( PDF ) Papel do eixo angiotensina-(1-7)-mas na resposta vascular induzida pelo desnudamento arterial

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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Fisiologia e Biofísica

Papel do Eixo Angiotensina-(1-7)-Mas na Resposta Vascular Induzida

pelo Desnudamento Arterial

Marco Túlio Villaça Castagna

Belo Horizonte

2008

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Marco Túlio Villaça Castagna

Papel do Eixo Angiotensina-(1-7)-Mas na Resposta Vascular Induzida

Pelo Desnudamento Arterial

Tese apresentado ao Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto

de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais para

obtenção do título de Doutor em Ciências

Área de Concentração: Fisiologia e Farmacologia

Orientador: Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos

Belo Horizonte

2008

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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Hipertensão do Departamento de

Fisiologia e Biofísica da Universidade Federal de Minas Gerais e teve o financiamento das

seguintes intituições: FAPEMIG, CAPES, CNPq e PRONEX.

Aos meus pais, Gianangelo Castagna e Maria de Lourdes Villaça Castagna, pelo amor,

carinho, amizade, dedicação, exemplo, determinação e pelos valores de vida e de família.

Por terem me ensinado a importância do estudo e do conhecimento e por terem me

propiciado a indescritível oportunidade da vida, dedico-lhes esta obra.

À minha mulher, Ilene Maria Guimarães de Siqueira Castagna, pelo amor, pelos dias

maravilhosos e pela mão sempre estendida nos dias tristes, pela companheira inigualável,

pela presença constante, mesmo que às vezes distante fisicamente e pelos filhos que

ajudaram a coroar nossa família.

Às minhas irmãs, Silvana e Daniela, que tornaram e tornam minha vida muito mais feliz na

presença delas; pelos exemplos e aprendizados que me proporcionam; pelo amor e carinho.

Aos meus filhos Mateus e Clara, que fazem tudo valer a pena.

Agradecimentos

Ao Professor Robson Augusto Souza dos Santos, pela oportunidade oferecida em seu

laboratório, pelo brilhantismo do conhecimento, pelas discussões que me fizeram crescer e

pela confiança depositada.

Aos Professores do Laboratório de Hipertensão do ICB-UFMG: Maria José Campagnole

Santos, Marco Antônio Peliky Fontes e Andréia Siqueira Haibara, pelo apoio logístico,

para que eu pudesse realizar meu trabalho, pelas discussões, pela convivência harmoniosa.

Aos Professores do Departamento de Fisiologia do ICB-UFMG: Cândido Celso Coimbra,

Adelina Martha dos Reis e Umeko Marubayashi, pela oportunidade de trabalhar em seus

laboratórios.

À Professora do Departamento de Patologia Geral do ICB, Rosa Maria Esteves Arantes,

colega de graduação, por ter despendido horas de seu precioso tempo em ajudar-me nas

análises das lâminas e pelo carinho e consideração para comigo.

Aos Professores Alvair Pinto de Almeida, Sílvia Passos Andrade e José Márcio

Ribeiro, pelos comentários, críticas e sugestões na minha qualificação.

Ao técnico do laboratório de Hipertensão do ICB-UFMG, José Roberto da Silva, pela

ajuda constante em todos os momentos.

Aos colegas da pós-graduação pelo apoio, discussões e amizade.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia, em especial à Celinha, que sempre me

orientou nas burocracias do processo com toda a paciência.

Lista de Abreviaturas

AA: amino-ácidos

AAS: ácido acetil salicílico

Ang I: angiotensina I

Ang II: angiotensina II

Ang III: angiotensina III

Ang IV: angiotensina IV

Ang-(1-7): angiotensina-(1-7)

Ang-(1-9): angiotensina-(1-9)

APA: aminopeptidades A

APN: aminopeptidade N

AVC: acidente vascular cerebral

AVE 0991: agonista não peptídico do receptor Mas da Ang-(1-7)

BRAT

da Ang II: Bloqueador do receptor AT

da Ang II

DA: desnudamento arterial

DAC: doença arterial coronariana

DCV: doença cardiovascular

ECA: enzima conversora da angiotensina

ECA 2: enzima conversora da angiotensina 2

HI: hiperplasia intimal

HPβCD: hidróxi-prolil-beta-ciclodextrina

IAM: infarto agudo do miocárdio

IP: intra-peritoneal

LEI: lâmina elástica interna

LEE: lâmina elástica externa

MBI: micro bomba de infusão

NEP: endopeptidase neutra

PEP: prolil endopeptidase

PLGA: (poly lactic-co-glycolic acid) ou ácido poli-lático co-glicólico

WHO: World Health Organization – Organização Mundial de Saúde

WHR: World Health Report – Relatório de Saúde Mundial da Organização Mundial de

Saúde.

Índice

Lista de Abreviaturas 7

Índice 10

Resumo 15

Abstract 18

I. Introdução 20

1.1

Epidemiologia 21

1.1.1 No Mundo 21

1.1.2 Nos Estados Unidos da América 24

1.1.3 No Brasil 25

1.2 Terapêutica da Doença Arterial Coronariana 26

1.3 O Sitema Renina-Angiotensina 31

1.3.1 Os peptídeos do Sistema Renina-Angiotensina 34

1.3.2 O heptapeptídeo Ang-(1-7) 35

II. Objetivos 40

III. Materiais e Métodos 42

3.1 Animais 43

3.2 Grupos de Estudo 43

3.2.1 Bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas 43

3.2.2 Agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas 44

3.2.3 Bloqueio do receptor AT

da Ang II 44

3.2.4 Controles 44

3.3 Cirurgia 45

3.4 Preparação dos tecidos 47

3.5 Análise Histo-morfométrica 48

3.6 Análise Estatística 49

IV. Algorítimo do Protocolo 50

V. Resultados 52

5.1 Bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas 53

5.1.1 A779 53

5.1.2 Mas

-/-

5.2 Agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas 61

5.2.1 AVE 0991 61

5.2.2 Ang-(1-7) 65

5.2.3 MBI-Ang-(1-7) 69

5.2.4 HPβCD-Ang-(1-7) 73

5.3 Bloqueio do Receptor AT

da Ang II 77

5.3.1 Losartan 77

5.3.2 Losartan + A779 81

5.4 Grupos Controles 85

5.4.1 PLGA 85

5.4.2 HPβCD 89

5.4.3 Cirurgia 93

5.4.4 Sham 97

Gráfico 25: Percentual de HI das Artérias Lesadas 101

Gráfico 26: Áreas de HI das Artérias Lesadas 102

Tabela 13: Comparação entre as Áreas de HI das Artérias Controles

e das Artérias Lesadas 103

Comparação entre as Áreas de HI das Artérias Controles e das

Artérias Lesadas dos diversos grupos – ANOVA 104

Gráfico 27: Áreas dos Vasos das Artérias Controles 105

Gráfico 28: Áreas dos Vasos das Artérias Lesadas 106

Tabela 14: Comparação entre as Áreas dos Vasos das Artérias

Controles e Lesadas 107

Comparação entre as Áreas dos Vasos das Artérias

Controles – ANOVA 108

Comparação entre as Áreas dos Vasos das Artérias

Lesadas – ANOVA 108

Gráfico 29: Áreas dos Lumens das Artérias Controles 109

Gráfico 30: Áreas dos Lumens das Artérias Lesadas 110

Tabela 15: Comparação entre as Áreas dos Lumens das Artérias

Controles e das Ártérias Lesadas 111

Comparação entre as Áreas dos Lumens das Artérias Controles

– ANOVA 112

Comparação entre as Áreas dos Lumens das Artérias

Lesadas - ANOVA 112

Gráfico 31: Áreas das Camadas Médias das Artérias

Controles 113

Gráfico 32: Áreas das Camadas Médias das Artérias

Lesadas 114

5.21 Tabela 16: Comparação entre as das Áreas das Camadas

Médias das Artérias Controles e Lesadas 115

Comparação entre as Áreas das Camadas Médias das Artérias

Controles – ANOVA 116

Comparação entre as Áreas das Camadas Médias das Artérias

Lesadas – ANOVA 116

Gráfico 33: Relação HI/Média das artérias Lesadas 117

Comparação entre a relação HI/Média das artérias

Lesadas – ANOVA 118

VI. Discussão 119

VII. Conclusão 130

VIII. Referências Bibliográficas 132

IX. Anexos - artigos publicados pelo autor relacionados à doença

arterial coronariana 150

Resumo

A Ang-(1-7) tem um papel contra-regulatório aos efeitos vasoconstritores e proliferativos

provocados pela Ang II. Avaliamos o papel do eixo Ang-(1-7)-Mas no remodelamento

vascular induzido pelo desnudamento arterial (DA). Utilizamos N=60, camundongos da

raça C57Bl/6J além de camundongos com deleção genética para o receptor Mas (knock-out

ou Mas

-/-

), sendo cinco animais em cada grupo (N=5). Também avaliamos se, em sendo

eficaz biologicamente por via oral, a Ang-(1-7) seria também eficaz comparado com a sua

administração por micro-bomba de infusão (MBI) [MBI-Ang-(1-7)] via SC implantado no

dorso do animal, sua administração por via oral estando incluída no composto hidróxi-

prolil-beta-ciclodextrina [HPβCD-Ang(1-7)] e a administração do agonista não peptídico

do receptor Mas (AVE 0991). Feito o DA de femoral esquerda. Os animais foram tratados

por 28 dias e sacrificados. Comparadas as artérias lesadas com as artérias femorais contra-

laterais (direita) dos mesmos animais e entre os diversos grupos. O bloqueio do eixo Ang-

(1-7)-Mas pelo antagonista A779 e nos animais Mas

-/-

promoveu o remodelamento negativo

com redução da área do vaso de 32.029±4.749 µ

para 19.363±3066 µ

(p=0,04) e de

29.919± 5399 µ

para 13.951±4765 µ

(p=0,03), além de um comprometimento importante

da área do lúmen pelo percentual de hiperplasia intimal (%HI) de 89,7±10% e 97,6±1,8%

respectivamente. Os agonistas deste eixo, por outro lado, promoveram o remodelamento

positivo, com aumento da área do vaso: AVE 0991: de 46.862±4.099 µ

para 87.966

±4.133 µ

, p<0,01, Ang-(1-7): de 26.735±8.298 µ

para 52.541±8.180 µ

, p=0,05, MBI-

Ang-(1-7): de 29.401±2.124 µ

para 70.253±9.924 µ

p=0,002, HPβCD- (Ang-(1-7): de

43.345±18.781 µ

para 69.793±19.127 µ

, p=0,01, além da manutenção da área do lúmen

das artérias lesadas pelo baixo % de HI de 34,5±10,8%, 21±5%, 32,2±2,5% e 35,9±4%

respectivamente.

O bloqueio do receptor AT

da Ang II (losartan) promoveu remodelamento positivo com

aumento da área do vaso de 30.613±10.543 µ

para 50.366±24.873 µ

, p=0,045 porém com

comprometimento intermediário da área do lúmen pela % de HI: 62,2±13,5%. Losartan +

A779, levou a um remodelamento negativo, reduzindo a área do vaso de 34.342±2.158 µ

para 21.322±5.242 µ

, p=0,04, e com o % de HI de 99,17±0,8%. Os grupos controles

apresentaram resultados semelhantes entre si e intermediários aos demais grupos. A Ang-

(1-7) administrada isoladamente por VO mostrou-se tão eficaz quanto os demais grupos nos

quais foram utilizadas diferentes formas de se administrar agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas

em promover o remodelamento vascular positivo e um baixo % de HI no DA. Estes

resultados indicam que o eixo Ang-(1-7)-Mas tem um papel importante na resposta

vascular induzido pelo DA.

Abstract

Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] counter-regulates the Angiotensin II effect in the vasculature

and Mas has been shown to be its cellular receptor. We aim to evaluate the role of Ang-(1-

7)-Mas axis on the arterial injure induced by arterial denudation (AD). C57BL/6 strain

(N=55) and knock-out Mas receptor (Mas

-/-

) mice (N=5), 12 ± 0,3 weeks old, 25 ± 2 g of

weight, underwent left femoral artery (LFA) AD by angioplasty guidewire passage.

Excepting Mas

-/-

, surgery group (AD without medication), and sham (surgery performed

without AD), N=5 each, treatment included: Mas antagonist [A779 included in PLGA (poly

lactic-co-glycolic acid) (N=5), AVE 0991 (Mas non-peptide agonist) (N=5); Ang-(1-7) PO

(N=5); Ang-(1-7) by subcutaneous osmotic minipump infusion (N=5); Ang-(1-7) included

in hidroxi-prolil β cycle dextrin [Ang-(1-7)-HPβCD] PO (N=5); AT

receptor blocker

(Losartan) (n=5); Losartan associated with A779 (N=5); PLGA (N=5) and HPβCD (N=5).

After 28 days, histological specimen of LFA and right femoral arteries (RFA) of each

group and of LFAs among the groups were compared.

LFA % stenosis were respectively: A779: 89,7±%; Mas

-/-

: 97%; AVE 0991: 34%;

Ang (1-7): 21%; Ang(1-7) by SC osmotic minipump: 32%; Ang-(1-7)-HPβCD: 35%;

Losartan: 62%; Losartan+ A779: 99%; PLGA: 66%; HPβCD: 71%; Surgery: 74% and

Sham: 0%. Ang-(1-7)-Mas axis agonists, administered in several formulations, including

Ang-(1-7) alone, promoted a positive vascular remodeling, with a low % stenosis and

maintained the luminal area (LA); Losartan promoted a positive remodeling but with a high

% stenosis meanwhile, the axis blockage by its antagonist, A779 and A779 + Losartan, and

by gene deletion of Mas receptor, induced a negative vascular remodeling, with a high %

stenosis and reduced the LA after arterial AD. These results indicate that the

Ang-(1-7)-Mas axis plays an important role in the vascular response induced by AD.

Introdução

I. Introdução

1.1 Epidemiologia

1.1.1 No Mundo

A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de mortalidade no Mundo, sendo

responsável por 16,7 milhões (29,2%) de mortes no ano de 2005. Destas, 7,2 milhões

(43%) são devido à doença isquêmica do coração (doença arterial coronariana - DAC), 5,5

milhões (33%) ao acidente vascular cerebral (AVC) e 3,9 milhões (24%) à doença

hipertensiva e a outras patologias cardíacas. Pelo menos 20 milhões de pessoas sobrevivem

a um infarto agudo do miocárdio (IAM) e a um AVC ao ano e, uma proporção significativa

delas vai requerer cuidados clínicos com custos altos, o que compromete de uma maneira

importante os recursos orçamentários da saúde a longo prazo

A DCV é muito prevalente e incidente em pessoas de meia-idade, alterando

significativamente o desenvolvimento sócio-econômico, afetando não só o indivíduo, mas

as famílias e as nações. Os grupos sócio-econômicos menos favorecidos têm uma maior

prevalência dos fatores de risco, doenças e mortalidade nos países desenvolvidos e um

padrão semelhante está surgindo com a evolução epidemiológica que se observa nos países

em desenvolvimento

Oitenta e cinco porcento das mortes e seqüelas advindas de DCV originam-se de países de

baixa ou média-renda. Em 2010, a DCV será a principal causa de mortalidade nos países

em desenvolvimento. Na Índia, por exemplo, aproximadamente 53% das mortes por DCV

ocorrem em pessoas com idade inferior a 70 anos; na China, este quadro corresponde a

35%.

A maioria dos estimados 32 milhões dos IAM e AVC ocorridos a cada ano, é causados por

um ou mais fatores de risco cardiovascular - hipertensão arterial, diabetes, tabagismo,

dislipidemia e inatividade física - e muitos destes eventos podem ser prevenidos por ações

tomadas contra estes fatores de risco. A DCV não tem limites geográficos, de gênero ou de

classificação sócio-econômicos.

