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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Clonagem, expressão e caracterização molecular e
funcional do inibidor endógeno do proteassoma PI31
de Schistosoma mansoni
Carla Botelho Machado
Ribeirão Preto
2008
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Clonagem, expressão e caracterização molecular e
funcional do inibidor endógeno do proteassoma PI31
de Schistosoma mansoni
Carla Botelho Machado
Dissertação de Mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo,
como requisito para obtenção do título
de mestre em Ciências. Área de
concentração: Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues
Ribeirão Preto
2008
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Machado, Carla Botelho.
Clonagem,expressão e caracterização molecular e funcional do
inibidor endógeno do proteassoma PI31 de Schistosoma mansoni.
Ribeirão Preto, 2008.
92p., il., 30cm
Dissertação (Mestrado- Programa de Pós Graduação em
Bioquímica)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2008.
1. Schistosoma mansoni. 2. Proteassoma. 3. Proteína heteróloga
Dedico este trabalho aos meus amados
pais Luis Carlos e Maria de Fátima, por
permitirem que eu desfrutasse dos bens
mais preciosos: a família e os estudos.
Estes são para sempre! Amo vocês.
Ao meu amado irmão Vitor
Felipe pelo amor, carinho, apoio
e compreensão incondicionais
durante o decorrer de nossas
vidas. Meu mais sincero amor.
Ao meu grande amor Fernando,
pelo amor e apoio demonstrados a
cada dia. Você é a luz do meu
amanhecer. Te amo
AGRADECIMENTOS
À Deus por permitir minha vinda ao mundo em uma família abençoada, amigos
maravilhosos e um grande amor. Obrigada pela proteção e pela força que são
renovadas a cada dia.
À minha família, meus amados avós Maria e Bairon
(in memorian)
pelo amor e
carinho incondicionais. À minha avó Isaura (
in memorian)
pelos momentos
maravilhosos que desfrutamos. Meus avós Jair e Joana pelo amor e carinho.
Aos meus pais Luis Carlos e Maria de Fátima pelo amor, carinho e
compreensão e ao meu irmão Vitor Felipe por existir! Aos meus queridos tios
Antônio e Luiza por serem meus segundos pais, sinceramente não tenho
palavras para agradecê-los. À minha prima Kriscia pela carinho e amizade.
Ao meu namorado Fernando pelo amor incondicional, companheirismo, pelo
apoio e compreensão nos momentos de ausência em prol deste trabalho.
À minha sogra e amiga Cidinha pelo amor, carinho e apoio. À Maria Rosa pelo
carinho e apoio. Meu muito obrigado.
Ao Domingos Zanchetta Netto por me ensinar a ser disciplinada nos
experimentos. Obrigada por me apresentar a minha primeira orientadora no
decorrer desta caminhada.
À Dra. Ana Cláudia Polli Lopes pelo despertar do caráter científico, pelo
carinho, dedicação e apoio durante a iniciação científica e aos grandes
laços de amizade que perpetuam até hoje. Muito obrigada.
Ao Dr. Joaquim Coutinho Netto, que foi o meu primeiro contato em Ribeirão
Preto, ensinou-me o nome das ruas e ajudou-me incondicionalmente nos momentos
em que precisei de conselhos. Obrigado por me apresentar o meu orientador.
Ao Dr. Vanderlei Rodrigues que me acolheu de braços abertos em seu
laboratório e me apoiou no decorrer da realização deste trabalho.Obrrigado
pela orientaçãoe pela aprendizagem adquirida.
Ás técnicas Elenice e Mara pelo apoio técnico realizado com muita
eficiência para a realização deste. Obrigado por todo carinho e amizade
demonstrado no decorrer destes anos. Adoro vocês.
Aos amigos do laboratório de Biologia Molecular de Parasitas: Cláudia,
Enyara, Érika, Lizandra, Micael e Wendel pelo auxílio para a realização
deste trabalho e pela convivência diária, afinal somos uma grande família.
Cada um de vocês, com um jeito peculiar deixaram uma lembrança pela qual
carregarei comigo para sempre.
À Dra. Fernanda Janku Cabral pelo auxílio na orientação deste trabalho e
pela amizade incondicional. Muito obrigado.
À Dra. Renata Guerra de Sá pela colaboração depositada neste trabalho.
Ao Dr. William de Castro Borges por ter aceito o convite de participar da
banca examinadora deste trabalho.
Aos técnicos Lucia e Nego pelos agradáveis momentos no decorrer destes
anos.
Ao Dr. Roberto Ruller pela colaboração neste trabalho e pelos ensinamentos
de biologia molecular e expressão de proteínas heterólogas. Meus sinceros
agradecimentos.
Ao Dr. Richard John Ward pelo auxílio na orientação deste trabalho e por
ter me recebido com tanto carinho em seu laboratório.
Aos amigos do laboratório do prof. Richard: Gilvan, Giselle,Juliana, Laila,
Leila, Lica, Lucas, Patrícia, Plínio, Raquel, Renata, Roberto e Taty pelo
apoio e amizade durante estes anos.
À amiga Patrícia Betoni Momo pela amizade, dedicação e carinho.
Aos técnicos Ivana e Niltinho pelo apoio técnico realizado com muita
eficiência para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Roy Larson por permitir o uso dos equipamentos em seu laboratório. A
Dra. Munira, Diego, Claudinha e especial à amiga Renata pelo auxílio
constante.
Ao Pitta pelo auxílio de toda a parte técnica que estivesse ao seu
alcance. Obrigado pelos conselhos, e lições de vida. Muito obrigado.
Às amigas Thaila, Carol e Renata pelo auxílio na formatação deste trabalho
e pelos bons momentos no decorrer destes anos. Adoro vocês.
A todos os professores e discentes do Departamento de Bioquímica e
Imunologia que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho.
Aos secretários do Departamento de Bioquímica e Imunologia Ivone, Ronaldo,
Téia e Lúcia pela eficiência e carinho no desenvolvimento de suas funções.
Às secretárias do Departamento de Imunologia Ana e Rosângela pela atenção e
carinho em momentos que precisei de serviços.
As instituições que colaboraram com recursos financeiros para a realização
deste trabalho: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
(FAPESP) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado.
Aos que esqueci de mencionar, mas que direta ou indiretamente contribuíram
para a realização deste.Meus sinceros agradecimentos.
È incrível a força
que as coisas parecem ter
quando elas precisam acontecer
Caetano
Lista de Abreviaturas e Siglas
i
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP Adenosina Trifosfato
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
CTAB Brometo de Hexadeciltrimetilamônio
CP Complexo Proteolítico
°C Grau Celcius ou Centígrados
cDNA DNA complementar
DTT Dithiothreitol
DEPC Dietilpirocarbonato
ESTs Expressed Sequence Tags
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético
GO Gene Ontology
Kb Kilobase
KDa Kilo Daltons = 1000 Daltons
mRNA RNA mensageiro
mM Milimolar
ml Mililitro
M Molar
NCBI National Center for Biotechnology Information
ONSA Organization for Nucleotide Sequencing and Analysis
ORESTES Open Reading Frame Expression Sequence Tag
ORF Open Read Frame
Pfam Protein family database
pb Pares de Bases
Rpn Regulatory Particle Non-ATPase
Rpt Regulatory Particle Triple A protein
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
SFB Soro Fetal Bovino
Sm
Schistosoma mansoni
SMART Simple Modular Architeture Research Tool Database
TE Tampão de Eluição
TFB Transformation Buffer
Lista de Abreviaturas e Siglas
ii
Tris Tris[hidroximetil]aminometano
µl Microlitro
UV Ultravioleta
XGal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Beta-D-Galactopyranoside
Abreviação dos Aminoácidos
iii
ABREVIAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS
AMINOÁCIDOS ABREVIAÇÃO DE TRÊS
LETRAS
ABREVIAÇÃO DE
UMA LETRA
Alanina
Ala A
Arginina
Arg R
Asparagina
Asn N
Ácido aspártico
Asp D
Ácido glutâmico
Glu E
Cisteína
Cys C
Glicina
Gly G
Glutamina
Gln Q
Histidina
His H
Isoleucina
Ile I
Leucina
Leu L
Lisina
Lys K
Metionina
Met M
Fenilanina
Phe F
Prolina
Pro P
Serina
Ser S
Tirosina
Try Y
Treonina
Thr T
Triptofano
Trp W
Valina
Val V
Resumo
iv
A degradação intracelular de proteínas mediada pelo sistema de ubiquitina e
proteassoma é uma importante rota na qual inúmeras proteínas são marcadas para a
destruição. O principal componente deste sistema proteolítico é o proteassoma 26S. A
modelagem estrutural e funcional do sistema proteolítico ubiquitina-proteassoma apresenta
diversos moduladores, os quais são responsáveis por funções específicas.
No presente estudo, foi feita a caracterização molecular e funcional do inibidor
endógeno do proteassoma PI31 do parasita Schistosoma mansoni durante seu ciclo evolutivo.
Assim, o gene que codifica para PI31 foi recuperado dos bancos de dados do parasita,
clonado, expresso em sistema heterólogo, e por fim a proteína recombinante foi purificada.
A partir da proteína purificada, camundongos foram imunizados para a produção de
anticorpos específicos anti-PI31.
Nossos resultados demonstraram que a expressão gene que codifica para SmPI31 é
diferencialmente expresso. Em relação à proteína, observamos a presença de SmPI31 em
todas as fases estudadas, ou seja, vermes adultos, cercária e ovos. Experimentos preliminares
de atividade proteolítica exógena do proteasssoma indicam que a proteína é funcional e
diminui a atividade da protease em cerca de 70%.
Desta forma, considerando-se que PI31 exerce um papel inibitório do proteassoma em
vários metazoários, em S. mansoni os nossos resultados indicam que esta proteína é funcional
e pode contribuir de forma efetiva na modulação da atividade proteolítica do proteassoma
durante o desenvolvimento do parasita.
Abstract
v
The intracellular degradation of proteins mediated by ubiquitin and proteasome system
is an important route of the proteins which are marked for the destruction. The main
component of this proteolytic system is the 26S proteasome. The structural and functional
modelling of the proteolytic system has shown several modulators of proteasome activity, that
are responsible for specific functions.
In the present study, we have done the molecular and functional characterization of the
endogenous inhibitor of the proteasome PI31 from Schistosoma mansoni during its life cycle.
Thus the gene encoding PI31 was recovered of the parasite’s databanks, cloned, expressed in
bacteria system, and the recombinant protein was purified using affinity colunm. Using the
purified protein, specific antibodies anti-PI31 were produced through mice immunization.
Our results demonstrated that SmPI31 transcript is differentially expressed during the
studied stages of the life cycle. Regarding the protein, we have found the presence of SmPI31
in all the studied phases, such as adult worms, cercariae and eggs. Preliminary assay of
exogenous proteolytic activity of the proteasome using protein fractions of the parasite
incubated with SmPI31 has suggested that the protein is functional and decreases the activity
of the protease in 70 %.
Finally, our reports have shown that PI31 inhibits the proteasome of the metazoans.
Our results have shown that SmPI31 is functional, and probably may play a role inhibiting the
proteasome activity of the parasite contributing to the modulation of this protease in the
complex developmental process of the S. mansoni.
Sumário
vi
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..............................................................................i
ABREVIAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS................................................................................iii
RESUMO..................................................................................................................................iv
ABSTRACT .............................................................................................................................. v
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................9
1.1. Aspectos Gerais............................................................................................................. 10
1.2. Ciclo de vida do parasita e a patologia da esquistossomose..........................................11
1.3. Transcriptoma e genoma do parasita............................................................................. 15
1.4. Sistema proteolítico Ubiquitina-Proteassoma ............................................................... 17
1.5. Moduladores do proteassoma 20S................................................................................. 21
1.6. PI31, um inibidor endógeno do proteassoma ................................................................ 23
2. OBJETIVOS .......................................................................................................................26
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................27
2.2. Objetivos específicos..................................................................................................... 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................................. 28
3.1. Manutenção do ciclo de vida de S. mansoni e obtenção da fase de vermes adultos ..... 29
3.2. Obtenção da fase de ovos de S. mansoni....................................................................... 29
3.3. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos........................................ 30
3.4. Análise in silico............................................................................................................. 31
3.5. Análise da estrutura genômica do gene SmPI31 ...........................................................31
3.6. Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a análise da expressão do
SmPI31 no ciclo evolutivo de Schistosoma mansoni utilizando PCR quantitativo. ............ 31
3.7. Extração de RNA total das diferentes fases evolutivas de S. mansoni.......................... 32
3.8. Quantificação do RNA .................................................................................................. 33
3.9. Obtenção do cDNA do transcrito que codifica para o inibidor endógeno PI31 em S.
mansoni................................................................................................................................. 34
3.10. Reação em cadeia da polimerase................................................................................. 34
3.11. Purificação do produto de PCR .................................................................................. 35
3.12. Clonagem no vetor pGEMT- easy e transformação em células competentes............. 35
3.13. Minipreparação de DNA plasmidial............................................................................ 35
3.14. Sequenciamento dos nucleotídeos............................................................................... 36
Sumário
vii
3.15. Análise computacional das seqüências........................................................................ 37
3.16. Análise da expressão diferencial do gene que codifica para o inibidor endógeno
do proteassoma PI31 de S. mansoni utilizando PCR quantitativo........................................ 37
3.17. Clonagem da seqüência codificadora em vetor pET 28a+ (Novagen) para
expressão em sistema bacteriano.......................................................................................... 38
3.17.1. Características do vetor pET 28a+ .......................................................................38
3.17.2. Preparação do vetor ..............................................................................................39
3.17.2.1. Preparo de células cálcio-competentes.......................................................... 39
3.17.2.2. Transformação em E. coli DH5α................................................................... 39
3.17.2.3. Extração do DNA plasmidial......................................................................... 40
3.17.2.4. Digestão do vetor........................................................................................... 41
3.17.2.5. Defosforilação da forma linear do vetor........................................................ 41
3.17.3 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para expressão da proteína
recombinante. ................................................................................................................... 41
3.17.4. Amplificação da sequência codificadora do SmPI31 e ligação no vetor
pET28a .............................................................................................................................42
3.18. Expressão de proteínas heterólogas em linhagens E. coli BL21 Rosetta
[DE3]plysS. ..........................................................................................................................43
3.18.1. Preparo de células BL21 competentes.................................................................. 43
3.18.2. Expressão da proteína em função do tempo de indução....................................... 43
3.18.3. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)...................... 44
3.18.4. Purificação parcial em média escala de proteínas por cromatografia de
afinidade ........................................................................................................................... 44
3.18.5. Quantificação da proteína..................................................................................... 45
3.19. Confirmação da identidade da proteína por espectrometria de massa......................... 45
3.20. Análise da estrutura primária....................................................................................... 46
3.21. Análise Filogenética ...................................................................................................46
3.22. Produção de anticorpo anti-PI31 de S. mansoni em camundongos Balb/C.................47
3.23. Purificação do anticorpo.............................................................................................. 47
3.24. Western blot para teste dos soros de camundongos imunizados................................. 48
3.25. Preparação do extrato bruto das fases de vermes adultos, cercárias e ovos ................ 48
3.26. Western blot para detecção de PI31 e proteínas poli-ubiquitinadas........................... 49
3.27. Medida da atividade proteolítica exógena.................................................................. 50
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 51
4.1 Análise in silico.............................................................................................................. 52
4.2. Estrutura genômica do gene SmPI31.............................................................................53
4.3. Amplificação do transcrito do gene PI31 em S. mansoni.............................................. 54
Sumário
viii
4.4. Análise da expressão do cDNA que codifica para SmPI31 no ciclo de vida do
parasita..................................................................................................................................54
4.5. Clonagem da sequência codificadora de SmPI31 em vetor pET 28a+ . ....................... 56
4.6. Expressão das proteínas recombinantes em bactéria E. coli linhagem BL21 Roseta
[DE3]pLysS.......................................................................................................................... 60
4.6.1. Determinação do tempo de expressão da proteína SmPI31 ................................... 60
4.7. Purificação da proteína heteróloga PI31........................................................................ 61
4.8. Confirmação da identidade da proteína por espectometria de massa do tipo
ESI/MS-MS ..........................................................................................................................62
4.9. Alinhamento da sequência primária de SmPI31 em relação aos seus ortólogos e
análise filogenética. ..............................................................................................................63
4.10. Produção e purificação de anticorpos policlonais específicos contra SmPI31 em
camundongos........................................................................................................................ 65
4.11. Titulação dos anticorpos policlonais purificados anti-SmPI31 ................................... 67
4.12. Expressão da proteína SmPI31 em extratos protéicos de vermes adultos, cercárias
e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-PI31........................................... 68
4.13. Determinação de conjugados poli-ubiquitinadas em extrato de vermes adultos,
cercárias e ovos sob efeito do inibidor endógeno heterólogo SmPI31................................. 69
4.12. Atividade proteolítica exógena com extrato bruto de vermes adultos........................70
5.DISCUSSÃO ........................................................................................................................71
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................ 80
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................82
8. ANEXOS ............................................................................................................................. 90
1. INTRODUÇÃO
Introdução
10
1.1. Aspectos Gerais
O parasita Schistosoma mansoni é o causador da esquistossomose mansônica humana,
popularmente conhecida como “Barriga d'água”, “Xistose” ou “Mal do Caramujo”. Esta
doença parasitária é conhecida desde a antiguidade, quando ovos de Schistosoma mansoni
foram encontrados em múmias egípcias e chinesas datadas de 3.500 antes de Cristo
(AMARAL E PORTO, 1999).
