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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada
Transferência de Imunidade Adotiva
como Estratégia de Imunização para o
vírus Dengue 2
Maria Teresa Prudente de Aquino
Ribeirão Preto- SP
2003
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Maria Teresa Prudente de Aquino
Transferência de Imunidade Adotiva
como Estratégia de Imunização para o
vírus Dengue 2
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, para
obtenção de título de Mestre em
Imunologia Básica e Aplicada Opção-
Bioagentes Patogênicos.
Orientador: Prof. Dr. Benedito Antônio Lopes da Fonseca
Ribeirão Preto- SP
2003
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FICHA CATALOGRÁFICA
AQUINO, Maria Teresa Prudente de
Transferência de Imunidade Adotiva como Estratégia de
Imunização para o vírus Dengue 2.
Ribeirão Preto, 2003.
88p. : il.; 30cm
Dissertação de Mestrado- Apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP- Área de Concentração:
Imunologia Básica e Aplicada, opção: Bioagentes Patogênicos.
Orientador: Fonseca, Benedito Antonio Lopes da
1. Transferência de Imunidade Adotiva. 2. Dengue
Abreviaturas
R
n
- sinal de fluorescência
ADE- aumento dependente de anticorpo
APC- célula apresentadora de antígeno
BSA- albumina de soro bovino
C - proteína do capsídeo do vírus dengue
C- controle negativo
C1q, C3, C4, C5- proteínas do sistema complemento
C3a e C5a- anafilatoxinas do sistema complemento
C6/36- células da linhagem do mosquito Aedes albopictus
CD62L- selectina-L
cDNA- DNA complementar
Con-A- concanavalina A
Ct- ciclo de limiar
CTL- linfócito T citolítico
DEN- vírus dengue
DF- febre de dengue ou dengue clássica
DHF- febre de dengue hemorrágica
DNA- ácido desoxirribonucléico
dNTP- deoxinucleotídeo
DSS- síndrome de choque por dengue
ELISA- ensaio imunoenzimático
Fc - receptor Fc gama
FrhL- células de pulmão de feto de macaco rhesus
Gag- HIV- proteína gag de HIV
HA- hemaglutinina
HIV-1- vírus da imunodeficiência adquirida tipo 1
HLA- antígeno leucocitário humano
IE- índice de estimulação
IFN- - interferon gama
Ig- imunoglobulina
IL- interleucina
M- proteína da membrana madura
MHC- complexo de histocompatibilidade principal
NGC- linhagem de dengue-2 New Guinea C
NS- proteína não estrutural
PAF- fator ativador de plaquetas
PBMC- células mononucleares do sangue periférico
PBS- solução salina de fosfato
PCR- reação em cadeia da polimerase
pd(N)
6
- primer randômico
PDK- células primárias de rim de cachorro
PFC- célula formadora de placa
PFU- unidade formadora de placa
PGMK- células primárias de rim de macaco verde africano
PrM – proteína pré- membrana
PRNT- teste de neutralização e redução de placa
RNA- ácido ribonucléico
SBF- soro fetal bovino
SF- fator de supressão
SNC- sistema nervoso central
TCD4
+
- linfócito T CD4
TCD8
+
- linfócito T CD8
TCGF- fator de crescimento de célula T
TNF- - fator de necrose tumoral beta
TNF-- fator de necrose tumoral alfa
TS- célula T supressora
UTR- região não –traduzível
WHO- organização mundial de saúde
Sumário
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................8
1.1 Considerações Gerais .......................................................................................9
1.2- Estratégias de imunização para as infecções pelo vírus dengue. ..................18
1.3 Transferência de imunidade adotiva como estratégia de imunização..............24
2. OBJETIVOS ......................................................................................................29
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL.................................................................31
4. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................33
4.1 Cultura de células e linhagens virais................................................................34
4.2 Estoque viral propagado em cérebro de camundongos recém – nascidos......34
4.3 Titulação viral através de ensaio de unidades formadoras de placas
(PFU). ....................................................................................................................35
4.4 Extração de RNA através do Kit QIAamp
RNA Viral (QIAGEN
)..................35
4.5 Confecção do DNA complementar (cDNA)......................................................36
4.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR convencional)..................................36
4.7 PCR em Tempo Real.......................................................................................37
4.8 Animais............................................................................................................38
4.9 Cultura de células de baço e estimulação in vitro de linfócitos........................38
4.10 Preparação dos esplenócitos para inoculação...............................................39
4.11 Ensaios de proliferação celular......................................................................39
4.12 Coleta de sangue para obtenção do soro......................................................40
4.13 Desafio intracerebral e análise de sobrevivência...........................................40
4.14 Teste de neutralização...................................................................................41
5. RESULTADOS ..................................................................................................42
5.1 Titulação dos vírus dengue-2 propagados em cérebro de camundongos
recém – nascidos através de ensaios de unidades formadoras de placas
(PFU). ....................................................................................................................43
5.2 Análise dos estoques virais através de PCR convencional. ............................44
5.3 Análise dos estoques virais através da PCR em Tempo Real.........................45
5.4 Ensaios de proliferação celular........................................................................48
5.5 Análise da presença do material genético viral no sobrenadante das
células esplênicas estimuladas in vitro com D2 inativado......................................51
5.6 Análise da Sobrevivência após Desafio Intracerebral com vírus Dengue 2
New Guinea C........................................................................................................52
5.7 Produção de anticorpos neutralizantes............................................................59
6. DISCUSSÃO......................................................................................................61
7. CONCLUSÕES..................................................................................................78
8. RESUMO..........................................................................................................80
9. SUMMARY .......................................................................................................83
10.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................86
Introdução
8
1. Introdução
Introdução
9
1.1 Considerações Gerais
A febre da dengue é responsável por mais altos índices de morbidade
e mortalidade que qualquer outra doença causada por um arbovirus em
humanos (Gubler, 1998). É a mais importante doença viral transmitida por
artrópodes de significância para a saúde pública (Fonseca & Fonseca,
2002). A cada ano, aproximadamente 100 milhões de casos de febre da
dengue e centenas de milhares de febre da dengue hemorrágica ocorrem,
dependendo da estrutura epidêmica (Gubler, 1998).
Há mais de duzentos anos, a febre da dengue foi reconhecida
clinicamente como doença. Durante os séculos XVIII e XIX, a dengue
ocorreu como epidemias afetando a Ásia e Américas, em intervalos de
várias décadas. A propagação era lenta, restringindo-se a embarcações que
carregavam populações de Aedes aegypti e hospedeiros humanos
susceptíveis. Este padrão mudou drasticamente durante a Segunda Guerra
Mundial, na qual os vírus dengue foram propagados através de militares em
campanhas no Pacífico. Múltiplos sorotipos de vírus dengue foram
espalhados através de tropas, refugiados, associados aos vetores
presentes em veículos, contêineres para estocagem de água e pneus. A
disseminação dos vírus e dos vetores aumentou no pós-guerra devido ao
rápido crescimento populacional e urbanização descontrolada, aumentando
assim as condições para a proliferação dos vetores. Além disso, com o
rápido crescimento das viagens aéreas, foram criados meios para a
movimentação de seres humanos virêmicos de uma região para outra.
Dessa forma, foram estabelecidas infecções hiperendêmicas de dengue no
sudeste da Ásia, com padrões de epidemias anuais com os quatro sorotipos
do vírus (Gubler, 1998). Neste contexto, houve o surgimento de casos das
formas mais severas da doença, a febre de dengue hemorrágica (DHF) e
síndrome de choque por dengue (DSS), em 1954 nas Filipinas. Nos anos de
1970 e 1980, a incidência de DHF cresceu dramaticamente e permanece
Introdução
10
elevada nos dias atuais. Assim como na Ásia, nas Américas, antes da
Segunda Guerra Mundial, as epidemias de dengue eram raras, passando a
serem mais freqüentes no pós-guerra, num período mais tardio que na Ásia.
Durante os anos 60 os vírus dengue tipo 2 e 3 estabeleceram-se na região e
em 1977, dengue tipo 1 foi introduzido. As endemias deixaram de ser
intermitentes e passaram a ser anuais em vários locais com a cocirculação
dos múltiplos sorotipos do vírus. A primeira verdadeira deflagração de uma
epidemia com casos de DHF nas Américas ocorreu em Cuba no ano de
1981, com 116 mil hospitalizados, 34 mil casos documentados e 158 mortes
(Monath, 1994). A partir de 1997, foram registrados casos de DHF em pelo
menos 24 países americanos. No Brasil, em 1973, o principal vetor A.
aegypti foi considerado extinto porém, três anos mais tarde, o vetor
reapareceu e desde então foi gradualmente espalhando-se pelo país. Os
primeiros casos relatados de dengue foram no estado de Roraima no início
dos anos 80, com a circulação dos sorotipos 1 e 4. Em 1986, a primeiras
epidemias ocorreram no Rio de Janeiro e nas capitais do nordeste. Desde
então, a dengue tornou-se endêmica no país, com epidemias que
introduziam novos sorotipos em regiões anteriormente não infectadas. Em
1990, houve a circulação do sorotipo 2 no estado do Rio de Janeiro. A partir
dos anos 90, a incidência de dengue aumentou como conseqüência da
disseminação do A. aegypti, principalmente em 1994 e com ele a dispersão
de novos sorotipos para novas áreas. Entre 1999 e 2000, surgiram várias
epidemias, principalmente nos grandes centros urbanos do sudeste e
nordeste onde a maioria dos casos ocorreu. Em dezembro de 2000, foi
detectada pela primeira vez a introdução do sorotipo 3 no estado do Rio de
Janeiro, e subseqüentemente, no estado de Roraima em novembro de 2001
(Silva Jr et al., 2002). Atualmente, a dengue continua sendo uma doença
endêmica no país e preocupante para a saúde pública, já que a cada ano,
novos casos de dengue clássica e dengue hemorrágica são relatados, com
presença de óbitos. Até dezembro de 2003, segundo dados fornecidos pela
Secretaria de Vigilância em Saúde e pelas Secretarias Estaduais de Saúde,
Introdução
11
o Brasil possuía 324.512 casos de dengue notificados, sendo 618 casos de
DHF, com 33 óbitos causados pela forma hemorrágica da doença (FUNASA,
2003).
A dengue é causada por quatro tipos de vírus dengue: dengue 1 a
dengue 4. Estes vírus pertencem ao gênero Flavivírus e a família
Flaviviridae, medem aproximadamente 50nm de diâmetro (Henchal &
Putnak, 1990), sendo compostos por um envelope lipoprotéico que engloba
um genoma de RNA de fita simples, senso positivo, e de aproximadamente
11kb. O genoma está incluso em um capsídeo icosaédrico, e o
nucleocapsídeo está cercado pela bicamada lipídica contendo as proteínas
E e M. Este genoma codifica as proteínas na seguinte ordem: 5’-C-prM(M)-
E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’. As proteínas sintetizadas
pelo vírus são: as estruturais, que consistem na proteína do nucleocapsídeo
ou proteína do core (C), uma proteína associada à membrana (M)
encontrada na forma glicosilada de vírions imaturos (prM), e uma proteína do
envelope (E), e as proteínas não estruturais (NS), que incluem sete
proteínas (NS1-NS5), com algumas estando envolvidas na replicação viral
(Fonseca & Fonseca, 2002).
Os vírus dengue são transmitidos pelas fêmeas dos mosquitos Aedes
aegypti, mas também podem estar associados a outras espécies do gênero
Aedes, como Aedes albopictus. Os mosquitos infectam-se após
alimentarem-se em indivíduos virêmicos e somente depois de um período de
incubação extrínseco de 8 a 12 dias é que são capazes de transmitir o vírus
para indivíduos não infectados. Após a picada do mosquito, segue-se um
período de incubação de 3 a 14 dias depois do qual o indivíduo infectado
pode manifestar uma febre aguda acompanhada de uma série de sintomas.
Estes sintomas variam desde de manifestações semelhantes à gripe (a
dengue clássica ou febre da dengue- DF), até a complicações severas que
culminam na forma mais grave da doença, que leva a hemorragias (febre de
dengue hemorrágica - DHF), e choque hipovolêmico (síndrome de choque
Introdução
12
por dengue - DSS) (Gubler, 1998). Cabe lembrar que uma grande parte das
infecções pelos vírus dengue são assintomáticas.
A dengue clássica ou febre por dengue (DF) é a forma mais branda
da doença que consiste em uma febre início abrupto, e uma série de sinais e
sintomas não específicos, incluindo dor na região frontal da cabeça, dor
retro-orbital, mialgias, artralgias e dores no abdômen, náusea e vômitos,
fraqueza, “rash”, diarréia, mal-estar e linfoadenopatia. Sangramentos nasais,
gengivais, petéquias, hematuria e menorragia não são incomuns. A febre e
dores cessam em um intervalo de 5 a 7 dias com o aparecimento de um
outro “rash” no final deste período. A febre de dengue hemorrágica (DHF) e
síndrome de choque por dengue (DSS) iniciam-se com aparentemente os
mesmos sintomas da dengue clássica, ou seja, febre alta (maior que 39°C)
que permanece por 2 a 7 dias. Sangramentos nasais e gengivais são
incomuns mas sangramentos gastrintestinais podem ser observados em
casos severos (Fonseca & Fonseca, 2002). As manifestações hematológicas
incluem um aumento no hematócrito, trombocitopenia, um prolongado tempo
de sangramento, e um aumento no tempo de protrombina (Kurane &
Takasaki, 2001). Hepatomegalia e esplenomegalia podem ser observados
em alguns casos, especialmente em crianças. Efusão pleural e ascite podem
também ser detectadas, e demonstram o desenvolvimento da DSS. Intensa
dor abdominal é um sintoma que muitas vezes antecede o choque.
Pacientes com choque apresentam pulso fino, diminuição da pressão
sanguínea e hipotensão com pele fria e úmida. O paciente pode ir à óbito
após 24 horas do início do choque, caso não seja feita a correta reposição
de fluidos. A melhora clínica após um correto tratamento é curto, em torno
de 2 a 5 dias (Gubler, 1998, Fonseca & Fonseca, 2002). A Organização
Mundial de Saúde (WHO) classifica a DHF em quatro graus, do menos
severo (grau 1) ao severo (grau 4). Os graus 3 e 4, nos quais a liberação de
plasma é tão profunda que o choque ocorre, é também referida como
Síndrome do Choque por Dengue (DSS) (World Health Organization, 1997).
Introdução
13
Estes vírus podem produzir padrões de manifestações clínicas bem
contrastantes, indo de uma manifestação menos severa (DF) a uma forma
potencialmente ameaçadora da vida que é a DHF. A primeira indicação de
uma base imunológica para a DHF, foi a observação de elevados títulos de
anticorpos com reatividade cruzada em 85% das crianças com DHF em
Bangkok, durante uma epidemia nos anos 60. Esta observação levou à
hipótese de que a DHF era mais comum em infecções secundárias que em
infecções primárias pelo vírus dengue. Os mecanismos imunológicos que
causam a DHF indubitavelmente não operam sozinhos. Juntamente com as
respostas imunes do indivíduo, a virulência viral parece ter um papel
importante na severidade da doença (Rothman & Ennis, 1999).
As principais células envolvidas nas infecções causadas pelo vírus
dengue são monócitos, macrófagos e outras células de origem retículo-
endotelial. As células de Langerhans, células dendríticas intersticiais e
dérmicas, parecem ser mais permissivas para o vírus dengue, que
monócitos e macrófagos (Kurane & Takasaki, 2001). Algumas hipóteses
foram desenvolvidas para tentar explicar os mecanismos imunopatológicos
que levam a DHF.
