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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto para obtenção
do Título de Mestre em Ciências, área de
concentração em Bioquímica
Atividade da Fosfolipase A
2
Secretada Humana do Grupo IID
(hsPLA
2
-IID) contra Membranas
Artificiais e Biológicas
Raquel Gomes Fonseca
Ribeirão Preto - 2008
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ii
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Atividade da Fosfolipase A
2
Secretada Humana
do Grupo IID (hsPLA
2
-IID) contra Membranas
Artificiais e Biológicas
Raquel Gomes Fonseca
Ribeirão Preto - 2008
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iii
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Atividade da Fosfolipase A
2
Secretada Humana
do Grupo IID (hsPLA
2
-IID) contra Membranas
Artificiais e Biológicas
Raquel Gomes Fonseca
Orientador: Prof. Dr. Richard John Ward
Ribeirão Preto - 2008
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto para obtenção
doTítulo de Mestre em Ciências, área de
concentração em Bioquímica
iv
A Deus.
“Mas Jesus foi, pegou-a pela mão e disse bem alto:
-Menina levante-se!
E ela tornou a viver.”
(Luc 8:54)
v
A minha família, Sandra (mamãe), Geraldo (papai) e Júlia (mana)
pelo apoio, confiança, dedicação e amor incondicional.
Não há palavras que expressem claramente toda
minha gratidão por ter vocês ao meu lado.
Ao meu querido Ivan, pelo amor, carinho e companheirismo,
compartilhando as alegrias e apoiando-me
nos momentos difíceis.
vi
.
As minhas amigas, Elisângela e Tatiana pela amizade, dedicação intensa
junto a mim ao construir este trabalho, pelos ensinamentos
e consolo nos momentos de desespero.
Valeu muito pela força, meninas.
Obrigada sempre.
As amigas, Leila, Renata e Vivian pelo carinho, companheirismo,
diversão, alegrias e lembranças de momentos
maravilhosos que passamos juntas.
Aos “irmãos”, Gilvan, Lucas, Liliane e Cristiana por terem me
direcionado na batalha pela fé e pela
assistência incondicional.
Ao Roberto, pelo apoio indispensável no desenvolvimento deste
trabalho, pela direção e orientação constante.
A minha grande amiga Lucimara Benine, e aos amigos, o Prof. Dr. Ricardo
Benine e Guilherme Lopes que acreditaram em minha
capacidade e sempre me incentivaram.
vii
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Richard John Ward do Depto. de Química da FFCLRP – USP,
pela oportunidade, dedicação e amizade no desenvolvimento deste trabalho, o meu
eterno muito obrigada.
À FAPESP, CAPES e FAEPA pelo apoio financeiro;
Aos Profs, Dr. Cláudio Miguel da Costa Neto do Depto. de Bioquímica da
FMRP - USP, e Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes do Depto. de Fisica e Biofísica
da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, pela participação na
avaliação de minha Dissertação.
Ao Prof. Dr. Pietro Ciancaglini do Depto. de Química da FFCLRP pela
utilização de seu laboratório, e por sua imensa simpatia e atenção.
Ao Prof. Dr. José Roberto Giglio do Depto de Bioquímica e Imunologia da
FMRP, Prof. Dr Fernando Luiz De Lucca do Depto. de Bioquímica e Imunologia da
FMRP, e Prof. Dr Renê de Oliveira Beleboni do Depto de Biotecnologia da UNAERP
pela atenção em meu exame de qualificação.
Ao Prof. Dr. Roy Eduard Larson do Depto. de Biologia Celular e Bioagentes
Patogênicos da FMRP - USP pela utilização de seu laboratório e em algumas atapas
do desenvolvimento do projeto e pela atenção durante a disciplina de Biologia
Celular.
Ao Prof. Dr. Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira do Depto. de Química da
FFCLRP pela participação crítica e conhecimentos no desenvolvimento do projeto.
A técnica Tânia Paula Aquino Defina do Depto. de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos da FMRP – USP, pela ajuda com o
seqüenciamento das amostras de DNA.
Aos técnicos Pita, Silvia, Ivana Aparecida Borin e Milton Rosa Alves pela
amizade e auxílio nos experimentos do projeto.
viii
Às secretárias Ivone e Lucia do Depto. de Bioquímica e Imunologia da FMRP
pela ajuda e eficiência em todos os momentos.
A todos os funcionários do Depto. de Química da FFCLRP-USP, e os
secretários Lâmia, Bel, Maria, André e Emerson pela atenção nos assuntos
burocráticos.
Aos amigos de laboratório Lica, Taty, Carlinha, Leiloca, Paty, Lelis, Plínio, Jú,
Gisele, João, dupla Lucas e Gilvan, obrigado pela companhia, diversão e
aprendizado. Obrigada Manu (da Taty) pela paciência ao me ajudar com a
formatação da Tese.
A todos os professores, funcionários e amigos do Depto. de Bioquímica e
Imunologia da FMRP.
A todos os professores, funcionários e amigos do Departamento de Química
da FFCLRP.
Finalmente, muito obrigada àqueles que possibilitaram o desenvolvimento
deste trabalho.
ix
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................1
2. OBJETIVOS..................................................................................................................... 14
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................ 15
3.1. Subclonagem do Gene de hsPLA
2
-IID em vetor pET-3a......................................... 15
3.1.1. Vetores pET....................................................................................................... 16
3.2. Mutagênese Sítio-Dirigida ....................................................................................... 16
3.2.1. Etapa I da reação de PCR: síntese do fragmento mutante..............................18
3.2.2. Etapa II da reação de PCR: extensão do fragmento mutado...........................19
3.2.3. Etapa III da reação de PCR: amplificação do gene.......................................... 19
3.2.4. Oligonucleotídeos de subclonagem................................................................. 20
3.2.5. Oligonucleotídeos mutagênicos....................................................................... 20
3.3. Digestão Enzimática e Ligação do Gene de hsPLA
2
-IID Selvagem e mutantes ao
vetor pET-3a...................................................................................................................21
3.4. Transdormação em Escherichia coli DH5
Ca
2+
Competente................................ 22
3.5. Extração e Purificação do DNA Plasmidial.............................................................24
3.6. Seqüenciamento Automático .................................................................................. 25
3.7. Expressão em Escherichia coli BL21[DE3]pLysS .................................................. 27
3.7.1. Preparação de E. coli BL21[DE3]pLysS competente....................................... 27
3.7.2. Transformação para expressão dos vetores em Escherichia coli
BL21[DE3]pLysS.............................................................................................................28
3.7.3. Teste de expressão em pequena escala .......................................................... 28
3.7.4. Escalonamento da expressão do vetor recombinante em Escherichia coli
BL21[DE3]pLysS.............................................................................................................29
3.8. Purificação de hsPLA
2
-IID Recombinante Tipo Selvagem e Mutantes..................29
3.8.1. Isolamento dos corpos de inclusão.................................................................30
3.8.2. Modificação química e enovelamento das proteínas recombinantes
expressas em
E. coli BL21[DE3]pLysS.......................................................................... 31
3.8.3. Purificação das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes de
hsPLA
2
-IID....................................................................................................................... 32
3.9. Dicroísmo Circular................................................................................................... 33
3.10. Teste de Atividade Enzimática Através de Indicador de Ácido Graxo Livre....... 34
3.11. Atividade de Liberação de Calceina Encapsulada Em Lipossomos.................... 37
3.11.1. Preparação de lipossomos............................................................................. 37
3.11.2 Dosagem de fosfato dos fosfolipídios ............................................................ 38
3.11.3. Liberação de calceína encapsulada em lipossomos..................................... 39
x
3.12. Efeito Bactericida...................................................................................................40
4. RESULTADOS................................................................................................................. 43
4.1. Subclonagem de hsPLA
2
-IID Tipo Selvagem..........................................................43
4.2. Mutagênese Stio-Drigida de hsPLA
2
-IID Aravés da Ração em Cadeia de
Polimerase ...................................................................................................................... 44
4.3. Subclonagem dos Genes de hsPLA
2
-IID Mutantes................................................. 46
4.4. Expressão das Proteínas Recombinantes de hsPLA
2
-IID...................................... 50
4.5. Enovelamento e Purificação das Proteínas Recombinantes de hsPLA
2
-IID .........51
4.6. Dicroísmo Circular................................................................................................... 56
4.7. Teste de Atividade Hidrolítica.................................................................................. 58
4.8. Atividade de Permeabilização de membranas Artificiais....................................... 60
4.9. Atividade Bactericida............................................................................................... 62
5. DISCUSSÃO....................................................................................................................65
6. CONCLUSÕES................................................................................................................81
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 83
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: Hidrólise de fosfatidilcolina pela PLA
1
, PLA
2
, PLB, PLC e PLD, e os
respectivos produtos da reação..........................................................................................1
FIGURA 2: Representação em fita da estrutura tridimensional de uma Asp 49-PLA
2
de
peçonha de serpente............................................................................................................6
FIGURA 3. Mecanismo de tríade catalítica de PLA
2
s..........................................................8
FIGURA 4: Esquema ilustrativo de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia de
polimerase.......................................................................................................................... 17
FIGURA 5: Esquema ilustrativo da modificação química de proteínas sob a forma de
corpos de inclusão............................................................................................................. 31
FIGURA 6. Titulação monitorada por fluorescência do ADIFAB com ácido oléico a 25°C.
............................................................................................................................................ 36
FIGURA 7: Diagrama de formação de lipossomos pelo método de evaporação de fase
reversa................................................................................................................................ 38
FIGURA 8: Esquema ilustrativo do teste de liberação de calceína encapsulada em
lipossomo........................................................................................................................... 40
FIGURA 9: Esquema ilustrativo do ensaio bactericida. Considere tampão como controle
negativo experimental (CFU = 100%)................................................................................. 42
FIGURA 10: Análise eletroforética em gel do gene da hsPLA
2
-IID................................... 43
FIGURA 11: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% da digestão NdeI/BamHI do
vetor pET-3a. ...................................................................................................................... 44
FIGURA 12: Análise eletroforética em gel de agarose a 2% das etapas I e III da reação
em cadeia de polimerase.. ................................................................................................. 46
FIGURA 13: Análise eletroforética em gel de agarose a 2% dos produtos da digestão
enzimática dos fragmentos originado na reação III da PCR.............................................47
FIGURA 14: Análise eletroforética em gel de agarose a 1% da subclonagem dos
fragmentos mutados no vetor pET-3a............................................................................... 47
FIGURA 15: Análise eletroforética de PCR de colônias obtidas após a transformação em
E. coli DH5α
αα
α competente.................................................................................................... 48
FIGURA 16. Eletroferograma mostrando a seqüência de DNA da fita complementar do
gene de hsPLA
2
-IID.............................................................................................................49
FIGURA 17: Expressão da hsPLA
2
-IID recombinante em E. coli BL21. .......................... 50
FIGURA 18: Expressão das proteínas recombinantes mutantes de hsPLA
2
-IID em E. coli
BL21 após 5 horas de indução com IPTG......................................................................... 51
FIGURA 19: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID renovelada segundo Ward e
colaboradores e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S............................ 52
xii
FIGURA 20: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
–IID renovelada com alteração do
estado de oxidação e redução do tampão de pré incubação e purificada em coluna de
troca catiônica Source 15S................................................................................................ 53
FIGURA 21: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA
2
-IID não
enovelada corretamente .................................................................................................... 54
FIGURA 22: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID renovelada por diluição
seguida de diálise e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S...................... 55
FIGURA 23: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
–IID renovelada segundo
protocolo estabelecido e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. ............ 55
FIGURA 24: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes em
coluna de troca catiônica Source 15S............................................................................... 56
FIGURA 25: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA
2
-IID tipo
selvagem e mutantes......................................................................................................... 57
FIGURA 26: Hidrólise fosfolipídica da hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes no sítio
ativo na presença de CA
2+
ou EGTA.................................................................................. 59
FIGURA 27: Cinética de liberação de calceína causada por hsPLA
2
-IID tipo selvagem e
mutantes sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG............................................. 61
FIGURA 28: Porcentagem da liberação de calceína encapsulada causada por hsPLA
2
-
IIDs em lipossomos compostos de DOPC e DOPG..........................................................61
FIGURA 29: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 5 e
10 g.mL
-1
de hsPLA
2
-IID sobre (A) Micrococcus luteus e (B) Escherichia coli (K12).... 63
FIGURA 30: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 10
g.mL
-1
de hsPLA
2
-IID mutantes sobre (A) Micrococcus luteus e (B) de Escherichia coli
(K12).................................................................................................................................... 65
FIGURA 31: Mecanismo catalítico de coordenação com Ca
+2
proposto por Yu et al para
as sPLA2. ........................................................................................................................... 72
FIGURA 32: Porcentagem do número de UFC apresentado no efeito bactericida sobre
E.coli K12 e M.luteus por (A) hsPLA
2
-IIA e (B) BthTx-I..................................................... 75
FIGURA 33: Estrutura simulada da proteína hsPLA
2
-IID(A) comparada a estrutura da
hsPLA
2
-IIA (B) e da BthTx-I (C)......................................................................................... 77
FIGURA 34: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas hsPLA
2
-IID,
hsPLA
2
-IIA e BthTx-I........................................................................................................... 78
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1: Resíduos de aminoácidos conservados entre hsPLA
2
-IID e BthTx-I e entre
hsPLA
2
-IID e hsPLA
2
-IIA na região do sítio de reconhecimento interfacial..................... 79
xiii
ABREVIATURAS
ADIFAB: proteína de ligação de ácido
graxo intestinal marcada com Acrilodan.
ACS: acilceramida sintase
ATP: adenosina trifosfato
BthTX-I: bothropstoxina I
CD: dicroísmo circular
cDNA: DNA complementar
CFU: unidade formadora de colônias
Cho: colina
CI: corpos de inclusão
cPLA
2
: fosfolipase A
2
citosólicas
DAG: diacilglicerol
DTT: ditiotreitol
dNTP:Desoxirribonucleotídeos fosfatados
DOPC: dioleoil fosfatidilcolina
DOPG: dioleoil fosfatidilglicerol
DMSO: dimetilsufóxido
DNA: ácido dioxiribonucleotídeo
E. coli: Escherichia coli
EDTA: ácido etilenodiamintetraacético
EGTA: ácido etitlenoglicoltetraacético
EXT1: oligonucleotídeo da extremidade 5´
EXT3: oligonucleotídeo seletivo
FA: ácido graxo
GdnHCl: hidrocloreto de guanidina
HDM: High density médium
HEPES: 4-(2-Hidroxiethil)1-ácido
piperazineethanesulfonico
HPLC: High-performance liquid
chromatography
I-FABP: proteína de ligação de ácido
graxo intestinal
iPLA
2
: fosfolipase A
2
independente de
Ca
2+
IPTG: isopropil- β-D-tiogalactopiranosídeo
IRS: sítio de reconhecimento interfacial
kDa: quilodalton
LB: Meio de cultura Luria-Bertan.
LysoPC: lisofosfolipídio
M. luteus: Micrococcus lysodeikticus
MET: Mutagênese de Escaneamento do
Triptofano
MUT: oligonucleotídeo mutagênico
NBS: N-bromo-sucimanida
NMR: ressonância magnética nuclear
NTSB: 2-nitro-5-(sulphotio)-benzoato
OD: densidade ótica
ORF: janela de leitura aberta
PAF-AH: fator de agregação de plaquetas-
acetilhidrolase
P-Cho: fosfocolina
PCR: reação em cadeia de polimerase
PIPES:1,4-Piperazin-bisethansulfonado
PLA
1
: fosfolipase A
1
PLA
2
: fosfolipase A
2
PLA
2
-Asp49: fosfolipase A
2
com resíduo
de ácido aspártico na posição 49
PLA
2
-Lys49: fosfolipase A
2
com resíduo
de lisina na posição 49
sPLA
2
: fosfolipase A
2
secretada
hsPLA
2
-IIA: fosfolipase A
2
secretada
humana do grupo IIA
hsPLA
2
-IID: fosfolipase A
2
secretada
humana do grupo IID
PLB: fosfolipase B
PLC: fosfolipase C
PLD: fosfolipase D
PMSF: phenylmethanesulphonylfluoride
SMC: sítio múltiplo de clonagem
SDS: dodecilsulfato de sódio
UTR: regiões não traduzidas
UV: ultravioleta
xiv
Nomenclatura, classificação e estrutura dos 20 aminoácidos
encontrados em sistemas biológicos.
Não polares
Glicina Alanina Valina Leucina Metionina Isoleucina
(Gly) (Ala) (Val) (Leu) (Met) (Ilo)
(G) (A) (V) (L) (M) (I)
Aromáticos
Fenilalanina Tirosina Triptofano
(Phe) (Tyr) (Trp)
(F) (Y) (W)
Polares não carregados
Serina Treonina Cisteín Glutamina Prolina Asparagina
(Ser) (Thr) (Cys) (Gln) (Pro) (Asn)
(S) (T) (C) (Q) (P) (N)
xv
Positivamente carregados
Histidina Lisina Arginina
(His) (Lys) (Arg)
(H) (K) (R)
Negativamente carregados
Aspartato Glutamato
(Asp) (Glu)
(D) (E)
xvi
ABSTRACT
Phospholipases A
2
(PLA
2
s) are enzymes involved in a wide range of
physiological processes, including phospholipid hydrolysis, membrane
recycling and regulation of the immune system in pathological states. The
group II secreted PLA
2
s (sPLA
2
-II) are proteins of the immune system present
in the acute phase of the immune response and show bactericidal activity,
participating in the activation and release of cytokines and other inflammatory
mediators. Although the recent studies have focused on the pharmacological
effects and catalytic mechanism of group IIA human sPLA
2
(hsPLA
2
-IIA), little
attention has been paid to group IID human sPLA
2
(hsPLA
2
-IID), a protein
associated with the development of the inflammatory process. The present
work represents a study to evaluate a possible correlation between the
mechanism of permeabilization of models membranes and the bactericidal
activity of the hsPLA
2
-IID.
