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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
AVALIAÇÃO DA TRANSDUÇÃO DE SINAL NO RECEPTOR AT
1
DE
ANGIOTENSINA II ATRAVÉS DE MUTAÇÕES SÍTIO-DIRIGIDAS
Rosana Inácio dos Reis
Ribeirão Preto
2007
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Rosana Inácio dos Reis
AVALIAÇÃO DA TRANSDUÇÃO DE SINAL NO RECEPTOR
AT
1
DE ANGIOTENSINA II ATRAVÉS DE MUTAÇÕES SÍTIO-
DIRIGIDAS
Orientador: Claudio Miguel da Costa Neto
Tese apresentada ao programa de Pós
Graduação da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do Título de
Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Bioquímica.
Ribeirão Preto
2007
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Reis, Rosana Inácio
Avaliação da transdução de sinal no receptor AT
1
de Angiotensina II através de mutações sito-dirigidas
Ribeirão Preto, 2007. 126p.;
Tese apresentada ao programa de Pós Graduação
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP-
USP, Departamento de Bioquímica e Imunologia
Orientador: Prof. Dr. Claudio Miguel da Costa Neto
1-receptor AT
1
; 2-Sistema Renina-Angiotensina;
3-GPCR; 4-Via clássica de ativação; 5-MAPK
Para sempre
Por que Deus permite
que as mães vão-se embora?
Mãe não tem limite,
é tempo sem hora,
luz que não apaga
quando sopra o vento
e chuva desaba,
veludo escondido
na pele enrugada,
água pura, ar puro,
puro pensamento.
Morrer acontece
com o que é breve e passa
sem deixar vestígio.
Mãe, na sua graça,
é eternidade.
Por que Deus se lembra
- mistério profundo -
de tirá-la um dia?
Fosse eu Rei do Mundo,
baixava uma lei:
Mãe não morre nunca,
mãe ficará sempre
junto de seu filho
e ele, velho embora,
será pequenino
feito grão de milho.
Carlos Drummond de Andrade
Dedico este trabalho
Aos meus pais, Antero Inácio dos Reis e
Eunice Cruz dos Reis (em memória), pelo
eterno amor, carinho, dedicação e confiança
infindáveis... Amo vocês!
Aos meus irmãos pela confiança, carinho,
companheirismo e total incentivo aos meus
sonhos... Amo vocês!
Agradecimentos
- Ao meu orientador Prof. Dr. Cláudio Miguel da Costa Neto pela confiança em mim
depositada, pelas oportunidades a mim concedidas e pela confiança transmitida
desde o início. Agradeço pela minha orientação e pelas demonstrações do quão
criterioso um profissional de Ciência deve ser. Sua preocupação em formar bons
pesquisadores e pensadores é um exemplo a ser seguido.
- Ao Dr. Jean-Loup Bascands e ao Dr. Joost P. Schanstra, pesquisadores do “Institut
National de la Santé et de la Recherche Médicale – INSERM“ pela grande
oportunidade que me proporcionaram com o estágio em seu laboratório, pelas
excelentes discussões, pela acolhida extremamente amigável em Toulouse e
principalmente pelo apoio em todos os momentos, fáceis e difíceis, durante o tempo
em que lá estive.
- À Christiane Pecher, por todos os ensinamentos, pelo exemplo de profissional de
excelência e pela sincera amizade, que tão importante foi na minha vida em
Toulouse.
-Ao Prof. Dr. João Bosco Pesquero pela disponibilização de seu laboratório e
parceria durante a realização deste trabalho.
- Ao Dr. Edson Lucas dos Santos pela ajuda nos experimentos de acidificação
extracelular e pelas sugestões e discussões sempre tão proveitosas.
- Ao Prof. Dr. Eduardo Brandt de Oliveira pelas discussões sempre estimulantes, por
disponibilizar seu espaço sempre que necessário e pela preocupação em formar
profissionais de excelência.
- Ao Prof. Dr. Marcelo Damario Gomes pelas discussões científicas e por
disponibilizar seu laboratório.
-À Dra. Carolina Baraldi pela ajuda nos experimentos de mobilização de cálcio
intracelular, pela disposição sempre em ajudar, pelas discussões sempre produtivas
e pela amizade.
- Às amigas Sami Yokoo e Maria Letícia pela sincera amizade, por todo o carinho e
pela presença constante (mesmo estando do outro lado do mundo) em minha vida.
