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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
PROGRAMA DE PÓS
-
GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
FÁBIO WILDSON GURGEL COSTA
AVALIAÇÃO DA NECROSE ÓSSEA PRODUZIDA POR DIFERENTES
PROTOCOLOS DE APLICAÇÃO DE NITROGÊNIO LÍQUIDO EM
DIÁFISE
FEM
U
RAL DE RATOS
FORTALEZA
2008
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FÁBIO WILDSON GURGEL COSTA
AVALIAÇÃO DA NECROSE ÓSSEA PRODUZIDA
POR DIFERENTES
PROTOCOLOS DE APLICAÇÃO DE NITROGÊNIO LÍQUIDO EM DIÁFISE
FEM
U
RAL DE RATOS
Dissertação submetida à Coordenação do Curs
o de
Pós
-
Graduação em Odontologia da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Odontologia.
Área de concentração: Clínica Odontológica
Orientador: Prof. Dr. Eduardo Costa Studart Soares
Co
-
orientadora: Profa.
Dra. Gerly Anne
de Castro
Brito
FORTALEZA
2008
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FÁBIO WILDSON GURGEL COSTA
AVALIAÇÃO DA NECROSE ÓSSEA PRODUZIDA
POR DIFERENTES
PROTOCOLOS DE APLICAÇÃO DE NITROGÊNIO LÍQUIDO EM DIÁFISE
FEM
U
RAL DE RATOS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós
-
Graduação em Odontologia, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre
em Odontologia. Área de concentração em Clínica Odontológica.
Aprovada em
08
/
10
/
2008
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Eduardo Costa Studart Soares (Orientador)
Universidade Federal do Ceará
-
UFC
Prof. Dr. Fabrício Bitu Sousa
Universidade Federal do Ceará
-
UFC
Prof. Dr. Francisco Wag
ner
Vasconcelos
Freire Filho
Universidade de Fortaleza
-
UNIFOR
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5
À Deus e às três
grandes Marias (Rodrigues, Helena e Helane)
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6
AGRADECIMENTOS
À Deus, “
Com Ele tudo.... Sem Ele nada
”. Agradeço pelo dom da vida, pela
capacidade de
aprender e por mais esta oportunidade de crescimento e conquista.
Às minhas mães, Maria Helena Costa Nunes e Maria Rodrigues Martins,
in
memorian
, por tudo que sou hoje, pelo grande exemplo de ética, dedicação, carinho,
competência, responsabilidade, compromisso e perseverança. Agradeço
pelo amor
incondicional e por cada segundo que estiveram ao meu lado.
Ao
meu pai
,
Ulisses Gurgel Nunes
, pelo apoio e participação na minha formação
pessoal e profissional. À sua esposa, Patrícia, por suportar
seu
s
momentos
hipocondríacos
(brincadeira pai!).
Aos meus
irmãos
, Ulisses Júnior, Maria Adelaide e Miguel Ângelo,
p
ela amizade e
apoio que me deram em vários momentos.
À minha querida irmã, Maria Helane Costa Gurgel, e seu esposo, Eduardo Castelo,
exemplos de caráter, competência,
superação
e amizade
.
A todas as minhas tias, especialmente Fátima, Aparecida e Luiza, que foram
fundamentais para superação de momentos difíceis.
Ao meu grande orientador e amigo
, professor
Dr. Eduardo Costa Studart Soares
,
pela dedicação, atenção
e
extrema paciência
dedicadas
durante todos esses anos. Agradeço
pelos momentos de divertimento, por todos os ensinamentos, oportunidades
incontáveis,
por me ajudar a superar momentos difíceis
e
, principalmente,
por
sempre
ter
acreditado e
investid
o no meu desenvolvimento pessoa
l
e profissional. Saiba que tenho uma dívida
impagável
. Respeitosamente
, agradeço, ainda,
à sua esposa e filhos
,
pela
sincera atenção
sempre prestada.
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7
À professora Dra. Gerly Ane Brito,
pela prontidão na realização das aná
lises
histológicas, por ter me dado orientações seguras em momentos
adversos
e pelo auxílio
indispensável na realização deste trabalho
.
Ao professor Dr. Eliardo Silveira pela importante colaboração no desenvolvimento
da presente dissertação.
Ao professor
Dr. Henrique Clasen Scarparo,
pelas suas valorosas e importantes
sugestões
e por ser um exemplo de caráter e competência.
Aos professores Dr. Fabrício Bitu
,
Dra. Ana Paula Negreiros Nunes Alves
e Dra.
Cristiane Fonteles Sá Roriz
,
pel
o exemplo de
competênc
ia, generosa acolhida, atenção e
apoio sempre dispensados.
Aos professores Wagner Freire
,
Alexandre Nogueira
e Luis Nogueira
pela
importante contribuição na minha formação e aperfeiçoamento
profissiona
is
.
À professora Dra. Eveline Turati,
pelos incentivo
s, apoio e auxílio importantes na
finalização do presente trabalho.
À professora Karuza Alves, por suas contribuições durante o desenvolvimento do
presente trabalho e, sobretudo, pela amizade.
À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Programa de Pós
-
Gr
aduação em
Odontologia, pela oportunidade de realizar o curso de Mestrado.
Ao professor Dr. Sérgio Lima Santiago, coordenado do Programa de Pós
-
Graduação
em Odontologia da UFC, pelo exemplo de competência, além de apoio e compreensão
necessários à conclusão deste trabalho.
A
todos os professores dos cursos de Graduação e do Programa de Pós
-
Graduação
em Odontologia da UFC que contribuíram para
o
meu desenvolvimento pessoa
l
,
profissional e científico.
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8
A todos os colegas de mestrado
, Cláudia, Rosana, Rebeca,
Nina, Nonato, Cláudio,
Valeska, Valkíria, Rosane, Milena, Alessandra,
Suyanne e Djane, pelo convívio e
oportunidade de tê
-
los conhecido.
Aos
colegas de mestrado e
estimados
amigos Tácio
Pinheiro
, Ivo
Pita
, Marcelo
Ferraro
,
Saulo
Batista
, Rafael Lima, Renata Ribeiro, Diego Perez,
Isabela Pacheco
e Denise
Moraes
p
ela atenção, dedicação, empenho e companheirismo
. Agradeço pelos momentos
de alegria e por ter aprendido
muito
com vocês.
Aos secretários do Programa de Pós
-
Graduação em Odontologia da UFC, Lúcia
e
Germano, pela atenção e apoio sempre prestados.
Aos amigos de graduação
do curso de Odontologia da UFC que participaram com
empenho e dedicação durante as fases experimentais desta pesquisa.
Aos amigos e colegas de trabalho dos municípios de São Luis do
Curu, Choró
Limão e Quixadá por contribuírem com meu desenvolvimento pessoal.
Ao amigo “Fábio das Placas”
pela amizade, apoio e bom
-
humor constantes.
Aos “velhos”
amigos Rafael e Janaína, Giuseppe e Isabele, Artêro e Kamile, André
e Geovana, Bruno e Ana
Áurea, Caio e Paula, Vitor e Cristiane,
Renata Morais,
Erebaldo,
Klécius, Marcelo, Vinícius,
Carolina Uchôa, Rafael
Linard
, Saulo Ellery, Rosana Andrade,
Helíada Chaves,
Geílson, Frederico,
Mirlene
Matos,
Kamile Abreu
e Kaline Lira
, por
fazerem parte de importantes momentos da minha vida.
Aos funcionários Soninha, Cotinha, Wandinha e Ivan pela atenção e apoio.
À professora Marivan Ferraro, pela realização da revisão gramatical
,
do presente
trabalho
,
com tamanha paciência e dedicação.
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9
Aos
bibliotecári
os
Norma de Carvalho,
Rosane Maria, Raimundo Cézar, Rita de
Cássia, Valder Cavalcante, Maria Dolores, Maria Josineide, e Flávio Pereira,
da Biblioteca
de Ciências da Saúde da UFC, pela atenção e correção das referências bibliográficas.
À FUNCAP, pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio.
Àqueles que injustamente não foram citados, mas que certamente contribuíram
muito para a realização deste trabalho.
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10
“
Entrega os teus caminhos ao Senhor, confie nele
, e o mais ele fará
”(
Salmo 37:5
)
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11
RESUMO
O
complexo facial maxilo
-
mandibular
pode ser acometid
o
por uma variedade de lesões
que
,
embora benignas,
apresentam
-
se localmente agressivas. O tratamento de tais condições
tem suscitado dúvidas quanto à escolha da melhor terapêutica a ser instituída, uma vez que
o tratamento conservador tem sido associado a índices elevados de recorrência, enquanto o
radical, embora geralmente leve a cura definitiva, tem gerado grave comprometimento
estético
-
funcional. Nesse contexto, terapias adjuvantes, como a criocirurgia com nitrogênio
líquido, têm sido combinadas com modalidades conservadoras com o propósito de reduzir a
taxa de reincidência sem elevar a sua morbidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar
os efeitos induzidos pela aplicação de nitrogênio líquido em diáfise femoral de ratos. Foram
realizadas, em diáfises femurais de 4
2
ratos
Wistar
, três aplicações locais e seqüenciais de
nitrogênio líquido, intercaladas por períodos de 5 minutos, com tempo de exposição que
variou entre 1 ou 2 minutos. Decorridas 1, 2, 4 e 12 semanas, os animais foram sacrificados
e as peças obtidas foram processadas e analisadas histomorfologicamente e
histomorfometricamente. Histologicamente, a segunda semana experimental representou o
pic
o máximo de necrose óssea em ambos os protocolos. A profundidade e extensão de
necrose óssea média máxima induzi
da no protocolo de 1 minuto foi, respectivamente,
124,509 µm e 2087,094µm, enquanto no de 2 minutos foi
, respectivamente,
436,424µm e
12046,426µ
m. Com base nos achados do
presente
trabalho,
podemos concluir que o
protocolo de 2 minutos produziu uma necrose óssea mais pronunciada do que o de 1
minuto
, sendo, portanto mais adequado no tratamento de lesões ósseas agressivas que
incidam os maxilares.
Palavras
-
chave: Criocirurgia.
Nitrogênio
Líquido
. Lesões dos Maxilares
.
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12
ABSTRACT
The maxillo
-
mandibular facial complex may be affected by a variety of injuries that,
although benign, present themselves locally aggressive. Treatment of these conditions ha
ve
raised doubts as to choose the best therapy to be established, since the conservative
treatment has been associated with high rates of recurrence, while the radical, but usually
lead to a definitive cure, has created severe aesthetic
-
functional. In th
is context, adjuvant
therapies, such as cryosurgery with liquid nitrogen, have been combined with conservative
modalities with the aim of reducing the rate of recurrence without increasing its morbidity.
The purpose of this study was to evaluate the effect
s induced by the application of liquid
nitrogen in femoral diaphysis of rats. Were performed in femoral diaphysis of 42
rats, three
local applications and sequential liquid nitrogen, interspersed with periods of 5 minutes,
time of exposure that ranged from
1 or 2 minutes. After 1, 2, 4 and 12 weeks, the animals
were sacrificed and the specimens were collected and processed and analyzed
histomorphological
and
histomorphometr
ically
. Histologically, the second week trial was a
maximum of bone necrosis in both
protocols. The depth and extent of bone necrosis
average maximum induced by the Protocol of 1 minu
te was, respectively, 124,509 and ìm
2087.094 ìm, while that of 2 minutes were, respectively, 436424
µm and 12046.426
micrometers. Based on the findings of this study, we can conclude that the protocol of 2
minutes produced a bone necrosis more pronounced t
han that of 1 minute, and therefore
more suitable for the treatment of aggressive bone lesions covering the jaw.
Keywords: Criosurgery.
Liquid
Nitrogen. Osteonecrosis.
Jaw Lesions.
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13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro1
30
Figura
1
32
Figura
2
35
Figura
3
37
Figura
4
42
Figura
5
44
Figura
6
45
Figura
7
46
Figura
8
48
Figura
9
49
Figura
10
58
Figura
11
59
Figura
12
59
Figura
13
60
Figura
14
61
Figura
15
62
Figura
16
63
Figura
17
63
Figura
18
65
Figura
19
66
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14
Figura
20
68
Figura
21
68
Figura
22
69
Figura
23
69
Figura
24
70
Figura
25
71
Figura
26
73
Figura
27
73
Figura
28
74
Figura
29
75
Figura
30
75
Figura
31
76
Figura
32
77
Figura
33
77
Figura
34
78
Figura
35
79
Figura
36
79
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15
Figura
37
80
Figura
38
80
Figura
39
81
Figura
40
82
Figura
41
82
Figura
42
83
Figura
43
84
Figura
44
85
Figura
45
86
Figura
46
86
Figura
47
87
Figura
48
87
Figura
49
89
Figura
50
89
Figura
51
90
Figura
52
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16
90
Figura
53
91
Figura
54
92
Figura 55
92
Figura 56
93
Figura 57
94
Figura 58
114
Figura 59
116
Figura 60
118
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17
LISTA DE TABELAS
1.
Criocirurgia com nitrogênio líquido em 50 casos d
e ameloblastoma
reportados na literatura...........................................................................
..........
38
2.
Curetagem associada à crioterapia em 42 casos de
t
umor
o
dontogênico
c
eratocístico reportados na literatura........................................................
......
39
3.
Grupos experimentais e protocolo de aplicação de nitrogênio
líquido......................................................................
...........
............................
64
4.
Grupos experimentais e semanas de sacrifício...............................................
64
5.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
após
1 semana......................................................................................................
...
95
6.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
após
2 semanas........................................................................................................
95
7.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
en
tre o grupo A
,
após
4 semanas.....................................................................................................
...
95
8.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
após
12 semanas.................................................................................................
.....
95
9.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
entre
1 e 2 semanas.............................................................................................
.....
96
10.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
entre
1 e 12 semanas.............................................................
........
96
11.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
entre
2 e 4 semanas..................................................................
.....................
...........
96
12.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
entre
2 e 12 semanas...................................................................
....................
.........
96
13.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo A
,
entre
2 e 12 semanas.............................................................................................
...
96
14.
Teste de Kruskal
-
Wa
llis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
após 1 semana...........................................................................................
......
97
15.
Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
após 1 seman
a............................................................................................
.....
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16.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
entre 1 e 4 semanas............................................................
.............................
97
17.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
entre 1 e 12 semanas............................................................
...........................
98
18.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a pro
fundidade da necrose,
entre o grupo A
,
entre 2 e 4........................................................................................
................
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19.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
entre 2 e 12 semanas........................................................................
...............
98
20.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo A
,
entre 4 e 12 semanas.........................................................................
..........
....
98
21.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
após
1 semana.........................................................................................................
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22.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de ost
eócitos,
entre o grupo A
,
após
2 semanas....
...................................................................................................
.
99
23.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
entre
1 e 2 semanas..........................................................................................
........
99
24.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
entre
1 e 4 semanas........................................................................................
..........
99
25.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
entre
1 e 12 semanas.........................................................................................
.......
100
26.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de os
teócitos
,
entre o grupo A
,
entre
2 e 5 semanas..........................................................................
..........
..............
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Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
entre
2 e 12 semanas..................................................................
.................
.
............
100
28.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo A
,
entre
4 e 12 semanas..........................................................................
...
...............
....
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29.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre o
grupo A...
..........................................................................................
..............
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Post
-
hoc teste de Dunn para a média do
s canais vazios necrosados entre o
grupo A...
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Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular
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entre o grupo A...............................................................................................
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32.
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hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular
entre o grupo A....................................................................................
...........
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Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose
,
entre o grupo B
,
após
2 semanas..
......................................................................................................
102
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Post
-
hoc teste de Dunn para a extensão da n
ecrose
,
entre o grupo B
,
após 2
semanas..
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Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose,
entre o grupo B
,
entre
1 e 2 semanas...................................................................
...............................
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Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
após 1 semana...........................................................
.....................
..............
...
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Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
após 1 semana.................................................................................................
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Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade
da necrose
,
entre o grupo B
,
após 2
semanas................................................................................................
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Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
após 2 semanas.........................................................................................
.......
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40.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 1 e 2 semanas....................................................................................
.....
107
41.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 1 e 4 semanas.................................................................
........................
107
42.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 1 e 12 semanas.............................................................................
..........
107
43.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 2 e 4 semanas...............................................................................
..........
107
44.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 2 e 12 semanas......................................................................
.................
108
45.
Teste
de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose
,
entre o grupo B
,
entre 4 e 12 semanas..................................................................................
.....
108
46.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo B
,
após
1
semana......
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Post
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hoc teste de Dunn para necrose de osteócitos,
entre o grupo B
,
após 1
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semana......
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Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre o grupo B
,
após
2 semanas....
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49.
P
ost
-
hoc teste de Dunn para necrose de osteócitos,
entre o grupo B
,
após 2
semanas....
.......................................................................................................
110
50.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos,
entre o g
rupo B,
entre
1 e 2 semanas......................................................................
............
................
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51.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos,
entre o grupo B
,
entre
1 e 4 semanas............................................................................
........
..............
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52.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos,
entre o grupo B
,
entre
1 e
12 semanas................................................................................................
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53.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos,
entre o grupo B
,
entre
2 e 4 semanas................................................................
.....................
.....
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54.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos,
entre
o grupo B
,
entre
2 e 12 semanas...........................................................................................
.....
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55.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre o
grupo B...
........................................................................................................
112
56.
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre o
grupo B...
....................................................................................................
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57.
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular
entre o grupo B.....................................................................................
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58.
Post
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hoc teste de Dunn para grau histológico de inflamação
medular entre
grupo B.....
......................................................................................................
113
59.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre os grupos após 2
semanas....................................................................................................
.......
113
60.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose,
entre os grupos
A e B,
após 12 semanas...........................................................................................
...
114
61.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos
após 1 semana...........................................................................................
......
115
62.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose ent
re os grupos
após 2 semanas.......................................................................................
.........
115
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21
63.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos
após 4 semanas...........................................................................................
.....
115
64.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos
após 12 semanas.......................................................................................
.......
115
65.
Teste
de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre os grupos A e B
,
após 1 semana...........................................................................
............
..........
116
66.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre os grupos A
e B
,
após 2 semanas.........................................................................................
.......
117
67.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre os grupos A e B
,
após 4 semanas..........................................................................................
......
117
68.
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos
,
entre os grupos A e B
,
após 12 semanas.....................................................................................
.........
118
69.
Teste
de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre
os grupos de 1 semana.............................................................................
.......
118
70.
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os
gru
pos de 1 semana.........................................................................................
119
71.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre
os grupos de 2 semanas............................................................................
.......
119
72.
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os
grupos de 2 semanas.......................................................................................
119
73.
Teste de Kruskal
-
Wallis para a
média dos canais vazios necrosados entre
os grupos de 4 semanas.............................................................................
......
119
74.
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os
grupos de 4 semanas.................................................................................
......
119
75.
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular
entre os grupos de 2 semanas.........................................................................
.
120
76.
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular
entre os grupos de 2 semanas......................................................................
....
120
77.
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular
entre os grupos de 4 semanas.................................................................
.........
120
78.
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular
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22
entre os grupos de 4 semanas..........................................................................
121
79.
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular
entre os grupos de 12 semanas........................................................................
121
80.
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológic
o de inflamação medular
entre os grupos de 12 semanas................................................................
........
121
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23
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm
–
micrômetro
ADP
–
Adipócito
CEPA
–
Comitê de Ética em Pesquisa em Animais
COs
–
Ceratocistos Odontogênicos
CV
–
Canal vascular
CVN
–
Canal vascular necrótico
ED
–
Edema
EV
–
Edema vascular
FB
–
Fibroblasto
FUNCAP –
Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa
H
0
–
Hipótese nula
H
1
–
Hipótese alternativa 1
H
2
–
Hipótese alternat
iva 2
HE
–
Hematoxilina
-
eosina
HEM
–
Hemácia
IF
–
Infiltrado inflamatório
INR
–
Informação não reportada
LAFICA
–
Laboratório de Farmacologia da Inflamação e do Câncer
LV
–
Lacuna vazia
Mand(A)
–
Mandíbula anterior
Mand(P)
–
Mandíbula posterior
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24
Máx
–
Máxi
mo
Max(P)
–
Maxila posterior
MCR
–
Macrófago
Min
–
Mínimo
min
–
Minutos
MSCs –
Células do estroma medular
MTO
–
Matriz óssea
N
–
Amostra
OM
–
Tecido ósseo maduro
ON
–
Osso novo
OSB –
Osteoblasto
OST
–
Osteócito
Q1
–
Primeiro quartil
Q3
–
Terceiro quartil
R
BCs
–
Células sangüíneas vermelhas
TC
–
Tecido conjuntivo
TXA2
–
Tromboxano A2
UFC –
Universidade Federal do Ceará
VC
–
Vaso congesto
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25
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃ
O
…………………………………………………………….
27
2
REVISÃO DE LITERATURA…………………………………………...
29
2.1
Criocirurgia
…………………………………………………………………
29
2.1.1
Evolução e desenvolvimento da criocirurgia .......................................
...........
29
2.1.2
Fisiopatologia.......................................................................................
............
30
2.1.3
Métodos Criocirúrgicos.........................................................................
..........
36
2.1.4
Criocirurgia em patologias ósseas do complexo maxilo
-
mandibular
..............
37
2.1.5
Alterações histológicas decorrentes da criociru
rgia
.............................
...........
41
2.2
Osso
......................................................................................................
...........
43
2.2.1
Tecido ósseo
.........................................................................................
...........
43
2.2.2
Medula óssea.......................................................................................
.............
49
3
OBJETIVOS..........................................................................................
.........
51
3.1
Objetivo geral
......................................................................................
...........
51
3.2
Objetivos específicos......................................................................................
51
4
HIP
Ó
TESES
..........................................................................................
........
52
4.1
Hipótese nula.......................................................................................
..........
52
4.2
Hipótese altern
ativa 1
.........................................................................
..........
52
4.3
Hipótese alternativa 2.........................................................................
..........
52
5
MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................
...
53
5.1
Delineamento do estudo....................................................................
...........
53
5.2
Animais de experimentação...................................................................
......
53
5.3
Critérios de exclusão.....................................................................................
54
5.4
Drogas, soluções e corante
s
..........................................................................
55
5.5
Materiais e equipamentos............................................................................
55
5.6
Desenvolvimento do modelo animal.................................................
..........
57
5.6.1
Pré
-
operatório e anestesia....................................................................
...........
57
5.6.2
Técnica cirúrgica experimental.............................................................
..........
57
5.7
Protocolo de aplicação do nitrogênio líquido..................................
...........
64
5.8
Sacrifício dos animais........................................................................
...........
64
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26
5.9
Processamento do material biológico..............................................
.............
65
5.10
Avaliação histomorfológica e histomorfométrica............................
...........
66
5.10.1
Avaliação histomorfológica...................................................................
.........
66
5.10.2
Avaliação histomorfométrica.................................................................
........
67
5.11
Análise estatística dos dados............................................................
...........
71
6
RESULTADOS......................................................................................
......
72
6.1
Ob
servações gerais
.......................................................................................
72
6.2
Análise histomorfológica...................................................................
...........
72
6.2.1
Grupo controle
......................................................................................
..........
72
6.2.2
Protocolo experimental de 1 minuto......................................................
.........
74
6.2.3
Protocolo experimental de 2 minutos....................................................
.........
83
6.3
Análise histomorfométrica.................................................................
..........
94
6.3.1
Protocolo experimental de 1minuto (grupo A).......................................
.......
94
6.3.2
Protocolo experimental de 2 minutos (grupo B)....................................
........
102
6.3.3
Protocolo de 1 minuto vs 2 minutos......................................................
........
113
7
DISCUSSÃO.........................................................................................
......
122
8
CONCLUSÕES
......................................................................................
.....
133
REFERÊNCIAS...................................................................................................
......
134
ANEXOS
..............................................................................................................
.......
143
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27
1 INTRODUÇÃO
O prefixo “crio” vem do grego
Kryos
, que significa frio. Cr
iocirurgia é um método
que utiliza baixas temperaturas capazes de produzirem destruição tecidual local
(COURAGE, HUEBSCH 1971). Constitui
-
se como um procedimento técnico no qual o
calor é removido dos tecidos pela aplicação do frio e congelamento induzido
(SOUZA
et
al
., 2006). Crioterapia descreve, em amplo sentido, o uso do frio para medidas terapêuticas,
sendo a criocirurgia uma forma desta (MAZUR, 1984), embora ambos os termos sejam
utilizados como sinônimos (KUFLIK et al
., 2000).