A DAC é a principal causa de mortalidade isolada, sendo responsável por 13% de todas as

mortes no Mundo

Projetando-se as tendências do total de mortes por causas selecionadas no Mundo, de 2002

a 2030, demonstra-se que somente a mortalidade por DAC corresponde à mortalidade

causada por todos os tipos de câncer e só será ultrapassada por esta em 2010, mas ainda sim

permanecerá como a principal causa isolada de morte (Fig. 1)

Figura 1. Projeção das Tendências do Total de Mortes por Causas Selecionadas no Mundo

de 2002 a 2030.

1.1.2 Nos Estados Unidos da América

A taxa de mortalidade por DCV tem diminuído, porém o grande impacto da DCV ainda

permanece alto. Em 2004, a taxa de mortalidade geral por DCV foi de 288 por 100.000

habitantes, sendo da raça branca: 335,1 homens e 238 mulheres por 100.000 habitantes, e

da raça negra: 454 homens e 333,6 mulheres por 100.000 habitantes.

De 1994 para 2004, a taxa de mortalidade por DCV diminui em 24,7%.

Em 2005, a DCV foi responsável por 861.826 (35,2%) das 2.447.910 mortes ocorridas no

país, ou seja, uma em cada 2,8 mortes. Cerca de 2.400 americanos morrem a cada dia de

DCV, uma média de uma morte a cada 37 segundos. Mais de 148.000 americanos mortos

em 2004 por DCV tinham idade inferior a 65 anos. Em 2004, 32% das mortes por DCV

ocorreram em pessoas com menos de 75 anos, o que é abaixo da média de expectativa de

vida que é de 77,9 anos.

A DAC foi responsável por uma a cada cinco mortes nos EUA em 2004. A mortalidade por

DAC foi de 451.326 americanos em 2004. Em 2008, estima-se que 770.000 americanos

terão um novo IAM. Estima-se um número adicional de 175.000 novos IAM silenciosos a

cada ano. A cada 26 segundos um americano tem um evento coronariano e a cada minuto

um cidadão americano morre devido a este evento.

Em 2004, uma a cada oito mortes ocorreu por insuficiência cardíaca nos EUA

1.1.3 No Brasil

Uma transição epidemiológica importante no perfil proporcional de mortalidade tem sido

verificada no Brasil desde a década de 30. A mudança deste perfil serve como um indicador

sensível das mudanças das condições de vida e do modelo de desenvolvimento da

população, sendo resultado da interação de diversos fatores interdependentes, como os

modos de produção econômica e de reprodução humana. A interação destes determina a

estrutura econômica e demográfica (fertilidade, mortalidade e migração) de uma população.

Além disso, fatores ambientais e sócio-culturais devem ser considerados, não sendo

possível, portanto, separar o nível de mortalidade de sua estrutura e de sua relação com

fatores históricos, sócio-econômicos, demográficos e ambientais

Tal como ocorreu anteriormente na Europa, o declínio do coeficiente de mortalidade geral

não é o único aspecto notável no Brasil nos últimos 60 anos; também a redução da

mortalidade infantil, o aumento da expectativa de vida, atrelados ao processo de

urbanização, melhorias das condições sanitárias, redução da pobreza e alterações sócio-

culturais, contribuíram para a mudança deste perfil. Assim, as mudanças no modelo de

desenvolvimento, no estilo de vida e no comportamento, assumem importância para a

Saúde Pública, estando os pobres, em desvantagem em relação aos ricos quanto ao risco

concomitante do perfil de morbi-molidalidade do atraso (doenças infecciosas) e da

modernidade (doenças cardiovasculares e neoplasias). Isto pode ser observado

particularmente nas diferentes regiões geográficas do Brasil, onde se constata uma redução

significativa da mortalidade por doenças infecto-contagiosas em todas as regiões e uma

elevação progressiva e constante da mortalidade por DCV. Este fenômeno, porém, não é

linear entre as diferentes regiões país, pois onde as condições sócio-econômicas e sanitárias

ainda eram precárias em 1985, como nas regiões nordeste e norte, apesar de ter havido a

mudança do perfil epidemiológico, era relevante a prevalência da mortalidade por doenças

infecto-contagiosas. Este perfil vem mudando.

No Brasil, no ano de 2005, num total de 1.006.827 mortes, 283.927 (28,2%) mortes foram

causadas por DCV, sendo 148.966 (52,4%) homens e 134.922 mulheres (41,6%).

Em 2005, foram os seguintes os percentuais de morte por DCV nas distintas regiões do

Brasil: Norte 20%, Nordeste 25,7%, Sudeste 29,6%, Sul 30,3% e Centro-Oeste 28,6%

1.2 Terapêutica da Doença Arterial Coronariana

Na abordagem terapêutica da DAC é fundamental o controle dos fatores de riscos

cardiovasculares passíveis de mudanças já sabidamente conhecidos, como a hipertensão

arterial, a dislipidemia, a diabetes, o tabagismo, o sedentarismo e a obesidade.

Dependendo da gravidade das lesões, do número de vasos acometidos por lesões graves, da

localização das lesões, e das condições gerais do indivíduo, podem ser considerados:

1) tratamento clínico com um arsenal terapêutico que tem possibilitado um avanço

significativo no controle dos sintomas como os nitratos, e na redução da morbi-mortalidade,

com o uso do ácido acetil salicílico (AAS), beta-bloqueadores (propranolol, metoprolol e

atenolol) e estatinas (inibidores da Hidroximetil Glutaril Coenzima A redutase - HMG Coa

redutase)

7 e 8

;

2) tratamento cirúrgico de revascularização do miocárdio;

3) tratamento por angioplastia coronariana sem ou com implante de stent;

Angioplastia

A angioplastia coronariana é uma terapêutica introduzida por Andréas Gruentzig em 1977,

inicialmente realizada em Zurich

, tornando-se uma modalidade terapêutica que tem

reduzido a morbidade quando comparado ao tratamento cirúrgico, o tempo de internação e

os custos hospitalares

10 e 11

. Expandindo-se o lúmen do vaso e comprimindo-se a placa

aterosclerótica, o fluxo sanguíneo é re-estabelecido imediatamente e os sintomas anginosos

da insuficiência coronariana aliviados prontamente.

O fenômeno da re-estenose tornou-se o fator limitante crítico desta abordagem terapêutica.

Tendo com base fisiopatológica o recolhimento elástico, o remodelamento negativo e a

hiperplasia neointimal, a re-estenose chegou a atingir 40 a 50% das artérias coronarianas

tratadas, após um ano, por angioplastia

12 e 13

Nos meados da década de 90, o desenvolvimento de uma prótese endovascular denominada

stent, constituída por uma malha tubular de aço inoxidável que alcançaria a lesão ao ser

colocada envolta ao balão convencional de angioplastia, foi implantada nas artérias

coronarianas. Isto possibilitou a exclusão de dois dos mecanismos fisiopatológicos da re-

estenose: o recolhimento elástico e o remodelamento negativo. Uma vez que esta prótese

endovascular, quando expandida, possui uma força radial centrífuga maior que a força

radial centrípeta propiciada pelo tecido elástico biológico das artérias, o stent reduziu a

reestenose para cerca de 20 a 25%

12 e 13

Esta proporção restante de re-estenose (20-25%) deve-se à hiperplasia intimal que é de fato

também deflagrada pelo implante do stent. O mecanismo fisiopatológico deste processo

deve-se à reação inflamatória causada pelo trauma mecânico no local onde a angioplastia

com implante do stent foi realizada, induzindo a proliferação e a migração de células

musculares lisas da camada média para a camada íntima da artéria, reduzindo assim a área

do lúmen, levando à re-estenose

14, 15, 16 e 17

No final dos anos 90, a braquiterapia intravascular, utilizando a radiação β e γ e tendo como

fontes emissoras o Fósforo 32 (

P) e o Iridium 192 (

192

Ir), surgiu como uma abordagem

muito eficaz para tratar a re-estenose intra-stent, reduzindo a hiperplasia intimal nestas

lesões re-estenóticas

18-21

Algumas preocupações tornaram–se relevantes quanto à aplicação em longo prazo desta

modalidade terapêutica como a identificação de um tecido eco-lucente (“Black Hole”) visto

pela ultrassonografia intra-vascular (IVUS), no lúmen da artéria coronariana de um

paciente submetido à braquiterapia intravascular para reestenose intra-stent, após 9 meses

do procedimento, além da ocorrência de oclusão total tardia, resultante da trombose

tardia

23 e 24

Este fenômeno observacional levou a um prolongamento da terapêutica anti-plaquetária

coadjuvante com as tienopiridinas, especificamente o clopidogrel, que foi estendida por

tempo indefinido. Associado a isto, a braquiterapia intracoronária necessitava de um

complexo aparato logístico, requerendo uma variedade de profissionais além do

cardiologista intervencionista, como o físico e o oncologista radioterapêuta, além de um

sistema especial de segurança, por estar sendo manipulado fontes de emissões radioativas β

e γ. Tudo isto limitou a disseminação desta ferramenta terapêutica, além do custo financeiro

do procedimento que, por todos os itens supracitados, passou a ser muito alto.

A propensão a uma alternativa terapêutica mais prática e com custo inferior, resultou no

desenvolvimento de drogas anti-proliferativas (rapamicina e paclitaxel) associadas a

polímeros que recobrissem os stents. Esta tecnologia, apresentada como o “estado-da-arte”

na nova abordagem terapêutica da DAC permitiu que a re-estenose intra-stent fosse

reduzida de 25% para 4%

25, 26 e 27

A rapamicina liga-se à FK506-proteína ligante (FKBP, que é a mesma molécula que é

ligada pela FK506); este complexo que é formado entre a SRL e a FKBP, liga-se à

mammalian target of rapamycin (mTOR). O complexo SRL–FKBP–mTOR inibe

bioquimicamente as vias que são necessárias para a progressão celular atuando na etapa

tardia da fase G

ou na fase S do ciclo celular. Diferentemente da ciclosporina e da FK506

(que bloqueiam a produção de citocinas), a rapamicina bloqueia o sinal de tradução da

citocina. A rapamicina tem como alvo: (1) a proteina kinase de 70-kD S6, p70

S6K

; (2) o

fator de iniciação eucariótico eIF-4F; (3) as proteínas quinases dependentes da ciclina (cdk)

que controlam a G1, tais como a ciclina D2 (cdK2), a ciclina D2 cdk6 ou a ciclina E cdk2 e

(4) a proteína inibitória da quinase Hip1(p27

kip

), que bloqueia a progressão celular para a

fase S

O paclitaxel interfere com a função normal do crescimento dos microtúbulos. Ele hiper-

estabiliza as estruturas dos microtúlos, levando a uma destruição da capacidade da célula de

usar seu citoesqueleto de uma maneira flexível. Ele liga-se à subunidade

β da tubulina que

é o arcabouço dos microtúbulos e a ligação do paclitaxel bloqueia a formação deste

arcabouço no local. Os microtúbulos são componentes do citoesqueleto e do fuso mitótico

sendo necessários para a divisão celular e motilidade. A ativação da sinalização da MAP-

quinase por fatores de crescimento associado aos microtúbulos despolimerizados é inibido

pelo paclitaxel, estabilizando os microtúbulos citoplasmático e bloqueando a separação dos

microtúbulos, o paclitaxel bloqueia a síntese de DNA iniciada pelos fatores de crescimento.

As células permanecem então nas fases G0/G1 e G2/M do ciclo celular. As células expostas

ao paclitaxel vão à apoptose ou à morte

Apesar de reduzir de 25% para 4% a re-estenose intra-stent, os fármacos acima citados,

inibem de tal forma a hiperplasia intimal que podem deixar parte das hastes metálicas

destes stents descobertos, sem a re-endotelização. Este fenômeno pode propiciar o

aparecimento de trombose tardia ou oclusão total tardia, pois a exposição das hastes destes

stents pode levar a alteração do fluxo laminar arterial que passa agora a ter um fluxo

turbilhonado e a um stress de cisalhamento, levando à agregação plaquetária. A trombose

tardia tem uma apresentação clínica geralmente dramática, cursando como infarto agudo do

miocárdio ou morte súbita

29 e 30

Na tentativa de evitar a trombose tardia (1.2% nos stents recobertos com rapamicina

contra 0.6% nos stents convencionais e 1.3% nos stents recobertos com paclitaxel contra

0.8% nos stents convencionais)

, o Food and Drug Administration (FDA) tem

recomendado o uso do anti-agregante plaquetário das tienopiridinas, clopidogrel, por um

período mínimo de um ano, associado ao AAS por tempo indeterminado.

Novos fármacos estão sendo testados e alguns já sendo utilizados na prática clínica, como o

everolimus, o pimecrolimus, o tacrolimus, etc., na tentativa de manter o baixo índice de re-

estenoses dos iniciais stents farmacológicos com rapamicina e paclitaxel, com o intuito de

não apresentarem uma inibição tão intensa de hiperplasia intimal, permitindo que as hastes

dos stents não fiquem desnudadas, ou seja descobertas pelo novo endotélio, o que é descrito

como o mecanismo fisiopatológico da trombose tardia

32, 33 e 34

1.3 O Sistema Renina-Angiotensina

IGURA 2: A cascata do sistema renina angiotensina ao conhecimento atual

u ECA2:

pela

Angiotensin I

Angiotensinogen

Ang-(1-9)

Ang-(1-7)Ang II

Renin

ACE2

ACE,NEP

NEP

PEP

ACE

Chymase

Cathepsin A

ACE2,PEP,PCP

Ang-(1-5)

ACE

AT1 receptor AT2 receptor Mas receptor

Vasodilatation

Anti-proliferation

Anti-hypertrophy

Vasoconstriction

Cell Proliferation

Hypertrophy

Bradykinin

RPR

Ang IV

Ang III

AMP

D-Amp

IRAP

AMP

Tonin

Cathepsin G

Degradation

products

Angiotensin IAngiotensin I

AngiotensinogenAngiotensinogen

Ang-(1-9)

Ang-(1-7)Ang-(1-7)Ang II

Renin

ACE2ACE2

ACE,NEPACE,NEP

NEP

PEP

NEP

PEP

ACE

Chymase

Cathepsin A

ACE

Chymase

Cathepsin A

ACE2,PEP,PCPACE2,PEP,PCP

Ang-(1-5)Ang-(1-5)

ACEACE

AT1 receptor AT2 receptor Mas receptor

Vasodilatation

Anti-proliferation

Anti-hypertrophy

Vasoconstriction

Cell Proliferation

Hypertrophy

BradykininBradykinin

RPR

Ang IV

Ang III

AMPAMP

D-AmpD-Amp

IRAP

AMPAMP

Tonin

Cathepsin G

Tonin

Cathepsin G

Degradation

products

ACE ou ECA: enzima conversora da angiotensina; Ang: angiotensina; ACE2 o

enzima conversora da angiotensina 2; AMP: aminopeptidase; AT

: receptor tipo 1 da Ang

II; AT

: receptor tipo 2 da Ang II; Mas: receptor da Ang-(1-7); D-Amp: dipeptidil-

aminopeptidase; IRAP: insulin-regulated aminopeptidase (aminopeptidase regulada

insulina; PCP: prolil-carboxi-peptidase; PEP: prolil-endopeptidase; NEP: endopeptidase

neutra; (P)RR: receptor renina/pró-renina.

O sistema renina angiotensina (SRA), tem um papel fundamental na manutenção da

homeostasia de nosso organismo. Considerado um sistema endócrno, parácrino e autócrino,

atua como um importante regulador das funções renais e cardiovasculares, sendo crucial

para a manutenção da pressão arterial, do balanço hidro-eletrolítico e do volume

extracelular. Este sistema é composto por uma complexa cascata de enzimas e suas

resultantes metabólicas que atuam na regulação endógena e, mais recentemente, vários

novos “players” desta cascata têm sido identificados e alguns com atuações ainda a serem

definidas.

A hiperatividade do SRA leva a alterações devastadoras ao sistema cardiovascular como a

hipertensão arterial, doenças cardíacas, DAC, AVC, aterosclerose, doenças renais e

síndrome metabólica.