The coding sequence of hsPLA
2
-IID was inserted in the expression
vector pET3a, and the recombinant protein was produced in the form of
inclusion bodies in Escherichia coli BL21(DE3). A protocol for the refolding of
the recombinant protein was developed that allowed the production of hsPLA
2
-
IID in the native conformation. To evaluate the role of catalytic activity in the
membranes permeabilization effect and in the bactericidal activity, mutants
H48Q, D49K and G30S in catalytic site were produced with the intention of
reducing or eliminating the catalytic activity of the enzyme.
The protein wild type hsPLA
2
-IID and the H48Q mutant had presented
hydrolytic activity of 58,45 and 7,7 M.min
-1
.mg
-1
respectively, and
xvii
demonstrated a membrane damages against liposomes. In contrast, mutants
G30S and D49K lost the catalytic activity completely, but retained the capacity
to damage artificial membranes, demonstrating that the hydrolytic activity and
the artificial membrane activity are not correlated. The wild type hsPLA2-IID
demonstrated bactericidal effect against Gram-negative (E. coli K12) and
Gram-positive (Micrococcus luteus) bacterias. The H48Q and D49K mutants
showed, the bactericidal activity against the E. coli, demonstrating that the
catalytically independent activity contributes to the killing effect against this
strain. The same mutants also cause significant reduction in the activity
against M. luteus, showing that the mechanisms of the bactericidal effect are
different between Gram-negative and Gram-positive bacteria. The effect of the
hsPLA
2
-IID mutations have been compared with the effect of the same
mutations in hsPLA
2
-IIA and with botropstoxina-I, a PLA
2
-Lys49 isolated from
the venon of Bothrops jararacussu, indicating that in addition its catalytic and
catalyzes independent activity, access to the internal membrane of the
bacterium may be a important factor in the determination of the bactericidal
activity of group II phospholipases A
2
.
xviii
RESUMO
As fosfolipases A
2
(PLA
2
s, EC 3.1.1.4) são enzimas envolvidas em uma
ampla variedade de processos fisiológicos que compreendem digestão
fosfolipídica, remodelagem de membranas, regulação do sistema imunológico
e processos patofisiológicos. As PLA
2
s secretadas do grupo II (sPLA
2
-II) são
proteínas do sistema imune presentes na resposta de fase aguda e na
atividade bactericida, participando na ativação e liberação de citosinas e de
outros mediadores pré-inflamatórios. Apesar dos estudos recentes sobre os
efeitos farmacológicos e mecanismo catalítico da sPLA
2
do grupo IIA humana
(hsPLA
2
-IIA), pouca atenção tem sido dada à sPLA
2
do grupo IID humana
(hsPLA
2
-IID), uma proteína associada ao progresso do processo inflamatório.
O presente trabalho representa um estudo para avaliar uma eventual
correlação entre o mecanismo de permeabilização de membranas modelos e
a atividade bactericida de hsPLA
2
-IID.
A seqüência codificadora da hsPLA
2
-IID foi inserida no vetor de
expressão pET3a, e a proteína heteróloga foi produzida na forma de corpos
de inclusão em Escherichia coli BL21(DE3). Um protocolo de enovelamento
da proteína recombinante foi desenvolvido que permitiu a produção de
hsPLA
2
-IID na conformação nativa. Para avaliar o papel de atividade catalítica
no efeito de permeabilização de membranas modelos e na atividade
bactericida, as mutantes H48Q, D49K e G30S na região de sitio ativo foram
produzidos com o intuito de reduz ou eliminar a atividade catalítica da enzima.
A proteína hsPLA
2
-IID tipo selvagem e a mutante H48Q apresentaram
atividade hidrolítica de 58,45 e 7,7
M.min
-1
.mg
-1
respectivamente, e
demonstraram uma atividade de danificação de membranas artificiais. Em
xix
contraste, as mutantes G30S e D49K perderam completamente a atividade
catalítica, mas mantiveram a capacidade de danificar membranas artificiais,
demonstrando que a atividade hidrolítica e a danificação de membranas
modelos não estão correlacionadas. A proteína hsPLA
2
-IID tipo selvagem
demonstrou um efeito bactericida contra bactérias Gram-negativa (E. coli K12)
e Gram-positiva (Micrococcus luteus). As mutantes H48Q e D49K reduziram,
mas não aboliram a atividade bactericida contra a E. coli, demonstrando que a
atividade independente da atividade catalítica contribui para o efeito contra
este linhagem. As mesmas mutantes causam uma redução maior na atividade
contra M. luteus, mostrando que os mecanismos do efeito bactericida são
diferentes entre bactérias Gram negativas e positivas. Os efeitos das
mutações da hsPLA
2
-IID foram comparados com os efeitos das mesmas
mutações na hsPLA
2
-IIA e com botropstoxina-I, uma Lys49-PLA
2
isolado do
veneno da serpente Bothrops jararacussu, indicando que além da atividade
catalítica e a atividade independente de catalise, acesso a membrana interna
da bactéria pode ser um fator na determinação da atividade bactericida das
fosfolipases A
2
de classe II.
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
As fosfolipases são enzimas lipolíticas que estão agrupadas nas
famílias A
1
(PLA
1
), A
2
(PLA
2
), B (PLB), C (PLC) e D (PLD) de acordo com a
ligação hidrolisada no fosfolipídio (FIGURA 1). As fosfolipases A
2
(PLA
2
) ou
fosfatidil-acil hidrolases (EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das
ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como
produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios (VAN DEENEN E DE
HAAS, 1963), sendo a hidrólise realçada sobre substratos agregados
micelares e lamelares, em membranas ou ainda, na interface água-lipídio
(RAMIREZ E JAIN, 1991).
FIGURA 1: Hidrólise de fosfatidilcolina pela PLA
1
, PLA
2
, PLB, PLC e PLD, e os
respectivos produtos da reação. As fosfolipases A
2
hidrolisam especificamente a ligação
éster sn-2 de fosfolipídios e liberam, como produto da catálise, ácido graxo e lisofosfolipídio.
Cho, colina; DAG, diacilglicerol; P-Cho, fosfocolina, FA, ácido graxo.
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
2
As PLA
2
s estão envolvidas em uma ampla variedade de processos
fisiológicos incluindo digestão fosfolipídica, remodelagem de membranas
biológicas e defesa do hospedeiro. Essas proteínas também participam de
processos patofisiológicos através da produção de mediadores lipídicos tais
como prostaglandinas e leucotrienos. O fato de exibirem uma função central
em diversos processos celulares faz com que as PLA
2
s sejam alvos de muitos
estudos, com o objetivo de correlacionar estrutura com função da enzima.
As fosfolipases A
2
constituem uma classe diversificada de enzimas com
relação à localização, regulação, mecanismo, seqüência de aminoácidos e
estrutura tridimensional. A superfamília de fosfolipases A
2
consiste em 15
grupos (SCHALOSKE E DENNIS, 2006), subdivididas em cinco principais
subfamílias: PLA
2
s secretadas (sPLA
2
), PLA
2
s citosólicas (cPLA
2
), PLA
2
s
independente de Ca
2+
(iPLA
2
), as PAF-AH (fator de agregação de plaquetas -
acetilhidrolases) e as PLA
2
s lisosomais.
As PLA
2
secretadas compreendem os grupos I, II, III, V, IX, X, XI, XII,
XIII e VIX. São enzimas interfaciais, de baixo peso molecular, dependentes de
Ca
2+
, encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais
vertebrados e invertebrados e estão implicadas na digestão fosfolipídica,
geração de mediadores lipídicos, proliferação celular, exocitose, atividade
bactericida, câncer e doenças inflamatórias. As sPLA
2
s do grupo I são
enzimas encontradas tanto no suco pancreático de mamíferos como no
veneno de serpentes das famílias Elapidae e Hidrophidae. Apresentam peso
molecular de 13 a 15 kDa e 14 resíduos de cisteínas que formam 7 pontes
dissulfeto. Ao grupo II pertencem as sPLA
2
s do veneno de serpentes das
famílias Viperidae e Crotalidae, do fluido sinovial de mamíferos (grupo IIA), do
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
3
veneno da víbora Gaboon (grupo IIB), do testículo de camundongos (grupo
IIC), do baço e pâncreas de camundongos/humanos (grupo IID), do útero,
coração e cérebro de camundongo/humano (grupo IIE) e do embrião e
testículo de camundongos (grupo IIF). Além desses cinco grupos, as sPLA
2
s
do grupo IIC, encontradas em roedores, foram identificadas em um
pseudogene em humanos (TISCHFIELD, 1997). São enzimas que
apresentam peso molecular de 13-17 kDa e contém de 6 a 8 pontes
dissulfeto. As proteínas dos grupos I e II apresentam alta similaridade em
suas seqüências de aminoácidos e alto grau de homologia estrutural. As
sPLA
2
s do grupo III incluem enzimas dos venenos de abelhas, lagartos e
também são encontradas nos exudados inflamatórios e grânulos de plaquetas
e mastócitos. O grupo V é composto de sPLA
2
s encontradas em macrófagos,
coração e pulmão de mamíferos e são expressas principalmente em resposta
a estímulos inflamatórios. Ao grupo IX pertencem as sPLA
2
s isoladas do
veneno de um gastrópodo marinho. O grupo X compreende sPLA
2
s isoladas
do timo, baço e leucócito humano. O grupo XI representa sPLA
2
s isoladas de
plantas e a descoberta de uma nova fosfolipase A
2
isolada de células T-helper
(HO, et al., 2001) levou ao estabelecimento do 12
o
grupo. O grupo XIII
compreende as sPLA
2
s encontradas em parvovírus (CANAAN, et al., 2002) e
o grupo XIV compreende as sPLA
2
s de fungos simbiontes e bactérias e estão
envolvidas na invasão celular durante rompimento da membrana celular do
hospedeiro (ISTIVAN E COLOE, 2006).
As PLA
2
s citosólicas compreendem o grupo IV composto de enzimas
que apresentam de 61 a 114 kDa e são encontradas tanto no músculo
esquelético e cardíaco de humanos (grupo IVC), no cérebro, coração e fígado
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
4
de humanos (grupo IVB) quanto no fígado de rato e plaquetas de humanos
(grupo IVA). Ambas cPLA
2
dos grupos IVB e IVC mostram uma pequena
especificidade para ácidos graxos sn-2 (SONG, et al., 1999, STEWART, et al.,
2002). O grupo IVD mostrou certa especificidade para acido linoléico (CHIBA,
et al., 2004). O grupo IVE não mostrou ter prioridade por substratos contendo
fosfatidilcolina ou fosfatidiletanolamina, no entanto o grupo IVF parece preferir
fosfatidiletanolamina como substrato (OTHO, et al., 2005).As PLA
2
s
citosólicas
têm recebido mais atenção como reguladoras da biossíntese do fator de
agregação de plaqueta (PAF) e eicosanóides, devido à liberação seletiva de
ácido araquidônico. Estas enzimas
sofrem translocações dependentes de Ca
2+
do citosol para as membranas do retículo endoplasmático e perinuclear, onde
estão localizadas várias enzimas associadas com a síntese de eicosanoídes,
como ciclooxigenases e lipoxigenases.
As PLA
2
s citosólicas de peso molecular entre 84-90 kDa,
independentes de Ca
2+
(iPLA
2
) exibem função central na remodelagem de
fosfolipídios (BALSINDE, et al., 1999). São encontradas no músculo
esquelético/cardíaco, testículo, linfócito e macrófago de humanos e
compreendem o grupo VI com subgrupos A-1, A-2, B, C, D, E e F. As iPLA
2
s
dos grupos VIA exibem função central na liberação de ácido aracdônico que
resulta na formação de ecosanoide (RICKARD, et al., 2005), na secreção
(SONG, et al., 1999), além de apresentar um papel na apoptose (ATSUMI, et
al., 2000). O grupo VIB também está envolvido na liberação de ácido
aracdônico para formação de eicosanóides, e estudos com enentiômeros de
lactona bromoenol tem ajudado a diferenciar as funções celulares entre os
grupos VIA e VIB (JENKINS, et al., 2002).
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
5
PAF-AHs (grupos VII e VIII) pertencem a um subtipo de fosfolipase A
2
que degrada especificamente PAF e lipídios oxidados relacionados. Os
grupos VII e VIII compreendem enzimas com atividade de PAF
acetilhidrolases sendo pertencentes ao grupo VII àquelas que apresentam de
40 a 45 kDa e são encontradas tanto no plasma quanto intracelularmente no
fígado e rim de humano/bovino e ao grupo grupo VIII aquelas com 26 kDa
encontradas no cérebro humano.
As PLA
2
lisossomais foram primeiramente purificadas do cérebro
bovino e denominadas como 1-O-acilceramida sintase (ACS) (ABE E
SHAYMAN, 1998). Entretanto, o grupo acil hidrolisado é transferido através de
uma enzima acil para ceramida ou água resultando ou na produção de 1-O-
acil-ceramida (ACS atividade) ou na liberação de ácidos graxos livres (PLA
2
atividade) dessa forma nome ACS foi modificado por PLA
2
lisossomal (LPLA
2
)
(HIRAOKA, et al., 2002) e de acordo com a nomenclatura de superfamília de
fosfolipases, esta enzima foi nomeada agora pelo grupo XV PLA
2
.
Estrutura de PLA
2
s dos grupos I e II
Estudos cristalográficos e espectroscópicos contribuíram
significativamente para a elucidação de um modelo para a catálise das PLA
2
s
(SCOTT, et al., 1992, SCOTT, et al., 1990, VERHEIJ, et al., 1981). As
enzimas que incluem um par aspartato-histidina no sítio ativo são tipicamente
extracelulares de baixo peso molecular e requerem concentrações milimolares
de Ca
2+
para exercerem sua atividade catalítica. Por outro lado, os grupos que
utilizam uma serina no sítio catalítico são tipicamente enzimas maiores,
intracelulares que utilizam uma serina nucleofílica para a clivagem hidrolítica e
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
6
que não apresentam nenhuma ligação dissulfeto e nenhum requerimento de
Ca
2+
para a catálise.
As estruturas tridimensionais das proteínas dos grupos I, II e III na
presença e ausência do cofator Ca
2+
e também de inibidores específicos para
a atividade catalítica foram resolvidas por cristalografia de raio-X (SCOTT, et
al., 1990). Como apresentado na FIGURA 2 das PLA
2
s apresentam duas -
hélices anti-paralelas conservadas (onde se localizam os resíduos do sítio
ativo), associadas com uma alça rica em resíduos de glicina, que está
envolvida na ligação do Ca
2+
(ARNI, et al., 1999, ARNI E WARD, 1996,
SCOTT E SIGLER, 1994).
FIGURA 2: Representação em fita da estrutura tridimensional de uma Asp 49-PLA
2
de
peçonha de serpente (MARCUSSI et al., 2007). Estrutura tridimensional típica das classes I
e II de sPLA
2
. As principais hélices e alças estão indicadas.
“asa”
Hélice 3
Hélice 2
Hélice 1
Alça C-
terminal
Alça de
ligação do
Ca
+2
Sítio Ativo
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
7
Utilizando a numeração de homologia dos grupos I e II, (DIJKISTRA, et
al., 1981) foi constatado que as posições dos resíduos His48, Asp49, Tyr52 e
Asp99 são altamente conservadas no sítio ativo dos dois grupos
(RENETSEDER, et al., 1985), sendo que, resíduos análogos são encontrados
no grupo III. O grupo carboxila do resíduo de aspartato presente na posição
49, juntamente com três oxigênios carbonil da cadeia principal dos resíduos
Tyr28, Gly30 e Gly32, estão envolvidos na ligação do Ca
2+
(THUNNISSEN, et
al., 1990), que funciona como um cofator no mecanismo de hidrólise (SCOTT,
et al., 1992, VERHEIJ, et al., 1980) Este cofator orienta tanto o substrato
fosfolipídico, como estabiliza o intermediário catalítico tetraédrico (SCOTT, et
al., 1990, SCOTT, et al., 1990, THUNNISSEN, et al., 1990) e, na sua
ausência, as PLA
2
s são inativas.
O mecanismo proposto por VERHEIJ e colaboradores (1981) e
revisado (BERG, et al., 2001) sugere que os resíduos Asp99, His48 e uma
molécula de água formam uma tríade catalítica . A seqüência do mecanismo
catalítico proposto ocorre em 3 etapas (FIGURA 3): (1) desprotonação da
molécula de água pela díade catalítica His48/Asp99; (2) ataque nucleofílico na
ligação ester sn-2 do glicerofosfolipídio pela água desprotonada; e a formação
do intermediário tetraédrico, que é estabilizado pelo cofator Ca
2+
; (3) e
finalmente, colapso do intermediário da reação, com a liberação dos produtos
da catálise, ácido graxo e lisofosfolipídio. O passo limitante da reação seria a
formação do intermediário tetraédrico quando o grupo δN do H48 é protonado.
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
8
FIGURA 3. Mecanismo de tríade catalítica de PLA
2
s. Representação esquemática do
mecanismo catalítico proposto para PLA
2
s. Asp 99, His48 e uma molécula de água formam
uma tríade catalítica, na qual a desprotonação da molécula de água pelo resíduo de His48
gera o ataque nucleofílico.
