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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
Papel do estresse na reatividade de
camundongos à infecção por Leishmania major
Andressa Rodrigues de Souza
RIBEIRÃO PRETO
2008
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ANDRESSA RODRIGUES DE SOUZA
Papel do estresse na reatividade de
camundongos à infecção por Leishmania major
RIBEIRÃO PRETO
2008
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área
de concentração: Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Souza, Andressa Rodrigues de
Papel do Estresse na Reatividade de Camundongos à Infecção
por Leishmania major.
Ribeirão Preto, 2008.
106 p. 25 il., 30 cm
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Área de concentração
em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto
1. Estresse. 2. Leishmania major. 3. Psiconeuroimunologia
Dedicatória
Aos meus queridos pais Aparecido José Rodrigues de Souza e Ariadne Silva
Rodrigues de Souza, por investirem e acreditarem em mim. Pelo amor, dedicação
e apoio incondicional em todos os momentos da minha vida.
Às minhas irmãs Aricila e Amélia pelos esforços despendidos em momentos
difíceis. Pelo carinho e amizade.
Ao meu namorado, Gustavo, pelo respeito atribuído à minha vida profissional.
Pelo incentivo, companheirismo, compreensão e paciência dedicados em toda a
nossa trajetória.
A todos que compartilharam e incentivaram os meus sonhos e de alguma forma
contribuíram neste trabalho...
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho Pinto, pelo acolhimento no laboratório, pela
criteriosa orientação neste trabalho e valiosos ensinamentos passados. Agradeço
pela atenção dedicada, pelos conselhos e sugestões oferecidos, por contribuir
efetivamente para o meu crescimento profissional. Esta minha conquista é atribuída
à sua disponibilidade, ao incentivo constante e por ter acreditado em mim. Obrigada
por tudo professor!
Ao Prof. Dr. José Antunes Rodrigues e à Profª Drª Lucila L. K. Elias por terem cedido
o seu laboratório para as dosagens hormonais. Em especial agradeço à Drª Lucila
pela disposição em dar sugestões ao meu trabalho, pelos importantes ensinamentos
oferecidos na área da psiconeuroimunologia, pelo acolhimento e atenção.
Ao Prof. Dr. João Santana da Silva por ter disponibilizado o seu laboratório para a
utilização do espaço físico e uso irrestrito dos seus equipamentos. Agradeço
especialmente os alunos integrantes e participantes do laboratório (Djalma, Diego,
Paulo, Fabrine, Carlo, Vanessa, Fredy...) pela gentileza com que sempre me
trataram, pelos ensinamentos imunológicos, pela força nas horas difíceis, pela
amizade.
Às funcionárias Val e Marina pela colaboração importante na realização das
dosagens hormonais e pelo carinho com que me atenderam. Agradeço também os
funcionários da Secretaria do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Ivone,
Lúcia e Ronaldo, pela atenção e dedicação prestadas nos momentos de dificuldade
junto à pós-graduação.
À Fabiana Rodrigues dos Santos pela grandiosa sabedoria transmitida durante a
minha formação acadêmica, pela participação constante nos meus projetos
científicos e em especial neste trabalho. Agradeço a você toda a dedicação e
disponibilidade em me atender nos momentos que mais precisei, pela amizade
sincera, pelo bom humor e energia positiva sempre presente. Devoto a você toda a
minha admiração!
À Denise Brufato Ferraz pela prontidão em me ajudar na realização dos
experimentos, pelo profissionalismo e dedicação, pela companhia agradável no
laboratório, pelas conversas e risadas, por todo o carinho, compreensão e paciência.
Ao colega Javier pela importante ajuda na realização da análise estatística dos
resultados apresentados nessa dissertação, pelos ensinamentos, idéias e sugestões
oferecidas, e principalmente pela gentileza com que me recebeu em seu laboratório.
Às colegas Marcelle, Vanessa e Fernanda, pela convivência no laboratório, pela
colaboração científica, pelos momentos de alegria compartilhados, pelo
companheirismo, além do precioso apoio profissional e emocional dedicado.
Às minhas grandes amigas da pós-graduação: Vivi “a meiga”, Thaís “a fortaleza”,
Nayara “a sabia”, Andréia “a justa”, Mariana “a guerreira” e Larissa “a prestativa”.
Agradeço imensamente todas vocês por estarem ao meu lado em todos os
momentos, por somarem conhecimento, subtraírem a inveja e o sentimento
negativo, multiplicarem meus sonhos e dividirem a mais pura amizade. Obrigada
pelos ouvidos atentos às minhas lamentações, pelos conselhos sábios nos
momentos de necessidade, pelo abraço forte e sincero nas conquistas adquiridas,
pela força, pelas gargalhadas, pela alegria, pelo afeto... Adoro vocês meninas!
Aos queridos colegas: Cláudia Sossai, Renata Sesti, William Andrioli, Rosana Reis,
Adriana Manfiolli, Patrícia Dillenburg, Sami Yokoo, Emiliana Mandarano e William
Schluchting por todos os momentos felizes compartilhados.
Ao CNPq pela concessão de bolsa de mestrado.
A todos... muito obrigada por tudo!
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS ................................................................i
ABREVIATURAS E SIGLAS ..........................................................................iv
RESUMO ............................................................................................................vi
ABSTRACT......................................................................................................viii
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
1
1.1 – Psiconeuroimunologia.................................................................................................2
1.2 – Alostase e Carga Alostática.........................................................................................4
1.3 – Interação entre os Sistemas Nervoso, Endócrino e Imune..........................................6
1.3.1 – O eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA)................................................................7
1.3.2 – Efeitos dos glicocorticóides no sistema imune............................................................. 11
1.3.3 – O eixo hipotalâmico-pituitária-gonadal (HPG)............................................................
16
1.4 – Modelos de Estresse ..................................................................................................18
1.5 – Efeitos do Estresse em Doenças Infecciosas.............................................................19
1.6 – Leishmanioses ...........................................................................................................22
2. OBJETIVOS...................................................................................................29
3. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................31
3.1 – Animais de experimentação.......................................................................................32
3.2 – Parasitas.....................................................................................................................32
3.3 – Meio de cultura..........................................................................................................32
3.4 – Obtenção e cultivo do parasita ..................................................................................33
3.5 – Infecção de camundongos C57BL/6 e BALB/c com promastigotas de L. major .....34
3.6 – Medida das patas .......................................................................................................35
3.7 – Condições estressantes utilizadas para a indução de estresse agudo ou estresse
crônico imprevisível...........................................................................................................36
3.8 – Estresse crônico (EC) ................................................................................................38
3.9 – Estresse agudo (EA) ..................................................................................................38
3.10 – Estresse crônico imprevisível (ECI)........................................................................40
3.11 – Dosagem do hormônio corticosterona.....................................................................41
3.12 – Obtenção e plaqueamento de macrófagos peritoneais murinos...............................42
3.13 – Infecção in vitro de macrófagos com promastigotas de L. major ...........................42
3.14 – Obtenção de células dos linfonodos ........................................................................43
3.15 – Dosagem de citocinas..............................................................................................43
3.16 – Dosagem de óxido nítrico........................................................................................44
3.17 – Quantificação da carga parasitária nas patas...........................................................45
3.18 – Análise estatística....................................................................................................45
4. RESULTADOS...............................................................................................46
4.1 – Efeito do estresse crônico em camundongos C57BL/6 de ambos os sexos infectados
com Leishmania major.......................................................................................................47
4.2 – Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas lesões pela infecção com
Leishmania major em camundongos C57BL/6 de ambos os sexos ...................................48
4.3 – Avaliação dos níveis de corticosterona em camundongos C57BL/6 de ambos os
sexos submetidos ao ECI....................................................................................................51
4.4 – Avaliação dos níveis de corticosterona em cada condição estressante submetida aos
animais C57BL/6 machos e fêmeas não-infectados...........................................................54
4.5 – Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas lesões pela infecção por L. major
em camundongos BALB/c de ambos os sexos...................................................................57
4.6 – Avaliação dos níveis de corticosterona em camundongos BALB/c, de ambos os
sexos, submetidos ao ECI...................................................................................................63
4.7 – Avaliação dos níveis de corticosterona em camundongos BALB/c, machos e fêmeas
não-infectados, submetidos a cada condição estressante....................................................66
4.8 – Determinação do número de parasitas recuperados de patas de camundongos
BALB/c, machos e fêmeas, infectados com L. major e submetidos ao ECI......................68
4.9 – Avaliação da produção de óxido nítrico (NO) in vitro por macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c de ambos os sexos, submetidos ao ECI e infectados pelo parasita
L. major ..............................................................................................................................69
4.10 – Análise da produção de citocinas por linfócitos T de camundongos BALB/c
machos submetidos ao ECI durante o curso da infecção por L. major ..............................71
4.11 – Avaliação do peso corporal de camundongos BALB/c machos e fêmeas submetidos
ao ECI, durante o curso da infecção por L. major..............................................................74
5. DISCUSSÃO...................................................................................................77
6. CONCLUSÕES ..............................................................................................91
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................93
i
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1.1 - Modulação da resposta hormonal no sistema nervoso central após um estímulo
estressor (Glaser & Kiecolt-Glaser, 2005) .................................................................................9
Figura 1.2 - Estrutura dos glicocorticóides endógenos corticosterona e cortisol....................10
Figura 1.3 - Efeitos dos glicocorticóides nas células do sistema imune (Sternberg, 2006)....12
Figura 1.4 - Mecanismos moleculares de regulação de neurotransmissores e glicocorticóides
na produção de citocinas (Sternberg, 2006) .............................................................................13
Figura 1.5 - Influência da secreção da corticosterona e adrenalina na imunidade (Modificado
de Elenkov & Chrousos, 1999) ................................................................................................15
Figura 1.6 - Ciclo de vida da Leishmania spp (WHO, 2008)..................................................25
Figura 1.7 - Resposta imune contra Leishmania (Ruiz & Becker, 2007)................................27
Figura 3.1 - Medida das patas de camundongos C57BL/6 fêmeas (A) e machos (B) infectados
com diferentes concentrações de L. major...............................................................................35
Figura 4.1 - Medida das patas de camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B)
submetidos ou não ao estresse crônico durante a infecção com L. major................................49
Figura 4.2 - Comparação entre machos e fêmeas C57BL/6 no tamanho das lesões
apresentadas nos diferentes grupos, submetidos ou não ao estresse crônico...........................50
Figura 4.3 - Medidas das patas de camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B) submetidos
ao estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso de infecção por L. major ......................... 52
Figura 4.4 - Comparação entre machos e fêmeas de camundongos C57BL/6, submetidos ou
não ao ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos diferentes grupos..................................53
ii
Figura 4.5 - Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos C57BL/6 após 11 semanas de infecção com L. major.........55
Figura 4.6 - Dosagem de corticosterona em camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B)
submetidos a diferentes condições estressantes........................................................................56
Figura 4.7 - Medidas das patas de camundongos BALB/c vindos do Biotério Central machos
(A) e fêmeas (B) submetidos ao estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso de
infecção por L. major ...............................................................................................................59
Figura 4.8 - Comparação entre machos e fêmeas de camundongos BALB/c vindos do
Biotério Central, submetidos ou não ao ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos
diferentes grupos ......................................................................................................................60
Figura 4.9 - Medidas das patas de camundongos BALB/c vindos do Biotério da Genética,
machos (A) e fêmeas (B), submetidos ao estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso
de infecção por L. major...........................................................................................................61
Figura 4.10 - Comparação entre machos e fêmeas de camundongos BALB/c vindos do
Biotério da Genética, submetidos ou não ao ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos
diferentes grupos ......................................................................................................................62
Figura 4.11 - Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos BALB/c vindos do Biotério central após 12 semanas de
infecção com L. major..............................................................................................................64
Figura 4.12 - Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos BALB/c vindos do Biotério da Genética após 12 semanas de
infecção com L. major..............................................................................................................65
Figura 4.13 - Dosagem de corticosterona em camundongos BALB/c machos (A) e fêmeas
(B) submetidos a diferentes condições estressantes.................................................................67
iii
Figura 4.14 - Carga parasitária das patas infectadas com L. major de camundongos BALB/c
vindos do Biotério Central (A) e Biotério da Genética (B)......................................................70
Figura 4.15 - Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos
BALB/c submetidos ou não ao ECI in vivo e estimulados ou não com promastigotas de L.
major in vitro............................................................................................................................72
Figura 4.16 - Detecção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 em sobrenadantes de células do linfonodo
inguinal drenante de camundongos BALB/c machos do Biotério Central submetidos a
diferentes tratamentos in vivo...................................................................................................75
Figura 4.17 - Ganho de peso corporal de camundongos BALB/c ao final do curso da infecção
com L. major (12 semanas de infecção)...................................................................................76
Tabela 1.1 - Espécies de Leishmania que causam doença (Modificado de Reithinger et al,
2007).........................................................................................................................................23
Tabela 3.1 - Grupos experimentais de camundongos C57BL/6 de ambos os sexos infectados
com diferentes concentrações do parasita L. major..................................................................34
Tabela 3.2 - Diferentes tipos de estresse agudo induzidos nos animais C57BL/6 (A) e
BALB/c (B) de ambos os sexos................................................................................................39
Tabela 3.3 - Grupos experimentais de animais C57BL/6 e BALB/c de ambos os sexos
submetidos ou não ao ECI........................................................................................................40
iv
ABREVIATURAS E SIGLAS
ACTH: adrenocorticotropic hormone – hormônio adrenocorticotrófico
AIDS: acquired immunodeficiency syndrome – síndrome da imunodeficiência adquirida
ANOVA: analisys of variance
AP1: activator protein 1 – proteína ativadora 1
APC: antigen presenting cell – célula apresentadora de antígeno
AVP: arginina vasopressina
CRH: corticotropin-releasing hormone – hormônio de liberação corticotrófico
DC: dendritic cell – célula dendrítica
DHEA: dihydroepiandrosterona
DNA: deoxyribonucleic acid – ácido desoxiribonucléico
DTH: delayed-type hypersensitivity – hipersensibilidade tipo tardia
ECI: estresse crônico imprevisível
ELAM 1: endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 - molécula de adesão de leucócito
endotelial 1
ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay – ensaio imunoenzimático de adsorção
FSH: follicle-stimulating hormone – hormônio folículo estimulante
GC: glicocorticóide
GH: growth hormone – hormônio do crescimento
GnRH: gonadotropin releasing hormone - hormônio liberador de gonadotrofina
GR: glucocorticoid receptor – receptor de glicocorticóide
HIV: human immunodeficiency virus – vírus da imunodeficiência humana
HPA: hipotálamo-pituitária-adrenais
HPG: hipotálamo-pituitária-gônadas
HSV: herpes simplex vírus – vírus do herpes simples
ICAM 1: intracellular adhesion molecule 1 – molécula de adesão intracelular 1
IFN: interferon
Ig: imunoglobulina
IκB: inhibitor kappa B – inibidor kappa B
IL: interleucina
LCD: leishmaniose cutânea difusa
LCL: leishmaniose cutânea localizada
v
LH: luteinising hormone – hormônio luteinizante
MHC: major histocompatibility complex – complexo de histocompatibilidade principal
MR: mineralocorticoid receptor – receptor de mineralocorticóide
NF-κB: nuclear factor kappa B – fator nuclear kappa B
NK: natural killer
NO: nitric oxide – óxido nítrico
NOS: nitric oxide syntase – óxido nítrico sintase
PBS: phosphate buffered salin – salina tamponada com fosfato
PNI: psiconeuroimunologia
PVN: paraventricular nucleus – núcleo paraventricular
RNA: ribonucleic acid – ácido ribonucléico
SFB: soro fetal bovino
SNC: sistema nervoso central
SNS: sistema nervoso simpático
Th: linfócito T helper
TGF: tumoral growth factor – fator de crescimento tumoral
TNF: tumoral necrosis factor – fator de necrose tumoral
VCAM 1: vascular adhesion molecule 1 – molécula de adesão vascular 1
WHO: world health organization – organização mundial da saúde
vi
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e
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vii
O estresse crônico afeta significativamente a função do sistema imune, assim como modifica a
evolução de uma variedade de doenças infecciosas. Neste estudo tivemos por objetivo investigar o
papel do estresse crônico no modelo de resistência/susceptibilidade à infecção por Leishmania major
em camundongos isogênicos e, paralelamente, avaliar possíveis diferenças entre machos e fêmeas na
reatividade ao estresse. Nossos dados sugerem que o estresse crônico repetitivo, por isolamento social,
não induz uma alteração uniforme no tamanho das lesões cutâneas leishmanióticas de camundongos
C57BL/6 de ambos os sexos. Por outro lado, quando camundongos tanto da linhagem C57BL/6,
quanto da linhagem BALB/c, foram submetidos ao estresse crônico imprevisível (aleatório), verificou-
se um aumento significativo das lesões cutâneas de machos e fêmeas C57BL/6, bem como de machos
BALB/c. Ao final do curso da infecção e indução de estresse, os níveis plasmáticos do hormônio
corticosterona apresentaram-se elevados apenas nas fêmeas da linhagem C57BL/6 e nos machos da
linhagem BALB/c. Além desses parâmetros avaliados, a quantificação da carga parasitária no local da
infecção, em animais BALB/c, evidenciou a presença de um número maior de parasitas nas lesões,
tanto nos machos como nas fêmeas submetidos ao estresse. Apesar desse aumento do número de
parasitas em animais de ambos os sexos, apenas nos machos da linhagem BALB/c foi detectada
diminuição na produção de óxido nítrico por macrófagos do peritônio. Nos camundongos machos
dessa linhagem, após o estresse crônico aleatório, a produção das citocinas IFN-γ , IL-4 e IL-5 também
foi alterada, com discreta diminuição na concentração de IFN-γ e aumento dos níveis de IL-4 e IL-5.
Um fato a ser notado, é que camundongos BALB/c machos apresentaram menor ganho de massa
corporal, não só quando foram infectados e estressados, mas também quando foram apenas infectados,
em relação aos animais saudáveis. Em conjunto, esses dados sugerem que as fêmeas da linhagem
C57BL/6 são mais susceptíveis à infecção por L. major que os machos, além de apresentarem maior
sensibilidade a eventos estressantes crônicos. Nos camundongos da linhagem BALB/c, apesar das
fêmeas apresentarem lesões de patas mais evidentes que os machos, essa diferença entre os sexos
torna-se praticamente inexistente quando os animais são submetidos ao estresse crônico aleatório,
possivelmente pela maior sensibilidade dos machos a esse estresse.
viii
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Chronic stress significantly affects the function of the immune system, modifying the evolution
of a variety of infectious diseases. In this study we have investigated the role of chronic stress in the
model of resistance/susceptibility to Leishmania major infection in inbred mice. We have also
assessed possible differences between males and females in their reactivity to stress. Our data suggest
that repetitive chronic stress by social isolation does not induce a uniform change in the size of
footpad lesions of C57BL/6 mice of both sexes. Moreover, when C57BL/6 or BALB/c mice were
subjected to chronic unpredictable stress, there was a significant increase in skin lesions of male and
female C57BL/6, as well as male BALB/c. At the end of the course of infection and stress induction,
the plasma levels of the corticosterone hormone was shown to be elevated only in the females
C57BL/6 and males BALB/c. Furthermore, the quantification of parasite load at the site of infection in
the footpads of BALB/c revealed the presence of a great number of parasites in lesions in both, males
and females, which had been under stress. Regardless of this increase in the number of parasites in
footpads in animals of both sexes, only in males BALB/c a decrease in the production of nitric oxide
by macrophages was detected. In males BALB/c under chronic random stress, the production of
cytokines IFN-γ, IL-4 and IL-5 was altered, with an slight decrease in the concentration of IFN-γ and
increased levels of IL-4 and IL -5. Furthermore, males BALB/c displayed less gain in body mass, not
only when they were infected and stressed, but even when they were simply infected, as compared to
control uninfected animals. Moreover, these data suggest that female C57BL/6 are not only more
susceptible to L. major infection than C57BL/6 males, but also very sensitive to chronic stressful
events. Although BALB/c males, when infected with L. major but not stressed, display smaller
footpad lesions than females, the difference between the sexes are almost nonexistent when animals
are subjected to chronic random stress, possibly because BALB/c males are more sensitive to stressful
situations. Taken together, our results with the protozoan parasite L. major indicate that chronic
unpredictable stress markedly affects the severity of this disease and possibly has a harmful influence
in the development of a variety of other parasitic diseases.