A criocirurgia tornou
-
s
e uma técnica bem estabelecida nas décadas de 70 e 80
(YANG
et al
., 2000), sendo amplamente utilizada para o tratamento de várias lesões orais
(ARIKAN
et al
., 2006). A simplicidade de aplicação, a facilidade de manuseio e a eficácia
como técnica terapêutic
a fizeram desta modalidade terapêutica um tratamento adequado
para remoção de patologias de tecido mole, tais como leucoplasias, hiperplasias,
granulomas, lesões vasculares, lesões pigmentadas, queilite actínica, ceratoacantomas,
fibromas e líquen plano (NATIELLA et al., 1974; BEKKE, BAART 1979; YEH, 2000).
A região maxilo
-
facial pode ser acometida por uma variedade de lesões benignas
localmente agressivas e com um alto percentual de recorrência, incluindo, principalmente, o
ameloblastoma (SANNOMIYA
et al
.,
2008) e ceratocisto (GONZÁLEZ
-
ALVA
et al.
2008), além de mixoma odontogênico (SIVAKUMAR
et al
., 2008) e lesão central de
células gigantes (FLÓRÉZ
-
MORENO et al
., 2008).
Nas literaturas científicas de língua inglesa e portuguesa, existem,
aproximadamente,
50 casos de ameloblastomas e 42 casos de ceratocistos odontogênicos
publicados onde a criocirurgia foi performizada. Além disso, relatos isolados desta
abordagem em outras lesões têm sido reportados, incluindo três casos de fibroma
ossificante (SIPPEL, EM
MINGS 1969), um caso de lesão central de células gigantes
(WEBB, BROCKBANK 1986) e sete casos de mixoma odontogênico (MAGRO
-
FILHO
et
al., 1994; SALMASSY, POGREL 1995; GOLDMAN, 2000; CERQUEIRA, SANT`ANA
2001; SCHMIDT, POGREL 2004).
Embora amplamente discut
ido, o tratamento de algumas lesões, como
ameloblastomas e ceratocistos odontogênicos, tem suscitado dúvidas entre diferentes
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28
autores no momento da escolha da melhor terapêutica a ser instituída. O tratamento
conservador de tais lesões pode levar a um alto
índice de recorrência, enquanto que o
radical, muitas vezes, pode causar comprometimento funcional e estético ao paciente
(SALMASSY, POGREL 1995). Dessa forma, terapias adicionais, como a criocirurgia,
aliadas às modalidades conservadoras têm sido empregadas por alguns autores com vistas a
melhorar o prognóstico e minimizarem
-
se os riscos advindos de abordagens radicais
(CURI, LAURIA, PINTO 1997; SALMASSY, POGREL 1995; SHMIDT, POGREL 2004).
A criocirurgia oferece diversas vantagens no tratamento dessas les
ões localmente
agressivas, principalmente pela não complexidade da execução do método criocirúrgico, e
pelo fato de conservar um remanescente ósseo não patológico, que pode ser desvitalizado
sem a necessidade de ressecção cirúrgica, além de servir como sít
io receptor para enxertos
ósseos (MARCIANI
et al
., 1977). Além disso, é descrito na literatura que este tratamento,
comparativamente às técnicas cirúrgicas radicais, permite uma maior chance de
preservação de estruturas vitais, particularmente do nervo alv
eolar inferior (SCHMIDT,
POGREL 2004). Somando
-
se esses benefícios, verifica
-
se que a criocirurgia representa
uma técnica que propicia um importante ganho funcional e estético ao paciente.
Apesar de existirem diversos trabalhos, inferindo sobre a utilizaçã
o de técnicas
criocirúrgicas para o tratamento de patologias da cavidade bucal, faltam subsídios na
literatura que indiquem protocolos específicos e padronizados. Pode
-
se citar, por exemplo,
a existência de critérios altamente subjetivos para nortear a apl
icação da substância
criogênica. O tempo de congelamento pode variar de segundos a minutos, de acordo com o
volume e profundidade do tecido que será congelado e a experiência do cirurgião. Outros
fatores também podem ser implicados, incluindo: 1) o tipo de
sistema utilizado; 2) o
tamanho da sonda; 3) a capacidade de condutibilidade térmica do tecido; 4) a osmolaridade
do tecido; 5) sua composição celular; 6) e sua vascularização (GILBERT
et al
., 1997).
Devido a este grande número de variáveis, torna
-
se di
fícil prever a real extensão da necrose
tecidual.
Dessa forma, a necessidade de pesquisas é evidente em diversos aspectos da
criocirurgia, especialmente na definição da quantidade de ciclos apropriados de
congelamento e “degelo” para o uso clínico (WHITTAK
ER, 1975). Existe, ainda, a
necessidade contínua em se desenvolver um modelo animal apropriado para se estudar as
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29
alterações morfológicas, quando a duração e a profundidade do congelamento são variadas
(NATIELLA
et
al., 1979). O presente trabalho, portanto
, diante das controvérsias
encontradas na literatura, propõe uma análise histomorfológica e histomorfométrica da
profundidade de necrose óssea, obtida a partir de diferentes protocolos de aplicação de
nitrogênio líquido com vistas à sua aplicabilidade tera
pêutica.
2. REVISÃO D
E
LITERATURA
2.1 Criocirurgia
2.1.1 Evolução e desenvolvimento da criocirurgia
Os Egípcios, há mais de 4000 anos, foram os primeiros povos a utilizarem o frio
para o tratamento de traumas e processos inflamatórios (ISHIDA, RAMOS
-
E
-
SILVA
1998). Hipócrates recomendou o uso do frio para redução de edema, hemorragia e dor
(AMEERALLY, COLVER 2007). O uso de baixas temperaturas, como forma terapêutica,
teve seu início na Inglaterra entre os anos de 1845 e 1851, quando James Arnott institu
iu o
uso de soluções salinas contendo gelo (duas partes de gelo para uma parte de cloreto de
sódio) para a redução do tamanho de tumores (cânceres de mama, útero e alguns de pele) e
alivio da sintomatologia dolorosa em tais casos. Também advogou o uso de b
aixas
temperaturas para o tratamento de acne, neuralgias, bem como cefaléias, alcançando
temperaturas de até
-
24
o
C. Contudo, tal preparado de sal e gelo não foi suficientemente
capaz de tratar efetivamente as neoplasias, o que fez outros estudiosos descobr
irem novas
substâncias e aparatos técnicos mais efetivos (GAGE, 1998).
Campbell White foi o primeiro pesquisador, em 1899, a empregar gás refrigerado
para uso médico em casos mais diversos, que incluíam herpes zoster, cancro mole, nevos,
lúpus eritematoso
sistêmico, úlceras varicosas de pernas e epiteliomas (COOPER,
DAWBER 2001).
O melhoramento das técnicas de congelamento só foi possível no início dos anos 90,
quando William Pusey popularizou o uso do gelo seco (dióxido de carbono), em
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30
preferência à mistu
ra salina de gelo, ao afirmar ser possível atingir temperaturas mais
baixas, logo sendo mais efetivo (COOPER, DAWBER 2001).
A origem do termo
crioterapia
foi atribuída ao professor Bordos em 1912, tendo
sido lançada em 1930, por Lortat
-
Jacobs e Solente, a primeira monografia sobre crioterapia,
intitulada “La Cryotherapie”, que descreveu diversas formas pelas quais o frio ou
temperaturas congelantes poderiam ser utilizadas em medicina, especialmente dermatologia
e ginecologia (KUFLIK et al
., 2000).
Diversas
substâncias foram utilizadas como criógenos (Freons 12 e 22, dióxido de
carbono e oxigênio), e algumas continuam sendo (óxido nitroso, argônio e nitrogênio
líquido), destacando
-
se o papel desse último (quadro 1).
A utilização do nitrogênio líquido teve seus primórdios a partir de 1950, no período
pós segunda guerra mundial, superando os já consagrados ar e oxigênio liquefeitos, em
virtude do potencial explosivo deste último. Graças ao dispositivo designado pelo Dr.
Irving Cooper, um expoente na criocirurgia
, foi possível atingirem
-
se temperaturas com o
nitrogênio líquido próximas de
-
196
0
C, o que fez perpertuar a utilização deste até os dias
atuais (COOPER, DAWBER 2001).
Quadro 1
-
Principais substâncias criogênicas e suas respectivas formas de apresentação
e temperaturas
alcançáveis
CRIÓGENO
ESTADO FÍSICO
TEMPERATURA
0
C
Freon 12
Líquido
-
29,8
Freon 22
Líquido
-
40,8
Dióxido de carbono
Sólido
-
78,5
Óxido nitroso
Líquido
-
89,5
Oxigênio
Líquido
-
182,9
Argônio
Líquido
-
185,7
Nitrogênio
Líquido
-
195
,8
Fonte: Baust (1997).
2.1.2 Fisiopatologia
Quando um tecido é resfriado, o percentual de perda térmica é um dado complexo
de ser compreendido, com diversos fatores associados: conteúdo de água intra e extra
-
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31
celular, suprimento sangüíneo, condutividad
e térmica do tecido, percentual de
congelamento e temperatura atingida pelo criógeno (AMEERALLY, COLVER 2007). A
crioterapia atinge seus efeitos localmente letais pela desidratação celular e formação de
cristais de gelo intracelulares com conseqüente injúr
ia citotóxica direta (figura 1), bem
como pelo dano isquêmico secundário (figura 2). Nesse contexto, observa
-
se que o dano
celular é, principalmente, imediato e o vascular tardio (HOFFMAN, BISCHOF 2002;
HAFRON, KAOUK 2007; BREDA et al
., 2008).
Injúria Celu
lar Direta
Os efeitos danosos de temperaturas baixas sobre as células iniciam
-
se gradualmente,
logo que haja queda no valor da temperatura (figura 1). O metabolismo celular e sua
estrutura são alterados juntamente com seus constituintes protéicos e lipídic
os (GAGE,
BAUST
1998). Com relação ao conteúdo lipídico, observa
-
se um processo generalizado de
peroxidação com aumento de separação de fases, bem como permeabilidade e fluidez. Por
outro lado, no conteúdo lipídico verifica
-
se um aumento da atividade prote
olítica com
desnaturação, inativação e agregação protéica. Através do sinergismo entre os efeitos
deletérios sobre o sistema lipídico
-
protéico celular associados à formação de cristais de
gelo intracelulares, produz
-
se um dano suficientemente capaz de caus
ar morte celular
(HOFFMAN, BISCHOF 2002), que, segundo alguns autores, ocorre através de mecanismos
de apoptose celular (BAUST, GAGE 2005).
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32
Figura 1: Esquema ilustrativo da provável fisiopatologia do dano celular direto decorrente da crioterapia.
Adapta
do: Baust, Gage 2005.
Até o presente momento a temperatura ideal para promover a morte celular não foi
estabelecida. Contudo, sabe
-
se que em temperaturas de
-
2.2
0
C muitos tecidos congelam e
que a temperatura, para ocasionar morte celular, deve ser inferio
r a
-
20
0
C (POGREL
et al
.,
1996; FARA, SAVAGE 2006; GAGE, BAUST 2007).
Em virtude da queda da temperatura a valores inferiores a 0
0
C, ocorre a cristalização
da água. A formação dos cristais ocorre inicialmente nos espaços extracelulares, a qual
propicia a criação de um ambiente hiperosmótico extracelular com conseqüente remoção de
conteúdo líquido intracelular. Efetiva desidratação celular ocorre predominantemente em
temperaturas entre 0
0
C e
-
20
0
C. Permitindo
-
se tempo suficiente para este estado de
desidrat
ação, o aumento da concentração de eletrólitos intracelulares é suficiente para
ocasionar a destruição celular. Entretanto, em alguns casos, o efeito deletério da
desidratação celular e concentração de solutos, também denominada de injúria
“concentração
-
e
feito”, pode não ser letal às células. Nessas situações, a formação de
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33
cristais intracelulares, que ocorre a temperaturas mais baixas que
-
20
0
C, geralmente torna
-
se deletéria às células (THEODORESCU, 2004).
Do ponto de vista clínico, é importante observar
que a formação de cristais
intracelulares é mais eficiente quando do resfriamento rápido (WHITTAKER, 1980). O
congelamento lento irá resultar em desidratação celular como descrita anteriormente.
Congelamento rápido não permite a saída de água intracelular
para o meio extracelular
mantendo, portanto, o soluto com alto ponto de congelamento e formando cristais
intracelulares letais (GONGLOFF, GAGE 1983). Nessa situação, a injúria “concentração
-
efeito” é decorrente da formação de cristais intracelulares (THEO
DORESCU, 2004). Em
adição, os cristais de gelo que se formaram no conteúdo extracelular, propiciaram um
aumento na concentração de eletrólitos na fração não congelada. O aumento da
concentração induz consequentemente à desidratação celular em virtude do au
mento na
diferença de pressão osmótica. Caso a desidratação seja severa, formas de toxicidade, ou
injúrias devidas à hiperosmolaridade, podem ser induzidas (HANN, BISCHOF 2004).
Devido a isto, alguns pesquisadores têm concordado que o congelamento rápido é
mais
letal do que o lento, visto que promove a formação de cristais de gelo intra e extracelulares,
com efeitos diretos em todos os substratos (BICKELS
et al
., 1999). Desta forma, tem
-
se
investigado a velocidade de formação dos cristais de gelo como impor
tante indicador na
criocirurgia (YANG et al
., 2004).
Quando o processo de congelamento é lento, ocorre, primeiramente, a formação de
cristais extracelulares (POPKEN
et al
., 2003). Na medida em que os cristais aumentam de
tamanho, ocorre a absorção da água
extracelular que, então, não mais poderá ser utilizada
como solvente para as células. Há um aumento da concentração iônica extracelular que
conseqüentemente provoca a saída de água do interior da célula, devido à diferença de
osmolaridade. Esta perda de ág
ua pela célula eleva a quantidade de eletrólitos no seu
interior, proporcionando níveis tóxicos e letais (LEOPARD, POSWILLO 1974).
Durante o período de descongelamento, cristais de gelo fusionam
-
se, formando
grandes cristais, um processo denominado de recr
istalização, o qual acontece em
temperaturas maiores que
-
40
o
C. Nos tecidos que apresentam uma grande quantidade de
células em íntima proximidade, grandes cristais são disruptivos às membranas celulares e
causam dano celular adicional. À medida que os cris
tais de gelo se liquefazem, o meio
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34
extracelular torna
-
se hipotônico. Isso ocorre em virtude da formação dos cristais
extracelulares ser o primeiro evento, resultando na saída compensatória de água intracelular
para conduzir a uma efetiva desidratação do es
paço extracelular. Portanto, após o
descongelamento, uma maior quantidade de água livre irá existir no meio extracelular e isto
subseqüentemente, levará ao aumento no volume celular podendo promover ruptura de
membranas celulares (THEODORESCU, 2004).
Prova
velmente os mecanismos de formação de cristais intracelulares e
extracelulares coexistam em um mesmo tratamento, pois depende da temperatura alcançada
em cada região da área total que está sendo tratada (ROBINSON
et al
., 2001). O
congelamento rápido ocorre
, principalmente, na região em contato direto com a ponta da
sonda (HOFFMAN, BISCHOF 2002). Muitas vezes o congelamento mais lento ocorre nas
zonas que estão mais distantes da fonte de congelamento, isto é, na zona fora da bola de
gelo formada no momento da aplicação do agente criogênico (RABIN, SHITZER 1996).
Há zonas onde o resfriamento pode não ser capaz de promover a formação de
cristais intracelulares e extracelulares, não ocasionando o conseqüente evento de destruição
celular. Sabe
-
se que a destruiçã
o celular é alcançada com as temperaturas baixas, mas a
temperatura nos tecidos não é tão fria quanto na ponta do aparelho utilizado (BAUST et al.,
1997).
Injúria Vascular
Dano microvascular, resultando em anóxia celular e hipóxia, tem sido considerado
com
o sendo o principal mecanismo de injúria tecidual em criocirurgia (BAUST
et al
.,
1997). Durante a etapa inicial do ciclo de congelamento, ocorre a resposta tecidual através
de vasoconstrição com concomitante redução do fluxo sanguíneo que eventualmente ces
sa
quando o resfriamento é completado (THEODORESCU, 2004).
Durante o descongelamento, o fluxo sanguíneo restabelece
-
se através de
vasodilatação compensatória. Contudo, o dano ao endotélio vascular resulta em um
aumento na permeabilidade das paredes dos ca
pilares, edema, agregação plaquetária e
formação de microtrombos. Juntos, esses efeitos culminam com a necrose tecidual, exceto
na zona periférica. Em tal região, onde a temperatura não foi suficientemente baixa para
ocasionar destruição celular, células a
poptóticas são encontradas primariamente. A
apoptose, ou morte celular programada, é reconhecida atualmente como sendo o
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35
mecanismo deletério celular provável de ocorrer após aplicação de baixas temperaturas
(BAUST, GAGE 2005).
Investigadores têm proposto d
ois mecanismos de injúria vascular endotelial que
podem ocorrer após o período de descongelamento, que se seguem quando da aplicação de
temperaturas baixas a tecidos. Em virtude de o tecido ter sido deprimido de fluxo sanguíneo
durante o congelamento, as c
élulas liberam fatores vasoativos após o degelo, objetivando
vasodilatarem e hiperperfundirem o tecido. No primeiro mecanismo pós
-
resfriamento, a
grande liberação de oxigênio, decorrente da hiperperfusão, ocasiona a formação de radicais
livres. Tais substâ
ncias constituem
-
se como letais ao endotélio vascular por promover a
peroxidação dos lipídios presentes na membrana celular. O segundo mecanismo proposto
sugere que neutrófilos sejam recrutados para destruir debris de células mortas ou que foram
lesionadas
durante o congelamento. Nesse processo, os neutrófilos aderem
-
se ao endotélio
para migrarem ao local afetado e liberarem enzimas designadas para destruir células
mortas, o que pode levar, também, ao dano do endotélio (HOFFMANN, BISCHOF 2002).
Figura 2:
Esquema representativo dos prováveis eventos vasculares tardios decorrentes da crioterapia.
Adaptado: Hoffmann, Bischof 2002.
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36
2.1.3 Métodos Criocirúrgicos
A técnica básica de crioterapia requer rápido congelamento, seguido de um lento
período de dege
lo, bem como repetição desse processo para se maximizar a destruição
tecidual (SALMASSY, POGREL 1995). Os dois principais métodos reconhecidos são: um
sistema fechado com uso de sondas (“probes”) e um sistema aberto, podendo este ser do
tipo
spray
ou atrav
és do auxílio de cotonetes ou swabs
(POGREL, 1993).
As técnicas que empregam o nitrogênio líquido na forma de spray ou através do
auxílio de um cotonete são mais acessíveis aos clínicos. Contudo, apresentam uma grande
desvantagem que é a falta de um controle padronizado da temperatura alcançada em virtude
da rápida evaporação do criógeno. Ao contrário, o sistema fechado, devido ao contato
direto entre a extremidade da sonda e o tecido alvo, oferece um maior controle da
temperatura, bem como maior penetrabilidade de congelamento (FARAH, SAVAGE 2006;
AMEERALLY, COLVER 2007). Outra vantagem do sistema fechado, quando se deseja
trabalhar em áreas focais, é que a área óssea afetada tende a ser limitada em extensão
(BRADLEY, 1978).
Outras técnicas de aplicação d
o nitrogênio líquido também têm sido relatas na
literatura (figura 3), embora sejam relativamente menos utilizadas em cavidade oral. Tais
métodos incluem a utilização de um meio lubrificante juntamente com a sonda fechada
(figura 3B) e a colocação de um tu
bo espiral (figura 3D) envolvendo, por contato, a
superfície óssea, por onde percorrerá o nitrogênio líquido (BRADLEY, 1978).
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37
Figura 3
-
Desenho ilustrativo de alguns métodos de crioaplicação em tecido ósseo.
Fonte: Bradley (1978).
Nota: A) Sistema fecha
do; B) Sistema fechado associado a um meio lubrificante; C) Sistema aberto do tipo
spray; D) Sistema fechado aplicável através de um tubo flexível circundando toda a área a ser intervida.
2.1.4 Criocirurgia em patologias ósseas do complexo maxilo
-
mandibul
ar
Desde o início da década de 70, a criocirurgia tem se mostrado como uma opção
terapêutica adjuvante para um variado número de lesões localmente agressivas dos
maxilares, principalmente ceratocistos odontogênicos e ameloblastomas (tabelas 1 e 2).
Outro
s relatos de patologias dos maxilares, cujo tratamento adicional empregado foi a
criocirurgia, também têm sido encontrados na literatura: fibroma ossificante (SIPPEL,
EMMINGS 1969), lesão central de células gigantes (WEBB, BROCKBANK 1986) e
mixoma odontogê
nico (MAGRO
-
FILHO
et
al., 1994; SALMASSY, POGREL 1995;
GOLDMAN, 2000; CERQUEIRA, SANT`ANA 2001; SCHMIDT, POGREL 2004).
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38
Tabela 1
-
Criocirurgia com nitrogênio líquido em 50 casos de ameloblastoma reportados na literatura.
Autores (ano)
No. casos
Local
Tra
tamento
cirúrgico
Protocolo Criocirúrgico
Fratura
Recorrência
Sistema
N
0
ciclos
Duração
Degelo
Emmings
et al
., 1971
01
Mand (P)
Curetagem
Sonda
Fechada
INR
INR
INR
01
Não
Marciani
et al
., 1977
02
Mand (P)
Curetagem
Sonda
Fechada
2
2 min
Curto
01
N
ão
Moroni
et al
., 1982
03
Mand (P)
Curetagem
Spray
2
8 min
INR
02
Não
01
Max (P)
Curetagem
Spray
2
8 min
INR
Não
Não
Salmassy, Pogrel 1995
04
Mand (P)
Curetagem
Spray
2
1 min
5 min
01
Não
02
Mand (P)
Curetagem
Spray
2
1 min
5 min
Não
Não
Curi
et al
.
, 1997
04
Mand (A)
Curetagem
Spray
3
1 min
5 min
Não
01
30
Mand (P)
Curetagem (25)
Resecção (05)
Spray
3
1 min
5 min
04
10
02
Maxilla
Curetagem
Spray
3
1 min
5 min
Não
Não
Laureano Filho
et al
., 2004
01
Mand (P)
Curetagem
Spray
3
1 min
5 min
01
Não
M
and (P), mandíbula posterior; Mand (A), mandíbula anterior; Max (P),maxila posterior; INR, informação não reportada; min, min
uto(s).
38
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39
Tabela 2
-
Curetagem associada à crioterapia em 42 casos de Tumor Odontogênico Ceratocístico reportados na literatu
ra.
Autores (ano)
No.
casos
Local
Protocolo Criocirúrgico
Fratura
Recorrência
Criógeno
Sistema
N
0
ciclos
Duração
Degelo
Bradley, Fisher 1975
01
Mand (P)
Nitrogênio
líquido
Spray
2
2 min
INR
Não
Não
01
Mand (P)
Nitrogênio
líquido
Spray
2
3.5 min
IN
R
Não
Não
01
Mand (P)
Nitrogênio
líquido
Sonda
Fechada
2
2 min
INR
Não
Não
Webb, Brockbank 1984
01
Mand (P)
Öxido nitroso
Sonda
Fechada
3
2 min
Lento
Não
Não
Jensen
et al
., 1988
08
Mand (P)
Öxido nitroso
Sonda
Fechada
2
1 min
INR
Não
03
03
Mand (A)
Ö
xido nitroso
Sonda
Fechada
2
1 min
INR
Não
02
02
Max (P)
Öxido nitroso
Sonda
Fechada
2
1 min
INR
Não
Não
Salmassy, Pogrel 1995
08
Mand (P)
Nitrogênio
líquido
Spray
2
1 min
5 min
01
Não
02
Mand (A)
Nitrogênio
líquido
Spray
2
1 min
5 min
Não
Não
Schmid
t, Pogrel 2004
15
Mand (P)
Nitrogênio
líquido
Spray
3
1 min
5 min
Não
Não
Mand (P), mandíbula posterior; Mand (A), mandíbula anterior; Max (P),maxila posterior; INR, informação não reportada; min, mi
nuto(s).
Ceratocisto
39
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40
Odontogênico
Ceratocistos odon
togênicos (COs), inicialmente designados como cistos epiteliais
de desenvolvimento, mas atualmente classificados como tumores odontogênicos (tumor
odontogênico ceratocístico), apresentam abordagens terapêuticas que variam entre
diferentes autores, sendo es
tas desde marsupialização e enucleação, as quais podem ser
combinadas com terapias adjuvantes tais como a crioterapia e solução de Carnoy, até
ressecção marginal ou em bloco (BLANAS
et al
., 2000; NAKAMURA
et al
., 2002;
CHIRAPATHOMSAKUL, SASTRAVAHA, JANSISY
ANONT 2006). Estas distintas
formas de tratamento refletem o comportamento biológico por vezes agressivo destas
lesões que tem sido relacionado a diferentes causas, tais como: produção de colagenase,
prostaglandinas e elevada atividade de enzimas oxidativa
s (OMURA
et al
., 1997);
atividade fibrinolítica aumentada da parede cística, proliferação epitelial no tecido
conjuntivo e presença de resíduos de lâmina dentária com formação de cistos satélites
(MYOUNG
et al
., 2001) . Em adição, a utilização de terapias
adicionais à enucleação, tal
como a crioterapia, é justificada com o intuito de se reduzir os índices de recorrência
quando da utilização de enucleação isolada, como observado em 58,3% dos 132 pacientes
avaliados por MYOUNG et al
. (2001).
