( PDF ) Distribuição de linfócitos T V delta 1 e V delta 2 durante a doença ativa e tratamento específico da tuberculose

Download PDF

ads:

Priscilla Ramos Costa

Distribuição de Linfócitos T Vδ

δδ

δ1 e Vδ

δδ

δ2 durante a doença ativa e

tratamento específico da tuberculose

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo – Escola Paulista de Medicina para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

São Paulo

2008

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Priscilla Ramos Costa

Distribuição de Linfócitos T Vδ

δδ

δ1 e Vδ

δδ

δ2 durante a doença ativa e

tratamento específico da tuberculose

Orientador: Esper Georges Kallás

Co-orientador: Denise S. S. Rodrigues

Coordenador da Pós Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

São Paulo

2008

ads:

COSTA, Priscilla Ramos

Distribuição de Linfócitos T Vδ1 e Vδ2 durante a doença ativa e

tratamento específico da tuberculose. 2008

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de

Medicina. Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas e Parasitárias,

São Paulo, 2008.

Distribuition of Vδ1 and Vδ2 T lymphocytes during the active disease and

specific therapy of tuberculosis.

1. Células T gama delta (γδ) 2. Tuberculose 3. Imunidade inata 3.Citometria de

fluxo

Disciplina de Infectologia

Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina

DEDICATÓRIA

Ao meu Deus, criador de todo o Universo, pelo amor incondicional, força, coragem, por

colocar pessoas especiais na minha vida, por permanecer sempre ao meu lado. Sem Seu

apoio a minha vida não faria sentido e nada disso teria acontecido.

Aos meus pais Edvaldo Vieira Costa (in memoriam) e Floriza Ramos Costa, pelo amor,

amizade, companheirismo, incentivo na busca pelo conhecimento, pelo apoio em toda e

qualquer situação, por iluminar a minha vida e principalmente por serem exemplos de vida

pra mim.

Aos meus irmãos Aline Ramos Costa e Franklin Ramos Costa pelo carinho,

companheirismo, amizade e por dividir a vida comigo tornando-a mais completa.

iii

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Dr. Esper G. Kallás, à minha gratidão pela confiança, diretrizes,

incentivo e competência, presença fundamental na minha formação profissional.

À minha co-orientadora Dra. Denise S. S. Rodrigues pelos ensinamentos e conselhos

preciosos, paciência e amizade, que juntos contribuíram para o meu crescimento

profissional. Agradeço também pelas amostras dos voluntários cedidas para o

desenvolvimento deste trabalho científico.

À Helena T. I. Tomiyama pelo acolhimento, pelos ensinamentos, amizade, paciência e

companheirismo ao longo desses anos.

Aos colegas e amigos do Centro Interdisciplinar de Terapia Gênica (CINTERGEN):

Débora Cristina Rocha, uma amiga pra qualquer hora, Fernanda R. Bruno, Karina

Carvalho, Dr. Hernán Bermudez, Ricardo Russo, Dr. Ricardo Palácios, Teresa

Maidana, Tânia Maria Silva, Dr. Fábio Leal, Raphaela Goulart, Claudia Tomiyama,

Vivian Motta, Leandro Tarosso, Dra. Mariana Sauer, Ângela Alencar, Karine Milani,

Zelinda Nakagawa, Dr. Hugo Marcelo, Maria Cândida Dantas, Danilo Mesquita,

Júlio Antônio Antunes, Ivonete dos Santos, Rosely do Carmo Souza, Eliézer, Nóe, à

minha gratidão pelo acolhimento, excelente convívio, apoio em todos os momentos e

valiosos conselhos.

Aos laboratórios de Imunologia I e Nefrologia da UNIFESP pelo apoio em toda e

qualquer situação.

À ex-funcionária Cristiane Gomes pelo excelente convívio, amizade e principalmente

pelo apoio em meio a mudanças. Ao funcionário da DIPA Charlys Costa pela amizade,

paciência e consideração em todos os momentos.

Ao funcionário Issler Morais da Silva pela amizade, auxílio no preparo das

documentações, e por nos ajudar a resolver os problemas.

Ao amigo Wilson Cruvinel pela amizade e pela ajuda na elaboração da figura da tese.

A todos os meus familiares, tios, primos e avós pelo apoio e incentivo contínuo a

perseverar apesar das dificuldades.

À minha avó Alice Novais, pelo amor, incentivo em toda situação e apoio nos momentos

que mais precisei.

Ao amigo Carlos Roberto Ferreira pelo carinho, amizade, apoio desde o início, e

principalmente por fazer parte da família.

Aos amigos queridos Ana Paula, Railen, Inara, Débora, Renata, Grazielle, Tatiana,

Lívia, Thaís, Gislaine, Balbiane, Valeria, Edílson e Silas, a minha gratidão pela

amizade, companheirismo, principalmente por fazerem parte da minha vida sendo bênçãos

pra mim.

Aos amigos da Igreja Batista Esperança, ao qual faço parte, pela amizade e

companheirismo em todos os momentos e por vocês fazerem parte da minha vida.

À amiga Neuma Moreno, pela amizade, iniciativa e incentivo em vir para São Paulo, em

busca de oportunidade e mais conhecimento. Tenho certeza que foi iluminada por Deus

para me ajudar a chegar até aqui.

Às amigas e companheiras de casa Thais, Keli e Natália, pela oportunidade de

compartilhar a casa e o dia a dia com vocês.

À Universidade Estadual de Santa Cruz pela oportunidade e capacitação na minha

carreira profissional.

Aos mestres que passaram pela minha vida me incentivando e ensinando de que a busca

do conhecimento deve ser contínua.

Ao Instituto Clemente Ferreira por possibilitar esse estudo e persistir na luta contra a

tuberculose.

Ao diretor do Instituto Clemente Ferreira Fernando Fiúza de Mello por ter acreditado e

investido no projeto.

Aos profissionais do Instituto Clemente Ferreira pelo auxílio na coleta de sangue dos

pacientes, essencial para a realização deste trabalho.

Aos voluntários por terem aceitado participar do projeto principal, contribuindo para o

desenvolvimento científico do país no âmbito da imunologia da tuberculose.

À Universidade Federal de São Paulo pelo apoio e participação no crescimento científico

do país.

À Disciplina de Infectologia por permitir o desenvolvimento deste projeto e me agraciado

com a bolsa e a matrícula na pós - graduação.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

financiamento do projeto, incentivando o desenvolvimento científico no âmbito da

tuberculose.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e CNPq, pelo

suporte financeiro, essencial para a minha permanência em São Paulo.

A todos aqueles que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho

científico.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS viii

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS ix

RESUMO x

ABSTRACT xii

1. INTRODUÇÃO 1

1.1Tuberculose 1

1.1.1 Imunopatogênese da Tuberculose 4

1.2 Linfócitos T gama delta (γδ

γδγδ

γδ) 9

2. OBJETIVOS 15

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS 16

3.1 Recrutamento de Voluntários 16

3.2 Citometria de Fluxo-Imunofenotipagem 17

3.3 Análise Estatística 18

4. MANUSCRITO 20

5. DISCUSSÃO 46

6. CONCLUSÕES 51

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52

8. ANEXOS I 59

9. ANEXOS II 67

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

Siglas Definições

APCs Células apresentadoras de antígenos

BCG Baccilus Calmette Guerin

CD Marcadores de diferenciação celular

CMSP Células mononucleares do sangue periférico

CTL Linfócito T citotóxico

EDTA Ácido etileno diaminotetracético

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HLA Antígeno leucocitário humano

IFN-γ Interferon gama- γ

IL Interleucina

MHC Complexo de histocompatibilidade principal

M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis

NIH Instituto Nacional de Saúde

NK Matadora Natural

NKT Célula T Matadora Natural

NO Óxido Nítrico

PPD Derivado de Proteína Purificada

TCR γδ Receptor de células T γδ

Th Linfócitos T auxiliares

TNF-α Fator α de necrose tumoral

TLR Receptor do tipo Toll

ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS

Figura 01. Rearranjo gênico da cadeia β, os segmentos desarranjados da cadeia α e a

localização dos genes da cadeia δ inseridos entre os segmentos V e J da cadeia α, figura A;

A cadeia β rearranjada, a cadeia α se recombinando e a cadeia δ sendo removida em forma

de círculo extra- cromossômico, figura B. (Adaptado de Janeway, CA et al., 2000).

Figura 02. O timócito CD3+ duplo negativo (CD4-CD8-) executa o rearranjo das cadeias

γ, δ e β produzindo proteínas funcionais e uma cadeia substituta pré-Tα, 2a; essa mesma

célula T, ao receber sinais via TCR γδ, promove a internalização da cadeia funcional β e da

cadeia substituta pré-Tα (Pré-TCR) e o desligamento da expressão gênica dessas cadeias,

originando células da linhagem γδ, 2b; quando o sinal é recebido via TCR αβ ocorre a

internalização das cadeias do TCR γδ, e a diferenciação da linhagem αβ, 2c; nas figuras 2d

e 2e os linfócitos T γδ e αβ iniciarão o processo de maturação e migrarão para outros sítios

(Adaptado de Janeway, CA, et al., 2000).

Tabela 01. Relação dos voluntários com tuberculose e os sintomas apresentados.

RESUMO

A tuberculose é considerada um problema de saúde pública mundial. Estima-se que um

terço da população mundial está infectada pelo Mycobacterium tuberculosis. Trabalhos

avaliando a interação patógeno vs. hospedeiro tem incentivado o estudo dos mecanismos

envolvidos na resposta imunológica inicial nos indivíduos infectados e doentes. A

participação dos linfócitos T na resposta contra a micobactéria tem destacado a

importância dessas células na imunopatogênese. Uma subpopulação de linfócitos T, as

células T γδ têm sido investigada quanto à sua participação na resposta imunológica,

principalmente frente a processos infecciosos e inflamatórios. Essas células carregam

cadeia TCR γδ, atuam tanto na resposta inata como na adaptativa e são encontradas em

epitélios de alguns órgãos e no sangue periférico. Duas subpopulações são predominantes

no sangue periférico, aquelas expressando TCR Vγ2Vδ2 e outras expressando TCR

VγnVδ1. A subpopulação Vδ2 tem demonstrado reatividade a produtos micobacterianos,

enquanto que os mecanismos específicos das células T Vδ1 permanecem desconhecidos.

Este trabalho propôs investigar através da citometria de fluxo a distribuição dos linfócitos

T γδ, Vδ1 e Vδ2 na infecção pelo M. tuberculosis. Este trabalho foi realizado com

amostras de pacientes com tuberculose pulmonar na fase aguda e durante terapia

específica, indivíduos expostos ao M. tuberculosis e controles saudáveis. Nós encontramos

uma diminuição na freqüência de células T Vδ2 nos pacientes com tuberculose,

permanecendo estável durante terapia. Ao contrário as células T Vδ1 revelaram tanto uma

freqüência aumentada na fase aguda, como também aumento contínuo ao longo da terapia

específica. Com base no impacto da doença na freqüência desses linfócitos T γδ,

acreditamos que essas células estejam envolvidas na resposta imunológica inicial contra a

micobactéria, e que exista uma provável função complementar dessas células com as

células T αβ. Nós recomendamos futuros estudos para explorar e avaliar a funcionalidade

das células T Vδ1 e Vδ2, esses dados serão de grande valia para melhor compreender a

contribuição dessas células na resposta imune durante a tuberculose.

xii

ABSTRACT

Tuberculosis is an enormous challenge to global health. One third of the world’s

population is estimated to be infected by the Mycobacterium tuberculosis. Previous

reports assessing the interaction between the pathogen and the host have promoted further

studies on the mechanisms involved during the innate immune response of infected

individuals. The participation of T lymphocytes in the response against the

mycobacterium has revealed the importance of these cells in immunopathogenesis of the

disease. The γδ T cells, a subset of T lymphocytes, have been investigated with regard to

their participation in the immune response, mainly against infectious and inflammatory

processes. These cells express TCR γδ chains, participating in innate as well as adaptive

responses, and are found in the epithelium of some organs and in the peripheral blood.