Vocês são minha família aqui.
- Aos amigos do laboratório, Lucas e Pedro pela ajuda constante, pelas risadas
infindáveis e momentos de excelentes discussões. Marília, amiga querida, sempre
de alto astral e sempre disposta a ajudar. Patrícia, colega de laboratório sempre
disposta a ajudar, amiga de bons conselhos e risadas. Tassiele, pela agradável
convivência e bons conselhos quando necessário. Amo vocês.
- Aos amigos Felipe, Adriana, Hugo e Lara pela disposição em sempre ajudar e
pelos momentos de descontração.
- À Lúcia e Odete pela organização e administração técnica do laboratório, pela
amizade e pelos mimos que tornam o ambiente do laboratório muito mais agradável.
- A todos os funcionários e técnicos do departamento de Bioquímica. Em especial
gostaria de agradecer à Ivone, Lúcia, Téia, Ronaldo e Victor, pela assistência e
competência em tornar nossa vida de pós-graduando menos burocrática e é claro,
obrigada pela amizade.
- Aos outros amigos de pós-graduação pela convivência agradável e por tornar essa
fase da vida mais leve e descontraída: Ricardo (Pancinha), Ruither, Ana Letícia,
Laura Letícia, Chris Becari, Amanda, Danúbia, Luciana, Silvia, Vivi, Amandinha,
Stêfani, Marcelão, Jony, Eulália, Fabrício, Érica, Carlinha, Lisandra e Claudinha.
- Aos amigos de sempre: Lisandrinha, Lisandra, Luciano, Aline, Nátali, Iran,
Emiliana, Helen e aos mais recentes amigos, Hugo (UNIFESP), Juliana, Pierre
Antoine, Julie e Jean Philipe.
- A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
- À FAPESP, CAPES, CNPq e FAEPA por apoiar financeiramente a realização
deste trabalho.
- À FAPESP pela concessão de minha bolsa de Doutorado.
1
ÍNDICE
RESUMO..................................................................................................................... 3
ABSTRACT ................................................................................................................. 5
Lista de Abreviaturas ................................................................................................ 7
INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 9
A Angiotensina II .................................................................................................................. 9
O Receptor AT
1
: uma visão geral ...................................................................................... 14
O Receptor AT
1
: uma visão molecular ............................................................................... 19
OBJETIVO E JUSTIFICATIVA ................................................................................. 35
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 36
1. Escolha de resíduos de aminoácidos candidatos a serem mutados ............................. 36
2. Mutações sítio-dirigidas ................................................................................................. 37
3. Transformação bacteriana ............................................................................................. 40
4. Mini preparação plasmidial ............................................................................................ 40
5. Sequenciamento ............................................................................................................ 42
6. Transfecção transiente em células COS-7 ou HEK 293T ............................................. 42
7. Localização celular dos receptores por fluorescência ................................................... 43
8. Ensaio de “binding” com células inteiras ....................................................................... 44
9. Medida da taxa de acidificação extracelular .................................................................. 45
10. Mobilização de cálcio intrancelular .............................................................................. 45
10.1. FURA-2/AM .......................................................................................................... 46
10.2. Fluo 3 .................................................................................................................... 47
11. Ensaio de fosforilação de ERK1/2 ............................................................................... 48
RESULTADOS .......................................................................................................... 51
1. Mutações sítio-dirigidas ................................................................................................. 51
2. Localização celular dos receptores por fluorescência ................................................... 57
3. Ensaio de “binding” com células inteiras ....................................................................... 59
4. Medida da taxa de acidificação extracelular .................................................................. 68
2
5. Mobilização de cálcio intracelular .................................................................................. 76
6. Ensaio de fosforilação de ERK1/2 ................................................................................. 84
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 107
_________________________________________________________________________________Resumo
3
RESUMO
A maioria dos efeitos fisiológicos desencadeados pela Angiotensina II,
principal molécula efetora do Sistema Renina-Angiotensina, ocorre através da
ativação do receptor AT
1
. O receptor AT
1
pertence à família dos receptores
acoplados à proteína-G e como tal, os resíduos de aminoácidos envolvidos com a
transdução do sinal extracelular para o meio intracelular são aqueles localizados nas
regiões transmembranares do receptor.