Uma delas é a hipótese de “aumento da infecção dependente de
anticorpo (ADE)”, a qual foi desenvolvida a partir da observação de que os
vírus replicam-se a títulos mais elevados em PBMC de pacientes com
infecções secundárias pelo vírus dengue, que em PBMC de indivíduos
“naive” para dengue. Esta maior probabilidade de infecção foi relacionada
com a presença de anticorpos residuais da infecção primária. Anticorpos
direcionados para a principal glicoproteína viral, a do envelope (E), ligam-se
ao vírus. Dentre estes anticorpos, estão contidos os que neutralizam os vírus
de um mesmo sorotipo, através da ligação a epítopos da proteína E
relacionados com a penetração do vírus nas células, bem como anticorpos
não – neutralizantes, que se ligam a outros epítopos desta proteína. Em
infecções por sorotipos diferentes, não ocorre a neutralização do vírus
responsável pela infecção secundária, devido a condições de especificidade
Introdução
14
ou concentração. Assim, estes complexos imunes vírus-anticorpo são
capturados mais facilmente que partículas virais não complexadas, por
células expressando os receptores Fc como os monócitos e macrófagos. A
existência de anticorpos pré-existentes, induzidos por uma infecção prévia
de vírus dengue, favorece a sua ligação ao vírus de sorotipo heterólogo sem
neutralizá-lo (Rothman & Ennis, 1999). Kliks e colaboradores (1989)
examinaram soros pré-infecção de indivíduos que subseqüentemente
desenvolveram DHF, e soros daqueles que desenvolveram infecções
secundárias assintomáticas por vírus dengue. As amostras de soros não
diluídas do grupo que desenvolveu DHF, aumentaram a infecção dos
monócitos humanos por vírus dengue tipo 2, enquanto o soro daqueles
indivíduos que desenvolveram a doença assintomática, possuía atividade
neutralizante forte a diluições menores. Eles também examinaram a idade
das crianças que desenvolveram DHF em suas infecções primárias, e o
título de anticorpos nas amostras de soro de suas respectivas mães. As
crianças que nasceram das mães que possuíam altos títulos de anticorpos,
desenvolveram DHF nos meses tardios do primeiro ano de vida. Aqueles
nascidos de mães, que possuíam baixos títulos de anticorpos,
desenvolveram DHF nos primeiros meses do primeiro ano de vida. Foi
concluído que, os níveis dos anticorpos anti-dengue maternais nas crianças
precisam decair, para níveis que possam aumentar a infecção pelo vírus, e
assim levar à DHF. Estas observações são consistentes com a idéia de que
anticorpos intensificadores aumentam o número de células infectadas pelo
vírus, e os níveis de viremia, levando à DHF (Kliks et al., 1988).
Devido a maior probabilidade de infecção dos monócitos e
macrófagos pelo vírus dengue, foi observado também, uma maior
concentração de citocinas no plasma de pacientes com DHF, do que
naqueles com febre da dengue. Uma das manifestações principais da DHF,
a perda de plasma, parece estar relacionada com o mal funcionamento das
células endoteliais induzida pelas citocinas, e não pela destruição dos
pequenos vasos. As citocinas que aparecem elevadas em pacientes com
Introdução
15
DHF incluem TNF-, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 e IFN-. TNF- é conhecido
por sua habilidade em induzir perda de plasma, e já foi relatado que
monócitos e células endoteliais infectadas por dengue, produzem esta
citocina. Outras citocinas como IFN-, IL-2, TNF- e TNF-, também são
produzidos por linfócitos T CD4
+
- vírus específico sob ativação. Assim, tanto
monócitos quanto linfócitos- vírus específicos ativados, são reservas de
níveis elevados destas citocinas na DHF. Dessa forma, a presença de níveis
elevados de citocinas com suas múltiplas funções, provenientes de células
hiper ativadas, são consideradas as responsáveis pela patologia e sintomas
da DHF (Kurane & Takasaki, 2001).
A presença de linfócitos de reatividade cruzada parece ser um outro
mecanismo relevante na indução de DHF durante infecções secundárias
pelo vírus dengue. Após uma infecção primária por vírus dengue de um
determinado sorotipo, permanecem as células T de memória específicas a
este vírus. Alguns clones de células T são capazes de responder ao sorotipo
homólogo do vírus, enquanto outros clones são de reatividade cruzada,
podendo responder a um, dois ou todos os três sorotipos heterólogos de
dengue. Em uma segunda infecção, por vírus de sorotipo diferente da
infecção prévia, tem-se uma expansão das células T de memória de
reatividade cruzada, que são capazes de responder à infecção por este
sorotipo diferente em uma cinética acelerada. O principal epítopo para estes
clones de reatividade cruzada parece ser a da proteína não estrutural NS3.
A ativação dos linfócitos T durante a interação com monócitos infectados por
dengue, resulta em aumento da permeabilidade capilar através de vários
mecanismos (Rothman & Ennis, 1999).
O primeiro mecanismo envolve a produção de citocinas por linfócitos
T ativados vírus específicos. Como mencionado anteriormente, linfócitos
TCD4
+
- vírus dengue específicos produzem elevados níveis de IFN-
(Kurane et al., 1989a) e também IL-2, TNF- e TNF- (Gagnon et al., 1999).
Linfócitos TCD8
+
também podem produzir níveis de IFN-. Muitos
pesquisadores demonstraram que a presença de TNF- pode induzir a
Introdução
16
perda de plasma, assim como a presença de IL-2 (Rothman & Ennis, 1999).
A produção de IFN- não induz uma perda de plasma de forma direta, ele
age na produção de TNF- pelos monócitos ativados (Nedwin et al., 1985) e
interage com este último na ativação das células endoteliais in vitro. O IFN-
pode também ajudar na apresentação de antígenos para os linfócitos T, já
que é capaz de aumentar a expressão de antígenos HLA de classe II e de
receptores de imunoglobulina induzindo ainda mais a captura de vírus
dengue, através de anticorpos intensificadores, pelos monócitos ativados
acentuando o fenômeno de ADE (Kontny et al., 1988).
Um segundo mecanismo imunopatológico de ativação de linfócitos T
dengue específicos é a lise celular das células alvo (Rothman & Ennis,
1999). Ambos linfócitos TCD4
+
e TCD8
+
- dengue específicos são capazes
de lisar células alvo in vitro (Gagnon et al., 1996, Green et al., 1993, Kurane
et al., 1989b, Livingston et al.,1995).
A ativação do sistema complemento parece ser outro fator
responsável pela patogênese da DHF. A cascata do complemento pode ser
ativada na DHF por imunocomplexos formados por vírus dengue circulantes,
e anticorpos específicos para o vírus dengue. Os níveis de anticorpos não-
neutralizantes aumentam rapidamente nas infecções secundárias pelo vírus
dengue e, além disso, altos níveis de anticorpos são alcançados antes da
viremia desaparecer, aumentando ainda mais a possibilidade de formação
dos imunocomplexos. Uma outra hipótese é que o complemento seja ativado
por citocinas produzidas de forma exacerbada na DHF (Ruangjirachuporn et
al., 1979). Alguns pesquisadores como Bokisch e colaboradores (1973) e
Malasit (1987) observaram a presença de níveis anormais no soro de C3, C4
e C5 e um metabolismo aumentado de C3 e C1q radiomarcados em
pacientes com DHF, e no plasma foi detectado elevados níveis de produtos
de ativação do complemento como C3a e C5a. Os níveis de C3a
correlacionaram-se com o grau de DHF e alcançaram seu grau máximo em
torno do tempo de defervescência, consistente com a hipótese que a
Introdução
17
ativação do sistema complemento induz diretamente a perda de plasma
(Rothman & Ennis, 1999).
Dessa forma, a imunopatogênese envolvida nas manifestações que
levam à DHF, a forma mais grave da dengue, pode ser descrita
resumidamente de acordo com o modelo proposto por Kurane e Ennis
(1994).
Anticorpos para o vírus dengue formam complexos vírus-anticorpo e
aumentam a infecção dos monócitos e macrófagos. Células T CD4
+
são
estimuladas e produzem citocinas como IL-2 e IFN-. IFN- estimula a
expressão de receptores Fc e intensifica a infecção pelo aumento
dependente de anticorpo (ADE). O número aumentado de monócitos
infectados por vírus dengue e a expressão aumentada de antígenos HLA
classe I e II, facilita o reconhecimento dos epítopos nas células infectadas,
pelos linfócitos T específicos ao vírus dengue, resultando em uma ativação
elevada de linfócitos T. Esta ativação resulta em uma elevada produção de
citocinas. Monócitos ativados por IFN- podem produzir elevados níveis de
TNF-, IL-1 e PAF (fator ativador de plaquetas) diante da infecção pelo
vírus, ou através da lise por linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
citotóxicos, e/ou por
contato dos monócitos com linfócitos específicos. Os altos níveis de C3a e
C5a são produzidos devido a ativação do sistema complemento pelos
imunocomplexos ou outros mecanismos. PAF pode ser produzida por
plaquetas ativadas ou por monócitos. Além disso, muitas citocinas podem
ser produzidas, mediante a indução de outras citocinas. Uma vez que as
citocinas são produzidas, uma rede complexa de indução aumenta os níveis
de citocinas e mediadores químicos. As citocinas, além de induzirem a
produção de outras citocinas, possuem efeitos sinérgicos. Assim, ocorre um
rápido aumento de TNF-, IL-2, IL-6, IFN-, PAF, C3a, C5a e histaminas, e
os efeitos sinérgicos destes mediadores, induzem um mal funcionamento
das células endoteliais vasculares. O funcionamento inadequado causa
extravasamento de plasma e choque, e desarranjos no sistema de
coagulação, levando às manifestações hemorrágicas. Estes processos
Introdução
18
podem ser iniciados pelo aumento dependente de anticorpo da infecção dos
monócitos pelo vírus dengue, e disparados pela ativação de linfócitos T
citotóxicos de reatividade cruzada.
1.2- Estratégias de imunização para as infecções pelo vírus
dengue.
A cada ano, há várias centenas de milhares de casos de dengue
hemorrágica e síndrome de choque por dengue, resultando em milhares de
mortes. O único método atualmente disponível para prevenir as infecções
por dengue é o controle do mosquito vetor, Aedes aegypti. Este método tem-
se mostrado caro e freqüentemente impraticável (Halstead & Deen, 2002).
No entanto, sabe-se que o método realmente eficiente para combater as
infecções virais e, dentre elas, as infecções pelos vírus dengue é a
vacinação. No caso da dengue, estas vacinas precisam ser tetravalentes e
eficientes em produzir anticorpos neutralizantes para os quatro sorotipos dos
vírus dengue, pois a preexistência de anticorpos heterotípicos não
neutralizantes, é um fator de risco que pode levar à DHF. Além disso,
precisam ser economicamente viáveis para imunizações de populações
numerosas dos países em desenvolvimento, que são os mais afetados pela
doença.
Os métodos de vacinação para dengue são colocados em três
categorias: vacinas vivas atenuadas, vacinas quiméricas, e outros métodos
que incluem vacinas derivadas de clones infectantes, subunidades de
estruturas virais e vacinas de DNA.
As vacinas vivas atenuadas tetravalentes foram desenvolvidas e
testadas como vacinas candidatas na Universidade de Mahidol, Tailândia, e
atualmente estão sendo produzidas em nível industrial pelo Pasteur Mérrieux
Connaught (Pang, 2003). A atenuação dos vírus dengue foi feita através de
passagens seriadas dos vírus em células primárias de rim de cachorro
(PDK) certificadas quanto a serem livres de agentes infecciosos caninos ou
Introdução
19
humanos (Bhamarapravati & Sutee, 2000). A atenuação dos vírus através de
passagens seriadas em células PDK foi conseguida com os sorotipos 1, 2 e
4 , mas o sorotipo 3 não cresceu bem nestas células e então foi passado em
células primárias de rim de macaco verde africano (PGMK), e depois em
células de pulmão de feto de macaco rhesus (FrhL) (Bhamarapravati &
Yoksan, 1997). Dessa forma, o número de vírions patogênicos seria
reduzido enquanto o número de vírions não patogênicos e atenuados seria
aumentado. O grau de atenuação desejado é aquele considerado
biologicamente seguro para humanos mas que ainda pode produzir
anticorpos neutralizantes (Bhamarapravati & Sutee, 2000). Os marcadores
biológicos de atenuação viral considerados, foram a sensibilidade, a
temperatura, e o diâmetro das placas (Bhamarapravati & Yoksan, 1997). O
desenvolvimento desta vacina começou em 1981 como vacinas
monovalentes para os quatro sorotipos e depois foram misturadas em
vacinas bivalentes, trivalentes e tetravalentes (Bhamarapravati & Sutee,
2000). As vacinas candidatas foram testadas quanto a segurança em
modelos experimentais e testes de neurovirulência em macacos. Após
mostrarem ser seguras e imunogênicas nos testes experimentais, o
protocolo de testes das vacinas em humanos foi aprovado pela Organização
Mundial de Saúde e pelo Ministério da Saúde Pública da Tailândia através
de um comitê de ética (Bhamarapravati & Yoksan, 1997). Os resultados em
voluntários humanos mostraram que as vacinas são realmente
imunogênicas, e não produzem sintomas clinicamente significantes, sinais
ou anormalidades laboratoriais nestes voluntários adultos susceptíveis a
flavivírus. As vacinas bivalentes induziram anticorpos bivalentes, sendo o
mesmo observado em voluntários susceptíveis que receberam a vacina
trivalente DEN-1, 2, 4. Nos indivíduos que receberam as vacinas
tetravalentes, a produção de anticorpos neutralizantes não foi tão boa
quanto a da vacina trivalente. A vacina tetravalente também foi administrada
em crianças com idades entre 5 a 14 anos, e também mostrou ser segura e
imunogênica (Bhamarapravati & Sutee, 2000). No entanto, esta vacina
Introdução
20
tetravalente precisa ser aperfeiçoada, pois foi encontrado em voluntários
humanos, um titulo maior de anticorpos dirigidos ao vírus Dengue 3, embora
em todos os voluntários tenham sido detectados anticorpos contra mais de
um vírus. Parece ter havido uma interferência competitiva entre os quatro
vírus ou o vírus Dengue 3 não foi completamente atenuado (Pugachev et al.,
2003).
Uma outra estratégia de vacinação, é a das vacinas quiméricas, a
qual baseia-se em recentes observações de que genes estruturais de um
flavivírus, podem ser substituídos por genes homólogos de um outro
flavivírus. Como resultado, tem-se um vírus quimérico que contém um
envelope heterólogo e induz uma resposta imune neutralizante para o vírus
heterólogo. A quimerização parece ser um fator atenuante “per se”,
freqüentemente reduzindo de forma significativa a virulência do vírus
patógeno, o doador dos genes estruturais (Pugachev et al., 2003). Uma
destas vacinas para a dengue tem a vantagem do uso de uma vacina de alto
sucesso desenvolvida contra o vírus da febre amarela, o qual pertence a
mesma família viral. Neste método, os genes das proteínas pré-membrana
(prM) e do envelope (E) dos vírus dengue foram inseridos nas regiões prM e
E do genoma da vacina da febre amarela 17D, para desenvolver uma vacina
quimérica. A vacina está sendo desenvolvida pela Acambis (USA) e
licenciada por Aventis Pasteur (França). Uma única dose desta vacina
quimérica tetravalente foi capaz de estimular a produção de anticorpos
neutralizantes, em 100% dos macacos inoculados. Porém, em experimentos
realizados em macacos rhesus com as vacinas quiméricas tetravalentes, foi
observado um título maior de anticorpos neutralizantes anti-dengue 2,
embora todos os macacos tenham soro-convertido para os quatro sorotipos.
Com a redução da dose do vírus dengue-2 na formulação da vacina, ocorreu
um equilíbrio maior da resposta imune contra os vírus dengue 1, 2, 3, mas
esta resposta continuou mais acentuada em relação ao vírus dengue-4.