There are two predominant subsets of cells in the peripheral blood: those expressing TCR

Vγ2Vδ2 chains and those expressing TCR VγnVδ1 chains. The Vδ2 subset has

demonstrated reactivity to compounds produced by M. tuberculosis, while the specific

mechanisms of Vδ1 T cells remain unknown. Using flow cytometry, this study aims were

to investigate the frequency of both Vδ1 and Vδ2 subsets of γδ T cells in Mycobacterium

tuberculosis infection. This study was performed with samples that include acute

tuberculosis patients, those receiving specific therapy, exposed individuals, and healthy

controls. We found that the frequency of Vδ2 T cells was diminished in tuberculosis

patients, and remained steadily low during specific therapy. In contrast, the Vδ1 T cells

subset displayed not only increased frequency at acute phase, but also continued to rise

throughout the course of specific therapy. Based on the impact of the disease on the γδ T

cells frequency, we believe that these cells may be involved in an innate immune response

xiii

against the mycobacterium. Additionally, it is likely that they play a complementary role

to αβ T cells during infectious processes. We recommend future studies to explore and

evaluate the funcionality of Vδ1 and Vδ2 T cells in order to better understand the

contribution of these subsets in the immune response during tuberculosis infection.

1 INTRODUÇÃO

1.1. Tuberculose

A Tuberculose (TB) é uma doença milenar, porém na década de 90 voltou a ser

considerado pela OMS um problema de saúde pública mundial. Em 1882 Robert Koch

identificou o agente etiológico da tuberculose, o Mycobacterium tuberculosis, conhecido

como o bacilo de Koch. O M. tuberculosis faz parte de um complexo constituído por

espécies de micobactérias que apresentam similaridades moleculares acima de 99% como:

M. bovis, M. africanum, M. microti e M. canettii (Falkinham, 1996).

A TB é uma doença que compromete principalmente os pulmões, mas pode afetar

qualquer órgão (Haas, Lavelle et al., 2000). O bacilo da tuberculose é uma micobactéria

intracelular facultativa, aeróbica obrigatória com predileção pelo pulmão, por ser um

tecido rico em oxigênio (Raja, 2004). A transmissão ocorre geralmente em locais fechados

e aglomerados em que gotículas respiratórias, contendo bacilos, são aerolizadas pela tosse

ou fala de pacientes com doença ativa (Melo, 2006). A estratégia utilizada para prevenir a

forma agressiva da doença em crianças, ocorre através da vacinação com o BCG (Baccilus

Calmette Guerin), entretanto essa vacina é praticamente ineficaz na proteção do adulto

contra a tuberculose. Mesmo possuindo tratamento específico, a tuberculose tem sido

responsável por um número de óbitos cada vez maior, principalmente devido à dificuldade

de diagnóstico rápido e à interrupção precoce do tratamento por parte dos pacientes,

contribuindo para a evolução do quadro clínico dos pacientes.

Indivíduos que entraram em contato com o M. tuberculosis e se infectaram podem

ser identificados mediante a realização do teste tuberculínico cutâneo. O teste, conhecido

como PPD (purified protein derivative), é realizado através da técnica de Mantoux, que se

baseia numa reação de hipersensibilidade do tipo tardia, onde uma resposta celular é

desencadeada após a inoculação intradérmica do derivado protéico do M. tuberculosis

(Saúde, 2005).

O teste avalia a sensibilidade do indivíduo a micobactéria, mediante reação cutânea

ou pápula, área de induração e edema no local do inóculo, decorrente da resposta

imunológica aos antígenos micobacterianos. A reatividade do PPD é interpretada de acordo

com a dimensão da induração em milímetros, os valores são identificados e agrupados de

acordo com a sensibilidade do indivíduo da seguinte maneira: 0 a 4 mm - não reator -

abrange indivíduo não infectado pelo M. tuberculosis ou outras micobactérias, ou ainda

infectado pelo M. tuberculosis num intervalo de 2 semanas sem que tenha ocorrido

viragem tuberculínica e em infectados que estejam experimentando algum grau de

depressão imunológica; 5 a 9 mm - reator fraco - indivíduo vacinado com BCG ou

infectado com M. tuberculosis ou outras micobactérias; >10 mm - reator forte - indivíduo

infectado pelo M. tuberculosis podendo estar doente ou não e indivíduos recém vacinados

com BCG (Saúde, 2005).

Estudos mostraram que apenas 5% dos indivíduos que apresentaram reação positiva

ao PPD, após um período de 2 a 5 anos, evoluem para doença pulmonar ou outras formas

de TB, e cerca de 95% dos infectados desenvolvem uma infecção latente, permanecendo

assintomáticos (Schluger e Rom, 1998). O diagnóstico clínico e laboratorial tem

contribuído para a identificação precoce desses indivíduos infectados, auxiliando no

controle da doença, uma vez que a descoberta dos doentes bacilíferos entre os sintomáticos

respiratórios e a introdução do esquema I de tratamento com rifampicina, isoniazida e

pirazinamida, quando necessário, além de curar o indivíduo, reduz o tempo de transmissão,

e quebra a cadeia epidemiológica da doença (Pneumologia, 2004; Melo, 2006). Apesar das

várias ferramentas de diagnóstico existentes, as falhas na identificação dos indivíduos

infectados permanecem e tem contribuído para a emergência de novos casos de TB. É de

grande necessidade o desenvolvimento de um teste de diagnóstico rápido, simples, sensível

e específico que possa diferenciar a forma de infecção latente, da TB ativa e da TB latente

progressiva (Abebe, Holm-Hansen et al., 2007).

O período de incubação da doença é muito variável, pode ser ativada geralmente

devido a perturbações do sistema imunológico como uma reinfecção exógena, ou uma

reativação da infecção latente pela presença de fatores imunossupressores como tratamento

com corticóides, idade, abuso do uso de drogas, álcool, infecção pelo vírus da

imunodeficiência humana (HIV) e outros fatores (Farebee, 1970; Chan, Heifets et al.,

2000). A co-infecção pelo M. tuberculosis e HIV é responsável anualmente por mais de 5,6

milhões do total de casos de TB em todo o mundo (Cherian e Verghese, 2000; Sharma e

Ahluwalia, 2000).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a tuberculose permanece

como a maior causa de morbidade e mortalidade entre as doenças infecto-contagiosas no

mundo, infectando anualmente mais de 9 milhões de pessoas e causando a morte de mais

de 3 milhões todo ano (Who, 2007). No cenário internacional o Brasil figura no 15º lugar,

permanecendo no grupo dos 22 países com maior incidência da doença, juntos são

responsáveis por mais de 80% do total de casos no mundo (Who, 2006). No Brasil são

identificados mais de 100 mil novos casos de tuberculose anualmente, a Região Sudeste

detém quase que 50% desses casos, sendo o município de São Paulo responsável por cerca

de seis a sete mil casos.

Registros epidemiológicos da tuberculose têm sido bastante explorados. Entre eles,

os fatores sócio-econômicos de diferentes regiões do mundo têm mostrado uma forte

ligação com o surgimento e desenvolvimento da doença. Cerca de 21% dos infectados são

contabilizados nos países avançados, ao passo que 79% ocorrem nos países em

desenvolvimento e pobres. Outra diferença é quanto à faixa etária dos infectados, nos

países desenvolvidos, a maior parte encontra-se acima dos 50 anos e nos países em

desenvolvimento 80% dos infectados encontra-se entre 15 e 59 anos, faixa etária em que

mais contribuem para o desenvolvimento do país (Pneumologia, 2004). A luta contra a

tuberculose tem despertado a busca de fatores tanto epidemiológicos como imunológicos

na procura de novas armas que auxiliem no controle da doença.

1.1.1.

Imunopatogênese da Tuberculose

A resposta imunológica, montada para combater e conter a infecção pelo M.

tuberculosis, é na grande maioria das vezes bem sucedida (Pneumologia, 2004; Melo,

2006). De acordo com a resposta imunológica, a tuberculose pode se manifestar na forma

pulmonar, responsável por cerca de 85% dos casos, ou na forma extrapulmonar. A

tuberculose extrapulmonar geralmente acontece como conseqüência de falhas na contenção

da infecção no pulmão, que permite a disseminação do bacilo via vasos linfáticos e

sanguíneos. São então detectados casos de tuberculose pleural e ganglionar periférica,

seguida pela tuberculose geniturinária, óssea, ocular, miliar e a meningoencefalite

tuberculosa (Pneumologia, 2004).

Após a entrada da micobactéria, a interação do bacilo com as células do sistema

imunológico do hospedeiro pode desencadear quatro tipos de resposta: -eliminação do

bacilo,- as micobactérias podem começar a se multiplicar logo após a infecção e causar

doença clínica; -a infecção pode ser contida através da formação de granuloma, gerando

uma infecção latente, onde após alguns anos as micobactérias podem eventualmente

começar a crescer e resultar em doença clínica ou os indivíduos com infecção latente

podem se reinfectar e desenvolver a forma ativa da TB (Dannenberg, 1994).

A tuberculose é um exemplo de infecção no qual a imunidade protetora e a

hipersensibilidade patológica coexistem, e as lesões são causadas pela resposta do

hospedeiro ao M. tuberculosis (Flynn e Chan, 2001). A resposta inicial é capaz de conter o

crescimento bacteriano por algum tempo, mas usualmente falha em erradicar a infecção e

necessita do auxílio de uma imunidade celular mais específica (Iho, Yamamoto et al.,

1999). O sistema imunológico é acionado com a entrada da micobactéria, onde células

como os macrófagos alveolares exercem sua função fagocítica, citocinas e quimiocinas são

produzidas, promovendo a quimiotaxia de mais células fagocíticas e apresentadoras de

antígenos, como células dendríticas e macrófagos, na tentativa de eliminar completamente

a bactéria. O recrutamento celular para o sítio da infecção persiste com a chegada de

macrófagos, fibroblastos, células gigantes, células T e B que auxiliarão na formação do

granuloma, orquestrado pelo fator α de necrose tumoral (TNF-α), citocina produzida por

macrófagos e linfócitos T com papel essencial na resposta imunopatológica (Bermudez e

Goodman, 1996; Tan, Canaday et al., 1997; Behr-Perst, Munk et al., 1999)

No interior das células fagocíticas, algumas micobactérias patogênicas apresentam

mecanismos de escape, evidenciado pela resistência à degradação causada pelas enzimas

hidrolíticas, exercendo um efeito inibitório no processo de fusão dos lisossomos com os

fagossomos (Flynn e Chan, 2001; Casanova e Abel, 2002). Com o decorrer da infecção

algumas bactérias podem persistir nos tecidos por meses e até décadas sem se multiplicar,

porém permanecendo viáveis. Esse estado persiste até que uma alteração resulte na ruptura

do granuloma ou em uma reativação e replicação do bacilo, causando necrose caseosa e

injúria do tecido pulmonar, resultando na liberação de produtos macrofágicos, enzimas

lisossômicas e intermediários reativos de oxigênio (Shiloh e Nathan, 2000). O processo de

necrose tem sido útil na eliminação de macrófagos infectados e promoção de um ambiente

anóxico, inibindo o crescimento micobacteriano (Sturgill-Koszycki, Schlesinger et al.,

1994; Winau, Hegasy et al., 2005).

A participação da imunidade celular inata na resposta ao M. tuberculosis tem sido

de suma importância principalmente durante a infecção ou a reativação da infecção.

Estudos comprovaram que, além de neutrófilos e macrófagos, as células matadoras

naturais (NK) também auxiliam na resposta a micobactéria. Quando as células NK estão

ativadas, exercem função citotóxica contra as células infectadas e produzem IFN-γ,

citocina potencializadora da atividade macrofágica e indutora da produção de altas

concentrações de óxido nítrico (NO) no local da infecção, resultando na morte bacteriana

(Boehm, Klamp et al., 1997; Macmicking, North et al., 1997). Além da participação dos

linfócitos T CD4 e CD8 tem sido relatado um efeito negativo da patogênese sobre outros

linfócitos T como as células T matadoras naturais (NKT), estas apresentam freqüência

diminuída no sangue periférico de pacientes infectados pelo M. tuberculosis durante fase

aguda e após tratamento, comparado com controles expostos ao M. tuberculosis e

saudáveis, acredita-se que essa células também fazem parte da reposta imunológica contra

a micobactéria (Snyder-Cappione, Nixon et al., 2007). Células T que apresentam cadeias

de TCR γδ tem sido alvo de investigação por possuir a capacidade de reconhecer

fosfoantígenos micobacterianos e exercer uma resposta efetora mediante produção de

citocinas, sua participação apresenta-se relevante tanto durante a resposta inata como

adaptativa, principalmente em um ambiente infeccioso.