A esquistossomose possui uma ampla distribuição geográfica, sendo uma das
parasitoses humanas mais difundidas pelo mundo. De acordo com a Organização Mundial de
Saúde, mais de 200 milhões de pessoas são afetadas em todo o mundo e estima-se que mais
de 1,53 milhões de pessoas estão incapacitadas devido à doença (WHO, 2002 e CHITSULO
et al., 2000). No Brasil devido ao clima tropical existem condições favoráveis à sua
transmissão, constituindo então, em um importante problema de saúde pública, especialmente
nas regiões nordeste e sudeste do país (KATZ, 2003; MELO & COELHO, 2005).
A espécie Schistosoma mansoni pertence ao reino Animalia, sub-reino Metazoa, filo
Platyhelmintes, classe Trematoda, subclasse Digenea e família Schistosomatidae. Esta família
é dividida em duas subfamílias: Bilharzielinae e Schistosomatinae. Na primeira encontramos
os vermes sem dimorfismo sexual, que parasitam aves e alguns mamíferos domésticos ou
silvestres, portanto, sem interesse médico direto. Na segunda, estão incluídos os que
apresentam um nítido dimorfismo sexual e com espécies que parasitam o homem e animais
(NEVES, 2005).
O gênero Schistosoma foi descrito primeiramente por Bilharz em 1852 e
posteriormente Weinland em 1858, que denominou o gênero deste helminto de Schistosoma,
uma vez que o macho apresenta no corpo uma fenda longitudinal (schisto=fenda;
soma=corpo), conhecido como canal ginecóforo, local onde a fêmea permanece alojada para
que a fecundação ocorra. Entretanto a denominação da espécie Schistosoma mansoni foi dada
Introdução
11
por Sambon em 1907. Estudos de Pirajá da Silva na Bahia, os quais foram realizados na
mesma época contribuíram muito para a confirmação que o S. mansoni produzia ovos,
habitava as veias mesentéricas e tratava-se de uma espécie distinta.
As três espécies que melhor se adaptaram ao parasitismo humano são: S. mansoni,
encontrada nas Américas Central e do Sul e na África; S. hematobium, encontrada na África e
Oriente Médio; S. japonicum , encontrada na China, Japão e nas Filipinas (BRINDLEY,
2005; MELO & COELHO, 2005).
1.2. Ciclo de vida do parasita e a patologia da esquistossomose
O parasita apresenta um ciclo biológico do tipo heteroxeno complexo, ou seja, possui
um molusco invertebrado como hospedeiro intermediário e um habitat permanente no
hospedeiro definitivo que pode ser representado pela espécie humana (REY, 1991). O parasita
apresenta uma interação adaptativa notável em seus hospedeiros intermediários e definitivos e
com o ambiente natural onde o ciclo ocorre (NEVES, 2005). Os hospedeiros intermediários
são do gênero Biomphalaria, sendo que das 17 espécies existentes, no Brasil somente três
atuam como hospedeiros intermediários deste parasita: B. glabrata, B. straminae e B.
tenagopila. Dentre as de maior importância epidemiológica, B. glabrata é a que se destaca
(COURA &AMARAL, 2004; MELO & COELHO, 2005).
O ciclo evolutivo do parasita S. mansoni, como demonstrado na Figura 1, apresenta
uma fase sexuada no hospedeiro vertebrado e uma assexuada no hospedeiro invertebrado.
Iniciando-se quando a fêmea deposita seus ovos imaturos, espiculados no sistema porta-
hepático . Estes ovos se desenvolvem, uma parte se aloja nos tecidos, especialmente no fígado
induzindo a formação do granuloma e outra parte atinge a luz intestinal, e posteriormente são
eliminados com as fezes, os quais eclodem em contato com a água doce devido a alguns
fatores como luz intensa, oxigenação da água e temperatura liberando a forma larval
Introdução
12
infectante denominada miracídio . O miracídio é um estágio que não se alimenta, capaz de se
movimentar através de movimentos rápidos. Este, por sua vez nada ativamente a procura do
hospedeiro invertebrado. Esta é uma etapa crítica, pois após 24 horas da eclosão, se o
hospedeiro não for encontrado o parasita morre. Quando o miracídio encontra o molusco do
gênero Biomphalaria, ocorre a penetração através da epiderme do caramujo. Imediatamente
após penetrar na hemocele do caramujo, o miracídio sofre metamorfose, tornando-se
esporocisto-mãe. Este é um estágio em que o parasita se alimenta, porém carecendo de um
tubo digestivo, deve adquirir nutrientes por difusão ou transporte ativo. A segunda geração,
que consiste de numerosos esporocistos-filhos, desenvolve-se por multiplicação assexuada. O
hepatopâncreas do caramujo fica repleto de esporocistos filhos, que se multiplicam, dando
origem à terceira geração, as larvas denominadas, cercárias (WILSON, 1979).
A cercária é a forma infectante do parasita no hospedeiro definitivo, no caso o homem.
As cercárias ultrapassam uma importante barreira mecânica oferecida pela pele do mamífero.
Para tanto, as cercárias possuem três tipos de glândulas com vesículas secretórias: as
glândulas acetabulares que possuem serino proteases, também conhecidas como elastases as
quais agem na penetração através da pele do hospedeiro, a glândula da cabeça que possui
atividade hidrolítica para atravessar as camadas da pele e chegar às vênulas e os corpos
celulares sub tegumentares (CURWEN & WILSON, 2003).
As cercárias penetram ativamente através da secreção de enzimas digestivas e este
processo leva apenas alguns minutos. Após a penetração, as cercárias perdem a cauda, e
algumas horas depois completam a metamorfose transformando-se em esquistossômulos, que
por sua vez, permanecem na pele por até 48 horas antes de migrar através do sistema
circulatório para o sistema porta-hepático. A migração ocorre preferencialmente através da
corrente sanguínea sendo os parasitas levados aos capilares do pulmão onde permanecem
durante 2 a 3 dias. Neste local os parasitas sofrem extenso remodelamento corporal
Introdução
13
caracterizado por aumento de tamanho e diminuição de volume para que estes migrem no
interior de vasos de pequeno diâmetro. Em aproximadamente seis semanas, após a infecção,
no sistema porta-hepático, ocorre o desenvolvimento dos parasitas em fase de vermes adultos,
a maturação, o acasalamento e o início da ovoposição, (NEVES, 2005). Um casal de vermes
adultos ovopõem cerca de 300-1000 ovos/dia.
O ovo é o principal fator patogênico na esquistossomose (STADECKER, 1992). Dos
ovos depositados na parede intestinal, 30% são eliminados nas fezes. O restante permanece
retido nas paredes do intestino e no parênquima hepático, sendo o responsável direto pela
reação inflamatória granulatomatosa nos tecidos.
Os ovos e sua conseqüente liberação de antígenos solúveis retidos no tecido hepático
induzem o aparecimento de uma intensa reação inflamatória ao redor do ovo, a qual
posteriormente, por um processo de fibrose, dará origem ao granuloma (MILLER &
WILSON, 1978; WILSON & COULSON, 1986, MELO &COELHO, 2005). Contudo, a
perda da função hepática ocasionada pela formação de cada granuloma é desprezível em
relação à área hepática total, mas a cronicidade da infecção fatalmente ocasiona um quadro de
grave insuficiência do órgão.
A patogenia da esquistossomose depende de vários fatores, dos quais podemos
destacar: a carga parasitária, a linhagem do parasita, as características do hospedeiro, isto é, a
imunidade, o estado nutricional e a idade. As características marcantes desta patologia em
longo prazo são: hipertensão portal, esplenomegalia e ascite.
Introdução
14
Figura 1: Ciclo Biológico do S. mansoni. Adaptado de RA Wilson, Introdução à Parasitologia Ed. EDUSP,
1979.
Introdução
15
1.3. Transcriptoma e genoma do parasita
O parasita S.mansoni, apresenta um genoma estimado em 2x10
8
pb, organizado em
oito pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par de cromossomos sexuais
com um conteúdo de GC de 34%. Os machos são homogaméticos (ZZ) e a fêmea
heterogamética (ZW) (TANAKA, 1995).
Devido a complexidade do ciclo de vida do parasita, implicando em numerosas
mudanças morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, imagina-se que o seu genoma possa ser
regulado por uma expressão gênica diferencial, desta forma, além dos genes constitutivos,
pode-se esperar a existência de dois outros grupos: um primeiro grupo, regulado por
mecanismos de estresse (térmico, osmótico ou oxidativo), e um segundo, regulado a longo do
desenvolvimento do parasita, influenciado diretamente pelo hospedeiro (vertebrado ou
invertebrado) (ROLLINSON & SOUTHGATE, 1987).
O incentivo para a descoberta dos genes do parasita se deu através de uma iniciativa
do Programa de Pesquisas em Doenças Tropicais da Organização Mundial de Saúde e de
outras agências de fomento (JOHNSTON et al, 1997).
Durante o começo da década de 90, ocorreu uma rápida expansão do conhecimento do
genoma do Schistosoma, incluindo o desenvolvimento de bibliotecas de cDNA de várias fases
do ciclo de vida do parasita, construção de bibliotecas de cromossomos artificiais de
leveduras, mapas físicos parciais dos cromossomos, e a geração de mais que 6000 ESTs
(Expressed Sequence Tags) que são sequências parciais de DNA complemantar (cDNA) de S.
mansoni (HILLIER et al, 1996, ADAMS et al, 1993, BLAXTER et al, 1996).
Mas, o avanço no número de seqüências de Schistosoma ocorreu a partir de 2003,
como resultado de dois projetos de sequenciamento que ocorreram simultaneamente no Brasil
e na Ásia, o projeto Transcriptoma do S. mansoni, que foi financiado pela FAPESP, com a
participação de um consórcio de laboratórios, conhecidos como a rede ONSA (Organization
Introdução
16
of Nucleotide Sequence and Analysis) e o projeto transcriptoma do S. japonicum,
respectivamente.
Sob liderança do pesquisador Sérgio Verjovski-Almeida, no projeto transcriptoma do
S. mansoni foram seqüenciados 163,586 ESTs, com cerca de 150-160pb, obtidas das
extremidades 5' e 3', sendo que 151,684 foram originadas de bibliotecas do tipo ORESTES
(Open reading frames ESTs), ou seja, a região central do gene (DIAS-NETO , 2000), e as
11,902 seqüências restantes foram originadas de bibliotecas normalizadas de vermes adultos.
O total predito de genes é aproximadamente 14,000 genes, o qual cobre aproximadamente
92% do transcriptoma do parasita.
Estes genes foram catalogados segundo a classificação funcional dos transcritos
através do Gene Ontology (GO), os genes do parasita identificados apresentam várias funções
importantes relacionadas com o complexo plano de vida e desenvolvimento deste parasita
(VERJOVSKI et al, 2003).
As iniciativas de sequenciamento do genoma completo do parasita S. mansoni ainda
estão em andamento com projetos financiados pelo National Institutes of Health (NIH) no
instituto TIGR (The Institute for Genomic Reasearch, Rockville, MD, USA), por outra
iniciativa brasileira, a Minas Gerais genome Network EST project e também pelo Instituto
Sanger Centre, financiado pela Welcome Trust, UK (EL-SAYED et al, 2004, BRINDLEY,
2005).
Com o sequenciamento do genoma e do transcriptoma do S. mansoni, várias
perspectivas se abriram para o estudo da biologia do parasita, no sentido de manipulação de
genes essenciais no desenvolvimento e manutenção do parasitismo, no estabelecimento de
novas drogas contra a parasitose e também do estabelecimento de uma vacina eficaz na
prevenção terapêutica.
O proteoma celular tem sido extensivamente estudado através da separação das
Introdução
17
proteínas solúveis e/ou secretáveis através de eletroforese bidimensional. As proteínas
selecionadas são digeridas com tripsina e os peptídeos resultantes são analisados em
espectrômetro de massa e são correlacionados aos cDNAs depositados nos bancos de dados
do transcriptoma (CURVEN et al, 2004).
1.4. Sistema proteolítico Ubiquitina-Proteassoma
Em todas as células eucarióticas existem pelo menos três vias proteolíticas importantes
(DONALD, 1995). A degradação das proteínas extracelulares e algumas proteínas de
superfície celular são realizadas via lisossomos. Exemplos de proteases presentes nesta
organela são as catepsinas. Outro processo proteolítico citossólico, presente em células de
mamíferos é o sistema dependente da ativação por Ca2+ e independente de ATP, as quais
envolvem cisteíno proteases denominadas calpaínas. Por esta via de degradação, proteínas
altamente abundantes tais como os componentes de citoesqueleto são direcionados à
degradação (MYKLES, 1998; ROCK et al., 1994, GOLL, et al., 2003).
A terceira via está relacionada com o mecanismo proposto para a degradação protéica
dependente de ubiquitina e proteassoma. Esta via é responsável pela degradação de proteínas
danificadas, mal enoveladas, com estruturas aberrantes ou de meia-vida curta exercendo
papéis extremamente importantes, tais como a regulação do ciclo celular, metabolismo
celular, apoptose, transdução de sinal, resposta imune e controle de qualidade das proteínas
(HERSHO & CIECHANOVER, 1998; TANAKA & CHIBA 1998).
A via ubiquitina-proteassoma é formada por dois componentes principais: o sistema de
ubiquitinação e um complexo protéico multicatalítico denominado proteassoma 26S
(GLICKMAN & CIECHANOVER, 2002). O sistema de ubiquitinação refere-se a um grupo
de proteínas e enzimas cuja função compreende a marcação de um substrato protéico com
uma ou mais moléculas de ubiquitina.
Introdução
18
Para que as proteínas sejam degradadas por esta via, as mesmas precisam sofrer uma
modificação pós traducional. As vias de modificação pós-traducionais são eventos de
processamento, envolvendo uma nova ligação covalente, alterando desta forma as
propriedades de uma proteína, tanto por clivagem proteolítica, como pela adição de um grupo
modificador de um ou mais resíduos de aminoácidos. Dentre os grupos, de natureza química
variável, podemos incluir a ubiquitina como um importante grupo modificador de proteínas
(GLICKMAN & CIECHANOVER, 2002).
