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WAGNER TADEU ALKMIM MAIA
ESTUDO DA GERAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA
DO HIV-1 EM CICLO ÚNICO DE INFECÇÃO
DURANTE O CULTIVO CELULAR
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de São Paulo – Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Luís Mário Ramos Janini
Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
SÃO PAULO
2008
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ii
WAGNER TADEU ALKMIM MAIA
ESTUDO DA GERAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA
DO HIV-1 EM CICLO ÚNICO DE INFECÇÃO
DURANTE O CULTIVO CELULAR
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Luís Mário Ramos Janini
Co-orientador: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
SÃO PAULO
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dr. Angelo Amato Vincenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biossegurança Nível III e no
Laboratório de Retrovirologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas da
UNIFESP (CEP n
o
1118/06) e contou com o apoio financeiro da Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo n
o
06/51495-6 e do Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Cnpq).
iv
Wagner Tadeu Alkmim Maia
ESTUDO DA GERAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO HIV-1 EM
CICLO ÚNICO DE INFECÇÃO DURANTE O CULTIVO CELULAR
Presidente da banca:
Prof. Dr. Luís Mário Ramos Janini
Disciplina de Infectologia. Universidade Federal de São Paulo
________________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Celso Hernandes Francisco Granato
Disciplina de Infectologia. Universidade Federal de São Paulo
Profa. Dra. Ester Cerdeira Sabino
Fundação Pró-Sangue. Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo.
Prof. Dr. Esper Kallas
Disciplina de Alergia e Imunologia. Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo.
SUPLENTE
Prof. Dr. Sabri Saaed Al Sanabani
Fundação Pró-Sangue. Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo.
v
Dedico este trabalho ao alicerce de todo ser humano: a família!
Especialmente,
Aos meus pais, Edmar e
Edmar e Edmar e
Edmar e Alaíde
AlaídeAlaíde
Alaíde,
,,
,
Pelo apoio e dedicação,
Orientadores na minha escola da vida;
Á minha irmã Geórgia
GeórgiaGeórgia
Geórgia,
,,
,
Pelo incentivo e perseverança.
À minha querida Sarah Gonçalves,
Sarah Gonçalves,Sarah Gonçalves,
Sarah Gonçalves,
Simplesmente por existir em minha vida!
vi
Agradecimentos
Para trilhar mais esse árduo caminho na vida, descobri pessoas que, por algum motivo
especial, estão sempre dispostas a facilitar toda a minha trajetória. Este espaço é
reservado a vocês.
Ao Prof. Dr. Luís Mário Ramos Janini, pela diligência e apoio. Pelas, sempre frutíferas,
discussões a cerca do fascinante mundo da virologia. Ao meu amigo Mário Janini, pelos
conselhos e ensinamentos. Pelos exemplos de caráter, humildade e respeito.
Ao Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz,pela credibilidade e confiança.
Ao Prof. Dr. Francisco Bosco, pelo primoroso auxílio nas análises e discussões acerca
dos achados deste estudo.
Ao Prof. Dr. João dos Reis Canela, pela minha iniciação no âmbito das Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Ao Dr. Divino Urias Mendonça, obrigado pelo estímulo à vida acadêmica.
À Fabiana Matrangolo, Adair Viera Júnior e ao Prof. Dr. Eduardo Purgatto, pelos
primorosos ensinamentos biomoleculares.
Ao Prof. Dr. Celso Granato, pelo enriquecedor ensinamento em virologia clínica.
Ao Prof. Dr. Reinaldo Salomão, pelos exemplos de ética e caráter.
À Carla Coristina Teixeira e à Mariana Leãozinho, pelas horas furtadas ao convívio
diário. Obrigado pelo apoio e fidelidade. Obrigado por compartilhar gargalhadas e aflições.
Às “crianças” Camila Santos, Juliana Peixoto, Michel Soane, Lucas Simão e Joice
Bueno. Obrigado pela fidelidade, seriedade e dedicação.
Ao Patrício Godoy e ao Daniel Arquimedes, pelo companheirismo e por me ajudarem a
cuidar da Sarah!
Ao Jean Zukurov, pelo suporte com as inferências filogenéticas.
Ao Marco Antônio Versiani, pelos ideais compartilhados.
vii
Ao meu amigo Luís Henrique Gagliani, pelos exemplos de altruísmo e humanidade.
Ao Dr. Carlos Santos, por sanar as minhas dúvidas biomoleculares em “Tempo Real”.
Ao Dr. Eric O. Freed e Dra. Sherimay Ablan (National Institute of Health/EUA), pelas
relevantes discussões técnicas a cerca dos mecanismos de transferência de gênica, em
especial, pelas sugestões a despeito das transfecções celulares e pelos vetores de
expressão gentilmente cedidos.
À Dra. Cecília Cheng-Mayer (The New York University, Aaron Diamond Research
Center/EUA) e ao Dr. Esteban Domingo (Universidad Autonoma de Madrid, Centro de
Biologia Molecular Severo Uchoa/Espanha) pelas valiosas discussões sobre genética e
evolução do HIV-1, as quais foram de suma importância para o delineamento deste
estudo. Pelos esclarecimentos práticos sobre a determinação do uso do co-receptor,
tropismo viral e construção de partículas virais pseudotipos. Pelos estudos (gentilmente
cedidos e detalhadamente discutidos) sobre a diversidade nas Populações de Vírus de
Genoma RNA e quasispécies.
Aos amigos do Laboratório de Retrovirologia que compartilharam toda essa trajetória
dissertativa: Adriana Urquiza, Alessandra, Alexandre, Ana Carolina Denadai, Carlos
Gasparoto, Cecília Sucupira, Cristiano Teodoro, Celina Moraes, Daniela Teixeira,
Daniela Papel, Dercy Sá-Filho, Elizabeth Cavalieri, Élcio Leal, Érica Fusuma, Joice
Bueno, Jose Vitelio, Fernanda Feitosa, Lucas Simão, Mara Stort, Márcia Oliveira,
Márcia RJ, Maria Clara Bizinoto, Michele Camargo, Juliana Galinskas, Patrícia
Munerato, Rafael Azevedo, Rejane Jorge, Rodrigo Côrtes, Sandra Mara Andreo,
Wancler, Wilson Pereira.
Aos amigos do Laboratório Especial de Micologia (LEMI), em especial à Gisela, Fernanda
e Sabrina. Aos amigos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), em
especial ao Rodrigo Cayô, Paulo Bispo e Fernanda Marques. Aos amigos do
Laboratório Alerta, em especial à Adriana, Danilo, Renata Picão, Anderson e Heloísa.
Aos amigos dos Laboratórios de Imunologia I e II, em especial à Milena, Maria, Helena e
Teresa. Aos amigos do Laboratório de Virologia, em especial ao Ari Watanabe.
viii
Sumário
Dedicatória ...............................................................................................................
v
Agradecimentos ........................................................................................................
vi
Lista de publicações (a partir de resultados parciais) ..............................................
xii
Lista de tabelas ........................................................................................................
xiii
Lista de figuras .........................................................................................................
xiv
Lista de abreviaturas e símbolos ............................................................................. xv
Abstract .................................................................................................................. xviii
Resumo ....................................................................................................................
xix
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 01
1.1. A Descoberta do HIV/aids ................................................................................
02
1.2. Aspectos Epidemiológicos da Infecção pelo HIV...............................................
05
1.3. As Características Gerais da Partícula Viral do HIV-1 ......................................
09
1.4. Organização Genômica do HIV- ........................................................................
10
1.4.1. Os Produtos Gênicos do HIV-1.......................................................................
13
1.4.1.1. Genes Estruturais ........................................................................................
13
1.4.1.2. Genes Adicionais .........................................................................................
15
1.4.1.2.1. Genes Regulatórios ..................................................................................
15
1.4.1.2.2. Genes Acessórios ....................................................................................
16
1.5. Ciclo Replicativo do HIV-1 .................................................................................
18
1.6. Tropismo Viral do HIV-1 ....................................................................................
20
1.7. A variabilidade Genética do HIV-1 ....................................................................
23
1.8. A Importância do Estudo da Diversidade Genética do HIV-1 .........................
28
ix
2. OBJETIVOS
.........................................................................................................
34
3. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................
36
3.1. Vetores ..............................................................................................................
37
3.2. Produção de Bactéria Eletrocompetente ...........................................................
39
3.3. Transformação Bacteriana por Eletroporação ...................................................
40
3.4. PCR para Verificação da Transformação Bacteriana ........................................
41
3.5. Purificação dos Plasmídeos ..............................................................................
43
3.6. Quantificação do DNA Plasmidial ......................................................................
43
3.7. Transfecção Celular ..........................................................................................
44
3.8. Obtenção de Células Mononucleares de Sangue Periférico (PBMCs) .............
46
3.9. Separação e Cultivo das PBMCs ......................................................................
47
3.10. Quantificação da Produção de Partículas Virais Pseudotipo ..........................
48
3.11. Cálculo da Multiplicidade de Infecção (m.o.i.) .................................................
49
3.12. Adição de Mitógenos e Infecção Viral .............................................................
50
3.13. Controle de Contaminação das Culturas Celulares ........................................
51
3.14. Condições de Infecção e Cultura ....................................................................
53
3.15. Extração do DNA do Sobrenadante de Cultura ...............................................
55
3.16. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), com Diluição Limite Final (End-
point PCR) ................................................................................................................
55
3.17. Geração dos Clones Virais para Seqüenciamento ..........................................
56
3.18. Purificação de Produto da PCR ......................................................................
57
3.19. Seqüenciamento da Região pol do DNA Proveniente de Culturas Infectadas
58
x
3.20. Detecção dos Fragmentos Seqüenciados ......................................................
60
3.21. Análise, Compilação e Alinhamento das Sequências .....................................
60
3.22. Análise Estatística ...........................................................................................
61
3.23. Análise da Variabilidade Genética ..................................................................
62
3.23.1. Entropia ........................................................................................................
62
3.23.2 Inferência Filogenética ..................................................................................
63
4. RESULTADOS .....................................................................................................
65
4.1. Transformação Bacteriana ................................................................................
66
4.2. Transfecção Celular ..........................................................................................
67
4.3. Geração de Clones por End-Point PCR ............................................................
67
4.4. Comprovação da Homogeneidade do Inóculo Viral ..........................................
68
4.4.1. Seqüenciamento dos Clones Gerados em Cultura ........................................
69
4.5. Identificação e Caracterização das Substituições Presentes nas Seqüências..
70
4.6. Análise da Variabilidade Genética .....................................................................
79
4.6.1. Cálculo da Taxa Mutacional ...........................................................................
79
4.6.2. Relação Quantitativa entre o Tropismo Viral e Ativação Celular
80
4.6.3. Entropia ..........................................................................................................
82
4.7. Reconstrução Filogenética ................................................................................
91
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................
94
6. CONCLUSÕES .................... ...............................................................................
116
xi
7. ANEXOS ...............................................................................................................
118
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................
131
Bibliografia consultada
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo
xii
LISTA DE PUBLICAÇÕES (A PARTIR DE RESULTADOS PARCIAIS)
1 - In vitro evaluation of the correlation between cellular activation and HIV-1 genetic
variability. Wagner Alkmim*, Cristiano Silva, Patrícia Munerato, Sandra Andreo, Élcio Leal,
Camila Santos, Ricardo Diaz, Mário Janini. Brazilian Aids Research Conference. Itapema,
SC, Brazil, 2007.
2 - In vitro evaluation of the correlation between cellular activation and HIV-1 genetic
variability. Wagner Alkmim*, Cristiano Silva, Patrícia Munerato, Sandra Andreo, Élcio Leal,
Camila Santos, Ricardo Diaz, Mário Janini. International Aids Conference, Mexico city,
Mexico, 2008.
3 - R5 and X4 HIV Genetic Variability in Single Round Infection in Primary Peripheral Blood
Mononuclear Cells. Wagner Alkmim*, Michel Soane, Camila Santos, Juliana Peixoto, Carla
Teixeira, Ricardo Diaz, Mário Janini. 16th Conference on Retroviruses and Opportunistics
Infections (CROI). Montreal. Canadá. 2009. Submetido.
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers utilizados na reação de amplificação confirmatória da transformação do
plasmídeo pNL4-3KFS ............................................................................................................
41
Tabela 2. Primers utilizados na primeira etapa de amplificação confirmatória da
transformação dos plasmídeos pIIINL4-3env e pNL(AD8)env ...............................................
42
Tabela 3. Primers utilizados na segunda etapa de amplificação confirmatória da
transformação dos plasmídeos pIIINL4-3env e pNL(AD8)env ...............................................
42
Tabela 4. Titulação dos pseudotipos virais ............................................................................
49
Tabela 5. Primers utilizados na reação de amplificação para controle de contaminação
bacteriana ...............................................................................................................................
52
Tabela 6. Tropismo viral e status de ativação celular das diferentes condições
experimentais ..........................................................................................................................
53
Tabela 7. Primers utilizados na reação de Endpoint-PCR .....................................................
56
Tabela 8. Primers utilizados no seqüenciamento de um fragmento do gene pol do HIV-1 ....
59
Tabela 9. Caracterização das substituições da condição 01 do grupo R5 .............................
71
Tabela 10. Caracterização das substituições da condição 02 do grupo R5............................
72
Tabela 11. Caracterização das substituições da condição 03 do grupo R5 ...........................
74
Tabela 12. Caracterização das substituições da condição 01 do grupo X4 ...........................
75
Tabela 13. Caracterização das substituições da condição 02 do grupo X4 ...........................
76
Tabela 14. Caracterização das substituições da condição 02 do grupo X4 ...........................
77
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Partícula viral do HIV-1.............................................................................................
10
Figura 2. Esquema representativo do genoma do HIV-1 e seus produtos gênicos..................
13
Figura 3. As formas recombinantes circulantes (CRFs) do HIV-1............................................
27
Figura 4. Mapa do plasmídeo pNL4 .........................................................................................
38
Figura 5. Alinhamento dos primers utilizados na reação de seqüenciamento.........................
59
Figura 6. Diferenças na eficiência da transformação bacteriana..............................................
66
Figura 7. Relação entre transições e transversões no grupo R5..............................................
78
Figura 8. Relação entre transições e transversões no grupo X4..............................................
79
Figura 9. Análise quantitativa da correlação entre o número de substituições e o estado de
ativação celular .........................................................................................................................
81
Figura 10. Variabilidade genética no grupo R5 ........................................................................
84
Figura 11. Variabilidade genética no grupo X4 ........................................................................
86
Figura 12. Representação esquemática dos resíduos analisados ..........................................
87
Figura 13. Análise comparativa da variabilidade entre os grupos R5 e X4 .............................
90
Figura 14. Relação filogenética das seqüências de nucleotídeos dos clones do grupo R5 ....
92
Figura 15. Relação filogenética das seqüências de nucleotídeos dos clones do grupo X4 ....
93
xv
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
aids Acquired Immune Deficiency Syndrome.
AZT 3´-azido-2´, 3´-didesoxitimidina: azidotimidina, zidovudina.
CA Capsídeo.
cm Centímetro.
CRFs Formas Recombinantes Circulantes.
CCID
50
Dose Infecciosa de Cultura Celular (Cell Culture Infective Dose).
DNA Ácido desoxirribonucléico.
dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfato.
ddNTPs Didesoxirribonucleotídeos trifosfato.
DST Doença Sexualmente Transmissível.
EDTA Ácido Etilenodiaminotetracético.
EUA Estados Unidos da América.
ELISA Ensaio Imunoenzimático (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
env Envelope.
FDA Food and Drug Administration.
FITC Isotiocianato de Fluoresceína (Fluorescein Isothiocyanate).
gag Grupo Antigênico ou Antígeno Grupo Específico.
gp Glicoproteína.
N
o
Número.
h Horas.
HCl Ácido clorídrico.
HIV-1 Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (Human Immunodeficiency Virus).
HIV-2 Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 2 (Human Immunodeficiency Virus).
HTLV Human T-Lymphotropic Virus Type.
HBV Hepatitis B Virus (Vírus da hepatite B).
HBS-Ag Hepatitis B surface antigen ( antígeno de superfície do Vírus da hepatite B).
HCV Hepatitis C Virus (Vírus da hepatite C).
VDRL Venereal Disease Research Laboratory.
HAART Terapia Anti-retroviral Altamente Ativa (Hightly Active Antiretroviral Therapy).
xvi
IN Integrase.
LAV Lymphadenopathy-Associated Virus.
LTRs Repetições Terminais Longas (Long Terminal Repeats).
MA Matriz.
MgCl
2
Cloreto de magnésio.
MHC Complexo Histocompatibilidade Principal (Major Histocompatibility Complex).
mm Milímetro.
mM Milimolar.
µg/mL micrograma por mililitro.
mg Miligrama.
mg/L Miligrama por litro.
µL Microlitro.
mL Mililitro.
M Molar.
MOI Multiplicity of Infection.
ng Nanograma.
ng/µL Nanograma por microlitro.
nm Nanômetro.
nmol Nanomol.
P Probabilidade de um evento ocorrer ao acaso.
NB-III Nível de Biossegurança 3.
NC Nucleocapsídeo.
nef Fator de Regulação Negativa.
OMS Organização Mundial de Saúde.
pb Pares de base.
PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico (Peripheral Blood Mononuclear
Cells).
PCR Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction).
pH Potencial hidrogeniônico.
PHA Fitohemaglutinina.
pol gene pol (polimerase) do HIV-1.
xvii
PR Protease.
RT Transcriptase reversa.
RNA Ácido ribonucléico.
RNAm Ácido ribonucléico – mensageiro.
RPM Rotações por minuto.
RPMI Meio de Cultura Celular que leva as iniciais do instituto onde foi desenvolvido
(Roswell Park Memorial Institute).
RRE Elementos de resposta a Rev.
SFB Soro Fetal Bovino.
TBE Tris borato EDTA.
T-Tropic Tropismo por célula que expressa o co-receptor CXCR4.
M-Tropic Tropismo por célula que expressa o co-receptor CCR5.
UDI Usuários de Drogas Intravenosas.
UNAIDS Comitê das Nações Unidas para a aids (Joint United Nations Programe).
vif Fator de Infectividade Viral.
vpr Proteína viral R.
vpu Proteína viral U.
~ aproximadamente.
CO
2
Dióxido de carbono.
X Vezes.
% Por cento.
< Menor.
0
C Graus Celsius.
Volts unidade de corrente elétrica.
A Adenina.
C Citosina.
G Guanina.
T Timina.
et al Colaboradores.
g Gramas.
xviii
ABSTRACT
HIV-1 has an important genetic diversity that results from the rapid viral turnover rate and
from reverse transcritase errors during viral DNA synthesis. Reverse transcription is a
crucial step during HIV-1 replication cycle and its accuracy depends on balanced cellular
dNTP pools. HIV-1 populations correspond to an organized swarm of mutants named
quasispecies. If a quasispecies population goes throught transmission genetic bottlenecks
and looses its best adapted variants, the fitness of the entire population is reduced. In the
present work we studied the HIV-1 genetic diversity generated after a single replication
cycle using CCR5 and CXCR4 pseudotyped particles in cell culture. Resting PBMCs from
healthy donors were stimulated with PHA before and during HIV-1 infection. Resting
PBMCs were also infected. 48 proviral DNA clones were obtained by End Point-PCR from
each infected culture. A 1050pb fragment from pol was sequenced from all clones. All
sequences were compared to the original sequence at time 0 and mutations introduced
after a single replicartion cycle were tabulated. Observed mutations were not uniformly
distributed occurring more frequently between the nucleotide 200 and 350, 400 and 650pb,
750 and 800pb and 950 and 1025pb in R5 pseudotypes and between the nucleotide 375
and 525pb, 600 and 650pb and 775 and 975pb in X4 pseudotypes. G to A and T to C
transitions were the most frequent substituition type. The calculated mutational tax was 2,0
x 10
-3
/nt/cycle for R5 virus and 1,07 x 10
-3
/nt/cycle for X4. Both mutational taxes were
higher than the ones currently described for HIV-1. The distribution of sites where
mutations occur is influenced by the cellular activation status with mutations clustering in
sequence segments in activated cells. R5 pseudotypes accumulated more variation than
X4 virus, suggesting that R5 virus host colonization soon after transmission may be a part
of a HIV-1 strategy to recuperate the genetic diversity reduction during the transmission
bottleneck.
xix
RESUMO
O HIV-1 possui uma importante diversidade genética. Essa diversidade decorre das
limitações de fidelidade da transcriptase reversa durante a replicação, acentuada pela alta
capacidade de geração e pelo rápido turnover viral. A transcrição reversa é um evento
crucial do ciclo de vida viral e pode sofrer a influência de diversos fatores, como, por
exemplo, o estado de ativação celular e a concentração de deoxrribonucleotídeos. A
redução da variabilidade e tamanho das populações quasispecies, como as que
acontecem durante a transmissão do HIV-1, coloca em risco a sua sobrevivência. A
proposta deste estudo foi analisar a geração da diversidade genética após um ciclo único
de replicação usando partículas virais pseudotipadas com envelopes R5 e X4 do HIV-1 em
cultivo celular. Para tanto, PBMCs de indivíduos saudáveis foram estimuladas com
fitohemaglutinina antes e durante infecção. Células em repouso também foram infectadas.
Quarenta e oito clones provirais foram obtidos por End Point-PCR para cada condição. Em
seguida, um fragmento de 1050pb do gene pol foi seqüenciado para todos os clones. As
mutações acumuladas em um evento único de transcrição viral foram analisadas e
comparadas com a seqüência do HIV-1 presente no inóculo original (tempo zero). Os
resultados mostraram uma alta taxa de substituições em todas as condições de cultura e a
existência de contextos comuns entre as seqüências onde ocorrem as substituições,
destacando-se as regiões 200 a 350pb, 400 a 650pb, 750 a 800pb e 950 a 1025pb no
grupo R5 e as regiões 375 a 525pb, 600 a 650pb e 775 a 975pb no grupo X4. Nestas
regiões, o processo mutacional é intenso, os eventos que mais ocorrem são as transições
e as substituições mais freqüentes são as de G para A e de T para C. A taxa mutacional
encontrada foi de 2,0 x 10
-3
/nt/ciclo no grupo R5 e 1,07 x 10
-3
/nt/ciclo no grupo X4,
valores muito acima dos comumente encontrados. A distribuição dos sítios onde ocorrem
as mutações é influenciada pelo estágio de ativação em que as células alvo se encontram
no momento da infecção, com regiões mais sujeitas a variação em segmentos de
sequência quando as células estão ativadas. A maior diversidade encontrada no grupo R5
indica um papel importante desta variante viral no estabelecimento da infecção. Esse
aumento brusco na diversidade genética viral pode fazer parte de uma estratégia do vírus
em recuperar parte diversidade genética perdida na população durante os eventos de
transmissão.
xx
dy
Maia, Wagner Tadeu Alkmim
Estudo da Geração da Diversidade Genética do HIV-1 em Ciclo Único de
Infecção Durante o Cultivo Celular / Wagner Tadeu Alkmim Maia - São Paulo,
2008. xx. 154f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia. Departamento de
Medicina.
Título em inglês: Generation Study of Genetic Diversity of HIV-1 in Single Round
Infection during Cell Culture.
1. HIV-1. 2. Diversidade Genética. 3. Cultura de Células. 4. Pseudotipos virais.
1 - INTRODUÇÃO
_________________________________
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
____________________________________________________________________________________
Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
2
1.1 . A Descoberta do HIV/aids
A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida foi primeiramente
observada por médicos e epidemiologistas em meados de 1981 nos Estados Unidos da
América (EUA) a partir da identificação de um número elevado de pacientes adultos do
sexo masculino, homossexuais e moradores de São Francisco, Califórnia,
apresentando pneumonia por Pneumocystis jiroveci (antigamente classificado como P.
carinii) e/ou também caracterizados pelo quadro clínico de febre persistindo por mais
do que 4 ou 5 dias; inexplicável perda de peso em poucos meses; dores gerais e
similares a uma síndrome viral por mais do que 10 dias; linfoadenopatia por um período
superior a uma semana; surgimento de lesões cutâneas violáceas (agora reconhecido
como Sarcoma de Kaposi); herpes que persistiam por mais do que 5 semanas; e perda
de habilidade motora ou defeitos em função neurológica Estes sinais e sintomas eram
extraordinariamente raros em adultos jovens e indicavam que algum tipo de alteração
imunológica estava ocorrendo nestes indivíduos (Gottlieb et al., 1981; Masur et al.,
1981; Chandler & Hughes, 1996; Levy, 2006; Wainberg & Jeang, 2008).
A primeira descrição completa já apresentava uma depleção
seletiva de linfócitos T CD4
+
no sangue periférico. Logo observou-se que uma
proporção muito maior de homossexuais masculinos sofria de linfadenopatia
generalizada. Inicialmente, esta doença foi chamada de “Síndrome da Imunodeficiência
relacionada aos Gays” (GRID, Gay-related Immune Deficiency Syndrome). No início de
1982, no entanto, investigadores do Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
em Atlanta, EUA, detectaram casos similares em usuários de drogas injetáveis,
trabalhadores do sexo, receptores de transfusões sanguíneas e hemoderivados. A
partir daí a doença foi mais apropriadamente renomeada para aids (Gallo et al., 1984;
Gallo, 2002; Montagnier, 2002; Gallo & Montagnier, 2003; Levy, 2006).
As principais características clínicas iniciais da aids (Sarcoma de
Kaposi, pneumocistose e comprometimento do sistema imune) levaram à conclusão de
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
____________________________________________________________________________________
Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
3
que se tratava de uma nova doença, ainda não classificada, de etiologia provavelmente
infecciosa e transmissível. Estas observações eram familiares àquelas verificadas em
indivíduos que trabalhavam com o Vírus da Hepatite B (HBV) na década de 1970 e
levou a conclusão de que a aids não era simplesmente uma conseqüência do estilo de
vida homossexual, mas sim causada por um agente infeccioso, disseminado tanto por
via sexual quanto parenteral. Para especialistas em doenças infecciosas, o desafio foi
identificar o agente etiológico (Gallo et al., 1984; Montagnier, 2002; Gallo & Montagnier,
2003; Levy, 2006).
A primeira indicação de que a doença era causada por um retrovírus
veio em 1983, quando Barré-Sinoussi e colaboradores, reconheceram a atividade da
enzima transcriptase reversa característica dos retrovírus em amostras de um paciente
com síndrome linfopática severa, considerada por muitos uma pré-condição de aids
(Barre-Sinoussi et al., 1983; Gallo et al., 1984; Gallo & Montagnier, 2003).
O vírus isolado por Françoise Barré-Sinoussi e colaboradores no
laboratório de Luc Montagnier, no Instituto Pauster em Paris, França, tinha a
característica original de infectar PBMCs e causar efeitos citopáticos dentro de seis ou
sete dias. O brotamento viral nas células infectadas era facilmente examinado por
microscopia eletrônica. Posteriormente, o vírus foi reconhecido como um lentivírus
(Gonda et al., 1985). Este vírus era diferente do Vírus da Leucemia de Células T em
Humanos (HTLV), um retrovírus humano descrito anteriormente que pode causar
leucemia (Poiesz et al., 1980). Então, foi nomeado como Vírus Associado à
Linfoadenopatia (LAV, Lymphadenopathy-Associated Virus) por não estabelecer um
estado transformado em células CD4
+
, mas causar morte celular após alto nível de
replicação (Barre-Sinoussi et al., 1983; Gallo & Montagnier, 2003).
Outros grupos de pesquisa informaram ter isolado o vírus a partir de
pacientes com aids após a descrição do LAV pelo laboratório de Luc Montagnier, O
primeiro identificou o vírus de Vírus da Leucemia de Células T em Humanos tipo III
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
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(HTLV-III), uma vez que acreditavam que este fazia parte da família HTLV de retrovírus
oncogênico (Gallo et al., 1984). O segundo grupo, trabalhando com pacientes de São
Francisco, notaram a presença de partículas virais com características de agentes
citopáticos tal como o LAV. Então, concluiu-se que estes vírus não poderiam ser
transformados como HTLV denominando-os de Vírus associado à aids (ARV, Aids
associated Retroviruses) (Levy et al., 1984). Com o tempo, descobriu-se que os vírus
isolados por esses grupos de pesquisas apresentavam características semelhantes,
embora fossem um pouco diferentes e, então, estes vírus foram chamados de Vírus da
Imunodeficiência Humana (Coffin, 1986; Brun-Vezinet & Simon, 1990; De Leys et al.,
1990; Levy, 1993; Levy, 1998; Robertson et al., 2000; Gallo, 2002; Gallo & Montagnier,
2003).
Em 1986, logo após a identificação do HIV, Luc Montaigner
recuperou outros vírus humanos a partir de pacientes da África Ocidental com aids.
Montaigner notou que estes vírus eram geneticamente diferentes do isolado em 1983
(mais do que 40%) e os nomeou HIV-2 (Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2),
renomeando o vírus isolado em 1983 de HIV-1. Os dois isolados virais, HIV-1 e HIV-2,
apesar de relacionados apresentam diferenças fundamentais em sua estrutura
genômica e antigenicidade. As estratégias replicativas destes vírus parecem distintas,
uma vez que, o tempo requerido para o aparecimento de efeitos patogênicos nas
infecções pelo HIV-2 é mais longo que no caso de infecções pelo HIV-1 (Clavel et al.,
1986; Coffin, 1986; Brun-Vezinet & Simon, 1990; De Leys et al., 1990; Robertson et al.,
2000; Levy, 2006).
Desde então, a comunidade científica mundial se empenha no
estudo da infecção pelo HIV. Embora ela tenha se disseminado rapidamente por todo o
mundo, grandes avanços foram alcançados em pouco tempo estudo. Exemplos destes
avanços é o emprego da triagem sorológica, iniciada a partir do final de 1985 para
prevenir mais infecções por transfusão sanguínea e produtos corporais; a elaboração
racional de drogas quimioterápicas e o surgimento da terapia combinada potente
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
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(HAART), a partir de 1996; o emprego de ferramentas biomoleculares tais como a
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a detecção, diagnóstico precoce e
quantificação viral, além do seqüenciamento de ácidos nucléicos para o monitoramento
da infecção pelos eficientes testes de genotipagem. Mais recentemente, grandes
progressos foram evidenciados a partir de estudos da interação patógeno-hospedeiro,
resultando no desenvolvimento de novos fármacos e novos candidatos vacinais (Coffin,
1986; Cheng-Mayer et al., 1988; Coffin, 1995; Isada & Calabrese, 1999; Clavel &
Hance, 2004; Coakley et al., 2005).
1.2. Aspectos Epidemiológicos da Infecção pelo HIV
Embora alguns estudos clássicos considerem que HIV tenha sido
introduzido na população humana a apenas 60-80 anos atrás (Hillis, 2000; Korber et
al., 2000), dados recentes indicam com maior acurácia que este fato pode ter ocorrido
entre 1884 a 1924 (Worobey et al., 2008). Notadamente, a partir do início da década de
1980 o HIV começou a se disseminar de forma avassaladora na população humana.
Estima-se mais de 33,2 milhões (30.3 - 36.1 milhões) de pessoas vivendo com o HIV.
Só em 2007, 2.7 milhões de pessoas tornaram-se infectadas (2.2 milhões - 3.2
milhões) com o vírus e 2 milhões (1.8 milhões - 2.3 milhões) morreram de causas
relacionadas ao HIV (UNAIDS, 2008). A propagação e expansão do vírus pela África e
por todo o mundo têm sido acompanhadas por uma das mais rápidas taxas evolutivas
descritas para um patógeno humano, ao lado do vírus da hepatite C. O HIV-1
permanece um dos patógenos mais letais (100% de mortalidade) que atualmente
infecta humanos, uma vez que a infecção por outros vírus humanos que são
freqüentemente mais temidos, tais como vírus Ebola, vírus da Síndrome Respiratória
Aguda Grave (SARS), vírus influenza H5NI e vírus Lassa Fever, podem ter uma taxa
de mortalidade menor que 60% (Geisbert & Jahrling, 2004; Perlman & Dandekar, 2005;
Doherty et al., 2006).
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Dois amplos padrões epidemiológicos na distribuição global da
infecção do HIV-1 têm emergido. A maioria dos países no mundo tem concentrado
epidemias de HIV-1, nas quais a infecção é detectada em grupos de risco específicos,
incluindo homens que fazem sexo com homens (MSM, do inglês men who have sex
with men), usuários de drogas injetáveis, trabalhadores do sexo e seus parceiros
sexuais regulares. Entretanto, em muitos países da África subsaariana, especialmente
na parte sul do continente, as epidemias de HIV-1 são generalizadas, isto é, elas são
auto-sustentáveis na população (Cohen, 2008a). Nestes locais, o risco de infecção com
HIV-1 não é igual entre as sociedades, mas está aumentado em pessoas com elevadas
taxas de troca de parceiro ou que possua clássicas doenças sexualmente
transmissíveis (DSTs) e/ou em pessoas que experimentam outras significantes
exposições potenciais ao HIV-1, tal como uso de drogas injetáveis (Cohen, 2008b;
Cohen, 2008a; UNAIDS, 2008).
Ademais, importantes mudanças no perfil epidemiológico da aids
vêm ocorrendo nos últimos anos. A epidemia que, em sua primeira fase (1980 a 1986),
caracterizava-se pela preponderância da transmissão em homens homo e bissexuais,
de escolaridade elevada, em sua segunda fase (1987 a 1991), passou a caracterizar-se
pela transmissão sanguínea, especialmente na subcategoria de usuários de drogas
injetáveis, dando início, nesta fase, a um processo mais ou menos simultâneo de
pauperização e interiorização da epidemia. Finalmente, em sua terceira fase (1992 até
os dias atuais), um grande aumento de casos por exposição heterossexual vem sendo
observado, assumindo importância cada vez maior a introdução de casos do sexo
feminino (feminização da epidemia). Portanto, a exposição heterossexual atualmente
representa a principal subcategoria de exposição em crescimento (em 1991,
correspondia a 21%, e a partir de 1996/97 ultrapassou 55%) (MS, 2007).