Assim, mais estudos serão necessários para identificar uma formulação
ótima para as quatro vacinas virais (Pugachev et al., 2003). Os testes
Introdução
21
clínicos da fase I já estão sendo realizados. A avaliação da habilidade de
mosquitos vetores tornaram-se infectados através do sangue de um
indivíduo vacinado e assim transmitirem a vacina candidata, também foi
realizada com a vacina quimérica dengue-febre amarela e parece ser
incomum (Pang, 2003). Em acréscimo a este método de vacina quimérica da
febre amarela, os vírus dengue também podem ser usados como “espinhas
dorsais” para vacinas quiméricas. Elas têm sido baseadas na deleção ou
inserção de mutações e/ou inserção de genes de prM e E de vários
sorotipos nas regiões estruturais dos vírus DEN-1, DEN-2, DEN-4. As
quimeras de DEN-2 produziram anticorpos neutralizantes em camundongos
susceptíveis (Kenney & Huang, 2001), e a vacina candidata usando a
“espinha dorsal” de DEN-1 foi altamente imunogênica em macacos rhesus
susceptíveis (Markoff et al., 2002). A vacina construída usando a “espinha
dorsal“ de DEN-4, onde os genes de virulência foram deletados, causou
somente reações mínimas em 20 voluntários adultos com 100% de soro
conversão de anticorpos neutralizantes (Durbin et al., 2001). Esta última
vacina quimérica também mostrou ter uma capacidade restrita para
disseminação em mosquitos e ausência de transmissão das vacinas para
mosquitos (Pang, 2003).
A tecnologia dos clones infecciosos tem aberto novas oportunidades
na pesquisa de vacinas para flavivírus. Um clone infeccioso é uma cópia de
cDNA de um vírus de genoma de RNA, que pode ser propagado de forma
estável, em vetores de plasmídeos bacterianos e facilmente manipulado
(Pugachev et al., 2003). A vantagem desta tecnologia está na redução do
risco de gerar variantes com fenótipos biológicos alterados, durante
passagens convencionais nas preparações de vacinas vivas atenuadas em
cultura celular (Chambers et al., 1997). Através de um clone infeccioso,
deleções foram introduzidas na região 3’ não traduzível (3’ UTR) do genoma
de dengue 4. As mutações alteraram, mas não impediram a replicação do
vírus na cultura celular. O vírus produziu placas de pequeno diâmetro nas
células C6/36 de mosquito, e cresceu pobremente nas células de símios
Introdução
22
LLC-MK2. Após inoculação em macacos, alguns dos vírus mutantes
demonstraram duração de viremia reduzida, mas desenvolveram respostas
de anticorpos neutralizantes. No entanto, reversões fenotípicas foram
encontradas após cultivo prolongado em células C6/36, sugerindo uma
limitação potencial nas substituições de um único nucleotídeo, o que
limitaria seu uso como vacina (Pugachev et al., 2003).
As vacinas de subunidades empregam vários vetores de expressão,
para gerar segmentos de polipeptídios definidos da poliproteína dos
flavivírus. As tecnologias recombinantes possuem uma potencial vantagem,
particularmente na expressão da proteína de dengue NS1, devido sua
ausência na indução de reação cruzada de anticorpos anti-E, eliminando o
risco de aumento da imunidade mediada por Fc e conseqüentemente, da
replicação do vírus dengue em recipientes da vacina subseqüentemente
exposta ao vírus selvagem. A vacinação com polipeptídios selecionados, os
quais já são sabidos em gerar ativação pobre de células T via MHC de
classe I durante exposição primária ou secundária à infecção por vírus
dengue, pode minimizar a indução de citocinas pró-inflamatórias. Um
sistema de expressão através de Escherichia coli, o qual produz uma
proteína contendo a região C terminal e um terço da proteína E, junto com a
região N-terminal da proteína NS1 do vírus dengue 2 (linhagem PR#159/S1),
tem sido empregado. Esta vacina de subunidade recombinante mostrou ser
altamente imunogênica em camundongos Swiss e Balb-c, os quais
receberam pelo menos duas doses tendo como adjuvante o alumínio, e
desenvolveram altos títulos de anticorpos neutralizantes contra o vírus
dengue 2. Uma completa proteção contra desafio intracerebral com vírus
dengue 2 também foi conseguida. Porém, a imunização de macacos exigiu
três doses para induzir níveis substanciais de anticorpos neutralizantes, mas
a resposta foi transitória e, nos experimentos de desafio, a não redução em
magnitude ou duração da viremia foi demonstrada, se comparada com os
animais controles não imunizados. Um outro sistema de expressão, baseado
em baculovírus, também foi empregado para produzir a proteína E de
Introdução
23
dengue com uma “tag” de histidina. A proteína pôde ser recuperada nas
formas monoméricas e diméricas com antigenicidade mantida. A imunização
de camundongos Balb-c com a forma dimérica mais o adjuvante de alumínio,
produziu anticorpos neutralizantes para vírus dengue tipo 2, similarmente à
imunização com o vírus inativado purificado. Após três doses da vacina, a
proteção contra o desafio foi conseguida na presença ou ausência de
adjuvante, mas a produção de anticorpos neutralizantes somente foi
conseguida com adjuvante. Uma crítica relacionada com as vacinas de
subunidades refere-se à durabilidade das respostas de anticorpos
neutralizantes, e assim, à proteção contra as conseqüências
imunopatológicas de uma infecção seqüencial (Chambers et al., 1997).
Um método muito popular usado para imunização é o DNA nu,
contendo genes apropriados de flavivírus, o qual é baseado na inoculação
direta em animais ou humanos pela rota intramuscular ou dentro de células
dendríticas. A inoculação é feita via “gene gun” ou plasmídeo de DNA,
contendo promotores eucarióticos apropriados para a expressão das
proteínas codificadas. O DNA é transcrito no núcleo das células, resultando
em subseqüente expressão da proteína e indução de imunidade. As
desvantagens das vacinas de DNA são as grandes quantidades de DNA
necessárias, e a possibilidade dos plasmídeos integrarem-se de forma
estável, em cromossomos em “loci” aleatórios. Além disso, os promotores
fortes que são usados nestes plasmídeos, teoricamente podem resultar em
uma regulação positiva de alguns genes celulares como oncogenes
(Pugachev et al., 2003). Uma vacina de DNA para dengue foi desenvolvida e
sua imunogenicidade avaliada em camundongos. A vacina chamada de
pcD2ME, é baseada em um plasmídeo pcDNA3, que codifica a seqüência
sinal dos genes das proteínas do envelope (E) e da pré-membrana (prM) do
vírus dengue tipo 2 da linhagem New Guinea C. Os camundongos Balb-c
receberam doses de 100g da vacina pcD2ME por duas ou três vezes, e
desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes de 1:40 ou maiores, nos
dias 4 e 8 depois do desafio com 3x10
5
PFU de dengue- 2 New Guinea C.
Introdução
24
Em contraste, os camundongos imunizados duas ou três vezes com 100g
de pcDNA3, não desenvolveram anticorpos neutralizantes detectáveis nos
dias 4 e 8 após o desafio, indicando assim, que a imunização com pcD2ME
é capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes e respostas de
células B de memória, ao vírus dengue- 2 New Guinea C (Konishi et al.,
2000). Uma vacina de DNA candidata, expressando a glicoproteína E
truncada sem a expressão concomitante de prM, foi construída contra o
vírus dengue -2 New Guinea C no Laboratório de Virologia Molecular da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os camundongos que foram
vacinados através de inoculação intramuscular com o plasmídeo
recombinante contendo 94% do gene E não produziram anticorpos anti-
dengue, resposta linfoproliferativa ou síntese de citocinas, quando
estimuladas com vírus dengue 2 purificado. Porém, foi observada uma
proteção contra desafio dos camundongos imunizados com o plasmídeo
recombinante, em um índice de 20%. A baixa resposta imune encontrada foi
relacionada com a possível secreção imperfeita da proteína E, devido a
ausência da proteína prM, apontando assim a necessidade da presença da
proteína prM nas próximas vacinas candidatas de dengue, para o correto
processamento da glicoproteína E (Jimenez & Fonseca, 2001).
1.3 Transferência de imunidade adotiva como estratégia de
imunização.
A transferência de imunidade adotiva é um mecanismo através do
qual é feita a transferência de células do sistema imune, como linfócitos, de
um doador imune para um receptor singenéico (geneticamente idêntico) não
imune para determinado antígeno. Esta transferência celular deve ser feita
entre doadores e receptores geneticamente idênticos, como membros da
mesma linhagem endocruzada de camundongos, de modo que os linfócitos
de um doador não sejam rejeitados pelo receptor e não ataquem os tecidos
Introdução
25
do mesmo. Este procedimento pode ser refinado transferindo-se certas
subpopulações de linfócitos, tais como células B, células T CD4, células T
CD8, além de linhagens clonadas de células T, também capazes de conferir
imunidade adotiva ao seu antígeno específico (Janeway & Travers, 1997).
A transferência de imunidade adotiva tem como objetivos substituir ou
enriquecer a população de células T pertencentes ao receptor das células
transferidas. As células estimuladas para determinado antígeno ao serem
transferidas para um receptor singenéico normal, estariam se multiplicando
na presença do antígeno específico a que estão previamente estimuladas,
permitindo uma resposta imune celular adaptativa de forma muito mais
rápida e eficiente. Estariam também possibilitando a ação da resposta imune
humoral do indivíduo receptor com a ativação de células B, e produção de
anticorpos. Sendo uma resposta imune adaptativa, tem como características
a especificidade, que garante a eliminação de microorganismos específicos,
e a memória, que intensifica as respostas às repetidas exposições ao
mesmo antígeno. Em infecções virais, por exemplo, o receptor das células
previamente primadas para o vírus específico, ao entrar em contato com o
mesmo, dispondo de células T específicas a este, teria uma expansão clonal
destas células após ativação através das células apresentadoras de
antígeno (APCs), expondo os peptídeos virais na superfície. Após a
expansão clonal, haveria um estímulo tanto da resposta imune celular como
da humoral, com a função de eliminar o patógeno, neste caso o vírus, de
forma mais rápida e mais potente. Esta eliminação, ocorrendo com sucesso,
resultaria em um receptor que não sofreria os sintomas da doença causada
pelo vírus, pois teria células T responsivas a este, sem que precisasse
adoecer para produzí- las. Uma outra vantagem, seria o desenvolvimento no
receptor, de células T de memória, que prolongassem esta resposta imune
às infecções posteriores com o mesmo vírus.
Nos dias atuais tem-se empregado a transferência adotiva de células
T como um mecanismo promissor no tratamento de infecções virais
persistentes (Hunziker et al., 2002), em terapias anti-tumorais (Kessels et al.,
Introdução
26
2002) e como uma importante estratégia de pesquisa para definir o papel de
determinadas populações celulares, como por exemplo, das células TCD4
+
em uma resposta imune (Abbas et al., 2000).
É sabido que as células TCD8 citotóxicas possuem um papel
importante na erradicação e controle de infecções virais persistentes (Riddell
& Greeenberg, 1995). Nas infecções pelo HIV, o papel destas células não
está bem definido embora se saiba que pacientes HIV
+
com longos períodos
de infecção assintomática mantêm respostas fortes de células T citotóxicas
(CTLs) específicas para HIV, ao contrário de pacientes sintomáticos, que
progressivamente vão perdendo esta resposta das CTLs específicas para
HIV (Cao et al.,1995, Harrer et al., 1996, Klein et al., 1995). Assim, através
da atividade funcional destas CTLs específicas para HIV e da habilidade
destas células efetoras em migrarem para sítios de infecção in vivo, clones
autólogos de CTLs CD8
+
específicas para Gag de HIV-1 foram expandidas
in vitro e transferidas adotivamente em indivíduos infectados por HIV. As
CTLs transferidas retiveram suas funções líticas in vivo, permaneceram
acumuladas junto às células infectadas por HIV nos linfonodos, e de forma
transitória, reduziram os níveis de células TCD4
+
circulantes infectadas pelo
vírus. Estes resultados mostram uma evidência direta que as CTLs HIV-
específicas tem como objetivo, atingir os sítios de replicação do vírus e
mediar uma atividade antiviral, e indicam também que, o desenvolvimento de
estratégias imunoterapêuticas para manter uma forte resposta citotóxica
para HIV pode ser uma importante arma no tratamento das infecções pelo
vírus (Brodie et al.,1999). Os tumores freqüentemente expressam antígenos
que podem ser reconhecidos pelo sistema imune, entretanto, as células
tumorais conseguem evadir-se de sua monitoração. Recentes dados
mostraram que o sistema imune adaptativo possui um papel definido na
monitoração imune e tanto as células CD4 quanto CD8 podem contribuir
para a regressão do tumor (Shankaran et al., 2001). Outros estudos
demonstraram a possibilidade de erradicação de tumores estabelecidos
através da transferência adotiva de células T CD8 (Hanson et al., 2000). O
Introdução
27
papel das células T CD4 na resposta anti-tumoral está em prevenir a
deleção dirigida do antígeno pelas T CD8 e assim prolongar a citotoxicidade
dirigida das células CD8 (Kurts et al., 1997). Dessa forma, para melhor
entender o mecanismo de evasão, Klein e colaboradores (2003) fizeram com
que células T CD4 e T CD8 reagissem contra um tumor em crescimento
subcutâneo, o qual foi modificado para expressar a hemaglutinina (HA) do
vírus influenza, como um antígeno substituto do tumor. Camundongos
transplantados com um carcinoma de cólon CT26 receberam
aproximadamente 8000 células T CD8 antígeno específicas, o que foi
suficiente para proteger os camundongos contra um desafio de 1x10
6
células
tumorais, porém, números maiores de células T rejeitaram tumores
estabelecidos. As células T CD4 não rejeitaram por si os tumores, mas
ajudaram na rejeição dos tumores pelas células T CD8 específicas. A
rejeição do tumor coincidiu com uma prolongada sobrevivência das células T
CD4 e CD8 específicas, enquanto uma falha na resposta anti-tumoral, foi
acompanhada por uma expansão transitória seguida de rápida eliminação
das células T antígeno específicas. Portanto, tumores altamente
imunogênicos podem evadir-se da monitoração imune, por causa do número
insuficiente de células T específicas ao tumor, e também devido a
sobrecarga de antígeno, resultando em uma exaustão da resposta imune.
Neste contexto, segundo os pesquisadores, a imunoterapia adotiva melhor
que a vacinação, promete ser um tratamento de sucesso no combate ao
câncer.
Uma outra forma de utilização da transferência adotiva é no estudo do
comportamento de certas populações celulares, como células T CD8 de
memória. Barber e pesquisadores (2003) avaliaram a atividade de
citotoxicidade de células T CD8 efetoras e de memória. Foi observado que,
durante uma infecção aguda pelo vírus da coriomeningite linfocítica, as
células T CD8 efetoras rapidamente mataram e começaram a eliminar
células alvo adotivamente transferidas, dentro de 15 minutos, por um
mecanismo dependente de perforina. Células T CD8 de memória apesar de
Introdução
28
serem pobremente citolíticas in vitro, neste estudo mostraram uma rápida
eliminação (1-4 horas) das células alvo após transferência, e as células de
memória expressando tanto CD62L
low
quanto CD62L
high
(moléculas de
superfície celular responsáveis pela adesão endotelial de leucócitos), foram
capazes de matar rapidamente in vivo. De forma surpreendente, as células T
CD8 de memória foram apenas um pouco mais lentas que as células
efetoras em eliminar as células alvo. Assim, concluiu-se que, as células T
CD8 de memória vírus específica podem rapidamente adquirir função
citolítica sob re-exposição ao antígeno, e seriam células eliminadoras de
antígenos muito mais eficientes in vivo, que previamente esperado.
Em relação ao vírus dengue, poucos trabalhos foram realizados
usando a transferência adotiva de imunidade. Os poucos existentes,
utilizaram esta estratégia como forma de estudar a atividade supressora ao
vírus dengue de células T específicas transferidas adotivamente em
camundongos (Chaturvedi et al., 1981, Tandon et al., 1979a, Tandon et al.,
1979b). Dessa forma, devido a inexistência de pesquisas realizadas com
estratégias de imunização utilizando a transferência adotiva de imunidade
para o vírus dengue, e a potencialidade mostrada por este mecanismo com
outras infecções virais, faz-se necessária sua avaliação como uma
estratégia de imunização, de forma a enriquecer o campo de pesquisas para
encontrar a melhor estratégia vacinal para a infecção causada pelo vírus
dengue.
Objetivos
29
2. Objetivos
Objetivos
30
Os objetivos deste estudo foram:
Verificar se ocorre a transferência de imunidade através de células
esplênicas estimuladas in vitro pelo vírus Dengue tipo 2, em
camundongos isogênicos.
Analisar a resposta imune humoral específica para Dengue-2
induzida por esta estratégia.