Fosfolipases Humanas e Suas Funções Independentes de Catálise
Cinco grupos de sPLA
2
s (IB, IIA, IID, V e X), identificados em humanos,
(TISCHFIELD, 1997) aumentam sinergicamente no plasma de pacientes com
inflamações sistêmicas, como choque séptico e queimaduras graves (NAKAE,
ET AL., 1995, SORENSEN E MARTINOFF, 1984) ou com sistema
imunológico inato comprometido (HAAPAMAKI, et al., 1999, HUHTINEN, et
al., 1999, LIN, et al., 1996)
ETAPA 1
ETAPA 2
ETAPA 3
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
9
Inicialmente, as sPLA
2
s humanas (hsPLA
2
s) eram consideradas
importantes no processo inflamatório devido á liberação de ácido aracdônico,
precursor de mediadores pré-inflamatórios, com prostaglandinas e
leucotrienos. Entretanto, estudos recentes têm sugerido que o efeito pré-
inflamatório das hsPLA
2
s não é limitado ao metabolismo do ácido
araquidônico. Muitas doenças associadas com alto nível de sPLA
2
extracelular
são caracterizadas por um aumento significativo das concentrações de
citocinas como TNF- e interleucina 1 (GRANATA, et al., 2003,
HAAPAMAKI, et al., 1999). Além disso, hsPLA
2
s são relatadas por induzir
desgranulação e produção de citocinas de uma variedade de células
autócrinas envolvidas em respostas inflamatórias (GRANATA, et al., 2003,
TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001). Este efeito ocorre por um mecanismo
independente da atividade enzimática o qual é mediado por interação das
hsPLA
2
s com receptores específicos de membrana (GRANATA, et al., 2003).
A descoberta da hsPLA
2
-IIA em plaquetas e fluido sinovial
(NEVALAINEN, et al., 1993), bem como sua associação com desordens
inflamatórias, direcionaram os esforços para determinação da função
fisiológica desta enzima (TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001). A localização
da sPLA
2
-IIA em macrófagos (INADA, et al., 1991), células Paneth do
intestino 1993 (HIETARANTA, et al., 1993, QU, et al., 1996), células da
glândula lacrimal (AHO, et al., 1996, NEVALAINEN, et al., 1994) , plaquetas
(KRAMER, et al., 1989), neutrófilos (WRIGHT, et al., 1990) e mastócitos
(MURAKAMI, et al., 1992) evidenciou uma possível função no sistema
imunológico inato do corpo (TOUQUI E ALAOUI-EL-AZHER, 2001).
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
10
As fosfolipases A
2
do grupo IIA e grupo V e de várias serpentes contém
vários resíduos básicos na superfície da enzima, entre os resíduos 54 e 77,
que estão envolvidos na ligação ao fator Xa e assim impedindo a formação do
complexo protrombinase durante a coagulação sanguínea (MOUNIER, et al.,
2001) O efeito anticoagulante dessas PLA
2
é independente da hidrólise de
fosfolipídios (KINI, 2005).
A hsPLA
2
-IIA apresenta um efeito bactericida evidente contra a
Micrococcus luteus, e a retirada de cargas positivas da enzima feita por
mutagênese sítio dirigida diminuíram o efeito bactericida em relação à nativa
(BEERS, et al., 2002). Foi sugerido que este resultado é devido à redução na
afinidade da proteína pela membrana bacteriana e à eliminação na hidrolise
dos fosfolipídeos (BEERS, et al., 2002). Entretanto, mutações no sítio ativo
(H48Q e D49K), reduziram, mas não eliminaram a atividade bactericida de
hsPLA
2
-IIA (CHIOATO, 2004). Com estes resultados pode-se inferir que a
função bactericida conferida por esta proteína é apenas parcialmente
dependente da atividade catalítica.
As propriedades enzimáticas da hsPLA
2
-IID e da hsPLA
2
-IIA são
similares em termos de requerimento de Ca
+2
, pH ótimo e substrato específico
(ISHIZAKI, et al., 1999). Entretanto o efeito bactericida de sPLA-IID tem sido
pouco avaliado e embora relatos com a proteína de camundongos mostrem
uma atividade bactericida evidente (KODURI, et al., 2002) até o presente,
nada foi relatado sobre a contribuição da sPLA
2
-IID humana nesta atividade.
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
11
Comparação das Funções de sPLA
2
-IID e sPLA
2
s-IIA com as sPLA-Lys49
do Veneno de Serpentes
Algumas variantes das sPLA
2
s, como a subfamília de sPLA
2
s miotóxica
do grupo II isolada do veneno de serpentes do gênero Bothrops,
Bothropstoxina-I (BthTx-I) , apresentam uma substituição do aminoácido ácido
aspártico (Asp) por lisina (Lys) na posição 49 do sítio ativo. Esta substituição
impede a ligação do cofator Ca
2+
, com a conseqüente perda do ciclo catalítico
produtivo, pois o grupo -amino do Lys49 está localizado na posição
normalmente ocupada pelo cofator Ca
2+
nas PLA
2
s-Asp49 (HOLLAND, et al.,
1990, SCOTT, et al., 1992). Embora sem atividade catalítica fosfolipásica, a
interação da sPLA
2
-Lys49 com membranas artificiais de lipossomos provoca
uma rápida liberação do conteúdo aquoso dos mesmos (PEDERSEN, et al.,
1995, RUFINI, et al., 1992). Em adição, as sPLA
2
s-Lys49 apresentam efeito
bactericida e atividade citotóxica, sugerindo que essas proteínas exibem
atividade de danificação de membranas em uma ampla variedade de alvos
biológicos (LOMONTE, et al., 1994) independente da ação catalítica (WARD,
et al., 2002)
A região C-terminal da sPLA
2
s-Lys49 e da hsPLA-IID é rica em
aminoácidos aromáticos e positivamente carregados (FRANCIS, et al., 1991,
WARD, et al., 1998). Motivos com resíduos catiônicos/hidrofóbicos são
observados em várias proteínas e peptídeos que interagem com membranas,
indicando que esta combinação de aminoácidos forma estruturas com
capacidade para penetrar na bicamada lipídica (SEGREST, et al., 1990).
Mutagênese sítio dirigida na região C-terminal de sPLA
2
s-Lys49 foi utilizada
para investigar o papel desta região nas atividades contra membranas
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
12
artificiais e biológicas (CHIOATO, et al., 2002). Os resultados demonstraram
que resíduos catiônicos e aromáticos localizados entre os resíduos 117 e 122
são determinantes estruturais das atividades miotóxica, danificadora de
membranas artificiais e efeito bactericida (CHIOATO, et al., 2007).
Recentemente, foi demonstrado que as substituições na região C-terminal de
sPLA
2
-Lys49, causa redução na atividade danificadora de membranas
artificiais, e também reduz o efeito bactericida, sugerindo que estes dois
efeitos estão correlacionados (ARAGÃO, 2005). O papel da hidrólise dos
fosfolipídios na atividade bactericida também é questionado pela atividade
bactericida apresentada pelas PLA
2
s-Lys49, que sugere que o mecanismo
bactericida pode ser causado na ausência de catálise. Tanto BthTX-I quanto
hsPLA
2
-IIA são proteínas básicas e apresentam alto número de aminoácidos
positivamente carregados em suas seqüências. Dessa forma, BEERS,
colaboradores (2002), sugerem que esta natureza fortemente catiônica
permite a penetração na parede celular durante o efeito bactericida. Dentro
deste parâmetro de investigação da base estrutural de atividades
farmacológicas de PLA
2
s de veneno de serpentes, a observação de que as
PLA
2
s-Lys49 apresentam efeito bactericida contra bactérias gram-negativas e
gram-positivas apesar de não apresentarem hidrólise de fosfolipídios de
membranas e uma vez que, a hsPLA
2
-IIA apresenta um efeito bactericida
parcialmente dependente da atividade catalítica, e também uma atividade
danificadora de membranas artificiais Ca
2+
independente (CHIOATO, et al.,
2007) e como há poucos estudos sobre a hsPLA
2
-IID, uma das metas deste
trabalho é identificar e avaliar o papel da atividade catalítica desta enzima
nestes efeitos.
_______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
13
A sPLA
2
-IID representa a isoenzima mais próxima a sPLA
2
-IIA e
segundo Ishizaki e colaboradores (1999), estaria substituindo sPLA
2
-IIA em
algumas condições da resposta inflamatória, pois em camundonfgos
deficientes de sPLA
2
-IIA há um aumento da expressão de PLA
2
-IID durante
infecções. Entretanto a expressão de sPLA
2
-IID, detectada em diferentes
mamíferos, ocorre principalmente no baço e no timo o que é contrastante com
a expressão da sPLA
2
-IIA, enfatizando que essas duas enzimas teriam
funçãos diferentes no organismo.
Apesar das evidências de que alguns efeitos celulares são provocados
por sPLA
2
do grupo IID, não é conhecido se a atividade catalítica dessa
enzima está envolvida na atividade danificadora de membranas biológicas
e/ou artificiais. Portanto, o papel da atividade catalítica da hsPLA
2
-IID nos
efeitos biológicos ainda está por ser esclarecido e diante das evidências que
mostram sua participação em processos inflamatórios o estudo das atividades
dependentes e independentes da atividade catalítica nesses processos torna-
se relevante.
_________________________________________________________________________OBJETIVOS
14
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do atual trabalho é avaliar a contribuição da atividade
catalítica da fosfolipase humana do grupo IID (hsPLA
2
-IID) no efeito
bactericida e na danificação de membranas artificiais. Portanto, os três
objetivos específicos consistiram em:
2.1) Expressão de hsPLA
2
-IID em E. coli, e estabelecimento de um
protocolo de purificação e enovelamento da enzima recombinante.
2.2) Avaliar o papel da atividade hidrolítica na atividade de danificação
de membranas artificiais, através de mutagênese sítio dirigida de resíduos no
sítio ativo da hsPLA
2
-IID.
2.3) Avaliar o papel da atividade hidrolítica da hsPLA
2
-IID tipo selvagem
e mutantes no efeito bactericida sobre linhagens Gram-negativa e Gram-
positiva.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Subclonagem do Gene de hsPLA
2
-IID em vetor pET-3a
O cDNA da hsPLA
2
-IID inserido em vetor de clonagem pCMV-SPORT6
foi obtido do IMAGE Consortium/MGC (IMAGE ID 5223912, Geneservice Ltd,
Cambridge, RU). Para a expressão o gene da hsPLA
2
-IID foi subclonado em
um vetor de expressão pET3a. O vetor pET-3a foi inicialmente escolhido pois
já possui um sistema de expressão bem padronizado em nosso laboratório e
uma análise do mapa de restrição do pCMV-SPORT6+hsPLA
2
-IID e do vetor
pET-3a foi realizada, e foram identificadas posições para inserir os sítios de
restrição únicos para NdeI e BamHI.
Oligonucleotídeos complementares às extremidades 5` (PLAG2DN) e
3` (PLAG2DC) do gene humano foram construídos introduzindo os sítios de
restrição nas extremidades da região codificadora. A partir de uma reação de
PCR, um fragmento foi amplificado e seqüenciado confirmando que a região
codificadora da hsPLA
2
-IID está flanqueada por sítios das enzimas de
restrição BamHI e NdeI.
NdeI
PLAG2DN (5`-3`): CCAATC CATATG GCGATCCTG
BamHI
PLAG2DC (5`-3`): AGGTGG GGATCC CAGAGCTCC
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
16
3.1.1. Vetores pET
Os vetores da série pET - Plasmídeos para a Expressão pela T7 RNA
polimerase - Novagen - (ROSENBERG, et al., 1987, STUDIER E MOFFATT,
1986, STUDIER, et al., 1990) apresentam uma seqüência promotora T7 N-
terminal, que controla a expressão de genes inseridos dentro do sítio múltiplo
de clonagem (SMC), além de apresentarem marcadores seletivos para a
resistência à ampicilina. Uma característica do sistema pET de vetores é a
capacidade de clonagem de genes sob condições de atividade transcricional
extremamente baixa. O nível de expressão basal é mínimo na ausência de T7
RNA polimerase porque o sítio de clonagem múltiplo (SMC) se localiza em
uma região fracamente transcrita pela atividade de leitura da RNA polimerase
bacteriana. Apenas após a indução com IPTG (isopropil -β-D-
tiogalactopiranosídeo), ocorre a transcrição e a tradução da enzima T7 RNA
polimerase do bacteriófago T7, que reconhece o promotor T7 N-terminal
presente no vetor, e transcreve o RNA mensageiro dos genes localizados
abaixo (downstream) do promotor T7. A T7 RNA polimerase elonga cadeias 5
vezes mais rapidamente do que a RNA polimerase de Escherichia coli,
fazendo transcritos completos de qualquer DNA sob controle deste promotor
(STUDIER E MOFFATT, 1986).
3.2. Mutagênese Sítio-Dirigida
O protocolo utilizado para a obtenção das proteínas recombinantes
mutantes da hsPLA
2
-IID foi o de mutagênese sítio-dirigida através de uma
modificação na reação em cadeia da polimerase (NELSON E LONG, 1989).
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
17
Esta técnica é muito utilizada em estudos de correlação entre estrutura e
função de proteínas, pois permite a introdução de uma mutação em qualquer
posição de uma seqüência de DNA de fita dupla.
O processo de mutagênese sítio-dirigida através da reação em cadeia
de polimerase é realizado em três etapas ilustradas na FIGURA 4. A primeira
é responsável pela inserção da mutação na região alvo. Na segunda etapa,
ocorre a extensão do fragmento mutado originado na primeira etapa, e na
terceira etapa é selecionada e amplificada somente a fita de DNA que
contenha a mutação.
FIGURA 4: Esquema ilustrativo de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia de
polimerase. EXT1, PLAG2DC, EXT3 E MUT: oligonucleotídeos complementares a seqüência
molde; NdeI e BamHI representam as posições dos sítios de restrição enzimáticos; ORF:
“Open Reading Frame” (fase de leitura aberta); UTR: regiões não traduzidas
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
18
Para a mutagênese sítio-dirigida por PCR, além dos dois
oligonucleotídeos complementares às extremidades da seqüência de DNA
alvo (EXT1 e PLAG2DC), um terceiro oligonucleotídeo é necessário, chamado
oligonucleotídeo mutagênico (MUT). O oligonucleotídeo mutagênico (5’ para
3’) é complementar à fita codificadora da seqüência de DNA de interesse e
apresenta um ou mais nucleotídeos de determinada trinca alterados para a
determinação de um novo aminoácido.
3.2.1. Etapa I da reação de PCR: síntese do fragmento mutante
O primeiro passo da PCR para mutagênese sítio-dirigida foi realizado
com 100 pMols do oligonucleotídeo mutagênico (MUT), 100 pMols do
oligonucleotídeo externo (EXT1), 1mM do cofator MgCl
2,
2,5 mM dNTP, 1 fMol
do DNA molde, 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) em tampão de
PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl) e água estéril para um volume
final de 50 l. A reação foi realizada em termociclador, programado para 30
repetições do seguinte ciclo: 1) 2 minutos a 96°C, para desnaturação da fita
dupla 2) 1 minuto à 55°C para hibridação das fitas complementares; e 3) 2
minutos à 72°C para amplificação do fragmento. O fragmento de fita dupla
(EXT1-MUT) gerado após 25 ciclos da PCR foi analisado em gel de agarose
2%, purificado e quantificado em absorbância 260nm em espectrofotômetro
Hitach U-2000. O cDNA da hsPLA
2
-IID e subclonado em vetor pET-3a foi
usado como DNA molde.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
19
3.2.2. Etapa II da reação de PCR: extensão do fragmento mutado
Na reação de extensão foi utilizado 1 pmol do fragmento gerado na
etapa I como iniciador em tampão de PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50
mM KCl), contendo MgCl2 (1mM), dNTP (2.5mM), seqüência molde (1fMol),
2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água estéril para um volume final
de 50 µL. A reação foi incubada em miniciclador por 2 minutos a 96°C, e
sofreu 5 repetições do seguinte ciclo: 1) 1 minuto a 96°C; 2) 30 segundos a
55°C e 3) 1 minuto a 72°C.
3.2.3. Etapa III da reação de PCR: amplificação do gene
Nesta última etapa, os ciclos da PCR são os mesmos que os da
primeira etapa, mas são utilizados dois outros oligonucleotídeos que delimitam
a amplificação da seqüência alvo inteira, PLAG2DC (3’ para 5’) e EXT3 (5’
para 3’). EXT3 é complementar a uma porção única de EXT1, portanto a
amplificação final só ocorrerá na etapa III se o oligonucleotídeo EXT1 tiver
sido incorporado durante a primeira etapa, ou seja, é um oligonucleotídeo
responsável pela amplificação seletiva do fragmento mutado.
Após a reação de extensão, o oligonucleotídeo PLAG2DC (100 pMol) e
o oligonucleotídeo EXT3 (100 pMol), que delimitam o gene, foram adicionados
à mistura, e a reação foi imediatamente incubada em miniciclador. O produto
da reação foi analisado em gel de agarose 2%, purificado e digerido para
posterior subclonagem em vetor de expressão.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
20
3.2.4. Oligonucleotídeos de subclonagem
EXT1 (5’- 3’)
5’ GGA AAG CAG AGA AAA GAT GCC TAA TAC GAC TAC CTA TAG 3’
EXT3 (5’-3’): é o oligonucleotídeo responsável pela amplificação seletiva do
primeiro fragmento.
5’ GGA AAG CAG AGA AAA GAT GCC 3’
PLAG2DC (5`- 3`):
5’ AGG TGG GGA TCC CAG AGC TCC 3’
3.2.5. Oligonucleotídeos mutagênicos
As mutações G30S H48Q e D49K foram realizadas no sítio ativo da
enzima humana com o objetivo de eliminar a atividade catalítica da hsPLA
2
-
IID. Os mutantes G30S e D49K eliminam a atividade catalítica, pois impedem
a ligação do cofator, o íon Ca
+2
. A histidina na posição 48 está diretamente
envolvida no mecanismo catalítico, logo sua substituição dificulta o ataque
nucleofílico e o rompimento da ligação ester.
