( PDF ) Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador de monócitos

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TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

São Paulo

2008

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

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TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Salomão

São Paulo

2008

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

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Pavanelli, Tais Francisco

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após

estimulação por lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e

lipopeptídeo ativador de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de

receptores de superfície em monócitos de pacientes com leptospirose.

/Tais Francisco Pavanelli. São Paulo, 2008.

63f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.

Título em inglês: Production of inflammatory cytokines after

lipoprotein L32 (LipL32), lipopolysaccharide (LPS) and macrophage-

activating lipopeptide-2 (MALP-2) stimulation and evaluation of superficial

receptors expression on monocytes of infected patients with leptospirosis.

1. Leptospirose 2. Monócitos 3. Lipoproteína L32

4. Citocinas 5. Imunofenotipagem 6. Citometria de fluxo

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr Angelo Amato Vincenzo de Paola

Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

Presidente da Banca:

Prof. Dr. Reinaldo Salomão

BANCA EXAMINADORA

TITULARES

Prof. Dr. Antônio Carlos Seguro

Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara

Dra. Milena Karina Coló Brunialti

SUPLENTES

Profa. Dra. Márcia Marinho

Dedicatória

DedicatóriaDedicatória

Dedicatória

Aos meus pais

, meu irmão e meu noivo

pelo

amor ilimitado... Compartilho com vocês a

alegria e a honra deste importante passo na

minha vida.

Agradecimentos

À Deus, que possibilitou-me a conclusão desta etapa muito importante da minha vida,

permitindo assim a realização de um sonho.

Ao orientador e amigo Prof. Dr. Reinaldo Salomão pela paciência e sobretudo pela

oportunidade de concretização desta pesquisa. Com certeza, o pesquisador mais brilhante que já

conheci.

À amiga Dra. Milena K. C. Brunialti, pela fascinante dedicação, competência e

incentivo todos os momentos deste trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Imunologia I, em especial, Aline J. Barbosa, Natália E.

Gomes, Leandro S.W. Martos, Maria da Luz Fernandes, Viviane K. Alves, Sidnéia S. Souza,

Marialice E. Mendes e Amanda B. Alves. Sempre lembrarei de nossos bons momentos juntos e

da ajuda oferecida nos momentos difíceis.

Ao meu noivo, Vitor, pelo grande incentivo, paciência e amor dedicados durante a

concretização desta etapa.

Aos amigos Glaucia D. Mahana e Carlos P. A. Melo, hoje colegas de trabalho, por

sempre acreditarem em mim e me ajudarem na realização do meu maior sonho.

Ao Laboratório Central do Hospital São Paulo, por permitir a conclusão dos meus

experimentos.

Obrigada a todos.

vii

Sumário

Dedicatória………………………………………………………………………………..

Agradecimentos…………………………………………………………………............

Lista de figuras....................................................................................................... ix

Lista de quadros..................................................................................................... x

Lista de tabelas...................................................................................................... xi

Lista de abreviaturas.............................................................................................. xii

Resumo.................................................................................................................. xiii

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 1

1.1 Epidemiologia, etiologia e transmissão da leptospirose...................................

1.2 Aspectos clínicos e patogênese……………………………..…………………….

2 OBJETIVOS........................................................................................................ 7

3 MATERIAIS......................................................................................................... 9

3.1 Anticorpos e corantes...................................................................................... 10

3.2 Aparelhos e Programas................................................................................... 10

3.3 Reagentes e estímulos…………………………………………………………….. 11

3.4 Soluções e meio de cultura.............................................................................. 11

4 MÉTODOS.......................................................................................................... 13

4.1 Pacientes e voluntários sadios……………………………………………………. 14

4.1.1 Grupo de pacientes com leptospirose e indivíduos sadios........................... 14

4.1.2 Critérios de inclusão………………………………………………………………

4.1.3 Critérios de exclusão…………………………………………………………….. 14

4.2 Coleta de amostra………………………………………………………………….. 15

4.2.1 Separação de células mononucleares do sangue periférico......................... 15

4.2.2 Congelamento das amostras…………………………………………………….

4.2.3 Descongelamento das amostras……………………………………………….. 16

4.3 Verificação da viabilidade de células CD14+................................................... 16

4.3.1 Aquisição de dados em citômetro de fluxo.................................................... 17

4.3.2 Análise da viabilidade celular com 7-AAD..................................................... 18

4.4 Curva dose-resposta de MALP-2……………………………………………........ 20

4.4.1 Aquisição e análise de dados em citômetro de fluxo.................................... 20

viii

4.5 Curva dose-resposta de LipL32…………………………………………………... 22

4.5.1 Aquisição e análise de dados em citômetro de fluxo.................................... 23

4.6 Estimulação in vitro de células mononucleares do sangue periférico para

detecção intracelular de citocinas em monócitos de pacientes e indivíduos

sadios.....................................................................................................................

4.7 Imunofenotipagem de monócitos de pacientes e indivíduos sadios através

da citometria de fluxo.............................................................................................

4.7.1 Aquisição e análise de dados para imunofenotipagem................................. 26

4.8 Análise estatística.............................................................................................

5 RESULTADOS.................................................................................................... 29

5.1 Detecção da produção de citocinas inflamatórias intracelulares (IL-6 e TNF-

α) por monócitos induzidas por LPS, MALP-2 e LipL32.........................................

5.1.1 Produção de IL-6…………………………………………………………………. 30

5.1.2 Produção de TNF-α induzida por LPS, MALP-2 e LipL32.............................

5.2 Imunofenotipagem de monócitos de pacientes e indivíduos sadios................ 34

5.2.1 Expressão de TLR2, TLR4 e CD14............................................................... 34

6 DISCUSSÃO....................................................................................................... 38

7 CONCLUSÕES................................................................................................... 42

8 REFERÊNCIAS................................................................................................... 44

Abstract 50

Lista de figuras

Figura 1.

Estratégia de aquisição de monócitos em CMSP................................... 18

Figura 2.

Análise da viabilidade de monócitos após descongelamento................. 19

Figura 3.

Porcentagem de monócitos viáveis após descongelamento.................. 19

Figura 4.

Curva dose-resposta de MALP-2 para indução de IL-6 e TNF-α

intracelular...............................................................................................

Figura 5.

Média da porcentagem da produção de IL-6 e TNF-α intracelular em

monócitos após estimulação com diferentes concentrações de

MALP-2...................................................................................................

Figura 6.

Curva dose-resposta de LipL32 para indução de IL-6 e TNF-α

intracelular...............................................................................................

Figura 7.

Porcentagem da produção de IL-6 e TNF-α intracelular em monócitos

após estimulação com diferentes concentrações de LipL32..................

Figura 8.

Intensidade de expressão dos receptores TLR2 e TRL4........................

Figura 9.

Intensidade de expressão do receptor CD14..........................................

Figura 10.

Produção de IL-6 intracelular induzida por LPS (caixas em branco),

MALP-2 (caixas em cinza) e LipL32 (caixas em hachurado) em

monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose...............

Figura 11.

Produção de TNF-α intracelular induzida por LPS (caixas em branco),

MALP-2 (caixas em cinza) e LipL32 (caixas em hachurado) em

monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose...............

Figura 12.

Expressão de TLR2 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose.....................................................................................

Figura 13.

Expressão de TLR4 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose....................................................................................

Figura 14.

Expressão de CD14 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose....................................................................................

Lista de quadros

Quadro 1.

Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com

leptospirose.............................................................................................

Lista de tabelas

Tabela 1.

Anticorpos e corantes utilizados nos experimentos................................ 10

Tabela 2.

Painel de anticorpos monoclonais...........................................................

Tabela 3.

Produção de IL-6 intracelular induzida por LPS, MALP-2 e LipL32 em

monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose...............

Tabela 4.

Produção de TNF-α intracelular induzida por LPS, MALP-2 e LipL32

em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose.........

Tabela 5.

Expressão de TLR2 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose.....................................................................................

Tabela 6.

Expressão de TLR4 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose.....................................................................................

Tabela 7.