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2
1.1 - PSICONEUROIMUNOLOGIA
A Psiconeuroimunologia (PNI) lida com a complexa interação entre os sistemas nervoso
central (SNC), endócrino e imune. Esta linha de pesquisa surgiu na metade da década de 1970
com o trabalho de Ader e Cohen (1975) e com os achados de que o condicionamento de um
comportamento poderia causar mudanças na função imune, de uma maneira análoga aos
estudos de condicionamento clássico de Pavlov em cães.
Em seu trabalho, Ader atraiu ratos a beber uma solução adocicada (sacarina 0,1%) com
diferentes volumes (1, 5 ou 10 mL) e após 30 min. injetou no peritônio desses animais uma
droga sabidamente causadora de náuseas e vômitos, a ciclofosfamida. Assim, a bebida
adocicada era um estímulo condicionador e a aversão à bebida uma resposta condicionada.
Entretanto, após 45 dias de treinamento, no momento em que seria induzida a reversão da
resposta condicionada, foi observado que alguns animais haviam morrido, sendo que todos
esses eram do grupo tratado com ciclofosfamida. Como a ciclofosfamida, além de ser uma
droga irritante para o sistema gastrointestinal, é também um agente imussupressor, a única
explicação para a mortalidade dos animais no experimento seria o fato do sistema imune
desses animais “entenderem” que a bebida adocicada ingerida era na verdade a
ciclofosfamida, induzindo assim um comprometimento nas funções imunes. Dessa maneira,
foi demonstrado que, como qualquer outro processo fisiológico, o sistema imune estava
sujeito a um condicionamento clássico, documentando a relação funcional entre o cérebro e o
sistema imune (Ader, 2000).
Até os meados da década de setenta, o sistema imune era considerado um sistema
autônomo e de regulação própria, essencial para a defesa do organismo contra a invasão de
substâncias estranhas. Ao mesmo tempo, o sistema imune era definido como um
compartimento responsável pela defesa, independente do sistema nervoso (Ader, 2000).
3
Entretanto, os estudos dos últimos 30 anos revelaram que os processos imunoreguladores são
na realidade influenciados pelo cérebro e, da mesma maneira, as funções neurais e endócrinas,
assim como os comportamentos, são influenciados pelo sistema imune.
A existência de uma via bidirecional entre o cérebro e o sistema imune reforça a
hipótese de que uma mudança na função imune pode constituir um importante mecanismo
pelo qual alguns fatores psicológicos podem influenciar tanto na saúde como na doença.
Assim, diversos estudos sugerem a influência de mudanças fisiológicas na susceptibilidade e
na progressão de doenças (Sapolsky, 2004). São de importância particular as doenças
relacionadas com processos de estresse, nas quais os fatores estressantes podem aumentar a
susceptibilidade do organismo a agentes infecciosos, aumentando a gravidade dessas doenças,
reduzindo a capacidade de cicatrização de feridas e a resposta imune às vacinas (Exton et al,
2001).
De maneira geral, um estressor pode ser definido como um agente físico, químico ou
psicológico que possa causar uma mudança no ambiente interno do organismo (Sheridan et al,
1994). Os agentes estressantes podem ser classificados, quanto à sua duração, em estresse
agudo ou crônico. Enquanto um estresse de longa duração (crônico) constitui-se de um agente
imunossupressor, um estresse de curta duração (agudo) pode aumentar alguns aspectos da
função imune, como por exemplo, o tráfego de células de órgãos linfóides para o sangue
periférico ou para a pele (Glaser & Kiecolt-Glaser, 2005).
4
1.2 – ALOSTASE E CARGA ALOSTÁTICA
Freqüentemente, a palavra “estresse” é usada para se referir a fatores biológicos que
alteram o funcionamento do organismo. Entretanto, isto é uma simplificação do processo de
mudança, pois esses fatores biológicos são mais que “estresse” envolvendo muitos aspectos
do estilo de vida, das experiências diárias e do comportamento, incluindo o ajustamento do
organismo ao ritmo circadiano claro/escuro. Além disso, o uso comum do termo “estresse” na
cultura popular tem feito desta palavra um termo ambíguo para descrever as formas como o
corpo enfrenta desafios psicossociais, ambientais e físicos, podendo significar tanto o evento
em si (o estressor) quanto à resposta do organismo ao evento (John & MacArthur, 1999).
Os mecanismos homeostáticos, como o controle nutricional, as freqüências respiratória e
cardíaca, o controle da temperatura corporal, além de mudanças estruturais e funcionais no
cérebro e no corpo, permitem que um indivíduo mantenha uma estabilidade psicológica e
comportamental a despeito de flutuações nas condições ambientais (McEwen & Wingfield,
2003).
As situações ambientais e psicossociais que normalmente são ditas como “estresse”,
foram substituídas por dois novos termos, “alostase” e “carga alostática”. Alostase, da
maneira como sugerido por Sterling & Eyer (1988), significa “manter estabilidade (ou
homeostase) a uma mudança” descrevendo o ajustamento do sistema cardiovascular aos
estados de atividade e repouso do corpo. Nesta linha, o conceito de “carga alostática” foi
proposto para se referir ao desgaste do corpo em resposta tanto a sucessivos ciclos de alostase
como pela ineficiência do organismo em diminuir ou controlar estas respostas (McEwen &
Stellar,1993 ; McEwen ,1998).
A alostase é muitas vezes considerada como uma reação de luta ou fuga (fight or flight,
expressão criada por Cânon em 1932) porque, levada ao extremo, prepara-se justamente para
5
essas duas eventualidades. Para essa reação, o organismo acelera a respiração e a freqüência
cardíaca para aumentar o fluxo de oxigênio até os músculos principais; induz vasoconstrição
na pele, para diminuir o sangramento em caso de ferimento; as glândulas mobilizam os
reservatórios de carboidratos no fígado e nos músculos, aumentando o nível de glicose no
sangue, para oferecer combustível suficiente ao esforço; além de reforçar o sistema imune
para a defesa. Até mesmo no simples ato de levantar pela manhã, a alostase torna-se
necessária. Passar do sono para a vigília, e da posição horizontal para a vertical, exige muito
do organismo. Para garantir que haja energia adequada para essas necessidades, a alostase
providencia um nível mais alto de mediadores do estresse nessas situações (McEwen &
Lasley, 2003).
Os mediadores da alostase incluem, principalmente, esteróides produzidos pelas
glândulas supra-renais e as catecolaminas, além de outros hormônios como a
dihydroepiandrosterona (DHEA), a prolactina, o hormônio do crescimento (GH) e as citocinas
com atividade imune (McEwen & Lasley, 2003). Enquanto os hormônios das supra-renais
promovem alostase pela aceleração na absorção de nutrientes, facilitando o restabelecimento
das reservas energéticas, a super atividade deste sistema propicia a elevação do nível de
glicocorticóides no início da noite, levando a uma carga alostática em termos de resistência à
insulina, acelerando, assim, a progressão de diabetes do tipo II, o acúmulo de gordura
abdominal, a aterosclerose e a hipertensão (Brindley & Rolland, 1989).
Apesar dos termos alostase e carga alostática representarem de maneira mais abrangente
a reação de um organismo frente a uma emergência ou ameaça e de como esse organismo
pode lidar com mudanças, ao longo desta dissertação utilizarei a palavra estresse, com
referência aos acontecimentos externos que influenciam funções psicofisiológicas, por se
tratar de um termo amplamente utilizado na literatura científica e ser adotado, quase sem
alteração, em muitos idiomas.
6
1.3 – INTERAÇÃO ENTRE OS SISTEMAS NERVOSO, ENDÓCRINO E IMUNE
Várias evidências suportam a idéia de uma comunicação bidirecional entre cérebro e
sistema imune. Entre elas, têm-se o fato de uma alteração no hipotálamo (incluindo uma
lesão) alterar a reatividade imunológica, assim como modificações na resposta imune influem
na atividade do SNC; a presença de inervação simpática no baço e outros órgãos linfóides,
incluindo a pele; além de mudanças nos níveis de hormônios e neurotransmissores
produzirem mudanças na função imune e vice-versa (Tausk et al, 2008).
As respostas neuroendócrinas controlam as funções imunes ao nível sistêmico através de
dois eixos principais: o eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) - pelos efeitos
antiinflamatórios de glicocorticóides; e o eixo hipotalâmico-pituitária-gonadal (HPG) - pelos
hormônios sexuais liberados de ovários e testículos. O controle em nível regional é feito pelo
sistema nervoso simpático (SNS) ou adrenérgico e pelo sistema nervoso parassimpático ou
colinérgico (Sternberg, 2006).
Quase todas as células imunes expressam receptores para um ou mais hormônios
associados aos eixos HPA e HPG e ao SNS, chamados “hormônios do estresse”. A modulação
imune por esses hormônios pode acontecer de duas formas: diretamente, através da ligação
dos hormônios aos seus respectivos receptores na superfície ou no interior das células ou,
indiretamente, pela indução de uma desregulação na produção de citocinas, tais como
interferon-gamma (IFN-γ), interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-6 e fator de necrose tumoral α
(TNF-α) (Glaser & Kiecolt-Glaser, 2005).
Assim como os “hormônios do estresse” podem provocar uma modulação imune,
algumas citocinas também podem atuar em vias neuroendócrinas. Uma série de citocinas
inflamatórias e imunoreguladoras têm efeitos marcantes no eixo HPA, entre elas estão o
interferon-alfa (IFN-α), IL-1, IL-6 e TNF-α. Em estudos realizados em pacientes com o
7
diagnóstico de depressão maior (endógena), foi observada uma elevação na produção do
hormônio de liberação corticotrófico (CRH) no hipotálamo, consequente ao aumento na
concentração das citocinas pró-inflamatórias.. Além disso, os pacientes deprimidos
apresentaram também alterações no receptor de glicocorticóide (GR), como na sua expressão,
seu estado de fosforilação, sua translocação até o núcleo da célula, e na sua ligação ao DNA.
Outros estudos indicam uma participação do IFN-α na redução das funções cognitivas no
cérebro, como por exemplo no processamento de informações (Irwin & Miller, 2007). Além
disso, citocinas como a IL-1 β e TNF-α estão associadas a comportamentos doentios (sickness
behavior), tais como a diminuição da atividade motora, o isolamento social, a perda de
apetite, o aumento na sensibilidade à dor e alterações do sono (Dantzer et al, 2008).
1.3.1 – O eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA)
Em resposta a um estímulo estressante, o eixo HPA é ativado para permitir ao
organismo se adaptar fisiologicamente a este desafio. Assim, após um evento estressor, o
núcleo paraventricular (PVN) do hipotálamo secreta o hormônio de liberação corticotrófico
(CRH) e arginina vasopressina (AVP). Do PVN, os neurônios contendo CRH emitem
projeções aos centros noradrenérgicos no cérebro e na medula espinhal. Além disso, o CRH
liberado ativa o eixo HPA, levando à liberação de peptídeos da pituitária (hipófise)
produzidos pela clivagem de pro-opiomelacortina, sendo os mais conhecidos: o hormônio
adrenocorticotrófico (ACTH), as encefalinas e as endorfinas (Tausk et al, 2008). O ACTH,
então, estimula a secreção de glicocorticóides (GC) da zona fasciculada do córtex da glândula
supra-renal (figura 1.1).
Em humanos, o glicocorticóide natural é o cortisol, enquanto em roedores é a
corticosterona (figura 1.2). Em nível fisiológico, os glicocorticóides atuam como
8
imunomoduladores, já em condições estressantes esses hormônios agem como
imunossupressores (Marketon & Glaser, 2008).
Existem dois tipos de receptores para glicocorticóides no citosol da célula. Os receptores
tipo I são receptores mineralocorticóides (MRs) enquanto receptores tipos II são receptores
glicocorticóides (GRs). Os MRs têm uma alta afinidade tanto para a aldosterona (um
mineralocorticóide), como para o cortisol e a corticosterona, enquanto têm de 2 a 5 vezes
menos afinidade para a dexametasona (um glicocorticóide sintético). Já os GRs têm alta
afinidade para a dexametasona, com afinidade 3 a 5 vezes menor para corticosterona e 10 a 20
menor afinidade para a aldosterona (de Kloet, 2008).
Os MRs estão concentrados no hipocampo e pouco encontrados nos tecidos periféricos.
Os GRs são distribuídos pelo cérebro e tecidos periféricos e são detectados em altas
concentrações no baço e no timo. Além disso, tanto receptores MRs quanto GRs são
detectados em linfócitos no sangue periférico. Devido à alta afinidade tanto pelo cortisol
como pela corticosterona, os MRs têm maior ocupação por glicocorticóides endógenos que os
GRs. Os GRs são ocupados progressivamente durante a elevação dos glicocorticóides
circulantes, após o estresse e durante o ciclo circadiano (de Kloet, 2008).
9
Figura 1.1. Modulação da resposta hormonal no sistema nervoso central após um estímulo
estressor. O eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) e o sistema nervoso simpático (SNS) são
ativados, resultando na liberação de glicocorticóides e catecolaminas, que são capazes de modular
vários aspectos do sistema imune. Além disso, algumas funções imunes também podem ser moduladas
pelos hormônios do crescimento (GH) e prolactina, secretados da hipófise. Figura obtida de Glaser &
Kiecolt-Glaser (2005).
10
O ciclo circadiano nada mais é que um ritmo sincronizado do relógio biológico presente
em seres vivos. Em mamíferos, o ciclo tem duração de aproximadamente 24 horas e é
controlado por genes localizados no núcleo supraquiasmático do hipotálamo, os quais são
regulados pelo ciclo de claro-escuro e de dormir-acordar. O ritmo circadiano exerce regulação
neuroendócrina durante os períodos do dia e, além disso, pode regular funções fisiológicas,
metabólicas e imunes. Em humanos, o cortisol apresenta um pico de secreção no período da
manhã, com decaimento no seu nível pela tarde; enquanto nos roedores, a corticosterona
apresenta um ritmo inverso ao do cortisol, com pico de secreção à noite e decaimento pela
manhã (Malarkey & Mills, 2007).
Figura 1.2. Estrutura dos glicocorticóides endógenos corticosterona e cortisol.
No SNC, o CRH e os neurônios noradrenérgicos inervam e estimulam uns aos outros. A
ativação das vias noradrenérgicas pelo CRH resulta na liberação local de norepinefrina do
nervo simpático terminal e na secreção de norepinefrina e epinefrina de células da medula da
supra-renal. Através de interações com receptores α- e β-adrenérgicos, as catecolaminas
norepinefrina (noradrenalina) e epinefrina (adrenalina) influenciam as adaptações
cardiocirculatórias e os efeitos metabólicos na ausência de estresse. Entrentanto, após um
estímulo estressante, o SNS parece exercer efeitos inibitórios sobre as respostas imunes,
induzindo uma diminuição na atividade de células natural killer (NK); inibindo a produção de
citocinas pró-inflamatorias como TNF, IL-1, IL-6 e IL-12, enquanto estimula a produção de
11
citocinas antiinflamatórias como a IL-10, por monócitos e células dendríticas (DCs)
(Sternberg, 2006).
Estudos pioneiros de Blalock e cols (1987) mostraram que as células do sistema imune
poderiam produzir “hormônios da pituitária”. Atualmente, tornou-se claro que hormônios
“hipotalâmicos” e “da pituitária” podem ser sintetizados por células humanas no timo, nas
tonsilas palatinas, no baço e nos linfonodos, produzindo efeitos biológicos localizados. Esses
“hormônios do sistema imune” são secretados em níveis baixíssimos e parecem exercer a
maioria de seus efeitos biológicos através de mecanismos autócrinos (atuando nas próprias
células que os produzem) ou parácrinos (atuando em células similares próximas das células
produtoras) (Malarkey & Mills, 2007).
Em contrapartida, também já foi observada uma co-localização de hormônios e citocinas
nas glândulas endócrinas. A hipófise humana e outros tecidos endócrinos podem produzir
citocinas como a IL-6 e TNF-α, onde podem atuar de modo autócrino ou parácrino para
influenciar a secreção endócrina (Malarkey & Mills, 2007).
1.3.2 – Efeitos dos glicocorticóides no sistema imune
Vários estudos indicam a necessidade de um balanço na produção de glicocorticóides
para a manutenção da homeostase imune, impedindo uma imunossupressão excessiva ou uma
produção abrupta de citocinas e respostas pró-inflamatórias (figura 1.3).
12
Figura 1.3. Efeitos dos glicocorticóides nas células do sistema imune. Os glicocorticóides podem
inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β e TNF, enquanto promovem a produção
de citocinas antiinflamatórias como a IL-10 por macrófagos e células dendríticas. Também podem
causar apoptose de macrófagos, células dendríticas e células T, levando a inibição das respostas
imunes. IFN-γ, interferon-γ; NK, célula natural killer; T
C
, célula T citotóxica; T
H
, célula T helper .
Figura obtida de Sternberg (2006).
Em geral, os glicocorticóides suprimem a maturação, diferenciação e proliferação de
todas células do sistema imune, incluindo células dendríticas e macrófagos (Sternberg, 2006).
Estes hormônios podem inibir a diferenciação das células dendríticas (dependendo do estágio
de maturação e subtipo celular), podendo, também, reduzir a capacidade dessas células de
ativar células T naïve in vitro, por regular negativamente a expressão do complexo de
histocompatibilidade principal tipo II (MHC II) e das moléculas co-estimuladoras.
Tanto os glicocorticóides endógenos quanto os sintéticos (dexametasona) inibem a expressão
de muitas moléculas de adesão celular, que estão envolvidas no tráfego de células imunes, como a
molécula de adesão intracelular 1 (ICAM 1), a molécula de adesão de leucócito endotelial 1 (ELAM
1) e a molécula de adesão vascular 1 (VCAM 1). Os glicocorticóides também inibem a produção e
secreção de quimiocinas como a CCL2 e CXCL8 por eosinófilos, assim como a expressão do RNA
mensageiro da IL-5 por mastócitos e células T (Sternberg, 2006).