G30S (5’-3’) 5´GCC ACC TAG TGA GCA GTG ACA GCC 3´
H48Q (5’-3’) 5´A GCA GCA GTC TTG GGT CTG GC 3´
D49K (5’-3’) 5’ A GCA GCA TTT ATG GGT CTG GC 3’
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
21
3.3. Digestão Enzimática e Ligação do Gene de hsPLA
2
-IID ao Vetor
pET-3a
Para que haja a ligação unidirecional de um inserto de DNA em um
plasmídeo, os dois devem apresentar extremidades coesivas formadas
através da clivagem pelas mesmas enzimas de restrição. Por isso, tanto o
inserto contendo o gene selvagem e/ou mutante de hsPLA
2
-IID quanto o vetor
pET-3a foram digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Ndel para
posterior subclonagem. A reação de digestão do gene foi realizada em volume
final de 100 L, na presença de tampão 1X (10 mM Tris-acetato, 10 mM
acetato de magnésio e 50 mM de acetato de potássio, pH 7,5), 1 mM de
albumina sérica bovina e 2.5 U de cada uma das enzimas de restrição (BamHI
e NdeI - Promega). A mistura foi incubada por 90 minutos a 37°C, seguida da
inativação enzimática por 15 minutos a 65°C.
A digestão foi aplicada em gel de agarose 2% e a banda
correspondente ao gene da hsPLA
2
-IID selvagem ou mutante foi isolada e
submetida à purificação do gel através do kit de extração de banda de gel
“Clean-up” (Eppendorf). O vetor de expressão pET-3a foi digerido com BamHI
e NdeI em uma reação de volume final de 200 L, na presença de tampão 1X
(10 mM Tris-acetato, 10 mM acetato de magnésio e 50 mM de acetato de
potássio, pH 7.5), 1 mM de albumina sérica bovina e 2,5 U de cada uma das
enzimas de restrição por 90 minutos a 37°C.
A reação de ligação foi feita na proporção molar de 10:1
fragmento/vetor respectivamente, anteriormente digeridos, na presença de 0,5
U de T4 DNA ligase e 1X do tampão apropriado (Tris-HCl 250 mM, MgCl
2
50
mM, ATP 5 mM, DTT (ditiotreitol) 5 mM e 25% peso/volume de
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
22
polietilenoglicol-8000) em um volume final de 10 L. A reação foi incubada por
1 hora a 23°C e o DNA plasmidial ligado foi transformado em E.coli DH5 .
3.4. Transformação em Escherichia coli DH5 Ca
2+
Competente
A transformação bacteriana é o processo de introduzir um vetor,
recombinante ou não, em uma bactéria. No entanto, para permitir a entrada
de DNA plasmidial nas células bacterianas, a bactéria deve apresentar
condições fisiológicas especiais, ou seja, estar competente. A técnica para
torná-las competentes quimicamente envolvem tratamento com soluções
como cloreto de cálcio e mudanças bruscas de temperatura, que alteram a
permeabilidade da parede celular. A preparação de células DH5α
competentes foi feita através do inóculo de algumas células DH5α em meio
LB sólido (10g.L
-1
, 5g.L
-1
, 10g.L
-1
, 1,5% de ágar), para posteriormente serem
incubadas por 12 horas a 37
o
C. Algumas colônias foram inoculadas em 5 mL
de meio LB liquído (10g.L
-1
, 5g.L
-1
, 10g.L
-1
) a 180rpm, 37
o
C por 12 horas.
Todo conteúdo foi transferido para 500mL de meio e incubado a 37
o
C entre 2
a 3 horas, sob agitação de 180 rpm, até atingir a densidade óptica de 0,3 em
600 nm. Em seguida, a cultura foi incubada por 5 minutos no gelo e
centrifugada a 1200 x g, em 4
o
C, por 10 minutos. Após centrifugação, o
sobrenadante foi descartado e o precipitado celular, por leve agitação, foi
ressuspendido em 100 mL do tampão de competência (CaCl
2
60 mM, PIPES
- 1,4-Piperazin-bis-(ethansulfonsado) - 10 mM e glicerol 15%) gelado. A
centrifugação foi repetida e o precipitado celular ressuspendido foi mantido
em gelo por 30 minutos. Após centrifugação a 4°C, 1200 x g por 10 minutos,
o precipitado celular foi ressuspendido em um volume final de 12 mL de
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
23
tampão e as células, agora competentes, distribuídas em alíquotas de 50 µL.
As mesmas foram estocadas a -70ºC até o uso.
Para o processo de transformação bacteriana, em cada tubo de 50 µL
de células DH5 competentes, foram adicionados 20 µL da reação de
ligação, 1,0 µL de 1M MgCl
2
, 0,5 µL de 1M CaCl
2
e 28,5 µL de água estéril. A
mistura final de 100 µL foi mantida em gelo por 20 minutos, e em seguida,
mantida a temperatura ambiente durante 10 minutos. Os íons cálcio
presentes na mistura têm a função de neutralizar as cargas negativas do DNA
e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela mesma
quando as células são transferidas do gelo para a temperatura ambiente. Em
seguida, 900 µL de meio LB líquido foram adicionados em cada tubo, e as
células mantidas a 37°C, sob a agitação de 180 rpm durante 1 hora para
regeneração. Durante o processo de transformação, apenas os plasmídeos,
que se recircularizaram por meio da ligação com o inserto, serão inseridos na
bactéria. Logo, a seleção da bactéria que apresenta o vetor, daquela que não
foi transformada, foi feita pelo plaqueamento de 50 µL da suspensão celular
em meio LB sólido contendo 100 µg.mL
-1
de ampicilina, pois o vetor pET-3a
apresenta resistência a este antibiótico. As bactérias cresceram por 12 horas
a 37°C.
Como alguns vetores nativos podem ter sido transformados, foi
necessária uma seleção das colônias crescidas em meio seletivo. Esta
seleção foi feita através da análise das colônias por PCR utilizando
oligonucleotídeos complementares as extremidades 5’ e 3’ do gene alvo. Em
uma reação composta de tampão de PCR 1X (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM
KCl), oligonucleotídeo de extremidade 5’ PLAG2DN (50 pMol),
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
24
oligonucleotídeo de extremidade 3’ PLAG2DC (50 pMol), MgCl
2
(1mM), dNTP
(2,5 mM), 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água estéril para um
volume final de 50 µl, foi adicionada 5ul de uma colônia diluída em 25ul de
tampão salino. A reação foi incubada em miniciclador nas mesmas condições
descritas para a etapa I da PCR. Apenas as colônias de bactérias que
apresentam vetor recombinante, ou seja, com o gene alvos inseridos
apresentarão uma banda correspondente ao gene de interesse no gel,
enquanto que aquelas colônias com vetores nativos não serão amplificados
por não apresentarem o DNA molde inseridos.
Após a seleção, as colônias identificadas foram inoculadas em 5 mL de
meio LB líquido contendo 100 µg.mL
-1
de ampicilina e mantido a 37°C,
durante 12 horas, sob agitação de 180 rpm, para a propagação e posterior
purificação do DNA plasmidial recombinante
3.5. Extração e Purificação do DNA Plasmidial
O DNA plasmidial das colônias selecionadas foi isolado de acordo com
o protocolo de lise alcalina. De 5 mL de LB líquido inoculados com as colônias
selecionadas, dois foram transferidos para tubos de 1,5 mL e centrifugados a
5000 rpm, 25
o
C por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
ressuspendido até completa homogeneização em 100 µL de solução GET (50
mM de glicose, 10 mM de EDTA pH 8,0; 25 mM Tris-HCl). A lise celular foi
obtida em 200 µL de NaOH 0,2 M e 0,01 M de SDS por 5 minutos seguida da
precipitação do DNA genômico pela adição de 150 µL de acetato de potássio
3M. A amostra foi centrifugada a 16000 x g, em temperatura ambiente, por 5
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
25
minutos e 400 L do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo de
1,5 mL. A adição de 1 mL de etanol 100% e a incubação em gelo seco por 5
minutos permitiu a precipitação da amostra, subseqüentemente centrifugada a
16000 x g, 4
o
C, por 5 minutos. O precipitado foi lavado pela adição de 1mL de
etanol 70%, e o sobrenadante descartado. O excesso de RNA bacteriano foi
eliminado pela incubação do DNA plasmidial em 100 L de RNAse A (200
g.mL
-1
) durante 3 horas, seguida de uma extração com 50 L de fenol
equilibrado (Tris -HCl, pH 8,0) que foi agitada em vortex e subseqüentemente
centrifugada a 16000 x g, 25
o
C por 5 minutos. A fase aquosa contendo o DNA
plasmidial foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL, e o DNA foi
precipitado pela adição de 10% de acetato de sódio 3 M, pH 5,2 e 2X o
volume de etanol 100% gelado. A amostra foi incubada por 5 minutos em gelo
seco e centrifugada a 16000 x g, por 5 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado lavado com 1mL de etanol 70%. Após completa
secagem, o DNA plasmidial purificado foi ressuspendido em 30 µL de TE (10
mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, pH 8) e armazenado a -20
o
C.
3.6. Seqüenciamento Automático
Após a purificação do DNA plasmidial recombinante selvagem e/ou
mutante da hsPLA
2
-IID, realizou-se o seqüenciamento para confirmação do
sucesso do processo de subclonagem. As reações de seqüenciamento foram
feitas de acordo com o kit ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction. Para cada gene mutante selecionado, foi preparada uma
reação com 300 ng de DNA, 4 pMol de oligonucleotídeo de seqüenciamento,
2,5X de tampão de seqüenciamento (Tris 200 mM, MgCl
2
5mM, pH 9,0) e 1
L
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
26
da solução Mix Big Die (deoxinucleosídeos trifosfatos: dATP, dCTP, dITP e
dUTP), terminador A-Dye marcado com dicloro[R6G], terminador C-Dye
marcado com dicloro[ROX], terminador G-Dye marcado com dicloro[R110],
terminador T-Dye marcado com dicloro [TAMRA], AmpliTaq DNA polimerase
com pirofosfatase termoestável), em um volume final de 20 L. O
oligonucleotídeo de seqüenciamento escolhido foi complementar a
extremidade 3’ de cada dos genes seqüenciados.
A reação foi incubada em termociclador nas seguintes condições: 1) 2
minutos a 96ºC; 2) 30 segundos a 96ºC; 3) 15 segundos a 50ºC; 4) 4 minutos
a 60ºC. A partir do ciclo 2, os passos foram repetidos 40 vezes. Em seguida,
as amostras foram transferidas para tubos de 1,5 mL e precipitadas pela
adição de 80 L de isopropanol 75%. A mistura foi incubada por 15 minutos a
temperatura ambiente. Subseqüentemente, as amostras foram centrifugadas
a 16000 x g por 20 minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante
descartado. Após a adição de 1 mL de etanol 70%, a amostra foi novamente
centrifugada e o sobrenadante descartado. As amostras foram armazenadas a
-20ºC após completa secagem. No momento da aplicação em gel, as
amostras foram ressuspendidas em 20 L de tampão Loading 2x formamida
(10X TBE, 90% formamida e 0,5% azul de bromofenol) e aquecidas por 2
minutos a 96ºC. As amostras foram aplicadas em gel de seqüenciamento
padrão 4,25% (18 g uréia, 5,3 mL acrilamida 40%, 0,5 g de resina, 5 mL TBE
10X (10,8 g de trisma base, 35 g de ácido bórico, 9,3 g de EDTA), 250 L de
APS 10% e 35 L de TEMED), monitorizado em aparelho seqüenciador
automático (ABI 377-18, Applied Biosystems) programado para 12 horas de
corrida. As seqüências obtidas foram alinhadas com sua respectiva seqüência
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
27
de DNA nativa no banco de dados e o resultado final apresentado sob a forma
de eletroferograma.
3.7. Expressão em Escherichia coli BL21[DE3]pLysS
.
3.7.1. Preparação de E. coli BL21[DE3]pLysS competente
Células de E. coli BL21 foram plaqueadas em meio HDM sólido (15 g.L
-
1
triptona, 25 g.L
-1
extrato de levedura, 1,5% de ágar, pH 7,5) contendo 34
µg.mL
-1
de cloranfenicol e incubadas a 37ºC durante a noite. No dia seguinte,
em torno de 3-5 colônias foram inoculadas em 5 mL de HDM líquido (15 g.L
-1
triptona, 25 g.L
-1
extrato de levedura, pH 7,5) e incubadas sob agitação a 180
rpm, 37ºC por 12 horas. Todo o conteúdo foi transferido para 500 mL de HDM
na manhã seguinte (diluição 1:100), ficando sob agitação a 180 rpm, 37ºC até
atingir a densidade óptica de 0,3 em 600 nm. A cultura foi transferida para 2
tubos de 250 mL e incubada por 5 minutos no gelo. Após centrifugação a 4°C,
16000 x g por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado de
cada tubo ressuspendido em 100 mL de tampão (CaCl
2
60 mM, PIPES 10 mM
e glicerol 15%). O homogeneizado foi novamente centrifugado por 10 minutos
a 3000 rpm, 4°C e o precipitado ressuspendido em 100 mL de tampão. O
homogeneizado foi incubado em gelo por 30 minutos e a centrifugação
descrita acima repetida. Juntou-se o precipitado originado em cada um dos
tubos e ressuspendeu-se em 12 mL de tampão final. As células competentes
foram distribuídas em alíquotas de 50 µL e estocadas a -70°C.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
28
3.7.2. Transformação para expressão dos vetores recombinantes em
Escherichia coli BL21[DE3]pLysS
Na transformação, em cada tubo de 50 µL de células competentes foram
adicionados 2 µL de DNA plasmidial recombinante (0,1µg.mL
-1
), 1,0 µL de 1M
MgCl
2
, 0,5 µL de 1M CaCl
2
e 46,5 µL de água estéril. A mistura foi mantida no
gelo por 20 minutos e em seguida a temperatura ambiente durante 10
minutos. A cada tubo foram adicionados 900 µL de meio HDM (15 g.L
-1
triptona, 25 g.L
-1
extrato de levedura, pH 7,5) contendo 10 mM de sulfato de
magnésio e 20 mM de glicose para a regeneração celular por 1 hora a 37°C
sob a agitação de 180 rpm. Cerca de 50-100 L das células regeneradas
foram plaqueados em HDM sólido contendo 100 µg.mL
-1
de ampicilina, 34
µg.mL
-1
de cloranfenicol e 10 mM de sulfato de magnésio. A presença de
ampicilina no meio é fundamental, pois seleciona as bactérias que
incorporaram o plasmídeo pET-3a recombinante que apresenta resistência a
este antibiótico. As placas foram mantidas a 37°C durante 12 horas.
3.7.3. Teste de expressão em pequena escala
Para o teste de expressão em pequena escala de hsPLA
2
-IID tipo
selvagem e mutantes, 3 colônias de cada placa de Escherichia coli
BL21[DE3]pLysS transformada com os vetores pET-3a recombinantes foram
inoculadas em 400 mL de meio HDM contendo 100 g.mL
-1
de ampicilina, 34
µg.mL
-1
de cloranfenicol e 10 mM de sulfato de magnésio sob agitação a 180
rpm e 37°C. Após atingirem a fase logarítmica de crescimento (densidade
óptica de 0,6-0,7 em 600nm) a expressão protéica foi induzida com 600 M
de IPTG. Durante aproximadamente 5 horas de indução, 1 mL a cada hora foi
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
29
coletado e centrifugado a 16000 x g por 2 minutos para a análise da
expressão em gel de poliacrilamida. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado ressuspendido em 200 L de tampão de amostra (0,025 mM Tris,
0,192 M Glicina e 0,1% de SDS). As amostras foram aquecidas por 2 minutos
para aumentar o nível de desnaturação e imediatamente aplicadas em SDS-
PAGE a 16%.
3.7.4. Escalonamento da expressão dos vetores recombinantes em
Escherichia coli BL21[DE3]pLysS
Para expressão em grande escala da hsPLA
2
-IID tipo selvagem e
mutantes 4-5 colônias foram inoculadas em 5 mL de meio HDM contendo
ampicilina (100 g.mL
-1
), cloranfenicol (34 g.mL
-1
) e sulfato de magnésio (10
mM) e incubadas durante 12 horas a 37ºC sob agitação de 180 rpm. Na
manhã seguinte, esta cultura foi transferida para tubos de 400 mL de meio
HDM complementado com os mesmos antibióticos e mantida sob agitação a
180 rpm, 37ºC até atingir a densidade óptica de 0,7 em 600 nm (cerca de 3
horas). A cultura foi induzida com 1 mM de IPTG e incubada por 5 horas a
37ºC sob agitação de 200 rpm. Posteriormente, a cultura foi centrifugada a
6000 x g por 10 minutos, o sobrenadante descartado e o precipitado
armazenado a -20ºC até o isolamento dos corpos de inclusão.
3.8. Purificação de hsPLA
2
-IID Recombinante Selvagem e Mutantes
Após a expressão das proteínas recombinantes de hsPLA
2
-IID, as
etapas de isolamento dos corpos de inclusão, enovelamento e purificação
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
30
foram feitas de acordo com protocolo de filtação em gel (WARD, et al., 2001)
modificado.
