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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
THAÍS AMARAL E SOUSA
Expressão de micro-RNAs em diferentes fases de
crescimento do melanoma humano
Ribeirão Preto-SP
2007
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2
THAÍS AMARAL E SOUSA
Expressão de micro-RNAs em diferentes fases de
crescimento do melanoma humano
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Área: Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Fernando Luiz De Lucca
Ribeirão Preto, SP
Junho de 2007
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3
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Sousa, Thaís Amaral
Expressão de micro-RNAs em diferentes fases de crescimento do
melanoma humano/ Thaís Amaral e Sousa; orientador Fernando Luiz
De Lucca. – Ribeirão Preto, 2007.
86p.:
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-graduação em
Bioquímica. Área de Concentração: Bioquímica) – Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
1. Introdução. 2. Obejetivos. Material e Métodos. 4. Resultados. 5.
Discussão. 6. Considerações Finais. 7. Referências Bibliográficas.
4
FOLHA DE APROVAÇÃO
Thaís Amaral e Sousa
“Expressão de micro-RNAs em diferentes
fases de crescimento do melanoma
humano”
Dissertação de mestrado apresentada à
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, para
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Área: Bioquímica
Aprovada em:
Banca examinadora
Prof. Dr. __________________________________________________________________________
Instituição: ______________________________________ Assinatura: _________________
Prof. Dr. __________________________________________________________________________
Instituição: ______________________________________ Assinatura: _________________
Prof. Dr. __________________________________________________________________________
Instituição: ______________________________________ Assinatura: _________________
5
"Um pouco de ciência nos afasta de Deus.
Muito, nos aproxima."
(Louis Pasteur)
6
Dedico este trabalho àqueles que me ensinaram a difícil arte de amar,
que torna possível todas as coisas...
Aos meus pais, Luiza e Mauro, minha luz e meu
refúgio, cujo amor e abnegação me permitiram ser
quem eu sou.
Ás minhas irmãs Lia, Caroline e Rafaela, meus
presentes mais valiosos que preenchem com tanto
amor e amizade a minha vida.
E ao Marcos, “amor da minha vida da minha
eterna felicidade”, por sonhar junto comigo... pelo
amor sem fronteiras.
7
Agradecimentos...
Agradecimentos...Agradecimentos...
Agradecimentos...
À Deus meu mestre, meu colo, meu tudo... “foi ele quem me fez conhecer a
constituição do mundo e a virtude dos elementos”. (Sb, 7,17)
Ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Luiz De Lucca, que me acolheu como
um pai, abrindo as portas do fascinante mundo da ciência e transmitindo, com muita
sabedoria, a paixão pelo mundo dos RNAs sem impedir que eu encontrasse meu
próprio caminho.
À toda minha família que torceu de longe por mim, pelo apoio acompanhado de
uma dose de loucura e muito calor humano, principalmente à minha avó D. Lia.
À Tia Ângela, seu esposo Valdemar Lacerda Jr e seus filhos Felipe e Luana,
que me acolheram em sua casa permitindo minha vinda pra Ribeirão Preto.
Obrigada pelo apoio material e emocional, pelo suporte familiar, pelos churrascos,
pelo convívio repleto de carinho.
Às técnicas do laboratório, Cacilda Dias Pereira e Zuleica Aparecida S. de
Moraes, pelo suporte técnico, pelo apoio, pelos sorrisos e pelos “ouvidos”.
Às amigas Nayara Delgado André e Viviane Aline Oliveira Silva pelo
companheirismo científico acadêmico e muito, muuuuuuito mais do que isso... uma
amizade que transcende as fronteiras da USP...e até do estado. Obrigada por
estarem sempre ao meu lado! “O que vamos fazer hoje? Dominaaaar o
muuuuuuuundo!!!!!!!
8
Às Balalaikas: Ernna Hérida e Fabrine Massafera, companheiras no sorriso e
na lágrima, nas festas e na “ralação”, nos dias de preguiça e de animação total...
Minha família em Ribeirão Preto! Obrigada pelo carinho, pelo apoio... pela amizade
na plenitude de seu significado!
À nossa “dinda” Vivian Cipriano e ao meu “irmão” Fausto Bruno por tornarem
meus dias muito mais felizes. Pega fooooooooooooooooooooooooooogo! Tchê-tchê-
tchê...
Aos alunos do departamento, em especial à Andressa e à Mariana, pela
amizade recheada de tantos almoços, compras, “happy hours” e sorrisos.
À Sônia, Maurício, Ricardo, Flaviane e demais companheiros do laboratório do
Prof Guilherme Lucas pela troca de experiências, pelo companheirismo e pela
alegria.
Aos meus amigos distantes: Kiara, Ronney, Sabrina, Larissa, Naiara, Aziza,
Priscila e tantos outros... “basta-me saber que eles existem. Esta mera condição me
encoraja a seguir em frente”.
À Prof.ª Dr.ª Enilza M. Espreafico por ceder as linhagens celulares usadas
neste estudo.
À Prof.ª Dr.ª Margaret de Castro por disponibilizar o aparelho de Real Time e ao
Fernando Colbari do Amaral pela orientação no manuseio do mesmo.
À aluna Dalila por me transmitir sua experiência com a metodologia utilizada.
Aos funcionários da secretaria do Departamento de Bioquímica e Imunologia,
Maria Ivone Campos Fonseca, Maria Tereza Rodrigues, Lucia Yaeko Shimada,
Ronaldo Sordi Campanini e Vitor Diaz Galban e todos os outros funcionários do
departamento pela constante atenção e disponibilidade em ajudar.
9
Aos professores do Departamento de Bioquímica e Imunologia por todos os
ensinamentos e pela convivência.
Aos professores Dr. Guilherme Lucas e Dr.ª Fabíola Attié de Castro, membros
da banca examinadora pelos preciosos conselhos e atenção dispensados a este
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa – CNPq, pelo apoio financeiro fornecido por
meio da bolsa de mestrado que permitiu que eu pudesse me dedicar integralmente à
realização deste trabalho.
À Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP e ao departamento
de Bioquímica e Imunologia por fornecerem a infra-estrutura necessária para que
esta dissertação fosse realizada.
A todos aqueles que de alguma forma se alegram com a minha conquista.
10
SUMÁRIO
Resumo.................................................................................................................
11
Abstract.................................................................................................................
13
Introdução.............................................................................................................
15
1. Considerações gerais sobre RNAs não codificadores de proteínas..
14
2. Noções básicas sobre micro-RNAs........................................................
17
3. Biogênese de micro-RNAs......................................................................
19
4. Mecanismo de ação de micro-RNAs......................................................
25
5. Micro-RNAs e câncer...............................................................................
33
6. Melanoma humano: modelo para estudo da progressão tumoral......
38
Objetivos...............................................................................................................
42
Material e Métodos...............................................................................................
42
Resultados............................................................................................................
51
Discussão.............................................................................................................
64
Considerações Finais..........................................................................................
76
Referências Bibliográficas..................................................................................
78
11
RESUMO
MicroRNAs (miRNAs) constituem uma classe de pequenos RNAs (21 a 25
nucleotídeos) não codificadores 0que controlam a expressão gênica através da
repressão da tradução ou degradação do RNA mensageiro (RNAm) alvo. Os
miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II, sendo que os transcritos primários
são clivados no núcleo pela Drosha (uma RNase III). O fragmento resultante
(“hairpin”) é então exportado do núcleo para o citoplasma pela exportina 5, onde é
clivado por uma outra RNase III (Dicer) produzindo um miRNA maduro. O miRNA
maduro é incorporado no RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA) e,
dependendo do grau de complementaridade entre o miRNA e seu transcrito alvo,
poderá levar à degradação do RNAm ou à repressão da tradução. Estudos recentes
indicam que muitos miRNAs estão aberrantemente expressos em vários cânceres
humanos. Entretanto, não há nenhum relato a respeito da expressão dos miRNAs
durante a progressão do tumor. No presente estudo, investigamos a expressão de
21 microRNAs em melanócitos isolados de diferentes estágios (radial, vertical e
metastático) da progressão do melanoma humano e em melanócito não
transformado. A expressão de miRNAs maduros foi analisada por RT-PCR em
tempo real usando oligonucleotídeos em forma de “stem-loop” para as reações de
transcrição reversa e oligonucleotídeos e sondas para a reação de amplificação de
acordo com TaqMan® Micro-RNA Assay (Applied Biosystems). O RNA de
melanócitos não transformados foi obtido comercialmente e usado como referência.
Este foi o primeiro estudo a demonstrar uma expressão aberrante de miRNAs
durante a progressão tumoral, sugerindo o envolvimento de miRNAs no
desenvolvimento do melanoma humano. Nossos resultados mostraram que let-7,
12
miR-16, miR-21, miR-29a, miR-29b-2, miR-146, miR-200a, miR-200b e miR-213 são
“super-expressos”, enquanto miR-34, miR-129.1, miR-194 e miR-205 apresentaram
expressão reduzida durante todos os estágios da progressão do tumor. Verificamos
também que miR-30a-3p, miR-30e, miR-96, miR-145, miR-182, miR-199a e miR-219
são “super-expressos” somente em um estágio da progressão do tumor. A
expressão do miR-215 não teve alteração significante durante a progressão do
tumor. A associação entre a expressão dos miRNAs e os seus efeitos em RNAm
alvos de proto-oncogenes e genes do supressores de tumor ainda não é totalmente
compreendida. Sabe-se, entretanto, que o miR-21 regula negativamente o gene
supressor de tumor TPM1 em células de câncer de mama. A compreensão de como
a expressão de miRNAs é regulada constitui um dos maiores desafios no campo da
pesquisa sobre miRNAs. Neste contexto, este estudo sugere que a expressão de
miR-146 e let-7a poderia ser regulada pela ativação NF-kB através da PKR e que
ambos os miRNAs poderiam estar envolvidos no desenvolvimento do melanoma.
Entretanto, estudos adicionais são necessários para identificar os RNAm alvos a fim
de elucidar a função dos miRNAs na progressão humana do melanoma.
13
ABSTRACT
MicroRNAs (miRNAs) are a class of naturally occurring small non-coding
RNAs (21-25 nucleotides) that control gene expression by targeting mRNAs for
translational repression or degradation. It was demonstrated that miRNAs are
transcribed by RNA polymerase II, and the primary transcripts is cleaved in the
nucleus by the RNase III enzyme Drosha and the resulting hairpin–loop fragment is
then exported from the nucleus to the cytoplasm by exportin 5, where it is cleaved by
the RNase III enzyme Dicer producing a mature miRNA. The mature miRNA is
incorporates into RISC (RNA-induced silence complex) and depending on the degree
of complementarity between miRNA and its target transcript will occur degradation of
mRNA or translational repression. Recent studies indicate that many miRNAs are
aberrantly expressed in various human cancers. However, there is no report
concerning the expression of miRNAs during tumor progression. In the present study,
we investigate the expression of 21 microRNAs in melanocytic cells isolated from
different stages (radial, vertical and metastatic) of human melanoma progression and
in non-transformated melanocytes. The expression of mature miRNAs was evaluated
by using stem-loop RT followed by TaqMan real-time PCR analysis and miRNAs of
non-transformated melanocytes were used as control. This study is the first
demonstration of an aberrant expression of miRNAs during tumor progression,
suggesting that they could be involved in the melanoma development. Our results
showed that let-7, miR-16, miR-21, miR-29a, miR-29b-2, miR-146, miR-200a, miR-
200b and miR-213 are over-expressed, whereas miR-34, miR-129.1, miR-194 e miR-
205 are down-regulated during all stages of tumor progression. We also found that
miR-30a-3p, miR-30e, miR-96, miR-145, miR-182, miR-199a e miR-219 are over-
14
expressed only in on stage of tumor progression. MiR-215 expression had no change
during tumor progression. The correlation between miRNAs expression and their
effects on targets mRNAs of proto-oncogenes and tumor suppressor genes is still not
fully understood. It is noteworthy that miR-21 has been described to down-regulate
the tumor suppressor gene TPM1 in breast cancer cells. To understand how miRNAs
expression is regulated is one the biggest challenges in the field of miRNA research.
Our findings suggest that the expression of miR-146 and let-7a could be regulated by
NF-kB activation through PKR and that both miRNAs could be involved in the
melanoma development. However, additional work is required to identify the target
mRNAs in order to elucidate the role played by miRNAs in human melanoma
progression.
15
INTRODUÇÃO
1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE RNAs NÃO CODIFICADORES DE
PROTEÍNAS
Os recentes estudos sobre o genoma humano revelaram dados
surpreendentes, dentre os quais podemos destacar a identificação de um número de
genes codificadores de proteínas menor do que o esperado por geneticistas e
biologistas moleculares. Verificou-se que apenas 1,4% do genoma humano é
utilizado na produção de transcritos codificadores de proteínas (Erdmann e cols.,
2001a; Erdmann e cols., 2001b; Mattick, 2001; Mattick, 2003; Szymański
e
Barciszewski, 2002). Esses resultados, portanto, têm despertado um grande
interesse sobre os transcritos não codificadores de proteínas (“non-coding RNAs” -
ncRNAs) que representam aproximadamente 98% dos transcritos produzidos pela
célula humana e que poderão desempenhar um papel relevante nos estudos do
genoma funcional (Eddy, 2001; Mattick, 2003).
Os transcritos não codificadores de proteínas (ncRNAs) têm sido classificados
basicamente em dois grupos (Szymański
e Barciszewski, 2002). No primeiro grupo,
estão incluídos aqueles transcritos que são constitutivamente expressos e que
participam de processos celulares normais, como é o caso dos RNAs ribossômicos
na biossíntese de proteínas e do RNA telomerase na síntese do DNA telomérico. Por
outro lado, os transcritos que pertencem ao segundo grupo são expressos em fases
específicas do desenvolvimento de um organismo, bem como durante o processo de
diferenciação celular e podem regular a expressão de outros genes em nível de
16
transcrição e tradução. Por esse motivo, estes transcritos não codificadores de
proteínas são denominados de RNAs reguladores ou riboreguladores, os quais
regulam funções celulares importantes em células eucarióticas (De Lucca e cols.,
2002; Erdmann e cols., 2001a; Erdmann e cols., 2001b; Mattick, 2004; Szymański
e
Barciszewski, 2002). No presente estudo, será dada uma ênfase especial para a
regulação da expressão gênica por meio de RNAs reguladores denominados de
micro-RNAs (miRNAs):
RNA ribossômico
RNA transportador
RNA mensageiro
RNAs reguladores
Síntese proteica
Regulação de funções celulares
Transcrição
Replicação
DNA
Regulação da expressão gênica:
RNAs ativadores da PKR
Micro RNAs
17
2. NOÇÕES BÁSICAS SOBRE Micro-RNAs
O primeiro miRNA, denominado lin-4, foi descoberto por Victor Ambros e
colaboradores em C. elegans em 1993 (Lee e cols., 1993). Por este motivo, o lin-4 é
considerado o paradigma desta crescente e numerosa família de miRNAs (Ambros,
2004; Lau e cols., 2001; Olsen e Ambros, 1999). Esses pesquisadores
demonstraram que o lin-4 apresentava complementaridade parcial com a região 3’-
UTR do RNAm da proteína lin-14 :
Figura 1. Pareamento do lin-4 com a região 3’-UTR do RNAm lin-14
A formação deste complexo entre RNAm lin-14 e lin-4 resulta na inibição da
tradução do RNAm lin-14. Portanto, a regulação da expressão gênica pelo miRNA
lin-4 ocorre em nível pós-transcricional. Embora este mecanismo de regulação
gênica proposto para o lin-4 tenha sido extremamente original, a repercussão
científica foi pequena desde que se atribuiu este fenômeno como peculiar ao
Caenorhabditis elegans. A descoberta do segundo miRNA, denominado let-7,
ocorreu também em C. elegans somente 7 anos após a descrição do lin-4 (Reinhart
e cols., 2000). Verificou-se que o let-7 atuava também em nível pós-transcricional e
18
apresentava complementaridade parcial com a região 3’-UTR do RNAm da proteína
lin-41 (Reinhart e cols., 2000; Lee e Ambros, 2001).