O objetivo deste trabalho foi analisar o papel de resíduos de prolina
localizados nas α-hélices transmembranas do receptor AT
1
na transdução de sinal
desencadeada mediante a ligação da Angiotensina II ao receptor. Os resíduos de
prolina analisados neste projeto de tese foram: Pro
82
, Pro
162
, Pro
207
e Pro
285
, os quais
foram alterados através de mutação sítio-dirigida para Ala, gerando os receptores
mutantes P82A, P162A, P207A e P285A. Os receptores mutantes foram analisados
quanto à capacidade de ligação à Angiotensina II, através de ensaios de “binding” e
funcionalmente através dos ensaios de acidificação extracelular, mobilização de
cálcio intracelular e ativação da via de MAP quinases (ERK1/2).
Os ensaios de “binding” mostraram que os receptores mutantes não
apresentaram alteração significativa quanto à afinidade de ligação à Angiotensina II.
Quanto aos ensaios funcionais, os mutantes P162A e P285A apresentaram um perfil
de ativação similar ao receptor selvagem. Por outro lado, nossos resultados
mostraram que a transdução de sinal da via clássica, extrapolada aqui para os
ensaios de acidificação extracelular e mobilização de cálcio intracelular, foi
drasticamente reduzida para o mutante P82A e praticamente nula para o mutante
P207A, quando estimulados com a Angiotensina II. Apesar da ausência de resposta
_________________________________________________________________________________Resumo
4
do mutante P207A ao estímulo da Angiotensina II nos ensaios de acidificação
extracelular e mobilização de cálcio intracelular, constatamos que este receptor
mutante poderia apresentar uma possível ativação espontânea, ou seja,
independente do estímulo do agonista. Em relação ao ensaio de ativação de ERK,
verificamos que ambos mutantes foram capazes de ativar esta proteína em nível
semelhante ao do receptor selvagem.
Com base nesses resultados, acreditamos que os resíduos de Pro
82
e Pro
207
estejam diretamente envolvidos no processo de ativação da via clássica
desencadeada mediante a ativação do receptor AT
1
. Além disso, nossos resultados
forneceram mais evidências de que os requerimentos estruturais do receptor AT
1
não
são os mesmos quanto às diferentes vias de sinalização desencadeadas por este
receptor quando estimulado com a Angiotensina II, evidenciados aqui através da
comparação de resultados obtidos nos ensaios funcionais de acidificação extracelular
e mobilização de cálcio intracelular com aqueles obtidos na ativação de ERK.
________________________________________________________________________________Abstract
5
ABSTRACT
The octapeptide hormone Angiotensin II is the main effector of the Renin-
Angiotensin System. Most of the physiological effects of Angiotensin II occur by
activating the AT
1
receptor, which belongs to the G-protein coupled receptor family;
and therefore residues involved in signal transduction are those located in
transmembrane regions.
The aim of this project was to analyze the role of proline residues located in
transmembrane α-helix domains in the signal transduction process of the AT
1
receptor. The following residues were analyzed: Pro
82
, Pro
162
, Pro
207
and Pro
285
,
which were mutated to Ala by site-directed mutagenesis, generating P82A, P162A,
P207A and P285A mutants. Concerning the affinity to Angiotensin II, mutant
receptors were analyzed by binding assays, and also functionally by extracelular
acidification, intracellular calcium mobilization and by activation of MAP kinases
(ERK) assays.
Binding assays showed that mutant receptors were not significantly altered
concerning to Angiotensin II affinity. Concerning to functional assays, P162A and
P285A showed an activation profile similar to that obtained for wild type receptor. On
the other hand, our results showed that classical signal transduction, extrapolated
here to extracellular acidification and calcium mobilization assays, was drastically
reduced for P82A mutant and almost null for the P207A mutant. Despite that in the
presence of Angiotensin II we obtained no response for the P207A mutant in the
extrecellular acidification and calcium mobilization assays, we found that this mutant
might present a spontaneous activation, i.e. independent of agonist. Moreover, in
________________________________________________________________________________Abstract
6
ERK activation assays we verified that both mutants were able to activate this protein
to a similar extent as that of the wild type receptor.
Based in those results, we believe that Pro
82
e Pro
207
residues are directly
involved in activation of classical signal transduction pathway triggered by the AT
1
receptor activation. In addition, we showed that different structural requirements of
the AT
1
receptor lead to activation of different signaling pathways, as concluded by
comparing the results of extracellular acidification and calcium mobilization with those
of ERK activation assays.