A renina foi o primeiro composto do sistema a ser descrito

, assim chamada por ter sido

isolada do rim. Seus precursores consistem de uma seqüência de 406 amino-ácidos (AA)

com um pré e um pró-segmento carregando 20 e 46 AA respectivamente. A renina

“madura” em si contém 340 AA e uma massa de 37 kD

Liberada a partir das células juxtaglomerulares do rim

37 e 38

entra na circulação plasmática e

converte o substrato angiotensinogênio, produzido pelo fígado, em angiotensina I (Ang I)

através da clivagem dos quatro últimos AA, Val-Ile-His-Ser, na porção N terminal. A Ang I

é então convertida pela enzima conversora de angiotensina (ECA) em angiotensina II (Ang

II)

, o principal componente ativo do SRA, através da clivagem dos dois últimos AA, His-

Leu, na porção N-terminal. A sucessão de reações enzimáticas continua atuando na

estrutura da angiotensina nas suas porções N-terminal, através da aminopeptidase A e a

aminopeptidase N (APA e APN) e C-terminal, através da prolil endopeptidase (PEP) e

endopeptidase neutra (NEP), da Ang II. A APA converte a Ang II em Ang III

. A APN

converte a Ang III em Ang IV

. A PEP e a NEP convertem a Ang II em Ang-(1-7)

43 e 44

Os vários passos da cascata metabólica podem ser inibidos seletivamente. Por exemplo, a

conversão do angiotensinogênio em Ang I pode ser inibida pela H-77, um peptídeo análogo

ao angiotensinogênio, com alta afinidade pela renina e grande resistência à metabolização

enzimática

. O captopril pode se ligar à ECA, com uma maior afinidade que a Ang I,

inibindo sua atividade e por seqüência, a síntese de Ang II. O mesmo pode acontecer com

outros inibidores da ECA (IECA) como o enalapril, o lisinopril, o fusinopril, o ramipril,

etc

A lise da Ang II em Ang III e Ang IV pode ser inibida pela amastatina que bloqueia

seletivamente a ação das APA e APN, mas sem diferenciar entre as isoformas

A lise da Ang II em Ang-(1-7) pode ser inibida pela Z-prolil-prolinol ou tiofan que inibem

respectivamente a PEP e a NEP

Recentemente, as combinações de técnicas fisio-farmacológicas clássicas, técnicas de

química das proteínas e dos gens (proteômica e genômica), têm levado à identificação de

novos componentes do SRA. A enzima conversora da angiotensina 2 (ECA2),

49 e 50

homóloga à ECA 1, foi identificada como uma carboxipeptidase insensível à ação do IECA

captopril. A ECA 2 tem atividades biológicas distintas da ECA, converte a Ang I em Ang-

(1-9), que é subseqüentemente hidrolisada pela ECA em Ang-(1-7). A ECA2 também

hidrolisa a Ang II, produzindo, a partir daí, a Ang-(1-7) como demonstrado na Fig 2. A

ECA 2 tem uma semelhança de 42% em sua estrutura química de seu domínio catalítico

com a ECA 1

51 e 52

. A ECA 2 media a conversão da Ang I em Ang-(1-9) que por sua vez

pode ser metabolizada a Ang-(1-7) pela ECA 1, que também media a conversão de Ang II

em Ang-(1-7) (Fig. 2). No entanto, a ECA 2 exibe uma afinidade cerca de 400 vezes maior

pelo substrato Ang II do que pela Ang I,

reforçando a idéia que esta enzima é criticamente

importante na regulação dos níveis das angiotensinas nos plasma e nos tecidos.

A ausência funcional de ECA 2 resultou em insuficiência cardíaca grave associada ao

acúmulo cardíaco de Ang II

. A ECA 2 tem um papel crucial no metabolismo da Ang II no

rim de ovelhas

e é responsável pela maior parte da formação da Ang-(1-7) partir da Ang

II acrescentada exogenamente em corações isolados de ratos hipertensos, sugerindo que a

ECA 2 pode servir como uma resposta compensatória para o remodelamento cardíaco

Além disto, a super-expressão da ECA 2 realizada através da manipulação genética com a

introdução de lentivírus no coração ratos hipertensos , resultou na reversão da hipertrofia e

fibrose cardíaca

Recentemente outros receptores foram acrescentados aos componentes do SRA: o receptor

da Ang IV, que é a enzima amino-peptidase regulada pela insulina ou Insulin-regulated

amino peptidase (IRAP)

, o receptor renina/pró-renina

ou renin-pro renin receptor (P)RR

e o receptor da Ang-(1-7) que é o Mas

(Fig. 2).

1.3.1 Os peptídeos do SRA.

O SRA tem dois tipos primordiais de atuação no sistema cardiovascular, um vasoconstritor

e proliferativo, no qual a Ang II é o principal efetor e outro vasodilatador e anti-

proliferativo, no qual a Ang-(1-7) e o principal efetor.

A Ang II interage com receptores transmembrana localizados na célula alvo. Estes

receptores pertencem à superfamília dos receptores acoplados à proteína G e se dividem

basicamente em dois subtipos: AT

e AT

. A maioria dos efeitos conhecidos da Ang II até

recentemente eram exclusivamente atribuídos à ativação dos receptores AT

. Entretanto,

estudos recentes têm demonstrado que a ativação dos receptores AT

também contribui

para a ação da Ang II em diferentes tecidos. Evidências recentes têm revelado que a

atuação dos receptores AT

e AT

é antagônica,

60 e 61

embora haja uma complexidade maior

neste conceito, visto que a ativação do receptor AT

da Ang II apresenta um efeito oposto à

ativação do receptor AT

da Ang II e que possivelmente envolve uma interação com o

receptor Mas da Ang-(1-7) [AT1-7]

. A ativação do AT

pela Ang II promove efeitos

conhecidos de vasoconstrição e podem ser bloqueados por drogas como o losartan,

valsatan, olmesartan, candesartan, ibesartan, etc e o receptor AT

pode ter seus efeitos

bloqueados seletivamente pelo antagonista não peptídico PD123319

63 e 64

Estruturas dos peptídeos do SRA:

Angiotensinogênio Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Ser

Angiotensina I Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu

Angiotensina II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina III Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina IV Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Angiotensina-(1-7) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro

Angiotensina-(1-9) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His

1.3.2 O heptapeptídeo Ang-(1-7)

Os estudos com o heptapeptídeo Ang-(1-7) começaram após a observação fortuita de que a

adição de Ang I ao homogenato de tronco cerebral de cães resultava no aparecimento de

um pico de alto desempenho da cromatografia líquida que correspondia a um peptídeo

truncado na porção terminal NH

. Posteriormente, sua aplicação no hipotálamo-

neurohipófise explantada de ratos estimulou a liberação de vasopressina em quantidades

equivalentes às obtidas com a aplicação de Ang II

, comprovando não só a sua atividade

biológica da Ang-(1-7) como também quebrando um paradigma de que os receptores

mediando as ações da Ang II requeriam a porção carboxi-terminal intacta, pois na

Ang-(1-7) faltava a fenilalanina na posição oito da Ang II

. Este pico alto de desempenho

estava presente em amostras incubadas na presença de inibidores da enzima conversora da

Angiotensina (IECA) que aboliram a formação do

125

I-Ang II, indicando uma rota

independente da ECA para a formação deste heptapeptídeo

. Experimentos posteriores

utilizando aorta bovina e de seres humanos e células endoteliais de veias umbilicais

confirmaram estes achados

Em 1994, foi caracterizado um novo antagonista para o SRA, a [7-D-ALA]-angiotensina-

(1-7) ou A779, agora seletivo para a Ang-(1-7), já demonstrando indícios de que as ações

da Ang-(1-7) eram mediadas por um receptor específico

69 e 70

A Ang-(1-7) passou a ser estudada intensamente a partir de então e com interesse cada vez

mais crescente. Seus efeitos têm sido demonstrados ser opostos ao da Ang II

70 e 71

Em 2003, Santos e colaboradores

identificaram o receptor Mas acoplado à proteína G

como o receptor endógeno específico para a Ang-(1-7), sendo esta descoberta ratificada

posteriormente por diversos trabalhos

73-78

Até o momento, são três as enzimas conhecidas que podem regular a formação da

Ang-(1-7) a partir da Ang I. Elas são a neprilisina 24,11 (NEP), oligopeptidase thimet 24,15

(TOP) e prolil oligopeptidase 21.26 POP 21.26 (POP). Além disto, são conhecidas duas

enzimas capazes de clivar a Ang II em Ang-(1-7): a POP e a ECA2, recentemente

descoberta

49,50

Particularmente no endotélio vascular humano a Ang-(1-7) mostrou-se presente, onde é

produzida e também metabolizada

79 e 80

. Recentemente, Sampaio e colaboradores

demonstraram que nas células endoteliais humanas a Ang-(1-7) contra-regula a sinalização

celular da Ang II/Ang II receptor tipo 1 ativado pela c-Src e seus alvos na cascata, a

ERK1/2 e NAD(P)H oxidase e que também a interação SHP-2-c-Src está aumentada pela

Ang-(1-7), mostrando que este fenômeno pode representar o mecanismo protetor pela Ang-

(1-7) que contra-regula os efeitos deletérios da Ang II. Sampaio e colaboradores

demonstraram em outro estudo

que 1) as células endoteliais humanas possuem um

receptor acoplado à proteína G, Mas, através do qual é mediado a ativação da óxido nítrico

sintase dependente do endotélio (eNOS), 2) a Ang-(1-7) regula diferencialmente a

fosforilação da Ser

177

e Thr

495

e 3) a via fosfato de inositol 3 K/Akt (PI3K/Akt) tem um

papel importante na ativação da eNOS mediada pela Ang-(1-7) e na liberação de óxido

nítrico, sugerindo que a Ang-(1-7) regula a função endotelial através do receptor Mas que

estimula a atividade da eNOS e a produção de óxido nítrico através das vias dependentes da

Akt. Estes dados enfatizam a importância do eixo Ang-(1-7)-Mas como um regulador da

função endotelial.

A Ang-(1-7) mostrou também reduzir o crescimento das células musculares dos vasos

quando submetida à lesão

, através da liberação de prostaciclina, sendo este mecanismo

devido à produção de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) mediado pela prostaciclina

e pela ativação do proteína quinase dependente do AMPc e pela atenuação da ativação da

proteína kinase ativada pelo mitógeno

Freeman e colaboradores

em 1996 já sugeriam que a Ang-(1-7) apresentava efeitos

opostos à Ang II na regulação do crescimento de células musculares lisas em cultura

isolada de aorta de ratos. A Ang-(1-7) atenuou a incorporação de timidina [

H] em

contraste com a Ang II que estimulou a sua incorporação. A Ang II também aumentou o

número total de células, sugerindo que o aumento da incorporação da timidina [

H] estava

associado com a proliferação de células musculares lisas. O antagonista AT

da Ang II,

losartan, reduziu a incorporação de timidina pela Ang II, o que não ocorreu quando o

antagonista AT

da Ang II foi administrado. Portanto, estes resultados sugeriam que a Ang-

(1-7) e a Ang II apresentavam efeitos opostos na regulação do crescimento de células

musculares lisas e suspeitou-se então, que a inibição da proliferação destas células pela

Ang-(1-7) parecia estar mediada por um novo receptor de angiotensina que não era inibido

pelos antagonistas dos receptores AT

e/ou AT

da Ang II. Sabe-se que a hiperplasia

intimal ocorre devido à proliferação e migração de células musculares lisas.

A Ang-(1-7) reduziu o crescimento de células musculares lisas após a lesão de carótida de

ratos por balão, devido à redução da síntese de DNA tanto da íntima quanto da média

destes vasos lesados

Mostrou ainda reduzir a hiperplasia intimal em stents implantados em aorta abdominal de

ratos quando infundida por via venosa contínua

A Ang-(1-7) também está presente no coração humano onde é dependente da Ang II como

substrato

Levando-se em consideração as propriedades enzimáticas das duas ECAs (ECA e ECA 2) e

sendo os principais efetores a Ang II e a Ang-(1-7) com efeitos opostos no sistema

cardiovascular, tem sido proposto uma nova visão do SRA onde este sistema tem uma

função dupla ocorrendo a ação vasoconstritora-proliferação e vasodilatadora-anti-

proliferativa basicamente desencadeadas pelo balanço entre ECA-ECA2. Sendo que com o

aumento da atividade da ECA/ECA2 levará ao aumento da Ang II e aumento do

catabolismo da Ang-(1-7), favorecendo a vasoconstrição. Por outro lado, a relação oposta

reduzirá a Ang II e aumentará a Ang-(1-7) o que facilitará a vasodilatação

Diante destas descobertas, que veio sedimentar ainda mais o papel contra-regulatório da

Ang-(1-7) aos efeitos deletérios provocados pela hiper-expressão da Ang II nas patologias

cardiovasculares, perguntamos qual seria o papel do eixo Ang-(1-7)-Mas nas artérias no

qual provocaríamos o estresse pelo desnudamento arterial, simulando uma agressão a esta

artéria como um intenso estresse de cisalhamento. Para tal, utilizamos o camundongo como

modelo experimental e induzimos este tipo de estresse, através da passagem de um fio guia

de angioplastia na sua luz por três vezes, conforme descrito anteriormente por técnica

validada por Roque M. e cols

. A seguir, tratamos então os animais (N=60) divididos em

12 grupos (N=5) nos quais foram administradas agonistas, em diversas formulações e

antagonistas dos receptores Mas e AT

e analisamos, após 28 dias, a resposta arterial a este

tipo de agressão comparando, por histomorfometria, as artérias lesadas com as artérias

controles (contra-laterais) e os diversos grupos entre si.

Objetivos

II. Objetivos

O primeiro objetivo deste trabalho é avaliar a atuação biológica do eixo Ang-(1-7)-receptor

Mas na resposta da lesão arterial induzida pelo desnudamento endotelial.

O segundo objetivo deste trabalho é avaliar se, em sendo biologicamente ativo na lesão

arterial induzida pelo desnudamento arterial, a Ang-(1-7) isoladamente seria eficaz por via

oral, comparado com:

1) a sua administração por micro-bomba de infusão via SC,

2) a sua administração por via oral estando associada com o composto hidróxi-prolil-beta-

ciclodextrina [HPβCD-Ang(1-7)]

3) a administração por via oral de AVE 0991, agonista não protéico do receptor Mas.

Materiais e Métodos

III. Materiais e Métodos

3.1 Animais

Camundongos da raça C57Bl/6J e Knock-Out para o receptor Mas da Ang-(1-7) [Mas

-/-

]

foram fornecidos pelo Centro de Bioterismo (CEBIO) do ICB, da UFMG. No total, foram

utilizados 60 animais (n=60), sendo 5 animais em cada grupo (n=5).

Os animais, todos do sexo masculino, tinham idade média de 12 ± 0,3 semanas e um peso

de 25 ± 2 gramas.

Foram mantidos em temperatura ambiente em regime de 12 horas de luz, alternado com 12

horas de escuridão. A alimentação foi à base de ração fornecida pelo CEBIO, sendo a

ingestão de ração e de água a vontade.

Os procedimentos cirúrgicos e os cuidados dos animais descritos foram realizados de

acordo com os critérios aprovados pelo Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals

e pelo comitê de ética desta instituição.

3.2 Grupos de estudo

Os animais foram divididos nos seguintes grupos, de acordo com as respectivas drogas

administradas, nas seguintes doses e vias, por um período de 28 dias:

3.2.1 Bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas:

3.2.1.1 A779: 100 mg em 2 g de PLGA implantado no dorso do animal - SC.

3.2.1.2 Mas

-/-

: 100 µl de água/dia em dose única diária, por gavagem.