O mecanismo proposto para a degradação protéica via ubiquitina-proteassoma , pode
ser tanto dependente quanto independente de ATP e ubiquitina. Quando a proteólise é
dependente de ATP e ubiquitina, o alvo é primeiramente poliubiquitinado e, posteriormentte
degradado pelo proteassoma 20S liberando pequenos peptídeos e aminoácidos livres. A
ubiquitina é uma proteína constituída por 76 aminoácidos, altamente conservada na evolução
de eucariotos. Esta proteína apresenta uma estrutura globular firmemente empacotada, dotada
de 7 sítios potenciais de lisina para conjugação com o substrato alvo, bem como para a
formação de ligações isopeptídicas com outras moléculas de ubiquitina. Esta proteína possui a
particularidade de ser estável em ampla faixa de pH (1-13), e em temperaturas de até 80°C
(OZKAYNAK et al., 1984).
Para que o processo de ubiquitinação de uma proteína ocorra, três componentes
enzimáticos são requeridos: a enzima ativadora de ubiquitina (E1) , a enzima conjugadora de
ubiquitina (E2) e a enzima de ligação (E3) como mostrado na Figura 2. Esta última é a
enzima chave do processo, pois é ela quem reconhece o substrato protéico e catalisa a
transferência da Ub ativada ao substrato.
Introdução
19
Figura 2. Esquema siplificado da via ubiquitina-proteassoma. A ubiquitina é inicialmente transferida para
enzima ativadora de ubiquitina, E1, de forma dependente de ATP. Esta ubiquitina ativada é depois transferida
para a enzima conjugadora de ubiquitina, E2. Por fim, a ubiquitina é ligada covalentemente na proteína-alvo pela
ubiquitina-ligase E3, dando origem à cadeia de poliubiquitina. As proteínas poliubiquitinadas são reconhecidas
pelo proteassoma 26S e degradadas numa reação dependente de ATP. Figura adaptada de NAKAYAMA &
NAKAYAMA, 2006.
O destino dos substratos poliubiquitinados está relacionado ao resíduo de lisina que
participará na formação da cadeias de ubiquitina, por exemplo, a poli-ubiquitinação (mínimo
de quatro ubiquitinas) localizada no resíduo de lisina 48 (K48) está relacionada com a
proteólise citoplasmática dependente do proteassoma (PICKART, 2002,YANG & YU, 2003;
FANG & WEISSMAN, 2004), bem como as proteínas monoubiquitinadas na lisina 29 (K29),
estão relacionadas com a modulação de receptores de superfície na endocitose
(CIECHANOVER & SCHWARTZ, 1998) e a poli-ubiquitinação da lisina 63 (K63) está
relacionada, dentre outras, à função de reparo do DNA após a replicação. Portanto, o processo
de marcação não está necessariamente condicionado à degradação protéica pelo proteassoma
(PICKART, 2001).
O proteassoma 26S é um complexo enzimático multicatalítico presente no núcleo e
no citoplasma das células eucarióticas, responsável pela principal via de degradação não-
lisossomal nas células (COUX, TANAKA & GOLDENBERG, 1996; BOCHTLER et al,
1999, NAUJOKAT, 2007).
Introdução
20
Este complexo possui uma estrutura de 2.4MDa e é composto por dois subcomplexos,
o centro catalítico, denominado, 20S que possui a atividade catalítica e a partícula
regulatória 19S também denominada de PA700. (ADAMS, 2003; PICKART, 2004; WOLF &
HILT, 2004 DeMARTINO & GILLETTE, 2007).
O proteassoma 20S é um complexo enzimático com 700-750 Kda de peso molecular.
Em eucariotos, é formado po 14 diferentes tipos de cadeias polipeptídicas, subdivididas em
duas famílias distintas: alfa e beta (HENDIL et al, 1995). Estudos de microscopia eletrônica
revelaram uma estrutura cilíndrica semelhante a um barril composta por quatro anéis
sobrepostos, com sete subunidades cada, organizados em um arranjo α1-7 β1-7 β1-7 α1-7. As
subunidades alfas são estruturais e localizam-se externemente enquanto que, as betas são
catalíticas e localizam-se internamente (COUX, TANAKA & GOLDBERG, 1996, HERSHO
& CIECHANOVER, 1998; TANAKA & CHIBA, 1998). Em eucariotos, as subunidade do
complexo 20S responsáveis pela atividade peptidil pós-glutamil hidrolase ou caspase-like,
atividade tripsina-símile e atividade quimiotripsina-símile são respectivamente as
subunidades β1, β2 e β5 (GROLL et al, 1997; GROLL & HUBER, 2004). Este arranjo
favorece a formação de um poro central por onde passariam as proteínas totalmente
desenoveladas e sem ligações dissulfeto à serem degradadas.
Enquanto o proteassoma 20S encerra a atividade proteolítica, o complexo 19S
contribui com múltiplas funções para o proteassoma 26S, como a capacidade de reconhecer e
se ligar a cadeias de poliubiquitina (DEVEROUX et al, 1994). Este complexo, também
denominado PA700 (Proteasome Activator) contém aproximadamente 20 subunidades
heterólogas, as quais podem ser divididas em dois subcomplexos: a base e a tampa.
A base é formada por três subunidades não ATPásicas (RPN1, RPN2 e RPN10) e seis
subunidades ATPásicas (RPT1-RPT6) (RUBIN et al, 1998; BRAUN et al, 1999; GLICKMAN &
RAVEH, 2005). As ATPases pertencem à família AAA (ATPase associada com uma variedade
Introdução
21
de atividades celulares), caracterizada por apresentar um domínio formado por 200 resíduos de
aminoácidos contendo a sequência consenso para a ligação ao ATP (BEYER, 1997).
A tampa é formada por oito subunidades não ATPásicas (RPN3, RPN5, RPN6, RPN7,
RPN8, RPN9, RPN11 e RPN 12). A subunidade RPN10 é o ponto de ligação entre os
subcomplexos (base e a tampa), que dentre outras funções foi a primeira caracterizada como
capaz de reconhecer substratos poliubiquitinados (DEVERAUX et al, 1994).
1.5. Moduladores do proteassoma 20S
A partícula catalítica 20S pode associar-se a uma ou duas unidades regulatórias
denominadas PA700, PA200, COP-9 signalossoma, PA28 e PI31, proporcionando uma
diversidade de proteassomas funcionais, sendo que cada uma dessas montagens apresenta
propriedades cinéticas e especificidade ao substrato como mostrado na Figura 3.
Figura 3. Modelo esquemático da montagem da estrutura do proteassoma 20S e seus reguladores, PA700,
PA200, COP9 e PA28. Através de processo dependente de ATP, o proteassoma 20S associa-se a duas unidades
regulatórias PA700 formando o proteassoma 26S. A unidade 20S, sob estímulo de INF-γ, numa reação
independente de ATP, pode associar-se a PA28, formando o imunoproteassoma. A ocorrência de proteassomas
híbridos tem sido reportada.
Introdução
22
O ativador do proteassoma melhor descrito na literatura é o PA700 ou 19S citado
acima. Outros complexos protéicos conservados como o PA200 e o PA28 (também
denominado 11S ou REG), são capazes de associar-se especificamente e ativar o proteassoma
20S, considerando que estes não são capazes de reconhecer proteínas ubiquitinadas (HILL et
al, 2002; USTRELL et al, 2002; RECHSTEINER & HILL, 2005). As propriedades
bioquímicas destes ativadores localizados no núcleo, já são bem descritas, porém seus papéis
biológicos não foram completamente elucidados. Recentemente, Ustrell e colaboradores em
2002 levantaram a hipótese de que o ativador PA200 esteja envolvido em processos no reparo
de DNA. Existem três genes homólogos de PA28, denominados α, β e γ. As subunidades α e
β formam um heteroheptâmero enquanto as α formam um homoheptâmero (TANAKA &
CHIBA, 1998). Diversos trabalhos independentes sugerem a conexão entre o complexo
PA28αβ estando associado ao 20S e resultando na apresentação de antígenos via MHC de
classe I, formando o complexo PA28αβ-20S-PA28αβ denominado imunoproteassoma. A
distribuição intracelular de PA28αβ é preferencialmente no citoplasma enquanto que o PA28
γ é localizado no núcleo. Até o momento, a função biológica do complexo PA28 γ é pouco
entendida, porém há evidências que relacione este complexo com a apoptose
(RECHSTEINER & HILL, 2005). Todos os genomas de metazoários contém pelo menos um
gene para o PA28γ , sugerindo uma função conservada deste ativador do proteassoma (HILL
et al, 2002)
Estudos demonstaram que estes dois ativadores normalmente encontram-se em
complexos misturados, onde o proteassoma 20S pode estar ligado em uma extremidade pelo
19S e na extremidade opsota pelo PA28 ou pelo PA200, podendo funcionar desta forma como
adaptadores de “proteassomas híbridos” ( TANAHASHI et al, 2000; USTRELL et al, 2002;
RECHSTEINER & HILL, 2005; LECKER et al, 2006).
Introdução
23
O COP9 signalossomo (CSN) é um complexo protéico, conservado em eucariotos, o
qual está aparentemente envolvido com o sistema ubiquitina proteassoma. Este complexo é
constituído por 8 subunidades no qual dados moleculares e filogenéticos destas subunidades
apontam para uma alta similaridade com as subunidades que formam a tampa do ativador 19S
(WEI & DENG, 1999).
Dados bioquímicos forneceram as primeiras evidências da relação entre a via de
ubiquitinação e o CSN, a partir de dados da interação do CSN com o complexo E3 ligase SCF
(LYAPINA et al, 2001). Evidências experimentais também indicam que o CSN interage
diretamente com o proteassoma 26S e compete com o complexo 19S. Em excesso molar de
CSN ocorre a substituição da tampa 19S pelo CSN, alterando desta forma a atividade
peptidásica do proteassoma in vitro (PENG et al, 2003; HUANG et al, 2005).
1.6. PI31, um inibidor endógeno do proteassoma
Em contraste aos ativadores mencionados acima, o PI31 (Protein inhibitor of 31KDa)
age como um inibidor endógeno do proteassoma, modulando desta forma sua atividade
proteolítica.
Esta proteína foi descrita por Chu-Ping e colaboradores em 1992, como uma simples
proteína monomérica que possuia a capacidade de inibir a atividade proteolítica do
proteassoma. O inibidor endógeno PI31 foi primeiramente isolado de hemáceas bovinas e
que sob condições não desnaturantes apresenta-se na forma multimérica e associa-se
diretamente com o proteassoma 20S. Recentemente a proteína PI31 foi clonada e expressa
em sistema heterólogo e foi constatado que ela inibe a hidrólise de pequenos substratos
sintéticos e de grandes proteínas desenoveladas pelo proteassoma 26S. Esta inibição é maior
sobre as atividades similares a quimiotripsina e caspase do que sobre a tripsina.
(McCUTCHEN-MALONEY et al, 2000; ZAISS et al, 1999).
Introdução
24
A sequência desta proteína não tem homologia com nenhuma outra família de
proteínas. A proteína PI31 possui a particularidade de apresentar uma região rica em prolina
na porção carboxi-terminal e que estudos de mutação da mesma sugerem que esta é a região
que apresenta o domínio ativo. Devido as prolinas presentes na região C-terminal, a sua
estrutura secundária é extendida nesta região sugerindo a interação com o proteassoma 20S e
modulando sua atividade (McCUTCHEN-MALONEY et al, 2000).
De acordo com estudos de Zaiss e colaboradores (2002), o PI31 age como um
modulador seletivo do proteassoma mediando as vias de processamento de antígeno via MHC
de classe I e também interfere na maturação dos complexos precursores do imunoproteassoma
representando desta forma uma papel de grande importância na célula.
Além disso, o PI31 também é um inibidor competitivo da ativação do proteassoma
20S pelo complexo PA28αβ, apresentando uma afinidade ao redor de 50 vezes maior do que
a afinidade da ligação do complexo PA28αβ ao proteassoma. Surpreendentemente, apesar da
alta afinidade, a taxa de inibição do proteassoma por PI31 não excede a 50%, mesmo em
níveis extremamente elevados de PI31 (ZAISS et al, 1999).
Durante os últimos anos, o nosso grupo vem estudando extensivamente a via
ubiquitina- proteassoma, levando a permanente conclusão de que S. mansoni apresenta um
sistema funcional de degradação intracelular. A sistemática caracterização bioquímica das
atividades peptidásicas endógenas e exógenas deste complexo proteolítico durante o
desenvolvimento do parasita nos seus respectivos hospedeiros, mostrou a existência de
variação estágio-específica nas atividades do proteassoma. Contudo verificou-se que a
atividade peptidásica exógena e a atividade proteolítica endógena do proteassoma na fase de
cercárias é consideravelmente menor quando comparadas as de vermes adultos, como também
um acúmulo de substratos poliubiquitinados nesta fase, sugerindo desta forma, a existência de
uma modulação na atividade do proteassoma nesta transição durante o ciclo de vida do
Introdução
25
parasita. (GUERRA-SÁ et al; 2000; GUERRA-SÁ et al, 2005).
Ainda nesta linha de pesquisa, Pereira-Jr em 2005, demonstrou a expressão diferencial
dos RNAm de várias subunidades constituintes do complexo 19S na fase de
esquistossômulos, como a aparente ausência de expressão das subunidades ATPásicas Rpt1,
Rpt2 e Rpt6.
Em 2007, Castro Borges e colaboradores identificaram a presença de várias isoformas
das subunidades do tipo α e β, sugerindo que os processos de modificações pós traducionais
tipo fosforilação estariam de alguma maneira envolvidos na modelagem deste complexo
proteolítico especialmente na transição de cercária a esquistossômulo. Neste contexto, as
modificações pós traducionais modificariam as subunidades α permitindo desta forma a
interação com outras partículas regulatórias.
Desta forma, a partir dessas evidências, o estudo de reguladores do proteassoma
permitirá um melhor entendimento da modulação da atividade do proteassoma durante o
desenvolvimento do S. mansoni no complexo ciclo de vida.
2. OBJETIVOS
Objetivos
27
2.1. Objetivo geral
Este trabalho tem como objetivo geral a caracterização molecular e funcional do
inibidor endógeno do proteassoma PI31 durante o ciclo de vida do parasita S. mansoni.
2.2. Objetivos específicos
Recuperar a seqüência que codifica para o inibidor endógeno do proteassoma PI31
através de análise in silico nos bancos de dados disponíveis do parasita.
Determinar a expressão do gene que codifica para o inibidor endógeno do PI31 no
ciclo de vida do parasita, através de PCR quantitativo;
Expressar o inibidor endógeno PI31 em sistema heterólogo, purificar, confirmar a
identidade por espectrometria de massa e produção do anticorpo em camundongos;
Analisar a estrutura primária da proteína e sua filogenia molecular;
Analisar a expressão da proteína nas fases de verme adulto, cercária e ovos por
western blot.
Analisar os níveis de conjugados poli-ubiquitinados em extrato protéicos de vermes
adultos por Western blot.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
29
3.1. Manutenção do ciclo de vida de S. mansoni e obtenção da fase de vermes adultos
O ciclo biológico da linhagem LE do S.mansoni, é mantida rotineiramente no
laboratório de Biologia Molecular de Parasitas do Departamento de Bioquímica e Imunologia
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP), utilizando
moluscos da espécie Biomphalaria glabrata, como hospedeiros intermediários, e
camundongos Swiss e BALB/c, como hospedeiros definitivos. Os ovos de S. mansoni,
presentes nas fezes de camundongos das linhagens Swiss ou Balb/C previamente infectados
com o parasita foram recolhidos pelo método de Hoffmann (HOFFMANN et al., 1934) e
expostos por aproximadamente 1 hora sob luz, para a liberação dos miracídios. Os miracídios
(cerca de 15 a 18) foram utilizados para infectar o caramujo, que após 38 a 43 dias liberaram
as cercárias, que são a forma infectante do parasita , que por sua vez será utilizada para
infectar o hospedeiro vertebrado . As cercárias foram inoculadas nos camundongos via
subcutânea e após aproximadamente 45 dias, os vermes adultos foram recuperados do sistema
porta-hepático por perfusão. Após a coleta, os parasitas foram mantidos em meio RPMI
(Invitrogen), suplementado com 20 µM de tampão HEPES, pH 7.5 e, sendo em seguida
congelados a -70ºC até o momento do uso.