_______________________________________________________________________Lista de Abreviaturas
7
Lista de Abreviaturas
7TM Sete hélices transmembranares
AngII Angiotensina II
AT
1
Receptor de angiotensina tipo 1
AT
2
Receptor de angiotensina tipo 2
B
max
Cálculo do número de receptores expressos
BSA Albumina sérica bovina
DMEN Dubelcco’s modifeid Eagles’s medium
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Desoxinucleotídeos tri-fosfatos
ECA Enzima conversora de angiotensina
EC Extracelular
EC
50
Concentração de agonista na qual se obtém 50% da ativação
máxima
EDTA Ácido etileno diamino tetracético
F
mut
Fator de mutação
IC Intracelular
IC
50
Concentração de ligante na qual se obtém 50% de inibição da
resposta máxima inicial
GPCR Receptor acoplado à proteína G
MAPK Mitogen-activated protein kinase (proteína quinase ativada por
mitógeno)
PCR Polymerase chain reaction (Reação de Polimerase em cadeia)
PKC Proteína quinase C
_______________________________________________________________________Lista de Abreviaturas
8
PLC Fosfolipase C
Proteína G Proteínas que ligam GTP
SDS Sódio dodecil sulfato
SV40 Simian vírus 40
TAE Tris-Acetato-EDTA
TM Transmembrana
Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano
_______________________________________________________________________________Introdução
9
INTRODUÇÃO
A Angiotensina II
A descoberta do Sistema Renina-Angiotensina (SRA) foi reconhecida há mais
de cem anos, após a descoberta da enzima renina por Tigerstedt e Bergman
(Phillips e Schmidt-Ott, 1999). O SRA compreende um grande número de moléculas
efetoras e foi inicialmente tratado como um sistema endócrino, no qual uma dessas
moléculas efetoras, a Angiotensina II (AngII) circulante, era responsável por regular
a pressão cardíaca e o balanço hidroeletrolítico via sua ação no tônus vascular,
liberação de aldosterona, retenção de sódio, aumento da ingestão de água e
liberação de vasopressina. Alguns estudos confirmam o papel fisiológico do SRA e
apontam para os novos papéis desempenhados por este sistema não apenas em
nível sistêmico, mas também em nível local (Paul et al., 2006). O angiotensinogênio
é a única molécula precursora dos peptídeos de angiotensina. Diferentes enzimas
clivam esta glicoproteína para gerar a angiotensina I (AngI) ou a AngII diretamente.
Uma das enzimas responsáveis pela conversão de AngI a AngII é a enzima
conversora de angiotensina (ECA). Porém, outras enzimas além da ECA, podem
converter a AngI a AngII. Estudos com inibidores de renina indicam um maior
destaque para esta enzima na geração de peptídeos de angiotensina circulantes,
entretanto outras enzimas podem desempenhar algum papel nos tecidos,
particularmente nos sítios de inflamação (Campbell, 2003). Os peptídeos de
angiotensina bioativos incluem a angiotensina-(1-8) (AngII), a angiotensina-(2-8)
(AngIII), a angiotensina-(3-8) (AngIV) e a angiotensina-(1-7) Ang-(1-7) (Hunyady e
_______________________________________________________________________________Introdução
10
Catt, 2006). Um esquema resumido do SRA e de seus peptídeos pode ser
visualizado na Figura 1.
Figura 1. Os principais componentes do SRA. A cascata clássica e as vias
alternativas para geração de AngII recentemente descobertas são mostradas.
CAGE, enzimas geradoras de AngII sensíveis a quimostatina; NEP, endopeptidase
neutra; PEP, prolil endopeptidase; t-pA, ativador de plasminogênio tecidual.
(Baseado em Hunyady e Catt, 2006).
Ang (1-7)
Angiotensinogênio
AngI
AngII
AngIII
AngIV
Renina
Receptor
Renina
Receptor
AT
2
Receptor
AT
1
Receptor
AT
4
Catepsina D
Toponina
t-pA
Aminopeptidase A
Aminopeptidase N
ECA-2
Endopeptidases
(NEP, PEP)
Fragmentos
inativos
Receptor
Mas
ECA
CAGE
Catepsina G
Quimase
_______________________________________________________________________________Introdução
11
A AngII, um octapeptídio (Figura 2) é a principal molécula efetora do SRA.