Teoricamente, s
egundo SCHMIDT, POGREL (2001), o tratamento ideal para os
COs deveria ser a enucleação ou curetagem, seguida pelo tratamento da cavidade com um
agente que pudesse destruir os remanescentes epiteliais ou cistos satélites. Em adição, o
arcabouço ósseo deveri
a ser deixado intacto para permitir a osteocondução. A criocirurgia
tem se mostrado capaz de produzir necrose celular em osso, enquanto mantém o
remanescente ósseo. Em virtude dessa propriedade única do nitrogênio líquido em
desvitalizar,
in situ
, o tecido
ósseo, a crioterapia tem sido advogada para os COs
(SCHMIDT, POGREL 2004).
Ameloblastoma
Constitui
-
se como um tumor odontogênico epitelial benigno, relativamente
incomum dos maxilares (GUMGUM, HOSGOREN 2005; GORTZAK
et al
., 2006) que,
caracteristicamente, exibe uma capacidade local invasiva e agressiva, representada pelo alto
índice de reincidivas após o tratamento empregado (SUGIYAMA, MIYAUCHI, SUEI
2004).
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41
As modalidades cirúrgicas de abordagem para ameloblastomas têm sido divididas
em conservadoras e
radicais. Técnicas conservadoras, tais como enucleação e curetagem,
têm exibido um alto índice de recorrências inaceitáveis. Já os métodos radicais, incluindo
-
se as ressecções totais ou com defeito de continuidade, têm reduzido os percentuais de
recorrênci
as, embora se constituam como problemas estéticos, funcionais e reconstrutivos
aos pacientes afetados (CURI, LAURIA, PINTO 1997).
Crioterapia oferece diversas vantagens no tratamento de ameloblastomas, à
semelhança dos COs, principalmente pela simplicidad
e da execução do procedimento
criocirúrgico, e pelo fato de conservar uma extensa margem de osso sadio, que pode ser
desvitalizado sem a necessidade de ressecção cirúrgica, o que reflete em um ganho
funcional e estético ao paciente (MARCIANI et al
., 1977).
A desvitalização, segundo EMMINGS, GAGE, KOEPF (1971) torna os segmentos
remanescentes matrizes para a deposição de osso
novo
. Tal processo pode se extender a
1cm em profundidade e a 3cm em lateralidade, a depender do método de congelamento,
bem como co
ndições locais. O reparo ósseo é facilitado pela cobertura de tecido íntegro, o
qual minimiza as chances de ocorrer infecção secundária, bem como restabelece o
suprimento sanguíneo da região. De acordo com essas condições, o reparo ósseo
caracteriza
-
se com
o um processo lento, sendo necessário mais de um ano para a completa
cicatrização.
Relatos de fraturas ósseas após crioterapia em ameloblastomas têm sido descritos.
Tais complicações devem
-
se ao fato de que representam tumores localmente agressivos,
que destroem amplas áreas de tecido ósseo e, por si só, predispõem a fraturas patológicas.
Em adição, as baixas temperaturas necessárias para um efetivo resultado clínico reduzem,
invariavelmente, a capacidade de regeneração óssea (EMMINGS, GAGE, KOEPF 1971;
MA
RCIANI
et al
., 1977). Estudos experimentais também têm reportado uma alta
incidência de fraturas espontâneas tardias após o criotratamento do tecido ósseo
(KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON 1980).
2.1.5 Alterações histológicas decorrentes da criocirurgi
a
Estudos experimentais em mandíbulas de ratos, realizados por BRADLEY,
FISCHER (1975), descreveram as principais respostas histomorfológicas ao nitrogênio
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42
líquido, quando aplicado ao tecido ósseo, dividindo
-
as em três principais fases: necrótica,
osteogênica e de remodelação.
Fase Necrótica
Correspondeu à primeira etapa após a criolesão, estabelecendo
-
se em questão de
dias até aproximadamente uma semana. Foi caracterizada pela perda de osteócitos, com
resultantes lacunas ósseas vazias, perda de elementos c
elulares e vasculares provenientes
dos canais nutrientes, alterações necróticas nos tecidos moles endosteais e membranas
periodontais, destruição de odontoblastos em polpas dentárias, trombose na artéria alveolar
inferior e perda de elementos celulares em ambas as paredes nervosas e vasculares.
O trabalho desenvolvido por POPKEN
et al
. (2003), em tíbias de carneiros,
evidenciou a marcante fase necrótica observada uma semana logo após a realização da
criocirurgia (figura 4).
Figura 4
-
Secção de tíbia de c
arneiro corada por HE em um aumento de 100X.
Fonte: Popken
et al.
(2003).
Nota:
Observou
-
se completa necrose óssea, com as setas indicando a característica presença de lacunas
destituídas de osteócitos.
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43
Fase Osteogênica
Evidenciou
-
se após diversas semana
s da aplicação do criógeno. Pode existir algum
resquício de reabsorção, principalmente na superfície subperiosteal, contudo a ênfase
durante essa fase é sobre a osteogênese. Caracteristicamente, iniciou
-
se nas margens da
área tratada do osso necrótico, caracterizando
-
se pela deposição de osso
novo
na superfície
subperiosteal. Em mandíbulas, os autores observaram marcante deposição subperiosteal
pelo aspecto lingual. Existiu, também, uma discreta deposição óssea sobre o aspecto
endosteal. Os espaços medulare
s foram repovoados a partir da periferia da área congelada
por tecido conjuntivo fibroso. Pelas conclusões do experimento, esta fase torna
-
se
importante, principalmente, para garantir aumento da resistência do osso necrótico. Caso
inibida, por exemplo, pel
o excesso de frio conferido ou extensão aos tecidos moles de
recobrimento, há um risco iminente de fratura patológica.
Fase de Remodelação
Ocorreu após a fase osteogênica e seguiu
-
se por vários meses. O osso lamelar não
vital, bem como o osso
novo
rapidame
nte formado foram gradualmente reabsorvidos e
repostos por osso vital lamelar. Reabsorção e reposição ocorreram em múltiplos locais,
particularmente nas entrâncias dos canais nutrientes e espaços medulares.
2.2 Osso
2.2.1 Tecido Ósseo
O tecido ósseo é o c
onstituinte principal do esqueleto, servindo de suporte para os
tecidos moles, protegendo órgãos vitais, como os contidos nas caixas craniana e torácica e
no canal raquidiano. Alem disso, alberga e protege a medula óssea, formadora das células
do sangue. E
m adição, proporciona apoio aos músculos esqueléticos, transformando suas
contrações em movimentos úteis, e constitui um sistema de alavancas que amplia as forças
geradas na contração muscular. Representa, portanto, um tecido conjuntivo especializado,
dese
mpenhando diversas funções, ricamente vascularizado, com uma intrincada
organização celular, sendo constituído pela matriz óssea e células (JUNQUEIRA,
CARNEIRO 2008).
Macroscopicamente, o tecido ósseo pode ser classificado como osso compacto e
osso esponjo
so. Nos ossos longos, as extremidades ou epífises são formadas por osso
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44
esponjoso com uma delgada camada superficial compacta. A diáfise (parte cilíndrica) é
quase totalmente compacta, com pequena quantidade de osso esponjoso na sua parte
profunda, delimitando o canal medular. Principalmente nos ossos longos, o osso compacto
é denominado de osso cortical. Ao contrário, as cavidades do osso esponjoso e o canal
medular da diáfise dos ossos longos são ocupados pela medula óssea (JUNQUEIRA,
CARNEIRO 2008).
Hist
ologicamente existem dois tipos de tecido ósseo: o imaturo ou primário; e o
maduro, secundário ou lamelar. Ambos apresentam as mesmas células e constituintes da
matriz óssea. O tecido primário é o que surge inicialmente, tanto no desenvolvimento
embrionári
o como na reparação de fraturas, sendo temporário e substituído por tecido
secundário. Este é a variedade geralmente encontrada no adulto. Sua principal característica
é possuir fibras colágenas organizadas em lamelas que ficam paralelas umas às outras, ou
se dispõem em camadas concêntricas em torno de canais com vasos nutrientes (figura 5)
(JUNQUEIRA, CARNEIRO 2008).
Figura 5
-
Fotomicrografia ilustrativa de tecido ósseo lamelar (secundário).
Fonte: Junqueira e Carneiro (2008).
Nota: As fibras colágenas
podem estar paralelas umas às outras ou organizadas em lamelas concêntricas em
volta de um canal neurovascular.
a) Nutrição
A nutrição é conferida através dos vasos sangüíneos, que são observados
superficialmente ao periósteo, endósteo e trabéculas medulares (figura 6). Nestas regiões as
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45
células ósseas se alinham paralelas a estes vasos. O osso compacto ou cortical apresenta um
sistema vascular denominado Harvesiano (canais de Havers), especializado em áreas mais
profundas (McKIBBIN, 1978). Cada sistema
de Havers ou ósteon é um cilindro longo, às
vezes bifurcado, paralelo à diáfise e formado por quatro a vinte lamelas ósseas
concêntricas. Os canais de Havers comunicam
-
se entre si, com a cavidade medular e com a
superfície externa de osso por meio de canai
s transversais ou oblíquos, os canais de
Volkmann que não apresentam lamelas ósseas concêntricas (JUNQUEIRA, CARNEIRO
2008).
Figura 6
-
Figura ilustrativa de uma visão macroscópica da estrutura da diáfise em ossos longos.
Fonte: Junqueira e Carneiro (20
08).
A manutenção tecidual é conferida de forma dinâmica e harmônica por meio de
células que irão comandar um processo de aposição e reabsorção (ou remodelação) através
de mecanismos precisos ou turnover ósseo (BLAIR; ZAIDI; SCHILESINGER, 2002).
b) Componentes celulares
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46
A estrutura óssea é formada, mantida e remodelada pela ação de três células
principais, osteoblastos, osteoclastos e osteócitos (figura 7). Essas células estão presentes
na superfície das trabéculas ósseas do osso esponjoso, superfícies ex
terna e interna do osso
cortical e inseridos no próprio osso. Os osteoblastos produzem a matriz (osteóide) que sofre
posterior calcificação. Durante o processo de maturação e calcificação do osteóide, alguns
osteoblastos são aprisionados transformando
-
se e
m osteócitos. Os osteócitos alojados nas
lacunas do osso calcificado ligam
-
se entre si e com osteoblastos da superfície óssea por
meio de prolongamentos citoplasmáticos que estão presentes em canalículos. Os
osteoclastos estão nas superfícies ósseas e desf
azem o material ósseo (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2008).
Figura 7
-
Figura ilustrativa dos componentes celulares do tecido ósseo.
Fonte: Junqueira e Carneiro (2008).
Nota: Visualizam
-
se osteoblastos, osteócitos e osteoclastos. Os osteoblastos sintetizam a matr
iz orgânica em
faixa (osteóide) que se mineraliza, aprisionando alguns osteoblastos que se diferenciam em osteócitos.
Os osteoblastos são responsáveis pela síntese de matriz orgânica de osso. Derivam
-
se de células osteoprogenitoras ou osteogênicas que se
diferenciam em osteoblastos, e
quando aprisionados na matriz óssea são denominados osteócitos. Geralmente são
observados como um revestimento celular cuboidal ou achatado, único, mononucleado,
situados diretamente sobre as superfícies interna e externa dos
ossos. O osteoblasto possui
aparelho de Golgi proeminente e um citoplasma basófilo, e apresenta retículo
endoplasmático desenvolvido, o que reflete sua capacidade para síntese protéica. São ricos
em fosfatase alcalina e sintetizam osteocalcina e proteogli
canos I e II (SMITH, 1993;
KARSENTY, 2000).
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47
Os osteoblastos ativos sintetizam e liberam colágeno tipo I para o espaço
extracelular adjacente. Fibrilas de colágeno se alinham em arranjos regulares, produzindo
uma matriz orgânica denominada osteóide. No inte
rior do osteóide, o íon cálcio é
depositado como massas amorfas de fosfato de cálcio. A seguir, íons hidróxido e
bicarbonato são gradualmente adicionados à fase mineral e cristais de hidroxiapatita
maduros são formados lentamente. Existem proteínas ósseas
que participam ativamente
deste processo: a osteocalcina, que contém resíduos de 3
-
carboxiglutamato, e tem afinidade
pelo cálcio e forte avidez pela hidroxiapatita não cristalizada; a osteonectina que se fixa no
colágeno e forma cristais de hidroxiapatita;
a enzima fosfatase alcalina, à qual é atribuído
um papel estabilizador dos cristais de cálcio em formação no osso (DUCY; SCHINKE;
KARSENTY, 2000; MACKIE, 2003; KNOTHE TATE et al.,
2004).
À medida que o osso completamente mineralizado se acumula e cerca o osteoblasto,
a célula diminui sua atividade sintética e torna
-
se um osteócito. Este é a célula encontrada
no interior da matriz óssea, ocupando as lacunas das quais partem canalículos. Cada lacuna
contém apenas um osteócito. Os osteócitos derivam
-
se dos os
teoblastos envolvidos pela
matriz óssea, entretanto não são capazes de secretar componentes da matriz e constituem
90% de todas as células ósseas. Mesmo situados na profundidade do tecido ósseo,
estabelecem contato com as células vizinhas através dos canal
ículos, o que permite o fluxo
intercelular de íons, nutrientes, metabólitos e pequenas moléculas, como mediadores
químicos, que controlam o crescimento e desenvolvimento dos ossos (HAMAYA
et al.
,
2002; KNOTHE TATE et al.,
2004).
Os osteoclastos são células
móveis, gigantes, derivados da fusão de até 50
monócitos macrófagos. Têm ciclo de vida curto e representam um tipo de célula óssea
transiente que é inativada e removida por processos de apoptose. Secretam ácidos que
diminuem o pH do microambiente ósseo ao
seu redor (solubilizando o cálcio
-
descalcificação), colagenases e outras enzimas lisossômicas que atacam a matriz e a
desfazem. Por descalcificar o osso e decompor o osteóide, o osteoclasto é capaz de escavar
depressões arredondadas na superfície trabecular, subcortical e periostal cavando túneis na
estrutura óssea. Essa destruição do osso faz parte do desenvolvimento, crescimento,
manutenção e reparo normais do osso (KATAGIRI; TAKAHASHI, 2002; TAKAHASHI
et
al
, 2007).
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48
c) Remodelação e Osteogênese
A re
absorção e formação óssea são realizadas por osteoclastos e osteoblastos,
respectivamente (SMITH, 1993). A remodelação óssea (figura 8) apresenta algumas etapas
bem reconhecidas: 1) Fase de reabsorção: osteoclastos multinucleados ativados, derivados
de mon
ócitos da medula vermelha, reabsorvem uma discreta área de matriz óssea
mineralizada; 2) Fase de reversão: subseqüentemente, células osteoprogenitoras
(precursores de osteoblastos), as quais podem localmente proliferar e se diferenciar em
osteoblastos, migram até a lacuna de reabsorção e alteram a atividade osteoclástica; 3) Fase
de formação: os osteoblastos depositam matriz óssea nova, a qual é inicialmente não
mineralizada e denominada de osteóide, preenchendo a lacuna reabsorvida; 4) Fase de
latência: um
a vez aprisionados no osteóide, os osteoblastos maturam
-
se e se diferenciam
em osteócitos. Os osteoblastos limitantes da superfície do osso recém
-
formado
permanecem quiescentes até serem ativados novamente (HILL, 1998).
Figura 8
-
Desenho ilustrativo d
os estágios de remodelação óssea.
Fonte: Hill (1998).
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49
A osteogênese é um processo complexo que envolve a diferenciação de células
mesenquimais pluripotentes em pré
-
osteoblastos e posteriormente em osteoblastos. Este
desenrolar celular se repetirá durant
e a remodelação fisiológica ou em fraturas (HING,
2004). Podem ser citados quatro períodos distintos:
Período I
: Proliferação das células
osteoblásticas e síntese de colágeno tipo I;
Período II:
Expressão genética para a maturação
da matriz óssea;
Período
III
: Mineralização da matriz óssea;
Período IV
: Finalização.
2.2.2 Medula óssea
A medula óssea (figura 9) consiste em um complexo formado por vários tipos
celulares que irão interagir e coexistir de forma sinérgica, tanto do sistema hematopoiético
como
do próprio estroma medular. Após o nascimento, é iniciada a produção das células
sangüíneas neste sítio. O desenvolvimento da medula ocorrerá de acordo com a colonização
de precursores sangüíneos ocupando as cavidades ósseas e cartilaginosas, formando uma
íntima ligação, e profunda interdependência entre estes tecidos (TAICHMAN; EMERSON,
1998).
Figura 9
-
Figura ilustrativa exibindo a arquitetura da medula com interação entre os sistemas hematopoiético
e estromal.
Fonte: Taichman e Emerson (1998).
Nota; MSCs,
marrow stromal cells
(células do estroma medular); RBCs,
red blood cells
(células sangüíneas
vermelhas).
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50
As células mesenquimais pluripotentes estarão disponíveis na hematopoiese
medular e darão origem a várias outras linhagens com funções de formaç
ão teciduais
diversas (figura 9). Entretanto, nem todas as células do estroma ósseo suportarão a
hematopoiese. Supõe
-
se que apenas discretos elementos celulares tenham esta função.
Quanto ao estroma, este será responsável não somente pelas células de supor
te
hematopoiético, mas contribuirá também para a formação óssea, através da intimidade e
características fenotípicas entre as células ósseas e as células estromais, que são
responsáveis por este fenômeno (TROMBI et al.,
2008).
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51
3 OBJET
IVOS
3.1 Objetivo geral
·
Avaliar os efeitos induzidos pela aplicação de nitrogênio líquido em diáfise femoral
de ratos.
3.2 Objetivos específicos
·
Determinar qual protocolo de nitrogênio líquido promove o maior grau de necrose
óssea em profundidade e ext
ensão;
·
Comparar os achados histomorfológicos encontrados em cortical óssea, decorrentes
do emprego do protocolo de 1 minuto, com aquele de 2 minutos;
·
Comparar os achados histomorfológicos encontrados em medula óssea, decorrentes
do emprego do protocolo de 1 minuto, com aquele de 2 minutos.
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52
4 HIPÓTESES
4.1 Hipótese nula (H
0
)
Não há diferenças histológicas na arquitetura óssea e nos níveis de necrose óssea,
obtidos quando se modifica a duração da aplicação de nitrogênio líquido sobre diáfis
es
femurais de ratos.
4.2 Hipótese alternativa 1 (H
1
)
Há diferença nos parâmetros histológicos quando se modifica a duração da
aplicação de nitrogênio líquido sobre diáfises femurais de ratos.
4.3 Hipótese alternativa 2 (H
2
)
Há diferença nos níveis d
e necrose óssea, obtida quando se modifica a duração da
aplicação de nitrogênio líquido sobre diáfises femurais de ratos.
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53
5 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado de acordo com as Normas de Pesquisa em Saúde da UFC
e do Conselho Nacio
nal de Saúde
–
Resolução n
o
1, de 13 de junho de 1988, e em
observância à lei 6.638, de 08 de maio de 1979 (ANEXO A). O protocolo de pesquisa foi
submetido à avaliação pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais
–
CEPA da
Universidade Federal do Ceará
–
UFC
, tendo sido aprovado e licenciado em 11/08/2006
sob o protocolo n
o
09/06 (ANEXO B).
5.1 Delineamento do estudo
O estudo realizado foi do tipo experimental longitudinal,
in vivo
, de caráter
analítico, com amostras independentes e animais divididos aleatoriamente entre os grupos.
5.2 Animais de experimentação
Foram escolhidos, por seleção aleatória simples, 45 ratos da linhagem Wistar,
clinicamente sadios, adultos jovens, machos, com massa corporal entre 390
–
460g,
provenientes do Biotério Central do Campus do Pici da Universidade Federal do Ceará. Os
animais foram mantidos no Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Ceará sob condições
ambientais estáveis.
Os animais foram ambi
entados em caixas de plásticos situadas em estantes
ventiladas, com livre acesso à água e comida, de tamanho apropriado e sob condições de
iluminação e climatização natural (iluminação, temperatura e umidade controladas),
obedecendo a ciclos claro/escuro d
e 12 horas. Forneceu
-
se ração peletizada padronizada,
sendo interrompida a distribuição desta 12 horas antes do procedimento cirúrgico.
Os animais foram randomicamente divididos em 3 grupos, designados com as letras
A, B e C, conforme o padrão de aplicaçã
o do nitrogênio líquido (A e B) ou ausência desta
(C). Portanto, padronizou
-
se como grupo A, aquele onde foram realizadas três aplicações
do criógeno durante um minuto, grupo B, onde se aplicou por três vezes seguidas de dois
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54
minutos cada e, como C, o grup
o controle onde não foram realizadas aplicações de
nitrogênio líquido. Os animais, em cada grupo, foram identificados individualmente como
A1, A2, A3, A4 e A5, com mesma aplicabilidade para os demais.
5.3 Critérios de exclusão
Os animais seriam excluí
dos da pesquisa, antes ou após o procedimento cirúrgico,
quando:
a)
Apresentassem complicações infecciosas ou necroses teciduais;
b)
Fossem vítimas de autofagias ou mesmo canibalismo;
c)
Apresentassem quadro clínico de desnutrição;
d)
Constatasse
-
se óbito no trans
-
operatório ou após a recuperação anestésica;
e)
Não chegassem ao final do período experimental proposto para seu sacrifício em
estado geral de saúde bom;
f)
Apresentassem fratura patológica espontânea;
g)
Apresentassem, microscopicamente, artefatos ou quaisquer alter
ações que viessem a
prejudicar ou impedir a análise morfológica e histomorfométrica.
Segundo os princípios adotados, 10 animais foram excluídos do estudo. Do total,
sete animais vieram ao óbito por sobredose anestésica (sendo imediatamente substituídos),
enquanto que os três restantes por causa desconhecida. Destes, o primeiro animal pertencia
ao grupo B4 (protocolo de três aplicações de nitrogênio líquido por dois minutos, sacrifício
em quatro semanas), o segundo pertencia ao grupo A12 (protocolo de três
aplicações de
nitrogênio líquido por um minuto, sacrifício em 12 semanas) e o terceiro pertencia ao grupo
B12 (protocolo de três aplicações de nitrogênio líquido por dois minutos, sacrifício em 12
semanas). A causa
mortis
nestes casos não foi determinada,
embora os animais houvessem
se recuperado normalmente após o procedimento cirúrgico. Embora estes animais não
tenham sido substituídos, o número amostral dos grupos permitiu análise estatística
adequada.
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55
5.4 Drogas, soluções e corantes
Foram utilizadas as seguintes drogas, soluções e corantes:
-
Ácido nítrico 65% PA (Merck
®
);
-
Água bidestilada;
-
Água destilada;
-
Albumina bovina (Sigma
®
fração V);
-
Álcool etílico (Reagen
®
);
-
Álcool iodado (Cromato
®
);
-
Eosina (Merck
®
);
-
Formaldeido 10% (Reagen
®
);
-
Hematoxilina de Ma
yer (Reagen
®
);
-
Soro Fisiológico 0,9% (Gaspar Viana
®
);
-
Sulfato de Sódio Anidro PA% (Synth
®
);
-
Tribromo
-
etano (250mg/kg –
Aldric
®
);
-
Xilol (Merck
®
);
-
Parafina histológica 56
-
58C (Synth
®
).
5.5 Materiais e equipamentos
Utilizou
-
se um criostato, CRY
-
AC
®
-
3, model
o #B
-
700 (Brymill, importado por
CRY
-
AC
®
, Brasil), com altura 28cm e capacidade de armazenar 0,5L de nitrogênio líquido.
Este aparelho apresenta pontas do tipo borrifadoras, “open sprays”, e do tipo sondas
fechadas (“closed probes”), adaptáveis, que podem
ser selecionadas de acordo com o
volume de nitrogênio que o profissional deseje aplicar. No presente estudo, utilizou
-
se
pontas do tipo sonda fechadas (“
closed probes
”) esféricas de 1mm de diâmetro. O
nitrogênio líquido, armazenado em garrafas térmicas sem
i
-
fechadas, foi transferido para o
criostato aproximadamente 2h antes do procedimento.