O interesse da comunidade científica pelos miRNAs ocorreu somente quando
estes ncRNA foram recentemente descritos em insetos e mamíferos (Lagos-
Quintana e cols., 2001; Lim e cols., 2003). Os resultados obtidos por vários grupos
de pesquisa sugeriam que o mecanismo de regulação gênica pós-transcricional
através da complementaridade parcial do miRNA com o seu RNAm alvo deveria ser
de caráter universal e estaria envolvido na regulação de importantes funções nas
células eucarióticas. Assim, admite-se que os miRNAs representam
aproximadamente 1% dos genes presentes no genoma humano, o que permite
classificá-los como uma classe abundante de ncRNAs (Ambros e cols., 2003a e
2003b; Lim e cols., 2003; Bentwich e cols., 2005). Por esse motivo, os miRNAs
tornam-se uma área de pesquisa atraente e os principais aspectos relacionados com
a biogênese e o mecanismo de ação de miRNAs já foram elucidados (Bartel, 2004;
He e Hannon, 2004, Karube e cols., 2005; Khvorova e cols., 2003; Lee e cols., 2002;
Lee e cols., 2003; Meister e cols., 2004). Verificou-se que os miRNAs são fitas
simples de 21-22 nucleotídeos filogeneticamente conservados e codificados por
genes localizados nas regiões entre os genes codificadores de proteínas (regiões
intergênicas) e surpreendentemente em íntrons (Bartel, 2004; Mattick, 1994; Mattick
e Gagen, 2001). Observou-se ainda que os miRNAs maduros são processados a
partir de um precursor (pré-miRNA) como indica a Figura 2.
19
Figura 2. Estrutura de um precursor de micro-RNA com o micro-RNA maduro
em negrito.
3. BIOGÊNESE DE Micro-RNAs
3.1. Genes de micro-RNA
Estimativas indicam a existência de 200 a 255 genes de miRNAs, o que
corresponde aproximadamente a 1% dos genes humanos preditos (Lim e cols.,
2003). A maioria dos miRNAs são transcritos de regiões genômicas não descritas
previamente como codificadores para proteínas diferentes. Alguns loci codificadores
para miRNA se encontram próximos do aparato de outros miRNAs sugerindo que
estes possuem suas próprias unidades transcrição; outros estão agrupados em um
único transcrito (“clusterizados”) e apresentam padrões de expressão semelhantes,
implicando que estes são transcritos simultaneamente (Lagos-Quitana e cols., 2001;
Lau e cols., 2001; Lee e cols., 2002; Reinhart e cols., 2002)
Os miRNAs de mamíferos conhecidos podem estar presentes em íntrons
tanto de genes codificadores para proteína (Figura 3a) como de genes não-
codificadores (Figura 3b) e podem ainda estar presentes em éxons de genes não-
codificadores (Figura 3c) (Rodriguez e cols.,2004).
20
Figura 3. Genes de micro-RNAs.
Quanto a localização no genoma, os micro-RNAs são classificados em: (a)
miRNAs intrônicos em transcritos que codificam proteínas; (b) miRNAs
intrônicos em transcritos não codificadores de proteínas; (c) miRNAs exônicos
em transcritos não codificadores de proteínas. As estruturas em “hairpins”
indicam os pri-miRNAs e os retângulos indicam as regiões codificadoras para
proteína.
Os miRNAs intrônicos são coordenadamente expressos com o RNAm do
gene no qual reside, formando um único transcrito primário (Rodriguez e cols.,2004;
Baskerville & Bartel, 2005). Existem também os transcritos primários codificadores
para miRNAs, os quais possuem características semelhantes aos RNAm como cap
5’ m
7
G e cauda poli(A) na extremidade 3’, sugerindo que estes também são
transcritos pela RNA polimerase II (Smalheiser & Torvik, 2005).
Pouco se conhece sobre a regulação transcricional dos pri-miRNAs e como
estão localizados dentro de íntrons, tanto em genes que codificam para proteína
quanto em genes não codificadores, especula-se que os pri-miRNAs poderiam ser
21
então transcricionalmente regulados pelos promotores dos genes (Lagos-Quintana e
cols., 2003).
É importante salientar que os precursores de miRNAs podem ser expressos
em “clusters”, constituindo verdadeiros RNAs policistrônicos, o que ocorre com 37%
dos miRNAs humanos (Altuvia e cols., 2005; He e cols., 2005). A existência de
“cluster” de 2 - 6 precursores de miRNAs sugere que a expressão de alguns tipos de
miRNAs pode ocorrer de forma coordenada, provavelmente através de um único
promotor (Altuvia e cols., 2005).
3.2 Etapas do processo de maturação de miRNAs
O processo de maturação de miRNAs envolve uma série de etapas
mostradas na Figura 3.
Figura 4. Etapas do processamento de micro-RNAs.
22
O produto primário da transcrição do gene de miRNA é denominado pri-
miRNA, o qual apresenta uma estrutura de dupla hélice do tipo “hairpin” (~70
nucleotídeos) e é processado no núcleo por uma ribonuclease do tipo III
denominada Drosha, e seu cofator DGCR8 (“DiGeorge syndrome critical region gene
8”).
A molécula resultante do processamento da Drosha é denominada de
precursor do miRNA (pré-miRNA), o qual é exportado do núcleo para o citoplasma
pela exportina 5 , uma proteína de exportação nuclear dependente de Ran-GTP
como cofator (Lund e cols., 2004).
No citoplasma, o pré-miRNA sofre a ação de outra ribonuclease do tipo III
denominada Dicer e dá origem a um pequeno e imperfeito duplex dsRNA (miRNA:
miRNA *) que contém tanto a fita de miRNA maduro quanto sua fita anti-senso
(miRNA *) (Hutvágner e cols., 2001; Grishok e cols.,2001; Ketting e cols., 2001;
Karube e cols., 2005; Lee e cols., 2003; Meister e cols., 2004).
O produto da Dicer é incorporado por um complexo multimérico denominado
RISC (RNA-induced silence complex), o qual contém proteínas da família Argonauta
como principais componentes. Apenas uma das fitas do duplex de miRNA
permanece no complexo RISC para controlar a expressão pós-transcricional de
genes alvos (Schwarz e cols., 2003).
3.3. Enzimas envolvidas na maturação de miRNAs
A Drosha, que cliva os pri-micro-RNAs, é localizada predominantemente no
núcleo e contém dois domínios tandem de ribonuclease-III (RNase III), um dsRNA
domínio de ligação e um segmento amino-terminal de função desconhecida (Lee e
23
cols., 2003). Apesar das diversas seqüências primárias e estruturas de pri-miRNAs,
Drosha cliva estes em pré-miRNAs de ~70-bp que consiste em uma estrutura de
stem-loop imperfeita (Figura 4) (Lee e cols., 2003). Embora os mecanismos precisos
que Drosha usa para separar precursores de miRNAs permanecam desconhecidos,
diversos estudos indicam que características estruturais dos pri-miRNAs contribuem
para a clivagem pela Drosha tanto in vitro quanto in vivo (Lee e cols., 2003, Zeng &
Cullen, 2003). A eficiência do processamento da Drosha depende do tamanho do
“loop” terminal, da estrutura do “stem” e das seqüências adjacentes ao sítio de
clivagem da Drosha, porque o encurtamento do “loop” terminal, diminuição da
complementaridade dentro do stem e a remoção ou mutação de seqüências
adjacentes ao sítio de clivagem da Drosha, diminuem significativamente ou abolem o
processamento dos pri-miRNAs (Lee e cols., 2003; Zeng & Cullen, 2003).
A Dicer que cliva os pré-miRNAs , contém um possível domínio de helicase,
um domínio de DUF283 (Domain of Unknown Function 283), um domínio PAZ (Piwi-
Argonauta-Zwille), dois domínios tandem de RNase-III e um domínio de ligação ao
dsRNA (dsRBD) de acordo com a Figura 5 (Berstein e cols.,2001).
Uma eficiente clivagem pela Dicer requer a presença de “overhang”
(nucleotídeos proeminetes despareados) e um comprimento de “stem” mínimo,
sendo que o domínio PAZ da Dicer reconhece o produto final da clivagem pela
Drosha, e então posiciona o sítio da segunda clivagem pela RNase-III no “stem” dos
precursores de miRNA (Carmell & Hannon, 2004). A clivagem pela Dicer gera
miRNAs maduros que variam de 21 a 25 nucleotídeos, e tal diferença em tamanho
possivelmente resulte da presença de protuberâncias e “mismatches” no “stem” do
pré-miRNA.
24
Figura 5. Estrutura da ribonuclease III Dicer humana.
É provável que Drosha e Dicer compartilhem mecanismos intimamente
relacionados para o processamento de miRNAs. Os miRNAs de plantas pareçem ser
produzidos de transcritos primários longos, e assim, a maturação destes miRNAs
deve, por necessidade, acontecer diferentemente da maturação de miRNA em
animais, tanto que ainda não foi encontrado nenhum homológo de Drosha em
plantas. Porém, a família Dicer em Arabidopsis thaliana tem um nível de
complexidade que não foi observada em outros organismos estudados. Verificou-se
que há quatro homológos de Dicer em A. thaliana - DCL1, DCL2, DCL3 e DCL4.
Assim, parece possível que aquela função de Drosha possa ser executada por uma
ou mais enzimas Dicer especializadas em plantas. Uma homóloga de Dicer DCL1,
que contém dois sinais de localização nuclear, foi encontrada predominantemente
no núcleo quando expressa como proteína fusionada com GFP (Green Fluorescent
Protein) em estudos de transfecção (Papp e cols., 2003).
25
4. MECANISMO DE AÇÃO DE Micro-RNAs
O miRNA maduro de fita simples é incorporado a um complexo protéico
denominado RISC (RNA-induced silencing complex), o qual direciona o miRNA para
a região de complementaridade na região 3’-UTR do RNAm alvo. Os precisos
mecanismos moleculares pelos quais os miRNAs atuam na repressão pós-
transcricional não estão completamente elucidados. Sabe-se, entretanto, que o RISC
pode efetuar a regulação negativa da expressão de genes por dois principais
mecanismos: clivagem do RNAm ou repressão traducional (Figura 6). Uma vez
incorporado no RISC citoplasmático, o miRNA especificará a clivagem do RNAm
quando ocorrer complementaridade perfeita com o RNAm alvo ou repressão da
tradução no caso de apresentar complementaridade parcial com o seu RNAm alvo
(Hutvágner and Zamore, 2002; Zeng e cols., 2002, 2003; Doench e cols., 2003).
Pareamento perfeito
mRNA
Degradação
miRNA
Pareamento imperfeito
mRNA
miRNA
TRANSCRIÇÃO
PROCESSAMENTO
Micro- RNA maduro
Repressão da tradução
Pareamento perfeito
mRNA
Degradação
miRNA
Pareamento imperfeito
mRNA
miRNA
TRANSCRIÇÃO
PROCESSAMENTO
Micro- RNA maduro
Pareamento perfeito
mRNA
Degradação
miRNA
Pareamento perfeito
mRNA
Degradação
miRNA
Pareamento imperfeito
mRNA
miRNA
Pareamento imperfeito
mRNA
miRNA
TRANSCRIÇÃO
PROCESSAMENTO
Micro- RNA maduro
TRANSCRIÇÃO
PROCESSAMENTO
Micro- RNA maduro
TRANSCRIÇÃO
PROCESSAMENTO
Micro- RNA maduro
Repressão da tradução
Figura 6. Principais mecanismos de ação de micro-RNAs.
26
Apesar de inicialmente se acreditar que a inibição da tradução era o único
mecanismo de atuação dos micro-RNAs animais, vários trabalhos recentes têm
apontado outros mecanismos possíveis como deadenilação, degradação e captura
dos RNAm nos “P-bodies” (Jackson & Standart, 2007; Nilsen, 2007; Pillai e cols.
2007). Entretanto, a inibição da tradução continua sendo considerada como o
mecanismo principal de regulação da expressão gênica por miRNAs em animais
(Nilsen, 2007).
Os componentes do RISC em diferentes organismos e como este complexo
funciona para executar os dois mecanismos aparentemente discrepantes de
silenciamento, não foi ainda elucidado (Denli e Hannon, 2003).
4.1. Inibição da tradução
As primeiras análises da função dos miRNAs foram realizadas em C. elegans,
verificando-se que a abundância de RNAm regulados por miRNAs não sofreu
mudanças substanciais, mas a abundância das proteínas codificada por estes
RNAm foi bruscamente reduzida (Olsen & Ambros,1999; Seggerson e cols.,2002).
Além disso, os RNAm regulados foram detectados nos polissomos (Olsen &
Ambros,1999; Seggerson e cols.,2002) e acoplados a ribossomos capazes de
subseqüente elongação in vitro (Seggerson e cols.,2002). Estas observações
sugeriram que a supressão da produção de proteína mediada por miRNA ocorreria
por um mecanismo que atua após a iniciação da síntese protéica.
O lin-4, primeiro miRNA descoberto ((Lee e cols., 1993), o qual regula
negativamente seu alvo lin-14 reprimindo sua tradução, é um dos melhores
exemplos no estudo do mecanismo de ação de miRNAs (Olsen & Ambros, 1999). O
27
pareamento de bases entre lin-4 e lin-14 (Figura 1) foi confirmado como sendo
crucial para a interação deles in vivo, tanto que mutações que afetam a
complementaridade deles comprometem ou abolem esta regulação negativa (Lee e
cols., 1993). De forma interessante, lin-4 só inibe a síntese protéica de LIN-14 não
afetando a síntese, poliadenilação ou abundância do RNAm lin-14 (Olsen & Ambros,
1999). Além disso, o início da tradução de lin-14 parece acontecer normalmente na
presença de lin-4, pois o RNAm lin-14 está eficientemente incorporado em
polissomos independentemente da expressão de lin-4 (Olsen & Ambros, 1999).