A imunidade adaptativa é iniciada com a apresentação de antígenos

micobacterianos, a expressão de sinais co-estimulatórios e produção de citocinas, eventos

que acontecem quase que concomitantemente com a imunidade inata (Van Crevel,

Ottenhoff et al., 2002). No início da infecção, as células T são ativadas com a apresentação

de antígenos microbianos e são induzidas a produzir citocinas Th1 de modo a potencializar

a resposta celular. Duas a três semanas após a infecção, linfócitos T CD4+ e CD8+ podem

participar da luta contra o bacilo.

A resposta antígeno- específica de células T CD4+ tem sido considerada por muitos

pesquisadores como a mais importante na defesa contra o M. tuberculosis (Lai, Ho et al.,

1997). A grande maioria dos antígenos produzidos pelas APCs são apresentados

especificamente aos linfócitos T CD4+ que exercem efeito protetor, principalmente pela

produção de citocinas como o IFN-γ (Powrie e Coffman, 1993; Stenger e Modlin, 1999;

Lazarevic, Nolt et al., 2005). Os linfócitos T CD8+ têm revelado um caráter polifuncional

variando com o estágio da infecção. Células T CD8+ específicas a micobactérias

conseguem reconhecer macrófagos infectados e gerar uma resposta que contribua na

contenção da doença. A importância das células T CD8 + consiste principalmente na sua

função citotóxica, quando ativadas, essas células são induzidas a produzir e liberar

grânulos citotóxicos (Schluger e Rom, 1998). Essa atividade citotóxica envolve em parte

dois mecanismos: a apoptose pela via de ligação das moléculas Fas/FasL e o mecanismo de

morte pela via de produção de perforina e granulisina (Stenger, Mazzaccaro et al., 1997).

A produção de granulisinas peptídicas antimicrobianas por parte das células T CD8+ tem

sido capazes de eliminar micobactérias intracelulares(Stenger, Hanson et al., 1998).

Estudos em animais deficientes de células T CD8+ mostraram que esses animais são mais

suscetíveis à infecção pelo M. tuberculosis. A produção de citocinas e a lise de células

infectadas por parte das células T CD8+ ressalta ainda mais a importância dessas células

no combate à infecção pelo M. tuberculosis.

Os vários tipos celulares do sistema imunológico podem atuar de forma conjunta de

é geralmente ordenada através da produção de fatores químicos, as citocinas. A produção

de diferentes citocinas tem levado à classificação das células produtoras em padrões Th1 e

Th2 (Mosmann e Coffman, 1989). Células padrão Th1 são produtoras de citocinas como

interleucina 2 (IL-2), IFN-γ e TNF-α que exercem papel inflamatório promovendo a

imunidade celular, ao contrário das citocinas padrão Th2 que atuam na regulação negativa

da resposta Th1, induzindo a imunidade humoral. As citocinas Th1 parecem exercer papel

central no controle da infecção micobacteriana, uma vez que citocinas Th2, IL-4 e IL-10

favorecem a infecção por patógenos intracelulares, por serem citocinas supressoras da

produção de IFN-γ (Lucey, Clerici et al., 1996).

Serbina, Lazarevic et al., 2001, revelou que a ativação macrofágica e a produção de

IFN-γ decorrentes da infecção micobacteriana induzem a apoptose de células padrão Th1,

sugerindo que a doença clínica vem acompanhada por uma redução de células padrão Th1

e da resposta de linfócitos T citotóxicos. Estudos envolvendo camundongos mostraram o

potencial citotóxico dos linfócitos T CD8+ sendo dependente de células T CD4+ (Serbina,

Lazarevic et al., 2001). A maioria dos pesquisadores concorda que para se obter uma

resposta protetora controladora da infecção micobacteriana necessita-se de uma melhora na

captura, no processamento de antígenos pelas APCs e na apresentação para as células T

CD4+ e CD8+ naïve (Peters e Ernst, 2003). Sud et al., 2006, sugeriu que quanto maior a

quantidade inicial de antígenos, mais forte será a resposta e melhor proteção contra a

doença (Sud, Bigbee et al., 2006).

A resposta celular é principalmente antígeno específica e a identificação de

antígenos imunodominantes tem sido alvo de estudos, com o intuito de se desenvolver

vacinas efetivas (Andersen, 1997). Alguns mecanismos imunológicos podem estar

relacionados com a susceptibilidade ou resistência de alguns indivíduos em desenvolver ou

não a forma grave da doença (Behr-Perst, Munk et al., 1999; Fenhalls, Wong et al., 2000).

Os próximos passos no estudo da tuberculose exige que se esclareçam os complexos

mecanismos envolvidos na indução e manutenção da imunidade inata e especifica, além da

identificação dos fatores que marcam a proteção ou a exacerbação da doença clínica.

1.2 Linfócitos T gama delta (

γδ

γδγδ

γδ

)

O sistema imunológico é constituído de células leucocitárias, que se originam na

medula óssea, algumas células se maturam na própria medula, outras migram para órgãos

primários para se maturarem. Entre os leucócitos existem células envolvidas somente na

imunidade inata, algumas executando funções intermediárias entre a imunidade inata e

adaptativa e outras exercendo papel central na imunidade adaptativa. Os linfócitos são

células muito importantes na imunidade, caracterizadas pela expressão de moléculas de

reconhecimento de antígenos na superfície, conhecidas como receptores. Os receptores são

gerados através de rearranjos gênicos que definem o tipo de linfócito e permite a geração

de uma variedade infinita de receptores, cada um expresso individualmente, por uma célula

B (BCR) ou célula T (TCR) (Gowans, 1996).

Há algumas subpopulações de linfócitos que expressam uma diversidade de

receptores muito limitada, sendo codificada por poucos rearranjos gênicos. Uma dessas

populações é constituída pelas células T gama delta (γδ), descobertas em 1986 por

Tonegawa e colaboradores. Atualmente o comportamento dessas células num ambiente

fisiológico ou num ambiente patológico permanece pouco compreendido.

Os linfócitos T γδ expressam receptores distintos dos linfócitos T αβ, envolvidos na

imunidade adaptativa. Os TCRs são compostos por duas cadeias heterodímeras similares às

imunoglobulinas tanto na sua estrutura protéica, possuindo também regiões variável e

constante, quanto nos mecanismos genéticos responsáveis pela sua grande variabilidade,

apresentando segmentos de variabilidade (V), diversidade (D) e junção (J). O TCR γδ é

formado por duas cadeias polipeptídicas diferentes, as cadeias γ e δ (Havran e Boismenu,

1994; Dunon, Courtois et al., 1997). A localização do complexo gênico que codifica a

cadeia TCR δ é visualizada na Figura 1A. Os segmentos gênicos das cadeias β, γ e δ

sofrem rearranjos quase que simultaneamente nos timócitos duplo negativos (CD4-CD8-),

sendo inicialmente expressos dentro da célula e, então em baixos níveis na superfície

celular. O rearranjo gênico da cadeia α inativa os genes codificadores da cadeia δ, por isso

uma cadeia protéica precursora da cadeia α é formada (Havran e Boismenu, 1994; Dunon,

Courtois et al., 1997) (Figura 1B).

Figura 1. A figura A mostra o rearranjo gênico da cadeia β, os segmentos desarranjados da cadeia α e a

localização dos genes da cadeia δ inseridos entre os segmentos V e J da cadeia α; A figura B mostra a cadeia

β rearranjada, a cadeia α se recombinando e a cadeia δ sendo removida em forma de círculo extra-

cromossômico. (Adaptado de Janeway, CA et al., 2000).

As células T γδ compreendem de 5 a 10% dos linfócitos T circulantes no sangue

periférico de indivíduos saudáveis, essas células expressam o complexo CD3, porém a

maioria não expressa as moléculas CD4 e CD8 (Behr-Perst, Munk et al., 1999). Essas

células apresentam uma diversidade limitada nas cadeias γ e δ. Os precursores das células

T saem da medula óssea via vasos sanguíneos e vai para o timo. Na maioria dos timócitos,

entretanto, ocorre um rearranjo bem-sucedido dos genes da cadeia β e conseqüente

produção da proteína β funcional, essa cadeia pareia com uma cadeia α substituta, pTα,

criando um pré-TCR (β: pTα). Apenas 1% desses timócitos apresentam rearranjo e

ββ

J C

αα

δδ

V J C

αα

C V

δδ

ββ

J C

expressão das cadeias γ e δ (Figura 2). O mecanismo pelo qual os progenitores das células

T tornam-se comprometidos com a expressão do TCR αβ ou TCR γδ ainda não é

totalmente conhecido, embora isso possa depender de uma sinalização que desencadeará

um rearranjo produtivo na mesma célula. Os sinais via receptor da célula pré-T pTα:β

direcionam a célula para a linhagem αβ, e as células que receberem o sinal via TCR γδ

internaliza e destrói as cadeias pré-TCR, originando as células γδ (Kang, Coles et al.,

1998; Fehling, Gilfillan et al., 1999; Hayday, Barber et al., 1999) (Figura 2).

Figura 2. O timócito CD3+ duplo negativo (CD4-CD8-) executa o rearranjo das cadeias γ, δ e β produzindo

proteínas funcionais e uma cadeia substituta pré-Tα, 2a; essa mesma célula T ao receber sinais via TCR γδ

promove a internalização da cadeia funcional β e da cadeia substituta pré-Tα (Pré-TCR) e o desligamento da

expressão gênica dessas cadeias, originando células da linhagem γδ, 2b; quando o sinal é recebido via TCR

αβ ocorre a internalização das cadeias do TCR γδ, e a diferenciação da linhagem αβ, 2c; nas figuras 2d e 2e

os linfócitos T γδ e αβ iniciarão o processo de maturação e migrarão para outros sítios (Adaptado de

Janeway, CA, et al., 2000).

Os rearranjos gênicos encontrados nas células T γδ e αβ maduras sugerem que elas

divergem de um progenitor comum nos estágios mais tardios do desenvolvimento, quando

já ocorreram rearranjos gênicos. A diversidade do repertório de células T γδ é teoricamente

ainda maior do que o repertório de células T αβ, em parte por causa do reconhecimento de

seqüências adjacentes do segmento D que permite a junção de D a D. Certas células T γδ

possuem capacidade de se desenvolver na ausência de um timo funcional esse fenômeno é

encontrado por exemplo, em camundongos nude (Dunon, Courtois et al., 1997; Kang,

Coles et al., 1998; Fehling, Gilfillan et al., 1999; Hayday, Barber et al., 1999).

As células T γδ têm sido encontradas em grande quantidade no epitélio de alguns

órgãos expressando diferentes cadeias TCR Vγ/Vδ. A grande maioria das células T γδ

localizadas na epiderme expressam cadeias Vγ5Vδ1, as células T γδ intra-epiteliais

intestinais são praticamente Vγ7, as células uterinas apresentam cadeias Vγ6Vδ1 e no

sangue periférico encontramos duas variedades de cadeias δ predominantes, Vδ1 e Vδ2, a

freqüência destas células são alteradas com o tempo, uma vez que na fase inicial da vida há

um predomínio de células T Vδ1 e com o passar dos anos há uma expansão das células T

Vδ2 permanecendo durante a vida, aumento conseqüente do contato com patógenos

microbianos durante a infância (Goodman e Lefrancois, 1989; Havran, Grell et al., 1989;

Itohara, Farr et al., 1990; Pereira, Gerber et al., 1995). Outros rearranjos nas cadeias do

TCR γδ ocorrem em baixa freqüência nesta população de linfócitos T.

Algumas subpopulações de linfócitos T γδ não precisam sofrer expansão clonal

antes de responder efetivamente a um antígeno, apresentam propriedades diferentes no

reconhecimento de antígenos em relação aos receptores αβ, por não depender de

apresentação de antígenos pelas APCs via MHC (Davis, Boniface et al., 1998; Hayday,

2000). A especificidade de células T γδ envolve o reconhecimento de peptídeos virais,

antígenos livres, moléculas fosforiladas, alquilaminas, proteínas ligadas ao estresse como

as de choque térmico e lipídeos antigênicos, encontrados em micobactérias e outros

micróbios presentes nas barreiras epiteliais, esses antígenos podem ser apresentados

através de moléculas do tipo MHC de classe I não clássicas, ou via TCR, iniciando uma

resposta imunológica a pequenos números de micróbios comuns, antes do recrutamento de

células T αβ. A diversidade das cadeias do TCRγδ, geram células com diferentes funções,

acredita-se que o tipo da cadeia γ é que define o sítio para qual a célula irá residir (Davis,

Boniface et al., 1998; Hayday, 2000).