Delineamento Experimental
31
3. Delineamento Experimental
Delineamento Experimental
32
IMUNIZAÇÃO
Inóculo via
endovenosa
Cultura de células
esplênicas estimuladas
ou não com vírus D2
inativado
Camundongos BALB/c
isogênicos
Grupos:
Células esplênicas estimuladas in vitro com D2 inativado
Células sem estímulo
Controle Positivo: D2 New Guinea C ativo
Controle Negativo: Solução PBS 1x
6 dias – “booster”
com vírus inativado
nos grupos de células
estimuladas in vitro
14 dias
Obtenção de soro
(anticorpos)
Linfoproliferação
Desafio intracerebral
Análise da sobrevivência
(21 dias)
Obtenção de soro
(anticorpos)
Material e Métodos
33
4. Material e Métodos
Material e Métodos
34
4.1 Cultura de células e linhagens virais
Neste estudo, foi utilizado para a estimulação dos linfócitos e desafio
dos camundongos isogênicos, o vírus Dengue 2 da linhagem New Guinea C
(TVP-1698 SM# 26) propagados em cérebro de camundongos recém –
nascidos.
As células utilizadas para ensaios de unidades formadoras de placas
(PFU) e para testes de neutralização (PRNT) foram as células da linhagem
Vero (rim de macaco verde africano- Cercopithecus aethiops) obtidas do
Instituto Adolfo Lutz de São Paulo-SP.
As células Vero foram cultivadas em garrafas de cultura de 25cm
3
(Costar-USA)
com meio Leibowitz L-15 suplementado com soro fetal bovino
a 10%, triptose e antibióticos (penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL).
Após a formação de monocamadas, estas células foram tripsinizadas e
repicadas para garrafas de cultura de 75cm
3
(Costar-USA). Posteriormente
estas células foram passadas para placas de cultura de 24 wells com
1,91cm
2
/poço, até o uso em ensaios a que foram destinadas.
4.2 Estoque viral propagado em cérebro de camundongos
recém – nascidos.
Foram inoculados aproximadamente 10l de vírus Dengue 2 New
Guinea C no cérebro de camundongos Swiss recém-nascidos. Após o
aparecimento dos sinais da doença, que normalmente ocorrem após o 3º dia
da inoculação do vírus, os camundongos foram sacrificados e congelados a -
70°C até o uso. O cérebro foi coletado por aspiração com seringa e
homogeneizado em graal estéril com solução de gelatina a 10% (Sigma) na
proporção de aproximadamente 1:1. Os homogeneizados foram transferidos
para tubos de centrifuga de 15 mL (Corning-USA), sedimentados a 5445 x g
por 20 minutos em centrífuga (Beckman). Os sobrenadantes foram coletados
e estocados em tubos criogênicos (Corning-USA) em freezer a – 70°C.
Material e Métodos
35
4.3 Titulação viral através de ensaio de unidades formadoras
de placas (PFU).
As células Vero após formarem monocamadas, foram removidas com
5 ml de tripsina a 0,25% (GIBCO
TM
-Invitrogen). Em seguida, foram
plaqueadas de forma que estivessem na concentração de 1x10
6
células/mL
de meio L15 a 10% de soro fetal bovino em placas de poliestireno (Costar-
USA) de 24 poços. As placas foram mantidas em estufa por 48 horas a
37ºC. Em seguida, foram feitas diluições seriadas de vírus (10
-1
a 10
-10
) em
PBS 1x estéril e estas diluições de vírus Dengue 2 New Guinea C foram
adicionadas em duplicata nos poços das placas. Após aproximadamente 2
horas de infecção, o inóculo foi retirado e os poços das placas receberam
uma camada de solução viscosa (carboximetilcelulose a 3%, meio L15 1x,
soro fetal bovino a 10%, penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL, L-
glutamina a 1%). Após 6 dias da infecção, os poços das placas foram
corados com vermelho neutro a 2% em meio L15 a 2% de SBF. O cálculo
do título viral é feito a partir da maior diluição onde as placas são visíveis,
levando em conta o número de placas, a diluição e o volume do inóculo
(Russell et al., 1967).
4.4 Extração de RNA através do Kit QIAamp
RNA Viral
(QIAGEN
).
Para obtenção de RNA viral presente nos estoques virais ou no
sobrenadante dos esplenócitos em cultura estimulados in vitro, foi feita a
extração do RNA das amostras através do QIAamp RNA viral kit que utiliza
uma coluna com afinidade para RNA. Na obtenção do RNA, 140L de cada
amostra foi lisada pelo tampão de lise e depois passadas nas colunas de
sílica com afinidade para RNA e submetidas a uma centrifugação de 6428 x
g por 1 minuto. Após centrifugação, as amostras foram lavadas com
tampões de lavagem e por último, o RNA extraído presente nas colunas foi
Material e Métodos
36
eluído através de tampão de eluição, e estocado em freezer a –20°C,
conforme instruções do fabricante.
4.5 Confecção do DNA complementar (cDNA).
Após a extração do RNA total das amostras, a confecção da fita de
cDNA foi feita com o kit Superscript
TM
(GIBCO
TM
- Invitrogen). De cada
amostra de RNA, foi retirada uma alíquota de 11L à qual foi adicionada 1L
de primer randômico pd(N)
6
(Amersham –Pharmacia, CA, USA). As
amostras foram submetidas a aquecimento de 70ºC por 10 minutos. Em
seguida, foi feito um “cocktail” com tampão da transcriptase reversa, DTT,
transcriptase reversa e dNTPs. O “cocktail” foi adicionado às amostras, e
estas, incubadas por 1 hora a 42ºC, e em seguida, foi feita uma nova
incubação de 15 minutos a 70ºC, para desnaturar a transcriptase reversa. O
cDNA obtido foi posteriormente estocado em freezer a –20°C.
4.6 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR convencional).
A reação em cadeia da polimerase foi empregada neste estudo para
analisar a presença de RNA viral nos estoques virais e também no
sobrenadantes de cultura de células de baço. Os “primers” utilizados foram
aqueles cujo sucesso já havia sido comprovado pela literatura (Henchal et
al., 1991). A reação de PCR já foi padronizada em nosso laboratório (De
Paula et al., 2001) e foi feita a partir de 3L de cDNA das amostras em uma
reação de 50L contendo 0,5 pmol/L dos primers AD3 e AD4 sense e anti-
sense (ver tabela 1), 0,2 mM dNTPs, tampão 10x da enzima e 2,5U de Taq-
DNA Polimerase.
O controle positivo utilizado foi o vírus Dengue sorotipo 2, propagado
em cérebro de camundongos recém-nascidos, e previamente analisado por
PCR em tempo real. As amplificações foram feitas em 35 ciclos de 3
Material e Métodos
37
segmentos: 94ºC por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e um
ciclo final de 10 minutos a 72°C.
O resultado das amplificações foi verificado por eletroforese em gel de
agarose a 2%, corado com brometo de etídeo 1g/mL e visualizados através
de luz ultravioleta e digitalizados pelo software UVP
Vision Works.
Tabela 1- Seqüências de “primers” AD3 e AD4
“Primers” Seqüência Região Referência
AD3
5’CTGATTTCCAT(A,C,G,T)CC(A,G)TA 3’ NS1 Henchal et
al., 1991
AD4 5’GA(C,T)ATGGG(A,C,G,T)TA(C,T)TGGATAGA3’ NS1
4.7 PCR em Tempo Real.
A PCR em Tempo Real foi outra metodologia empregada neste
estudo, através do Sistema de Detecção de Seqüências GeneAmp 5700
(Applied Biosystems
), cuja metodologia foi padronizada em nosso
laboratório, para confirmarmos a presença do sorotipo específico Dengue-2,
além de quantificarmos o estoque do vírus. O sistema TaqMan, de detecção
e quantificação de seqüências foi preparado utilizando um par de “primers“ e
uma sonda específica para Dengue-2, correspondente a região 3´-não
codificadora do genoma do vírus Dengue (Huong et al., 2001).
O RNA do vírus dengue foi amplificado utilizando o TaqMan
One-
Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems), composto por
AmpliTaq Gold
DNA polimerase, dNTPs com dUTP, referência passiva
(ROX), componentes de tampões, e um tubo adicional contendo enzimas de
transcrição reversa Multiscribe e inibidor de RNase. Para tanto, foi preparada
uma mistura padrão contendo 12,5l do master mix, 2,25 l de cada primer
(450nM), 1,5 l de sonda (150nM), 0,63l de Multiscribe/inibidor de RNase,
Material e Métodos
38
0,87l de água DEPC (dietil pirocarbonato 97% - ACROS Organics), e 5l de
RNA, totalizando um volume final de 25l por reação. As condições de
amplificação usadas foram: 48C por 20 min e 95C por 10 min, seguido por
40 ciclos de 95C por 15 segs e 60C por 1 min.
4.8 Animais.
Os animais utilizados neste estudo foram camundongos isogênicos
fêmeas da linhagem BALB/c “naive” (que não receberam qualquer estímulo)
de aproximadamente 4 semanas, obtidos junto ao Biotério Geral da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP. Os camundongos foram
mantidos com ração e água estéreis em uma sala individualizada de outros
animais no biotério da Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, USP.
4.9 Cultura de células de baço e estimulação in vitro de
linfócitos.
Camundongos isogênicos da linhagem BALB/c “naive” foram
sacrificados sob anestesia para a obtenção de baços. Os baços foram
divulsionados e as hemácias lisadas com tampão de lise (Tris a 0,17M e
NH
4
Cl a 0,16 M). Após centrifugações seriadas com PBS 1x (GIBCO
TM
-
Invitrogen) a 259 x g por 10 minutos a 4°C , o sedimento celular foi
ressuspenso em 2mL de meio RPMI 1640 completo (GIBCO
TM
- Invitrogen)
suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 mM de Hepes, 2mM de L-
glutamina , aminoácidos não-essenciais , 5x10
-5
M de 2-mercaptoetanol,
penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL. O número de células foi
ajustado para 5 x 10
6
/mL em meio RPMI a 10% de SBF e plaqueadas em
placas de poliestireno (Costar-USA) de 24 poços (1 mL/poço). Células
esplênicas de camundongos C57Bl/6 “naive”, utilizadas como controle da
transferência de células, foram igualmente manipuladas e estimuladas com
Material e Métodos
39
vírus dengue, como as células da linhagem de camundongos BALB/c. As
células que foram estimuladas in vitro com vírus Dengue 2 New Guinea C
inativado (60ºC por 30 minutos) receberam aproximadamente 1,5 x10
5
pfu/ml de vírus. As células não estimuladas com vírus não receberam
qualquer estímulo. As placas foram mantidas em estufa a 5% de CO
2
e a
37ºC por 48 horas.
4.10 Preparação dos esplenócitos para inoculação.
As células foram coletadas das placas com solução salina de PBS 1x
estéril e centrifugadas a 259 x g por 10 minutos a 4ºC. Após a última
centrifugação, o número de esplenócitos foi ajustado para 5x 10
7
/mL, em
solução de PBS 1x estéril. Os camundongos BALB-c foram inoculados com
100L de PBS 1x, contendo 5x 10
6
células esplênicas de BALB-c ou de
C57Bl/6, através da via endovenosa pela cauda.
4.11 Ensaios de proliferação celular.
Os vírus dengue 2 New Guinea C foram testados em uma cultura de
esplenócitos de camundongos BALB-c com intuito de verificar o efeito do
vírus sobre a proliferação antígeno-específica de células T. Para tal,
esplenócitos foram obtidos de camundongos previamente imunizados e não
imunizados para o vírus Dengue 2 por divulsionamento do baço em solução
de PBS 1 x estéril, após 14 dias de imunização e antes do desafio. Estas
células foram centrifugadas por 10 minutos a 259 x g, e diluídas em meio
RPMI –1640 a 10% de SBF. As culturas foram efetuadas em placas de
cultura de fundo chato e 96 poços (Corning- USA), numa concentração de 5
x 10
5
células/ poço. As células foram estimuladas com concentrações de
1x10
3
, 1x10
2
e 10 pfu/mL de vírus Dengue 2 inativado (60°C por 30
minutos), como controle positivo do ensaio, as células também foram
estimuladas com 2g/mL de Con-A e como controle negativo do ensaio,
Material e Métodos
40
estas células também receberam meio RPMI –1640. Após um período de
incubação de 48 horas em uma estufa a 5% de CO
2
a 37ºC, as células
foram pulsadas com metil-
3
H- timidina (Amersham Life Science,
Bukinghamshire, UK), numa concentração de 0,5 Ci por poço. Depois de 8-
10 horas, a quantidade de timidina incorporada nas células foi determinada
utilizando-se um coletor de células (Cambridge Technology Inc., Watertown,
MA) e um contador de cintilação líquida (Beckman Instruments Inc.,
Fullerton, CA). O índice de estimulação (IE) foi calculado de acordo com a
média das cpm (contagem por minuto) dos antígenos virais dividido pela
média das cpm das células controle incubadas apenas com meio RPMI-1640
a 10% de soro fetal bovino. Os valores de IE considerados como positivos
seriam aqueles maiores e/ou iguais a 3 (Murata et al., 2003). Os Valores de
IE foram analisados através do software GraphPad Prism
versão 3.0.
4.12 Coleta de sangue para obtenção do soro.
Os camundongos foram anestesiados e com auxílio de pipetas
Pasteur (Costar-USA), o sangue de cada animal foi coletado pela punção do
seio retroocular e armazenado individualmente. Após retração do coágulo e
centrifugação a 4018 x g, os soros dos camundongos foram coletados,
armazenados individualmente em tubos criogênicos e estocados em freezer
a –70°C.
4.13 Desafio intracerebral e análise de sobrevivência.
A fim de verificarmos se a transferência de imunidade adotiva foi
capaz de proteger os camundongos imunizados contra uma dose elevada de
vírus Dengue 2 New Guinea C, foi feito o ensaio de desafio intracerebral. Os
camundongos de todos os grupos receberam um inóculo de 50L contendo
1,5 x10
5
pfu/mL de vírus dengue 2, via intracerebral. A análise da
sobrevivência foi realizada observando estes animais quanto ao
Material e Métodos
41
aparecimento dos sinais da doença e sobrevivência ao desafio por 21 dias.
Os dados obtidos foram analisados através do software GraphPad Prism
versão 3.0.
4.14 Teste de neutralização.
O teste de neutralização tem como objetivo verificar a presença de
anticorpos neutralizantes no soro obtido dos camundongos imunizados. Para
tal, diluições seriadas de soro (1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160) foram
incubadas overnight a 4ºC com uma amostra de vírus contendo
aproximadamente 30 pfu/mL. Após este período, as soluções vírus-soro
foram colocadas em duplicata em placas de 12 poços (Corning-USA)
contendo monocamadas de células Vero. Depois de um período de 2 horas
de infecção, o inóculo foi retirado e os poços das placas foram cobertos com
uma camada de solução viscosa (carboximetilcelulose a 3%, meio L15 1x,
soro fetal bovino a 10%, penicilina 100U/mL e estreptomicina 1mg/mL, L-
glutamina a 1%). Após 6 dias da infecção, os poços das placas foram
corados com vermelho neutro a 2% em meio L15 a 2% de SBF. O cálculo do
título de anticorpos neutralizantes é feito de acordo a maior diluição que foi
capaz de reduzir em 50%-90%, o número das placas formadas no controle
positivo (Russell et al., 1967).
Resultados
42
5. Resultados
Resultados
43
5.1 Titulação dos vírus dengue-2 propagados em cérebro de
camundongos recém – nascidos através de ensaios de unidades
formadoras de placas (PFU).
Três estoques virais de dengue-2 New Guinea C foram os utilizados neste
estudo, todos obtidos após passagens seriadas em camundongos em períodos
diferentes. A titulação dos vírus Dengue obtidos de estoques virais em cérebro de
camundongos recém-nascidos foi feita de acordo como descrito no item 4.3. Após
coloração das placas com vermelho neutro, que é um corante vital, as placas
formadas pelo vírus a ser titulado nas células Vero foram visualizadas e contadas
a olho nu. A maior diluição do vírus que apresentou a formação de placas foi a
utilizada no cálculo do título viral e os títulos encontrados podem ser visualizados
na tabela 2. A solução mãe após 2 passagens seguidas teve seu título viral
levemente aumentado.