Figura 2. Estrutura química da AngII. Sequência de resíduos: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-
His-Pro-Phe.
Este hormônio, como comentado anteriormente, está implicado na regulação
de múltiplas funções cardiovasculares, tais como pressão sanguínea e homeostase
hidroeletrolítica. Até pouco tempo, a AngII era vista apenas como um hormônio
regulatório responsável pela regulação da pressão sanguínea, liberação de
aldosterona e reabsorção de sódio. Entretanto, numerosos dados clínicos e
laboratoriais disponíveis no momento suportam a hipótese que o SRA é relevante na
patogênese de doenças cardiovasculares (Schiffrin e Touys, 2004) e renais (Perez et
al., 2003) e também evidenciam sua participação na progressão de cânceres de
próstata, de mama e outros (Marsigliante et al., 1996, Inwang et al., 1997, Chen et
al., 1991). Tem sido postulado que o Losartan e outros bloqueadores do receptor
para a AngII do tipo 1 (AT
1
) podem atuar como novos agentes anti-angiogênicos e
anti-metastáticos em tecidos neoplásicos (Abali et al., 2002). Além disso, Smith e
Missailidis (2004) afirmam que na maioria dos tumores sólidos há um aumento da
_______________________________________________________________________________Introdução
12
expressão e ativação do receptor AT
1
com subseqüente expressão de citocinas e
quimiocinas inflamatórias o que auxilia na instalação de um processo inflamatório.
Este processo inflamatório permite ao tumor escapar do sistema imune e favorece
também o seu crescimento e metástase. A AngII também induz a expressão do fator
de crescimento endotelial vascular (VEGF) que tem um papel central na
angiogênese do turmor e tem sido alvo de várias terapêuticas (Tucker et al., 1999).
O peptídeo AngII também evoca uma resposta celular que regula a expressão
de muitas outras moléculas, incluindo fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas
e moléculas de adesão, substâncias estas envolvidas no crescimento celular,
apoptose, fibrose e inflamação (Egido, 1996, Matsubara, 1998, Mezzano et al., 2001,
Sadoshima, 2000, Ruiz-Ortega et al., 2001a). Recentemente, nosso laboratório
descreveu o aumento do nível de expressão dos receptores AT
2
na inflamação
dentino-pulpar, que foi acompanhado de vasodilatação, recrutamento de células
inflamatórias e aumento da expressão de citocinas (Souza et al., 2007). Em modelos
experimentais de aterosclerose e hipertensão, inibidores da ECA e antagonistas do
receptor AT
1
levaram à diminuição de células inflamatórias, moléculas de adesão,
bem como a expressão de algumas citocinas e quimiocinas envolvidas em
inflamação (Ruiz-Ortega et al., 2001b). Em experimentos in vivo, a infusão de AngII
em ratos causou além de hipertensão, infiltração de monócitos e também expressão
de molécula de adesão de célula vascular tipo 1 (VCAM-1) e proteína quimioatraente
de monócito tipo 1 (MCP-1) na aorta (Tummala et al., 1999, Carpes et al., 1997).
Também foi mostrado que monócitos de pacientes hipertensos são pré-ativados e
produzem mais citocinas e moléculas de adesão a células endotelias que pacientes
normotensos (Dorffel et al., 2001). Em células endoteliais e mononucleares
vasculares, a AngII além de aumentar a expressão de MCP-1 também leva ao
_______________________________________________________________________________Introdução
13
aumento de interleucina-8 (IL-8) e interleucina-10 (IL-10), potentes ativadores de
neutrófilos (Hernandez-Presa et al., 1998, Ortego et al., 1999). Em células
vasculares, a AngII aumenta a produção de interleucina-6 (IL-6) e em macrófagos
também aumenta a produção do fator de necrose tumoral α (TNF α) (Han et al.,
1999, Nakamura et al., 1999).