Globalmente, o número de crianças vivendo com HIV aumentou de
1.5 milhão (1,3 –1,9 milhão) em 2001 para 2,5 milhões (2,2–2,6 milhões) em 2007,
sendo que aproximadamente 90% do total de crianças infectadas com HIV vivem na
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África subsaariana. Entretanto, a estimativa de novas infecções entre crianças declinou
de 460 mil (420–510 mil) em 2001 para 420 mil (390–470 mil) em 2007. Mortes devido
à aids entre crianças aumentaram de 330 mil (380–560 mil) em 2001 para 360 mil
(350–540 mil) em 2005. A partir de 2007 esta estimativa começou a diminuir para 330
mil (310–380 mil) (UNAIDS, 2008).
Aumentos similares ocorreram na estimativa dos números totais de
novas infecções em homens e mulheres entre 2001 e 2007. A taxa de mulheres e
homens permanece estável globalmente. Estima-se 15,4 milhões (13,9–16,6 milhões)
de mulheres vivendo com HIV em 2007, 1,6 milhões a mais do que em 2001. Para
homens, estima-se que 15,4 milhões (14,3–17,0 milhões) vivem com HIV, 1,7 milhões a
mais comparando-se com 2001. Na África subsaariana, aproximadamente 61% dos
adultos vivendo com HIV são mulheres, enquanto que no Caribe esta porcentagem é
de 43%. A proporção de mulheres vivendo com HIV na América Latina, Ásia e Europa
Oriental está crescendo lentamente. Muito provavelmente o HIV é transmitido para
parceiros femininos de homens que se infectam através do uso de drogas injetáveis,
durante o sexo pago desprotegido ou sexo com outros homens (UNAIDS, 2008).
Atualmente, a África subsaariana permanece sendo a região mais
seriamente afetada. Para esta região existem estimativas alarmantes de 22,5 milhões
(20,9 milhões–24,3 milhões) de pessoas vivendo com HIV; 1,6 milhões (1,5 milhões–
2,0 milhões) de mortes de adultos e crianças devido à aids (76% do total mundial de
2,1 milhões (1,9 milhões–2,4 milhões) resultando em, aproximadamente, 11,4 milhões
(10,5 milhões–14,6 milhões) de órfãos. A África do Sul é o país com o maior número de
infecções de HIV no mundo. Apesar disso, declínios de incidência do HIV começam a
surgir devido, principalmente ao acesso a serviços de tratamento anti-retroviral e aos
programas de prevenção e controle, que estão resultando na mudança de
comportamento em diferentes contextos (UNAIDS, 2008).
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Na América Latina a epidemia permanece estável e a transmissão
continua a ocorrer entre as populações de maior risco de exposição, incluindo
trabalhadores do sexo e homens que fazem sexo com homens. O número estimado
atualmente de novas infecções por HIV na América Latina é de 100 mil (47–220 mil),
elevando para 1,6 milhões (1,4 milhões–1,9 milhões) o número total de pessoas
vivendo com HIV nesta região. Estima-se que 58 mil (49–91 mil) pessoas morreram de
aids só em 2007. Sexo desprotegido entre homens é um importante fator na epidemia
da Bolívia, Chile, Equador e Peru, bem como em vários países da América Central,
incluindo El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicarágua e Panamá (UNAIDS,
2008).
Aproximadamente um terço de todas as pessoas vivendo com HIV
na América Latina residem no Brasil. Em 2005, foi estimado que 620 mil (370 mil-1
milhão) pessoas viviam com HIV. Embora no início concentrada principalmente entre
homens que faziam sexo com homens, a epidemia posteriormente disseminou-se a
usuários de drogas injetáveis e, finalmente, na população em geral, com um aumento
no número de mulheres tornando-se infectadas (Dourado et al., 2006; Dourado et al.,
2007). Uma grande proporção das infecções entre mulheres pode ser atribuída ao
comportamento de seu parceiro sexual masculino (Silva & Barone, 2006). Entretanto,
sexo desprotegido entre homens permanece sendo um fator importante e representa,
aproximadamente, metade de todas as infecções por HIV que são transmitidas
sexualmente no Brasil. Em algumas cidades a prevalência do HIV entre usuários de
drogas injetáveis tem diminuído como resultado dos programas de prevenção, troca de
drogas injetáveis para drogas inalantes e mortalidade entre os usuários de drogas (MS,
2007; UNAIDS, 2008).
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1.3. As Características Gerais da Partícula Viral do HIV-1
O HIV-1, como os demais retrovírus, pertence ao gênero Lentivirus e
à família Retroviridae (Coffin, 1986). A partícula viral é envelopada e quando madura
(virion) tem morfologia esférica de 100-120 nm de diâmetro (Figura 1). Seu material
genético é constituído por duas fitas de RNA. Nas células infectadas a forma
persistente do genoma do HIV-1 é um DNA proviral dupla fita (Sierra et al., 2005). Ao
longo das fitas de RNA há associações de monômeros de duas proteínas, p7 e p9, que
são denominadas proteínas do nucleocapsídeo. A este complexo encontram-se
associadas às proteínas virais: transcriptase reversa (responsável pela síntese da fita
dupla de DNA), a integrase (enzima que catalisa o processo de integração da fita dupla
ao genoma da célula hospedeira) e a protease (processa precursores protéicos virais
nas etapas finais do ciclo replicativo) (Haseltine, 1991; Morikawa & Tsurutani, 2007).
Este complexo é envolvido pela proteína p24, proteína formadora do
capsídeo, cujos monômeros se organizam formando uma estrutura cônica (Ehrlich et
al., 1992) A porção mais externa da partícula viral, o envelope, é formada por uma
bicamada fosfolipídica de origem celular obtida da membrana citoplasmática da célula,
infectada no momento do brotamento da partícula viral. A porção mais externa da
proteína transmembrana gp41 interage com a proteína de superfície gp120, sendo
estas encontradas como projeções na forma de botão do lado externo da camada
fosfolipídica do vírus (Frankel & Young, 1998; Freed, 1998). Entre a porção mais
central (denominada core) e o envelope viral, encontra-se uma proteína denominada de
matriz (p17) e é esta matriz a responsável por manter a estrutura do virion (Frankel &
Young, 1998, Chatterjee et al., 1992).
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Figura 1. Partícula viral do HIV-1.
Fonte: Adaptado do National Institutes of Health (NIH, 2008).
1.4. Organização Genômica do HIV-1
O material genético do HIV-1 é constituído por duas fitas simples de
RNA polaridade positiva. O genoma do HIV-1 tem um tamanho aproximado de 9,8
kilobases (kb) e os provírus apresentam ainda regiões LTRs (Repetições terminais
longas, do inglês Long Terminal Repeats) localizados nos extremos do genoma viral.
Apresentam, ainda, genes estruturais, gag, pol e env que codificam 3 proteínas
estruturais, além de, pelo menos, seis genes adicionais, incluindo genes regulatórios
essenciais como tat, nef e rev e genes acessórios como vif, vpr e vpu que codificam 6
proteínas acessórias (Coffin, 1992; Cheng-Mayer et al., 1989) (Figura 2).
Os retrovírus possuem um genoma único em relação aos outros
vírus devido a vários aspectos, incluindo sua organização física, seu modo de síntese,
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e suas funções replicativas. O genoma viral diplóide é sintetizado e processado pela
maquinaria de condução de RNA mensageiro (mRNA) da célula hospedeira (Gardner,
1993; Weiss, 1993; Weiss, 1995; Weiss, 2001; Gardner, 2003). Este é organizado em
três frames de leituras principais (ORFs, Open Reading Frames) e regiões de
sobreposição. Neste último caso, por exemplo, parte do vpu no frame 2 está
sobreposto ao env no frame 3 (Carter & Saunders, 2007).
Os genes retrovirais são expressos a partir da cópia integrada de
seu genoma de DNA dupla fita. Ambas as fitas do DNA genômico retroviral são
sintetizadas pela principal enzima envolvida no ciclo de replicação viral, a transcriptase
reversa, codificada pelo próprio vírus. Esta proteína possui atividade de polimerase de
DNA dependente, tanto de DNA quanto de RNA. A molécula de ácido nucléico molde
(template) para a síntese da fita negativa é o RNA genômico viral e a template para a
síntese da fita positiva é a fita negativa recém transcrita reversamente, após a remoção
do RNA a partir do híbrido RNA-DNA pela atividade RNase H, associada com a
transcriptase reversa (Friedrich & Moelling, 1979; Grandgenett et al., 1972). A síntese
da fita negativa e, posteriormente, da fita positiva é iniciada próxima à extremidade 5’
dos respectivos templates. Os pequenos segmentos correspondentes (fitas negativa e
positiva de DNA) são depois transferidos para o outro final do template e resultam na
formação das LTRs, presentes em cada extremidade do genoma proviral (Gilboa et al.,
1979; Temin et al., 1980; Temin, 1981). O primer para a síntese da fita negativa é a
extremidade 3’ da molécula de RNAt (RNA transportador), empacotado na partícula
viral junto com o RNA viral genômico e hibridizado ao sítio de ligação de primer (PBS,
Primer Binding Site), localizado na extremidade 3’ da região U5 (Staskus et al., 1976;
Taylor & Ilmensee, 1975; Varmus, 1988). O sítio de início da fita positiva está localizado
imediatamente downstream do trato polipurínico (PPT, Polypurine Tract),
representando a porção 5’ da região U3 (Gilboa et al., 1979; Olsen & Watson, 1982)
(Figura 2). Tem sido proposto que o PPT é usado para definir um primer de RNA por
clivagem específica do template de RNA, neste sítio, pela RNase H associada à
transcriptase reversa (Omer et al., 1984; Resnick et al., 1984; Smith et al., 1984b;
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Smith et al., 1984a). A maioria dos retrovírus, incluindo lentivírus como HIV, possui
duas cópias do PPT, uma na extremidade da LTR 3’ e a outra localizada próxima à
metade do genoma, dentro da região codificadora pol (Sonigo et al., 1985; Wain-
Hobson et al., 1985; Chakrabarti et al., 1987; Guyader et al., 1987; Chakrabarti et al.,
1990).
Uma vez que o RNA viral foi convertido num cDNA, o ácido nucléico
do HIV-1 pode, então, integrar-se no DNA hospedeiro e usar a maquinaria genética da
célula para fazer novos vírus. A integração ocorre dentro de um grande complexo
macromolecular. O complexo pré-integração (PIC) é uma unidade estrutural crucial
para a integração viral. O HIV-1 contém uma enzima, a integrase, que facilita a
incorporação cDNA viral no genoma celular. A integração requer vários co-fatores,
tanto celulares quanto virais em adição à integrase. O PIC, por exemplo, contém
proteínas da matriz, do nucleocapsídeo e transcriptase reversa. Entre os fatores
celulares estão o LEDGEF/p75, (fator derivado do epitélio), o IN1 (interador de
integrase 1), o BAF (fator de barreira de auto-integração) e o HMGA1 (proteína A1 de
alta mobilidade de grupo cromossômico) (Semenova et al., 2008; Zhao et al., 2008). A
estrutura do DNA viral, integrado no genoma da célula hospedeira, é idêntica à da
molécula linear não integrada, exceto pela ausência de dois pares de base de cada
LTR terminal nos sítios de ligação ao DNA celular (Nandi & Banerjee, 1993; Sharkey &
Stevenson, 2001; Sharkey et al., 2005). Há evidências convincentes de que a forma
linear não integrada é o precursor direto do provírus integrado (Simmonds et al., 1990;
Fujiwara & Mizuuchi, 1988). Embora a expressão do genoma viral seja regulada por
fatores celulares, devido a seu efeito nas LTRs virais e outros fatores regulatórios, o
vírus também codifica fatores regulatórios que atuam em trans (Nandi & Banerjee,
1993).
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Figura 2. Esquema representativo do genoma do HIV-1 e seus produtos gênicos.
Fonte: Adaptado de (Carter & Saunders, 2007).
1.4.1. Os produtos Gênicos do HIV-1
1.4.1.1. Genes Estruturais
O gene env codifica o precursor polipeptídico gp160 (complexo
glicoproteíco do envelope). Este complexo é o único produto gênico do HIV-1,
conhecido como relevante para a imunidade humoral protetora. Esta é uma estrutura
trimérica, composta de seis subunidades individuais, sendo três gp120s (glicoproteína
de superfície) e três gp41s (glicoproteína transmembrana), que medeiam a ligação do
virion e fusão das membranas. Além disso, este complexo é o alvo para os anticorpos
neutralizantes de vírus (Ditzel et al., 1997; Moore et al., 2001; Zwick et al., 2001; Moore
et al., 2004).
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Ao ser clivada a gp160 origina duas glicoproteínas, a gp120 e a
gp41. Estas proteínas são expressas na superfície externa da célula hospedeira e
incorporadas a novas partículas virais no momento do brotamento dos virions. A gp120
é a proteína responsável pela interação viral com a molécula de CD4 e dos co-
receptores presentes na membrana das células alvo para o HIV-1 (Deng et al., 1996). A
interação com o CD4 leva a mudanças conformacionais na gp120, expondo sua alça
V3 que estabelece interações com os co-receptores, exibindo o domínio de fusão da
gp41 (Moore et al., 1990a; Moore et al., 1990b; Cheng-Mayer et al., 1991; Moore &
Blanc, 1991; Moore et al., 1991; Moore & Nara, 1991).
Com a completa fusão das membranas celular e viral há a entrada
do capsídeo viral no citoplasma da célula. Neste momento, todas as proteínas virais
sofrem alterações, dando início ao processo de retrotranscrição dos RNAs virais
(Butera, 1993; Butera et al., 1994).
O gene gag codifica uma proteína precursora, p55, que ao ser
processada, origina quatro proteínas que constituem o core viral: p17 ou proteína de
matriz; p24, principal proteína estrutural do capsídeo; p7 ou proteína do
nucleocapsídeo, que auxilia na transcrição reversa; e, p6, uma proteína rica em prolina
cujo papel principal é construir o domínio L, atuando como um sítio de ligação para
vários componentes celulares envolvidos na clivagem e entrega protéica dentro de
compartimentos endossomais tardios (Greene, 1990; Luban et al., 1992; Berkowitz &
Goff, 1994; Reicin et al., 1996; Provitera et al., 2001; Cohen, 2008b).
O gene pol é uma região gênica estrutural e enzimática que
apresenta uma área de sobreposição à gag. Codifica dois precursores poliprotéicos. A
poliproteína Gag inclui as proteínas do nucleocapsídeo e a poliproteína Gag-Pol, que
compõe algumas proteínas estruturais e três enzimas virais: protease (PR),
transcriptase reversa (RT) e integrase (IN) (Shehu-Xhilaga et al., 2002; Hill et al., 2005;
Wang et al., 2008).
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A protease viral (PR ou p10) é responsável pela clivagem das
poliproteínas precursoras Gag e Gag-Pol tornando-as funcionais. A transcriptase
reversa (RT ou p66/p51) é encontrada dentro do core. Possui duas atividades
catalíticas que incluem atividade de DNA polimerase e a atividade ribonuclease H
(RNase H). A integrase (IN ou p31) é a enzima essencial para a integração do genoma
do HIV no genoma da célula hospedeira (Li et al., 1992; Neamati, 2001; Hill et al., 2005;
Cohen, 2008b).
1.4.1.2. Genes Adicionais
1.4.1.2.1. Genes Regulatórios
O gene tat é o principal transativador da expressão dos genes virais.
Esta atividade acontece durante a transcrição dos RNAs virais e é essencial para a
replicação viral (Bannwarth & Gatignol, 2005). Seu produto é a proteína Tat de 14 kDa
(Richter & Palu, 2006; Theisen et al., 2006).
O gene nef codifica a proteína citoplasmática Nef (p27) que se liga à
superfície interna das membranas celulares, onde exerce suas principais funções:
aumentar a replicação viral e inibir e/ou diminuir a expressão (down-regulation) dos
receptores CD4 das células hospedeiras, o que, conseqüentemente, inibe a re-infecção
das células infectadas pelo vírus. A proteína Nef é uma das primeiras a serem
expressas nas células infectadas quando o ciclo replicativo do HIV-1 é iniciado.
Estudos sugerem que a Nef pode aumentar a atividade do NF-κB (fator de estímulo da
transcrição celular) facilitando, desta forma, a replicação do vírus (Cheng-Mayer et al.,
1989; Goldsmith et al., 1995; Geyer et al., 2001; Raney et al., 2007).
O gene rev atua na fase pós transcripcional e promove o transporte
das moléculas de mRNA das proteínas estruturais e acessórias. Produz a segunda
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proteína da regulação denominada Rev (p19), cuja função é regular a expressão do
mRNA viral (Haseltine, 1991; Lesnik et al., 2002).
1.4.1.2.2. Genes Acessórios
O gene vif codifica uma proteína de 23 kDa que é produzida, em
altos níveis no citoplasma, tardiamente durante a replicação viral, como os demais
genes acessórios. Esta proteína é chamada de Fator de Infectividade Viral, sendo que
sua principal função é acentuar a infectividade das partículas virais e a transmissão
célula-a-célula. Além de ajudar na síntese do DNA proviral e/ou na montagem viral,
essa proteína promove a maturação viral (Anderson & Hope, 2003; Kremer & Schnierle,
2005; Barraud et al., 2008).
A partir da descoberta do fator de restrição celular APOBEC3G
humana (hA3G; inicialmente chamada CEM15), em 2002 (Sheehy et al., 2002), cuja
atividade antiviral é neutralizada pela proteína Vif, surgiram novas possibilidades de
terapia antiretroviral. A clivagem da ligação entre Vif e APOBEC, com pequenas
moléculas inibidoras, pode ativar a atividade antiviral das enzimas celulares. A
APOBEC3G é um membro da grande família das APOBECs, proteínas com atividade
de citidina deaminase, que estão envolvidas na edição do RNAm e diversificação do
gene da imunoglobulina. Na ausência de Vif, a APOBEC3G é incorporada ao virion
dentro da célula produtora e, no próximo ciclo de infecção, a APOBEC3G associada ao
virion converte citocinas em uracilas, durante a síntese de DNA polaridade negativa e,
conseqüentemente, gera-se a hipermutação, com substituições G para A no genoma
viral durante a transcrição reversa. Isto pode resultar na degradação do DNA viral
recém sintetizado pela ação das proteínas celulares uracil-DNA-glicosilases (Kremer &
Schnierle, 2005; He et al., 2008).
O gene vpr codifica uma proteína de 15KDa que é traduzida a partir
de um mRNA que sofreu um único evento de splicing. A proteína Vpr detectada nas
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células está localizada no núcleo. Funções propostas para a Vpr incluem o transporte
do complexo pré-integração para o núcleo, transativação de genes celulares e indução
da diferenciação celular, inibição da divisão celular, paralisação do ciclo celular das
células infectadas na fase G2 e apoptose (Janvier et al., 2000; Rouzic & Benichou,
2005).
O gene vpu codifica a proteína Vpu de 16KDa, por uma fase aberta
de leitura que se sobrepõe à extremidade 5’ do gene env. Tem como uma das funções
a regulação da expressão de CD4 na superfície celular, pois degrada esta molécula
ainda no retículo endoplasmático, quando este se associa à gp160 recém sintetizada.
Logo, esta proteína subsidia a liberação de partículas do HIV-1 da célula (Buonocore et
al., 1994; Inubushi et al., 1998; Malim & Emerman, 2008).
As proteínas acessórias têm sido muito úteis na revelação de
funções de proteínas principais do HIV-1 e, também, de atividades biológicas
associadas a proteínas celulares normais. Estas proteínas acessórias definem a
natureza complexa de lentivírus como o HIV-1 e fornecem um entendimento de como o
vírus tem buscado maneiras para infectar uma variedade de tipos celulares diferentes,
bem como, dos processos mutacionais associados à geração da diversidade genética
viral (devido à alta taxa de erro de sua transcriptase reversa) e, conseqüentemente,
dos mecanismos de integração, latência e persistência viral (Inubushi et al., 1998; Levy,
1998; Levy, 2006; Malim & Emerman, 2008).
Além dos genes acessórios o HIV apresenta as LTRs, localizadas
nos extremos das moléculas de RNA viral, flanqueando a região codificadora. As LTRs
são geradas durante o processo de transcrição reversa do RNA genômico viral em
DNA viral e realizam uma série de funções durante o ciclo infeccioso, atuando,
principalmente, como regiões regulatórias, sendo sua função principal promover a
transcrição viral (Vicenzi et al., 1994; Vicenzi & Poli, 1994; Pereira et al., 2000).
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Cada seqüência LTR foi historicamente subdividida em três regiões
(U3, R e U5) com base em suas localizações no genoma viral. Por definição, as
seqüências R estão situadas nos finais das moléculas de RNA genômico viral. Elas
participam do processo de transcrição reversa, ligando pequenas moléculas nascentes
de DNA fita simples ao template RNA genômico (não transcrito) para formar o híbrido
DNA-RNA (Coffin & Haseltine, 1977; Junghans et al., 1977; Stoll et al., 1977; Barbas, et
al., 1993; Vicenzi et al., 1994). Os componentes U3 e U5 dos LTRs são blocos únicos
(U), de seqüências, que se localizam imediatamente interno às regiões R dos finais 3’ e
5’ do RNA retroviral, respectivamente (Vicenzi et al., 1994).
1.5. Ciclo Replicativo do HIV-1
A infecção de uma célula susceptível ao HIV começa com a
ancoragem e adesão do vírus, através da glicoproteína de superfície gp120, ao
receptor CD4 da célula-alvo. A ligação CD4 com a gp120 é uma ligação de alta
afinidade. Os principais domínios da gp120 que estabelecem interações com a
molécula de CD4 foram mapeados e estão localizados nas regiões conservadas C2,
C3 e C4. A interação entre a molécula de CD4 com a gp120 acarreta nessa
glicoproteína modificações conformacionais, que geram um sítio para a interação desta
com a molécula do co-receptor, levando a formação de um complexo gp120-CD4-co-
receptor (Clapham, 1997; Clapham & Weiss, 1997). A principal região da gp120
envolvida nesta ligação é a alça hipervariável V3. Após o estabelecimento do complexo
CD4-gp120-co-receptor, a glicoproteína transmembrana gp41 sofre mudanças
conformacionais que resultam no seu alongamento e exposição de seu peptídeo de
fusão, que é, então, inserido na membrana celular, iniciando, assim, a fusão desta com
a membrana viral (Cocchi et al., 1995; Cocchi et al., 1996a; Cocchi et al., 1996b).
Após a fusão das membranas viral e celular, o capsídeo entra no
citoplasma da célula alvo. O material genético do vírus (RNA fita simples) é liberado
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neste local e inicia-se, assim, o processo de transcrição reversa do genoma viral em
cDNA viral. Uma vez que o material genético do HIV foi convertido em cDNA, este
cDNA viral nascente transloca-se ao núcleo, no contexto do complexo nucleoprotéico
de alto peso molecular. No núcleo, o complexo de pré-integração liga-se a cromatina e
catalisa a integração do cDNA viral com o DNA celular, sendo que esta integração é
catalisada pela integrase viral. O cDNA viral integrado ao genoma celular é
denominado de provírus e passa a ser controlado pela maquinaria de transcrição
celular da célula hospedeira. Depois de integrado ao material genético do hospedeiro, o
HIV pode permanecer em estado latente por muitos anos. Esta habilidade que o vírus
tem de permanecer latente em células infectadas é o maior obstáculo para a sua
erradicação (Bartlett et al., 1998; Fauci et al., 1998; Lehmann-Che & Saib, 2004; Abbink
& Berkhout, 2008; Stevenson, 2008).
Como a síntese dos mRNAs virais depende agora da maquinaria
celular, a expressão de seus genes está diretamente relacionada com o estado de
ativação celular (Butera et al., 1994). A ativação da célula-alvo resulta na transcrição do
DNA viral em RNAs mensageiros virais, que serão traduzidos em poliproteínas virais,
as quais serão processadas para gerar as proteínas estruturais, glicoproteínas e
enzimas pela ação da protease (Weiss, 2001). O novo RNA viral forma o material
genético da próxima geração de vírus. O RNA viral e as proteínas virais se estruturam
junto à membrana da célula para formar um novo vírus. Após a estruturação na
superfície da célula, o vírus se desprende (“brota”) desta e fica livre para infectar outra
célula-alvo. Se o ciclo de vida do HIV não for interrompido através do tratamento, a
infecção se espalha pelo corpo e resulta na destruição do sistema imunológico do
organismo (Cheng-Mayer et al., 1988; Cheng-Mayer et al., 1990; Gandhi et al., 1999).
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1.6. Tropismo viral do HIV-1
O tropismo viral é um termo frequentemente usado para definir a
especificidade de um vírus a um tecido particular ou célula do hospedeiro. O tropismo é
determinado, principalmente, pela interação entre estruturas de superfície viral com
receptores presentes na superfície da célula (Berger, 1997; Berger et al., 1998).
No caso do HIV-1, a transmissão da infecção em humanos requer a
disseminação do vírus, a partir de locais de infecção nas superfícies das mucosas para
zonas de células T nos órgão linfóides secundários, onde ocorre extensa replicação
viral nas células T CD4
+
auxiliares. Estas células expressam universalmente a molécula
de CD4 (Cheng-Mayer et al., 1990; Fauci, 1996).
Além do CD4, o HIV requer um co-receptor para a entrada nas
células alvo. Atualmente, o repertório de co-receptores inclui vários membros, em sua
maioria, receptores de quimiocina e alguns receptores órfãos. O CXCR4 e o CCR5,
membros da superfamília de receptores acoplados à proteína G, são os principais co-
receptores utilizados pelos isolados de HIV-1 com tropismo por células T e macrófagos,
respectivamente (Berger, 1997; Moore, 1997; Moore et al., 1997).
Geralmente, os vírus que são transmitidos entre os indivíduos são
capazes de infectar macrófagos e células TCD4
+
primárias, mas não se replicam em
linhagens de células T transformadas (Schuitemaker et al., 1992; Connor et al., 1997).
Como resultado não induz a formação de sincício em cultura de células (MT-2 ou
outras linhagens celulares comumente utilizadas). Anteriormente, vírus com estas
propriedades eram referidos como M-tropic, devido à habilidade de infectar
macrófagos, NSI (Non-Syncytium Inducing), devido à inabilidade de formar sincício em
linhagens de células T, ou SL (Slow-Low), em relação à sua cinética de replicação em
cultura (Fenyo et al., 1988). Dada a importância do fenótipo viral para a patogênese e
progressão da doença, associada à natureza imprecisa dos sistemas de classificação
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anteriores, um sistema de classificação mais acurado foi proposto (Doms & Peiper,
1997; Edinger et al., 1997). Atualmente, baseando-se no uso do co-receptor, as cepas
virais que infectam células que expressam o CCR5 em sua superfície, são chamadas
de R5 (Cheng-Mayer et al., 1997; Berger, 1997; Berger et al., 1998).
Os vírus capazes de infectar linhagens de células T eram
previamente referidos como T-tropic, SI (Syncytium Inducing) ou RH (Rapid High), de
acordo com propriedades já mencionadas. Hoje, esses vírus, que infectam células que
expressam o CXCR4 em sua superfície, são chamados de X4. Com o tempo,
tipicamente 4-5 anos após a infecção, as cepas virais R5 evoluem em alguns
indivíduos (cerca de 50%), adquirindo a capacidade de infectar linhagens de células T
(em adição às células TCD4
+
primárias). Estas cepas virais, previamente conhecidas
como dual-tropic, são agora denominadas R5/X4 (Connor et al., 1993a; Connor et al.,
1993b; O'Brien & Moore, 2000).
A emergência destas variantes virais correlaciona-se diretamente
com a progressão da doença. Somente os vírus R5 podem infectar células dendríticas,
tais como, as células de Langerhans na mucosa (Geijtenbeek et al., 2000). As cepas de
HIV-1 R5 são também selecionadas após a transmissão parental (Weiss, 2001; Sierra
et al., 2005). Vírus com tropismo para outras quimiocinas receptoras, especialmente
CXCR4, são raramente transmitidos e, geralmente, aparecem somente tardiamente na
infecção como uma tendência de troca a partir do fenótipo R5 para o X4 (Geijtenbeek
et al., 2000; Weiss, 2001).
Os vírus R5 predominam nos estágios iniciais da infecção pelo HIV-
1 e são responsáveis pelo estabelecimento da infecção in vivo (Zhu et al., 1993;
Shankarappa et al., 1999), enquanto que os vírus X4 tendem a aparecer nos últimos
estágios e podem estar relacionados com um rápido declínio de células TCD4
+
,
acelerada progressão para a doença e reduzida sobrevivência dos indivíduos não
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tratados (Tersmette et al., 1988; Schuitemaker et al., 1992; Koot et al., 1993; Briz et al.,
2008).
O CCR5 é altamente expresso em células TCD4
+
de memória
(CD4+RO+CCR5), as quais representam a principal fonte de produção viral in vivo. O
tecido linfóide associado ao intestino, que é rico em células T CD4
+
CCR5 positivas,
tem uma função crucial no sítio de infecção inicial na replicação massiva do HIV-1 e na
depleção de células TCD4
+
(Guadalupe et al., 2003) Por outro lado, as moléculas de
CXCR4 são expressas preferencialmente em células T naive, como os timócitos
imaturos. Esta diferença na expressão de co-receptores pode explicar, em parte, a
maior depleção celular e a mais rápida progressão para a aids verificada em indivíduos
infectados com variantes X4 (Briz et al., 2008).
A descoberta destes co-receptores celulares forneceu uma nova
abordagem para o entendimento de importantes características da biologia viral,
incluindo o tropismo seletivo de variantes virais para diferentes células CD4 alvo e,
também, os mecanismos que regem o processo de fusão e entrada do HIV-1 na célula.
Os co-receptores também fornecem perspectivas moleculares em relação ao enigma
central da infecção pelo HIV-1, incluindo a transmissão seletiva de variantes R5 e o
surgimento de variantes X4 na maioria dos indivíduos infectados durante a progressão
para a aids, bem como diferenças individuais na susceptibilidade à infecção e
progressão da doença. Estudos genéticos têm produzido os principais insights in vivo
sobre a função de co-receptores específicos e seus ligantes. Neste sentido, foi de
particular importância, a descoberta de uma mutação no gene CCR5, na qual a forma
homozigota confere forte resistência à infecção pelo HIV-1. Além de fornecer novas
perspectivas sobre aspectos fundamentais da transmissão e patogênese do HIV-1, os
co-receptores representam agora novas abordagens terapêuticas e estratégias de
combate à aids (Cheng-Mayer et al., 1997; Gorry et al., 2004; Coakley et al., 2005).
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Recentemente, muitos estudos têm avaliado a dinâmica do
tropismo viral durante o curso da infecção pelo HIV-1 e sua associação com a terapia
antiretroviral graças ao desenvolvimento de drogas inibidoras da entrada do vírus na
célula, como o Maraviroc
®
e o Vicriviroc
®
(Lehmann-Che & Saib, 2004; Brumme et al.,
2005a; Brumme et al., 2005b; Melby et al., 2007). Grande parte dos estudos
envolvendo a diversidade genética do HIV-1 e o tropismo viral está voltada para a
determinação do uso do co-receptor, monitoramento genotípico da transição R5 para
X4 e resistência à drogas (de Mendoza et al., 2007; Poveda et al., 2007a; Poveda et
al., 2007b; Briz et al., 2008; de Mendoza et al., 2008; Fatkenheuer et al., 2008; Gulick
et al., 2008; Landovitz et al., 2008).
A diversidade genética das populações de HIV-1, num indivíduo, é
perdida durante os eventos de transmissão para um novo hospedeiro. Este fenômeno,
conhecido como population bottleneck, é importante para a determinação da dinâmica
evolucionária das populações virais, particularmente, para o impacto relativo da
seleção natural e do drift genético imediatamente após a infecção (Clarke et al., 1993;
Domingo et al., 1996). Até o momento, não existem relatos avaliando a geração da
diversidade genética do HIV-1 nos momentos iniciais da infecção em cultivo celular e
sua correlação com o tropismo viral. Ademais, de acordo com dados da literatura, a
diversidade genética diferenciada in vitro entre variantes virais R5 e X4 nunca foi
analisada. Uma vez que a magnitude do population bottleneck ainda não está
esclarecida e que os vírus R5 predominam no curso inicial da infecção, é plausível
considerar a extrema relevância deste tipo de abordagem.
1.7. A variabilidade Genética do HIV-1
A elevada variabilidade genômica do HIV tem conduzido importantes
implicações para o diagnóstico, tratamento e prevenção (Gelderblom, 1991; Gardner,
1993; Hirsch et al., 1993; Deng et al., 1996; Gardner, 2003; Geisbert & Jahrling, 2004;
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Fauci, 2007; Hurwitz et al., 2008; King & Aberg, 2008; Walker & Burton, 2008). O HIV
pode ser subdividido em dois tipos: o HIV-1 e HIV-2. Embora sejam retrovírus, a
patogênese da doença que eles causam difere drasticamente. Estes vírus possuem
estruturas genéticas muito similares, mas eles podem diferir em mais do que 40% em
termos de seqüência de nucleotídeos (Robertson et al., 2000; Levy, 2006). Os dois
vírus possuem genes acessórios e estruturais que influenciam na replicação e
patogênese, muitos desses genes são compartilhados entre ambos tais como os genes
gag e pol; entretanto, somente o HIV-1 possui o gene que codifica a proteína Vpu,
sendo a proteína Vpx somente codificada pelo HIV-2 (Robertson et al., 2000).