Um dos papéis chave dessas células T γδ é patrulhar e inspecionar o organismo,

destruindo as células que expressam um fenótipo anormal como resultado de estresse ou

infecção (Kang, Coles et al., 1998). Vários estudos realizados em camundongos com

deficiência de células T γδ, revelaram respostas exageradas a vários patógenos e mesmo

aos tecidos próprios, ao contrário de deficiências no controle e rejeição dos patógenos. Isso

levou a sugestão de que pelo menos algumas células T γδ exercem papel regulatório

mediante circunstâncias específicas, essa função seria consistente com sua capacidade

demonstrada em secretar citocinas regulatórias quando ativadas (Havran e Boismenu,

1994).

Dentre as células T γδ do sangue periférico de indivíduos saudáveis estão a

subpopulação de linfócitos T Vγ2Vδ2, a mais predominante, seguida pela subpopulação de

linfócitos T VγVδ1. Esses linfócitos circulantes têm demonstrado diferentes perfis durante

processos infecciosos ou estresse, porém os mecanismos específicos de cada subpopulação

ainda não estão totalmente entendidos. Essas células podem exercer atividade citolítica,

produzir citocinas padrão Th1 como Th2, além da subpopulação de células TVδ2 exercer

função de apresentadora de antígeno. As subpopulações Vδ1 e Vδ2 têm revelado diferentes

padrões de distribuição em tecidos humanos normais (Chervenak, Lederman et al., 1997;

Brandes, Willimann et al., 2005).

As células T γδ modulam a resposta inflamatória in situ, e podem reconhecer

diretamente moléculas induzidas sobre células epiteliais estressadas e entretanto podem

responder muito rapidamente ao ataque exógeno, essas funções caracterizam essas células

como sentinelas, as primeiras a chegar no local da infecção. A respeito da função

regulatória que essas células exercem no tecido epitelial, foi sugerido como principal

função à prevenção de uma resposta imunológica excessiva, de modo a evitar o

desenvolvimento de imunopatologias.

A participação dessas células durante o processo infeccioso causado pelo

M.tuberculosis, foi relatado em alguns estudos, porém o grau de importância e

envolvimento dessas células na imunopatogênese ainda precisa ser elucidado. Muito do

que se conhece hoje sobre as células T γδ tem reforçado a necessidade de entender como

estas células contribuem na resposta inicial. As células T Vδ2 são facilmente ativadas com

a entrada de agentes infecciosos no corpo, reativas a produtos liberados por bactérias vivas

intracelulares e extracelulares e participando da fase inicial da resposta imune (De Libero,

1997). Há evidências de que as células T Vδ2, assim como as células T αβ, contribuem na

resposta imunológica adaptativa contra as infecções micobacterianas (Shen, Zhou et al.,

2002). Em relação ao comportamento das células T Vδ1 durante a infecção pelo M.

tuberculosis e em outras infecções há relatos de uma possível contribuição na imunidade

inicial.

2. OBJETIVOS

1. Avaliar a freqüência das células T Vδ1 e Vδ2 nos pacientes com tuberculose

pulmonar ativa e na infecção latente.

2. Avaliar a distribuição dessas células durante o tratamento específico nos pacientes

com tuberculose pulmonar em atividade.

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Recrutamento dos Voluntári

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Imunologia II da Disciplina de

Infectologia da Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina-

UNIFESP. Os voluntários selecionados para a participação foram arrolados no Projeto de

pesquisa “Avaliação da Resposta Imunológica à Tuberculose” CEP 0925/04,

disponibilizados pela Dra. Denise Rodrigues.

Foram utilizadas amostras de 50 voluntários, recrutados do Instituto Clemente

Ferreira, com idade entre 18 e 60 anos, divididos em três grupos: 1) 20 pacientes com

diagnóstico clínico e bacteriológico de tuberculose pulmonar positiva, indivíduos que

apresentaram duas baciloscopias positivas e/ou uma cultura positiva para o M.tuberculosis;

ou uma baciloscopia positiva e imagem radiológica sugestiva.. Os pacientes desse grupo

foram seguidos após 30, 90 e 180 dias, quando o paciente recebeu alta por cura. 2) 20

voluntários saudáveis, contatos de pacientes com tuberculose, com reação cutânea positiva

ao PPD > 10 mm, e sem sinais clínicos ou laboratoriais de tuberculose em atividade. 3)10

voluntários sadios, sem história prévia de exposição ao Mycobacterium tuberculosis, sem

reação cutânea ao teste tuberculínico, forma utilizados como controles. Esses indivíduos

foram recrutados do Laboratório de Imunologia II, pertencente à Disciplina de Infectologia

da UNIFESP. Todos os voluntários assinaram consentimento informado para participação

no estudo.

O quadro clínico apresentado pelos pacientes no momento do diagnóstico da

tuberculose é relacionado na Tabela 1 (Anexo I).

3.2 Citometria de Fluxo

Imunofenotipagem

As amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo o anticoagulante Ácido

etileno-diamino-tetra-acético (EDTA) (BD Diagnostics, Plymouth, United Kingdon). Com

essa amostra foi realizada a separação das células mononucleares do sangue periférico

(CMSP) através da técnica de diferença de gradiente de densidade com a solução Ficoll

Hypaque

Plus (Amersham Biosciences Upsala, Suécia). Após a separação as células

mononucleares foram lavadas em solução PBS 1x (GIBCO- Invitrogen, Grand Island, NY,

USA), foram centrifugadas a 600g por 10 minutos em Temperatura ambiente. Após a

lavagem foram resuspensas em meio de cultura e preparadas com solução azul de Tripan

0,1% (Sigma-Aldrich chemie, Steinheim, Germany) para a contagem celular na câmara de

Neubauer. Em seguida, as células foram centrifugadas e congeladas em tubos de

criopreservação com meio de congelamento, esse processo foi realizado com auxílio de um

cooler refrigerado onde os criotubos foram manuseados e armazenados no freezer -80

durante 24 hrs e transferidas para o nitrogênio líquido.

Com o objetivo de caracterizar fenotipicamente o receptor de células T γδ, as

CMSPs foram descongeladas rapidamente em Banho Maria a 37º C e resuspensas em meio

de cultura, foram centrifugadas a 600g por 10 minutos em temperatura ambiente, em

seguida desprezado o sobrenadante as células foram resuspensas em meio de cultura para a

contagem celular. As células foram distribuídas na placa de fundo “V” 96 poços e

marcadas na superfície com anticorpos monoclonais, o anti- CD3, anti-Vδ1, anti-Vδ2, anti-

CD4 e anti- CD8, a placa foi incubada por 30 minutos a 4º C ao abrigo da luz, em seguida

foi centrifugada a 600g por 10 minutos, lavada 2x com tampão MACS -solução preparada

com PBS 1x, 250mM EDTA, e 10% de Albumina (Sigma-Aldrich chemie, Steinheim,

Germany) e centrifugada novamente, por fim as células foram fixadas em solução de

paraformaldeído 1% (Sigma-Aldrich chemie, Steinheim, Germany) e mantidas a 4º C ao

abrigo de luz até a aquisição no citômetro de fluxo FACS CANTO (Becton Dickinson, San

Jose, CA, EUA). A população de células T γδ foi definida pelas combinações de anticorpos

ligados à moléculas fluorescentes. Anti-Vδ2-PE (clone B6) e anti-Vδ1-FITC (clone T58.2)

(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), e anti –CD3- Alexa 750 ou PerCP (clone

SK7), anti-CD8- PerCP (clone SK1) e anti-CD4- APC (SK3) (BD Biosciences, San Diego,

CA). Todos os dados foram analisados utilizando software Flowjo (Tree Star Inc, Ashland,

OR).

3.3 Análise estatística

Os dados foram compilados e analisados no software Prism, versão 4.0 (GraphPad

Software, San Diego, CA). As comparações de grupos foram realizadas utilizando teste

não-paramétrico Kruskal Wallis, ANOVA, pós-teste; associações entre as variáveis foram

avaliadas pelo teste de Spearman na disposição de correlações. O valor p crítico foi

considerado estatisticamente significante quando < 0,05.

Um modelo de regressão logística múltiplo foi criado incluindo todos os 40

indivíduos expostos, e apresentavam as duas variáveis: indivíduos com tuberculose

pulmonar ou sem tuberculose pulmonar. O objetivo principal da análise multivariada foi

obter uma estimativa válida do relacionamento das células T Vδ1 e Vδ2 com o

desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa, confirmada por cultura de escarro

positiva, depois da exposição pelo M. tuberculosis. As variáveis explicativas avaliadas

incluíram: idade, sexo, quantidade total de células T γδ, a freqüência de células T Vδ1, a

freqüência de células T Vδ2, a freqüência de linfócitos, e a freqüência de células CD3 γδ+,

todos obtidos de sangue periférico.

A orientação geral, proposta por (Kleinbaum e Klein, 2002) foi utilizada para tentar

promover um relato mais consistente do modelo de estratégia empregado, e tornar isso

mais fácil para avaliar a validade dos resultados fornecidos. Depois de uma forma de

checagem da função, todas as variáveis contínuas foram transformadas em categóricas.

Três variáveis indicadoras foram criadas para idade (<30, ≥30 <50, e ≥50 anos) e o

percentual de 50 foi utilizado como cutoff para transformar as variáveis permanentes

dentro das duas condições. Todas as variáveis explicativas foram incluídas no modelo

final, mas nenhum termo de interação foi testado ou incluído no modelo final. A análise

multivariada foi realizada utilizando STATA 10.0 (Stata Corporation, Texas).

4. MANUSCRITO

Elevated Vδ

δδ

δ1 T cell frequency is independently associated with active tuberculosis

and proliferation during specific therapy

Priscilla Costa

, Denise Silva Rodrigues

1,2

, João Luiz Miraglia

, Jorge Barros Afiune

Fernando Fiuza de Melo

, Esper G. Kallas

1,3

Infectious Diseases Division, Federal University of São Paulo, São Paulo, Brazil

Clemente Ferreira Institute, São Paulo, Brazil

Clinical Immunology and Allergy Division, University of São Paulo, São Paulo, Brazil

Word count: 3477 words (excluding abstract, references, and legends)

Running title: Vδ1 and Vδ2 T cells in tuberculosis (35 characters).

Keywords: γδ T cells, Vδ1, Vδ2, tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis

Footnote page:

This work was supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq), grant #474092/2006-2. Ms. Costa was supported by the CNPq,

Brazilian Ministry of Science and Technology, and the Fundação de Amparo a Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP, scholarship #06/52989-2).

Conflicts of interest: The authors do not have any competing conflict of interest to declare.

Corresponding author: Esper Georges Kallas, M.D., Ph.D.

Laboratório de Imunologia II

Disciplina de Infectologia

Escola Paulista de Medicina / UNIFESP

Rua Mirassol 207

04044-010 - São Paulo - SP

Brazil

[email protected]

Abstract (1212 words)

Vδ1 T cells are capable of reponses to both tumors and foreign infections, but their

mechanisms are not fully understood. Other subsets critical to the γδ Τ cells group are the

Vδ2 T cells, known for their role in protection, antigen presentation, effector mechanisms,

and their critical part in the homeostasis of the immune system. We investigated the

frequency of both subsets of γδ T cells in an environment infected by Mycobacterium

tuberculosis, in samples that included tuberculosis patients, exposed individuals and

healthy controls. We demonstrated that frequency of Vδ2 T cells diminished in

tuberculosis patients, and remained steady during frequency. In contrast, the Vδ1 T cells

subset displayed not only increased frequency but also continued proliferation throughout

the course of specific therapy. This expansion of Vδ1 T cells may be caused by

chemokines, lymphokines or interactions with other cells of the immune system..

