogênicas (FOSS et al., 2005a; FOSS et al., 2005b).
Para avaliarmos o efeito do pH na agregação dos dímeros engenheirados da TTR,
incubamos 3,5 µM do WT-TTR, LD-TTR ou BD-TTR na presença ou ausência de DTT à
pressão atmosférica nos pHs 2.6, 3.0, 3.8, 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 6.2, 6.6 e 7.0 por até 96 horas a
37°C (Figura 23). Em determinados intervalos de tempo, a D.O. em 330 nm foi medida para
avaliarmos a extensão da agregação de cada proteína.
Resultados
60
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
W T -TTR
1
2
3
4 5
54
3
3
3
3
3
3
3
3 3
4
4
4
4
4
4
4 4
5
5
5
5
5
5
5
5
2
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1 1
1
2
A
2,6
3,0 3,8 4,2
4,6
5,0 5,4 6,2 6,6
7,0
Turbidez (330 nm)
p H
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
3
5
2
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
4
5
4
4
4
5
B D -TT R + D TT
B
2,6
3,0 3,8 4,2
4,6
5,0 5,4 6,2 6,6
7,0
Turbidez (330 nm)
p H
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4 5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3 4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
BD-TTR - DTT
C
2,6
3,0 3,8 4,2
4,6
5,0 5,4 6,2 6,6
7,0
Turbidez (330 nm)
pH
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3
4
5
2
1
3 4
5
2
1
3
4
5
21
3
4
5
2
1 3
4 5
2
1
3
4
5
21
3
4
5
21
LD-TTR
D
2,6
3,0 3,8 4,2
4,6
5,0 5,4 6,2 6,6
7,0
Turbidez (330 nm)
pH
Figura 23- Desnaturação ácida do BD-TTR, LD-TTR e WT-TTR em diferentes tempos de incubação a 37°
°°
°
C. As amostras foram incubadas a pressão atmosférica a 37°C em diferentes tempos e pHs. Os números em cima
das barras representam os diferentes tempos de incubação: (1) 0 h; (2) 24 h; (3) 48 h; (4) 72 h; (5) 96 h. Foram
testados os seguintes pHs
: ▄ pH 2.6; ▄ pH 3.0; ▄ pH 3.8; ▄ pH 4.2; ▄ pH 4.6; ▄ pH 5.0; ▄ pH 5.4; ▄ pH 6.2; ▄
pH 6.6;
▄ pH 7.0. A concentração final de proteína foi 3,5 µM. A turbidez foi acompanhada em 330 nm.
Resultados
61
Nos painéis A, B, C e D, estão representados os dados do aumento de turbidez para a
WT-TTR, BD-TTR tratado com DTT, BD-TTR na ausência DTT e LD-TTR,
respectivamente. Como podemos verificar, a WT-TTR (painel A) tem sua agregação mais
acentuada nos pHs 3.8 e 4.2, assim como o BD-TTR tratado com DTT (painel B), que
apresentou um comportamento muito semelhante ao da proteína WT, como esperado. Foi
interessante observar neste experimento que o BD-TTR foi capaz de agregar mesmo na
ausência de DTT, quando incubado nos pHs 3,8 e 4,2 (painel C). O BD-TTR incubado em
condições ácidas na ausência de DTT é convertido nos dímeros AB e CD que são capazes de
agregar, o que indica que não é necessária a formação de monômeros isolados para se
deflagar a agregação da TTR. Dessa forma, essa espécie dimérica capaz de agregar em
condições ácidas também seria um intermediário amiloidogênico na rota de dissociação e
agregação da TTR, o que amplia o modelo vigente proposto para a agregação dessa proteína.
O LD-TTR não agregou em nenhum dos pHs testados (painel D), embora
acreditemos que em pHs ácidos essa proteína deva se dissociar nos dímeros AC e BD, que,
muito provavelmente, devido a sua arquitetura, não devem ser capazes de serem incorporados
na fibra amilóide.
Com o intuito de melhor caracterizarmos a espécie presente em pHs ácidos, avaliamos a
ligação de bis-ANS em diferentes pHs à pressão atmosférica (Figura 24). Para tal, as proteínas
foram incubadas por 10 minutos em cada pH a 25°C. Esta temperatura foi utilizada para evitar
a agregação e a ausência de mudanças nos valores de espalhamento de luz foi verificada
nestas condições.
A Figura 24 mostra os espectros de emissão de fluorescência do bis-ANS ligado às
proteínas BD-TTR na presença de DTT (painel A), BD-TTR na ausência de DTT (painel B) e
LD-TTR (painel C). O painel D mostra os valores de área dos espectros de bis-ANS em cada
pH normalizados pelo valor da área do espectro de bis-ANS em pH 7.0, para cada proteína.
Resultados
62
Como podemos observar por esses dados, a WT-TTR liga bastante bis-ANS em pHs
abaixo de 5,0 e de forma bastante acentuada em pHs mais ácidos ainda (símbolos pretos do
painel D). O BD-TTR tratado com DTT segue o mesmo perfil da proteína selvagem (símbolos
vermelhos do painel D), embora a ligação ao bis-ANS não tenha sido tão pronunciada. Isso
indica que em pHs ácidos a proteína dissocia e forma monômeros parcialmente enovelados
capazes de ligar bis-ANS. Já o BD-TTR sem DTT apresenta um aumento discreto na ligação
de bis-ANS em pHs abaixo de 4.2 (veja inserto do painel E) indicando, mais uma vez, que a
manutenção da ponte dissulfeto impede a formação do intermediário. Porém, o LD-TTR
mostrou uma ligação muito baixa de bis-ANS, mesmo em pHs mais baixos. Esse dado sugere
que o LD-TTR não está sofrendo desnaturação ácida, e isso se deveria a alta estabilidade da
sua estrutura, que é conferida pela inserção do peptídeo entre os monômeros AC e BD.
Resultados
63
400 450 500 550 600
Intensidade de Fluorescência (u. a.)
Comprimento de onda (nm)
400 450 500 550 600400 450 500 550 600
0
40000
80000
LD-TTRBD-TTR - DTTBD-TTR + DTT
pH
2 3 4 5 6 7 8
A\A
0
0
20
40
60
80
100
120
B
C
D
A
pH
2 3 4 5 6 7
A\A
0
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
Acidificação
Figura 24- Caracterização de intermediários formados pela acidificação pela ligação de bis-ANS. As
proteínas foram incubadas a 25° C a pressão atmosférica NOS PHS INDICADOS. (●) WT-TTR; (
●) BD-TTR
sem DTT; (
●) BD-TTR com DTT e (●) LD-TTR. Inset: (●) BD-TTR sem DTT e (●) LD-TTR. Painéis (A) a
(C): espectros de bis-ANS em função Da diminuição do pH. A concentração de proteína foi 3.5 µM e de bis-
ANS 35 µM em todos os casos. A excitação foi fixada em 360 nm e a emissão foi coletada de 400 a 600 nm. A
área de cada espectro de bis-ANS foi dividido pela área em pH 7.0 (A/A
0
). A concentração final de DTT foi 10
mM.