O agente principal responsável pela pandemia da aids é o HIV-1,
enquanto que a ocorrência do HIV-2 está restrita a algumas regiões da África Central e
Ocidental. Estes vírus têm uma notável capacidade mutacional e de adaptação a novas
condições do ambiente humano (Arien et al., 2005a; Arien et al., 2005b; Requejo, 2006;
Arien et al., 2007).
Indivíduos infectados com HIV-2 são principalmente encontrados na
África Ocidental e Índia e, em um grau mais limitado, em Portugal e antigas colônias
portuguesas. Em relação às características biológicas, o HIV-2 parece ser menos
patogênico e prevalente. As infecções pelo HIV-2 estão associadas com uma lenta
progressão da deficiência imune (Jeffs et al., 2006; Vlahakis et al., 2007). Porém, esta
observação pode mascarar um espectro bimodal de virulência, em que alguns
indivíduos infectados com HIV-2 progridem para aids em uma taxa similar àqueles com
HIV-1, enquanto que em maiores proporções, os pacientes HIV-2 positivos são não-
progressores a longo prazo. É também notável que, entre as pessoas infectadas com o
HIV-2 que desenvolvem aids, as doenças cerebrais são mais comuns (Lucas, 1993;
Lucas et al., 1993). Embora o HIV-2 não tenha grupos, há cinco subtipos distintos e
eqüidistantes denominados de A-E, dos quais A e B são os mais proeminentes
(Requejo, 2006; Cohen, 2008b).
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O HIV-1 pode ser subdividido em três grandes grupos: M (Major),
O (Outlier) e N (New ou non-M, non-O) (Moore et al., 2001). Estes grupos são
membros da linhagem primata Lentivírus que incluem também o SIVcpz. Os grupos M
e N são aproximadamente eqüidistantes do SIVcpz (Taylor & Hammer, 2008). Subtipos
de HIV-1 compartilham 70–90% de identidade de seqüência, enquanto os grupos
compartilham menos que 70% de identidade (Arien et al., 2007).
O grupo M é responsável por mais de 99% das infecções mundiais,
sendo composto por subtipos ou clades genéticas distintas. Atualmente o grupo M é
composto por nove subtipos denominados de A-D, F-H, J e K (Milich et al., 1993;
Moore et al., 2001; Miceli et al., 2002; Vallejo et al., 2003; Vallejo et al., 2004; Requejo,
2006).
O subtipo C parece ter se espalhado mais rapidamente pelo mundo
do que os demais subtipos (McCutchan, 2006). Este retém o fenótipo R5 até durante a
progressão da doença. Esta característica pode fornecer uma vantagem na
transmissão se o fenótipo R5 for favorecido (Piribauer & Duer, 1998; Ping et al., 1999).
Atualmente o grupo O não apresenta classificação análoga de
subtipos, entretanto, uma nova classificação tem sido proposta a partir de 5 novos
agrupamentos filogenéticos, distribuídos de I a V. Além disso, as infecções pelo grupo
O são menos comuns e endêmicas no oeste da África Central, principalmente em
Camarões, Gabão, Nigéria e Guiné Equatorial (Requejo, 2006; Little et al., 2008; Taylor
et al., 2008; UNAIDS, 2008).
Além dos subtipos virais do HIV-1, recombinantes intersubtipos
podem ocorrer em um cenário de intermistura de subtipos. Os recombinantes na
população apresentam muitos ciclos de co-infecção e backcrossing, diante de fatores
como dispersão geográfica ou entrada em diferentes redes sociais, conduzindo a
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fixação das formas recombinantes particulares (Artenstein et al., 1995a; Artenstein et
al., 1995b; Artenstein et al., 1995c; Brodine et al., 1995; Robertson et al., 2000).
Os recombinantes intersubtipos têm se disseminado na pandemia de
HIV/aids, estabelecendo-se como linhagens distintas. Na epidemia global do HIV-1
existem formas recombinantes únicas (URFs) e as formas recombinantes circulantes
(CRFs, Circulating Recombinant Forms). As URFs apresentam uma estrutura de
mosaico única descrita em apenas um paciente ou, no máximo, entre indivíduos
relacionados (dentro de uma família, por exemplo) e não adquiriu caráter epidêmico. As
CRFs são as formas recombinantes virais capazes de se manterem e expandirem em
uma população de indivíduos. Possuem, portanto, um caráter epidêmico. Estes vírus
recombinantes têm uma designação que incluem as letras dos subtipos genéticos
parentais (por exemplo, CRF01_AE), se bem que em CRFs derivadas por
recombinação de mais do que três subtipos, as letras são substituídas por cpx
(complexo), por exemplo, CRF04_cpx (Robertson et al., 2000; McCutchan et al., 2004;
McCutchan, 2006). De fato, a partir do advento do estudo sistemático do genoma
completo do HIV-1 a partir da década de 1990, ficou claro que isolados recombinantes
possuem um papel muito importante no avanço da epidemia global do HIV-1.
Atualmente, cerca de 25% das novas infecções virais se dão por vírus recombinantes e
existem áreas geográficas no mundo onde a epidemia do HIV-1 é dominada por
isolados virais recombinantes. Já foram descritas cerca de 43 CRFs (figura 4)
(McCutchan et al., 2004; de Sa Filho et al., 2006; McCutchan, 2006).
No Brasil, os principais subtipos circulantes do HIV-1 são o B
(75%), seguido pelo F (10%) e outros subtipos tais como o C e recombinantes B/C e
B/F. No entanto, é considerável a expansão do subtipo C (de Sa Filho et al., 2006;
McCutchan, 2006; Sanabani et al., 2006; de Sa-Filho et al., 2008). A recombinação
pode introduzir conseqüências genéticas e biológicas que são melhores que aquelas
resultantes, a partir do acúmulo definitivo de mutações únicas. A partir disto, é possível
presumir qual tipo de impacto que a diversidade causada pelas estruturas CRF podem
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ter sobre o desenvolvimento de vacinas HIV/aids altamente eficazes. A disseminação
de subtipos do HIV-1 e CRFs têm mostrado um processo dinâmico e imprevisível,
sendo inevitável o alastramento geográfico destas variantes virais (Esparza et al., 1991;
Loeb et al., 1999; Stoeckli et al., 2000; Carrington et al., 2001; Stoeckli et al., 2002;
Kewal & Coffin, 2003; McCutchan et al., 2004; McCutchan, 2006).
Figura 3. As formas recombinantes circulantes (CRFs) do HIV-1.
Fonte: Adaptado do (HIV Sequence Database, 2008).
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1.8. A importância do Estudo da Diversidade Genética do HIV-1
O estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 permite um
melhor entendimento sobre a estrutura genética das populações ao longo do tempo e,
consequentemente, o entendimento do curso evolutivo destas populações virais. A
manutenção de taxas de mutação específicas para organismos também pode ser
encarada como o resultado de um processo evolutivo. Nesse sentido, a evolução do
HIV-1 sofre a influência de três fatores principais. O primeiro é o fato de que os vírus
como o HIV (de genoma RNA) possuem as taxas de mutação mais elevadas na
natureza, em torno de 10
-3
a 10
-5
por nucleotídeo por ciclo de replicação (Dougherty &
Temin, 1988; Drake, 1993; Domingo, 1997; Domingo et al., 1997; Drake et al., 1998;
Drake, 1999). Isto significa que um nucleotídeo errado pode ser incorporado a cada mil
ou cem mil bases copiadas. Os demais fatores são representados pelo tempo de
geração extremamente curto e pela capacidade de constituição de populações virais de
tamanho muito grande. Quando combinados, estes fatores contribuem para a
existência de um processo evolutivo acelerado (Domingo et al., 1996; Domingo, 1997;
Domingo et al., 1998a; Domingo et al., 1998b).
Embora a maioria das mutações produzidas durante o ciclo
replicativo viral possua um efeito negativo na capacidade adaptativa do vírus, mutantes
que contenham mutações vantajosas se replicam mais eficientemente que os genomas
contendo mutações deletérias criando um equilíbrio seletivo. Este equilíbrio advém da
contínua geração de mutantes replicando sob forças seletivas positivas e negativas que
agem no conjunto das unidades replicativas como um todo e gera uma população viral
composta por um elevado número de genomas únicos, porém relacionados. Esta
população, embora dinâmica, é altamente organizada (Domingo et al., 1978; Domingo
et al., 2001) e pode ser considerada um exemplo real da organização molecular
denominada de quasispecies, usada para representar a evolução de moléculas auto-
replicativas sujeitas a erros durante a replicação, durante o estabelecimento da vida no
planeta (Eigen, 1971a; Eigen, 1971b; Domingo et al., 1978; Eigen, 1993; Domingo et
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al., 1998a; Domingo et al., 2001; Eigen, 2002; Domingo et al., 2005a; Domingo et al.,
2005b).
Além disso, as populações do HIV-1 podem ser influenciadas por
processos de dinâmica populacional como deriva gênica e de redução drástica do seu
tamanho populacional conhecida como population bottlenecks. Isto pode determinar a
constituição genética da distribuição de mutantes em populações virais. Os population
bottlenecks são eventos aleatórios capazes de reduzirem o tamanho da população
efetiva a ponto de que apenas alguns representantes da população original serem
capazes de formar a nova população resultante. Logo, population bottlenecks podem
reduzir a diversidade genética de uma população. Quando apenas algumas partículas
virais mutantes são selecionadas ao acaso para estabelecerem uma população
derivada, é provável que estes mutantes possuam mutações deletérias, com menor
valor adaptativo, em relação aos mutantes melhores adaptados presentes na
população original. Estas mutações serão refletidas em muitas unidades replicativas
presentes na nova população, acelerando o acúmulo destas mutações nas sequências
consenso da população quasispecie derivada (Muller, 1964; Duarte et al., 1992;
Kondrashov, 1994).
Na natureza, eventos como os population bottlenecks ocorrem
frequentemente durante a transmissão do HIV-1 e podem facilmente constituir um
problema para a sobrevivência das populações virais. Interessantemente, apesar da
alta frequência de population bottlenecks e da extinção de populações virais
decorrentes dos efeitos de population bottlenecks que já foram documentadas, as
populações virais não são facilmente extintas. Assim sendo, é plausível imaginar que
as populações virais desenvolveram mecanismos de compensar os efeitos negativos
dos bottlenecks. Em relação ao HIV-1, as novas infecções caracterizam-se por uma
diversidade viral menor do que a observada nas infecções originais. Isto implica que
apenas algumas variantes virais presentes na população original são capazes de
estabelecer a nova infecção no indivíduo recentemente infectado, indicando que o vírus
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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30
é transmitido através de um pequeno número de partículas (Chao, 1990; Nowak et al.,
1991; Nowak & May, 1991; Duarte et al., 1992; Pang et al., 1992; Escarmis et al., 1996;
Escarmis et al., 2002; Novella & Ebendick-Corpus, 2004).
Nas populações quasispecies as pressões seletivas atuam na
população como um todo, selecionando rapidamente os vírus melhores adaptados para
um dado momento seletivo. Assim, a possibilidade de escape às pressões e
sobrevivência das populações virais está intimamente relacionada ao tamanho do
conjunto de variantes genéticas que ela apresenta (Domingo & Holland, 1997; Yuste et
al., 1999; Yuste et al., 2000; Yuste et al., 2005).
Embora, o processo mutacional viral intenso propicie vantagens
seletivas e permita ao vírus sua própria sobrevivência, a habilidade do HIV em se
adaptar às pressões seletivas impostas pelo meio possui um custo alto. O
favorecimento do erro durante a replicação do vírus impõe ao HIV uma carga
mutacional importante que resulta na contínua geração de partículas defectivas. As
taxas mutacionais encontradas nos retrovírus e em outros vírus de genoma RNA
aproximam-se do limite máximo compatível com a produção de uma progênie viral
viável e infecciosa (Holland et al., 1990). A violação deste limite de viabilidade resulta
no repentino e irreversível colapso da estrutura populacional viral decorrente de um
acúmulo intolerável de mutações deletérias. Esta perda do potencial replicativo da
população viral levando à sua extinção é conhecida como error catastrophe. As
populações de vírus RNA como a do HIV replicam muito perto do error catastrophe o
que as torna suscetíveis à extinção caso ocorra pequenos aumentos na taxa de
incorporação de erros (Eigen, 1971a; Eigen, 1993; Domingo & Holland, 1997; Eigen,
2002).
Estas mutações nos genomas do HIV podem surgir como o
resultado de 3 etapas distintas de polimerização dos ácidos nucléicos virais sujeitas à
incorporação de erros e ocorridas durante o ciclo replicativo retroviral. Estudos sobre a
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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fidelidade da enzima transcriptase reversa, demonstraram que durante a síntese de
molécula de DNA complementar, a transcriptase reversa é muito menos acurada do
que as DNA polimerases regulares das células (Preston et al., 1986; Preston et al.,
1988; Preston & Dougherty, 1996; Menendez-Arias, 2002; Menendez-Arias & Berkhout,
2008). Enquanto a transcriptase viral pode incorporar 1 nucleotídeo errado a cada
10.000 ou 100.000 nucleotídeos incorporados, as DNA polimerases celulares erram em
torno de 1 vez a cada 1 bilhão de nucleotídeos incorporados. Muito desta diferença em
fidelidade decorre do fato de que a transcriptase reversa não possui associada a sua
estrutura, uma atividade revisora exonucleotídica 3’ → 5’. A atividade revisora das
polimerases significa a parada na síntese do DNA nascente após a incorporação
errada de nucleotídeo, retorno da enzima ao local do erro e consequente eliminação do
nucleotídeo incorporado erradamente (Battula & Loeb, 1976; Roberts et al., 1988;
Svarovskaia et al., 2003).
A disparidade entre a taxa de incorporação de erros da enzima viral
transcriptase reversa e das DNA polimerases celulares envolvidas no processo de
replicação regular do DNA genômico celular, sugere que mutações surgidas durante o
processo de cópia do DNA proviral integrado, são muito raras e pouco contribuem na
geração de diversidade de uma população viral em processo de replicação ativa
(Gojobori & Yokoyama, 1985). Esta noção advém do fato de que em ensaios de ciclo
replicativo único, a grande maioria das mutações observadas durante a cultura de
células é o resultado da ação da enzima transcriptase reversa viral (Zhang & Temin,
1993; Kim et al., 1996; O'Neil et al., 2002; Zhang, 2004).
Ensaios de ciclo de infecção único onde apenas as etapas de
transcrição reversa e integração do genoma viral possam ocorrer podem trazer uma
boa idéia da real contribuição das RNA polimerases sobre a variação viral (Zhang &
Temin, 1993; Bebenek et al., 1999; Zhuang et al., 2002; Zhang, 2004; Yuste et al.,
2005).
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Variações nas concentrações de deoxirribonucleotídeos
intracelulares e a consequente incorporação errada de bases podem contribuir para a
geração de diversidade durante a síntese do DNA viral. A concentração intracelular de
deoxirribonucleotídeos varia em diferentes estágios do ciclo celular e pode ser
influenciada por diferentes momentos de ativação celular. Células em repouso tendem
a possuir uma concentração baixa de deoxirribonucleotídeos ou uma concentração
residual resultante dos eventos anteriores de divisão celular. Esta é desequilibrada
onde existem excessos relativos de um ou outro deoxirribonucleotídeo, o que favorece
a incorporação de erros pela enzima transcriptase viral, caso a síntese do DNA viral
ocorra num ambiente assim (Vartanian et al., 1994; Julias & Pathak, 1998; Vartanian et
al., 2003; Lerner et al., 1995; Chen et al., 2002).
Além disso, a maneira em que a transcrição reversa viral ocorre
também facilita a manutenção de erros incorporados já que a fita molde genômica
original é degradada pela ação da porção RNAse H da enzima viral transcriptase
reversa. Desta forma, à medida que a primeira fita de DNA viral é sintetizada o molde
original viral é degradado não permitindo ação de qualquer mecanismo por reparo
celular. Com este mecanismo, todos os erros incorporados são, portanto mantidos.
Este mecanismo impede a ação de programas celulares de reparo que atuam após a
síntese do DNA de fita dupla. Com a progressão da célula ao longo do ciclo celular,
ocorre um aumento e equilíbrio nas concentrações intracelulares de
deoxirribonucleotídeos em preparação para síntese do DNA celular antes que ocorra a
divisão mitótica. Este aumento e equilíbrio da concentração dos deoxirribonucleotídeos
oferecem ao HIV um ambiente bioquimicamente mais favorável para que ocorra a
transcrição reversa dos seus genomas. Assim existem momentos da vida celular mais
ou menos favoráveis ao processo de transcrição reversa viral, sendo que, nos menos
favoráveis, existe um risco maior de que o processo de transcrição reversa viral não se
complete ou que ocorra um acúmulo de mutações além do limite de tolerabilidade para
a produção de partículas virais infecciosas (Roberts et al., 1988; Svarovskaia et al.,
2003).
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Um estudo preciso das taxas de mutação operando no HIV-1
envolve o desenho de protocolos experimentais que reduzam a capacidade replicativa
do vírus a um número definido e desejável de ciclos replicativos. Sem controle de
quantos ciclos de replicação viral ocorrem nos experimentos, não se pode inferir muita
coisa a respeito das taxas mutacionais virais.
Portanto, o estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 é
de suma importância uma vez que as mutações presentes nos genomas virais
constituem o repertório genético que pode proporcionar ao vírus o escape imune,
mudanças de tropismo viral, além de dificultarem o desenho de estratégias de
intervenção viral como uso de medidas terapêuticas e elaboração de vacinas (Domingo
et al., 1997; Rambaut et al., 2004).
2 - OBJETIVOS
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OBJETIVOS:
2.1. Geral
• Estudar em cultivo celular a geração de diversidade genética do HIV-1 após ciclo
único de infecção.
2.2. Específicos
• Estudar os efeitos genéticos decorrentes do encontro inicial viral com uma
população heterogênea de células.
• Comparar a diversidade genética gerada a partir da infecção de Células
Mononuclerares do Sangue Periférico (PBMCs) com partículas virais contendo o
mesmo backbone, pseudotipadas com vetores de expressão para envelopes R5
e X4 do HIV-1.
• Comparar a diversidade genética viral gerada a partir da infecção de PBMCs em
diferentes estados de ativação celular.
• Identificar regiões do HIV-1 intrinsecamente sujeitas a maior variação genética.
3 - MATERIAL E MÉTODOS
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3.1. Vetores
Os vetores (plasmídeos) utilizados para a montagem dos
pseudotipos virais foram gentilmente cedidos pelo Dr. Eric O. Freed do National
Institute of Health-NIH (Maryland, EUA).
Estes plasmídeos foram enviados em papel filtro tipo Whatman 3
mm (New Jersey, EUA). Resumidamente, um círculo foi desenhado no papel filtro
antes da aplicação de cada plasmídeo com intuito de identificar e evitar a
contaminação cruzada entre as diferentes amostras. Dez microgramas de cada
plasmídeo, eluído em Tris 10 mM, pH 7,6, foi aplicado no centro do círculo. O papel
filtro foi, então, vedado em embalagem plástica e, deste modo, os plasmídeos foram
enviados por correspondência. O procedimento acima foi necessário para evitar que o
material fosse perdido ou se contaminasse, caso o envelope de postagem entrasse em
contato com a água.
O pNL4-3KFS corresponde a uma variante do clone molecular
infeccioso do HIV-1 pNL4-3 (Adachi et al., 1986) (número de catálogo 114, AIDS
Reagent Program, NIH, Maryland, EUA) (Figura 4). Este plasmídeo foi produzido pela
inserção de linkers de Bgl II, no sítio da enzima KpnI localizada na região amino
terminal do envelope, produzindo uma mutação de fase de leitura. Portanto, o pNL4-
3KFS é defectivo para o gene do envelope (Freed et al., 1992; Yuste et al., 1999).
O plasmídeo pIIINL4env (número de catálogo 289, AIDS Reagent
Program, NIH, Maryland, EUA) é um vetor de expressão do envelope da cepa viral
NL4-3, que expressa o co-receptor CXCR4 (Sodroski et al., 1986; Freed et al., 1992;
Khan et al., 2001; Khan et al., 2003).
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O pNL(AD8)env é um vetor de expressão do envelope da cepa viral
AD8. Este vetor expressa um envelope viral R5 num backbone do pNL4-3 (Freed et al.,
1995).
Figura 4. Mapa do plasmídeo pNL4-3, do qual derivam-se todos os plasmídeos utilizados no
presente trabalho. O pNL4-3KFS é um pNL4-3 defectivo para o gene do envelope. O pIIINL4-3
é um vetor de expressão do envelope da cepa viral NL4-3. O pNL(AD8)env é um vetor de
expressão do envelope da cepa viral AD8 (que possui tropismo por CCR5) num backbone de
pNL4-3.
O processo de eluição dos plasmídeos foi realizado utilizando-se um
método aprimorado baseando-se no Kit de Extração de DNA do HIV em sangue – Kit
GFX
TM
(Qiagen, Alemanha). Resumidamente, o círculo de identificação da amostra no
papel filtro foi cortado utilizando-se uma lâmina estéril (bisturi) e colocado num
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microtubo de 1,5 mL. Em seguida, 500 µL da solução de extração foram adicionados
ao microtubo e o disco de papel contendo o plasmídeo foi macerado. A mistura foi
incubada a temperatura ambiente por 5 minutos. Todo o conteúdo líquido do microtubo
foi transferido para uma coluna GFX (os resíduos do papel filtro macerado foram
descartados) e centrifugado a 8000 rpm por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e
500 µL da solução de extração foram adicionados à coluna que foi, novamente,
centrifugada a 8000 rpm por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e a coluna
reposicionada em um novo tubo coletor. Quinhentos microlitros da solução de lavagem
foram adicionados à coluna. Esta foi centrifugada em velocidade máxima
(aproximadamente 12000-16000 rpm) por 3 minutos. Finalmente, 50 µL do tampão de
eluição (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), previamente aquecido a 70
o
C, foram
adicionados no centro da coluna posicionada num novo microtubo de 1,5 mL. A
solução foi incubada à temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugada a 8000 rpm
por 1 minuto. Os plasmídeos eluídos foram quantificados e armazenados a -20
o
C.
3.2. Produção de Bactéria Eletrocompetente
Após o procedimento citado acima, o sobrenadante (contendo cada
plasmídeo) foi utilizado para transformar uma bactéria competente. Para isso, células
competentes da cepa de Escherichia coli DH10B, gentilmente cedida pelo Laboratório
Alerta (uma ramificação do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica-LEMC, da
Universidade Federal de São Paulo-UNIFESP), foram plaqueadas em meio ágar Luria
Bertani (LB) (Invitrogen, EUA) sem antibiótico e incubadas em estufa a 37º C overnight
(cerca de 12-16 horas). No dia seguinte, algumas colônias foram isoladas para
replicação em 100-200 mL de caldo TSB (Trypticase Soy Broth, Merck, Alemanha) sob
agitação moderada (200 rpm) por aproximadamente 3 horas a 37º C. O crescimento
bacteriano foi monitorado pela quantificação em espectrofotômetro (a 600 nm). Em
seguida, o caldo foi transferido para tubos de fundo cônico de 50 mL e centrifugados a
6000 rpm por 15 minutos a 4º C. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado
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40
ressuspenso e lavado em 40, 20 e 5 mL, respectivamente, de H
2
O deionizada
ultrapurificada estéril a 4º C. A lavagem com 5 mL de H
2
O estéril a 4º C foi repetida e
alíquotas de 1 mL do sobrenadante foram transferidas para 5 microtubos de 1,5 mL
que foram centrifugados em condições idênticas às acima mencionadas. Os
sobrenadantes dos 5 tubos foram removidos e, ao volume do precipitado total (pellet)
formado foi adicionado a mesma quantidade de glicerol 70%. Quarenta microlitros
foram distribuídos em microtubos de 0,2 mL e armazenados a - 80º C.
3.3. Transformação Bacteriana por Eletroporação
Ao microtubo contendo as bactérias eletrocompetentes, previamente
descongeladas em gelo, foram adicionados 2-3 µL de DNA plasmidial. A solução
contendo as bactérias e cada um dos diferentes plasmídeos foi transferida para uma
cubeta de eletroporação (gap 0,2 cm) e eletroporada no MicroPulser electroporator
(BioRad, França) a 400 volts e 500 µF (Farads) de capacitância. Imediatamente, 400
µL de meio SOC (Invitrogen, EUA) foram acrescentados a uma cubeta que foi incubada
a 37º C por 1 hora. Em seguida, duas placas contendo ágar LB e ampicilina 50 µg/mL
(Sigma, Suécia) foram plaqueadas (aproximadamente metade do volume total da
cubeta em cada placa) e incubadas a 32-37
o
C com rotação moderada (200 rpm) por
18-24 horas. Posteriormente, cerca de cinco colônias de cada placa foram isoladas
para replicação em 100 mL de caldo TSB (Merck, Alemanha) ou LB contendo
ampicilina 50 µg/mL (Sigma, Suécia). As garrafas de cultura bacteriana foram
incubadas em um agitador magnético a 37º C com rotação moderada
(aproximadamente 200 rpm) por 18-24 horas. Após a verificação do crescimento
bacteriano no caldo pela análise da turbidez do meio, uma alíquota de 1 mL foi retirada
para a realização de uma PCR confirmatória da transformação. Duas alíquotas de 850
µL de cada garrafa foram misturadas a 150 µL de glicerol para criopreservação a - 80 º
C.
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3.4. PCR para Verificação da Transformação Bacteriana
Alíquotas de 1 mL de cada transformante foram centrifugadas por 15
minutos a 4
o
C e 6000 rpm. O sobrenadante foi descartado e o precipitado formado foi
ressuspenso em 50 µL de água DEPC (água livre de RNAse, tratada com
Dietilpirocarbonato). A mistura foi aquecida em termobloco a 100
o
C por 10 minutos
para lise bacteriana. Cinco microlitros do lisado foram utilizados como amostra para a
PCR confirmatória da transformação.
Para o plasmídeo pNL4-3KFS, defectivo para o gene do envelope do
HIV-1, um fragmento de 516 pb, correspondendo ao gene da integrase, foi amplificado
numa reação constituída por 0,5 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen, EUA), 4 mM
de dNTPs, 2,5 mM de MgCl
2
, 5 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl e 0,4 µM de cada um
dos primers B06 e B14 (Tabela 1).
Tabela 1. Primers utilizados na reação de amplificação confirmatória da transformação
do plasmídeo pNL4-3KFS
Primers Orientação Posição (HXB2) Seqüência
B06 Forward 1839 - 1863 5´- aaa tga aca agt aga taa att agt - 3´
B14 Reverse 3534 - 3558 5´- taa gat gtt cag ctt gat ctc - 3´
As condições de termociclagem foram as seguintes: após o
aquecimento inicial por 7 minutos a 94
o
C, seguiram-se 35 ciclos consistindo de
denaturação a 94
o
C por 30 segundos, anelamento a 55
o
C por 30 segundos e extensão
a 72
o
C por 1 minuto. Ao término dos 35 ciclos foi implementada uma etapa de
extensão final de 72
o
C por 7 minutos. O produto amplificado foi submetido à
eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 0,5 X (Tris-Borato-EDTA,
Invitrogen, EUA), corado com o corante intercalante GelRed™ 10000 X em água
(Biotium, Alemanha). A corrida eletroforética foi realizada em 45 minutos a 100 volts e
100 miliAmperes. Posteriormente, o gel foi visualizado em luz ultravioleta e as imagens
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foram fotografadas e capturas pelo Geldoc-it TS Imaging Systems BioImaging (UVP,
EUA).
Para os plasmídeos pIIINL4-3env e pNL(AD8)env, que carregam o
gene do envelope do HIV-1, um fragmento de 506 pb, correspondendo ao gene da
glicoproteína transmembrana do envelope viral (gp41), foi amplificado numa reação
constituída por 0,25 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen, EUA), 2,5 mM de dNTPs,
2,5 mM de MgCl
2
, 1,4x do 10 x buffer (Invitrogen, EUA) e 0,5 µM de cada um dos
primers externos gp41 Outer 1 e gp41 Outer 2 (Tabela 2).
Tabela 2. Primers utilizados na primeira etapa de amplificação confirmatória da
transformação dos plasmídeos pIIINL4-3env e pNL(AD8)env
Primers Orientação Posição (HXB2) Seqüência
gp41 Outer 1
Forward 7691 – 7720 5’ – aaa aat tga acc act agg agt agc acc cac – 3’
gp41 Outer 2
Reverse 8347 – 8374 5’ – tta ggc agg gat act cac ctt tgt cgt t – 3’
As condições de termociclagem foram as seguintes: após o
aquecimento inicial por 5 minutos a 94
o
C, seguiram-se 35 ciclos consistindo de
denaturação a 94
o
C por 30 segundos, anelamento a 55
o
C por 30 segundos e extensão
a 72
o
C por 45 segundos. Ao término dos 35 ciclos foi implementada uma etapa de
extensão final de 72
o
C por 5 minutos. Na segunda etapa, mantendo-se a mesma
termociclagem, foram transferidos 5 µL do produto da primeira reação para microtubos
com uma solução idêntica a acima descrita, mas adicionando-se desta vez 0,4 µM de
cada um dos primers internos gp41 Inner 1 e gp41 Inner 2 (Tabela 3).
Tabela 3. Primers utilizados na segunda etapa de amplificação confirmatória da
transformação dos plasmídeos pIIINL4-3env e pNL(AD8)env
Primers
Orientação Posição (HXB2) Seqüência
gp41 Inner-1
Foward 7789 – 7816 5’- tct tag gag cag cag gaa gca cta tgg g – 3’
gp41 Outer 2
Reverse 8265 – 8294 5’- tcc tac tat cat tat gaa tat ttt tat ata – 3
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3.5. Purificação dos Plasmídeos
Os transformantes positivos na PCR confirmatória da transformação
foram purificados utilizando-se o QIAfilter Plasmid Midi-Kit (Qiagen, Alemanha), de
acordo com as instruções do fabricante. Nos primeiros experimentos de transformação
realizados, os meios para cultivo bacteriano utilizados foram adquiridos “pré-prontos”.
Isto significa que os meios já continham antibiótico (ampicilina), IPTG (isopropiltio-β-
galactosídeo) e X-GAL (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo). Ademais, o volume
de caldo utilizado variou de 20-50 mL. Como a eficiência de recuperação de DNA
plasmidial foi baixa, estes meios foram substituídos por TSB ou LB preparado in house
no qual ampicilina (50 µg/mL), IPTG (20 µg/mL) e X-GAL (40 µg/mL) foram adicionados
somente no momento da utilização e não passaram por qualquer etapa de
aquecimento, o que poderia levar a degradação. Além disso, o volume da cultura foi
ajustado para 100-200 mL e o volume dos tampões utilizados na purificação do DNA
plasmidial foi dobrado (de 4 mL para 8 mL). Em seguida, os plasmídeos purificados
foram quantificados no GeneQuantpro Amersham Pharmacia (Biotech AB, Inglaterra).
3.6. Quantificação do DNA Plasmidial
Alíquotas de 5 µL de cada plasmídeo foram diluídas em 100 µL de
água DPEC. Em seguida, a absorbância foi medida em 260 nm de comprimento de
onda em espectrofotômetro (GeneQuantpro, Amersham Pharmacia, Inglaterra).
Segundo (Sambrook et al., 1989) a absorbância igual a 1, contém uma concentração
de 50 µg/mL de DNA dupla fita, 40 µg/mL de DNA fita simples e ~ 20 µg/mL de
oligonucleotídeos fita simples. Também foi medida a absorbância em 280 nm de
comprimento de onda para verificar a presença de proteínas e calcular a pureza do
DNA. A razão entre as leituras DO
260
/DO
280
permite uma estimativa da pureza do DNA,
que deve apresentar valores entre 1,8 e 2,0. A razão abaixo de 1,6 indica grande
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quantidade de contaminantes e proteínas e, na sua ocorrência, uma nova alíquota do
caldo contendo transformantes foi purificada.
3.7. Transfecção Celular
Linhagens Celulares Aderentes (HeLa ou HEK-293T) foram
transientemente transfectadas utilizando-se o Effectene Transfection Reagent (Qiagen,
Alemanha). Resumidamente, um dia antes da transfecção, 5x10
5
células/mL foram
semeadas em placas de cultura de 60 mm em 5 mL de meio DMEM (Gibco, EUA),
contendo 10 % soro fetal bovino (Gibco, EUA), inativado a 60
o
C por um hora e
contendo 1% de antibiótico (penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 µg/mL) (Gibco,
EUA). As placas foram incubadas a 37
o
C em atmosfera de 5 % de CO
2
. No dia da
transfecção, 1 µg do DNA eluído em TE (pH 7-8; concentração mínima de DNA:
0,1µg/mL) foi diluído com o tampão EC (tampão de condensação) para um volume final
de 150 µL. Oito microlitros de Enhancer foram adicionados a esta solução que foi
incubada a temperatura ambiente (15-25
o
C) por 2-5 minutos. Em seguida, 25 µL do
reagente Effectene foram adicionados à mistura DNA/Enhancer. As amostras foram
incubadas por 5-10 minutos a temperatura ambiente (15-25
o
C) para permitir a
formação dos complexos de transfecção. Enquanto ocorria a formação dos complexos,
o meio de crescimento da placa contendo as células a serem transfectadas foi
removido e as células foram lavadas com 4 mL de PBS 1 X (Gibco, EUA). Em seguida,
foram adicionados 4 mL de meio fresco (contendo soro e antibiótico) às células. Ao
microtubo contendo os complexos de transfecção foi adicionado 1 mL de meio de
crescimento completo. A solução foi homogeneizada suavemente e, imediatamente,
adicionada à placa de cultura. Esta foi incubada a 37
o
C em atmosfera de 5 % de CO
2
.