TABELA 2 – Títulos virais dos estoques de Dengue 2 através de
ensaio de unidades formadoras de placas (PFU)
Estoque viral
Título viral (PFU/mL)
D2-NGC (Solução mãe)
1,5 x 10
6
D2-NGC (1ª Passagem)
1,5 x 10
6
D2-NGC (2ª Passagem)
2,0 x 10
6
Resultados
44
5.2 Análise dos estoques virais através de PCR convencional.
Após extração do RNA, obtenção do DNA complementar e amplificação do
DNA por PCR convencional usando os “primers” AD3 e AD4, o DNA amplificado
dos estoques virais foi detectado através de eletroforese em gel de agarose a 2%
como descrito anteriormente. O resultado das amplificações pode ser visualizado
na figura 1, mostrando o fragmento de 419 pb que confirma a presença do
material genético do vírus e marcador de 50 pb.
M 1 2 3 4 5 6 C-
800
2652 pb
419 pb
350
50
Figura 1- Análise dos fragmentos amplificados por PCR (419 pb) (par de primers
AD3/AD4) por meio de eletroforese em gel de agarose a 2 %, corado pelo brometo de
etídeo. M - marcador de peso molecular (50 pb, Gibco BRL); 1 – 3, controles positivos da
PCR, extração de RNA e transcrição; 4 - 6, amostras positivas dos estoques virais ; C-
controle negativo.
Resultados
45
5.3 Análise dos estoques virais através da PCR em Tempo Real.
Utilizando a metodologia de PCR em Tempo Real que é altamente
específica e sensível, foi possível quantificar e detectar os estoques virais de
Dengue 2 New Guinea C utilizados neste estudo. Todos os estoques virais
testados foram específicos para o sorotipo Dengue 2 (figuras 2 e 3) pois os
“primers” e sondas utilizados nesta metodologia são altamente específicos e
correspondentes à região 3’- não codificadora, que é uma região altamente
conservada nos vírus Dengue, e além disso, todos os “primers” e sondas
utilizados, já foram previamente testados e padronizados em nosso laboratório
para esta metodologia. Dessa forma, a especificidade pode ser comprovada pela
amplificação ocorrida, representada pela curva, e comparada com a curva padrão
que é o controle positivo da reação que corresponde a um vírus Dengue 2 New
Guinea C de padrão 2x10
5
pfu/mL (figura 2). As curvas da amostras amplificadas
contidas na figura 3 também comprovam a sua especificidade e o seu título,
quando comparadas com todas as curvas padrão amplificadas na figura. Os
estoques da 1ª passagem e 2ª passagem foram quantificados e os valores obtidos
estão apresentados na tabela 3. Como pôde ser observado, o estoque da 1ª
passagem possui o título viral de 3x10
6
pfu/mL enquanto que o estoque da 2
passagem possui o título viral de 4 x10
6
pfu/mL. O estoque viral solução mãe não
foi quantificado mas seu valor pôde ser calculado como em torno de 2x10
6
pfu/mL
através da figura 2, comparando a curva da amostra com o padrão de 2x10
5
pfu/mL, pois a curva da solução mãe iniciou a emissão de fluorescência num ciclo
anterior ao da amostra padrão, detectando assim, uma maior quantidade de DNA.
Resultados
46
b
a
n
R
n
Ct
Figura 2 - Perfil de amplificação do estoque viral solução mãe. O perfil de amplificação é a
representação gráfica do sinal da fluorescência (R
n
) versus os ciclos da PCR. A presença da
curva de amplificação da amostra comprova a especificidade do estoque viral. a) curva de
amplificação da amostra; b) curva padrão 2x10
5
pfu/mL. Ct (ciclo do limiar- início da detecção da
fluorescência).
Número de Ciclos
R
n
g
e
a
b
c
d
f
Ct
Número de ciclos
Figura 3 – Perfil de amplificação dos estoques virais D2 NGC 1ª passagem e 2ª passagem. O
perfil de amplificação é a representação gráfica do sinal da fluorescência (Rn) versus os ciclos da
PCR. A presença das curvas de amplificação das amostras comprova a especificidade dos
estoques. a)curva de amplificação dos estoques 1ª passagem e 2 passagem; b) curva padrão
2x10
6
pfu/mL; c) curva padrão 2x10
5
pfu/mL; d) curva padrão 2x10
4
pfu/mL; e) curva padrão 2x10
3
pfu/mL; f) curva padrão 2x 10
2
pfu/mL; g) curva padrão 2x10
1
pfu/mL. Ct (ciclo do limiar- início da
detecção da fluorescência).
Resultados
47
TABELA 3- Valores quantitativos dos estoques virais da 1ª e 2ª
passagem obtidos pela PCR em Tempo Real. Amostra 1- estoque viral
da 2ª passagem; Amostra 2- estoque viral da 1ª passagem
Tipo Primer/Sonda Ct
*
Quantidade
Quantidade
Média
**
Padrão PR1 31.91 20.00
Padrão PR1 32.30 20.00
Padrão PR1 28.49 200.00
Padrão PR1 27.94 200.00
Padrão PR1 23.96 2000.00
Padrão PR1 24.45 2000.00
Padrão PR1 21.46 20000.00
Padrão PR1 21.45 20000.00
Padrão PR1 17.48 200000.00
Padrão PR1 17.65 200000.00
Padrão PR1 14.11 2000000.00
Padrão PR1 14.05 2000000.00
Amostra 1 PR1 12.79 4438285.00 4247988.00
Amostra 1 PR1 12.93 4057691.50 4247988.00
Amostra 2 PR1 13.04 3761029.25 3865459.50
Amostra 2 PR1 13.96 3969889.75 3865459.50
(*) Ct- Ciclo do limiar (o início da detecção da emissão de fluorescência); (**) Quantidade média-
valores médios da quantidade de DNA das amostras que são amplificadas em duplicata,
correspondem aos títulos virais.
Resultados
48
5.4 Ensaios de proliferação celular.
Procurando verificar se a transferência adotiva de imunidade confere
resposta antígeno-específica aos camundongos receptores e qual o efeito do vírus
Dengue 2 (NGC) na proliferação de esplenócitos oriundos de camundongos
BALB/c, foram realizados ensaios de proliferação, na presença de diferentes
concentrações do vírus. Primeiramente foi realizado um ensaio, para verificar se
esplenócitos oriundos de camundongos imunizados com 1x10
6
, 1x10
5
e 1x10
4
pfu/mL de vírus Dengue 2 selvagem, proliferam in vitro, e a que concentrações de
antígeno isto ocorre. Através deste ensaio foi verificado que as melhores
concentrações de vírus para imunizar os animais e para se obter resposta
antígeno-específica foram 10
5
e 10
6
pfu/mL de Dengue 2, e que as concentrações
de antígeno para estimular as células seriam 10
3
, 10
2
e 10 pfu/mL de vírus
Dengue 2 inativado, como observado na figura 4. Os gráficos B e C
correspondentes ao grupo de animais que foram imunizados com 1x10
5
e 1x10
6
pfu/mL com vírus Dengue 2 NGC selvagem, respectivamente, obtiveram o Índice
de Estimulação (IE) correspondente a valores iguais e/ou maiores que 3. Estes
valores de IE foram conseguidos, quando os esplenócitos foram estimulados in
vitro com 10
3
, 10
2
e 10 pfu/mL de vírus Dengue 2 inativado. A partir deste ensaio,
foi padronizada a quantidade de vírus a ser utilizada em experimentos posteriores.
Para a transferência adotiva de imunidade, as células esplênicas “naive” seriam
estimuladas in vitro com 3x10
5
pfu/mL de Dengue 2, e nos ensaios de proliferação
celular o antígeno viral usado como estímulo, seria inativado e nos títulos de 10
3
,
10
2
e 10 pfu/mL. Como observado na figura 5, a transferência adotiva de células
esplênicas que foram estimuladas in vitro não resultou em valores de IE
significantes. Apenas no grupo Controle Positivo, que é representado pelos
camundongos imunizados com vírus selvagem e não com células esplênicas, foi
obtido valor significante de índice de estimulação.
Resultados
49
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Estatisticamente significante em relação aos outros grupos
com p< 0,001
B
p < 0,001
IE
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
A
10
4
pfu/m D2 selvagem
10
3
pfu/mL D2 selvagem
10
2
pfu/mL D2 selvagem
10
3
pfu/mL D2 inativado
10
2
pfu/mL D2 inativado
10 pfu/mL D2 inativado
IE
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
C
Estatiscamente diferentes entre si com p< 0,01 e p< 0,001
respectivamente.
p<0,01
p<0,001
IE
Figura 4 – Efeito do vírus dengue 2 selvagem e inativado na proliferação de células esplênicas
murinas. Os camundongos foram imunizados com vírus Dengue 2 selvagem. As células esplênicas
foram coletadas e cultivadas na presença de antígeno viral. A proliferação celular foi determinada
pela incorporação de metil -
3
H –timidina e o índice de estimulação (IE) foi calculado como
anteriormente descrito. Os valores positivos do IE referem-se aos grupos de camundongos
imunizados com 1x10
5
e 1x10
6
pfu/mL de Dengue 2. A) Camundongos imunizados uma dose de
1x10
4
pfu/ml de vírus; B) Camundongos imunizados uma dose de 1x10
5
pfu/ml de vírus; C)
Camundongos imunizados uma dose de 1x10
6
pfu/ml de vírus. p < 0,01 e p < 0,001, diferença
estatisticamente significante (Teste de Tukey).
Resultados
50
0
2
4
6
8
10
10
3
pfu/mL D2 inativado
10
2
pfu/mL D2 inativado
10 pfu/mL D2 inativado
IE
0
2
4
6
8
10
IE
0
2
4
6
8
10
**
**
(**) Estatisticamente diferentes entre si com p< 0,01.
IE
0
2
4
6
8
10
IE
0
2
4
6
8
10
IE
A
B
C
D
E
Figura 5 - Efeito do vírus Dengue 2 inativado na proliferação de células esplênicas murinas. Os
camundongos receberam adotivamente aproximadamente 5x10
6
células esplênicas/mL. As células
esplênicas foram obtidas e cultivadas na presença de antígenos virais inativados. A proliferação
celular foi determinada pela incorporação de metil -
3
H –timidina e o índice de estimulação (IE) foi
calculado como anteriormente descrito. Os valores positivos do IE referem-se apenas ao grupo
Controle Positivo, os demais grupos foram considerados negativos quanto ao IE. A) Camundongos
imunizados com células esplênicas não estimuladas com antígeno viral; B) Camundongos
imunizados com células esplênicas estimuladas
in vitro com Dengue 2 inativado ; C) Camundongos
imunizados com 3 x 10
5
pfu/mL de vírus Dengue 2 selvagem (controle positivo); D) Camundongos
não imunizados (controle negativo); E) Camundongos imunizados com células esplênicas de
camundongos C57Bl/6 estimulados
in vitro com vírus Dengue 2 inativado. “**”, p < 0,01, diferença
estatisticamente significante (Teste de Tukey).
Resultados
51
5.5 Análise da presença do material genético viral no
sobrenadante das células esplênicas estimuladas in vitro com D2
inativado.
Na transferência adotiva de imunidade é importante que sejam inoculadas
apenas as células que irão conferir a imunidade ao camundongo receptor, e não o
vírus, que é antígeno apresentado às células para estimulá-las. Deste modo,
teremos a certeza de que a resposta imune obtida provenha das células e não do
vírus em cultura. Uma das maneiras utilizadas para verificar a ausência da
partícula viral no sobrenadante das células esplênicas foi a PCR convencional, e a
análise desta, mostrou que não se encontrava presente o RNA viral nas amostras
de sobrenadante, da cultura de células esplênicas estimuladas in vitro (figura 6).
Como observado, não houve amplificação do DNA de 419 pb do vírus nas
amostras obtidas dos sobrenadantes da cultura celular.
M 1 2 3 4 C-
2072 pb
600
300
419 pb
Figura 6 - Análise dos fragmentos amplificados por PCR (419 pb) (par de primers
AD3/AD4) por meio de eletroforese em gel de agarose a 2 %, corado pelo brometo de
etídeo. M - marcador de peso molecular (100 pb, Gibco BRL); 1- controle positivo; 2- 4:
amostras negativas do sobrenadante dos esplenócitos sem estímulo viral, dos
esplenócitos de BALB-c estimulados in vitro e dos esplenócitos de C57Bl/6 estimulados in
vitro; C- controle negativo.
Resultados
52
5.6 Análise da Sobrevivência após Desafio Intracerebral com
vírus Dengue 2 New Guinea C.
Com o intuito de observar a sobrevivência dos camundongos imunizados
através da transferência adotiva de esplenócitos frente a um desafio com uma
dose letal de vírus selvagem, foi realizado o desafio intracerebral como descrito no
item 4.13. Como pode ser observado na figura 7, 100% dos camundongos que
receberam células estimuladas in vitro pelo vírus Dengue 2 sobreviveram, e os
camundongos do grupo Controle Positivo tiveram também uma proteção ao
desafio em torno de 70%. Por outro lado, somente 20% dos camundongos que
receberam adotivamente células não estimuladas pelo vírus sobreviveram, de
maneira similar aos camundongos do grupo Controle Negativo (os não
imunizados). Para descartar a possibilidade de que a proteção observada na
figura 7, foi mediada por partículas virais presentes no momento da inoculação, foi
feito um outro controle, além da PCR, composto de camundongos BALB/c que
receberam adotivamente células de camundongos C57Bl/6 estimuladas in vitro
com vírus Dengue 2. Os camundongos deste grupo tiveram uma sobrevivência de
66% (figura 8), porém, não estavam sadios e apresentavam os sinais da doença
(observar figura 9). Ao compará-los com aqueles camundongos que receberam
células de camundongos da mesma linhagem, estimuladas da mesma maneira
(figura 9), observou-se que não estavam protegidos da doença. Com este controle
pode-se confirmar que a proteção observada nos camundongos receptores de
células estimuladas in vitro pelo vírus, e adotivamente transferidas, é conferida
pelas mesmas, validando nossos experimentos. Esta confirmação pode ser
observada através da análise da figura 6, e também pela figura 8, pois os
camundongos receptores de esplenócitos oriundos de uma linhagem diferente de
camundongos, não podem conferir imunidade. Quanto ao aparecimento dos sinais
da doença, caracterizados principalmente pela paralisia dos membros traseiros e o
óbito, foi observado que estes sinais são bem evidentes entre os grupos controle
negativo, e o dos animais que receberam células não estimuladas com vírus. O
mesmo não foi observado com os grupos controle positivo e o grupo dos animais
Resultados
53
que receberam células estimuladas com vírus, nos quais estes sinais não são
evidentes (figuras 10 e 11). Ao comparar-se também o aparecimento dos sinais da
doença entre o grupo dos camundongos que receberam esplenócitos de BALB/c
estimulados in vitro, e o grupo dos camundongos que receberam esplenócitos de
C57Bl/6 estimulados in vitro, observou-se que estes sinais são visíveis apenas, no
segundo grupo descrito (figura 9). Estes sinais foram observados neste grupo pois
ele não estava protegido contra a viremia, devido à ausência de transferência
adotiva de imunidade.
Resultados
54
0 3 6 9 12 15 18 21
0
20
40
60
80
100
Controle Negativo
Controle Positivo
Células não estimuladas
Células estimuladas in vitro
Dias
Sobrevivência (%)
Figura 7- Análise dos resultados de dois experimentos pareados, mostrando a média das
curvas de sobrevivência dos camundongos, após seguimento por 21 dias de desafio
intracerebral. Os camundongos foram desafiados após 14 dias de imunização e
analisados quanto à sobrevivência. Os valores da sobrevivência dos camundongos são
dados em porcentagem. As curvas de sobrevivência dos grupos de camundongos que
receberam adotivamente células esplênicas estimuladas in vitro com vírus, assim como a
curva do grupo controle positivo, mostraram proteção ao desafio com dose letal de vírus.
Os grupos de camundongos que receberam adotivamente células não estimuladas com
antígeno viral e o grupo controle negativo não foram protegidos.