Unfortunately, these mechanisms remain unknown. The reduced frequency of Vδ2 T cells

reactive to M. tuberculosis suggest that a probable activation of these cells can promote

their proliferation, and Vδ1 T cells can present a secondary function as a response to this

infection, expanding and exerting effectors and cytotoxics mechanisms. We suggest that

Vδ1 T cells may play an important role in infectious diseases, and recommend future

studies exploring this hypothesis..

Introduction

Infection with Mycobacterium tuberculosis remains a public health crisis as it kills over

two million people every year and has infected more than two billion across the globe

(Koch-Weser, 1993; Kochi, 2001; Organization, 2006; Who, 2006) Tuberculosis may

develop anywhere in the body, but usually affects the lungs. Of all infection cases, only

5%-10% of the patients develop disease, and the activation of tuberculosis requires, in the

vast majority of cases, specific therapy.

In this disease, the immune response is primarily cellular and involves CD4+ and

CD8+ T cells as well as macrophages that together aim to control bacterial replication at

the infection site (Tan, Canaday et al., 1997; Behr-Perst, Munk et al., 1999). Others cells

of the immune system, like γδ T cells have been well described, mainly in infections

disease. γδ T cells comprise 5%-10% of all T lymphocytes in the peripheral blood. Their

main subsets express Vδ1 or Vδ2 gene segments and are differently distributed across the

tissues where they likely possess different functions (Chervenak, Lederman et al., 1997;

Brandes, Willimann et al., 2005). There are many functional attributes to γδ T cells, such

as their ability to recognize antigens without the need for processing and presentation by

classical MHC molecules, and the regulation of inflammatory response. When these cells

are absent, inflammation infiltrates and persists causing more severe tissue lesions (Fu,

Roark et al., 1994).Despite the evidence of their important role, knowledge of their

functions and contributions in anti-mycobacterial activity is not yet clearly understood

(Hayday, 2000).

Vδ2 T cells are known for their effector functions, and mainly secrete a variety of

cytokines and act as antigen presenting cells broadly reactive to phosphoantigens and

alkilamines (Constant, Davodeau et al., 1994; Tanaka, 1995; Belmant, 1999; Bukowski,

Morita et al., 1999; Tanaka, 2006). Some studies suggest the participation of these cells in

the early stage of the immune response to M. tuberculosis, therefore linking the innate and

adaptive immunity branches to a wide range of immunogens (De Libero, 1997).

Expansions of Vδ2 T cells are associated with the decline of bacterial burdens and

resolution of active BCG infection in monkeys (Lai, Shen et al., 2003). However, studies

have reported a decreased percentage of Vδ2 T cells in both the blood and BAL fluid of

patients with pulmonary tuberculosis when compared with control subjects (Li, Rossman et

al., 1996). However, this hypothesis is weakened due to its conflict with the concept of the

compartmentalization of Vδ2 T cells.

Studies have shown that in the gut, spleen, and thymus the Vδ1 T cells are the most

predominant of all γδ T cells. Vδ1 T cells express a set of chemokine receptors, (Falini,

Flenghi et al., 1989; Glatzel, Wesch et al., 2002), and can respond to APCs (Antigen

Presenting Cells) expressing CD1c specific molecules. This allows for an immune

response with the capacity to respond rapidly to nonpolymorphic molecules in the absence

of foreign antigens, which may activate or eliminate APCs (Spada, Grant et al., 2000). Vδ1

T cells can also respond to Epstein Barr virus- infected lymphocytes (Fujishima, Hirokawa

et al., 2007), and to infectious pathogens, but the nature of the antigens recognized by TCR

remains unknown. However, many characteristics about this subset, such as antigenic

specificity and functions, are not completely understood.

It is possible these cells are also nonspecifically activated via inflammatory

cytokines (Das, Sugita et al., 2004). Most Vδ1 T cells have also been reported to recognize

MICA and MICB, molecules that are induced by stress on intestinal epithelial cells and are

sometimes expressed by tumor cells (Groh, Steinle et al., 1998; Groh, Rhinehart et al.,

1999). Vδ1 can also express the molecule NKG2D, whose ligands are molecules

MICA/MICB, which appear to be dependent on biological stress caused by cellular

transformations and microbial infections. The interaction of NKG2D with its ligands

results in cytolysis of target cells in vitro (Wu, Groh et al., 2002; Wu, Wu et al., 2007)

It was reported that lung γδ T cells were activated after five days of infection, while

γδ TCR and NK cells seem to remain unchanged up to two weeks after the infection by

BCG (Bacillus Calmette-Guéran). The γδ T cells can be involved in the maintenance of the

balance between the host and the M. tuberculosis during the chronic infection.

In this study we compared tuberculosis patients with subjects exposed to M.

tuberculosis as well as healthy control subjects and concluded that immune mediators may

stimulate Vδ1 T cells, causing an exhaustion of the Vδ2 T cells in TB infected patients.

We also analyzed the frequency of Vδ1 and Vδ2 T cells after three and six months of

specific therapy to tuberculosis. We found an inversion of the Vδ1:Vδ2 T cells ratio in

peripheral blood of tuberculosis patients, suggesting that these cells may have different

roles and take distinct pathways in immunity to M. tuberculosis.

Materials and Methods

Study subjects

This study was performed using frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from

volunteers who had signed an Institutional Review Board (IRB)-approved informed

consent, in accordance with the guidelines of the Brazilian Ministry of Health. Fifty

individuals were enrolled at the Federal University of Sao Paulo and the Clemente Ferreira

Institute, and subsequently divided into three groups: 20 pulmonary tuberculosis patients,

20 subjects exposed to M. tuberculosis, and 10 healthy controls subjects. Pulmonary

tuberculosis (16 males, 4 females, average age of 38 years-old) was defined by clinical

history and a thorax chest roentgenogram suggestive of pulmonary tuberculosis. Infection

was confirmed by the presence of acid-fast bacilli in the smear and/or M. tuberculosis

positive sputum culture for resistant alcohol-acid bacillus Mycobacterium tuberculosis

(TBC). Exposure to M. tuberculosis (6 males, 14 females, average age of 41 years-old) was

defined by a positive tuberculin skin test (TST) in a subject reporting close contact with an

individual with active, sputum positive, symptomatic tuberculosis and lack of clinical

history or chest roentgenogram suggestive of active tuberculosis. Control subjects (1 male,

9 females, average age of 29 years-old) were defined by a negative TST and a history

lacking identified exposure to M. tuberculosis.

All the available TST results from 18 patients with pulmonary tuberculosis yielded

a positive response (≥10 mm induration). Tuberculosis patients were treated with six-

month tuberculosis combination therapy (rifampin, isoniazid, and pyrazinamide)

immediately after the diagnosis.

Flow cytometry

PBMC were obtained from the EDTA blood from the 50 volunteers by Ficoll Hypaque

(SIGMA) gradient centrifugation, and then frozen. Thawed PBMCs were analyzed for

staining T lymphocytes for the V of chain gamma-delta (γδ) receptor using surface staining

for CD3, Vδ1, Vδ2, CD4 e CD8. Cells were incubated for 30 minutes, washed twice, fixed

with 1% paraphormaldehyde and kept at 4ºC until acquisition in a FACSCanto flow

cytometer

(Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). γδ T cell populations were defined

using combinations of the following antibodies: PE labeled anti-Vδ2 (clone B6) and FITC

labeled anti-Vδ1 (clone T58.2) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), and Alexa

750 or PerCP labeled anti-CD3 (clone SK7), PerCP-labeled anti-CD8 (SK1) and APC-

labeled anti-CD4 (SK3) (BD Biosciences, San Diego, CA) (Figure 1). All the data were

analyzed using FlowJo software (Tree Star Inc, Ashland, OR).

Statistical analyses

Data sets were compiled and analyzed using Prism software, release 4.0 (GraphPad

Software, San Diego, CA). Group comparisons were performed using non-parametric

Kruskal Wallis test, ANOVA by ranks test to evaluate associations between variables

inside the group and Dunn’s Multiple comparison test to find between which groups that

could be the significant results. Critical p values were considered statistically significant

when <0.05.

A multiple logistic regression model was created including all the 40 exposed individuals,

and had as the dichotomous outcome pulmonary tuberculosis or no pulmonary

tuberculosis. The primary objective of this multivariate analysis, performed through a

logistic regression model, was to obtain a valid estimate of the relationship of Vδ1 and

Vδ2 cells, and the development of active pulmonary tuberculosis, confirmed by a positive

sputum culture, after exposure to M. tuberculosis. The explanatory variables measured

included: age, sex, total count of γδ T cells, frequency of Vδ1 cells, frequency of Vδ2 T

cells, frequency of lymphocytes, and frequency of γδ T cells stained using CD3, all

obtained from peripheral blood.

A general guideline, proposed by Kleinbaun and Klein,(Kleinbaum e Klein, 2002) was

used to try to provide a more consistent report of the modeling strategy employed, and to

make it easier to assess the validity of the results provided. After a function form check, all

continuous variables were transformed into categorical ones. Three indicators variables

were created for age (<30 years old, ≥30 <50 years old, and ≥50 years old), and the 50

percentile was used as the cut-off to transform the remaining variables into dichotomous

ones. All explanatory variables were included in the final model, but no interaction terms

were tested or included in the final model. The multivariate analyses were performed

using STATA 10.0 (Stata Corporation, Texas).

Results

Vδ1 and Vδ2 T cells distribution is changed in active tuberculosis

Initially, we observed that the overall γδ T cell frequency in peripheral blood in active

tuberculosis was decreased compared to the controls subjects. When analyzing the

phenotypic distribution of the Vδ1 and Vδ2 T cells, we found a reduced number of Vδ2 T

cells in tuberculosis patients (median 1.2 [IQR 0.6-3.0]), compared to exposed and controls

subjects, with 2.3 [IQR 1.1-4.2] and 4.3 [IQR 1.3-6.7], respectively, (Figure 2A, Kruskal

Wallis test shown p>0.05). We also observed an increase of Vδ1 T cell numbers in

tuberculosis patients (median 2.1 [IQR 2.5-0.7]), almost three fold higher when compared

with exposed and controls subjects (median 1.0 [IQR 0.6-1.6] and 0.7 [IQR 0.5-3.2],

respectively, Figure 2B). This, however, was not statistically significant, (Kruskal-Wallis

p>0.05). To investigate the phenotype of the subsets of γδ T cells, we verified whether in

some samples of patients the γδ T cells were stained by CD4 and/or CD8. It was observed

that more than 50% of Vδ1 T cells expressed CD4 molecules, and only 10% were CD8+,

while Vδ2 T cells were almost entirely CD8- CD4- with only 10% CD4+ and 5% CD8+

(Figure 1).

The increase in Vδ1 frequency was independently associated with active tuberculosis after

multivariate analyses

The results from the multiple logistic regression models support the finding that

individuals with active pulmonary tuberculosis had a higher frequency of Vδ1 T cells in

the peripheral blood when compared to the exposed individuals that did not develop active

disease (OR

Vδ1

=18.28; 95% CI 1.27-261.31; p=0.032). Although the frequency of Vδ2 T

cells and the total count of γδ T cells in the peripheral blood was lower in the individuals

with active pulmonary tuberculosis when compared to exposed individuals who did not

develop active disease, the results were not statistically significant (OR

Vδ2

=0.63; 95% CI

0.08-4.83; p=0.6; OR

γδ

=0.62; 95% CI 0.09-4.27; p=0.6, respectively).

Vδ1 T cell frequency increases during specific therapy for tuberculosis

After detecting a higher frequency of Vδ1 T cells during active pulmonary tuberculosis, we

decided to monitor these active pulmonary tuberculosis patients receiving specific therapy

over time. We detected that Vδ1 cells continued to increase after three and six months of

specific therapy, the Kruskal-Wallis test shown p<0.01 (Fig. 3A), while Vδ2 T cells

remained stable (Fig. 3B, p>0.05). The observed increase of γδ T cell frequency after

therapy (data not shown), was therefore, caused by the continued increase of Vδ1 T cells.

We observed that the imbalance between Vδ1 and Vδ2 T cell frequency elevated the

Vδ1:Vδ2 ratio between 5 to 8 fold more in pulmonary tuberculosis (median value for TBC

of 1.5, IQR 0.5-3.0), compared to PPD+ group (0.3, IQR 0.2-0.8) and CTL group (0.2, IQR

0.1-2.1), which was a statistically significant statistic (Figure 4, p=0.01), and was done

Dunn’s Multiple comparison test and was found the significant difference primarily

between patients vs. control subjects (p<0.05).