13
Os glicocorticóides regulam a transcrição gênica por se ligarem a elementos de resposta
hormonal nas regiões promotoras de vários genes, mas também podem regular a transcrição
gênica pela interação com outros fatores de transcrição como o NF-κB ou o AP1. O NF-κB
normalmente existe em um estado inativo, ligado ao seu inibidor (IκB). Pela ativação da célula, o
NF-κB é liberado do IκB e se transloca para o núcleo celular, onde se liga a sítios promotores
específicos, promovendo a expressão de citocinas pró-inflamatórias (figura 1.4). Os
glicocorticóides inibem o NF-κB por interação com a subunidade p65 desta molécula e por
induzir a expressão de IκB. Devido a essa inibição do NF-κB, os glicocorticóides promovem a
diminuição da síntese de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, IL-6 e TNF) (Sternberg, 2006).
Vários estudos sugerem que os glicocorticóides suprimem sistematicamente o eixo de
imunidade celular do tipo Th1 (células T helper 1) e promovem um direcionamento da
resposta imune para o padrão Th2 (células T helper 2), por suprimir a produção de citocinas
do tipo Th1 pelas células apresentadoras de antígenos (APCs) e células T e estimular as
citocinas do tipo Th2 (Elenkov, 2004).
Figura 1.4. Mecanismos moleculares de regulação de neurotransmissores e glicocorticóides na
produção de citocinas. Os glicocorticóides se ligam aos seus receptores no citosol, que se desliga da
proteína de choque térmico 90 (HSP90) e permite a dimerização do receptor, que posteriormente se
move para o núcleo celular para a ligação no DNA. Isso leva a produção da proteína IκB que seqüestra
NF-κB e inibe a ativação da transcrição de citocinas pró-inflamatórias. cAMP, AMP cíclico; PKA,
proteína kinase A; TLR, receptor Toll-like. Figura obtida de Sternberg (2006).
14
As células Th1 secretam de maneira prioritária as citocinas interferon-γ (IFN-γ), IL-2 e
TNF-β, que promovem imunidade celular, enquanto as células Th2 secretam IL-4, IL-10, IL-5
e IL-13, que promovem imunidade humoral. As células Th0 (precursoras das células Th1 e
das Th2) são direcionadas a se diferenciarem no padrão Th1 ou Th2, dependendo dos tipos de
citocinas produzidos pelas células da imunidade inata. Assim, a IL-12, uma citocina
produzida por monócitos/macrófagos ou outras APCs, é a maior indutora da diferenciação das
células Th0 para um padrão Th1, agindo em conjunto com o IFN-γ produzido por células NK
(Elenkov, 2004).
As respostas Th1 e Th2 são mutuamente inibitórias. Assim, IL-12 e IFN-γ inibem a
resposta Th2, enquanto a IL-4 e a IL-10 promovem a imunidade humoral por estimularem o
crescimento e ativação de mastócitos e eosinófilos, a diferenciação de células B em
plasmócitos produtores de imunoglobulinas e uma mudança de classe das imunoglobulinas
para IgE. Além disso, essas citocinas de padrão Th2 inibem a ativação de macrófagos, a
proliferação de células T e a produção de citocinas pró-inflamatórias (Elenkov & Chrousos,
1999).
Pelo fato da IL-12 ser uma citocina importante para o estímulo da produção de IFN-γ e
inibição da síntese de IL-4 pelas células T, a inibição na produção de IL-12 pode representar o
principal mecanismo pelo qual os glicocorticóides afetam o balanço Th1/Th2. Portanto,
monócitos/macrófagos tratados com glicocorticóides produzem menos IL-12, levando a uma
diminuição na capacidade dessas células de induzirem a produção de IFN-γ pelas células T
CD4
+
comprometidas, ao mesmo tempo que induzem a produção de IL-4, como resultado do
bloqueio dos efeitos supressivos da IL-12 (figura 1.5) (Elenkov & Chrousos, 1999). Além
disso, os glicocorticóides regulam negativamente a expressão de receptores de IL-12 nas
células T e das células NK e têm efeito direto nas células Th2 por estimular a produção de IL-
4, IL-10 e IL-13 nessas células (Elenkov, 2004), exercendo seus efeitos antiinflamatórios pela
15
inibição da atividade da fosfolipase A
2
(Blackwell & Flower, 1983). Os GCs podem também
provocar a inibição da expressão do gene da IL-2 e de seu receptor nos linfócitos (Grabstein
et al., 1986; Northrop et al., 1992).
Figura 1.5. Influência da secreção da corticosterona e adrenalina na imunidade. São mostrados os
efeitos sistêmicos de glicocorticóides e catecolaminas na produção de citocinas reguladoras tipo 1 e 2,
as funções Th1 e Th2 e componentes da imunidade celular e humoral. As linhas sólidas representam
estimulação, as linhas em negrito representam uma estimulação mais acentuada e as linhas pontilhadas
representam inibição. β2, receptor β2-adrenérgico; +/-, estimulação/inibição; B, célula B; Eo,
eosinófilo; GR, receptor glicocorticóide; NA, noradrenalina. Modificado de Elenkov & Chrousos
(1999).
16
1.3.3 – O eixo hipotalâmico-pituitária-gonadal (HPG)
O eixo HPG regula o desenvolvimento e o funcionamento endócrino e reprodutivo das
gônadas por todas as fases da vida. Sua atividade é altamente regulada por uma complexa
integração de estímulos endógenos, sinais cronobiológicos (do ritmo circadiano) e estressores
exógenos.
No hipotálamo, neurônios especializados enviam pulsos do hormônio liberador de
gonadotrofina (GnRH) que modula a secreção de gonadotrofinas da glândula pituitária
anterior, como o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo-estimulante (FSH). Estes
hormônios, então, estimulam a produção e secreção de esteróides pelas gônadas masculina e
feminina (ovários e testículos, respectivamente) (Isidori et al, 2008).
Durante uma situação estressante, alguns mediadores do estresse (secretados pelo eixo
HPA) podem atuar sobre o eixo HPG. Assim, o CRH produzido pelo hipotálamo inibe a
secreção do GnRH, enquanto os glicocorticóides suprimem tanto a produção do hormônio LH
na pituitária quanto a secreção de estrógeno e progesterona dos ovários, além de induzir
resistência ao hormônio estradiol em alguns tecidos alvos. Além disso, as citocinas pró-
inflamatórias IL-1 e TNF-α inibem a secreção de GnRH do hipotálamo e LH da pituitária
com uma subseqüente redução nos níveis de estrógeno nas fêmeas e da testosterona nos
machos (Malarkey & Mills, 2007).
Geralmente, os andrógenos são imunossupressores e os estrógenos podem tanto inibir
quanto estimular as respostas imunes (Grossman, 1989). A complexa interação entre o eixo
HPG e o sistema imune foi avaliada em diversos estudos que analisaram a influência dos
hormônios sexuais nas funções de todos os tipos de células imunes. Nesta linha, foi observado
que o estrógeno e a progesterona atuam diretamente nas células da imunidade inata, podendo
reduzir a atividade de células NK e assim prejudicar a defesa do organismo contra tumores,
17
mas por outro lado, auxiliar na evolução de uma gravidez (Baral et al, 1995; Furukawa et al,
1984; Hanna & Schneider, 1983); podem também regular positivamente a fagocitose e a
produção de intermediários reativos de oxigênio nos macrófagos e induzir uma redução na
produção de citocinas pró-inflamatórias nessas células (Chao et al, 1994; Miller & Hunt,
1998) além de aumentar a degranulação de mastócitos e eosinófilos (Silva et al, 1997;
Vliagoftis et al, 1992).
Os hormônios sexuais também influenciam o desenvolvimento, a maturação e o estado
de ativação tanto das células B como dos linfócitos T, atuando de forma indireta através dos
seus efeitos nas células da imunidade inata. Assim, o andrógeno testosterona pode atuar como
um potente supressor de componentes humorais e celulares da resposta imune. Por outro lado,
o estrógeno e a progesterona atuam aumentando a resposta imune humoral (com maior
produção de IgM, IgG e IgA), enquanto suprimem a resposta imune celular. A supressão da
imunidade celular parece ocorrer pela regulação negativa do estrógeno e progesterona sobre o
desenvolvimento de células T no timo e depleção dessas células na periferia, além da indução
de um aumento na produção de citocinas de padrão Th2 e redução das citocinas de padrão
Th1 (Roberts et al, 2001; Zuk & McKean, 1996).
A gravidez também pode afetar o funcionamento de células B e T, visto que os efeitos
imunomoduladores de hormônios como estrógeno e progesterona (com níveis elevados nesta
ocasião) são essenciais para prevenir uma rejeição imunológica do feto. Para tanto, estes
hormônios induzem um viés de resposta imune para o padrão Th2, favorecendo a produção de
citocinas antiinflamatórias como IL-4, IL-5 e IL-10 (Roberts et al, 2001).
18
1.4 – MODELOS DE ESTRESSE
Os estudos na área da psiconeuroimunologia desenvolveram numerosos modelos de
estresse. Em humanos, os modelos utilizados são: estressores induzidos em laboratório, como
a utilização de um teste baseado em uma conversa e teste de cálculos aritméticos; estressores
da vida diária como a avaliação do estresse em estudantes de medicina, estresse conjugal,
estresse em cuidadores de pacientes com doença de Alzheimer ou demência, pacientes com
câncer de mama, dor pós-cirúrgica; e estressores psicológicos como o sentimento de solidão
ou depressão (Marketon & Glaser, 2008).
Uma compreensão da interação entre sistema imune e sistema nervoso central, assim
como a verificação da relevância biológica da comunicação entre esses sistemas, requer a
utilização de animais de experimentação. Em roedores, diferentes modelos de estresse são
utilizados para a avaliação de seus efeitos em doenças infecciosas e autoimunes, em doenças
neoplásicas, em transtornos psiquiátricos e na avaliação de alterações de comportamento.
Entre os modelos de estresse mais utilizados em roedores estão o estresse rotacional, no
qual as gaiolas dos animais são giradas suavemente, induzindo uma leve desorientação
espacial (Marketon & Glaser, 2008); choques elétricos nas patas (Palermo-Neto et al, 2003);
estresse de contenção em tubos ventilados (Okuyama et al, 2007); frustração social através da
inserção de um “agressor” em um grupo de animais (Gasparotto et al, 2002); estresse pelo frio
(Baccan et al, 2004); exposição ao odor de um predador (Tannenbaum et al, 2002); nado
forçado (Lufty et al, 2006); estresse por privação alimentar por um longo período (Okuyama
et al, 2007); inversão do ciclo circadiano (Matuszewich et al, 2007); isolamento social (Wu et
al, 2001); estresse por superlotação em um espaço restrito (gaiola) (Reber et al, 2006) e
estresse auditivo por submeter o animal a uma ampla faixa de barulho (Núñez et al, 2005).
Além disso, alguns estudos utilizam um modelo de estresse crônico baseado na seleção e
19
aplicação de estressores randomizados uma ou duas vezes ao dia, denominados assim de
estresse crônico imprevisível (Anisman et al, 2007; Munhoz et al, 2006; Ortiz et al, 1996).
1.5 – EFEITOS DO ESTRESSE EM DOENÇAS INFECCIOSAS
No mínimo, três variáveis interagem com sinais neurosensoriais para causar mudanças
nas reações do sistema imune frente a doenças infecciosas. São variáveis: o sujeito do
experimento (idade, sexo, linhagem, entre outros), a natureza do estímulo dado (intensidade,
duração e a percepção do indivíduo ao estímulo) e que tipo de resposta imune está sendo
examinada (Tausk et al, 2008).
Resultados semelhantes obtidos em estudos com roedores e humanos indicam que o
estresse pode desregular a imunidade celular e humoral a patógenos e aumentar o risco ao
desenvolvimento de doenças infecciosas, além de prolongar esses episódios infecciosos
(Sheridan et al, 1994).
Vários paradigmas de estresse interferem com a sobrevivência de animais infectados.
Assim, Friedman et al (1973) mostrou que um estresse de superlotação alterava a resistência
de camundongos à infecção por malária, e em outro estudo, esse mesmo tipo de estresse
resultou em um aumento na susceptibilidade de camundongos a Salmonella typhimurium
(Edwards & Dean, 1977). Os efeitos do estresse em doenças causadas por micobactérias
também já foram avaliados. Um estudo utilizando camundongos infectados com o
Mycobacterium avium e estressados pelo método de contenção mostrou que a experiência
estressante aumentava a susceptibilidade dos camundongos ao crescimento das micobactérias
(Brown et al, 1993).
Um dos primeiros estudos relacionando estresse às mudanças na resposta imune foi feito
por Cohen e cols (1991) que estudaram o impacto do estresse na fisiopatologia de cinco
20
diferentes formas de vírus respiratórios pela avaliação dos sintomas clínicos comumente
associados ao resfriado.
Na síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), em estudo desenvolvido por
Goodkin et al (1992), foi evidenciada uma associação entre estresse e atividade imune na
infecção pelo vírus HIV-1. Este estudo, feito com 11 homens homossexuais soropositivos
assintomáticos, mostrou que o aumento nos níveis de estresse e uma diminuição na habilidade
de combatê-lo estavam associados a uma diminuição na contagem total de linfócitos. O
aumento da habilidade em lidar com o estresse estava associado a um aumento no número de
linfócitos T CD4
+
no sangue periférico.
O estresse também já foi identificado como um co-fator na reativação de vírus latentes
em humanos. Um número variado de estímulos locais e sistêmicos foi associado à reativação
do herpes vírus simples (HSV) em neurônios com infecção latente. Entre os estímulos
sistêmicos para a recorrência da doença estavam estresses físicos e emocionais, mudanças
hormonais, febre e imunossupressão (Sheridan et al, 1994). Modelos animais também foram
desenvolvidos para estudar os efeitos do estresse na fisiopatologia do HSV latente e infecção
lítica. Esses modelos indicaram uma evidência experimental de que o estresse não somente
aumenta o desenvolvimento e gravidade da infecção nos sistemas nervoso central e periférico,
mas também suprime a resposta de linfócitos T citotóxicos à infecção (Cao et al, 2004).
Dados obtidos usando um modelo de infecção de camundongos com o vírus influenza
mostraram que o estresse de contenção alterava a resposta imune ao vírus, incluindo a cinética
de resposta dos anticorpos e supressão de ambas citocinas pró-inflamatórias e
antiinflamatórias (Konstantinos & Sheridan, 2001).
O estresse também pode afetar a resposta imune a vários de tipos de vacinas. Isso pôde
ser observado em um estudo que investigou a relação entre estresse e a resposta de anticorpos
a uma vacina recombinante contra a hepatite B. Nesse estudo, foram utilizados 81 estudantes
21
de medicina que apresentaram um aumento nos níveis de estresse e ansiedade por um período
de 6 meses, seguido a administração da primeira dose da vacina de hepatite B. A elevação nos
níveis de estresse foi associada a um maior pico dos títulos de anticorpos, indicando que o
estresse parece afetar a resposta imune humoral contra essa vacina (Petry et al., 1993). Por
outro lado, um estudo feito com a vacina do vírus influenza, mostrou que homens e mulheres
cronicamente estressados por cuidarem de pacientes com demência, apresentaram uma clara
deficiência tanto na resposta imune humoral quanto na celular, quando comparados aos
indivíduos controles (Kiecolt-Glaser et al, 1996). Em outro estudo avaliando cuidadores de
pacientes com demência, foi investigada a influência do estresse na resposta à vacina contra a
pneumonia pneumocócica, onde se observou uma diminuição nos títulos de anticorpos
específicos para a vacina, durante o período de 6 meses de exposição aos pacientes com
demência (Glaser et al, 2000).
Uma relação entre os sistemas neuroendócrino e imune também foi observada em
doenças parasitárias (Klein, 2004). Estudos recentes, estabelecendo modelos de estresse e
infecção em roedores, utilizaram os parasitas Toxoplasma gondii (Aviles & Monroy, 2001),
Trypanosoma cruzi (Santos et al, 2005), Tritrichomonas foetus (Rutkowski & Harmsen,
2007) e Leishmania mexicana (Ruiz et al, 2003) como alvos dos efeitos do estresse. Esses
estudos indicam um papel modulador do estresse em respostas fisiológicas do hospedeiro,
como evidenciado por alterações endócrinas e imunológicas em nível sistêmico ou localizado,
com conseqüente aumento da carga parasitária e de processos inflamatórios, afetando de
forma significativa o curso das infecções.
22
1.6 – AS LEISHMANIOSES
As leishmanioses acometem cerca de 1,5 a 2 milhões de pessoas e matam
aproximadamente 70.000 indivíduos ao ano. Atualmente, 12 milhões de pessoas apresentam
alguma forma de leishmaniose e 350 milhões estão expostas a ela em todo o mundo
(Reithinger et al, 2007). As leishmanioses são doenças parasitárias, causadas pelo protozoário
parasita do gênero Leishmania, pertencente à família Trypanosomatidae. A doença tem um
amplo espectro de manifestações clínicas que depende não somente da espécie de Leishmania
causadora da infecção, mas também das condições imunológicas do hospedeiro (Santarém et
al, 2007). Assim, especialistas distinguem cerca de 17 espécies de leishmania em função do
tipo de lesão que causam e de algumas características imunológicas e moleculares (tabela 1).
A leishmaniose pode ser classificada em quatro grupos: leishmaniose cutânea localizada
(LCL), leishmaniose cutânea difusa (LCD), leishmaniose mucocutânea e leishmaniose
visceral. A leishmaniose cutânea localizada é caracterizada por lesões ulcerativas na pele,
desenvolvidas no local da picada do inseto vetor. Já a leishmaniose cutânea difusa apresenta
múltiplos nódulos não-ulcerativos e essa forma da doença está associada a um sistema imune
deficiente. A forma mucocutânea da leishmaniose pode causar destruição total ou parcial das
mucosas do nariz, boca e faringe, sendo geralmente acompanhada por infecções secundárias e
destruição do tecido. A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar, é uma doença
sistêmica, na qual há migração dos parasitas para o fígado, baço e medula óssea. Essa forma é
caracterizada por febre irregular, perda de peso, aumento do fígado e do baço.
23
Tabela 1.1. Espécies de Leishmania que causam doença. LCL, leishmaniose cutânea localizada;
LCD, leishmaniose cutânea difusa. Os subgêneros foram descritos em parênteses. Modificado de
Reithinger et al, 2007.