A repressão traducional de genes designados não é específica a lin-4; na
verdade, parece ser o mecanismo predominante pelo qual miRNAs regulam
negativamente seus RNAm alvos no reino animal. A ligação de let-7 e Bantam (que
codifica um miRNA anti-apoptótico) à região 3' UTRs dos seus RNAm alvos regula
negativamente a tradução destes em nematóides e moscas, respectivamente
(Reinhart e cols., 2000; Brennecke, 2003).
Centenas de miRNAs foram agora identificados em vários organismos, e a
estrutura do RNA e mecanismos regulatórios que foram caracterizados em lin-4 e
let-7 ainda fornecem uma assinatura molecular única que é definida como miRNAs.
Pelo menos em animais, a maioria dos miRNAs liga-se na região 3'-UTR do RNAm
alvo com complementaridade imperfeita e funciona como repressores traducionais
(Bartel, 2004). Em muitos casos, miRNAs ligam-se à região 3'-UTRs por
complementaridade imperfeita em sítios múltiplos, e então regula negativamente a
expressão ao nível de tradução. Embora a maioria dos miRNAs animais reprimam
tradução, foi verificado recentemente que o miR-196 que induz a clivagem do RNAm
do Hoxb8, o qual é o seu RNAm alvo (Yekta e cols., 2004).
28
Embora estudos subseqüentes mostrem que os miRNAs podem exercer seus
efeitos por uma variedade dos mecanismos, há numerosos exemplos em que a
redução da produção da proteína mediada por miRNA não é acompanhada por
mudanças correspondentes na abundância do RNAm (Zhao e cols 2005; O’Donnell
e cols.,2005; Saito e cols., 2006; Chen e cols .,2006; Boutz e cols., 2007).
Estudos recentes fornecem evidências de que a repressão da produção de
proteína ocorre após o início da síntese (Maroney e cols., 2006; Nottrott e cols.,
2006; Petersen e cols., 2006). Maroney e cols. (2006) estudaram a associação de
miRNAs com RNAm em células HeLa e verificaram que um RNAm regulado por
miRNA encontrava-se exclusivamente nos polissomos e associados com os
ribossomos que se encontravam na fase de elongação da síntese de proteínas.
Outros autores demonstraram que um RNAm, descrito como alvo de um
miRNA endógeno, estava também presente nos polissomos (Nettrott e cols., 2006).
Diversas linhas de evidência mostraram que estes polissomos estavam traduzindo
ativamente; entretanto, os polipepitídeos nascentes não puderam ser detectados por
imunoprecipitação, sugerindo que a repressão da acumulação de proteína resultou
da degradação co-traducional da proteína, ou seja, a degradação da proteína foi
concomitante com a tradução do RNAm alvo (Nettrott e cols., 2006). No terceiro
estudo, uma construção do repórter contendo um 3’-UTR com os sítios projetados
como alvo para um miRNA sintético que tivesse complementaridade extensiva, mas
imperfeita, àqueles sítios foi mostrada como reprimida traducionalmente e associada
com os polissomos (Humphreys e cols., 2005). Neste caso, a evidência sugeriu que
o deficit na produção da proteína resultou do término prematuro da tradução (“drop
off” prematuro do ribossomo) (Humphreys e cols., 2005).
29
Em contraste, outros dois trabalhos demonstraram que os miRNAs inibem o
início da síntese protéica (Pillai e cols., 2005; Humphreys e cols., 2005). Pillai e cols.
(2005) demonstraram que um miRNA endógeno reduziu a associação dos
polissomos em uma construção de um gene “repórter” com os sítios alvos
apropriados. Humphreys e cols. (2005) demonstraram que o cap na extremidade 5’ e
a cauda de poli (A) na extremidade 3’ são necessários para a repressão completa da
tradução. Como a associação dos ribossomos e o cap na extremidade 5’ são
essências para a iniciação da tradução, conclui-se que a repressão da iniciação da
tradução é necessária para uma reprresão completa da tradução da proteína.
4.2. De-adenilação e degradação do RNAm
Conforme salientado anteriormente, a inibição da tradução é o principal, mas
não o único mecanismo de ação dos miRNAs. Há numerosos exemplos de miRNAs
que destabilizam e/ou degradam seus RNAm alvos. Lim e cols. (2005), por exemplo,
transfectaram os miRNAs miR-1 e miR-124 (específicos do músculo e cérebro,
respectivamente) em células HeLa (que normalmente não os expressam) e
encontraram redução na abundância de diversos RNAm, a maioria destes, contendo
sítios alvos para o miRNA transfectado. Além disso, a análise de diversos RNAm
alvos de miRNAs em C. elegans revelou que estes também tiveram abundância
reduzida pela ação dos miRNAs (Bagga e cols. 2005).
Existem evidências, resultantes do estudo de diversas espécies e de RNAm
distintos, de que a desestabilização do RNAm mediada por miRNA seja uma
conseqüência da de-adenilação seguida pela remoção do cap 5’. Estes estudos
sugerem que o aumento da de-adenilação pode ser uma conseqüência geral de
30
interações do miRNA-RNAm (Behm-Ansmant e cols., 2006; Giraldez e cols.,2006;
Wu e cols.,2006).
A repressão da síntese da proteína não é responsável pela deadenilação:
dois grupos mostraram que os RNAm que não podem ser traduzidos, por causa de
um “stem-loop” forte no 5’-UTR ou de um cap defeituoso, são ainda sujeitos à
deadenilação (Wu e cols.,2006; Mishima e cols.,2006).
Em plantas, a maioria dos miRNAs estudados leva a degradação do RNAm
alvo (Hake, 2003). Estes miRNAs diferem dos miRNAs animais pelo fato de que o
pareamento entre eles e seus alvos é quase perfeito e que os sítios aos quais são
complementares ficam situados ao longo das regiões transcritas do gene designado,
em vez de ser limitado a região 3'-UTRs. Quando um miRNA direciona para uma
clivagem, o corte é feito precisamente entre os nucleotídeos pareados aos resíduos
10 e 11 do miRNA partindo da extremidade 5’(na região de codificação ou nas
UTRs), condenando o seu RNAm designado à destruição por clivagem e
degradação (Elbashir cols., 2001; Hutvágner & Zamore, 2002; Llave e cols., 2002;
Kasschau e cols., 2003). Depois da clivagem do RNAm, o miRNA permanece intacto
e pode guiar o reconhecimento e destruição de outros RNAm (Hutvágner & Zamore,
2002; Tang e cols., 2003). Uma exceção é o miR-172, que age como um repressor
traducional em plantas (Chen, 2004; Llave e cols., 2002; Rhoades, 2002).
4.3. Captura de RNAm e formação de “P-bodies”
Está claro que a repressão mediada por miRNA pode ser manifestada pela
inibição da tradução e/ou pelo aumento da degradação do RNAm. Uma variedade
de estudos bioquímicos e celulares tem convergido na indicação de um papel central
31
para os focos citoplasmáticos conhecidos como “P-body” em ambos os processos.
Têm sido demonstrado que os “P-bodies” contêm a co-localização em altas
concentrações de enzimas envolvidas na desestabilização e degradação do RNAm
como enzimas de “decapping”, deadenilases e exonucleases (Valencia-Sanchez e
cols., 2006).
Embora muitas outras proteínas tenham sido encontradas nos “P-bodies”
(Eulálio e cols., 2006), a exata composição destes ainda não foi determinada.
Diversos grupos mostraram proteínas da família Argonauta (que se ligam aos
miRNAs) localizadas nos “P-bodies” (Pillai e cols., 2005; Chu &Rana, 2006; Sen &
Blau,2005; Liu e cols., 2005). Além disso, as análises de co-immunoprecipitação
indicam que as proteínas Argonautas interagem de forma RNA-independente com os
componentes dos “P-bodies” conhecidos: DCPlA e GW182 (Behm-Ansmant, e cols.,
2006; Meister e cols., 2005; Liu e cols., 2005). Além disso, Liu e cols. (2005)
demonstraram que os RNAm alvejados se localizam nos “P-bodies” de forma
miRNA-dependente.
Juntos estes dados fornecem a base para um modelo direto e atrativo de
mecanismo de ação dos miRNAs. De forma simples, um miRNA ligado a uma
proteína Argonauta reconhece seus RNAm alvo por pareamento de bases; a
proteína de Argonauta, por sua vez, interage com o GW182, e o complexo RNAm-
miRNA- Argonauta é encaminhado aos “P-bodies”. No “P-body”, o RNAm alvo é
deadenilado pelas deadenilases presentes, então decapeado e degradado ou
removido da maquinaria traducional (uma vez que os “P-bodies” são destituídos de
ribossomos) (Pillai e cols., 2005; Valencia-Sanchez e cols., 2006). Este modelo tem
a vantagem de racionalizar o todo o conteúdo da literatura atual a respeito dos
mecanismos de ação dos miRNAs (Nilsen, 2007).
32
Embora a hipótese dos “P-bodies” seja sustentada por diversas linhas de
evidência, diversas observações parecem ser incompatíveis com a idéia que o
processamento nos “P-bodies” esclareçam toda a regulação por miRNA (Nilsen,
2007). Principalmente, o fato de que o knockdown de um componente do “P-body”
causou desaparecimento de focos visíveis mas não comprometeu a função dos
micro-RNAs (Chu &Rana, 2006).
Enfim, apesar do rápido progresso e da riqueza de informações, o estudo dos
mecanismos de regulação gênica através de miRNAs está apenas começando. É
provável que existam mecanismos distintos corroborando e talvez estes se
sobreponham
Em resumo, os possíveis mecanismos de ação dos micro-RNAs estão
ilustrados na Figura 7.
Figura 7. Mecanismos de ação dos micro-RNAs.
33
5. Micro-RNAs E CÂNCER
Apesar de mais de 450 micro-RNAs terem sido descritos no genoma humano,
as funções desempenhadas por estes ncRNAs não foram ainda completamente
elucidadas (Lim e cols., 2003; Ambros, 2004; Alvarez-Garcia & Miska 2005). Entre
os motivos principais deste fato é que o interesse pelo estudo dos miRNAs ocorreu
somente nos últimos 4 anos, além das dificuldades surgidas na identificação dos
RNAm alvos. Assim, podemos salientar que os miRNAs lin-4 e let-7, membros
fundadores desta classe abundante de ncRNAs, são os mais conhecidos e já está
bem estabelecido que estes miRNAs regulam o desenvolvimento larval em C.
elegans (Ambros, 2004; Lau e cols., 2001).
Estudos recentes revelaram que os miRNAs estão envolvidos na regulação
da proliferação celular, apoptose, diferenciação neuronal e de células
hematopoiéticas (Chen & Lodish., 2005; Lim e cols., 2003; Mette e cols., 2000;
Metzler e cols., 2004; Nelson e cols., 2004). Mais recentemente, foi sugerido que os
miRNAs estariam relacionados com a patogênese do câncer humano, pois se admite
que acima de 50% dos genes de miRNAs estão localizados em regiões associadas
com deleção, amplificação e translocação em câncer (Calin e cols., 2004a, Calin e
cols., 2004b, Croce, 2004; McManus, 2003, Wiemer, 2007).
Vários trabalhos têm classificado os miRNAs como oncogenes e supressores
de tumor de acordo com o RNAm que eles regulam (Figura 8). Assim, quando um
micro-RNA regula um oncogene, ele é considerado um supressor de tumor e a
redução da sua expressão pode levar a instabilidade genômica, diminuição da
apoptose, aumento da proliferação celular e da angiogênese, culminando no
estabelecimento de um tumor. De forma inversa, quando este regula um gene
34
supressor de tumor, é considerado um oncogene e a sua “super-expressão”
também pode levar ao desenvolvimento de um tumor (Chen., 2005; Morris &
McManus, 2005; Esquela-Kerscher & Slack, 2006; Garzon e cols.,2006; Hammond,
2006; Zhang e cols.,2006, Wiemer, 2007).
Figura 8. MicroRNAs como oncogenes e supressores de tumor.
A primeira evidência de que os micro-RNAs agiriam como supressores de
tumor foi a expressão reduzida dos miR-15 e miR-16 em leucemia linfocítica crônica
(LLC). Esses micro-RNAs estão localizados em uma região cromossômica
freqüentemente deletada em LLC (Calin e cols 2002). Posteriormente, Cimmino e
cols. (2005) mostraram que esses dois micro-RNAs regulavam negativamente o
gene BCL2 (B-cell LLC/lymphoma 2) um gene anti-apoptótico freqüentemente
“super-expresso” em LLC (Sanchez-Beato e cols., 2004). Também em adenomas
hipofisários, a expressão destes micro-RNAs encontra-se reduzida. Esta expressão
35
está, ainda, inversamente associada com o tamanho do tumor (Bottoni e cols.,
2005).
O primeiro micro-RNA encontrado “super-expresso” em câncer (considerado
oncogene) foi o miR-155 em linfoma de Burkitt (Metzler e cols.,2004).
Posteriormente, a “super-expressão” do miR-155 foi também observada em outros
tipos de linfomas, sendo que os níveis mais altos foram encontrados nos linfomas
mais agressivos (Metzler e cols.,2004; Eis e cols.,2005). Este miRNA está localizado
numa região filogeneticamente conservada do gene BIC, considerado um proto-
oncogene (Tam, 2001; Tam e cols., 2002)
O miR-143 e miR-145, foram os primeiros miRNAs que tiveram alteração da
expressão descrita em tumores sólidos. Estes foram encontrados com expressão
reduzida em casos de câncer de cólon humano (Michael e cols., 2003).
Posteriormente, essa alteração também foi observada em câncer de mama humano
(Iorio e cols.,2005).
Entretanto, os resultados mais relevantes foram obtidos com o miRNA let-7,
verificando-se que a sua expressão está diminuída (redução maior que 80%) em
44% dos pacientes com câncer de pulmão e que esses pacientes possuem uma
menor sobrevida pós-cirúrgica (Takamizawa e cols., 2004).
Outro resultado significante foi a demonstração que o miRNA let-7 regula
negativamente o proto-oncogene ras, sendo que a região 3’-UTR do RNAm do ras
humano contém vários sítios de ligação para o let-7 (Johnson e cols., 2005). Este
trabalho constitui o primeiro exemplo descrito sobre o mecanismo molecular de um
miRNA envolvido na patogênese de um câncer humano. Desta maneira, o miRNA
let-7 poderá se transformar em parâmetro molecular de diagnóstico e prognóstico
para os pacientes com câncer de pulmão.