Vδ1:Vδ2 ratio and tuberculin skin test reactivity

We further explored whether the skin test reactivity to PPD could correlate with the

frequency of Vδ1 or Vδ2 T cell frequency or Vδ1:Vδ2 ratio. Although no statistically

significant correlation was found, a trend between Vδ1:Vδ2 ratio and the PPD test results

was observed (Spearman r=0.24, p>0.05, graphic not shown).

Discussion

In this study we demonstrated that Vδ2 T cells are diminished in tuberculosis patients, in

contrast with Vδ1 cells, which not only increased in percentage, but also continued to

proliferate throughout the course of tuberculosis treatment. As a result, Vδ1:Vδ2 ratio is

increased in tuberculosis patients, and continues to increase during the specific therapy.

These observations enable those studying the pathogenesis of M. tuberculosis infection to

raise several hypotheses, but clearly points to a bona fide engagement of Vδ1 T

lymphocytes in the immune response against this pathogen.

In contrast with the well-described functionality of Vδ2 cells, Vδ1 T cell function

remains poorly understood. Some studies have noted an increase in Vδ2 T cells during

active TB, while others revealed contrasting results, similar to our own. Belles et al.

reported that clinically advanced pulmonary tuberculosis patients can present chronic

activation of these Vδ2 cells, with a consequent increase in production of IL-2, and cellular

death promoted by higher expression of Fas:FasL signaling to initiate the cascade of

apoptosis (Belles, Kuhl et al., 1996; Duarte, Ramirez et al., 1997). This reduction can be

also related to an exhaustion of Vδ2 T cells (Ueta, Tsuyuguchi et al., 1994) or to a possible

migration to the site of infection or secondary lymphoid organs. These studies suggest that

conditions such as the control of bacterial growth and/or restriction at the site would result

in reduced activation and would promote the survival and expansion of Vδ2 T cell subsets

in a majority of the M. tuberculosis exposed individuals.

Various properties of Vδ1 T cells and their behavior in TB disease and other

infections suggest their role in early immunity. These cells can recognize and lyse

expressed CD1c+ cells through a specific interaction involving γδ TCR, CD1c and lipidic

components (Spada, Grant et al., 2000). A recent study showed that human γδ T cells are

partially activated through NKG2D alone. NKG2D ligand MIC A can induce an increase

of cellular activation and stimulate the production of TNF-α and the release of cytolytic

granules (Rincon-Orozco, Kunzmann et al., 2005). Its mechanisms shows that Vδ1 T cells

may help bridge the gap between innate and adaptive immunity.

Recently, a new interleukine, called IL-17, has been of increasing interest. New

results about the role of this IL-17 showed that it is produced by CD4 T cells and also

suggest that this cytokine is rather important in the induction of optimal Th1 response and

protective immunity against mycobacterial infection (Wu, Groh et al., 2002; Umemura,

Yahagi et al., 2007). Umemura, Yahagi et al., 2007, showed in mice that the major IL-17

producers were the γδ T cells, specifically Vδ1 (Umemura, Yahagi et al., 2007). However,

this it still was not demonstrated in human cells. We found an expansion of Vδ1 T cells in

tuberculosis patients, and it would be very interesting if the functional properties of Vδ1 T

cells were identified in tuberculosis patients. The IL-17 producers may be related to

progression of disease, and it is possible that compromising the IL-17 producing capacity

by such cells can promote a decrease of Th1 response during active tuberculosis. Future

experiments are needed to confirm this hypothesis. Studies regarding other immune

stimulating factors have shown the contribution of Vδ1 T cells in host defense against

tumors and microbial infection through perforin-dependent cytolytic pathway (Hayday,

2000). Vδ1 T cells can participate in several ways, but the fundamental cause of their

increased frequency in the patients remains unclear.

Our results have shown that Vδ2 T cells are diminished before and after therapy.

To help explain this finding, we suggest a possible compartmentalization of these cells in

the lung. Cytotoxic activity has been reported for these cells against a variety of target

cells, including M. tuberculosis-infected macrophages (Dieli, Troye-Blomberg et al., 2000;

Caccamo, Barera et al., 2003). The cytotoxic activity of γδ T cells in the lung must be

important to containing the amount of bacilli, promoting the development of the protective

immune response in the early stage of M. tuberculosis infection (Caccamo, Sireci et al.,

2006), and may influence the immune response in anergic patients.

It was demonstrated that Vδ1 T cells markedly respond to total lipid extracts of

Gram-negative bacteria, whereas Vδ2 T cells did not respond similarly (Das, Sugita et al.,

2004). The presence of co-stimulatory molecules, lymphokines, and chemokines

contributes to the activation of leucocytes in the immune response to infectious pathogens.

Nevertheless, the influence of interleukin IL-12 produced by dendritic cells in the

proliferation and activation of Vδ1 T cells has been reported, and it does not occur with

Vδ2 T cells. The interaction between Vδ1 T cells and dendritic cells are of critical

importance in the activation of T cells (Das, Sugita et al., 2004).

Studies have shown that γδ T cells significantly influence the development of

cytotoxic specific-antigen CD8+ T cells and the maturation of dendritic cells. These

interactions suggest that γδ T cells must help in the control of the mycobacterial infection

in the transition period between innate immunity and the adaptive CD8 T cell mediated

response (Caccamo, Sireci et al., 2006). Andersen, 1997, concluded that improvement in

the cellular immune response against M. tuberculosis is necessary to most effectively

present and recognize these key antigens and promote a successful immune response

(Andersen, 1997).

We conclude that Vδ1 and Vδ2 T cells participate in distinct mechanisms in the

immune response against M. tuberculosis infection as suggested by their different behavior

and inversion of frequencies. Additional studies about Vδ1 and Vδ2 T cells are needed to

explore the integration of signals, their intercellular interactions in immune response,

infection outcomes and, finally, to identify the stimulating factor for δ1 T cells in infection.

Future development of efficient Tuberculosis vaccines may target γδ T cells, priming the

immune system’s innate response to M. tuberculosis.

Acknowledgments

We would like to thank Colyn Watkins in the preparation of the manuscript, to Debora

Rocha for the assistance in blood collection, and Dr. Lishomwa Ndhlovu for the helpful

scientific discussions. We are also grateful to Helena Tomiyama for the continuous

laboratory support.

References

Andersen, P. Host responses and antigens involved in protective immunity to

Mycobacterium tuberculosis. Scand J Immunol, v.45, n.2, Feb, p.115-31. 1997.

Behr-Perst, S. I., M. E. Munk, et al. Phenotypically activated gammadelta T lymphocytes

in the peripheral blood of patients with tuberculosis. J Infect Dis, v.180, n.1, Jul, p.141-9.

1999.

Belles, C., A. K. Kuhl, et al. Bias in the gamma delta T cell response to Listeria

monocytogenes. V delta 6.3+ cells are a major component of the gamma delta T cell

response to Listeria monocytogenes. J Immunol, v.156, n.11, Jun 1, p.4280-9. 1996.

Belmant, C., Espinosa, E., Poupot, R., Peyrat, M. A., Guiraud, M., Poquet, Y., Bonneville,

M., Fournie, J. J. 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphate A novel mycobacterial metabolite-

activating human gamma delta T cells. J. Biol Chem., v.274, p.32079-89. 1999.

Brandes, M., K. Willimann, et al. Professional antigen-presentation function by human

gammadelta T Cells. Science, v.309, n.5732, Jul 8, p.264-8. 2005.

Bukowski, J. F., C. T. Morita, et al. Human gamma delta T cells recognize alkylamines

derived from microbes, edible plants, and tea: implications for innate immunity. Immunity,

v.11, n.1, Jul, p.57-65. 1999.

Caccamo, N., A. Barera, et al. Cytokine profile, HLA restriction and TCR sequence

analysis of human CD4+ T clones specific for an immunodominant epitope of

Mycobacterium tuberculosis 16-kDa protein. Clin Exp Immunol, v.133, n.2, Aug, p.260-6.

2003.

Caccamo, N., G. Sireci, et al. gammadelta T cells condition dendritic cells in vivo for

priming pulmonary CD8 T cell responses against Mycobacterium tuberculosis. Eur J

Immunol, v.36, n.10, Oct, p.2681-90. 2006.

Chervenak, K. A., M. M. Lederman, et al. Bacterial antigen activation of Vdelta1 and

Vdelta2 gammadelta T cells of persons infected with human immunodeficiency virus type

1. J Infect Dis, v.175, n.2, Feb, p.429-33. 1997.

Constant, P., F. Davodeau, et al. Stimulation of human gamma delta T cells by nonpeptidic

mycobacterial ligands. Science, v.264, n.5156, Apr 8, p.267-70. 1994.

Das, H., M. Sugita, et al. Mechanisms of Vdelta1 gammadelta T cell activation by

microbial components. J Immunol, v.172, n.11, Jun 1, p.6578-86. 2004.

De Libero, G. Sentinel function of broadly reactive human gamma delta T cells. Immunol

Today, v.18, n.1, Jan, p.22-6. 1997.

Dieli, F., M. Troye-Blomberg, et al. Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes reduce the viability

of intracellular Mycobacterium tuberculosis. Eur J Immunol

, v.30, n.5, May, p.1512-9.

2000.

Duarte, R., R. Ramirez, et al. A role for gamma delta T lymphocytes in the development of

advanced clinical forms of tuberculosis in HIV-infected patients. Aids, v.11, n.1, Jan,

p.130-2. 1997.

Falini, B., L. Flenghi, et al. Distribution of T cells bearing different forms of the T cell

receptor gamma/delta in normal and pathological human tissues. J Immunol, v.143, n.8,

Oct 15, p.2480-8. 1989.

Fu, Y. X., C. E. Roark, et al. Immune protection and control of inflammatory tissue

necrosis by gamma delta T cells. J Immunol, v.153, n.7, Oct 1, p.3101-15. 1994.

Fujishima, N., M. Hirokawa, et al. Skewed T cell receptor repertoire of Vdelta1(+)

gammadelta T lymphocytes after human allogeneic haematopoietic stem cell

transplantation and the potential role for Epstein-Barr virus-infected B cells in clonal

restriction. Clin Exp Immunol, v.149, n.1, Jul, p.70-9. 2007.

Glatzel, A., D. Wesch, et al. Patterns of chemokine receptor expression on peripheral

blood gamma delta T lymphocytes: strong expression of CCR5 is a selective feature of V

delta 2/V gamma 9 gamma delta T cells. J Immunol, v.168, n.10, May 15, p.4920-9. 2002.

Groh, V., R. Rhinehart, et al. Broad tumor-associated expression and recognition by

tumor-derived gamma delta T cells of MICA and MICB. Proc Natl Acad Sci U S A, v.96,

n.12, Jun 8, p.6879-84. 1999.

Groh, V., A. Steinle, et al. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal

epithelial gammadelta T cells. Science, v.279, n.5357, Mar 13, p.1737-40. 1998.

Hayday, A. C. [gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third

way of protection. Annu Rev Immunol, v.18, p.975-1026. 2000.

Koch-Weser, D. BCG vaccination. Can it contribute to tuberculosis control? Chest, v.103,

n.6, Jun, p.1641-2. 1993.

Kochi, A. The global tuberculosis situation and the new control strategy of the World

Health Organization. 1991. Bull World Health Organ, v.79, n.1, p.71-5. 2001.

Lai, X., Y. Shen, et al. Immune biology of macaque lymphocyte populations during

mycobacterial infection. Clin Exp Immunol, v.133, n.2, Aug, p.182-92. 2003.

Li, B., M. D. Rossman, et al. Disease-specific changes in gammadelta T cell repertoire and

function in patients with pulmonary tuberculosis. J Immunol, v.157, n.9, Nov 1, p.4222-9.

1996.

Spada, F. M., E. P. Grant, et al. Self-recognition of CD1 by gamma/delta T cells:

implications for innate immunity. J Exp Med, v.191, n.6, Mar 20, p.937-48. 2000.

Tan, J. S., D. H. Canaday, et al. Human alveolar T lymphocyte responses to

Mycobacterium tuberculosis antigens: role for CD4+ and CD8+ cytotoxic T cells and

relative resistance of alveolar macrophages to lysis. J Immunol, v.159, n.1, Jul 1, p.290-7.