3.2. Obtenção da fase de ovos de S. mansoni
Além dos ovos terem sido obtidos pelo método de Hoffmann, eles também foram
recuperados do fígado de camundongos após 45 dias de infecção com o parasita S. mansoni.
Cerca de dez fígados foram coletados na perfusão e homogeneizados em 200 mL de solução
contendo 1.79 g de Na
2
HPO
4
, 0.09 g de KH
2
PO
4
, pH 8,3 e 20 mg de tripsina (Invitrogen). O
homogeneizado foi incubado em banho-maria a 37ºC durante 3 horas e posteriormente, os
ovos foram recuperados por duas peneiras de malhas metálicas de 0.30 e 0.180 milímetros
respectivamente, em solução de NaCl a 0.9%. (Castro-Borges, 2005).
Materiais e Métodos
30
3.3. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos
A transformação de cercárias em esquistossômulos, foi feita segundo o método
descrito por Harrop e Wilson ,1993. Em linhas gerais, as cercárias após serem liberadas pelos
caramujos foram transferidas para um tubo de poliestireno de 50 mL (tipo Falcon) e
incubadas em gelo por duas horas para sedimentar. Transcorrido este período, o sobrenadante
foi aspirado com o auxílio de pipeta Pasteur. As cercárias presentes no fundo do tubo foram
transferidas para tubos de poliestireno (tipo falcon) de 15 mL, ressuspendidas em 10 mL de
água declorada e deixadas em gelo por 10 minutos. O processo de lavagem com água
declorada e descarte do sobrenadante foi repetido por três vezes. Posteriormente a água foi
retirada e foram adicionados 6 mL de meio RPMI 1640 (Invitrogen). Para a transformação
mecânica, as cercárias foram vigorosamente agitadas em vortex (Tecnal TE 089) sob
velocidade máxima, durante 90 segundos para que ocorra a separação da cauda do corpo
cercariano. Para a remoção das caudas, 1 mL de meio RPMI 1640 foi adicionado em cada
eppendorf contendo os esquistossômulos e estes sofreram repetidas lavagens com meio
RPMI, com um intervalo de quatro minutos entre cada lavagem, para sedimentação dos
mesmos e remoção das caudas presentes no sobrenadante. As lavagens foram acompanhadas
em microscópio de luz invertida (Leitz, Diavert). O material foi transferido para uma garrafa
estéril de 50mL e o volume completado para 30mL com meio RPMI 1640 (Invitrogen)
suplementado com 20 µM of HEPES, pH 7.4, penicilina cristalina G (1000 UI/mL),
estreptomicina (1000 µg/mL) e 10% de soro fetal bovino (Gibco). A cultura foi mantida a
37°C com atmosfera de 5% CO
2
. Após o período de incubação, aproximadamente 28 mL do
sobrenadante foi aspirado e descartado; e os 2 mL restantes foram distribuídos em tubos tipo
eppendorf e imediatamente recuperados por centrifugação (centrifuga 5417R-eppendorf/
1000g / 3minutos / 4ºC) e mantidos a -70ºC até o momento do uso.
Materiais e Métodos
31
3.4. Análise in silico
A seqüência referente ao cluster do inibidor endógeno do proteassoma PI31 (número
de aceseeo 609743.1) foi recuperada do banco de dados do projeto transcriptoma do S.
mansoni (Verjovski-Almeida et al 2003) . A identificação da provável região codificadora foi
feita com o auxílio do algorítimo ORF finder (www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)
. A seqüência
predita para SmPI31 foi analisada utilizando os algorítimos BLASTn para nucleotídeos e
BLASTx para aminoácidos.
Visando identificar domínios conservados, a seqüência foi submetida a uma análise na
base de dados do algorítimo Pfam localizado no site www.sanger.ac.uk/software/pfam/.
3.5. Análise da estrutura genômica do gene SmPI31
A sequência de DNA genômico foi recuperada do banco de dados do parasita
S.mansoni GeneDB, cujo número de acesso é Smp_066340 , os íntrons foram localizados e a
sequência genômica foi alinhada com a sequência de cDNA com o auxílio do programa
CLUSTALW (www.2ebi.ac.uk/clustalw).
3.6. Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para a análise da expressão do
SmPI31 no ciclo evolutivo de Schistosoma mansoni utilizando PCR quantitativo.
Com base na seqüência de cDNA do SmPI31, idealizamos os oligonucleotídeos
iniciadores com o auxílio do programa Vector NTI (Invitrogen), para amplificar a matriz de
leitura aberta (ORF) predita do gene a ser estudado (Tabela 1). O alinhamento dos
oligonucleotídeos iniciadores pode ser observado no Anexo 1.
Materiais e Métodos
32
Tabela 1. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para o PCR quantitativo. Os clusters foram recuperados
do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma geneDB, Sanger-UK e analisados conforme descrito neste
ítem. A seguir, utilizamos o programa VectorNTI (Invitrogen) para a idealização dos oligos. Como controle
endógeno foi utilizado o gene que codifica para alfa-tubulina (Webster et al. 1992).
Cluster
Gene Oligos Temperatura de
anelamento
Produto
Esperado/(pb)
03519 PI31 F5’-ACGAAGGCCCTTTGTGGACGA-3’
R5’-GCATGGCATGATCAGGATCTGGA3’
60 °C 321
M80214*
α-tubulina F5’-ACGAAGGCCCTTTGTGGACGA-3'
R5’-GCATGGCATGATCAGGATCTGGA-3’
60 °C 377
3.7. Extração de RNA total das diferentes fases evolutivas de S. mansoni
Vermes adultos, ovos, cercárias e esquistossômulos, foram utilizados para a extração
do RNA total, como descrito a seguir: As diferentes fases evolutivas do parasito S. mansoni,
foram homogeneizadas em politron ( JK IKA LABOR TECHNIIK ULTRA TURRAX T8)
com 1,0 mL de Trizol LS (Invitrogen), até completa solubilização. Em seguida, a mistura foi
incubada por 15 minutos à temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos
complexos de nucleoproteínas.
Decorrido este intervalo de tempo, o extrato foi passado em uma seringa de 1 mL com
agulha de 26G (13 x 4.5) por 3 vezes para conferir a quebra do DNA genômico e então, foi
adicionado à mistura 200µL de clorofórmio. As amostras foram agitadas vigorosamente em
vortex (tecnal TE 089) por 10 segundos e incubados à temperatura ambiente durante 5
minutos. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 12000g por 15 minutos a 4°C (centrífuga
5417R-eppendorf). Após esta etapa de centrifugação, a mistura separou-se em duas fases,
inferior (fase fenol-clorofórmio), interfase e fase aquosa superior incolor. Neste processo, o
DNA fica retido na interfase, as proteínas na fase orgânica, enquanto o RNA permanece
exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um tubo de poliestireno
Materiais e Métodos
33
estéril (tipo eppendorf) e adicionamos aproximadamente 500 µL de etanol 70% em água
previamente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) ao RNA. O tubo foi vagarosamente
invertido por três vezes e incubado à temperatura ambiente por 15 minutos. Após esta fase de
separação com Trizol LS (Invitrogen) o RNA foi purificado com o auxílio do sistema
“Purelink
TM
Micro-to-Midi Total RNA Purification System”(Invitrogen). Aproximadamente
700 µL da amostra foram transferidos para uma coluna com membrana de sílica e
centrifugados a 12.000g por 15 segundos, o eluído foi descartado e o restante da amostra foi
submetido ao mesmo processo, para que o RNA ficasse ligado à coluna. Posteriormente, foi
realizada a lavagem pela adição de 700 µL de Tampão de lavagem I e centrifugação a
12.000g por 2 minutos. A coluna foi colocada em um novo tubo e então, adicionados 500 µL
de Tampão de lavagem II , centrifugadas a 12.000 x g por 15 segundos, este procedimento foi
realizado por 2 vezes. A coluna foi colocada em um tubo tipo eppendorf para a eluição do
RNA, onde foram adicionados 30 µL de água livre de RNase. Após 5 minutos de incubação,
as amostras foram centrifugadas a 12.000g por 15 segundos, a coluna foi desprezada e o
precipitado final foi seco a vácuo (speed vac), depois ressuspendido em 15 µL de água tratada
com DEPEC e mantido a -70ºC até o momento do uso. Uma alíquota do material foi avaliada
em gel de agarose-formaldeído 1%, para verificar a qualidade do RNA.
3.8. Quantificação do RNA
As concentrações de RNA foram estimadas a partir da medida de absorbância a
260nm em espectofotômetro (eppendorf Biophotometer 8,5mm). Uma unidade de
absorbância a 260nm corresponde aproximadamente a 40 µg/mL de RNA. O grau de pureza
da preparação foi estimado através da relação entre as leituras a 260 e 280nm. As preparações
foram consideradas boas, quando o valor da razão A=260/280 variava entre 1,8-2,2.
Materiais e Métodos
34
3.9. Obtenção do cDNA do transcrito que codifica para o inibidor endógeno PI31 em S.
mansoni
Para sintetizar o DNA complementar (cDNA) nos diferentes estágios evolutivos do
parasita S. mansoni, foi utilizada a técnica de RT-PCR. Neste procedimento, inicialmente foi
sintetizada a fita simples de cDNA, utilizando o kit ThermoScript RT-PCR System
(INVITROGEN), com o iniciador oligo (dT), como resumidamente descrito abaixo:
Foi utilizado 1µg de RNA total obtido a partir de diferentes formas evolutivas do
parasita, 50pmol do iniciador oligo (dT), 10mM de dNTP`s e água livre de RNase, para um
volume final de 12µL. Esta mistura foi incubada por 5 minutos a 65ºC, seguido de banho de
gelo por 3 minutos. Em seguida foram adicionados tampão 5X para concentração final de 1X
e a enzima transcriptase reversa, 0,1 M de DTT, RNAout 40 u/µL e água livre de RNAse.
Posteriormente, a amostra foi transferida para um termociclador, sendo incubada por 60
minutos a 50ºC. Após este intervalo de tempo, a reação foi interrompida por incubação a 85ºC
por 5 minutos. Como passo seguinte, foi adicionada à amostra1µL de RNAse H, seguido de
incubação por 20 minutos a 37ºC. As amostras foram armazenadas a -20ºC até o uso.
3.10. Reação em cadeia da polimerase
Foram realizadas amplificações utilizando cDNA de vermes adultos, combinados com
os oligonucleotídeos específicos indicados na tabela 01 para a amplificação do gene em
estudo neste traballho.
Para a reação do PCR, utilizamos um programa de amplificação com 35 ciclos, cada
um composto de uma etapa de desnaturação durante 1 minuto a 95°C, uma de anelamento
durante 1 minuto a 60°C e uma de extensão durante 2 minutos a 72°C, utilizando a enzima
Taq DNA Polimerase (Invitrogen). Como controle endógeno, utilizamos o gene da alfa
tubulina. Uma alíquota de 10µL desta reação foi analisada em gel de agarose a 1%.
Materiais e Métodos
35
3.11. Purificação do produto de PCR
Alíquotas de 30
a 40µL das reações de amplificação foram aplicadas em gel de
agarose 1,5%, seguidas de coloração com brometo de etídio (0,5mg/mL). Em seguida o gel
foi exposto em luz ultravioleta (transiluminador Uvis-20), e um pequeno bloco de agarose
(200 a 300mg) contendo o fragmento de interesse foi retirado, com o auxílio de um bisturi.
Após este procedimento, o fragmento de interesse foi extraído do bloco de agarose com o
auxílio do kit Geneclean Turbo (GE) de acordo com o boletim técnico do fabricante.
3.12. Clonagem no vetor pGEMT- easy e transformação em células competentes
Os fragmentos de cDNA devidamente purificados foram ligados em vetor de
sequenciamento pGEMT easy (Promega), de acordo com especificações do fabricante. Cerca
de 5,0µL das reações de ligação foram utilizados nos procedimentos de transformação.
Nestes experimentos utilizamos células competentes preparadas pelo método descrito por
HANAHAN (1985).
O plasmídio foi introduzido em bactéria competente E. coli da linhagem DH5α,
através de choque térmico durante 90 segundos a 42°C, seguido de 3 minutos em banho de
gelo. Em seguida a bactéria foi mantida sob agitação em meio SOC (SOB enriquecido com
glicose) a 200 rpm e 37°C, por 1h e 30 min. Decorrido este intervalo, a suspensão bacteriana
foi espalhada em meio LB/ampicilina contendo X-GAL (20µL/mL), para fazermos uma
prévia seleção dos plasmídeos com inserto (colônias brancas) e sem inserto (colônias azuis) e
mantidas em estufa durante16 horas a 37°C.
3.13. Minipreparação de DNA plasmidial
Uma alíquota de uma colônia que supostamente continha o inserto foi inoculada em
5mL de LB/ampicilina (100mg/mL) e incubada a 37ºC sob agitação constante de 200 rpm por
Materiais e Métodos
36
16 horas. Após a incubação, 1,5mL da suspensão bacteriana foi transferida para tubo
eppendorf estéril e centrifugada a 12.000g por 1 minuto, e o sobrenadante foi desprezado.
Este procedimento foi repetido mais duas vezes. Portanto, a quantidade recuperada em cada
eppendorf ao final desse processo foi equivalente a 4,5mL de suspensão bacteriana. Em
seguida, as bactérias foram ressuspendidas em 400µL de tampão STET (glicose 8%, triton X-
100 0,1%, EDTA 50mM, Tris-HCl 50mM, pH 8,0) e adicionado 10mL de lisozima
(50mg/mL). Os tubos foram agitados em vortex por 10 segundos, incubados 5 minutos a
temperatura ambiente por 45 segundos a 95ºC para inativar a enzima. Após este período, os
tubos foram centrifugados a 12.000g por 10 minutos e o precipitado removido com o auxílio
de um pequeno bastão de madeira. Ao sobrenadante, foram adicionados 10mL uma solução
de CTAB 5% . Os tubos foram invertidos por 5 vezes e centrifugados a 12.000g por 5
minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspenso em 600µL de NaCL
1,2M. Em seguida, o DNA plasmidial foi precipitado com a adição de 750µL de etanol 100%.
A mistura foi vigorosamente agitada em vortex por 10 segundos e o DNA recuperado por
centrifugação a 12.000g por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o precipitado lavado
com 800µL de etanol 70%. Após nova centrifugação a 12.000g por 5 minutos, o sobrenadante
foi novamente removido e o precipitado seco a vácuo. Este foi ressuspendido em 25µL de
Tampão (HCl 10mM pH 8,0 e EDTA 0,1mM) e uma alíquota foi utilizada para estimar a
concentração e outra analisada em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio.Os
plasmideos assim obtidos foram mantidos a -20ºC até o momento do uso.
3.14. Sequenciamento dos nucleotídeos
Para realizar o sequenciamento dos plasmídeos bem como produtos de PCR,
utilizamos a técnica do término do crescimento da cadeia, inicialmente desenvolvida por
SANGER et al, 1997. As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit Big-
Materiais e Métodos
37
Dye Terminator (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante e as
reações, analisadas no seqüenciador automático de DNA, ABI 3100 Genetic Analyzer
(Applied-Biosystems). Os plasmídeos foram seqüenciados nas direções “forward” e
“reverse” com o auxílio dos oligos iniciadores M13 universal (S) ou M13 reverso (AS).
3.15. Análise computacional das seqüências
As seqüências obtidas foram submetidas à busca de homologia com nucleotídeos e
aminoácidos com o auxílio dos algoritmos BLASTn e BLASTx, respectivamente
(www.ncbi.nlm.nih.gov). Também foi utilizado o algoritmo Pfam
(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/), para identificar os domínios conservados nas seqüências
preditas de aminoácidos. O programa BLAST2 (www.ncbi.nlm.nih.gov) e ClustalW
(www.ebi.ac.uk) foram utilizados para auxiliar no alinhamento das seqüências de
nucleotídeos e aminoácidos preditas e o programa BOXSHADE (bioweb.pasteur.fr) para a
formatação dos resultados a serem apresentados.