Resultados
55
0 3 6 9 12 15 18 21
0
20
40
60
80
100
Células de BALB/c estimuladas in vitro
Células de C57Bl/6 estimuladas in vitro
Dias
Sobrevivência (%)
Figura 8 - Análise da sobrevivência dos camundongos BALB/c após 21 dias de desafio
intracerebral entre os grupos de animais que receberam células de BALB/c estimuladas in
vitro, e de animais que receberam células de C57Bl/6 estimuladas in vitro com vírus
Dengue 2. Os camundongos foram desafiados após 14 dias de imunização e analisados
quanto à sobrevivência. Os valores da sobrevivência dos camundongos são dados em
porcentagem. O grupo dos camundongos que receberam adotivamente células esplênicas
de BALB/c, obteve uma sobrevivência maior ao desafio que o grupo de camundongos que
receberam adotivamente células esplênicas de outra linhagem de camundongos
(C57Bl/6).
Resultados
56
123456789101112131415161718192021
0
20
40
60
80
100
A
Dias
Valores em Porcentagem
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
0
20
40
60
80
100
Sadio
Paralítico
Óbito
B
Dias
Valores em Porcentagem
(%)
Figura 9- Análise do aparecimento dos sinais da doença em camundongos, durante
análise da sobrevivência em um período de 21 dias. Comparação entre os grupos de
camundongos que receberam células esplênicas da mesma linhagem estimuladas in vitro
com vírus, e o grupo dos camundongos que receberam células de outra linhagem,
também estimuladas in vitro com vírus. A comparação evidencia um número maior de
sinais da doença nos camundongos receptores de células de C57Bl/6 (não protegidos no
desafio). A) Grupo que recebeu células de BALB/c ; B) Grupo que recebeu células de
C57Bl/6.
Resultados
57
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
0
20
40
60
80
100
A
Sadio
Óbito
Paralítico
Dias
Valores em porcentagem
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
0
20
40
60
80
100
B
Dias
Valores em porcentagem
(%)
Figura 10- Análise do aparecimento dos sinais da doença em camundongos, durante
análise da sobrevivência em um período de 21 dias. Comparação entre os grupos
controle positivo e controle negativo. A comparação evidencia um número maior de sinais
da doença nos camundongos não protegidos do desafio, o grupo controle negativo. A)
Grupo controle positivo; B) Grupo controle negativo.
Resultados
58
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
0
25
50
75
100
A
Dias
Valores em porcentagem
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021
0
20
40
60
80
100
Sadio
Paralítico
Óbito
B
Dias
Valores em porcentagem
(%)
Figura 11- Análise do aparecimento dos sinais da doença em camundongos, durante
análise da sobrevivência em um período de 21 dias. Comparação entre os grupos de
camundongos que receberam células esplênicas estimuladas in vitro com vírus, e o grupo
dos camundongos que receberam células não estimuladas in vitro por antígeno viral. A
comparação evidencia um número maior de sinais da doença nos camundongos não
protegidos do desafio, o grupo que recebeu células não estimuladas. A) Grupo que
recebeu células estimuladas por vírus; B) Grupo que recebeu células não estimuladas por
vírus.
Resultados
59
5.7 Produção de anticorpos neutralizantes.
A análise das tabelas 4 e 5, referentes à produção de anticorpos
neutralizantes, confirmou a presença dos mesmos no soro dos camundongos
imunizados. Antes do desafio, o único grupo que apresentou título de anticorpos
neutralizantes capaz de reduzir em 50% o número de placas formadas, foi o dos
camundongos que receberam células estimuladas in vitro com vírus Dengue 2.No
entanto, em um teste considerando a redução em 90% (restringindo o título de
anticorpos a aqueles altamente neutralizantes), estes anticorpos não tenham sido
detectados. Após o desafio, o grupo dos camundongos que recebeu células
estimuladas in vitro com vírus Dengue 2 teve seu título de anticorpos
neutralizantes aumentado e detectado a presença em títulos maiores. No entanto,
encontramos um “background” de anticorpos naqueles animais que receberam
células sem estímulo, que pode estar relacionado com uma resposta dos
camundongos ao desafio, devido ao maior número de células linfocíticas que
foram adotivamente transferidas, mesmo não estando estas, previamente
estimuladas por antígeno de dengue.
Resultados
60
TABELA 4- Título de anticorpos neutralizantes obtidos antes do
desafio
Grupo
Título de Anticorpos Neutralizantes
PRNT 50/PRNT 90 (Antes do desafio)
Células sem estímulo Zero/ Zero
Controle Negativo Zero/ Zero
Controle Positivo Zero/Zero
Céls estimuladas in vitro 1:40/ Zero
TABELA 5- Título de anticorpos neutralizantes obtidos após o desafio
Grupo
Título de Anticorpos Neutralizantes
PRNT 50/PRNT 90 (Após desafio)
Células sem estímulo 1:40 / 1:10
Controle Negativo Zero / Zero
Controle Positivo 1:20 / Zero
Céls estimuladas in vitro > 1:160 / 1:40
Discussão
61
6. Discussão
Discussão
62
A febre da dengue é responsável por mais altos índices de morbidade e
mortalidade que qualquer outra doença causada por um arbovirus em humanos
(Gubler, 1998). É a mais importante doença viral transmitida por artrópodes de
significância para a saúde pública (Fonseca & Fonseca, 2002). A cada ano,
aproximadamente 100 milhões de casos de febre da dengue, e centenas de
milhares de febre da dengue hemorrágica ocorrem, dependendo da estrutura
epidêmica (Gubler, 1998).
O único método atualmente disponível para prevenir as infecções por
dengue é o controle do mosquito vetor, Aedes aegypti. Este método tem-se
mostrado caro e freqüentemente impraticável (Halstead & Deen, 2002). No
entanto, sabe-se que o método realmente eficiente para combater as infecções
virais e, dentre elas, as infecções pelos vírus dengue é a vacinação. A dengue nos
dias atuais é de grande preocupação para a saúde pública mundial, pois acomete
indivíduos residentes nos países em desenvolvimento, em especial nos países
tropicais, onde as condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a
proliferação do Aedes aegypti, principal mosquito vetor (FUNASA, 2002). Em
1997, a dengue foi considerada a mais importante doença viral transmitida por
mosquitos e com distribuição global comparada à da malária, além disso, estima-
se que 2,5 bilhões de pessoas vivam em áreas de risco (CDC, 1997). Embora a
dengue clássica seja confundida muitas vezes com outras infecções virais devido
aos sintomas semelhantes a outras infecções por vírus como: febre alta de início
abrupto, mialgias, mal-estar geral, a doença é considerada grave quando na forma
hemorrágica, e precisa ser diagnosticada precocemente e tratada a tempo,
evitando dessa forma a ocorrência de óbitos (Fonseca & Fonseca, 2002). A forma
mais grave da dengue caracteriza-se por febre alta, fenômenos hemorrágicos,
hepatomegalia e insuficiência circulatória. O grau de severidade da doença é
medido através da efusão de plasma, que se manifesta através dos valores
crescentes de hematócrito e da hemoconcentração (FUNASA, 2002). A febre de
dengue hemorrágica, quando na sua forma mais severa, pode levar à síndrome de
choque por dengue (DSS), a qual caracteriza-se por pacientes apresentando pulso
fino, diminuição da pressão sanguínea e hipotensão com pele fria e úmida. O
Discussão
63
paciente pode ir à óbito após 24 horas do início do choque, caso não seja feita a
correta reposição de fluidos (Gubler, 1998, Fonseca & Fonseca, 2002). Devido a
severidade da doença e sua ampla distribuição global, várias estratégias de
vacinação estão sendo desenvolvidas para as infecções causadas pelo vírus
dengue, e uma das possíveis estratégias de imunização, que foi escolhida para
ser analisada neste estudo é a transferência de imunidade adotiva. A transferência
de imunidade adotiva é um mecanismo através do qual é feita a transferência de
células do sistema imune, como linfócitos, de um doador imune para um receptor
singenéico (geneticamente idêntico) não imune para determinado antígeno.
Chaturvedi e colaboradores (1978) verificaram que, ao transferirem passivamente
soro obtido de camundongos imunizados após 3 a 5 semanas da terceira
inoculação intraperitonial de vírus dengue tipo 2, houve proteção dos
camundongos contra desafio intracerebral com vírus dengue. Entretanto, esta
proteção não foi obtida quando era transferido passivamente soro de
camundongos imunizados após 1 ou 2 semanas. Quando foi feita a transferência
adotiva de células de baço via intravenosa, obtidas de camundongos imunizados
com vírus dengue após 1 a 5 semanas, não houve proteção dos camundongos
receptores contra uma pequena dose de vírus Dengue no desafio. A depleção das
células T pelo tratamento dos camundongos com soro anti-timócitos, não
potencializou a infecção pelos vírus Dengue. O desenvolvimento de uma resposta
imune mediada por células contra o vírus dengue foi observado apenas em dois
períodos através do teste de inibição da migração de leucócitos com valores de
corte de 20 a 21%. O vírus Dengue não causou doença ou morte quando
administrado pelas rotas intraperitonial ou intravenosa, e este padrão não foi
afetado pelo pré-tratamento dos camundongos com sílica para danificar os
macrófagos locais. Foi concluído pelos pesquisadores que anticorpos possuem
um papel crítico na recuperação da infecção primária pelo vírus Dengue em
camundongos, entretanto, a resposta imune mediada por células e macrófagos
parece não apresentar papel protetor.
Shukla e Chaturvedi (1985) estudaram os efeitos supressores causados
pelo vírus Dengue através da transferência adotiva em camundongos. Segundo os
Discussão
64
pesquisadores o vírus Dengue 2 foi capaz de induzir a via supressora que envolve
a geração seqüencial de três tipos de linfócitos T e seus produtos. As células TS1
são geradas em camundongos infectados pelo vírus dengue, e produzem fator
supressor solúvel chamado SF, o qual é apresentado por células tipo-macrófago
para recrutar as células supressoras TS2, que produzem por sua vez, um fator de
supressão tipo prostaglandina chamado SF2. Este SF2 recruta as células TS3,
que finalmente induzem uma atividade supressora da resposta imune humoral.
Através de camundongos que receberam células TS1, adotivamente transferidas e
que foram estimulados in vivo com doses de vírus Dengue em intervalos
diferentes, eles observaram que houve supressão de PFC (célula formadora de
placa), após 2 semanas da inoculação das células TS1. Na quarta semana após a
inoculação das células TS1, esta atividade supressora foi diminuída para 4%.
Quando o fator de supressão SF foi transferido passivamente, os camundongos
que receberam este fator, apresentaram uma elevada atividade supressora até o
décimo dia. Após 15 e 21 dias, esta supressão foi reduzida. Nos camundongos
que receberam as células TS2 e que foram estimuladas in vivo com vírus dengue
em intervalos diferentes, foi observada uma atividade supressora via células TS2
que persistiu por 15 dias, mas pela terceira semana foi reduzida a 3%. Quando os
animais receberam SF2 em intervalos diferentes, e a atividade supressora foi
analisada in vitro, com inoculação na cultura de vírus dengue logo após o
plaqueamento das células, foi observado que a atividade supressora induzida por
SF2 persistiu até o sétimo dia, sendo reduzida a partir do décimo dia a 11%. Os
pesquisadores concluíram que, os diferentes constituintes da via supressora
persistem por períodos variáveis de tempo em camundongos normais que os
receberam adotivamente. A via supressora neste modelo murino envolveu a
indução seqüencial de três gerações de células T e seus produtos, os quais são
responsáveis pela presença prolongada da atividade supressora.
Em relação aos vírus dengue, como observado, poucos trabalhos foram
realizados usando a transferência adotiva de imunidade visando a proteção contra
novas infecções, e por este motivo, resolvemos neste estudo verificar seu
potencial como estratégia de imunização.
Discussão
65
Neste estudo, os estoques virais de Dengue 2 New Guinea C preparados
em cérebro de camundongos recém-nascidos, foram titulados através do ensaio
de unidades formadoras de placas (PFU) e através de PCR em tempo real. Os
títulos obtidos através dos dois métodos diferenciaram-se quanto aos valores,
sendo os valores dados pela PCR em tempo real maiores que os conseguidos
pelo outro método. Esta observação está relacionada com o fato da PCR em
tempo real ser um método molecular baseado na amplificação do RNA viral após
transcrição reversa usando-se “primers” e sondas específicos. A amplificação
obtida é resultante das partículas virais íntegras ou não, ou seja, a PCR em tempo
real amplifica o material genético do vírus, seja ele infeccioso ou não. O PFU por
sua vez, mostra a formação de placas e a capacidade de um determinado vírus
em infectar células, mas não fornece informações quanto a especificidade do vírus
que está replicando na cultura celular, que por outro lado é conseguida pela PCR
em tempo real. Dessa forma, ambas as metodologias foram importantes na
análise do estoques virais de Dengue 2 NGC utilizados neste estudo. O PFU para
mostrar a capacidade infectante dos vírus, e a PCR em tempo real, para fornecer
informações quantitativas (título viral) e qualitativas (especificidade do vírus frente
a um padrão de mesma linhagem viral).
A partir da obtenção e análise dos estoques virais de Dengue 2 NGC
quanto a especificidade e quanto ao título, os ensaios de transferência adotiva
foram realizados. Como previamente descrito, camundongos isogênicos da
linhagem BALB/c foram imunizados com células esplênicas estimuladas in vitro
pelo vírus Dengue 2 inativado. Após um período de imunização, alguns
camundongos foram sacrificados e as células esplênicas destes animais foram
analisadas quanto a proliferação celular.
Os primeiros ensaios de proliferação celular por nós realizados,
investigaram a capacidade de proliferação de células esplênicas de camundongos
imunizados in vivo pelo vírus, e não por células adotivamente transferidas. Como
observado na figura 4, foi detectado neste ensaio de imunização in vivo com vírus
Dengue 2 selvagem, índices de estimulação positivos. Estes dados confirmaram
então, que o vírus Dengue 2 foi capaz de induzir uma resposta proliferativa
Discussão
66
antígeno-específica nos camundongos, ou seja, o antígeno viral foi processado
pelas células apresentadoras de antígeno e adequadamente apresentado para os
linfócitos T, estimulando-os frente ao antígeno viral. Em cultura, houve
reconhecimento do antígeno pelos linfócitos T específicos para Dengue, e
expansão clonal com a detecção da proliferação celular pela incorporação da
timidina. Como a maioria dos estudos realizados com vírus Dengue e ensaios de
proliferação celular está envolvida com respostas de células T em humanos, foi
necessário este experimento inicial para análises posteriores com camundongos,
pois não temos modelo animal que mimetize com 100% de eficácia, as reações
virais observadas em células humanas (Johnson & Roehrig, 1999). A confirmação
de que células murinas imunizadas com vírus Dengue proliferam em cultura, foi
importante para a análise da proliferação celular nos camundongos imunizados
com células estimuladas in vitro, e adotivamente transferidas. Em estudos
realizados por outros pesquisadores envolvendo proliferação celular e vírus
Dengue, Vázquez e colaboradores (2002) buscaram verificar resposta imune à
peptídeos sintéticos da proteína prM de Dengue em camundongos BALB/c. Foram
desenhados e sintetizados 5 peptídeos derivados da proteína prM de Dengue 2, e
os camundongos foram imunizados formando 2 grupos. O primeiro grupo, formado
de 20 camundongos para cada peptídeo, recebeu os peptídeos conjugados a BSA
(albumina de soro bovino) e adjuvante completo de Freund na primeira dose,
adjuvante incompleto de Freund foi usado nas quatro inoculações posteriores. O
segundo grupo, formado de 5 camundongos para cada peptídeo, foi imunizado
com peptídeos livres (não conjugados) para avaliar a resposta das células T, em
um total de 3 imunizações com adjuvante incompleto de Freund. A resposta
proliferativa aos antígenos de dengue foi avaliada 8 semanas após a última dose.