Expressão de CD14 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes

com leptospirose.....................................................................................

xii

Lista de abreviaturas

APC

aloficocianina

Becton Dickinson

BSA

albumina bovina sérica

cluster of differentiation

CMSP

células mononucleares do sangue periférico

DMSO

dimetil sulfóxido

FCS

soro fetal bovino

FITC

fluoresceína isotiocianato

fosfolipídeo

GLP

glicoproteína

IFN-γ

γγ

interferon - gama

IL-10

interleucina - 10

IL-6

interleucina - 6

Lip

lipoproteínas

LPS

lipopolissacarídeo

Molaridade

MALP-2

lipopeptídeo ativador de monócitos – 2

µL

microlitro

miligrama

min

minuto

mililitro

graus Celsius

ficoeritrina

peptídeoglicano

TLR2

Toll-like receptor 2

TLR4

Toll-like receptor 4

TNF-α

αα

fator de necrose tumoral – alfa

xiii

Resumo

A leptospirose constitui uma importante zoonose, encontrada em regiões de

clima tropical, ocorrendo principalmente em épocas chuvosas. O controle da infecção

depende do adequado reconhecimento do microorganismo pelos receptores de

reconhecimento de padrão de patógenos, os TLRs, presentes nas células do sistema

imune inato do hospedeiro. A ativação dos TLRs é fundamental para o

desencadeamento da resposta inflamatória, mediadora da resposta de proteção e de

lesão no processo infeccioso. Objetivos: Avaliar a expressão dos receptores TLR2,

TLR4 e CD14 na superfície de monócitos e a resposta in vitro aos estímulos LipL32

(extraído de Leptospira sp.), MALP-2 (antígeno sintético de Mycoplasma fermentans) e

LPS (antígeno extraído de Salmonella abortus equi) ligantes dos TLRs, medida pela

produção de citocinas, em pacientes com leptospirose. Métodos: Foram incluídos 07

pacientes com quadro clínico e laboratorial de leptospirose e 07 voluntários sadios,

utilizados como controle. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) foram

separadas utilizando ficoll-paque, congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido.

Após descongelamento, verificação da viabilidade e acerto da concentração de células

para 1x10

células/mL foi mensurada a expressão de TLR2, TLR4 e CD14 na superfície

de monócitos. O restante da suspensão de células foi incubada por 6 horas com os

estímulos de 1000ng/mL de LipL32, 0,4U/mL de MALP-2 ou 100ng/mL de LPS. Após a

primeira hora de incubação foi adicionado monensina para bloqueio da secreção de

citocina. Em seguida, as CMSP foram marcadas com CD14, fixadas, permeabilizadas e

expostas aos anticorpos anti-IL-6 e anti-TNF-α para detecção intracelular da produção

destas citocinas inflamatórias nos monócitos. Foram adquiridos 10.000 eventos

combinado-se morfologia e positividade para CD14 em citometria de fluxo.

Resultados: Não foi observada diferença significativa na resposta inflamatória entre

pacientes com leptospirose e voluntários sadios quando CMSP foram estimuladas in

vitro com MALP-2 e LipL32 para indução da produção de citocinas inflamatórias (IL-6 e

TNF-α) em monócitos. Todavia, a produção de TNF-α foi menor após estímulo com

LPS (p=0,035), o que não ocorreu com a produção de IL-6. Em relação à expressão de

receptores de superfície, foi observado aumento da expressão de TLR2 (p=0,025) na

superfície de monócitos dos pacientes, porém não houve diferença na expressão de

TLR4 e CD14. Conclusões: Neste estudo demonstramos que a capacidade de

reconhecimento de antígenos pelos monócitos do sangue periférico de pacientes com

leptospirose está preservada ou aumentada. Além disso, observamos que a produção

de citocinas inflamatórias frente a antígeno da própria Leptospira (LipL32) e outro

antígeno agonista de TLR2 (MALP-2) está mantida. Entretanto, a produção de citocina

inflamatória frente ao LPS (agonista de TLR4) mostrou-se complexa podendo estar

influenciada pela tolerância cruzada.

1. 1.

1. Introdução

IntroduçãoIntrodução

Introdução

1.1 Epidemiologia, Etiologia e Transmissão da Leptospirose

A leptospirose constitui uma das zoonoses mundialmente mais importantes,

comumente encontrada em regiões de clima tropical, ocorrendo principalmente em

épocas chuvosas. É uma doença causada por espiroquetas patogênicas do gênero

Leptospira, pertencente à família Leptospiraceae.

(3,9-11)

As leptospiras são microorganismos aeróbios obrigatórios, helicoidais, flexíveis e

móveis. Estas são individualizadas em sorotipos com base nas suas características

antigênicas. Dois ou mais sorotipos antigenicamente relacionados formam um

sorogrupo.

(3,22)

No Brasil, são mais freqüentes os sorogrupos icterohemorrhagiae,

copenhageni e canícola.

(21)

São bactérias altamente invasivas, capazes de infectar os hospedeiros,

principalmente mamíferos selvagens ou domésticos, instalando-se nos túbulos

contornados proximais dos rins desses animais.

(13,21-22)

O principal animal reservatório

das leptospiroses é o rato, pois é capaz de permanecer eliminando o microorganismo

pela urina por toda sua vida, constituindo-se um portador universal. A transmissão ao

homem pode ocorrer por contato direto com sangue, tecidos, órgãos ou urina de

animais infectados ou, por via indireta, através do contato com água ou solo

contaminados com a urina dos portadores.

(2,3,14,21,24)

Lesões em pele ou conjuntiva são as principais portas de entrada das bactérias,

mas, a contaminação também pode se dar com o epitélio intacto, se o hospedeiro se

mantiver imerso na água por um longo período, com inalação de água ou aerossóis,

que podem resultar na infecção das membranas do trato respiratório, através de

mordidas de animais e transmissão entre humanos, sendo os dois últimos exemplos

extremamente raros.

(3,21)

Apesar de a leptospirose manter-se associada à exposição ocupacional,

acometendo comumente trabalhadores rurais, pescadores, garimpeiros e mineradores,

sua epidemiologia está se modificando.

(19,25,29)

A mudança do contexto rural para

urbano ocorre em paralelo ao aumento da freqüência do sorogrupo

icterohaemorrhagiae, carreado especialmente por roedores nos grandes centros.

(4,37)

As enchentes e chuvas fortes favorecem, em nosso meio, o contato do homem

com as águas contaminadas. Sendo assim, no Brasil, a incidência é maior no período

de janeiro a abril, quando ocorrem cerca de 70% dos casos.

(22)

Em São Paulo e Salvador, a leptospirose relaciona-se a condições sócio-

econômicas desfavoráveis, devido ao alagamento das zonas urbanas com baixas

condições sanitárias.

(8,20,31)

1.2 Aspectos Clínicos e Patogênese

A doença pode se manifestar de várias formas, desde quadros

oligossintomáticos aparentando uma gripe, passando por formas anictéricas de

gravidade moderada, como meningite, até formas graves, como síndrome hemorrágica

pulmonar. Estas cursam com icterícia, fenômenos hemorrágicos e múltiplas disfunções

orgânicas e são conhecidas como síndrome de Weil.

(23,39)

Pacientes acometidos pelas

formas graves da leptospirose mostram quadro similar àquele apresentado por

indivíduos com sepse grave por bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, com

febre, taquicardia, taquipnéia, leucocitose, hipotensão e disfunções orgânicas diversas,

como insuficiência renal aguda, coma, coagulopatia e icterícia. Este quadro pode ser

caracterizado como síndrome da resposta inflamatória sistêmica por leptospirose.

(22,28)

As alterações patológicas presentes nestes pacientes são pouco intensas em

comparação ao grau de disfunção orgânica observado, sendo que as lesões são de

caráter mais focal em sua maioria. As alterações tissulares mostram, por

imunohistoquímica, a presença de depósitos de antígenos bacterianos nos locais de

lesão e poucas ou nenhuma bactéria íntegra.

(14)

As lesões apresentam características

de lesão de membranas celulares, concentradas principalmente no endotélio vascular

de pequenos vasos, levando ao extravasamento de células e plasma para o interstício

dos tecidos e podendo chegar até a hemorragias graves. Estes fatos sugerem que as

lesões patológicas da leptospirose sejam causadas por um ou mais fatores tóxicos da

bactéria associados a sua capacidade de aderência aos lípides da membrana celular. A

adesão de leptospiras à membrana celular de diversos tipos de células precede o

aparecimento de lesões celulares.