Após 48-72h, alíquotas do sobrenadante foram coletadas para teste de verificação da
transfecção.
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As células foram transfectadas com o plasmídeo genômico do HIV-1
(pNL4-3-KFS) e um dos vetores de expressão do envelope viral. Quando os
pseudotipos foram montados a partir do vetor de expressão pIIINL4-3env, os vírus
foram denominados X4. Quando os pseudotipos foram montados a partir do vetor de
expressão pNL(AD8)env, os vírus foram denominados R5.
Inicialmente, uma proporção de 5:1 de plasmídeo genômico (pNL4-
3KS) em relação plasmídeos do envelope (pIIINL4env ou pNL(AD8env) foi utilizada
para a transfecção de células Hela ou HEK-293T, de acordo com protocolos
previamente estabelecidos pelo Dr. Eric O. Freed do National Institute of Health-NIH
(Maryland, EUA). Essa proporção foi mantida utilizando-se o Effectene Transfection
Reagent (Qiagen, Alemanha). Este reagente requer um mínimo de 1µg de DNA total
para a transfecção, ou seja, 0,8 µg do pNL4-3KFS e 0,2 µg de um dos plasmídeos do
envelope.
As alíquotas de cada plasmídeo que apresentaram maior quantidade
de DNA foram utilizadas para a transfecção celular. Dessa forma, o volume a ser
utilizado de cada plasmídeo foi obtido de acordo com o cálculo abaixo:
pNL4-3KFS:153 µg/mL
153 µg_________1 mL x = 0,00523 mL
0,8 µg__________x
pIIINL4env: 430 µg/mL
430 µg_________1 mL x = 0,00046 mL
0,2 µg__________x
pNL(AD8)env: 241µg/mL
241 µg_________1 mL x = 0,00083 mL
0,2 µg__________x
x = 5,23 µL
x = 0,46 µL
x = 0,83 µL
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46
A transfecção celular foi eficiente a partir de modificações no
protocolo do Dr. Eric O. Freed. Além disso, quando alíquotas de plasmídeos com baixo
número de cópias foram utilizadas (< 40 µg/mL), o volume de material a ser diluído no
tampão de condensação (EC) era elevado, desbalanceando a reação de transfecção,
cujo volume final era de 150 µL. Isto é, pouco DNA condensado era fornecido às
etapas subseqüentes para a formação dos complexos de transfecção.
A partir de uma série de reações de otimização, variando-se 0,5 µg
de DNA, 4 µg de DNA foram utilizados para a transfecção, numa proporção de 3:1
pNL4-3KFS para plasmídeo de envelope. Ou seja, baseando-se nos cálculos acima,
foram transfectados 3 µg do plasmídeo genômico (19,60 µL) e 1 µg do pIIINL4env (2,33
µL) ou 1 µg do pNL(AD8)env (4,15 µL). Além disso, o volume de Enhancer e do
reagente Effectene para permitir a formação dos complexos de transfecção foi dobrado.
Após a transfecção, as partículas virais foram tratadas com 20
µg/mL de DNase I (Invitrogen, EUA) por 30 minutos a 37° C para remover qualquer
resíduo de DNA plasmidial antes da estocagem.
Usando este sistema de transfecção, os vírus produzidos pelas
células transfectadas foram submetidos a um ciclo único de replicação, produzindo
uma progênie viral que não apresenta proteínas do envelope.
3.8. Obtenção de Células Mononucleares de Sangue Periférico
(PBMCs)
As células mononucleares de sangue periférico ou Peripheral Blood
Mononuclear Cells foram obtidas a partir de bolsas de sangue (concentrado de
hemácias e leucócitos) de indivíduos doadores, cedidas pelo Banco de Sangue do
Hospital São Paulo (Escola Paulista de Medicina - UNIFESP). Foram utilizadas apenas
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47
as bolsas de sangue que apresentaram todos os testes de triagem negativos. Os testes
sorológicos de triagem realizados pelo banco de sangue foram: Anti-HBC, HBS-Ag,
Anti-HCV, Anti-HIV 1 e 2, Anti-HTLV 1 e 2, VDRL e Doença de Chagas.
3.9. Separação e Cultivo das PBMCs
Bolsas de sangue contendo antigoagulante CPDA (Citrato Fosfato
Dextrose) foram adquiridas somente no dia da separação celular, para evitar o risco de
hemólise. O sangue foi transferido para tubos de fundo cônico de 50 mL e diluído em
partes iguais com soro fisiológico 0,09 %. Para cada amostra foi preparado um tubo de
50 mL com 15 mL de Ficoll-paque (Amersham Pharmacia, Suécia). O sangue diluído
foi adicionado vagarosamente ao tubo contendo o Ficoll e centrifugado a 500 g, 18º C
por 20 minutos. Após a centrifugação, um gradiente de diferentes populações celulares
formou-se no tubo e a fina camada de células contendo as PBMCs, localizada entre o
plasma e o resíduo de Ficoll, foi coletada e transferida para outro tubo de fundo cônico.
O volume foi completado para 50 mL com soro fisiológico 0,09 % e o tubo centrifugado
a 500 g, 18 ºC por 10 minutos. Após uma segunda lavagem com soro fisiológico, as
células foram incubadas por 2 minutos com 3 mL de uma solução de lise de hemácias
baseada em cloreto de amônio 0,1 M. Em seguida, as células foram lavadas em meio
RPMI 1640 (Gibco, EUA) suplementado com 2 mM de L-glutamina e antibiótico. O
pellet ou precipitado de células foi, então, ressuspenso em 5 mL de meio RPMI 1640
completo (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino (SFB) e
1% de antibiótico). As células foram contadas em câmara de Neubauer utilizando-se o
corante Trypan Blue 0,04% (Invitrogen, EUA) para análise de viabilidade celular. Foram
utilizadas PBMCs com viabilidade superior à 95%. As células foram imediatamente
colocadas em culturas com agentes mitogênicos ou foram armazenadas a -80
o
C em
meio de congelamento específico, consistindo de RPMI 1640, 10% de soro fetal bovino
e 20% de DMSO (Dimetilsulfóxido) (Sigma, Suécia).
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48
3.10. Quantificação da Produção de Partículas Virais Pseudotipo
A determinação do título viral por diluição limite requer a inoculação
de múltiplas culturas com diferentes diluições do vírus, para obter a estimativa da
quantidade de vírus capaz de infectar 50 % das culturas (Cell Culture Infectious Dose).
Esta quantidade de vírus é conhecida como 50 % da dose infecciosa de uma cultura,
ou CCID
50
. O título viral determinado desta maneira pode ser expresso em CCID
50
/mL.
A quantificação da produção viral foi medida através da reação de PCR direcionada ao
gene pol do HIV-1. Diluições seriadas do sobrenadante contendo as partículas virais
pseudotipo foram utilizadas para infectar um número definido de células. O CCID
50
foi
calculado seguindo método descrito Reed & Muench, 1938. O resultado obtido foi
utilizado para o cálculo da multiplicidade de infecção (multiplicity of infection, m.o.i.) de
0,02.
O CCID
50
foi determinado para cada estoque de pseudotipo viral.
Inicialmente, as PBMCs foram contadas em câmara de Neubauer e o estoque viral foi
diluído em meio RPMI 1640 (fator de diluição = 10). Cada diluição viral foi utilizada para
infectar 10
6
células/mL. Para a infecção foi utilizada uma centrifugação de 2000 x g, a
20 º C por 120 minutos. Neste passo ocorre a infecção das células por spin inoculation,
protocolo este que aumenta muito a eficiência de infecção viral, sem contanto causar
prejuízos a este tipo celular. Após 2 horas de centrifugação, o sobrenadante foi
descartado. O meio RPMI 1640 (Gibco, EUA) contendo 10 % de soro fetal bovino e 1 %
de antibiótico (penicilina 100 U/mL e estreptomicina 100 µg/mL) foi acrescentado ao
precipitado de células infectadas. As células foram homogeneizadas e distribuídas em
placas de cultura.
Uma placa para cada pseudotipo viral foi processada.
Classicamente, o CCID
50
é revelado pela visualização do efeito citopático resultante da
infecção viral. Uma vez que a infecção celular com os pseudotipos virais gerados é de
curta duração e não resulta em citopaticidade visível, o CCID
50
foi revelado por PCR.
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49
Para isso, as placas acima foram incubadas em estufa a 37º C e 5 %CO
2
, durante
aproximadamente 3 dias. Em seguida, a titulação viral foi revelada utilizando uma
Nested-PCR para o gene pol do HIV-1, conforme descrito no item 3.5. O CCID
50
foi
calculado seguindo método descrito em Reed and Muench 1938. Ferramentas de
análises de dados do pacote estatístico Excel do Microsoft Office foram utilizadas para
os cálculos de previsão do CCID
50
de cada pseudotipo viral.
Inicialmente, os pseudotipos infectaram 100 % das células até a
diluição viral (10
-4
). Por este motivo, uma nova placa de titulação contendo diluições
virais até 10
-6
foi realizada. Na tabela 4 estão apresentados os valores de CCID
50
para
cada um dos pseudotipos virais:
Tabela 4. Titulação dos pseudotipos virais
Pseudotipo viral
CCID
50
/mL
pNL4-3KFS+pIIINL-4env (X4)
143.336,05
pNL4-3KFS+pNL(AD8)env (R5)
60.599,99
3.11. Cálculo da Multiplicidade de Infecção (m.o.i.)
Para a realização dos experimentos de infecção viral, foram
utilizados m.o.i. de 0,02, baseando-se em dados científicos previamente analisados
(Larder et al., 1990; Chelucci et al., 1995; Paskaleva et al., 2006; Zeng et al., 2006; Han
et al., 2008; Krowicka et al., 2008). Assim, o volume de partículas virais usado para
cada infecção foi calculado da seguinte forma:
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50
Cálculo do CCID
50
/mL (volume de partículas):
pIIINL4env: CCID
50
= 143.336,05/mL
pNL(AD8)env: CCID
50
= 60.599,99/mL
Quantidade de vírus
m.o.i. = ________________________
Nº células
Quantidade de vírus (x)
0,02 = ____________________________________
→
x = 20.000 CCID
50
/mL
10
6
1 mL--------------- 143.336,05 CCID
50
1mL---------------60.599,99 CCID
50
/mL
X --------------20.000 CCID
50
X ---------------20.000 CCID
50
X (pIIINL4env) = 0,139 mL = 139µL X (pAD8env) = 0,330 mL = 330µL
3.12. Adição de Mitógenos e Infecção Viral
As PBMCs foram ativadas com 1 µg/mL de Fitohemaglutinina
(Gibco, EUA) e mantidas com 20 U/mL de Interleucina-2 (IL-2) (Sigma, Suécia) a 37
o
C
com atmosfera de 5 % de CO
2
por 72 h. As PBMCS também receberam os estímulos
acima descritos simultaneamente à infecção viral.
A infecção foi realizada mantendo as células em cultura com os
pseudotipos virais por 2 horas em meio RPMI 1640 (Gibco, EUA) acrescido de 10% de
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Soro Fetal Bovino inativado, 2 mM de L-glutamina (Gibco, EUA), 100 U/mL penicilina e
100 mg/mL estreptomicina (Gibco, EUA). Após esse período foram executadas três
lavagens com meio RPMI 1640 para retirada de vírus livres. Em seguida, as células
foram incubadas em RPMI 1640 completo em estufa a 37
o
C com atmosfera de 5 % de
CO
2
.
3.13. Controle de Contaminação das Culturas Celulares
As garrafas e placas de culturas foram monitoradas diariamente
quanto à contaminação com agentes microbianos tais como bactérias, fungos
filamentosos e leveduras em microscópio óptico de luz invertida (Nikon-TMS, Japão).
Além disso, métodos moleculares foram utilizados para a detecção
de contaminantes que são dificilmente identificados por microscopia, como
micoplasmas e outras bactérias. Alíquotas de cada condição de cultura foram coletas, o
ácido nucléico foi extraído utilizando-se o QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen,
Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante.
Para a amplificação de um fragmento de 512 pb, correspondendo a
uma região altamente conservada do rRNA de micoplasmas, foram usados 0,4 µM de
cada um dos primers GP01 5’ ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA 3’ e MGSO 5’
TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC 3’ numa reação composta por 0.5 U de Taq
DNA Polymerase (Invitrogen, EUA), 4 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl
2
, 1 x buffer 10 x
(Invitrogen, EUA). As condições de termociclagem foram as seguintes: após o
aquecimento inicial por 5 minutos a 94
o
C, seguiram-se 35 ciclos consistindo de
denaturação a 94
o
C por 30 segundos, anelamento a 54
o
C por 30 segundos e extensão
a 72
o
C por 45 segundos.
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52
Uma Nested-PCR para a amplificação de um fragmento de 287 pb
do rRNA 16S de bactéria foi gerado através da utilização dos seguintes primers
universais (Tabela 5).
Tabela 5. Primers utilizados na reação de amplificação para controle de contaminação
bacteriana
Uma solução de 45 µL de reativos foi preparada com 0,5 U de Taq
DNA Polymerase (Invitrogen, EUA), 4 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl
2
, 1 x buffer 10 x
(Invitrogen, EUA) e 0,6 µM de cada um dos primers citados. Cinco microlitros do DNA
extraído do sobrenadante das culturas ou do precipitado celular, formado após a
centrifugação das células, foram adicionados à solução.
As condições de termociclagem (idênticas para as duas etapas da
amplificação) foram as seguintes: 5 minutos a 94
o
C, seguidos por 30 ciclos consistindo
de denaturação a 94
o
C por 1 minuto, anelamento a 55
o
C por 1 minuto e extensão a
72
o
C por 1 minuto. Ao término dos 35 ciclos, foi implementada uma etapa de extensão
final de 72
o
C por 5 minutos. Na segunda etapa, foram transferidos 2 µL do produto da
primeira reação para tubos com uma solução idêntica à descrita acima, mas
adicionando-se desta vez 0,6 µM de cada um dos primers internos.
Primers
Orientação Etapa de
amplificação
Seqüência
UNI_OL
Foward Externo
1 5’-gtg tag cgg tga aat gcg-3’
UNI_OR
Reverso Externo
1 5’-acg ggc ggt gtg tac aa-3’
UNI_IL
Forward Interno
2 5’-ggt gga gca tgt ggt tta-3’
UNI_IR
Reverso Interno
2 5’-cca ttg tag cac gtg tgt-3’
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53
Para cada uma das reações de amplificação supracitadas foram
utilizadas amostras controles, gentilmente cedidas pelo LEMC. Particularmente, foram
utilizadas as cepas de Staphylococcus aureus (número de catálago 12228 no American
Type Culture Collection-ATCC) como controle positivo para a Nested-PCR bacteriana e
a cepa de Mycoplasma fermentans (ATCC 15474) como controle positivo para a
detecção de micoplasmas nas culturas.
3.14. Condições de Infecção e Cultura
As diferentes condições experimentais utilizadas neste estudo
basearam-se no tropismo celular específico para cada pseudotipo viral e no status de
ativação das células alvo para a infecção pelo HIV-1 (tabela 05). As partículas virais
pseudotipadas com o vetor de expressão pIIINL-4env apresentam tropismo por células
que expressam o CXCR4 em sua superfície, como os linfócitos TCD4
+
, e foram
chamadas de X4. As partículas virais pseudotipadas com o vetor de expressão
pNL(AD8)env apresentam tropismo por células que expressam o CCR5 em sua
superfície, como macrófagos e monócitos, e foram chamadas de R5.
Tabela 6. Tropismo viral e status de ativação celular das diferentes condições
experimentais
Grupo
Tropismo do pseudotipo
viral Status de ativação celular
Identificação da
condição
CCR5 Células em ciclo R5-01
CCR5 Células em pré-ciclo R5-02
R5
CCR5 Células em repouso R5-03
CXCR4 Células em ciclo X4-01
CXCR4 Células em pré-ciclo X4-02
X4
CXCR4 Células em repouso X4-03
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54
Três diferentes condições de ativação celular foram oferecidas para
cada grupo (R5 e X4). Na condição 01, uma alíquota de 1,0 x 10
6
células/mL foi
ativada com fitohemaglutinina e mantida em cultura por 72 h. Após este período, as
células plenamente ativadas (em ciclo) foram infectadas com cada um dos pseudotipos
virais. As células permaneceram em contato com o vírus por duas horas, em seguida,
foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) e colocadas em meio
RPMI + 10 % SFB + IL-2 e mantidas em cultura por 48 horas.
Na condição 02, uma alíquota de 1,0 x 10
6
células/mL foi ativada
com fitohemaglutinina concomitantemente a infecção com cada pseudotipo viral
(células pré-ciclo). As células permaneceram em contato com o vírus por duas horas,
em seguida, foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) e colocadas
em meio RPMI + 10 % SFB + IL-2 e mantidas em cultura por 48 horas.
Na condição 03, uma alíquota de 1,0 x 10
6
células/mL, sem ativação
com uso de mitógenos, ou seja, em repouso (fora de ciclo), foi infectada com cada um
dos pseudotipos virais. As células permaneceram em contato com o vírus por duas
horas, em seguida foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) e
colocadas em meio RPMI + 10 % SFB + 2 mM IL-2 + 1 % antibiótico e mantidas em
cultura por 48 horas.
Após as 48 horas, o DNA proviral foi extraído para a realização da
PCR-End Point (PCR com Diluição Limitante) com objetivo de produzir clones. Estes
foram seqüenciados e analisados quanto à presença de processos mutacionais. A
viabilidade das PBMCs, avaliada por Trypan Blue (Invitrogen, EUA), no momento em
que foram colocadas em cultura por 72 horas na presença de fitohemaglutinina era de
97%. Após as 72 horas, antes da infecção com os pseudotipos, a viabilidade verificada
foi de 95%.
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55
Durante todos os experimentos envolvendo cultivo celular, nenhum
tipo de agente contaminante foi detectado por microscopia óptica (bactérias, fungos) ou
análise molecular (micoplasma, bactérias, fungos).
3.15. Extração do DNA do Sobrenadante de Cultura
O DNA proviral das células infectadas pelos pseudotipos virais foi
extraído utilizando-se o QIAamp DNA Blood Mini Kit, (Qiagen, EUA), de acordo com
instruções do fabricante. O DNA foi armazenado a - 20
o
C para utilização nas reações
de amplificação e sequenciamento genômico para análise da variabilidade genética
viral.
3.16. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), com Diluição Limite
Final (End-point-PCR)
Após a extração do DNA proviral, eluído em aproximadamente 50 µL
de tampão de eluição (TE), foi preparada uma diluição seriada de cada amostra em
água DEPC, com seis pontos e um fator de diluição de 1:10, isto é, até 10
-6
.
Resumidamente, para cada ponto da diluição o DNA foi usado como
molde numa reação de amplificação constituída por 0,5 U de Taq DNA Polymerase
(Invitrogen, EUA), 4 mM de dNTP, 2,5 mM de MgCl
2
, 1 x buffer 10 x (Invitrogen, EUA)
0,4 µM de cada dos seguintes primers (Tabela 7).
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Tabela 7. Primers utilizados na reação de Endpoint-PCR
Primers
Orientação Posição (HXB2) Seqüência
Pol-1 Foward externo 1839 – 1863 5´- ggg agt ggg ggg acc cgg cca taa - 3´
INBO-1R Reverse externo 3534 – 3558 5´- catt tgg cctt tgc ccc tgc ttc tgtt - 3´
Kozal – 1 (K1) Foward interno 2147 – 2166 5´- cag agc caa cag ccc cac ca - 3´
Kozal – 2 (K2) Reverse interno 3338 – 3309 5´- ttt ccc cac taa ctt ctg tat gtc ctt gac a - 3´
Na primeira etapa, 5 µL do DNA foram adicionados à solução acima
completando um volume final de 50 µL. A reação foi incubada em um termociclador
9700 (Perkin-Elmer, EUA) e aquecida por 7 minutos a 94
o
C. Após o aquecimento
seguiram-se 35 ciclos consistindo de: desnaturação a 94
o
C por 30 segundos,
anelamento a 55
o
C por 30 segundos e extensão a 72
o
C por 2 minutos. Ao término dos
35 ciclos foi implementada uma etapa de extensão final de 72
o
C por 7 minutos.
Na segunda etapa, mantendo-se as mesmas condições descritas
acima, 5 µL do produto amplificado na primeira reação foram transferidos para
microtubos com uma solução idêntica à primeira mas, adicionando-se desta vez 0,4 µM
de cada um dos primers internos Kozal-1 e Kozal-2.
3.17. Geração dos Clones Virais para Seqüenciamento
Após a PCR da diluição limitante, o último ponto positivo da diluição
foi usado como template para a amplificação de um fragmento de aproximadamente
1070 pb em outra Nested-PCR, utilizando-se os primers e as mesmas condições
descritas acima. Para tanto, 5 µL do DNA foi adicionado a 1 mL da mistura de reativos
e 50 µL foram distribuídos em 20 microtubos de 0,2 mL.
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57
De acordo com a distribuição de Poisson, para que a reação seja
válida, sua positividade não deve ultrapassar 25 %, ou seja, no máximo 5 amostras
positivas em 20 reações. Dessa forma, cada seqüência obtida pelo Endpoint-PCR
representa o produto de amplificação a partir de uma única molécula de DNA proviral.
Assim, se em uma reação houver 4 amostras positivas, todas são consideradas clones
de produto de PCR. Caso haja 6 amostras positivas é possível que em um ou mais
tubos a amplificação tenha sido iniciada a partir de mais de uma molécula de DNA e,
portanto, os produtos de PCR desta reação não serão considerados clones e serão
descartados. Os produtos amplificados foram detectados por eletroforese em gel de
agarose 1 %.
Para demonstrar que a diversidade genética encontrada nas
sequências não foi decorrente de erros inerentes à reação de amplificação por PCR, foi
utilizada uma DNA polimerase com atividade de correção de erros de incorporação de
nucleotídeos (Pfu High Fidelity, Invitrogen, EUA). Além disso, 10 clones gerados por
End-Point PCR a partir do clone molecular do HIV-1 pNL4-3-KFS foram seqüenciados
para a comprovação da ausência de incorporação de erros durante a PCR.
3.18. Purificação de Produto da PCR
Os produtos da PCR em duas etapas foram purificados por meio do
Charge Switch PCR Clean-Up kit (Invitrogen, EUA), de acordo com as especificações
do fabricante. Esse método purifica o produto de PCR removendo o excesso de sais,
primers, dNTPs e outros reagentes por meio de partículas magnéticas de carga positiva
que se ligam ao ácido nucléico negativamente carregado. Proteínas, reagentes e
outros contaminantes são eliminados nas lavagens. A carga dessas partículas é
neutralizada pelo tampão de eluição (pH 8,5) em que o acido nucléico é eluído.
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58
Resumidamente, a cada microtubo de amostra (contendo 50 µL do
produto da PCR) foram acrescentados 50 µL de tampão de purificação (N5), 10 µL de
Charge Switch Magnetic Beads (25 mg/mL). A solução foi incubada a temperatura
ambiente por 1 minuto. Os tubos foram colocados em estante magnética (Magna Rack,
Invitrogen, EUA) e o sobrenadante foi descartado. Em seguida, os tubos foram
retirados da estante magnética e foi acrescentado 150 µL do tampão de lavagem. As
amostras foram incubadas novamente na estante magnética nas mesmas condições
acima. O sobrenadante foi descartado e a lavagem foi repetida. Os tubos foram
removidos da estante magnética e 50 µL de tampão de eluição foram acrescentados.
Depois de homogeneizada, a solução foi incubada na estante magnética. O
sobrenadante contendo o produto purificado foi depositado em novo microtubo de 1,5
mL previamente identificado e armazenado a -20
o
C.
O produto da PCR purificado foi observado em corrida eletroforética
em gel de agarose a 1 %. As bandas do produto purificado foram comparadas ao
padrão de peso molecular Low DNA Mass Ladder (Invitrogen, EUA) para definir a
massa molecular dos clones a serem seqüenciados.
3.19. Sequenciamento da Região pol do DNA Proveniente de Culturas
Infectadas
Para cada condição de cultura infectada com os diferentes
pseudotipos virais, cerca de 15-20 clones foram gerados e seqüenciados. As amostras
foram amplificadas e, posteriormente, seqüenciadas utilizando-se o Big-Dye Terminator
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, EUA), de acordo com as instruções do
fabricante. A reação consistiu no seqüenciamento das regiões codificadoras das
proteínas protease e transcriptase reversa da região pol de HIV-1, alvos principais da
ação das drogas anti-retrovirais. Como o fragmento a ser seqüenciado era muito
extenso (aproximadamente 1070 pb) e o limiar ótimo de detecção da eletroforese
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capilar pelo analisador genético é de 500-650 pb, as seqüências foram obtidas
utilizando-se um conjunto de cinco primers (Tabela 8) que geram seqüências que se
sobrepõem (figura 5).
Tabela 8. Primers utilizados no sequenciamento de um fragmento do gene pol do HIV-
1
Primers
Orientação Posição (HXB2) Seqüência
Kozal – 1 (K1) Foward 2147 – 2166 5’- cag agc caa cag ccc cac ca - 3’
Frenkel-2 (F2) Reverse 3321 - 3301 5’- gta tgt cat tga cag tcc agc - 3’
DP-11 Reverse 2598 – 2572 5’ - cca ttc ctg gct tta att tta ctg gta -3’
Kozal – 2 (K2) Reverse 3338 – 3309 5’- ttt ccc cac taa ctt ctg tat gtc ctt gac a – 3’
RTINT Reverse 3018 – 3042 5’- cca gca ata ttc caa agt agc agt a - 3’
Figura 5. Alinhamento dos primers utilizados na reação de seqüenciamento.
Cada reação de seqüenciamento foi composta de 6 µL de produto
de PCR purificado (diluído ou não em água DEPC) e 13 µL de uma mistura preparada
para cada primer, contendo também tampão de seqüenciamento, dNTPs, ddNTPs,
enzima polimerase (AmpliTaq DNA polimerase), MgCl
2
. A placa preparada foi ciclada
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num termociclador 9700 (Applied Biosystems, EUA), em 25 ciclos de 10 segundos a
96° C, 5 segundos a 50° C e 4 minutos a 60° C.
Posteriormente, o produto da reação de seqüenciamento foi
purificado, numa reação que consiste na precipitação com etanol 70 % e denaturação
das fitas do DNA a 94° C, após aplicação de formami da Hidi (Invitrogen, EUA).
3.20. Detecção dos Fragmentos Seqüenciados
Após a reação de seqüenciamento, as amostras foram submetidas à
separação eletroforética capilar em um seqüenciador automático de DNA modelo ABI
3100 (Applied Byosistems, EUA), em gel de poliacrilamida Rapid Gel XL 6 % cartridge
(Amersham Phamarcia, EUA), em TBE 1 X durante 30 minutos, a 54º C e 1300 volts,
com o laser na potência de 25 %.
3.21. Análise, Compilação e Alinhamento das Sequências
Os dados foram coletados com o ABI PRISM DNA Sequencing
Analysis Software e a edição e análise prévia das seqüências foi realizada no
Sequencher Analysis Software, Version 4.5 (Gene Codes Corporation, EUA).
As seqüências de nucleotídeos obtidas foram visualizadas por meio
do alinhamento no programa Clustal W (Thompson et al., 1997; Chenna et al., 2003;
Larkin et al., 2007). As seqüências contendo inserções, deleções (indels), códons
indeterminados e/ou códons de terminação foram ajustadas manualmente no Se-Al
(Sandelin, 2005). Nos anexos I e II essas sequências podem ser vizualizadas. Nestes,
apenas as substituições foram incluídas. A sequência do pNL4-3 foi considerada como
referência (ou seqüência no tempo zero, isto é, sem mutaões) para a análise
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comparativa com as sequências de cada clone. Após o alinhamento, as mutações
foram identificadas, quantificadas e categorizadas.
3.22. Análise Estatística
Para avaliar a significância estatística do número de substituições
encontrado em cada condição de cultura (1,2,3) intra e inter-grupo (R5, X4), foi usada a
ferramenta ANOVA do pacote estatístico SPSS versão 15.0. As diferenças foram
consideradas significantes para um valor de P < 0,05.
A taxa mutacional por clone foi calculada de acordo com a seguinte
fórmula:
Uma vez que o ensaio foi de ciclo único de infecção, isto é, o
número de ciclos replicativos foi igual a um, a taxa mutacional por clone foi, então,
calculada da seguinte forma:
O cálculo da taxa mutacional por condição e por grupo foi o produto
da fórmula acima multiplicado pelo número de clones de cada condição ou grupo.
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3.23. Análise da Variabilidade Genética
3.23.1. Entropia
O estudo molecular da diversidade genética gerada in vitro foi,
primeiramente, realizado pela análise de entropia das seqüências. Um gráfico de
entropia pode dar uma idéia da quantidade de variabilidade num conjunto de
seqüências previamente alinhadas. A entropia é a medida da ausência de conteúdo
informacional em cada posição no alinhamento. O cálculo dessa variabilidade foi
realizado a partir da ferramenta Entropy (H(x)) Plot do pacote BioEdit Sequence
Alignment Editor versão 7.0.9.0. (Hall, 1999).
Mais especificamente, a entropia é a medida da ausência de
preditibilidade para uma posição no alinhamento. Se há X seqüências de DNA no
alinhamento (i.e. X = 40 seqüências) e na posição Y (i.e., Y = posição 5) há uma base
“A” em todas as seqüências, assumimos que há uma grande quantidade de informação
para a posição 5 e, se tivéssemos que adivinhar a base na posição 5 para outra
seqüência homóloga, estaríamos certos que seria a base “A”. A informação é máxima
para a posição 5 e a entropia é 0. Agora, se há 4 possibilidades para cada posição (A,
C, T, G) e cada uma delas ocorre na posição 5 com uma freqüência de 25 %
(probabilidade equivalente), então nosso conteúdo informacional (como bem
poderíamos predizer a posição para uma nova seqüência) foi reduzido a zero e a
entropia está na variabilidade máxima.
Matematicamente, as bases dessa teoria foram definidas por Claude
Shannon:
H(l) = -Sf(b,l)log(base 2)f(b,l) (medida em bits), onde,
H(l) = a incerteza ou entropia na posição 1;
b = representa um resíduo (fora da escolha permitida para a seqüência em questão);
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f(b,l) = a freqüência na qual o resíduo b é encontrado na posição 1.
O conteúdo informacional da posição 1 do alinhamento é definido
como uma diminuição na incerteza ou entropia nesta posição. Como o alinhamento
melhora a qualidade, portanto, a entropia em cada posição (especialmente em regiões
conservadas) deve diminuir.
Para facilitar a análise global da variabilidade entre as seqüências de
diferentes condições, uma análise gráfica de valores de entropia cumulativas foi
realizada. Para tanto, valores da entropia em cada posição foram somados
cumulativamente com cada posição subseqüente no alinhamento. Esta análise foi
realizada a partir da ferramenta de plotagem gráfica bidimensional para dados
numéricos Xmgrace versão 5.0.2 (Grace Development Team, EUA).
3.23.2. Inferência Filogenética
O método de construção das árvores genealógicas foi realizado
por máxima verossimilhança, que usa matrizes de probabilidade de mudança entre
nucleotídeos que explicitam modelos evolutivos para a inferência dos estados
ancestrais dos caracteres, a partir dos estados observados nos táxons apicais. As
reconstruções ótimas maximizam a verossimilhança para todos os caracteres ao
longo de uma topologia.
As matrizes de probabilidade de substituições foram escolhidas
de acordo com o modelo evolutivo indicado pelo teste de razão de verossimilhança
LRT (Likelihood Ratio Test).
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As estimativas dos parâmetros e de verossimilhança para 56
modelos aninhados foram feitas com o programa PAUP (Swofford, 2002). O teste
LRT foi executado pelo programa Modeltest versão 3.06b (Posada & Crandall, 1998;
Posada, 2003; Posada, 2006). A heterogeneidade das taxas de substituição entre os
sítios é incorporada através da distribuição gama. Da mesma forma, os valores das
matrizes de transição e a freqüência de bases também foram estimados de forma
interativa durante o processo de reconstrução. A reconstrução filogenética foi feita
em três etapas:
• Escolha do modelo de evolução de nucleotídeos e obtenção de uma árvore
inicial pelo método de distâncias de agrupamento de vizinhos (neighbor-joining);
• A seguir, os parâmetros da matriz foram ajustados e usados para a obtenção de
uma árvore por Maximum Likelihood;
• Por fim, foram feitos rearranjos (perturbações) na árvore através do método de
busca heurística com o algoritmo Stepwise Addition e o método Nearest
Neighbor Interchange (NNI) de rearranjo das árvores. As árvores com maior
verossimilhança que a inicial foram escolhidas.
Esse método de reconstrução filogenética é bastante apropriado
para ajuste de comprimentos de ramos, visto que em cada uma das três etapas é feito
um refinamento dos parâmetros da matriz de transição (modelo escolhido pelo
Modeltest).
4 - RESULTADOS
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4.1. Transformação Bacteriana
A princípio, a transformação foi realizada com linhagens bacterianas
de E. coli quimicamente competentes (DH5α), utilizando-se a metodologia de
transformação química com cloreto de cálcio (CaCl
2
), seguida por choque térmico.
Dada a baixa eficiência de transformação verificada, uma série de parâmetros foi
variada (tais como meios de cultura, concentração de antibiótico, temperatura de
incubação e linhagem bacteriana) com o intuito de otimizar a reação de transformação.
Por fim, optou-se pela eletroporação com a linhagem de E. coli DH10B. Ademais, em
algumas situações, quando os plasmídeos a serem transformados continham o gene
do envelope do HIV-1, a temperatura de incubação foi reduzida de 37
o
C (comumente
utilizada) para 32
o
C. Acredita-se que o envelope do HIV-1 possa ser altamente tóxico
para as sensíveis bactérias competentes, dificultando o seu crescimento. A redução da
temperatura minimizou esse fato (Figura 6).