Patologia clínica Distribuição geográfica
Leishmania spp do Novo Mundo
L (Viannia) braziliensis
LCL, Mucocutânea América do Sul, América Central e México
L (Viannia) panamensis
LCL, Mucocutânea
Noroeste da América do Sul e Sudoeste da
América Central
L (Viannia) peruviana
LCL Peru
L (Viannia) guyanensis
LCL América do Sul
L (Viannia) lainsoni
LCL América do Sul
L (Viannia) colombiensis
LCL Noroeste da América do Sul
L (Leishmania) amazonensis
LCL, LCD América do Sul
L (Leishmania) mexicana
LCL, LCD América Central, México e EUA
L (Leishmania) pifanoi
LCL América do Sul
L (Leishmania) venezuelensis
LCL Noroeste da América do Sul
L (Leishmania) garnhami
LCL América do Sul
Leishmania spp do Velho Mundo
L (Leishmania) aethiopica
LCL, LCD Etiópia e Quênia
L (Leishmania) killicki
LCL Norte da África
L (Leishmania) major
LCL
Ásia Central, Norte da África, Oriente
Médio, e Leste da África
L (Leishmania) tropica
LCL
Ásia Central, Oriente Médio, Norte da
África, Sudeste da Ásia
L (Leishmania) donovani
LCL, Visceral África, Ásia Central, Sudeste da Ásia
Leishmania spp do Novo e Velho Mundo
L (Leishmania) infantum
LCL, Visceral
Europa, Norte da África, América Central,
América do Sul
As leishmanias são transmitidas pela picada de mosquitos hematófagos dos gêneros
Phlebotominae (na Europa, Norte da África, Oriente Médio e Ásia) e Lutzomyia (do sudeste
dos EUA ao nordeste da Argentina). Esses insetos sejam no homem ou em animais silvestres
24
infectados, ingerem macrófagos contendo leishmanias. No tubo digestivo dos insetos, as
leishmanias se transformam em formas alongadas, dotadas de um flagelo e são denominadas
de promastigotas. Essas formas se multiplicam intensamente no tubo digestivo dos insetos
que, ao picarem novos hospedeiros, regurgitam as promastigotas e, por esse mecanismo,
infectam novos vertebrados.
Tanto no homem como em animais silvestres ou domésticos, seja qual for a espécie de
leishmania, elas vivem e proliferam em macrófagos e monócitos de vários tecidos, no
chamado sistema fagocítico mononuclear. No interior de vacúolos (fagossomos) dessas
células, multiplicam-se sob formas esféricas chamadas amastigotas. Abarrotados de
amastigotas, os macrófagos se rompem e as leishmanias liberadas são fagocitadas por novos
macrófagos, dando progresso à infecção (figura 1.6).
A capacidade dos macrófagos de controlar a proliferação das leishmanias ou de
sucumbir a sua proliferação depende de vários fatores. Alguns desses fatores dizem respeito à
virulência da espécie infectante. Outros, da capacidade do hospedeiro em montar uma
resposta imunológica eficiente que, por meio dos linfócitos T e B, estimule a destruição das
leishmanias pelos macrófagos (Camargo & Barcinski, 2003). Embora a infecção por
leishmania induz uma forte resposta humoral, os anticorpos parecem não ter papel importante
na proteção à doença e de fato estão relacionados às formas não-curáveis da leishmaniose. Já
a resposta de células T é crucial para o controle das leishmanioses humana e experimental, já
que essas células desempenham papel essencial na geração de resposta imune celular
específica e de memória a infecção intracelular pelo parasita. Em modelos experimentais
murinos, o controle da infecção é mediado por células T CD4
+
, sendo estabelecida uma clara
dicotomia entre proteção à doença mediada por células Th1 e a susceptibilidade mediada por
células Th2 (Sacks & Noben-Trauth, 2002).
25
Estudos recentes sugerem que as células T CD8
+
podem também estar envolvidas na
eliminação das leishmanias em uma infecção primária (Bertholet et al, 2005; Bertholet et al,
2006). A resposta das células T CD8
+
a patógenos intracelulares se inicia quando essas células
reconhecem antígenos específicos apresentados por moléculas MHC de classe I em
associação com sinais co-estimuladores nas APCs. Mas para tornarem-se completamente
ativas, as células T CD8
+
dependem da expansão e diferenciação de células T CD4
+
, que
regulam positivamente a expressão da molécula co-estimuladora CD40 L (ligante) a qual
interage com a molécula CD40 na superfície das células dendríticas, capacitando as mesmas
de ativar as células T CD8
+
.
Figura 1.6. Ciclo de vida da Leishmania spp (obtido de WHO, 2008).
Pelo fato das leishmanias residirem em vacúolos parasitófagos dos macrófagos, sendo
apresentadas às células T CD4
+
via MHC de classe II, ainda não está claro como os
macrófagos apresentam os antígenos de Leishmania as células T CD8
+
via MHC de classe I.
Um possível mecanismo para a resposta citotóxica de células T CD8
+
na leishmaniose seria
26
através de uma “apresentação cruzada” dos antígenos de Leishmania, que ganham entrada no
citosol de macrófagos e células dendríticas. Este mecanismo dependeria da proteína
chaperona Sec61, uma proteína que poderia intermediar a fusão do fagossomo (contendo os
parasitas) com o retículo endoplasmático, permitindo o transporte seletivo de antígenos
internalizados para o citosol, onde poderiam ser processados para a apresentação via MHC de
classe I (Ruiz & Becker, 2007).
Apesar de serem todas inoculadas na pele, espécies distintas de leishmanias têm
preferências por órgãos diferentes e causam lesões maiores ou menores, produzem ou não
metástases, podem ser ou não autocuráveis e podem induzir imunidade permanente ou
temporária, e às vezes nenhuma. Esse conjunto de fatores e suas possíveis combinações com a
capacidade de resposta do hospedeiro são os responsáveis pelas diversas formas clínicas das
leishmanioses.
A espécie Leishmania major, como descrito na tabela 1.1, é causadora da leishmaniose
cutânea localizada, que é caracterizada pelo aparecimento de pápulas no local da picada do
inseto vetor, além de comprometimento nodular e ulcerações por um período de 1 a 3 meses
após a infecção. A L. major é extensivamente utilizada em estudos que investigam o
mecanismo de ação deste parasita, assim como as condições que predispõe o seu hospedeiro à
susceptibilidade e resistência à doença. Assim, o paradigma Th1/Th2 de
resistência/susceptibilidade a infecção intracelular é baseada em investigações usando a L.
major (Scott, 1998).
A maioria das linhagens de camundongos desenvolvem uma autocura quando infectadas
com L. major, como por exemplo as linhagens C57BL/6, C3H e CBA. Frente à infecção, os
camundongos de fenótipo resistente desenvolvem uma resposta imune de padrão Th1 aos
antígenos do parasita (regulada pelo fator de transcrição T-bet), produzindo IFN-γ, que
conseqüentemente, induz a produção de óxido nítrico (NO) em células fagocíticas
27
(principalmente macrófagos), culminando com a destruição do parasita (figura 1.7). Ao
contrário, camundongos da linhagem BALB/c desenvolvem uma típica resposta de padrão
Th2 (regulada pelo fator de transcrição GATA-3), produtora da citocina IL-4, capaz de
induzir a susceptibilidade desses animais ao parasita L. major (Tripathi et al, 2007).
Figura 1.7. Resposta imune contra Leishmania (obtido de Ruiz & Becker, 2007).
Além do IFN-γ e IL-4, várias outras citocinas têm efeitos marcantes na infecção de
camundongos com L. major. Entre elas estão o TNF-α e os IFN-α e β que são importantes
indutores da ativação de macrófagos e da produção de NO por essas células para a eliminação
do parasita (Bogdan et al, 2000), além do fator de crescimento-β (TGF-β) que pode inibir a
produção de IFN-γ e permitir a infecção de macrófagos com Leishmania, e IL-6 que pode
promover tanto o desenvolvimento de uma resposta Th1 quanto Th2 (Tripathi et al, 2007).
A susceptibilidade e resistência à infecção por Leishmania em modelos murinos estão
também associadas a uma classe de células T, chamadas de células T reguladoras (T
reg
) e com
os níveis de IL-10 produzidas por essas células (Belkaid et al, 2002). As células T
reg
(CD4
+
CD25
+
) suprimem a atividade de células T efetoras (CD4
+
CD25
-
) específicas para antígenos
28
próprios, assim como para invasores externos como o parasita Leishmania, através da
produção de IL-10. A citocina IL-10 é também um potente inibidor de IFN-γ, favorecendo a
persistência de L. major até mesmo em camundongos C57BL/6 (resistentes ao parasita) após
a cura espontânea de suas lesões.
Apesar de vários estudos demonstrarem a relação entre estresse e desregulação imune
em doenças infecciosas, ainda são praticamente inexistentes estudos sobre a relação do
estresse com infecção causada por protozoários. Dessa maneira, uma compreensão da
complexa relação entre o sistema endócrino e nervoso na modulação da resposta imune para
L. major, permitirá compreender de forma holística os mecanismos envolvidos no
aparecimento e progressão da leishmaniose cutânea em mamíferos, além de propiciar avanços
na formulação de esquemas de tratamento da doença.
2
2
.
.
O
O
b
b
j
j
e
e
t
t
i
i
v
v
o
o
s
s
30
Visto que um organismo submetido a condições estressantes está sujeito a sofrer
alterações neuroendócrinas e imunes, tornando-se propenso ao desenvolvimento de variados
tipos de doenças infecciosas, temos por objetivo avaliar o papel do estresse crônico no modelo
de resistência/susceptibilidade apresentado por camundongos C57BL/6 e BALB/c à infecção
por Leishmania major e, paralelamente, procuraremos avaliar se existe diferença significativa
em lidar com o estresse, dependente do sexo, entre os animais dessas linhagens. Assim, os
objetivos específicos desse trabalho são:
1. Observar a progressão das lesões nas patas infectadas com L. major em camundongos
C57BL/6 e BALB/c de ambos os sexos submetidos ao estresse crônico;
2. Avaliar os níveis do hormônio corticosterona no plasma de camundongos C57BL/6 e
BALB/c de ambos os sexos expostos ao estresse crônico imprevisível durante todo o
curso da infecção por L. major;
3. Avaliar os níveis de corticosterona plasmática em cada condição estressante induzida
nos animais C57BL/6 e BALB/c machos e fêmeas não-infectados;
4. Verificar a quantidade de parasitas presentes no local da infecção (pata) após a
exposição dos camundongos BALB/c machos e fêmeas ao estresse crônico
imprevisível durante o curso da doença;
5. Avaliar a produção de óxido nítrico in vitro por macrófagos peritoneais de
camundongos BALB/c machos e fêmeas após serem submetidos ao estresse crônico
imprevisível, durante o curso de infecção por L. major;
6. Investigar o padrão de citocinas produzidas in vitro por linfócitos T de camundongos
BALB/c machos após serem submetidos ao estresse, durante o curso da infecção por
L. major.
7. Observar o papel do estresse crônico imprevisível no ganho de peso corporal de
camundongos BALB/c machos e fêmeas, ao final do curso da infecção por L. major.
3
3
.
.
M
M
a
a
t
t
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l
l
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M
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o
o
d
d
o
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s
s
32
3.1 – ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Para os experimentos in vivo e in vitro, foram utilizados camundongos machos e fêmeas das
linhagens C57BL/6 e BALB/c com idade de 5 a 10 semanas e 20 a 25g de peso. Esses
camundongos eram obtidos do Centro de Criação de Camundongos Especiais da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da USP ou do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da USP e mantidos em caixas plásticas forradas com maravalha autoclavada, todos com
livre acesso à água e ração. Durante todos os experimentos, os camundongos eram mantidos no
biotério do Departamento de Imunologia sob condições convencionais de temperatura e umidade
do ar, e com controle do ciclo claro-escuro (12/12 h). Os experimentos foram conduzidos de
acordo com o comitê de ética em pesquisa animal (CETEA) da FMRP-USP.
3.2 – PARASITAS
Os parasitas utilizados no presente trabalho foram promastigotas de Leishmania
(Leishmania) major MRHO/SU/1959/P (LV-39), cuja cultura original foi gentilmente cedida
pelo Dr. Gabriel Grimaldi, do Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose, Departamento de
Imunologia da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro.
3.3 – MEIO DE CULTURA
Para a propagação das promastigotas de L. major in vitro, era utilizado o meio de cultura
Schneider (Schneider’s Insect Medium, Sigma Chemical Co., USA) com sulfato de
gentamicina (Gentamicina, Ducto, Brasil) na concentração final de 50 mg/L e suplementado
com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Fetal Bovine Serum characterized, HyClone, USA ou
33
CultiLab, Campinas) previamente inativado a 56ºC por 30 min. Esse meio era esterilizado por
filtração em membrana de nitrocelulose com poros de 0,22 µm (Sartorius, Alemanha).
3.4 – OBTENÇÃO E CULTIVO DO PARASITA
Camundongos BALB/c previamente inoculados com promastigotas de L. major em uma
das patas traseiras e com o curso de infecção de aproximadamente 2 meses foram sacrificados
por deslocamento cervical e a pata infectada foi retirada. O tecido necrosado foi removido e a
pata foi macerada em meio Schneider/SFB para o isolamento das amastigotas de L. major.
Para a obtenção da cultura inicial de L. major, o meio contendo amastigotas era transferido
para uma garrafa de cultura, que subseqüentemente era mantida em estufa B.O.D a 25ºC para
a transformação dos parasitas em formas promastigotas.
Para a propagação dessas promastigotas in vitro, uma alíquota de parasitas, no 5º dia de
cultivo, era coletada para contagem. Os parasitas eram contados com o corante eritrosina B
(Merck, Alemanha) a 0,04% em câmara hemocitométrica tipo Neubauer espelhada (Neubauer
Improved, Labor Optik) em microscópio óptico (Olympus Optical Co., LTD, BX50F-3,
Japão) com aumento de 400x. Os parasitas corados de vermelho eram considerados mortos e
aqueles birrefringentes e móveis eram considerados vivos. O número de parasitas por mL da
solução era calculado através da seguinte fórmula:
Número de parasitas = média dos 4 quadrantes x inverso da diluição da amostra x 10
4
Após a realização dos cálculos, 1x10
5
promastigotas/mL eram inoculadas em meio
Schneider/SFB e mantidas em estufa B.O.D, como descrito anteriormente neste item, até o
máximo de 12 passagens.
34
3.5 – INFECÇÃO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E BALB/c COM
PROMASTIGOTAS DE L. MAJOR
Para os camundongos C57BL/6, um experimento prévio de infecção com diferentes
concentrações de parasitas foi realizado para a avaliação da concentração mínima de parasitas
necessária para causar uma lesão visível na pata infectada dos animais de ambos os sexos.
Assim, foram formados 8 grupos experimentais contendo 5-6 animais com 6 semanas de
idade em cada grupo. Destes grupos, 4 eram constituídos de fêmeas e 4 eram constituídos de
machos inoculados com diferentes concentrações do parasita, como representado na tabela
3.1:
Tabela 3.1. Grupos experimentais de camundongos C57BL/6 de ambos os sexos infectados com
diferentes concentrações do parasita L. major.
GRUPOS
SEXO
NÚMERO DE PARASITAS
1
Fêmeas
Controle (PBS)
2
Fêmeas
1 x 10
6
3
Fêmeas
1 x 10
7
4
Fêmeas
1 x 10
8
5
Machos
Controle (PBS)
6
Machos
1 x 10
6
7
Machos
1 x 10
7
8
Machos
1 x 10
8
Promastigotas de 5º dia de cultivo foram coletadas por centrifugação a 2000 rpm a 25ºC
por 10 minutos. Os parasitas foram então lavados duas vezes com 10 mL de PBS 1X e
centrifugados nas mesmas condições anteriores. Após, foram ressuspendidos em 5 mL de
35
meio Schneider/SFB e contados com eritrosina B. Cada animal foi inoculado na pata traseira
direita com 50 µL de PBS 1X contendo a concentração de parasitas especificados na tabela
3.1.
A concentração de 1x10
6
parasitas provocou a formação de uma lesão visível nas patas
infectadas dos machos e das fêmeas, como observado na figura 3.1. Dessa maneira, nos
demais experimentos de infecção, tanto os camundongos C57BL/6 quanto os BALB/c de
ambos os sexos foram inoculados com a concentração de 1x10
6
promastigotas de L. major.
(A) (B)
123456789101112
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Controle (PBS)
1x10
6
parasitas
1x10
7
parasitas
1x10
8
parasitas
0123456789101112
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Controle (PBS)
1x10
6
parasitas
1x10
7
parasitas
1x10
8
parasitas
Figura 3.1. Medida das patas de camundongos C57BL/6 fêmeas (A) e machos (B) infectados com
diferentes concentrações de L. major.
3.6 – MEDIDA DAS PATAS
O tamanho da lesão na pata direita dos animais era avaliado semanalmente durante todo
o curso da infecção, por 12 a 20 semanas. As patas traseiras dos animais infectados eram
medidas com o auxílio de um paquímetro de resolução 0,02 mm (Starrett, cat. # 125MEA-
6/150, Brasil). A medida do tamanho da lesão era calculada pela diferença de tamanho entre a
36
pata direita e a pata esquerda. O tamanho da lesão foi representado pela média ± SE das
diferenças obtidas em cada grupo de camundongos.
3.7 – CONDIÇÕES ESTRESSANTES UTILIZADAS PARA A INDUÇÃO DE
ESTRESSE AGUDO OU ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL
¾ Nado forçado
Este é um tipo de estresse físico que consiste em forçar o animal a nadar por algum
tempo. Assim, os animais foram submetidos à natação por 15 minutos em cilindros
plástico de 21 cm de diâmetro e 23 cm de altura contendo 3 L de água a 25ºC.
¾ Contenção
O estresse por contenção consiste na restrição da movimentação do animal por sua
colocação em um espaço físico limitado. Esse tipo de estresse induz comportamentos
de ansiedade e depressão em roedores e, portanto, é classificado como um estresse
psicofisiológico. Para tanto, foram utilizados tubos plásticos de 50 mL (tipo Falcon)
contendo alguns orifícios em sua extensão para permitir uma corrente de ar intratubo.
Os animais da linhagem C57BL/6 foram submetidos ao estresse por 60 minutos, já os
da linhagem BALB/c por 30 minutos (devido a uma menor resistência desses animais
ao tempo de 60 min. de contenção).
¾ Luz acesa
Este é um tipo de estresse fisiológico, no qual se submete o organismo a uma
inversão do ritmo circadiano ou ciclo biológico claro-escuro/dia-noite. Este ritmo é
crucial para a organização e sincronização dos sistemas autonômico e
37
neuroendócrino, promovendo variações de secreção hormonal, como por exemplo
do hormônio cortisol em humanos e corticosterona em roedores, dependendo do
período do dia. Assim, a inversão do ritmo circadiano provoca um desajuste
fisiológico, induzindo estresse. Desta maneira, os animais foram mantidos na
presença de luz acesa durante o período da noite (overnight).
¾ Luz apagada
Novamente, este tipo de estresse submete o organismo a uma inversão do ritmo
circadiano por mimetizar um período noturno durante o dia. Os animais
permaneceram, então, em uma câmara escura (com ausência de luz) por 120
minutos, durante o dia.
¾ Frio
O frio se constitui em um tipo de estresse fisiológico, por submeter o organismo a
baixas temperaturas. Para a indução de frio, os animais foram separados em gaiolas
individuais, contendo pouca maravalha, e ficaram expostos a uma temperatura de
4
○
C em câmara fria por 90 minutos.
¾ Isolamento social
O isolamento social consiste na separação de um animal do convívio social com
outros animais, mimetizando uma situação de solidão, constituindo-se assim de um
estresse psicossocial. Para tanto, os animais foram mantidos juntos em uma mesma
gaiola de dimensões 35x25x15 cm, por um período de 1 a 2 semanas para adaptação.
Em seguida, os animais foram separados em gaiolas individuais de iguais dimensões
38
à anterior, com uma distância mínima de 12 cm entre duas gaiolas, durante 2 ou 24
horas.