Resultados
64
Em seguida, decidimos avaliar se o tratamento com a APH modificaria o perfil de
agregação desses mutantes, uma vez que já foi visto pelo nosso grupo e citado anteriormente,
que a WT-TTR tem sua cinética de agregação após tratamento com APH (FERRÃO-
GONZALES et al., 2003).
Para tal, submetemos o WT-TTR, LD-TTR e o BD-TTR na presença ou ausência de
DTT a 3.000 bar por uma hora a 37
o
C na concentração de 3,5 µM, pH 5,0. Após esta etapa, as
amostras foram descomprimidas e o espalhamento de luz monitorado ao longo do tempo a 37
o
C (Figura 25, painel A). O pH 5,0 foi escolhido para os nossos experimentos de agregação
por ser o pH encontrado em lisossomas onde, acredita-se, inicia-se a agregação da TTR e por
ser a faixa de pH onde ocorre o rearranjo estrutural que geraria o intermediário
amiloidogênico, seja ele um monômero ou tetrâmero modificado. Como controle, incubamos
as mesmas amostras a pressão atmosférica no mesmo pH e temperatura e o espalhamento de
luz foi acompanhado ao longo do tempo (Figura 25 B-E, símbolos vazios).
Para tal, submetemos o WT-TTR, LD-TTR e o BD-TTR na presença ou ausência de
DTT a 3.000 bar por uma hora a 37
o
C na concentração de 3,5 µM, pH 5,0. Após esta etapa, as
amostras foram descomprimidas e o espalhamento de luz monitorado ao longo do tempo a 37
o
C (Figura 25, painel A). O pH 5,0 foi escolhido para os nossos experimentos de agregação
por ser o pH encontrado em lisossomas onde, acredita-se, inicia-se a agregação da TTR e por
ser a faixa de pH onde ocorre o rearranjo estrutural que geraria o intermediário
amiloidogênico, seja ele um monômero ou tetrâmero modificado. Como controle, incubamos
as mesmas amostras a pressão atmosférica no mesmo pH e temperatura e o espalhamento de
luz foi acompanhado ao longo do tempo (Figura 25 B-E, símbolos vazios).
Conforme observado, após a descompressão, o WT-TTR mostrou aumento do
espalhamento de luz de cerca de 5 vezes, sugerindo agregação, conforme reportado
anteriormente FERRÃO-GONZALES et al., 2003). A amostra de WT-TTR que permaneceu
Resultados
65
a pressão atmosférica em pH 5.0 pelo mesmo tempo (~ 20 min), não apresenta agregação,
sugerindo que é a alta pressão que transforma a proteína numa espécie amiloidogênica (painel
B).
O BD-TTR na presença de DTT também foi capaz de agregar após o tratamento com
APH, com uma cinética semelhante a do WT-TTR. A pressão atmosférica, quando nessas
condições, essa proteína não foi capaz de agregar (painel D). O LD-TTR não apresentou
agregação após descompressão, assim como a pressão atmosférica (painel C), o que indica
que esse dímero não seria capaz de formar o intermediário amiloidogênico que levaria à
formação das fibras amilóides.
Surpreendentemente, o BD-TTR na ausência de DTT foi capaz de agregar em menos
de 20-30 min (painel A) após ciclo de compressão-descompressão, assim como foi observado
na agregação induzida por pH ácido (Figura 23) após dias de incubação, indicando que a
presença da ponte dissulfeto não impede a formação do intermediário amiloidogênico, que,
neste caso, pode ser um dímero ou um tetrâmero modificado T
4
* (FERRÃO- GONZALES et
al., 2000). Isso confirma os dados de agregação em baixo pH onde sugerimos a existência de
alguma outra espécie presente na rota de agregação da TTR, muito provavelmente um dímero
alterado ou mesmo um tetrâmero, capaz de agregar. Tal resultado reforça a necessidade da
revisão da rota vigente que explica a agregação da TTR.
Resultados
66
Tempo (minutos)
0 20 40 60
Tempo (minutos)
0 10 20 30 40 50 60
(EL/EL
0
)
0
4
8
12
16
(EL/EL
0
)
0
4
8
12
16
CB
WT-TTR
BD-TTR + DTT
BD-TTR - DTT
D
LD-TTR
E
Tempo (minutos)
0 10 20 30 40 50 60
(EL/EL
0
)
0
2
4
6
8
10
12
14
A
Figura 25 - A APH induz a agregação dos variantes da TTR. As proteínas foram submetidas a 3000 bar
durante 60 minutos a 37° C e pH 5.0. Após a liberação da pressão o espalhamento de luz (EL) foi medido e
normalizado pelos valores iniciais (EL/EL
0
). Painel (A): (•) WT-TTR; (•) BD-TTR
sem DTT; (•) BD-TTR
com
DTT e (
•) LD-TTR. Para comparação a agregação a pressão atmosférica dos variantes da TTR nas mesmas
condições de temperatura e pH, está mostrado nos painéis (B), (C), (D) e (E) os símbolos cheios representam a
agregação a pressão atmosférica, e os símbolos vazios a agregação após o tratamento com APH. As cores de
cada mutante foram mantidas como no painel (A). A concentração de proteína usada foi de 3.5 µM. O EL foi
medido excitando as amostras em 320 nm e coletando a emissão de 315 a 325 nm. A concentração final de DTT
foi 10 mM.
Resultados
67
A fim de caracterizarmos se os agregados formados pelo BD-TTR com e sem DTT
teriam características amilóides, utilizamos um método tintorial de identificação específica
para fibras amilóides, ou seja, a sonda fluorescente tioflavina T (ThT). Para tal, fizemos um
experimento similar ao mostrado na Figura 25, porém incubamos as amostras de BD-TTR na
presença e ausência de DTT, na concentração de 3,5µM em pH 5,0 a 37ºC com a sonda ThT
na concentração final de 50 µM. É descrito na literatura que a presença de ThT nestes ensaios
não altera as cinéticas de agregação (KREBS et al., 2005). Ainda assim acompanhamos
conjuntamente a fluorescência da ThT e o espalhamento de luz após a liberação da pressão.