Com esses dados, a participação da AngII no recrutamento de células e
substâncias pró-inflamatorias é evidente. Além disso, dados emergentes sugerem
um potencial papel para o fator de transcrição nuclear–κB (NF-κB) como mediador
do processo inflamatório induzido por AngII. A infusão da AngII em ratos provocou o
aumento da atividade de NF-κB nos vasos e rins, tanto em células residentes quanto
em células infiltrantes (Ruiz-Ortega et al., 2001a, Ruiz-Ortega et al., 2001b). Os dois
tipos de receptores para a AngII (AT
1
e AT
2
), embora apresentem vias intracelulares
diferentes, participam na ativação de NF-κB (Ruiz-Ortega et al., 2001a). Em
experimentos in vivo, a atividade renal de NF-κB, provocada pela infusão de AngII foi
parcialmente diminuída por tratamento com antagonistas de AT
1
e AT
2
(Ruiz-Ortega
et al., 2001b). Em ratos com obstrução unilateral, antagonistas de AT
1
e AT
2
também
diminuíram a atividade de NF-κB no rim obstruído (Klahr e Morrissey, 2000). Além
disso, camundongos “knockout” para o receptor AT
1
apresentaram menos atividade
de NF-κB no rim obstruído comparado ao camundongo selvagem (Lorenzo et al.,
2001). Dessa forma, a AngII participa na resposta inflamatória por uma ativação
direta de células inflamatórias ou pela regulação de moléculas de adesão e
expressão de quimiocinas, via mecanismos de óxido-redução e via NF-κB,
contribuindo para o recrutamento de células inflamatórias na lesão (Ruiz-Ortega et
al., 2001b).
_______________________________________________________________________________Introdução
14
Além de ser pró-inflamatória, a AngII também tem ações fibrogênicas. Uma
das principais causas de fibrose é o desequilíbrio entre síntese e degradação de
componentes de matriz extracelular (ECM). Referente a isso, a AngII ativa o fator de
necrose tumoral β (TNFβ) e este é um dos responsáveis por indução de síntese de
ECM (Mezzano et al., 2001). O fator de crescimento do tecido conectivo, uma
citocina fibrogênica, é um outro mediador de fibrose induzido por AngII (Gupta et al.,
2000). O aumento da produção de ECM devido ao aumento de sua síntese e
diminuição de sua degradação é principalmente causado por inibidores de
proteases. Metaloproteases são capazes de degradar uma variedade de proteínas
ECM e a AngII leva ao aumento de ambas, síntese de ECM e produção de
metaloproteases (Matsubara et al., 1998, Kim e Iwao, 2000). Além disso, o SRA
também está ligado à indução do inibidor de plasminogenio tipo 1 facilitando tanto
trombose quanto fibrose (Nakamura et al., 2000).
O Receptor AT
1
: uma visão geral
Mediante o papel central da AngII na regulação fisiopatológica fica evidente a
necessidade de entender e elucidar cada vez mais as vias de sinalização
desencadeadas por este peptídeo. Os dois principais tipos de receptores para a
AngII expressos em células de mamíferos são os receptores AT
1
e AT
2
, com cerca
de 30% de identidade entre si na seqüência de aminoácidos (Griendling et al., 1996,
Hunyady et al., 1996). Embora a estrutura básica destes receptores seja similar (isto
é, três alças extracelulares, sete hélices transmembranares e três alças
intracelulares) e o agonista o mesmo, suas funções são muito diferentes.
_______________________________________________________________________________Introdução
15
O receptor AT
1
(Figura 3) parece mediar a maioria dos efeitos fisiológicos
clássicos da AngII, incluindo vasoconstrição e liberação de aldosterona. Este receptor
pertence à família dos receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e a cadeia de
eventos melhor caracterizada, quando a AngII se liga ao receptor AT
1
, é a ativação da
proteína G
q
com subseqüente ativação da fosfolipase C, induzindo a produção de
diacilglicerol e inositol trisfosfato (IP
3
), que por sua vez leva a um aumento de cálcio
citosólico, com subseqüente ativação de quinases citosólicas e ativação transcricional
(Blume et al., 1999, Inagami, 1999). Mediadores adicionais, incluindo tirosina quinases
transmembranares, fosfatases e serina-treonina quinases (Hall et al., 1999, Sayesky
et al., 199, Blume et al., 1999) também têm sido identificados. As tirosinas quinases
ativadas por AngII, via o receptor AT
1
, incluem c-Src, quinase de adesão focal,
tirosinas quinases dependentes de Ca
2+
(por exemplo, tirosinas quinases ricas em
prolina), quinases Janus e receptores tirosina quinases incluindo o receptor do fator de
crescimento epidermal (EGFR), o receptor do fator de crescimento derivado de
plaqueta (PDGFR) e o receptor do fator-I de crescimento insulina-símile (IGF-I) (Berk
e Corson, 1997, De Gasparo et al., 2000, Saito e Berk, 2002). Em paralelo a estes
eventos de sinalização, o receptor AT
1
é rapidamente internalizado após a ativação
com a AngII. A internalização do receptor AT
1
ocorre predominantemente por
vesículas revestidas por clatrina (Thomas, 1999, Hunyady et al., 2000). Em
concentrações fisiológicas, este processo é dependente de dinamina e β-arrestinas
servem como proteínas adaptadoras (Werbonat et al., 2000, Gáborik et al. 2001). A
internalização de um GPCR induzida pelo agonista é importante para o controle da
função do receptor pelo menos por dois motivos: (i) regula o número de receptores
disponíveis na superfície celular e (ii) facilita a ressensibilização dos receptores
_______________________________________________________________________________Introdução
16
Figura 3: Esquema em serpentina do receptor AT
1
. São mostradas a região N-
terminal, as sete hélices transmembranares (TM), as três alças extracelulares (EC),
as três alças intracelulares (IC) e a cauda C-terminal. Os resíduos em destaque
correspondem aos resíduos de prolina 82, 162, 207 e 285, respectivamente
(Baseado em Costa-Neto et al., 2002).