3.8 - ESTRESSE CRÔNICO (EC)
O estresse crônico foi realizado com apenas camundongos da linhagem C57BL/6, de
ambos os sexos, com o objetivo de induzir uma condição estressante de longa duração nestes
animais. Para tanto, foi utilizado o método de isolamento social (descrito anteriormente no
item 3.7). Os animais foram divididos em três grupos:
Grupo I: animais infectados com o parasita L. major e não foram submetidos ao estresse
durante todo o experimento.
Grupo II: animais submetidos ao isolamento social uma semana antes da infecção com
o parasita e permaneceram isolados por mais 12 semanas, durante os curso da infecção.
Grupo III: animais infectados com o parasita e submetidos ao isolamento social
somente após a infecção, por 12 semanas.
3.9 – ESTRESSE AGUDO (EA)
Para avaliar a contribuição de cada condição estressante em animais não-infectados, os
animais de ambos os sexos e linhagens foram divididos em diferentes grupos (tabela 3.2).
Cada grupo foi submetido, uma única vez, a uma das condições estressantes descritas
anteriormente no item 3.7, e em seguida foi realizada a dosagem do hormônio corticosterona
(especificado no item 3.11).
39
Tabela 3.2. Diferentes tipos de estresse agudo induzidos nos animais C57BL/6 (A) e BALB/c (B) de
ambos os sexos.
(A)
Grupos Tipos de estresse Duração Decapitação
1
Sem estresse
(controle)
-
Após aos demais grupos
2
Nado forçado
15 min. 10 min. após o estresse
3
Contenção
60 min.
15 min. após o estresse
4
Luz apagada
120 min.
5 min. após o estresse
5
Luz acesa
Overnight
Imediatamente após o
estresse
6
Isolamento social
24 h.
Imediatamente após o
estresse
(B)
Grupos Tipos de estresse Duração Decapitação
1
Sem estresse
(controle)
-
Após aos demais grupos
2
Nado forçado
15 min.
10 min. após o estresse
3
Contenção
60 min.
15 min. após o estresse
4
Luz apagada
120 min.
5 min. após o estresse
5
Luz acesa
Overnight
Imediatamente após o estresse
6
Isolamento social
24 h.
Imediatamente após o estresse
7
Frio
90 min.
Imediatamente após o estresse
8
Infecção com L.
major
-
120 min. após o estresse
40
3.10 – ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL (ECI)
O método de ECI utilizado nos experimentos foi modificado de Munhoz et al (2006).
Resumidamente, o modelo consiste na aplicação de um fator estressante diferente a cada dia
por um longo período de tempo. Assim, o estresse torna-se imprevisível pelo organismo,
reduzindo as chances de adaptação.
Os animais da linhagem C57BL/6 e BALB/c foram submetidos a todas a condições
estressantes descritas no item 3.7 (tabela 3.3). As diferentes condições estressantes foram
efetuadas diariamente (com um ou dois dias de pausa durante a semana), uma vez ao dia,
entre as 9:00 e 12:00 horas ou 13:00 e 15:00 horas ou ainda overnight, por um período de 11 a
13 semanas. A decapitação dos animais era consumada 24 horas após o último procedimento
de estresse utilizado.
Tabela 3.3. Grupos experimentais de animais C57BL/6 e BALB/c de ambos os sexos submetidos ou
não ao ECI. Obs: Nos animais C57BL/6 foram utilizados apenas os grupos I, III, IV e VI.
Grupos Denominação Procedimento
I
Controle da infecção
Apenas infecção
II
Estresse pré-infecção
Estresse por 1 ou 2 semanas antes da
infecção
III
Estresse pós-infecção
Estresse após a infecção e durante
todo o curso da doença
IV
Estresse pré e pós-infecção
Estresse antes e depois da infecção
(durante o curso da doença)
V
Controle do estresse
Apenas estresse (durante o curso da
infecção)
VI
Controle Saudável
Ausência de infecção e estresse
41
Esquema de indução de estresse:
Dia 1: nado forçado; Dia 2: contenção; Dia 3: luz apagada; Dia 4: frio; entre Dia 4 e 5:
luz acesa; Dia 6: isolamento social; Dia 7: pausa; e assim sucessivamente durante o curso da
infecção.
3.11 – DOSAGEM DO HORMÔNIO CORTICOSTERONA
Os animais submetidos ao EA e ECI foram decapitados com uma tesoura afiada e o
sangue do tronco corporal foi colhido com heparina e centrifugado a 4
○
C em 3.000 rpm por
20 minutos, para a coleta de plasma sanguíneo. Para a extração do hormônio corticosterona de
cada amostra, 25 µL do plasma foi adicionado a 1 mL de etanol e posteriormente
centrifugado por 15 minutos e liofilizado por 2 horas.
A dosagem hormonal foi realizada por radioimunoensaio, conforme descrito por Vecsei
(1979). A técnica utiliza IgG de coelho anti-corticosterona e corticosterona marcada com
trício (H
3
) que são incubados com cada amostra. Desta forma, a corticosterona radioativa
triciada compete com a corticosterona da amostra pela ligação ao anticorpo. Após esta etapa,
adiciona-se dextrana (um polissacarídeo sintético que se deixa penetrar pelas moléculas de
corticosterona livres) + carvão ativado (com capacidade de absorver a dextrana) e então são
separados por centrifugação, restando os imunocomplexos de corticosterona marcada e da
amostra, no sobrenadante.
A quantificação hormonal é feita em um contador centilográfico β (para trício). O
número de cpm das amostras é comparado com o da curva padrão, inferindo a concentração
dos desconhecidos. A medida radioativa da corticosterona da amostra é inversamente
proporcional à medida de corticosterona marcada. Assim, quanto maior a medida radioativa,
mais hormônio H
3
se ligou ao anticorpo, indicando que menos hormônio havia no plasma.
42
3.12 – OBTENÇÃO E PLAQUEAMENTO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS
MURINOS
Macrófagos peritoneais residentes foram obtidos de camundongos BALB/c machos e
fêmeas após o experimento de ECI (conforme descrito no item 3.10) e infecção ou não por 12
semanas com o parasita L. major. Os animais foram sacrificados e 5 mL de PBS 1X
(Phosphate Buffered Saline tablets, Sigma, USA) gelado foram inoculados na cavidade
peritoneal (i.p.) de cada animal dos diferentes grupos e em seguida esse volume foi aspirado.
O pool de líquido peritoneal de animais de um mesmo grupo foi centrifugado a 2000 rpm por
10 minutos a 4
○
C (Beckman Instruments, J2-HS Centrifuge, USA) e o precipitado contendo
as células foi lavado duas vezes com PBS 1X a 2000 rpm por 10 minutos a 4
○
C,
ressuspendido em meio RPMI-1640/10%SFB e contados com eritrosina B. Foram plaqueados
1x10
6
macrófagos/mL/poço em placas de cultura de 24 poços (Nunc, USA) contendo
triplicatas, quadruplicatas ou quintuplicatas de cada grupo de animais. Essas placas foram
incubadas por 2 horas em estufa a 37
○
C com atmosfera úmida de 5% de CO
2
(Forma
Scientific, Inc., USA).
3.13 – INFECÇÃO IN VITRO DE MACRÓFAGOS COM PROMASTIGOTAS DE
L. MAJOR
Os macrófagos plaqueados (como descrito anteriormente) foram infectados com formas
promastigotas de L. major na proporção de 3 parasitas : 1 macrófago. Após a infecção, as
células foram mantidas em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
à de 33
○
C (temperatura
intermediária escolhida para a sobrevivência dos macrófagos e das promastigotas) por 4 horas
43
(para os ensaios de dosagem de citocinas) e 48 horas (para os ensaios de dosagem de óxido
nítrico).
3.14 – OBTENÇÃO DE CÉLULAS DOS LINFONODOS
Linfonodos inguinais drenantes de cada animal infectado ou não com L. major foram
obtidos por dissecação e suas cápsulas sofreram rompimento mecânico para a obtenção das
células. Em seguida, foi realizada a centrifugação do macerado em 2000 rpm por 10 minutos a
4
○
C. O pellet foi ressuspendido em meio RPMI 1640/10%SFB e as células foram contadas em
câmara de Neubauer. Após, foi feita a incubação de 1x10
6
células/mL nas placas contendo
macrófagos infectados ou não (conforme item 3.13) em estufa de CO
2
a 5% a 37
○
C por 48
horas para posterior dosagem de citocinas.
3.15 – DOSAGEM DE CITOCINAS
A produção de citocinas no sobrenadante de cada cultura (conforme item 3.14) foi
avaliada quanto à produção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 pelo método de ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay). Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nuc-Immuno Plates,
USA) foram sensibilizadas com 100 µL de solução de anticorpo monoclonal purificado
específico para as citocinas de interesse (PharMingen, USA). Os anticorpos específicos foram
diluídos em tampão de ligação (Na
2
HPO
4
a 0,1 M, pH 9,0) em uma concentração final de 1
µg/mL. As placas foram incubadas a 4
○
C overnight e em seguida lavadas sucessivamente com
PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec). As placas foram então incubadas com 200
µL/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS 1X /10% SFB (Gibco BRL, USA) por 1
hora, a temperatura ambiente, e novamente lavadas. 100 µL de amostra por poço foi
44
adicionado, juntamente com a curva padrão da citocina recombinante, diluída em
PBS/10%SFB/Tween 20 a 0,05% e incubadas overnight a 4
○
C. Após lavagem, o anticorpo
monoclonal conjugado com biotina específico para cada citocina (PharMingen, USA) foi
incubado por 1 hora, adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em
PBS/10%SFB/Tween 0,05% em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Seguido de uma etapa
de lavagem, adicionou-se 100 µL/poço de solução de avidina biotina peroxidase StrepAB
kit
TM
(Dako, USA) e incubou-se por 30 minutos a temperatura ambiente. As placas foram
reveladas pela adição da solução de OPD (Sigma, USA) após novo procedimento de lavagem
e a reação foi interrompida ela adição de 50 µL/poço de ácido sulfúrico 16% (Merk). A leitura
da absorbância foi feita em espectrofotômetro de placa (mQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a
490 nm. A determinação das concentrações das citocinas foi obtida por interpolação dos
resultados de absorbância das amostras em relação aos da curva padrão.
3.16 – DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO
Macrófagos peritoneais murinos foram cultivados em meio RPMI/10%SFB a uma
concentração de 1x10
6
células/mL (conforme item 3.12) e em seguida foram estimulados ou
não com promastigotas de L. major (ver item 3.13). Os sobrenadantes das culturas celulares
foram coletados após 48 horas de incubação e congelados a -20
○
C. A produção de óxido
nítrico foi dosada indiretamente através da concentração de seu metabólito no meio de cultura
(NaNO
2
– nitrito de sódio), pelo método de Griess (Ding et al, 1988). Resumidamente, os
sobrenadantes foram descongelados e um volume de 100 µL de cada amostra foi adicionado
em placas de 96 poços, adicionando-se igual quantidade de reagente de Griess (Sigma, USA).
As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 15 minutos e a quantificação
colorimétrica foi realizada em leitor de ELISA a 540 nm. A curva padrão foi feita com nitrito.
45
3.17 – QUANTIFICAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA NAS PATAS
A quantificação de parasitas das patas infectadas foi realizada pela técnica de diluição
limitante (LDA – limiting dilution assay conforme LIMA et al, 1997). O método estima o
número de formas amastigotas viáveis nas patas infectadas. Para tanto, as patas infectadas de
três animais de cada grupo foram maceradas em Medmachine (Becton Dickinson) de forma
asséptica para a suspensão das formas amastigotas. A solução resultante foi diluída em série
sob potência de dez em meio Schneider/10%SFB (Sigma) e distribuída em placa de 96 poços.
A observação dos poços positivos para o parasita foi feita no 7
○
e 15
○
dia após o
plaqueamento, em microscópio de luz invertida sob objetiva de 40 vezes. O cálculo do
número provável de amastigotas por pata utilizada foi feito em programa Excel (Microsoft),
com os dados expressos em log
10
+1.
3.18 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados estão apresentados como a média + erro padrão da média. As diferenças
estatísticas foram determinadas utilizando-se as análises de variância One Way ANOVA -
variância de um fator – (para a análise comparativa dos diferentes tratamentos em um mesmo
sexo) e Two Way ANOVA -variância de dois fatores – (para a análise comparativa entre os
diferentes tratamentos e sexos), seguido dos testes de comparações múltiplas Student-
Newman-Keuls ou Duncan’s. O programa utilizado para as análises foi o Sigma Stat.
4
4
.
.
R
R
e
e
s
s
u
u
l
l
t
t
a
a
d
d
o
o
s
s
47
4.1. EFEITO DO ESTRESSE CRÔNICO EM CAMUNDONGOS C57BL/6 DE
AMBOS OS SEXOS INFECTADOS COM LEISHMANIA MAJOR:
Com o objetivo de avaliar o efeito do estresse na infecção por L. major em uma
linhagem de camundongos sabidamente resistentes a esse parasita, foram utilizados
camundongos da linhagem C57BL/6, machos e fêmeas, com aproximadamente 5 semanas de
vida. Esses animais foram infectados com 10
6
formas promastigotas de L. major e
submetidos ou não a uma condição estressante de longa duração, através de isolamento social
por 12 ou 13 semanas. Para tanto, 10 machos foram mantidos juntos em uma mesma gaiola de
dimensões 54x30x17 cm por 2 semanas (14 dias) para adaptação; o mesmo sendo feito com
10 fêmeas em outra gaiola de iguais dimensões à dos machos.
Após o período de adaptação, os animais de ambos os sexos foram sub-divididos em 3
grupos (como descrito no item 3.8 de Material e Métodos). Conforme observado na figura 4.1
(A), o grupo dos machos estressados pré e pós-infecção apresentou uma regressão mais
acentuada no tamanho das lesões em relação ao grupo controle, a partir da 10ª semana de
infecção. Uma alteração na progressão da doença também foi observada entre os grupos das
fêmeas, como mostra a figura 4.1 (B). Assim como nos machos, foi o grupo de animais
estressados antes e depois da infecção nas fêmeas que diferiu do grupo controle, apresentando
lesões menores que esse grupo durante a 5ª e 6ª semanas de infecção. Entretanto, após esse
período as lesões dos três grupos experimentais das fêmeas apresentaram-se semelhantes até o
final da avaliação.
Na figura 4.2 são feitas comparações entre machos e fêmeas no tamanho das lesões
apresentadas nos diferentes grupos. Assim, podemos observar que entre os grupos controles,
as fêmeas apresentam lesões maiores que os machos apenas por um pequeno período (6ª e 7ª
semanas) (A). Além disso, entre os grupos estressados antes e depois da infecção, as fêmeas
48
apresentaram uma progressão da doença mais lenta que os machos até a 7ª semana de
infecção e depois desse período o tamanho das lesões superaram o dos machos até o período
final de avaliação (12ª semana) (B).
4.2. EFEITO DO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL (ECI) NAS LESÕES
PELA INFECÇÃO COM LEISHMANIA MAJOR EM CAMUNDONGOS C57BL/6 DE
AMBOS OS SEXOS:
Além de avaliarmos o papel de um estresse crônico repetitivo (isolamento social),
decidimos verificar também o papel de um estresse crônico aleatório e imprevisível no
tamanho das lesões. Assim, foram formados três grupos experimentais para cada sexo: Grupo
I: animais infectados com L. major e com ausência de estresse durante todo o curso da
infecção; Grupo II: submetidos ao ECI por 12 dias antes da infecção e permaneceram
estressados por mais 11 semanas pós-infecção; Grupo III: submetidos ao ECI somente após a
infecção com o parasita por 13 semanas, durante o curso da infecção. A medida das patas
realizada nos camundongos machos mostrou um aumento no tamanho das lesões dos animais
do Grupo III quando comparados aos animais do Grupo I e II, a partir da 10ª semana de
infecção, chegando a aproximadamente 50% de diferença na 12ª semana. Já o Grupo II não
apresentou diferença em relação ao Grupo I durante todo o curso da infecção (figura 4.3 – A).
Nas fêmeas também foi observado um aumento no tamanho das lesões dos animais do Grupo
III em relação aos animais controle, com uma diferença mais expressiva na 10ª semana de
infecção (aproximadamente 100%). Semelhante aos machos, o Grupo II das fêmeas também
não apresentou uma diferença expressiva no tamanho das lesões em relação ao Grupo I
durante todo o período avaliado (figura 4.3 - B).
49
(A)
0123456789101112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Sem estresse
Estresse pré e pós-infecção
Estresse pós-infecção
(B)
0123456789101112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Sem estresse
Estresse pré e pós-infecção
Estresse pós-infecção
Figura 4.1. Medida das patas de camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B) submetidos ou não
ao estresse crônico durante a infecção com L. major. Os dados representam a média + erro padrão da
média do tamanho das lesões nas patas dos animais. Resultado de um experimento realizado, n = 4 (4
animais por grupo experimental).
50
(A) (B)
0123456789101112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
0123456789101112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
(C)
0123456789101112
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
Figura 4.2. Comparação entre machos e fêmeas C57BL/6 no tamanho das lesões apresentadas nos
diferentes grupos, submetidos ou não ao estresse crônico. (A) Grupo I (sem estresse); (B) Grupo II
(estresse pré e pós-infecção); (C) Grupo III (estresse pós-infecção). Os dados representam a média +
erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos animais. Resultado de um experimento
realizado, n = 4 (4 animais por grupo experimental).
51
Além disso, pela comparação da medida das patas dos machos com a medida das fêmeas
foi possível observar que entre os animais do Grupo I houve um aumento de 87% nas lesões das
fêmeas frente aos machos, na 13ª semana de infecção (figura 4.4 – A). A diferença foi ainda
mais expressiva nos animais do Grupo II, em que as fêmeas apresentaram lesões 137% maiores
que os machos na 12ª semana de infecção (figura 4.4 – B). Já nos animais do Grupo III a
diferença chegou a 75% entre fêmeas e machos na 10ª semana de infecção (figura 4.4 – C).
4.3. AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE CORTICOSTERONA EM
CAMUNDONGOS C57BL/6 DE AMBOS OS SEXOS SUBMETIDOS AO ECI:
Sendo o hormônio corticosterona um mediador de estresse em camundongos, decidimos
verificar as concentrações plasmáticas deste hormônio nos camundongos C57BL/6 após
serem submetidos ao ECI por 11 semanas de infecção com L. major, além de avaliar se existe
diferença nos níveis de corticosterona entre machos e fêmeas dessa linhagem. O grupo de
animais que não foi infectado e submetido ao ECI foi denominado de “grupo saudável” (SD).
Havia ainda um grupo controle da infecção (Inf), no qual os animais eram apenas infectados,
não sendo submetidos ao ECI em nenhum momento. Entre os grupos estressados havia um
grupo que foi submetido ao estresse apenas depois da infecção e durante todo o curso da
doença (Inf/St), e um grupo submetido ao estresse antes e depois da infecção, durante o curso
da doença (St/Inf/St).