Conforme visto na Figura 26, o aumento do espalhamento de luz (símbolos cheios) é
acompanhado de um aumento da fluorescência de ThT (símbolos vazios) na agregação do
BD-TTR com e sem DTT, assim como para WT-TTR. Esses dados sugerem que os agregados
formados possuem características amilóides e reforçam a idéia de que o BD-TTR é capaz de
formar fibras amilóides após o tratamento por APH.
Tempo (min)
0 10 20 30
Flu ThT / Flu ThT
0
(u.a)
0
2
4
6
8
10
12
Tempo (min)
0 10 20 30
EL / EL
0
(u.a.)
0
2
4
6
8
10
12
Tempo (min)
0 10 20 30
A
B
C
WT-TTR
BD-TTR + DTT
BD-TTR - DTT
Figura 26- A APH induz a formação de fibras pelo BD-TTR. As proteínas foram submetidas a um ciclo de
pressurização de 3000 bar por 60 minutos a 37
0
C, pH 5.0. (A) BD-TTR sem DTT (•) medida do espalhamento
de luz e (
○) Ligação de ThT; Painel (B) BD-TTR com DTT (•) medida do espalhamento de luz e(○) ligação de
ThT; Painel (C) WT-TTR (•) medida do espalhamento de luz e (○) ligação de ThT. As proteínas foram
pressurizadas na presença de 50 µM de ThT e a intensidade de fluorescência foi medida com excitação fixa em
450 nm e a emissão coletada de 440 a 600 nm. Os valores de áreas dos espectros foram normalizados pelos
valores iniciais. Para comparação, após a liberação da pressão o espalhamento de luz (EL) foi medido e
normalizado pelos valores iniciais (EL/EL
0
). A concentração de proteína usada foi de 3.5 µM. O EL foi medido
excitando as amostras em 320 nm e coletando a emissão de 315 a 325 nm. A concentração final de DTT foi 10
mM.
Resultados
68
Decidimos então, verificar se, além das fibras amilóides, outros agregados também
estariam presentes nas amostras submetidas à pressão. Para tal, utilizamos gel filtração e a
coluna GPC 300, pois essa coluna é ideal para caracterização de proteínas com peso
molecular maior.
A Figura 27 mostra os cromatogramas das espécies agregadas após o tratamento por
pressão para a WT-TTR (painel A), BD-TTR na presença de DTT (painel B) e na ausência de
DTT (painel C). Como controle, incubamos essas mesmas proteínas por 2 h em pH 5.0 na
mesma concentração e temperatura (linhas cheias na Figura 27).
Observamos que, após o tratamento com APH, a WT-TTR e o BD-TTR tratado ou
não com DTT, apresentam um pico majoritário em 8.5 minutos que é compatível com o peso
do tetrâmero da TTR. Curiosamente, nota-se a presença de um novo pico bastante alargado,
em torno de 5.6 minutos, que seria compatível com a presença de oligômeros maiores que o
tetrâmero e que são formados após descompressão das amostras. Esse pico é, inclusive, mais
proeminente na amostra de BD-TTR na ausência de DTT. Cabe ressaltar que, as amostras que
ficaram incubadas a pressão atmosférica em pH 5.0 por 2 horas não apresentam tal pico em
tempos menores (linhas cheias), sugerindo que não houve agregação nessas condições.
Resultados
69
0 5 10 15
Intensidade de fluorescência (u. a.)
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Tempo (min)
0 5 10 15
0 5 10 15
A
B C
WT-TTR
BD-TTR + DTT
BD-TTR - DTT
Figura 27 - Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular do BD-TTR após um ciclo de
pressurização em pH 5.0, 37
0
C. As proteínas foram submetidas a 3000 bar durante 60 minutos a 37
0
C, pH 5.0.
Após a descompressão as amostras foram incubadas por mais 60 minutos a 37
0
C e injetadas no HPLC. O
controle corresponde a proteína incubada em pH 5.0 a 37
0
C, por 2 h sem tratamento com pressão, que estão
representadas pelas linhas cheias. As linhas tracejadas representam a proteína depois da pressão. Painel (A) WT-
TTR (▬); Painel (B) BD-TTR com DTT (
▬); Painel (C) BD-TTR sem DTT (▬). A eluição foi acompanhada
pela emissão de fluorescência atavés da da excitação em 280 nm e coletando a emissão em 330 nm. Foram
aplicados 50 µl de amostra a 3,5 µM numa coluna GPC 300. A coluna foi equilibrada com tampão Tris-HCl 10
mm, KCl 100 mm, pH 8.0, num fluxo de 0.3 mL/min.
Com o objetivo de identificar qual espécie oligomérica estaria sendo formada após o
tratamento por APH e que estaria servindo de matéria prima para a formação das fibras
amilóides, pressurizamos o BD-TTR e o LD-TTR em pH 5.0, porém, desta vez, a 1°C, já que
nessa temperatura a taxa de agregação é nula. Sendo assim aplicamos as amostras
imediatamente após serem retiradas da pressão na coluna GPC 300.
Na figura 28, podemos verificar que, após um ciclo de compressão-descompressão a
1°C, a WT-TTR (painel A) apresenta dois picos distintos, um deles compatível com o tempo
de eluição do tetrâmero (8.5 min) e outro em torno de 12 min compatível com o tempo de
eluição do monômero da TTR (12 min). Isto sugere que após-descompressão, temos a
presença de monômeros e tetrâmeros, sendo que os primeiros são formados sob pressão
persistindo após descompressão. O BD-TTR tratado com DTT (painel B) também apresenta
dois picos distintos após descompressão a 1°C, um dos quais mais proeminente, compatível
com a presença de tetrâmeros e outro mais alargado que elui no tempo do monômero. Nesse
Resultados
70
painel A também está mostrado para comparação o perfil de eluição do M-TTR, um mutante
monomérico da TTR que jamais tetrameriza.
Já o BD-TTR sem DTT (painel C), após descompressão, não apresenta dois picos
muito bem definidos, mas sim observamos a presença de um grande ombro eluindo de 8 a 14
min que sugere a presença de uma população heterogênea composta por tetrâmeros e dimeros.
Para ajudar nossa análise, injetamos na coluna um outro variante da TTR, S122I, que forma
dímeros em solução. Este mutante foi detectado em uma família japonesa e é causador de um
tipo de amiloidose sensorial e motora (MATSUBARA et al., 2005). Verificamos no painel C
da Figura 28 (linha preta) que o tempo de eluição desse dímero (9.4 min) se sobrepõe a uma
parte do pico alargado formado pelo BD-TTR após o tratamento com APH sem DTT,
sugerindo que existam diferentes populações oligoméricas presentes nessa amostra, sendo a
principal delas, os dímeros. Este resultado é interessante já que, juntamente com os dados de
agregação desta proteína (Figuras 25), reforça a proposta de que é possível ocorrer a
agregação da TTR a partir de um intermediário dimérico. O LD-TTR se apresenta na forma
tetramérica mesmo após o tratamento com APH, indicando que, ou o processo de
desnaturação por pressão é totalmente reversível para esta proteína ou que a APH não é capaz
de dissociar esse mutante. Os dados anteriores sugerem que mais provavelmente a segunda
possibilidade seja a mais plausível.