Outros materiais e equipamentos utilizados no estudo incluíram:
-
Afastador de Minessota;
-
Agulha descartável 13cmx7cm
-
Algodão;
-
Balança eletrônica (C
-
G
-
Libror L
-
600);
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56
-
Band
eja em aço inox para colocação de instrumental cirúrgico;
-
Broca esférica de aço inox, haste longa número 2, para baixa rotação;
-
Cabo de bisturi do tipo Bard Parker número 3;
-
Câmara de Newbauer 0,1mm/0,0025mm
2
(Laboroptik
®
);
-
Câmera fotográfica OS
-
Fil (Nikon
®
);
-
Campos estéreis descartáveis;
-
Caneta cirúrgica reta (Dentscler
®
);
-
Cassetes histológicos (Erviegas
®
);
-
Cronômetro digital (Instrutherm
®
);
-
Cuba metálica;
-
Cubas para coloração de lâminas;
-
Estufa para secagem de lâminas;
-
Fio de sutura bioabsorvível Vicryl 3
-
0 (70cm trançado);
-
Fio de sutura poliamida 5
-
0 (nylon);
-
Foco de luz auxiliar para iluminação;
-
Gaze estéril;
-
Lâmina de bisturi n
o
15;
-
Lâminas e lamínulas para microscopia;
-
Luvas de látex para procedimentos cirúrgicos;
-
Mesa para procedimentos em ratos, adaptada para a manutenção do animal em
decúbito lateral;
-
Microscópio óptico LEICA
®
modelo LMD 6000;
-
Micrótomo (Lupe
®
);
-
Motor elétrico cirúrgico Ômega (Dentscler
®
);
-
Pinça Adson 12cm com dente;
-
Pinça clínica;
-
Pinça halstead mosquito 12cm curva;
-
Pinça halstead mosquito 12cm reta;
-
Porta agulha tipo Mayo
-
Hegar;
-
Proveta;
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57
-
Régua milimetrada;
-
Seringa descartável 1mL e 5mL;
-
Sonda milimetrada do tipo OMS;
-
Tesoura Iris;
-
Tesoura Metzembaum curva;
-
Tubos plásticos do tipo Falcon.
5.6 Desevolvimento do modelo animal
5.6.1
Pré
-
Operatório e Anestesia
Cada grupo foi submetido ao experimento em um dia específico. Os animais foram
pesados e, em seguida, administrou
-
se, via intraperitoneal, tribromo
-
etano a 2,5% (0,1 ml/
100 g de massa corpórea). Com o animal anestesiado, a reg
ião a ser operada (diáfise
femural esquerda) foi submetida a um processo de antissepsia com álcool iodado. Na
medida em que transcorria o ato cirúrgico, verificada a necessidade de complementação
anestésica, esta era, prontamente, realizada, respeitando
-
se
sempre a proporção dose
anestésica/massa corpórea.
5.6.2 Técnica cirúrgica experimental
Todos os animais submeteram
-
se a um procedimento cirúrgico experimental, com
passos metodológicos padronizados e seqüênciados (figura 10). O grupo controle, em
espe
cial, foi submetido apenas aos procedimentos cirúrgicos, não sendo realizados nestes
qualquer protocolo criocirúrgico.
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58
Figura 10
-
Desenho esquemático dos passos experimentais.
Nota: 1) seleção aleatória dos animais e divisão em grupos de seis espécimes;
2) após anestesia
intraperitoneal, tricotomia e antissepsia da área; 3) exposição do local da criolesão; 4 e 5) diferentes
protocolos de aplicação do nitrogênio líquido, respeitando o intervalo de cinco minutos entre as realizações;
6) sacrifício dos anim
ais segundo dias específicos; 7) após parafinização das peças, realização de microcortes;
8) confecção de lâminas e coloração com hematoxilina e eosina; 9) análise descritiva das lâminas; 10) análise
quantitativa da necrose óssea observada através de
softw
are
apropriado.
Os procedimentos foram realizados sobre uma mesa cirúrgica, especialmente
desenvolvida, previamente desinfectada, e coberta por panos de campos estéreis, onde o
animal foi posicionado em decúbito lateral, de maneira que a área a ser operad
a
permanecesse voltada para o pesquisador, objetivando facilitar o acesso cirúrgico.
Previamente ao ato operatório, a região anatômica pré
-
determinada foi submetida à
tricotomia (Figura 11) com equipamento elétrico.
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59
Figura 11
-
Figura representativa do p
ré
-
operatório.
Nota: A) Anestesia intraperitoneal com tribromo
-
etano a 2,5%; B) Animal em decúbito lateral, após
tricrotomia.
Subsequentemente, por meio de uma lâmina n
0
15 montada em um cabo de bisturi
n
0
3, realizou
-
se uma incisão de cerca de 1cm em pele
, trespassando tecido muscular
adjacente, obtendo
-
se, portanto, acesso cirúrgico ao osso femural (figura 12).
Figura 12
-
Figura representativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: A) Posicionamento da perna do animal; B) Incisão em pele e exposição
do tecido muscular subjacente.
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60
Em seguida, com o auxílio de um destacaperiósteo, realizou
-
se o rebatimento do
retalho total (incluindo tecido muscular e periósteo) que foi isolado da área intervida por
meio de dois afastadores de Minessota (Figura 13).
Figura 13
-
Figura representativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: Observa
-
se o posicionamento cuidadoso dos afastadores de minessota com fins de maior proteção ao
periósteo rebatido, tecido muscular e pele do campo operatório.
Posteriormente
, localizou
-
se a articulação fêmur
-
coxal, desinseriu
-
se os ligamentos
articulares e posicionou
-
se, 3mm aquém da superfície articular (direcionamento crânio
-
caudal) uma broca cirúrgica esférica de aço inox n
0
2, haste longa, a qual foi acionada por
um motor
elétrico cirúrgico Ômega (Dentscler
®
), conjuntamente com irrigação abundante
de soro fisiológico a 0,9% (Figura 14).
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61
Figura 14
-
Figura representativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: Posicionamento de broca cirúrgica esférica n
0
2 com fins de con
feccionar
-
se um defeito cirúrgico em
região de cabeça de côndilo femural
Em seguida, posicionou
-
se uma sonda periodontal milimetrada e padronizou
-
se,
para todos os animais, o local de contato da ponta do criostato, que foi a 1cm (sentido
crânio
-
caudal) d
o defeito cirúrgico previamente confeccionado de 0,2mm de profundidade
(Figura 15).
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62
Figura 15
-
Figura representativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: A) Posicionamento da sonda periodontal milimetrada; B) Visão mais aproximada da relação entre
a
sonda periodontal e o defeito cirúrgico padronizado.
Após a padronização do defeito cirúrgico, posicionou
-
se a superfície de contato da
ponta da sonda fechada do criostato, e realizou
-
se a aplicação do nitrogênio líquido no local
previamente definido (Figura 16), seguindo
-
se o protocolo experimental ao qual se referia o
animal, ou seja, protocolo n
0
1 (três aplicações seqüenciais de nitrogênio líquido com um
minuto de duração cada), protocolo n
0
2 (três aplicações seqüenciais de nitrogênio líquido
com d
ois minutos de duração cada), ou mesmo não inserido em nenhum protocolo
experimental (grupo controle). Em ambos os protocolos, entre cada aplicação do criógeno,
aguardou
-
se o tempo de 5 minutos referente ao período de degelo.
Após a realização dos procedim
entos operatórios e instituição dos protocolos
criocirúrgicos, realizou
-
se a reposição dos tecidos e suturaram
-
se os planos anatômicos
musculares com fio absorvível (Vicryl 3
-
0) e a pele de recobrimento com nylon 5
-
0 (Figura
17).
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63
Figura 16
-
Figura repr
esentativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: A) Posicionamento da superfície da ponta da sonda criocirúrgica sobre área pré
-
determinada e
padronizada entre os grupos; B) Aspecto da sonda após o início do acionamento do criostato.
Fi
gura 17
-
Figura representativa da técnica cirúrgica experimental.
Nota: A) Realizada sutura interrompida simples em tecido muscular profundo; B) Detalhe da sutura
continuada realizada com nylon 5
-
0 em pele de recobrimento.
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64
5.7 Protocolos de aplicação do nitrogênio líquido
Os grupos foram diferenciados pelo protocolo de aplicação do nitrogênio líquido na
área previamente determinada:
ü
Protocolo 1 (grupo A): três aplicação de nitrogênio líquido durante um minuto cada,
com o tempo de degelo de 5 minutos apó
s a aplicação;
ü
Protocolo 2 (grupo B)
: três aplicações de nitrogênio líquido durante dois minuto
cada, com o tempo de degelo de 5 minutos entre as aplicações.
Tabela 3
–
Grupos experimentais e protocolos de aplicação de nitrogênio líquido.
Grupo
Total de a
nimais
Total de aplicações
Duração da aplicação
A
19
3
1 minuto
B
18
3
2 minutos
C
4
0
0
5.8 Sacrifícios dos animais
Os animais foram sacrificados através de deslocamento cervical (figura 18), no
seguinte protocolo:
Tabela 4
–
Grupos experiment
ais e semanas de sacrifícios.
Sacrifício
Grupo
1
a
semana
2
a
semana
4
a
semana
12
a
semana
A
A
1
à A
5
A
6
à A
10
A
11
à A
15
A
16
à A
19
B
B
1
à B
5
B
6
à B
10
B
11
à B
15
B
15
à B
19
controle
C
1
C
2
C
4
C
12
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65
Figura 18
-
Figura representativa do sacrifício animal.
Nota:
Com auxílio de instrumental apropriado, realizou
-
se a eutanásia animal através de deslocamento
cervical.
5.9 Processamento do material biológico
As amostras foram armazenadas em tubos plásticos do tipo Falcon e fixadas em
formaldeído a 10% por 48 horas
, descalcificadas em ácido nítrico a 5% por sete dias,
tamponadas com sulfato de sódio a 5% por 24 horas e posteriormente embebidas em água
deionizada, desidratadas em banhos de concentração crescente de álcool etílico (70%
-
80%
-
90%
-
100%) uma hora cad
a, diafanizadas através de xilol durante uma hora e incluídas
em parafina (56
0
-
60
0
), segundo métodos convencionais. Em seguida, foram realizados
cortes longitudinais do osso femural, seriados, de 4 µm de espessura que foram fixados em
ovoalbumina e permaneceram em estufa a 37
0
C por 24 horas para secagem. Posteriormente,
os blocos foram desparafinizados em xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
álcool (100%
-
90%
-
80%
-
70%) para posterior coloração em hematoxilina e eosina,
desidratadas em ba
nhos de concentração crescente de álcool etílico (70%
-
80%
-
90%
-
100%), imersos em xilol para o clareamento e posterior montagem das lâminas (figura 19).
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66
Figura 19
-
Figura ilustrativa do processamento do material biológico.
5.10 Avaliação histomorfológica e histomorfométrica
Após o processamento do material biológico e confecção de lâminas coradas pela
técnica tintorial com hematoxilina
-
eosina, as mesmas foram examinadas com o auxílio de
um microscópio ótico (Leica
®
) em objetivas de 4x, 10x e 40x. R
ealizou
-
se um estudo
morfológico descritivo e morfométrico quantitativo, ambos do tipo cego, onde os
observadores desconheciam ao qual grupo animal pertencia a lâmina avaliada que,
previamente, foi codificada. Para a análise morfológica foram utilizados do
is
examinadores, sendo empregada uma análise de concordância prévia interobservadores. Em
contrapartida, para o estudo histomorfométrico utilizou
-
se de apenas um observador
previamente calibrado, onde uma análise de concordância intraexaminador.
5.10.1 Avaliação histomorfológica
a) Cortical óssea:
Realizou
-
se uma análise descritiva das alterações evidenciadas na cortical óssea, nos
diferentes grupos experimentais, comparativa com as do grupo não tratado por nitrogênio
líquido. Procurou
-
se observar os seg
uintes parâmetros histológicos: lacunas ósseas
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67
preenchidas por osteócitos, lacunas ósseas destituídas de osteócitos (vazias), canais
nutrientes revestidos por endotélio e preenchidos por hemácias, canais nutrientes vazios e
tecido ósseo secundário.
b) Tec
ido medular:
Realizou
-
se uma análise descritiva das alterações observadas no tecido medular,
comparativa com as do grupo controle, sendo coletadas de forma qualitativa, categorizadas
como presença ou ausência de tecido conjuntivo frouxo, adipócitos, edema
intercelular,
vasos congestos, tecido ósseo secundário (osteóide) e tecido ósseo maduro (mineralizado).
Para o grau histológico de inflamação, em adição, foi criada uma variável ordinal, com
valores de zero a três, sendo 0 = ausente ou escasso (até 5% da a
mostra), 1 = leve
(acima de 5% e inferior a 25%), 2 = moderado (acima de 25% e inferior a 75%) e 3 =
intenso ou acentuado (acima de 75%), sendo caracterizado pela intensidade da
permeação do tecido medular por linfócitos, neutrófilos, plasmócitos e macrófa
gos.
5.10.2 Avaliação histomorfométrica
Para a avaliação histomorfométrica do efeito da crioterapia sobre o tecido ósseo, os
seguintes parâmetros foram quantificados: número de lacunas preenchidas por osteócitos,
número de lacunas vazias (não preenchida
s por osteócitos), número de canais nutrientes
normais, número de canais nutrientes vazios, extensão e profundidade de necrose óssea.
Para estas análises, utilizou
-
se um microscópio óptico com o qual se observou todos os
campos dos cortes histológicos. Em
seguida, as imagens dos campos histológicos foram
capturadas em microscópio Leica
®
com câmera OS
-
Fi1 (Nikon
®
) e processadas através do
software
analisador de imagens Image J 1.40 (National Institutes of Health, USA). Para
tanto, apenas uma secção histológica de cada região do osso foi observada, garantindo que
a mesma célula não fosse examinada mais de uma vez.
A contagem de células, lacunas ósseas vazias, canais nutrientes preservados, bem
como canais nutrientes vazios, foi realizada através de ferramenta
específica do
software
utilizado (figuras 20, 21 e 22). Neste programa, padronizou
-
se como tipo 1, lacunas ósseas
vazias e canais nutrientes vazios, e tipo 2, como sendo os osteócitos e canais nutrientes
preservados.
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68
Figura 20
-
Figura ilustrativa da
ferramenta específica para contagem de células do
software
Image J 1.40.
Figura 21
-
Fotomicrografia analisada pelo
software Image J.
Nota: Visualizam
-
se lacunas ósseas vazias (
type
1) e osteócitos normais (
type
2).
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69
Figura 22
-
Fotomicrografia ana
lisada pelo
software Image J.
Nota: Visualiza
-
se a contagem de canais nutrientes vazios (
type
1) e canais nutrientes normais (
type
2)
A quantificação da extensão e profundidade de necrose óssea foi realizada através
de medições específicas nas fotomicro
grafias. Os valores obtidos em
pixels
foram
transformados em micrometros através de proporções matemáticas, seguindo
-
se a relação
de 0,55 micrômetros para cada um
pixel
analisado na Câmara de Neubauer
(0,1mm/0,0025mm
2
) em aumento de 100 vezes no microscópio óptico (figura 23).
Figura 23
-
Câmara de Neubauer.
Nota: A) Figura ilustrativa da câmara de Neubauer; B) Desenho ilustrativo dos campos visualizados ao
microscópio óptico; C) Fotomicrografia da câmara de Neubauer capturada pelo
software
Image J; o tra
çado
em amarelo representa 250µm, equivalente a 450
pixels
(aumento de 100x)
Para a extensão da necrose óssea, definiu
-
se a região mediana do corte histológico
como parâmetro em todas as medições desta variável. Através de ferramenta específica do
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70
program
a Image J, mediu
-
se a distância entre o início e o fim da necrose em todos os
campos que continham lacunas ósseas vazias (figura 24). Posteriormente, os valores
individuais foram somados, compilando
-
se a extensão total de necrose.
Figura 24
-
Fotomicro
grafia de secção histológica, em aumento de 100x, processada pelo programa Image J.
Nota: Padronizou
-
se com uma reta (traçado em amarelo), na região mediana horizontal, a extensão de necrose
óssea.
Para realizar
-
se a medição da profundidade de necrose óss
ea, padronizaram
-
se, em
todos os campos analisados, três faixas de referência situadas em cada um quarto da área
examinada. Por meio de ferramenta específica do
software
utilizado na pesquisa, mediu
-
se
a distância entre o início e o fim da necrose. Em segu
ida, realizou
-
se a média dos três
valores encontrados por cada campo e, ao final, foi obtida a média geral de profundidade de
cada lâmina (figura 25).
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71
Figura 25
-
Fotomicrografia de secção histológica, em aumento de 100x, processada pelo programa Image
J.
Nota: Observa
-
se a demarcação de três linhas amarelas verticais (1, 2 e 3) referenciais e eqüidistantes entre si
para medir
-
se a profundidade de necrose óssea.
5.11 Análise estatística dos dados
Após colhidos, os dados obtidos foram tabulados e montados em um banco de dados
eletrônicos com o programa Microsoft Excel
®
. Os dados foram analisados com o programa
eletrônico Origin
®
(versão 8.0) e a eles aplicaram
-
se testes estatísticos apropriados.
Para testar as diferenças significativas entre os parâmetros analisados, foi utilizado o
teste não
-
paramétrico de
Kruskal
-
Wallis
. Aos grupos com mais de duas amostras que
apresentaram diferenças significativas, aplicou
-
se o
post
-
hoc
teste de
Dunn
para se
determinar quais diferenças eram significativas. O nível de significância adotado foi de 5%
(a=0,05).
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72
6 RESULTADOS
6.1 Observações gerais
Todos os animais alimentaram
-
se normalmente durante o período experimental de
observação, não tendo sido constatada perda de peso considerável entre os grupos.
Não foram
constatadas alterações persistentes de locomoção, bem como processo
infeccioso no sítio cirúrgico. Da mesma forma, clinicamente, macroscopicamente e
microscopicamente não foram evidenciados sinais de fratura patológica.
A análise de concordância interobse
rvadores e intraobservador foi estatisticamente
significante, apresentando um p
valor menor que 0,05.
6.2 Análise histomorfológica
6.2.1 Grupo controle
Os animais não submetidos a qualquer protocolo experimental, seja o de 1 minuto
ou o de 2 minutos,
foram categorizados como grupo controle, totalizando quatro animais
(referentes a cada semana de sacrifício).
A análise descritiva desse grupo evidenciou matriz óssea de aspecto normal, com
osteócitos de tamanhos diferentes, aprisionados em lacunas óssea
s, apresentado núcleos
basofílicos ora arredondados, ora achatados, dispostos entre os canais vasculares do sistema
de Havers (figura 26).
Os canais vasculares, por sua vez, caracterizavam
-
se pela presença de formações
ora ovais, ora elípticas, revestidas
por endotélio tênue e preenchidos por hemácias,
dispersos na matriz óssea (figura 27).
Em virtude do procedimento cirúrgico para obtenção das peças, no qual todos os
tecidos foram dissecados e removidos, e do processo laboratorial de descalcificação com
ácido nítrico a 5% para preparo histológico, na grande totalidade das lâminas não foi
observado periósteo e, conseqüentemente, pavimentação osteoblástica na superfície externa
da cortical óssea. Osteoclastos também não foram evidenciados.
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73
Figura 26
-
Fot
omicrografia de cortical óssea representativa do grupo controle HE 100x.
Nota: Visualizam
-
se os componentes da matriz óssea: osteócitos, com núcleos basofílicos e aprisionados em
lacunas ósseas, além de canais vasculares do sistema de Havers.
Figura 27
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo controle. HE 400x.
Nota: Em maior detalhe, observam
-
se dois canais vasculares (CV), com seus respectivos revestimentos
endoteliais, preenchidos por hemácias extravasadas. Em adição, osteócitos (OS
T) em lacunas ósseas estão
dispersos na matriz óssea (MTO).
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74
O tecido medular apresentou
-
se de aspecto normal, caracterizado por numerosas
hemácias, células adipócitas, além de células progenitoras da linhagem mielóide e linfóide.
Visualizaram
-
se, ainda,
osteoblastos revestindo internamente a cavidade medular (Figura
28).
Figura 28
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo controle. HE 400x.
Nota: Observam
-
se hemácias (HEM) extravasadas, adipócitos (ADP) e células progenitoras (CP) no
estroma
medular.
6.2.2 Protocolo experimental de 1 minuto
1 SEMANA
Visualizou
-
se pequena área de necrose em cortical óssea com clara distinção do
tecido ósseo normal. Em adição, poucos campos histológicos mostraram canais nutrientes
vazios em meio às la
cunas ósseas destituídas de osteócitos (figura 29). A cortical óssea
oposta não apresentou alterações.
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75
O tecido medular mostrou
-
se íntegro, obtendo como grau histológico de inflamação
escore médio de 0 (ausente ou escasso) em todas as amostras representati
vas deste grupo
(figuras 30 e 31).
Figura 29
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo experimental A1 (protocolo 1 minuto /
1semanana). HE 100x.
Nota: Observa
-
se faixa superficial de tecido ósseo necrosado, caracterizado por lacunas ó
sseas vazias (LV) e
canais vasculares necróticos (CVN) em meio a matriz óssea normal composta por osteócitos (OST) e canais
vasculares íntegros (CV).
Figura 30
-
Fotomicrografia de tecido medular representativo do grupo A1(protocolo 1 minuto / 1semanana
).
HE 100x.
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76
Nota: Visualiza
-
se tecido de aspecto normal, sem alterações inflamatórias ou degenerativas. Pode observar
-
se,
ainda, cortical óssea interna sem apresentar sinais de necrose.
Figura 31
-
Fotomicrografia de tecido medular representativo do gr
upo A1(protocolo 1 minuto / 1semanana).
HE 400x.
Nota: Observa
-
se tecido medular sem sinais inflamatórios, além de adipócitos dispersos entre células
progenitoras do estroma medular e hemácias.
2 SEMANAS
Observou
-
se aumento em profundidade e extensão da
área de necrose óssea,
entretanto, não atingindo a cortical em toda sua profundidade. Visualizou
-
se ausência de
osteócitos, e conseqüente formação de lacunas vazias, além de canais nutrientes necróticos
nas áreas afetadas (figura 32). Sinais indicativos de
necrose óssea não foram encontrados na
cortical oposta ao tratamento empregado. Em adição, observou
-
se, na maior parte dos
campos histológicos, tecido ósseo normal caracterizado por celularidade e vascularidade
preservados.
O tecido medular sobrejacente mostrou
-
se alterado, contendo numerosos adipócitos
e de tamanhos desproporcionais (figuras 33 e 34). O grau histológico de inflamação para
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77
este grupo obteve escore médio de 1 (leve), variando entre 0 (ausente ou escasso) e 2
(moderado).
Figura 32
-
Fotomi
crografia de cortical óssea representativa do grupo A2 (protocolo 1 minuto / 2 semanas).
HE 100x.
Nota: Observa
-
se necrose óssea em profundidade caracerizada pela presença de lacunas ósseas vazias (LV) e
canais vasculares necróticos (CVN) em maior número c
omparativamente aos osteócitos (OST) e canais
vasculares íntegros (CV).
Figura 33
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A2 (protocolo 1 minuto / 2 semanas).
HE 100X.
Nota: Verifica
-
se o tecido medular alterado, com presença de vá
rios adipócitos de tamanho aumentado.
Ainda, observa
-
se cortical óssea marginal íntegra e sem sinais degenerativos.
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78
Figura 34
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A2 (protocolo 1 minuto / 2 semanas).
HE 400X.
Nota: Observa
-
se hip
eremia vascular.
4 SEMANAS
Constatou
-
se redução em profundidade da necrose óssea caracterizada por faixa
superficial de lacunas ósseas vazias e raros canais vasculares degenerados. Em
contrapartida, observaram
-
se, na matriz óssea, formações irregulares
de osso novo, em
meio à população de osteócitos, caracterizando o processo de remodelação óssea (figuras
35 e 36).
O tecido medular, por sua vez, apresentou
-
se alterado, com grande formação de
adipócitos de volume aumentado (figura 37). Observou
-
se, ainda
, a presença de material
osteóide (osso novo) disperso na matriz medular (figuras 38 e 39). O grau histológico de
inflamação para este grupo obteve escore médio de 1 (leve), variando entre 0 (ausente ou
escasso) e 1 (leve).
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79
Figura 35
-
Fotomicrografia de
cortical óssea representativa do grupo A4 (protocolo 1 minuto / 4 semanas).
HE 100x.
Nota: Faixa restrita de necrose óssea, composta por poucas lacunas ósseas vazias (LV) e canais vasculares
íntegros (CV). Observa
-
se processo de remodelação óssea, com marcante formação de estruturas irregulares
na matriz óssea caracterizadas como osso novo (ON).