1997.

Tanaka, Y. Human gamma delta T cells and tumor immunotherapy. J Clin Exp Hematop,

v.46, n.1, Mar, p.11-23. 2006.

Tanaka, Y., Morita, C.T., Tanaka, Y., Nieves, E., Brenner, M.B., Bloom, B. R. Natural and

synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells. Nature, v.375,

p.155-8. 1995.

Ueta, C., I. Tsuyuguchi, et al. Increase of gamma/delta T cells in hospital workers who are

in close contact with tuberculosis patients. Infect Immun, v.62, n.12, Dec, p.5434-41. 1994.

Umemura, M., A. Yahagi, et al. IL-17-mediated regulation of innate and acquired immune

response against pulmonary Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin infection. J

Immunol, v.178, n.6, Mar 15, p.3786-96. 2007.

Who. Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planing Financing. WHO report. 2006.

Wu, H. P., C. L. Wu, et al. Efficiency of interleukin-4 expression in patients with

tuberculosis and nontubercular pneumonia. Hum Immunol, v.68, n.10, Oct, p.832-8. 2007.

Wu, J., V. Groh, et al. T cell antigen receptor engagement and specificity in the

recognition of stress-inducible MHC class I-related chains by human epithelial gamma

delta T cells. J Immunol, v.169, n.3, Aug 1, p.1236-40. 2002.

Table 1. Demographics, TST response, and cell counts of the study subjects.

Subject number Age Gender TST** CD3 count CD4 count CD8 count

TBC group (years) (mm)

(cells/

µµ

l) (cells/

µµ

l) (cells/

µµ

102*

57 M 15 ND*** ND ND

103*

56 M 15 1164 767 368

106

43 M 15 1095 742 241

110

29 M 13 1453 1029 408

111

16 M 18 1232 684 465

114

29 M 10 ND ND ND

118

50 M 17 ND ND ND

122*

19 M 14 ND ND ND

123

23 F 18 ND ND ND

124

45 M 20 1293 808 470

126

47 M 19 1086 609 448

127

43 M 17 863 664 187

128

43 M 16 984 601 348

129*

53 M 17 1801 1094 723

131*

51 M 17 1065 777 277

132

30 M 0 1114 698 396

133

20 F 11 1142 717 371

134

21 F ND 1093 677 300

138*

32 F 21 723 511 192

140*

58 M 14 1016 420 577

PPD group

302

45 F 20 3734 1556 2017

304

50 M 19 1561 824 724

305

20 M 8 1518 787 687

308

41 F 16 1931 1408 456

309

44 F 21 1911 1236 615

310

45 F 14 2004 1227 695

311

52 F 11 ND ND ND

314

43 M 17 ND ND ND

315

47 F 18 ND ND ND

318

56 F 22 1917 1131 760

319

27 M 10 1531 1010 478

320

43 F 16 1714 1195 480

321

51 F 0 935 592 246

322

53 F 18 1159 884 234

323

38 M 22 1587 798 677

324

56 F 15 1969 1280 641

325

25 F 13 1691 929 710

326

41 M 14 1462 812 589

336

22 F 0 1835 1184 581

337

18 F 0 2174 981 1012

CTL group

401

24 F 0 ND ND ND

403

40 F 0 993 670 296

406

21 F 0 1854 1128 505

407

27 F 0 1816 860 685

408

21 F 0 1315 836 365

409

31 F 0 1879 1202 622

410

31 F 0 1806 1018 646

411

31 F 0 1077 600 434

412

30 F 0 1468 956 398

413

38 M 0 909 632 283

424

31 M 0 1525 1090 380

*Patientes that were follwing after three and six months after therapy.

**TST: Tuberculin skin test reactivity, reaction measured in milimeters (mm).

***ND: not done

Figure Legends

Figure 1. Identification of Vδ1 and Vδ2 cells using flow cytometry. (A) The lymphocytes

were gated on a forward and side scatter dot plot, followed by identification of T cells in a

CD3 staining histogram. A dot plot depicting Vδ1 and Vδ2 staining was made with T cell

events. The dot plots in the lower row show examples of a healthy control volunteer

(CTL), PPD reactive subject (PPD+), and a tuberculosis patient (TBC). (B) Frequency of

Vδ1 cells among CD4+ and CD8+ T cells.

Figure 2. Frequency of (A) Vδ2 and (B) Vδ1 T cells and (C) Vδ1:Vδ2 ratio in the groups

of participantes. CTL: healthy subjects; PPD+: subjects exposed to M. tuberculosis; TBC:

pulmonary tuberculosis patients; The datas were analysed by Kruskal Wallis test, only

p<0.05 value was considered significant result and was performed Dunn’s Multiple

comparison test. Figure (C) the analysis obtained Kruskal-Wallis p=0.01 and was

performed the Dunn’s Multiple comparison test to find where was the diference, and the

result shown significant difference between healthy controls (CTL) and tuberculosis

patients (TBC) groups, p<0.05.

Figure 3. Frequency of (A) Vδ1 or (B) Vδ2 T cells in the pulmonary tuberculosis group

before (Day 0) and after specific therapy (Day 90 and Day 180). The data were analysed

by ANOVA two -way test, only the analysis of figure (A) was significant statisticaly,

shown p<0.01.

Figure 1A

PPD

TBC

CTL

0.81

1.76

0 10

<PE-A>: delta 2

0.91

4.24

2.29

0.64

FSC

50K

100K

150K

200K

250K

50K

100K

150K

200K

250K

48.4

1000

2000

3000

4000

# Cells

56.7

0.64

2.54

1-FITC

δδ

2-PE

CD3-APC-

CY7

δδ

2-PE

SSC

1-FITC

Figure 1B.

1-FITC

0 10

<PE-Cy7-A>

<FITC-A>

3.041.13

CD4-PE CY7

1-FITC

<PerCP-A>

0.56

2.42

CD8-PerCP

Figure 2A

Figure 2B

CTL

PPD+

TBC+

0.1

100

p>0.05

CTL

PPD+

TBC

CTL

PPD+

TBC+

0.01

0.1

100

p>0.05

δδ

2 among T cells

TBC

CTL

PPD+

δδ

1 among T cells

Figure 2C

CTL

PPD+

TBC+

0.01

0.1

100

p<0.05

p=0.01

% V

δδ

1: V

δδ

2 ratio

TBC

CTL

PPD

% V

1:V

2 ratio

Figure 3A

Figure 3B

δδ

2 T cells after therapy

0.01

0.1

100

p >0.05

Day 0

Day 90

Day 180

0.1

100

p <0.01

δδ

1 T cells after therapy

TBC Pa

ients

Day 0

Day 90 Day 180

Day 0

Day 90

Day 180

TBC Pa

ients

DISCUSSÃO

A descrição das funções e mecanismos pela qual as células T γδ participam da

resposta imunológica permanece superficial. Num quadro de infecção pelo Mycobacterium

tuberculosis, a interação das células T γδ com a micobactéria varia de acordo com o

estágio da infecção. A ocorrência de tuberculose pulmonar em adultos usualmente ocorre

como resultado de infecção pelo M. tuberculosis ou diminuição da imunidade, resultando

em reativação da infecção latente, que é conseqüência de supressão imunológica ou de

defeito celular dos pacientes que desenvolvem a doença.

Neste trabalho, observamos que as subpopulações de células T γδ, células TVδ1 e

Vδ2 comportaram-se de forma diferente no sangue periférico de pacientes ao ser

comparadas com indivíduos controles. A freqüência das células T Vδ2 mostrou-se

diminuída, ao contrário das células T Vδ1, com freqüência aumentada. Ao monitorar a

freqüência dessas células nos pacientes com tuberculose pulmonar após três e seis meses

de terapia específica, as células T Vδ2 não apresentaram alterações percentuais

significativas, enquanto que as células T Vδ1 tiveram aumento contínuo de sua freqüência.

Os resultados mostram que as células T Vδ2 permaneceram diminuídas antes e depois da

terapia. Correlacionamos a proporção de células T Vδ1:Vδ2 com a reatividade ao teste

tuberculínico, porém não encontramos significância estatística. Esta correlação foi baseada

num achado em que as células T γδ representaram cerca de 20 a 40% do total de linfócitos

T presentes nas lesões de pele resultantes da reação de hipersensibilidade do tipo tardia ao

Mitsuda, teste de sensibilidade ao Mycobacterium leprae (Porcelli, Brenner et al., 1991).

Alguns estudos revelaram um aumento na freqüência das células T Vδ2 no sangue

periférico de pacientes com tuberculose ativa, enquanto outros estudos relataram resultados

semelhantes ao nosso, apresentando freqüência reduzida dessas células. Belles, C. et al,

1996, mostrou que pacientes com tuberculose clinicamente avançada apresentaram células

TVδ2 ativadas cronicamente, um aumento crescente na produção de interleucina- 2 (IL-2)

e um aumento no percentual de morte celular desencadeada pela alta interação entre as

moléculas Fas e FasLigante (Fas: FasL), expressas na superfície das células alvo, dão

início ao processo apoptótico (Belles, Kuhl et al., 1996). A redução dessas células na

periferia de alguns processos infecciosos pode estar relacionada com sua possível migração

para o local da infecção ou para órgãos linfóides secundários (Ueta, Tsuyuguchi et al.,

1994). Acredita-se que um provável defeito na função efetora das células T Vδ2 em

pacientes tuberculosos pode resultar em ativação crônica e exaustão dessas células. Essa

possibilidade é baseada no achado de que pacientes com tuberculose ativa possuem uma

diminuição nos números de células T efetoras Vδ2 e uma diminuição na função efetora in

vitro, em resposta a fosfoantígenos (Ueta, Tsuyuguchi et al., 1994). Essa redução na

população de Vδ2 na tuberculose ativa é consistente com o papel sugerido a essas células,

na manutenção do equilíbrio entre o hospedeiro e o M. tuberculosis durante a infecção

crônica (Carvalho, Matteelli et al., 2002).

As células T Vδ2, por possuir a capacidade de secretar moléculas bactericidas e

citotóxicas como perforina e granulisina, têm contribuído para a morte de microorganismos

residentes em compartimentos intracelulares (Dieli, Troye-Blomberg et al., 2001). Alguns

estudiosos acreditam que o controle do crescimento bacteriano e/ou a restrição da

micobactéria no local da infecção resultaria em uma menor ativação e promoveria a

sobrevivência das células T Vδ2 na maioria dos indivíduos infectados pelo M.

tuberculosis.

As células T Vδ1 e Vδ2 exercem função citotóxica mediante expressão de

moléculas natural killer NKG2D, cujos ligantes são as moléculas MICA e MICB,

produzidas mediante estresse biológico desencadeado por transformações celulares e

infecções microbianas. A interação de NKG2D com seus ligantes resultam na lise das

células alvo in vitro (Wu, Groh et al., 2002). As células alteradas podem ser reconhecidas e

mortas por essas células Tγδ, reparando o tecido injuriado (Havran e Boismenu, 1994).

O comportamento das células T Vδ1 tem apresentado relevantes contribuições na

defesa do hospedeiro contra tumores e infecções através de vias citotóxicas (Hayday,

2000). Essas células podem reconhecer e lisar células que expressam moléculas CD1c,

através da interação específica dessa molécula com antígenos lipídicos e o TCR γδ (Spada,

Grant et al., 2000). Essas células foram descritas pela primeira vez apresentando uma

resposta marcante a extratos lipídicos totais de bactérias Gram-negativas, enquanto as

células T Vδ2 não exerceram essa resposta (Das, Sugita et al., 2004). As células T Vδ1

exercem sua função citotóxica contra uma variedade de células alvos, incluindo

macrófagos infectados pelo M. tuberculosis (Dieli, Troye-Blomberg et al., 2000; Caccamo,

Barera et al., 2003). A atividade citotóxica das células T γδ no pulmão dos pacientes com

tuberculose deve ser importante nos termos de limitar a quantidade dos bacilos (Caccamo,

Sireci et al., 2006). A indução da apoptose nos macrófagos infectados levam a erradicação

dos patógenos microbianos, essa ação iniciada pelas células T γδ, é fisiologicamente

importante, já que a morte celular por necrose não consegue eliminar os patógenos

intracelulares influenciando, assim, a resposta imune dos pacientes anérgicos e

promovendo o desenvolvimento de uma imunidade protetora no estágio inicial da infecção

pelo M. tuberculosis.