3.2.2 Agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas:

3.2.2.1 AVE 0991: 1 mg/Kg/dia diluído em 100 µl de água, em dose única

diária, por gavagem. (Preparo da AVE 0991: 5 mg/ml em KOH a 10 mM. Sonicado por

um período de 20 minutos)

3.2.2.2 Ang-(1-7): 100 µg/Kg/dia diluído em 100 µl de água, em dose única

diária, por gavagem.

3.2.2.3 Ang-(1-7) em micro-bomba de infusão Alzet

[MBI-Ang-(1-7)]: 0,25

µl/h por 28 dias, implantado no dorso do animal - SC; dose de Ang-(1-7): 100

µg/Kg/dia.

3.2.2.4 Ang-(1-7) incluída em HPβCD [HPβCD-Ang(1-7)]: sendo que o volume

do composto administrado continha 100 µg de Ang-(1-7)/Kg/dia e 3,18 µg/Kg/dia de

HPβCD, em dose única diária, por gavagem.

3.2.3 Bloqueio do Receptor AT

da Ang II:

3.2.3.1 BRAT

da Ang II (Losartan): 5 mg/Kg/dia diluído em 100 µl de água,

em dose única diária, por gavagem.

3.2.3.2 Losartan +A779: Losartan na dose de 5 mg/Kg/dia diluído em 100 µl de

água, em dose única diária, por gavagem, +100 mg em 2 g de PLGA implantado no

dorso do animal – SC.

3.2.4 Controles:

3.2.4.1 PLGA (poly lactic-co-glycolic acid) ou ácido poli-lático co-glicólico:

pastilha de 2g implantado no dorso do animal. 100 µl de água/dia, em dose única diária,

por gavagem.

3.2.4.2 HPβCD: 3,18 µg/Kg/dia diluído em 100 µl de água/dia em dose única

diária, por gavagem.

3.2.4.3 Cirurgia: 100 µl de água/dia por gavagem em dose única diária;

3.2.4.4 Sham: 100 µl de água/dia em dose única diária, por gavagem.

3.3 Cirurgia

Todos os animais foram anestesiados com a solução de ketamina (100 mg/kg) e xilazina

(10 mg/kg), diluídos em salina 0,9%, aplicados via intra-peritoneal (IP), sendo utilizado de

0,18 a 0,20 ml de volume da solução.

A seguir os animais foram colocados em decúbito dorsal sobre uma pequena prancha de

madeira.

Realizada a tricotomia da região inguinal esquerda seguido de anti-sepsia com álcool

iodado.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob uma lupa, utilizando-se aumentos

de 10, 20 e 40x.

Feito incisão perpendicular ao ligamento inguinal, em região inguinal esquerda, seguido de

dissecção e isolamento de artérias ilíaca e femoral esquerda com fio de algodão.

Clampeamento de artéria femoral esquerda na altura do ligamento inguinal seguido de

arteriotomia em artéria femoral esquerda logo distal à artéria inominada (hipogástrica).

Introduzido fio guia de 0,010” (0,254 mm) de diâmetro, de angioplastia, na luz da artéria

femoral esquerda, seguido de soltura do clampe.

Passagem sucessiva do fio guia 0,010” por 3 vezes, até a bifurcação da Aorta, seguido de

sua retirada.

Ligamento da artéria femoral esquerda com fio de algodão, distal à origem da artéria

hipogástrica e imediatamente proximal ao local de onde foi feito a arteriotomia.

Sutura da pele com fio prolene 6.0.

Os procedimentos cirúrgicos duraram entre 15 a 20 minutos de média.

Os tempos de clampeamento das artérias femoral esquerda, antes que o fio guia 0,010”

fosse introduzido para evitar perda de sangue, foram inferiores a 1 minuto.

No grupo Sham, foi feito incisão em região inguinal esquerda, seguido de dissecção e

isolamento da artéria femoral esquerda com fio de algodão. Posteriormente, foi colocado o

clampe na artéria ilíaca esquerda, na altura do ligamento inguinal, seguido de arteriotomia

em artéria femoral esquerda logo distal à artéria hipogástrica. Não foi feita a passagem do

fio guia 0,010” na luz das artérias operadas neste grupo. Foi então ligada a artéria femoral

esquerda com fio de algodão, distal à origem da artéria hipogástrica e imediatamente

proximal ao local de onde foi feito a arteriotomia. Soltura do clampe. Feito sutura da pele

com fio prolene 6.0.

Assim como as artérias contra-laterais dos outros grupos, estas artérias do grupo Sham

também serviram de grupo controle.

Todos os animais submetidos ao procediemento cirúrgico foram aquecidos a 37

C até a

completa recuperação.

Posteriormente, foram mantidos em temperatura ambiente em regime de 12 horas de luz,

alternado com 12 horas de escuridão.

A alimentação foi à base de ração fornecida pelo CEBIO, sendo a ingestão de ração e de

água a vontade.

Este procedimento cirúrgico, como metodologia para avaliar a lesão arterial a partir do

desnudamento arterial, foi validado anteriormente

16 animais morreram: 5 do grupo A779, 3 do grupo A779 + Losartan, 2 do grupo Mas

-/-

2 do grupo Losartan, 2 do grupo Ang-(1-7) e 2 do grupo Cirurgia.

A autópsia dos animais não revelou a causa de morte. Os animais mortos foram

substituídos por outros, que foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico e

incluídos nos respectivos grupos para completarem o número de 5 animais em cada grupo.

3.4 Preparação dos tecidos

No 28

dia após o procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados com a solução de

ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), diluídos em salina 0,9%, aplicados via IP,

sendo utilizado de 0,18 a 0,20 ml de volume da solução.

Foi feito toracotomia, seguido de punção de Ventrículo Esquerdo com agulha 30 x 15 mm e

de incisão no Átrio Direito.

Realizado perfusão com paraformaldeído a 4% em 0,1 M de tampão fosfato, PBS, com

pH=7,4, por um período de 15 minutos a 100 mm Hg de pressão.

Realizado a ressecção do trem posterior.

Os espécimes foram mantidos “overnight” imersas no paraformaldeído a 4% em 0,1 M de

tampão fosfato, PBS, com pH=7,4.

No dia seguinte foi realizado a dissecção das artérias lesada (femoral esquerda) e controle

(contra-lateral ou femoral direita).

As artérias com cerca de 3 a 4 mm de comprimento, retirados abaixo do ligamento inguinal,

foram mantidas em álcool a 70%.

Coloração de HE eVer Hoff.

As artérias foram processadas e emblocadas em parafina, para posterior cortes transversais

com 5 µm de espessura com intervalos de 100 µm entre cada 2 cortes. Foram preparadas 2

lâminas com cerca de 15 cortes.

3.5 Análise Histo-morfométrica

Nas artérias lesadas, os cortes selecionados para análise foram aqueles que apresentaram

um maior comprometimento da área do lúmen.

Nas artérias controles, as medidas foram realizadas nos cortes feitos a 2 mm do local de

incisão das artérias.

As medidas foram realizadas através de método duplo-cego.

As imagens foram capturadas por um microscópio com uma câmara digital acoplada a um

computador. As imagens foram digitalizadas. As medidas foram feitas utilizando-se o

software NIH Image v1.60.

As medidas realizadas foram as seguintes:

1) área do vaso: delimitada pela lâmina elástica externa (LEE). Ela também serviu para

avaliar o comportamento do tamanho do vaso nos grupos controles (artéria femoral direita)

e nos grupos lesados (artéria femoral esquerda), ou seja, determinar se houve

remodelamento positivo ou negativo ou se não houve alteração;

2) área da camada muscular média (área da média): foi calculada como a diferença entre

e área da medida das LEE e LEI;

3) área do lúmen: demarcada como a área cercada pela camada de células endoteliais;

4) área da hiperplasia intimal: definida como a área entre o lúmen e a lâmina elástica

interna. Nas artérias controles, esta área é virtual;

5) comprimento da Lâmina Elástica Externa;

6) comprimento da Lâmina Elástica Interna;

7) percentual de hiperplasia intimal (HI) das artérias: é igual à área da LEI ocupada

pela HI = (área da HI x 100 / área do lúmen + área da HI) = área da LEI ocupada pela HI =

carga de HI

92-94

;

8) área da íntima/área da média: feito o cálculo da razão entre as áreas da íntima e da

média, com finalidade de avaliar o efeito inibitório dos fármacos.

Os resultados de pelo menos três cortes transversais de cada artéria foram utilizados para o

cálculo da média, que foi assim considerado para a avaliação e análise estatística.

3.6 Análise estatística

Os dados são expressos em médias ± desvio padrão; as comparações entre as medidas das

áreas do vaso, da média, da íntima, do lúmen, do % de HI e do comprimento da LEI e LEE

nas artérias do mesmo grupo (variáveis contínuas), foram feitas através do teste t de student

pareados. A diferença entre os grupos foi testada com ANOVA de Friedman (pareada e

distribuição não normal). Os critérios para relevância estatística foram considerados quando

p<0,05.

Algorítimo do Protocolo

IV. Algorítimo do Protocolo

Desnudamento da artéria

femoral esquerda de

camundongos (N=60)

Administração de

fármacos por 28 dias

DIA 0

Grupos de Estudo

Bloqueio Ang-(1-7)-Mas

1) A779 (N=5)

)

Mas

-/-

(

N=5

)

Agonistas Ang-(1-7)-Mas

1) AVE 0991 (N=5)

2) Ang-(1-7) (N=5)

3) MBI-Ang-(1-7) (N=5)

4) HPβCD-Ang-(1-7) (N=5)

Bloqueio receptor AT

Ang II

1) Losartan (N=5)

)

Losartan + A779

(

N=5

)

Controles

1) PLGA (N=5)

2) HPβCD (N=5)

3) Cirurgia (N=5)

4) Sham (N=5)

DIA 28 Sacrifício dos animais

Comparação histomorfométrica das artérias femoral esquerda e

direita entre camundongos do mesmo grupo e entre os grupos

Áreas

1) lâmina elástica externa

2) lâmina elástica interna

3) média

4) lúmen

)

íntima

Percentual

de hiperplasia intimal

Resultados

V Resultados

5.1 Bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas

5.1.1 A779

100 µ

AUMENTO: 200X

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 3: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com A779.

Como mostrado na figura 3, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta completa oclusão de toda sua luz por HI, além de redução da sua

área total comparada com a artéria femoral direita (controle).

Tabela 1: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal além do comprimento médio da LEE e LEI e do percentual de HI do grupo

submetido à cirurgia e tratado com A779.

Controle Lesão P

Área do Vaso (µ

)

32.029 ± 4.749 19.363 ± 3.066 p =0,049

Área da Muscular Média (µ

)

6.276 ± 1.305 6.619 ± 1.147 p=0,9

Área do Lúmen (µ

)

25.752 ± 3.495 2.073 ± 2.073 p=0,001

Área da Hiperplasia Intimal (µ

)

0 10.669 ± 2.078 p=0,003

Comprimento da LEE (µ)

1.058 ± 75 854 ± 58 p=0,9

Comprimento da LEI (µ)

929 ± 77 750 ± 72 p=0,15

% de Hiperplasia Intimal

0 89 ± 10 p=0,0003

Como mostrado na tabela 1, observa-se redução significativa das áreas do vaso e do lúmen

e aumento significativo da área de HI e do % de HI nas artérias lesadas comparadas com as

artérias controles.

representam diferenças significativas

Gráfico 1: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com A779.

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Intima A779 C Intima A779 L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Vaso A779 C Vaso A779 L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Lúmen A779 C Lúmen A779 L

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Média A779 C Média A779 L

Como mostrado no gráfico 1, nas artérias lesadas, as áreas do vaso e do lúmen apresentam

redução significativa e a área de íntima (ou HI) apresenta aumento significativo

comparadas com as artérias controles.

100

120

HI A779 C HI A779 L

1200

* representam diferenças significativas

Gráfico 2: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

submetido à cirurgia e tratado com A779.

Como mostrado no gráfico 2, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

200

400

600

800

1000

Comprimento LEE

A779 C

Comprimento LEE

A779 L

1200

1000

Comprimento LEI

A779 C

Comprimento

LEI

A779 L

5.1.2 Mas

-/-

ita (Controle) Artéria fem querda (

Como mostrado na figura 4, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta completa oclusão de toda sua luz por HI, além de redução da sua

área total, comparada com a artéria femoral direita (controle).

100 µ

AUMENTO: 200X

Artéria femoral dire oral es Lesão)

Figura 4: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

Mas

-/-

submetido à cirurgia.

Tabela 2: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio da LEE e LEI e percentual de HI no grupo Mas

-/-

submetido à

cirurgia.

Controle Lesão P

Área do Vaso (µ

) 29.919 ± 5.329 13.951 ± 4.756 p =0,04

Área da Muscular Média (µ

) 8.809 ± 621 4.406 ± 810 p=0,05

Área do Lúmen (µ

) 21.109 ± 4.948 174 ± 101 p=0,002

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 9.370 ± 3.952 p=0,004

Comprimento da LEE (µ) 1.154 ± 64 595 ± 81 p=0,02

Comprimento da LEI (µ) 1.044 ± 52 671 ± 116 p=0,07

% de Hiperplasia Intimal 0 97 ± 2 P<0,0001

Como mostrado na tabela 2, observa-se redução significativa das áreas do vaso, da média e

do lúmen e do comprimento da LEE, além de aumento significativo da área de HI e do %

de HI nas artérias lesadas comparadas com as artérias controles.

* representam diferenças significativas

Gráfico 3: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo Mas

-/-

submetido à cirurgia.

Como mostrado no gráfico 3, nas artérias lesadas, as áreas do vaso, da média e do lúmen

apresentam redução significativa e a área de íntima (ou HI) apresenta aumento significativo

comparadas com as artérias controles.

4000

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Vaso Mas

C Vaso Mas

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Média Mas

C Média Mas

200

400

600

800

1000

1200

1400

Íntima Mas

2250

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

Lúmen Mas

C Lúmen Mas

Intima Mas

* represen

-/-

submetido à cirurgia.

primento da LEE.

tam diferenças significativas

Gráfico 4: Percentual de hiperplasia intimal (%HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

Mas

Como mostrado no gráfico 4. nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI e redução significativa do com

100

120

HI Mas

C HI Mas

Comprimento LEI

Mas

-/-

Comprimento LEI

Mas

-/-

200

400

600

800

1000

12001400

Comprimento LEE

Mas

-/-

Comprimento LEE

Mas

-/-

200

400

600

800

1000

1200

5.2 Agonistas do eixoAng-(1-7)-Mas

5.2.1 AVE 0991

Como mostrado na figura 5, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta discreta HI sem comprometimento do lúmen, além de aumento da

área total do vaso, comparada com a artéria femoral direita (controle).

AUMENTO: 100X

100 µ

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 5: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com AVE 0991.

Tabela 3: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio da LEE e LEI e percentual de HI no grupo submetido à

cirurgia e tratado com AVE 0991.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 46.862 ± 4.099 87.966 ± 10.936 0,001

Área da Muscular Média (µ

) 15.124 ± 1.232 16.336 ± 1.781 0,5

Área do Lúmen (µ

) 31.738 ± 5.170 47.121 ± 3.959 0,01

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 24.508 ± 2.626 <0,001

Comprimento da LEE (µ) 1.324 ± 44 1.335 ± 60 0,9

Comprimento da LEI (µ) 1.121 ± 27 998 ± 75 0,2

% de Hiperplasia Intimal 0 34,5 ± 10,8 0,0002

Como mostrado na tabela 3, observam-se aumento significativo das áreas de HI, do lúmen e

do vaso e do % de HI comparando as artérias lesadas com as artérias controles. Não houve

redução da área do lúmen nas artérias lesadas, pelo contrário, houve aumento deste

parâmetro nestas artérias, pois apesar do aumento significativo da HI, houve um aumento

compensatório e significativo da área do vaso.

Pelo contrário, houve até aumento significativo do lúmen devido ao aumento

compensatório e significativo da área do vaso.