Figura 6. Diferenças na eficiência da transformação bacteriana. A - Transformação por choque térmico utilizando a
linhagem de E. coli quimicamente competente DH5α. B - Eletroporação utilizando E. coli DH10B. O número de
transformantes gerados pela eletroporação foi notavelmente maior. Os diferentes vetores utilizados neste estudo
foram inicialmente expandidos por transformação bacteriana para a geração de um estoque de trabalho.
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4.2. Transfecção Celular
Alíquotas de transformantes do pNL4-3KFS apresentaram valores
entre 57-153 µg/mL de DNA plasmidial. O pIIINL4env foi o plasmídeo com maior valor
de DNA recuperado após a purificação, com diferentes alíquotas quantificadas variando
entre 82-430 µg/mL. O pNL(AD8)env apresentou valores de 69-241µg/mL.
4.3. Geração de Clones por End-Point PCR
O DNA proviral, obtido das células infectadas em cultura, foi
submetido à técnica de PCR com diluição limitante (End-Point PCR) para obtenção dos
clones representativos de cada uma das três condições de cultura dos grupos R5 e X4.
Para a obtenção de todos os clones do grupo R5, foi necessária a
realização de um total de 33 End-Point PCRs. Para a condição 01 (células em ciclo)
foram necessárias 09 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 09 reações,
em 07 PCRs obtivemos clones, num total de 18 clones. Para a condição 02 (células em
pré-ciclo) foram necessárias 11 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 11,
em 09 PCRs obtivemos clones, num total de 18. Para a condição 03, foram
necessárias 13 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 13, em 11
obtivemos clones, num total de 18.
Para a obtenção de todos os clones do grupo X4, foi necessária a
realização de um total de 29 PCRs End-Point. Para a condição 01 (células em ciclo)
foram necessárias 07 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 07 reações,
em 06 PCRs obtivemos clones, num total de 18. Para a condição 02 (células em pré-
ciclo) foram necessárias 08 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 08, em
07 PCRs obtivemos clones, num total de 18. Para a condição 03 (células em repouso),
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foram necessárias 14 reações de PCR para obtenção dos clones. Destas 14, em 11
obtivemos clones, num total de 18.
4.4. Comprovação da Homogeneidade do Inóculo Viral
Dez clones foram gerados por End-Point PCR a partir do plasmídeo
genômico pNL4-3-KFS. Esses clones foram seqüenciados e comparados com a
seqüência previamente conhecida da região pol do clone molecular infeccioso pNL4-3
(Número de acesso AF324493 no GeneBank), vetor do qual origina-se o pNL4-3-KFS.
Isso descartou a possibilidade de, na ocorrência de variabilidade, esta não ter sido
gerada por erros inerentes à reação de PCR, como por exemplo, da negligência da
atividade de correção de erros de incorporação de nucleotídeos da polimerase usada
no processo de amplificação. É importante ressaltar que, a enzima DNA polimerase,
usada nas reações de amplificação, foi criteriosamente escolhida justamente por
apresentar a referida atividade de correção, ao contrário das polimerases comumente
usadas em biologia molecular.
Além disso, mais dez clones foram gerados por End-Point PCR a
partir das partículas virais pseudotipo geradas pela transfecção celular. Esses clones
foram seqüenciados e comparados com a seqüência previamente conhecida do pNL4-
3-KFS. Isso garantiu a homogeneidade do inóculo viral e, assim, descartou a
possibilidade de, na ocorrência de variação genética, esta não ter sido gerada por
diferenças entre o inoculo viral e o produto da cultura.
O resultado da confirmação da seqüência genômica da região pol
das partículas virais pseudotipadas, com envelopes R5 e X4, mostrou que as
seqüências nucleotídicas geradas a partir do DNA desses diferentes estoques virais,
inóculos pré-infecção, confirmaram a seqüência descrita para o pNL4-3-KFS. Este
experimento comprovou, assim, a homogeneidade do inóculo viral, não demonstrando
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qualquer variação genética nos inóculos após a transfecção celular. Isto é, antes da
infecção das PBMCs os inóculos eram comprovadamente homogêneos.
4.4.1. Seqüenciamento dos Clones Gerados em Cultura
Somando-se todos os experimentos realizados no decorrer deste
estudo, incluindo os de comprovação da homogeneidade do inóculo viral, foram
gerados cerca de 142 clones por End-Point PCR. Quatorze clones nos ensaios iniciais
de padronização da End-Point PCR e Nested-PCR, 10 nos experimentos de
comprovação da homogeneidade do inóculo viral, 10 nos testes de variabilidade
intrínseca à PCR e 108 clones a partir de PBMCs infectadas por partículas virais
pseudotipadas com envelopes R5 ou X4.
Os cento e oito clones (54 para cada um dos pseudotipos) obtidos
na reação de End-Point PCR do gene pol do HIV-1 foram submetidos à reação de
seqüenciamento de DNA pelo método de Terminação em Cadeia (Sanger, 1977).
Para descartar a possibilidade de erros durante a reação de
seqüenciamento e, posteriormente, na edição, todos os clones foram seqüenciados bi-
direcionalmente por um conjunto de cinco primers que geram seqüências que se
sobrepõem. Além disso, para descartar a possibilidade de erros no processo de edição
das seqüências de nucleotídeos, as seqüências foram editadas e alinhadas
manualmente por no mínimo 03 pesquisadores em momentos distintos.
As seqüências de nucleotídeos de um fragmento de
aproximadamente 1.050 pb, correspondente a região pol do HIV-1 de cada um clones
(todas as condições), foram alinhadas e comparadas com a seqüência referência do
plasmídeo pNL4-3-KFS. Os resultados destes alinhamentos podem ser vistos nos
anexos I e II. Nos alinhamentos podemos observar os pontos onde há diferenças de
nucleotídeos entre os clones em relação ao pNL4-3-KFS.
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Após o alinhamento e análise minuciosa das seqüências, 06 clones
foram descartados do grupo R5, por apresentarem em suas seqüências regiões de
ambigüidade entre nucleotídeos, o que sugere ser um DNA proviral misto, não
proveniente de uma única seqüência alvo, portanto, não foram considerados clone.
Mais especificamente, foi descartado 01 clone dos 18 analisados da condição 01; 03
clones dos 18 analisados da condição 02; e 02 clones dos 18 analisados da condição
03.
Igualmente, após o alinhamento e análise minuciosa das
seqüências, 06 clones foram descartados do grupo X4, por apresentarem em suas
seqüências regiões de ambigüidade entre nucleotídeos, o que sugere ser um DNA
proviral misto, não proveniente de uma única seqüência alvo, portanto, não
considerados clones. Mais especificamente, foram descartados 02 clones dos 18
analisados para cada uma das 03 condições do grupo X4.
4.5. Identificação e Caracterização das Substituições Presentes nas
Seqüências
Após o seqüenciamento, edição e alinhamento das seqüências, os
clones de cada grupo e condição foram comparados com a seqüência do pNL4-3-KFS
para a identificação dos pontos onde ocorreram substituições de nucleotídeos. Em
seguida, foi caracterizado o tipo de substituições. Esta análise foi realizada
manualmente comparando clone a clone com a sequência referência. As tabelas
abaixo identificam as substituições, o contexto, as posições onde ocorreram e a taxa
mutacional nos clones de cada condição experimental. Também foram identificados os
eventos de substituições mais freqüentes. As possíveis relações para os eventos de
substituições são:
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Evento de Transição: Substituições entre as bases púricas: A-G ou G-A;
Evento de Transição: Substituições entre as bases pirimídicas: T-C ou C-T;
Evento de Transversão: Substituições entre as bases púricas e pirimídicas: G-T,
ou T-G, C-A ou A-C, C-G ou G-C, T-A ou A-T.
No grupo R5 encontramos 101 substituições e duas deleções nos 48
clones das três condições. Das substituições, 93,07% eram transições e 6,93%
transversões. Na condição 01 do grupo R5 encontramos 36 substituições e uma
deleção. Dessas substituições, 94,44% foram eventos de transição, sendo que, 36,11%
foram substituições de T para C e 30,56% de G para A. Por outro lado, apenas 5,56%
das substituições foram eventos de transversão, representadas pelas substituições de
A para T e de T para G (Tabela 9).
Tabela 9. Caracterização das substituições da condição 01 do grupo R5
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
R5 1.10 G→A TGC-TAC 210 2,86E-03
R5 1.10 T→C GTA-GCA 511
R5 1.10 T→C CTT-CCT 817
R5 1.11 C→T ACA-ATA 475 1,90E-03
R5 1.11 T→C ATT-ACT 865
R5 1.13 G→A TGA-TAA 323 1,90E-03
R5 1.13 C→T GCA-GTA 405
R5 1.14 T→C GTT-GCT 278 9,52E-04
R5 1.15 T→C TTA-TCA 237 1,90E-03
R5 1.15 GG→A GGGA-GAGA 729
R5 1.16 C→T TCT-TTT 77 1,90E-03
R5 1.16 A→G CAC-CGC 757
R5 1.18 GG→A GGAC-GAAC 213 3,81E-03
R5 1.18 T→C ATT-ACT 264
R5 1.18 G→A TGG-TAG 359
R5 1.18 A→T AAT-ATT 853
R5 1.2 GG→A GGAC-GAAC 213 1,90E-03
R5 1.2 T→C GTA-GCA 869
R5 1.3 C→T CCA-CTA 483 3,81E-03
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ContinuaçãoTabela 9.
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
R5 1.3 C→T CCA-CTA 855
R5 1.3 T→C GTA-GCA 869
R5 1.3 GG→A GGAT-GAAT 994
R5 1.4 A→G CAT-CGT 857 1,90E-03
R5 1.4 T→C ATG-ACG 862
R5 1.5 C→T TCA-TTA 450 9,52E-04
R5 1.6 T→G ATT-AGT 107 4,76E-03
R5 1.6 C→T TCC-TTC 308
R5 1.6 T→C GTA-GCA 511
R5 1.6 GG→A GGGA-GAGA 760
R5 1.6 G→A TGG-TAG 765
R5 1.7 A→G ACA-AGA 826 1,90E-03
R5 1.7 T→C ATG-ACG 1022
R5 1.8 T→C CTA-CCA 514 9,52E-04
R5 1.9 GG→A GGAC-GAAC 213 2,86E-03
R5 1.9 T→C TTT-TCT 536
R5 1.9 GG→A GGAT-GAAT 762
Na condição 02 do grupo R5 encontramos 29 substituições, sendo
93,10% transições e 6,90% transversões. Das transições, 31,03% foram substituições
de T para C; 27,59% de A para G; 24,14% de C para T e apenas 10,34% de G para A.
Já os eventos de transversão foram representados por duas substituições de T para A
(Tabela 10).
Tabela 10. Caracterização das substituições na condição 02 do grupo R5
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
R5 2.10 T→C ATC-ACC 213 2,86E-03
R5 2.10 A→G AAT-AGT 422
R5 2.10 C→T GCA-GTA 606
R5 2.14 A→G TAC-TGC 92 3,81E-03
R5 2.14 GG→A GGAA-GAAA 436
R5 2.14 C→T ACC-ATC 596
R5 2.14 T→C CTT-CCT 823
R5 2.15 T→C CTA-CCA 854 9,52E-04
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Continuação Tabela 10.
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
R5 2.18 C→T CCA-CTA 958 9,52E-04
R5 2.1 A→G AAA-AGA 408 3,81E-03
R5 2.1 C→T CCA-CTA 597
R5 2.1 T→C ATC-ACC 813
R5 2.1 T→C TTG-TCG 942
R5 2.2 A→G AAA-AGA 972 9,52E-04
R5 2.3 A→G GAA-GGA 579 2,86E-03
R5 2.3 G→A AGC-AAC 820
R5 2.3 C→T ACC-ATC 957
R5 2.5 T→C ATG-ACG 435 9,52E-04
R5 2.6 G→A AGG-AAG 170 9,52E-04
R5 2.7 A→G TAG-TGG 415 1,90E-03
R5 2.7 T→C ATG-ACG 435
R5 2.8 T→C ATG-ACG 435 6,67E-03
R5 2.8 T→C TTA-TCA 588
R5 2.8 C→T CCT-CTT 711
R5 2.8 A→G AAT-AGT 812
R5 2.8 C→T ACA-ATA 974
R5 2.8 A→G AAA-AGA 981
R5 2.8 T→A CTG-CAG 1050
R5 2.9 T→A CTA-CAA 854 9,52E-04
Por fim, na condição 03 do grupo R5, encontramos 36
substituições e uma deleção. Dessas substituições, 91,67% foram eventos de
transição, sendo que, 27,78% foram substituições de G para A; 27,78% de T para C;
22,22% de C para T e 13,89% de A para G. Enquanto que, 8,33% das substituições
foram eventos de transversão, sendo que destes, 5,56% foram substituições de T para
A e 2,78% de G para C (Tabela 11).
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Tabela 11. Caracterização das substituições da condição 03 do grupo R5
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
R5 3.14 GG→A GGAA-GAAA 157 2,86E-03
R5 3.14 C→T ACT-ATT 298
R5 3.14 G→A AGA-AAA 500
R5 3.15 C→T CCT-CTT 253 4,76E-03
R5 3.15 GG→A GGAA-GAAA 442
R5 3.15 T→C GTA-GCA 625
R5 3.15 C→T ACA-ATA 907
R5 3.15 GG→A GGAT-GAAT 995
R5 3.18 A→G AAT-AGT 620 9,52E-04
R5 3.10 T→C CTG-CCG 634 1,90E-03
R5 3.10 G→A AGC-AAC 780
R5 3.12 T→C CTC-CCC 40 5,71E-03
R5 3.12 A→G GAT-GGT 288
R5 3.12 G→A AGT-AAT 336
R5 3.12 T→C TTA-TCA 529
R5 3.12 C→T ACA-ATA 594
R5 3.12 C→T TCT-TTT 848
R5 3.13 T→C ATA-ACT 892 9,52E-04
R5 3.1 T→C CTG-CCG 464 1,90E-03
R5 3.1 A→G AAA-AGA 503
R5 3.2 A→G CAC-CGC 251 4,76E-03
R5 3.2 T→C TTC-TCC 578
R5 3.2 G→A AGA-AAA 614
R5 3.2 G→C TGA-TCA 923
R5 3.2 C→T ACC-ATC 952
R5 3.4 T→A TTC-TAC 308 9,52E-04
R5 3.5 G→A AGT-AAT 411 2,86E-03
R5 3.5 T→C ATA-ACT 738
R5 3.5 T→C ATC-ACC 851
R5 3.7 G→A GGT-GAT 166 2,86E-03
R5 3.7 C→T GCC-GTC 493
R5 3.7 A→G AAC-AGC 627
R5 3.8 T→A ATA-AAA 496 9,52E-04
R5 3.9 G→A TGC-TAC 211 2,86E-03
R5 3.9 T→C ATC-ACC 470
R5 3.9 C→T CCT-CTT 1014
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75
No grupo X4, encontramos 54 substituições e duas deleções nos
48 clones das três condições. Das substituições, 94,44% foram transições e 5,26%
transversões. Na condição 01 do grupo X4, encontramos 12 substituições. Todas as
substituições nesta condição foram eventos de transição, sendo que, 50% foram
substituições de G para A; 33,33% de T para C; 8,33% de A para G e 8,33% de C para
T (Tabela 12).
Tabela 12 - Caracterização das substituições da condição 01 do grupo X4
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
X4 1.3 GG→A
AGGA-
AGAA
252 1,90E-03
X4 1.3 T→C CTA-CCA 910
X4 1.10 T→C GTA-GCA 194 9,52E-04
X4 1.14 C→T ACA-ATA 636 9,52E-04
X4 1.5 A→G AAC-AGC 267 1,90E-03
X4 1.5 G→A AGC-AAC 413
X4 1.9 GG→A
AGGA-
AGAA 780 9,52E-04
X4 1.1 G→A TGC-TAC 219 1,90E-03
X4 1.1 T→C GTA-GCA 520
X4 1.2 T→C ATT-ACT 874 9,52E-04
X4 1.11 G→A TGA-TAA 332 9,52E-04
X4 1.13 G→A TGA-TAA 728 9,52E-04
Na condição 02 do grupo X4 encontramos 23 substituições, sendo
91,30% transições e 8,70% transversões. Das transições, 43,48% foram substituições
de G para A; 21,74% de C para T; 17,39% de A para G e 8,70% de T para C. Por outro
lado, as transversões foram representadas por 4,35% de A para T e 4,35% de C para
G (Tabela 13).
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
76
Tabela 13. Caracterização das substituições da condição 02 do grupo X4
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
X4 2.3 G→A AGA-AAA 398 1,90E-03
X4 2.3 G→A TGG-TAG 439
X4 2.11 G→A AGA-AAA 622 2,86E-03
X4 2.11 G→A AGA-AAA 912
X4 2.11 A→G AAA-AGA 1029
X4 2.5 C→T TCA-TTA 52 2,86E-03
X4 2.5 G→A AGA-AAA 401
X4 2.5 C→T GCA-GTA 414
X4 2.6 A→G AAA-AGA 184 2,86E-03
X4 2.6 T→C GTC-GCC 325
X4 2.6 G→A TGA-TAA 394
X4 2.12 A→G CAG-CGG 787 9,52E-04
X4 2.7 G→A TGG-TAG 287 1,90E-03
X4 2.7 A→T AAC-ATC 619
X4 2.9 C→T TCA-TTA 293 9,52E-04
X4 2.14 G→A AGA-AAA 508 9,52E-04
X4 2.15 C→G GCG-GGG 652 9,52E-04
X4 2.17 T→C ATA-ACT 234 4,76E-03
X4 2.17 G→A TGA-TAA 332
X4 2.17 C→T ACA-ATA 396
X4 2.17 A→G AAT-AGT 628
X4 2.17 C→T GCA-GTA 905
X4 2.18 GG→A TGGG-TGAG
650 9,52E-04
Por fim, na condição 03 do grupo X4, encontramos 19 substituições.
Dessas substituições, 94,74% foram eventos de transição, sendo que, 47,37% foram
substituições de G para A; 21,05% de A para G; 15,79% C para T e 10,53% de T para
C. Já os eventos de transversão foram representados por 5,26 % de substituições de T
para A (Tabela 14).
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
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Tabela 14 - Caracterização das substituições da condição 03 do grupo X4
Clone Substituição Contexto Posição Taxa mutacional
X4 3.1 G→A TGA-TAA 332 1,90E-03
X4 3.1 GG→A TGGA-TGAA 529
X4 3.3 C→T GCT-GTT 231 9,52E-04
X4 3.6 G→A AGA-AAA 821 1,90E-03
X4 3.6 G→A AGA-AAA 982
X4 3.16 G→C GGC-GCC 388 2,86E-03
X4 3.16 A→G TAA-TGA 416
X4 3.16 GG→A AGGG-AGAG
903
X4 3.12 G→A AGA-AAA 830 9,52E-04
X4 3.15 A→G AAG-AGG 448 9,52E-04
X4 3.5 G→A TGA-TAA 394 1,90E-03
X4 3.5 T→C GTT-GCT 614
X4 3.7 GG→A TGGA-TGAA 440 2,86E-03
X4 3.7 C→T TCC-TTC 605
X4 3.7 A→G AAA-AGA 973
X4 3.10 GG→A AGGA-AGAG
252 9,52E-04
X4 3.11 T→C ATG-ACG 196 2,86E-03
X4 3.11 C→T TCA-TTA 459
X4 3.11 A→G AAC-AGC 635
A consequência imediata da elevada taxa mutacional foi a geração
de diversas substituições nucleotídicas nas seqüências genômicas dos clones
analisados. As transições e transversões foram as substituições nucleotídicas mais
freqüentemente encontradas no grupo R5, com predomínio da primeira sobre a
segunda em todas as condições experimentais. Além disso, o acúmulo de transições
foi diretamente proporcional à distância genética, dada pelo modelo evolutivo de
Tamura-Nei, 1993 (figura 7).
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
78
Figura 7. Relação entre transições e transversões no grupo R5. As substituições nucleotídicas
de transição são mais freqüentes que as transversões, na análise par-a-par das seqüências
nucleotídicas de todas as condições do grupo R5. O acúmulo de transições foi diretamente
proporcional à distância genética, determinada pelo modelo evolutivo de Tamura-Nei, 1993
(TN93). Apenas as substituições foram inseridas nas análises.
Igualmente, as transições e transversões foram as substituições
nucleotídicas mais freqüentemente encontradas no grupo X4, com predomínio da
primeira sobre a segunda em todas as condições experimentais. Também, o acúmulo
de transições foi diretamente proporcional à distância genética, dada pelo modelo
evolutivo de Tamura-Nei, 1993 (figura 8).
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
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Figura 8. Relação entre transições e transversões no grupo X4. Assim como verificado no
grupo R5, as substituições nucleotídicas de transição são mais freqüentes que as transversões,
na análise par-a-par das seqüências nucleotídicas de todas as condições. O acúmulo de
transições foi diretamente proporcional à distância genética, determinada pelo modelo evolutivo
de Tamura-Nei, 1993 (TN93). Apenas as substituições foram inseridas nas análises.
4.6. Análise da Variabilidade Genética
4.6.1. Cálculo da Taxa Mutacional
A taxa mutacional foi calculada por clone, condição e grupo
baseando-se no número de substituições encontradas em cada clone e no tamanho do
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
80
fragmento gênico analisado. Para o cálculo da taxa mutacional por condição e grupo, o
número de clones também foi levado em consideração. Valores específicos das taxas
mutacionais para cada clone podem ser verificados nas tabelas 9-14.
A taxa mutacional da condição 01 do grupo R5 foi de 1,0 x 10
-03
. A
amplitude de variação foi de 4,76 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com clones apresentando 01 a 05
substituições. A taxa mutacional verificada na condição 02 do grupo R5 foi de 1,0 x10
-3
.
A amplitude de variação foi de 6,67 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com clones apresentando 01 a
07 substituições. A taxa mutacional verificada na condição 03 do grupo R5 foi de 1,0 x
10
-3
. A amplitude de variação foi de 5,71 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com clones apresentando
01 a 06 substituições. A taxa mutacional total do grupo R5 foi de 2,0 x 10
-3
.
A taxa mutacional verificada na condição 01 do grupo X4 foi de 1,0 x
10
-3
. A amplitude de variação foi de 1,90 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com clones apresentando
01 a 02 substituições. A taxa mutacional verificada na condição 02 do grupo X4 foi de
1,0 x 10
-3
. A amplitude de variação foi de 4,76 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com clones
apresentando 01 a 05 substituições. A taxa mutacional verificada na condição 03 do
grupo X4 foi de 1,0x10
-3
. A amplitude de variação foi de 2,86 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
com
clones desta condição apresentando 01 a 03 substituições. A taxa mutacional total do
grupo X4 foi de 1,07 x 10
-3
. Comparando-se os grupos, a taxa mutacional foi cerca de
duas vezes maior no grupo R5.
4.6.2. Relação Quantitativa entre o Tropismo Viral e Ativação Celular
Com o objetivo de verificar se o número médio de substituições
depende do grupo e da condição, foi ajustado o modelo de análise de variância
(ANOVA) com dois fatores fixos (grupo e condição). Todas as exposições exigidas pela
ANOVA foram previamente satisfeitas. Para a verificação da variação entre as
condições, foi usado o teste de igualdade de erros de variâncias de Levene e o teste de
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
81
normalidade de Kolmogorov-Smirnov. O número de substituições em cada grupo
apresentou distribuição normal. Os resultados do modelo ANOVA ajustado revelaram
que não há efeito de interação entre grupo e condição (P=0,869). Desta forma, notou-
se que as condições apresentaram o mesmo número médio de substituições (P=0,659)
(figura 9). Em outras palavras, quantitativamente não foi verificada diferença
estatística significativa entre o número médio de substituições por clone em cada uma
das condições intra grupo e o status de ativação das células.
Figura 9. Análise quantitativa da correlação entre o número de substituições em cada grupo e
o estado de ativação celular. O número médio de substituições por clone em cada uma das
condições (1-células em ciclo, 2-células em pré-ciclo, 3-células em repouso) tanto no grupo R5
quanto no X4 não variou de maneira significativa.
Todavia, quando as substituições foram analisadas por grupo, isto é,
a somatória das substituições de todas as condições do grupo R5 comparada com a
somatória das substituições de todas as condições do grupo X4, o grupo R5
apresentou um número médio de substituições maior que o grupo X4 (P=0,094; α=5%).
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
82
4.6.3. Entropia
Após os alinhamentos e análise par-a-par, foi realizada uma análise
baseando-se no cálculo da entropia de Shannon para a melhor identificação dos pontos
de diferenças genéticas ao longo das seqüências. A entropia foi calculada
isoladamente a partir do alinhamento das sequências dos clones de cada condição
conforme as figuras 10-11.
Todas as seqüências de nucleotídeos dos clones do grupo R5 foram
alinhadas e comparadas entre si. A entropia foi calculada isoladamente para cada
condição. Na figura 10, podem ser observadas as regiões nas quais ocorrem
substituições nucleotídicas com maior freqüência.
Na condição 01 do grupo R5 existem pontos em que as
substituições são comuns a quase todos os clones, como, por exemplo, entre as
posições 75 a 100 pb; 200 a 550 pb; 725 a 875 pb; e 975 a 1025 pb. Ao longo de todo
o fragmento analisado, a entropia foi de 0,225 bit para praticamente todos os resíduos,
no entanto, em alguns pontos a entropia foi extremamente alta, com algumas regiões
alcançando 0,35-0,45 bit de entropia (figura 10, superior).
Na condição 02 do grupo R5, entre as posições 75 a 225 pb, 400 a
450 pb e 575 a 625 pb, 700 a 712, 800 a 860 pb e 925 a 1000 pb as substituições
nucleotídicas são comuns entre os clones desta condição. A entropia flutuou entre
0,225 bit na maior parte dos resíduos, no entanto, em alguns pontos a entropia foi
extremamente alta, com algumas regiões alcançando 0,46-0,48 bit de entropia (figura
10, centro).
Na condição 03 do grupo R5, nota-se que os pontos comuns de
substituições nucleotídicas são mais raros e a variabilidade genética ocorre de maneira
não homogênea, dispersa ao longo das sequências (posições 25 a 50 pb, 150 a 650
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
83
pb, 725 a 1025 pb), sendo difícil caracterizar regiões onde as substituições são mais
freqüentes. Nesta condição a entropia foi de 0,225 bit para todos os pontos de variação
(figura 10, inferior).
Analisando os pontos de substituição nucleotídicas entre os clones
das três condições do grupo R5 juntas, observam-se regiões comuns em que as
substituições ocorrem em todas as condições, destacando as regiões entre 200 a 350
pb, 400 a 650 pb, 750 a 875 pb e 950 a 1025. Interessantemente, fica clara a influência
do status de ativação celular sobre a variabilidade genética viral. Esta ocorre de forma
mais dispersa ou desordenada nas partículas virais que infectaram células em repouso
(condição 03 do grupo R5). Por outro lado, na condição 01, em que as células
encontravam-se plenamente ativadas, isto é, em ciclo, a variabilidade ocorre de
maneira mais seletiva, em regiões bem determinadas. Isto é, existem regiões do
genoma viral mais sujeitas à variação. Enquanto na condição 02, em que as células
estavam em pré-ciclo, verificamos um grau intermediário de seletividade entre as
condições 01 e 03 do grupo R5 (figura 10).
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
84
Figura 10. Variabilidade genética no grupo R5. A análise da diversidade das três condições
experimentais do grupo R5 foi calculada pela entropia de Shannon e representa o grau de
variação por sítio ao longo do alinhamento. A distância genética representa o tamanho do
fragmento analisado (1050 pb).
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Na condição 01 do grupo X4 existem pontos em que as
substituições são comuns a quase todos os clones, como, por exemplo, entre as
posições 200 a 350 pb; 725 a 900 pb. A entropia para todos os pontos de variabilidade
foi de 0,23 bit (figura 11, superior).
Na condição 02 do grupo X4, percebemos que entre as posições
175 a 510 pb, 600 a 660 pb e 900 a 925 as substituições nucleotídicas são comuns
entre os clones desta condição. A entropia foi 0,225 bit em todos os resíduos variáveis
(figura 11, centro).
Na condição 03 do grupo X4, notamos que os pontos comuns de
substituições nucleotídicas estão entre as posições 190 a 260 pb, 475 a 650 pb, 825 a
975 pb. Nesta condição, a entropia foi de 0,23 bit para todos os pontos de variação
(figura 11, inferior).
Analisando os pontos de substituição nucleotídicas entre os clones
das três condições do grupo X4 juntas, observamos regiões comuns em que as
substituições ocorrem em todas as condições, destacando as regiões entre 175 a 325
pb, 375 a 525 pb, 600 a 650 pb e 775 a 975. No grupo X4, a influência do status de
ativação celular sobre a variabilidade genética viral não é tão conspícua quanto no
grupo R5, ocorrendo numa intensidade menor e de maneira mais dispersa ou menos
seletiva (figura 11). Todavia, assim como no grupo R5, as substituições ocorrem de
maneira mais seletiva quando o vírus infecta células plenamente ativadas (condição
01).
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86
Figura 11. Variabilidade genética no grupo X4. A análise da diversidade das três condições
experimentais do grupo X4 foi calculada pela entropia de Shannon e representa o grau de variação por
sítio ao longo do alinhamento. A distância genética representa o tamanho do fragmento analisado.
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
87
Além disso, com o objetivo de verificar se as regiões mais sujeitas à
variação correspondem a sítios importantes das proteínas codificadas (protease e
transcriptase reversa), a partir da informação genética contida nas sequências
estudadas, a variabilidade genética foi também analisada em termos de estrutura
protéica. Para tal, as sequências dos clones foram fragmentadas nos resíduos de
nucleotídeos, diretamente correspondentes aos resíduos de aminoácidos de cada
domínio protéico.
É importante ressaltar que as sequências de nucleotídeos estudadas
representam um fragmento de 1050 pb do gene pol do HIV-1. Este fragmento é
representado por uma porção inicial de 87 pb relativo a uma sobreposição entre os
genes pol e gag. Em seguida, localiza-se a porção codificadora da protease viral com
297 pb e uma parte da transcriptase reversa com 788 pb. Estas regiões foram também
estratificadas em domínios. Nesse sentido, a protease apresenta β-sheets em suas
extremidades e, ao centro, vários resíduos de flaps. Aqui, a porção da transcriptase
reversa apresenta-se em grandes domínios bem definidos, incluindo os fingers, palms
e uma parte do domínio thumbs (figura 12).
Figura 12. Representação esquemática dos resíduos analisados. O impacto da variabilidade
genética do HIV-1 no gene pol foi exportado para as proteínas codificadas pela região gênica
de 1050pb estudada. Os pontos vermelhos indicam as posições onde ocorreram variação no
grupo R5 e os pontos pretos no grupo X4.
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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88
No grupo R5, as regiões de maior variabilidade foram: de 200 a
350 pb, 400 a 650 pb, 750 a 875 pb e 950 a 1025 (figura 10). A protease viral, que
apresenta 99 resíduos de aminoácidos, não foi uma região tão variável quanto a
trancriptase reversa. Na protease, os resíduos de flaps, cantilever e β-sheets foram as
regiões mais freqüentemente variadas e as que apresentaram maior intensidade de
variação, isto é, apresentaram entropia mais elevada. No entanto, no grupo R5 foi
verificada uma mutação na região do sítio catalítico. Já na porção da transcriptase
reversa, os domínios finger (primeiro) e palm (segundo) foram as regiões com maior
freqüência e intensidade de variação. Na transcripase reversa, interessantemente o
primeiro resíduo do sítio catalítico foi alvo de variação (figura 12).
No grupo X4, as regiões de maior variabilidade foram: entre 175 a
325 pb, 375 a 525 pb, 600 a 650 pb e 775 a 975pb (figura 11). Neste grupo, a entropia
foi relativamente baixa comparando-se com o grupo R5. No entanto, a transcriptase
reversa também foi a região mais variável, com destaque para os domínios finger e
palm com maior freqüência e intensidade de variação. No grupo X4, assim como no
R5, o sítio catalítico também foi alvo de variação (figura 12).
Para facilitar a visualização da análise global da variabilidade entre
as seqüências das diferentes condições em cada grupo, foi realizada uma análise das
entropias cumulativas. Para tanto, valores da entropia em cada posição foram somados
cumulativamente com cada posição subseqüente no alinhamento (figura 13). Através
desta análise, podemos observar claramente a influência da ativação celular sobre a
geração da diversidade genética do HIV-1.
Corroborando as análises isoladas de entropias em cada grupo
(figuras 10 e 11), a análise comparativa de cada condição de grupos distintos aponta
uma variabilidade ocorrendo de maneira não seletiva ou desordenada na condição em
que as células estavam em repouso (figura 13, inferior, R5-3 vs X4-3). Particularmente,
quanto maior o ruído nas linhas gráficas representativas das entropias, maior a
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
89
freqüência de variação. A sobreposição entre as mesmas indica entropias similares.
Quanto maior a distância entre as entropias, maior a diferença genética entre os vírus.
Nesta condição, independentemente do tipo viral, as substituições ocorrem ao longo de
toda a seqüência. Também pode ser verificado que a região entre 600 a 800pb é a
menos variável.
Na condição 02 (figura 13, gráfico central, R5-2 vs X4-2), há uma
nítida diferença na intensidade da entropia dos vírus R5 em relação aos vírus X4.