(22,33,34)

A caracterização dos diversos componentes de efeito tóxico presentes nas

leptospiras, tais como as lipoproteínas (Lip), a glicoproteína (GLP), o lipopolissacarídeo

(LPS), o fosfolipídeo (FL) e o peptídeoglicano (PG) e a avaliação da resposta

inflamatória são importantes aspectos investigativos nesta doença.

(12,14,22)

As lipoproteínas, constituintes externos da membrana das leptospiras, são

consideradas potentes agentes imunogênicos.

(10,39)

Dentre elas, a LipL21 é a segunda

lipoproteína mais abundante, além de ser encontrada em cerca de 90% das espécies

saprofíticas.

(10)

A LipL32 tem grande destaque por ser encontrada em maior quantidade

na bactéria patogênica. Guerreiro et al. demonstraram que esta é altamente expressa e

conservada em espécies patogênicas de Leptospira, além de ser a lipoproteína

antigênica imunodominante reconhecida pela resposta humoral na infecção natural por

leptospirose.

(9,15,18,40)

A GLP, isolada de leptospiras patogênicas, mostrou-se tóxica para células em

cultura e animais.

(37)

O efeito tóxico parece ocorrer sobre a membrana celular, mas seu

mecanismo íntimo não está esclarecido. Tal citotoxicidade da GLP parece estar

relacionada à presença de ácidos graxos, como por exemplo, o ácido hexadecanóico,

que, na sua forma livre ou ligado a um fosfolípide, produziria lesões na membrana

celular. Há possibilidade de que a GLP possa ser a toxina comum às L. interrogans, e

que participaria das lesões vasculares, renais e também de outros órgãos, agindo de

maneira similar a endotoxina dos bacilos Gram-negativos.

(2,12,22,24)

O LPS isolado de L interrogans tem ação biológica similar à do LPS de bactérias

gram-negativas, porém, sua potência é cerca de 12 a 20 vezes menor.

(26)

Todavia,

diferente do LPS dos gram-negativos, o LPS de L. interrogans provoca lesão hepática

em animais, que se prolonga por vários dias. Este efeito é acompanhado do aumento

dos níveis plasmáticos de citocinas pró-inflamatórias via estimulação de macrófagos e

monócitos. Embora haja semelhança entre os dois tipos de LPS, o LPS de leptospira

não possui o ácido 2-ceto-3-deoxiotônico nem o ácido hidroximirístico. O mesmo

apresenta conteúdo protéico maior que o LPS de Gram-negativos.

(38)

Werts et al.

demonstraram que o LPS das leptospiras desencadeia a atividade dos macrófagos

principalmente através do CD14 e receptores do tipo Toll 2 (TLR2), ao contrário das

bactérias gram-negativas, cujos componentes de reconhecimento são os receptores do

tipo Toll 4 (TLR4), porém este mecanismo está não está completamente elucidado na

literatura. Há bastante interesse também em respostas cruzadas das células dos

pacientes com leptospirose a outros compostos bacterianos, como LPS de bactérias

gram-negativas e MALP-2, presente em Mycoplasma fermentans, agonista de TLR2/6.

(40,41)

Através dos componentes patogênicos derivados das leptospiras, há indução de

citocinas pró-inflamatórias e também antiinflamatórias. Tais citocinas são liberadas

como resposta mediadora do hospedeiro frente ao desenvolvimento da doença.

(35)

Como na sepse por bactérias gram-positivas e gram-negativas acredita-se que

as citocinas inflamatórias tenham um papel fundamental na fisiopatologia da

leptospirose. Dentre as citocinas pró-inflamatórias, a interleucina - 6 (IL-6), produzida

por fagócitos mononucleares ativados, células endoteliais e fibroblastos, estimula a

síntese de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos, bem como o crescimento de

linfócitos B que produzem anticorpos, e o fator de necrose tumoral - alfa (TNF-α),

produzido principalmente por fagócitos mononucleares ativados, estimula as células

endoteliais vasculares a expressarem novas moléculas de adesão, induz macrófagos e

células endoteliais a produzirem quimiocinas e promove apoptose de células alvo. Em

infecções graves, exerce efeitos sistêmicos, incluindo a indução de febre, síntese de

proteínas de fase aguda e caquexia.

(1)

De Fost et al. demonstraram que L. Interrogans

serovar rachmati induz a produção de IFN-γ e TNF-α in vitro, estabelecendo assim que

leptospiras patogênicas podem estimular a produção de citocinas tipo I, envolvidas na

imunidade celular.

(11)

Níveis elevados de TNF-α foram inicialmente associados com a reação de

Jarisch-Herxheimer na leptospirose.

(16)

Posteriormente, níveis circulantes foram

detectados, observando-se associação entre a elevação desta citocina e uma maior

taxa de gravidade e mortalidade da leptospirose.

(36)

Em investigações conduzidas por

nosso grupo, demonstramos que a GLP induziu a produção de citocinas inflamatórias e

anti-inflamatórias em células mononucleares do sangue periférico e que os monócitos

eram ativados, pela detecção de IL-6 e TNF-α intracelular.

(12,13)

Estes achados indicam

que GLP leva a indução de citocinas que são essenciais ao controle da infecção e

podem estar envolvidas na patogênese das lesões nos tecidos afetados pela

Leptospira sp.

(13)

Diversos estudos avaliando a atividade biológica de componentes tóxicos da

Leptospira foram conduzidos em células de animais ou de voluntários sadios. Estudos

conduzidos em células do sangue periférico de pacientes com sepse causada por

bactérias gram-negativas e gram-positivas mostram que essas sofrem modulação da

resposta a antígenos bacterianos, como o LPS, durante o curso da doença.

(6)

Todavia,

não há estudos conduzidos avaliando a adaptação celular em células do sangue

periférico de pacientes com leptospirose, que foi objeto dessa investigação.

2. 2.

2. Objetivos

Objetivos Objetivos

Objetivos

O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta inflamatória na fase aguda da

leptospirose, através da produção de citocinas inflamatórias frente a diferentes

estímulos e expressão de receptores na superfície celular.

Para tanto foram investigados:

1. A produção de citocinas inflamatórias, IL-6 e TNF-α, frente aos estímulos LPS,

MALP-2 e LipL32 em monócitos.

2. A expressão dos receptores TLR2, TLR4 e CD14 na superfície de monócitos.

3. 3.

3. Materiais

MateriaisMateriais

Materiais

3.1 Anticorpos e corantes

Tabela 1: Anticorpos e corantes utilizados nos experimentos.

Anticorpo Quantidade

(µl)

Clone Isotipo Fabricante

CD14-FITC

MφP9

mIgG

BD Bioscience

TLR2-PE

10 TL2.1 mIgG

eBioscience

TLR4-PE 20 HTA125 mIgG

eBioscience

TNF-α-APC 2 MAb11 mIgG

BD Bioscience Pharmingen

IL6-PE 10 AS12 mIgG

BD Bioscience

7-AAD 5 - - BD Bioscience

1. APC: aloficocianina

2. FITC: fluoresceína isotiocianato

3. PE: ficoeritrina

3.2 Aparelhos e Programas

• Citômetro de fluxo - BD FACSCalibur (BD Bioscences)

A leitura das amostras foi realizada em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD

Bioscience) equipado com dois laseres, um de argônio e outro de diodo, com emissão

de comprimentos de onda de 488nm e 633nm, respectivamente. O laser de argônio

possibilita a excitação de três fluorocromos: FITC, PE e PerCP. O laser de diodo excita

o fluorocromo APC. A detecção das fluorescências foi feita em escala logarítmica. As

dispersões frontal e lateral de luz detectam, sem auxilio de fluorescência, tamanho e

complexidade celular, respectivamente. A dispersão frontal e lateral de luz foram

observadas em escala linear. Desta forma foi possível detectar até seis parâmetros

para cada evento adquirido, sendo que cada evento foi considerado como uma célula.