3.8.1. Isolamento dos corpos de inclusão
Um dos principais problemas da expressão de proteínas heterólogas
em bactérias é o enovelamento incorreto das cadeias polipeptídicas recém
sintetizadas, com a formação de agregados insolúveis ou corpos de inclusão
que são biologicamente inativos. Devido ao alto conteúdo de pontes
dissulfeto, as hsPLA
2
-IID recombinante expressas são insolúveis, levando à
formação desses agregados, cujo isolamento representou o primeiro passo
da purificação das proteínas. O isolamento é necessário, pois as etapas
subseqüentes de enovelamento são fortemente influenciadas pela presença
de lipídios e ácidos nucléicos.
A purificação dos corpos de inclusão da hsPLA
2
-IID seguiu-se de
acordo com protocolo já estabelecido (OTHMAN, et al., 1996). As células
derivadas de 400 mL de cultura foram ressuspendidas em Tris-Cl 50 mM pH
8.0, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,5 mM de PMSF, num volume final de
40 mL. Triton X-100 e deoxicolato foram adicionados a 0,4% na concentração
final e a mistura agitada por 20 minutos a 4ºC. As células foram sonicadas em
aparelho Sonic dismembrator (Fisher scientific). Depois da centrifugação a
13000 x g por 10 minutos, o processo foi repetido aumentando a
concentração final de TRITON X-100 e deoxicolato para 0,8%. O sedimento
obtido depois da centrifugação foi lavado e sonicado com 20mL de tampão
contendo 1% de TRITON-X100 e sem a adição de detergentes. Em seguida
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
31
fez-se a centrifugação do conteúdo em microtubos de 2mL resultando nos
corpos de inclusão para o início do enovelamento.
3.8.2. Modificação química e enovelamento das proteínas recombinantes
expressas em
E. coli BL21[DE3]pLysS
A dissolução dos agregados protéicos formados durante a expressão
de hsPLA
2
-IID em E.coli BL21[DE3]pLysS é feita através do uso de agentes
químicos, e este passo é extremamente essencial para a obtenção dessas
proteínas.
Cada corpo de inclusão foi incubado por cerca de 1 hora em 500 L de
uma solução contendo 4,8 M de tiocianato de guanidina e NTSB (disódio 2-
nitro-5-(tiosulfo)-benzoato). O tiocianato de guanidina é um agente
desnaturante que rompe a camada de solvatação existente entre a solução e
a proteína, desestabilizando as interações hidrofóbicas e conseqüentemente
expondo as pontes dissulfeto. Uma vez expostas, as pontes de dissulfeto
sofrem redução através dos grupos sulfito do NTSB. A adição de um grupo
SO
3-
as cisteínas aumenta a solubilidade das mesmas. O esquema é ilustrado
na FIGURA 5.
FIGURA 5: Esquema ilustrativo da modificação química de proteínas sob a forma de
corpos de inclusão
S-S
S-S
S-S
TIOCIANATO DE GUANIDINA
S-SO
3
-
NO
2
COO
-
NTSB
S
-
NO
2
COO
-
NTB
S-SO
3
-
S-SO
3
-
(NH
2
)
2
C=H.HNCS
S-S
S-S
S-S
S-S
S-S
S-S
TIOCIANATO DE GUANIDINA
S-SO
3
-
NO
2
COO
-
S-SO
3
-
NO
2
COO
-
NTSB
S
-
NO
2
COO
-
NTB
S
-
NO
2
COO
-
S
-
NO
2
COO
-
NTB
S-SO
3
-
S-SO
3
-
(NH
2
)
2
C=H.HNCS
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
32
Após a modificação química, a amostra foi submetida a uma coluna de
filtração em gel (2 x 5 cm) contendo resina Bio-Gel P-6, 200-400 mesh,
equilibrada com 2,5 M de hidrocloreto de guanidina, 20 mM de Tris e 2 mM de
EDTA, pH 8,0. Esta etapa separa a proteína modificada, retirando o excesso
de NTSB, e reduz a quantidade de agente desnaturante de 4,8 M para 2,5 M.
A proteína eluída em cerca de 1,5 mL, serviu como material inicial para o
processo de enovelamento.
A cada eluído foram adicionados 150ul do tampão 20 mM de Tris pH
8,0, 10 mM de cistína, 80 mM de cisteína, e mantidos durante 24 horas a
temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, as amostras foram
diluídas com o tampão de enovelamento (20mM de Tris pH 7,0 1mM cistina e
8mM de cisteína) até atingirem uma concentração de 1,5M de hidrocloreto de
guanidina e deixadas sob repouso 24 horas. Outra diluição foi realizada com o
tampão de enovelamento (20mM de Tris pH 7,0 1mM cistina e 8mM de
cisteína) até atingirem uma concentração de 1,0M de hidrocloreto de
guanidina e deixadas sob agitação suave por 24 horas Ao fim do processo
foram feitas duas diálises seguidas por 24 horas contra tampão de
enovelamento para retirada de todo agente desnaturante.
3.8.3. Purificação das proteínas recombinantes selvagem e mutantes de
hsPLA
2
-IID
As proteínas hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes são proteínas
básicas e portanto foram purificadas por cromatografia de troca catiônica.
Utilizou-se uma coluna de dimensões 2X10cm previamente empacotada com
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
33
resina SOURCE 15S (Amersham-pharmacia). Essa resina é fortemente
catiônica e sua matriz apresenta grupos metil-sulfonato. O mecanismo de
separação por cromatografia de troca catiônica é baseado no grau de
afinidade que substâncias básicas diferentes apresentam pela matriz, devido
a diferenças na carga, densidade e distribuição das mesmas sobre a
superfície molecular. A coluna foi equilibrada com 20 mM de Tris-Cl pH 7,5 e a
proteína eluída em um gradiente linear de NaCl 1M, com fluxo de 1 mL.min
-1
.
A cromatografia foi realizada em HPLC (Shimadzu) previamente programado
para um gradiente de 0 a 100% do tampão salino em 20 minutos.
3.9. Dicroísmo Circular
Dicroísmo circular (CD) é a técnica ideal para o estudo de moléculas
quirais em solução, pois é muito sensível à assimetria do sistema. O CD é por
definição a diferença em absorção, A, da luz polarizada circularmente (CPL) à
direita e à esquerda:
CD = A - A
r
O sinal de CD é observado em comprimentos de onda onde a amostra
absorve fótons, podendo ser positivo ou negativo dependendo da molécula e
da transição eletrônica que está sendo estudada.
As aplicações mais comuns da técnica em bioquímica incluem a
determinação da estrutura de macromoléculas biológicas. A avaliação da
estrutura secundária das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes
foi realizada em espectropolarímetro Jasco 810, em comprimento de onda de
200 a 250 nm. Como cada proteína apresenta um padrão característico de
sinal de CD (HOLZWARTH E DOTY, 1965), foram retirados espectros de
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
34
proteína nativa da mesma família e comparados aos espectros das proteínas
recombinantes de hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes para avaliar se
estrutura secundária das proteínas está mantida. Para cada medida, utilizou-
se 100 L de proteína de concentração desconhecida em tampão Hepes 20
mM, pH 7,0. Foi utilizada cubeta de quartzo 3mm e o sinal de CD obtido foi
resultado de uma média de três medidas de cada amostra. O sinal obtido da
análise apenas do tampão foi subtraído de todas as amostras. O valor de
elipticidade ( ) em 222 nm foi anotado e a concentração foi calculada de
acordo com uma curva padrão de espectros de CD com concentrações
crescentes de um padrão de hsPLA
2
. A amplitude do sinal de absorção em
222 nm é diretamente proporcional a quantidade de proteína utilizada. Os
valores de elipticidade em 222 nm foram plotados contra cada concentração
da curva padrão e o seguinte cálculo foi utilizado para determinar a
concentração de cada amostra, de acordo com os parâmetros obtidos de um
fit linear da curva padrão:
3.10. Teste de Atividade Enzimática Através de Indicador de Ácido Graxo
Livre
ADIFAB (proteína de ligação de ácido graxo intestinal marcado com
Acrilodan) é um indicador fluorescente para a medida da concentração de
ácidos graxos livres. Como já sugerido pelo nome, o indicador é um
conjugado composto por uma sonda fluorescente sensível a polaridade
(acrilodan) e pela proteína de ligação de ácido graxo intestinal (I-FABP), uma
proteína de baixo peso molecular (15 kDa) com alta afinidade para o ácido
[proteína] = (
θ
θθ
θ
222
– 0,70119)/ -0,0857 x fator de diluição
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
35
graxo (RICHIERI, et al., 1992, RICHIERI, et al., 1999). A detecção do ácido
graxo pelo ADIFAB é baseada na mudança de posição do fluoróforo acrilodan
em relação à bolsa de ligação apolar da proteína I-FABP quando ela torna-se
ocupada pelo ácido graxo. Quanto maior a concentração de ácido graxo,
menor a intensidade de fluorescência em 425 nm e maior em 505 nm
(FIGURA 6), devido a um deslocamento do espectro para maiores
comprimentos de onda. A mudança espectral do ADIFAB permite a
determinação da concentração de ácidos graxos através da razão da
intensidade de fluorescência do indicador ligado e desligado medido em 505 e
425 nm, respectivamente.
A solução estoque de ADIFAB foi preparada pela dissolução de uma
unidade de 200 µg de ADIFAB (Sigma) em 1,0 mL de tampão 50 mM de Tris,
1 mM de EGTA, 0,05% de azida, pH 8.0 (solução estoque de 13 µM). Para o
ensaio de volume final de 1 mL foram utilizados 15 µL de ADIFAB (estoque
200 µg.mL
-1
), 6 µL (estoque 5 mg.mL
-1
) de vesículas unilamelares grandes de
90% de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC – Sigma PM:786,1) e 10% de dioleoil
fosfatidilglicerol (DOPG – Sigma PM: 797) 1 µL de CaCl
2
, proteína e tampão
Hepes 20 mM, NaCl 20 mM para completar o volume. As medidas foram feitas
em espectrofluorímetro Spectronic SLM 8100C a 25ºC, utilizando cubeta de
quartzo de caminho óptico de 1 cm sob agitação magnética. O aparelho foi
programado para medir a razão entre as intensidades de fluorescência em
505 e 425 nm com excitação de ADIFAB em 385 nm. As amostras contendo
tampão, ADIFAB, vesículas lipídicas e 1mM Ca
2+
foram pré-incubada por 15
minutos e em seguida, a razão entre as intensidades de fluorescência em 505
e 425 nm foi monitorada por 2000 segundos. Após 500 segundos de ensaio,
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
36
foram adicionados 0,2 µg.mL
-1
da hsPLA
2
-IID tipo selvagem na presença de 1
mM de CaCl
2
ou 1 mM de EGTA. As proteínas mutadas no sítio ativo, H48Q,
D49K e G30S foram ensaiadas na concentração de 0,5 µg.mL
-1
com 1mM
CaCl
2
ou 1 mM de EGTA.
FIGURA 6. Titulação monitorada por fluorescência do ADIFAB com ácido oléico a 25°C.
A concentração de indicador é 0,2 µM em 10 mM Tris-Cl, 0, 15 M NaCl, 1 mM de EGTA, pH
8.0. O espectro representante da maior concentração de ácido oléico titulada está
representado por uma linha pontilhada
A atividade específica enzimática é diretamente proporcional à
quantidade de ácido graxo liberada pela hidrólise dos fosfolipídios
DOPC:DOPG, na razão molar de 9:1 respectivamente. A concentração de
ácidos graxos liberados foi calculada de acordo com RICHIERI et al, 1999.
[ácido graxo]= K
d
x 19,5 x (R – Ro)/(11,5 – R)
onde, K
d
para os ácidos graxos liberados é de 0,28 (RICHIERI, et al., 1995)),
Ro é a razão 505/425nm da intensidade de fluorescência sem ácido graxo, R
é a razão quando o ADIFAB está ligado ao ácido graxo.
Comprimento de onda (nm)
In
t
e
n
s
i
d
a
d
e
d
e
flu
o
r
e
s
c
ê
n
c
ia
re
l
a
tiv
a
Comprimento de onda (nm)
In
t
e
n
s
i
d
a
d
e
d
e
flu
o
r
e
s
c
ê
n
c
ia
re
l
a
tiv
a
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
37
3.11. Atividade de Liberação de Calceina Encapsulada em Lipossomos
3.11.1. Preparação de lipossomos
Os lipossomos foram preparados pela técnica de evaporação de
reverso de fase (SZOKA E PAPAHADJOPOULOS, 1978). Esta técnica produz
vesículas com capacidade de encapsular altas porcentagens de solução
aquosa, além de permitir a variação da composição fosfolipídica da bicamada
artificial e da razão entre eles. O princípio do método (FIGURA 7) é baseado
na encapsulação do material aquoso em micelas invertidas na presença de
solvente orgânico. A remoção subseqüente do solvente orgânico resulta na
encapsulação da solução de interesse. Neste estudo, foi utilizado lipossomos
90% de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC – Sigma PM:786,1) e 10% de dioleoil
fosfatidilglicerol (DOPG – Sigma PM: 797). Uma mistura de 5 mg.mL
-1
dos
dois lipídios nas devidas proporções foi solubilizada em éter e
subseqüentemente colocada em um evaporador rotativo para secagem.
Posteriormente os lipídios foram resolubilizados em 1 mL de éter mais 1 mL
de tampão de encapsulação (tampão 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH
7,0, calceína 20 mM). Sonicou-se (Sonicator XL- Misonix) no gelo por 2
minutos na presença de tampão para formar uma emulsão de fase reversa, na
qual o tampão foi encapsulado dentro de micelas reversas numa suspensão
em éter. A fusão dessas micelas foi induzida pela evaporação lenta do éter
em evaporador rotativo (Tecnal, mínimo duas horas) produzindo lipossomos
unilamelares de diâmetro 1→100 µm.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
38
Após a passagem dos lipossomos por membranas de policarbonato
(400 nm), produzindo uma população de lipossomos homogênia e de diâmetro
definido, uma coluna de filtração em gel (Sephadex G-25, 1 x 10cm) foi usada
para separar os lipossomos intactos contendo solução encapsulada, da
calceína livre. Como a filtração em gel dilui a solução de lipossomos, a
dosagem do fosfato das amostras de lipossomos é necessária.
FIGURA 7: Diagrama de formação de lipossomos pelo método de evaporação de fase
reversa. Os lipídios são dissolvidos em solventes apropriados e ficam solúveis (1), após a
fixação na superfície (2) eles formam as micelas em fase reversa (3). Com a sonicação, elas
formam os lipossomos pela fusão entre as micelas (4, 5 e 6).
3.11.2 Dosagem de fosfato dos fosfolipídios
A dosagem de fosfato e permite a avaliação na faixa de 0,1
a 10 µg.ml
-1
de PO
4
. A amostra de lipossomo (100 µL) foi mantida a 300
o
C (banho de
areia) em ácido perclórico 70% por 5 minutos. Após o resfriamento, foram
adicionados 4,2 mL de água, 200 µL de molibidato de amônio (Merck) 5%
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
39
(Sigma) e 200 µL de diaminofenol (Sigma) 1% em bissulfito de sódio 20%
(Sigma). A solução foi agitada e deixada em banho de água fervente por 7
minutos. Leu-se a absorbância em 830 nm em cubeta de quartzo de 1cm de
caminho óptico em espectrofotômetro Hitach U-2000. A curva padrão foi feita
com amostras contendo 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µg de Na
2
HPO
4
.
3.11.3. Liberação de calceína encapsulada em lipossomos
A calceína (PM = 622,5 - Sigma) é um fluoróforo auto-supressor, com
comprimentos de excitação (λex= 490 nm) e emissão (λem = 520 nm) muito
próximos, permitindo que a emissão de uma molécula possa ser usada para a
excitação de outra. Em concentrações altas (≥ 25mM), a luz fluorescente
emitida por uma amostra de calceína é baixa, porém em soluções diluídas a
intensidade da luz aumenta, pois não ocorre auto-supressão. Dentro do
lipossomo, a calceína encontra-se em alta concentração (25 mM), por isso a
intensidade de emissão de fluorescência é baixa. Quando ocorre a
danificação da membrana lipossomal, a calceína encapsulada é liberada,
diluindo-se na cubeta, aumentando em cerca de 10 vezes a intensidade de
fuorescência emitida.
Os experimentos foram realizados em tampão 20 mM HEPES (Sigma)
com 150 mM de NaCl (Merck) em pH 7,0 com concentração fixa de 1 µg.ml
-1
de hsPLA
2
-IID tipo selvegem e mutantes. A quantidade de proteína e
lipossomo corresponde à proporção de uma molécula de hsPLA
2
-IID para 200
moléculas de lipídio. O lipossomo usado foi de 400 nm de diâmetro e as
medidas feitas em espectrofluorímetro Spectronic SLM 8100C a 25
o
C,
utilizando-se cubeta de quartzo de caminho óptico de 1cm, sob agitação. A
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
40
excitação foi em 480 nm e a emissão em 520 nm, sendo a abertura de
excitação e emissão de 4 nm e a voltagem fotomultiplicadora de 600V. O
detergente Triton X-100 foi adicionado (0,1%) no final do processo de
liberação para se obter a intensidade de fluorescência máxima de liberação
da calceína encapsulada. A FIGURA 8 mostra um esquema ilustrativo do
ensaio de liberação de calceína encapsulada em lipossomos.
.