36
O cluster miR-17-92 também apresentou alteração da expressão em câncer
de pulmão humano. Verificou-se que, ao contrário do let-7, o cluster miR-17-92
apresentou a expressão muito aumentada nos tecidos tumorais, principalmente nas
formas mais agressivas (Hayashita e cols., 2005). Dentre os alvos preditos estão os
supressores de tumor PTEN e RB2 (Lewis e cols., 2003). Apesar de não haver
evidências experimentais que estes sejam verdadeiramente os alvos do cluster miR-
17-92, a atuação destes como oncogenes foi reforçada pela associação entre o
cluster miR-17-92 e o oncogene c-myc, freqüentemente amplificado ou “super-
expresso” em câncer de pulmão como descrito por O’Donnell e cols. (2005).
Tabela 1. Relação entre alguns micro-RNAs e câncer.
Micro-RNA
Expressão em câncer Função Referências
miR-15 e
miR-16
Expressão reduzida em
leucemia linfocítica crônica
(LLC); regulam negativamente
o gene anti-apoptótico BCL2
Supressor
de Tumor
( Calin e cols. 2002;
Cimmino e cols., 2005)
miR-155
Expressão aumentada em
linfomas e câncer de mama
localizado no gene BIC (um
proto-oncogene)
Oncogene
(Metzler e cols.,2004;
Iorio e cols., 2005; Tam,
2001)
miR-143 e
miR-145
Expressão reduzida em
tumores sólidos e câncer de
mama
Supressor
de Tumor
(Michael e cols., 2003;
Iorio e cols., 2005)
let-7
Expressão reduzida em
câncer de pulmão; regula
negativamente o proto-
oncogene ras
Supressor
de Tumor
(Takamizawa e cols.,
2004, Johnson e cols.,
2005)
cluster
miR-17-92
Expressão aumentada em
diversos tipos de câncer,
dentre eles, câncer de
pulmão; associado ao
oncogene c-myc.
Oncogene
(Hayashita e cols., 2005;
O’Donnell e cols., 2005)
37
O perfil de expressão de micro-RNAs em câncer humano pode ser utilizado
eficientemente na classificação tumoral (Ricarte Filho & Kimura, 2006). Analisado
200 cânceres humanos, dados de expressão de 217 miRNAs foram mais eficientes
na definição de tipo de câncer do que 16.000 RNAm, mostrando a extrema utilidade
destes perfis de expressão no diagnóstico de câncer (Lu e cols.,2005).
Yanaihara e cols. (2006) compararam o perfil de expressão de miRNAs de
pacientes com câncer de pulmão com controles saudáveis e obtiveram uma
assinatura única constituída de 42 micro-RNAs que expressos de forma distintiva
entre tecidos tumorais versus tecidos normais. Muitos desses 42 miRNAs estão
associados a sítios frágeis e regiões amplificadas em câncer. Esses miRNAs ainda
foram analisados quanto à sua associação com a sobrevida dos pacientes. Foi
descoberto então que altos níveis de expressão de miR-155 e baixos níveis de let-
7a-2 estão associados à um prognóstico ruim com baixa sobrevida.
Em câncer de mama, o perfil de expressão de miRNAs também foi estudado
e a expressão foi asociada com características patológicas específicas como: status
do receptor de estrógeno, estágio do tumor, invasão vascular e índice de
proliferativo. Os micro-RNAs com maior alteração na expressão foram: miR-10b,
miR-125b, miR-145 (expressão diminuída) e miR-155 e miR-21 (expressão
aumentada) (Iorio e cols.,2005).
Um aspecto que ainda não havia sido investigado é a expressão de miRNAs
durante as diferentes fases do crescimento de um mesmo tumor. O melanoma
humano constituiu um excelente modelo para se atingir este objetivo, devido à
existência de linhagens celulares derivadas de melanoma humano em diferentes
estágios da progressão tumoral (Meier e cols., 1998).
38
6. MELANOMA HUMANO: MODELO PARA ESTUDO DA PROGRESSÃO
TUMORAL
Os casos de câncer vêm aumentando constantemente no Brasil e no mundo.
O Instituto Nacional de Câncer previa 472.050 novos casos de câncer no país em
2006 segundo as Estimativas de Incidência de Câncer no Brasil. Estima-se que
destes, 5760 casos seriam de melanoma. Apesar da baixa incidência quando
comparado aos outros tipos de câncer (correspondendo apenas cerca de 4% dos
cânceres de pele), o melanoma requer atenção máxima devido a sua alta letalidade.
Nos últimos anos, houve uma grande melhora na sobrevida dos pacientes
com melanoma, principalmente devido à detecção precoce do mesmo. Nos países
desenvolvidos, a sobrevida média estimada em cinco anos é de 73%, enquanto que,
para os países em desenvolvimento, a sobrevida média é de 56%. A média mundial
estimada é de 69%.
A classificação de um câncer de pele em melanoma depende do tipo de
célula do qual se originou. Assim, o câncer de pele pode ser dividido em dois tipos:
melanoma (originado de melanócitos) e não melanoma (derivado de células
epiteliais que não os melanócitos).
Os melanócitos são células responsáveis pela produção de melanina (o
pigmento escuro da pele) e residem sobre a membrana basal que separa a
epiderme da derme no tecido subcutâneo. Eles se encontram aderidos aos
queratinócitos, responsáveis pelo controle de seu fenótipo e crescimento. Este
controle pode ser quebrado quando os melanócitos deixam de produzir moléculas de
39
superfície responsáveis pela adesão tecido-específica dando origem a um nevus,
que nada mais é do que um aglomerado de células normais.
A produção de outros tipos de proteínas de superfície celular possibilita a
interação do melanócito com outros tipos celulares como fibroblastos e células
endoteliais levando a transformação do melanócito em melanoma. Durante a
transformação e progressão dos melanócitos em melanoma ocorrem alterações na
comunicação dos melanócitos com as células do seu microambiente, resultando em
interações das células neoplásicas entre si e com outras células adjacentes
(Bogenrieder & Herlyn, 2002).
O estabelecimento do melanoma maligno é um processo que envolve várias
fases. A progressão fenotípica envolvida durante este processo inicia-se com lesões
melanocíticas benignas, as quais passam por fenótipos de displasia crescente,
culminando em um tumor altamente invasivo e metastático (Bardeesy e cols., 2000).
O modelo descrito para a progressão do melanoma segundo suas características
clínicas e histopatológicas (Meier e cols., 1998), propõe o estabelecimento de cinco
estágios principais: (a) nevus comum congênito ou adquirido: melanócitos
estruturalmente normais; (b) nevus displásico: melanócitos com atipia estrutural e
arquitetural; (c) melanoma primário em fase de progressão radial: confinado à
epiderme crescendo lateralmente; (d) melanoma primário em fase de crescimento
vertical: início da invasão da derme e aquisição de competência para a metástase;
(e) melanoma metastático. A Figura 9 ilustra as diferentes fases de crescimento do
melanoma humano:
40
Figura 9. Fases de crescimento do melanoma humano.
A progressão tumoral ocorre na ausência do balanço homeostático entre
crescimento, diferenciação e morte celular. O principal responsável por esse
desequilíbrio é o acúmulo de alterações gênicas, o qual tem sido relacionado à
progressão do melanoma maligno, entretanto os detalhes do que determinam cada
fase da progressão do melanoma são pouco conhecidos. A progressão tumoral,
desde o aparecimento de uma displasia até a formação de um melanoma
metastático, envolve uma série de processos, dentre eles: crescimento do tumor
primário, vascularização, invasão para os tecidos circundantes, penetração nos
vasos sangüíneos ou linfáticos, circulação e disseminação, adesão às células
endoteliais ou membrana basal, extravasamento dos vasos, migração e crescimento
nos órgãos alvo. Essa cascata de processos complexos que culminam com a
metástase requer a participação de vários genes (Bogenrieder & Herlyn, 2002).
41
É importante salientar que a maioria dos estudos sobre os mecanismos
moleculares envolvidos no estabelecimento e desenvolvimento de melanomas têm
sido realizada em linhagens celulares. Embora existam diferenças entre os
melanomas cultivados e os não cultivados, foi demonstrado que as linhagens
celulares obtidas de melanomas em diferentes fases de progressão tumoral
apresentam estabilidade genômica e propriedades biológicas compatíveis com seu
comportamento in vivo (Herlyn e cols., 1985, Herlyn e cols., 1987). Assim, as
linhagens celulares originadas de melanomas em diferentes estágios da progressão
tumoral constituem um excelente modelo para o estudo e caracterização dos genes
envolvidos nesse processo (Ryu e cols., 2007; Przybylo e cols., 2007).
42
OBJETIVOS
O presente trabalho tem como objetivo geral a avaliação da expressão de
micro-RNAs durante a progressão tumoral de melanoma humano, utilizando como
modelo experimental as linhagens celulares estabelecidas a partir das diferentes
fases de crescimento deste tumor.
Entre os objetivos específicos podemos destacar:
• Análise de miRNAs que apresentaram da expressão alterada em
outros tipos de câncer humano: let-7, miR-21, miR-29-a, miR-29b-2
miR-34, miR-96, miR-145, miR-146, miR-199, miR-200a, miR-200b,
miR-205, miR-214.
• Avaliar a expressão de miRNAs cujos genes estão presentes nos
cromossomos 1, 6 e 7, nos quais já foram descritas alterações do tipo
deleção e translocação em células de melanoma humano: miR-30a-
3p, miR- 30e, miR-182, miR-194, miR-213, miR-215 e miR-219.
43
MATERIAL E MÉTODOS
Linhagens celulares
As linhagens celulares correspondentes as diferentes fases de crescimento
do melanoma humano tais como fase de crescimento radial (linhagem WM 1552),
crescimento vertical (linhagem WM 278) e crescimento metastático (linhagem WM
1617) foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino,
gentamicina 0,1%, em atmosfera úmida de 5% de CO
2
a 37
º
C. As linhagens
celulares de melanoma humano foram estabelecidas pelo Dr. Meenhard Herlyn
(http://www.wistar.upenn.edu/herlyn) e gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Enilza
M. Espreafico, docente da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.
Seleção de miRNAs
Conforme salientado anteriormente, foi verificado que acima de 50% dos
genes de miRNAs estão localizados em regiões associadas com deleção,
amplificação e translocação em câncer (Calin e cols., 2004a; Calin e cols., 2004b;
Croce, 2004; McManus, 2003). Portanto, o primeiro critério para seleção dos micro-
RNAs a serem analisados foi a existência de alteração da expressão descrita em
câncer.
O primeiro micro-RNA selecionado foi o let-7, pois verificou-se que a
expressão deste miRNA está reduzida no câncer de pulmão e que o RNAm alvo do
let-7 é o RNAm do proto-oncogene ras (Takamizawa e cols., 2004; Johnson e cols.,
2005).
44
Em seguida, foram selecionados: o miR-21 , “super-expresso” em vários tipos
de câncer (Chan e cols., 2005b; Calin & Groce, 2006); a família miR-29 (miR-29-a e
miR-29b-2) com expressão alterada em leucemia linfocítica crônica (Pekarsky e
cols., 2006); miR-34, com expressão reduzida em neuroblastoma (Welch e cols.,
2007); miR-96, com expressão aumentada em câncer colo-retal (Bandrés e cols.,
2006); miR-145, com expressão reduzida em câncer de mama (Iorio e cols., 2005) e
neoplasia colo-retal (Michael e cols., 2003); miR-146, “super-expresso” em
carcinoma da tireóide (He e cols., 2005), miR-199 e miR-200a, com expressão
reduzida em carcinoma hepatocelular (Murakami e cols. 2006); miR-200b, “super-
expresso” em colangiocarcinoma (Meng e cols., 2006); miR-205, “super-expresso”
em câncer de cabeça e pescoço (Tran e cols., 2007); miR-214, alterado em câncer
de pulmão (Cheng e cols., 2005).
Sabendo que as células de melanoma humano apresentam alterações
cromossômicas do tipo deleção e translocação envolvendo os cromossomos 1, 6 e 7
(Herlyn e cols., 1985; Herlyn e cols., 1987) foram também avaliados alguns miRNAs
sem alteração descrita em câncer, porém localizados nestes cromossomos: miR-
30a-3p, miR- 30e, miR-182, miR-194, miR-213, miR-215 e miR-219.
Extração de RNA
A extração de RNA das células das diferentes linhagens de melanoma
humano foi realizada pelo método do Trizol (Invitrogen - Gibco). Aproximadamente 5
x 10
6
células foram homogeneizadas em microtubos de 1,5 mL com 1,0 mL de
Trizol, até a completa solubilização. Em seguida, a mistura foi incubada por 10
minutos à temperatura ambiente para permitir a completa dissociação dos
complexos de nucleoproteínas. Decorrido este tempo, foi adicionado à mistura 0,2
45
mL de clorofórmio e as amostras foram agitadas vigorosamente por 1 minuto e
incubadas à temperatura ambiente por 5 minutos, sendo posteriormente
centrifugadas a 12000 x g por 15 minutos a 4° C. Após esta etapa de centrifugação,
a mistura apresentou uma fase inferior vermelha (fase fenol-clorofórmio), uma
interfase e uma fase aquosa superior incolor. O DNA se apresenta na fase orgânica
ou vermelha e as proteínas na interfase, enquanto que o RNA permanece
exclusivamente na fase aquosa. Assim, fase aquosa foi transferida para um novo
microtubo de 1,5 mL e o RNA precipitado pela adição de 0,5 mL de isopropanol/mL
de Trizol utilizado na homogeneização inicial, e incubado à temperatura ambiente
por 10 minutos. O RNA foi então recuperado por centrifugação a 12000 x g por 10
minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com 1 mL de
etanol 75% (v/v) com água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), e em seguida
centrifugado a 7500 x g por 5 minutos a 4°C. Ao precipitado final foi adicionado 1 mL
de etanol absoluto e a amostra será estocada a - 80°C.
RNA de melanócito
O RNA de melanócito utilizado neste estudo foi obtido da Gentaur Europe
Molecular Products ( Bruxelas, Bélgica).
Quantificação do RNA
O RNA foi seco em corrente de nitrogênio gasoso para retirar o excesso de
etanol. O precipitado foi dosado espectrofotometricamente, considerando-se que
uma unidade de absorvância a 260 nm equivale a 40 µg de RNA/mL. Foram também
realizadas leituras espectrofotométricas nos comprimentos de ondas de 220 e 280
46
nm. Nos experimentos foram utilizadas somente as preparações de RNA que
apresentarem relações de absorbância 220/260 = 0,65 - 0,80 e 260/280 = 1,9 - 2,0,
pois são consideradas livres de fenol e de proteínas, respectivamente. A integridade
das preparações de RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose 1%.