Pela dosagem hormonal foi possível observar que os dois grupos de machos submetidos
ao estresse não apresentaram níveis de corticosterona diferentes dos níveis plasmáticos dos
animais saudáveis e dos animais apenas infectados. Já entre as fêmeas, verificamos um
aumento significativo na concentração de corticosterona no grupo de animais submetidos ao
ECI antes e depois da infecção, em relação aos outros tratamentos utilizados (figura 4.5).
52
(A)
1245678910111213
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Sem estresse
ECI pré e pós-infecção
ECI pós-infecção
(B)
1245678910111213
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Sem estresse
ECI pré e pós-infecção
ECI pós-infecção
Figura 4.3. Medidas das patas de camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B) submetidos ao
estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso de infecção por L. major. Os dados representam a
média + erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos animais. Resultado representativo
de dois experimentos realizados, n = 6 (6 animais por grupo em cada experimento).
53
(A) (B)
1245678910111213
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
1245678910111213
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
(C)
1245678910111213
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
Figura 4.4. Comparação entre machos e fêmeas de camundongos C57BL/6, submetidos ou não ao
ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos diferentes grupos. (A) Grupo I (sem estresse); (B) Grupo
II (estresse pré e pós-infecção); (C) Grupo III (estresse pós-infecção). Os dados representam a média
+ erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos animais. Resultado representativo de dois
experimentos realizados, n = 6 (6 animais por grupo em cada experimento).
54
A comparação entre os níveis hormonais de machos e fêmeas, nos diferentes
tratamentos, mostrou uma alteração na produção de corticosterona entre os gêneros, conforme
observado na figura 4.5 (C). As fêmeas que foram submetidas ao ECI antes e depois da
infecção, apresentaram níveis hormonais significativamente maiores que os machos
submetidos ao mesmo ou aos demais tratamentos. Uma diferença significativa também foi
observada entre o grupo estressado depois da infecção nas fêmeas em relação aos grupos
saudável e apenas infectado nos machos.
4.4. AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE CORTICOSTERONA EM CADA
CONDIÇÃO ESTRESSANTE SUBMETIDA AOS ANIMAIS C57BL/6 MACHOS E
FÊMEAS NÃO-INFECTADOS:
Para avaliarmos a contribuição de cada condição estressante utilizada nos experimentos
de estresse crônico imprevisível (ECI), em animais C57BL/6 não-infectados, o nível de
corticosterona plasmática foi determinado imediatamente após cada procedimento de estresse.
Na figura 4.6 verificamos que os níveis hormonais, tanto dos machos quanto das
fêmeas, submetidos ao estresse de nado forçado e contenção foram significativamente
maiores que os níveis hormonais dos grupos submetidos aos demais tipos de estresse e ao
grupo controle. Além disso, nas fêmeas foi observada uma diferença na concentração de
corticosterona produzida pelos animais submetidos ao estresse de luz apagada em relação aos
animais submetidos ao estresse de luz acesa. Podemos observar também que os níveis de
corticosterona das fêmeas submetidas ao estresse de nado forçado são consideravelmente
maiores que os níveis dos machos submetidos ao mesmo tipo de estresse.
55
(A) (B)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
SD Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
SD Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
(C)
**
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
SD Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
Machos Fêmeas
Figura 4.5. Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos C57BL/6 após 11 semanas de infecção com L. major. (A) machos,
(B) fêmeas, (C) comparação dos níveis hormonais entre machos e fêmeas nos diferentes grupos. SD,
animais saudáveis; Inf, animais apenas infectados; Inf/St, animais estressados depois da infecção;
St/Inf/St; animais estressados antes e depois da infecção. Os dados representam a média + erro padrão
da média, n=6 (6 animais por grupo) de dois experimentos independentes. * p<0,05 quando o grupo
St/Inf/St das fêmeas é comparado aos demais grupos (SD, Inf, Inf/St) (B) e quando o grupo St/Inf/St
das fêmeas é comparado a todos os grupos dos machos (SD, Inf, Inf/St, St/Inf/St) (C); **p<0,05
quando o grupo Inf/St das fêmeas é comparado aos grupos SD e Inf dos machos (C).
56
(A)
**
*
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
Controle Natação Contenção Luz acesa Luz apag. Isol. social
Corticosterona (
µ
g/dL)
(B)
*
**
#
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
Controle Natação Contenção Luz acesa Luz apag. Isol. social
Corticosterona (
µ
g/dL)
Figura 4.6. Dosagem de corticosterona em camundongos C57BL/6 machos (A) e fêmeas (B)
submetidos a diferentes condições estressantes. Os resultados representam a média + erro padrão da
média, n=4 (4 animais por grupo) de um experimento realizado. *p<0,05 quando o grupo de animais
submetidos ao estresse de natação foi comparado aos animais submetidos aos demais tipos de estresse
e ao grupo controle; **p<0,05 quando o grupo de animais submetidos ao estresse de contenção foi
comparado aos animais submetidos aos demais tipos de estresse e ao controle; #p<0,05 quando o
grupo de animais submetidos ao estresse de luz apagada é comparado ao grupo submetido ao estresse
de luz acesa nas fêmeas (B).
57
4.5. EFEITO DO ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL (ECI) NAS LESÕES
PELA INFECÇÃO POR L. MAJOR EM CAMUNDONGOS BALB/c DE AMBOS OS
SEXOS:
Os resultados obtidos com camundongos da linhagem BALB/c mostraram que além das
variáveis de tratamentos e sexos utilizadas nos experimentos, existia ainda uma terceira
variável com relação aos biotérios de onde provinham os animais dessa linhagem. Visto que
os dados de experimentos com animais BALB/c vindos do Biotério Central da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto-USP (denominado apenas de Biotério Central) apresentaram-se
muitos diferentes dos dados obtidos com animais da mesma linhagem vindos do Centro de
Criação de Camundongos Especiais da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
(denominado de Biotério da Genética), optamos por apresentar os resultados dos animais de
cada biotério separadamente.
Os animais de ambos os biotérios foram submetidos ao mesmo protocolo de ECI e
infecção com L. major, conforme descrito no item 3.10 de Material e Métodos, sendo também
avaliada a reatividade dos camundongos machos e fêmeas dessa linhagem frente ao estresse.
Foram formados os mesmos grupos experimentais utilizados nos animais da linhagem
C57BL/6, com o acréscimo de mais dois grupos: um grupo com animais submetidos ao ECI
apenas antes da infecção com o parasita, por 6 dias; e um grupo com animais que não foram
infectados, porém foram submetidos ao ECI durante o curso da infecção induzida nos demais
grupos (controle do estresse).
Na figura 4.7 são apresentadas as medidas das patas dos animais BALB/c machos e
fêmeas obtidos do Biotério Central e infectados com L. major. Como podemos observar, os
três grupos de machos infectados e submetidos ao ECI apresentaram maiores lesões nas patas
que o grupo apenas infectado, com destaque para o grupo submetido ao ECI pré-infecção que
58
apresentou uma diferença de até 100% no tamanho das lesões em relação ao grupo apenas
infectado, na 12ª semana de infecção (A). Entretanto, nas fêmeas observamos uma inversão
do resultado obtido com os machos. Neste caso, os grupos submetidos ao ECI apresentaram
lesões inferiores às do grupo apenas infectado, com destaque para o grupo estressado antes da
infecção (B). Pela comparação do tamanho das lesões entre machos e fêmeas, verificamos que
as fêmeas apresentaram lesões maiores que os machos quando esses animais foram apenas
infectados (ausência de estresse), não sendo observadas diferenças entre os sexos nos demais
tratamentos (figura 4.8).
A figura 4.9 apresenta as medidas das patas dos animais BALB/c machos e fêmeas
obtidos do Biotério da Genética e infectados com L. major. Para a realização desse
experimento foram utilizados os mesmos grupos experimentais usados nos animais obtidos do
Biotério Central. Assim, diferentemente dos animais BALB/c do Biotério Central, esses
animais não foram afetados pelo ECI, tanto nos grupos dos machos quanto nos grupos das
fêmeas. A comparação entre os dois sexos nos diferentes tratamentos mostra que também não
há diferença no tamanho das lesões entre machos e fêmeas em todos os grupos analisados
(figura 4.10).
59
(A)
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
Apenas ECI
Controle saudável
(B)
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
Apenas ECI
Controle saudável
Figura 4.7. Medidas das patas de camundongos BALB/c vindos do Biotério Central machos (A) e
fêmeas (B) submetidos ao estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso de infecção por L.
major. Os dados representam a média + erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos
animais, n = 5 (5 animais por grupo experimental) de um experimento realizado.
60
(A) (B)
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
(C) (D)
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
0123456789101112
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
Figura 4.8. Comparação entre machos e fêmeas de camundongos BALB/c vindos do Biotério Central,
submetidos ou não ao ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos diferentes grupos. (A) Grupos
apenas infectados (sem estresse); (B) Grupos submetidos ao ECI pré-infecção; (C) Grupos submetidos
ao ECI pós-infecção; (D) Grupos submetidos ao ECI pré e pós-infecção. Os dados representam a
média + erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos animais, n = 5 (5 animais por
grupo experimental) de um experimento realizado.
61
(A)
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
Apenas ECI
Controle saudável
(B)
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
Apenas ECI
Controle saudável
Figura 4.9. Medidas das patas de camundongos BALB/c vindos do Biotério da Genética, machos (A)
e fêmeas (B), submetidos ao estresse crônico imprevisível (ECI) durante o curso de infecção por L.
major. Os dados representam a média + erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos
animais, n = 5 (5 animais por grupo experimental) de um experimento realizado.
62
(A) (B)
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
(C) (D)
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
24681012
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Tamanho da lesão (mm)
Semanas de infecção
Machos
Fêmeas
Figura 4.10. Comparação entre machos e fêmeas de camundongos BALB/c vindos do Biotério da
Genética, submetidos ou não ao ECI, no tamanho das lesões apresentadas nos diferentes grupos. (A)
Grupos apenas infectados (sem estresse); (B) Grupos submetidos ao ECI pré-infecção; (C) Grupos
submetidos ao ECI pós-infecção; (D) Grupos submetidos ao ECI pré e pós-infecção. Os dados
representam a média + erro padrão da média do tamanho das lesões nas patas dos animais, n = 5 (5
animais por grupo experimental) de um experimento realizado.
63
4.6. AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE CORTICOSTERONA EM
CAMUNDONGOS BALB/c, DE AMBOS OS SEXOS, SUBMETIDOS AO ECI:
As concentrações plasmáticas do hormônio corticosterona também foram analisadas nos
animais da linhagem BALB/c, machos e fêmeas, obtidos do Biotério Central e do Biotério da
Genética. Para tanto, os animais foram submetidos ao ECI por 12 ou 13 semanas durante os
curso da infecção com L. major. Tanto os machos como as fêmeas, dos dois biotérios, foram
também divididos em Grupo saudável (SD), Controle do estresse (St), Controle da infecção
(Inf), ECI apenas antes da infecção (St/Inf), ECI depois da infecção, durante o curso da
doença (Inf/St), ECI antes e depois da infecção, durante o curso da doença (St/Inf/St). A
figura 4.11 mostra as dosagens de corticosterona em machos e fêmeas de camundongos
BALB/c do Biotétio central. Nela podemos observar que entre os tratamentos submetidos aos
machos, apenas o Grupo Controle do estresse (St) apresentou um aumento significativo nos
níveis hormonais em relação aos demais grupos. Entretanto, quando os mesmos tratamentos
foram induzidos nas fêmeas, não foi verificada nenhuma diferença significativa nos níveis
hormonais de todos os grupos avaliados. Além disso, a comparação da concentração de
corticosterona entre machos e fêmeas mostrou que o grupos St e St/Inf/St dos machos
apresentaram níveis hormonais bem mais elevados que os níveis dos mesmos grupos das
fêmeas. Porém uma diferença estatisticamente significativa foi observada apenas entre
machos e fêmeas do grupo St. Nos camundongos BALB/c obtidos do Biotério da Genética,
observamos que entre os grupos dos machos e das fêmeas não houve diferença significativa
nas concentrações de corticosterona. Quando realizada a comparação entre os sexos,
observamos que os níveis hormonais das fêmeas tendem a serem maiores que os níveis dos
machos em quase todos os grupos experimentais. Contudo, essas diferenças não se
apresentam como estatisticamente significativas (figura 4.12).
64
(A) (B)
*
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona
(
µ
g
/dL
)
(C)
*
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
Machos Fêmeas
Figura 4.11. Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos BALB/c vindos do Biotério central após 12 semanas de infecção com
L. major. (A) Machos, (B) Fêmeas, (C) Comparação dos níveis hormonais entre machos e fêmeas nos
diferentes grupos. SD, animais saudáveis; St, animais estressados e não-infectados; Inf, animais
apenas infectados; St/Inf, animais estressados antes da infecção; Inf/St, animais estressados depois da
infecção; St/Inf/St; animais estressados antes e depois da infecção. Os dados representam a média +
erro padrão da média, n=3 (3 animais por grupo experimental) de um experimento realizado. * p<0,05
quando o grupo St dos machos é comparado aos demais grupos (SD, Inf, St/Inf, Inf/St, St/Inf/St) (A) e
quando o grupo St dos machos é comparado ao grupo St das fêmeas (C).
65
(A) (B)
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona
(
µ
g
/dL
)
(C)
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Corticosterona (
µ
g/dL)
Mac hos Fêmeas
Figura 4.12. Efeito do estresse crônico imprevisível (ECI) nas concentrações plasmáticas de
corticosterona em camundongos BALB/c vindos do Biotério da Genética após 12 semanas de infecção
com L. major. (A) machos, (B) fêmeas, (C) comparação dos níveis hormonais entre machos e fêmeas
nos diferentes grupos. SD, animais saudáveis; St, animais estressados e não-infectados; Inf, animais
apenas infectados; St/Inf, animais estressados antes da infecção; Inf/St, animais estressados depois da
infecção; St/Inf/St; animais estressados antes e depois da infecção. Os dados representam a média +
erro padrão da média, n=3 (3 animais por grupo experimental) de um experimento realizado.
66
4.7. AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE CORTICOSTERONA EM
CAMUNDONGOS BALB/c, MACHOS E FÊMEAS NÃO-INFECTADOS,
SUBMETIDOS A CADA CONDIÇÃO ESTRESSANTE:
Nos camundongos BALB/c, machos e fêmeas não-infectados, também foi avaliada a
contribuição de cada condição estressante utilizada nos experimentos de estresse crônico
imprevisível (ECI), com o nível de corticosterona plasmática sendo determinado
imediatamente após cada procedimento de estresse. Assim, tanto os machos quanto as fêmeas
dessa linhagem foram divididos em oito grupos, em que cada grupo foi submetido a uma
condição estressante diferente: Grupo I, controle (sem estresse); Grupo II, infecção com L.
major, Grupo III, frio; Grupo IV, nado forçado; Grupo V, contenção; Grupo VI, luz acesa;
Grupo VII, luz apagada e Grupo VIII, isolamento social.
Na figura 4.13 verificamos que os níveis hormonais dos machos submetidos ao estresse
de contenção foram significativamente maiores que os níveis hormonais apenas do grupo
submetido ao estresse de infecção com L. major. Já entre as fêmeas foi observada uma
diferença significativa na concentração de corticosterona nos animais submetidos ao estresse
de frio e nado forçado em relação aos demais grupos experimentais. Podemos observar
também que os níveis de corticosterona das fêmeas submetidas ao estresse de frio são
consideravelmente maiores que os níveis dos machos submetidos ao mesmo tipo estresse.
67
(A)
#
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
Co
ntro
l
e
Inf
e
cção
F
r
io
Na
t
a
çã
o
Co
n
t
enç
ã
o
Luz acesa
Luz
ap
a
g.
I
s
ol.
so
c
ial
Corticosterona (
µ
g/dL)
(B)
**
*
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
Control
e
Inf
ecç
ão
F
r
i
o
N
at
ação
Conten
ç
ão
Luz
acesa
Luz apag.
I
sol.
social
Corticosterona (
µ
g/dL)
Figura 4.13. Dosagem de corticosterona em camundongos BALB/c machos (A) e fêmeas (B)
submetidos a diferentes condições estressantes. Os resultados representam a média + erro padrão da
média, n=4 (4 animais por grupo experimental) de um experimento realizado. #p<0,05 quando o grupo
de machos submetidos ao estresse de contenção foi comparado aos animais submetidos ao estresse de
infecção por L. major (A); *p<0,001 quando o grupo de fêmeas submetidas ao estresse de frio é
comparado aos demais grupos; **p<0,01 quando o grupo de fêmeas submetidas ao estresse de natação
é comparado aos demais grupos (B).
68
4.8. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE PARASITAS RECUPERADOS DE
PATAS DE CAMUNDONGOS BALB/c, MACHOS E FÊMEAS, INFECTADOS COM
L. MAJOR E SUBMETIDOS AO ECI:
Para a determinação da carga parasitária nas patas infectadas com L. major de
camundongos BALB/c, de ambos os sexos, foram utilizados 3 animais por grupo
experimental, após o período de 12 semanas do curso da infecção. Os parasitas foram
recuperados de quatro grupos de animais infectados nos machos e nas fêmeas: Grupo I:
apenas infecção; Grupo II, ECI antes da infecção; Grupo III, ECI depois da infecção e Grupo
IV, ECI antes e depois da infecção. Entre os animais do Biotério Central, foi possível a
recuperação dos parasitas nas patas tanto dos machos quanto das fêmeas (figura 4.14 – A).
Entretanto, nos animais vindos do Biotério da Genética, a carga parasitária foi obtida somente
nos grupos dos machos (figura 4.14 – B), já que não foi possível realizar uma análise do
número de parasitas presentes nas placas de cultura das fêmeas, devido à presença de
contaminantes.
Conforme observado na figura 4.14 (A), entre os grupos dos machos do Biotério
Central foi verificado um aumento no número de parasitas presentes nas patas dos animais
submetidos aos três tipos de tratamentos utilizados (ECI antes da infecção, ECI depois da
infecção e ECI antes e depois da infecção) em relação ao grupo controle (apenas infectado),
porém, esse aumento não se mostrou como estatisticamente significativo. Nos grupos das
fêmeas, foi observada uma maior quantidade de parasitas apenas nos grupos de animais
submetidos ao ECI antes da infecção e submetidos ao ECI antes e depois da infecção em
relação ao grupo apenas infectado, sendo que o grupo estressado antes e depois da infecção
apresentou um aumento significativo no número de parasitas em relação aos grupos apenas
infectado e estressado depois da infecção (figura 4.14 – A).
69
Entre os machos, oriundos do Biotério da Genética, verificamos que apenas o grupo de
animais submetidos ao ECI depois da infecção apresentou um discreto aumento na carga
parasitária em relação aos demais grupos submetidos ao ECI e ao grupo controle. Entretanto,
esse aumento novamente não se apresentou como significativo (figura 4.14 – B).