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

Média AVE C Média AVE L

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

Vaso AVE C Vaso AVE L

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Lúmen AVE C Lúmen AVE L

5000

10000

15000

20000

* representam diferenças significativas

Gráfico 5: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias dos grupos controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado co

AVE 0991.

Como mostrado no gráfico 5, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles, a

área de HI apresenta-se significativamente aumentada, porém sem comprometimento do

lúmen.

25000

30000

Intima AVE C Intima AVE L

100

120

140

160

Comprimento LEE

AVE C

Comprimento LEE

AVE L

200

ráfico 6: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

o grupo

rtérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI e não houve alterações nos comprimentos da LEE

e LEI.

400

600

800

100

120

Comprimento LEI

AVE C

Comprimento LEI

AVE L

AVE C AVE L

* representam diferenças significativas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) d

submetido à cirurgia e tratado com AVE 0991.

Como mostrado no gráfico 6, nas a

5.2.2 Ang-(1-7)

100 µ

AUMENTO: 200X

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 6: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com Ang-(1-7).

Como mostrado na figura 6, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta discreta HI sem comprometimento do lúmen, pelo contrário, houve

até aumento do lúmen, além de aumento da sua área total do vaso quando comparada com a

artéria femoral direita (controle).

Tabela 4: Medidas das médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio da LEE e LEI e percentual de HI do grupo submetido à

cirurgia e tratado com Ang-(1-7), comparando as artérias controles com as artérias lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 26.735 ± 8.298 52.541 ± 8.180 0,005

Área da Muscular Média (µ

) 15.645 ± 6.527 10.025 ± 1.908 0,03

Área do Lúmen (µ

) 11.090 ± 2.420 33.683 ± 6.551 0,03

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 8.833 ± 5.533 0,0004

Comprimento da LEE (µ) 1.223 ± 179 994 ± 67 0,2

Comprimento da LEI (µ) 1.076 ± 153 774 ± 86 0,06

% de Hiperplasia Intimal 0 21 ± 5 0,02

Com

do vaso e do % de HI e redução da área da m

com en nas artérias lesadas, pelo

contrário, houve aumento significativo deste parâmetro, pois apesar do aumento

significativo da área de HI nestas artérias,

da área do vaso.

o mostrado na tabela 4, observa-se aumento significativo das áreas da HI, do lúmen e

édia quando comparado as artérias lesadas

as artérias controles. Não houve redução da área do lúm

houve um aumento compensatório e significativo

m comprometimento do lúmen. Pelo contrário,

houve até aumento significativo do lúmen devido ao aumento compensatório e

significativo da área do vaso, além de redução significativa da área da média, quando

comparado com as artérias controles.

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Vaso Ang-(1-7) C Vaso Ang-(1-7) L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Lúmen Ang-(1-7) C Lúmen Ang-(1-7) L

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

25000

Média Ang-(1-7) C Média Ang-(1-7) L

2000

4000

6000

8000

10000

12000

* representam diferenças significativas

Gráfico 7: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles(C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com

Ang-(1-7).

Como mostrado no gráfico 7, nas artérias lesadas, a área de HI apresenta-se

significativamente aumentada, porém se

Intima Ang-(1-7) C Intima Ang-(1-7) L

HI Ang-(1-7) C HI Ang-(1-7) L

200

400

600

800

1000

1200

1400

* representam diferenças significativas

comprimento médio das lâminas

lásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

nto significativo do % de HI.

Gráfico 8: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e o

submetido à cirurgia e tratado com Ang-(1-7).

Como mostrado no gráfico 8, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aume

Comprimento LEI

Ang-(1-7) C

Comprimento L

Ang-(1-7) L

1600

200

400

600

800

Comprimento LEE

Ang 1-7 C

Comprimento LEE

Ang 1-7 L

1000

1200

1400

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 7: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com MBI-Ang-(1-7).

Como mostrado na figura 7, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta discreta HI sem comprometimento do lúmen, além de aumento da

sua área total e aumento da área do lúmen quando comparado com a artéria femoral direita

(controle).

5.2.3 MBI-Ang-(1-7)

100 µ

AUMENTO: 200X

Tabela 5: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio da LEE e LEI e percentual de HI do grupo submetido à

cirurgia e tratado com MBI-Ang-(1-7), comparando as artérias controles com as artérias

lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 29.401 ± 5.620 70.253 ± 26.257 0,002

Área da Muscular Média (µ

) 9.111 ± 2.215 16.576 ± 8.767 0,05

Área do Lúmen (µ

) 20.289 ± 5.886 34.077 ± 18.266 0,04

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 19.598 ± 7.479 <0,0004

Comprimento da LEE (µ) 1.015 ± 223 1.138 ± 185 0,4

Comprimento da LEI (µ) 808 ± 339 932 ± 195 0,35

% de Hiperplasia Intimal 0 32,2 ± 2,5 0,0004

Como mostrado na tabela 5, observa-se aumento significativo das áreas da HI, do lúmen e

o vaso e do % de HI quando comparado as artérias lesadas com as artérias controles. Não

houve redução da área do lúmen nas artérias lesadas, pelo contrário, houve aumento deste

parâmetro, pois apesar do aumento significativo da área de HI nestas artérias, houve um

aumento compensatório e significativo da área do vaso, quando comparado com as artérias

controles.

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Lúmen MBI-

(

)

) C

Lúmen MBI-

* representam diferenças significativas

Gráfico 9: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com

MBI-Ang-(1-7).

Como mostrado no gráfico 9, nas artérias lesadas houve aumento significativo das áreas de

HI, do lúmen e da média quando comparado com as artérias controles. Ao contrário do que

se esperava o aumento da área da íntima nestas artérias não reduziu a área luminal, houve

até um aumento da área do lúmen, pois houve um aumento compensatório e significativo

da área do vaso.

(

)

) L

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

Média MBI-

(

)

C Média MBI-

(

)

) L

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

25000

Intima MBI-

(

)

) C Intima MBI-

(

)

) L

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

(

)

(

)

* representam diferenças significativas

oles (C) e lesadas (L) do grupo

bmetido à cirurgia e tratado com MBI-Ang-(1-7).

Gráfico 10: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias contr

Como mostrado no gráfico 10, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEI

MBI-Ang-(1-7) C

Comprime

MBI-Ang-(1-7) L

nto LEI

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEE

MBI-Ang-(1-7) C

Comprimento LEE

MBI-Ang-(1-7) L

HI MBI-

(

)

) C

HI MBI-

(

)

) L

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 8: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com HPβCD-Ang-(1-7).

Como mostrado na figura 8, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta discreta HI sem comprometimento do lúmen, além de um aumento

da área total comparada com a artéria femoral direita (controle).

5.2.4 HPβCD-Ang-(1-7)

100 µ

AUMENTO: 100X

Tabela 6: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio das LEE e LEI e percentual de HI do grupo submetido à

cirurgia e tratado com HPβCD-Ang-(1-7), comparando as artérias controles com as artérias

lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 43.345 ± 9.390 69.793 ± 9.563 0,04

Área da Muscular Média (µ

) 11.133 ± 1.015 14.258 ± 1.905 0,1

Área do Lúmen (µ

) 32.212 ± 8.386 36.015 ± 6.779 0,7

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 19.519 ± 2.566 0,004

Comprimento da LEE (µ) 1.294 ± 5 1.187 ± 130 0,5

Comprimento da LEI (µ) 1.119 ± 13 1.048 ± 101 0,6

% de Hiperplasia Intimal 0 35,9 ± 4 0,0003

Como mostrado na tabela 6, observa-se aumento significativo das áreas da HI e do vaso e

do % de HI quando comparado as artérias lesadas com as artérias controles. Não houve

redução da área do lúmen nas artérias lesadas, pelo contrário, houve aumento deste

arâmetro, pois apesar do aumento significativo da área de HI nestas artérias, houve um p

aumento significativo e compensatório da área do vaso.

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

(

)

Vaso

(

)

) L

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Lúmen

(

)

) C

Lúmen

(

)

) L

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Média

(

)

) C

Média

(

)

) L

2500

5000

7500

1000

1250

1500

1750

2000

2250

2500

Intima

(

)

) C

Intima

(

)

) L

* representam diferenças significativas

cirurgia e tratado com HPβCD-

ng-(1-7).

lesadas houve aumento significativo das áreas

de HI, quando comparado com as artérias controles. Ao contrário do que se esperava o

aumento da área da íntima nestas artérias não reduziu a área luminal, pois houve um

aumento significativo e compensatório da área do vaso.

Gráfico 11: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima d

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à

Como mostrado no gráfico 11, nas artérias

diferenças significativas

omo mostrado no gráfico 12, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

ouve aumento significativo do % de HI.

* representam

Gráfico 12: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

submetido à cirurgia e tratado com HPβCD-Ang-(1-7).

Comprimento LEI

(

Comprime

)

) C

nto LEI

(

)

) L

100

120

140

Comprimento LEE

(

)

) C

Comprimento LEE

(

)

) L

(

)

) C

(

)

) L

5.3 Bloqueio do Receptor AT

da Ang II:

5.3.1 Losartan

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

bmetido à cirurgia e tratado com Losartan.

prometimento significativo de sua luz por HI, além de aumento

a sua área total comparada com a artéria femoral direita (controle).

100 µ

AUMENTO: 200X

Figura 9: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

Como mostrado na figura 9, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta com

Tabela 7: Medidas médias das áreas do vaso, da muscular, da hiperplasia intimal,

omprimento médio das LEE e LEI e percentual de HI do grupo submetido à cirurgia e

tratado com Losartan, comparando as artérias controles com as artérias lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 30.613 ± 4.715 50.366 ± 10.523 0,04

Área da Muscular Média (µ

) 8.179 ± 868 20.727 ± 5.106 0,03

Área do Lúmen (µ

) 22.4434 ± 4.627 7.727 ± 3.256 0,01

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 28.385 ± 7.569 0,01

Comprimento da LEE (µ) 1.061 ± 80 1.056 ± 274 0,9

Comprimento da LEI (µ) 990 ± 88 921 ± 199 0,9

% de Hiperplasia Intimal 0 62,2 ± 13,5 0,009

Como mostrado na tabela 7, observam-se aumento significativo das áreas de HI e do % de

tivo da

roles.

HI, com redução significativa da área do lúmen, apesar de um aumento siginifica

área do vaso nas artérias lesadas comparadas com as artérias cont

* representam diferenças significativas

Como mostrado no gráfico 13, nas artérias lesadas houve aumento significativo das áreas

de HI, da média e do vaso, com redução significativa da área do lúmen quando comparado

com as artérias controles.

Gráfico 13: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com Losartan.

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

Vaso Losartan C Vaso Losartan L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Média Losartan C Média Losartan L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

Intima Losartan C Intim a Losartan L

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Lúmen Losartan C Lúmen Los n Larta

ráfico 14: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

Como mostrado no gráfico 14, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

HI Losartan C HI Losartan L

100

120

100

120

140

* representam diferenças significativas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L)

do grupo submetido à cirurgia e tratado com Losartan.

Comprimento LEI

Losartan C

Comprimento LEI

Losartan L

Comprimento LEE

Losartan C

Comprimento LEE

Losartan L

5.3.2 Losartan + A779

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

e seu lúmen por HI.

100 µ

AUMENTO: 200X

Figura 10: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com Losartan + A779.

Como mostrado na figura 10, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta completa oclusão d

do vaso, da muscular, do lúmen e da hiperplasia

intimal, comprimento médio da LEE e LEI e o percentual de HI no grupo submetido à

cirurgia e tratado com A779 + Losartan, comparando as artérias controles com as artérias

lesadas.

Controle Lesão p

Tabela 8: Medidas médias das áreas

Área do Vaso (µ

) 34.342 ± 2.158 21.322 ± 5.242 0,01

Área da Muscular Média (µ

) 8.384 ± 262 4.998 ± 509 0,009

Área do Lúmen (µ

) 25.957 ± 1.909 73 ± 73 0,0008

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 16.324 ± 4.792 0,004

Comprimento da LEE (µ) 1.047 ± 140 728 ± 59 0,16

Comprimento da LEI (µ) 980 ± 137 756 ± 38 0,27

% de Hiperplasia Intimal 0 99 ± 1 <0,0001

Como mostrado na tabela 8, observa-se aumento significativo da área de HI, aumento

significativo do % de HI e redução significativa das áreas do lúmen, da muscular média e

do vaso das artérias lesadas comparadas com as artérias controles.

* representam diferenças significativasas

ráfico 15: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

rtérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com A779 +

trado no gráfico 15, nas artérias lesadas houve aumento significativo das áreas

de HI, com redução significativa das áreas do lúmen, da média e do vaso comparadas com

as artérias controles.

ráfico 15: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

rtérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com A779 +

trado no gráfico 15, nas artérias lesadas houve aumento significativo das áreas

de HI, com redução significativa das áreas do lúmen, da média e do vaso comparadas com

as artérias controles.

Losartan.

Como mos

Losartan.

Como mos

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Vaso A779 + Los C Vaso A779 + Los L

3000

500

1000

1500

2000

2500

Lúmen A779 + Los C Lúmen A779 + Los L

2500

5000

7500

1000

1250

1500

1750

2000

2250

Intima A779 + Los C Intima A779 + Los L

900

100

200

300

400

500

600

700

800

Média A779 + Los C Média A779 + Los L

100

120

HI A779 + Los C HI A779 + Los L

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEE

A779 + Los C

Comprimento LEE

A779 + Los L

200

400

600

800

1000

1200

1400

Comprimento LEI

A779 + Los C

Comprimento LEI

A779 + Los L

* representam diferenças significativas

(LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

bmetido à cirurgia e tratado com A779 + Losartan.

Gráfico 16: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna

Como mostrado no gráfico 16, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

5.4 Grupos Controles:

5.4.1 PLGA

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 11: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com PLGA implantado no dorso do animal.

Como mostrado na figura 11, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta completa oclusão de seu lúmen por HI.

100 µ

AUMENTO: 200X

Tabela 9: Médias das áreas do vaso, da muscular do lúmen e da hiperplasia intimal,

comprimento médio da LEE e LEI e o percentual de HI no grupo submetido à cirurgia e

tratado com PLGA implantado no dorso do animal, comparando as artérias controles com

s artérias lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 3 3.960 ± 8.504 43.600 ± 9.769 0,4

Área da Muscular Média (µ

) 12.493 ± 4.115 7.884 ± 2.201 0,47

Área do Lúmen (µ

) 21.467 ± 4.861 12.908 ± 7.463 0,046

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 22 3 0 .807 ± 6.58 0,02

Comprimento da LEE (µ) 1.237 ± 96 931 ± 152 0,2

Comprimento da LEI (µ) 1161 8 ± 113 87 ± 138 0,2

% de Hiperplasia Intimal 0 66,4 ± 12.8 0,0067

Como mostrado na tabela 9, observam-se aumento significativo da área de HI, do % de HI

e redução significativa da área do lúmen das artérias lesadas comparadas com as artérias

controles.

representam diferenças significativas

Gráfico 17: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e tratado com PLGA

implantado no dorso do animal.

Como mostrado no gráfico 17, nas artérias lesadas houve aumento significativo da área de

HI, com redução significativa das áreas do lúmen e da média comparadas com as artérias

controles.

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Vaso PLGA C Vaso PLGA L

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Média PLGA C Média PLGA L

500

1000

1500

2000

2500

3000

Intima PLGA C Intima PLGA L

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

Lúmen PLGA C Lúmen PLGA L

al.

100

120

140

Comprimento LEE

PLGA C

Comprimento LEE

PLGA L

100

120

140

Comprimento LEI

PLGA C

Comprimento

LEI

HI PLGA

HI PLGA L

* representam diferenças significativas

Gráfico 18: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

submetido à cirurgia e tratado com PLGA implantado no dorso do anim

Como mostrado no gráfico 18, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

5.4.2 HPβCD

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Lesão)

Figura 12: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

submetido à cirurgia e tratado com HPβCD.