PCR em tempo real
A quantificação da expressão dos miRNAs foi realizada por PCR em tempo
real (quantitativo) utilizando-se o método descrito por Chen e cols. (2005). De acordo
com este método, os oligonucleotídeos anelam-se aos miRNAs maduros, criando
uma extensão em “stem-loop” durante a reação da transcriptase reversa, originando
um cDNA maior que permite o alinhamento dos oligonucleotídeos e da sonda
TaqMan® durante a reação de PCR em tempo real como ilustra a figura abaixo:
47
Figura 10. Análise da expressão de micro-RNAs por RT-PCR em tempo real
(TaqMan® Micro-RNA Assay).
A reação de transcrição reversa (RT) foi feita usando o protocolo padrão do
TaqMan® Micro-RNA RT Kit (Applied Biosystems) com os oligonucleotídeos “stem-
loop” do TaqMan® Micro-RNA Assays Human Panel como descrito abaixo:
RT primer específico 1,5 µL
dNTP (100mM) 0,075 µL
tampão RT 10X 0,75 µL
inibidor de RNAse (20U/ µL) 0,094 µL
transcriptase Multiscribe (50 U/ µL) 0,5 µL
água livre de nucleases 2,08 µL
RNA total 10 ng (2,5 µL)
Volume total 7,5 µL
A reação foi incubada em termociclador PCR Thermo-Hybaid com a seguinte
programação:
16ºC 30 minutos
42ºC 30 minutos
85ºC 5 minutos
4ºC ∞
48
Os seguintes genes considerados constitutivamente expressos foram
testados como possíveis controles endógenos: ACTB (β–actina), GAPDH
(gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), GUSB (β-glucuronidase), RPLO (“large
ribossomal protein”) e TBP (“TATA-box binding protein”). Em todos os ensaios foram
usados os oligonucleotídes e sonda MGB específicos (TaqMan® Endogenous
Controls). Os melhores resultados foram obtidos com a β-actina, a qual foi utilizada
como controle endógeno em nossos experimentos.
No caso da β-actina, bem como dos outros controles endógenos testados, a
transcrição reversa foi feita utilizando-se os reagentes do kit TaqMan® Micro-RNA
RT Kit (Applied Biosystems) com os oligonucleotídeos randômicos (Random
Hexamers 50 µM, Applied Biosystems) de acordo com o seguinte protocolo:
tampão 10X 5,0 µL
dNTP (100mM) 1,0 µL
oligonucleotídeos randômicos 5,0 µL
transcriptase reversa Multiscribe (50 U/ µL) 3,0 µL
1 µg de RNA 5,0 µL
água livre de nucleases q.s.p. 50 µL
A mistura acima foi incubada no termociclador PCR Thermo-Hybaid por 1
hora a 42°C.
A reação de amplificação para análise dos miRNAs foi realizada com os
reagentes TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), os oligonucleotídeos
49
e sondas do TaqMan® Micro-RNA Assays Human Panel (Applied Biosystems). Para
cada reação, foram utilizados:
Master Mix 5,0 µL
conjunto de oligonucleotídeos e sonda específicos 1,0 µL
cDNA diluído (1:4) 4,0 µL
Volume total 10,0 µL
Para análise do controle endógeno, a amplificação foi realizada com o
conjunto de oligonucleotídeos e sonda específicos para a β-actina humana (Pre-
Developed TaqMan Assay Reagentes Human β-actin, Applied Biosystems) de
acordo com o seguinte protocolo:
Master Mix 5,0 µL
conjunto de oligonucleotídeos e sonda específicos 0,5 µL
cDNA diluído (1:4) 4,5 µL
Volume total 10,0 µL
As reações de amplificação foram realizadas em sistema de PCR em tempo
real (Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System) com a programação:
50
1 ciclo 95ºC 10 minutos
95ºC 15 segundos
40 ciclos
60ºC 1 minuto
A expressão relativa dos miRNAs analisados foi determinada usando-se o
método 2
−∆∆Ct
(Livak & Schmittgen, 2001). O Ct (cycle threshold ) foi definido como
o número fracionado de ciclos em que a fluorescência detectada passa pelo limiar
fixado dentro da fase exponencial da curva de amplificação (threshold). Inicialmente,
foram calculadas as médias e o desvio padrão dos valores de Ct obtidos nas
duplicatas de cada amostra. O Ct médio de cada amostra foi normalizado através da
subtração do Ct médio do controle endógeno correspondente (∆Ct = Ct amostra - Ct
endógeno). Para cada miRNA, o valor de ∆Ct foi normalizado novamente em relação
à amostra de calibradora ou referência (∆∆CT = ∆Ct amostra - ∆Ct amostra de
calibradora). Esse valor é usado na expressão 2
−∆∆CT
. De acordo com Livak &
Schmittgen (2001), o valor obtido desta expressão reflete a proporção da expressão
do gene estudado em cada amostra em relação à amostra calibradora (RNA de
melanócitos não transformados). Foram considerados aceitáveis as duplicadas com
desvio padrão menor ou igual à que 0,2. A expressão de cada miRNA foi analisada
em três experimentos independentes para confirmação do perfil obtido.
51
RESULTADOS
Os perfis de expressão dos miRNAs, nas diferentes fases de crescimento do
melanoma humano, apresentaram uma grande diversidade. De acordo com Pineles
e cols. (2007), uma alteração de duas ou mais vezes da expressão de um miRNA é
considerada significante. Adotando este critério, verificamos no presente trabalho
que alguns miRNAs apresentaram aumento da expressão, outros sofreram redução,
houve ainda os que apresentaram uma alteração atípica com aumento em apenas
uma fase e apenas um miRNA que não sofreu alteração significante. Assim, os
miRNAs foram classificados em quatro grupos de acordo com as alterações de
expressão detectadas nas várias fases do crescimento do melanoma humano em
relação aos melanócitos não transformados:
• Grupo I - Composto por miRNAs que apresentaram aumento
significante na expressão durante todos os estágios da progressão tumoral:
let-7, miR-16, miR-21, miR-29a, miR-29b-2, miR-146, miR-200a, miR-200b,
miR-213.
52
let-7a
0
2
4
6
8
10
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 11. Expressão do miR-let-7a em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-let-7a em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-16
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 12. Expressão do miR-16 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-16 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
53
miR-21
0
10
20
30
40
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 13. Expressão do miR-21 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-21 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-146
0
1
2
3
4
5
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 14. Expressão do miR-146 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-146 em melanócito foi padronizada como referência.
Esse experimento é representativo de três experimentos independentes.
54
miR-29a
0
1
2
3
4
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 15. Expressão do miR-29a em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-29a em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-29b-2
0
1
2
3
4
5
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 16. Expressão do miR-29b-2 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-29b-2 em melanócito foi padronizada como referência.
Esse experimento é representativo de três experimentos independentes.
55
miR-200a
0
1
2
3
4
5
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 17. Expressão do miR-200a em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-200a em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-200b
0
2
4
6
8
10
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 18. Expressão do miR-200b em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-200b em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
56
miR-213
0
20
40
60
80
100
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 19. Expressão do miR-213 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-213 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
• Grupo II - Neste grupo foram enquadrados os miRNA que
sofrem redução significante da expressão em todas fases de crescimento do
melanoma humano: miR-34, miR-129.1, miR-194 e miR-205.
57
miR-34
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 20. Expressão do miR-34 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-34 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-129-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 21. Expressão do miR-129-1 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-129-1 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
58
miR-194
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 22. Expressão do miR-194 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-194 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-205
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 23. Expressão do miR-205 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-205 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
59
• Grupo III - Neste grupo foram incluídos os miRNAs que
apresentaram um aumento significante da expressão durante em apenas uma
das fases do crescimento: miR-30a-3p, miR-30e, miR-96, miR-145, miR-182,
miR-199a e miR-219.
miR-30a-3p
0
1
2
3
4
5
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 24. Expressão do miR-30a-3p em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-30a-3p em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
60
miR-30e
0
2
4
6
8
10
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 25. Expressão do miR-30e em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-30e em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-96
0
200
400
600
800
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 26. Expressão do miR-96 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-96 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
61
miR-145
0
200
400
600
800
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 27. Expressão do miR-145 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-145 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-182
0
200
400
600
800
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 28. Expressão do miR-182 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-182 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
62
miR-199a*
0
500
1000
1500
2000
2500
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 29. Expressão do miR-199
a
* em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-199
a
* em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
miR-219
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
melanócito radial vertical metastático
expressão relativas
Figura 30. Expressão do miR-219 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-219 na fase radial foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
63
No caso do miR-219, utilizamos como referência (valor igual a 1,0) a
expressão observada na fase radial de crescimento do melanoma, pois a
expressão do miR-219 não foi detectada em melanócitos.
• Grupo IV - Este grupo compreende o único miRNA que não
apresentou alteração significante da expressão em nenhuma das fases de
crescimento de crescimento do melanoma humano: miR-215.
miR-215
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
melanócito radial vertical metastático
expressão relativa
Figura 31. Expressão do miR-215 em melanócito e nas linhagens de
melanoma humano nas fases de crescimento radial, vertical e metastático.
A expressão do miR-215 em melanócito foi utilizada como referência. Esse
experimento é representativo de três experimentos independentes.
64
DISCUSSÃO
Desde que os miRNAs foram identificados no genoma humano, iniciou-se
uma tentativa de se estabelecer conexões entre este novo mecanismo de regulação
da expressão gênica com o câncer.
No início da década de 90 já se estudava uma região do cromossomo 13
deletada em mais da metade dos casos de leucemia linfocítica crônica. Nesta época,
buscava-se insistentemente nesta região cromossômica um gene supressor de
tumor que justificasse a relação entre essa deleção e o estabelecimento deste tipo
de câncer. Assim, quando o conceito de miRNA emergiu, não demorou para que
Calin e cols. (2002) identificassem os miR-15 e miR16 na região deletada do
cromossomo 13. A idéia de que estes miRNAs poderiam ser os supressores de
tumor buscados, foi reforçada quando Cimmino e cols. (2005) identificou o RNAm
bcl2, o qual codifica uma proteína anti-apoptótica, como alvo destes miRNAs.
Iniciou-se então uma intensa busca por alterações na expressão de miRNAs
em câncer. Assim, os miRs foram classificados como ongogenes e supressores de
tumor de acordo com sua expressão e os genes por eles regulados negativamente.
Entre eles podemos citar o let-7, miR-143, miR-145, miR-155, miR-21, cluster miR-
17-92. É importante salientar que constantemente novos miRNAs têm sido
adicionados a essa lista.
O perfil de expressão de miRNAs passou a ser visto então como uma
alternativa no diagnóstico e prognóstico de tumores (Iorio e cols., 2005; Ricarte Filho
& Kimura, 2006; Yanaihara e cols., 2006). Desta maneira, vários grupos de pesquisa
tem se empenhado em mapear a expressão de miRNAs em tumores, comparando-
65
os aos tecidos normais correspondentes (Michael e cols 2003; Iorio e cols., 2005; Lu
e cols., 2005; Ynaihara e cols., 2006).
Apesar do empenho em caracterizar o padrão de expressão de miRNAs em
tumores, verificou-se que muitos miRNAs menos abundantes e nem por isso menos
relevantes, escapavam constantemente das tecnologias usuais tais como como
clonagem, Northern blot (Lim, 2003) e análise por microarray (Krichevsky e cols.,
2003; Liu e cols., 2004).
Já foi salientado anteriormente que na biogênese de miRNAs, o transcrito
primário (pri-miRNA) é processado pela Drosha dando origem a um pré-miRNA, o
qual é exportado para o citoplasma onde é clivado pela Dicer dando origem ao
miRNA maduro. Como o pré-miRNA contém a seqüência do miRNA maduro, as
análises de expressão por Northern blot não eram confiáveis na distinção entre pré-
miRNA e miRNAs maduros. Apesar de não se conhecer os exatos mecanismos,
sabe-se que os miRNAs também sofrem regulação e a abundância do pré-miRNA
não corresponde exatamente a abundância do maduro. Michael e cols. (2003)
identificaram dois miRNAS maduros que sofriam redução na expressão na
neoplasia colo-retal sem que os níveis de seus respectivos precursores sofressem
alteração de expressão. Além do mais, não é possível distinguir, através de Northen
blot, os miRNAs que diferem em apenas uma ou duas bases como é o caso dos
membros da família let-7 (Chen e cols., 2005). As análises por microarray tem sido
também muito utilizadas para avaliar a expressão de miRNAs em câncer. Entretanto,
esse método é limitado quanto à sensibilidade e especificidade (Krichevsky e cols.,
2003; Liu e cols., 2004).
A técnica de PCR em tempo real já era conhecida como uma metodologia
extremamente sensível e específica para avaliação da expressão gênica. Entretanto,
66
a aplicação desta técnica para a avaliação da expressão de miRNAs era limitada
pela dificuldade de se ampliar moléculas pequenas como os miRNAs. Este cenário
foi mudado em 2005 quando Chen e cols. desenvolveram um oligonucleotídeo em
forma de “stem-loop” que usado durante a reação de transcrição reversa produzia
um cDNA longo o suficiente para permitir o anelamento dos dois oligonucleotídeos e
da sonda TaqMan durante a reação de PCR em tempo real. Uma das extremidades
desse oligonucleotídeo anela-se ao miRNA por complementaridade formando a
porção “stem” enquanto a outra se anela ao próprio oligonucleotídeo formando um
“loop”. Outros aspectos relevantes deste método é a sua alta sensibilidade e
quantidade muito pequena de RNA necessária para executá-lo (1-10ng). Com base
no que foi exposto acima, o método de Chen e cols. (2005) foi utilizado no presente
trabalho para avaliar a expressão de miRNAs nas diferentes fases de crescimento
do melanoma humano por ser capaz de detectar miRNAs com expressão
imperceptível a outros métodos e com maior especificidade, discriminando entre
miRNAs maduros e seus precursores, bem como permitir também a distinção de
miRNAs que apresentam a diferença em apenas uma base nas suas seqüências
(Chen e cols., 2005; Jiang e cols., 2005; Tang e cols., 2006).
É importante salientar que apesar da existência de vários trabalhos sobre o
padrão de expressão de miRNAs em câncer, nenhum se preocupou em descrever
as alterações de expressão ao longo da evolução dos tumores.
O processo metastático é considerado complexo e constituído de múltiplas
fases e depende de interações das células tumorais invasivas e seus produtos e
propriedades do hospedeiro, incluindo as células efetoras da resposta imune (Jain,
1991). As células tumorais para poderem se separar de uma massa primária,
penetrar nos vasos sanguíneos ou nos linfáticos e produzir crescimento secundário,
67
em um local distante, terão que percorrer uma série de etapas. Cada etapa está
sujeita a uma infinidade de influências e, assim, em qualquer ponto desta seqüência
a célula invasiva poderá não sobreviver.
Considerando a resposta das células a influências tão distintas, quais miRNAs
seriam mais importantes na instalação do tumor? E na proliferação celular durante o
crescimento deste tumor? Quais miRNAs estariam envolvidos na aquisição de
características metastáticas? Estas são questões relevantes que não foram ainda
devidamente investigadas.