A detecção de cada parâmetro e compensação entre os canais de fluorescências foram

acertados para aperfeiçoar a aquisição de eventos. O citômetro é acoplado a unidade

constituída por um microcomputador Macintosh Power PC, modelo G4 (Apple

Computer Inc.), que permite controle sobre o citômetro e armazenamento dos dados

em arquivo.

• Cell Quest

Software versão 3.3 (BD Biosciences)

3.3 Reagentes e estímulos

• LipL32

Proteína recombinante de leptospira, obtida conforme Haake, et al., 2002. Gentilmente

cedida pelo Dr Albert I. Ko, Fundação Oswaldo Cruz, Bahia, Brasil.

(19)

• MALP-2 (Lipopeptídeo-2 ativador de macrófago)

Sintético, 50 µg/500 µL corresponde a 1x10

unidades.Reconstuído em PBS 5% BSA,

conforme instruções do fabricante (Aléxis Biochemicals).

(17)

• LPS de Salmonella abortus equi

Obtido pelo método do fenol-água e purificado com fenol, clorofórmio e éter de

petróleo, gentilmente cedido pelo Dr Chris Galanos, Instituto Max-Planck de

Imunobiologia, Freiburg, Alemanha.

• Monensina – 1mM (Sigma)

3.4 Soluções e meio de cultura

• Albumina bovina sérica (BSA – Sigma)

• Corante trypan blue

Trypan blue (Sigma) 0,1% em PBS

• Meio de congelamento celular

Soro bovino fetal 10% Dimetil sulfóxido (DMSO – Calbiochem)

• Meio de cultura RPMI 1640 pH 7,0

Meio RPMI 1640 autoclavável (Sigma), Penicilina G 10 IU/mL (Gibco), Estreptomicina

sulfatada 10 ug/mL (Gibco), L-glutamina 200 mM (Sigma)

• PBS 0,15M pH 7,2

NaCl 0,286M (Merck), KH

2,95mM (LabSynth), Na

HPO

16,4mM (LabSynth), KCl

5,56mM (LabSynth)

• PBS 1% azida sódica

Azida sódica 1% (Sigma) diluído em PBS

• Solução de lise BD

(BD Bioscences)

• Tampão de fixação pH 7,4-7,6

Paraformaldeído 4% (Polysciences) diluído em PBS

• Tampão de marcação pH 7,4-7,6

Soro bovino fetal 1% (FCS – Gibco), azida sódica 0,1% diluídos em PBS

• Tampão de permeabilização pH 7,4-7,6

Soro bovino fetal 1%, saponina 0,1% (Sigma), azida sódica 0,1% diluídos em PBS

4. M

4. M 4. M

4. Métodos

étodosétodos

étodos

4.1 Pacientes e voluntários sadios

4.1.1 Grupo de pacientes com leptospirose e indivíduos sadios

Voluntários sadios e pacientes foram incluídos no estudo após assinatura do

termo de consentimento livre e esclarecido por eles mesmos ou responsáveis. O

estudo obteve a aprovação dos Comitês de Ética do Hospital Santa Marcelina e

Hospital São Paulo/UNIFESP.

Voluntários: 07 indivíduos sadios, sem uso de medicamentos, foram pareados

por gênero e idade em relação aos pacientes.

Pacientes: 07 pacientes com quadro clínico e laboratorial de leptospirose,

admitidos no Hospital Santa Marcelina, na cidade de São Paulo. Todos os pacientes

incluídos são do sexo masculino. As demais características estão no quadro 1.

4.1.2 Critérios de inclusão

• Pacientes com quadro clínico e laboratorial de leptospirose, com menos de 48

horas de admissão hospitalar.

• Pacientes sem histórico de imunodeficiência.

O diagnóstico de leptospirose foi confirmado por sorologia ou isolamento de

leptospira.

4.1.3 Critérios de exclusão

• Pacientes menores de 18 anos ou com doença em estádio terminal, como

neoplasias ou Aids.

• Pacientes que receberam alguma terapia experimental.

• O evento definidor da leptospirose ocorrido há mais de 48 horas.

Quadro 1: Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com leptospirose

Paciente

Idade Epidemiologia Início dos

Sintomas*

Alterações

em Urina I

Confirmação

Sorológica

Evolução

22 Exposição a

enchente

03 dias Hematúria e

leucocitúria

1ª amostra

positiva

Disfunção

renal

16 Exposição a

enchente

06 dias Hematúria e

proteinúria

1ª amostra

positiva

Sem

disfunção

31 Exposição a

ratos

10 dias Sem

alterações

1ª amostra

positiva

Sem

disfunção

40 Exposição a

ratos e

profissional

07 dias Hematúria,

leucocitúria e

proteinúria

1ª amostra

positiva

Insuficiência

respiratória e

renal

16 Exposição a

ratos

06 dias Hematúria e

leucocitúria

1ª amostra

positiva

Disfunção

renal

38 Exposição a

enchente

05 dias Hematúria e

leucocitúria

1ª amostra

positiva

Insuficiência

renal aguda

45 Exposição a

enchente

05 dias Leucocitúria

e proteinúria

1ª amostra

positiva

Sem

disfunção

*Até a data da coleta do sangue

4.2 Coleta de amostra

Para cada indivíduo sadio ou paciente com leptospirose foram coletados 20 mL de

sangue em tubo a vácuo contendo heparina sódica (BD) para obtenção das células

mononucleares do sangue periférico. As amostras foram encaminhadas para

processamento no Laboratório de Imunologia I da Disciplina de Infectologia da

UNIFESP.

4.2.1 Separação de células mononucleares do sangue periférico

O sangue coletado em tubo com heparina foi diluído em parte igual de soro

fisiológico estéril 0,9% (Áster, Sorocaba, SP, BR). O sangue diluído foi adicionado

sobre ficoll-paque plus (GE Bio-Science, Uppsala, Suécia) e centrifugado a 500g por 20

minutos a temperatura ambiente. Durante a centrifugação, as células mononucleares

do sangue periférico (CMSP) foram separadas devido à densidade do ficoll-paque plus

formando uma camada esbranquiçada de células. As células da camada foram

coletadas e passaram por duas lavagens com 50mL de soro fisiológico. O botão de

células mononucleares foi suspendido em meio de cultura RPMI suplementado com L-

glutamina, soro fetal bovino (FCS), estreptomicina e penicilina. A viabilidade e a

concentração da suspensão de células foram verificadas através da utilização do

corante trypan blue (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) e câmara de Neubauer.

4.2.2 Congelamento das amostras

A suspensão de células foi congelada na concentração de 1x10

em FCS

10%DMSO em alíquotas de 1mL em criotubos. Estes permaneceram em caixas

especiais para congelamento celular (Strata Cooler) em freezer -80

C pelo menos 24

horas. Após este período as alíquotas foram transferidas para nitrogênio líquido onde

permaneceram até a realização dos ensaios.

4.2.3 Descongelamento das amostras

Assim que retiradas do nitrogênio líquido, as amostras foram colocadas em

banho-maria a 37

C para um rápido descongelamento. Imediatamente, as amostras

foram transferidas para tubos de 15 mL. As células foram lavadas com 10 mL de RPMI

a 37

C e centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. O

sobrenadante foi desprezado e as células foram suspensas em 3 mL de RPMI. A

viabilidade e correção da concentração da suspensão de células para 1x10

células/mL

foi através da utilização do corante trypan blue (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) e

câmara de Neubauer, respectivamente.

4.3 Verificação da viabilidade de células CD14+

Amostras de 3 indivíduos sadios foram utilizadas. Dois mililitros da suspensão

de 1x10

células/mL foram centrifugados a 2000 rpm por 10 minutos a temperatura

ambiente e o sobrenadante foi desprezado. Após serem suspendidas, foram

aliquotadas em dois tubos de polipropileno. Um deles, foi incubado por 5 horas a 37

e o outro teve as células marcadas com 5 µL de 7-AAD (marcador de células mortas) ,

5 µL de CD14-FITC (marcador de monócitos) e 2 µL de CD45-APC (marcador de

leucócitos) e incubadas por 15 minutos em câmara escura a temperatura ambiente. As

células então foram lavadas com tampão de marcação, novamente centrifugadas a

2000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o sobrenadante foi

desprezado e as células suspendidas em 300 µL de tampão de marcação para ser feita

a aquisição de dados por citometria de fluxo. Transcorridas as 5 horas, o mesmo

procedimento foi realizado com o outro tubo para certificação da viabilidade das células

CD14+ após o período de incubação utilizado nos experimentos de detecção de

citocinas intracelulares.