Figura 36
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo A4 (protocolo 1 minuto / 4 semanas).
HE 400x.
Nota: Observam
-
se áreas de deposição de osso
novo (seta) em meio à matriz óssea.
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80
Figura 37
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A4 (protocolo 1 minuto / 4 semanas).
HE 40x e 100x.
Nota: A) Observação em menor aumento do tecido medular, evidenciando formação de inúmeros espaç
os,
compatíveis com células adipócitas de tamanho aumentado; B) Detalhe em maior aumento das células
adipócitas.
Figura 38
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A4 (protocolo 1 minuto / 4 semanas).
HE 100X.
Nota: Presença de osso n
ovo (ON) sendo depositado na matriz medular.
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81
Figura 39
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A4 (protocolo 1 minuto / 4 semanas).
HE 400X.
Nota: Presença de osso novo (ON) sendo depositado na matriz medular.
12 SEMANAS
Após 12
semanas do tratamento empregado, a cortical óssea permaneceu com uma
faixa mínima, superficial, tanto em extensão como em profundidade, de necrose óssea.
Visualizaram
-
se poucas lacunas vazias e raros canais vasculares necrosados. Entretanto,
observou
-
se u
ma marcante deposição de osso novo em uma matriz óssea mais compacta
(figura 40). Alteração na cortical oposta não foi constatada.
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82
Figura 40
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo A12 (protocolo 1 minuto / 12 semanas).
HE 100x e 400x
.
Nota: A) Secção histológica evidenciando estreita faixa de necrose óssea, caracterizada por eventuais lacunas
vazias (LV) destituídas de osteócitos, além de marcante deposição de formações irregulares de osso novo
(ON); B) Visão em maior aumento das depo
sições de osso novo (ON) na matriz extracelular, bem como
detalhe das lacunas vazias (LV) e osteócitos com núcleos grandes, caracterizando o processo de remodelação
óssea.
O tecido medular apresentou
-
se alterado, com o mesmo padrão descrito no grupo
A4,
compondo
-
se, principalmente, por adipócitos de maiores proporções, além de hemácias
extravasadas e outras células hematopoiéticas (figura 41). O grau histológico de inflamação
para este grupo obteve escore médio de 1 (leve), não apresentando variação.
F
igura 41
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo A12 (protocolo 1 minuto / 12
semanas). HE 100x e 400x.
Nota: A) Visualização em menor aumento de matriz medular composta por diversos adipócitos volumosos; B)
Em uma maior aproximação, ob
servam
-
se adipócitos (ADP) volumosos e de tamanhos diferente, permeados
entre si por células hematopoiéticas e células multinucleadas (seta).
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83
6.2.3 Protocolo experimental de 2 minutos
1 SEMANA
Observou
-
se necrose de cortical óssea pronunciada em profundi
dade e em extensão,
embora poucos campos apresentassem necrose completa da área analisada, caracterizada
pela morte de osteócitos, inclusive na região margeante ao tecido medular. A
vascularização também se mostrou alterada, apresentando diversos canais nu
trientes
degenerados (figura 42). Não se constatou necrose na cortical oposta ao tratamento
empregado.
Figura 42
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B1 (protocolo 2 minutos / 1 semana).
HE 100x.
Nota: Verifica
-
se a presença de vá
rias lacunas vazias (LV) por decorrência da necrose que se propagou em
profundidade e extensão, embora a cortical margeante ao tecido medular não se apresente completamente
afetada, com alguns osteócitos (OST) remanescentes. Ainda, observam
-
se canais vascu
lares necrosados
(CVN).
O tecido medular mostrou
-
se alterado, com deposição de tecido conjuntivo fibroso
denso, adipócitos volumosos, infiltrado inflamatório disperso, edema intercelular e
vascular, vasos congestos e áreas irregulares de neoformação ó
ssea. Esta se caracterizou
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84
por matriz óssea composta de osteócitos com núcleos volumosos, configurados como
osteoblastos diferenciados e recém
-
aprisionados, e permeada por pavimentação
osteoblástica com estas células dispostas lado a lado (figura 43). O gr
au histológico de
inflamação para este grupo obteve escore médio de 1 (leve), variando entre 0 (ausente ou
escasso) e 2 (moderado).
Figura 43
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B1 (protocolo 2 minutos / 1 semana.
HE 400x.
Nota: A
) Verifica
-
se deposição de tecido fibroso denso, caracterizado por células fusiformes/ovóides,
infiltrado inflamatório (IF) disperso, além de células adipócitas (ADP) volumosas; B) Edema vascular (EV) e
intercelular (ED), além de vasos congestos (VC), célu
las inflamatórias e osso novo (ON); C) Áreas de
neoformação óssea irregular, além vasos congestos por hemácias; D) Detalhe do material osteóide,
caracterizado por osteócitos (OST) de núcleos basofílicos volumosos recém
-
incluídos, com osteoblastos
(OSB) na
periferia dispostos lado a lado (pavimentação osteoblástica), além de edema, infiltrado inflamatório
e vasos congestos
2 SEMANAS
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85
Verificou
-
se, após duas semanas, o pico de necrose da cortical óssea entre os
grupos, caracterizada por marcante formação de
lacunas vazias na maior parte dos campos
histológicos analisados e diversos canais vasculares degenerativos (figura 44). As áreas
representativas deste grupo apresentavam necrose em profundidade, atingindo
completamente a cortical óssea (figura 45). Entretanto, a cortical do lado oposto manteve
-
se
íntegra.
O componente medular apresentou
-
se modificado, exibindo quadro histológico
composto por importante infiltrado inflamatório disperso por entre as áreas de deposição
fibro
-
adiposa, além de diversos vasos
sangüíneos congestos, além de locais exibindo tecido
ósseo neoformado e disposto em trabéculas (figura 46). Na maioria dos animais deste
grupo, observou
-
se esta marcante formação de traves de osso imaturo, dispostas entre o
tecido fibro
-
adiposo produzido
(figuras 47 e 48). O grau histológico de inflamação para o
tecido medular obteve escore médio de 2 (moderado), não apresentando variação de
severidade.
Figura 44
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B2 (protocolo 2 minutos / 2 sema
nas).
HE 100x.
Nota: Pico de necrose entre todos os grupos, representado por faixa de tecido ósseo necrosado atingindo
margem profunda, com matriz contendo lacunas ósseas destituídas de osteócitos (LV), bem como canais
nutrientes necrosados (CVN) inclusive
na margem interna da cortical.
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86
Figura 45
-
Fotomicrografia representativa do grupo B2 (protocolo 2 minutos / 2 semanas).
Nota: Em maior aumento, observa
-
se a margem interna da cortical óssea, preenchida tanto por lacunas vazias
(LV) como por canais
vasculares necrosados (CVN), em adjacência a um tecido medular com deposição de
fibras colágenas frouxamente organizadas e permeadas por infiltrado inflamatório (IF).
Figura 46
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B2 (protocolo 2
minutos / 2 semanas).
HE 100x.
Nota: Observa
-
se quadro inflamtório (IF) importante, com áreas de deposição fibro
-
adiposa, formação de osso
novo (ON) irregular, edema intercelular (ED), além de diversos vasos congestos.
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87
Figura 47
-
Fotomicrografia de te
cido medular representativa do grupo B2 (protocolo 2 minutos / 2 semanas).
HE 100x.
Nota: A) Observa
-
se deposição de osso neoformado (ON) em meio a um tecido fibro
-
adiposo frouxamente
organizado, onde é possível observar
-
se, também, vasos congestos (VC); B
) Detalhe da formação de um
tecido conjuntivo fibroso denso (TC), exuberante, em meio a traves de tecido ósseo lineadas por osteoblastos
dispostos lado a lado.
Figura 48
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B2 (protocolo 2 minut
os / 2 semanas).
HE 400x.
Nota: Observa
-
se infiltrado inflamatório (IF) disperso em estroma com edema intercelular (ED) e vasos
congestos (VC), além da presença de osso novo (ON).
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88
4 SEMANAS
Decorridas quatro semanas, verificou
-
se redução principalmente
em profundidade,
da necrose óssea na cortical óssea onde foi aplicado o criógeno. Foram visualizadas lacunas
ósseas sem osteócitos em faixa, além de poucos canais nutritivos necrosados (figura 49).
Em nenhum campo analisado constatou
-
se necrose que atingi
sse a região marginal ao
tecido medular. Da mesma forma, a cortical oposta mostrou
-
se preservada.
Foi observado na cortical processo de remodelação. Este caracterizou
-
se pela
produção de osso neoformado, caracteristicamente menos mineralizado, irregular,
assumindo algumas vezes disposição lamelar e concêntrica, e distribuído principalmente
próximo à margem interna da cortical óssea (figura 50).
As áreas de formação óssea no tecido medular também se mostraram com grau
maior de mineralização, apresentando m
atriz extracelular mais compacta e osteócitos
diferenciados, com núcleos fusiformes e rechaçados, além da ausência de pavimentação
osteoblástica (figura 51). Observou
-
se, ainda, maior número de células gigantes
multinucleadas de permeio ao tecido ósseo, al
ém de hemácias extravasadas, adipócitos e
células inflamatórias dispersas (figura 52). O grau histológico de inflamação para este
grupo obteve escore médio de 0,5 (entre ausente ou escasso e leve), variando entre 0
(ausente ou escasso) e 2 (moderado).
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89
Figura 49
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B4 (protocolo 2 minutos / 4 semanas).
HE 100x.
Nota: Pequena faixa de necrose óssea, com lacunas vazias e poucos canais vasculares necrosados.
Figura 50
-
Fotomicrografia de cortical
óssea representativa do grupo B4 (protocolo 2 minutos / 4 semanas).
HE 100x e 400x.
Nota: A) Secção histológica de tecido ósseo apresentando lacunas preenchidas por osteócitos e entremeadas
por matriz contendo focos de deposição de osso novo (ON). B) Deta
lhe em maior aumento da área
selecionada em vermelho, evidenciando tecido ósseo lamelar depositado concentricamente.
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90
Figura 51
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B4 (protocolo 2 minutos / 4 semanas).
HE 400x.
Nota: Observa
-
se te
cido ósseo mais mineralizado, caracterizado por matriz extracelular compacta e osteócitos
com núcleos fusiformes e rechaçados, evidenciando maior diferenciação, além da ausência de pavimentação
osteoblástica de permeio.
Figura 52
-
Fotomicrografia de t
ecido medular representativa do grupo B4 (protocolo 2 minutos / 4 semanas).
HE 400x.
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91
Nota: Tecido ósseo depositado compacto, e com osteócitos diferenciados em sua matriz extracelular,
permeado por hemácias extravasadas, células inflamatórias, e células gig
antes multinucleadas (setas pretas).
12 SEMANAS
Após doze semanas da terapia instituída, pode se observar marcante redução da área
de necrose óssea em cortical, representando, dentre os grupos com protocolo de aplicações
de dois minutos, o que se apresentou com a faixa mais superficial e de menor extensão. Da
mesma forma, o processo de remodelação óssea mostrou
-
se significativo em todos os
animais tratados, com várias áreas de formação de material mineralizado (figuras 53 e 54).
A vascularização mostro
u
-
se completamente restabelecida, com áreas mostrando diversos
canais nutrientes (figura 55).
Figura 53
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B12 (protocolo 2 minutos / 12
semanas). HE 100x.
Nota: Faixa superficial de lacunas vazias
(LV), acelulares, acompanhada por matriz extracelular com diversas
áreas focais de deposição de material mineralizado, muitos deles contendo osteócitos aprisionados.
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92
Figura 54
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B12 (protocolo 2
minutos / 12
semanas). HE 400x.
Nota: Em maior detalhe a presença de material mineralizado na matriz óssea.
Figura 55
-
Fotomicrografia de cortical óssea representativa do grupo B12 (protocolo 2 minutos / 12
semanas). HE 100x.
Nota: Área ricamente vasc
ularizada (CV), exibindo faixa superficial de necrose óssea (LV)..
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93
O tecido medular também se mostrou modificado, com a maior parte da área
analisada composta por tecido conjuntivo frouxo, associado à presença de várias células
adiposas. Além disso, hemá
cias extravasadas, vasos sangüíneos congestos e osso
mineralizado foram encontrados (figuras 56 e 57). O grau histológico de inflamação para
este grupo obteve escore médio de 1,5 (entre leve e moderado), variando entre 1 (leve) e 2
(moderado).
Figura 56
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B12 (protocolo 2 minutos / 12
semanas). 100x.
Nota: Observa
-
se formação de tecido ósseo maduro (OM) interposto por tecido conjuntivo (TC) frouxamente
organizado, com numerosas células adiposas (A
DP) e alguns vasos sangüíneos (VC).
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94
Figura 57
-
Fotomicrografia de tecido medular representativa do grupo B12 (protocolo 2 minutos / 12
semanas). 400x.
Nota: Em A e B evidencia
-
se deposição marcante de tecido conjuntivo (TC) frouxo, caracterizado por
de
posição de fibras colágenas através da atividade dos fibroblastos (FB) presentes. Na amostra, também se
observa a presença de osso maduro (OM), infiltrado inflamatório (IF) e alguns adipócitos (ADP).
6.3 Análise histomorfométrica
Tendo
-
se dois grupos exp
erimentais, contendo 38 ratos, e um grupo controle,
apresentando 4 animais, obteve
-
se um total de 42 fêmures que foram analisados. Dessa
forma, foram observados 456 campos histológicos em toda a amostra, totalizando 4104
análises realizadas pelo programa I
mage J. Foram realizadas análises estatísticas
comparativas para as médias de cada grupo/subgrupos e para as médias entre cada
grupo/subgrupos. Adotou
-
se, para todos os dados, o micrômetro (µm) como sendo a
unidade de medida padrão, e as tabelas foram expr
essas utilizando
-
se, quando aplicadas às
mesmas, o campo, número de amostras (N), valor mínimo (Mín), primeiro quartil (Q1),
valor da mediana, terceiro quartil (Q3), valor máximo (Max), rank médio, soma dos ranks e
valor de
p. Os valores das médias individuais, por campos e por semanas de avaliação estão
descritas nos ANEXOS C, D, E, F e G.
6.3.1 Protocolo experimental de 1 minuto
(
grupo A
)
6.3.1.1 Extensão
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95
A análise dos dados das médias dos campos histológicos de cada semana
experimental não mostrou dife
rença estatística significante (tabelas 5
–
8). O valor médio
máximo de extensão foi de 2087,094µm (anexo C).
Tabela 5
-
Teste de
Kruskal
-
Wallis
para a extensão da necrose entre o grupo A após 1 semana.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
808,4
919,8
1.034,7
1.182,3
1.203,8
11,2
56
0,20*
2
5
1.071,1
1.107,3
1.147,0
1.176,1
1.182,9
16,8
84
3
5
1.075,5
1.103,1
1.146,5
1.158,8
1.164,7
15,8
79
4
5
971,2
1.022,5
1.089,9
1.138,3
1.149,3
10,8
54
5
4
810,7
849,8
1.009,5
1.122,2
1.145,7
6,75
27
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 6
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A após 2 semanas.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
1.148,4
1.149,1
1.159,5
1.172,4
1.179,9
16,6
83
0,20*
2
5
1.145,9
1.146,3
1.152,0
1.177,5
1.188,1
15
75
3
5
1.134,7
1.140,2
1.145,9
1.180,1
1.189,9
13,2
66
4
5
1.124,4
1.128,8
1.148,1
1.160,6
1.164,7
10,2
51
5
4
1.114,7
1.117,3
1.133,9
1.151,0
1.153,8
6,25
25
* Não
significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 7
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A após 4 semanas.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
1094,5
1097,9
1108,1
1117,8
1121,3
7
35
0,12*
2
5
732,0
801,4
1062,2
1115,4
1159,4
4
20
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 8
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A após 12 semanas.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ran
ks
p
1
4
890,2
904,2
960,9
1043,3
1065,8
5,75
23
0,15*
2
4
737,0
772,3
887,0
952,9
971,9
3,25
13
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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96
Ao realizar
-
se a análise comparativa dos valores médios de extensão entre as
semanas experimenta
is, verificou
-
se diferença estatisticamente significante (tabelas 9 –
13).
Entretanto, o mesmo não foi observado entre a 1
a
e 4
a
semanas.
Tabela 9
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A entre 1 e 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
M
ediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
1025,4
1053,1
1087,8
1112,7
1123,9
3
15
0,01**
A2
5
1128,2
1134,2
1143,7
1164,4
1167,4
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 10
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão d
a necrose entre o grupo A entre 1 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
1025,4
1053,1
1087,8
1112,7
1123,9
7
35
0,01**
A12
4
901,4
904,1
921,6
934,6
935,7
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p
< 0,05)
Tabela 11
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A entre 2 e 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
1128,2
1134,2
1143,7
1164,4
1167,4
7,8
39
0,02**
A4
5
920,0
953,1
1078,4
1116,6
1136,8
3,2
16
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 12
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A entre 2 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
1128,2
1134,2
1143,7
1164,4
1167,4
7
35
0,01**
A12
4
901,4
904,1
921,6
934,6
935,7
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 13
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo A entre 2 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
920,0
953,1
1078,4
1116,6
1136,8
6,6
33
0,05**
A12
4
901,4
904,1
921,6
934,6
935,7
3
12
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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97
6.3.1.2 Profundidade
Observando
-
se os dados concernentes
à média entre os campos histológicos de cada
semana experimental, encontrou
-
se diferença estatística significante apenas para os animais
sacrificados com uma semana (A1) (tabelas 14 e 15). O valor médio máximo de
profundidade foi de 124,509µm (anexo D).
Tabela 14
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo A após 1 semana.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
91,6
95,3
102,6
114,2
115,7
11,8
59
0,04**
2
5
107,0
112,4
126,8
128,7
130,4
19,2
96
3
5
87,0
93,5
109,6
144,5
162,2
14,8
74
4
5
57,1
73,2
96,5
120,6
124,7
10,2
51
5
4
40,8
50,7
86,9
95,9
96,8
5,0
20
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 15
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose entre o grupo
A após 1 semana.
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo 2
-
7400,0
*
Campo 2 vs. Campo 4
9000,0
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
3000,0
*
Campo 2 vs. Campo 5
14,20
**
Campo 1 vs
. Campo 4
1600,0
*
Campo 3 vs. Campo 4
4600,0
*
Campo 1 vs. Campo 5
6800,0
*
Campo 3 vs. Campo 5
9800,0
*
Campo 2 vs. Campo 3
4400,0
*
Campo 4 vs. Campo 5
5200,0
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Comparando
-
se, entre as seman
as, os dados referentes às médias dos campos
histológicos, obteve
-
se diferença estatística na maioria dos pares (tabelas 16 –
20). Apenas
o pareamento entre a 1
a
e 2
a
semanas experimentais não seguiu esse comportamento.
Tabela 16
-
Teste de Kruskal
-
Wallis
para a profundidade da necrose entre o grupo A entre 1 e 4 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
33,1
36,1
40,8
48,1
50,2
8
40
0,01**
A4
5
7,8
7,9
8,6
9,2
9,4
3
15
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98
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0
,05)
Tabela 17
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo A entre 1 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
33,1
36,1
40,8
48,1
50,2
7
35
0,01**
A12
4
5,1
5,2
5,9
6,5
6,6
2,5
10
* Nã
o significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 18
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo A entre 2 e 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
35,0
41,7
50,7
64,1
69,3
8
40
0,01**
A4
5
7,8
7,9
8,6
9,2
9,4
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 19
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo A entre 2 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
35,0
41,7
50,7
64,1
69,3
7
35
0,01**
A12
4
5,1
5,2
5,9
6,5
6,6
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 20
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo A entre 4 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
7,8
7,9
8,6
9,2
9,4
7
35
0,01**
A12
4
5,1
5,2
5,9
6,5
6,6
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.1.3 Necrose de osteócitos
Para avaliar
-
se a necrose de osteócito
s das amostras, realizaram
-
se, inicialmente a
contagem do número de lacunas vazias presentes, seguida da contagem do número de
osteócitos visíveis. Posteriormente, realizou
-
se uma proporção entre o número de lacunas
vazias e o número total de lacunas (lacu
nas vazias + lacunas preenchidas por osteócitos),
obtendo
-
se, dessa forma, uma razão numérica.
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99
Entre os campos histológicos de cada semana experimental, a necrose de osteócitos
mostrou
-
se significativa, apenas para os grupos A1 e A2 (tabelas 21 e 22). Ent
retanto,
quando se realizou análise comparativa entre os grupos, verificou
-
se diferença significante
entre todas as possíveis combinações (tabelas 23 –
28).
Tabela 21
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A após 1 semana.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
0,09
0,10
0,12
0,17
0,19
9,4
47
0,04**
2
5
0,15
0,17
0,19
0,24
0,28
18,6
93
3
5
0,13
0,15
0,18
0,22
0,24
16,6
83
4
5
0,04
0,07
0,12
0,20
0,22
10,2
51
5
4
0,07
0,07
0,11
0,15
0,15
6,5
26
*
Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 22
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A após 2 semanas.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
0,20
0,20
0,21
0,26
0,27
9,2
46
0,03**
2
5
0,19
0,22
0,24
0,27
0,28
11,5
57,5
3
5
0,19
0,20
0,22
0,25
0,26
9,4
47
4
5
0,23
0,26
0,31
0,31
0,31
20,0
100
5
4
0,24
0,25
0,29
0,31
0,31
18,4
73,5
6
1
0,19
0,19
0,19
0,19
0,19
1,0
1
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 23
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A entre 1 e 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,05
0,05
0,06
0,07
0,08
3,2
16
0,02**
A2
5
0,07
0,09
0,11
0,12
0,13
7,8
39
* Não sig
nificante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 24
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A entre 1 e 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,05
0,05
0,06
0,07
0,08
8
40
0,01**
A4
5
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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100
Tabela 25
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A entre 1 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,05
0,05
0,06
0,07
0,08
7
35
0,01**
A12
4
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 26
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A entre 2 e 5 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
0,07
0,09
0,11
0,12
0,13
8
40
0,01**
A4
5
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 27
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o g
rupo A entre 2 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
0,07
0,09
0,11
0,12
0,13
7
35
0,01**
A12
4
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 28
-
Teste de Krus
kal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo A entre 4 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
7
35
0,01**
A12
4
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Sig
nificante (p < 0,05)
6.3.1.4 Necrose de canais vasculares
Para avaliar
-
se a necrose de canais vasculares das amostras, realizaram
-
se,
inicialmente, a contagem do número de canais vasculares necrosados, seguida da contagem
do número de canais vasculares
normais. Posteriormente, realizou
-
se uma proporção entre
o número de canais vasculares necrosados e o número total de canais vasculares (canais
necrosados + canais vasculares íntegros), obtendo
-
se, dessa forma, uma razão numérica.
Entre os grupos de cada
semana experimental, individualmente, não se observaram
amostras com significância estatística. Por outro lado, quando se realizaram as possíveis
combinações entre as semanas, incluindo o grupo controle, verificou
-
se, apenas, diferença
estatística entre o
grupo de 1 semana e o de 2 semanas com os animais do grupo controle
(tabelas 29 e 30).
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101
Tabela 29
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre o grupo A.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,04
0,05
0,06
0,21
0,34
18,0
90,0
0,00**
A2
5
0,03
0,07
0,15
0,27
0,33
18,8
94,0
A4
5
0,03
0,03
0,05
0,05
0,05
12,8
64,0
A12
4
0,00
0,00
0,02
0,04
0,05
8,0
32,0
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,0
20,0
* Não significante (p > 0,05)
** Significant
e (p < 0,05)
Tabela 30
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre o grupo A.
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
A1 vs A2
-
1,1
*
A2 vs A12
7,25
*
A1 v
s A4
5,1
*
A2 vs Controle
14
**
A1 vs A12
6,15
*
A4 vs A12
1,05
*
A1 vs Controle
12,9
**
A4 vs Controle
7,8
*
A2 vs A4
6,2
*
A12 vs Controle
6,75
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.1.5 Grau histológico de inflamação medul
ar
Foram definidos três escores para quantificar o grau de severidade de
comprometimento medular por processo inflamatório. Dessa maneira, estabeleceu
-
se que o
escore 0 representaria ausência ou escassez (até 5%) de inflamação, o escore 1 representaria
i
nflamação leve (acima de 5% e inferior a 25%), o escore 2 foi representado como
moderado (acima de 25% e inferior a 75%), e o escore 3 como sendo grau intenso ou
acentuado (acima de 75%).
Realizou
-
se um estudo comparativo entre as diferentes semanas de sac
rifício (tabela
31). Neste estudo, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, bem
como entre os mesmos e o grupo controle (tabela 32).