O estudo da expressão de miRNAs poderá contribuir para a elucidação do
processo de progressão tumoral, especialmente através da identificação dos RNAm
alvos de miRNAs e das vias de sinalização em que eles atuam. Estimativas sugerem
que aproximadamente 30% dos miRNAs humanos sejam alvos da regulação por
miRNAs (Lewis e cols., 2005). Verificou-se ainda cada miRNA pode regular em até
200 transcritos e mais de um miRNA pode regular coordenadamente um único
RNAm alvo (Krek e cols., 2005). Portanto, isso nos leva a supor uma enorme
possibilidade combinatória, sugerindo um modelo altamente complexo de regulação
da expressão gênica.
Existem vários algoritmos de predição de alvos de miRNA baseados,
principalmente, no alinhamento das seqüências de miRNA com as seqüências das
regiões 3’-UTR de RNAm: miRanda (http://www.micro-RNA.org//miranda.htm),
miRBase (http://micro-RNA.sanger.ac.uk/targets/v2/), PicTar
(http://pictar.bio.nyu.edu) e TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan) (Maziére &
Enright, 2007; Chaudhuri & Chatterjee, 2007).
Verificou-se que existem uma infinidade e diversidade de alvos preditos para
cada miRNA e a maioria desses pares miRNA-RNAm alvo não se confirma
68
experimentalmente. Hua e cols. (2006) encontraram 96 miRNA preditos como
possíveis reguladores do VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) e somente 5
destes foram capazes de regular experimentalmente o VEGF.
Utilizando o miRBase e o PicTar para avaliar os possíveis alvos dos miRNAs
analisados, obtivemos um número muito grande de RNAm cuja região 3’UTR
apresentou sítios de complementaridade a seqüência do miRNA (dados não
mostrados). Entretanto, alguns dados não coincidiam entre os dois algoritmos e
alguns alvos sugeridos para um mesmo micro eram completamente contraditórios,
pois possuem funções celulares opostas.
No presente trabalho, consideramos como possíveis alvos apenas os pares
miRNA-RNAm alvo validados experimentalmente que podem ser encontrados na
literatura atual e no programa Tarbase
(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase.html).
É importante salientar que apesar de sabermos as alterações na expressão
de miRNAs, ainda não sabemos ao certo que proteínas eles regulam e,
conseqüentemente, como essa alteração contribui para o estabelecimento e
manutenção do tumor.
De forma geral, o perfil de expressão de miRNAs obtido em melanoma
apresentou diversos tipos de alterações. A maioria dos miRNAs analisados (16
deles) apresentou aumento da expressão, sendo que 9 miRNAs apresentaram
aumento durante toda a progressão, enquanto que 7 apresentaram um aumento
brusco em apenas uma das fases de crescimento tumoral (Tabela 2).
69
Tabela 2. Perfil de expressão de micro-RNAs durante a progressão de
melanoma humano.
Grupos micro-RNAs
Grupo I
(aumento da expressão durante toda a
progressão)
let-7, miR-16, miR-21, miR-29a,
miR-29b-2, miR-146, miR-200a,
miR-200b e miR-213
Grupo II
(redução da expressão)
miR-34, miR-129.1, miR-194 e miR-
205
Grupo III
(aumento da expressão em apenas uma
fase)
miR-30a-3p, miR-30e, miR-96, miR-
145, miR-182, miR-199a e miR-219
Grupo IV
(não apresentou alteração significante)
miR-215
Dos miRNAs analisados, o let-7 é um dos micro-RNAs mais bem
caracterizados. Takamizawa e cols (2004) mostraram que a expressão do let-7
estava freqüentemente reduzida em pacientes com câncer de pulmão e que essa
expressão tinha impacto no prognóstico e sobrevivência pós-cirúrgica dos pacientes.
Eles mostraram também que a “super-expressão” in vitro do let-7 inibia o
crescimento em linhagens celulares do câncer de pulmão. Logo em seguida,
Johnson e cols. (2005) sugeriram que o proto-oncogene ras seria um alvo do let-7,
pois detectaram sítios de ligação do let-7 na região 3’-UTR do RNAm do ras e
demonstraram a associação inversamente proporcional entre a expressão do let-7 e
70
da proteína ras. Assim, os autores deste trabalho sugeriram que este seria um
possível mecanismo responsável pelo desenvolvimento do tumor. Esses dados
foram reforçados pela atuação deste miRNA como inibidor do crescimento de células
de câncer de cólon humano (Akao e cols. 2006).
Apesar de se esperar uma redução da expressão do let-7 também em
melanoma humano, os nossos resultados revelaram o contrário. Verificamos que a
expressão deste miRNA aumenta gradativamente durante a progressão tumoral
sendo ~ 9 vezes maior na fase metastática em relação ao melanócito (Figura 11).
Este resultado está de acordo com um estudo recente de Garzon e cols. (2007), o
qual mostrou que a expressão do let-7 está aumentada em pacientes com leucemia
promielocítica aguda e que a transcrição deste miRNA pode ser ativada pelo fator de
transcrição NF-κB. Já foi demonstrado que o NF-κB é uma proteína dimérica que se
liga ao DNA, atuando como um modulador transcricional (Karin & Ben-Neriah, 2000).
Este fator de transcrição está presente em sua forma inativa no ciptoplasma, ligado a
um inibidor denominado I-κB (Karin & Ben-Neriah, 2000). Kumar e cols. (1994)
demonstraram que a proteína quinase dependente de RNA (PKR) é capaz de ativar
o NF-κB através da fosforilação do seu inibidor I-κB. É fato conhecido que a
fosforilação do inibidor I-kB induz a sua degradação pelo sistema da ubiquitina-
proteasoma, deixando o NF-kB livre para migrar ao núcleo e se ligar aos promotores
de genes que possuem sítios de ligação para este fator de transcrição (Karin & Ben-
Neriah, 2000).
É importante salientar que Kim e cols. (2002) detectaram nas células do
melanoma humano, especialmente nas células metastáticas, um aumento da
expressão e atividade da PKR. É possível que o aumento da expressão do let-7
observado em nosso trabalho esteja relacionado com o aumento da atividade da
71
PKR nas células do melanoma humano com subseqüente ativação do fator NF-kB, o
qual regula a transcrição do let-7 como ilustra a Figura 32.
Célula metastática de melanoma humanoCélula metastática de melanoma humano
Gene
let-7a
Promotor
NF-kB
Degradação
do I-
κ
κκ
κ
B
PKR
inativa
Auto fosforilação
PKR
ativa
NF-kB
IkB
NF-kB
IkB
P
P
Núcleo
Membrana plasmática
IKK inativa
IKK ativa
+
P
let-7a
Gene
let-7a
Promotor
NF-kB
Degradação
do I-
κ
κκ
κ
B
PKR
inativa
Auto fosforilação
PKR
ativa
NF-kB
IkB
NF-kB
IkB
PP
P
Núcleo
Membrana plasmática
IKK inativa
IKK ativa
+
P
let-7a
Célula metastática de melanoma humanoCélula metastática de melanoma humano
Gene
let-7a
Promotor
NF-kB
Degradação
do I-
κ
κκ
κ
B
PKR
inativa
Auto fosforilação
PKR
ativa
NF-kB
IkB
NF-kB
IkB
PP
P
Núcleo
Membrana plasmática
IKK inativa
IKK ativa
+
P
let-7a
Gene
let-7a
Promotor
NF-kB
Degradação
do I-
κ
κκ
κ
B
PKR
inativa
Auto fosforilação
PKR
ativa
NF-kB
IkB
NF-kB
IkB
PP
P
Núcleo
Membrana plasmática
IKK inativa
IKK ativa
+
P
let-7a
Figura 32. Regulação da expressão do let-7a em células de melanoma humano.
Anteriormente ao let-7a, Taganov e cols. (2006) já haviam demostrado que a
indução do miR-146 por NF-κB. Nossos dados indicam um aumento (> 4 vezes) na
expressão do miR-146 na fase metastática de melanoma (Figura 14). Esse resultado
sugere que o aumento da PKR observado na fase metastática de melanoma poderia
levar a uma maior ativação do NF-κB, o que resultaria na indução dos miRNAs let-7
e miR-146.
O aumento da expressão de miR-146 também foi detectado em carcinoma de
tireóide (He e cols., 2005) tumor em que a “super-expressão” da PKR também foi
72
detectada (Terada e cols., 2000) nos permitindo especular que neste tipo de câncer,
a “super-expressão” de miR-146 seria conseqüência de uma indução pelo NF-κB
ativado pela PKR.
Taganov e cols. (2006) também apontaram, e validaram experimentalmente,
os genes IRAK1 (proteína quinase associada a receptor de Interleucina-1 – IL-1) e
TRAF6 (receptor associado ao Fator de Necrose Tumoral – TNF), importantes na
imunidade inata, como alvos do miR-146. Durante a sinalização via IL-1, a ligação
desta ao receptor de IL-1 induz o recrutamento de IRAK1 que se autofosforila e se
dissocia do complexo e subseqüentemente liga-se a TRAF6 que ativa tanto NF-κB
como AP-1. Assim, podemos propor um mini-circuito negativo do NF-κB. Assim, NF-
κB induz miR-146, que leva a repressão de IRAK1 e TRAF6, diminuindo a ativação
de NF-κB.
Devemos salientar que um dos maiores aumentos na expressão durante toda
a progressão tumoral foi observado com o miR-21 (~31 vezes na fase metastática).
O aumento da expressão de miR-21 já havia sido observado em outros tipos de
câncer e mais claramente em câncer de mama (Iorio e cols., 2005). Chan e cols.
(2005) demonstraram que o miR-21 atua como um fator anti-apoptótico em
glioblastoma. Si e cols. (2006) reforçaram esses dados demonstrando que a
supressão do miR-21 inibe o crescimento do tumor tanto in vitro quanto in vivo,
possivelmente devido ao aumento da apoptose associado à regulação negativa da
expressão de bcl-2 (um gene anti-apoptótico), sugerindo que se trata de um efeito
indireto do miR-21. O gene supressor de tumor Tropomiosina 1 (TPM1) (Zhu e cols.,
2007) e o PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten)
(Meng e cols., 2006) são alvos do miR-21 validados experimentalmente, o que
reforça a idéia de que este miRNA atue como um oncogene contribuindo para a
73
malignidade. Podemos assim sugerir que o miR-21 é um possível alvo terapêutico
em melanoma.
A alteração da expressão do miR-16 observada neste estudo foi distinta do
observado em leucemia linfocítica crônica (LLC) em que ocorre redução na
expressão. Este miRNA apresentou um aumento discreto (2,3 vezes em relação ao
melanócito não transformado). Esse dado é aceitável e até esperado uma vez que a
relação entre o miR-16 e LLC foi estabelecida com base na sua localização em uma
região (13q14) freqüentemente deletada nesta doença (Calin e cols., 2004b), o que
não ocorre em melanoma humano.
É difícil relacionar os dados obtidos com gene alvo, pois o miR-16 têm como
alvo validado o gene anti-apoptótico bcl2 e a supressão desse gene levaria a
manutenção das condições normais e não a malignidade. Entretanto, é provável que
o miR-16 regule direta e/ou indiretamente outros RNAm e esses outros possíveis
alvos poderiam levar a compreensão de como o aumento da expressão do miR-16
contribui para o desenvolvimento da malignidade.
Assim como o let-7, o miR-21, miR-16 e o miR-146, os miRNAs miR-29a,
miR-29b-2, miR-200a, miR-200b, miR-213 são promissores alvos terapêuticos pois a
expressão destes pode ser antagonizada com o uso de metodologias de inibição dos
miRNAs como por exemplo a injeção de seqüências antisenso (anti-miR ou
antagomiR) como já utilizado por Krutzfeldt e cols. (2005).
O miR-34 foi caracterizado como um supressor de tumor em neuroblastoma
por induzir apoptose pela via da caspase 3/7 (Welch e cols., 2007). Este mesmo
trabalho validou experimentalmente o fator de transcrição E2F3 como alvo do miR-
34. Apesar dos membros da família E2F poderem ter tanto efeito proliferativo quanto
pró-apoptótico em função do estado fisiológico da célula (Jonhson & Degregori,
74
2006), o cluster miR-17-92 que tem o gene E2F1 como alvo já foi caracterizado
como supressor de tumor (O’Donnell e cols., 2005). Associados a esses fatores, a
redução da expressão do miR-34 durante a progressão tumoral nos leva a crer que o
mesmo atue como um supressor de tumor em melanoma (Figura 20).
Assim como o miR-34, os miRNAs miR-129.1, miR-194 e miR-205
apresentaram redução na expressão indicando que esses micro-RNA provavelmente
atuem como supressores de tumor regulando oncogenes. Porém estes últimos ainda
não tiveram nenhum alvo validado experimentalmente.
A redução da expressão do miR-145 foi inicialmente observada em neoplasia
coloretal (Michael e cols., 2003). Posteriormente, Iorio e cols. (2005) também
observaram esta redução em câncer de mama. Apesar de ambos os estudos terem
feito uma predição computacional dos alvos do miR-145, nenhum alvo foi validado
experimentalmente. Neste estudo, este miRNA sofreu um brusco aumento da
expressão durante estabelecimento do tumor (fase radial) e em seguida ocorre a
redução e a expressão na fase vertical se iguala a expressão em melanócito.
Verificou-se ainda que essa redução continua e na fase metastática a expressão é
70% menor que em melanócito (Figura 27), Estes dados sugerem que o miR-145
desempenha um papel crucial no estabelecimento da malignidade ou na preparação
deste para invasão tecidual que ocorre na fase vertical.
Os miRNAs miR-30e, miR-96, miR-145, miR-182, miR-199a e miR-219
apresentaram o mesmo perfil do miR-145 sendo que o aumento mais brusco na fase
radial foi encontrado na expressão do miR-199* (> 2000 vezes a expressão em
melanócito não transformado). Portanto, acreditamos que estes miRNAs funcionem
como promotores do processo de malignidade. Por terem a expressão
extremamente alta na primeira fase tumoral (radial), os referidos miRNAs podem ser
75
promissores na assinatura do tumor com possibilidade de aplicabilidade no
diagnóstico.
76
CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente trabalho avaliamos a expressão relativa de 21 micro-RNAs nas
fases radial, vertical e metastática do crescimento de melanoma humano, usando
como referência a expressão em melanócitos não transformados.
Nossos resultados indicam que:
• Os miRNAs let-7, miR-16, miR-21, miR-29a, miR-29b-2, miR-146, miR-
200a, miR-200b e miR-213 encontram-se “super-expressos” durante a progressão
tumoral de melanoma humano.
• Os miRNAs miR-34, miR-129.1, miR-194 e miR-205 apresentaram
redução significante na expressão ao longo de progressão tumoral.