Resultados
71
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Intensidade de fluorescência ( u. a.)
Tempo (min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0
10000
20000
30000
40000
0
10000
20000
30000
40000
A B
C
D
WT-TTR BD-TTR + DTT
BD-TTR - DTT
LD-TTR
M-TTR
S122I
Figura 28-Cromatografia líquida de exclusão por peso molecular da TTR após um ciclo de pressurização
em pH 5.0 a 1
0
C.
As proteínas foram submetidas a 3000 bar durante 60 minutos a 1
0
C, pH 5.0. Após a descompressão as amostras
foram injetadas imediatamente no HPLC. As linhas cheias representam as proteínas antes da pressão e as linhas
tracejadas depois da pressão. Painel (A) WT-TTR (▬) e M-TTR (
▬); (B) BD-TTR com DTT (▬); (C) BD-
TTR sem DTT (
▬) e S122I-TTR (▬); (D) LD-TTR (▬). As setas indicam o tempo de eluição do monômero da
TTR. A eluição foi seguida setando a excitação em 280 nm e coletando a emissão em 330 nm. Foram aplicados
50 µl de amostra a 3,5 µM numa coluna GPC 300. A coluna foi equilibrada com tampão Tris-HCl 10 mm, KCl
100 mm, pH 8.0, num fluxo de 0.3 mL/min.
Resultados
72
4.7- Análise morfológica dos agregados formados pelo mutante BD-
TTR.
A fim de melhor caracterizar os agregados formados pelo BD-TTR após um ciclo de
pressão em pH 5.0 a 37°C, utilizamos microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de
força atômica (MFA). Para isso, as amostras tratadas por pressão nessas condições foram
contrastadas negativamente com acetato de uranila 2% em uma grade de carbono ou
adsorvidas na mica, respectivamente. Os painéis de A a C da Figura 15 apresentam as
microscopias eletrônicas e os painéis D a F as MFA. Conforme podemos observar na Figura
29 (A-C), onde mostramos as imagens observadas com aumentos de 20.000 (painel A),
30.000 (painel B) ou 50.000 vezes (painel C), os agregados formados após o tratamento por
APH são largos e irregulares e não observamos a formação de fibras amilóides maduras
nessas condições.
O painel D mostra a imagem de força atômica da proteína nativa antes da pressão,
onde percebemos a presença de formações arredondadas que representariam os tetrâmeros da
TTR. Nas amostras, recuperadas de um ciclo de pressão-descompressão novamente
observamos a presença de agregados que apresentam uma tendência linear, porém sem
aspecto fibrilar típico. Como esses agregados ligam Thioflavina T (Figura 26), acreditamos
que eles sejam ricos em folhas-β e podem representar os oligômeros precursores da formação
das fibras maduras por esse mutante.
Resultados
73
Figura 29 – Microscopia eletrônica de transmissão e MFA do BD-TRR sem DTT após um ciclo de
pressurização em pH 5.0, 37
0
C. Três e meio µM do BD-TTR sem DTT foi submetido a 3000 bar durante 60
minutos a 37°
C, pH 5.0. Após a descompressão a amostra foi incubada por mais 60 minutos a 37°C. As
amostras foram contrastadas com acetato de uranila 2%. Microscopia eletrônica: O painel (A) representa um
aumento de 20.000X; painel (B): aumento de 30.000X ; Painel (C): aumento de 50.000X. A barra indica 1 µm
em cada painel. A barra no painel (A) e (B) é de 100 µM e no paienl (C) 200 µM. Microscopia de força atômica:
Painel (D): BD-TTR antes da pressão; Painel (E): BD-TTR após a pressurização; Painel (F): BD-TTR após a
pressurização.
5
4
3
2
1
0
µm
543210
µm
6 6
6 5
6 4
6 3
6 2
6 1
nm
5
4
3
2
1
0
µm
543210
µm
67
66
65
64
63
nm
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
µm
2.01.51.00.50.0
µ m
67
66
65
64
63
nm
A
B
C
D
E
F
DISCUSSÃO
Discussão
75
5. Discussão
Atualmente, mais de 20 amiloidoses já foram descritas (PEPYS, 2001) e todas elas
estão relacionadas ao enovelamento incorreto ou perda de função de alguma proteína, levando
a formação de depósitos extracelulares, comprometendo órgãos e tecidos. Entre as
amiloidoses mais conhecidas, podemos citar a doença de Alzheimer, Diabetis tipo 2 e Doença
de Huntington.
Estudos mais recentes têm tentado elucidar os mecanismos pelos quais essas
proteínas mudam sua rota de enovelamento. A maioria das proteínas enovela em sua forma
nativa através de mecanismos bem definidos que envolvem um número limitado de
intermediários transitórios. Esses intermediários têm uma importância relevante no processo
de enovelamento, pois muitas doenças de natureza genética são, de fato, causadas pela
formação de espécies estáveis, inativas de intermediários durante o processo de
desenovelamento (SANTUCCI et al, 2008).
A proposta mais aceita para a agregação da proteína transtirretina (TTR) pressupõe a
formação de um intermediário amiloidogênico monomérico, sugerindo que a proteína teria
que sofrer dissciação para agregar (COLON et al, 1992; LASHUEL et al, 1998). Com isso,
alguns mecanismos já foram propostos para a dissociação do tetrâmero da TTR em
monômeros, conforme ilustrado na Figura 30. No mecanismo 1, a estrutura tetramérica se
dissociaria em dímeros AC e BD. No mecanismo 2, a TTR também se dissociaria em
dímeros, mas agora AB e CD, mas agora através do eixo cristalográfico C
2
. No mecanismo 3,
o tetrâmero perderia um monômero de cada vez, até a dissociação completa da proteína.
Discussão
76
Figura 30 - Possíveis mecanismos de dissociação da TTR de tetrâmeros em monômeros. (adaptado de
FOSS et al.. 2005b).