3.16. Análise da expressão diferencial do gene que codifica para o inibidor endógeno do
proteassoma PI31 de S. mansoni utilizando PCR quantitativo.
Para análise da expressão do gene que codifica para PI31 em S. mansoni foi utilizada a
técnica de PCR em tempo real. Para tanto, foram utilizados primers especificos indicados na
tabela 01. As reações da PCR foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR
SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação de PCR
quantitativo foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500 Applied
Biosystems. As análises foram feitas utilizando o método do ∆Ct, utilizando a fórmula 2
-∆Ct
,
para quantificar a expressão do gene em estudo durante o desenvolvimento do parasita,
conforme boletim técnico do fabricante (Applied Biosystems).
Materiais e Métodos
38
3.17. Clonagem da seqüência codificadora em vetor pET 28a+ (Novagen) para expressão
em sistema bacteriano.
3.17.1. Características do vetor pET 28a+
O vetor pET28a+ (Figura 4) possui duas seqüências que codificam para cauda de
histidina (17pb), uma origem de replicação (455pb), as regiões do promotor, a seqüência
referente ao operon da lactose, lac I (1079pb), e o gene que confere resistência à Kanamicina
(812pb). Além disso, apresenta também uma região com múltiplos sítios de clonagem, que
podem ser clivados pelas enzimas de restrição.
Figura 4. O vetor pET28a. Note as seqüências codificadoras do operon lac (lacI), a que confere resistência à
Kanamicina (kan) e a origem de replicação (ori) As enzimas NdeI e BamHI marcados indicam a localização das
seqüências clivadas para a inserção do gene de interesse (SmPI31) juntamente à seqüência da cauda de
6xHistidina), também previamente clivado com as mesmas enzimas (adaptado, Novagen).
Materiais e Métodos
39
3.17.2. Preparação do vetor
3.17.2.1. Preparo de células cálcio-competentes
Células E. coli DH5α foram inoculadas em placa contendo meio LB seletivo
(100µL/mL de ampicilina) e mantidas 37°C durante 12 horas. Em seguida, 5 mL de meio
líquido LB foram inoculados com algumas destas colônias crescidas neste período, deixando-
se este pré-inóculo crescer durante a noite a 37°C com agitação de 180 rpm. Estes 5mL de
cultura crescidos foram usados para semear 500mL (diluição 100 vezes) de meio LB líquido
(contendo 20mM de glicose e 20mM de Mg
2+
). A cultura foi crescida a 37°C sob agitação
constante de 180 rpm, até que a DO
600
atingisse 0,3.
Em seguida, transferiu-se toda a cultura para tubos de centrífuga estéreis e todo o
processo foi feito a 4°C. Incubou-se a cultura no gelo por 5 minutos, em seguida a mesma foi
centrifugada a 4000g por 10 min. Na sequência, o sedimentado foi ressuspendido em 100 mL
de tampão cálcio/glicerol (CaCl
2
60mM, PIPES 10mM e glicerol 15%).
Centrifugou-se por mais 10 min. a 4000g descartou-se o sobrenadante e as células
foram precipitadas em novos 100mL de tampão cálcio/glicerol e incubou-se em gelo por 30
min. Repetiu-se posteriormente a etapa de centrifugação e o sedimentado de células foi
ressuspenso em 12mL de tampão cálcio/glicerol. As bactérias foram distribuidas em alíquotas
de 50µL e congeladas em banho de gelo seco/etanol, sendo posteriormente armazenadas e
mantidas por até 60 dias a -70°C.
3.17.2.2. Transformação em E. coli DH5α
As bactérias foram transformadas adicionando-se 50µL de 30mM MgCl
2
, 10mM
CaCl
2
e 50µL de solução contendo a bactéria E.coli da linhagem DH5α competentes e 100ng
de vetor pET28a. A introdução dos vetores na bactéria foi realizada por choque térmico (20
Materiais e Métodos
40
min. em gelo seguido de 20 min. à temperatura ambiente). O crescimento das bactérias
ocorreu por 1 hora a 37ºC em 1,0 mL de meio de cultura Luria-Bertani (LB - 10g/L triptona,
5g/L extrato de levedura e 10g/L Cloreto de Sódio), 10mM de glicose e 10mM MgCl
2
. Após
este período, as células foram centrifugadas (Centrífuga Eppendorf, modelo 5415 R) a 5000g
por 3 minutos a 25ºC. As bactérias foram ressuspensas em 100 µL de meio de cultura e
semeadas em placas de Petri contendo meio LB com 1,5% de Ágar e 40µg/mL de Kanamicina
(Sigma) e mantidas em estufa de cultura a 37ºC por 16 horas.
3.17.2.3. Extração do DNA plasmidial
As colônias de bactéria contendo o vetor foram inoculadas em tubos com 3mL de
meio LB (SAMBROOK et al., 2001) e 40µg/mL de Kanamicina (Sigma) e mantidas a 37°C
durante 12 horas. A seguir, as culturas foram centrifugadas à 1000g/5minutos/4
o
C e o
sedimentado foi ressuspenso em 100µL tampão GET (50mmol.L
-1
Glicose, 10mmol.L
-1
EDTA pH8.0, 25mmol.L
-1
TRIS-Cl pH8.0) e agitado fortemente. Posteriormente, adicionou-
se 200µL de solução de lise (200mmol.L
-1
NaOH, 1% SDS), com agitação e foi mantida a 5
minutos a temperatura ambiente. Após a lise, foi adicionado 150µL de 3mol.L
-1
de acetato de
potássio na solução e mantido por 5 minutos a temperatura ambiente. A solução foi
centrifugada à 10000g/5minutos e o sobrenadante foi precipitado com etanol 100%, lavado
com 70% etanol, seco e mantido por 2 horas a 37
o
C em 200µg/mL de RNase A (Sigma). Em
seguida, o DNA foi extraído com fenol (dois volumes de fenol, centrifugação 10000g/5
minutos/4
o
C, coleta da fase aquosa) e precipitado (10% 3mol.L
-1
acetado de Sódio, dois
volumes de 100% etanol, centrifugação 10000g/5minutos/4
o
C, lavado com etanol 70% , seco
e ressuspenso em 20µL de água ultrapura autoclavada).
Materiais e Métodos
41
3.17.2.4. Digestão do vetor
O vetor pET28a foi digerido a 37°C durante 16 horas com 5U da enzima NdeI e 5U
de BamHI (Promega).No final de cada digestão, a forma linear foi purificada do gel de
agarose 1,5% , conforme descrito anteriormente (item3.11).
3.17.2.5. Defosforilação da forma linear do vetor
A defosforilação da forma linear foi feita com 0,01U de fosfatase alcalina de
bezerro/pmol DNA (Promega) por uma hora a 37ºC e posterior purificação do DNA com o
Kit Geneclean turbo, conforme boletim técnico do fabricante.
3.17.3 Idealização dos oligonucleotídeos iniciadores para expressão da proteína
recombinante.
Os oligonucleotídeos foram idealizados para a amplificação da sequência codificadora
da proteína SmPI31, inserindo-se sítios de restrição para as enzimas NdeI no sítio 5', com o
códon iniciador para expressão (ATG), e BamHI no sítio 3', ambos sublinhados, como
demonstrado na Tabela 2. Os oligonucleotídeos alinhados a sequência estão apresentados no
Anexo 2.
Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados para a clonagem do sequência codificadora da proteína SmPI31.
Os clusters foram recuperados do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma geneDB, Sanger-UK. Os
sítios sublinhados correspondem respectivamente as enzimas de restrição NdeI e BamHI .
Cluster
Gene Oligos Temperatura de
anelamento
Produto
Esperado/(pb)
03519 PI31 F 5'TCACTTCACATATGCCTGGT3'
R 5'GGTATTGGGATCC
GCCTACATA3'
47°C 936
Materiais e Métodos
42
3.17.4. Amplificação da sequência codificadora do SmPI31 e ligação no vetor pET28a
Para a amplificação da sequência codificadora do inibidor PI31, foi escolhido o
estágio de vermes adultos devido a facilidade de obtê-los. O cDNA foi obtido conforme
descrito no item 3.9.
As amplificações foram feitas utilizando cDNA proveniente de vermes adultos,
combinados com os oligonucleotídeos específicos. A reação foi feita com uma etapa inicial de
desnaturação : 1 minuto a 93° C , uma de anelamento durante 1 minuto a 47°C , uma de
extensão durante 1 minuto e 30 segundos a 72°C seguidos de 35 ciclos utilizando a enzima
Taq DNA Polimerase (Invitrogen). Como controle endógeno utilizamos o gene da alfa
tubulina. As amostras foram purificadas do gel conforme descrito (item 3.11),multiplicadas
(item 3.17.2.2) e digeridas com as endonucleases de restrição NdeI e Bam HI (item 3.17.2.4).
O fragmento purificado e digerido com as enzimas NdeI e BamHI foi ligado ao vetor
pET28a defosforilado. Para a ligação foi usada a proporção de 3 partes de fragmento para 1
parte de vetor na presença de 1U da enzima T4 DNA ligase (Promega) durante 18 horas/16°C.
A solução de ligação foi usada na transformação da bactéria E.coli da linhagem DH5α
competentes (item 3.17.4), na presença de 40µg/mL de kanamicina.
A seleção das colônias de bactérias transformadas com os vetores contendo
fragmentos desejados foi feita pela reação de PCR de colônia com os iniciadores idealizados
para o promotor T7 (F 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' e R
GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'), (Novagen). Após a observação da banda de interesse no
gel de agarose 1%, a colônia foi crescida em meio LB na presença de 40µg/mL de
kanamicina, e o DNA plasmidial foi extraído da cultura conforme descrito no item 3.17.2.3.
Os clones selecionados foram submetidos ao sequenciamento para verificar se a janela
de leitura estava correta conforme descrito no item 3.14.
Materiais e Métodos
43
3.18. Expressão de proteínas heterólogas em linhagens E. coli BL21 Rosetta [DE3]plysS.
3.18.1. Preparo de células BL21 competentes
As bactérias foram crescidas em uma placa contendo 34µg/mL de cloranfenicol por 16
horas. Posteriormente inoculamos uma colônia isolada em 3mL de meio HDM (15g de
triptona, 25g de extrato de levedura pH=7.5) a qual foi mantida a 37°C po 16 horas (pré-
inóculo).
Inicialmente, 400µl do pré-inóculo foi inoculado em 40 mL de meio HDM e deixamos
sob agitação de 200 rpm a 37° até atingir densidade óptica igual a 0,6 no comprimento de
onda de 600 ηm. As bactérias foram centrifugadas a 3.500 rpm por 6 minutos, ressuspensas
em 40mL de MgCL2 0.1M, centrifugadas, ressuspendidas em 20mL de CaCl2 0.1M,
centrifugadas e ressuspendidas em 4mL de CaCl2.
As bactérias permaneceram por 40 minutos no gelo e foram aliquotadas com a adição
de glicerol 80% até o momento do uso.
3.18.2. Expressão da proteína em função do tempo de indução
A linhagem de E. coli BL21 competente foi transformada com: pET28a+ (controle
positivo), pET28a+PI31 e sem nenhum vetor (controle negativo). Foi utilizado 100µL de
solução contendo E.coli BL21 competentes. Os produtos foram introduzidos na bactéria por
choque térmico de 30 minutos no gelo seguido de 5 minutos em banho maria à 37°C. Após
este procedimento, as bactérias cresceram por 1 hora a 37ºC em 1,0 mL de meio de cultura
HDM. Em seguida, as células foram centrifugadas (Centrífuga Eppendorf, modelo 5415 R) a
2000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e as bactérias ressuspensas em 100 µL
de meio de cultura, que foram transferidas para placas de Petri com meio de cultura HDM
com 1,5% de ágar, 40µg/mL de kanamicina e 34µg/mL de cloranfenicol (Sigma) e mantidas
Materiais e Métodos
44
por 16 horas a 37°C. Uma colônia isolada foi inoculada em 3 mL de meio HDM que após 16
horas de crescimento foi inoculada em 400mL de meio HDM na presença de 40µg/mL de
kanamicina e 34µg/mL de cloranfenicol sob agitação de 200rpm a 37°C até atingir a
densidade óptica 0,6 no comprimento de onda de 600 ηm, onde 1mL de cultura foi coletado
(amostra sem indução) e o restante da cultura foi induzida com 1mM de isopropil-β-D-
tiogalactopiranosídeo (IPTG) (Promega). Até a quinta hora foi coletado 1mL de cultura a cada
hora e centrifugado a 4000xg por 3 minutos. O sedimentado foi ressuspendido em 100µL de
tampão de amostra para proteína ( 3,8mL de água, 1 mL de Tris-HCl 0,5M pH=6.8, 0,8mL de
glicerol, 1,6mL de SDS 10%, 0,4mL de 2-betamercaptoetanol, 0,4mL de azul de bromofenol
1%) e um volume correspondente a 0,15 unidades de OD
600
, foi aplicado em gel de
poliacrilamida desnaturante.
3.18.3. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A análise de proteínas das amostras foi feita em gel de poliacrilamida 12% (SDS-
PAGE) (Laemmli, 1970) sob voltagem de 300V e corrente de 20mA. Soluções de “Comassie
Blue (Sigma)” (0,1% “Comassie R-250”, 50% metanol, 7% ácido acético) foram usadas para
a coloração de proteínas.
3.18.4. Purificação parcial em média escala de proteínas por cromatografia de afinidade
A resina utilizada para a purificação das proteínas expressas foi a Ni-NTA (Quiagen).
Essa resina possui um adsorvente que interage com 4 sítios de ligação do íon de níquel ,
deixando 2 sítios livres para a interação com a cauda de histidina da proteína. Essa interação
com os íons divalentes é estável em várias condições, permitindo uma melhor variação de
parâmetros para a purificação da proteína de interesse.
A purificação parcial das proteínas em resina de Ni
2+
(Ni-NTA, Quiagen, Hilden,
Materiais e Métodos
45
Alemanha) foi iniciada com a adição de 40 mL de tampão de lise (60mM imidazol, 50mM
NaH
2
PO
4 ,
400mM NaCl, 4mM PMSF e Triton X 1% pH 8.0) e sonicado no gelo com pulsos
de 10 segundos intecarlados com 10 segundos de descanso por dez repetições.
O extrato solúvel da lise (40mL) foi incubado por uma hora a 4ºC com 1mL de resina
Ni-NTA (Quiagen), previamente equilibrada em tampão de lise. A resina foi empacotada em
coluna de cromatografia (10x1,5 cm). Coletou-se amostra do conteúdo que não ligou na
resina (“Flow Through”, FT). A resina empacotada foi lavada com 30 volumes de tampão de
lavagem (80 mM imidazol 50mM NaH
2
PO
4
, 400 mM NaCl, pH 8,0) e a proteína foi eluída
com 10 volumes de coluna de tampão de eluição (300 mM imidazol 50mM NaH
2
PO
4
, 400
mM NaCl, pH 8,0), coletados a cada 1 mL. As amostras da eluição foram analisadas por
eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante conforme descrito no item 3.18.3.
3.18.5. Quantificação da proteína
A quantificação das proteínas recombinantes purificadas por cromatografia de
afinidade foi realizadas pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). A curva padrão foi
feita com albumina bovina (Sigma) na faixa de concentração de 2,5 a 10mg/mL. A leitura da
absorbância foi feita no comprimento de onda de 595ηm utilizando o espectofotômetro
Hitachi U-2000.