• O miR-30a-3p tem uma expressão elevada apenas na linhagem de
crescimento vertical enquanto os miRNAs miR-30e, miR-96, miR-145, miR-182, miR-
199a e miR-219 estão “super-expressos” apenas na fase de crescimento radial do
melanoma humano.
• A expressão do miR-215 não apresentou alteração significante da
expressão durante a progressão tumoral do melanoma.
É fato conhecido que os miRNAs let-7a e miR-146 são induzidos por NF-κB e
que a PKR é capaz de ativar o NF-κB. Os nossos resultados revelaram a “super-
expressão” dos miRNAs let-7a e miR-146 na fase metastática do tumor onde foi
observada a “super-expressão” da PKR. Por esse motivo, é provável que o aumento
77
da expressão dos miRNAs let-7a e miR-146 seja resultante da indução pelo NF-κB
ativado pela PKR.
O presente estudo abre uma ampla gama de perspectivas, tais como:
• Inibir miRNAs que se mostraram “super-expressos” através de
antagomiR (anti-senso do miRNA) e estabelecer a associação desta inibição com a
expressão de possíveis RNAm alvos e seu efeito sobre o crescimento tumoral;
• Validar experimentalmente os alvos preditos;
• Analisar a expressão de let-7 e miR-146 em um células metastáticas de
melanoma humano após a incubação com ativadores clássicos da PKR, tais como
poli I:C, para testar a hipótese de que a indução destes miRNAs ocorra através da
ativação do NF-κB pela PKR.
78
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Akao Y, Nakagawa Y, Naoe T. (2006). let-7 microRNA functions as a potential
growth suppressor in human colon cancer cells. Biol Pharm Bull 29(5):903-6.
Altuvia Y, Landgraf P, Lithwick G, Elefant N, Pfeffer S, Aravin A, Brownstein MJ,
Tuschl T, Margalit H. (2005). Clustering and conservation patterns of human
microRNAs. Nucleic Acids Res 33(8):2697-2706.
Alvarez-Garcia I, Miska EA. (2005). MicroRNA functions in animal development
and human disease. Development. 132(21):4653-62.
Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G,
Hedí SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T. (2003a).
A uniform system for microRNA annotation. RNA 9(3):277-279.
Ambros V, Lee RC, Lavanway A, Williams PT, Jewell D. (2003b). MicroRNAs and
other tiny endogenous RNAs in C. elegans. Curr Biol 13(10):807-818.
Ambros V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431(7600):350-
355.
Bagga S, Bracht J, Hunter S, Massirer K, Holtz J, Eachus R, Pasquinelli AE.
(2005). Regulation by let-7 and lin-4 miRNAs results in target mRNA degradation.
Cell 122(3), 553–563.
Bandrés E, Cubedo E, Agirre X, Malumbres R, Zárate R, Ramirez N, Abajo A,
Navarro A, Moreno I, Monzó M, García-Foncillas J. (2006). Identification by Real-
time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer
and non-tumoral tissues. Molecular Câncer 19; 5: 29.
Bardeesy N, Wong KK, DePinho RA, Chin L. (2000). Animal models of
melanoma: recent advances and future prospects. Adv Cancer Res 79:123-156.
79
Bartel DP. (2004). MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.
Cell 116 (2):281-297.
Baskerville S., Bartel DP. (2005). Microarray profiling of microRNAs reveals
frequent coexpression with neighboring miRNAs and host genes. RNA 11(3):241-
7.
Behm-Ansmant I, Rehwinkel J, Doerks T, Stark A, Bork P, Izaurralde E. (2006).
mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT
deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev 20 (14): 1885–
1898.
Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P,
Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. (2005). Identification of
hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet
37(7):766-770.
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. (2001). Role for a bidentate
ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409 (6818):295–
296.
Bogenrieder T., Herlyn M. (2002). Cell-surface proteolysis, growth factor
activation and intercellular communication in the progression of melanoma. Crit
Rev Oncol Hematol 44(1): 1-15.
Bottoni A, Piccin D, Tagliati F, Luchin A, Zatelli MC, degli Uberti EC. (2005) MiR-
15a and miR-16-1 down-regulation in pituitary adenomas. J Cell Physiol 204(1):
280–285.
Boutz PL, Chawla G, Stoilov P, Black DL. (2007) MicroRNAs regulate the
expression of the alternative splicing factor nPTB during muscle development.
Genes Dev 21, 71–84.
80
Brengues M, Teixeira D, Parker R. (2005). Movement of eukaryotic mRNAs
between polysomes and cytoplasmic processing bodies. Science 310, 486–489.
Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB & Cohen SM. (2003). Bantam
encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation
and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell 113(1): 25–36.
Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch, E, Aldler H, Rattan S,
Keating M, Rai K. (2002). Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA
genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl
Acad Sci U S A 99(24):15524-15529.
Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, Hyslop T, Noch E, Yendamuri S, Shimizu M,
Rattan S, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. (2004a). Human microRNA genes are
frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc
Natl Acad Sci U S A 101(9):2999-3004.
Calin GA, Liu CG, Sevignani C, Ferracin M, Felli N, Dumitru CD, Shimizu M,
Cimmino A, Dono SZM, Dell’Aquila ML, Alder H, Rassenti L, Kipps TJ, Bullrich F,
Negrini M, Croce CM. (2004b). MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B
cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A 101:11755–11760.
Calin GA., Croce CM. (2006). MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev
Cancer 6(11):857-66.
Carmell MA., Hannon GJ. (2004). RNase III enzymes and the initiation of gene
silencing. Nature Struct Mol Biol 11(3): 214–218.
Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS. (2005). MicroRNA-21 is an antiapoptotic
factor in human glioblastoma cells. Cancer Res 65 (14):6029-6033.
Chaudhuri K., Chatterjee R. (2007). MicroRNA detection and target prediction:
integration of computational and experimental approaches. DNA Cell Biol
26(5):321-37.
81
Chen X. (2004). A MicroRNA as a translational repressor of APETALA2 in
Arabidopsis flower development. Science 303(5666):2022-5.
Chen CZ. (2005). MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors. N Engl J
Med 353 (17):1768-71.
Chen CZ., Lodish HF. (2005). MicroRNAs as regulators of mammalian
hematopoiesis. Semin Immunol 17 (2):155-165.
Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu
NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. (2005). Real-
time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33
(20): 179.
Chen JF, Mandel EM, Thomson JM, Wu Q, Callis TE, Hammond SM, Conlon FL,
Wang DZ. (2006). The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle
proliferation and differentiation. Nat Genet 38(2): 228–233.
Cheng AM, Byrom MW, Shelton J, Ford LP. (2005). Antisense inhibition of human
miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and
apoptosis. Nucleic Acid Res 33(4): 1290–1297
Chu CY., Rana TM. (2006). Translation repression in human cells by microRNA-
induced gene silencing requires RCK/p54. PLoS Biol 4 (7): e210.
Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, Iorio MV, Ferracin M, Shimizu M, Wojcik SE,
Aqeilan RI, Zupo S, Dono M, Rassenti L, Alder H, Volinia S, Liu CG, Kipps TJ,
Negrini M, Croce CM. (2005). miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting
BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 102(39):13944-13949.
Croce CM. (2004). Human microRNA genes are frequently located at fragile sites
and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci U S A 101 (9):2999-
3004.
82
De Lucca FL, Souza LR, Murad JM, Watanabe MAE. (2002). Evidence for the
involvement of the RNA-dependent protein kinase (PKR) in the induction of
human cytotoxic T lymphocytes against a synthetic peptide of HIV-1 by regulatory
RNA. Mol Cell Biochem 238(1-2):19-26
Denli A., Hannon G. (2003). RNAi: an evergrowing puzzle. Trends Biochem. Sci.
28 (4):196-201.
Doench JG, Peterson CP, Sharp PA. (2003). siRNAs can function as miRNAs.
Genes Dev 17: 438–442.
Eddy SR. (2001). Non-coding RNA genes and the modern RNA world. Nat Rev
Genet 2 (12):919-929.
Eis PS, Tam W, Sun L, Chadburn A, Li Z, Gomez MF, Lund E, Dahlberg JE.
(2005). Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas Proc
Natl Acad Sci U S A 102(10):3627-32.
Elbashir, S. M.; Leneckel, W, Tuschl, T. (2001). RNA interference is mediated by
21- and 22- nucleotide RNAs. Genes Dev 15(2):188–200.
Erdmann VA, Barciszewska MZ, Szymanski M, Hochberg A, De Groot N,
Barciszewski J. (2001a). The non-coding RNAs as riboregulators. Nucleic Acids
Res 29(1):189-193.
Erdmann VA, Barciszewska MZ, Hochberg A, Groot N, Barciszewski J. (2001b).
Regulatory RNAs. Cell Mol Life Sci 58:960-977.
Esquela-Kerscher A., Slack FJ. (2006). Oncomirs - microRNAs with a role in
cancer. Nat Rev Cancer 6(4):259-69.
Eulalio A, Behm-Ansmant I, Izaurralde E. (2007). P bodies: at the crossroads of
post-transcriptional pathways. Nat Rev Mol Cell Biol 8(1):9-22.
83
Garzon R, Fabbri M, Cimmino A, Calin GA, Croce CM. (2006). MicroRNA
expression and function in cancer. Trends Mol Med 12(12):580-7.
Garzon R, Pichiorri F, Palumbo T, Visentini M, Aqeilan R, Cimmino A, Wang H,
Sun H, Volinia S, Alder H, Calin GA, Liu CG, Andreeff M, Croce CM. (2007).
MicroRNA gene expression during retinoic acid-induced differentiation of human
acute promyelocytic leukemia. Oncogene 26(28):4148-57
Giraldez AJ, Mishima Y, Rihel J, Grocock RJ, Van Dongen S, Inoue K, Enright AJ,
Schier AF. (2006). Zebrafish miR-430 promotes deadenylation and clearance of
maternal mRNAs. Science 312(5770):75–79.
Grishok, A.; Pasquinelli, A. E.; Conte, D.; Li, N.; Parrish, S.; Ha, I.; Baillie, D. L.;
Fire, A.; Ruvkun, G. & Mello, C. C. (2001). Genes and mechanisms related to
RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C.
elegans developmental timing. Cell 106(1):23–34.
Hake S. (2003). MicroRNAs: a role in plant development. Curr Biol 13(21):R851–
R852.
Hammond SM. (2006). MicroRNAs as oncogenes. Curr Opin Genet Dev 16(1):4-9
Hayashita Y, Osada H, Tatematsu Y, Yamada H, Yanagisawa K, Tomida S,
Yatabe Y, Kawahara K, Sekido Y, Takahashi T. (2005). A polycistronic microRNA
cluster, miR-17-92, is overexpressed in human lung cancers and enhances cell
proliferation. Cancer Res 65(21):9628-32.
He L., Hannon GJ. (2004). MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene
regulation. Nat Rev Genet 5(7):522-531.
He L, Thomson JM, Hemann MT, Hernando-Monge E, Mu D, Goodson S, Powers
S, Cordon-Cardo C, Lowe SW, Hannon GJ, Hammond SM. (2005). A microRNA
polycistron as a potential human oncogene. Nature 435(7043):828-833.
84
Herlyn, M, Thurin J, Balaban G, Bennicelli JL, Herlyn D, Elder DE, Bondi, E,
Guerry D, Nowell, P, Clark WH. (1985). Characteristics of cultured human
melanocytes isolated from different stages of tumor progression. Cancer Res
455(11 pt 2):5670-5676.
Herlyn M, Clark WH, Rodeck U, Mancianti ML, Jambrosic J, Koprowski H. (1987).
Biology of tumor progression in human melanocytes. Lab Invest 56(5):461-474.
Hua Z, Lv Q, Ye W, Wong CK, Cai G, Gu D, Ji Y, Zhao C, Wang J, Yang BB,
Zhang Y. (2006). MiRNA-Directed Regulation of VEGF and Other Angiogenic
Factors under Hypoxia. PLoS ONE 27:1:e116.
Humphreys DT, Westman BJ, Martin DI, Preiss T. (2005). MicroRNAs control
translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail
function. Proc Natl Acad Sci U S A 102(47): 16961–16966.
Hutvágner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zamore PD.
(2001). A cellular function for the RNAinterference enzyme Dicer in the maturation
of the let-7 small temporal RNA. Science 293(5531): 834–838.
Hutvágner G., Zamore PD. (2002). A microRNA in a multiplecrassa turnover RNAi
enzyme complex. Science 297(5589): 2056–2060.
Iorio MV, Ferracin M, Liu CG, Veronese A, Spizzo R, Sabbioni S, Magri E,
Pedriali M, Fabbri M, Campiglio M, Menard S, Palazzo JP, Rosenberg A, Musiani
P, Volinia S, Nenci I, Calin GA, Querzoli P, Negrini M, Croce CM. (2005).
MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer. Cancer Res
65(16):7065-70.
Jackson RJ., Standart N. (2007). How do microRNAs regulate gene expression?
Sci STKE (367):re1.
Jain RK. (1991) Therapeutic implications of tumor physiology. Curr Opin Oncol
3(6):1105.
85
Jiang J, Lee EJ, Gusev Y, Schmittgen TD. (2005). Real-time expression profiling
of microRNA precursors in human cancer cell lines. Nucleic Acids Res
33(17):5394–5403.
Johnson DG., Degregori J. (2006). Putting the Oncogenic and Tumor Suppressive
Activities of E2F into Context. Curr Mol Med 6(7):731-8.
Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom M, Jarvis R, Cheng A, Labourier
E, Reinert KL, Brown D, Slack FJ. (2005). Ras is regulated by the let-7 microRNA
family. Cell 120(5):635-647.
Karin M., Ben-Neriah Y. (2000). Phosphorylation meets ubiquitination: the control
of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol 18:621-63
Karube Y, Tanaka H, Osada H, Tomida S, Tatematsu Y, Yangisawa K, Yatabe Y,
Takamizawa J, Mivoshi S, Mitsudomi T, Takahashi T. (2005). Reduced
expression of Dicer associated with poor prognosis in lung cancer patients.
Cancer Sci 96(2):111-115.
Kasschau KD, Xie Z, Allen E, Llave C, Chapman EJ, Krizan KA, Carrington JC.
(2003). P1/HC-Pro, a viral suppressor of RNA silencing, interferes with
Arabidopsis development and miRNA function. Dev Cell 4(2):205–217.
Ketting RF, Fischer SEJ, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RHA. (2001).
Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in
developmental timing in C. elegans. Genes Dev 15:2654–2659.
Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. (2003). Functional siRNAs and miRNAs
exhibit strand bias. Cell 115(2):209-216.
Kim
SH, Gunnery
S, Choe
JK, Mathews MB. (2002). Neoplastic progression in
melanoma and colon cancer is associated with increased expression and activity
of the interferon-inducible protein kinase, PKR. Oncogene 21(57):8741-8748.