Porém, as regiões variáveis e não variáveis (200 a 400pb, 450 a 550 e 600 a 800pb)
são coincidentes. À medida que o grau de ativação celular aumenta (condição 03
condição 02 condição 01), a seletividade para a geração da diversidade genética
também aumenta, culminando com o grau máximo de seleção das regiões onde a
variabilidade acontece quando as células estão plenamente ativadas. Apesar disso, é
notável uma maior entropia dos vírus R5 (figura 13, superior, R5-1 vs X4-1). Neste
caso, também se verifica coincidência nos pontos de invariabilidade (500 a 750pb).
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90
Figura 13. Análise comparativa da variabilidade entre os grupos R5 e X4. A análise da
diversidade das três condições experimentais de cada grupo foi calculada pela entropia de
Shannon e representa o grau de variação por sítio ao longo do alinhamento. A distância
genética representa o tamanho do fragmento analisado (1050pb). As linhas vermelhas
representam entropias cumulativas dos vírus R5 e as pretas dos vírus X4. As regiões
invariáveis são representadas por linhas horizontais.
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91
4.7. Reconstrução Filogenética
O método de construção das árvores genealógicas foi realizado por
máxima verossimilhança, usando matrizes de probabilidade de mudança entre
nucleotídeos. A partir dos alinhamentos das seqüências de nucleotídeos dos clones de
cada condição, foram construídas árvores para cada condição e grupo estudados. Nas
figuras 14 e 15, podemos observar a representação de árvores genealógicas baseada
nas diferenças nucleotídicas entre todas as seqüências dos grupos R5 e X4,
respectivamente, mostrando que os clones se relacionam entre si, mas possuem
características genéticas distintas. É importante ressaltar que, nenhuma correlação
entre a variabilidade genética e a ativação celular é passível de verificação a partir
deste tipo de inferência. Os métodos de reconstrução são extremamente úteis, neste
caso, singularmente como uma ferramenta adicional de comprovação da diversidade
genética do HIV-1.
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
92
Figura 14. Relação filogenética das seqüências de nucleotídeos dos clones do grupo R5. A
matriz de distância foi determinada por Máxima Verossimilhança com o modelo evolutivo
Tamura-Nei. Todos os indels foram excluídos da análise. A árvore foi enraizada usando o
pNL4-3, clone molecular infeccioso do HIV-1.
3.14
1.5
3.8
1.4
3.3
1.16
3.13
1.15
3.10
1.14
2.2
2.7
2.5
2.8
3.11
2.10
3.1
3.7
2.18
2.15
2.9
1.18
1.9
1.2
3.15
1.3
2.16
3.4
1.13
2.6
1.11
1.10
1.6
2.14
3.9
2.12
2.1
1.12
3.18
3.6
3.12
1.17
1.7
1.8
2.11
3.2
2.3
3.5
HIV-1vectorpNL4-3completesequence
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
93
Figura 15. Relação filogenética das seqüências de nucleotídeos dos clones do grupo X4. A
matriz de distância foi determinada por Máxima Verossimilhança com o modelo evolutivo
Tamura-Nei. Todos os indels foram excluídos da análise. A árvore foi enraizada usando o
pNL4-3, clone molecular infeccioso do HIV-1.
5 – DISCUSSÃO
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Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
95
O HIV-1 possui uma importante diversidade genética. A capacidade
de diversificação da informação genética contida em seu genoma permite ao HIV-1
adaptar-se às pressões seletivas impostas pelo meio onde está se replicando. Esta
diversidade é responsável pela geração de partículas virais mutantes resistentes às
drogas anti-retrovirais e aos mecanismos de defesa do sistema imunológico, sendo a
principal limitação para o desenvolvimento de vacinas anti-HIV. Portanto, é relevante
conhecer melhor os mecanismos envolvidos nesse complexo processo. Esta
diversidade genética resulta de limitações de fidelidade intrínsecas ao mecanismo de
replicação viral acentuados pela alta capacidade de geração e pelo rápido turnover viral
durante a infecção.
A etapa da transcrição reversa do genoma viral é um momento
crucial do ciclo de vida do HIV-1, podendo sofrer a influência de vários fatores como,
por exemplo, à oferta de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) ou o estado de ativação
celular. O déficit de oferta de dNTPs no momento da transcrição reversa pode gerar
genomas altamente mutados nos quais, o conteúdo informacional se perde, resultando
em partículas virais defectivas que são incapazes de deixar a célula hospedeira e
infectar novas células, como no caso da hipermutação. Isto é particularmente
importante uma vez que, a partir do momento que o conteúdo de informação genética
de uma população viral ultrapassa o conteúdo suportado pelo sistema genético em
questão, a população viral pode ser extinta. Esta perda da viabilidade das populações
de vírus RNA é conhecida como Error Catastrophe.
A proposta deste estudo foi analisar in vitro os mecanismos que
podem fazer parte da geração da diversidade genética do HIV-1 no momento inicial da
infecção viral. Também foi de interesse correlacionar esta variabilidade com o tropismo
viral. A maior parte dos estudos envolvendo a diversidade genética do HIV-1 em cultura
de células utiliza partículas virais com capacidade de múltiplos ciclos de infecção. A
grande desvantagem desse tipo de abordagem é que o número de ciclos replicativos
não pode ser acessado diretamente, sendo estimado de acordo com o período médio
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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96
de geração da partícula do HIV-1 (algo em torno de 1,47 dias). Consequentemente, a
diversidade genética é calculada de maneira indireta, podendo não representar
fielmente a taxa mutacional de uma dada população viral. Para contornar essa
situação, foi montado um sistema altamente controlado a partir da construção de
partículas virais pseudotipos capazes de realizar um ciclo de infecção único.
Para tanto, PBMCs isoladas de indivíduos saudáveis foram
infectadas, paralelamente, com diferentes partículas virais pseudotipadas com
envelopes R5 ou X4. Assim, toda a diversidade foi sabidamente gerada após um único
ciclo de replicação viral e não a partir de uma estimativa temporal. Segundo Kok et al.,
1993 o tempo necessário para que ocorra a transcrição reversa leva em média 12
horas e o tempo total para que o HIV-1 complete o ciclo replicativo e monte uma nova
partícula leva em média 48 horas. Para garantir, in vitro, o desenrolar dos momentos
iniciais do encontro vírus/células e observar os primeiros eventos do processo de
replicação viral envolvidos na geração da diversidade genética do HIV-1, as células
foram mantidas em cultura por 48 horas após a infecção (Karlsson et al., 1998). Assim,
foi observado o efeito mutacional sobre o HIV-1 em apenas um evento de transcrição
reversa onde as taxas de mutação são conhecidas (entre 10
-5
a 10
-4
bases por ciclo
replicativo). Com a utilização de partículas virais pseudotipadas, garante-se que as
substituições observadas são decorrentes de um ciclo celular e não correspondem ao
acúmulo de mutações de várias gerações virais, ao contrário de outros estudos
descritos na literatura (Karlsson et al., 1998; Ritola et al., 2004) onde estes eventos são
observados após obtenção de PBMCs de indivíduos infectados pelo HIV-1 e
relacionados com a geração de diversidade genética após 72 horas de cultura celular.
Deste modo, foram desenhadas três diferentes condições de
infecção e cultura para as PBMCs e cada um dos pseudotipos de HIV-1. Na primeira
condição as PBMCs foram ativadas 72 horas antes da infecção (células plenamente
ativadas ou células em ciclo), infectadas e mantidas em cultura por 48 horas. Na
segunda condição as PBMCs foram ativadas simultaneamente a infecção (células em
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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ativação ou células pré-ciclo) e mantidas em cultura por 48 horas. Na terceira condição,
PBMCs em repouso (células não ativadas ou células fora de ciclo celular) foram
infectadas e as mantidas em cultura por 48 horas. Portanto, foram realizadas seis
condições experimentais: infecção utilizando o pseudotipo viral R5 e cada uma das
condições de ativação celular acima descrito (grupo R5) e, infecção utilizando o
pseudotipo viral X4 e cada uma das condições de ativação acima descritas (grupo X4).
Após o período de cultivo celular, o DNA proviral gerado nestas
seis condições experimentais foi isolado e, através da técnica de End-Point PCR, foram
produzidos um total de 96 clones a partir do inóculo inicial (desconsiderando-se os
demais produzidos para testes de otimização de reações e/ou comprovação de
homogeneidade do inóculo inicial). Considerando as três condições do grupo R5,
isoladamente, 17 clones foram obtidos na condição 01; 15 clones na condição 02 e; 16
clones na condição 03. No grupo X4, 16 clones foram obtidos em cada uma das três
condições. Posteriormente, todos os clones tiveram o gene pol seqüenciado (fragmento
de aproximadamente 1.050 pb). As seqüências de cada clone foram comparadas entre
si e com a seqüência previamente conhecida da região pol do clone molecular
infeccioso pNL4-3 (Número de acesso AF324493 no GeneBank), vetor do qual origina-
se o pNL4-3-KFS. O pNL4-3-KFS foi o plasmídeo genômico utilizado para a construção
dos pseudotipos virais.
Previamente à infecção das PBMCs, o inóculo inicial foi
sequenciado. As seqüências obtidas foram comparadas entre si e nenhuma diferença
genética foi encontrada. Todas as seqüências foram idênticas quanto à composição
genômica quando comparadas com a seqüência da mesma região do pNL4-3.
Portanto, o inóculo viral mostrou-se geneticamente homogêneo a partir de
amplificações independentes. Além disso, para descartar a possibilidade de erros de
incorporação de nucleotídeos decorrentes da reação de PCR, 10 clones foram gerados
e seqüenciados a partir do clone molecular pNL4-3-KFS. Esse conjunto de sequências
mostrou-se altamente homogêneo, não apresentando qualquer variação.
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Por outro lado, um intenso processo mutacional foi verificado nas
seqüências oriundas das 06 condições experimentais. Neste processo, foi observada
uma alta taxa de substituições nucleotídicas em alguns clones, sendo que esta taxa de
substituições corresponde à incorporação de bases nucleotídicas diferentes das do
inóculo inicial, na região gênica analisada. Na condição 01 do grupo R5, foi
observado um total de 36 substituições nos 17 clones analisados, sendo que o intervalo
destas substituições foi de 01 a 06 substituições por clone. A taxa mutacional para esta
condição (R5-01) foi de 1,0 x 10
-3
, com clones apresentando taxas entre 4,76 x 10
-3
a
9,52 x 10
-4
. Na condição 02 do grupo R5, foi observado um total de 29 substituições
nos 15 clones analisados, sendo que o intervalo destas substituições foi de 01 a 07
substituições por clone. A taxa mutacional para esta condição (R5-02) foi de 1,0 x 10
-3
,
com clones apresentando taxas entre 6,67 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
. Na condição 03 do
grupo R5, foi observado um total de 36 substituições nos 16 clones analisados, sendo
que o intervalo destas substituições foi de 01 a 06 substituições por clone. A taxa
mutacional para esta condição (R5-03) foi de 1,0 x 10
-3
, com clones apresentando
taxas entre 6,67 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
.
Na condição 01 do grupo X4, foi observado um total de 12
substituições nos 16 clones analisados, sendo que o intervalo destas substituições foi
de 01 a 02 substituições por clone. Quanto à taxa mutacional, esta variou em um
intervalo de 1,90 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
entre os clones desta condição (X4-01). Na
condição 02 do grupo X4, foi observado um total de 23 substituições nos 16 clones
analisados, sendo que o intervalo destas substituições foi de 01 a até 05 substituições
por clone. Quanto à taxa mutacional, esta variou em um intervalo de 4,76 x 10
-3
a 9,52
x 10
-4
entre os clones desta condição (X4-02). Na condição 03 do grupo X4, foi
observado um total de 19 substituições nos 16 clones analisados, sendo que o intervalo
destas substituições foi de 01 a 03 substituições por clone. Quanto à taxa mutacional,
esta variou em um intervalo de 2,86 x 10
-3
a 9,52 x 10
-4
entre os clones desta condição
(X4-03). É importante ressaltar que essa taxa de substituições representa as
substituições nucleotídicas encontradas no gene pol, em um fragmento de 1.050 pb.
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Durante a replicação do DNA em células eucarióticas e
procarióticas na natureza, o processo mutacional ocorre com taxas entre 10
-8
a 10
-11
(Beckman & Loeb, 1993; Domingo et al., 1996; Domingo et al., 2005b). Por outro lado,
no caso dos vírus, especialmente os de genoma RNA, como o HIV-1, que tem a
transcrição reversa como uma etapa importante de sua replicação, o processo
mutacional ocorre em taxas muito mais elevadas, entre 10
-4
a 10
-5
substituições de
bases nucleotídicas por genoma a cada ciclo replicativo. Isto significa que, a cada
10.000 ou 100.000 nucleotídeos ocorre um erro e que este erro é incorporado ao
genoma na forma de um nucleotídeo diferente do original. Esta incorporação de erro é
responsável, em grande parte, pela geração da diversidade genética, que pode ser
favorável ou desfavorável, dependendo do contexto em que ocorra. Favorável, por
exemplo, para produzir partículas virais mutantes, capazes de resistirem às drogas
anti-retrovirais ou escaparem do sistema imune do hospedeiro. Desfavorável no sentido
que pode levar populações virais à extinção (Holland et al., 1992; Domingo et al., 1996;
Domingo et al., 2005b).
Uma explicação plausível para isso seria a taxa mutacional, que
varia de maneira inversamente proporcional ao tamanho do genoma e, também, por
evidências bioquímicas e estruturais relacionadas à transcriptase reversa. Estas
importantes enzimas replicativas não apresentam atividade de proof-reading, isto é,
não possuem atividade de correção de erros de incorporação de nucleotídeos. Tais
fatores prejudicam a atividade de edição competente (atividade exonuclease 3'→5')
durante a transcrição reversa. Outrossim, a variação das concentrações relativas do
pool de substrato nucleotídicos (dNTPs), pode influenciar na elevação da taxa
mutacional (Domingo et al., 1996; Domingo, 1997; Domingo et al., 1998; Domingo,
2003; Domingo et al., 2005a; Domingo et al., 2006).
No presente trabalho, ferramentas biomoleculares foram utilizadas
para a geração de seqüências nucleotídicas do HIV-1. É importante ressaltar que,
quando se utilizam técnicas de amplificação in vitro, como a do End-Point PCR aqui
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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100
empregada, há que se considerar a taxa de erro da enzima DNA polimerase que é
utilizada durante a reação de PCR. Normalmente, as Taq Polimerases mais usadas in
vitro, não apresentam a capacidade de revisão da seqüência sintetizada e possui uma
taxa de erro de incorporação nucleotídica que varia entre 1,1 x 10
-4
a 8,9 x 10
-5
bases
por ciclo replicativo (Cariello et al., 1991). Para contornar essar situação, foi utilizada
uma DNA polimerase (Pfu High Fidelity) com atividade de proof-reading. Esta DNA
polimerase é normalmente encontrada no Pyrococcus furiosus e possui a menor taxa
de erro conhecida na amplificação por PCR. Por esta razão, a Pfu é bastante
empregada nas aplicações de PCR que exigem grande fidelidade. A enzima apresenta
atividade exonucleásica 3´5´ o que lhe permite corrigir erros durante a polimerização.
A Pfu apresenta uma taxa de erro inferior a 2,6 x 10
-6
por nucleotídeo em cada ciclo
(Lundberg et al., 1991; Chunlin & Erickson, 1997). Particularmente, no caso do HIV-1, a
taxa de incorporação de erro no momento da transcrição reversa é de 3,4 x 10
-5
bases
nucleotídicas em um genoma de aproximadamente 10 kb, ou seja, em média, a cada
10.000 bases sintetizadas ocorre um erro (Holland et al., 1992; Mansky & Temin, 1994;
Mansky & Temin, 1995).
Em todas as condições estudadas, independentemente do tipo de
vírus usado para as infecções (R5 ou X4), os resultados demonstraram um processo
mutacional muito acima do comumente verificado nos primeiros momentos da
replicação viral. No grupo R5, a taxa mutacional
entre os clones foi de 2,0 x 10
-3
. No
grupo X4, a taxa mutacional
entre os clones foi de 1,07 x 10
-3
. Essa exacerbada taxa
mutacional implica que, em alguns clones (por exemplo, clones 2.8-R5 e 3.2-R5, com
07 e 06 substituições, respectivamente), a cada 150 e 175 bases sintetizadas ocorreu
um erro e uma base diferente da seqüência do inóculo original foi incorporada à nova
seqüência.
Levando-se em consideração o intervalo das taxas de erro da DNA
polimerase Pfu (High Fidelity) e da transcrição reversa peculiar ao HIV-1, que fica entre
10
-5
a 10
-6
erros por base sintetizada, a elevada taxa mutacional aqui encontrada
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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101
seguramente não está relacionada ao erro da DNA polimerase e está muito além dos
valores comumente encontrados durante a transcrição reversa do HIV-1 ou descritos
em outros estudos do gênero.
A conseqüência imediata desta elevada taxa mutacional foi a
geração de diversas substituições nucleotídicas nas seqüências genômicas dos clones
analisados. As transições e transversões foram as substituições nucleotídicas mais
frequemente encontradas, com predomínio da primeira sobre a segunda. As transições
consistem em substituições entre bases de mesma característica, ou seja, bases
púricas (A-G) trocam entre si (por exemplo, G → A; lê-se, de G para A) e as bases
pirimídicas (T-C) trocam entre si (por exemplo, C → T). Por outro lado, as transversões
consistem na troca entre bases de características diferentes, púricas trocam com
pirimídicas (por exemplo, A → T) e vice-versa. No HIV-1 as substituições mais
freqüentes são as de transição, havendo um predomínio das substituições de G → A
(Moriyama et al., 1991).
Aqui, este padrão natural de substituições nucleotídicas também foi
observado. As substituições mais freqüentes encontradas foram os eventos de
transição e, na maior parte das condições essas substituições foram do tipo G para A e
T para C. Esses dados corroboram estudos bioquímicos que demonstram uma
possibilidade maior de ocorrência dos eventos de transição em relação às
transversões. Para que esta última ocorra, há a necessidade de um complexo
mecanismo de torção nas moléculas nucleotídicas, fenômeno conhecido como
tautomeria (Sinha & Haimes, 1981).
No grupo R5, 93,07% das substituições foram transições. Na
condição 01 do grupo R5 94,44% das substituições foram eventos de transição,
sendo que, 36,11% foram substituições de T para C e 30,56% de G para A. Na
condição 02 do grupo R5, 93,10% das substituições foram eventos de transição,
sendo que, 31,03% foram substituições de T para C. Por fim, na condição 03 do
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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grupo R5, 91,67% das substituições foram eventos de transição, sendo que, 27,78%
foram substituições de G para A.
No grupo X4, 94,44% das substituições foram eventos de
transição. Na condição 01 do grupo X4 todas as substituições nesta condição foram
eventos de transição, sendo que, 50% foram substituições de G para A. Na condição
02 do grupo X4, 91,30% das substituições foram eventos de transição, sendo que
43,48% foram substituições de G para A. Por fim, na condição 03 do grupo X4,
94,74% das substituições foram eventos de transição, sendo que, 47,37% foram
substituições de G para A.
Este padrão de substituições também foi descrito em estudos
seminais. Mansky et al (1995) descreveu uma alta taxa de erros de incorporação de
nucleotídeos (3,4 x 10
-05
/pb/ciclo) num sistema de ciclo único de replicação, porém,
utilizando o gene que codifica o peptídeo LacZα como alvo mutacional. No referido
estudo, as transições foram as substituições mais frequemente encontradas (> 90%
das substituições), com destaque para as substituições de G para A e C para T. Yuste
et al. (2000), descreveram um padrão de distribuição de mutações não usual,
associado a perda de fitness do HIV-1, após vários bottlenecks como resultado da ação
da catraca de Muller. Neste último caso, interessantemente, mesmo com um sistema
de múltiplos ciclos de replicação, a taxa mutacional variou entre 1,2 x 10
-3
a 6,6 x 10
-6
(alcançando valores tão elevados quanto os aqui encontrados). Igualmente, os eventos
de transição foram predominantes (> de 75%), com destaque para as substituições de
A para G e de G para A. Todavia, embora as taxas mutacionais verificadas tenham sido
muito mais elevadas do que as usualmente encontradas, diferentemente, nestes dois
trabalhos houve uma dominância massiva de substituições de G para A e,
consequentemente, de clones hipermutados. Aqui, nenhum clone hipermutado foi
verificado.
Estudo da geração da diversidade genética do HIV-1 em ciclo único de infecção durante o cultivo celular
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
103
Diferentes padrões de mutações foram identificados entre os
clones. Primeiramente, foi observado um padrão onde as mutações acontecem ao
acaso. No segundo padrão, praticamente não foi verificada mutação. Quando as
mutações ocorrem ao acaso, a taxa mutacional no clone é mais elevada e as
substituições ocorrem aleatoriamente sem predomínio de um tipo específico de
substituição nucleotídica sobre outro, como, por exemplo, no clone R5-3.2 (ver tabela
11 em resultados). Neste caso, as mutações podem ser importantes para a
manutenção de viabilidade das populações virais, favorecendo a diversidade genética
que lhe dará plasticidade para escapar das pressões terapêutica e/ou do sistema
imunológico do hospedeiro. De outra maneira, esta taxa mutacional elevada também
pode gerar mutações maléficas que podem influenciar na sobrevivência das partículas
virais.
Quando a taxa mutacional é reduzida, as substituições
nucleotídicas ao longo da seqüência são praticamente inexistentes. Logo, a geração de
diversidade genética não é expressiva, o que deixa a seqüência nucleotídica oriunda
da cultura, idêntica ou quase idêntica à do inóculo inicial, como por exemplo, no clone
X4 2.12 (ver tabela 14 em resultados), que apresenta apenas uma substituição e taxa
mutacional de 9,52 x 10
-4
nt/pb/ciclo.
Assim como verificado em estudos clássicos (Mansky & Temin,
1994; Mansky & Temin, 1995), além das substituições, foram encontrados outros
mecanismos que podem estar envolvidos na geração da diversidade genética do HIV-
1, como as deleções, verificadas em duas ocasiões.
Interessantemente, outro mecanismo relacionado à geração da
diversidade genética do HIV-1, a hipermutação, esteve ausente nestes resultados. Mais
especificamente, a hipermutação ocorre quando há substituições de G para A, em Gs
seguidos de A (GA→AA) ou quando há uma substituição de G para A em Gs seguidos
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104
de G (GG→AG). Em partículas virais hipermutadas este tipo de substituição é
predominante e ocorre ao longo de toda a sequência de nucleotídeos.
Nenhum clone hipermutado foi encontrado neste estudo, apesar da
verificação de uma taxa mutacional extremamente alta, o que favoreceria a
hipermutação. Mesmo nos clones onde a frequência de substituições foi maior (como,
por exemplo, o clone R5 1.6 ou o clone R5 2.8) as substituições G →
→→
→ A não foram tão
conspícuas, estando distribuídas numa taxa relativamente equivalente à outras
substituições e, portanto, tais clones não foram considerados hipermutados.
A presença das hipermutações pode levar a perda do fitness da
partícula do HIV-1, podendo causar a extinção das populações virais. Dois fatores
principais poderiam estar relacionados à ausência de hipermutação aqui verificada. Em
primeiro lugar, as partículas virais pseudotipo foram construídas a partir do
empacotamento em células Hela, uma linhagem celular aderente, de origem epitelial,
que não expressa APOBECs. Essas proteínas celulares apresentam atividade de
citidina deaminase sendo a principal família protéica associada ao fenômeno da
hipermutação. Secundariamente, é possível que o curto período de replicação, uma
característica inerente aos aspectos metodológicos utilizados, representados por um
ciclo de infecção único tenha sido insuficiente para o completo desenrolar dos
processos hipermutacionais, sendo estes, mais facilmente verificados após várias
gerações virais.
Todos os resultados encontrados estão necessariamente
relacionados às condições celulares e a população celular escolhida para o estudo.
Foram utilizadas PBMCs de indivíduos saudáveis e destas não foram isolados os
linfócitos T CD4
+
, principal alvo natural da infecção pelo HIV-1. Além disso, outras
populações celulares, como as de monócitos e macrófagos, por exemplo, não foram
excluídas. Logo, os resultados representam a infecção viral em uma população celular
heterogênea. Nesse sentido, os diferentes tipos celulares que compõem esta
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Wagner Tadeu Alkmim Maia – Mestrado
105
população poderiam estar em momentos distintos do ciclo celular. Consequentemente,
cada célula poderia possuir um status de ativação celular próprio, diferente uma das
outras. As células não foram isoladas levando-se em consideração a ativação celular.
Apenas induzimos, por ação de mitógenos, um grau variável de ativação celular
(condição 01, células ativadas 72 horas antes da infecção; condição 02, células
ativadas simultaneamente à infecção; condição 03, células em repouso). Portanto, em
relação à ativação celular, as condições experimentais apresentaram-se com
populações celulares heterogêneas.
Estudos prévios propuseram condições em que as populações
celulares foram especificamente separadas. Janini et al., 2001 isolaram linfócitos de
indivíduos infectados pelo HIV-1. Em seguida, as células ativadas e outros tipos
celulares foram excluídos por meio de colunas com anticorpos específicos para
separação celular, obtendo ao final do processo uma população celular homogênea,
composta unicamente por linfócitos T CD4
+
no mesmo momento de ativação celular.
Karlsson et al., 1998 também utilizaram condições de estudos similares, nas quais os
linfócitos T CD4
+
foram isolados de pacientes HIV
+
sob HAART. No entanto,
abordagens como estas não reproduzem com exatidão os eventos que ocorrem in vivo.
Naturalmente, é um contra-senso metodológico assumir que num indivíduo infectado
um único tipo celular é alvo da infecção pelo HIV.
No presente estudo, uma vez que uma população celular mista foi
utilizada, é possível que o status de ativação celular tenha sido similar em todas as
condições. Portanto, algumas observações devem ser levadas em consideração. Na
primeira condição, em que células plenamente ativadas foram utilizadas, é possível que
houvesse células em repouso e em ativação. Na segunda condição, em que as células
foram ativadas simultaneamente à infecção, é possível que um determinado número de
células ativadas e em repouso pudesse estar presente. Na terceira condição, células
em repouso foram utilizadas, porém, é possível que houvesse uma quantidade de
células ativadas, ainda que em menor quantidade. Ademais, o agente mitogênico
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usado para a ativação celular foi a fitohemaglutinina, que possui como alvo
predominantemente os linfócitos. No entanto, células como monócitos e macrófagos,
presentes na população heterogênea, são mais comumente estimuladas por
lipopolissacarídeos. Dessa forma, seria esta a explicação mais plausível para a
observação de genomas mutados em todas as condições celulares. Evidentemente, os
dados aqui encontrados representam uma maior aproximação do que ocorre in vivo.
Pela primeira vez um estudo associa a geração de diversidade
genética de maneira diferenciada e sua correlação com o tropismo viral. O tropismo é a
especificidade que o vírus possui para infectar determinados tipos celulares. Em termos
de quantidade média de substituições, não houve diferença estatística significativa
entre as diferentes condições entre os grupos R5 e X4. No entanto, considerando-se
apenas os grupos experimentais, essa diferença é marcante. De acordo com os
resultados, a taxa mutacional tanto do grupo R5 quanto do X4 é extremamente
elevada. No entanto, a taxa mutacional do grupo R5 é cerca de duas vezes maior que à
do grupo X4.
De acordo com estudo realizado por Cicala et al. (2006) proteínas
do envelope do HIV-1 derivadas de variantes virais R5 e X4 podem induzir um perfil
distinto de expressão gênica em PBMCs. A partir da análise da modulação da
expressão gênica usando microarrays foi demonstrado que o envelope R5 facilita a
replicação do HIV-1 em PBMCs, incluindo células TCD4
+
em repouso. Além disso, a
sinalização mediada por gp120 R5 pode modular genes associados com a proliferação
celular, ciclo celular e fatores de transcrição associados às proteínas MAP quinases,
facilitando a transmissão de vírus R5 por induzir a formação de um ambiente mais
permissível para a replicação viral. Dessa forma, pode-se sugerir que a taxa de erro
aqui encontrada (cerca de duas vezes maior no grupo R5 do que no X4) poderia estar
relacionada a uma maior modulação da expressão gênica de PBMCs por envelopes
virais R5 nos momentos precoces da infecção viral.
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Os efeitos da ativação celular sobre a geração da diversidade
genética do HIV-1 são bem visualizados neste estudo. Como mencionado
anteriormente, a diversidade é mais acentuada e seletiva nas condições em que as
PBMCs já estavam em ciclo no momento da infecção. Possivelmente, a oferta de
deoxirribonucleotídeos também foi um fator chave para influenciar a ocorrência da
variabilidade observada.
A elevada taxa mutacional encontrada poderia, em grande parte,
dirigir a geração da diversidade genética, que poderia ser favorável ou desfavorável,
dependendo do contexto em que ocorra. Dessa forma, os efeitos da variabilidade
genética sobre a possível atividade funcional das proteínas codificadas pela região
analisada poderiam ser catastróficos (ou benéficos) para o HIV-1, caso as partículas
virais não fossem pseudotipadas e apresentassem a capacidade de múltiplos ciclos de
infecção.
De fato, tanto a protease quanto a transcriptase reversa possui
papel crucial no ciclo de vida viral. Em relação ao grupo R5, na protease, os resíduos
de flaps, cantilever e β-sheets foram as regiões mais freqüentemente variadas e as que
apresentaram maior intensidade de variação, isto é, apresentaram entropia mais
elevada. Estas estruturas são relevantes para a manutenção da conformação correta
da proteína. Apresentam um papel importante na flexibilidade da estrutura terciária da
proteína, fazendo a aproximação de regiões importantes como os resíduos do sítio
ativo (figura 12).
Através de simulações, estudos recentes têm relatado a
propriedade destas regiões, especialmente dos resíduos de flaps para a identificação
das conformações corretas de ligação para a ação da proteína (Hornak et al., 2006;
Layten et al., 2006; Toth & Borics, 2006a; Toth & Borics, 2006b) . Os flaps naturalmente
cobrem a região do sítio catalítico, restringindo seu acesso. Mutações nestas regiões
poderiam alterar a flexibilidade e a conformação da protease e, inclusive causar a
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inativação da enzima. Consequentemente, a função principal da protease no ciclo vital
do HIV-1, que é o processamento de polipeptídeos precursores, seria prejudicada.
Além disso, no grupo R5 foi verificada uma mutação na região do sítio catalítico, o que
poderia contribuir para a inativação da enzima.
Já na porção da transcriptase reversa, os domínios finger (primeiro)
e palm (segundo) foram as regiões com maior freqüência e intensidade de variação. Na
transcripase reversa, interessantemente o primeiro resíduo do sítio catalítico foi alvo de
variação (figura 12). Essas regiões são importantes para a interação entre a p51 e a
p66, sendo cruciais para a replicação viral (Mulky & Kappes, 2005; Mulky et al., 2005)
Mulky et al. (2007) demonstraram função relevante das β-sheets 7 e 8. Mais
especificamente, esta região compreende a interface entre o domínio finger na p51 e o
domínio palm na p66, sendo o resíduo 136 foi essencial para a infectividade viral. No
grupo R5, esta região é alvo de variação. Entretanto, a região do sítio ativo também foi
submetida à variação. Uma vez que mudanças bruscas no sítio catalítico de enzimas
são sensivelmente refletidas em sua atividade, neste caso, haveria grande
probabilidade, inclusive, de inativação protéica e conseqüente perda da viabilidade viral
(Mulky et al., 2005; Mulky et al., 2007).
No grupo X4, a entropia foi relativamente baixa comparando-se
com o grupo R5. No entanto, a transcriptase reversa também foi a região mais variável,
destacando-se, assim como no R5, os domínios finger e palm com maior freqüência e
intensidade de variação. No grupo X4, assim como no R5, o sítio catalítico também foi
alvo de variação (figura 12). Explanações acerca dos efeitos da variabilidade sobre
essas variantes virais são similares às acima mencionadas para a transcriptase reversa
no grupo R5, exceto pela freqüência menor de substituições e pela ausência de
mudança no resíduo 136 no grupo X4.
Comparando-se a diversidade genética dos grupos
R5 e X4 em cada condição é possível verificar regiões comuns onde as substituições
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acontecem bem como regiões onde a variabilidade é nula. A análise comparativa de
cada condição aponta uma variabilidade ocorrendo de maneira não seletiva ou
desordenada na condição em que as células estavam em repouso (figura 13, inferior,
R5-3 vs X4-3). Nesta condição, independentemente do tipo viral, as substituições
ocorrem ao longo de toda a seqüência. Também pode ser verificado que a região entre
600 a 800pb é a menos variável. Na condição 02 (figura 13, gráfico central, R5-2 vs X4-
2), há uma nítida diferença na intensidade da entropia dos vírus R5 em relação aos
vírus X4. Porém, as regiões não variáveis (200 a 400pb, 450 a 550 e 600 a 800pb) são
coincidentes. À medida que o grau de ativação celular aumenta (condição 03
condição 02 condição 01), a seletividade para a geração da diversidade genética
também aumenta, culminando com o grau máximo de seleção das regiões onde a
variabilidade acontece quando as células estão plenamente ativadas. Apesar disso, é
notável uma maior entropia dos vírus R5 (figura 13, superior, R5-1 vs X4-1). Neste
caso, também foi verificada coincidência entre os pontos de invariabilidade (500 a
750pb). Aparentemente, um padrão similar de entropia foi verificado entre os dois
grupos em todas as condições de ativação celular. Isto pode ser verificado pela
proximidade e, principalmente, pela sobreposição das curvas de entropia cumulativas.
Em todos os casos, a entropia no grupo R5 é maior que no X4. Na condição 2 (figura
13, centro) o padrão de entropia também é verificado, isto é, as regiões variáveis e
invariáveis são coincidentes, apenas a intensidade da entropia é muito mais elevada
em algumas posições do genoma no grupo R5 do que no X4.