A avaliação desta resposta mostrou que ocorreu uma significante resposta
proliferativa dos linfócitos T estimulados com 40g do antígeno viral para Dengue
2, e pulsados com
3
H-timidina, para quatro dos cinco peptídeos que imunizaram
os camundongos. No entanto, quando células T de baço de camundongos BALB/c
imunizados com o vírus foram cultivadas na presença de diferentes peptídeos, não
houve resposta proliferativa para qualquer dos peptídeos testados. A explicação
Discussão
67
encontrada pelos pesquisadores foi que estes peptídeos possuem epítopos não –
imunodominantes (epítopos críticos facultativos), pois os linfócitos T CD4
+
são
capazes de se reestimularem frente a uma proteína nativa. Eles concluem que o
estudo teve sua importância, em identificar a presença de epítopos de células T
nos peptídeos sintéticos das proteínas prM e M de Dengue 2, e também, na
avaliação pela primeira vez, das respostas celulares e humorais (verificaram
também a presença de anticorpos e proteção ao desafio) induzidas pelos
peptídeos sintéticos das proteínas prM do vírus Dengue. Rothman e
pesquisadores (1996) por sua vez, estudaram as células T específicas para
dengue, obtidas de camundongos, através do isolamento de clones de T CD4
+
e
T CD8
+
, e analisaram estas células quanto a especificidade ao sorotipo e proteína
viral, assim como as funções citolíticas. Camundongos BALB/c foram imunizados
com vírus Dengue 2 e em cultura foram reestimuladas com os antígenos virais.
Em seguida, para a geração de clones de T CD4
+
, as células foram incubadas
com células esplênicas singeneicas não imunes juntamente com antígenos virais
derivados de células Vero mais TCGF (fator de crescimento de célula T livre de
lectina em rato); para a geração de clones de T CD8
+
, as células foram incubadas
com células alvo restritas a MHC infectadas com Dengue 2 na presença de TCGF.
Após o isolamento dos clones de T CD4
+
, foi feita a análise destes clones quanto
a especificidade através de ensaios de proliferação usando antígenos de Dengue
inativados. Todos os clones mostraram respostas proliferativas para o antígeno de
Dengue 2. Três dos cinco clones foram Dengue 2-específicos, não mostrando
respostas proliferativas à antígenos virais de outros sorotipos. Um dos clones
mostrou uma baixa, mas reprodutível, resposta proliferativa para o antígeno de
Dengue 4. O quinto clone apresentou uma elevada resposta proliferativa para
todos os quatro sorotipos de Dengue, sendo a resposta para o antígeno de
Dengue 4, a mais elevada. A análise da resposta proliferativa destes clones de
TCD4
+
frente às proteínas E, NS1, NS3 e NS5 de Dengue 2, também foi realizada.
Nenhum dos clones mostrou resposta proliferativa usando as proteínas E, NS3 e
NS5. Apenas um dos clones proliferou de forma dose-dependente para a proteína
NS1 purificada de Dengue 2, os outros quatro clones não obtiveram esta mesma
Discussão
68
resposta. Em relação aos clones de TCD8
+
, a análise da especificidade à
proteínas e sorotipos de Dengue foi realizada através de ensaios líticos de células
alvo P815 infectadas com vírus Vaccinia, expressando as proteínas virais de
Dengue. Dos seis clones identificados, três reconheceram células alvo
expressando as proteínas estruturais de Dengue 2 e de nenhum outro sorotipo,
indicando que estes clones de CTLs eram sorotipo-específicos. Dois clones de
CTLs reconheceram proteínas não estruturais de sorotipos diferentes de Dengue,
dando a indicação de serem de reatividade cruzada, quando reconheciam
proteínas não estruturais do vírus Dengue. Um dos clones não reconheceu
nenhum dos vírus vaccinia recombinantes, embora tenha reconhecido as células
alvo infectadas com vírus Dengue 2. Os pesquisadores concluíram que em seus
estudos, foram encontrados tantos clones de T CD4
+
e T CD8
+
sorotipo-
específicos quanto clones de sorotipo-cruzado, no que se referiam a
especificidade ao sorotipo, e às proteínas virais de Dengue 2. Além da utilidade
deste sistema experimental murino em estudar o papel do sorotipo do vírus nas
respostas de células T, após uma infecção primária pelo vírus Dengue. Porém, em
nossos ensaios de transferência adotiva de imunidade, não foi detectada pela
incorporação com timidina a proliferação das células destes camundongos. Esta
ausência de proliferação pôde ser devida a uma falha dos antígenos virais
utilizados em estimular o reconhecimento dos linfócitos T, para que realizassem a
expansão clonal. Outras possibilidades seriam, a sensibilidade do método em
detectar pequena intensidade de proliferação, ou mesmo, uma concentração baixa
dos antígenos usados in vitro para induzir estímulo adequado para detecção por
este método. Nos ensaios iniciais, nos quais os camundongos foram imunizados in
vivo com vírus selvagem, e posteriormente testados quanto a proliferação in vitro,
foi observada a proliferação, mas os camundongos foram diretamente infectados
com vírus e não imunizados com células. Sabe-se que em camundongos existe
uma dificuldade em obter resultados quanto a infecção pelo vírus Dengue, devido
a uma falha do vírus em replicar a níveis detectáveis no sangue ou tecidos destes
animais. Este comportamento do vírus poderia reduzir o estímulo para respostas
de células T, em adição à reduzida sensibilidade do camundongo aos efeitos da
Discussão
69
ativação das células T, e produção de citocinas, interferindo na proliferação celular
(revisto por Rothman et al., 1996). Por outro lado, estudos mostraram que, o
contato do vírus Dengue 2 com células de baço de camundongos DBA/2 que
foram estimulados com Con-A in vitro, tiveram um decréscimo na incorporação da
timidina, o que levou à observação da capacidade do vírus Dengue em alterar
algumas respostas imunes relacionadas com células T e B (Islas-Rodrigues et al.,
1990). Mathew e pesquisadores (1999) também observaram em humanos, que a
proliferação de células T a uma ampla variedade de estímulos, é suprimida
durante infecção aguda pelo vírus Dengue. As células acessórias obtidas de
células mononucleares de sangue periférico (PBMC), durante uma infecção
aguda, não provêem um estímulo adequado para permitir proliferação das células
T. No entanto, as células T de PBMC de fase aguda podem proliferar, se forem
providas com células acessórias competentes. O decréscimo nas respostas
proliferativas de células T, também pode ser parcialmente restaurado, sob adição
de IL-2 e IL-7 exógeno. O decréscimo das moléculas co-estimulatórias e de
adesão devido a diminuição em número de monócitos, pode contribuir para os
efeitos imunosupressores vistos in vitro usando PBMC obtidos durante infecção
aguda por Dengue. Estas observações sugerem que nesta situação de infecção, o
principal defeito na habilidade de células T para proliferarem, está relacionado
com a população de células acessórias.
Vários estudos utilizando modelos murinos são usados para avaliar a
proteção contra desafio letal com vírus dengue, em ensaios de imunização com
vacinas (Konishi et al., 2000). Chambers e colaboradores (2003), avaliaram a
imunogenicidade e proteção contra desafio letal em camundongos imunizados
com vírus quiméricos de Febre Amarela/Dengue 2 e Febre Amarela/ Dengue 4,
que expressam as proteínas prM e E dos virus Dengue 2 e 4. Estes vírus foram
testados quanto as suas propriedades em culturas celulares e como vacinas
experimentais em camundongos. Camundongos que receberam a inoculação
intraperitonial de 10
5
pfu do vírus Febre Amarela/Dengue 2 ou Febre
Amarela/Dengue 4, foram desafiados com vírus dengue homólogos virulentos (10
6
pfu de vírus Dengue 2 NGC ou 10
4
pfu de vírus Dengue 4) por inoculação
Discussão
70
intracraniana. Animais controle foram “imunizados” com PBS mais 10% de soro
fetal bovino. Todos os camundongos imunizados com Febre Amarela/Dengue 2
resistiram ao desafio, e não exibiram sinais de doença em um período de
observação de 3 semanas pós-desafio. Em contraste, 70% dos animais controle
sucumbiram ao desafio, com uma média de sobrevivência em torno de 9,3 dias. O
mesmo foi observado com aqueles camundongos imunizados com Febre
Amarela/Dengue 4, onde todos resistiram ao desafio, e não exibiram nenhum dos
sinais da doença. Setenta e cinco por cento (75%) dos animais controle deste
experimento sucumbiram à encefalite, com uma média de sobrevivência em torno
de 9,8 dias. Os animais imunizados com os vírus quiméricos também foram
capazes de produzir anticorpos neutralizantes. Os pesquisadores concluíram, que
estes vírus quiméricos foram capazes de em cultura, processar e glicosilar
corretamente as proteínas E e PrM, e que os mesmos vírus conseguiram proteger
os animais imunizados contra encefalite letal, além de produzirem anticorpos
neutralizantes. Vázquez e pesquisadores (2002), além de observarem respostas
linfoproliferativas em camundongos imunizados com peptídeos sintéticos da
proteína prM de Dengue, como anteriormente descrito, também observaram a
proteção ao desafio intracerebral com dose letal de Dengue 2. Três dos cinco
peptídeos usados para imunização dos camundongos induziram uma proteção a
níveis estaticamente significantes, e somente um, dos três peptídeos sintéticos,
possuía atividade de anticorpos neutralizantes. Estas informações confirmaram a
idéia de que, em estudos usando peptídeos sintéticos, a atividade neutralizante in
vitro não é um requisito absoluto na proteção contra desafio com uma dose letal
de vírus. Os resultados obtidos com a análise da sobrevivência após desafio com
uma dose letal de vírus selvagem, em nosso estudo, mostraram que
camundongos receptores de células adotivamente transferidas e estimuladas in
vitro com vírus Dengue 2 inativado, são mais protegidos da encefalite letal que
aqueles camundongos que receberam células não estimuladas por antígeno viral
ou que não foram imunizados. A proteção foi ainda maior que nos animais
imunizados diretamente com vírus Dengue 2 selvagem. Estes dados sugerem
que, apesar de não ter sido detectada a proliferação de linfócitos, as células
Discussão
71
estimuladas in vitro e adotivamente transferidas, foram capazes de induzir uma
resposta imune protetora. Foi observada também, uma pequena porcentagem de
sobrevivência dos camundongos não imunizados, o que pode estar relacionado
com outros fatores de resistência à neurovirulência dos vírus Dengue, como
analisado no trabalho realizado por Chambers et al., 2003, descrito anteriormente.
Um dos fatores bem estabelecidos quanto a resistência de camundongos à
infecção do sistema nervos central (SNC) pelos vírus Dengue é a idade, sendo
que, com o aumento da idade há uma diminuição da intensidade de infecção do
SNC, fator observado por Wu e colaboradores (2003). Estes pesquisadores
concluíram através de seus resultados com vacina de DNA, que existe uma
dificuldade potencial em estabelecer um modelo de desafio em camundongos,
para analisar a eficiência protetora de vacinas contra infecções por Dengue pois,
parece haver uma resistência idade-dependente de camundongos à infecções
causadas por este vírus. Apesar de termos usados camundongos jovens, portanto,
susceptíveis à infecção do SNC, existe uma susceptibilidade individual a qual
envolve inúmeros fatores como nutrição, quantidade de vírus inoculado, que
poderia explicar esta pequena porcentagem de sobrevivência dos camundongos
não-imunizados. O grupo controle positivo, no qual foi feito a imunização dos
camundongos com o vírus selvagem, não foi tão protegido quanto o grupo que
recebeu células estimuladas in vitro, frente ao desafio com uma dose letal de
vírus. Estas informações estiveram de acordo com a hipótese de que os vírus
Dengue “per si”, em camundongos, não são bons imunogênicos, talvez devido a
dificuldade do vírus em replicar ou induzir uma relevante resposta imune em
camundongos (Rothman et al., 1996). Este talvez seja um dos motivos pelos quais
ainda não exista uma vacina tetravalente de vírus dengue atenuado para uso em
humanos. Os estudos mais avançados de vacina tetravalente apresentam
problemas de replicação viral, quando os quatro sorotipos virais em um mesmo
produto são administrados em humanos, com uma predominância de replicação
do Dengue 3 sobre os outros. O motivo deste real achado não é bem explicado na
literatura, mas a principal hipótese é de que estes vírus exibam características
replicativas diferentes em hospedeiros diferentes. Entretanto, o fator mais
Discussão
72
provável, que explicaria o melhor desempenho do grupo que recebeu células
estimuladas in vitro e adotivamente transferidas, é que os camundongos deste
grupo reagiram ao desafio de duas maneiras. A primeira delas, semelhante ao
grupo controle positivo, refere-se ao estímulo imune causado pelo próprio desafio
e a segunda, que foi provavelmente o diferencial neste experimento, deve-se à
presença de células já estimuladas para o antígeno e que responderam mais
precocemente à infecção, determinando uma melhor proteção contra o desafio,
neste grupo de animais. A proteção ao desafio não acontece de forma tão eficaz,
quando células de uma outra linhagem de camundongos estimuladas in vitro por
antígeno viral são transferidas adotivamente. Apesar de uma relativa
sobrevivência ao desafio, os camundongos receptores destas células ficaram
doentes mas não morreram, como verificado na figura 9, gráfico B. Estas
observações comprovaram a eficácia da transferência adotiva de imunidade, e
também o conceito de reconhecimento de antígeno através da apresentação deste
por MHC (complexo de histocompatibilidade principal) próprio (da mesma
linhagem e genótipo de camundongos) (Abbas et al., 2000). Neste grupo de
camundongos que recebeu células esplênicas de uma outra linhagem de
camundongos, também não foi observada proliferação celular, indicando falhas no
reconhecimento de antígeno viral, como visto na figura 5, gráfico E.
A avaliação da produção de anticorpos neutralizantes foi coerente com a
proteção observada nos ensaios de sobrevivência, após desafio com uma dose
letal de vírus. A capacidade de reduzir placas formadas em cultura através de
teste de neutralização, é medida pela porcentagem em reduzir o número de placas
formadas pelos vírus. A eficiência de redução de 50% é considerada uma boa
eficiência de neutralização dos anticorpos, porém o soro que os contém, teria uma
composição mais heterogênea de anticorpos neutralizantes dirigidos para o
epítopos do vírus. Soros com capacidade de redução de 50% são eficientes
neutralizadores de vírus, mas, melhores neutralizantes são soros capazes de
reduzir 90% das placas. Soros com eficiência de redução de 90%, possuem uma
composição mais homogênea em relação aos anticorpos, com concentrações
maiores destes, capazes de neutralizar com mais avidez os vírus Dengue. Os
Discussão
73
grupos de camundongos que receberam células estimuladas in vitro com antígeno
viral, produziram antes do desafio, anticorpos neutralizantes, embora não tenham
sido anticorpos capazes de reduzir 90% das placas, eles foram capazes de
reduzir 50% das placas nos testes de neutralização. Esta precoce produção de
anticorpos talvez seja devida ao “booster”, que induziu o reconhecimento do
antígeno viral, e permitiu uma resposta imune humoral, produzindo anticorpos. O
grupo controle positivo, por sua vez, não foi capaz de antes do desafio, produzir
anticorpos neutralizantes detectáveis, como já discutido, por motivos de menor
sensibilidade de camundongos em responder à replicação viral, e induzir uma
resposta imune humoral. Os outros grupos de camundongos que não foram
imunizados, ou que receberam células esplênicas não estimuladas por antígeno
viral, não produziram anticorpos pois, não entraram em contato com estímulo viral
para desenvolver uma resposta imune humoral. Resultados semelhantes de
produção de anticorpos neutralizantes antes do desafio, foram obtidos com
Konishi e colaboradores (2000), que avaliaram a imunogenicidade de uma vacina
de DNA expressando os genes das proteínas do envelope (E), e da pré-
membrana (prM) do vírus dengue tipo 2 em camundongos. Grupos de 3 a 5
camundongos BALB/c de 6 semanas de idade, foram imunizados duas ou três
vezes em um intervalo de 2 semanas, com doses da vacina pcD2ME, do
plasmídeo pcDNA3 sem as seqüências do vírus inserido, e como controle, alguns
camundongos foram imunizados intraperitonialmente com 1x10
5
pfu de dengue
tipo 2. Eles detectaram nos animais imunizados duas vezes com uma elevada
concentração da vacina pcD2ME, anticorpos neutralizantes em um título de 1:10,
capazes de neutralizar 90% das placas, o que não foi aumentado com mais uma
dose da vacina. Doses da mesma vacina com concentrações menores de DNA,
não induziram resposta de anticorpos neutralizantes, assim como não houve
produção de anticorpos em animais controle, vacinados 2 ou 3 vezes apenas com
o plasmídeo sem as seqüências do vírus inseridas. Os animais imunizados
intraperitonialmente com 1x10
5
pfu de dengue tipo 2 duas vezes, induziram um
título de 1:10 capaz de reduzir 90% das placas, o que não foi observado em nosso
estudo.