Como mostrado na figura 12, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta completa oclusão de seu lúmen por HI.

100 µ

AUMENTO: 100X

Tabela 10: Médias das áreas do vaso, da muscular do lúmen e da hiperplasia intimal,

comprimento médio da LEE e LEI e o percentual de HI no grupo submetido à cirurgia e

tratado com HPβCD, comparando as artérias controles com

as artérias lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

) 26.680 ± 6.368 27.173 ± 6.555 0,9

Área da Muscular Média (µ

) 8.207 ± 530 7.849 ± 1.235 0,74

Área do Lúmen (µ

) 18.472 ± 6.295 8.552 ± 6.516 0,01

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 12.561 ± 3.653 0,001

Comprimento da LEE (µ) 1.052 ± 41 864 ± 96 0,2

Comprimento da LEI (µ) 951 ± 33 778 ± 37 0,03

% de Hiperplasia Intimal 0 71 ± 15 0,009

Como mostrado na tabela 10, observam-se aumento significativo da área de HI, do % de HI

e redução significativa da área do lúmen das artérias lesadas comparadas com as artérias

controles.

tratado com HPβCD.

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

aso

500

1000

1500

2000

2500

3000

Lúmen

D Lúmen

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Média

D Média

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Intima

* representam diferenças significativas

Gráfico 19: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia e

Como mostrado no gráfico 19, nas artérias lesadas houve aumento significativo da área de

HI, com redução significativa da área do lúmen comparado com as artérias controles.

Intima

representam diferenças significativas

Gráfico 20: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

submetido à cirurgia e tratado com HPβCD.

Como mostrado no gráfico 20, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

houve aumento significativo do % de HI.

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEE

D L

Comprimento LEI

D C

Comprimento LEI

D L

200

400

600

800

1000

1200

D C HI

D L

5.4.3 Cirurgia

AUMENTO: 200X

100 µ

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femor squerda (Lesão

igura 13: Cortes histológicos de artérias femoral direita e femoral esquerda de animal

Como mostrado na figura 13, a artéria femoral esquerda (lesada pelo fio guia de

angioplastia) apresenta comprometimento importante de seu lúmen por HI.

al e )

submetido à cirurgia.

Tabela 11: Médias das áreas do vaso, da muscular do lúmen e da hiperplasia intimal,

comprimento médio da LEE e LEI e o percentual de HI no grupo submetido à cirurgia,

comparando as artérias controles com as artérias lesadas.

Controle Lesão p

Área do Vaso (µ

)

29.192 ± 3.663 26.916 ± 5.424 0,67

Área da Muscular Média (µ

)

10.907 ± 653 15.025 ± 1.972 0,01

Área do Lúmen (µ

)

18.284 ± 3.308 4.407 ± 4.111 0,05

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0

15.025 ± 1.972 0,0006

Comprimento da LEE (µ)

1.189 ± 93 766 ± 69

0,04

Comprimento da LEI (µ)

974 ± 77 793 ± 60

0,05

% de Hiperplasia Intimal 0 75 ± 11 0,001

Como mostrado na tabela 11, observam-se aumento significativo das áreas de HI, da média

e do % de HI e redução significativa da área do lúmen, do comprimento das LEE e LEI das

rtérias lesadas comparadas com as artérias controles.a

100

omo mostrado no gráfico 21, nas artérias lesadas houve aumento significativo da área da

do com as

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Vaso Cirurgia C Vaso Cirurgia L

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

Lúmen Cirurgia C Lúmen Cirurgia L

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Média Cirurgia C Média Cirurgia L

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Íntima Cirurgia C

Íntima Cirurgia L

* representam diferenças significativas

Gráfico 21: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo submetido à cirurgia.

íntima com redução significativa das áreas do lúmen e da média quando compara

artérias controles.

101

HI Cirurgia C HI Cirurgia L

* representam diferenças significativas

al (HI) e comprim inas

stica inte a (LE ) das a térias rol ) do rupo

met

Como mostrado no gráfico 22, nas artérias lesadas, comparadas com as artérias controles,

Gráfico 22: Percentual de hiperplasia intim ento médio das lâm

elá s externa (LEE) e rn I r cont es (C) e lesadas (L g

sub ido à cirurgia.

houve aumento significativo do % de HI.

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEI

Cirurgia C

Comprimento LEI

Cirurgia L

200

400

600

800

1000

1200

1400

Comprimento LEE

Cirurgia C

Comprimento LEE

Cirurgia L

102

5.4.4 Sham

Artéria femoral direita (Controle) Artéria femoral esquerda (Operada)

ita e femoral esquerda de animal

Como mostrado na figura 14, tanto a artéria controle quanto a artéria operada (neste grupo

ngio não há

100 µ

AUMENTO: 100X

Figura 14: Cortes histológicos de artérias femoral dire

Sham.

não foi feito introdução do fio guia de a plastia na luz da artéria operada)

qualquer comprometimento do lúmen por HI.

103

Tabela 12: Médias das áreas do vaso, da muscular do lúmen e da hiperplasia intimal,

comprim dio da LEE e LEI e o percentual de HI no grupo Sham.

Controle Lesão p

ento mé

Área

32.578 ± 4. 13.865

do Vaso (µ

)

667 38.909 ± 0,6

Área da Muscular Média (µ

)

8.124 ± 865 7.856 ± 723 0,71

Área do Lúmen (µ

)

24.454 ± 4.115 31.053 ± 613.297

0,6

Área da Hiperplasia Intimal (µ

) 0 0 1

Comprimento da LEE (µ)

1.213 ± 123 1.092 ± 116

0,4

Comprimento da LEI (µ)

1.064 ± 10 ± 96

1 934

0,0

% de Hiperplasia Intimal 0 0 1

Como m diferenças quando

comparadas as artérias controles com as lesadas.

ostrado na tabela 12, observa-se que as medidas não apresentam

104

* representam diferenças significativas

Gráfico 23: Áreas médias do vaso, da camada muscular (Média), do lúmen e da íntima das

artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo Sham.

Como mostrado no gráfico 23, não há diferença entre as áreas do vaso, do lúmen, de HI e

da média das artérias controles e lesadas.

1000

2000

3000

4000

5000

6000

aso Sham

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

Lúmen Sham Lúmen Sham

1000

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Média Sham Média Sham

-10

-8

-6

-4

-2

Intima Sham C Intima Sham L

105

-10

-8

-6

-4

-2

HI Sham C HI Sham L

200

400

600

800

1000

1200

Comprimento LEI

Sham C

Comprimento LEI

Sham L

200

400

600

800

1000

1200

1400

Comprimentp LEE

Sham C

Comprimento LEE

Sham L

* representam diferenças significativas

Gráfico 24: Percentual de hiperplasia intimal (HI) e comprimento médio das lâminas

am.

mo difere ça ent m

comprimentos da LEE e LEI das artérias controles e lesadas.

elásticas externa (LEE) e interna (LEI) das artérias controles (C) e lesadas (L) do grupo

Co mostrado no gráfico 24, não há n re as edididas do % de HI,

106

100

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

Gráfico 25: Percentual de HI das Artérias Lesadas.

2 ± 13,5%

omo mostrado no gráfico 25, nos grupos que tiveram o eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado (A779, Mas

-/-

, entre 60 e 75%.

1) A779: 89,7 ± 10 % 7) Losartan: 62,

2) Mas

-/-

: 97,6 ± 1.8 % 8) Losartan + A779: 99,17 ± 0,8 %

3) AVE 0991: 34,5 ± 10,8 % 9) PLGA: 66,4 ± 12.8%

4) Ang-(1-7): 21 ± 5% 10) HPβCD: 71 ± 15%

5) MBI-Ang-(1-7): 32,2 ± 2,5% 11) Cirurgia: 75 ± 11%

6) HPβCD-Ang(1-7): 35,9 ± 4% 12) Sham: 0%

Losartan+ A779) observamos o % de HI acima de 90%; nos grupos no qual foi administrado agonistas deste

eixo [AVE, Ang-(1-7, MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)], observamos o % de HI abaixo de 36% e no

grupos controles (PLGA, HβCD e Cirurgia)

, assim como no que recebeu Losartan isoladamente, o % de

i intermediário

107

Gráfico e HI das s em

1) A779 10 .078 µ

7) Lo .565 µ

2) Mas

-/-

: 9.370 ± 3.952 µ

8) Losartan + A779 : 16.324 ± 4.792 µ

3) AVE 0991: 24.508 ± 2.626 µ

9) PLGA: 22.807 ± 6.583 µ

4) A

5) MBI-Ang-(1-7): 19.598 ±

11) Cirurgia: 15.025 ± 1.972

6) HP

Com

de HI

comparadas ao grupo Sham.

26: Área d Artérias Lesada µ

.669 ±2

sartan: 28.385 ± 14

ng-(1-7): 8.833 ± 2.766 µ

10) HPβCD: 12.561 ± 3.653 µ

2.827 µ µ

βCD-Ang(1-7): 19.519 ± 2.566 µ

12) Sham: 0 µ

o mostrado no gráfico 26, t

odas as artérias lesadas apresentaram aumento da área

10000

15000

20000

25000

30000

35000

5000

40000

A 779 Mas

- HPβ βCD ia Sham

-7) An

AVE A -(1-7) MBI

Ang-(1

ng CD- Losarta sartan PLGA H

g-(1-7) + A 779

n Lo Cirurg

108

Tab

Les

Grupo Artéria Controle Artéria Lesada p

A779

10.669 ±2.078

0,0037

ela 13: Comparação das Médias das Áreas de HI das Artérias Controles e das Artérias

adas em µ .

Mas

-/-

0 9.370 ± 3.952 0,04

AVE 0991

24.508 ± 2.626;

<0,0001

Ang-(1-7)

8.833 ± 2.766;

0,04

MBI-Ang-(1-7):

19.598 ± 2.827

0,004

HPβCD-Ang(1-7):

19.519 ± 2.566

0,004

Losartan

28.385 ± 14.565

0,001

Losartan + A779

16.324 ± 4.792

0,03

PLGA

22.807 ± 6.583;

0,002

HPβCD

12.561 ± 3.653

0,01

Cirurgia

15.025 ± 1.972

0,006

Sham

1,0

Como mostrado na tabela 13, com exceção do grupo Sham, todas as a.rtérias lesadas

apresentaram HI comparadas com as artérias controles.

109

Comparação entre as áreas de HI das Artérias Lesadas (ANOVA)

AVE vs Ang-(1-7) p=0,03

Ang-(1-7) vs HPβCD-Ang-(1-7) p=0,01

110

Gráfico 27: Médias das Áreas dos Vasos das Artérias Controles em µ .

2 2

-/- 2 2

2 2

Ang-(1-7): 26.735 ± 16.597 µ

10) HPβCD: 26.680 ± 14.239 µ

5) MBI-Ang-(1-7): 29.401 ± 2.124 µ

11) Cirurgia: 29.192 ± 8.972 µ

1) A779: 32.029 ± 11.634 µ 7) Losartan: 30.613 ± 10.543 µ

2) Mas : 29.919 ± 5399 µ 8) A779 + Losartan: 34.342 ± 2.158 µ

3) AVE 0991: 46.862 ± 10.846 µ 9) PLGA: 33.960 ± 19.016 µ

6) HPβCD-Ang(1-7): 43.345 ± 18.781 µ

12) Sham: 32.578 ± 9335 µ

Como mostrado no gráfico 27, não o servamos diferenças significativas entre as áreas das

artérias controles.

10000

20000

30000

40000

50000

60000

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

111

Gráf édias das das A em µ

1) .363 ± 7.5

artan: 50.36 73 µ

2) Mas

-/-

: 13.951 ± 4.765 µ

8) A779 + Losartan: 21.322 ± 5.242µ

) Ang-(1-7): 52.541 ± 16.360 µ

10)

HPβCD: 27.173 ± 16.058 µ

MBI-Ang-(1-7): 70.253 ± 9.924 µ

11) Cirurgia: 26.916 ± 13.288 µ

enores do que as áreas dos grupos

ráf édias das das A em µ

1) .363 ± 7.5

artan: 50.36 73 µ

2) Mas

-/-

: 13.951 ± 4.765 µ

8) A779 + Losartan: 21.322 ± 5.242µ

) Ang-(1-7): 52.541 ± 16.360 µ

10)

HPβCD: 27.173 ± 16.058 µ

MBI-Ang-(1-7): 70.253 ± 9.924 µ

11) Cirurgia: 26.916 ± 13.288 µ

enores do que as áreas dos grupos

ico 28: Mico 28: M áreas dos Vasos áreas dos Vasos rtérias Lesadas rtérias Lesadas

A779: 19A779: 19 10 µ 10 µ 7) Los7) Los 6 ± 24.86 ± 24.8

AVE 0991: 87.966 ± 10.936 µAVE 0991: 87.966 ± 10.936 µ

9) PLGA: 43.600 ± 21.844 µ9) PLGA: 43.600 ± 21.844 µ

5)5)

6) HPβCD-Ang(1-7): 69.793 ±19.127 µ

12) Sham: 38.909 ±13.865 µ

Como mostrado no gráfico 28, as áreas dos vasos das artérias lesadas e tratadas com

agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas [AVE, Ang-(1-7), MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)] e

Losartan são maiores do que as áreas dos vasos dos grupos controles (PLGA, HβCD

Cirurgia e Sham). Já as áreas dos vasos das artérias lesadas e tratadas com antagonistas

deste eixo (A779 e Mas

-/-

e Losartan + A779), são m

controles.

6) HPβCD-Ang(1-7): 69.793 ±19.127 µ

12) Sham: 38.909 ±13.865 µ

Como mostrado no gráfico 28, as áreas dos vasos das artérias lesadas e tratadas com

agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas [AVE, Ang-(1-7), MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)] e

Losartan são maiores do que as áreas dos vasos dos grupos controles (PLGA, HβCD

Cirurgia e Sham). Já as áreas dos vasos das artérias lesadas e tratadas com antagonistas

deste eixo (A779 e Mas

-/-

e Losartan + A779), são m

controles.

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

A 779 Mas

BI- HPβC sartan PLGA ia Sham

g-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

µP

AVE Ang-(1-7) M

D- Losartan Lo HβCD Cirurg

112

Tabela 14: Comparação entre as Médias das Áreas dos Vasos das Artérias Controles e

Lesadas em µ

nos diversos grupos.

ria Controle Artéria Lesada p

9 ± 1.634

19.363 ± 7.510

0,05

Grupo Arté

A779 32.02

Mas

-/-

29.919 ± 5399

13.951 ± 4.765

0,02

AVE 0991

46.862 ± 10.846

87.966 ± 10.936

0,017

Ang-(1-7) 26.735 ± 16.597 52.541 ± 16.360 0,05

MBI-Ang-(1-7)

29.401 ± 2.124

70.253 ± 9.924

0,002

HPβCD-Ang(1-7) 43.345 ± 18.781 69.793 ±19.127

0,01

Losartan

30.613 ± 10.543

50.366 ± 24.873

0,045

Losartan + A779

34.342 ± 2.158

21.322 ± 5.242

0,04

PLGA

33.960 ± 19.016

43.600 ± 21.844

0,5

HPβCD

26.680 ± 14.239

27.173 ± 16.058

0,9

Cirurgia

29.192 ± 8.972

26.916 ± 13.288

0,6

Sham

32.578 ± 9335

38.909 ±13.865

0,5

Como mostraado na tabela 14, houve aumento significativo nas áreas dos vasos das

artérias lesadas que receberam agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas [AVE, Ang-(1-7),

MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)] e do grupo que recebeu Losartan e redução

significativa nas áreas dos vasos das artérias lesadas dos grupos que receberam

antagonistas deste eixo (A779, Mas

-/-

e Losartan + A779) , quando comparados com as

áreas dos vasos das artérias controles (contra-laterais) dos respectivos grupos.