4.3.1 Aquisição de dados em citômetro de fluxo

Durante a aquisição dos dados, dois gráficos de pontos foram utilizados (figura

1). O primeiro, de dispersões frontal e lateral de luz, que representam respectivamente,

o tamanho e a complexidade das células, foi utilizado para determinar uma região R1

de morfologia de monócitos. Utilizando-se outro gráfico de dispersão lateral de luz

versus expressão de CD14, foi delimitada uma região R2 para eventos positivos para

CD14. Através da combinação de R1 com R2, foram adquiridos 10.000 eventos, os

quais possuíam, portanto, morfologia de monócitos e positividade para CD14. Todos os

eventos foram salvos. Tanto a aquisição dos eventos quanto a análise dos resultados

foram realizadas através do programa CellQuest (BD Bioscience).

Figura 1: Estratégia de aquisição de monócitos em CMSP. O gráfico a esquerda

mostra a dispersão frontal e lateral de luz, correspondendo ao tamanho e complexidade

celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população característica de

monócitos. O gráfico da direita mostra expressão de CD14 e dispersão lateral de luz. A

região 2 (R2) separa os eventos CD14+. Durante a aquisição foram armazenados

10.000 eventos combinando as regiões R1 e R2.

4.3.2 Análise da viabilidade celular com 7-AAD

A figura 2 mostra o índice de viabilidade das células CD14+ logo após

descongelamento. A média da porcentagem de viabilidade celular de indivíduos foi de

65,70. O mesmo ocorreu após 5h de incubação destas células (média 51,82%). Este

dado foi importante para nos certificarmos que as células ainda estariam viáveis para

os ensaios de citocina intracelular. A figura 3 mostra a viabilidade de monócitos de 3

indivíduos logo após o descongelamento (T0) e após 5 horas de incubação (T5).

Figura 2: Análise da viabilidade de monócitos após descongelamento. O gráfico a

esquerda mostra a dispersão frontal e lateral de luz, correspondendo ao tamanho e

complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população

característica de monócitos. O gráfico a direita mostra as células de R1 marcadas por

CD14 e 7-AAD. As células viáveis estão localizadas no quadrante superior esquerdo,

as quais são CD14 positivas e 7-AAD negativas. Resultado de um voluntário sadio.

T0 T5

horas de incubação

viabilidade de monócitos (%)

média

Figura 3: Porcentagem de monócitos viáveis após descongelamento.

4.4 Curva dose-resposta de MALP-2

Células descongeladas como no item 4.2.3 foram utilizadas para determinar a

concentração ideal de MALP-2 a ser empregada. Foram feitas alíquotas de 1 mL na

concentração de 1x10

cél/mL de 3 voluntários sadios em tubos de polipropileno. As

alíquotas foram mantidas a 37°C a 5% de CO2 por 30 min para estabilização das

células. Após a incubação, foram adicionadas as doses 0,4 ou 4,0 U de MALP-2. Um

tubo sem estímulo foi mantido como controle negativo. Após 30 min os tubos

receberam 2 µL de monensina e permaneceram incubados por 5 horas. Em seguida,

os tubos receberam 2 mL de tampão de marcação e foram centrifugados a 2000rpm

por 5min a 4°C. As amostras foram marcadas com o anticorpo monoclonal de

superfície, CD14-FITC e incubadas por 20 minutos no escuro a 4 ºC. Logo após, as

células foram lavadas em 2 mL de tampão de marcação, suspendidas em 1 mL de

tampão de fixação e incubadas por 20 minutos a 4ºC no escuro. Os tubos foram

novamente centrifugados e o sobrenadante desprezado. As células foram suspendidas

em 50 µL de tampão de permeabilização, receberam 10 µL de IL6-PE e 2 µL TNFα-

APC , sendo incubadas por 30 minutos a 4ºC no escuro. Após este período, as células

foram lavadas em 1 mL de tampão de permeabilização e suspendidas em tampão de

marcação para aquisição no citômetro de fluxo.

4.4.1 Aquisição e análise de dados em citômetro de fluxo

A aquisição dos dados para o ensaio de dose-resposta de MALP-2 foi feita como

no item 4.3.1. A figura 4 mostra gráficos de citometria da produção de IL-6 e TNF-α

intracelular em monócitos de um indivíduo após estímulo com 0,4 e 4U de MALP-2 e a

figura 5 ilustra a média de detecção em três indivíduos. Após análise dos resultados

escolhemos a dose de 0,4U/mL de MALP-2 para realizar os demais ensaios desta tese.

Figura 4: Curva dose-resposta de MALP-2 para indução de IL-6 e TNF-α intracelular.

(A) Gráficos de identificação da população de monócitos através da combinação das

regiões R1 e R2. (B) Os gráficos controle mostram em porcentagem o basal de

monócitos produzindo citocinas. Os demais gráficos mostram a porcentagem de

monócitos produtores de IL-6 e TNF-α estimulados com 0,4 e 4,0U/mL de MALP-2.

Resultado de um indivíduo.

controle

0,4 U

4,0 U

IL-6

TNF-alfa

dispersão frontal de luz

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

22, 60%

13, 70%

32,28%

54, 06%

51,51%

59,91%

controle

0,4 U

4,0 U

IL-6

TNF-alfa

dispersão frontal de luz

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

22, 60%

13, 70%

32,28%

54, 06%

51,51%

59,91%

0,4 U 4,0 U

Dose de MALP-2

Porcentagem de monócitos

produzindo citocina

TNF-alfa

IL-6

Figura 5: Média da porcentagem da produção de IL-6 e TNF-α intracelular em

monócitos após estimulação com diferentes concentrações de MALP-2. O valor basal

de produção de citocina foi descontado da condição estimulada. Média obtida de três

indivíduos sadios.

4.5 Curva dose-resposta de LipL32

Células descongeladas como no item 4.2.3 foram utilizadas para determinar a

concentração ideal de LipL32 a ser empregada. Foram feitas alíquotas de 1 mL na

concentração de 1x10

cél/mL de um voluntário sadio em tubos de polipropileno. As

alíquotas foram mantidas em estufa de CO

a 5% por 30 min para estabilização das

células. Em seguida, foram adicionadas as doses de LipL32 10, 100, 1000 ng/mL. Um

tubo sem estímulo foi mantido como controle negativo. Todo o processo de ativação

celular e marcação intracelular foram feitos de forma similar ao item 4.4.

4.5.1 Aquisição e análise de dados em citômetro de fluxo

A aquisição dos dados para o ensaio de dose-resposta de LipL32 foi feita como

no item 4.3.1. A figura 6 mostra gráficos de pontos (dot plots) e a figura 7 o percentual

de monócitos positivos para produção de IL-6 e TNF-α de um indivíduo após estímulo

com 10, 100 e 1000 ng/mL de LipL32. Após análise do resultado escolhemos a dose de

1000 ng/mL de LipL32 para realizar os demais ensaios desta tese.

Figura 6: Curva dose-resposta de LipL32 para indução de IL-6 e TNF-α intracelular.

(A) Gráficos de identificação da população de monócitos através da combinação das

regiões R1 e R2. (B) Os gráficos controle mostram em porcentagem o basal de

monócitos produzindo citocinas. Os demais gráficos mostram a porcentagem de

monócitos produtores de IL-6 e TNF-α estimulados com 10, 100 e 1000 ng/mL de

LipL32.