Os dois mutantes utilizados nesse trabalho foram construídos com o intuito de
melhor evidenciar qual dos mecanismos anteriormente descritos ocorreria na dissociação da
TTR. Nesse sentido, o BD-TTR, que possui uma ponte dissulfeto que une as subunidades AB
e CD, só permitiria a formação de dímeros AB e CD (FOSS et al, 2005b). Contrariamente o
LD-TTR, ao conectar as subunidades AC e BD, só permitiria que a proteína fosse dissociada
formando dímeros AC e BD. Nenhum desses dois mutantes seria capaz de ser dissociado até a
formação de monômeros (no caso do BD-TTR isso seria possível na presença de uma agente
redutor de ponte dissulfeto).
Um estudo anterior com o LD-TTR demonstrou que a inserção do peptídeo ligante
foi capaz de aumentar a barreira para a dissociação do tetrâmero, pois a formação de hetero-
Discussão
77
tetrâmeros que é facilmente observada quando se mistura, por exemplo, WT-TTR e V30M-
TTR, não foi vista quando da mistura do WT-TTR e LD-TTR (FOSS et al, 2005a). Esse
resultado indica que provavelmente, o mecanismo 1 não deve prevalecer na dissociação da
TTR.
Além disso, outro estudo com os dímeros BD-TTR e o LD-TTR demonstrou que
ambos são resistentes à desnaturação por uréia, que sabidamente requer a dissociação do
tetrâmero, e, no entanto, são sensíveis a desnaturação por guanidina, que pode dissociar o
tetrâmero diretamente (FOSS et al, 2005b).
5.1-Estabilidade dos dímeros versus proteína selvagem.
Os dímeros A/B e C/D da TTR são unidos por ligações de hidrogênio e interações
sítio a sítio associando uma fita beta H de um monômero com a fita beta H de outro
monômero (ver Figura 5). Essas interações ocorrem principalmente entre os resíduos Ser115 e
Tyr123 (FOSS et al., 2005b). Em contraste, a interface mantida pelo eixo cristalográfico C
2
é
estabilizada por contatos hidrofóbicos mediados pelos loops AB e GH (FOSS, T. R. et al.,
2005b).
No presente trabalho, verificamos que os dímeros construídos da TTR têm uma
estabilidade maior frente à APH do que a WT-TTR, o que, no caso do BD-TTR, se deve a
inserção da ponte dissulfeto e para o LD-TTR, à inserção do peptídeo ligante. Percebemos
também que, quando tratado com DTT, o BD-TTR passa a apresentar menor estabilidade, o
que significa que as pontes dissulfeto estariam sendo quebradas. O LD-TTR foi o mutante que
se apresentou mais estável ao tratamento com APH demonstrando que o peptídeo inserido
próximo ao canal da tiroxina reforça a interação dos dímeros A/B e C/D, aumentando a
Discussão
78
estabilidade da estrutura tetramérica da proteína. Sendo assim, conseguimos estabelecer uma
comparação quanto à estabilidade desses mutantes e a proteína selvagem:
WT-TTR< BD-TTR + DTT< BD-TTR - DTT << LD-TTR.
Na avaliação do BD-TTR tratado com DTT quanto à dependência de concentração,
verificamos que não há dependência de concentração no processo de dissociação, assim como
acontece para a proteína selvagem. Isso se explica pelo fato de alguns oligômeros não
obedecerem à lei das massas, devido à existência de heterogeneidade conformacional entre
cada subunidade (SILVA et al., 1993).
Nos experimentos de ligação ao VBO, uma molécula fluorescente que se liga ao
canal de tiroxina, verificamos que o LD-TTR liga muito pouco VBO, o que talvez se deva a
um impedimento estérico causado pelo peptídeo inserido próximo ao canal da tiroxina, onde
seria o sítio de ligação da droga. O BD-TTR, tanto na presença, quanto na ausência de DTT,
apresentou uma ligação menor de VBO do que a WT-TTR. A princípio, isso não seria
esperado, a menos que a inserção da ponte dissulfeto tenha de alguma forma, modificado a
arquitetura do canal da tiroxina. Este especulação precisa de estudos adicionais para ser
confirmada ou descartada.
Quando utilizamos o VBO como marcador do estado tetramérico, verificamos que,
sob pressão, a WT-TTR desligou esse marcador, mas não totalmente, como seria esperado se
estivesse havendo a completa dissociação dos tetrâmeros. No entanto, a ligação do VBO à
proteína ocasionou estabilização da estrutura quaternária, pois, na ausência de VBO o p1/2
obtido foi de 430 bar ao passo que na sua presença observamos um p1/2 de 80 bar. Isso
poderia explicar porque o VBO não se desliga completamente da proteína quando sob
pressão. O BD-TTR tratado com DTT, que apresentou em quase todos os experimentos um
Discussão
79
comportamento similar à WT-TTR, surpreendentemente, não desligou VBO quando
submetido à pressão, sugerindo que esta variável não estaria dissociando esta proteína. No
entanto, quando acompanhamos o desvio do centro de massa, observamos que seu desvio foi
maior que o da proteína selvagem. Este dado foi para nós inesperado necessitando de maiores
investigações futura para sua completa interpretação.
A sonda fluorescente bis-ANS foi utilizada em nossos estudos com a TTR a fim de
caracterizar mudanças conformacionais durante a dissociação/desnaturação. Proteínas nativas
na sua maioria não são capazes de ligar bis-ANS. As proteínas ligadoras de DNA, por
possuírem sulcos carregados positivamente, são exceções à regra (FERREIRO et al, 2000).
Diversos estudos têm utilizado a sonda bis-ANS como um marcador de exposição de regiões
hidrofóbicas (HAWE et al., 2007), tornando-a uma ferramenta ideal para a caracterização de
intermediários de enovelamento, por serem estruturas que geralmente perdem parte de sua
estrutura terciária, mantendo a estrutura secundária intacta e expondo regiões hidrofóbicas
(BRAGA et al, 2007; MORAIS et al., 2005; LIMA et al., 2004). A TTR é capaz de ligar bis-
ANS no seu estado nativo devido à presença do canal da tiroxina que é um sítio hidrofóbico
onde a sonda se ligaria.
Sob APH na presença da sonda bis-ANS a proteína selvagem apresenta uma ligação
alta a essa sonda, assim como o BD-TTR tratado com DTT, indicando que a ausência da
ponte dissulfeto faz com que a estrutura protéica fique mais sensível a APH, assumindo uma
conformação parcialmente desenovelada. Já o BD-TTR sem DTT e o LD-TTR apresentam
um desligamento inicial de bis-ANS, devido à perturbação do canal da tiroxina. Porém, em
pressões maiores esses dímeros apresentam uma ligação discreta de bis-ANS, indicando que
não assumem uma conformação totalmente desenovelada, mas de certa forma a inserção da
ponte dissulfeto no BD-TTR e do peptídeo ligante para o LD-TTR não deixam esses mutantes
assumirem uma conformação de intermediário.