3.19. Confirmação da identidade da proteína por espectrometria de massa
As bandas foram excisadas do gél de poliacrilamida SDS-PAGE e submetidas à
identificação por espectrometria de massa no laboratório química de proteínas aos cuidados do
professor Dr. José César Rosa. Os peptídeos após tripsinização foram analisados em um
espectrômetro de massas do tipo eletrospray triplo-quadrupolo (ESI-3Q-MS) (Quattro II,
Micromass, Manchester, UK) que permite obter dados de seqüência de aminoácidos via CID-
Materiais e Métodos
46
MS/MS. A análise utilizou uma origem eletrospray do tipo nanoflow contendo um capilar de
sílica fundida de 20µm de diâmetro interno, mantido a 3-4 kV, 40 V no cone de entrada e a uma
temperatura de 100ºC. A amostra foi introduzida através de uma bomba tipo seringa (Harvard,
Inc, USA) a um fluxo de 300 nl/min e os espectros de massa foram coletados na forma de média
de scans (15-30 scans) e processados com o software MassLynx v.3.3 (Micromass, Manchester,
UK). A coleta de dados de massa utilizou varredura em MS1(400-1200 u.m.a) obtendo-se assim
a determinação da massa dos peptídeos (“peptide mass fingerprint”). Cada íon de peptídeo
detectado foi submetido a CID-MS/MS (daughter ion scanning) que promove a fragmentação do
íon selecionado originando fragmentos de íons tipo b e y que foram utilizados para a dedução das
respectivas seqüências de aminoácidos dos peptídeos.
3.20. Análise da estrutura primária
As análises para a identificação dos domínios protéicos da protéina recombinante
SmPI31 foram realizadas utilizando o s programas Pfam (FINN et al. ,2000) ,SMART
(SCHULTZ et al. ,2000) e expasy www.expasy.org . A sequência da SmPI31 foi alinhada
com as sequências provenientes de outros organismos usando o programa CLUSTALW
(www.2ebi.ac.uk/clustalw) e os resultados foram formatados com o auxílio do programa
Boxshade (www.biomed.pasteur.fr) .
3.21. Análise Filogenética
Os alinhamentos da sequencias preditas bem como dos ortólogos recuperados do
GENBANK como:Homo sapiens NP006805
, Macaca mulatta XP001112708, Rattus
norvegicus NP001094475, Gallus gallus NP001026753, Xenopus laevis NP001088291,
Drosophila melanogaster NP610715
, Schistosoma mansoni Sm03519, Schistosoma
japonicum AAW25294
, e Schizosacharomyces pombe CAB88268 como grupo externo
Materiais e Métodos
47
(outgroup). Estas sequências foram utilizadas para calcular a árvore filogenética com a
utilização do software Mega (version 4.0) (Kumar et al 2004), utilizando a máxima
parcimônia como método de análise. A confiabilidade dos clados foi avaliada por análise
“bootstrap” utilizando 1,000 amostragens. Os alinhamentos para a reconstrução da filogenia
foram feitos com o auxílio do programa CLUSTAL W, contido no programa MEGA 4.0.
3.22. Produção de anticorpo anti-PI31 de S. mansoni em camundongos Balb/C
Amostras da proteína PI31 (50µg/animal), recuperadas por cromatografia de afinidade
foram emulsificadas em 3mL de Adjuvante completo de Freund (ACF-Sigma) e usadas para
imunizações subcutâneas no dorso dos camundongos Balb/C. Nas duas doses seguintes (15 e
30 dias após a primeira injeção) a proteína foi emulsificada em 3 mL de adjuvante incompleto
de Freund (AIF). Após uma semana de injeção foi realizado um ensaio imunoenzimático
(Western blot) para a detecção de anticorpos específicos. Aproximadamente 20µg de proteína
recombinante foram imobilizadas em membrana de nitrocelulose (Gibco). Esta membrana foi
incubada com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado , Tris 1M pH 7,5; 0,1% Tween 20)
durante uma noite. Após lavagens convencionais , a membrana foi incubada com soro pré-
imune ou imune do camundongo diluídos 1:500 e 1:1000. Seguiu-se a incubação com
anticorpo anti-IgG de camundongo marcado com fosfatase alcalina. A reação foi detectada
com NBT (nitrobluetetrazolium) e BCIP (5-bromo-4cloro-3indolil-fosfato) (Gibco BRL).
Soro de camundongo pré-imune foi utilizado com controle negativo. Os soros recuperados
foram armazenados a -20ºC.
3.23. Purificação do anticorpo
Amostras do soro recuperados dos camundongos foram aplicadas à coluna de Ni-NTA
(Quiagen) imobilizada com a proteína recombinante PI31. A coluna foi previamente
Materiais e Métodos
48
equilibrada com tampão fosfato 20mM, pH 7,4. e lavada com o tampão de equilíbrio para
remoção do material não adsorvido à coluna. O material adsorvido foi eluído pela adição de
0.1M de glicina pH 2,4. O procedimento cromatográfico foi realizado em sistema
cromatográfico automático FPLC (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), monitorado
por absorbância em 280nm.
3.24. Western blot para teste dos soros de camundongos imunizados
Cerca de 20µg de proteína PI31 recombinante foram transferidas para uma membrana
de Nitrocelulose (Amersham Hybond
TM
-P, GE Healthcare) e submetidas à análise por
Western blot. Após a eletrotransferência em Mini-Protean a membrana foi bloqueada com 5%
de leite desnatado no tampão de bloqueio (Tris 1M pH 7,5; 0,1% Tween 20). Depois da
reação de bloqueio as membranas foram incubadas com o anticorpo primário policlonal anti-
PI31 de camundongo (diluição 1/500) por 4 horas. Decorrido este tempo, as membranas
foram lavadas e posteriormente incubadas com o anticorpo de coelho anti-IgG de
camundongo conjugado à fosfatase alcalina (ZyMac
TM
Grade, Zymed) ( diluição 1:2500) por
1h e 30 minutos. A reação foi revelada utilizando os reagentes NBT/BCIP (INVITROGEN).
3.25. Preparação do extrato bruto das fases de vermes adultos, cercárias e ovos
A partir de parasitas adultos, cercárias e ovos foram preparados extratos de proteínas
totais. Os parasitas foram homogenizados no tampão (Tris 5mM pH 8,0; glicerol 1%, EDTA
1mM e PMSF 1mM;). O material foi brevemente sonicado e centrifugado a 10.000g por 30
minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenandante foi centrifugado a 40.000g por 60
minutos.
As concentrações protéicas presente nos extratos brutos, foram determinadas como
descrito no item 3.18.5 e analisadas em SDS-PAGE 12% (item 3.18.3).
Materiais e Métodos
49
3.26. Western blot para detecção de PI31 e proteínas poli-ubiquitinadas
Após a corrida eletroforética das frações protéicas de vermes adultos, cercárias e ovos,
o gel foi preparado para transferência (Biorad Trans-Blot) de acordo com o método descrito
por Towbin et al, 1979. Inicialmente, o gel foi imerso na solução de transferência (25mM
Tris-HCl, 0,192M de glicina , 20% de etanol absoltuto, pH8,3) por cerca de 20 minutos. Após
a montagem do sistema de tranferência, as proteínas presentes no gel de poliacrilamida foram
transferidas para membrana de PVDF previamente tratada com metanol, sendo o processo de
transferência realizado durante 2 horas sob voltagem fixa de 100Volts a 4°C. Após o término
da transferência, a membrana foi submetida à imunoblot, sendo incubada por 1 hora, sob
agitação, à temperatura ambiente com leite desnatado em pó 5%, diluído em TBS-T (0,02M
de Tris-HCl, 0,16M de NaCl, 0,1% de Tween 20). Após o bloqueio, a membrana foi
incubada overnight a 4°C com anticorpos primários para a detecção da proteína PI31
(anticorpo policlonal anti-PI31 produzido em nosso laboratório) e proteínas poli-ubiquitinadas
(anticorpo de camundongo anti-ubiquitina de humano-clone FKI-PW8805/BIOMOL). As
diluições dos anticorpos primários foram realizadas em solução TBS-T contendo 2,5% de
albumina bovina e utilizadas as seguintes razões dos anticorpos 1:500 e 1:2000
respectivamente.
O anticorpo foi então retirado e a membrana devidamente lavada com solução TBS-T,
posteriormente incubada durante 1 hora a temperatura ambiente, com anticorpo secundário
anti- IgG conjugado à peroxidase (anti-IgG de camundongo, diluição de 1:2500 em TBS-T) e
anticorpo secundário anti-IgM conjugado à peroxidase (anti-IgM de camundongo, diluição de
1:5000 ) respectivamente. Após a lavagem das membranas para remoção do anticorpo
secundário não ligado, a membrana foi revelada com filme autoradiográfico (Hyperfilm
ECL), na ausência de luz, 1 minuto após a adição de partes iguais dos reagentes do kit de
Quimioluminescência Amplificada (ECL, Amersham);
Materiais e Métodos
50
3.27. Medida da atividade proteolítica exógena
Foi utilizado o substrato fluorogênico Succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-4-metil-cumaril-7-
amida (SLLVT-MCA) para a determinação da atividade peptidásica do proteassoma presente
na fração citossólica de vermes adultos . Nestes ensaios foram utilizadas 50µg de proteínas e
13µM do substrato fluorogênico. O tampão utilizado foi Tris-HCl 50mM pH 8,0, MgCl
2
na
presença dos inibidores MG132 (para uma concentração final de 50µM, obtida a partir de
uma solução estoque de 11mM de DMSO) e PI31 (0,2µg e 1µg). O ensaio foi realizado num
volume final de 240µL e a incubação realizada durante 30 minutos a 37°C sendo interrompida
pela adição de 2 mL de etanol.
Os frascos permaneceram no gelo por no mínimo 1 hora, sendo posteriormente
centrifugados durante 10 minutos a 2500 rpm. A seguir, foram feitas leituras fluorimétricas
nos comprimentos de onda de 380nm (exitação) e 440 nm (emissão) e os resultados,
expressos em unidades de fluorescência obtidos em 1 hora por µg de proteína.
4. RESULTADOS
Resultados
52
4.1 Análise in silico
A sequência do inibidor endógeno do proteassoma do parasita S. mansoni denominada
PI31
foi recuperada do banco de dados do projeto transcriptoma do S. mansoni (Verjovski-
Almeida et al, 2003) cujo número de acesso é 609743.1. É sabido que 92% do transcriptoma
do parasita já estão anotados, o que corresponde a aproximadamente 14.000 genes (Verjovski-
Almeida et al, 2003).Para a identificação da provável região codificadora, a sequência predita
para SmPI31 foi submetida à análise utilizando o algorítimo ORF finder
(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) como demonstrada na Figura 5.
Figura 5. Sequência de nucleotídeos da região codificadora do gene SmPI31 de 909 pares de bases (pb). A
sequência foi analisada com o auxílio do algorítimo ORF finder.
A seqüência foi submetida à análise utilizando os algoritmos BLASTn para
nucleotídeos e BLASTp para aminoácidos. Para confirmar a identidade das seqüências de
aminoácidos preditas de SmPI31, as sequências também foram analisadas em banco de dados
Resultados
53
que permitem a identificação de domínios conservados numa seqüência primária de
aminoácidos. Neste caso, utilizamos a base de dados do algoritmo Pfam
(www.sanger.ac.uk/software/pfam/
), onde constatamos a presença de um único domínio,
denominado PI31, no fragmento gênico de SmPI31, que se inicia no 223° aminoácido e
termina no 285° aminoácido, como pode ser observado na Figura 06.
Figura 06. Sequência de aminoácidos predita de SmPI31 destacando o domínio PI31. A sequência predita
de aminoácidos foi analisada com auxílio do algorítimo Pfam para a identificação de domínios conservados na
sequência primária de aminoácidos.
4.2. Estrutura genômica do gene SmPI31
A seqüência de DNA genômico foi recuperada do banco de dados do parasita S.
mansoni GeneDB cujo número de acesso é Smp_066340. A Figura 7 demonstra a
organização estrutural do gene SmPI31, cuja sequência de DNA tem um tamanho de 9758pb,
composta por 2 íntrons e 3 éxons. O primeiro íntron possui 1922pb e o segundo 6807pb.
Figura 7. Organização genômica do gene SmPI31 em S. mansoni. Organização estrutural do gene SMPI31.
Representação esquemática da região codificadora e a localização genômica dos éxons e suas posições relativas.
O primeiro íntron contém 1922pb, e o segundo 6807pb.
Resultados
54
4.3. Amplificação do transcrito do gene PI31 em S. mansoni
Para amplificação do gene que codifica para SmPI31 foram idealizados
oligonucleotídeos que compreendiam uma pequena região localizada no interior da região
codificadora para posterior análise da expressão deste gene no ciclo de vida do parasita .
Como observado na Figura 8, após o RT-PCR obtivemos um cDNA que apresentou um
tamanho de 321 pares de bases (pb), o qual está de acordo com análises prévias. O transcrito
foi clonado no vetor pGEMT-easy e sequenciado como descrito em materiais e métodos. Para
confirmar a identidade do transcrito, as sequências foram submetidas à busca de homologia
em banco de dados (www.ncbi.nlm.nih.gov), com o auxílio do algorítimo BLAST.
Figura 8. Amplificação do transcrito de 321pb provenientes do gene SmPI31. Os primers foram idealizados
com o auxílio do programa Vector-NTI e validados por PCR. As amostras foram analisadas em gel de agarose
1%. PM- Peso Molecular de 100pb DNA ladder (Invitrogen).
4.4. Análise da expressão do cDNA que codifica para SmPI31 no ciclo de vida do
parasita
Para analisarmos a expressão do cDNA que codifica para SmPI31 nos estágios de
vermes adultos, esquistossômulos mecanicamente transformados (MTS) de 4horas(h), 18,5h,
24h, 48h e 72h, cercárias e ovos, utilizamos os oligonucleotídeos apropriados à análise por
Resultados
55
PCR quantitativo em tempo real (tabela 01). Esses oligonucleotídeos possuem a
particularidade de apresentarem um maior conteúdo de GC na porção 3', e também
apresentam um temperatuta de anelamento de 60°C o qual é mais adequado para a
amplificação do transcrito nas condições do PCR e também para a análise empregando curvas
de dissociação. As reações de PCR foram realizadas utilizando o kit Platinun SYBR green
qPCR SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação de
PCR quantitativo foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500
(Applied Biosystems).
Portanto, a análise da expressão do cDNA de 321pb obtido por qPCR que codifica
para SmPI31 durante o desenvolvimento do parasita, aponta para uma expressão diferencial
desse gene. Através do gráfico demonstrado na Figura 9, podemos verificar que esse gene
apresenta uma expressão diferencial nos estágios do parasita.
Podemos observar um aumento de 1,5X no nível de expressão de cDNA no estágio de
esquistossômulo MTS de 4h em relação à fase evolutiva de cercária. Esta expressão dimunui
em até 4,5X em esquistossômulos MTS de 24h e atinge um pico em esquistossômulos MTS
de 48h. Em MTS de 72h ocorre uma discreta diminuição na expressão do transcrito SmPI31.
No estágio evolutivo de vermes adultos, a expressão deste gene atinge o pico máximo, sendo
diminuído por volta de 3X na fase evolutiva de ovos.
Resultados
56
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Cercária E-4h E-18,5h E-24h E-48h E-72h Vermes
Adultos
Ovos
Expressão do gene SmPI31 em relação a
SmAlfa-tubulina
Figura 9. Expressão do gene SmPI31 no desenvolvimento do parasita. A expressão do mRNA foi avaliada
nos estágios de cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (MTS) de 4h; 18,5h; 24h; 48h e 72h ,
vermes adultos e ovos. Como controle endógeno normalizador foi utilizado o gene da alfa-tubulina e a análise da
expressão gênica relativa foi determinada pelo método do ∆Ct, utilizando a fórmula 2
-∆Ct
, onde foi designado
como calibrador da curva a expressão relativa à mensagem correspondente à alfa tubulina. Os resultados foram
divididos pelo de menor valor (E-24h) para efeito de representação gráfica. Cerca de 0,5µg de RNA de cada
estágio foram utilizados para a síntese do cDNA. A expressão foi confirmada em gel de agarose 1,5%.
4.5. Clonagem da sequência codificadora de SmPI31 em vetor pET 28a+ .
Com o intuito de produzir e purificar a proteína heteróloga PI31, a sequência que
codifica para SmPI31 foi amplificada por PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores
contendo sítios para as enzimas de restrição NdeI (sítio 5'), o qual possui em seu sítio de
clivagem o códon de iniciação da transcrição (CATATG
) e BamHI (sítio 3'), as quais eram
compatíveis com os sítios das enzimas de restrição presentes no poly-linker do vetor
pET28a+.