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

controle

10 ng /mL

100 ng /mL

1000 ng /mL

dispersão frontal de luz

IL-6 TNF-alfa

1,38%

5,44%

12,89%

6,86%

41,71%

25,27%

49,51%

35,85%

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

controle

10 ng /mL

100 ng /mL

1000 ng /mL

dispersão frontal de luz

IL-6 TNF-alfa

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

controle

10 ng /mL

100 ng /mL

1000 ng /mL

dispersão frontal de luz

IL-6 TNF-alfa

1,38%

5,44%

12,89%

6,86%

41,71%

25,27%

49,51%

35,85%

10 ng/mL 100 ng/mL 1000 ng/mL

Doses de LipL32

Porcentagem de monócitos

produzindo citocina

IL-6

TNF-alfa

Figura 7: Porcentagem da produção de IL-6 e TNF-α intracelular em monócitos após

estimulação com diferentes concentrações de LipL32. O valor basal de produção de

citocina foi descontado da condição estimulada.

4.6 Estimulação in vitro de células mononucleares do sangue periférico para

detecção intracelular de citocinas em monócitos de pacientes e indivíduos

sadios

As células dos pacientes e voluntários sadios foram descongeladas conforme

item 4.2.3. Após acerto da concentração para 1x10

cel/mL foram feitas alíquotas de

1mL da suspensão de CMSP em tubos de polipropileno. Estes foram incubadas por 30

minutos a 37

C. Ao fim da incubação manteve-se um tubo controle (sem estímulo) e

outros tubos foram estimulados com 100 ng/mL de LPS (dose previamente

padronizada pelo nosso laboratório, conforme artigo 11), 0,4 U/mL de MALP-2 e 100

ng/mL de LipL32. Todo o processo de ativação celular e marcação intracelular foi feito

de forma similar ao item 4.4.

4.7 Imunofenotipagem de monócitos de pacientes e indivíduos sadios através da

citometria de fluxo

As células dos pacientes e voluntários sadios foram descongeladas conforme

item 4.2.3. Após acerto da concentração para 1x10

cel/mL foram feitas alíquotas de

500 µL da suspensão de CMSP em tubos de polipropileno e acrescentando 2 mL de

tampão de marcação. Os tubos foram centrifugados a 2000 rpm por 8 minutos a

temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram desprezados e as células

suspendidas. As amostras foram marcadas com os anticorpos monoclonais de

superfície como descrito na tabela 2 e incubadas por 15 minutos no escuro. Após o

tempo de incubação os tubos foram centrifugados a 2000 rpm por 8 minutos a

temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram desprezados e as células suspendidas

em 300 µL para leitura em citômetro de fluxo.

Tabela 2: Painel de anticorpos monoclonais.

Tubos

FITC PE

1 CD14 (2,5 µL)

mIgG

(5 µL)

2 CD14 (2,5 µL)

TLR2 (5 µL)

3 CD14 (2,5 µL)

TLR4 (10 µL)

4.7.1 Aquisição e análise de dados para imunofenotipagem

A aquisição dos dados para análise da imunofenotipagem foi feita como no item

4.3.1. A figura 8 mostra a expressão dos receptores TLR2 e TLR4 na superfície de

monócitos através de gráficos de histograma. Isotipos controles foram utilizados em

cada situação.

Para análise da expressão de CD14 em monócitos utilizou-se estratégia similar,

como mostrado na figura 9. A intensidade de expressão de CD14 foi verificada dentro

da marcação M1.

Figura 8: Intensidade de expressão dos receptores TLR2 e TLR4. (A) Gráficos de

identificação da população de monócitos através da combinação das regiões R1 e R2.

(B) Análise a expressão dos receptores TLR2 e TLR4 através de histogramas. Foi

utilizado isotipo controle.

Ig G 2a

TLR4

TLR2

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

Ig G 2a

TLR4

TLR2

Ig G 2a

TLR4

TLR2

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

Dispersão lateral de luz

CD14 FITC

dispersão frontal de luz

dispersão lateral de luz

Figura 9: Intensidade de expressão do receptor CD14. (A) Gráficos de identificação da

população de monócitos através da combinação das regiões R1 e R2. (B) Análise a

expressão de CD14 dentro da marcação M1.

4.8 Análise estatística

Os dados obtidos com a análise dos ensaios de imunofenotipagem e produção

de citocina intracelular foram transferidos a uma planilha de dados dos programas

Excel 2003 (Microsoft Corporation, Seattle, WA, EUA) e SPSS 13.0 (SPSS Inc. and

Predictive Analytics, Chicago, IL, EUA). Os valores obtidos com a ligação dos isotipos

na imunofenotipagem e a produção de citocinas detectadas na condição sem estímulo

foram subtraídos dos resultados. A comparação das variáveis foi realizada com o teste

não paramétrico Mann-Whitney. A diferença estatística foi considerada significativa

quando o valor de p observado foi menor que 0,05.

Dispersão lateral de luz

dispersão frontal de luz

FL3

CD14 FITC

Dispersão lateral de luz

dispersão frontal de luz

FL3

CD14 FITC

Dispersão lateral de luz

dispersão frontal de luz

FL3

CD14 FITC

5. 5.

5. Resultados

ResultadosResultados

Resultados

5.1 Detecção da produção de citocinas inflamatórias (IL-6 e TNF-α) induzidas por

LPS, MALP-2 e LipL32 em monócitos de pacientes com leptospirose e

voluntários sadios

5.1.1 Produção de IL-6

A produção de IL-6 foi similar frente aos estímulos de LPS, MALP-2 e LipL32

(figura 10 e tabela 3). Os valores basais de produção de IL-6 foram subtraídos das

condições de estímulos. Ao analisarem-se os grupos verificou-se que não houve

diferença significativa na produção de IL-6 entre voluntários sadios e pacientes com

leptospirose. Os valores de p comparando células de pacientes com leptospirose e

voluntários sadios para os estímulos foram: LPS (p=0,100), MALP-2 (p=0,917) e LipL32

(p=1,000) (Mann-Whitney).

Figura 10: Produção de IL-6 intracelular induzida por LPS (caixas em branco), MALP-2

(caixas em cinza) e LipL32 (caixas em hachurado) em monócitos de indivíduos sadios

e pacientes com leptospirose. Resultado de 07 voluntários sadios e 07 pacientes. No

gráfico os valores são representados em porcentagem de células positivas para IL-6.

Estão representados os valores máximos e mínimos, o percentil 25% e 75% (caixas),

mediana dos grupos e valores extremos (asteriscos).

Tabela 3: Produção de IL-6 intracelular induzida por LPS, MALP-2 e LipL32 em

monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose. Valores expressos em

porcentagem de células positivas para IL-6.

LPS

sadio

MALP-2

LipL32

LPS

paciente

MALP-2

LipL32

média 33,7

24,4

26,6

20,9

24,9

30,4

mediana 29,0

25,3

29,6

16,8

18,6

26,4

mínimo 22,2

24,4

20,3

16,8

15,6

19,7

máximo 46,4

40,5

34,9

49,2

47,5

52,2

percentis 25 24,7

15,1

19,3

12,1

15,5

16,9

45,2

33,3

32,4

37,0

37,5

47,7

voluntário sadio paciente

Porcentagemde monócitospositivos paraIL-6

5.1.2 Produção de TNF-α

Nos dois grupos estudados, a produção de TNF-α induzida por MALP-2 e LipL32

apresentou uma magnitude de resposta bastante similar (figura 11 e tabela 4). Os

valores basais de produção de TNF-α foram subtraídos das condições de estímulos. Ao

analisarem-se os grupos verificou-se que houve diferença significativa na produção de

TNF-α entre voluntários sadios e pacientes com leptospirose quando o estímulo foi LPS

(p=0,035). Para os estímulos MALP-2 (p=0,317) e LipL32 (p=0,180) não houve

diferença significativa (Mann-Whitney).

Figura 11: Produção de TNF-α intracelular induzida por LPS (caixas em branco),

MALP-2 (caixas em cinza) e LipL32 (caixas em hachurado) em monócitos de indivíduos

sadios e pacientes com leptospirose. Resultado de 07 voluntários sadios e 07

pacientes. No gráfico os valores são representados em porcentagem de células

positivas para TNF-α. Estão representados os valores máximos e mínimos, o percentil

25% e 75% (caixas), mediana dos grupos e valores extremos (círculos). *

p<0,05 na

comparação entre os grupos estimulados com LPS (Mann-Whitney).