Discussão
80
Comparando os dados que obtivemos com os dados publicados anteriormente com
esses dímeros, podemos perceber que a ação da APH no BD-TTR e LD-TTR, se assemelha à
ação da uréia, não sendo capaz de desnaturá-los completamente. O fato do BD-TTR ser mais
sensível a APH do que o LD-TR se deve ao fato da APH estar afetando o resíduo de lisina 15,
que fica próximo ao eixo crisatalográfico C
2
, pois estudos anteriores demonstraram que esse
resíduo contribui substancialmente para a estabilidade da estrutura quaternária da TTR. Esse
resíduo pode sofrer uma desestabilização pelo aumento da força iônica do tampão, devido a
sua maior exposição ocasionada pela APH. No caso do LD-TTR o mesmo não ocorreria, pois
a presença do peptídio ligante atenuaria a interação eletrostática de um resíduo de lisina 15 de
um monômero com o resíduo de outro monômero, estabilizando o tetrâmero e impedindo sua
dissociação, por isso ele se mostrou mais resistente a ação da APH. Assim como acontece
com a uréia, a APH é capaz de dissociar o BD-TTR nos dímeros AB e CD, que são resistentes
a sua ação desnaturante. Já o LD-TTR parece não dissociar nem mesmo em dímeros,
mantendo sua estrutura tetramérica que é resistente a desnaturação por APH, assim como por
uréia.
5.2- Agregação protéica.
A PFA ou Polineuropatia Familiar Amilóide é caracterizada pela deposição de
agregados protéicos, acometendo principalmente nervos periféricos. Nos pacientes
acometidos por esta doença, a substituição de um único aminoácido na seqüência primária da
proteína transtirretina é capaz de alterar a estabilidade estrutural da proteína (DAMAS et al.,
2000; ANDO et al, 2005; YANG et al., 2006;
BERGSTROM et al., 2006)
. O mecanismo
molecular que leva à polimerização da TTR e sua deposição nos tecidos como fibras
amilóides não é ainda totalmente elucidado, contudo evidências indicam que a formação de
Discussão
81
fibras é conseqüência da desestabilização da forma tetramérica da proteína (REDONDO et al.,
2000; FOSS et al, 2005; PASQUATO et al., 2007).
Nos experimentos de desnaturação ácida com o mutante BD-TTR sem DTT,
verificamos que o esse dímero é capaz de formar agregados sob determinadas condições como
após a desnaturação por pH e após o tratamento com APH. Estes dados são muito
interessantes, pois sugerem que não há a necessidade da formação do intermediário
monomérico amiloidogênico para a formação das fibras conforme proposto anteriormente
(LAI et al., 1996), uma vez que devido à presença da ponte dissulfeto esse mutante não é
capaz de formar monômeros. O BD-TTR tratado com DTT também foi capaz de agregar em
pHs mais baixos e após o tratamento com APH. Além disso, através de experimentos de
ligação de bis-ANS em diferentes pHs, observamos que o BD-TTR tratado com DTT sofre
mudanças conformacionais em pHs abaixo de 5.0, indicando a dissociação da proteína e
formação de monômeros parcialmente enovelados, conforme ocorre para a WT-TTR. Já o
BD-TTR sem DTT apresentou um aumento discreto na ligação de bis-ANS em pHs mais
baixos, indicando a ausência de uma conformação intermediária.
O LD-TTR não agregou em nenhum dos pHs testados, assim como não apresentou
aumento da ligação de bis-ANS, indicando que apesar de possivelmente ele dissociar em
dímeros, a estrutura formada por eles não deve se encaixar para a formação de uma fibra
amilóide.
A alta pressão hidrostática (APH) tem sido uma ferramenta interessante no estudo da
estabilidade de proteínas, uma vez que perturba de forma controlada a estrutura de proteínas.
Além disso, trabalhos do nosso grupo já mostraram que a pressão é capaz de levar proteínas à
formação de intermediários de enovelamento (SILVA et al., 1992; PENG et al., 1993;
FOGUEL et al., 1998; FOGUEL et al., 2004) com capacidade de agregar, sendo também uma
Discussão
82
ótima ferramenta para mapear as mudanças conformacionais necessárias para uma proteína
sofrer agregação.
Nosso grupo havia mostrado que a APH é capaz de levar a TTR a formação de um
intermediário amiloidogênico tetramérico, o T4
*
(FERRÃO-GONZALES et al., 2000). Em
nossos estudos, fomos capazes de observar a agregação do BD-TTR após o tratamento por
APH, mesmo na ausência de DTT. Como no caso do BD-TTR, não existe a formação de
monômeros através da dissociação por alta pressão, podemos especular que não é necessária a
dissociação completa da TTR para que haja a formação de tal intermediário. Esta hipótese é
corroborada pelos experimentos de gel filtração, no qual observamos que após o tratamento
por APH alguns dímeros ainda são observados em solução. Observamos que os agregados
formados por esses mutantes ligam a sonda Tioflavina T (ThT), que se liga especificamente a
estruturas com características amilóides. A análise por gel filtração mostra que os agregados
formados pelo BD-TTR com e sem DTT possuem um peso molecular maior que o tetrâmero
da TTR, indicando a formação de oligômeros após tratamento por APH. Além disso, na
análise morfológica destes agregados por microscopia eletrônica de transmissão e
microscopia de força atômica, não observamos fibras amilóides e sim oligômeros, que podem
ser as espécies precursoras da formação de fibras. Talvez seja possível observarmos a
formação de fibras maduras se as amostras ficarem incubadas a 37
◦
C por mais tempo.
Com base nesses resultados de agregação, podemos sugerir, então, um novo modelo
para a agregação da TTR, onde mostramos que um dímero rearranjado é capaz de formar um
intermediário capaz de estabelecer contatos interprotéicos levando à formação de agregados
amilóides, conforme mostrado na Figura 31. Esses contatos ocorrem pelo fato dessas espécies
possuírem extensas regiões hidrofóbicas expostas que podem tanto estabelecer contatos intra
cadeia (o que é desejável) gerando a proteína nativa ou contatos errôneos inter cadeia (o que é
indesejável) neste caso levando à agregação da proteína. Neste sentido, muitas patologias
Discussão
83
amiloidogênicas que resultam da agregação de determinadas proteínas também se devem a
agregação de intermediários do enovelamento.
Figura 31-Mecanismos proposto para agregação da TTR. (adaptado de FOSS
et al.,
2005b)
Esse novo dado pode ser conciliado com dados anteriores, onde estudos sobre o
mecanismo de agregação da TTR, no qual mutantes foram construídos, ligando-se
covalentemente as fitas F e F’ e as fitas H e H’ através de pontes de dissulfeto, que impedem
sua monomerização, porém, também são capazes de agregar (SERAG et al, 2001).