113

Comparação entre as Médias das Áreas dos Vasos das Artérias

Controles - ANOVA:

AVE vs MBI-Ang-(1-7), p=0,01

Comparação entre as Médias das Áreas dos Vasos das Artérias

Lesadas - ANOVA:

HPβCD-Ang-(1-7) vs Mas

-/-

, p=0,02

114

Gráfico 29: Média das Áreas dos Lumens das Artérias Controles em µ

.909 µ

2 2

4) Ang-(1-7): 11.090 ± 2.420 µ

10) HPβCD: 18.472 ± 6.295 µ2

5) MBI-Ang-(1-7): 20.289 ± 2.224 µ

11) Cirurgia: 18.284 ± 3.308 µ

1) A779: 25.752 ± 8.562 µ

7) Losartan: 22.434 ± 4.627 µ

2) Mas

-/-

: 21.109 ± 4.948 µ

8) Losartan+A779: 25.957 ± 1

3) AVE 0991: 31.738 ± 5.170 µ 9) PLGA: 21.467 ± 4.861 µ

6) HPβCD-Ang-(1-7): 32.212 ± 8.386 µ

12) Sham: 24.454 ± 4.115 µ

Como mostrado no gráfico 29, não houve nenhum fenômeno homogêneo entre as artérias

controles nos diversos grupos que possa ser conclusivo na comparação deste parâmetro.

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

115

60000

Gráfico 30: Médias das Áreas dos Lumens das Artérias Lesadas em µ

1) 73 ± 5.079

artan: 7.727 ± 2 µ

2) Mas

-/-

: 174 ±101 µ

8) Losartan + A779: 73 ± 73 µ

3) AVE 0991: 47.121 ± 3.959 µ 9) PLGA: 12.908 ± 7.463 µ

4) Ang-(1-7): 33.683 ± 6.551 µ

10) HPβCD: 8.552 ± 6.516 µ

rtérias lesadas e tratadas com agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas

[AVE, Ang-(1-7), MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)] apresentarm aumento significativo nas

áreas dos lúmens comparadas aos grupos controles (PLGA, HβCD, Cirurgia) e aos grupos tratados

com antagonista deste eixo (A779, Mas

-/-

e Losartan+A779). Houve manutenção destas áreas

quando comparadas ao grupo Sham.

A779: 2.0 µ 7) Los 7.56

5) MBI-Ang-(1-7): 34.077 ± 6.904 µ

11) Cirurgia: 4.407 ± 4.111 µ

6) HPβCD-Ang(1-7): 36.015 ±6.779 µ

12) Sham: 31.053 ± 13.297 µ

Como mostrado no gráfico 30, as a

10000

20000

30000

40000

50000

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losarta sartan PLGA HβCD C ia Sham

-(1-7) Ang-(1

n Lo irurg

Ang -7) + A 779

116

Houve redução das áreas dos lumens das artérias lesadas e tratadas com antagonistas do eixo Ang-

Tabela 15: Comparação entre as Médias das Áreas dos Lumens das Artérias Controles e

Grupo Artéria Controle Artéria Lesada p

.562

2.073 ± 5.079

0,001

(1-7)-Mas quando comparadas com as áreas dos lumens dos grupos controles.

das Artérias Lesadas em µ

A779

25.752 ± 8

Mas

-/-

174 ±101

0,002

21.109 ± 4.948

AVE 0991 31.738 ± 5.170 47.121 ± 3.959 0,001

Ang-(1-7) 11.090 ± 2.420 33.683 ± 6.551

0,004

MBI-Ang-(1-7) 20.289 ± 2.224

34.077 ± 6.904

0,04

HPβCD-Ang(1-7) 32.212 ± 8.386

36.015 ±6.779

0,05

Losartan 22.4

34 ± 4.627

7.727 ± 7.562

0,01

Losartan + A779

25.957 ± 1.909

73 ± 73

0,0008

PLGA

21.467 ± 4.861

12.908 ± 7.463

0,046

HPβCD

18.472 ± 6.295

8.552 ± 6.516

0,01

Cirurgia

18.284 ± 3.308

4.407 ± 4.111

0,05

Sham

24.454 ± 4.115

31.053 ± 13.297

0,6

Como mostrado na tabela 15, as áreas dos lumens das artérias lesadas nos grupos tratados com

agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas [AVE, Ang-(1-7), MBI-Ang-(1-7) e HPβCD-Ang-(1-7)] são

maiores, enquanto que as áreas dos lumens das artérias lesadas e tratadas com antagonista do eixo

Ang-(1-7)-Mas (A779, Mas

-/-

e Losartan+A779) e tratadas com controle (PLGA, HPβCD, cirugia e

sham) são menores que as áreas dos lumens das artérias controles. Com a administração do

117

Losartan, também houve redução das áreas dos lumens nas artérias lesadas comparadas com as

áreas dos lumens das artérias controles.

118

ng-(1-7) vs Losartan p=0,05

omparação entre as Médias das Áreas dos Lúmens das Artérias

Lesadas – ANOVA:

AVE vs Losartan p=0,0013

Comparação entre as Médias das Áreas dos Lumens das Artérias

Controles – ANOVA:

119

Gráfico 31: Médias das Áreas das Camadas Musculares das Artérias Controles em µ

1) A779: 6.276 ± 1.305 µ

7) Losartan: 8.179 ± 868 µ

2) Mas

-/-

: 8.809 ± 621 µ

8) Losartan + A779: 8.384 ± 262 µ

3) Ave 0991: 15.124 ± 1.232 µ

9) PLGA: 12.493 ± 4.115 µ

4) Ang-(1-7): 15.645 ± 6.527 µ

10) HPβCD: 8.207 ± 530 µ

5) MBI-Ang-(1-7): 9.111 ± 837 µ

11) Cirurgia: 10.907 ± 1.908 µ

6) HPβCD_Ang-(1-7): 11.133 ± 1.015 µ

12) Sham: 8.124 ± 865 µ

2500

5000

7500

10000

12500

15000

17500

20000

22500

25000

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

120

12) Sham: 7.856

-Mas

35000

Gráfico 32: Médias das Áreas das Camadas Musculares das Artérias Lesadas em µ

1) A779: 6.619± 1.147 µ

7) Losartan: 20.727 ±10.333 µ

2) Mas

-/-

: 4.406 ± 810 µ

8) Losartan + A779: 4.998 ± 509 µ

3) Ave 0991: 16.336 ± 1.781µ

9) PLGA: 7.884 ± 2.201 µ

4) Ang-(1-7): 10.025 ± 1.908 µ

10) HPβCD: 7.849 ± 1.235 µ

5) MBI-Ang-(1-7): 16.576 ± 3.313 µ

11) Cirurgia: 7.482 ± 1.060 µ

6) HPβCD_Ang-(1-7): 14.258 ± 1.905 µ ± 723 µ

Como mostrado no gráfico32, nos grupos tratados com agonistas do eixo Ang-(1-7)

(AVE, Ang-(1-7), MBI-Ang-(1-7) e MBI-Ang-(1-7) e Losartan isoladamente, observam

5000

10000

15000

20000

25000

30000

A 779 Mas

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

121

uma maior área da média nas artérias lesadas quando comparadas com os grupos controles

e com os grupos tratados com antagonistas deste eixo (A779, Mas

-/-

e Losartan+A779).

Tabela 16: Comparação entre as Médias das Áreas das Camadas Musculares das Artérias

Controles e das Artérias Lesadas em µ

Grupo Artéria Controle Artéria Lesada p

A779 6.276 ± 1.305 6.619 ± 1.147 1,0

Mas

-/-

8.809 ± 621 4.406 ± 810 0,05

AVE 0991 15.124 ± 1.232 16.336 ± 1.781 0,6

Ang-(1-7) 15.645 ± 6.527 10.025 ± 1.908 0,3

MBI-Ang-(1-7) 9.111 ± 837 16.576 ± 3.313 0,06

HPβCD-Ang(1-7) 11.133 ± 1.015 14.258 ± 1.905 0,1

Losartan 8.179 ± 868 20.727 ± 10.333 0,005

Losartan + A779 8.384 ± 262 4.998 ±

509 0,009

PLGA

12.493 ± 4.115

7.884 ± 2.201

0,46

HPβCD

8.207 ± 530

7.849 ± 1.235

0,7

Cirurgia

10.907 ± 653

7.482 ± 1.060

0,5

Sham

8.124 ± 865

7.856 ± 723

0,7

Como mostrado na tabela 16, não observamos nenhum fenômeno homogêneo entre as

artérias lesadas e seus controles nos diversos grupos, que possa ser conclusivo na

comparação destes parâmetros.

122

Comparação entre as Médias das Áreas das Camadas Muscular

das Artérias Controles – ANOVA:

AVE vs Losartan, p=0,01

AVE vs MBI- Ang(1-7), p=0,003

Losartan vs HPβCD-Ang(1-7), p=0,03

das Artérias Lesadas – ANOVA:

AVE vs Ang-(1-7) p=0,01

Comparação entre as Médias das Áreas das Camadas Musculares

123

1) A779: 2,1 ± 1,7 7) Losartan: 1,5 ± 0,4

2) Mas

Gráfico 33: Relação da HI / Média das Artérias Lesadas.

9) PLGA: 4,6 ± 5,4

5) MBI-Ang-(1-7): 1,2 ± 0,3 11) Cirurgia: 2,0 ±0,1

6) HPβCD-Ang-(1-7): 1,3 ± 0,05 12) Sham: 0

comparação destes parâmetros.

-/-

: 1,9 ± 0,9 8) Losartan + A779: 3,1 ± 1,4

3) AVE: 1,7 ± 1,1

4) Ang-(1-7): 1,0 ± 0,3 10) HPβCD: 1,8 ± 1,2

Como mostrado no gráfico 33, não observamos nenhum fenômeno homogêneo entre as

artérias lesadas e seus controles nos diversos grupos, que possa ser conclusivo na

A 779 Mas

Ang-(1-7) Ang-(1-7) + A 779

AVE Ang-(1-7) MBI- HPβCD- Losartan Losartan PLGA HβCD Cirurgia Sham

124

Comparação entre a Relação da HI / Média das Artérias Lesadas –

ANOVA:

AVE vs HPβCD-Ang-(1-7): p=0,03

Ang-(1-7) vs HPβCD

-Ang-(1-7): p=0,05

125

Discussão

126

VI. Discussão

O trauma induzido pela introdução e passagem sucessiva, por três vezes, do fio guia de

angioplastia 0,010” na luz da artéria femoral esquerda proporcionou uma formação

abundante de HI. As áreas e o percentual de HI foram significativamente maiores em todas

as artérias lesadas (femoral esquerda) quando comparadas às artérias controles contra-

laterais (femoral direita) em todos os grupos, exceto no grupo Sham, onde a artéria femoral

esquerda foi dissecada, isolada mas não foi feito o desnudamento endotelial (gráfico 25,

página 101 e tabela 13, página 103). Reproduzimos os resultados apresentados

anteriormente em estudo que validou este método .

Os achados do nosso estudo demonstram que o eixo Ang-(1-7)-Mas é relevante na

manutenção do lúmen da artéria femoral após a lesão arterial induzida pelo desnudamento

endotelial.

Nos grupos onde o eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado após o desnudamento arterial, A779

e Mas , as áreas de HI das artérias femorais lesadas foram 10.669 ± 2.078 µ e 9.370 ±

3.952 µ respectivamente (tabela 1, página 54 e tabela 2, página 58). No grupo tratado com

o agonista do receptor Mas, Ang-(1-7) isoladamente, a área de HI da artéria femoral lesada

foi de 8.833 ± 2.766 µ , (tabela 4, página 66) sem diferença entre este grupo e os dois

descritos acima quando o eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado. Já as áreas de HI das artérias

femorais lesadas nos demais grupos também tratados com agonistas do eixo

Ang-(1-7)-Mas, como o AVE 0991, a Ang-(1-7) veiculada por MBI e a Ang-(1-7)

associada ao polímero HPβCD [HPβCD-Ang(1-7)], foram respectivamente:

-/- 2

127

24.508 ± 2.626 µ

no AVE, 19.598 ± 2.827 µ

no MBI-Ang-(1-7) e 19.519 ± 2.566 µ

peito

do eixo

21 ±

HPβCD-Ang(1-7), ou seja significativamente maiores que as áreas de HI nos grupos onde o

eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado (tratados com A779 e Mas

-/-

), (gráfico 26, página 102).

Nos grupos controles, as áreas de HI nas artérias lesadas foram as seguintes: PLGA 22.80

± 6.583 µ

; HPβCD: 12.561 ± 3.653 µ

; Cirurgia 15.025 ± 1.972 µ

e Sham: 0 µ

Além deste achado, encontramos uma grande diferença entre os grupos, no que diz res

à área luminal das artérias lesadas, que fisiologicamente é o que importa, pois a

manutenção do fluxo sanguíneo tecidual para suprir a demanda metabólica se dá pelo

lúmen. A área luminal nas artérias lesadas dos grupos tratados com os antagonistas

Ang-(1-7)-Mas

-/-

, foi de 2.073 ± 5.079 µ

no grupo tratado com A779 e de 174 ±101 µ

Mas

-/-

, o que foi significativamente menor quando comparado às áreas dos lúmens das

artérias lesadas dos grupos tratados com agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas: AVE: 47.1

3.959 µ

, Ang-(1-7): 33.683 ± 6.551 µ

, MBI-Ang-(1-7): 34.077 ± 6.904 µ

e HPβCD-

Ang(1-7): 36.015 ±6.779 µ

. (Gráfico 30, página 110).

Como explicar este paradoxo existente entre uma área de HI significativamente maior nas

artérias lesadas dos grupos tratados com agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas e uma área

significativamente menor de HI nas artérias lesadas nos grupos tratados com antagonista

deste eixo, sendo que as áreas luminais das artérias lesadas deste último grupo d

antagonista do eixo Ang-(1-7)-Mas são significativamente menores?

128

Se analisarmos os dados obtidos nas áreas dos vasos tratados com agonistas do eixo Ang-

(1-7)-Mas e compará-los aos dados encontrados nos vasos controles contra-laterais

(femoral direita), encontraremos um dado interessante que pode explicar este achado.

Veremos que houve um aumento do tamanho da área dos vasos lesados comparado aos

vasos contra-laterais (vasos controles dos mesmos grupos) nos grupos tratados com

agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas, quando comparados com os grupos tratados com os

4.520 µ

, p=0,02.

antagonistas deste eixo e seus controles contra-laterais. Assim, temos as seguintes

diferenças das áreas dos vasos controles para os vasos lesados:

AVE: de 46.862 ± 10.846 µ

para 87.966 ± 10.936 µ

, aumento de 41.104 µ

, p=0,017;

Ang-(1-7): de 26.735 ± 16.597 µ

para 52.541 ± 16.360 µ

, aumento de 25.806 µ

, p=0,05;

MBI-Ang-(1-7): de 29.401 ± 2.124 µ

para 70.253 ± 9.924 µ

, aumento de 40.852 µ

p=0,002; HPßCD-Ang-(1-7): de 43.345 ± 18.781 µ

para 69.793 ±19.127 µ

, aumento d

26.448 µ

, p=0,01 (tabela 14, página 107).

Portanto houve um aumento significativo nas áreas dos vasos lesados comparado aos vasos

controles nestes grupos tratados com agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas.