4.9. AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) IN VITRO POR
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS BALB/c DE AMBOS OS
SEXOS, SUBMETIDOS AO ECI E INFECTADOS PELO PARASITA L. MAJOR:
Considerando que o NO é uma das principais moléculas envolvidas nos efeitos
leishmanicidas de macrófagos ativados (Bogdan et al, 2000), avaliamos a produção de nitrito
em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c do Biotério Central e da Genética, de
ambos os sexos, submetidos ao ECI. Para tanto foram preparadas sete culturas de macrófagos
para machos e fêmeas:
Cultura I: macrófagos de animais infectados in vivo;
Cultura II: macrófagos de animais estressados antes da infecção in vivo;
Cultura III: macrófagos de animais estressados depois da infecção in vivo;
Cultura IV: macrófagos de animais estressados antes e depois da infecção in vivo;
Cultura V: macrófagos de animais apenas estressados;
Cultura VI: macrófagos de animais saudáveis (sem estresse e infecção in vivo);
Cultura VI*: macrófagos de animais saudáveis (sem estresse e infecção in vivo e in
vitro).
70
(A)
Machos Fêmeas
0,00
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
*
Número de parasitas/pata (log
10
+1)
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
(B)
Machos
0,00
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
Número de parasitas/pata (log
10
+ 1)
Apenas infecção
ECI pré-infecção
ECI pós-infecção
ECI pré e pós-infecção
Figura 4.14. Carga parasitária das patas infectadas com L. major de camundongos BALB/c vindos do
Biotério Central (A) e Biotério da Genética (B). Os resultados representam a média + erro padrão da
média, n=3 (3 animais por grupo experimental) de um experimento realizado. *p<0,05 quando o grupo
das fêmeas submetido ao ECI pré e pós-infecção foi comparado ao grupo submetido ao ECI pós-
infecção e ao grupo apenas infectado, no mesmo gênero.
71
Com exceção da cultura VI* que foi incubada in vitro apenas com o meio RPMI, todas
as demais culturas foram estimuladas com promastigostas de L. major in vitro, na proporção
de 3 parasitas para cada macrófago (3:1).
A figura 4.15 (A) nos mostra que entre os machos do Biotério Central as culturas de
macrófagos de todos os animais submetidos ao ECI produziram significativamente menores
níveis de nitrito em relação aos macrófagos de animais infectados in vivo que não foram
submetidos ao ECI. Isso também foi observado com as culturas controles (macrófagos de
animais saudáveis estimulados com L. major ou não in vitro). Já entre as fêmeas do Biotério
Central não foi observada diferença na produção de nitrito em todas as culturas de macrófagos
analisadas (figura 4.15 – B). Os macrófagos dos animais do Biotério da Genética não
apresentaram diferenças na produção de nitrito em todos as culturas avaliadas nos machos e
nas fêmeas (figura 4.15 – C e D), com exceção dos macrófagos obtidos de fêmeas saudáveis
e incubados apenas com meio de cultura in vitro, que apesar de não terem sido estimulados
por L. major tanto in vivo quanto in vitro, apresentaram níveis de nitrito significativamente
maiores que as demais culturas (figura 4.15 – D).
4.10. ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS POR LINFÓCITOS T DE
CAMUNDONGOS BALB/c MACHOS SUBMETIDOS AO ECI DURANTE O CURSO
DA INFECÇÃO POR L. MAJOR:
Uma vez que em camundongos BALB/c machos obtidos do Biotério Central
observamos diferenças expressivas entre os grupos estressados e os grupos controles em
diferentes análises, como no tamanho das lesões nas patas infectadas com L. major, na
concentração plasmática de corticosterona, no número de parasitas no local da infecção e na
produção de nitrito por macrófagos, decidimos avaliar os níveis de citocinas de padrão Th1
(IFN-γ) e Th2 (IL-5 e IL-4) produzidos por linfócitos T desses animais in vitro.
72
(A) (B)
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
I II III IV V VI VI*
Nitrito (
µ
M)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
I II III IV V VI VI*
Nitrito (
µ
M)
(B) (D)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
I II III IV V VI VI*
Nitrito (
µ
M)
*
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
I II III IV V VI VI*
Nitrito (
µ
M)
Figura 4.15. Produção de nitrito em culturas de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c
submetidos ou não ao ECI in vivo e estimulados ou não com promastigotas de L. major in vitro. (A) e
(B) machos e fêmeas do Biotério Central, respectivamente. (C) e (D) machos e fêmeas do Biotério da
Genética, respectivamente. I, macrófagos de animais infectados in vivo; II, macrófagos de animais
submetidos ao ECI pré-infecção; III, macrófagos de animais submetidos ao ECI pós-infecção; IV,
macrófagos de animais submetidos ao ECI pré e pós-infecção; V, macrófagos de animais apenas
submetidos ao ECI; VI, macrófagos de animais saudáveis; VI*, macrófagos de animais saudáveis e
incubados apenas com meio de cultura in vitro. As culturas de macrófagos de I a VI foram estimuladas
in vitro com promastigotas de L. major (3:1). Os resultados representam a média + erro padrão da
média, n=5 (5 animais por grupo experimental) de um experimento realizado. *p<0,05 quando nos
machos do Biotério Central a dosagem de nitrito produzido pela cultura I foi comparada a todas as
demais culturas de macrófagos dos machos; e quando nas fêmeas do Biotério da Genética a dosagem
de nitrito produzido pela cultura VI* foi comparada aos macrófagos das demais culturas das fêmeas.
73
Para tanto, foram preparadas seis culturas de macrófagos: Cultura I, macrófagos de
animais infectados in vivo; Cultura II, macrófagos de animais estressados antes da infecção in
vivo; Cultura III, macrófagos de animais estressados depois da infecção in vivo; Cultura IV,
macrófagos de animais estressados antes e depois da infecção in vivo; Cultura V, macrófagos
de animais apenas estressados; Cultura VI, macrófagos de animais saudáveis (sem infecção e
estresse). Essas culturas foram estimuladas com L. major ou meio de cultura in vitro e após 4
horas foram colocadas na presença de células do linfonodo inguinal drenante para posterior
coleta dos sobrenadantes (48 horas depois) e dosagem das citocinas pelo método de ELISA
(ver itens 3.13 – 3.15 de Material e Métodos).
A comparação dos níveis de IFN-γ, IL-4 e IL-5 detectados nos diferentes grupos
experimentais não mostrou diferença estatisticamente significativa. Porém, na figura 4.16
observamos que as células T de animais submetidos ao ECI depois da infecção com L. major
(III) e antes e depois da infecção (IV), assim como dos animais que não foram infectados in
vivo como o grupo apenas estressado (V) e grupo saudável (VI) produziram níveis reduzidos
de IFN-γ em relação às células T dos animais infectados (I) e dos animais estressados antes da
infecção (II). Além disso, pela dosagem de IL-4 observamos níveis mais elevados dessa
citocina nos três grupos de animais infectados com L. major e submetidos ao ECI in vivo (II,
III, IV) em relação ao grupo de animais apenas infectados (I). Entretanto, todos os grupos
experimentais produziram níveis menores de IL-4 em relação às células do grupo de animais
saudáveis (VI). A produção de IL-5 pelas células dos grupos de animais estressados antes da
infecção in vivo (II) e antes e depois da infecção (IV) também foi maior que do grupo de
animais infectados in vivo que não foram submetidos ao estresse durante todo o experimento
(I). Contudo, nas células dos grupos de animais que não foram infectados in vivo, como nos
animais apenas estressados (V) e animais saudáveis (VI), praticamente não foram detectados
níveis da citocina IL-5.
74
4.11. AVALIAÇÃO DO PESO CORPORAL DE CAMUNDONGOS BALB/c
MACHOS E FÊMEAS SUBMETIDOS AO ECI, DURANTE O CURSO DA
INFECÇÃO POR L. MAJOR:
Durante os experimentos de ECI realizados com os camundongos BALB/c machos e
fêmeas do Biotério Central observamos que os grupos experimentais apresentaram diferenças
no ganho de peso corporal ao final do curso da infecção com L. major. Assim a figura 4.17
(A) mostra que o grupo de machos que foi apenas infectado e os três grupos infectados e
submetidos ao ECI diferiram de maneira significativa do grupo saudável no ganho de peso
corporal ao final do curso da infecção (12 semanas). Porém, a mesma diferença não foi
observada entre os grupos das fêmeas (figura 4.17 – B). Entre os animais do Biotério da
Genética também podemos verificar uma diferença no ganho de peso corporal entre alguns
grupos dos machos, sendo, entretanto, uma diferença menos evidente que as diferenças
apresentadas entre os grupos dos machos do Biotério Central (figura 4.17 – C). Foram
verificadas diferenças significativas entre o grupo saudável e os três grupos infectados e
submetidos ao ECI, e entre o grupo apenas estressado e o grupo submetido ao ECI depois da
infecção. Novamente, nas fêmeas não foram observadas diferenças no ganho de peso corporal
em todos os grupos experimentais (figura 4.17 – D).
75
I II III IV V VI
0
40
80
120
160
200
IFN-
γ
(pg/mL)
Estímulo com L. major
Estímulo com meio de cultura
I II III IV V VI
-10
0
10
20
30
40
50
250
300
350
400
450
500
550
600
IL-4 (pg/mL)
Estímulo com L. major
Estímulo com meio de cultura
I II III IV V VI
0
100
200
300
400
500
600
700
IL-5 (pg/mL)
Estímulo com L. major
Estímulo com meio de cultura
Figura 4.16. Detecção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 em sobrenadantes de células do linfonodo inguinal
drenante de camundongos BALB/c machos do Biotério Central submetidos a diferentes tratamentos in
vivo. I, células de animais apenas infectados in vivo; II, células de animais estressados antes da
infecção; III, células de animais estressados depois da infecção; IV, células de animais estressados
antes e depois da infecção; V, células de animais apenas estressados; VI, células de animais saudáveis
(sem estresse e infecção in vivo). Os resultados representam a média + erro padrão da média, n= 4 (4
animais por grupo experimental) de um experimento realizado.
76
(A) (B)
*
0
2
4
6
8
10
12
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Ganho peso corpora (g)
0
2
4
6
8
10
12
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Ganho peso corporal (g)
(C) (D)
**
#
0
2
4
6
8
10
12
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Ganho peso corporal (g)
0
2
4
6
8
10
12
SD St Inf St/Inf Inf/St St/Inf/St
Ganho peso corporal (g)
Figura 4.17. Ganho de peso corporal de camundongos BALB/c ao final do curso da infecção com L.
major (12 semanas de infecção). (A) machos e (B) fêmeas do Biotério Central; (C) machos e (D)
fêmeas do Biotério da Genética. SD, animais saudáveis; St, animais apenas estressados; Inf, animais
apenas infectados; St/Inf, animais estressados antes da infecção; Inf/St, animais estressados depois da
infecção; St/Inf/St, animais estressados antes e depois da infecção. Os dados representam a média +
erro padrão da média, n=5 (5 animais por grupo experimental) de um experimento realizado. *p<0,05
quando o grupo saudável dos machos do Biotério Central foi comparado aos grupos apenas infectado,
estressado antes da infecção, estressado depois da infecção e estressados antes e depois da infecção
(A). **p<0,05 quando o grupo saudável dos machos do Biotério da Genética foi comparado aos três
grupos infectados e submetidos ao estresse (St/Inf; Inf/St; St/Inf/St) e #p<0,05 quando o grupo
estressado depois da infecção foi comparado ao grupo apenas estressado nos machos do Biotério da
Genética (C).
5
5
.
.
D
D
i
i
s
s
c
c
u
u
s
s
s
s
ã
ã
o
o
78
A pesquisa na área da psiconeuroimunologia vem demonstrando que mecanismos
imunoreguladores fazem parte de uma complexa rede de respostas adaptativas. Os
conhecimentos sobre as interações entre o cérebro e o sistema imune permitem a expansão de
nossa compreensão acerca dos mecanismos interligados ao processo saúde-doença, assim
como o papel das emoções e do estresse nesse contexto.
Durante a resposta do organismo a um tipo de estresse, vários hormônios e
neurotransmissores permitem a mobilização de todos os recursos desse organismo para lidar
com o desafio. Um dos efeitos, ao nível do sistema imune, é que as células imunes deslocam-
se dos seus “compartimentos primários”, como baço e timo, para os “locais de batalha” como
o sangue periférico, os linfonodos e a pele (Bartolomucci et al, 2005).
Em estudos de Dhabhar & McEwen (2001), foi avaliada a resposta imune mediada por
células, denominada de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) ou tipo IV, de acordo com
Gell e Coombs. Se a DTH era precedida por uma sessão de estresse de contenção (evento
agudo), o resultado era uma potencialização da resposta imune, e ao contrário, essa resposta
era deprimida após a repetição intermitente do estresse de contenção (evento crônico),
resultando na redução da resposta de DTH. Estes achados confirmam o papel adaptador do
organismo frente a um estresse agudo, já que a pele é uma das principais rotas de acesso de
patógenos ao corpo. Entretanto, o problema da resposta ao estresse é que ela é adaptativa em
um curto período, mas pode tornar-se altamente mal-adaptada ao longo do tempo.
Com base nisso, decidimos verificar se um estresse de longa duração, induzido pelo
isolamento social de camundongos da linhagem C57BL/6 machos e fêmeas, poderia agravar
uma infecção parasitária de pele, causada pelo protozoário Leishmania major. O isolamento
social é um modelo de ausência de interações entre os animais, que é relativamente
comparável a um sentimento de solidão em humanos. Em roedores, o isolamento social
resulta em distúrbios fisiológicos e de comportamento, podendo tanto aumentar a
79
competência imunológica quanto aumentar o risco para o desenvolvimento de patologias
(Grewal et al, 1997; Wu et al, 2001).
Conforme observado na figura 4.1, o estresse de isolamento social induziu leves
modificações no tamanho das lesões apresentadas tanto por machos quanto por fêmeas da
linhagem C57BL/6. Contudo essa alteração morfológica foi observada apenas nos animais
submetidos ao estresse antes e depois da infecção, não ocorrendo o mesmo com os animais
submetidos ao estresse somente depois da infecção.
Nos animais C57BL/6 machos, verificamos uma regressão mais acentuada das lesões
nas patas do grupo de animais estressados antes e depois da infecção em relação ao demais
grupos, a partir da 10ª semana de infecção (figura 4.1 – A). Uma explicação para tal
acontecimento seria o fato de camundongos machos dessa linhagem apresentarem um
aumento na proliferação de células T CD4
+
quando imunizados com um antígeno protéico, da
4ª a 15ª semanas de submissão ao estresse de isolamento social, o mesmo não sendo
observado em fêmeas da mesma linhagem, como reportado no estudo realizado por Grewal e
cols (1997). Assim, em nosso estudo, os machos estressados poderiam estar reduzindo o
tamanho da lesão de uma maneira mais eficiente que os animais controle, devido a um
aumento no número de células T CD4
+
antígeno-específicas, culminando em uma eliminação
mais rápida e efetiva do parasita L. major.
O achado de Grewal e cols, poderia explicar também o fato das fêmeas submetidas ao
estresse antes e depois da infecção, apresentarem lesões maiores que os machos submetidos
ao mesmo tratamento, a partir da 8ª semana de infecção com L. major (figura 4.2 – B), já que
os machos parecem ser mais susceptíveis a mudanças imunológicas (como o aumento da
imunocompetência) frente ao isolamento social, quando comparados às fêmeas.
O fato das lesões não terem se apresentado maiores ou menores nos animais estressados
em relação aos animais controle, de uma forma homogênea durante todo o curso da infecção,
80
nos remeteu a idéia de que o método de isolamento social não se apresentava como um fator
estressante a longo tempo e, portanto, não induzia uma diferença em responder à infecção
entre os grupos experimentais e ambos os sexos. Essa hipótese é reforçada pelo estudo
desenvolvido por Bartolomucci e cols (2003) no qual foi mostrado que o isolamento social,
aplicado por um longo período, não induzia alterações endócrinas e imunes em camundongos
Swiss CD-1.
Decidimos, então, investigar o papel de um estresse crônico imprevisível (ECI) em
camundongos tanto da linhagem C57BL/6, quanto da linhagem BALB/c, machos e fêmeas, no
tamanho das lesões formadas pela infecção crônica por L. major. Esse modelo consiste na
aplicação diária de um estresse ao acaso, submetendo os animais a diversos tipos de condições
estressantes no decorrer de um experimento, apresentando-se, portanto, como um evento
estressante imprevisível para o organismo. Alguns estudos prévios mostraram que o ECI
resulta em sinais marcantes de superexposição crônica a glicocorticóides (mediadores de
estresse), como o aumento no peso das glândulas supra-renais, atrofia do timo, redução no
ganho de peso corporal e aumento dos níveis de corticosterona (Cullinan & Wolfe, 2000;
Herman et al, 1995). Assim, selecionamos o ECI como método de estresse a ser aplicado nos
experimentos posteriores desenvolvidos nesse trabalho. Além disso, a mistura de estressores
físicos e psicológicos encontrada no modelo de ECI, não somente reduz as chances de
adaptação dos animais como também mimetiza a variabilidade de estressores encontrados na
vida diária dos indivíduos.
Quando realizamos a medida das patas de camundongos C57BL/6 submetidos ao ECI,
verificamos uma maior alteração no tamanho das lesões causadas pela infecção com L. major
em relação ao grupo controle, do que quando submetíamos os animais a um tipo de estresse
crônico repetitivo (isolamento social). Quando os animais foram expostos ao ECI,
apresentaram maiores lesões que o grupo controle a partir de um determinado período da
81
infecção e permaneceram assim até o final do curso da doença. Porém essa diferença
marcante nas lesões foi observada apenas no grupo submetido ao ECI pós-infecção, tanto dos
machos, quanto das fêmeas (figura 4.3). Além disso, pela comparação das lesões
apresentadas pelos machos com as lesões das fêmeas dessa linhagem, observamos um maior
comprometimento tecidual nas fêmeas que nos machos, em todos os grupos experimentais
analisados, como identificado por um expressivo aumento no tamanho das lesões (figura 4.4).
Essa diferença sexual foi ainda mais nítida entre os grupos submetidos ao ECI pré e pós-
infecção, no qual as fêmeas chegaram a apresentar lesões 137% maiores que os machos na 12ª
semana de infecção (figura 4.4 – B).
Diversos estudos apontam um dimorfismo sexual em lidar com doenças infecciosas
(Klein, 2004). Na grande maioria desses estudos foi observado que as fêmeas apresentam
tipicamente maiores respostas imunes que os machos (Zuk & Mckean, 1996), seja pelo fato
das fêmeas apresentarem uma menor exposição a agentes patogênicos que os machos, seja
pela menor predisposição e susceptibilidade dos animais desse gênero a grande parte das
doenças infecciosas. A elevada imunidade encontrada nas fêmeas as remete a duas vertentes:
enquanto torna-se benéfica contra doenças infecciosas, pode ser prejudicial em termos de
aumentar as chances para o desenvolvimento de doenças auto-imunes. Com relação às
doenças parasitárias, os machos também se apresentam como mais propensos à infecção.
Entretanto, apesar de camundongos machos serem mais susceptíveis que as fêmeas a muitos
parasitas, há parasitas pelos quais os machos são mais resistentes que as fêmeas, como por
exemplo, na infecção por Toxoplasma gondii (Walker et al, 1997), por Schistosoma mansoni
(Eloi-Santos et al, 1992) e Taenia crassiceps (Larralde et al, 1995). Na infecção por
Leishmania, alguns estudos também apontam uma maior susceptibilidade das fêmeas em
relação aos machos, dependendo da espécie de Leishmania e da linhagem de camundongo
utilizadas (Alexander, 1988; Krishnan et al, 1996). A causa desse dimorfismo sexual em lidar
82
com certos parasitas parece estar relacionada a diferenças nas interações parasita-hospedeiro
que são afetas pelo sistema endócrino (Morales-Montor et al, 2004).