86
Krek A, Grün D, Poy MN, Wolf R, Rosenberg L, Epstein EJ, MacMenamin P, da
Piedade I, Gunsalus KC, Stoffel M, Rajewsky N. (2005). Combinatorial microRNA
target predictions. Nat Genet 37(5):495-500.
Krichevsky AM, King KS, Donanhue CP, Khrapko K, Kosik KS. (2003). A
microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain
development. RNA 9: 1274-1281.
Krutzfeldt J, Rajewsky N, Braich R, Rajeev KG, Tuschl T, Manoharan M, Stoffel
M. (2005). Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'. Nature
438(7068):685-689.
Kumar A, Haque J, Lacoste J, Hiscott J, Williams BRG. (1994). Double-stranded
RNA-dependent protein kinase actives transcription fator NF-κB by
phosphorylating I- κB. Proc Natl Acad Sci U S A 91(14):6288-6292.
Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T. (2001). Identification of
novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294 (5543):853–858.
Lagos-Quintana M, Rauhut R, Meyer J, Borkhardt A, Tuschl T. (2003). New
microRNAs from mouse and human. RNA 9(2):175-179.
Lau N, Lim L, Weinstein E, Bartel DP. (2001). An abundant class of tiny RNAs
with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science
294(5543):858–862.
Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-
4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75(5):843–
854.
Lee RC., Ambros V. (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis
legans. Science 294(5543):862–864.
87
Lee Y, Jeon K, Lee JT, Kim S, Kim VN. (2002). MicroRNA maturation: stepwise
processing and subcellular localization. EMBO J 21(17):4663-4670.
Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Radmark O, Kim S.
(2003). The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature
425(6956):415–419.
Lewis BP, Shih IH, Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Burge CB. (2003). Prediction
of mammalian microRNA targets. Cell 115(7):787–798.
Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. (2005). Conserved seed pairing, often flanked by
adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell
120(1):15–20.
Lim LP, Glasner ME, Yekta S, Burge CB, Bartel DP. (2003). Vertebrate microRNA
genes. Science 299(5612):1540.
Lim LP, Lau NC, Garrett-Engele P, Grimson A, Schelter JM, Castle J, Bartel DP,
Linsley PS, Johnson JM. (2005). Microarray analysis shows that some
microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature 433(7027):
769–773.
Liu CG, Calin GA, Meloon B, Gamliel N, Sevignani C, Ferracin M, Dumitru CD,
Shimizu M, Zupo S, Dono M, Alder H, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. (2004). An
oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and
mouse tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 101(26):9740–9744.
Liu J, Valencia-Sanchez MA, Hannon GJ, Parker R. (2005) MicroRNA-dependent
localization of targeted mRNAs to mammalian P-bodies. Nat Cell Biol 7 (7):719–
723.
88
Livak KJ., Schmittgen TD. (2001). Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25
(4):402–408.
Llave C, Kasschau KD, Rector MA, Carrington JC. (2002). Endogenous and
silencing-associated small RNAs in plants. Plant Cell 14(7):1605–1619.
Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A,
Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR.
(2005). MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature
435(7043):834–838.
Lund E, Guttinger S, Calado A, Dahlberg JE, Kutay U. (2004). Nuclear export of
microRNA precursors. Science 303(5654):95–98.
Maroney PA, Yu Y, Fisher J, Nilsen TW. (2006). Evidence that microRNAs are
associated with translating messenger RNAs in human cells. Nat Struct Mol Biol
13(12):1102-1107
Mattick JS. (1994). Introns: evolution and function. Curr Opin Genet Dev
4(6):823–831.
Mattick JS. (2001). Non-coding RNAs: the architects of eukaryotic complexity.
EMBO Rep 2(11):986–991.
Mattick JS., Gagen MJ. (2001). The evolution of controlled multitasked gene
networks: the role of introns and other noncoding RNAs in the development of
complex organisms. Mol Biol Evol 18(9):1611-1630.
Mattick JS. (2003). Challenging the dogma: the hidden layer of non-protein-coding
RNAs in complex organisms. Bioessays 25(10):930-939.
Mattick JS. (2004). RNA regulation: a new genetics? Nat Rev Genet 5(4):316-
323.
89
Mazière P., Enright AJ. (2007). Prediction of microRNA targets. Drug Discov
Today 12(11-12):452-8.
McManus MT. (2003). MicroRNAs and cancer. Semin Cancer Biol 13(4):253-258.
Meier F, Satyamoorthy K, Nesbit M, Hsu MY, Schittek B, Garbe C, Herlyn M.
(1998). Molecular events in melanoma development and progression. Front Biosci
15; 3:D1005-D1010.
Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G, Tuschl T. (2004).
Human Argonauta2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs.
Mol Cell 15(2):185–197.
Meng F, Henson R, Lang M, Wehbe H, Maheshwari S, Mendell JT, Jiang J,
Schmittgen TD, Patel T. (2006). Involvement of human micro-RNA in growth and
response to chemotherapy in human cholangiocarcinoma cell lines.
Gastroenterology 130(7):2113-29.
Mette MF, Aufsatz W, van derWinden J, Matzke MA, Matzke AJ. (2000).
Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded
RNA. EMBO J 19(19):5194–5201.
Metzler M, Wilda M, Busch K, Viehmann S, Borkhardt A. (2004). High expression
of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma. Genes
Chromosomes Cancer 39(2):167-169.
Michael MZ, O’Conner SM, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ.
(2003). Reduced Accumulation of Specific MicroRNAs in Colorectal Neoplasia.
Mol Cancer Res 1(12):882–891.
Mishima Y, Giraldez AJ, Takeda Y, Fujiwara T, Sakamoto H, Schier AF, Inoue K.
(2006). Differential regulation of germline mRNAs in soma and germ cells by
zebrafish miR-430. Curr Biol 16(21):2135–2142.
90
Morris JP & McManus MT. (2005). Slowing down the Ras lane: miRNAs as tumor
suppressors? Sci STKE 2005(297):pe41.
Murakami Y, Yasuda T, Saigo K, Urashima T, Toyoda H, Okanoue T, Shimotohno
K. (2006). Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in
hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues. Oncogene 25(17):2537-45.
Nelson PT, Hatzigeorgiou AG, Mourelatos Z. (2004). miRNP:mRNA association in
polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA 10(3):387-394.
Nilsen TW. (2007). Mechanisms of microRNA-mediated gene regulation in animal
cells. Trends Genet 23(5):243-9.
Nottrott S, Simard MJ, Richter JD. (2006). Human let-7a miRNA blocks protein
production on actively translating polyribosomes. Nat Struct Mol Biol
13(12):1108–1114.
O'Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, Dang CV, Mendell JT. (2005) c-Myc-
regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 435(7043):839–843.
Olsen P & Ambros V. (1999). The lin-4 regulator RNA controls developmental
timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis after the
initiation of translation. Dev Biol 216(2):671–680.
Papp I, Mette MF, Aufsatz W, Daxinger L, Schauer SE, Ray A, van der Winden J,
Matzke M, Matzke AJ. (2003). Evidence for nuclear processing of plant micro
RNA and short interfering RNA precursors. Plant Physiol 132 (3):1382–1390.
Pekarsky Y, Santanam U, Cimmino A, Palamarchuk A, Efanov A, Maximov V,
Volinia S, Alder H, Liu CG, Rassenti L, Calin GA, Hagan JP, Kipps T, Croce CM.
(2006). Tcl1 expression in chronic lymphocytic leukemia is regulated by miR-29
and miR-181. Cancer Res 66(24):11590-3.
91
Petersen CP, Bordeleau ME, Pelletier J, Sharp PA. (2006). Short RNAs repress
translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell 21(4):533–542.
Pillai RS, Bhattacharyya SN, Artus CG, Zoller T, N. Cougot N, Basyuk E, Bertrand
E, Filipowicz W. (2005). Inhibition of translational initiation by let-7 microRNA in
human cells. Science 309(5740):1573-6.
Pillai RS, Bhattacharyya SN, Filipowicz W. (2007). Repression of protein
synthesis by miRNAs: how many mechanisms? Trends Cell Biol 17(3):118–126.
Pineles BL, Romero R, Montenegro D, Tarca AL, Han YM, Kim YM, Draghici S,
Espinoza J, Kusanovic JP, Mittal P, Hassan SS, Kim CJ. (2007). Distinct subsets
of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with
preeclampsia. Am J Obstet Gynecol 196(3):261.e1-6.
Przybylo M, Martuszewska D, Pochec E, Hoja-Lukowicz D, Litynska A. (2007).
Identification of proteins bearing beta1-6 branched N-glycans in human
melanoma cell lines from different progression stages by tandem mass
spectrometry analysis. Biochim Biophys Acta. No prelo.
Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE,
Horvitz HR, Ruvkun G. (2000). The 21-nucleotide let-7 RNA regulates
developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403(6772):901-6.
Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP. (2002).
MicroRNAs in plants. Genes Dev 16(13):1616–1626.
Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B, Bartel DP. (2002).
Prediction of plant microRNA targets. Cell 110(4): 513–520.
Ricarte Filho JC & Kimura ET. (2006). MicroRNAs: nova classe de reguladores
gênicos envolvidos na função endócrina e câncer. Arq Bras Endocrinol Metabol
50(6):1102-7.
92
Rodriguez A, Griffiths-Jones S, Ashurst JL, Bradley A. (2004). Identification of
mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res
14(10A):1902-10.
Ryu B, Kim DS, Deluca AM, Alani RM. (2007). Comprehensive expression
profiling of tumor cell lines identifies molecular signatures of melanoma
progression. PLoS ONE 2:e594.
Saito Y, Liang G, Egger G, Friedman JM, Chuang JC, Coetzee GA, Jones PA.
(2006) Specific activation of microRNA-127 with downregulation of the proto-
oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs in human cancer cells. Cancer Cell
9(6):435–443.
Sanchez-Beato M, Sanchez E, Garcia JF, Perez-Rosado A, Montoya MC, Fraga
M, Artiga MJ, Navarrete M, Abraira V, Morente M, Esteller M, Koseki H, Vidal M,
Piris MA. (2004). Abnormal PcG protein expression in Hodgkin's lymphoma.
Relation with E2F6 and NFkappaB transcription factors. J Pathol 204(5):528-37.
Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. (2003). Asymmetry
in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115(2):199-208.
Seggerson K, Tang L, Moss EG. (2002). Two genetic circuits repress the
Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 after translation initiation. Dev
Biol 243(2):215–225.
Sen GL & Blau HM. (2005). Argonaute 2/RISC resides in sites of mammalian
mRNA decay known as cytoplasmic bodies. Nat Cell Biol 7(6):633–636.
Si ML, Zhu S, Wu H, Lu Z, Wu F, Mo YY. (2006). miR-21-mediated tumor growth.
Oncogene 26(19):2799-803.
Smalheiser NR & Torvik VI. (2005). Mammalian microRNAs derived from genomic
repeats. Trends Genet 21(6):322-6.
93
Szymański
M & Barciszewski J. (2002). Beyond the proteome: non-coding
regulatory RNAs. Genome Biol 3(5): reviews 0005.1-0005.8.
Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, Baltimore D. (2006). NF-kappaB-dependent
induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of
innate immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A 103(33):12481-6
Takamizawa J, Konishi H, Yanagisawa K, Tomida S, Osada H, Endoh H, Harano
T, Yatabe Y, Nagino M, Nimura Y, Mitsudomi T, Takahashi T. (2004). Reduced
expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with
shortened postoperative survival. Cancer Res 64(11):3753-3756.
Tam W. (2001). Identification and characterization of human BIC, a gene on
chromosome 21 that encodes a noncoding RNA. Gene 274(1-2):157-67.
Tam W, Hughes SH, Hayward WS, Besmer P. (2002). Avian bic, a gene isolated
from a common retroviral site in avian leukosis virus-induced lymphomas that
encodes a noncoding RNA, cooperates with c-myc in lymphomagenesis and
erythroleukemogenesis. J Virol 76(9):4275-86.
Tang G, Reinhart BJ, Bartel DP, Zamore PD. (2003). A biochemical framework for
RNA silencing in plants. Genes Dev 17(1): 49–63.
Tang F, Hajkova P, Barton SC, Lao K, Surani A. (2006). MicroRNA expression a
profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 34(02):e9.
Terada T, Maeta H, Endo K, Ohta T. (2000) Protein expression of double-
stranded RNA-activated protein kinase in thyroid carcinomas: correlations with
histologic types, pathologic parameters, and Ki-67 labeling. Hum Pathol
31(7):817-21.
Tran N, McLean T, Zhang X, Zhao CJ, Thomson JM, O'Brien C, Rose B. (2007).
MicroRNA expression profiles in head and neck cancer cell lines. Biochem
Biophys Res Commun 358(1):12-7.
94
Valencia-Sanchez MA, Liu J, Hannon GJ, Parker R. (2006). Control of translation
and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev 20(5):515–524.
Welch C, Chen Y, Stallings RL. (2007). MicroRNA-34a functions as a potential
tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells. Oncogene No
prelo.
Wiemer EA. (2007). The role of microRNAs in cancer: No small matter. Eur J
Cancer. No prelo.
Wu L, Fan J, Belasco JG. (2006). MicroRNAs direct rapid deadenylation of
mRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 103(11):4034–4039.
Yanaihara N, Caplen N, Bowman E, Seike M, Kumamoto K, Yi M, Stephens RM,
Okamoto A, Yokota J, Tanaka T, Calin GA, Liu CG, Croce CM, Harris CC. (2006).
Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis.
Cancer Cell 9(3):189-98.
Yekta S, Shih IH, Bartel DP. (2004). MicroRNA-directed cleavage of HOXB8
mRNA. Science 304(5670):594-6.
Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA. (2006). MicroRNAs as oncogenes and
tumor suppressors. Dev Biol 302(1):1-12.
Zhao Y, Samal E, Srivastava D. (2005). Serum response factor regulates a
muscle-specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis. Nature
436(7048):214-20.
Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR. (2002). Both natural and designed micro RNAs
can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells.
Mol Cell 9(6):1327-33
95
Zeng Y & Cullen BR. (2003). Sequence requirements for microRNA processing
and function in human cells. RNA 9(1):112–123.
Zeng Y, Yi R, Cullen BR. (2003). MicroRNAs and small interfering RNAs can
inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA
100(17):9779-84.
Zhu S, Si ML, Wu H, Mo YY. (2007). MicroRNA-21 targets the tumor suppressor
gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem 282(19):14328-36.
Portais Internet utilizados:
http://genes.mit.edu/targetscan
http://microrna.sanger.ac.uk/
http://pictar.bio.nyu.edu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase.html
http://www.inca.gov.br/
http://www.microrna.org/
http://www.wistar.upenn.edu/herlyn
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