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102
Tabela 31
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular entre o grupo A.
G
rupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
7,5
37,5
A2
5
0,00
0,00
1,00
1,50
2,00
15,4
77,0
A4
5
0,00
0,00
1,00
1,00
1,00
14,4
72,0
0,01**
A12
4
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
19,0
76,0
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
7,5
37,5
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 32
-
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular entre o grupo A.
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença
na
soma dos
Ranks
Significância
A1 vs A2
-
7,9
*
A2 vs A12
-
3,6
*
A1 vs A4
-
6,9
*
A2 vs Controle
7,9
*
A1 vs A12
-
11,5
*
A4 vs A12
-
4,6
*
A1 vs Controle
0,0
*
A4 vs Controle
6,9
*
A2 vs A4
1,0
*
A12 vs Controle
11,5
*
* Não significante (p > 0,05)
**
Significante (p < 0,05)
6.3.2 Protocolo experimental de 2 minutos (grupo B
)
6.3.2.1 Extensão
A análise dos dados das médias dos campos histológicos de cada semana
experimental mostrou diferença estatística significante apenas para os animais avaliados na
s
egunda semana da pesquisa (tabelas 33 e 34). O valor médio máximo de extensão foi de
12046,426µm (anexo C).
Tabela 33
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo B após 2 semanas
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ra
nks
p
1
5
1131,2
1132,1
1139,7
1143,7
1146,2
17,8
89
0,00**
2
5
1100,5
1110,2
1160,4
1180,8
1196,6
34,2
171
3
5
1154,3
1154,9
1155,7
1166,8
1173,5
41,0
205
4
5
1146,5
1152,4
1159,7
1186,5
1195,8
42,6
213
5
5
1148,7
1150,9
1153,4
1190,9
1194,3
41,0
205
6
5
1148,6
1151,9
1155,4
1176,2
1179,7
40,8
204
7
5
1147,2
1147,9
1151,7
1159,9
1163,5
34,4
172
8
5
1114,6
1128,3
1142,5
1156,5
1164,6
25,2
126
9
5
613,0
620,6
628,4
636,1
640,5
4,8
24
10
5
1105,0
1108,2
1144,5
1158,3
1168,2
23,8
119
11
3
1071,9
1071,9
1145,4
1146,9
1146,9
18,7
56
12
3
589,6
589,6
630,0
630,8
630,8
4,0
12
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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103
Tabela 34
-
Post
-
hoc teste de Dunn
para a extensão da necrose entre o grupo B após 2 semanas.
Comparações
Dif
erença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo 2
-
16,4
*
Campo 4 vs. Campo 8
17,4
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
23,2
*
Campo 4 vs. Campo 9
37,8
**
Campo 1 vs. Campo 4
-
24,8
*
Campo 4 vs. Campo 10
18,8
*
Campo 1 vs. Campo 5
-
23,2
*
Campo 4 vs. Campo 11
23,9
*
Campo 1 vs. Campo 6
-
23,0
*
Campo 4 vs. Campo 12
38,6
*
Campo 1 vs. Campo 7
-
16,6
*
Campo 5 vs. Campo 6
0,2
*
Campo 1 vs. Campo 8
-
7,4
*
Campo 5 vs. Campo 7
6,6
*
Campo 1 vs. Campo 9
13,0
*
Campo 5 vs. Campo 8
15,8
*
Campo 1 vs. Campo 10
-
6,0
*
Campo 5 vs. Campo 9
36,2
**
Campo 1 vs. Campo 11
-
0,9
*
Campo 5 vs. Campo 10
17,2
*
Campo 1 vs. Campo 12
13,8
*
Campo 5 vs. Campo 11
22,3
*
Campo 2 vs. Campo 3
-
6,8
*
Campo 5 vs. Campo 12
37,0
*
Campo 2 vs. Campo 4
-
8,4
*
Campo 6 vs. Campo 7
6,4
*
Campo 2 vs. Campo 5
-
6,8
*
Campo 6 vs. Campo 8
15,6
*
Campo 2 vs. Campo 6
-
6,6
*
Campo 6 vs. Campo 9
36,0
**
Campo 2 vs. Campo 7
-
0,2
*
Campo 6 vs. Campo 10
17,0
*
Campo 2 vs. Campo 8
9,0
*
Campo 6
vs. Campo 11
22,1
*
Campo 2 vs. Campo 9
29,4
*
Campo 6 vs. Campo 12
36,8
*
Campo 2 vs. Campo 10
10,4
*
Campo 7 vs. Campo 8
9,2
*
Campo 2 vs. Campo 11
15,5
*
Campo 7 vs. Campo 9
29,6
*
Campo 2 vs. Campo 12
30,2
*
Campo 7 vs. Campo 10
10,6
*
Campo 3 vs.
Campo 4
-
1,6
*
Campo 7 vs. Campo 11
15,7
*
Campo 3 vs. Campo 5
0,0
*
Campo 7 vs. Campo 12
30,4
*
Campo 3 vs. Campo 6
0,2
*
Campo 8 vs. Campo 9
20,4
*
Campo 3 vs. Campo 7
6,6
*
Campo 8 vs. Campo 10
1,4
*
Campo 3 vs. Campo 8
15,8
*
Campo 8 vs. Campo 11
6,5
*
Campo 3 vs. Campo 9
36,2
**
Campo 8 vs. Campo 12
21,2
*
Campo 3 vs. Campo 10
17,2
*
Campo 9 vs. Campo 10
-
19,0
*
Campo 3 vs. Campo 11
22,3
*
Campo 9 vs. Campo 11
-
13,9
*
Campo 3 vs. Campo 12
37,0
*
Campo 9 vs. Campo 12
0,8
*
Campo 4 vs. Campo 5
1,6
*
Campo 10 vs. Campo 11
5,1
*
Campo 4 vs. Campo 6
1,8
*
Campo 10 vs. Campo 12
19,8
*
Campo 4 vs. Campo 7
8,2
*
Campo 11 vs. Campo 12
14,7
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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104
Ao analisarem
-
se as combinações entre semanas de sacrifício, observou
-
se, somente
no par formado entre a 1
a
e 2
a
semanas, significância estatística com diferença acusada
(tabela 35).
Tabela 35
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre o grupo B entre 1 e 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Median
a
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
1071,8
1091,7
1122,6
1133,6
1143,8
7,4
37
0,05*
B2
5
1060,9
1061,9
1072,6
1093,8
1094,7
3,6
18
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.2.2 Profundidade
Observando
-
se os dados referente
s à média entre os campos histológicos de cada
semana experimental, demonstrou
-
se diferença estatística significante apenas para os
animais sacrificados com uma e duas semanas (B1 e B2) (tabelas 36 –
39). O valor médio
máximo de profundidade foi de 436,424µm (anexo D).
Tabela 36
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B após 1 semana
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
49,1
54,7
67,3
118,2
121,6
4,6
23
0,00**
2
5
59,1
133,0
247,0
338,4
355,2
12,2
61
3
5
52,7
183,0
388,5
463,6
492,0
20,6
103
4
5
344,1
348,4
356,9
509,2
513,7
26,8
134
5
5
315,4
352,3
416,8
515,4
541,2
27,0
135
6
5
316,2
319,5
331,4
419,8
431,7
22,2
111
7
5
261,2
262,2
276,0
313,5
319,1
12,6
63
* Não significante (p > 0,
05)
** Significante (p < 0,05)
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105
Tabela 37
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose entre o grupo B após 1 semana
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo
2
-
7,6
*
Campo 3 vs. Campo 4
-
6,2
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
16
*
Campo 3 vs. Campo 5
-
6,4
*
Campo 1 vs. Campo 4
-
22,2
**
Campo 3 vs. Campo 6
-
1,6
*
Campo 1 vs. Campo 5
-
22,4
**
Campo 3 vs. Campo 7
8
*
Campo 1 vs. Campo 6
-
17,6
*
Campo 4 vs. Campo 5
-
0,2
*
Campo 1 vs. Campo 7
-
8
*
Campo 4 vs. Campo 6
4,6
*
Campo 2 vs. Campo 3
-
8,4
*
Campo 4 vs. Campo 7
14,2
*
Campo 2 vs. Campo 4
-
14,6
*
Campo 5 vs. Campo 6
4,8
*
Campo 2 vs. Campo 5
-
14,8
*
Campo 5 vs. Campo 7
14,4
*
Campo 2 vs. Campo 6
-
10
*
Campo 6 v
s. Campo 7
9,6
*
Campo 2 vs. Campo 7
-
0,4
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 38
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B após 2 semanas
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
207,0
220,9
281,6
360,0
435,4
6,8
34
0,00**
2
5
251,4
258,7
352,2
394,4
395,7
9,2
46
3
5
298,2
340,0
384,8
425,8
454,3
14,2
71
4
5
386,6
404,4
429,3
480,2
496,5
23,2
116
5
5
419,3
451,9
498,2
521,6
531,4
37,8
189
6
5,0
467,5
468,2
476,6
537,7
577,3
36,8
184
7
5,0
443,5
443,9
464,1
514,0
532,0
32,2
161
8
5,0
488,9
496,0
513,8
534,5
545,8
45,6
228
9
5,0
324,8
403,1
504,6
515,7
516,2
36,2
181
10
5,0
334,0
393,9
488,4
507,6
510,0
31,4
157
11
3,0
451,5
451,5
462,5
491,6
491,6
28,7
86
12
1,0
479,6
479,6
479,6
479,6
479,6
32,0
32
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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106
Tabela 39
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a profundidade da necrose entre o grupo B após 2 semanas
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Signi
ficância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo 2
-
2400,0
*
Campo 4 vs. Campo 8
-
22,40
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
7400,0
*
Campo 4 vs. Campo 9
-
13,00
*
Campo 1 vs. Campo 4
-
16,40
*
Campo 4 v
s. Campo 10
-
8,200
*
Campo 1 vs. Campo 5
-
31,00
*
Campo 4 vs. Campo 11
-
5,467
*
Campo 1 vs. Campo 6
-
30,00
*
Campo 4 vs. Campo 12
-
8,800
*
Campo 1 vs. Campo 7
-
25,40
*
Campo 5 vs. Campo 6
1,000
*
Campo 1 vs. C
ampo 8
-
38,80
**
Campo 5 vs. Campo 7
5,600
*
Campo 1 vs. Campo 9
-
29,40
*
Campo 5 vs. Campo 8
-
7,800
*
Campo 1 vs. Campo 10
-
24,60
*
Campo 5 vs. Campo 9
1,600
*
Campo 1 vs. Campo 11
-
21,87
*
Campo 5 vs. Campo 10
6,400
*
Campo 1 vs. Campo 12
-
25,20
*
Campo 5 vs. Campo 11
9,133
*
Campo 2 vs. Campo 3
-
5,000
*
Campo 5 vs. Campo 12
5,800
*
Campo 2 vs. Campo 4
-
14,00
*
Campo 6 vs. Campo 7
4,600
*
Campo 2 vs. Campo 5
-
28,60
*
Campo 6 vs. Campo 8
-
8,800
*
Campo 2 vs. Campo 6
-
27,60
*
Campo 6 vs. Campo 9
0,6000
*
Campo 2 vs. Campo 7
-
23,00
*
Campo 6 vs. Campo 10
5,400
*
Campo 2 vs. Campo 8
-
36,40
**
Campo 6 vs. Campo 11
8,133
*
Campo 2 vs. Campo 9
-
27,00
*
Campo 6 vs. Campo 12
4,800
*
Campo 2 vs. Campo 10
-
22,20
*
Campo 7 vs. Campo 8
-
13,40
*
Campo 2 vs. Campo 11
-
19,47
*
Campo 7 vs. Campo 9
-
4,000
*
Campo 2 vs. Campo 12
-
22,80
*
Campo
7 vs. Campo 10
0,8000
*
Campo 3 vs. Campo 4
-
9,000
*
Campo 7 vs. Campo 11
3,533
*
Campo 3 vs. Campo 5
-
23,60
*
Campo 7 vs. Campo 12
0,2000
*
Campo 3 vs. Campo 6
-
22,60
*
Campo 8 vs. Campo 9
9,400
*
Campo 3 vs
. Campo 7
-
18,00
*
Campo 8 vs. Campo 10
14,20
*
Campo 3 vs. Campo 8
-
31,40
*
Campo 8 vs. Campo 11
16,93
*
Campo 3 vs. Campo 9
-
22,00
*
Campo 8 vs. Campo 12
13,60
*
Campo 3 vs. Campo 10
-
17,20
*
Campo 9 vs. Camp
o 10
4,800
*
Campo 3 vs. Campo 11
-
14,47
*
Campo 9 vs. Campo 11
7,533
*
Campo 3 vs. Campo 12
-
17,80
*
Campo 9 vs. Campo 12
4,200
*
Campo 4 vs. Campo 5
-
14,60
*
Campo 10 vs. Campo 11
2,733
*
Campo 4 vs. Campo 6
-
13,60
*
Campo 10 vs. Campo 12
-
0,6000
*
Campo 4 vs. Campo 7
-
9,000
*
Campo 11 vs. Campo 12
-
3,333
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Comparando
-
se, entre as semanas experimentais, os grupos do presente estudo,
observou
-
se que existe uma correlação positiva, estatisticamente significante entre todos os
grupos (tabelas 40 –
45).
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107
Tabela 40
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B entre 1 e 2 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
136,2
151,9
183,7
204,0
204,8
3
15
0,01**
B2
5
347,5
348,5
399,6
436,1
457,1
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 41
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grup
o B entre 1 e 4 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
136,2
151,9
183,7
204,0
204,8
7
35
0,01**
B4
4
18,1
20,5
28,1
35,9
38,5
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 42
-
Teste de Krusk
al
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B entre 1 e 12 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
136,2
151,9
183,7
204,0
204,8
7
35
0,01**
B12
4
9,7
9,7
10,0
14,6
16,1
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
*
* Significante (p < 0,05)
Tabela 43
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B entre 2 e 4 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B2
5
347,5
348,5
399,6
436,1
457,1
7
35
0,01**
B4
4
18,1
20,5
28,1
35,9
38,5
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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108
Tabela 44
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B entre 2 e 12 semanas
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B2
5
347,5
348,5
399,6
436,1
457,1
7
35
0,01**
B12
4
9,7
9,7
10,0
14,6
16,1
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 45
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre o grupo B entre 4 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q
1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B4
4
18,1
20,5
28,1
35,9
38,5
6,5
26
0,02**
B12
4
9,7
9,7
10,0
14,6
16,1
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.2.3 Necrose de osteócitos
Para avaliar
-
se a necrose de osteóci
tos das amostras, utilizou
-
se o mesmo método
matemático descrito no item 6.3.1.3.
A análise dos campos histológicos em cada semana experimental evidenciou a
necrose de osteócitos como sendo significativa somente para os grupos de uma e duas
semanas (tabel
as 46
–
49). Contudo, quando se realizou análise comparativa entre os
grupos, o único pareamento que não foi estatisticamente positivo foi o realizado entre B4 e
B12, sendo que, para os demais, diferença significativa foi encontrada (tabelas 50 –
54).
Tab
ela 46
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B após 1 semana
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
0,08
0,08
0,09
0,13
0,13
3,0
15
0,00**
2
5
0,14
0,17
0,22
0,26
0,29
10,8
54
3
5
0,32
0,37
0,45
0,74
0,84
24,0
120
4
5
0,43
0,45
0,52
0,74
0,95
27,0
135
5
5
0,37
0,41
0,49
0,73
0,80
26,0
130
6
5
0,39
0,41
0,48
0,67
0,72
24,8
124
7
5
0,17
0,17
0,18
0,27
0,33
10,4
52
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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109
Tabela 47
-
Post
-
hoc t
este de Dunn para necrose de osteócitos entre o grupo B após 1 semana
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo 2
-
7,8
*
Campo 3 vs. Campo 4
-
3,0
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
21,0
**
Campo 3 vs. Campo 5
-
2,0
*
Campo 1 vs. Campo 4
-
24,0
**
Campo 3 vs. Campo 6
-
0,8
*
Campo 1 vs. Campo 5
-
23,0
**
Campo 3 vs. Campo 7
13,6
*
Campo 1 vs. Campo 6
-
21,8
**
Campo 4 vs. Campo 5
1,0
*
Campo 1 vs. Campo 7
-
7,4
*
Campo 4 vs. Campo 6
2,2
*
Campo 2 vs. Campo 3
-
13,2
*
Campo 4 vs. Campo 7
16,6
*
Campo 2 vs. Campo 4
-
16,2
*
Campo 5 vs. Campo 6
1,2
*
Campo 2 vs. Campo 5
-
15,2
*
Campo 5 vs. Campo 7
15,6
*
Campo 2 vs. Campo 6
-
14,0
*
Campo 6 vs. Campo 7
14,4
*
Campo 2 vs. Campo 7
0,4
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 48
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B após 2 semanas.
Campo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
1
5
0,24
0,25
0,37
0,46
0,47
6,6
33
0,00**
2
5
0,36
0,44
0,56
0,60
0,61
15,2
76
3
5
0,41
0,49
0,58
0,65
0,67
19,8
99
4
5
0,59
0,61
0,67
0,78
0,87
32,2
161
5
5
0,69
0,70
0,75
0,83
0,83
41,6
208
6
5,0
0,65
0,71
0,82
0,86
0,86
43,4
217
7
5,0
0,42
0,57
0,74
0,79
0,79
34,8
174
8
5,0
0,59
0,64
0,69
0,85
0,85
37,2
186
9
5,0
0,39
0,50
0,69
0,78
0,78
29,6
148
10
5,0
0,40
0,45
0,67
0,77
0,86
27,0
135
11
3,0
0,44
0,44
0,45
0,62
0,62
15,0
45
12
1,0
0,30
0,30
0,30
0,30
0,30
3,0
3
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p
< 0,05)
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110
Tabela 49
-
Post
-
hoc teste de Dunn para necrose de osteócitos entre o grupo B após 2 semanas
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
Campo 1 vs. Campo 2
-
8,6
*
Campo 4 vs. Campo
8
-
5,0
*
Campo 1 vs. Campo 3
-
13,2
*
Campo 4 vs. Campo 9
2,6
*
Campo 1 vs. Campo 4
-
25,6
*
Campo 4 vs. Campo 10
5,2
*
Campo 1 vs. Campo 5
-
35,0
**
Campo 4 vs. Campo 11
17,2
*
Campo 1 vs. Campo 6
-
36,8
**
Campo 4 vs. Campo 12
29,2
*
Campo 1 vs. Campo
7
-
28,2
*
Campo 5 vs. Campo 6
-
1,8
*
Campo 1 vs. Campo 8
-
30,6
*
Campo 5 vs. Campo 7
6,8
*
Campo 1 vs. Campo 9
-
23,0
*
Campo 5 vs. Campo 8
4,4
*
Campo 1 vs. Campo 10
-
20,4
*
Campo 5 vs. Campo 9
12,0
*
Campo 1 vs. Campo 11
-
8,4
*
Campo 5 vs. Campo 10
14,6
*
Campo 1 vs. Campo 12
3,6
*
Campo 5 vs. Campo 11
26,6
*
Campo 2 vs. Campo 3
-
4,6
*
Campo 5 vs. Campo 12
38,6
*
Campo 2 vs. Campo 4
-
17,0
*
Campo 6 vs. Campo 7
8,6
*
Campo 2 vs. Campo 5
-
26,4
*
Campo 6 vs. Campo 8
6,2
*
Campo 2 vs. Campo 6
-
28,2
*
Campo 6 vs. Campo 9
13,8
*
Campo 2 vs. Campo 7
-
19,6
*
Campo 6 vs. Campo 10
16,4
*
Campo 2 vs. Campo 8
-
22,0
*
Campo 6 vs. Campo 11
28,4
*
Campo 2 vs. Campo 9
-
14,4
*
Campo 6 vs. Campo 12
40,4
*
Campo 2 vs. Campo 10
-
11,8
*
Campo 7 vs. Campo 8
-
2,4
*
Campo 2 vs. Campo 11
0,2
*
Campo 7 vs. Campo 9
5,2
*
Campo 2 vs. Campo 12
12,2
*
Campo 7 vs. Campo 10
7,8
*
Campo 3 vs. Campo 4
-
12,4
*
Campo 7 vs. Campo 11
19,8
*
Campo 3 vs. Campo 5
-
21,8
*
Campo 7 vs. Campo 12
31,8
*
Campo 3 vs. Campo 6
-
23,6
*
Camp
o 8 vs. Campo 9
7,6
*
Campo 3 vs. Campo 7
-
15,0
*
Campo 8 vs. Campo 10
10,2
*
Campo 3 vs. Campo 8
-
17,4
*
Campo 8 vs. Campo 11
22,2
*
Campo 3 vs. Campo 9
-
9,8
*
Campo 8 vs. Campo 12
34,2
*
Campo 3 vs. Campo 10
-
7,2
*
Campo 9 vs. Campo 10
2,6
*
Campo 3
vs. Campo 11
4,8
*
Campo 9 vs. Campo 11
14,6
*
Campo 3 vs. Campo 12
16,8
*
Campo 9 vs. Campo 12
26,6
*
Campo 4 vs. Campo 5
-
9,4
*
Campo 10 vs. Campo 11
12,0
*
Campo 4 vs. Campo 6
-
11,2
*
Campo 10 vs. Campo 12
24,0
*
Campo 4 vs. Campo 7
-
2,6
*
Campo 11
vs. Campo 12
12,0
*
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111
Tabela 50
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B entre 1 e 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
0,19
0,19
0,22
0,27
0,30
3
15
0,01**
B2
5
0,46
0,49
0,58
0,63
0,64
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 51
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B entre 1 e 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
0,19
0,19
0,22
0,27
0,30
7
35
0,01**
B4
4
0,02
0,02
0,03
0,04
0,04
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 52
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B entre 1 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
0,19
0,19
0,22
0,27
0,30
7
35
0,01**
B12
4
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 53
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o grupo B entre 2 e 4 sema
nas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B2
5
0,46
0,49
0,58
0,63
0,64
7
35
0,01**
B4
4
0,02
0,02
0,03
0,04
0,04
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 54
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose
de osteócitos entre o grupo B entre 2 e 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B2
5
0,46
0,49
0,58
0,63
0,64
7
35
0,01**
B12
4
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
2,5
10
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.2.4 Necrose de canais vasculares
Para avaliar
-
se a necrose de canais vasculares das amostras, utilizou
-
se o mesmo
método matemático descrito no item 6.3.1.4.
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112
Os dados obtidos dos grupos entre si, incluindo o controle, mostraram significância
estatíst
ica. Esta foi demonstrada apenas entre os grupos B2 e B12, e entre o grupo B2 e o
grupo controle (tabelas 55 e 56).
Tabela 55
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre o grupo B.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
0,28
0,29
0,37
0,47
0,54
16,0
80,0
B2
5
0,60
0,61
0,63
0,69
0,71
21,0
105,0
B4
4
0,03
0,04
0,06
0,07
0,07
11,3
45,0
0,00**
B12
4
0,00
0,00
0,00
0,04
0,06
5,9
23,5
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,5
22,5
* Não significan
te (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 56
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre o grupo B.
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
B1 vs B2
-
5
*
B2 vs B12
14,88
**
B1 vs B4
5
*
B2 vs Controle
16,5
**
B1 vs B12
9,875
*
B4 vs B12
4,875
*
B1 vs Controle
11,5
*
B4 vs Controle
6,5
*
B2 vs B4
10
*
B12 vs Controle
1,625
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.2.5 Grau histológico de inflamação medular
Baseado em escores crescentes de severidade de inflamação medular, pré
-
determinados na metodologia do presente trabalho (0, 1, 2 e 3), realizou
-
se um estudo
comparativo entre as diferentes semanas de sacrifício (tabela 57).
Verificou
-
se diferença
significativa apenas entre o grupo B2 e o controle (tabela 58).
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113
Tabela 57
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular entre o grupo B.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
B1
5
0,00
0,00
0,00
2,00
2,00
10,3
51,5
B2
5
1,00
1,50
2,00
2,00
2,00
17,5
87,5
B4
4
1,00
1,00
1,00
1,75
2,00
13,4
53,5
0,02**
B12
4
1,00
1,00
1,50
2,00
2,00
15,3
61,0
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
4,5
22,5
* Não significante (p > 0,05)
** Significa
nte (p < 0,05)
Tabela 58
-
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular entre o grupo B.