Tabela 4: Produção de TNF-α intracelular induzida por LPS, MALP-2 e LipL32 em

monócitos de indivíduos sadios e pacientes com leptospirose. Valores expressos em

porcentagem de células positivas para TNF-α.

LPS

sadio

MALP-2

LipL32

LPS

paciente

MALP-2

LipL32

média 32,8

30,7

46,0

19,1

25,6

36,6

mediana 32,2

24,0

46,6

15,1

22,9

37,8

mínimo 16,6

21,0

28,6

3,39

15,1

20,2

máximo 48,2

50,8

62,5

41,8

37,3

54,8

percentis 25 27,8

21,7

39,4

11,3

15,3

20,9

40,5

40,7

50,4

31,6

38,0

48,3

voluntário sadio paciente

Porcentagem de monócitos positivos para TNF-α

voluntário sadio paciente

Porcentagem de monócitos positivos para TNF-α

5.2 Imunofenotipagem de monócitos de pacientes e indivíduos sadios

5.2.1 Expressão de TLR2, TLR4 e CD14

Foi observada diferença estatística quando se compararam os dois grupos

estudados (indivíduos sadios e pacientes com leptospirose) quanto à expressão de

TLR2 (p=0,025) na superfície de monócitos como mostrado na figura 12, porém não

houve diferença estatística na expressão de TLR4 (p=0,318) e CD14 (p=0,949), como

mostrado nas figuras 13 e 14, respectivamente. Os valores obtidos no estudo das

expressões de TLR2, TLR4 e CD14 estão nas tabelas 5, 6 e 7, respectivamente.

Figura 12: Expressão de TLR2 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Resultado de 7 voluntários sadios e 07 pacientes. Foram adquiridos

10.000 eventos na janela de monócitos, combinado tamanho e complexidade das

células e positividade para CD14. No gráfico os valores são mostrados em média

geométrica da intensidade de fluorescência da expressão de TLR2. Estão

representados os valores máximos e mínimos, o percentil 25% e 75% (caixas) e a

mediana dos grupos. p<0,05 na comparação entre os grupos (Mann-Whitney).

Tabela 5: Expressão de TLR2 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Valores mostrados em média geométrica da intensidade de fluorescência.

sadio

paciente

média 37,2

70,8

mediana 33,6

74,6

mínimo 20,7

24,1

máximo 58,0

116,7

percentis 25

21,2

54,9

44,3

89,9

100

Expressão de TLR2 em monócitos (MGIF)

voluntário sadio paciente

100

Expressão de TLR2 em monócitos (MGIF)

voluntário sadio paciente

Figura 13: Expressão de TLR4 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Resultado de 7 voluntários sadios e 07 pacientes. Foram adquiridos

10.000 eventos na janela de monócitos, combinado tamanho e complexidade das

células e positividade para CD14. No gráfico os valores são mostrados em média

geométrica da intensidade de fluorescência da expressão de TLR4. Estão

representados os valores máximos e mínimos, o percentil 25% e 75% (caixas) e a

mediana dos grupos e valores extremos (círculos). p>0,05 na comparação entre os

grupos (Mann-Whitney).

Tabela 6: Expressão de TLR4 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Valores mostrados em média geométrica da intensidade de fluorescência.

sadio

paciente

média 31,6

39,2

mediana 27,2

37,3

mínimo 16,4

19,0

máximo 58,4

59,9

percentis 25

17,2

42,3

34,5

45,1

voluntário sadio

paciente

Expressão de TLR4 em monócitos (MGIF)

voluntário sadio

paciente

Expressão de TLR4 em monócitos (MGIF)

Figura 14: Expressão de CD14 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Resultado de 7 voluntários sadios e 07 pacientes. Foram adquiridos

10.000 eventos na janela de monócitos, combinado tamanho e complexidade das

células e positividade para CD14. No gráfico os valores são mostrados em média

geométrica da intensidade de fluorescência da expressão de CD14. Estão

representados os valores máximos e mínimos, o percentil 25% e 75% (caixas) e a

mediana dos grupos. p>0,05 na comparação entre os grupos (Mann-Whitney).

Tabela 7: Expressão de CD14 em monócitos de indivíduos sadios e pacientes com

leptospirose. Valores mostrados em média geométrica da intensidade de fluorescência.

sadio

paciente

média 391,6

395,3

mediana 406,7

417,5

mínimo 317,8

290,8

máximo 483,4

488,5

percentis 25

334,4

439,8

309,5

482,8

250

300

350

400

450

500

voluntário sadio

paciente

Expressão de CD14 em monócitos (MGIF)

250

300

350

400

450

500

voluntário sadio

paciente

Expressão de CD14 em monócitos (MGIF)

6. 6.

6. Discussão

DiscussãoDiscussão

Discussão

A leptospirose é uma doença causada por toxina ou toxinas presentes nas

células do espiroqueta e liberadas nos tecidos afetados. Dentre os vários produtos

isolados da leptospira destaca-se a LipL32 (agonista de TLR2), por ser altamente

expressa e conservada em espécies patogênicas de Leptospira, além de ser a

lipoproteína antigênica imunodominante, indutora de resposta humoral na infecção

natural por leptospirose.

(9,15,18,39)

Há bastante interesse também em respostas cruzadas de CMSP dos pacientes

com leptospirose a outros compostos bacterianos, como LPS de bactérias gram-

negativas (agonista de TLR4) e MALP-2, presente em Mycoplasma fermentans

(agonista de TLR2/6), para que haja uma comparação entre a produção de citocinas

induzida por produtos antigênicos isolados de leptospiras patogênicas e de outros tipos

de bactérias que também induzem a sepse.

(40,41)

Em investigações conduzidas por nosso grupo, demonstramos que níveis

elevados de TNF-α foram encontrados no plasma de pacientes com as formas mais

graves da doença, estando ausente ou em baixos níveis nas formas mais brandas, o

que nos mostrou que há uma associação entre a elevação desta citocina circulante e

maior gravidade e mortalidade da leptospirose.

(36)

Em outra série de investigações, observamos que em monócitos de voluntários

sadios estimulados com GLP proveniente de leptospiras patogênicas ocorreu indução

da produção de citocinas inflamatórias (como IL-6 e TNF-α) e anti-inflamatória (IL-10),

as quais são essenciais ao controle da infecção e podem estar envolvidas na

patogênese das lesões nos tecidos afetados pela Leptospira sp.

(12,13)

De Fost et al. induziram a produção de IFN-γ e TNF-α em células do sangue

periférico de bovinos estimuladas com L. interrogans serovar rachmati inativada por

calor. Após estimulação do sangue total, detectou-se a presença das citocinas por

ELISA em sobrenadante da cultura, estabelecendo assim que leptospiras patogênicas

podem estimular a produção de citocinas tipo I, envolvidas na imunidade celular.

(11)

Investigações conduzidas em CMSP de pacientes com sepse por bactérias

gram-negativas e gram-positivas mostram que essas sofrem modulação da resposta a

antígenos bacterianos, como o LPS, durante o curso da doença. Encontrou-se uma

regulação positiva da produção de citocinas inflamatórias no estádio inicial da sepse,

seguida de uma importante regulação negativa nos estágios tardios, ou seja, pacientes

em sepse grave e choque séptico.

(6)

Este resultado é concordante com a hipótese de

patogênese da sepse, onde no estádio inicial após a infecção há o surgimento de

citocinas inflamatórias e antiinflamatórias. O estádio tardio é caracterizado por

persistente desativação do monócito e aumento do risco de morte.

(5,30)

Não há relatos de trabalhos que avaliem a adaptação celular em células do

sangue periférico de pacientes com leptospirose. A produção de citocinas, na maioria

das investigações, foi induzida in vitro, a partir da estimulação de células sadias, de

animais ou voluntários, com LPS ou GLP de leptospiras patogênicas.

Em nosso estudo, avaliamos a produção de citocinas por células mononucleares

de pacientes com leptospirose, detectada intracelular em monócitos estimulados com

antígenos purificados de Leptospira patogênica (LipL32), Salomonella abortus equi

(LPS) e Mycoplasma fermentans (MALP-2).