Uma explicação plausível para as diferenças encontradas em
relação à diversidade genética entre os grupos R5 e X4 seria o fato de que os vírus R5
predominam nos estágios iniciais da infecção pelo HIV-1 e são responsáveis pelo
estabelecimento da infecção in vivo (Zhu et al., 1993; Shankarappa et al., 1999),
enquanto que os vírus X4 tendem a aparecer nos últimos estágios e podem estar
relacionados com um rápido declínio de células TCD4
+
, acelerada progressão para a
doença e reduzida sobrevivência dos indivíduos não tratados (Tersmette et al., 1988;
Schuitemaker et al., 1992; Koot et al., 1993; Soriano et al., 2008). Portanto, essa maior
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diversidade do grupo R5 poderia estar relacionada à um aumento na plasticidade
gênica viral como uma estratégia das populações de HIV-1 para recuperarem a
variabilidade perdida durante os eventos de transmissão. Quanto às regiões de
invariabilidade, existe a possibilidade de atuação da ativação celular e da concentração
do pool de nucleotídeos de maneira não homogênea sobre as populações em cada
condição, uma vez que para o presente estudo, foi utilizada uma população celular
mista. É importante ressaltar também que, como já descrito anteriormente, o HIV pode
evoluir de maneira distinta entre diferentes hospedeiros ou condições de cultivo de
células.
Estudos adicionais serão importantes para a verificação da
correlação entre esta diversidade genética gerada nos momentos precoces da infecção
e fatores genéticos do hospedeiro. Para tal, PBMCs de diferentes indivíduos saudáveis
devem ser isoladas para os ensaios de infecção com as partículas virais pseudotipos.
Segundo Janini et al. (2001) os diferentes estágios de ativação
celular correlacionam-se diretamente com a concentração do pool de substrato de
nucleotídeos (dNTPs). Esta, por sua vez, influencia na geração de diversidade genética
do HIV-1. No presente trabalho, independentemente do pseudotipo viral utilizado, a
diversidade genética (dada pela entropia) foi nitidamente variável com status de
ativação celular (ver figuras 10 e 11 nos resultados). Mais especificamente, quando as
células encontram-se em repouso (condição 03), isto é, fora de ciclo celular (fase G0),
a concentração do pool de dNTPs está abaixo do kM de concentração da transcriptase
reversa, favorecendo a formação de genomas mutados. Consequentemente, um
aumento da diversidade genética viral poderia ser verificado neste momento, podendo
este ser benéfico ou prejudicial ao vírus, dependendo do contexto em que ocorra,
conforme já discutido previamente. Por outro lado, quando as células estão em
ativação (condição 02), ou seja, quando estão entrando em ciclo e se preparando para
a síntese de DNA (Fase G1), o pool de dNTPs está em expansão, mas de forma
desequilibrada, o que favoreceria a hipermutação. Embora nenhum clone hipermutado
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tenha sido encontrado, clones com freqüências elevadas de substituição foram
encontrados nesta condição (como por exemplo, clone R5-2.8). Já quando as células
estão plenamente ativadas (condição 01), ou seja, quando estão em ciclo e em
síntese de DNA (Fase S), o pool de dNTPs encontra-se balanceado, sendo este
momento o mais apropriado para que ocorra a transcrição reversa. Isto porque, devido
a esta oferta equilibrada de dNTPs, as chances de erro da transcriptase reversa
diminuem, favorecendo assim a geração de genomas sem mutações deletérias para o
vírus.
Todos os estudos do gênero verificados na literatura analisaram a
diversidade genética do HIV-1 utilizando estimativas temporais a despeito do número
de ciclos replicativos (por exemplo, 48-72 horas), tempo suficiente para
estabelecimento de uma população viral homogênea, o que impossibilitaria a
observação das primeiras etapas do processo mutacional que geram a diversidade
genética. Em outros casos, a taxa mutacional do HIV-1 foi calculada a partir de genes
repórteres (Mansky & Temin, 1994; Mansky & Temin, 1995; Karlsson et al., 1998;
Mansky, 2000). Os resultados aqui encontrados são decorrentes da diversidade viral
gerada após, exatamente, um único ciclo replicativo. Este estudo baseou-se na análise
do gene pol do HIV-1, que codifica as principais proteínas envolvidas no ciclo de vida
viral.
A produção de partículas virais mutadas foi observada em todas as
condições de cultura celular sob diferentes estados de ativação, em um ciclo único de
infecção altamente controlado em que os vírus utilizados não possuíam a capacidade
de múltiplos ciclos replicativos. Portanto, os resultados não se referem a um estudo dos
momentos iniciais da infecção medida por estimativa temporal. Isso fundamentalmente
permitiu a observação dos acontecimentos precoces envolvidos no processo
mutacional gerador da diversidade genética viral. Esta estratégia foi adotada na
tentativa de se aproximar ao máximo do que ocorre durante a infecção e nos primeiros
momentos da replicação viral in vivo.
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Fatores como os acima mencionados incidem diretamente sobre a
diversidade genética do HIV-1 que, em condições diferentes, pode ser sofrer processos
mutacionais distintos. Foi verificado um desequilíbrio na geração da diversidade
genética viral, sendo que, a medida que as células vão sendo ativadas esse
desbalanço é reduzido e as mutações ocorrem de maneira seletiva, em pontos
específicos ao longo da sequência. Quando as condições são favoráveis, as células
estão plenamente ativadas e a oferta de dNTPs é equilibrada, as substituições ocorrem
em regiões bem definidas do genoma (condição 01, figuras 10 e 11). Quando a célula
encontra-se em repouso e as concentrações do pool de nucleotídeos estão em total
desequilíbrio são gerados diversos mutantes cujas substituições ocorrem de maneira
aleatória, dispersas ao longo do genoma (condição 03, figuras 10 e 11). No entanto,
quando as condições estão se equilibrando, as células estão se ativando e as dNTPs
estão em expansão, a taxa de erro pode se elevar, sendo observado um padrão
intermediário entre os acima descritos (condição 03, figuras 10 e 11).
Além disso, também é possível que o processo mutacional seja
relacionado a seqüências alvo e não necessariamente a toda uma população viral
submetida à determinada condição. Dessa forma, algumas seqüências alvo poderiam
ser mais favorecidas do que outras. Isto poderia explicar o fato de que, em algumas
condições, certas seqüências de clones oriundos de PBMCs ativadas 72 horas antes
da infecção, isto é, em ciclo, apresentaram entropia ou freqüência de substituições
menor do que seqüências clonais das condições em que as células foram submetidas a
graus menores de ativação por mitógenos.
Surpreendentemente, um padrão mutacional foi verificado nas
seqüências dos clones analisadas nas diferentes condições experimentais. Isso fica
claro quando as figuras 10 e 11 são analisadas (ver resultados). Na figura 10 são
verificadas as regiões onde as substituições nucleotídicas ocorrem com maior
freqüência no grupo R5. Existem pontos em que as substituições são comuns a quase
todos os clones, como, por exemplo, entre as posições 75 a 100 pb; 200 a 550 pb; 725
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a 875 pb; e 975 a 1025 pb na condição R5-01; 75 a 225 pb, 400 a 450 pb e 575 a 625
pb, 700 a 712, 800 a 860 pb e 925 a 1000 pb na condição R5-02; e na condição R5-03
nota-se que os pontos comuns de substituições nucleotídicas são mais raros e a
variabilidade genética ocorre de maneira não homogênea, dispersa ao longo das
sequências, sendo difícil caracterizar regiões onde as substituições são mais
freqüentes. Fica claro que existem regiões comuns em que as substituições ocorrem
em todas as condições, destacando as regiões entre 200 a 350 pb, 400 a 650 pb, 750 a
875 pb e 950 a 1025.
Na figura 11 são verificadas as regiões onde as substituições
nucleotídicas ocorrem com maior freqüência no grupo X4. Existem pontos em que as
substituições são comuns a quase todos os clones, como, por exemplo, entre as
posições 200 a 350 pb; 725 a 900 pb na condição X4-01; 175 a 510 pb, 600 a 660 pb e
900 a 925 na condição X4-02; e na condição X4-03 também nota-se que os pontos
comuns de substituições nucleotídicas são mais raros e a variabilidade genética ocorre
de maneira não homogênea, dispersa ao longo das sequências, sendo difícil
caracterizar regiões onde as substituições são mais freqüentes. Fica claro que existem
regiões comuns em que as substituições ocorrem em todas as condições, destacando
as regiões 175 a 325 pb, 375 a 525 pb, 600 a 650 pb e 775 a 975. Nestas regiões o
processo mutacional é intenso, os eventos mutacionais que mais ocorrem são os de
transição, as substituições nucleotídicas mais freqüentes são as de G para A e, em
alguns casos, de T para C. As substituições em cada um dos clones podem ser
observadas nas tabelas 09 a 14 nos resultados e os alinhamentos dos clones em cada
uma das condições em comparação com a seqüência referência pNL4-3 estão
representados nos anexos I e II.
A maior parte dos estudos relacionando a infecção primária com a
variabilidade genética viral nos momentos precoces da infecção verifica a presença de
uma população viral geneticamente homogênea. Toda essa homogeneidade é
decorrente dos population bottlnecks, que reduzem a diversidade genética da
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população. Estes eventos genéticos aleatórios são capazes de reduzir o tamanho da
população efetiva a ponto de que apenas alguns representantes da população original
serem capazes de formar a nova população resultante (Domingo et al., 1978;
Dougherty & Temin, 1988; Domingo et al., 1996; Domingo, 1997; Douek et al., 2003;
Domingo et al., 2005a; Domingo et al., 2006).
Um indivíduo infectado há algum tempo (doador da infecção),
possui uma população viral com diversidade genética estabelecida, que aumentou ao
longo do tempo. Entretanto, no momento da transmissão apenas uma pequena parte
desta população viral é transferida ao novo indivíduo (receptor da infecção). Esta
população viral leva consigo as características mutacionais estabelecidas no doador. O
bottleneck ocorre exatamente neste instante, reduzindo a diversidade genética
transferida na infecção primária. Uma vez no receptor, esta população viral tende a
expandir para se estabelecer, para isso, novos vírus serão produzidos (Delwart et al.,
1994; Karlsson et al., 1999; Shankarappa et al., 1999; Ritola et al., 2004). Nesse
sentido, é de extrema importância estudar o momento exato e quais as condições em
que ocorrem a infecção viral nas células do hospedeiro e os mecanismos envolvidos na
formação da população viral nos primeiros momentos da infecção.
Relatos anteriores sobre a diversidade genética viral envolvem
ensaios de múltiplos ciclos de infecção ou análise de amostras de indivíduos sob
terapia, estocadas há muito tempo. Nestas situações não existe a possibilidade de
estudar os momentos iniciais da infecção de forma controlada (Yuste et al., 1999; Yuste
et al., 2000; Manrubia et al., 2005; Yuste et al., 2005).
Esses achados demonstram que há um processo ordenado de
variação genética nos primeiros momentos da replicação viral. As substituições
ocorrem em pontos específicos do genoma que está sendo gerado, coordenado pelo
status de ativação das células no exato momento em que a transcrição reversa e a
síntese de DNA estão ocorrendo.
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No decorrer da infecção, as populações de HIV-1 tendem à
variação para melhoria do fitness em relação às pressões exercidas pelo sistema
imune do hospedeiro e pressões terapêuticas por ação das drogas anti-retrovirais,
(Domingo et al., 1998). Até então se considerava que esta diversidade genética
constituía-se sem que houvesse um padrão mutacional pré-existente. Todavia, os
resultados demonstram que a geração de diversidade genética talvez possa ter um
padrão mutacional que antecede a pressão seletiva, sendo este, um processo inato ao
vírus, ocorrendo justamente nos momentos anteriores à montagem da resposta
imunológica, antes mesmo que haja a estabilização da população viral infectante, até
que esta se torne uma população homogenia geneticamente.
6 - CONCLUSÕES
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• Os resultados sugerem um processo mutacional nos clones de todas as condições
experimentais, com a geração de genomas idênticos, quase idênticos e genomas
mutados (mas não hipermutados) em relação à sequência genômica tempo zero
(inóculo inicial), resultando em uma população viral heterogênea.
• A alta taxa de substituições e a existência de contextos comuns entre as seqüências
onde ocorrem as substituições refletem o intenso processo mutacional ocorrendo nos
primeiros momentos da infecção, exatamente quando o vírus está diversificando sua
informação genética a fim de se estabelecer no hospedeiro.
• A taxa mutacional encontrada foi maior do que a prevista pela taxa de erro da enzima
transcriptase reversa quando considerada isoladamente.
• A diversidade genética do HIV-1 é influenciada pelo estágio de ativação em que as
células alvo se encontram no momento da infecção, com mutações se agrupando em
contextos específicos de sequência quando as células estão ativadas.
• Pseudotipos R5 acumularam maior variação do que os vírus X4, sugerindo um papel
importante desta variante viral no estabelecimento da infecção.
• A colonização do hospedeiro com vírus R5 logo após a transmissão pode fazer parte de
uma estratégia viral em recuperar parte da diversidade genética perdida durante o
gargalo genético da transmissão (bottleneck).
• A geração de diversidade genética possui um padrão mutacional que antecede a
pressão seletiva, sendo este, um processo inato ao vírus. Na infecção primária este
processo ocorre nos momentos mais precoces e antecedem à estruturação da resposta
imune, antes mesmo que haja a estabilização da população viral infectante.
7 – ANEXOS
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Anexo I - Alinhamento das sequências de nucleotídeos dos clones do grupo R5.
#pNL4-3 CCT TTA GCT TCC CTC AGA TCA CTC TTT GGC AGC GAC CCC TCG TCA CAA TAA AGA TAG GGG GGC AAT TAA AGG AAG CTC TAT TAG ATA CAG GAG CAG ATG ATA CAG TAT TAG AAG AAA TGA ATT
#3.14 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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#pNL4-3 TGC CAG GAA GAT GGA AAC CAA AAA TGA TAG GGG GAA TTG GAG GTT TTA TCA AAG TAA GAC AGT ATG ATC AGA TAC TCA TAG AAA TCT GCG GAC ATA AAG CTA TAG GTA CAG TAT TAG TAG GAC
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#1.9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#pNL4-3 ATT CCT TTG GAT GGG TTA TGA ACT CCA TCC TGA TAA ATG GAC AGT ACA GCC TAT AGT GCT G
#3.14 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#3.15 ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#3.1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#3.2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#3.3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#3.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#3.8 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#3.9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#2.10 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#2.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#2.9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#1.10 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#1.11 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#1.14 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#1.2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#1.4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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#1.6 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#1.7 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... ... .
#1.8 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
#1.9 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
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Anexo II - Alinhamento das sequências de nucleotídeos de todos os clones do grupo X4.
#pNL4_3 CCT TTA GCT TCC CTC AGA TCA CTC TTT GGC AGC GAC CCC TCG TCA CAA TAA AGA TAG GGG GGC AAT TAA AGG AAG CTC TAT TAG ATA CAG GAG CAG ATG ATA CAG TAT TAG AAG AAA TGA ATT
#3.1_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.3_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.6_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.4_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.14_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.16_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.12_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.15_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.8_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.2_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.5_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.7_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.9_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#3.10_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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#2.11_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.4_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.10_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.5_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.6_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.12_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.7_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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#2.9_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.14_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#2.15_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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#1.3_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.8_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.10_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.14_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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#1.9_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.4_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.1_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.2_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.6_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.11_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.12_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#1.13_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#pNL4_3 TGC CAG GAA GAT GGA AAC CAA AAA TGA TAG GGG GAA TTG GAG GTT TTA TCA AAG TAA GAC AGT ATG ATC AGA TAC TCA TAG AAA TCT GCG GAC ATA AAG CTA TAG GTA CAG TAT TAG TAG GAC
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#3.3_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ...
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#pNL4_3 CTA CAC CTG TCA ACA TAA TTG GAA GAA ATC TGT TGA CTC AGA TTG GCT GCA CTT TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TTG AGA CTG TAC CAG TAA AAT TAA AGC CAG GAA TGG ATG GCC CAA AGT
#3.1_X4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
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8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
___________________________________
132
Abbink, T. E.&B. Berkhout (2008). "HIV-1 reverse transcription initiation: a potential target for
novel antivirals?" Virus Res 134(1-2): 4-18.
Anderson, J. L.&T. J. Hope (2003). "Recent Insights into HIV Accessory Proteins." Curr Infect
Dis Rep 5(5): 439-450.
Arien, K. K., A. Abraha, et al. (2005a). "The replicative fitness of primary human
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) group M, HIV-1 group O, and HIV-2 isolates." J
Virol 79(14): 8979-90.
Arien, K. K., R. M. Troyer, et al. (2005b). "Replicative fitness of historical and recent HIV-1
isolates suggests HIV-1 attenuation over time." AIDS 19(15): 1555-64.
Arien, K. K., G. Vanham, et al. (2007). "Is HIV-1 evolving to a less virulent form in humans?"
Nat Rev Microbiol 5(2): 141-51.
Artenstein, A. W., J. Coppola, et al. (1995a). "Multiple introductions of HIV-1 subtype E into
the western hemisphere." Lancet 346(8984): 1197-8.
Artenstein, A. W., J. H. Kim, et al. (1995b). "Isolated peripheral tuberculous lymphadenitis in
adults: current clinical and diagnostic issues." Clin Infect Dis 20(4): 876-82.
Artenstein, A. W., T. C. VanCott, et al. (1995c). "Dual infection with human immunodeficiency
virus type 1 of distinct envelope subtypes in humans." J Infect Dis 171(4): 805-10.
Bannwarth, S.&A. Gatignol (2005). "HIV-1 TAR RNA: the target of molecular interactions
between the virus and its host." Curr HIV Res 3(1): 61-71.
Barbas, C. F., 3rd, T. A. Collet, et al. (1993). "Molecular profile of an antibody response to HIV-
1 as probed by combinatorial libraries." J Mol Biol 230(3): 812-23.
Barraud, P., J. C. Paillart, et al. (2008). "Advances in the structural understanding of Vif
proteins." Curr HIV Res 6(2): 91-9.
Barre-Sinoussi, F., J. C. Chermann, et al. (1983). "Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from
a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)." Science 220(4599):
868-71.
Bartlett, J. A., R. DeMasi, et al. (1998). "Variability in repeated consecutive measurements of
plasma human immunodeficiency virus RNA in persons receiving stable nucleoside
reverse transcriptase inhibitor therapy or no treatment." J Infect Dis 178(6): 1803-5.
Battula, N.&L. A. Loeb (1976). "On the fidelity of DNA replication. Lack of
exodeoxyribonuclease activity and error-correcting function in avian myeloblastosis virus
DNA polymerase." J Biol Chem 251(4): 982-6.
133
Bebenek, K., J. C. Boyer, et al. (1999). "The base substitution fidelity of HIV-1 reverse
transcriptase on DNA and RNA templates probed with 8-oxo-deoxyguanosine
triphosphate." Mutat Res 429(2): 149-58.
Beckman, R. A.&L. A. Loeb (1993). "Multi-stage proofreading in DNA replication." Q Rev
Biophys 26(3): 225-331.
Berger, E. A. (1997). "HIV entry and tropism: the chemokine receptor connection." AIDS 11
Suppl A: S3-16.
Berger, E. A., R. W. Doms, et al. (1998). "A new classification for HIV-1." Nature 391(6664):
240.
Berkowitz, R. D.&S. P. Goff (1994). "Analysis of binding elements in the human
immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and nucleocapsid protein." Virology
202(1): 233-46.
Briz, V., E. Poveda, et al. (2008). "Impact of antiretroviral therapy on viral tropism in HIV-
infected patients followed longitudinally for over 5 years." J Antimicrob Chemother
61(2): 405-10.
Brodine, S. K., J. R. Mascola, et al. (1995). "Detection of diverse HIV-1 genetic subtypes in the
USA." Lancet 346(8984): 1198-9.
Brumme, Z. L., J. Goodrich, et al. (2005a). "Molecular and clinical epidemiology of CXCR4-
using HIV-1 in a large population of antiretroviral-naive individuals." J Infect Dis 192(3):
466-74.
Brumme, Z. L., B. M. Henrick, et al. (2005b). "Short communication. Association of the
CCR5delta32 mutation with clinical response and >5-year survival following initiation of
first triple antiretroviral regimen." Antivir Ther 10(7): 849-53.
Brun-Vezinet, F.&F. Simon (1990). "[Classification of retroviruses]." Rev Prat 40(23): 2116-9.
Buonocore, L., T. G. Turi, et al. (1994). "Stimulation of heterologous protein degradation by the
Vpu protein of HIV-1 requires the transmembrane and cytoplasmic domains of CD4."
Virology 204(1): 482-6.
Butera, S. T. (1993). "Cytokine involvement in viral permissiveness and the progression of HIV
disease." J Cell Biochem 53(4): 336-42.
Butera, S. T., B. D. Roberts, et al. (1994). "Human immunodeficiency virus type 1 RNA
expression by four chronically infected cell lines indicates multiple mechanisms of
latency." J Virol 68(4): 2726-30.
134
Cariello, N. F., J. A. Swenberg, et al. (1991). "Fidelity of Thermococcus litoralis DNA
polymerase (Vent) in PCR determined by denaturing gradient gel electrophoresis."
Nucleic Acids Res 19(15): 4193-8.
Carrington, M., G. Nelson, et al. (2001). "Considering genetic profiles in functional studies of
immune responsiveness to HIV-1." Immunol Lett 79(1-2): 131-40.
Carter, J.&V. Saunders (2007). "Virology: principles and applications. Book Review." Wiley 1
edition: 382 pages.
Chakrabarti, L., M. Guyader, et al. (1987). "Sequence of simian immunodeficiency virus from
macaque and its relationship to other human and simian retroviruses." Nature 328(6130):
543-7.
Chakrabarti, S., T. Mizukami, et al. (1990). "Synthesis, oligomerization, and biological activity
of the human immunodeficiency virus type 2 envelope glycoprotein expressed by a
recombinant vaccinia virus." Virology 178(1): 134-42.
Chandler, R.&S. S. Hughes (1996). "AIDS history San Francisco: archival documentation and
oral history." Watermark (Arch Libr Hist Health Sci) 19(4): 113-5.
Chao, L. (1990). "Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet." Nature 348(6300): 454-5.
Chatterjee, S., S. Basak, et al. (1992). "Morphogenesis of human immunodeficiency virus type
1." Pathobiology 60(4): 181-6.
Chen, R., H. Wang, et al. (2002). "Roles of uracil-DNA glycosylase and dUTPase in virus
replication." J Gen Virol 83(Pt 10): 2339-45.
Cheng-Mayer, C., D. Seto, et al. (1988). "Biologic features of HIV-1 that correlate with
virulence in the host." Science 240(4848): 80-2.
Cheng-Mayer, C., P. Iannello, et al. (1989). "Differential effects of nef on HIV replication:
implications for viral pathogenesis in the host." Science 246(4937): 1629-32.
Cheng-Mayer, C., M. Quiroga, et al. (1990). "Viral determinants of human immunodeficiency
virus type 1 T-cell or macrophage tropism, cytopathogenicity, and CD4 antigen
modulation." J Virol 64(9): 4390-8.
Cheng-Mayer, C., D. Seto, et al. (1991). "Altered host range of HIV-1 after passage through
various human cell types." Virology 181(1): 288-94.
Cheng-Mayer, C., R. Liu, et al. (1997). "Macrophage tropism of human immunodeficiency virus
type 1 and utilization of the CC-CKR5 coreceptor." J Virol 71(2): 1657-61.
135
Chunlin, L.&H. P. Erickson (1997). "Expression inEscherichia coliof the Thermostable DNA
Polymerase fromPyrococcus furiosus " Protein Expression and Purification 11(2): 179-
184.
Cicala, C., J. Arthos, et al. (2006). "R5 and X4 HIV envelopes induce distinct gene expression
profiles in primary peripheral blood mononuclear cells." Proc Natl Acad Sci U S A
103(10): 3746-51.
Clapham, P. R. (1997). "HIV and chemokines: ligands sharing cell-surface receptors." Trends
Cell Biol 7(7): 264-8.
Clapham, P. R.&R. A. Weiss (1997). "Immunodeficiency viruses. Spoilt for choice of co-
receptors." Nature 388(6639): 230-1.
Clarke, D. K., E. A. Duarte, et al. (1993). "Genetic bottlenecks and population passages cause
profound fitness differences in RNA viruses." J Virol 67(1): 222-8.
Clavel, F., M. Guyader, et al. (1986). "Molecular cloning and polymorphism of the human
immune deficiency virus type 2." Nature 324(6098): 691-5.
Clavel, F.&A. J. Hance (2004). "HIV drug resistance." N Engl J Med 350(10): 1023-35.
Coakley, E., C. J. Petropoulos, et al. (2005). "Assessing chemokine co-receptor usage in HIV."
Curr Opin Infect Dis 18(1): 9-15.
Cocchi, F., A. L. DeVico, et al. (1995). "Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1
beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells." Science
270(5243): 1811-5.
Cocchi, F., A. L. DeVico, et al. (1996a). "The V3 domain of the HIV-1 gp120 envelope
glycoprotein is critical for chemokine-mediated blockade of infection." Nat Med 2(11):
1244-7.
Cocchi, F., A. L. Devico, et al. (1996b). "Response: Role of beta-Chemokines in Suppressing
HIV Replication." Science 274(5291): 1394-1395.
Coffin, J. M. (1986). "Genetic variation in AIDS viruses." Cell 46(1): 1-4.
Coffin, J. M. (1992). "Genetic diversity and evolution of retroviruses." Curr Top Microbiol
Immunol 176: 143-64.
Coffin, J. M. (1995). "HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation,
pathogenesis, and therapy." Science 267(5197): 483-9.
Coffin, J. M.&W. A. Haseltine (1977). "Terminal redundancy and the origin of replication of
Rous sarcoma virus RNA." Proc Natl Acad Sci U S A 74(5): 1908-12.
136
Cohen, J. (2008a). "HIV/AIDS. Botswana's success comes at steep cost." Science 321(5888):
526-9.
Cohen, J. (2008b). "Virology. HIV gets by with a lot of help from human host." Science
319(5860): 143-4.
Connor, R. I., H. Mohri, et al. (1993a). "Increased viral burden and cytopathicity correlate
temporally with CD4+ T-lymphocyte decline and clinical progression in human
immunodeficiency virus type 1-infected individuals." J Virol 67(4): 1772-7.
Connor, R. I., D. W. Notermans, et al. (1993b). "Biological cloning of functionally diverse
quasispecies of HIV-1." AIDS Res Hum Retroviruses 9(6): 541-6.
Connor, R. I., K. E. Sheridan, et al. (1997). "Change in coreceptor use coreceptor use correlates
with disease progression in HIV-1--infected individuals." J Exp Med 185(4): 621-8.
de Leys, R., B. Vanderborght, et al. (1990). "Isolation and partial characterization of an unusual
human immunodeficiency retrovirus from two persons of west-central African origin." J
Virol 64(3): 1207-16.
de Mendoza, C., C. Rodriguez, et al. (2007). "Prevalence of X4 tropic viruses in patients recently
infected with HIV-1 and lack of association with transmission of drug resistance." J
Antimicrob Chemother 59(4): 698-704.
de Mendoza, C., K. Van Baelen, et al. (2008). "Performance of a population-based HIV-1
tropism phenotypic assay and correlation with V3 genotypic prediction tools in recent
HIV-1 seroconverters." J Acquir Immune Defic Syndr 48(3): 241-4.
de Sa-Filho, D. J., M. Da Silva Soares, et al. (2008). "HIV Type 1 pol Gene Diversity and
Antiretroviral Drug Resistance Mutations in Santos, Brazil." AIDS Res Hum
Retroviruses.
de Sa-Filho, D. J., M. C. Sucupira, et al. (2006). "Identification of two HIV type 1 circulating
recombinant forms in Brazil." AIDS Res Hum Retroviruses 22(1): 1-13.
Deng, H., R. Liu, et al. (1996). "Identification of a major co-receptor for primary isolates of
HIV-1." Nature 381(6584): 661-6.
Delwart, E. L., H. W. Sheppard, et al. (1994). "Human immunodeficiency virus type 1 evolution
in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility assays." J Virol 68(10): 6672-83.
Ditzel, H. J., P. W. Parren, et al. (1997). "Mapping the protein surface of human
immunodeficiency virus type 1 gp120 using human monoclonal antibodies from phage
display libraries." J Mol Biol 267(3): 684-95.
137
Doherty, T., M. Chopra, et al. (2006). "Effect of the HIV epidemic on infant feeding in South
Africa: "When they see me coming with the tins they laugh at me"." Bull World Health
Organ 84(2): 90-6.
Domingo, E. (1997). "Rapid evolution of viral RNA genomes." J Nutr 127(5 Suppl): 958S-961S.
Domingo, E., E. Baranowski, et al. (1998a). "Quasispecies structure and persistence of RNA
viruses." Emerg Infect Dis 4(4): 521-7.
Domingo, E., C. Escarmis, et al. (2005a). "Quasispecies dynamics and RNA virus extinction."
Virus Res 107(2): 129-39.
Domingo, E., C. Escarmis, et al. (1998b). "Population dynamics in the evolution of RNA
viruses." Adv Exp Med Biol 440: 721-7.
Domingo, E., C. Escarmis, et al. (1996). "Basic concepts in RNA virus evolution." FASEB J
10(8): 859-64.
Domingo, E., C. Gonzalez-Lopez, et al. (2005b). "Population dynamics of RNA viruses: the
essential contribution of mutant spectra." Arch Virol Suppl(19): 59-71.
Domingo, E.&J. J. Holland (1997). "RNA virus mutations and fitness for survival." Annu Rev
Microbiol 51: 151-78.
Domingo, E., A. Mas, et al. (2001). "Virus population dynamics, fitness variations and the
control of viral disease: an update." Prog Drug Res 57: 77-115.
Domingo, E., L. Menendez-Arias, et al. (1997). "RNA virus fitness." Rev Med Virol 7(2): 87-96.
Domingo, E., D. Sabo, et al. (1978). "Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage
population." Cell 13(4): 735-44.
Doms, R. W.&S. C. Peiper (1997). "Unwelcomed guests with master keys: how HIV uses
chemokine receptors for cellular entry." Virology 235(2): 179-90.
Dougherty, J. P.&H. M. Temin (1988). "Determination of the rate of base-pair substitution and
insertion mutations in retrovirus replication." J Virol 62(8): 2817-22.
Douek, D. C., L. J. Picker, et al. (2003). "T cell dynamics in HIV-1 infection." Annu Rev
Immunol 21: 265-304.
Dourado, I., C. A. Milroy, et al. (2007). "HIV-1 seroprevalence in the general population of
Salvador, Bahia State, Northeast Brazil." Cad Saude Publica 23(1): 25-32.
Dourado, I., M. A. Veras, et al. (2006). "[AIDS epidemic trends after the introduction of
antiretroviral therapy in Brazil]." Rev Saude Publica 40 Suppl: 9-17.
138
Drake, J. W. (1993). "Rates of spontaneous mutation among RNA viruses." Proc Natl Acad Sci
U S A 90(9): 4171-5.
Drake, J. W. (1999). "The distribution of rates of spontaneous mutation over viruses,
prokaryotes, and eukaryotes." Ann N Y Acad Sci 870: 100-7.
Drake, J. W., B. Charlesworth, et al. (1998). "Rates of spontaneous mutation." Genetics 148(4):
1667-86.
Duarte, E., D. Clarke, et al. (1992). "Rapid fitness losses in mammalian RNA virus clones due to
Muller's ratchet." Proc Natl Acad Sci U S A 89(13): 6015-9.
Edinger, A. L., A. Amedee, et al. (1997). "Differential utilization of CCR5 by macrophage and T
cell tropic simian immunodeficiency virus strains." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8):
4005-10.
Ehrlich, L. S., B. E. Agresta, et al. (1992). "Assembly of recombinant human immunodeficiency
virus type 1 capsid protein in vitro." J Virol 66(8): 4874-83.
Eigen, M. (1971a). "Molecular self-organization and the early stages of evolution." Q Rev
Biophys 4(2): 149-212.
Eigen, M. (1971b). "Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules."
Naturwissenschaften 58(10): 465-523.
Eigen, M. (1993). "Viral quasispecies." Sci Am 269(1): 42-9.
Eigen, M. (2002). "Error catastrophe and antiviral strategy." Proc Natl Acad Sci U S A 99(21):
13374-6.
Escarmis, C., M. Davila, et al. (1996). "Genetic lesions associated with Muller's ratchet in an
RNA virus." J Mol Biol 264(2): 255-67.
Escarmis, C., G. Gomez-Mariano, et al. (2002). "Resistance to extinction of low fitness virus
subjected to plaque-to-plaque transfers: diversification by mutation clustering." J Mol
Biol 315(4): 647-61.
Esparza, J., S. Osmanov, et al. (1991). "Planning for HIV vaccine trials: the World Health
Organization perspective." AIDS 5 Suppl 2: S159-63.
Fatkenheuer, G., M. Nelson, et al. (2008). "Subgroup analyses of maraviroc in previously treated
R5 HIV-1 infection." N Engl J Med 359(14): 1442-55.
Fauci, A., J. G. Bartlett, et al. (1998). "Early treatment of HIV-1 infection." Lancet 352(9144):
1935; author reply 1936.
139
Fauci, A. S. (1996). "Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease." Nature
384(6609): 529-34.
Fauci, A. S. (2007). "Pathogenesis of HIV disease: opportunities for new prevention
interventions." Clin Infect Dis 45 Suppl 4: S206-12.
Fenyo, E. M., L. Morfeldt-Manson, et al. (1988). "Distinct replicative and cytopathic
characteristics of human immunodeficiency virus isolates." J Virol 62(11): 4414-9.