O transcrito amplificado por PCR em vermes adultos apresenta um tamanho de
aproximadamente 940pb, onde a temperatura de anelamento adotada foi a de 47°C para
posteriores amplificações de acordo com a Figura 10.
Resultados
57
Figura 10. PCR de gradiente com as amplificações da sequência codificadora para a proteína PI31. Os
oligonucleotídeos iniciadores foram idealizados adicionando-se sítios para as enzimas de restrição NdeI (sítio 5'),
que possui em seu sítio de clivagem o códon de iniciação da transcrição (CATATG
) e BamHI (sítio 3'), as quais
eram compatíveis com os sítios das enzimas de restrição presentes no poly-linker do vetor pET28a+. As
amostras foram analisadas em gel de agarose 1%. PM - Foi utilizado o Peso Molecular 1000pb (Invitrogen).
Resultados
58
Figura 11. Digestão do produto de PCR purificado e do vetor com as enzimas de restrição NdeI e BamHI
respectivamente. PM - Foi utilizado o Peso Molecular 1000pb (Invitrogen).
Bactérias da linhagem DH5α foram transformadas com o produto da ligação e foi feito
o PCR das colônias existentes para identificar os clones que possuiam o inserto. O DNA
plasmidial dos clones positivos foram amplificados e submetidos ao sequenciamento
automático para confirmar se a proteína estava na fase de leitura correta. Na Figura 12
mostramos o resultado do sequenciamento confirmando que a proteína PI31 está na fase de
leitura correta, iniciando-se com a metionina e terminando com o códon de parada (TGT).
Desta forma partimos para a próxima etapa que foi a expressão da proteína heteróloga.
Resultados
59
Figura 12. Sequenciamento automático de nucleotídeos do gene que codifica para a proteína PI31 clonado
no vetor de expressão pET28a+. Podemos observar a presença da cauda de seis histidinas na porção N-
terminal da proteína, seguida do sítio da enzima NdeI (sublinhado) e subsequente fim da proteína caracterizado
pelo códon de terminação(TAG).
Resultados
60
4.6. Expressão das proteínas recombinantes em bactéria E. coli linhagem BL21 Roseta
[DE3]pLysS.
4.6.1. Determinação do tempo de expressão da proteína SmPI31
As bactérias E. coli linhagem BL21 Roseta [DE3]pLysS foram transformadas com as
construções de pET28a +PI31 e pET28a como controle interno. As culturas de 400mL de
meio HDM foram inoculadas com as colônias provenientes das transformações. Ao atingir 0,6
de densidade óptica em 660 nm, 1mM de IPTG foi adicionado às culturas para a indução da
expressão da proteína recombinante. Na análise da expressão em função do tempo,
demonstrada na Figura 13, observa-se o aumento significativo da banda correspondente à
proteína heteróloga PI31 cujo tamanho é por volta de 35kDa nos intervalos de 1 a 5 horas de
indução quando comparado com a cultura não induzida (NI). Para a expressão desta proteína
o tempo estabelecido foi de 4 horas.
Figura 13. Cinética da expressão da proteína recombinante PI31. A ORF que codifica para a proteína PI31
foi clonada em vetor pET28a+ (Novagen) e a expressão foi induzida por 1mM de IPTG. A análise da expressão
foi monitorada pela retirada de alíquotas das bactérias em intervalos de 1 hora durante 6 horas (1h-6h), as quais
foram analisadas em gel SDS-PAGE 12%. NI- cultura não induzida. - vetor pET28a vazio. O marcador de peso
molecular utilizado foi o 6H (Sigma-Aldrich). A seta aponta a banda de aproximadamente35 kDa correspondente
a proteína PI31.
Resultados
61
4.7. Purificação da proteína heteróloga PI31
Depois da expressão, partimos para a determinação da identidade da proteína.
Primeiramente purificamos a proteína recombinante por coluna de afinidade Ni-NTA
conforme descrito no item 3.18.4. Para isso, o extrato solúvel foi submetido a este
procedimento. Como observado na Figura 14, uma parte da proteína não ligou à resina
presente na coluna (FT- “flowthrough”). A proteína que apresenta uma possível degradação
foi eluída em quatro frações e está livre de contaminações. O rendimento da proteína
purificada chega próximo a 20mg de proteína/litro.
Figura 14. Purificação da proteína heteróloga PI31 por cromatografia de afinidade. Gel de poliacrilamida
12% corado com Comassie Blue demonstrando Peso molecular 6H (Sigma-Aldrich) (PM), fração não ligada à
coluna (FT), lavagens 1, 5 e 10 (L1, L5 e L10 respectivamente) e as frações 1, 2, 3 e 4 das eluições (E1, E2, E3 e
E4).
Resultados
62
4.8. Confirmação da identidade da proteína por espectometria de massa do tipo
ESI/MS-MS
A proteína SmPI31 recombinante e sua degradação foram excisadas do gel e
submetidas à identificação por espectrometria de massa. A Figura 15 demonstra o espectro
de massa Peptide mass fingerprint dos peptídeos trípticos da proteína PI31 e de sua
degradação, confirmando desta forma a identidade das mesmas.
Figura 15. Análise da espectometria de massa da proteína recombinante de SmPI31 confirmando a
degadação da proteína. (A) Peptide mass fingerprint da digestão tripsínica da proteína SmPI31 recombinante.
(B) Degradação da proteína PI31 recombinante. (C) Sequência de aminoácidos da proteína SmPI31 do parasita
S. mansoni mostrando a localização dos peptídeos detectados pelo peptide mass fingerprint.
C
Resultados
63
4.9. Alinhamento da sequência primária de SmPI31 em relação aos seus ortólogos e
análise filogenética.
A seqüência de aminoácidos predita referente ao fragmento gênico SmPI31 em S.
mansoni, foi alinhada com os respectivos ortólogos com o auxílio do programa CLUSTALW
(www.2.ebi.ac.uk/clustalw) e formatados com o auxílio do programa Boxshade
(www.biomed.pasteur.fr), com a intenção de identificar aminoácidos conservados e
idênticos.Como pode ser observado na Figura 16, a proteína é conservada em relação aos
seus ortólogos em outros organismos. Destacamos também os domínios ricos em prolina na
região carboxi-terminal da proteína PI31. Estes domínios conferem uma estrutura secundária
extendida.
Resultados
64
Figura 16. Alinhamento das sequências preditas de aminoácidos do inibidor endógeno do proteassoma
PI31 provenientes de diferentes organismos. Esta análise foi feita com o auxílio dos programas CLUSTALW
(www.ebi.ac.uk) para os alinhamentos e Boxshade (
www.biomed.pasteur.fr) para a formatação dos
resultados a serem apresentados. As caixas em preto indicam os aminoácidos idênticos e as caixas em cinza
indicam os aminoácidos conservados.
Resultados
65
Na Figura 17, mostramos um resultado de filogenia molecular, para reforçarmos a
conservação da SmPI31 em relação aos outros organismos e também mostrarmos que a
sequência da proteína de S. mansoni, está filogeneticamente próxima da sequência do parasita
S. japonicum e da D. Melanogaster.
Figura 17. Filogenia molecular para a sequência predita de aminoácidos de SmPI31 e sua conservação em
relação aos seus ortólogos. A árvore filogenética foi calculada usando o algorítimo máxima parcimônia
presente no programa MEGA 4. As distâncias lineares entre as sequências homólogas são inversamente
proporcionais às similaridades entre as sequências de aminoácidos.
4.10. Produção e purificação de anticorpos policlonais específicos contra SmPI31 em
camundongos
Para a caracterização da proteína SmPI31 por western-blots em extratos de algumas
fases do ciclo de vida do parasita S. mansoni, foi produzido um anticorpo policlonal anti-PI31
em camundongos, utilizando-se a proteína de fusão his-PI31. A imunização foi realizada com
proteína his-PI31 eluída que apresentava um perfil eletroforético semelhante ao mostrado na
Figura 14 e injetada nos camundongos conforme descrito em materiais e métodos.
Após 21 dias, o soro dos camundongos foi recuperado via punção cardíaca e testado
com a proteína recombinante PI31. O reconhecimento do soro imune contra a proteína PI31
imobilizada em nitrocelulose foi revelada pela reação biotina/streptoavidina conjugada com
fosfatase alcalina e NBT/BCIP conforme mostrado na Figura 18.
Resultados
66
Figura 18. Teste dos soros pré-imune e imune de camundongos imunizados com a proteína PI31
heteróloga. O soro pré-imune (A) coletado antes das imunizações e o soro imune (B) coletado após 21 dias a
partir da primeira imunização foram testados por imunoblotting para a produção de anticorpos específicos contra
his-PI31 imobilizada em membrana de nitrocelulose. A seta aponta a proteína com cerca de 35kDa.
Após o reconhecimento da proteína de interesse pelo soro de camundongos
imunizados, a próxima etapa foi purificar o anticorpo em procedimento cromatográfico
automático FPLC, monitorado por absorbância em 280nm para garantir a pureza dos
anticorpos. Para isto, a proteína recombinante foi imobilizada na resina de níquel por
afinidade à cauda de 6 histidinas e as amostras do soro dos camundongos foram incubadas
nesta coluna. O anticorpo ligado a resina imobilizada com a proteína de interesse foi eluído
pela adição de glicina em três picos, como demonstrada na Figura 19.
Figura 19. Purificação do anticorpo policlonal anti PI31 em camundongos. A coluna foi previamente
equilibrada com tampão fosfato e lavada com o tampão de equilíbrio para remoção do material não adsorvido à
coluna. O anticorpo ligado a resina imobilizada com a proteína de interesse foi eluído pela adição de glicina em
três frações. O procedimento cromatográfico foi realizado em sistema cromatográfico automático FPLC
(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), monitorado por absorbância em 280nm.
Resultados
67
4.11. Titulação dos anticorpos policlonais purificados anti-SmPI31
Para determinar o título dos anticorpos policlonais anti-SmPI31 produzidos em
camundongos, aproximadamente 150ng da proteína recombinante SmPI31 foram
imobilizadas em membrana de nitrocelulose e colocadas para reagir com soro de
camundongos contendo o anticorpo anti-SmPI31 em diferentes diluições.
O anticorpo testado apresentou resposta positiva até o título de 1:5000 quando testado
com a proteína recombinante como mostrado na Figura 20. Como controle negativo da
marcação, foi utilizado soro pré-imune dos camundongos, o qual não apresentou o
reconhecimento da proteína recombinate que pudesse comprometer os resultados obtidos com
os anticorpos anti-SmPI31 (resultados não mostrados).
Figura 20. Titulação dos anticorpos purificados. Aproximadamente 50ng de proteína recombinante PI31
foram imobilizadas em membrana de nitrocelulose e colocadas para reagir com o anticorpo policlonal anti-
SmPI31 nas diluições de 1:250, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:2500, 1:5000, 1:10000, 1:20000 e com o anticorpo
secundário anti IgG de camundongo conjugado a fosfafase alcalina como controle. A reação foi revelada com
NBT/BCIP.
Resultados
68
4.12. Expressão da proteína SmPI31 em extratos protéicos de vermes adultos, cercárias
e ovos do parasita S. mansoni utilizando o anticorpo anti-PI31.
Após a passagem das imunoglobulinas totais provenientes do soro dos camundongos
imunizados pela resina de níquel imobilizada com a proteína recombinante PI31, como
descrito em materiais e métodos, fizemos um imunoblotting para análise do perfil desta
proteína em fases de vermes adultos, cercárias e ovos do parasita. Na Figura 21, a membrana
foi incubada com anticorpo policlonal anti-SmPI31 purificado. O imunoblotting revela que o
anticorpo purificado reconhece uma proteína de tamanho 35kDa nas fases de vermes adultos,
cercárias e ovos. Também revela a marcação de outras proteínas reconhecidas pelo anticorpo
anti-SmPI31.
Os mesmos extratos não revelam nenhuma marcação quando incubados apenas com o
anticorpo secundário , excluindo desta forma a possibilidade de interações com o mesmo.
Figura 21. Western blotting da proteínas reconhecidas pelo anticorpo anti-PI31 em extrato bruto de
vermes adultos, cercárias e ovos. (A) Gel de poliacrilamida 12%, corado com Comassie blue, correspondente a
20µg de proteínas provenientes do extrato bruto de vermes adultos, cercárias e ovos. B. Detecção dos níveis
protéicos dos extratos de vermes adultos, cercárias e ovos por western blot com o uso do anticorpo anti-PI31
em extratos brutos de vermes adultos, cercárias e ovos.
Resultados
69
4.13. Determinação de conjugados poli-ubiquitinadas em extrato de vermes adultos,
cercárias e ovos sob efeito do inibidor endógeno heterólogo SmPI31.
Para correlacionarmos indiretamente o efeito inibitório de SmPI31 com o
proteassoma, procedemos um experimento de inibição do proteassoma endógeno de S.
mansoni detectando os conjugados poli-ubiquitinados. Para isso, 1µg de PI31 recombinante
foi adicionado a 20µg de extrato protéico das fases evolutivas de vermes adultos, cercárias e
ovos e incubados a 37°C por 90 minutos. Da mesma forma que o experimento anterior, as
proteínas presentes no gel foram transferidas para a membrana de PVDF e submetidas à
immunoblot. Neste caso, o anticorpo utilizado direciona apenas a detecção de proteínas
poliubiquitinadas (BIOMOL). De acordo com a Figura 22, podemos observar que os níveis
de proteínas poli-ubiquitinadas em extrato bruto de vermes adultos e ovos incubados com o
inibidor endógeno SmPI31 teve um aparente aumento quando comparado com o controle.
Para descartar a possibilidade de ligações inespecíficas, foi feito um controle apenas com o
anticorpo secundário anti IgM de camundongo conjugado com peroxidase.
Figura 22. Western blotting de proteínas poli-ubiquitinadas em extrato bruto de vermes adultos e ovos na
presença e ausência do inibidor PI31 produzido em sistema heterólogo. (A) Gel de poliacrilamida 12%,
corado com Comassie blue, correspondente a 20µg de proteínas provenientes do extrato bruto de vermes adultos
e ovos. B. Detecção dos níveis protéicos de proteínas poli-ubiquitinadas por western blot com o uso do anticorpo
de camundongo anti-ubiquitina de humano em extratos brutos de vermes adultos e ovos controle e extratos
incubados com o inibidor SmPI31 . A revelação foi feita conforme descrito em materiais e métodos.
Resultados
70
4.12. Atividade proteolítica exógena com extrato bruto de vermes adultos
Os resultados da atividade proteolítica exógena com o substrato Succinil-Leu-Leu-
Val-Tyr-4-metil-cumaril-7-amida (SLLVT-MCA) estão demonstrados na Tabela 3.
Observamos a presença da atividade peptidásica do proteassoma no extrato bruto de vermes
adultos similar à quimiotripsina.
A presença do inibidor SmPI31 produzido em sistema heterólogo na concentração de
1µ
g foi capaz de promover uma inibição 64% na atividade peptidásica do extrato bruto
enquanto que na presença de 0,2µg do mesmo mostrou-se inibir cerca de 50%.
Tabela 3. Atividade proteolítica sobre substrato SUC-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (Fluorescência.h
-1
.50µg h
-1
).
Meio U Fluorescência
Extrato Bruto 36± 1,03
Extrato bruto + P31(1ug) 13± 1,8
Extrato bruto + P31(0,2ug) 19± 1,2
Extrato bruto + MG132 (50uM) 1,8± 1,0
Estes valores são resultados de no mínimo três experimentos independentes, para cada situação apresentada.
5.DISCUSSÃO
Discussão
72
O proteassoma é um complexo proteolítico, constituído de múltiplas subunidades,
sendo responsável pela degradação e processamento proteolítico de proteínas celulares
essenciais na regulação do desenvolvimento, diferenciação, proliferação, ciclo celular,
apoptose, transcrição gênica, transdução de sinal, senescência e reposta ao stress.