A ativação de células T γδ durante os estágios iniciais e progressivos da infecção,

pode auxiliar na sinalização de citocinas e quimiocinas locais necessárias para promover

uma resposta protetora (D'souza, Cooper et al., 1997). Aparentemente, citocinas como a

IL-12 exercem propriedades regulatórias, conectando a imunidade inata e a adaptativa na

resposta do hospedeiro contra a micobactéria (Sieling, Wang et al., 1994; O'neill e Greene,

1998). A IL-12 tem sido detectada na tuberculose em infiltrados pulmonares (Casarini,

Ameglio et al., 1999), na pleura (Zhang, Gately et al., 1994) e em granulomas (Bergeron,

Bonay et al., 1997). Experimentos com camundongos knockout para a IL-12, mostraram

que a ausência dessa interleucina enfraquece a resposta imunológica, tornando o

camundongo mais susceptível a infecções micobacterianas (Cooper, Magram et al., 1997).

A participação das células T γδ na imunidade tem sido ampliada, uma vez que elas

participam do desenvolvimento e maturação de outras células. As células dendríticas foram

caracterizadas como de importância crucial na proliferação e ativação das células T Vδ1

através da produção de IL-12, mas esta influência não foi observada nas células T Vδ2

(Das, Sugita et al., 2004). A proliferação das células T Vδ1 em pacientes com tuberculose

encontrada neste trabalho pode estar relacionada a essa interação. Estudos posteriores

poderão confirmar o papel das células T Vδ1 na imunidade contra o M. tuberculosis,

identificando a via pela qual estas células são ativadas. A interação das células T γδ no

desenvolvimento e maturação das células T CD8+ citotóxicas específicas a antígenos

sugere função de auxílio no controle da infecção micobacteriana, no período de transição

entre a imunidade inata e adaptativa da resposta mediada por células T CD8+(Caccamo,

Sireci et al., 2006).

Recentes trabalhos têm descrito importantes funções da interleucina IL-17, como

uma ótima indução da resposta Th1 e uma imunidade protetora contra a infecção

micobacteriana. Células T Vδ1 têm sido descritas como grandes produtoras de IL-17

(Umemura, Yahagi et al., 2007). A interleucina IL-17 possui um papel chave na indução

de neutrófilos durante infecção micobacteriana pulmonar. Cerca de 45 % das células TCR

γδ produziam IL-17 em células do baço de camundongos infectados pelo M. bovis BCG.

Essa interleucina mostrou ser extremamente útil, podendo ser usada como adjuvante num

modelo vacinal para potencializar a resposta Th1 (Umemura, Yahagi et al., 2007).

Estudos adicionais sobre células T Vδ1 e Vδ2 são necessários para uma melhor

descrição dos sinais de integração e interações intercelulares na resposta imune e

resoluções de infecções. O desenvolvimento de vacinas tuberculosas podem alvejar as

células Tγδ, iniciando uma resposta imune inata contra o M. tuberculosis, potencializar a

resposta imunológica contra o Mtb e a ativação das propriedades imunoregulatórias dessas

células e por interagir com outras células imunes, auxiliando-as no processo de maturação.

Esses dados estão embasados na hipótese de papel essencial na elaboração da resposta

imunológica a micobactéria. Células T γδ executam funções únicas e eficientes, logo têm

papel necessário na manutenção da competência imunológica, (Porcelli, Brenner et al.,

1991).

Andersen, P. et al, 1997, afirmou que na luta contra o Mycobacterium tuberculosis

para se obter uma resposta celular mais efetiva seria necessário uma melhora na

apresentação e no reconhecimento de antígenos chaves, para então se ter uma resposta bem

sucedida (Andersen, 1997). As células T γδ ajudam a orquestrar a resposta imunológica a

infecções por participar da maioria dos eventos ocorridos na imunidade.

Nossos resultados contribuem para esclarecer como a frequência de subpopulações

de linfócitos T γδ, especificamente as subpopulações Vδ1 e Vδ2, se comportam na

infecção aguda e no curso do tratamento. É fundamental utilizar esses dados para planejar

novos experimentos que esclareçam o papel funcional de tais subpopulações na patogênese

da infecção pelo M. tuberculosis e no desenvolvimento da tuberculose.

7.CONCLUSÕES

1. Foi encontrada uma inversão nas taxas de linfócitos T Vδ1 e Vδ2 do sangue

periférico dos pacientes com tuberculose ativa quando comparados com indivíduos

expostos ao M. tuberculosis e controles saudáveis;

2. A freqüência dos linfócitos T Vδ1 revelou-se maior do que a freqüência dos

linfócitos T Vδ2 na tuberculose ativa;

3. O aumento na freqüência dos linfócitos T Vδ1 apresentou-se contínuo nos

pacientes com tuberculose até o termino do tratamento;

4. A subpopulação de linfócitos T Vδ2 mostrou-se reduzida nos pacientes com

tuberculose ativa, perdurando até o fim do tratamento;

6. BIBLIOGRAFIA

Abebe, F., C. Holm-Hansen, et al. Progress in serodiagnosis of Mycobacterium

tuberculosis infection. Scand J Immunol, v.66, n.2-3, Aug-Sep, p.176-91. 2007.

Andersen, P. Host responses and antigens involved in protective immunity to

Mycobacterium tuberculosis. Scand J Immunol, v.45, n.2, Feb, p.115-31. 1997.

Behr-Perst, S. I., M. E. Munk, et al. Phenotypically activated gammadelta T lymphocytes

in the peripheral blood of patients with tuberculosis. J Infect Dis, v.180, n.1, Jul, p.141-9.

1999.

Belles, C., A. K. Kuhl, et al. Bias in the gamma delta T cell response to Listeria

monocytogenes. V delta 6.3+ cells are a major component of the gamma delta T cell

response to Listeria monocytogenes. J Immunol, v.156, n.11, Jun 1, p.4280-9. 1996.

Belmant, C., Espinosa, E., Poupot, R., Peyrat, M. A., Guiraud, M., Poquet, Y., Bonneville,

M., Fournie, J. J. 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphate A novel mycobacterial metabolite-

activating human gamma delta T cells. J. Biol Chem., v.274, p.32079-89. 1999.

Bergeron, A., M. Bonay, et al. Cytokine patterns in tuberculous and sarcoid granulomas:

correlations with histopathologic features of the granulomatous response. J Immunol,

v.159, n.6, Sep 15, p.3034-43. 1997.

Bermudez, L. E. e J. Goodman. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within

type II alveolar cells. Infect Immun, v.64, n.4, Apr, p.1400-6. 1996.

Boehm, U., T. Klamp, et al. Cellular responses to interferon-gamma. Annu Rev Immunol,

v.15, p.749-95. 1997.

Brandes, M., K. Willimann, et al. Professional antigen-presentation function by human

gammadelta T Cells. Science, v.309, n.5732, Jul 8, p.264-8. 2005.

Bukowski, J. F., C. T. Morita, et al. Human gamma delta T cells recognize alkylamines

derived from microbes, edible plants, and tea: implications for innate immunity. Immunity,

v.11, n.1, Jul, p.57-65. 1999.

Caccamo, N., A. Barera, et al. Cytokine profile, HLA restriction and TCR sequence

analysis of human CD4+ T clones specific for an immunodominant epitope of

Mycobacterium tuberculosis 16-kDa protein. Clin Exp Immunol, v.133, n.2, Aug, p.260-6.

2003.

Caccamo, N., G. Sireci, et al. gammadelta T cells condition dendritic cells in vivo for

priming pulmonary CD8 T cell responses against Mycobacterium tuberculosis. Eur J

Immunol, v.36, n.10, Oct, p.2681-90. 2006.

Carvalho, A. C., A. Matteelli, et al. gammadelta T lymphocytes in the peripheral blood of

patients with tuberculosis with and without HIV co-infection. Thorax, v.57, n.4, Apr,

p.357-60. 2002.

Casanova, J. L. e L. Abel. Genetic dissection of immunity to mycobacteria: the human

model. Annu Rev Immunol, v.20, p.581-620. 2002.

Casarini, M., F. Ameglio, et al. Cytokine levels correlate with a radiologic score in active

pulmonary tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med, v.159, n.1, Jan, p.143-8. 1999.

Chan, E. D., L. Heifets, et al. Immunologic diagnosis of tuberculosis: a review. Tuber

Lung Dis, v.80, n.3, p.131-40. 2000.

Cherian, T. e V. P. Verghese. Tuberculosis with human immunodeficiency virus infection.

Indian J Pediatr, v.67, n.2 Suppl, Feb, p.S47-52. 2000.

Chervenak, K. A., M. M. Lederman, et al. Bacterial antigen activation of Vdelta1 and

Vdelta2 gammadelta T cells of persons infected with human immunodeficiency virus type

1. J Infect Dis, v.175, n.2, Feb, p.429-33. 1997.

Constant, P., F. Davodeau, et al. Stimulation of human gamma delta T cells by nonpeptidic

mycobacterial ligands. Science, v.264, n.5156, Apr 8, p.267-70. 1994.

Cooper, A. M., J. Magram, et al. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of

protective immunity in mice intravenously infected with mycobacterium tuberculosis. J

Exp Med, v.186, n.1, Jul 7, p.39-45. 1997.

D'souza, C. D., A. M. Cooper, et al. An anti-inflammatory role for gamma delta T

lymphocytes in acquired immunity to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol, v.158, n.3,

Feb 1, p.1217-21. 1997.

Dannenberg, A. M., Jr. Roles of cytotoxic delayed-type hypersensitivity and macrophage-

activating cell-mediated immunity in the pathogenesis of tuberculosis. Immunobiology,

v.191, n.4-5, Oct, p.461-73. 1994.

Das, H., M. Sugita, et al. Mechanisms of Vdelta1 gammadelta T cell activation by

microbial components. J Immunol, v.172, n.11, Jun 1, p.6578-86. 2004.

Davis, M. M., J. J. Boniface, et al. Ligand recognition by alpha beta T cell receptors. Annu

Rev Immunol, v.16, p.523-44. 1998.

De Libero, G. Sentinel function of broadly reactive human gamma delta T cells. Immunol

Today, v.18, n.1, Jan, p.22-6. 1997.

Dieli, F., M. Troye-Blomberg, et al. Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes reduce the viability

of intracellular Mycobacterium tuberculosis. Eur J Immunol, v.30, n.5, May, p.1512-9.

2000.

______. Granulysin-dependent killing of intracellular and extracellular Mycobacterium

tuberculosis by Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes. J Infect Dis, v.184, n.8, Oct 15, p.1082-

5. 2001.

Duarte, R., R. Ramirez, et al. A role for gamma delta T lymphocytes in the development of

advanced clinical forms of tuberculosis in HIV-infected patients. Aids, v.11, n.1, Jan,

p.130-2. 1997.

Dunon, D., D. Courtois, et al. Ontogeny of the immune system: gamma/delta and

alpha/beta T cells migrate from thymus to the periphery in alternating waves. J Exp Med,

v.186, n.7, Oct 6, p.977-88. 1997.

Falini, B., L. Flenghi, et al. Distribution of T cells bearing different forms of the T cell

receptor gamma/delta in normal and pathological human tissues. J Immunol, v.143, n.8,

Oct 15, p.2480-8. 1989.

Falkinham, J. O., 3rd. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clin

Microbiol Rev, v.9, n.2, Apr, p.177-215. 1996.

Farebee, S. H. Controlled chemoprophylaxis trials in tuberculosis: A Review. Adv. Tuberc.

Res, v.7, p.29-106. 1970.

Fehling, H. J., S. Gilfillan, et al. Alpha beta/gamma delta lineage commitment in the

thymus of normal and genetically manipulated mice. Adv Immunol, v.71, p.1-76. 1999.

Fenhalls, G., A. Wong, et al. In situ production of gamma interferon, interleukin-4, and

tumor necrosis factor alpha mRNA in human lung tuberculous granulomas. Infect Immun,

v.68, n.5, May, p.2827-36. 2000.

Flynn, J. L. e J. Chan. Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immunol, v.19, p.93-129.

2001.