Frankel, A. D.&J. A. Young (1998). "HIV-1: fifteen proteins and an RNA." Annu Rev Biochem
67: 1-25.
Freed, E. O. (1998). "HIV-1 gag proteins: diverse functions in the virus life cycle." Virology
251(1): 1-15.
Friedrich, R.&K. Moelling (1979). "Effect of viral RNase H on the avian sarcoma viral genome
during early transcription in vitro." J Virol 31(3): 630-8.
Fujiwara, T.&K. Mizuuchi (1988). "Retroviral DNA integration: structure of an integration
intermediate." Cell 54(4): 497-504.
Gallo, R. C. (2002). "Human retroviruses after 20 years: a perspective from the past and
prospects for their future control." Immunol Rev 185: 236-65.
Gallo, R. C.&L. Montagnier (2003). "The discovery of HIV as the cause of AIDS." N Engl J
Med 349(24): 2283-5.
Gallo, R. C., S. Z. Salahuddin, et al. (1984). "Frequent detection and isolation of cytopathic
retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS." Science
224(4648): 500-3.
Gandhi, R., J. Bartlett, et al. ( 1999 ). "Life Cycle of HIV Infection." Johns Hopkins University.
Division of Infectious Diseases and aids Service. Disponível em http://www.hopkins-
aids.edu/hiv_lifecyle/hivcyle_text.html. Acesso em 13/03/08.
Gardner, M. B. (1993). "The importance of nonhuman primate research in the battle against
AIDS: a historical perspective." J Med Primatol 22(2-3): 86-91.
Gardner, M. B. (2003). "Simian AIDS: an historical perspective." J Med Primatol 32(4-5): 180-
6.
Geijtenbeek, T. B., D. S. Kwon, et al. (2000). "DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-
binding protein that enhances trans-infection of T cells." Cell 100(5): 587-97.
Geisbert, T. W.&P. B. Jahrling (2004). "Exotic emerging viral diseases: progress and
challenges." Nat Med 10(12 Suppl): S110-21.
140
Gelderblom, H. R. (1991). "Assembly and morphology of HIV: potential effect of structure on
viral function." AIDS 5(6): 617-37.
Geyer, M., O. T. Fackler, et al. (2001). "Structure--function relationships in HIV-1 Nef." EMBO
Rep 2(7): 580-5.
Gilboa, E., S. W. Mitra, et al. (1979). "A detailed model of reverse transcription and tests of
crucial aspects." Cell 18(1): 93-100.
Gojobori, T.&S. Yokoyama (1985). "Rates of evolution of the retroviral oncogene of Moloney
murine sarcoma virus and of its cellular homologues." Proc Natl Acad Sci U S A 82(12):
4198-201.
Goldsmith, M. A., M. T. Warmerdam, et al. (1995). "Dissociation of the CD4 downregulation
and viral infectivity enhancement functions of human immunodeficiency virus type 1
Nef." J Virol 69(7): 4112-21.
Gonda, M. A., F. Wong-Staal, et al. (1985). "Sequence homology and morphologic similarity of
HTLV-III and visna virus, a pathogenic lentivirus." Science 227(4683): 173-7.
Gorry, P. R., J. Sterjovski, et al. (2004). "The role of viral coreceptors and enhanced macrophage
tropism in human immunodeficiency virus type 1 disease progression." Sex Health 1(1):
23-34.
Gottlieb, M. S., R. Schroff, et al. (1981). "Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal
candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular
immunodeficiency." N Engl J Med 305(24): 1425-31.
Grandgenett, D. P., G. F. Gerard, et al. (1972). "Ribonuclease H: a ubiquitous activity in virions
of ribonucleic acid tumor viruses." J Virol 10(6): 1136-42.
Greene, W. C. (1990). "Regulation of HIV-1 gene expression." Annu Rev Immunol 8: 453-75.
Guadalupe, M., E. Reay, et al. (2003). "Severe CD4+ T-cell depletion in gut lymphoid tissue
during primary human immunodeficiency virus type 1 infection and substantial delay in
restoration following highly active antiretroviral therapy." J Virol 77(21): 11708-17.
Gulick, R. M., J. Lalezari, et al. (2008). "Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-
1 infection." N Engl J Med 359(14): 1429-41.
Guyader, M., M. Emerman, et al. (1987). "Genome organization and transactivation of the
human immunodeficiency virus type 2." Nature 326(6114): 662-9.
Haseltine, W. A. (1991). "Molecular biology of the human immunodeficiency virus type 1."
FASEB J 5(10): 2349-60.
141
He, Z., W. Zhang, et al. (2008). "Characterization of conserved motifs in HIV-1 Vif required for
APOBEC3G and APOBEC3F interaction." J Mol Biol 381(4): 1000-11.
Hill, M., G. Tachedjian, et al. (2005). "The packaging and maturation of the HIV-1 Pol
proteins." Curr HIV Res 3(1): 73-85.
Hillis, D. M. (2000). "AIDS. Origins of HIV." Science 288(5472): 1757-9.
Hirsch, V. M., G. A. Dapolito, et al. (1993). "A distinct African lentivirus from Sykes'
monkeys." J Virol 67(3): 1517-28.
HIV Sequence Database. (2008). " The Circulating Recombinant Forms (CRFs). Los Alamos,
New Mexico. Disponível em
http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html. Acesso em 09/09/2008.
Holland, J. J., E. Domingo, et al. (1990). "Mutation frequencies at defined single codon sites in
vesicular stomatitis virus and poliovirus can be increased only slightly by chemical
mutagenesis." J Virol 64(8): 3960-2.
Holland, J. J., J. C. De La Torre, et al. (1992). "RNA virus populations as quasispecies." Curr
Top Microbiol Immunol 176: 1-20.
Hornak, V., A. Okur, et al. (2006). "HIV-1 protease flaps spontaneously close to the correct
structure in simulations following manual placement of an inhibitor into the open state." J
Am Chem Soc 128(9): 2812-3.
Hurwitz, J. L., X. Zhan, et al. (2008). "HIV-1 vaccine development: tackling virus diversity with
a multi-envelope cocktail." Front Biosci 13: 609-20.
Inubushi, R., M. Tamaki, et al. (1998). "Functional roles of HIV accessory proteins for viral
replication (review)." Int J Mol Med 2(4): 429-33.
Isada, C. M.&L. H. Calabrese (1999). "AIDS update 1999: viral reservoirs and immune-based
therapies." Cleve Clin J Med 66(5): 267-9.
Janini, M., M. Rogers, et al. (2001). "Human immunodeficiency virus type 1 DNA sequences
genetically damaged by hypermutation are often abundant in patient peripheral blood
mononuclear cells and may be generated during near-simultaneous infection and
activation of CD4(+) T cells." J Virol 75(17): 7973-86.
Janvier, K., C. Petit, et al. (2000). "HIV auxiliary proteins: an interface between the virus and the
host." AIDS 14 Suppl 3: S21-30.
Jeffs, S. A., S. Goriup, et al. (2006). "Comparative analysis of HIV-1 recombinant envelope
glycoproteins from different culture systems." Appl Microbiol Biotechnol 72(2): 279-90.
142
Julias, J. G.&V. K. Pathak (1998). "Deoxyribonucleoside triphosphate pool imbalances in vivo
are associated with an increased retroviral mutation rate." J Virol 72(10): 7941-9.
Junghans, R. P., S. Hu, et al. (1977). "Heteroduplex analysis of avian RNA tumor viruses." Proc
Natl Acad Sci U S A 74(2): 477-81.
Karlsson, A. C., H. Gaines, et al. (1999). "Reappearance of founder virus sequence in human
immunodeficiency virus type 1-infected patients." J Virol 73(7): 6191-6.
Karlsson, A. C., S. Lindback, et al. (1998). "Characterization of the viral population during
primary HIV-1 infection." AIDS 12(8): 839-47.
Kewal, R.&J. M. Coffin (2003). "Virology. Weapons of mutational destruction." Science
301(5635): 923-5.
Kim, T., R. A. Mudry, Jr., et al. (1996). "Retroviral mutation rates and A-to-G hypermutations
during different stages of retroviral replication." J Virol 70(11): 7594-602.
King, J.&J. A. Aberg (2008). "Clinical impact of patient population differences and genomic
variation in efavirenz therapy." AIDS 22(14): 1709-17.
Kondrashov, A. S. (1994). "Muller's ratchet under epistatic selection." Genetics 136(4): 1469-73.
Koot, M., I. P. Keet, et al. (1993). "Prognostic value of HIV-1 syncytium-inducing phenotype for
rate of CD4+ cell depletion and progression to AIDS." Ann Intern Med 118(9): 681-8.
Korber, B., M. Muldoon, et al. (2000). "Timing the ancestor of the HIV-1 pandemic strains."
Science 288(5472): 1789-96.
Kok, T., P. Li, et al. (1993). "Cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus
infection induces two distinct phases of viral RNA expression under separate regulatory
control." J Gen Virol 74 ( Pt 1): 33-8.
Kremer, M.&B. S. Schnierle (2005). "HIV-1 Vif: HIV's weapon against the cellular defense
factor APOBEC3G." Curr HIV Res 3(4): 339-44.
Landovitz, R. J., J. B. Angel, et al. (2008). "Phase II study of vicriviroc versus efavirenz (both
with zidovudine/lamivudine) in treatment-naive subjects with HIV-1 infection." J Infect
Dis 198(8): 1113-22.
Layten, M., V. Hornak, et al. (2006). "The open structure of a multi-drug-resistant HIV-1
protease is stabilized by crystal packing contacts." J Am Chem Soc 128(41): 13360-1.
Le Rouzic, E.&S. Benichou (2005). "The Vpr protein from HIV-1: distinct roles along the viral
life cycle." Retrovirology 2: 11.
143
Lehmann-Che, J.&A. Saib (2004). "Early stages of HIV replication: how to hijack cellular
functions for a successful infection." AIDS Rev 6(4): 199-207.
Lerner, D. L., P. C. Wagaman, et al. (1995). "Increased mutation frequency of feline
immunodeficiency virus lacking functional deoxyuridine-triphosphatase." Proc Natl Acad
Sci U S A 92(16): 7480-4.
Lesnik, E. A., R. Sampath, et al. (2002). "Rev response elements (RRE) in lentiviruses: an
RNAMotif algorithm-based strategy for RRE prediction." Med Res Rev 22(6): 617-36.
Levy, J. A. (1993). "Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection." Microbiol Rev
57(1): 183-289.
Levy, J. A. (1998). "Caution: should we be treating HIV infection early?" Lancet 352(9132):
982-3.
Levy, J. A. (2006). "HIV pathogenesis: knowledge gained after two decades of research." Adv
Dent Res 19(1): 10-6.
Levy, J. A., A. D. Hoffman, et al. (1984). "Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San
Francisco patients with AIDS." Science 225(4664): 840-2.
Levy, J. P. (1998). "AIDS vaccine development." Science 280(5365): 806-7.
Li, Y., H. Hui, et al. (1992). "Complete nucleotide sequence, genome organization, and
biological properties of human immunodeficiency virus type 1 in vivo: evidence for
limited defectiveness and complementation." J Virol 66(11): 6587-600.
Little, S. J., S. D. Frost, et al. (2008). "The Persistence of Transmitted Drug Resistance among
Subjects with Primary HIV Infection." J Virol.
Loeb, L. A., J. M. Essigmann, et al. (1999). "Lethal mutagenesis of HIV with mutagenic
nucleoside analogs." Proc Natl Acad Sci U S A 96(4): 1492-7.
Luban, J., K. B. Alin, et al. (1992). "Genetic assay for multimerization of retroviral gag
polyproteins." J Virol 66(8): 5157-60.
Lucas, S. (1993). "Human immunodeficiency virus and leprosy." Lepr Rev 64(2): 97-103.
Lucas, S. B. (1993). "HIV and the necropsy." J Clin Pathol 46(12): 1071-5.
Lucas, S. B., A. Hounnou, et al. (1993). "The mortality and pathology of HIV infection in a west
African city." AIDS 7(12): 1569-79.
Lundberg, K. S., D. D. Shoemaker, et al. (1991). "High-fidelity amplification using a
thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus." Gene 108(1): 1-6.
144
Malim, M. H.&M. Emerman (2008). "HIV-1 accessory proteins--ensuring viral survival in a
hostile environment." Cell Host Microbe 3(6): 388-98.
Manrubia, S. C., C. Escarmis, et al. (2005). "High mutation rates, bottlenecks, and robustness of
RNA viral quasispecies." Gene 347(2): 273-82.
Mansky, L. M. (2000). "In vivo analysis of human T-cell leukemia virus type 1 reverse
transcription accuracy." J Virol 74(20): 9525-31.
Mansky, L. M.&H. M. Temin (1994). "Lower mutation rate of bovine leukemia virus relative to
that of spleen necrosis virus." J Virol 68(1): 494-9.
Mansky, L. M.&H. M. Temin (1995). "Lower in vivo mutation rate of human immunodeficiency
virus type 1 than that predicted from the fidelity of purified reverse transcriptase." J Virol
69(8): 5087-94.
Masur, H., M. A. Michelis, et al. (1981). "An outbreak of community-acquired Pneumocystis
carinii pneumonia: initial manifestation of cellular immune dysfunction." N Engl J Med
305(24): 1431-8.
McCutchan, F. E. (2006). "Global epidemiology of HIV." J Med Virol 78 Suppl 1: S7-S12.
McCutchan, F. E., J. L. Sankale, et al. (2004). "HIV type 1 circulating recombinant form
CRF09_cpx from west Africa combines subtypes A, F, G, and may share ancestors with
CRF02_AG and Z321." AIDS Res Hum Retroviruses 20(8): 819-26.
Melby, T., R. Demasi, et al. (2007). "Evolution of genotypic and phenotypic resistance during
chronic treatment with the fusion inhibitor T-1249." AIDS Res Hum Retroviruses 23(11):
1366-73.
Menendez-Arias, L. (2002). "Molecular basis of fidelity of DNA synthesis and nucleotide
specificity of retroviral reverse transcriptases." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 71: 91-
147.
Menendez-Arias, L.&B. Berkhout (2008). "Retroviral reverse transcription." Virus Res 134(1-2):
1-3.
Miceli, M., M. Giuliani, et al. (2002). "Residual risk of HIV-1 transmission: the case of a
seroconverter." Clin Lab 48(5-6): 283-6.
Milich, L., B. Margolin, et al. (1993). "V3 loop of the human immunodeficiency virus type 1
Env protein: interpreting sequence variability." J Virol 67(9): 5623-34.
Montagnier, L. (2002). "Historical essay. A history of HIV discovery." Science 298(5599):
1727-8.
145
Moore, J. P. (1997). "Coreceptors: implications for HIV pathogenesis and therapy." Science
276(5309): 51-2.
Moore, J. P.&D. F. Blanc (1991). "Immunological incompetence in AIDS." AIDS 5(4): 455-6.
Moore, J. P., S. G. Kitchen, et al. (2004). "The CCR5 and CXCR4 coreceptors--central to
understanding the transmission and pathogenesis of human immunodeficiency virus type
1 infection." AIDS Res Hum Retroviruses 20(1): 111-26.
Moore, J. P., J. A. McKeating, et al. (1990a). "Dissociation of gp120 from HIV-1 virions
induced by soluble CD4." Science 250(4984): 1139-42.
Moore, J. P., Y. Morikawa, et al. (1991). "Binding of recombinant HIV-1 and HIV-2 SU
glycoproteins to sCD4." J Acquir Immune Defic Syndr 4(4): 442-3.
Moore, J. P.&P. L. Nara (1991). "The role of the V3 loop of gp120 in HIV infection." AIDS 5
Suppl 2: S21-33.
Moore, J. P., P. W. Parren, et al. (2001). "Genetic subtypes, humoral immunity, and human
immunodeficiency virus type 1 vaccine development." J Virol 75(13): 5721-9.
Moore, J. P., Q. J. Sattentau, et al. (1990b). "Enhancement of soluble CD4-mediated HIV
neutralization and gp 120 binding by CD4 autoantibodies and monoclonal antibodies."
AIDS Res Hum Retroviruses 6(11): 1273-9.
Moore, J. P., A. Trkola, et al. (1997). "Co-receptors for HIV-1 entry." Curr Opin Immunol 9(4):
551-62.
Moriyama, E. N., Y. Ina, et al. (1991). "Mutation pattern of human immunodeficiency virus
gene." J Mol Evol 32(5): 360-3.
Morikawa, Y.&N. Tsurutani (2007). "Assembly and maturation of HIV particle." Tanpakushitsu
Kakusan Koso 52(10 Suppl): 1181-6.
MS (2007). "Boletim Epidemiológico. Programa Nacional de DST/AIDS. Ministério da Saúde.
Disponível em www.aids.gov.br. Acesso em 21/05/2008."
Muller, H. J. (1964). "The Relation of Recombination to Mutational Advance." Mutat Res 106:
2-9.
Mulky, A.&J. C. Kappes (2005). "Analysis of human immunodeficiency virus type 1 reverse
transcriptase subunit structure/function in the context of infectious virions and human
target cells." Antimicrob Agents Chemother 49(9): 3762-9.
146
Mulky, A., S. G. Sarafianos, et al. (2005). "Identification of amino acid residues in the human
immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase tryptophan-repeat motif that are
required for subunit interaction using infectious virions." J Mol Biol 349(4): 673-84.
Mulky, A., B. C. Vu, et al. (2007). "Analysis of amino acids in the beta7-beta8 loop of human
immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase for their role in virus replication." J
Mol Biol 365(5): 1368-78.
Nandi, J.&K. Banerjee (1993). "Alternative mode of replication of human immunodeficiency
virus: a hypothesis." Med Hypotheses 40(1): 1-7.
Neamati, N. (2001). "Structure-based HIV-1 integrase inhibitor design: a future perspective."
Expert Opin Investig Drugs 10(2): 281-96.
NIH (2008). "National Institutes of Health. National Library of Medicine. Disponível em
http://www.nlm.nih.gov/. Acesso em 15/09/2008."
Novella, I. S.&B. E. Ebendick-Corpus (2004). "Molecular basis of fitness loss and fitness
recovery in vesicular stomatitis virus." J Mol Biol 342(5): 1423-30.
Nowak, M. A., R. M. Anderson, et al. (1991). "Antigenic diversity thresholds and the
development of AIDS." Science 254(5034): 963-9.
Nowak, M. A.&R. M. May (1991). "Mathematical biology of HIV infections: antigenic variation
and diversity threshold." Math Biosci 106(1): 1-21.
O'Brien, S. J.&J. P. Moore (2000). "The effect of genetic variation in chemokines and their
receptors on HIV transmission and progression to AIDS." Immunol Rev 177: 99-111.
O'Neil, P. K., G. Sun, et al. (2002). "Mutational analysis of HIV-1 long terminal repeats to
explore the relative contribution of reverse transcriptase and RNA polymerase II to viral
mutagenesis." J Biol Chem 277(41): 38053-61.
Olsen, J. C.&K. F. Watson (1982). "Reverse transcription of avian myeloblastosis virus 35S
RNA. Early synthesis of plus strand DNA of discrete size in reconstructed reactions."
Nucleic Acids Res 10(3): 1009-27.
Omer, C. A., R. Resnick, et al. (1984). "Evidence for involvement of an RNA primer in initiation
of strong-stop plus DNA synthesis during reverse transcription in vitro." J Virol 50(2):
465-70.
Pang, S., Y. Shlesinger, et al. (1992). "Rapid generation of sequence variation during primary
HIV-1 infection." AIDS 6(5): 453-60.
Pereira, L. A., K. Bentley, et al. (2000). "A compilation of cellular transcription factor
interactions with the HIV-1 LTR promoter." Nucleic Acids Res 28(3): 663-8.
147
Perlman, S.&A. A. Dandekar (2005). "Immunopathogenesis of coronavirus infections:
implications for SARS." Nat Rev Immunol 5(12): 917-27.
Ping, L. H., J. A. Nelson, et al. (1999). "Characterization of V3 sequence heterogeneity in
subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates from Malawi:
underrepresentation of X4 variants." J Virol 73(8): 6271-81.
Piribauer, F.&W. Duer (1998). "Trends in HIV seroprevalence, AIDS and prevention policy
among intravenous drug users and men who have sex with men, before and after 1990 in
Austria." Eur J Epidemiol 14(7): 635-43.
Poiesz, B. J., F. W. Ruscetti, et al. (1980). "Detection and isolation of type C retrovirus particles
from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma." Proc
Natl Acad Sci U S A 77(12): 7415-9.
Poveda, E., V. Briz, et al. (2007a). "Prevalence of X4 tropic HIV-1 variants in patients with
differences in disease stage and exposure to antiretroviral therapy." J Med Virol 79(8):
1040-6.
Poveda, E., V. Briz, et al. (2007b). "Correlation between a phenotypic assay and three
bioinformatic tools for determining HIV co-receptor use." AIDS 21(11): 1487-90.
Preston, B. D.&J. P. Dougherty (1996). "Mechanisms of retroviral mutation." Trends Microbiol
4(1): 16-21.
Preston, B. D., B. J. Poiesz, et al. (1988). "Fidelity of HIV-1 reverse transcriptase." Science
242(4882): 1168-71.
Preston, B. D., B. Singer, et al. (1986). "Mutagenic potential of O4-methylthymine in vivo
determined by an enzymatic approach to site-specific mutagenesis." Proc Natl Acad Sci
U S A 83(22): 8501-5.
Provitera, P., A. Goff, et al. (2001). "Role of the major homology region in assembly of HIV-1
Gag." Biochemistry 40(18): 5565-72.
Rambaut, A., D. Posada, et al. (2004). "The causes and consequences of HIV evolution." Nat
Rev Genet 5(1): 52-61.
Raney, A., A. Y. Shaw, et al. (2007). "Structural constraints on human immunodeficiency virus
type 1 Nef function." Virology 368(1): 7-16.
Reicin, A. S., A. Ohagen, et al. (1996). "The role of Gag in human immunodeficiency virus type
1 virion morphogenesis and early steps of the viral life cycle." J Virol 70(12): 8645-52.
Requejo, H. I. (2006). "Worldwide molecular epidemiology of HIV." Rev Saude Publica 40(2):
331-45.
148
Resnick, R., C. A. Omer, et al. (1984). "Involvement of retrovirus reverse transcriptase-
associated RNase H in the initiation of strong-stop (+) DNA synthesis and the generation
of the long terminal repeat." J Virol 51(3): 813-21.
Richter, S. N.&G. Palu (2006). "Inhibitors of HIV-1 Tat-mediated transactivation." Curr Med
Chem 13(11): 1305-15.
Ritola, K., C. D. Pilcher, et al. (2004). "Multiple V1/V2 env variants are frequently present
during primary infection with human immunodeficiency virus type 1." J Virol 78(20):
11208-18.
Roberts, J. D., K. Bebenek, et al. (1988). "The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1."
Science 242(4882): 1171-3.
Robertson, D. L., J. P. Anderson, et al. (2000). "HIV-1 nomenclature proposal." Science
288(5463): 55-6.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.H. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd
Edition. Cold Spring Habour Laboratory Press, New York. 1989.
Sanabani, S., W. Kleine Neto, et al. (2006). "Analysis of the near full length genomes of HIV-1
subtypes B, F and BF recombinant from a cohort of 14 patients in Sao Paulo, Brazil."
Infect Genet Evol 6(5): 368-77.
Schuitemaker, H., M. Koot, et al. (1992). "Biological phenotype of human immunodeficiency
virus type 1 clones at different stages of infection: progression of disease is associated
with a shift from monocytotropic to T-cell-tropic virus population." J Virol 66(3): 1354-
60.
Semenova, E. A., C. Marchand, et al. (2008). "HIV-1 integrase inhibitors: update and
perspectives." Adv Pharmacol 56: 199-228.
Shankarappa, R., J. B. Margolick, et al. (1999). "Consistent viral evolutionary changes
associated with the progression of human immunodeficiency virus type 1 infection." J
Virol 73(12): 10489-502.
Sharkey, M., K. Triques, et al. (2005). "In vivo evidence for instability of episomal human
immunodeficiency virus type 1 cDNA." J Virol 79(8): 5203-10.
Sharkey, M. E.&M. Stevenson (2001). "Two long terminal repeat circles and persistent HIV-1
replication." Curr Opin Infect Dis 14(1): 5-11.
Sheehy, A. M., N. C. Gaddis, et al. (2002). "Isolation of a human gene that inhibits HIV-1
infection and is suppressed by the viral Vif protein." Nature 418(6898): 646-50.
149
Shehu-Xhilaga, M., M. Hill, et al. (2002). "The conformation of the mature dimeric human
immunodeficiency virus type 1 RNA genome requires packaging of pol protein." J Virol
76(9): 4331-40.
Sierra, S., B. Kupfer, et al. (2005). "Basics of the virology of HIV-1 and its replication." J Clin
Virol 34(4): 233-44.
Silva, A. C.&A. A. Barone (2006). "[Risk factors for HIV infection among patients infected with
hepatitis C virus]." Rev Saude Publica 40(3): 482-8.
Simmonds, P., P. Balfe, et al. (1990). "Human immunodeficiency virus-infected individuals
contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low copy
numbers." J Virol 64(2): 864-72.
Sinha, N. K.&M. D. Haimes (1981). "Molecular mechanisms of substitution mutagenesis. An
experimental test of the Watson-Crick and topal-fresco models of base mispairings." J
Biol Chem 256(20): 10671-83.
Smith, J. K., A. Cywinski, et al. (1984a). "Initiation of plus-strand DNA synthesis during reverse
transcription of an avian retrovirus genome." J Virol 49(1): 200-4.
Smith, J. K., A. Cywinski, et al. (1984b). "Specificity of initiation of plus-strand DNA by Rous
sarcoma virus." J Virol 52(2): 314-9.
Sonigo, P., M. Alizon, et al. (1985). "Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to
the AIDS virus." Cell 42(1): 369-82.
Soriano, V., A. Mocroft, et al. (2008). "Spontaneous Viral Clearance, Viral Load, and Genotype
Distribution of Hepatitis C Virus (HCV) in HIV-Infected Patients with Anti-HCV
Antibodies in Europe." J Infect Dis 198(9): 1337-1344.
Staskus, K. A., M. S. Collett, et al. (1976). "Initiation of DNA synthesis by the avian
oncornavirus RNA-directed DNA polymerase: structural and functional localization of
the major species of primer RNA on the oncornavirus genome." Virology 71(1): 162-8.
Stevenson, M. (2008). "Basic science summary." Top HIV Med 16(1): 1-5.
Stoeckli, T. C., S. MaWhinney, et al. (2002). "Phenotypic and genotypic analysis of biologically
cloned human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with
zidovudine and lamivudine." Antimicrob Agents Chemother 46(12): 4000-3.
Stoeckli, T. C., I. Steffen-Klopfstein, et al. (2000). "Molecular epidemiology of HIV-1 in
Switzerland: evidence for a silent mutation in the C2V3 region distinguishing intravenous
drug users from homosexual men. Swiss HIV Cohort Study." J Acquir Immune Defic
Syndr 23(1): 58-67.
150
Stoll, E., M. A. Billeter, et al. (1977). "Avian myeloblastosis virus RNA is terminally redundant:
implications for the mechanism of retrovirus replication." Cell 12(1): 57-72.
Svarovskaia, E. S., S. R. Cheslock, et al. (2003). "Retroviral mutation rates and reverse
transcriptase fidelity." Front Biosci 8: d117-34.
Taylor, B. S.&S. M. Hammer (2008). "The challenge of HIV-1 subtype diversity." N Engl J Med
359(18): 1965-6.
Taylor, B. S., M. E. Sobieszczyk, et al. (2008). "The challenge of HIV-1 subtype diversity." N
Engl J Med 358(15): 1590-602.
Taylor, J.&R. Ilmensee (1975.). "Site on the RNA of an avian sarcoma virus at which primer is
bound." J. Virol. 16: 553-558.
Temin, H. M. (1981). "Structure, variation and synthesis of retrovirus long terminal repeat." Cell
27(1 Pt 2): 1-3.
Temin, H. M., E. Keshet, et al. (1980). "Correlation of transient accumulation of linear
unintegrated viral DNA and transient cell killing by avian leukosis and
reticuloendotheliosis viruses." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 44 Pt 2: 773-8.
Tersmette, M., R. E. de Goede, et al. (1988). "Differential syncytium-inducing capacity of
human immunodeficiency virus isolates: frequent detection of syncytium-inducing
isolates in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related
complex." J Virol 62(6): 2026-32.
Theisen, D. M., C. Pongratz, et al. (2006). "Targeting of HIV-1 Tat traffic and function by
transduction-competent single chain antibodies." Vaccine 24(16): 3127-36.
Toth, G.&A. Borics (2006a). "Closing of the flaps of HIV-1 protease induced by substrate
binding: a model of a flap closing mechanism in retroviral aspartic proteases."
Biochemistry 45(21): 6606-14.
Toth, G.&A. Borics (2006b). "Flap opening mechanism of HIV-1 protease." J Mol Graph Model
24(6): 465-74.
UNAIDS (2008). Report on the global AIDS epidemic. Geneva, UNAIDS.
Vallejo, A., L. Gurtler, et al. (2003). "Nucleotide sequence analysis of the accessory genes of
HIV-1 group O isolates." Virus Res 91(2): 189-93.
Vallejo, A., M. Olivera, et al. (2004). "Genotypic resistance profile in treatment-experienced
HIV-infected individuals after abacavir and efavirenz salvage regimen." Antiviral Res
61(2): 129-32.
Varmus, H. (1988). "Retroviruses." Science 240(4858): 1427-35.
151
Vartanian, J. P., A. Meyerhans, et al. (1994). "G-->A hypermutation of the human
immunodeficiency virus type 1 genome: evidence for dCTP pool imbalance during
reverse transcription." Proc Natl Acad Sci U S A 91(8): 3092-6.
Vartanian, J. P., P. Sommer, et al. (2003). "Death and the retrovirus." Trends Mol Med 9(10):
409-13.
Vicenzi, E., D. S. Dimitrov, et al. (1994). "An integration-defective U5 deletion mutant of
human immunodeficiency virus type 1 reverts by eliminating additional long terminal
repeat sequences." J Virol 68(12): 7879-90.
Vicenzi, E.&G. Poli (1994). "Ultraviolet irradiation and cytokines as regulators of HIV latency
and expression." Chem Biol Interact 91(2-3): 101-9.
Vlahakis, S. R., G. D. Bren, et al. (2007). "Flying in the face of resistance: antiviral-independent
benefit of HIV protease inhibitors on T-cell survival." Clin Pharmacol Ther 82(3): 294-9.
Wain-Hobson, S., P. Sonigo, et al. (1985). "Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV." Cell
40(1): 9-17.
Wainberg, M. A.&K. T. Jeang (2008). "25 years of HIV-1 research: progress and perspectives."
BMC Med 6(1): 31.
Walker, B. D.&D. R. Burton (2008). "Toward an AIDS vaccine." Science 320(5877): 760-4.
Wang, Q., I. Barr, et al. (2008). "Evidence of a novel RNA secondary structure in the coding
region of HIV-1 pol gene." RNA.
Weiss, R. A. (1993). "How does HIV cause AIDS?" Science 260(5112): 1273-9.
Weiss, R. A. (1995). "Cofactors, coreceptors, and new retroviruses. An interview with Robin A
Weiss, PhD. Interview by Mark Mascolini." J Int Assoc Physicians AIDS Care 1(1): 6-
10.
Weiss, R. A. (2001). "Gulliver's travels in HIVland." Nature 410(6831): 963-7.
Worobey, M., M. Gemmel, et al. (2008). "Direct evidence of extensive diversity of HIV-1 in
Kinshasa by 1960." Nature 455(7213): 661-4.
Yuste, E., A. V. Borderia, et al. (2005). "Few mutations in the 5' leader region mediate fitness
recovery of debilitated human immunodeficiency type 1 viruses." J Virol 79(9): 5421-7.
Yuste, E., C. Lopez-Galindez, et al. (2000). "Unusual distribution of mutations associated with
serial bottleneck passages of human immunodeficiency virus type 1." J Virol 74(20):
9546-52.
152
Yuste, E., S. Sanchez-Palomino, et al. (1999). "Drastic fitness loss in human immunodeficiency
virus type 1 upon serial bottleneck events." J Virol 73(4): 2745-51.
Zhang, J. (2004). "Host RNA polymerase II makes minimal contributions to retroviral frame-
shift mutations." J Gen Virol 85(Pt 8): 2389-95.
Zhang, J.&H. M. Temin (1993). "Rate and mechanism of nonhomologous recombination during
a single cycle of retroviral replication." Science 259(5092): 234-8.
Zhao, X. Z., E. A. Semenova, et al. (2008). "2,3-dihydro-6,7-dihydroxy-1H-isoindol-1-one-
based HIV-1 integrase inhibitors." J Med Chem 51(2): 251-9.
Zhu, T., H. Mo, et al. (1993). "Genotypic and phenotypic characterization of HIV-1 patients with
primary infection." Science 261(5125): 1179-81.
Zhuang, J., A. E. Jetzt, et al. (2002). "Human immunodeficiency virus type 1 recombination:
rate, fidelity, and putative hot spots." J Virol 76(22): 11273-82.
Zwick, M. B., A. F. Labrijn, et al. (2001). "Broadly neutralizing antibodies targeted to the
membrane-proximal external region of human immunodeficiency virus type 1
glycoprotein gp41." J Virol 75(22): 10892-905.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Ferreira ABH, Dicionário Aurélio Básico de Língua Portuguesa. Nova Fronteira. Rio de
Janeiro; 1988.
Rother ET, Braga MER. Como elaborar sua tese: estrutura e referências. São Paulo;
2005. 122p.
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