(NAUJOKAT et al, 2007).
Esta maquinaria proteolítica dependendo da condições ambientais sofre modulação
tanto estrutural como funcional. As principais partículas regulatórias que fazem parte da
estrutura primária do proteassoma são o complexo regulatório 19S (PA700) e o 11S (PA28).
Além destas, existem várias proteínas acessórias que não fazem parte da estrutura do
proteassoma, mas que se ligam à protease e são capazes de exercer atividade regulatória na
modulação da atividade. As mais conhecidas são as Hul 5 que é uma ubiquitina ligase e a Ubp
6 que apresenta atividade de desubiquitinação (DeMARTINO E GILLETTE, 2007). Por outro
lado, uma outra proteína acessória conhecida como PI31, um inibidor endógeno do
proteassoma, o qual já foi demonstrado competir com o PA28, conhecido ativador do
proteassoma em células eucarióticas (ZAISS et al, 1999). Este inibidor endógeno do
proteassoma denominado PI31 é uma proteína rica em prolina capaz de inibir a degradação de
peptídeos fluorogênicos e proteínas não-estruturais in vitro (McCUTCHEN-MALONEY et al,
2000).
Diante dessas evidências, o estudo do inibidor endógeno do proteassoma denominado
PI31 neste parasita tornou-se importante para auxiliar no entendimento da regulacão da
atividade do proteassoma de S. mansoni durante o seu complexo ciclo de desenvolvimento.
A partir da entrada 609743.1 depositados no banco de dados do Projeto Transcriptoma
de S. mansoni, foi identificada a provável região codificadora desta proteína (Figura 5) e
idealizado oligonucleotídeos específicos para a análise da expressão do cDNA que codifica
para PI31 no ciclo de vida do parasita. A partir deste momento, passamos a denominar este
Discussão
73
gene de SmPI31 (S. mansoni PI31).
Desta forma, a sequência do gene SmPI31 foi analisada em bancos de dados utilizando
os algorítimos BLASTx e BLASTn, os quais correspondem a bancos de dados de sequências
de proteínas e nucleotídeos respectivamente. A análise da sequência de 302 aminoácidos
(Figura 6), mostrou que o gene SmPI31 apresenta um único domínio em seu fragmento
gênico denominado PI31. Em relação à estrutura genômica, a sequência genômica
depositada no banco de dados do parasita S. mansoni GeneDB com entrada Smp_066340, foi
observado a existência de dois íntrons, um com 1922pb e o outro com 6807pb
respectivamente (Figura 7). Estes íntrons são de tamanhos não usuais, quando comparados
aos pequenos íntrons anteriormente descritos, como por exemplo para o gene que codifica
para o GAPDH (CHARRIER-FERRARA et al, 1992).
Para avaliar a expressão do gene que codifica para SmPI31 na transição de cercárias-
esquistossômulo-vermes adultos, desenvolvemos uma cultura de esquistossômulos
mecanicamente transformados e recuperados após 4h, 18,5h, 24h, 48h e 72h de cultivo in
vitro. Esta fase mimetiza o período correspondente aos três primeiros dias de infecção dentro
do hospedeiro mamífero definitivo. Após a penetração da cercária, o desenvolvimento do
esquistossômulo pode ser dividido entre a migração da pele até os pulmões e deste órgão para
o fígado. A fase de crescimento se inicia ao final da migração dos pulmões, quando o parasita
recebe estímulos do hospedeiro (LAWSON E WILSON, 1980). Outros estudos indicam que a
fase de migração compreende desde o dia zero após a infecção, quando o parasita ainda está
alojado na pele, chegando ao fígado no oitavo dia (CRABTREE E WILSON, 1980). Neste
processo de migração, o parasita passa por um estado metabólico semi-dormente, havendo
apenas mudanças na morfologia do verme, possivelmente para se adequar aos tamanhos dos
capilares das veias, as quais compreendem a rota de migração do esquistossômulo (WILSON
et al, 1978). Várias evidências indicam que a síntese de proteínas é bastante diminuída nas
Discussão
74
primeiras 24 horas após a transformação em esquistossômulo e depois ocorre um aumento até
alcançar o pico máximo no oitavo dia (YUCKENBERG et al, 1987, NAGAI et al 1977,
HARROP E WILSON, 1993, BLANTON E LICATE 1992), quando o verme recebe estímulo
para crescer e também terminar de formar o seu tegumento heptalaminado, característico de
vermes adultos totalmente diferenciados (HOCLEY E MacLAREN, 1973). Além do que,
durante a migração, o esquistossômulo pode utilizar proteínas pré-sintetizadas na fase de
cercária (HARROP E WILSON, 1993).
De acordo com a Figura 9, o gene que codifica para SmPI31 apresenta uma expressão
diferencial nos estágios estudados. Tendo em vista o mecanismo de invasão do parasita no
hospedeiro mamífero e também as transformações morfológicas e bioquímicas, podemos
observar que os diferentes níveis de expressão deste gene no estágio de cercárias, vermes
adultos e esquistossômulos mecanicamente transformados de 2 e 3 dias respectivamente,
podem refletir na atividade do proteassoma no desenvolvimento do parasita.
Vale ressaltar também que em nossos resultados observamos uma diminuição bastante
significativa na expressão do gene SmPI31 em MTS de 24h, os quais simulam
esquistossômulos de pele. Esses resultados estão de acordo com resultados prévios do nosso
laboratorio, onde também evidenciamos baixos niveis de trancrição para o gene que codifica
SmPIAS (CABRAL, F.J., 2007) e para os genes que codificam SmDicer e SmArgonauta
(GOMES, M.S., 2008). Todos esses resultados estão de acordo, com resultados anteriores de
estudo de transcrição em esquistossômulos recém transformados, onde através de
experimentos de incorporação de uridina marcada, constatou-se que durante as primeiras 24
horas da transformação em esquistossômulos, não foi observado um aumento significativo na
transcrição de novos rRNAs e/ou mRNA (BLANTON & LICATE, 1992). Isto sugere que
pode ocorrer um controle pós-transcricional levando a um consequente bloqueio na tradução,
nestes estágios iniciais da vida do esquistossômulo, e que este bloqueio deve ser revertido
Discussão
75
com o tempo, para permitir a expressão dos mRNAs que estarão disponíveis posteriormente.
Por outro lado, Nabhan et al em 2007 observou que a expressão de algumas
subunidades que codificam para genes do complexo 19S estavam extremamente baixas nesta
transição de cercária-esquistossômulo-vermes adultos, respectivamente em esquistossômulos
de 3, 6, 9 e 12 dias enquanto que para as subunidades do complexo 20S estavam aumentadas,
sugerindo desta forma que este complexo poderia estar na forma livre ou associado a outros
moduladores. Os nossos resultados apontam para uma alta expressão do inibidor PI31 em
esquistossômulos de 48h, 72 horas, vermes adultos e ovos, podendo sugerir que os baixos
níveis de expressão das subunidades da tampa e base do complexo regulatório 19S, e os altos
níveis de SmPI31 podem estar intrinsicamente relacionados, culminando na modulação da
atividade desta protease.
Depois de analisar a expressão desse transcrito que codifica SmPI31 no ciclo de vida
do parasita, partimos para uma análise da proteína SmPI31 que foi produzida em sistema
heterólogo. Desta forma, o cDNA que expressa o inibidor foi clonado em vetor de expressão
pET28a+ para produção de anticorpo e posteriores análises no ciclo de vida do parasita. Desta
maneira o sequenciamento observado na Figura 12 indica que o fragmento foi clonado na
posição correta, evidenciando a cauda composta por 6 histidinas na porção N-terminal
seguido dos aminoácidos referentes aos códons do vetor e posterior início da proteína
SmPI31, na fase de leitura correta e finalizada pelo códon de terminação.
Após a purificação da proteina SmPI31, observamos uma proteína aparentemente pura
com com tamanho de aproximadamente 35kDa e algumas bandas com massa molecular
menor, aparentando uma possível degradação desta proteína que foi confirmada por
espectometria de massa (Figura 15).
Os resultados da análise da sequência primária de aminoácidos ( Figura 16) e da
filogenia molecular (Figura 17) mostraram que a proteína SmPI31 é conservada entre seus
Discussão
76
ortólogos, e que sua conservação obedece a evolução das espécies.
A proteína PI31 (Figura 16) possui regiões ricas em prolina preferencialmente na
região carboxi-terminal. Este domínio rico em prolina é o responsável pelo mecanismo de
inibição do proteassoma pelo inibidor endógeno PI31como demonstrado por McCUTCHEN-
MALONEY e colaboradores em 2000. Este grupo sugere que a proteína PI31 pode interagir
com as subunidades alfa do proteassoma 20S como um “cap”, mantendo-se externamente ou
como um “plug”, onde um segmento da proteína entra no canal central do proteassoma 20S.
Kofler e colaboradores, 2005 mostraram evidências de que a proteína PI31 contém sítios
favoráveis de para a interação com o domínio CD2BP2-GYF in vitro, os quais foram
confirmados através da realização de experimentos de ensaio de duplo-híbrido em leveduras .
A proteína CD2BP2 é uma proteína celular adaptadora, associada ao complexo spliceosoma,
originalmente identificada como sendo constituinte da ligação da proteína de adeesão da
célula T CD2 no contexto de sinalização mediado pelas células T.(NISHIZAWA et al,1998).
Análises prévias de dicroísmo circular (dados não mostrados) indicam que essa
proteína possui uma estrutura de alfa hélice na região amino-terminal e na região carboxi-
terminal apresenta uma estrutura random coil ou seja desenovelada devido a grande
quantidade do aminoácido prolina. A característica peculiar de possuir um domínio rico no
aminoácido prolina e consequente estrutura nativa desenovelada sugere a participação desta
proteína em uma nova classe de proteínas, as IUPs (Intrinsically Unfolded Proteins), que são
proteínas que possuem uma porção desenovelada em sua estrutura na sua forma nativa (FINK,
2005). Desta forma, dentro da bactéria, logo após ser traduzida, esta proteína que apresenta
uma porção da sua estrutura desenovelada, ficaria com seus sítios expostos, sendo susceptível
à ação das proteases, podendo desta forma, ocorrer a degradação desta proteína logo após o
processo de tradução.
A produção de anticorpos policlonais anti his-PI31 em camundongos, sugere que o
Discussão
77
anticorpo produzido é aparentemente específico (Figura 18). O anticorpo policlonal anti-PI31
foi purificado em procedimento cromatográfico automático FPLC em três picos pela adição
de glicina (Figura 19).
O título do anticorpo anti-PI31 escolhido para a realização dos experimentos foi de
1:500, pois embora o mesmo fosse detectado até o título de 1:5000, a marcação observada
estava fraca, dificultando a visualização. Algumas bandas abaixo do tamanho esperado para a
proteína SmPI31 foram reconhecidas pelo anticorpo anti-PI31, a qual pode ser explicada pelo
fato de que haviam algumas bandas provenientes de degradação da proteína SmPI31, que
aliás foram determinadas por análises de espectometria de massa (Figura 15).
Em relação aos níveis de expressão da proteína heteróloga SmPI31, observou-se a
presença da mesma nas três fases analisadas: vermes adultos, cercárias e ovos (Figura 21). As
bandas protéicas identificadas além de PI31, podem representar diferentes montagens com o
complexo 20S e produtos de sua degradação .
Em cercárias, os resultados de expressão do transcrito bem como da expressão da
proteína SmPI31, culmina na tradução de uma proteína funcional que pode estar cumprindo a
sua função de inibição do proteassoma do parasita. Estes dados se mostram importantes
quando comparados aos resultados obtidos por GUERRA-Sá e colaboradores em 2005, os
quis demonstraram a baixa atividade em cercárias quando comparados com vermes adultos e
que existem subpopulações de proteassomas no desenvolvimento (CASTRO-BORGES et al,
2007). Os nossos resultados em conjunto com esses relatos prévios, poderiam explicar as
diferentes montagens do proteassoma em determinadas fases, havendo desta forma
subpopulações de complexos 20S interagindo com os moduladores PI31, PA28, CSN e com o
complexo regulatório 19S.
Na tentativa de investigarmos indiretamente o efeito inibitório da proteína SmPI31
com o proteassoma foi idealizado um experimento de inibição do proteassoma endógeno de S.
Discussão
78
mansoni e posterior detecção do acúmulo de conjugados poli-ubiquitinados utilizando
anticorpo anti-ubiquitina. Este resultado, mostrado na figura 22 revela um aparente aumento
nos níveis de conjugados poli-ubiquitinados em extratos de vermes adultos e ovos na presença
de 1µg do inibidor endógeno SmPI31 quando comparados aos controles. Resultados
anteriores do nosso laboratório, mostraram que a incubação de extrato total de vermes adultos
com o inibidor clássico do proteassoma o MG132, e posterior detecção com anticorpo anti-
ubiquitina levou a um acúmulo de conjugados ubiquitinados (GUERRA-SÁ et al 2005).
Nossos resultados de atividade proteolítica exógena sobre substrato Succinil-Leu-Leu-
Val-Tyr-4-metil-cumaril-7-amida (SLLVT-MCA) em extrato total de vermes adultos
utilizando frações protéicas do parasita incubadas com SmPI31 demonstrados na Tabela 3,
indicam que ocorre uma inibição eficaz em torno de 70 % da atividade similar à
quimiotripsina, sugerindo que a proteína heteróloga é funcional. Estes dados são consistentes
com análises feitas por McCUTCHEN-MALONEY e colaboradores, 2000 que indicam que a
inibição da atividade peptidásica de proteassoma 20S purificados sobre substrato exógeno
caseína methyl-14C é por volta de 50%.
Por outro lado, existem evidências de que in vivo, o inibidor PI31, ao contrário do que
observado in vitro não apresenta atividade inibitória em proteassomas 20S/26S em células
intactas, mas age como um modulador seletivo do proteassoma, mediando os passos de
reconhecimento e processamento de antígenos via MHC de classe I e interferindo na
maturação dos imunoproteassomas. Experimentos de imunolocalização com anticorpo anti-
PI31 de coelho demonstraram que a proteína PI31 está distribuída preferencialmente no
envelope nuclear e na membrana do retículo endoplasmático bem como os
imunoproteassomas. (ZAISS et al, 2002).
Considerando que PI31 exerce um papel majoritariamente inibitório do proteassoma
em vários metazoários in vitro, em S. mansoni esta proteína também pode participar no
Discussão
79
processo de regulação dessa protease, contribuindo para o sucesso do parasita nos processos
de organização de um tegumento mais complexo e adaptação tanto no meio aquático, quanto
no interior do hospedeiro vertebrado. A possibilidade da existência de populações de
proteassoma , cada uma predominante em um determinado tecido do parasita poderá ser
confirmado com experimento de imunolocalização de cortes histológicos de S. mansoni, os
quais serão posteriormente realizados.
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
Conclusões e Perspectivas Futuras
81
A estrutura primária desta proteína apresenta um único domínio denominado PI31 e
sua filogenia molecular é altamente conservada em outros organismos.
Foi observado um aparente aumento nos níveis de conjugados poli-ubiquitinados em
extratos protéicos de vermes adultos e ovos na presença do inibidor endógeno
heterólogo SmPI31.
A expressão diferencial de SmPI31 no ciclo evolutivo do parasita, sinaliza para um
papel modulador da atividade do proteassoma e que provavelmente competindo
estequiometricamente com outros moduladores. Futuros experimentos serão
idealizados para comprovar estas hipóteses.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXOS
Anexos
91
Anexo 1
Figura 23. Alinhamento da sequência de nucleotídeos que codifica para o gene SmPI31 com os
oligonucleoídeos idealizados (sublinhado) para análise da expressão deste gene no ciclo de vida do parasita
pela técnica de PCR em tempo real.
Anexos
92
Anexo 2
Figura 24. Alinhamento da sequência de nucleotídeos que codifica para o gene SmPI31 com os
oligonucleoídeos idealizados (sublinhado) para a clonagem em vetor de expressão pET28a+.
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