Outro mutante construído pela substituição de dois aminoácidos na fita hidrofóbica
A, também mostrou capacidade de agregar e formar uma espécie estável dimérica que foi
capturada em seu processo de agregação (OLOFSSON et al., 2001). Além disso, foi visto que
Discussão
84
durante o processo de agregação do mutante L55P-TTR há a formação majoritariamente de
dímeros quando comparado com a proteína selvagem (KEETCH et al, 2005).
Recentemente foi descoberto um novo mutante da TTR chamado S112I, que se
apresenta na forma dimérica com interações terciárias não nativas, que é capaz de formar
agregados esféricos em condição próxima a fisiológica, e induzem a morte celular. Os
pacientes portadores desse mutante apresentam neuropatia sensoriomotora dos membros
inferiores seguida de desautonomia, severa cardiomiopatia e falência crônica dos rins
(MATSUBARA et al., 2005). Existem ainda grupos que sugerem que dímeros podem ser
unidades formadoras das fibras amilóides da TTR (CORREA et al, 2005).
Todos os dados obtidos nessa dissertação, em conjunto com dados anteriores sobre a
diferença na estabilidade do BD-TTR e LD-TTR a agentes desnaturantes e a troca de
subunidades, demonstram que a interface do eixo cristalográfico C
2
, seria o local onde a
dissociação da TTR teria início. Uma vez que o mutante BD-TTR, que possui essa interface
livre, foi capaz de dissociar em dímeros e agregar, e como mesmo não ocorreu para o LD-
TTR, a dissociação através do mecanismo 1 e 3 pode ser descartada, pois as interações entre
os monômeros A-B e CD é bastante forte.
Desta forma, compreender o papel desses intermediários no enovelamento protéico
vai além de se compreender apenas como se dá o enovelamento de diversas proteínas, mas
permite planejar estratégias voltadas para impedir o contato entre eles e, com isso, buscar
resolução para estas patologias.
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V
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Y
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ANEXO
98
Anexo I
PROTOCOLO DE EXPRESSÃO DE TTR
A) TRANSFORMAÇÃO (DIA 1)
1-(no fluxo) Lavar a cubeta de eletroporação com álcool e deixá-la no UV por 30 minutos.
2- (no fluxo)-Misturar 1 µl de plasmídio em 40 µl de bactéria (E. coli BL21DE3) competente transferir para a
cubeta de eletroporação e colocar no gelo até que gele. Guardar 10 µl de bactéria restante não transformada
para o controle.
3- Eletroporar com:
Capacitância: 25 µF
Resistência: 200 ohm
Voltagem: 1.8 kV
4-(no fluxo)-Ressuspender a bactéria dentro da cubeta com 960µl de meio LB e transferir a suspensão para um
tubo estéril 17x100 mm.
5- Incubar o tubo a 37ºC, 200 rpm por 1 h.
6- Fundir 50 mL de meio ágar,esfriar a garrafa com água corrente até ser possível segurá-la sem incômodo, mas
sem gelificar o meio e adicionar 100 µg/mL de ampicilina.
7- (no fluxo) Cobrir o fundo de 3 placas de Petri com o meio e esperar endurecer.
8-(no fluxo)-Com uma alça de Drigalski estéril espalhar os 10 µL de bactéria não transformadas em uma placa
até que seque. Este será o controle. Nada deverá crescer nesta placa, mostrando que a ampicilina inibiu o
crescimento de quaisquer outras bactérias não transformadas.
9- (No fluxo) – Com uma alça de Drigalski estéril, espalhar 50 µL de bactéria transformada em uma placa até
que seque. Esta será a DILUÍDA. Deverão crescer colônias esparsas.
10- (No fluxo) - Transferir a suspensão restante para um Eppendorf centrifugar a 13000 rpm por l min.
11- (No fluxo) - Eliminar a sobrenadante e ressuspender pellet totalmente com 50 µl de meio LB.
12- (No fluxo) – Com uma alça de Drigalski estéril, espalhar a suspensão de bactérias transformadas em uma
placa até que seque. Esta será a CONCENTRADA.
13- Colocar as placas na estufa a 37 °C por 12- 14 h ou até que cresçam as colônias, sendo o tempo máximo de
24 h.
Retire as placas e observe se é possível coletar uma única colônia. Se não, deve-se estricar a cultura.
B) REPICAÇÃO E INDUÇÃO (DIA 2)
1- (No fluxo)-Adicionar 100 µg/mL de ampicilina a 3 erlenmeyer com 25 mL de meio LB cada.
2- (No fluxo)-Flambar a alça de platina, esperar esfriar; coletar. UMA
colônia e semear, um erlenmeyer. Repetir
piara os outros dois erlenmeyer.
3- Colocar os erlenmever no shaker a 37 °C, 200 rpm por 12-14 h ou até que o meio fique bem leitoso, sendo o
tempo máximo de 24 h.
4- (No fluxo) Adicionar 100 µg/mL de ampicilina a 3 erlenmeyer com 800 mL de meio LB cada.
5- (No fluxo) - Retirar 500µl da suspensão para um eppendorf e acrescentar 50 µl de tampão de amostra de gel
desnaturante. Replicar 8ml da suspensão de bactéria de um
dos erlenmeyer de 800 ml. Repetir para os outros
dois.
Obs.: A proporção de repique deve ser l parte de suspensão de bactéria para 100 partes de meio LB estéril.
6- Colocar os erlenmeyer no shaker a 37 °C, 200 rpm, até a A
600
que chegue a 1.0-1.5.
7- (No fluxo) - Retirar 500 µL da suspensão para um eppendorf e acrescentar 50 µl de tampão de amostra de gel
desnaturante. Adicionar 1 mM de IPTG em cada erlenmeyer para induzir as bactérias a expressar a TTR.
8- Colocar os erlenmeyer no shaker a 37 ºC, 300 rpm, por 12-14 h,
C) PURIFICAÇÃO (DIA 3)
1- Retirar 500 µl da suspensão para um eppendorf acrescentar 50 µL de tampão de amostra de gel desnaturante.
Centrifugar a suspensão a 8000 rpm por 10 min.
99
2- (No fluxo) - Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em Tris-HCl 20 mM, NaCI 500 mM, pH 7,5
na proporção de 100 mL de tampão para 1000mL de meio de cultura.
3- Congelar a suspensão a -80 °C por 1 h e depois descongelar em temperatura ambiente.