Os indícios da participação do sistema endócrino na intensidade de doenças parasitárias
nos levaram a investigar se o hormônio corticosterona (induzido pelo estresse) tinha relação
com o aumento das lesões apresentadas pelo grupo de camundongos C57BL/6 estressados,
além de uma relação com a menor resistência apresentada pelas fêmeas, quando comparadas
aos machos, no modelo de infecção por L. major. Como já comentado nessa dissertação, os
glicocorticoídes, como a corticosterona nos roedores e o cortisol em humanos, em altas
concentrações podem suprimir as respostas imunes inata e adaptativa (Elenkov, 2004;
Sternberg, 2006). Os glicocorticóides podem também influenciar um dimorfismo sexual na
função imune, como comprovado por estudos em roedores, que identificaram concentrações
plasmáticas basais maiores de corticosterona nas fêmeas, além de uma secreção hormonal
mais rápida nas fêmeas que nos machos, após a exposição ao estresse (Critchlow et al, 1963;
Kitay, 1961).
Presumivelmente, se uma infecção desregula de maneira diferente a homeostase de
machos e fêmeas, então os efeitos dos glicocorticóides na resposta imune podem diferir entre
os sexos. Os nossos resultados indicam que camundongos C57BL/6 apresentam alterações na
produção de corticosterona após uma condição estressante de longa duração (figura 4.5).
Porém, observamos que apenas as fêmeas dessa linhagem apresentaram aumento nas
concentrações plasmáticas de corticosterona, quando submetidas ao ECI, e mais
especificamente, foi observado um aumento significativo nos níveis hormonais do grupo de
fêmeas submetido ao ECI antes e depois da infecção (B). Além disso, pela comparação entre
os sexos, na concentração de corticosterona circulante nos diferentes grupos experimentais,
observamos que as fêmeas apresentaram níveis hormonais superiores aos dos machos tanto
nos grupos submetidos ao ECI quanto no grupo apenas infectado com L. major. As diferenças
83
entre machos e fêmeas foram significativas quando o grupo das fêmeas estressado antes e
depois da infecção foi comparado a todos os grupos experimentais dos machos; e quando o
grupo das fêmeas submetido ao ECI apenas depois da infecção foi comparado aos grupos
apenas infectado e saudável dos machos (C).
Diferentes tipos de estresse induzem diferentes respostas fisiológicas e comportamentais
(Bowers et al, 2007). Com base nisso, decidimos avaliar a contribuição de cada condição
estressante utilizada no modelo de estresse crônico imprevisível nos animais C57BL/6 de
ambos os sexos, não-infectados, através da determinação do nível de corticosterona
plasmática apresentado pelos grupos de machos e fêmeas, submetidos uma única vez a um
dos procedimentos de estresse: nado forçado, contenção, luz acesa e luz apagada (inversão do
ritmo circadiano) e isolamento social. Tanto nos machos, quanto nas fêmeas, as condições
estressantes que apresentaram destaque na concentração hormonal produzida foram as de
nado forçado e contenção (figura 4.6). Entre os machos, verificamos que os níveis de
corticosterona foram semelhantes nesses dois tipos de estresse, que se diferenciaram
significativamente dos níveis apresentados pelos demais grupos experimentais (A). Essa
resposta hormonal dos camundongos C57BL/6 machos, frente a um evento agudo,
corresponde aos resultados obtidos por Bowers et al (2007) com camundongos dessa mesma
linhagem e sexo, em que os estresses de nado forçado e contenção induziram consideráveis
aumentos nos níveis de corticosterona. Contudo, o estresse de isolamento social, por exemplo,
não induziu uma diferença na produção hormonal em relação ao grupo controle (sem
estresse). Em adição ao trabalho de Bowers e cols, investigamos também a produção de
corticosterona nos diferentes grupos experimentais das fêmeas. Assim como nos machos, as
fêmeas apresentaram destaque na produção hormonal após o estresse de nado forçado e
contenção, que se diferenciaram de maneira significativa dos demais grupos estressados e do
grupo controle. Além disso, nas fêmeas observamos maiores níveis hormonais nos animais
84
submetidos ao estresse de luz apagada em relação ao estresse de luz acesa (B). Juntos, esses
resultados sugerem que diferentes tipos de estresse, comumente utilizados na área da
psiconeuroimunologia, podem não ativar respostas fisiológicas ao estresse em uma mesma
intensidade e extensão.
Considerando a existência de uma variabilidade de respostas comportamentais e
neuroquímicas a estressores, entre animais de diferentes backgrounds genéticos (Anisman et
al, 2007), resolvemos testar o modelo de estresse crônico imprevisível na indução de
possíveis alterações endócrinas e imunes em camundongos da linhagem BALB/c machos e
fêmeas, além de avaliar o papel do estresse na progressão da infecção por L. major também
nos camundongos dessa linhagem. Ao contrário de camundongos C57BL/6, os animais
BALB/c apresentam extrema susceptibilidade à infecção por L. major. Dessa maneira, o
nosso interesse em trabalhar com camundongos dessa linhagem foi de investigar o papel de
um estresse crônico na reatividade desses animais à infecção por L. major, observando
também possíveis diferenças entre os sexos e em relação às respostas apresentas pelos
camundongos C57BL/6. Entretanto, no decorrer dos experimentos, nos deparamos com
diversas diferenças apresentadas por camundongos BALB/c obtidos de biotérios diferentes.
Assim, enquanto os animais oriundos do Biotério Central da FMRP -USP, submetidos ao
método de ECI, apresentaram expressivas diferenças na maioria dos parâmetros avaliados, os
animais oriundos do Biotério da Genética da FMRP-USP, também submetidos ao ECI, não
mostraram diferenças significativas em relação aos grupos controles, em quase todos os
experimentos realizados.
Levando em consideração que o habitat ou o ambiente em que se vive e desenvolve tem
profundas implicações no meio ambiente interno de um organismo, como em relação ao perfil
comportamental, a respostas psicológicas, endócrinas e imunes a determinados eventos e em
relação ao enfrentamento de traumas e desafios, podemos aceitar o fato de animais de uma
85
mesma linhagem, porém, oriundos de diferentes lugares, apresentarem perfis desiguais de
resposta frente a condições estressantes. Assim, os diferentes dados obtidos de animais
BALB/c oriundos do Biotério Central em relação aos animais oriundos do Biotério da
Genética, nos levaram a concluir que o meio ambiente (como temperatura ambiental,
iluminação, ruídos, presença ou não de parasitas oportunistas e da utilização ou não de
técnicas assépticas no manuseio dos animais) poderia estar atuando como uma variável
adicional nos resultados adquiridos com animais dessa linhagem.
A respeito do efeito do ECI nas lesões de animais BALB/c, adquiridos do Biotério
Central, infectados com L. major, foi observado que nos machos houve um aumento do
tamanho das lesões em todos os grupos submetidos ao ECI e infectados em relação ao grupo
apenas infectado. Surpreendentemente, o contrário foi observado entre os grupos das fêmeas,
em que os animais submetidos ao ECI antes da infecção e submetidos ao ECI antes e depois
da infecção apresentaram menores lesões que o grupo apenas infectado (figura 4.7). São
praticamente inexistentes estudos que relacionam o estresse com a infecção por Leishmania
em camundongos. Em um único estudo encontrado na literatura científica, foram utilizados
camundongos BALB/c fêmeas, submetidos a um estresse agudo de contenção por 2 ou 8
horas antes da infecção com a espécie Leishmania mexicana (Ruiz et al, 2003). Nesse estudo,
o tipo de estresse selecionado foi indutor de um aumento no tamanho das lesões causadas pela
L. mexicana, nos dois grupos submetidos ao estresse em diferentes períodos. Isso contrasta
com o resultado apresentado pelas fêmeas em nosso trabalho, indicando que a mudança de
protocolo no modelo de estresse e a utilização de uma espécie diferente de Leishmania em
nosso caso (L. major), induz respostas diferentes nos camundongos dessa mesma linhagem e
sexo. A comparação entre os sexos mostrou que entre o grupo de animais apenas infectados,
as fêmeas apresentaram lesões muito superiores às lesões dos machos, não sendo observada
diferenças entre os sexos nos demais grupos experimentais (figura 4.8).
86
Pela análise dos níveis de corticosterona produzidos por BALB/c, machos e fêmeas, do
Biotério Central, verificamos uma diferença significativa na concentração hormonal apenas
no grupo dos machos que não foi infectado, mas submetido ao ECI (St), em relação a não só
todos os outros grupos experimentais do mesmo gênero, como também em relação a todos os
grupos experimentais das fêmeas (figura 4.11). Esse resultado sugere que o hormônio
corticosterona não tem influência importante nas alterações observadas nas lesões de
camundongos dessa linhagem, infectados e submetidos ao ECI, tanto nos machos, quanto nas
fêmeas. Essa alteração morfológica nas patas dos animais estressados poderia estar sendo
induzida pela atuação de outros hormônios, tais como os hormônios sexuais testosterona nos
machos, e estrógeno e progesterona nas fêmeas, além de uma produção diferenciada de
catecolaminas (noradrenalina e adrenalina) entre os sexos, durante o evento estressante. Essa
idéia surge do fato de alguns estudos terem mostrado que a resistência das fêmeas, está
relacionada à produção de altos níveis de estrógeno e uma conseqüente modulação da resposta
imune para um padrão Th1, produtor de IFN-γ, e um efeito oposto do hormônio testosterona
nesse padrão de resposta imune (Araneo et al, 1991; Satoskar et al, 1998).
Nos camundongos BALB/c, machos e fêmeas, oriundos do Biotério da Genética, no
entanto, não foram observadas diferenças significativas entre os animais estressados e não-
estressados, tanto no tamanho das lesões pela infecção com L. major, quanto na produção de
corticosterona após o período de estresse crônico (figuras 4.9 e 4.12). Quando fomos avaliar a
contribuição de cada condição estressante na produção de corticosterona nos camundongos
BALB/c machos e fêmeas, observamos que assim como nos camundongos C57BL/6, esses
animais produziram maiores concentrações hormonais frente aos estresse de nado forçado e
contenção em relação aos demais tipos de estresse e ao grupo controle. Além disso, decidimos
avaliar o papel de mais dois tipos de estresse na indução de corticosterona: o estresse pelo frio
e o estresse de infecção por L. major. O estresse pelo frio induziu uma produção de
87
corticosterona semelhante aos níveis do estresse de nado forçado e contenção nos machos e,
nas fêmeas, apresentou concentrações significativamente maiores que os demais tipos de
estresse e o grupo controle. Já a simples infecção por L. major não induziu alterações na
produção hormonal em relação ao grupo controle nos dois sexos (figura 4.13).
O tamanho das lesões formadas pela infecção por L. major é o resultado de uma
combinação entre a replicação do parasita e a conseqüente resposta inflamatória do
hospedeiro. Assim, o tamanho das lesões cutâneas não reflete necessariamente a intensidade
da infecção, já que as lesões podem estar presentes mesmo na ausência de parasitas no tecido,
assim como parasitas podem estar presentes em um tecido que já não apresenta mais lesões
(Titus et al, 1985). Essas observações demonstram que a interpretação de experimentos com
Leishmania, baseados somente no tamanho das lesões, pode ser um tanto quanto enganosa
(Lima et al, 1997). Em vista disso, resolvemos avaliar a carga parasitária de camundongos
BALB/c de ambos os sexos, ao final do experimento de infecção por L. major e indução de
ECI (12 semanas de infecção). Os resultados apresentados na figura 4.14 mostram que, entre
os camundongos do Biotério Central, houve um aumento do número de parasitas no local da
infecção (pata) quando os machos foram submetidos ao protocolo de ECI, indicando que o
aumento no tamanho das lesões apresentadas por esses animais possa estar relacionado à
quantidade superior de parasitas nessas lesões. Já entre as fêmeas desse mesmo biotério,
observamos um aumento significativo do número de parasitas nos animais submetidos ao ECI
pré e pós-infecção em relação ao grupo controle, contrastando com a redução no tamanho das
lesões desse grupo de animais quando comparado ao grupo controle da infecção. Nos
camundongos do Biotério da Genética, verificamos que os machos submetidos ao ECI não
apresentaram aumentos expressivos na quantidade de parasitas nas lesões em relação ao grupo
apenas infectado, coincidindo com a ausência de diferenças no tamanho das lesões
apresentadas pelos grupos experimentais desses animais.
88
A resolução da doença causada pela infecção por L. major, requer um padrão de
resposta imune do tipo Th1 com produção das citocinas IL-12 e IFN-γ e da atividade da
enzima óxido nítrico sintase tipo 2 (iNOS ou NOS2). O iNOS, que gera óxido nítrico (NO) e
outros intermediários reativos de nitrogênio (RNI) do aminoácido arginina e oxigênio
molecular, exerce diretos efeitos leishmanicidas, assim como, efeitos imunorreguladores no
modelo de infecção por L. major (Bogdan et al, 2000). Com base nisso, decidimos analisar
indiretamente a produção de NO em culturas de macrófagos de camundongos BALB/c de
ambos os sexos e biotérios, submetidos ao ECI, avaliando os níveis de nitrito produzidos. Os
resultados indicam que o ECI interfere com a produção de nitrito em macrófagos de
camundongos do Biotério Central, o mesmo não acontecendo com os macrófagos de animais
do Biotério da Genética (figura 4.15). Entre os animais do Biotério Central, observamos que
apenas os machos apresentaram redução na síntese de nitrito por macrófagos, quando estes
eram de animais infectados in vivo e submetidos ao ECI, além de serem estimulados in vitro
com L. major. A redução nos níveis de nitrito foi observada em relação aos macrófagos de
animais apenas infectados in vivo e também estimulados com L. major in vitro. Entretanto, a
produção de nitrito pelas fêmeas não foi alterada entre os diferentes grupos. Com isso, parece
que apenas macrófagos dos machos são afetados pelo ECI durante a infecção por L. major,
sendo que as fêmeas não sofrem modificações nesse tipo de resposta imune inata frente ao
mesmo protocolo de estresse que os machos.
Visto que os macrófagos de camundongos BALB/c machos do Biotério Central foram
os únicos a apresentarem modificações na produção de NO, achamos interessante avaliar os
níveis de citocinas de padrão Th1 (IFN-γ) e Th2 (IL-4 e IL-5) nos animais dessa linhagem e
sexo. Como já comentado nessa dissertação, camundongos da linhagem BALB/c
desenvolvem uma típica resposta de padrão Th2, capaz de induzir a susceptibilidade desses
animais ao parasita L. major (Tripathi et al, 2007). Assim, o nosso interesse em avaliar os
89
níveis de citocinas produzidas por camundongos dessa linhagem era de investigar o papel do
estresse tanto na resposta direcionada para um padrão Th2, assim como observar uma possível
influência do estresse na resposta Th1. Nossos resultados indicam que o ECI foi capaz de
induzir pequenas alterações na produção de IFN-γ, IL-4 e IL-5 (figura 4.16), como observado
pela diminuição dos níveis de IFN-γ nos animais infectados e submetidos ao ECI pós-infecção
e pré e pós-infecção em relação aos animais apenas infectados; pelo discreto aumento dos
níveis de IL-4 em todos os grupos infectados e submetidos ao ECI em relação ao grupo
apenas infectado, e finalmente, pela produção de níveis superiores de IL-5 em animais
estressados pré-infecção e pré e pós-infecção em relação aos animais apenas infectados. Esses
dados apresentados podem ter relação com a maior susceptibilidade dos camundongos
BALB/c machos, quando submetidos ao ECI, à infecção por L. major, correlacionando com
dados obtidos anteriormente, como o aumento das lesões cutâneas e da quantidade de
parasitas no local da infecção e a redução nos níveis de NO.
Um resultado interessante obtido durante os experimentos desenvolvidos com os
camundongos BALB/c foi a notável alteração no peso corporal desses animais (figura 4.17).
Tanto os machos do Biotério Central (A), quanto os do Biotério da Genética (C), que foram
apenas infectados ou infectados e submetidos ao ECI, apresentaram um ganho de peso
corporal significativamente inferior ao ganho de peso do grupo saudável (sem infecção e
estresse), ao final do curso da infecção por L. major (12ª semana). Contudo, nas fêmeas dos
dois biotérios, não foram observadas diferenças expressivas entre os grupos experimentais (B
e D). Diversos estudos relacionam os efeitos de um estresse crônico na homeostase energética
de humanos e roedores (Moles et al, 2006). Em modelos animais, foi reportado o papel do
estresse repetitivo de contenção na diminuição do peso corporal de ratos e camundongos
(Harris et al, 1998; Ricart-Jane et al, 2002). Bartolommucci e cols (2004) também relatam o
efeito de um estresse psicossocial crônico na alteração metabólica de camundongos,
90
observando uma redução no ganho de peso corporal a despeito de um consumo alimentício
normal. Um estudo realizado por Santos et al (2005) avaliando o efeito de um estresse
repetitivo de exposição ao vapor de éter, em ratos Wistar infectados ou não com o parasita
Trypanosoma cruzi, mostrou que tais animais apresentaram diminuição do peso corporal
quando infectados e submetidos ao estresse, e até mesmo o grupo apenas submetido ao
estresse (sem infecção) apresentou alteração no peso corporal em relação ao grupo sem
infecção e estresse. Os nossos dados obtidos em relação ao ganho de peso corporal no modelo
de estresse crônico imprevisível e infecção com L. major, corroboram com os dados
apresentados na infecção por T. cruzi, já que em nosso trabalho, o ganho de peso corporal
reduzido em camundongos BALB/c apenas infectados ou infectados e submetidos ao ECI,
indica que não só esse modelo de estresse pode estar interferindo nas funções metabólicas,
mas também a própria infecção com L. major esteja contribuindo para o desajuste energético
nesses animais.
As diferenças clínicas, endocrinológicas e imunológicas observadas nesse estudo, entre
camundongos estressados e não-estressados na infecção pelo parasita L. major, demonstra
uma clara intervenção do estresse crônico na reatividade dos animais a esse modelo de
infecção. Entretanto, se faz necessária a realização de novos estudos que abordem o papel das
emoções e condições estressantes nas respostas hormonais e imunes à infecção parasitária por
Leishmania.
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Nossos resultados com o parasita L. major indicam que o estresse crônico imprevisível
afeta de forma marcante a gravidade dessa doença e possivelmente tenha uma influência
prejudicial no desenvolvimento de uma variedade de outras doenças parasitárias. Pela
comparação entre os resultados apresentados por ambos os sexos e linhagens de
camundongos, concluímos que:
9 As fêmeas da linhagem C57BL/6 parecem ser mais susceptíveis à infecção por
L. major que os machos, além de apresentarem maior sensibilidade a eventos
estressantes crônicos;
9 Nos camundongos da linhagem BALB/c, apesar das fêmeas apresentarem lesões
de patas mais evidentes que os machos, essa diferença entre os sexos torna-se
praticamente inexistente quando os animais são submetidos ao estresse crônico
imprevisível, possivelmente pela maior sensibilidade dos machos a esse estresse.
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