Comparações
Diferença na
somas do
Ranks
Significância
Comparações
Diferença na
soma dos
Ranks
Significância
B1 vs B2
-
7,2
*
B2 vs B12
2,3
*
B1 vs B4
-
3,1
*
B2 vs Controle
13,0
**
B1 vs B12
-
5,0
*
B4 vs B12
-
1,9
*
B1 vs Controle
5,8
*
B4 vs Controle
8,9
*
B2 vs B4
4,1
*
B12 vs Controle
10,8
*
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.3 Protocolo de 1 minuto (grupo A
) vs
2 minutos (grupo B
)
6.3.3.1 Extensão
Observou
-
se, ao compararem
-
se as semanas de sacrifício entre o grupo A e o grupo
B, significância estatística para a segunda (A2xB2) e décima segunda (A12xB12) semanas
de sacrifício (tabela 59 e 60). Tal achado pode ser
visto na figura 58.
Tabela 59
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre os grupos A e B após 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
1128,2
1134,2
1143,7
1164,4
1167,4
8
40
0,01**
B2
5
1060,9
1061,9
1072,6
1093,8
1094,7
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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114
Tabela 60
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a extensão da necrose entre os grupos após 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A12
4
901,4
904,1
921,6
934,6
935,7
2,5
10
0,02**
B12
4
1110,5
1111,6
1120,9
1127,1
1127,2
6,5
26
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
Extensão
Semanas
A
B
Extensão
Semanas
A
B
Figura 58
-
Gráfico representativo da evolução média da extensão e
m relação às semanas de avaliação.
Nota: Cada ponto de deflexão representa a média, e o traço vertical sobre o mesmo representa a dispersão ou
erro.
6.3.3.2 Profundidade
As comparações das medidas de profundidade média de necrose entre as semanas
equi
valentes dos grupos A e B mostraram diferença estatística significante para todas elas
(tabelas 61 – 64), sendo espacialmente observadas na figura 59.
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115
Tabela 61
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos após 1 semana.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
33,1
36,1
40,8
48,1
50,2
3
15
0,01**
B1
5
136,2
151,9
183,7
204,0
204,8
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 62
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da
necrose entre os grupos após 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
35,0
41,7
50,7
64,1
69,3
3
15
0,01**
B2
5
347,5
348,5
399,6
436,1
457,1
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 63
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos após 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
7,8
7,9
8,6
9,2
9,4
3
15
0,01**
B4
4
18,1
20,5
28,1
35,9
38,5
7,5
30
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 64
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a profundidade da necrose entre os grupos após 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A12
4
5,1
5,2
5,9
6,5
6,6
2,5
10
0,02**
B12
4
9,7
9,7
10,0
14,6
16,1
6,5
26
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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116
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0
100
200
300
400
500
600
Produndidade
Semanas
A
B
Produndidade
Semanas
A
B
Produndidade
Semanas
A
B
Figura 59
-
Gráfico representativo da evolução média da profundidade em relação às semanas de avaliação.
Nota: Cada ponto de deflexão representa
a média, e o traço vertical sobre o mesmo representa a dispersão ou
erro.
6.3.3.3 Necrose de osteócitos
A análise comparativa dos dados referentes a necrose de osteócitos entre as
respectivas semanas de avaliação dos grupos A e B mostrou que, em toda
s as combinações,
ocorreu concordância dos dados com diferença estatística significante (tabelas 65
–
68),
observável, também, na figura 60.
Tabela 65
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre os grupos A e B após 1 semana.
Grupo
N
Mín,
Q
1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,05
0,05
0,06
0,07
0,08
3
15
0,01**
B1
5
0,19
0,19
0,22
0,27
0,30
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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117
Tabela 66
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre o
s grupos A e B após 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
0,07
0,09
0,11
0,12
0,13
3
15
0,01**
B2
5
0,46
0,49
0,58
0,63
0,64
8
40
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 67
-
Teste de Krus
kal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre os grupos A e B após 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
3,2
16
0,03**
B4
4
0,02
0,02
0,03
0,04
0,04
7,25
29
* Não significante (p > 0,05)
** S
ignificante (p < 0,05)
Tabela 68
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para necrose de osteócitos entre os grupos A e B após 12 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A12
4
0,01
0,01
0,01
0,01
0,01
2,5
10
0,02**
B12
4
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
6,5
26
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Osteócitos
Semanas
A
B
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118
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Osteócitos
Semanas
A
B
Figura 60
-
Gráfico representativo da evolução média da necrose de osteócitos em relação às semanas de
avaliação.
Nota: Cada ponto de defle
xão representa a média, e o traço vertical sobre o mesmo representa a dispersão ou
erro.
6.3.3.4 Necrose de canais vasculares
Baseando
-
se nas combinações entre as semanas do grupo A e as análogas do grupo
B, observou
-
se que os testes estatísticos demon
straram significância para quase todos os
pareamentos com o grupo controle (tabela 69
–
73), com exceção, apenas, dos animais de
última semana de estudo (A12xB12). Todavia, ao realizar
-
se o teste de Dunn, constatou
-
se
diferença significativa apenas entre o grupos B (1, 2 e 4 semanas) e controle.
Tabela 69
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre os grupos de 1 semana.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A1
5
0,04
0,05
0,06
0,21
0,34
8,4
42
0,00**
B1
5
0,28
0,29
0,37
0,47
0,54
12,6
63
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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119
Tabela 70
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os grupos de 1 semana.
Comparaçõ
es
Diferença na
somas do Ranks
Significância
A1 vs. B1
-
4,2
*
A1 vs. Controle
5,4
*
B1 vs. Controle
9,6
**
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 71
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre os
grupos de 2 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
0,0
0,1
0,2
0,3
0,3
8
40
0,00**
B2
5
0,6
0,6
0,6
0,7
0,7
13
65
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 72
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os grupos de 2 semanas.
Comparações
Diferença na
somas do Ranks
Significância
A2 vs. B2
-
5
*
A2 vs. Controle
5
*
B2 vs. Controle
10
**
* Não significante (p > 0,05)
** S
ignificante (p < 0,05)
Tabela 73
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para a média dos canais vazios necrosados entre os grupos de 4 semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A4
5
0,0
0,0
0,0
0,0
0,1
8,8
44
0,01**
B4
4
0,0
0,0
0,1
0,1
0,1
11,5
46
Controle
5
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
3
15
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 74
-
Post
-
hoc teste de Dunn para a média dos canais vazios necrosados entre os grupos de 4 semanas.
Comparações
Diferença na
somas do Ra
nks
Significância
A4 vs. B4
-
2,5
*
A4 vs. Controle
5,9
*
B4 vs. Controle
8,4
**
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120
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
6.3.3.5 Grau histológico de inflamação medular
Ao se realizar o estudo comparativo entre os grupos, incluindo o controle, observou
-
se que, embora o teste de Kruksal
-
Wallis tenha acusado diferença significante, na verdade,
apenas constatou
-
se real diferença entre o grupo B (2, 4 e 12 semanas) e o controle, ao
utilizar
-
se o post
-
hoc teste de Dunn (tabelas 75 –
80).
T
abela 75
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular entre os grupos de 2
semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A2
5
0
0
1
2
2
7,8
39
0,01**
B2
5
1
2
2
2
2
12,2
61
Controle
5
0
0
0
0
0
4
20
*
Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 76
-
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular entre os grupos de 2
semanas.
Comparações
Diferença na
somas do Ranks
Significância
A2 vs. B2
-
1,9
*
A2 vs. Contro
le
5,3
*
B2 vs. Controle
7,2
**
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 77
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico de inflamação medular entre os grupos de 4
semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma d
os
Ranks
p
A4
5
0
0
1
1
1
7,9
39,5
0,01**
B4
4
1
1
1
2
2
11,4
45,5
Controle
5
0
0
0
0
0
4,0
20,0
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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121
Tabela 78
-
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular entre os grupo
s de 4
semanas.
Comparações
Diferença na
somas do Ranks
Significância
A4 vs. B4
-
0,9
*
A4 vs. Controle
5,5
*
B4 vs. Controle
6,4
**
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
Tabela 79
-
Teste de Kruskal
-
Wallis para o grau histológico
de inflamação medular entre os grupos de 12
semanas.
Grupo
N
Mín,
Q1
Mediana
Q3
Máx,
Rank
Médio
Soma dos
Ranks
p
A12
4
1
1
1
1
1
8,5
34,0
0,00**
B12
4
1
1
2
2
2
10,5
42,0
Controle
5
0
0
0
0
0
3,0
15,0
* Não significante (p > 0,05)
** Significante (p
< 0,05)
Tabela 80
-
Post
-
hoc teste de Dunn para o grau histológico de inflamação medular entre os grupos de 12
semanas.
Comparações
Diferença na
somas do Ranks
Significância
A12 vs. B12
-
2,0
*
A12 vs. Controle
5,5
*
B12 vs. Controle
7,5
**
* Não signi
ficante (p > 0,05)
** Significante (p < 0,05)
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122
7 DISCUSSÃO
O complexo facial maxilo
-
mandibular é sede para uma variedade de lesões
benignas, muitas apresentando comportamento biológico agressivo e alto potencial de
recorrência, tais como ameloblastomas,
ceratocistos, mixomas odontogênicos e lesões
centrais de células gigantes (CERQUEIRA, SANT’ANA FILHO, 2001). O manejo ideal
para tais condições seria o que proporcionasse além da completa exérese lesional, o menor
comprometimento funcional e estético ao p
aciente. A efetividade da criocirurgia como
modalidade terapêutica reflete
-
se nos baixos índices de recorrência observados por
diferentes autores (MORONI
et al.,
1982; WEBB, BROCKBANK, 1984; SALMASSY,
POGREL, 1995; SCHMIDT, POGREL, 2004).
Desenvolvemos e u
tilizamos um modelo experimental de fêmures de ratos,
objetivando realizar estudos comparativos para extrapolar o uso clínico da crioterapia em
patologias ósseas dos maxilares, em virtude de apoio por parte de estudos morfo
-
funcionais
filogenéticos. Dentro
desse contexto, sabe
-
se que o emprego de modelos animais para
estudos em Odontologia têm viabilizado a análise de alguns aspectos da arquitetura óssea
que dificilmente seriam estudados em humanos. Em diversos estudos, o rato é comumente
empregado por apre
sentar algumas vantagens em relação a outros animais. Dentre estas,
pode
-
se salientar o baixo custo, facilidade de manipulação, manutenção em condições
ambientais e sanitárias controladas e possibilidade de se realizar estudos em animais com
imunodeficiênc
ias (HELLER; NANDA, 1979). Além disso, segundo NAJJAR, KAHN
(1977), ossos longos, como fêmur e tíbia, apresentam reparo e remodelação semelhantes à
mandíbula. Embora esses dois ossos apresentem origens embriológicas distintas, a
similaridade no processo de
reparo deve
-
se às forças fisiológicas a que ambos estão
submetidos: tensão muscular e compressão pelo peso do corpo no osso longo dos membros
inferiores e tensão muscular e compressão pela mastigação na mandíbula.
Optamos em utilizar testes não
-
paramétri
cos devido ao fato de que, para estes, não
há necessidade em assumir uma distribuição de probabilidade para as populações, já que
algumas amostras do presente estudo não foram consideradas normais, mediante o teste de
normalidade de
Kolmogorov
-
Smirnov
. Em
adição, para os dados aqui analisados, a
mediana, estatística utilizada pelos testes não paramétricos, apresenta uma interpretação
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123
mais coerente do que a média. Ainda, os métodos não paramétricos não fazem suposições
acerca da distribuição de onde se origi
nam os dados, baseando
-
se apenas na ordem (
rank
)
dos mesmos.
Seguindo
-
se a padronização da metodologia do presente modelo criocirúrgico,
decidimos pelo uso do sistema de sonda fechada, por permitir melhor controle acerca da
quantidade de tecido a ser afetado. O nitrogênio líquido pode ser utilizado, principalmente,
através de hastes plásticas recobertas com pontas de algodão ou, ainda, por meio do sistema
de sonda aberta (spray).
Descartamos a possibilidade de utilização do sistema de hastes flexíveis com
pontas
de algodão apoiando
-
se em trabalhos na literatura, como o de FARAH, SAVAGE (2006).
Segundo estes autores, em decorrência da perda de nitrogênio líquido pela rápida
evaporação a partir da ponta de algodão, seriam necessárias inúmeras aplicações no te
cido.
Em adição, tal sistema apresenta indicações restritas à cavidade bucal, principalmente para
lesões de tecido mole, bem localizadas, não tendo seu uso sendo descrito para lesões ósseas
dos maxilares, provavelmente pelas desvantagens sobressaírem
-
se so
bre os benefícios de
seu uso, bem como pelo fato de muitas lesões apresentarem comportamento agressivo e
infiltrativo. Portanto, ao escolhermos um modelo experimental
in vivo
em tecido ósseo
resolvemos não basear nosso estudo com esse sistema de aplicação.
MARCOVE
et al.
(1973) descreveram o uso de nitrogênio líquido na forma de
spray, a temperaturas próximas de
-
198
0
C, dentro de cavidades cirúrgicas em ossos longos
após remoção de tumores de células gigantes. Tais autores demonstraram a grande potência
de
sse método, entretanto, alertaram quanto à dificuldade do seu manejo em lesões que
acometessem maxila e/ou mandíbula. Embora diversos trabalhos advoguem o uso do
spray
de nitrogênio líquido para lesões ósseas maxilo
-
mandibulares, autores afirmam que tais
s
istemas abertos podem, caso não haja uma adequada proteção dos tecidos moles
adjacentes à área a ser tratada, ocasionar severos danos a tais tecidos, modificando a
resposta de reparo local (BRADLEY, 1978). Em virtude dessas observações, realizamos a
técnic
a cirúrgica experimental, tendo
-
se o cuidado na salvaguarda dos tecidos moles,
completamente dissecados e rebatidos, através do uso de afastadores teciduais apoiados em
osso sadio.
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124
Segundo BRADLEY (1978), o tecido ósseo pode ser adequadamente congelado
atr
avés de sondas fechadas. Para estes autores, o nitrogênio líquido aplicado com esse
sistema apresenta a grande vantagem, sobre os mesmos métodos que usam óxido nitroso
líquido como criógeno, de alcançar temperaturas mais baixas. Com base nesse aspecto,
vár
ios estudos em animais foram realizados utilizando
-
se o sistema fechado para fins
específicos: BRADLEY, FISHER em 1975 (análise histológica dos efeitos da criocirurgia
em mandíbula de ratos); FISHER, WILLIAMS, BRADLEY em 1978 (efeito da criocirurgia
sobre
a resistência óssea em mandíbulas de ratos); BRADLEY em 1978 (alterações
histológicas decorrentes da crioterapia em mandíbulas de porco); KUYLENSTIERNA,
LUNDQUIST, NATHANSON em 1980 (destruição e regeneração de mandíbulas de
coelhos após a aplicação criogê
nica); KEIJSER
et al.
, em 1999 (estudo experimental de
necrose e revitalização de ossos longos em coelhos); e POPKEN
et al.
, em 2003 (estudo
termográfico da criocirurgia em fêmures de carneiros). Dessa forma, e especialmente em
virtude de um maior controle
sobre a temperatura no tecido
-
alvo, bem como da área a ser
atingida pelo criógeno, o sistema fechado (“
closed probe
”) mostrou
-
se apropriado para ser
utilizado em nossa pesquisa.
Além da escolha do método de aplicação criocirúrgico (aberto ou fechado), c
omo
descrito anteriormente, observou
-
se na literatura revisada, ainda, ausência de padronização
quanto ao criógeno utilizado, quanto ao tempo de aplicação deste, bem como quanto ao
número de aplicações e tempo de intervalo entre as mesmas (curto ou rápido)
. Ao contrário,
observam
-
se em diversas metodologias, principalmente aquelas para estudo ou
aplicabilidade clínica em cavidade oral, que as mesmas têm sido baseadas em experiências
clínicas dos autores (CHAPIN, 1976; POGREL, 1993). Em nossa metodologia uti
lizamos o
nitrogênio líquido como criógeno de escolha, realizamos três ciclos de aplicação deste e
adotamos um período de cinco minutos entre cada ciclo, variando apenas o tempo de
aplicação (protocolo “A” de um minuto e protocolo “B” de dois minutos).
Em
bora estudos experimentais em mandíbulas de ratos, como o de FISHER,
WILLIAMS, BRADLEY (1978), tenham utilizado o óxido nitroso em estado líquido como
agente crioterápico, para a realização do presente estudo utilizamos o nitrogênio líquido em
virtude, principalmente, das baixas temperaturas que este alcança na extremidade da sonda
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125
aplicadora (YEH, 2000), superior às alcançadas pelo óxido nitroso, como apontado por
BRADLEY em 1978.
Invariavelmente ao protocolo de tempo de aplicação que seguimos, padroniza
mos
uma quantidade de três ciclos em virtude de estudos em animais mostrarem que, quando
um tecido é submetido a um estado de resfriamento a temperaturas que permitam a
ocorrência do fenômeno de recristalização, o dano celular é incrementado. Além disso, a
repetição dos ciclos ocasiona um efeito tecidual mais significativo, em virtude das células
ficarem sujeitas a alterações mais nocivas e acumulativas, sejam elas físicas e/ou químicas.
Dessa maneira, os efeitos deletérios sobre as células e seus constitui
ntes no primeiro ciclo
de congelamento podem ser responsáveis pelo aumento da transmissão térmica nos ciclos
subseqüentes (THEODORESCU, 2004). Estudo conduzido por POPKEN
et al.
(2003),
utilizando fêmures de carneiros adultos em protocolos criocirúrgicos d
istintos, sendo um
composto por dois ciclos de 15 minutos de aplicação e o outro por três ciclos de 15
minutos, demonstrou que tanto a temperatura diminuiu drasticamente e rapidamente para
cada ciclo adicional, como a necrose se tornou mais pronunciada no
protocolo de três
aplicações.
Da mesma maneira, adotamos o período lento de descongelamento, pós
-
crioaplicação, por constatarmos na literatura que um tempo de cinco minutos é suficiente e
importante para o efeito lesivo tecidual, como referido por VETH
et
al
. (2005). De acordo
com GAGE, BAUST (1998) um período inter
-
aplicações lento favorece que os cristais de
gelo cresçam, aumentem de volume significativamente, promovendo tanto dano mecânico
como osmótico.
Estudos experimentais utilizando
-
se de animais de médio e grande porte, como
coelhos e carneiros, respectivamente, apresentam geralmente tempos maiores de aplicação
do agente criocirúrgico (EMMINGS
et al.
, 1966; BRADLEY, 1978; KEIJSER et al.
, 1999;
POPK
EN
et al
., 2003). EMMINGS
et al.
(1966) realizaram uma pesquisa em cães,
utilizando nitrogênio líquido com ciclos de 15 minutos para cada aplicação. Utilizando
-
se
de fêmures de coelhos adultos, KEIJSER
et al.
(1999) estudaram os efeitos da terapia com
nitr
ogênio líquido ao se aplicarem três ciclos de congelamento de 20 minutos. Ao contrário,
embora trabalhando em coelhos, KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON
(1980) realizaram ciclos com três minutos para cada aplicação. Já FISHER, WILLIAMS,
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126
BRALEY (1978) apl
icaram ciclos consecutivos de dois minutos em mandíbulas de ratos.
Dessa forma, definimos em nossa pesquisa que um dos grupos de fêmures de ratos seria
exposto ao tempo máximo de dois minutos para cada aplicação e que o outro grupo seria
submetido apenas a
um minuto de aplicação.
Histologicamente verificou
-
se uma fase necrótica logo na primeira semana após a
aplicação do criógeno, como observado nos estudos em mandíbulas de ratos realizados por
BRADLEY, FISHER (1975) e BRADLEY (1978). Corroborando com a an
álise descritiva
realizada por estes autores, nosso estudo identificou uma faixa superficial, em ambos os
protocolos de aplicação, de perda de osteócitos, com conseqüente formação de lacunas
vazias. Além disso, poucos canais nutrientes degenerados foram en
contrados e a cavidade
medular encontrou
-
se preservada no protocolo de um minuto e com inflamação mínima e
áreas de formação irregulares de osso novo no protocolo de dois minutos. Ao contrário das
nossas constatações, POPKEN
et al.
(2003) descreveram, na p
rimeira semana do seu
estudo, necrose total de cortical óssea, embora tenham adotado uma metodologia com
aplicações de 15 minutos em fêmures de carneiros. EMMINGS
et al
. (1966), além de
demonstrarem completa necrose de cortical óssea nos primeiros sete dia
s, encontraram
infiltrado de células inflamatórias mínimo e área de neoformação óssea em cavidade
medular, como observado no nosso protocolo de dois minutos. Entretanto, a necrose óssea
exuberante relatada por estes autores provavelmente deveu
-
se ao fato d
e os mesmos terem
adotado, também, um protocolo de aplicação com 15 minutos de duração para cada
aplicação.
Avaliando
-
se microscopicamente os fêmures dos animais na segunda semana
posterior à crioterapia, verificamos um aumento na necrose óssea em ambos
os protocolos
do estudo. Particularmente, os grupos submetidos a aplicações de dois minutos
experimentaram completa necrose de cortical óssea em diversos campos histológicos
avaliados. Similarmente, KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON (1980)
observaram des
vitalização completa de cortical mandibular de coelhos após duas semanas
de aplicação de nitrogênio líquido por três minutos cada. Em adição, não identificamos
áreas de deposição de osso novo na cortical óssea de ambos os protocolos crioterápicos,
diferent
emente do que observado por KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON
(1980). Em relação à cavidade medular, observou
-
se infiltrado inflamatório variando entre
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127
leve (protocolo de um minuto) a moderado (protocolo de dois minutos), com áreas de
deposição de osso n
eoformado, quando instituído o protocolo de dois minutos. Tal fase
osteogênica foi marcadamente encontrada no tecido medular mandibular de coelhos
estudados por KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON (1980).
Após quatro semanas, a cortical óssea demonstrou uma significante fase osteogênica
em cortical óssea. Esta foi caracterizada pela redução do número de lacunas destituídas de
osteócitos e aumento do número de osteócitos e canais vasculares íntegros,
comparativamente com a segunda semana. Em adição, o córtex femural apresentou áreas de
deposição de osso neoformado, sendo mais pronunciado no protocolo de dois minutos de
aplicação. Estes achados estão de acordo com os experimentos realizados por BRADLEY
(1978) e KEIJSER
et al.
(1999). Deposição de material oste
óide, bem como infiltrado
inflamatório leve (protocolo um minuto) a moderado (protocolo dois minutos), na cavidade
medular também foi notificada por nós, assim como por KEIJSER
et al.
(1999) em osso
longos de coelhos.
Finalizando o período de observações morfológicas, os grupos na 12
a
semana foram
os que apresentaram a menor quantidade de células necróticas, principalmente no protocolo
de aplicações de um minuto cada, onde uma pequena faixa de lacunas vazias superficiais
foi demarcada. Corroborando com os a
chados microscópicos de BRADLEY, FISHER
(1975), em ambas as metodologias de aplicação do presente trabalho, a cortical óssea era
composta por uma matriz ricamente celular e vascularizada, caracterizando essa semana
como a de máxima vascularização. Em adiçã
o, a fase osteogênica mostrou
-
se mais
consistente, especialmente no protocolo de dois minutos, onde, em diversas áreas,
verificou
-
se a formação de osso lamelar e maduro, assim como reportado por KEIJSER
et
al.
(1999). Interessantemente, a cavidade medular,
no protocolo de dois minutos,
apresentou um consistente padrão de substituição fibro
-
adiposa, com o tecido ósseo
anteriormente formado mais compacto e osteócitos mais diferenciados, configurando uma
possível fase de remodelação óssea. Tal achado é sustent
ado por KUYLENSTIERNA,
LUNDQUIST, NATHANSON (1980).
A presente pesquisa, além de desenvolver e propor um novo modelo para estudo
histomorfológico dos efeitos da crioterapia em ossos longos de ratos, representou o
primeiro trabalho, segundo ampla revista da literatura, onde parâmetros histomorfométricos
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128
foram considerados para se avaliar a resposta tecidual à criocirurgia. Optamos, para tanto,
pelo uso do
software
Image J por se tratar de um programa de domínio público, com livre
acesso na rede mundial de internet, relativa simplicidade de execução, além de ser utilizado
com outros propósitos em odontologia como reportado por DEMURBAS et al
. (2008).
Em relação às variáveis histomorfométricas, observamos que a quantificação da
extensão da desvitalização óssea
, da necrose de osteócitos e de canais vasculares, além da
profundidade de necrose, representou uma importante ferramenta de avaliação dos efeitos
do nitrogênio líquido sobre fêmures de ratos.
Ao analisarmos a extensão do processo de osteonecrose nos anima
is submetidos ao
protocolo de três aplicações de nitrogênio líquido com um minuto cada, não observamos
diferença significativa nos valores médios entre os campos histológicos dos animais
pertencentes à mesma semana de avaliação. Entretanto, comparando
-
se a
s semanas entre si,
verificou
-
se que praticamente todos os possíveis pareamentos apresentaram diferença
estatística significante, com exceção, apenas, da primeira semana em relação à quarta. Em
adição, a segunda semana apresentou o maior valor médio total
de extensão.