FIGURA 8: Esquema ilustrativo do teste de liberação de calceína encapsulada em
lipossomo. (A) Os comprimentos de onda de excitação e emissão da molécula de calceína
são muito próximos, por isso ocorre auto-supressão; (B) Perfil da liberação de calceína
provocada pela adição da proteína em 20 segundos e da liberação máxima de calceína
provocada pela adição de TRITON X-100 em 150 segundos em um total de 170 segundos
3.12. Efeito Bactericida
O efeito bactericida de hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes foi
avaliado em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. O teste realizado
com bactérias Gram negativas, Escherichia coli (K12) foi realizado segundo
A
B
% LIBERAÇÃO: (B-A)/(C-A)* 100
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
41
protocolo já estabelecido (PÁRAMO, et al., 1998). Em torno de 3-4 colônias de
uma placa fresca foram inoculadas em 5 mL de meio LB líquido e cresceram
por 12 horas sob agitação. Um millilitro dessa cultura foi inoculado em 50 mL
de LB líquido e a cultura agitada a 180 rpm, 37°C até atingir densidade óptica
de 0,7 em 660 nm. As bactérias foram diluídas em tampão fosfato de sódio
0,01 M pH 7.4 contendo 1% de triptona e ajustadas para 4X10
6
unidades
formadoras de colônias (CFU).mL
-1
, para determinação da atividade
bactericida. As proteínas foram incubadas com 4X10
5
células por 120 minutos
a 37ºC. Em seguida foi realizada uma diluição serial, e as bactérias dispersas
em LB sólido.
O teste realizado com bactérias Gram-positivas, Micrococcus luteus (M.
lysodeikticus - ATCC 9341), foi feito segundo o protocolo descrito por BEERS
e colaboradores (2002). Em torno de 3-4 colônias de uma placa fresca
cresceram por 12 horas a 37°C em 5 mL de meio LB líquido. Um mL dessa
cultura foi inoculado em 50 mL de LB líquido e a cultura agitada a 180 rpm,
37°C até atingir densidade óptica de 0,45 em 600 nm. A cultura foi
centrifugada a 3500 x g por 10 minutos e o sedimento ressuspendido em 10
mL de tampão fosfato de sódio 0,01 M pH 7,4 contendo 1% de triptona, sendo
ajustado para 2X10
7
unidades formadoras de colônias (CFU).mL
-1
para
determinação da atividade bactericida. As proteínas foram incubadas com
2X10
6
células por 3 horas a 37°C. Em seguida, foi feita uma diluição serial e
as bactérias foram dispersas em LB sólido. A sobrevida das células foi
analisada após 18 horas de incubação, através da contagem do número de
unidades formadores de colônia (UFC) por placa de cultura.
_____________________________________________________________MATERIAIS E MÉTODOS
42
FIGURA 9: Esquema ilustrativo do ensaio bactericida. Considere tampão como controle
negativo experimental (CFU = 100%). (1) Linhagem Gram-positiva, (2) Linhagem Gram-
negativa.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
43
4. RESULTADOS
4.1. Subclonagem de hsPLA
2
-IID Selvagem
Um fragmento de 443pb foi obtido após uma reação de PCR
contendo 2 sítios de restrição delimitando a região codificadora de hsPLA
2
-IID,
NdeI na extremidade 5´e BamHI na extremidade 3´. A digestão do fragmento
com estas enzimas para posterior subclonagem em vetor pET-3a resultou em
uma banda de aproximadamente 431 pares de bases como mostra a FIGURA
10
Apesar de o gene ter cerca de 370 pares de bases, o fragmento isolado
foi de 431pb, porque o sítio de restrição de ambas enzimas utilizadas na
digestão contém alguns pares de bases da seqüência do vetor tanto na
extremidade 3’, quanto na extremidade 5’. O vetor pET-3a utilizado para a
subclonagem também foi digerido com as enzimas de restrição NdeI/BamHI
(FIGURA 11).
FIGURA 10: Análise eletroforética do gene da hsPLA
2
-IID. (M) marcador de peso
molecular de DNA de 1 kb (Invitrogen). (1) produto de 431pb da digestão enzimática NdeI
/BamHI do fragmento originado na reação da PCR. (2) fragmento amplificado de 443pb obtido
após uma reação de PCR contendo 2 sítios de restrição delimitando a região gênica de
hsPLA
2
-IID.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
44
FIGURA 11: Análise eletroforética da digestão NdeI/BamHI do vetor pET-3a. (M)
marcador de peso molecular de 1 kb; (1) pET-3a sem digestão; (2) pET-3a + NdeI; (3) pET-
3a + NdeI /BamHI.
O vetor pET-3a contendo o inserto foi transformado em bactérias
DH5α, selecionadas pela presença de ampicilina no meio de cultura. Foi feita
uma seleção das colônias obtidas através da digestão NdeI/BamHI para
confirmação da presença do gene no vetor. A região codificadora de hsPLA
2
-
IID foi seqüenciada com oligonucleotídeos complementares ao vetor.
4.2. Mutagênese Sítio-Dirigida de hsPLA
2
-IID Através da Reação em
Cadeia de Polimerase
Todas as proteínas recombinantes mutantes propostas para hsPLA
2
-IID
foram obtidas pelo método de mutagênese sítio-dirigida através da reação em
cadeia de polimerase (PCR). A FIGURA 12.A mostra o fragmento obtido na
_______________________________________________________________________RESULTADOS
45
etapa I da reação de PCR. O fragmento I é originado da extensão do
oligonucleotídeo mutagênico e o oligonucleotídeo EXT1 (que delimita a
extremidade 5´ do fragmento de interesse), tendo como molde o gene de
hsPLA
2
-IID, subclonado em pet-3a. A diferença de tamanho observada entre
os fragmentos amplificados na reação I corresponde ao tamanho baseado na
posição de inserção do oligonucleotídeo mutagênico, ou seja quanto mais
próxima a inserção estiver da extremidade do gene, menor o tamanho do
fragmento sintetizado. Os fragmentos mutados apresentaram o tamanho
esperado após a etapa I da reação de PCR. Após a purificação e
quantificação do fragmento I, 1pmol foi utilizado na reação II, de extensão. Na
terceira etapa, o fragmento II final foi amplificado, utilizando-se os
oligonucleotídeos EXT3, que delimita a extremidade 5’, e PLAG2DC a
extremidade 3’. Como o oligonucleotídeo EXT3 é complementar a uma
pequena seqüência de EXT1, o anelamento só ocorre se EXT1 tiver sido
incorporado na etapa I, selecionando-se desta maneira a fita de DNA mutada.
A FIGURA 12.B mostra o resultado da terceira etapa da reação de PCR. O
fragmento, depois de estendido e amplificado, apresenta em torno de 535
pares de bases, o que corresponde ao número de pares de bases delimitados
pelos oligonucleotídeos EXT1 e PLAG2DC.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
46
FIGURA 12: Análise eletroforética das etapas I e III da reação em cadeia de polimerase.
(A) Etapa I da reação de PCR, representada pelos fragmentos H48Q (254 pb), D49K (254 pb)
3 G30S (202pb) do numero 1 ao 3 respectivamente. (B) Etapa III da reação, representada
pelos mesmos fragmentos citados acima. (M) Marcador de peso molecular de DNA de 1kb
plus (Invitrogen).
4.3. Subclonagem dos Genes de hsPLA
2
-IID Mutantes
O fragmento de 535 pares de bases, obtido após as três etapas da
reação de PCR apresenta 2 sítios de restrição delimitando a região
codificadora de hsPLA
2
-IID, NdeI na extremidade 5´e BamHI na extremidade
3´. A digestão do fragmento com estas enzimas para posterior subclonagem
em vetor pET-3a, resultou em uma banda de aproximadamente 431 pares de
bases como mostrado na FIGURA 13. Apesar do gene ter cerca de 378 pares
de bases, o fragmento isolado foi de 431 pb, porque o sítio de restrição de
ambas enzimas utilizadas na digestão contém alguns pares de bases da
seqüência do vetor tanto na extremidade 3’, quanto na extremidade 5’.
M 1 2 3 M 1 2 3
B
A
_______________________________________________________________________RESULTADOS
47
O vetor pET-3a utilizado para a subclonagem também foi digerido com
as enzimas de restrição NdeI/BamHI para a inserção dos fragmentos
mutantes como mostrado na FIGURA 14.
.
FIGURA 13: Análise eletroforética dos produtos da digestão enzimática NdeI/BamHI dos
fragmentos originado na reação III da PCR. (M) marcador de peso molecular de DNA de 1
kb (Invitrogen) e (1-3) fragmentos H48Q, D49K e G30S respectivamente, após a digestão
com as enzimas de restrição, contendo cerca de 431 pares de bases.
FIGURA 14: Análise eletroforética da subclonagem dos fragmentos mutados no vetor
pET-3a (M) marcador de peso molecular de 1 kb (Invitrogen); (1) pET-3a sem digestão; (2)
pET-3a + NdeI+BamHI; (3) pET-3a + fragmento H48Q (4) pET-3a + fragmento D49K (5) pET-
3a + fragmento G30S.
M 1 2 3
M
1
2 3 4
5
_______________________________________________________________________RESULTADOS
48
O vetor pET-3a contendo o inserto foi transformado em bactérias
DH5α, selecionadas pela presença de ampicilina no meio de cultura. Foi feita
uma seleção das colônias obtidas através de um PCR de colônias para
confirmação da presença do gene no vetor como mostrado na FIGURA 15.
FIGURA 15: Análise eletroforética de PCR de colônias obtidas após a transformação em
E. coli DH5α
αα
α competente. (1) (M) marcador de peso molecular de 1OO pb (Fermentas) (1-
12) DNA plasmidial selecionado do total de transformantes. Os vetores 1, 4, 6, 7 e 12 não
apresentaram o gene, pois não possuem a banda correspondente ao DNA amplificado
O gene de hsPLA
2
-IID foi seqüenciado com um oligonucleotídeo
complementar a extremidade 3’ do gene. Todas as seqüências obtidas foram
alinhadas com a seqüência gênica de hsPLA
2
-IID tipo selvagem presente no
Geneban. O resultado do alinhamento mostrou que nenhuma das mutações
obtidas tinha substituições indesejáveis em outras regiões da seqüência de
hsPLA
2
-IID. A FIGURA 16 mostra a seqüência da fita codificadora de DNA
dos fragmentos mutados obtidos.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1000pb
500pb
100pb
_______________________________________________________________________RESULTADOS
49
FIGURA 16. Eletroferograma mostrando a seqüência de DNA da fita complementar do
gene de hsPLA
2
-IID. (A) seqüência de DNA da região da proteína tipo selvagem e a mesma
região contendo a mutação G30S. (B) seqüência de DNA da região da proteína tipo selvagem
e a mesma região contendo a mutação D49K. (C) seqüência de DNA da região da proteína
tipo selvagem e a mesma região contendo a mutação H48Q. A seqüência nucleotídica
sublinhada representa a trinca nucleotídica mutada que corresponde ao novo aminoácido.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
50
4.4. Expressão das Proteínas Recombinantes de hsPLA
2
-IID
O plasmídio pET-3a contendo o gene da hsPLA
2
-IID tipo selvagem ou
mutantes foi transformado em células de E. coli da linhagem BL21, bactérias
capazes de expressar a proteína recombinante quando induzidas com IPTG.
A FIGURA 17 mostra um gel de poliacrilamida da expressão da hsPLA
2
-IID
tipo selvagem em função do tempo. A análise foi feita através da coleta de
alíquotas com intervalos de uma hora durante 5 horas. Após 5 horas de
indução, uma banda intensa em torno de 14 kDa, correspondente à proteína,
foi visualizada, a qual não estava presente no controle não induzido. A
FIGURA 18 mostra o resultado da expressão após 5 horas de indução das
três hsPLA
2
-IID mutantes.
FIGURA 17: Expressão da hsPLA
2
-IID recombinante em E. coli BL21. (M) marcador de
peso molecular (Benchmark protein ladder LMW- Amersham Pharmacia – fosforilase b:
97000, albumina: 66000, ovoalbumina: 45000, Anidrase Carbônica: 30000, α-Lactalbumina:
14300); (N) controle negativo e (1-5) hsPLA
2
-IID no intervalo de 1 a 5 horas, respectivamente.
As demais bandas correspondem às proteínas expressas pela E.coli.
14,3kDa
30kDa
45kDa
66kDa
97kDa
MN 1 2 3 4 5
_______________________________________________________________________RESULTADOS
51
.
FIGURA 18: Expressão das proteínas recombinantes mutantes de hsPLA
2
-IID em E. coli
BL21 após 5 horas de indução com IPTG. (M): marcador de peso molecular (Benchmark
protein ladder LMW- Amersham Pharmacia – fosforilase b: 97000, albumina: 66000,
ovoalbumina: 45000, anidrase carbônica: 30000, α-Lactalbumina: 14300 (N) controle
negativo realizado com vetor pET-3a induzido. (2-4) hsPLA
2
-IID mutante G30S, D49K e
H48Q, respectivamente
4.5. Enovelamento e Purificação das Proteínas Recombinantes de
hsPLA
2
-IID
Um dos principais problemas da expressão de proteínas heterólogas
em bactérias é o enovelamento incorreto das cadeias polipeptídicas recém
sintetizadas, com a formação de agregados insolúveis ou corpos de inclusão
O protocolo de isolamento dos corpos de inclusão para a hsPLA
2
-IID
recombinante foi realizado com sucesso, uma vez que esta técnica se
encontra estabelecida em nosso laboratório para o tratamento da hsPLA
2
-IIA.
Após o isolamento seguiu-se com as etapas de enovelamento, e purificação
por troca catiônica que foram primeiramente executadas de acordo com o
protocolo de WARD e colaboradores (2001)
FIGURA 19 mostra que o perfil de eluição da hsPLA
2
-IID apresentou
baixa resolução e um baixo rendimento.
N
2
3
4
M
97
66
45
30
14,3
_______________________________________________________________________RESULTADOS
52
0 5 10 15 20 25
-0,000
0,000
0,000
0,001
0,001
0,002
Absorbância (280nm)
Tem po (min)
FIGURA 19: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID renovelada segundo Ward e
colaboradores e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. Os picos mal
definidos correspondem às formas mal enoveladas da hsPLA
2
gIID durante o processo de
enovelamento e a fraca interação da proteína na resina da coluna de purificação.
Diante da dificuldade em obter um rendimento razoável, devido à
grande quantidade de precipitado ao longo do enovelamento e ao baixo
rendimento do HPLC algumas modificações tornaram-se necessárias.
A primeira modificação a ser feita teve o intuito de aumentar o
rendimento de proteína nativa minimizando a precipitação durante a primeira
etapa do enovelamento (pré-incubação com tampão de oxidação/redução).
Para isso as concentrações de cisteína e cistina foram alteradas de 0,8mM e
0,1mM para 8 e 1 mM respectivamente e o tempo de reação para 24 horas.
Entretanto diante da dificuldade em um espectro de dicroísmo circular com os
decaimentos bem definidos fez-se necessário investigar se durante o
_______________________________________________________________________RESULTADOS
53
0 2 4 6 8 10 12 14
0,000
0,004
0,008
0,012
0,016
0,020
0,024
Absorbância (280nm)
Tem po (minuto)
enovelamento e a purificação por troca catiônica estava ocorrendo seleção de
alguma isoforma mal enovelada. Inicialmente, no protocolo de purificação
o gradiente linear de 0 a 100% de tampão salino 2,5M foi substituído por um
gradiente suave e com tampão salino 1,5 M.
A FIGURA 20 mostra que o perfil de eluição da hsPLA
2
-IID apresentou
início de separação das isoformas não enoveladas. A FIGURA 21 mostra o
espectro de dicroísmo circular da proteína quando não enovelada
corretamente.
FIGURA 20: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
–IID renovelada com alteração do
estado de oxidação e redução do tampão de pré incubação e purificada em coluna de
troca catiônica Source 15S.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
54
200 210 220 230 240 250
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
(θ) mdeg.cm
2
.dmol
-1
comprimento de onda (nm)
FIGURA 21: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA
2
-IID não
enovelada corretamente
Diante deste resultado modificações constantes foram feitas no
protocolo de enovelamento a fim de selecionar somente formas enoveladas
corretamente e permitindo que formas mal enoveladas sejam eliminadas
durante o processo.
Após várias tentativas de pouca melhora, o enovelamento feito em
coluna de filtração em gel foi substituído por enovelamento em diluição
seguido de diálise para evitar que o gel permita que proteína não nativa
permaneça solúvel e comprometa o rendimento final de proteína nativa. A
partir disso obteve-se o perfil de eluição mostrado na FIGURA 22 com melhor
separação de isoformas não enoveladas corretamente.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
55
-2 0 2 4 6 8 10 12 14
0,000
0,004
0,008
0,012
0,016
0,020
0,024
Absorbância (280nm)
Tem po (m inuto )
FIGURA 22: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID renovelada por diluição
seguida de diálise e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S
Modificações continuaram a ser feitas com intuito de aperfeiçoar ainda
mais o enovelamento e chegar ao protocolo estabelecido e referido na
metodologia. A FIGURA 23 representa o resultado das modificações no
protocolo.
FIGURA 23: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
–IID renovelada segundo
protocolo estabelecido e purificada em coluna de troca catiônica Source 15S. Os
eluídos 1 e 3 correspondem às formas mal enoveladas da hsPLA
2
-IID durante o processo de
enovelamento e o eluído 2 corresponde à forma nativa da proteína
1
2
3
-2 0 2 4 6 8 10 12 14
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
Absorbância (280nm)
Tem po (m inuto)
_______________________________________________________________________RESULTADOS
56
-2 0 2 4 6 8 1 0 12 14
0 ,000
0 ,005
0 ,010
0 ,015
0 ,020
0 ,025
0 ,030
0 ,035
0 ,040
Absorbância (280nm)
T e m p o (m in u to )
h sP L A
2
-IID S elv a ge m
h sP L A
2
-IID H 4 8 Q
h sP L A
2
-IID G 3 0 S
h sP L A
2
-IID D 4 9 K
O mesmo protocolo de enovelamento e purificação em HPLC da
proteína tipo selvagem foi usado para as proteínas mutantes. O perfil de
eluição é mostrado na FIGURA 24. As proteínas obtidas em purificação de
acordo com FIGURA 24 foram usadas em testes de atividade catalítica e
danificação de membranas artificiais e biológicas.