Obs: Caso seja necessário testar a indução, pode-se deixar as bactérias congeladas enquanto ore-se um gel de
eletroforese com as amostras reservadas em eppendorf.
4- (No fluxo) - Colocar a suspensão em um tubo plástico (NÃO PODE SER DE VIDRO!) e este tubo num
isopor com gelo.
5- Sonicar a suspensão, sem encostar a ponteira no tubo ou no fundo do tubo. Certificar-se de que a potência do
aparelho está selecionada o suficiente para lisar as bactérias Fazer 10 ciclos de 30 s com l min de intervalo
entre os ciclos Fechar bem a porta da caixa a prova de som do sonicador ou usar proteção de ouvido e
NUNCA TOCAR NA PONTEIRA DO SONICADOR, MESMO ENTRE OS CICLOS!
6- Retirar 500 µL da suspensão para um eppendorf acrescentar 50 µL de tampão de amostra de gel desnaturante.
Centrifugar a suspensão a 8000 rpm por l0 min.
7- Retirar 500 µL da solução para um eppendorf e acrescentar 50 µL de tampão de amostra de gel desnaturante.
Medir o volume do sobrenadante e usar a fórmula abaixo para calcular a quantidade de sulfato de amônio
((NH
4
)
2
SO
4
) para que se obtenha 50% de saturação.
((NH
4
)
2
SO
4
(g) = vol. de sobrenadante (L) x 291
Macerar o sulfato de amônio até obter um pó finíssimo Adicionar o sulfato de amônio pouco a pouco, de modo
que dissolva pouco a pouco. Depois de todo dissolvido, agitar por mais 30 min.
8- Centrifugar a solução a 8000 rpm por 10 min..
9- Retirar 500 µL da solução para um eppendorf e acrescentar 50 µL de tampão de amostra de gel desnaturante.
Fazer o mesmo para o precipitado. Medir o volume do sobrenadante e usar a fórmula abaixo para calcular a
quantidade de sulfato de amônio ((NH
4
)
2
SO
4
) para que se obtenha 90% de saturação.
((NH
4
)
2
S0
4
(g) = vol. de sobrenadante (L) x 268
Macerar o sulfato de amônio até obter um pó finíssimo Adicionar o sulfato de amônio pouco a pouco, de modo
que dissolva pouco a pouco. Depois de todo dissolvido, agitar por mais 30 min.
10- Centrifugar a solução a 8000 rpm por 10 min.
11 - Retirar 500µl da solução para um eppendorf e acrescentar 50 µL de tampão de amostra e gel desnaturante.
Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10ml de Tris-HCl 25mM, pH 8,0.
12- Retirar 50 µL da solução para um eppendorf e acrescentar 5 µL de tampão de amostra de gel desnaturante.
Dializar a solução em mesmo tampão por 12-14 h para dessalinização. Para o WT-TTR, usar membrana de
cone em 12-14 kDa. Para o M-TTR usar membrana de corte cm 3.5 kDa.
13- Estimar a concentração de proteína da solução dializada por absorbância em 280 nm, segundo a relação
abaixo:
ABS
280
0,8 = 1 mg/mL de proteína
Obs: caso seja necessário testar a purificação, pode-se deixar a solução na geladeira enquanto corre-se um gel de
eletroforese com as amostras reservadas em eppendorf.
14- Tampões:
TnsHCl25mM, pH 8,0 (A)
TnsHCl 25 mM, NaCI 1 M, pH 8,0 (B)
Equilibrar uma coluna XK 26 contendo 20ml da resina Source 30 Q do tampão B 5%.
15- Injetar a solução de proteínas com bomba peristáltica (deve-se respeitar a carga máxima de proteína, usando-
se para isso a estimativa de concentração feita no passo 13).
16- Lavar a colona com tampão B 5%, 2ml/min por 6 min. Aumentar o fluxo para 5 mL/min por 6 min, lavando-
se assim as proteínas não ligadas com 2 volumes da coluna (6 min a 2 ml/min + 6 min a 5 mL/min).
17- Fazer um gradiente de NaCI de 5% de B a 35% de B em 6 min, 5 mL/min (1,5 volumes da coluna). Coletar o
pico.
18- Ao termino deste, subir o tampão B para 100% e lavar a coluna por 10 min, 5 mL/min (2,5 volumes da
coluna).
100
Nome Priscila dos Santos Ferreira da Silva
Sexo feminino
Nascimento 26/01/1978 - Rio de Janeiro/RJ - Brasil
_________________________________________________________________________________
_____
Formação Acadêmica/Titulação
2006 - 2008 Mestrado em Bioquímica.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Rio De Janeiro, Brasil
Título: Estudos de dissociação e agregação com os dímeros engenheirados da
proteína amiloidogênica transtirretina, Ano de obtenção: 2008
Orientador: Debora Foguel
Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
2001 - 2005 Graduação em Biomedicina.
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, UNIRIO, Rio De Janeiro, Brasil
Título: ESTUDO DO ENOVELAMENTO E AGREGAÇÃO DO TETRÂMERO
CONSTRUÍDO DA PROTEÍNA AMILOIDOGÊNICA TRANSTIRRETINA (BD-TTR)
E AVALIAÇÃO DA CITOTOXIDADE DA TRANSTIRRETINA SELVAGEM (WT-
TTR) E SEUS MUTANTES L55P-TTR E V30M-TTR.
Orientador: Debora Foguel
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
_________________________________________________________________________________
___
Orientações e Supervisões
Orientações e Supervisões concluídas
Monografias de conclusão de curso de aperfeiçoamento/especialização
1. Vanessa Evelyn Zanco dos Santos. Estudos estruturais com o dímero construído da
transtirretina.. 2006. Monografia (Técnico em Química) - Centro Educacional Manoel Pereira
Referências adicionais : Brasil/Português.
Iniciação científica
1. Aline Pereira da Silva. Estudos de dissociação e agregação com os dímeros engenheirados
da proteína amiloidogênica Trantirretina. 2008. Iniciação científica (Farmácia) - Universidade
Federal do Rio de Janeiro
Referências adicionais : Brasil/Português.
Comunicações em congressos
-3 comunicações em congressos internacionais
- 14 cominicações em congressos nacionais
Publicações
Mariana P. B. Gomes, Thiago A. Millen, Priscila S. Ferreira, Narcisa L. Cunha e Silva, Tuane C. R.
G. Vieira, Marcius S. Almeida, Jerson L. Silva e Yraima Cordeiro. Prion protein complexed to N2a
cellular RNAs through its N-terminal domain forms aggregates and is toxic to murine neuroblastoma
cells. JBC Papers in Press. Published on May 1, 2008 as Manuscript M802102200
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