Nossos resultados indicam que há preservação da resposta inflamatória em

pacientes com leptospirose comparados a voluntários sadios quando CMSP são

estimuladas in vitro com MALP-2 e LipL32 para indução da produção de citocinas

inflamatórias intracelulares (IL-6 e TNF-α) em monócitos. Todavia, a produção de TNF-

α intracelular foi menor após estímulo com LPS, o que não ocorreu com a produção de

IL-6 que se manteve preservada.

Sato et al. Demonstraram regulação negativa, in vitro, da produção de TNF-α

intracelular em macrófagos de murinos pré-tratados com MALP-2 em resposta ao LPS,

o que confirma a tolerância cruzada entre antígenos sinalizadores de TLR2 e TLR4.

(32)

Esse efeito poderia explicar o mecanismo pelo qual pacientes com leptospirose

mostraram-se hiporresponsivos ao estímulo com LPS em nosso estudo, uma vez que

eles já tiveram sua ativação de resposta celular primária via TLR2.

Estudos indicam que lipoproteínas e LPS provenientes de Leptospiras

patogênicas desencadeiam a atividade dos macrófagos, principalmente através dos

receptores CD14 e TLR2, ao contrário das bactérias gram-negativas, cujos

componentes de reconhecimento são os receptores CD14 e TLR4. Entretanto, o

mecanismo de reconhecimento de antígenos padrão de Leptospiras não está

completamente elucidado na literatura.

(40)

A expressão de TLR2 e TLR4 em monócitos durante a leptospirose reveste-se

de grande interesse, já que estes são, sabidamente, receptores de reconhecimento de

patógenos. Investigações conduzidas com camundongos e seres humanos mostram

que há diferença na especificidade de receptores do tipo Toll por LPS de Leptospira em

seres humanos e camundongos. Os humanos requerem CD14 e TLR2, mas não TLR4

para o reconhecimento do patógeno, diferentemente dos camundongos que o

reconhecem via TLR2 e TLR4. É sabido que camundongos são pouco susceptíveis a

leptospirose e humanos são sensíveis, por este motivo acredita-se que a via de

reconhecimento do antígeno por monócitos de camundongos faça parte de uma efetiva

resposta imune inata da doença.

(27)

Nossos resultados mostram que os receptores da superfície celular de

monócitos estão diferentemente regulados na leptospirose. Assim, houve aumento da

expressão de TLR2 e não se observou diferença na expressão de TLR4 e CD14 entre

voluntários sadios e pacientes. Todavia, o aumento da expressão de TLR2 não resultou

em acréscimo da produção de citocinas inflamatórias, que se manteve semelhante ao

grupo controle. Também observamos uma discrepância em relação à produção de

TNF-α intracelular após estimulação com LPS e expressão de receptores, ou seja,

embora a produção de TNF-α tenha sido menor, a expressão de TLR4 e CD14 se

manteve inalterada. Este resultado é concordante com estudo realizado por nosso

grupo em pacientes com sepse por bactérias gram-negativas ou gram-positivas, onde a

expressão destes receptores permaneceu inalterada no continuum da doença, porém a

detecção de citocinas foi elevada no estágio inicial e suprimida nos estágios mais

graves da síndrome, sugerindo que a regulação positiva ou negativa se dê na

sinalização intracelular.

(6)

7. 7.

7. Conclusões

Conclusões Conclusões

Conclusões

1. Monócitos do sangue periférico de pacientes com leptospirose mantêm a

capacidade de reconhecimento e sinalização celulares, avaliados pela detecção

intracelular de IL-6 e TNF-α frente a estímulos da própria Leptospira (LipL32),

assim como a outro antígeno agonista de TLR2 (MALP-2). Todavia, a produção

de TNF-α intracelular foi menor após estímulo com LPS, o que não ocorreu com

a produção de IL-6 que se manteve preservada.

2. A expressão dos receptores de superfície, TLR4 e CD14 nos monócitos está

inalterada na fase aguda da leptospirose em relação a indivíduos sadios, já a

expressão de TLR2 mostra-se aumentada. A preservação da expressão desses

receptores na superfície celular pode desempenhar um importante papel na

preservação da capacidade de reconhecimento e sinalização demonstrada in

vitro.

8. 8.

8. Referências

ReferênciasReferências

Referências

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Abstract

The Leptospirosis is one of the world's most important zoonoses, found in regions of

tropical climate, occurring mainly in rainy seasons. The control of infection depends on

the proper recognition of the microorganism by receptors for recognition of patterns of

pathogens, the TLRs present in the cells of the innate immune system of the host. The

activation of TLRs is crucial for triggering the inflammatory response, mediator of the

response of protection in case of injury and infection.

Objectives: To evaluate the

expression of receptors TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface in vitro and

response to stimuli LipL32 (extracted from Lestospira sp.), MALP-2 (synthetic antigen of

Mycoplasma fermentans) and LPS (antigen extracted from bacteria-gram negative)

binders of TLRs, as measured by production of cytokines in patients with leptospirosis.

Methods: 07 patients with clinical and laboratory of leptospirosis were included and 07

healthy volunteers, used as controls. The peripheral blood mononuclear cells (PBMC)

were separated using ficoll-paque, frozen and stored in liquid nitrogen. After thawing,

checking the feasibility and wisdom of the concentration of cells to 1x10

células/mL was

measured the expression of TLR2, TLR4 and CD14 on the monocytes surface. The rest

of the cell suspension was incubated for 6 hours with the stimuli of 1000ng/mL of

LipL32, 0.4 U / mL of MALP-2 or 100ng/mL of LPS. After the first hour of incubation was

added monensin for blocking the secretion of cytokine. Then the PBMC were stained

with CD14, set, permeabilizaded and exposed to anti-IL-6 and anti-TNF-α for detection

of intracellular production of inflammatory cytokines in monocytes. They were acquired

10,000 events combined to morphology and positive for CD14 in flow cytometry.

Results: There was no significant difference in the inflammatory response among

patients with leptospirosis and healthy volunteers when PBMC were stimulated in vitro

with MALP-2 and LipL32 to induce the production of inflammatory cytokines (IL-6 and

TNF-α) in monocytes. However, the production of intracellular of TNF-α was lower after

stimulation with LPS (p = 0035), which did not occur to the production of IL-6.

Regarding the expression of surface receptors, it was observed increased expression of

TLR2 (p = 0025) on the monocytes surface of patients, but there was no difference in

the expression of TLR4 and CD14. Conclusions: This study demonstrated that the

ability of recognition of antigens by peripheral blood monocytes of patients with

leptospirosis is preserved or increased. Also, we observed that the production of

inflammatory cytokines in front of the Leptospira antigen (LipL32) and another antigen

agonist of TLR2 (MALP-2) is maintained. Meanwhile, the production of inflammatory

cytokine front of LPS (agonist of TLR4) proved to be complex may be influenced by

cross tolerance.

TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

São Paulo

2008

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Salomão

São Paulo

2008

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

Pavanelli, Tais Francisco

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após

estimulação por lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e

lipopeptídeo ativador de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de

receptores de superfície em monócitos de pacientes com leptospirose.

/Tais Francisco Pavanelli. São Paulo, 2008.

63f.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.

Título em inglês: Production of inflammatory cytokines after

lipoprotein L32 (LipL32), lipopolysaccharide (LPS) and macrophage-

activating lipopeptide-2 (MALP-2) stimulation and evaluation of superficial

receptors expression on monocytes of infected patients with leptospirosis.

1. Leptospirose 2. Monócitos 3. Lipoproteína L32

4. Citocinas 5. Imunofenotipagem 6. Citometria de fluxo

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr Angelo Amato Vincenzo de Paola

Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

TAIS FRANCISCO PAVANELLI

Avaliação da produção de citocinas inflamatórias após estimulação por

lipoproteína L32 (LipL32), lipopolissacarídeo (LPS) e lipopeptídeo ativador

de monócitos – 2 (MALP-2) e expressão de receptores de superfície em

monócitos de pacientes com leptospirose.

Presidente da Banca:

Prof. Dr. Reinaldo Salomão

BANCA EXAMINADORA

TITULARES

Prof. Dr. Antônio Carlos Seguro

Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara

Dra. Milena Karina Coló Brunialti

SUPLENTES

Profa. Dra. Márcia Marinho