Discussão
74
A produção de anticorpos neutralizantes seguida ao desafio, é um
componente crítico para a proteção dos camundongos à uma encefalite letal
(Konishi et al., 2000). Estes pesquisadores observaram também que, além da
produção de anticorpos neutralizantes antes do desafio, houve também um
aumento destes títulos após o desafio, chegando a valores acima de 1:80 com
capacidade de reduzir 90% das placas naqueles grupos de camundongos
imunizados com uma dose mais elevada da vacina pcD2ME. Nos grupos de
camundongos que receberam apenas o plasmídeo pcDNA3 sem o inserto viral,
não foram detectados anticorpos neutralizantes nos primeiros dias após o desafio.
Apenas um camundongo deste grupo no dia 21, apresentou um título de 1:20 de
anticorpo neutralizante, sugerindo respostas imunes induzidas pela replicação do
vírus usado no desafio. Estes resultados, segundo os pesquisadores, indicaram
que a vacina pcD2ME induziu células B de memória, que foram responsivas à
infecção com dengue tipo 2 em camundongos. Wu e colaboradores (2003)
também verificaram a presença de anticorpos nos camundongos C3H imunizados
com vacina de DNA pD
2
NS1, que codifica para a proteína não estrutural NS1 de
Dengue. Os camundongos da linhagem C3H foram imunizados duas ou três vezes
com a vacina pD
2
NS1, ou com o plasmídeo psDNA3 sem o inserto do vírus, ou
com PBS. Uma semana após a última inoculação, os camundongos foram
desafiados intraperitonialmente com uma dose de 5x10
6
pfu de Dengue 2 PL046
(linhagem Taiwanesa isolada de paciente). A análise da sobrevivência foi feita por
3 semanas. Eles observaram que antes do desafio, não houve produção de
anticorpos em nenhum dos grupos de camundongos imunizados. Após o desafio,
foi verificada uma forte resposta de anticorpos, através de ELISA, nos
camundongos imunizados com a vacina pD
2
NS1 se comparada com os
camundongos imunizados com PBS, ou com plasmídeo pcDNA3. Estes resultados
indicaram um efeito de estimulação através da imunização com DNA, de forma
antígeno-específica. Através de outros resultados obtidos pelos pesquisadores,
eles concluíram que esta vacina de DNA, que codifica para a proteína NS1 de
Dengue, possui potencial, pois foi capaz de conferir respostas imunes que
Discussão
75
contribuíram para a proteção dos camundongos desafiados com dose letal de
Dengue 2.
Esta proteção também foi observada em nosso trabalho nos camundongos
que obtiveram um elevado título de anticorpos neutralizantes, pertencentes ao
grupo dos animais que receberam adotivamente células esplênicas estimuladas in
vitro pelo vírus Dengue 2. A transferência possibilitou um desenvolvimento de
resposta imune humoral eficaz, e conferiu proteção contra a encefalite letal, com
anticorpos capazes de reduzir 90% das placas. O grupo controle positivo diante da
dose letal de vírus Dengue 2 selvagem, também foi capaz de produzir anticorpos
neutralizantes, porém, em títulos menores e capazes de reduzir 50% das placas.
Este talvez seja o motivo pelo qual ocorreu uma sobrevivência menor do grupo
controle positivo, em relação ao grupo de camundongos que recebeu células
esplênicas estimuladas in vitro com antígeno viral. Foi observada também a
presença após o desafio, de anticorpos neutralizantes no grupo de camundongos
que recebeu células não estimuladas por antígeno viral. Curiosamente, este grupo
de animais não deveria produzir anticorpos neutralizantes, pois não entraram em
contato com o vírus anteriormente, mas chegaram a desenvolver um título de 1:10
de anticorpos capazes de reduzir 90% das placas. Uma possível explicação para
esta produção de anticorpos talvez seja a presença de um número elevado de
células do sistema imune, como linfócitos e células apresentadoras de antígeno,
que juntamente com as células residentes do camundongo, conseguiram
desenvolver uma forte resposta imune humoral frente à infecção viral causada
pelo desafio intracerebral. O desafio propiciou uma resposta imune pela replicação
do vírus utilizado, embora esta resposta não tenha sido eficiente em proteger
todos animais do desafio, nem todos os animais deste grupo sucumbiram à
encefalite letal. Outros estudos sugeriram que, embora a produção de anticorpos
neutralizantes seja importante na proteção contra o desafio intracerebral, em
alguns casos, esta proteção não pode ser creditada exclusivamente à presença
destes, e que os mecanismos responsáveis por esta proteção não estão
completamente esclarecidos (Rothman et al., 1996). O grupo controle negativo
não apresentou anticorpos neutralizantes mesmo após o desafio, e também não
Discussão
76
foi eficientemente protegido da encefalite letal. A ausência de anticorpos neste
grupo era esperada devido ao não reconhecimento prévio do vírus, e a
impossibilidade no intervalo de tempo analisado, de desenvolver uma resposta
imune humoral suficientemente potente para proteger os animais do desafio.
O mecanismo de transferência adotiva de imunidade com estimulação in
vitro pelo vírus Dengue-2 inativado, mostrou-se capaz de induzir resposta imune
adequada e eficiente contra as infecções pelo sorotipo 2 do vírus Dengue, em
camundongos BALB/c. Provavelmente, em experimentos futuros utilizando os
outros 3 sorotipos do vírus Dengue, seja possível obter as mesmas respostas
protetoras e, conseguir informações também, sobre os efeitos dos quatro sorotipos
na resposta imune humoral e celular em um único recipiente murino. É necessária
a obtenção de uma resposta imune equilibrada entre os quatro sorotipos, quando
colocados juntos em um mesmo organismo, não havendo portanto, uma
prevalência na produção de anticorpos dirigidos para qualquer dos sorotipos.
Assim, seria evitada a produção de anticorpos não neutralizantes para os outros
sorotipos não prevalentes. Caso fosse obtido este equilíbrio na resposta imune
entre os quatro sorotipos do vírus Dengue, uma nova etapa envolveria o uso de
modelo primata não - humano. Obtido sucesso nestes animais quanto a redução
da viremia e produção de anticorpos para os quatro sorotipos, de forma
equilibrada entre eles, este estudo poderia ser finalizado com testes em células
humanas. A utilização da transferência de imunidade como uma estratégia de
imunização em humanos, não teria como objetivos imunizar populações inteiras
que vivem em áreas epidêmicas. Seria dirigida à grupos restritos, como tropas
militares em campanha que precisam estar imunes contra a dengue,
pesquisadores que visitam regiões epidêmicas na coleta de dados de campo e
outros pequenos grupos. Se fosse conseguida uma estimulação dos linfócitos do
indivíduo para os quatro sorotipos, este estaria imune para qualquer dos sorotipos
da dengue e não correria riscos de desenvolver a dengue hemorrágica. A
princípio, este indivíduo teria células responsivas produtoras de anticorpos
neutralizantes, que ao entrarem em contato com qualquer dos sorotipos estariam
aptas a produzirem tais anticorpos, evitando o desenvolvimento de ADE. A
Discussão
77
aplicação desta estratégia de imunização, porém, teria alguns problemas quanto
ao custo, pois estes ensaios são dispendiosos, necessitando de técnicos
capacitados, e também quanto a possibilidade de desenvolvimento de ADE, pois é
sabido que as células de cada indivíduo reagem de maneira particular a uma
infecção viral. Para a imunização, é necessária a certeza de produção de
anticorpos neutralizantes para os quatro sorotipos, caso contrário, a imunização
através da transferência adotiva favoreceria o desenvolvimento da dengue
hemorrágica através do fenômeno de ADE. Assim, o futuro desta estratégia ainda
é incerto, mas com possibilidades de sucesso.
No momento, este estudo contribuiu com informações relativas ao vírus e
seu comportamento em um modelo murino. Devido a inexistência de um modelo
animal que mimetize os sintomas causados pelo vírus Dengue em humanos,
quaisquer informações obtidas sobre os efeitos deste vírus na resposta imune e o
comportamento do mesmo, são de extrema valia. Dessa forma, a compreensão
dos fatores imunológicos da doença, fornece informações importantes para o
desenvolvimento de futuras estratégias de imunização para a dengue, tão
necessárias para o combate desta infecção viral.
Conclusões
78
7. Conclusões
Conclusões
79
Através da análise dos experimentos realizados neste estudo usando a
transferência de imunidade adotiva como uma estratégia de imunização para o
vírus Dengue 2 New Guinea C, foi possível chegar às seguintes conclusões:
1. Não foi possível verificar a resposta proliferativa antígeno-específica
através de ensaios de proliferação celular para os linfócitos T, obtidos dos
camundongos que receberam adotivamente células esplênicas;
2. A transferência de imunidade adotiva foi uma estratégia de imunização
eficiente em proteger com índices de sobrevivência de 100% contra a
encefalite letal, os camundongos receptores de células esplênicas
adotivamente transferidas e estimuladas in vitro para o vírus Dengue 2;
3. A transferência de imunidade adotiva mostrou ser eficiente em desenvolver
também uma resposta imune humoral, com anticorpos neutralizantes
contra o vírus Dengue 2 NGC;
4. O estudo da transferência de imunidade abriu caminhos para avançar no
conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos nas infecções
causadas pelo vírus Dengue.
Resumo
80
8. Resumo
Resumo
81
A febre da dengue é a mais importante doença viral transmitida por
artrópodes de significância para a saúde pública, pois acomete a cada ano,
centenas de milhares de indivíduos nos países em desenvolvimento,
principalmente nos países das regiões tropicais, onde as condições do meio
ambiente favorecem a proliferação do Aedes aegypti, principal mosquito vetor. A
doença é causada pelo vírus Dengue, um vírus envelopado, de RNA senso
positivo, e que mede cerca de 50nm de diâmetro. A febre de Dengue, apresenta-
se com um amplo espectro de sintomas, indo desde uma doença febril aguda até
uma forma mais grave com liberação de plasma e fenômenos hemorrágicos, que é
a dengue hemorrágica. A dengue hemorrágica, em sua forma mais severa, pode
levar à síndrome de choque por dengue e esta por sua vez, é fatal se não tratada
a tempo, pois leva os pacientes ao choque devido à intensa efusão de plasma.
Vários estudos estão sendo realizados para a obtenção de eficientes estratégias
de imunização, que possibilitem o desenvolvimento de uma resposta imune eficaz
e duradoura para estas infecções virais. A vacinação é considerada a mais
eficiente estratégia contra as infecções por dengue. A vacina precisa ser
tetravalente, pois precisa desenvolver uma eficiente resposta protetora contra os
quatro sorotipos de dengue, evitando assim, a formação de imunocomplexos com
anticorpos intensificadores que aumentam a infecção viral. Em nosso laboratório,
além do desenvolvimento de vacinas de DNA para os quatro sorotipos da dengue,
desenvolveu-se um estudo para analisar a transferência de imunidade adotiva,
como mais uma estratégia de imunização para as infecções pelo vírus Dengue 2.
A transferência adotiva consiste em um mecanismo através do qual é feita a
transferência de células do sistema imune, como linfócitos, de um doador imune
para um receptor singenéico (geneticamente idêntico) não imune para um
determinado antígeno. Assim, foram transferidas células esplênicas de
camundongos BALB/c isogênicos, estimuladas in vitro pelo vírus Dengue 2
inativado, ou não estimuladas por antígeno viral. Foi observado através dos
ensaios de proliferação celular de linfócitos que não ocorreu a detecção de
proliferação antígeno-específica. Por outro lado, houve uma elevada sobrevivência
ao desafio intracerebral com uma dose letal de vírus Dengue 2 selvagem,
Resumo
82
naqueles camundongos receptores de células esplênicas estimuladas in vitro e
adotivamente transferidas. Esta sobrevivência foi de 100% e maior até que a do
controle positivo, (dos camundongos imunizados com o vírus Dengue 2
selvagem), que ficou em torno de 70%. Os grupos de camundongos não
imunizados (controle negativo), e dos camundongos receptores de células
esplênicas não estimuladas com antígeno viral, sucumbiram a encefalite letal. Nos
mesmos grupos de camundongos receptores de células esplênicas estimuladas in
vitro e adotivamente transferidas, foi detectado elevados títulos de anticorpos
neutralizantes após o desafio, em torno de 1:160 para redução de 50% das placas
e 1:40 para a redução de 90% das placas. Não foi detectada a presença de
anticorpos neutralizantes no grupo controle negativo após o desafio, porém, no
grupo de camundongos receptores de células esplênicas não estimuladas com
antígeno viral, também foi detectada a presença de anticorpos neutralizantes após
o desafio, embora não tenham sido protegidos contra a encefalite letal. Dessa
forma, a transferência de imunidade adotiva mostrou ser uma promissora
estratégia de imunização contra as infecções pelo vírus Dengue 2 New Guinea C,
capaz de desenvolver uma resposta imune humoral protetora contra encefalite
letal em camundongos BALB/c isogênicos.
Summary
83
9. Summary
Summary
84
Dengue fever is the most important disease transmitted by arthropods of
importance to public health because each year one hundred thousand cases
occur in developing countries, specially in countries of tropical regions, where
enviromental conditions supported Aedes aegypti proliferation, the main mosquito
vector. The disease is caused by Dengue virus, a virus covered by an envelope,
having a positive-sense RNA genome and 50nm in diameter. Dengue fever is
characterized by a wide spectrum of symptoms ranging from an acute febrile
disease to the most severe form with plasma leakage and hemorrhagic
manifestations, the dengue hemorrhagic fever. Many studies have been done to
develop efficient immunization strategies to induce an efficient and durable
immune response to these viral infections. Vaccination is considered the most
efficient strategy against dengue virus infections. Vaccine have to be tetravalent,
because it needs to develop an efficient protective response against the four
serotypes of dengue, avoiding in this way, the formation of immune complexes
with enhanced antibodies which augment viral infection. In our laboratory, we
have been developing DNA vaccines to the four serotypes of dengue virus, and
we have decided to undertake a study to analyze the adoptive transfer of
immunity as an additional immunization strategy against Dengue virus infections.
The adoptive transfer of immunity is a mechanism in which a transfer of immune
system cells is done from an immune donor to a non immune syngeneic receptor
(genetically identical). In this way, spleen cells of BALB/c mice primed in vitro by
Dengue 2 virus as well as not primed spleen cells were transfered to naive
syngeneic mice. The cellular proliferation assays did not detect cellular
proliferation. On the other hand, it was observed that there was an increased
survival rate after intracerebral challenge with a letal dose of wild Dengue 2 virus
in mice that have received the transfer of in vitro primed cells by this virus. The
survival rate of this group was 100% and it was higher than the positive control
(mice immunized with wild Dengue 2 virus) group, which survival rate was about
70%. Non immune mice group (negative control) and mice which had received the
transfer of not primed spleen cells succumbed by letal encephalitis. In the group
of mice which had received in vitro primed cells an elevated level of neutralizing
Summary
85
antibodies was detected after challenge, the titers were over of 1:160 for a 50% of
plaque reduction and 1:40 for a 90% of plaque reduction. The presence of
neutralizing antibodies was not detected in negative control group after challenge,
however, neutralizing antibodies were detected post challenge in the group of
mice which had received not primed spleen cells, although this response was not
protective against letal encephalitis. Thus, the adoptive transfer of immunity
showed to be a promising strategy against Dengue 2 New Guinea C virus
infections since it was capable of inducing a humoral immune response and
protective against letal encephalitis in isogenic BALB-c mice.
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