A média da extensão dos campos histológicos entre os animais da mesma semana
de sacrifício do protocolo de dois minutos por aplicação, diferentemente do observado no
protocolo anterior, mostrou que somente a segunda semana apresentou diferença
significativa entre os valores. Similarmente, a segunda semana obteve o valor médio
máximo em relação a todos os grupos, mas significativamente diferente apenas da primeira
semana de avaliação.
Confrontando
-
se os protocolos de aplicação de nitrogênio líqu
ido, verificamos que
há uma aparente homogeneidade no valor médio de extensão de necrose entre as semanas,
com poucos pareamentos acusando diferença estatística significante, apenas para a segunda
e décima segunda semanas.
Outro parâmetro importante, e qu
e reflete a análise descritiva das alterações
morfológicas resultantes da crioterapia, é a porcentagem de osteócitos necrosados.
Observou
-
se que no protocolo de um minuto a segunda semana apresentou a maior
diferença com significância estatística em relaçã
o às demais semanas. O mesmo foi
observado no outro protocolo experimental. Ao se observar ambos os protocolos,
conjuntamente, a segunda semana do protocolo de dois minutos apresentou
-
se com média
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129
significativamente maior do que a segunda semana do protoco
lo de um minuto,
representando, portanto, o pico máximo de necrose de osteócitos do presente estudo.
Além da quantificação da necrose de osteócitos, a desvitalização dos canais
vasculares também mostrou diferenças significativas entre os grupos de ambos os
protocolos. Dessa forma, como também observado no estudo morfológico anteriormente
descrito, a segunda semana de avaliação dos experimentos mostrou uma maior
porcentagem significativa de canais necrosados em relação às demais. Conclui
-
se neste,
como para
o parâmetro anterior, que a segunda semana representou o pico de necrose
vascular. Em contrapartida, a última semana posterior à crioterapia mostrou a menor
percentagem de vasos corticais necrosados, representando o pico máximo de vascularização
do present
e estudo.
A profundidade de necrose geralmente é avaliada com o auxílio de estudos
termográficos em animais onde agulhas térmicas, acopladas nos tecidos
-
alvo, monitoram o
campo de temperatura local durante o procedimento criocirúrgico (KEIJSER
et al
., 199
9).
Utilizando
-
se desse recurso, BRADLEY, FISHER (1975) conduziram uma série de
experimentos em cavidades cirúrgicas de mandíbulas secas de porcos, de 2cm de largura,
variando apenas o método criocirúrgico de aplicação. Constataram que o uso de nitrogênio
spray
obteve, após cinco minutos, completa penetração óssea, inclusive no córtex oposto.
Em contrapartida, verificaram que o uso de sondas fechadas obteve, após 10 minutos de uso
contínuo, uma pequena área de cortical óssea que atingiu uma temperatura celu
lar letal.
Entretanto, tais estudos inferem apenas resultados imediatos e
in vitro
, ao contrário da
nossa pesquisa que se propôs a realizar um estudo
in vivo
longitudinal, com parâmetros
qualitativos e quantitativos.
Verificamos que a profundidade de oste
onecrose também variou entre os campos
histológicos, entre as semanas de estudo, e entre os protocolos de aplicação.
No protocolo de três aplicações de um minuto do presente estudo, observou
-
se que a
média de profundidade de necrose óssea entre os campos histológicos obteve significância
apenas no grupo sacrificado com uma semana, mostrando que nos outros grupos ocorreu
uma maior homogeneidade na faixa de cortical óssea necrosada. A média da profundidade
de necrose obteve o valor máximo na segunda semana de avaliação, sendo numericamente
similar à primeira, e estatisticamente maior em relação às demais com o mesmo protocolo.
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130
Ao realizarem
-
se aplicações pelo período de dois minutos, os dados referentes à
média de profundidade entre campos mostraram, difere
ntemente do protocolo de um
minuto, significância, além do grupo de uma semana, também para o de duas semanas,
grupos estes que demonstraram uma maior heterogeneidade dos efeitos celulares da
crioterapia, mostrando campos específicos onde a profundidade de
necrose se deu com
maior destaque. Verificou
-
se que a média da profundidade de necrose foi
significativamente maior no período de duas semanas, similar ao encontrado no protocolo
de um minuto de duração da crioaplicação.
Comparando
-
se os métodos, a segu
nda semana de observação do protocolo onde se
instituiu nitrogênio líquido pelo tempo de dois minutos por aplicação obteve o pico máximo
de necrose do presente estudo, tendo sido estatisticamente significante em relação ao valor
médio da segunda semana de
sacrifício do protocolo de um minuto. Tal achado corrobora
com o que foi encontrado por KUYLENSTIERNA, LUNDQUIST, NATHANSON (1980)
em um estudo com mandíbulas de coelho. Estes autores constataram uma marcante necrose
óssea na segunda semana de avaliação dos experimentos. Ao contrário, análises
histológicas em fêmures de coelhos, realizadas por KEIJSER
et al
. (1999), demonstraram
uma clara demarcação da osteonecrose uma semana após a criocirurgia. Em relação ao
nosso estudo, esta ressalva se fez similar ao protocolo de um minuto.
No presente trabalho não observamos fratura patológica, mesmo nos animais do
grupo de duas semanas, de ambos os protocolos, onde se observou os picos máximos em
extensão e profundidade, sendo corroborado por outros estudos (KUYLENS
TIERNA,
LUNDQUIST, NATHANSON, 1980; POPKEN
et al
., 2003). Ao contrário, alguns autores
têm relatado sua alta ocorrência, em outros modelos animais submetidos a criotratamento,
como GAGE
et al.
(1966) que notificaram fraturas espontâneas em 11 de 16 fêmures
de
cães. KEIJSER
et al.
(1999) reportaram apenas duas fraturas patológicas femurais dentre
oito coelhos do seu grupo experimental. BRADLEY (1978) relatou fraturas patológicas em
uma mandíbula de gato após oito semanas do resfriamento a que foi submetida.
Em acordo
com o que foi constatado por este último autor, FISHER, WILLIAMS, BRADLEY (1978),
demonstraram uma diminuição estatisticamente significante na resistência óssea de
mandíbulas de ratos tratadas após oito semanas, com uma redução aproximada em 40%
deste parâmetro.
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131
Em uma abordagem clínica, relatos de fraturas ósseas após a crioterapia têm sido
descritos principalmente em ameloblastomas, que representam tumores localmente
agressivos, destruindo amplas áreas de tecido ósseo (EMMINGS
et al.
, 1967; MA
RCIANI
et al
., 1977; MORONI
et al.,
1982; SALMASSY, POGREL 1995; CURI
et al
., 1997;
LAUREANO
-
FILHO
et al.,
2004). De acordo com BRADLEY (1978), alguns fatores são
importantes no desenvolvimento de fraturas espontâneas, tais como: lesões extensas em que
a e
nucleação ocasionaria uma grande perda óssea e, a esta, seria adicionada uma
significante redução na resistência advinda dos efeitos da criocirurgia sobre o arcabouço
remanescente; áreas extensas para aplicação do criógeno ocasionariam uma maior
desvitaliz
ação óssea, dificultando a migração de osso neoformado a partir de regiões de
osso normal, consideravelmente distante da área afetada; dano ao tecido mole de suporte,
com redução na vascularização local; infecção e conseqüente formação de seqüestros
ósseos
. Dessa forma, precauções devem ser tomadas para prevenir ou mesmo reduzir as
chances de ocorrência de fraturas após a criocirurgia, como dieta pastosa, repouso para se
evitar eventuais traumatismos, bem como um criterioso acompanhamento clínico
-
radiográfi
co a longo prazo (FISHER, WILLIAMS, BRADLEY, 1978; BRADLEY, 1978).
Outras complicações podem ser observadas em decorrência do criotratamento como
deiscência de sutura e distúrbios neurosensoriais (SALMASSY, POGREL 1995;
CERQUEIRA, SANT’ANA FILHO, 2001; LA
UREANO
-
FILHO
et al.,
2004) A primeira
está relacionada à falha na proteção dos tecidos moles no momento da aplicação do
criógeno, levando à posterior necrose da região suturada e exposição do leito ósseo, o que
pode ser prevenido com a devida retração dos tecidos adjacentes com afastadores cirúrgicos
e proteção com gaze, como preconizado por BRADLEY, FISHER (1975). Em virtude
disso, preconizamos para todos os nossos experimentos o uso de retratores teciduais e
contínua observação da área tratada. Por conseg
uinte, a segunda complicação, de acordo
com os últimos autores, pode ocorrer quando há falha na regeneração nervosa após a
crioterapia, resultante da não preservação do feixe vasculonervoso, o que em muitas lesões
infiltrativas, tais como ameloblastomas, n
ão é possível de se obter em virtude do seu
comportamento biológico.
Informações advindas de estudos experimentais são reconhecidamente importantes
para se compreender os mecanismos pelos quais a criocirurgia exerce seus efeitos. Dessa
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132
forma, embora os no
ssos resultados não possam ser completamente extrapolados para a
clínica, eles fazem constatações importantes quanto ao comportamento do tecido ósseo
submetido a diferentes ciclos de aplicação de nitrogênio líquido, podendo servir como base
para a realização de pesquisas clínicas futuras.
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133
8 CONCLUSÕES
Considerando
-
se as condições nas quais o presente estudo foi realizado, concluiu
-
se
que:
·
O maior grau de necrose, tanto em profundidade quanto em extensão, foi
evidenciado no protocolo de 2 minutos;
·
O grau
de inflamação da medula óssea foi maior no protocolo de 3 aplicações de 2
minutos quando comparado com o protocolo de 3 aplicações de 1 minuto cada;
·
A cortical óssea submetida ao protocolo de 3 aplicações de 2 minutos apresentou
maior quantidade de lacunas ósseas vazias e canais vasculares necrosados do que o
protocolo de 3 aplicações de 1 minuto.
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144
ANEXO A
–
Lei n° 6.638, de 8 de maio de 1979
LEI N° 6.638, de 8 de maio de 1979
Estabelece normas para a prática didática
-
científica da vivissecção de animais e determina
outras providências
O PRES
IDENTE DA REPÚBLICA
Faço saber que Congresso Nacional decreta e eu sanciono a seguinte Lei:
Artigo 1°
-
Fica permitida, em todo o território
-
nacional, vivissecção de animais, nos
termos desta Lei.
Artigo 2°
-
Os biotérios e os centros de experiências e demonstrações com animais vivos
deverão ser registrados em órgão competente e por ele autorizado a funcionar.
Artigo 3°
-
A vivissecção não será permitida:
I
-
sem o emprego de anestesia;
II
-
em centros de pesquisas e estudo não, registrados em órgã
o competente;
III
-
sem a supervisão de técnico especializado;
IV
-
com animais que não tenham permanecido mais de quinze dias em biotérios
legalmente autorizados;
V
-
em estabelecimentos de ensino de primeiro e segundo graus e em quaisquer
locais
freq
üentemente por menores de idade.
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145
Artigo 4°
-
O animal só poderá ser submetido às intervenções recomendadas nos protocolos
das experiências de constituem a pesquisa ou programas de aprendizado cirúrgico, quando,
durante ou após a vivissecção, receber cui
dados especiais.
§ 1°
-
Quando houver indicação, o animal poderá ser sacrificado sob escrita obediência às
prescrições científicas.
§ 2°
-
Caso não sejam sacrificados, os animais utilizados em experiências ou
demonstrações, somente poderão sair do biotério trinta dias após a intervenção, desde que
destinados a pessoas ou entidades idôneas que por eles queiram responsabilizar
-
se.
Artigo 5°
-
Os infratores desta Lei estarão sujeitos:
I
-
às penalidades cominadas no artigo 64, caput, do decreto
-
lei n
o
3.688, de 3 de Outubro
de 1941, no caso de ser primeira infração;
II
-
à interdição e cancelamento do registro do biotério ou do centro de pesquisa, no caso de
reincidência.
Artigo 6°
-
O Poder Executivo, no prazo de noventa dias, regulamentará a presente
Lei,
especificando:
I
-
o órgão competente para o registro e a expedição de autorização dos biotérios e centros
de experiências e demonstração com animais vivos;
II
-
as condições gerais exigíveis para o registro e o funcionamento dos biotérios;
III
-
órgão e autoridades competentes para a fiscalização dos biotérios e centros
mencionados no Inciso I.
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146
Artigo 7°
-
Esta Lei entrará em vigor na data de sua publicação.
Artigo 8°
-
Revogam
-
se as disposições em contrário.
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147
ANEXO B
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ANEXO C
Média dos valores de extensão entre campos (1 a 12)
SEMAN
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
TOTAL
A1a
1,034,713
1,182,929
1,164,685
1,073,755
1,051,584
-
-
-
-
-
-
-
5,507,665
A1b
1,203,813
1,169,178
1,130,696
1,089,875
810,
664
-
-
-
-
-
-
-
5,404,225
A1c
1,160,828
1,143,580
1,075,449
971,216
-
-
-
-
-
-
-
-
4,351,073
A1d
1,031,157
1,146,949
1,146,512
1,149,304
1,145,707
-
-
-
-
-
-
-
5,619,629
A1e
808,387
1,071,072
1,152,922
1,127,198
967,341
-
-
-
-
-
-
-
5,126,919
-
A2a
1,149,872
1,145,858
1,145,904
1,133,189
-
-
-
-
-
-
-
-
4,574,824
A2b
1,179,884
1,188,112
1,189,859
1,164,670
1,114,663
-
-
-
-
-
-
-
5,837,187
A2c
1,159,525
1,166,785
1,170,425
1,156,426
1,153,761
-
-
-
-
-
-
-
5,806,921
A2d
1,148,348
1,146,666
1,145,765
1,148,105
1,142,853
1,037,628
-
-
-
-
-
-
6,769,366
A2e
1,164,984
1,152,044
1,134,676
1,124,408
1,12
5,007
-
-
-
-
-
-
-
5,701,119
-
A4a
1,094,478
1,062,241
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,156,719
A4b
1,108,064
731,981
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,840,044
A4c
1,101,330
870,910
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,972,241
A4d
1,114,248
1,159,417
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,273,665
A4e
1,121,331
1,071,471
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,192,802
-
A12a
890,212
971,924
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,862,136
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1
A12b
1,065,792
736,975
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,802,766
A12c
975,617
895,825
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,871,442
A12d
946,114
878,211
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
1,824,325
-
B1a
1,153,931
1,153,931
1,146,892
1,145,
942
1,149,443
1,148,790
1,107,665
-
-
-
-
-
8,006,594
B1b
1,034,629
1,034,629
1,145,733
1,146,708
1,146,708
1,148,410
1,124,759
-
-
-
-
-
7,781,575
B1c
900,523
900,523
1,144,851
1,145,638
1,147,795
1,152,195
1,111,256
-
-
-
-
-
7,502,782
B1d
1,076,558
1,076,558
1,149,087
1,147,422
1,148,226
1,145,966
1,114,564
-
-
-
-
-
7,858,381
B1e
1,065,727
1,065,727
1,148,294
1,148,828
1,14
4,469
1,144,618
1,146,751
-
-
-
-
-
7,864,415
-
B2a
1,139,734
1,11
9,911
1,155,499
1,159,733
1,153,353
1,155,271
1,148,549
1,142,008
628,104
1,144,512
-
-
10,946,673
B2b
1,141,272
1,100,494
1,173,512
1,158,268
1,153,05
4
1,155,358
1,151,663
1,142,527
628,390
1,148,393
1,146,925
630,809
12,730,664
B2c
1,132,977
1,165,038
1,154,343
1,146,466
1,148,692
1,148,578
1,147,222
1,148,410
631,626
1,104,976
-
-
10,928,328
B2d
1,146,203
1,196,634
1,160,095
1,195,799
1,194,269
1,179,663
1,163,473
1,164,611
640,536
1,168,149
1,071,930
589,561
12,870,923
B2e
1,131,238
1,160,432
1,155,672
1,177,183
1,187,473
1,172,645
1,156,412
1,114,598
613,029
1,111,463
1,145,418
629,980
12,755,542
-
B4a
1,171,569
1,170,821
1,175,209
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,517,598
B4b
1,039,781
1,135,845
858,663
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,034,289
B4c
1,152,641
1,150,589
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,303,230
B4d
1,119,429
1,148,403
1,143,303
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,411,135
-
B1
2a
1,152,853
1,123,511
1,105,223
-
-
-
-
-
-
-
-
-
3,381,588
B12b
1,095,445
1,125,555
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,221,001
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2
B12c
1,120,122
1,109,722
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,229,844
B12d
1,134,302
1,119,285
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2,253,587
-
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3
ANEXO D
Média dos valores de profundidade entre campos (1 a 12)
SEMANA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A1a
115,660
117,693
109,647
116,573
93,382
-
-
-
-
-
-
-
A1b
102,610
130,415
126,809
89,226
40,836
-
-
-
-
-
-
-
A1c
112,833
126,954
100,058
57,100
-
-
-
-
-
-
-
-
A1d
91,607
126,754
162,208
124,694
96,795
-
-
-
-
-
-
-
A1e
99,055
107,017
87,011
96,502
80,486
-
-
-
-
-
-
-
A2a
84,446
103,859
120,159
111,675
-
-
-
-
-
-
-
-
A2b
100,740
114,714
114,492
134,645
114,880
-
-
-
-
-
-
-
A2c
108,809
113,370
129,014
137,743
119,859
-
-
-
-
-
-
-
A2d
148,757
138,497
143,627
147,097
129,922
123,820
-
-
-
-
-
-
A2e
144,196
153,422
148,809
132,076
127,695
-
-
-
-
-
-
-
A4a
51,959
42,239
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4b
44,540
51,142
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4c
61,011
45,666
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4d
43,707
59,897
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4e
54,999
58,052
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12a
38,454
40,401
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12b
41,047
34,833
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12c
30,205
30,735
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12d
30,858
35,282
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
This watermark does not appear in the registered version - http://www.clicktoconvert.com
4
B1a
49,078
59,116
52,707
356,852
389,220
408,
005
319,073
-
-
-
-
-
B1b
60,330
321,543
388,471
504,600
489,553
431,652
261,241
-
-
-
-
-
B1c
121,556
247,005
313,327
513,724
416,830
316,208
275,958
-
-
-
-
-
B1d
114,764
206,829
435,280
344,105
315,385
331,393
263,188
-
-
-
-
-
B1e
67,350
355,216
491,994
352,745
541,247
322,785
307,993
-
-
-
-
-
B2a
206,969
266,09
8
298,248
463,812
484,537
476,595
444,302
503,041
516,187
510,032
-
-
B2b
435,408
395,656
397,411
386,559
419,291
498,068
464,136
513,761
515,
200
488,364
491,627
479,645
B2c
234,867
251,373
454,270
496,498
531,381
577,259
443,504
545,752
324,821
334,043
-
-
B2d
284,587
393,208
384,766
422,273
511,774
467,504
531,984
523,345
504,579
505,140
451,508
-
B2e
281,626
352,169
381,799
429,323
498,220
468,922
496,077
488,880
481,437
453,784
462,45
7
-
B4a
116,683
179,026
166,305
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4b
99,099
115,802
124,425
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4c
89,230
127,430
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4d
95,697
141,276
97,326
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12a
55,091
73,362
64,227
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12b
58,235
63,884
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12c
57,019
60,155
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12d
61,139
54,810
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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5
ANEXO E
Média dos valores de necrose óssea entre campos (1 a 12)
SEMANA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A1a
0.18723
0.18773
0.23643
0.17177
0.14015
-
-
-
-
-
-
-
A1b
0.14893
0.20238
0.20454
0.11553
0.06666
-
-
-
-
-
-
-
A1c
0.11870
0.28229
0.17154
0.04219
-
-
-
-
-
-
-
-
A1d
0.10652
0.18211
0.17803
0.22167
0.14802
-
-
-
-
-
-
-
A1e
0.08745
0.14983
0.12837
0.10684
0.08516
-
-
-
-
-
-
-
A2a
0.19847
0.25206
0.21518
0.22580
-
-
-
-
-
-
-
-
A2b
0.20940
0.24320
0.21673
0.31034
0.28807
-
-
-
-
-
-
-
A2c
0.20212
0.18996
0.19188
0.30943
0.29966
-
-
-
-
-
-
-
A2d
0.24907
0.28016
0.26054
0.29964
0.30970
0.18681
-
-
-
-
-
-
A2e
0.27170
0.24101
0.24324
0.31317
0.24101
-
-
-
-
-
-
-
A4a
0.08537
0.07302
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4b
0.08054
0.06230
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4c
0.06835
0.06109
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4d
0.09091
0.07770
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A4e
0.11039
0.11419
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12a
0.03215
0.05034
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12b
0.05438
0.04075
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12c
0.05705
0.04636
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
A12d
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6
0.05016
0.03560
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B1a
0.08058
0.13703
0.31560
0.53036
0.48995
0.63320
0.18000
-
-
-
-
-
B1b
0.08888
0.21590
0.64843
0.95357
0.80277
0.71523
0.21661
-
-
-
-
-
B1c
0.07916
0.20463
0.45021
0.45991
0.45364
0.43037
0.16822
-
-
-
-
-
B1d
0.12252
0.28691
0.83512
0.43109
0.36981
0.39416
0.17752
-
-
-
-
-
B1e
0.12955
0.22656
0.42241
0.52434
0.66063
0.47844
0.32773
-
-
-
-
-
B2a
0.36915
0.35806
0.40566
0.59415
0.82484
0.77394
0.79477
0.85266
0.78233
0.49032
-
-
B2b
0.46781
0.57859
0.57006
0.69186
0.69424
0.85950
0.78113
0.69372
0.69230
0.6704
1
0.61940
0.30158
B2c
0.23770
0.56122
0.66990
0.86601
0.70979
0.65371
0.41577
0.58865
0.39411
0.40131
-
-
B2d
0.46118
0.51257
0.58461
0.62857
0.83024
0.81791
0.74006
0.83774
0.78034
0.86377
0.44827
-
B2e
0.26953
0.61279
0.63139
0.66666
0.75084
0.86229
0.73178
0.68458
0.60677
0.68120
0.44000
-
B4a
0.11821
0.19016
0.22711
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4b
0.12456
0.07717
0.06271
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4c
0.09764
0.08754
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B4d
0.12956
0.12624
0.12830
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12a
0.10386
0.09422
0.08503
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12b
0.08401
0.05398
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12c
0.06490
0.05810
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B12d
0.07553
0.09589
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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7
ANEXO F
Média dos valores de necrose de canais vasculares corticais entre campos (1 a 12)
SEMANA
SOMA CHEIOS
SOMA VAZIOS
RAZAO
A1a
45
2
0.0444444
A1b
42
3
0.0714286
A1c
51
3
0.0588235
A1d
41
14
0.3414634
A1e
78
5
0.0641026
A2a
38
8
0.2105263
A2b
66
7
0.1060606
A2c
79
2
0.0253165
A2d
84
13
0.1547619
A2e
72
24
0.3333333
A4a
21
1
0.047619
A4b
21
1
0.0476
19
A4c
28
1
0.0357143
A4d
20
1
0.05
A4e
33
1
0.030303
A12a
20
0
0
A12b
30
1
0.0333333
A12c
22
0
0
A12d
21
1
0.047619
B1a
64
20
0.3125
B1b
81
44
0.5432099
B1c
87
24
0.2758621
B1d
84
35
0.4047619
B1e
92
34
0.3695652
B2a
155
96
0.6193548
B2b
228
153
0.6710526
B2c
93
56
0.6021505
B2d
219
139
0.6347032
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8
B2e
174
123
0.7068966
B4a
35
2
0.0571429
B4b
29
1
0.0344828
B4c
17
1
0.0588235
B4d
28
2
0.0714286
B12a
43
0
0
B12b
22
0
0
B12c
3
9
0
0
B12d
36
2
0.0555556
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9
ANEXO G
Escores atribuídos ao grau de inflamação medular de acordo com as semanas de observação
SEMANA
GRAU
SEMANA
GRAU
A1a
0
B1a
0
A1b
0
B1b
2
A1c
0
B1c
0
A1d
0
B1d
0
A1e
0
B1e
2
A2a
1
B2a
2
A2b
0
B2b
2
A2c
0
B2c
2
A2d
1
B2d
2
A2e
2
B2e
1
A4a
1
B4a
1
A4b
0
B4b
1
A4c
0
B4c
2
A4d
1
B4d
1
A4e
1
B12a
2
A12a
1
B12b
2
A12b
1
B12c
1
A12c
1
B12d
1
A12d
1
CONTROLE
0
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