FIGURA 24: Cromatograma da purificação da hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes em
coluna de troca catiônica Source 15S. O mesmo perfil de eluição é apresentado tanto para
hsPLA
2
-IID recombinante tipo selvagem quanto para as proteínas recombinantes mutantes.
4.6. Dicroísmo Circular
Para avaliar a estrutura secundária mediu-se o espectro de CD da
proteína heteróloga na região UV-distante (200-250nm). Proteínas ricas em α-
hélices apresentam espectro de CD característico com valores mínimos em
208 e 222nm e máximo em 194nm. Esse padrão de espectro foi encontrado
tanto na BthTX-I quanto na hsPLA
2
-IIA, que sabidamente são proteínas ricas
_______________________________________________________________________RESULTADOS
57
190 200 210 220 230 240 250
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
comprimento de onda (nm)
(θ) mdeg.cm
2
.dmol
-1
hsPLA
2
-IID G30S
hsPLA
2
-IID H48Q
hsPLA
2
-IID Selvagem
hsPLA
2
-IID D49KK
em α-hélices e estudadas em nosso laboratório. As proteínas recombinantes
mutantes de hsPLA
2
-IID apresentou espectro de CD indistinguível daquele
apresentado por hsPLA
2
-IID selvagem, ou seja, as mutações inseridas não
causaram nenhuma mudança significativa na conformação secundária da
cadeia polipeptídica dessas proteínas. A FIGURA 25 mostra o espectro de CD
das hsPLA
2
-IID mutantes e tipo.
FIGURA 25: Espectro de dicroísmo circular na região UV-distante de hsPLA
2
-IID tipo
selvagem e mutantes. As mutações sítio-dirigidas apresentadas não perturbaram a estrutura
secundária das proteínas recombinantes.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
58
4.7. Teste de Atividade Hidrolítica
Os ensaios de atividade hidrolítica das proteínas hsPLA
2
-IIDs
recombinantes tipo selvagem e mutantes foram realizados através da técnica
do ADIFAB, um indicador de ácido graxo livre. Para tal, foi utilizada a
composição fosfolipídica de DOPC e DOPG na razão molar de 9:1,
respectivamente. A FIGURA 26 mostra a atividade hidrolítica das hsPLA
2
-IIDs
recombinantes tipo selvagem e mutantes.
Através da metodologia utilizada, tanto a hsPLA
2
-IID nativa quanto a
proteína recombinante mutante H48Q apresentaram atividade hidrolítica que
foi quantificada através do aumento da razão da intensidade de fluorescência
(I
505
/I
425
nm).
A adição de 0,2µg.mL
-1
da enzima tipo selvagem apresentou uma
atividade específica de 58,45
M.min
-1
.mg
-1
, na presença de Ca
2+
. Foi
observado que a atividade hidrolítica da hsPLA
2
-IID é dose dependente, pois
a adição de 0,1µg.mL
-1
resultou em atividade total menor que quando
adicionado 0,2ug.mL
-1
da hsPLA
2
-IID. A mutante H48Q apresentou uma
atividade específica de 7,7 M.min
-1
.mg
-1
e as mutantes D49K e G30S
apresentaram atividade zero. Nenhuma das proteínas avaliadas apresentou
atividade hidrolítica na presença de EGTA, um quelante de Ca
2+
,
evidenciando que a atividade catalítica é dependente do íon Ca
+2
.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
59
A
B
C
D
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
R
505/425nm - Fluorescência
Tempo (segundos)
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID selvagem (0,1ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ EGTA
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
R
505/425nm - Fluorescência
Tempo (segundos)
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID H48Q (0,5ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID H48Q (0,5ug.mL
-1
)+ EGTA
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
R
505/425nm - Fluorescência
Tempo (segundos)
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID D49K (0,5ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ EGTA
0 500 1000 1500 2000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
R
505/425nm - Fluorescência
Tempo (segundos)
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID G30S (0,5ug.mL
-1
)+ Ca
2+
hsPLA
2
-IID selvagem (0,2ug.mL
-1
)+ EGTA
FIGURA 26: Hidrólise fosfolipídica da hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes no sítio
ativo na presença de CA
2+
ou EGTA. (A) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505
e 425 nm após a adição de 0,2 g.mL
-1
comparada a 0,1 g.mL
-1
da hsPLA
2
-IID tipo
selvagem; (B) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505 e 425 nm após a adição de
0,5 g.mL
-1
da mutante H48Q; (C) Razão da intensidade de fluorescência (I) em 505 e 425
nm após a adição de 0,5 g.mL
-1
da mutante D49K; (D) Razão da intensidade de
fluorescência (I) em 505 e 425 nm após a adição de 0,5 g.mL
-1
da mutante G30S.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
60
4.8. Atividade de Permeabilização de Membranas Artificiais
A liberação de marcadores fluorescentes encapsulados dentro de
lipossomos é uma técnica utilizada para o estudo da interação de PLA
2
s com
membranas. Foram realizados testes de liberação de calceína encapsulada
em lipossomos cujas membranas foram compostas de uma mistura DOPC e
DOPG na razão molar de 9:1, respectivamente. Nestes experimentos, a perda
da integridade da membrana lipossomal resulta na diluição do fluoróforo, com
conseqüente aumento do sinal de fluorescência (DE OLIVEIRA, et al., 2001,
RUFINI, et al., 1992). A liberação total do fluoróforo encapsulado ocorre após
a adição de 0,1% do detergente TRITON X-100.
A FIGURA 27 e a FIGURA 28 mostram os resultados de liberação de
marcador fluorescente das proteínas hsPLA
2
-IID recombinantes tipo selvagem
e mutantes. A adição de 1µg.mL
-1
hsPLA
2
-IID recombinate tipo selvagem,
sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG resultou em perda da
integridade da membrana lipossomal com conseqüente liberação da calceína
encapsulada. A porcentagem de liberação apresentada por hsPLA
2
-IID
recombinante tipo selvagem, nesta composição fosfolipídica, foi de
aproximadamente 10,5% da liberação total causada por TRITON-X100. As
proteínas recombinantes D49K e G30S, perderam parcialmente atividade de
danificação de membranas em relação à proteína tipo selvagem com
porcentagem de liberação de 4,2% e 4,1% respectivamente. Entretanto a
proteína recombinante H48Q manteve capacidade de danificar a membrana
de lipossomos DOPC e DOPG com porcentagem de liberação de
aproximadamente 11%.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
61
0 20 40 60 80 100 120
0
500
1000
5000
7500
100 00
Fluorescência
Tem po (segundos)
Branco (tam pão)
hsPLA
2
selvagem (1ug.m L
-1
)
hsPLA
2
H 48Q (1 ug.m L
-1
)
hsPLA
2
G 30S (1ug.m L
-1
)
hsPLA
2
D 49K (1ug.m L
-1
)
FIGURA 27: Cinética de liberação de calceína causada por hsPLA
2
-IID tipo selvagem e
mutantes sobre lipossomos compostos de DOPC e DOPG. Fluorescência de liberação de
calceína encapsulada após 20 segundos da adição das proteínas na concentração de
1ug.mL
-1
. A liberação máxima de calceína ocorreu após a adição de 0,1% de TRITON X-100
FIGURA 28: Porcentagem da liberação de calceína encapsulada causada por hsPLA
2
-
IIDs tipo selvagem e mutantes em lipossomos compostos de DOPC e DOPG
0
2
4
6
8
10
12
90
100
Danificação de membranas artificiais (%)
Branco hsPLA
2
-IID
Selvagem
hsPLA
2
-IID
H48Q
hsPLA
2
-IID
D49K
hsPLA
2
-IID
G30S
_______________________________________________________________________RESULTADOS
62
4.9. Atividade Bactericida
O efeito bactericida apresentado por hsPLA
2
-IID tipo selvagem foi
avaliado contra duas linhagens de bactérias, linhagem de bactéria Gram-
negativa Escherichia coli K12, e a linhagem Gram-positiva Micrococcus
luteus (ATCC 9341). A atividade bactericida observada para a proteína
hsPLA
2
-IID tipo selvagem sobre 4x10
6
células.mL
-1
de E.coli K12 e sobre
2x10
7
células.mL
-1
de Micrococcus luteus após 120 minutos da adição da
proteína está apresentada na FIGURA 29. A atividade bactericida foi
determinada com concentração de 5 e 10ug.mL
-1
. Nas duas linhagens
analisadas nota-se que o número de unidades formadoras de colônias (UFC)
é menor quanto maior a concentração de proteína utilizada.
O efeito bactericida sob concentração de 10ug.ml
-1
de proteína
selvagem foi de 74% sobre a linhagem Gram-positiva de Micrococcus luteus e
de aproximadamente 54% sobre a linhagem Gram-negativa de Escherichia
coli (K12) em relação ao controle experimental realizado apenas na presença
de tampão fosfato 0,01 M.
A partir do teste dose-resposta apresentada na FIGURA 29 a
concentração fixa de 10
g.mL
-1
foi escolhida para a avaliação do efeito
bactericida das hsPLA
2
-IID mutantes sobre as linhagens de Escherichia coli
K12 e Micrococcus luteus.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
63
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
(%) UFC
Controle
hsPLA
2
-
IID
5ug.ml
-1
hsPLA
2
-
IID
10ug.ml
-1
B
Controle
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
(%) CFU
hsPLA
2
-
IID
5ug.ml
-1
hsPLA
2
-
IID
10ug.ml
-1
A
FIGURA 29: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 5 e
10 g.mL
-1
de hsPLA
2
-IID sobre (A) Micrococcus luteus e (B) Escherichia coli (K12). O
controle experimental foi realizado apenas na presença de tampão fosfato de sódio 0,01M. Os
valores estão apresentados como a média da porcentagem ± SD de pelo menos 3
experimentos.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
64
Como há relatos que algumas PLA
2
s apresentam atividade bactericida
independente da atividade hidrolítica, as duas mutantes do sítio ativo da
hsPLA
2
-IID, H48Q e D49K, foram utilizadas para avaliar se a propriedade de
hidrolisar fosfolipídios de membranas, era na sua integridade, responsável
pelo efeito bactericida observado contra as bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas. A FIGURA 30 mostra os resultados obtidos. As mutações dos
resíduos no sítio catalítico (H48) e no sítio de ligação ao íon Ca
+2
(D49) teve
forte influência no o efeito bactericida de hsPLA
2
-IID sobre a linhagem Gram-
positiva de Micrococcus luteus. Essas substituições diminuíram drasticamente
o efeito bactericida total apresentado pela proteína selvagem. A mutante
H48Q teve atividade bactericide reduzida para 14% e a mutante D49K teve
atividade reduzida para 8% comparada à proteína selvagem que apresentou
atividade de 74% contra essa linhagem.
Entretanto, as mutações D49K e H48Q da hsPLA
2
-IID reduziram
levemente a atividade bactericida exercida pela proteína selvagem sobre a
linhagem Gram-negativa Escherichia coli (K12), um efeito bactericida
significativo ainda é apresentado por estes mutantes, como verificado na
FIGURA 30B. Sobre a linhagem Gram-negativa a mutante H48Q conservou o
efeito bactericida em 47% e a mutante D49K apresentou efeito de 33%
comparado ao efeito de 54% da proteína selvagem.
_______________________________________________________________________RESULTADOS
65
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
(%) do número de UFC
Controle
hsPLA
2
-IID
selvagem
10ug.mL
-1
hsPLA
2
-IID
H48Q
10ug.mL
-1
hsPLA
2
-IID
D49K
10ug.mL
-1
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
(%) do número de UFC
Controle hsPLA
2
-IID
selvagem
10ug.mL
-1
hsPLA
2
-IID
H48Q
10ug.mL
-1
hsPLA
2
-IID
D49K
10ug.mL
-1
FIGURA 30: Porcentagem do numero de UFC apresentado no efeito bactericida por 10
g.mL
-1
de hsPLA
2
-IID mutantes sobre (A) Micrococcus luteus e (B) de Escherichia coli
(K12). O controle experimental foi realizado apenas na presença de tampão fosfato de sódio
0,01M. Os valores estão apresentados como a média da porcentagem ± SD de pelo menos 3
experimentos.
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
66
5. DISCUSSÃO
Para o estudo das atividades catalítica, danificadora de membranas
artificiais e bactericida de hsPLA
2
-IID, alem da proteína tipo selvagem, foram
produzidas as mutantes G30S, H48Q e D49K através da técnica de
mutagênese sítio-dirigida. Todos os fragmentos de DNA contendo a
seqüência codificadora mutante de hsPLA
2
-IID foram subclonados no vetor de
expressão pET-3a. Apesar de apresentam aproximadamente 4640 pares de
bases, tamanho que dificulta tanto a ligação de fragmentos quanto a
transformação bacteriana (HANAHAN, 1983, INOUE, et al., 1990), não houve
problemas relacionadas as etapas de mutagênese e clonagem e este
constructo expressou eficientemente as proteínas heterólogas. Os vetores da
série pET (ROSENBERG, et al., 1987, STUDIER E MOFFATT, 1986,
STUDIER, et al., 1990) apresentam uma seqüência promotora T7 N-terminal,
que controla a expressão de genes inseridos dentro do sítio múltiplo de
clonagem (SMC), além de apresentarem marcadores seletivos para a
resistência à ampicilina. Uma característica do sistema pET de vetores é a
capacidade de clonagem de genes sob condições de atividade transcricional
extremamente baixa. (HANAHAN, 1983, INOUE, et al., 1990).
Idealmente, a estratégia de mutagênese sítio-dirigida deve ser utilizada
juntamente com um sistema eficiente de expressão de proteínas heterólogas,
e um protocolo de purificação que renda níveis satisfatórios da proteína
funcionalmente ativa. As PLA
2
s freqüentemente são bem expressas por E.
coli, mas a principal desvantagem é que as PLA
2
s dos grupos I e II não são
expressas na forma nativa e sim como agregados protéicos insolúveis
denominados corpos de inclusão (KELLEY, et al., 1992, KUO, et al., 1995,
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
67
LIU, et al., 1990, WARD, et al., 2001). O primeiro passo no processo de
purificação das proteínas foi o isolamento destes agregados protéicos. As
etapas de purificação dos corpos de inclusão são fundamentais antes do
enovelamento protéico, pois a presença de contaminantes incluindo DNA,
RNA, fosfolipídios e outras proteínas, é o fator que mais interfere no
rendimento protéico final, influenciando fortemente o processo de
enovelamento (BATAS E CHAUDHURI, 1998). Embora facilmente purificados
por centrifugação, os corpos de inclusão devem posteriormente ser
solubilizados com desnaturantes químicos e a proteína reenovelada na sua
conformação nativa.
O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de
fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Protocolos de
enovelamento protéico usando uma resina de filtração em gel têm sido
utilizados com sucesso para enovelamento hsPLA
2
-IIA expressada na forma
de corpos de inclusão, pois a difusão reduzida das proteínas em coluna de
filtração em gel suprime as interações não específicas de moléculas
parcialmente renoveladas, reduzindo assim a agregação (BATAS, et al.,
1999). Entretanto para hsPLA
2
-IID este método não ajudou a reduzir a
agregação de proteína nativa, mas permitiu que formas não corretamente
enoveladas permanecessem em solução prejudicando o rendimento
qualitativo de proteína realmente ativa. Outra etapa importante do processo de
enovelamento é a redução lenta da concentração do agente desnaturante,
hidrocloreto de guanidina (GdnHCl), que interage com o solvente, causando
destruição do arranjo estrutural existente entre as moléculas de água e a
proteína. Além disso, como as PLA
2
s dos grupos I e II apresentam de 6 a 8
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
68
pontes dissulfeto, o enovelamento protéico deve ser realizado na presença de
tampão de oxidação/redução.
O enovelamento protéico da hsPLA
2
-IID foi alternativamente conduzido
através de repetidos ciclos de diluição e diálise contra um tampão que
apresentava o par redox cisteína-cistina, e concentrações decrescentes de
GdnHCl e na presença de 1 mM do cofator Ca
2+
que aumentou
significativamente o rendimento final de hsPLA
2
-IID funcionalmente ativa. O
processo de enovelamento foi monitorado através de medidas de dicroísmo
circular, sobre espectro de comprimento de onda de 190-250 nm,
cromatografia de troca catiônica e ensaios de atividade hidrolítica, que
confirmaram a produção da proteína recombinante sob uma forma solúvel e
biologicamente ativa. O mesmo protocolo de enovelamento foi utilizado para
as proteínas mutantes.
A análise da estrutura secundária das proteínas recombinantes é
fundamental para eliminar as proteínas recombinantes mutadas com
conformação estrutural não nativa. A ligação peptídica é rígida e planar, e a
rotação em volta do Cα é limitada por impedimento estérico das cadeias
laterais dos aminoácidos vizinhos. Isso faz com que certas conformações da
cadeia principal sejam energicamente favorecidas. O conjunto limitado de
arranjos das ligações peptídicas tem sinais bem definidos de CD, e a soma
das contribuições resulta num espectro que é característico de cada proteína
(GORE, 1998). O espectro de CD de proteínas é geralmente medido dentro
das regiões entre 250 e 300 nm (denominada região UV-próxima) e em
comprimentos de onda menores do que 250 nm (UV-distante). O espectro de
CD na região próxima é dominado por sinais das cadeias laterais aromáticas,
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
69
embora transições de ligações dissulfeto também contribuam para a
intensidade de absorção total. A absorção na região do UV-distante é
dominada por transições eletrônicas da cadeia peptídica da proteína, mas
algumas cadeias laterais também contribuem nesta região, especialmente se
o conteúdo de α-hélices da proteína é baixo. Uma das utilizações da técnica
de CD no estudo de proteínas é a avaliação da conformação e estrutura
protéica. As α-hélices (direita) são as estruturas secundárias dominantes em
muitas proteínas, mas o espectro de CD da proteína nativa é a soma das
porcentagens apropriadas de cada componente do espectro. Os resultados de
CD na região UV-distante (190-250nm) mostraram que as proteínas
enoveladas hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes apresentaram estrutura
secundária semelhante à outras hsPLA
2
s nativas da mesma família. Este
resultado era esperado, pois as mutações envolvem resíduos voltados para o
solvente e, portanto não foram previstas alterações significativas nas
estruturas e estabilidade das proteínas mutantes.