Por outro lado, são as seguintes as alterações nos grupos no qual o eixo Ang-(1-7)-Mas é

bloqueado:

A779: de 32.029 ± 11.634 µ

para 19.363 ± 7.510 µ

, redução de 22.666 µ

, p=0,05

Mas

-/-

: de 29.919 ± 5399 µ

para 13.951 ± 4.765 µ

, redução de 2

Desta forma, houve uma redução na área do vaso lesado comparado ao vaso controle

(contra-lateral) nestes grupos onde o eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado (tabela 14, pági

107). Este fenômeno, alteração do tamanho do vaso, conhecido como remodelamento

vascular, foi descrito por Glagov em 1987

e expressa a alteração que a vasculatura pode

apresentar como resposta à agressão. Inicialmente este mecanismo foi identificado na

129

aterosclerose e representa uma resposta hemodinâmica ao processo bioquímico sofrido pela

artéria, no qual ela aumenta de tamanho - remodelamento positivo - para acomodar a placa

aterosclerótica que se instala, sem comprometer a área luminal, até que cerca de 40% d

área do vaso seja acometido pela placa aterosclerótica. A partir daí, por mecanismo não

muito bem esclarecido, há uma perda desta capacidade adaptativa de aumento de tamanho

do vaso ao crescente aumento da placa aterosclerótica e

o vaso passa então a sofrer uma

dução de sua área – remodelamento negativo – comprometendo a partir de então, a área

tem-se

ém é

l de HI das artérias lesadas nos grupos tratados com

ratados com agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas, como: 34,5 ±

10,8 % no AVE, 21 ± 5% na Ang-(1-7) isoladadmente, 32,2 ± 2,5% na MBI-Ang-(1-7) e

35,9 ± 4% no HPβCD-Ang(1-7) (Gráfico 25, página 101).

do lúmen

Embora a descrição deste fenômeno tenha ocorrido no processo de aterosclerose,

observado que o mesmo fenômeno de remodelamento vascular pode também ocorrer em

várias condições fisiopatológicas no qual o vaso é submetido a outros tipos de stresse. Por

exemplo, nas arteriopatias relacionadas aos transplantes, as artérias coronárias apresentam

um aumento compensatório no comprimento do raio do vaso que preserva o diâmetro da

luz do vaso a despeito de um significativo aumento da espessura da parede do vaso

Além disto, modelos experimentais de aterosclerose primária e angioplastia, em

camundongos, também mostraram aumento do raio do vaso mantendo desta forma o raio do

lúmen

. Portanto, o fenômeno descrito por Glagov de remodelamento vascular tamb

observado na lesão vascular e na re-estenose.

Se observarmos o percentua

antagonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas, ela foi de 89,7 ± 10 % no A779 e

97,6 ± 1.8 % no Mas

-/-

, o que é significativamente maior quando comparadas com o

percentual de HI dos grupos t

130

Embora no grupo tratado com Ang-(1-7)

quantitativamente, a área de HI tenha sido sem lhante aos grupos onde o eixo Ang-(1-7)-

Mas foi bloqueado, o percentual de HI do grupo tratado com a Ang-(1-7) foi

significativamente menor: 21 ± 5%, quando comparado com o A779, que foi de 89,7 ± 10

% no e com o Mas

-/-

, que foi de 97,6 ± 1.8 %. Mais uma vez, o percentual de HI representa

a área do vaso ocupado pela HI, portanto, definindo de uma forma mais precisa a relação

entre estes dois parâmetros: área de HI e vaso, que em última instância vai expressar uma

área luminal maior para atender o fluxo sanguíneo e, por conseguinte, a uma demanda

metabólica tecidual.

O nosso estudo foi desenhado para avaliar a resposta vascular às diversas formulações que

atuam como agonistas ou antagonistas no eixo Ang-(1-7)-Mas e receptor AT

após o

estresse induzido pelo desnudamento ndo-se o fenômeno encontrado em

nosso estudo com o descrito por Glagov, observamos que o remodelamento positivo foi

encontrado nos grupos onde o percentual de HI foi de 34,5 ± 10,8 % no AVE, 21 ± 5% na

Ang-(1-7) isoladadmente, 32,2 ± 2,5% na MBI-Ang-(1-7), 35,9 ± 4% na HPβCD-Ang(1-

7), o que é similar aos resultados demonstrados por Glagov na aterosclerose, onde o

remodelamento positivo ocorre até que cerca de 40% da área do vaso seja ocupado pela

placa aterosclerótica, a partir de então começa haver o remodelamento negativo.

Interessantemente no nosso estudo, no bloqueio do AT

com o Losartan, o percentual de HI

foi de 62,2 ± 13,5%, o que vai além do que foi achado por Glagov. Mas quando associamos

o antagonista do receptor Mas, A779, ao bloqueio do receptor AT

com o Losartan, estes

vasos passaram apresentar um remodelamento negativo com percentual de HI muito alto,

99,17 ± 0,8 %, sugerindo que de alguma forma haja uma interação entre o eixo Ang-(1-7)-

Mas e receptor AT

na resposta a este fenômeno. Estudos posteriores serão necessários para

arterial. Compara

131

esclarecer mais detalhadamente a interação entre estes dois receptores na resposta a este

tipo de estresse.

É interessante também observar que nos grupos controles, os percentuais de HI foram:

PLGA 66,4 ± 12.8%, HPβCD: 71 ± 15% e Cirurgia: 75 ± 11% e não apresentaram

remodelamento positivo ou negativo, quando comparado com as artérias contra-laterais do

mesmo grupo (tabela 14, página 107), diferentemente do que foi achado por Glagov. Talvez

a artéria do camundongo apresente uma susceptibilidade diferente da artéria humana a este

tipo de estresse no que se refere ao remodelamento vascular, tolerando uma maior ocupação

da área do vaso pela HI sem sofrer redução no seu tamanho, principalmente quando não é

administrado drogas que atuem no SRA, pois quando o bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas foi

feito, encontramos uma redução do vaso de 40% de sua área no grupo tratado com A779 e

de 54% no grupo Mas

-/-

, com percentuais de HI de 89,7 ± 10 % e 97,6 ± 1.8 %

respectivamente.

Os resultados obtidos por Freeman e colaboradores

em 1996 já sugeriam que a Ang-(1-7)

apresentava efeitos opostos à Ang II na regulação do crescimento de células musculares

lisas em cultura isolada de aorta de ratos. A Ang-(1-7) atenuou a incorporação de timidina

[ H] em contraste com a Ang II que estimulou a sua incorporação. A Ang II também

aumentou o número total de células, sugerindo que o aumento da incorporação da timidina

[

H] estava associado com a proliferação de células musculares lisas. O antagonista AT

Ang II, losartan, reduziu a incorporação de timidina pela Ang II, o que não ocorreu quando

o antagonista AT

da Ang II foi administrado. Portanto, estes resultados sugeriam que a

Ang-(1-7) e a Ang II apresentavam efeitos opostos na regulação do crescimento de células

musculares lisas e suspeitou-se então, que a inibição da proliferação destas células pela

Ang-(1-7) parecia estar mediada por um novo receptor de angiotensina que não era inibido

132

pelos antagonistas dos receptores AT

e/ou AT

da Ang II. Sabe-se que a hiperplasia

timal ocorre devido à proliferação e migração de célus musculares lisas. Strawn e

colaboradores

também demonstraram em 1999 que a Ang-(1-7) reduzia o crecimento de

usculares lisas após a lesão de carótida de ratos por balão, devido à redução da

ntese de DNA tanto da íntima quanto da média destes vasos lesados. No nosso trabalho,

mbora a área de hiperplasia intimal, em valores absolutos, dos grupos no quais os

gonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas foram administrados tenha sido maior que dos grupos

onde este eixo foi bloqueado (gráfico 26, página 102), o percentual de hiperplasia intimal

enor com a administração dos agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas (gráfico 25, página

01), pois houve um remodelamento vascular positivo nas artérias em que foram feitos o

esnudamento arterial, demonstrando, portanto, um efeito benéfico dos agonistas do eixo

Ang-(1-7)-Mas na preservação funcional da luz arterial (gráfico 30, página 110); por sua

vez, nos trabalhos de Freeman e Strawn , não foram abordados o remodelamento

vascular das artérias, se positivo ou negativo ou mesmo se não houve.

Bas Langeveld e colaboradores

observaram uma redução da hiperplasia intimal em ratos

que tiveram stents implantados em aorta abdominal com a Ang-(1-7). Assim como no

nosso trabalho, foi observada uma diferença significativa do percentual de estenose

(% HI), do grupo controle comparado ao grupo que recebeu Ang-(1-7), de 14 ± 1,3 para

10,4 ± 1 (p=0,05). Porém, no trabalho de Bas Langeveld, o peptídeo foi administrado por

micro bomba osmótica na dose de 24 µg/Kg/h por 28 dias, portanto uma dose bem superior

a que nos administramos que foi de 100 µg/Kg/dia. Embora tenhamos obtido, no nosso

trabalho como no trabalho de Bas Langeveld e colaboradores

, esta redução de % de HI

com agonistas da Ang-(1-7) comparado ao grupo controle, e também no nosso trabalho,

comparado aos grupos onde o eixo Ang-(1-7)-Mas foi bloqueado: A779 e Mas

-/-

, é difícil

células m

sí

foi m

86 84

133

uma comparação entre os dois estudos, pois o implante de stent impede uma análise do

remodelamento vascu

Sampaio e colaboradores

demonstraram que nas células endoteliais humanas a Ang-(1-7)

contra-regula a sinalização celular da Ang II/AngII receptor tipo 1 ativado pela c-Src e seus

alvos na P-2-c-Src

está aum

mecanismo

Sampaio e c s

endoteli

mediado a a

Ang-(1-7) r 95 e 3) a via fosfato de

inositol 3 K

Ang-(1-7) e na liberação de óxido nítrico, sugerindo que a Ang-(1-7) regula a função

endoteli

nítrico atrav

Ang-(1-7)-M

preservação

do eixo Ang

Um outro a

administraç

semelhante ivo,

traduzindo ptídeo

administrad HPβCD ou liberado

através da MBI ou através do agonista não peptídico AVE, os resultados foram

lar.

cascata, a ERK1/2 e NAD(P)H oxidase e que também a interação SH

entada pela Ang-(1-7), mostrando que este fenômeno pode representar o

protetor pela Ang-(1-7) que contra-regula os efeitos deletérios da Ang II.

olaboradores demonstraram também em outro estudo

que 1) as célula

ais humanas possuem um receptor acoplado à proteína G, Mas, através do qual é

tivação da óxido nítrico sintase dependente do endotélio (eNOS), 2) a

egula diferencialmente a fosforilação da Ser1177 e Thr4

/Akt (PI3K/Akt) tem um papel importante na ativação da eNOS mediada pela

al através do receptor Mas que estimula a atividade da eNOS e a produção de óxido

és das vias dependentes da Akt. Estes dados enfatizam a importância do eixo

as como um regulador da função endotelial e podem talvez explicar a

do lúmen com o baixo percentual de HI quando na administração dos agonistas

-(1-7)-Mas quando foi feito o desnudamento endotelial em nosso trabalho.

chado muito interessante neste trabalho foi que as várias formas de

ão dos agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas comportaram-se de maneira

, ou seja, preservando o lúmen através de um remodelamento vascular posit

num menor percentual de HI. Seja o eixo Ang-(1-7)-Mas ativado pelo pe

o por via oral isoladamente ou associado ao polímero

134

semelha iferentes

formas em q r

VO, 100 µg/Kg/dia, tenha sido alta o suficiente para mitigar a possível degradação que este

peptídeo a

em que o eixo Ang-(1-7)-Mas foi ativado, houve um padrão de resposta semelhante

(gráfico

Outra obser po onde o

receptor AT do pelo losartan. Neste grupo, também houve um

remode

este aument ,

aumento de ±

14.565 µ

, ( s

lesadas. E m ão

se traduziu

deste grupo e

22.434 ± 4. bela

15, pági ,

valor interm os grupos tratados com agonistas e antagonistas do eixo

Ang-(1-

Um outro a II

com o uso d

grupo houv 21.322 ± 5.242

, p= 0,04 (tabela 14, página 107) diferentemente do grupo onde somente o receptor AT

da Ang II foi bloqueado com o losartan, portanto levando a um remodelamento negativo.

ntes, demonstrando a eficácia dos agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas nas d

ue foi veiculado. Talvez a dose do peptídeo quando administrado isolado po

possa sofrer pelo trato gastro-intestinal. O fato é que independentemente da form

28, página 106).

vação muito interessante foram os resultados que encontramos no gru

de Ang II foi bloquea

lamento positivo do vaso lesado comparado ao vaso controle contra-lateral, sendo

o da área do vaso significativo (de 30.613 ± 10.543 µ

para 50.366 ± 24.873 µ

19.573 µ

, p=0,045 (tabela 14, página 107). Porém a área de HI foi de 28.385

tabela 13, página 103) configurando a maior área de HI de todas as artéria

ais importante ainda, foi que o remodelamento positivo nas artérias lesadas n

em benefício concomitante na manutenção da área do lúmen nos vasos lesados

, visto que a área de HI foi tamanha que comprometeu a área do lúmen d

627 µ

para 7.727 ± 7.562 µ

, com uma redução de 14.707 µ

, p=0,01 (ta

na 111). O percentual de HI nas artérias lesadas deste grupo foi de 62,2 ± 13,5%

ediário entre

7)-Mas e dos grupos controles (gráfico 25, página 101).

chado importante foi quando associamos o bloqueio do receptor AT

da Ang

e losartan, ao bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas com adição de A779. Neste

e uma redução no tamanho do vaso, de 34.342 ± 2.158 µ

para

135

Podemo

a um bloqu g

II, demonst ez, a presença do eixo Ang-(1-7)-Mas na resposta

vascula l,

que provave ular

através de u

A agressão

inicial que o

culminando portante

da luz arter nsão

arterial, seja pela injúria vascular no caso da angioplastia. Acreditamos, portanto, que este

estudo, o,

pode abrir p

proteção da

SRA, onde

também na

Ang-(1-7)-M os,

preservando

Seja por

mostraram- o

o remodelam

s, por conseguinte inferir, que o bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Mas pelo A779 levou

eio do remodelamento positivo induzido pelo bloqueio do receptor AT

da An

rando assim, mais uma v

r ao desnudamento endotelial e demonstrando ainda, neste modelo experimenta

lmente o bloqueio do receptor AT

da Ang II atue no remodelamento vasc

m “cross-talk” com o eixo Ang-(1-7)-Mas.

ao endotélio vascular pelo estresse de cisalhamento é uma alteração anatômica

corre na artéria e que desencadeia todo um processo fisiopatológico

com uma resposta vascular, podendo levar a um comprometimento im

ial, seja pelo espessamento da camada média da artéria, no caso da hiperte

consubstanciado por diversos achados recentes da literatura e citados neste trabalh

erspectivas para aplicação terapêutica de agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas na

vasculatura. Em situações clínicas, principalmente quando no desbalanço do

há uma exarcebação deletéria da Ang II como no caso de hipertensão arterial e

agressão ao endotélio, como no caso de angioplastia, agonistas do eixo

as poderiam atuar de forma a manter as características funcionais dos vas

a luz arterial.

via oral ou outras formas de administração, os agonistas do eixo Ang-(1-7)-Mas

se eficaz em manter a luz arterial neste modelo de trauma vascular, promovend

ento positivo.

136

Conclusão

137

VII. Conclusão

O eixo Ang

induzida pe

remodelame

A Ang-(1-7 ntando

diferença qu

adminis

Mas.

O bloqueio m

sem preserv

Ang II com s pelo A779, não só impediu o

remode

bloqueio do ” com

o eixo Ang-

-(1-7)-Mas tem um papel importante na preservação da luz quando na lesão

lo desnudamento arterial, atenuando a carga de HI e promovendo o

nto positivo do vaso.

) demonstrou ser eficaz quando administrada por via oral, não aprese

anto à sua eficácia quando comparado à associação com HPβCD ou quando

trada por MBI ou quando comparado ao agonista não peptídico do eixo Ang-(1-7)-

do receptor AT

da Ang II promoveu o remodelamento positivo do vaso, poré

ar concomitantemente o lúmen. A associação do bloqueio do receptor AT

o bloqueio do eixo Ang-(1-7)-Ma

lamento positivo do vaso como manteve uma carga de HI elevada, sugerindo que o

receptor AT

atue no remodelamento vascular através de um “cross-talk

(1-7)-Mas.

138

Referências Bibliográficas

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