As PLA
2
s atuam sobre fosfolipídios em membranas ou formas
agregadas e o ciclo catalítico é iniciado através da ligação interfacial, que é
distinta da ligação da molécula do fosfolipídio no sítio ativo (GELB, et al., 1995
). A composição lipídica de DOPC e DOPG em membranas sintéticas tem sido
utilizada na literatura para o entendimento do mecanismo de ação da hsPLA
2
(BAKER, et al., 1998, BEERS, et al., 2003). Sabe-se que a hsPLA
2
são
proteínas básicas, e que devido ao alto número de aminoácidos carregados
positivamente localizados na superfície da proteína, elas apresentam uma
marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol
(PG) encontrados em membranas bacterianas (SNITKO, et al., 1997). Por
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
70
outro lado, a hsPLA
2
liga-se fracamente a interfaces zwiteriônicas presente
em membranas celulares de eucariotos (BAYBURT, et al., 1993).
Um ensaio com o conjugado ADIFAB foi realizado para avaliar a
capacidade das proteínas recombinantes tipo selvagem e mutantes de
hidrolisar fosfolipídios. A enzima humana tipo selvagem apresentou atividade
hidrolítica específica contra vesículas unilamelares compostas de
DOPC:DOPG de 58,45 M.min
-1
.mg
-1
. A mutante H48Q apresentou uma
atividade de 7,7 M.min
-1
.mg
-1
. Os resultados apresentados mostraram que a
atividade enzimática da proteína hsPLA
2
-IID tipo selvagem e da mutante
H48Q é dependente de Ca
2+
, pois na presença de EGTA a atividade
hidrolítica foi abolida. Além disso, foi verificado que a atividade catalítica é
dose dependente, pois o ensaio com concentração menor de proteína
detectou atividade específica menor. Cristalização de raio-X da mutante H48Q
da hsPLA
2
-IIA mantém algumas características da maquinaria catalítica
comparada à nativa (EDWARDS, et al., 2002). O íon Ca
+2
ocupa uma posição
idêntica no sitio ativo nas duas proteínas permitindo que a mutante H48Q
apresente atividade catalítica residual sobre vesículas unilamelares de DOPG
(dioleoil fosfatidilglicerol). A partir disso propuseram um mecanismo catalítico
para a mutante H48Q (FIGURA 31) o qual está baseado no mecanismo de
catálise para as PLA
2
s de Yu e colaboradores (1993). Entretanto, devido à
estrutura do anel imidazol que sofre deslocamento de elétrons e estabilização
por ressonância, a histidina é mais acida, desprotonando mais facilmente, e
dessa forma é favorecida no mecanismo catalítico em relação à ressonância
do grupo amida da glutamina. No mecanismo proposto há duas moléculas de
égua e não uma única como proposto por Verheij em 1981, e revisado em
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
71
2001 (BERG, et al., 2001), envolvidas na catalise e uma delas faz
coordenação com o íon Ca
+2
.
Por outro lado, a mutante D49K da hsPLA
2
-IID, uma fosfolipase A
2
-
Lys49 (PLA
2
-Lys49), não apresentou atividade catalítica da mesma forma que
duas PLA
2
s-Lys49 cataliticamente inativas isoladas em 1984 dos venenos de
Agkistrodon p. piscivorus e Bothrops atrox (MARAGANORE E HEINRIKSON,
1986). Portanto, a ausência de atividade hidrolítica residual da mutante D49K
observada neste estudo já era esperada. A mutante G30S elimina a
capacidade da enzima de hidrolisar fosfolipídios por impedir a ligação do
cofator Ca
2+
(THUNNISSEN, et al., 1990, VERHEIJ, et al., 1981).
A
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
72
FIGURA 31: Mecanismo catalítico de coordenação do Ca
+2
com um oxiânion para as
sPLA
2
(YU, et al., 1993). (A) A molécula de água (w5) que gera o ataque nucleofílico é
coordenada com Ca
+2
enquanto a molécula de água (w6) está diretamente ligada a His-48.
Pontes de hidrogênio facilitam o fluxo de elétrons e transferência de prótons. (B) Mecanismo
proposto por Edwards para a mutante H48Q na qual a desprotonação da molécula de água
(w5) resulta na protonação da molécula de água (w6). A molécula H3O
+
é estabilizada por
ressonância com Gln-48 que por sua vez é estabilizada por pontes de hidrogênio com Asp-99.
R2 é o ácido graxo liberado e PL representa o lisofosfolípidio.
B
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
73
A atividade de danificação de membranas artificiais da hsPLA
2
-IID,
contra lipossomos compostos de fosfolipídios de 90% de DOPC e 10% de
DOPG com conseqüente liberação da calceína encapsulada também foi
avaliada no presente trabalho. Esta composição lipídica foi escolhida, pois
ISHIZAKI e colaboradoes (1999) usando hsPLA
2
-IID purificada por
cromatografia de afinidade determinou, dentre 13 tipos de fosfolipídios
comerciais, quais substratos são hidrolizados por esta proteína. Foi observada
uma ausência e especificidade, também encontrada na hsPLA
2
-IIA (ONO, et
al., 1988). Dentre os substratos mais hidrolizados estava fosfosfolipidios com
cabeça polar composta por fosfatidilglicerol e fosfatidiletanolamina contendo
acido oléico como acido graxo na posição sn-2.
O resultado encontrado mostrou que a atividade de danificação de
membranas observada para a proteína tipo selvagem foi de aproximadamente
10,5%, semelhante à mutante H48Q de 11% da liberação total causada por
TRITON-X100. As mutantes D49K e G30S apresentaram atividade de
aproximadamente 4%. Este resultado mostra que a hsPLA
2
-IID tem uma
atividade de danificação de membranas não relacionada a atividade catalítica
pois mesmo a mutante H48Q possuindo uma atividade catalítica residual
pequena apresentou uma atividade de danificação de membrana semelhante
a proteína tipo selvagem e as mutantes D49K e G30S que tiveram atividade
catalítica abolida apresentaram mesmo que reduzida uma atividade de
danificação de membranas artificiais. Uma vez que a hsPLA
2
-IID tipo
selvagem apresenta atividade hidrolítica dependente de Ca
2+
, esperava-se
que a porcentagem de liberação de calceína apresentada por esta enzima
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
74
fosse realçada na presença do cofator pois, além do mecanismo danificador
de membranas, esta fosfolipase apresentaria também hidrólise dos
fosfolipídios. Entretanto, no intervalo de tempo (80 segundos) em que a
liberação de calceína é monitorada, uma fração muito pequena dos
fosfolipídios é hidrolisada de acordo com a FIGURA 26.
A proteína hsPLA
2
-IID tipo selvagem e mutantes também foram
avaliadas quando a capacidade de causar efeito bactericida. A atividade
bactericida foi avaliada contra as linhagens Gram-positiva, Micrococcus luteus
e Gram-negativa, Escherichia coli (K12). A contagem do número de unidades
formadoras de colônia (UFC) foi realizada em função das concentrações de
5ug.ml
-1
e 10ug.ml
-1
para a proteína selvagem (FIGURA 29), mostrando que o
efeito bactericida é dependente da concentração de proteína, independente
da linhagem. Este resultado está em concordância com a atividade bactericida
demonstrada por hsPLA
2
-IIA e BthTx-I descritos por CHIOATO, 2004. Os
resultados demonstraram que a hsPLA
2
-IID selvagem possui atividade contra
as duas linhagens. Como mostrado na FIGURA 32 este efeito bactericida é
diferenciado de outras sPLA
2,
pois a humana sPLA
2
-IIA tem somente atividade
contra a linhagem Gram positiva e a BthTx-I, uma Lys 49, é capaz de
permeabilizar somente a linhagem Gram negativa .
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
75
FIGURA 32: Porcentagem do número de UFC apresentado no efeito bactericida sobre
E.coli K12 e M.luteus por (A) hsPLA
2
-IIA e (B) BthTx-I.
(Chioato et al, 2004)
(Chioato et al, 2004)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
UFC(%)
Escherichia coli (K12)
Micrococcus luteus
Controle hsPLA
2
-IIA
selvagem
5ug.mL
-1
hsPLA
2
-IIA
selvagem
10ug.mL
-1
A
B
Controle BthTX-I
selvagem
5ug.mL
-1
BthTX-I
selvagem
10ug.mL
-1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
UFC (%)
Escherichia coli (K12)
M icrococcus luteus
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
76
Diante de tal resultado e sabendo que a região C-terminal de PLA
2
s-Lys49
está envolvida no efeito bactericida (PÁRAMO, et al., 1998) e um cluster de
resíduos básicos na região N-terminal tem importância crucial no efeito
bactericida da proteína humana sPLA
2
-IIA
(WEISS, et al., 1994)
foi feita um
análise das seqüências de aminoácidos presentes na cadeia polipeptídica de
hsPLA
2
-IID e hsPLA
2
-IIA e BthTx-I com o intuito de identificar possíveis
resíduos que estariam envolvidos com o efeito bactericida contra as linhagens
E. coli K12 e M. luteus. Um modelo tridimensional de hsPLA
2
-IID foi calculado
através do programa “Modeller” (MARTI-RENOM, et al., 2000) usando As
coordenados de hsPLA
2
-IIA (WERY, et al., 1991) como um molde. Usando o
modelo e alinhamento das seqüências de aminoácidos da hsPLA
2
-IID, as
posições dos resíduos com cargas positivas e negativas foram comparadas
com hsPLA
2
-IIA e BthTx-I (FIGURA 33). Através do alinhamento de
seqüência de aminoácidos (FIGURA 34) foi possível identificar resíduos
comuns entra as sPLA
2
s humana do grupo IID e IIA e a Lys-49, BthTx-I.
A proteína hsPLA
2
-IIA apresenta um cluster de aminoácidos básicos
na região N-terminal, em particular a Arg7 e Lys 15 que segundo Weis, 1994
são determinantes estruturais na atividade bactericida da hsPLA
2
-IIA. Dessa
forma a conservação de resíduos básicos nessa região na hsPLA
2
-IID (Lys7,
Lys 10 e Lys15) pode está envolvida em sua atividade bactericida. Há também
uma região de resíduos polares e básicos conservados entre os resíduos 65 a
80, sendo a Lys 67 e Arg 100 unicamente presente nas proteínas hsPLA
2
-IID
e hsPLA
2
-IIA
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
77
FIGURA 33: Estrutura simulada da proteína hsPLA
2
-IID(A) comparada a estrutura da
hsPLA
2
-IIA (B) e da BthTx-I (C).
A
B
C
hsPLA
2
-IID
hsPLA
2
-IIA
BthTx-I
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
78
FIGURA 34: Alinhamento das seqüências de aminoácidos das proteínas hsPLA
2
-IID,
hsPLA
2
-IIA e BthTx-I
Entretanto, há regiões que são conservadas entre hsPLA
2
-IID e BthTx-I
que não estão presentes em hsPLA
2
-IIA. Um exemplo são os resíduos Asp64
e Lys63 que estão ausentes na hsPLA
2
-IIA.
Estudos cristalográficos e de RMN mostram uma superfície protéica de
ligação interfacial comum para as PLA
2
s dos grupos II. Esta superfície
denominada de sítio de reconhecimento interfacial, SRI (PIETERSON, et al.,
1974) ou “i-face” (RAMIREZ E JAIN, 1991) é composta por uma fenda
hidrofóbica altamente conservada que se liga a cadeia de ácido graxo do
substrato fosfolipídico, e um anel de resíduos carregados e polares. Sabendo
que em Lys-49-PLA
2
os resíduos da alça C-terminal contribuem para
formação do anel do SRI e que estes resíduos interagem eletrostaticamente
com as cargas negativas nos fosfolipídios da membrana permitindo um
deslocamento da região C-terminal, facilitando assim seu contato com a
membrana (CHIOATO, et al., 2002) foi verificado uma semelhança
significativa entre as regiões C-terminais das proteínas hsPLA
2
-IID e BthTx-I
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
79
com aproximadamente 50% de identidade quanto a composição dos
aminoácidos e um total de 8 resíduos conservados na região do IRS
(TABELA 1) que estão presentes em hsPLA
2
-IID e BthTx-I e ausentes em
hsPLA
2
-IIA. Dessa forma é possível sugerir que a atividade bactericida contra
a linhagem Gram-neativa apresentada por essas duas proteinas tem seus
determinates estruruturiais em regiões de contato com o substrato. Enquanto
isso além dos aminoácidos da região N-terminal, já citados, a Arg 100 só
aparece em hsPLA
2
-IIA e hsPLA
2
-IID, estes são aminoácidos que ficam
opostos ao local do IRS, pondendo inferir que os determinantes estruturais de
permeabilização de membranas bacterianas da linhagem Gram-positiva não
dependem somente da região de contato com o substrato, mas que regiões
envolvidas no acesso a membrana estão contribuindo com a permeabilização
bacteriana.
hsPLA
2
-IID vs BthTx-I hsPLA
2
-IID vs hsPLA
2
-IIA
Resíduos Conservados
no IRS
Pro 18, Lys 70, Asp 71,
Glu 87, Arg 107, Leu
110, Arg 118, Lys 122
Thr 46, Lys 77
TABELA 1: Resíduos de aminoácidos conservados entre hsPLA
2
-IID e BthTx-I e entre
hsPLA
2
-IID e hsPLA
2
-IIA na região do sítio de reconhecimento interfacial.
O fato de BthTx-I não apresentar atividade hidrolítica e mesmo assim
provocar danificação de membranas bacterianas, mostra que esta toxina
apresenta atividade bactericida independente de catálise (CHIOATO, et al.,
2002). Mutantes da hsPLA
2
-IID no resíduo do sítio catalítico H48 e no resíduo
de ligação ao íon Ca
+2
D49 também foram testados contra as linhagens
propostas. Contra a linhagem Gram-negativa, os mutantes apresentaram um
_________________________________________________________________________DISCUSSÃO
80
efeito bactericida independente de catálise, pois mantiveram um efeito
bactericida de 47% para a mutante H48Q e 33% para a mutante D49K, contra
um efeito de 54% da hsPLA
2
-IID tipo selvagem. Mas contra a linhagem Gram-
positiva este efeito foi bem sutil, pois os mutantes apresentaram um efeito de
aproximadamente 10%, enquanto a proteína selvagem teve 77% de efeito
bactericida. Estes dados sugerem uma dissociação da atividade hidrolítica em
relação ao efeito bactericida.
O efeito das mutações no resíduo do sítio catalítico e no sítio de ligação
ao íon Ca
+2
sobre a atividade de danificação de membranas artificiais não foi
o mesmo apresentado sobre o efeito bactericida das duas linhagens, uma vez
que os mutantes mesmo possuindo atividade de danificação de membranas
artificiais não tiveram efeito bactericida sobre a linhagem Gram-positiva. Este
resultado pode ser devido às diferenças na composição e estrutura da parede
celular das linhagens bacterianas que dificultam ou impedem o acesso das
enzimas ou ainda devido às diferenças na membrana interna que não é
susceptível ao ataque independente de hidrólise no caso da linhagem de
Micrococcus luteus.
_______________________________________________________________________CONCLUSÕES
81
6. CONCLUSÕES
1) A proteína recombinante hsPLA
2
-IID é expressa em E. coli sob a forma de
corpos de inclusão e pode ser renovelada para sua forma nativa através de
um protocolo estabelecido em nosso laboratório.
2) A hsPLA
2
-IID tipo selvagem apresentou atividade catalítica de 58,45
M.min
-1
.mg
-1
e a mutante H48Q uma atividade de 7,7 M.min
-1
.mg
-1
,
enquanto as mutantes G30S e D49K não apresentam atividades detectáveis
usando a metodologia de ligação de acido graxo em ADIFAB.
3) A hsPLA
2
-IID apresenta atividade danificadora de membranas artificiais por
um mecanismo que não envolve hidrolise dos fosfolipídios. Esta conclusão é
reforçada pela observação de atividade danificadora de membranas não
correlacionada com a hidrolise, como no caso da mutante H48Q que
apresentou atividade de danificação de membranas artificiais semelhante a
proteína selvagem e os mutantes G30S e D49K, que tiveram atividade
hidrolítica abolida no entanto apresentaram atividade de danificações de
membranas.
4) Além da atividade contra substrato artificial, a hsPLA
2
-IID apresenta
atividade bactericida contra linhagens Gram-positiva e Gram-negativa.
5) Mutantes que reduziram a atividade hidrolítica continuaram apresentando
atividade bactericida contra linhagem Gram-negativa, entretanto os mesmos
_______________________________________________________________________CONCLUSÕES
82
mutantes reduziram significativamente a atividade bactericida contra a
linhagem Gram-positiva. Assim a atividade hidrolitica não está correlaciona
com o efeito bactericida.
6) Comparação da seqüência e da distribuição dos aminoácidos carregados
mostram diferenças entre hsPLA
2
-IID, hsPLA
2
-IIA e BthTx-I, que podem
indicar os fatores estruturais que determinam a especificidade de efeito
bactericida entre bactérias Gram-positiva e Gram-negativa.
______________________________________________________REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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