EC
IC
TM
_______________________________________________________________________________Introdução
17
de membrana que foram dessensibilizados pela fosforilação mediada por quinase de
GPCR (Ferguson, 2001). Tem sido sugerido que a desfosforilação de GPCRs (por
exemplo, o receptor β
2
-adrenérgico) ocorra dentro dos endossomos após a
endocitose do receptor e que a subseqüente reciclagem do receptor ressensibilizado
para a superfície celular mantenha a geração do sinal (Lefkowitz, 1998). A
reciclagem de receptores AT
1
internalizados para a superfície celular ocorre através
de vias dependentes e independentes da enzima fosfoinositídeo 3-quinase (PI3-K)
(Hunyady et al., 2002).
Recentemente, outro mecanismo de interação receptor-receptor tem se
tornado cada vez mais evidente: a formação de dímeros/oligômeros. Em alguns
casos, a oligomerização parece ser um pré-requisito para a ligação e sinalização
eficiente do agonista; em outros, parece simplesmente ocorrer constitutivamente,
ainda sem conseqüências biológicas totalmente claras (Rocheville et al., 2000,
Galvez et al., 2001, Milligan, 2001). Foi demonstrado que o receptor AT
1
pode formar
heterodímeros estáveis com o receptor AT
2
, com o receptor B
2
da bradicinina
(Abdalla et al., 2001a, Abdalla et al., 2001b) e mais recentemente, com o receptor
Mas (Kostenis et al., 2005, Santos et al., 2007). Muitas outras situações mostram
que a ativação do receptor AT
1
é modulada por outros GPCRs co-expressos. Neste
sentido, a dessensibilização e a dimerização têm sido mostradas estarem envolvidas
na regulação do receptor AT
1
(Abdalla et al., 2001a, Abdalla et al., 2001b).
Recentemente também relatamos a importância da formação de dímeros para o
resgate das funções estruturais e funcionais de um receptor mutante (Santos et al.,
2007). Neste trabalho, o mutante defectivo C18F-K20A recuperou plenamente tanto
suas propriedades de ligação à AngII quanto suas propriedades funcionais quando
co-expresso com o receptor Mas. Kostenis e colaboradores (2005) também
_______________________________________________________________________________Introdução
18
verificaram um aumento na capacidade de ligação de [H
3
]AngII ao receptor AT
1
quando este foi co-expresso com o receptor Mas. Assim, este mecanismo de
dimerização/oligomerização entre receptores, pode ser indicativo de uma nova
propriedade dos receptores, onde a transdução do sinal, desencadeada pelo ligante,
também poderia ser diretamente regulada pela presença física de um outro receptor.
Recentemente, Pignatari e colaboradores (2006) demonstraram que a
integridade da TM V é necessária para a organização adequada do sítio de ligação
do receptor, e a estrutura nativa da TM VI é necessária para o correto enovelamento,
maturação, dimerização e assim expressão na superfície celular do receptor AT
1
.
Daviet e colaboradores (1999), em análises in vitro e in vivo, demonstraram que o
receptor AT
1
também pode interagir com a proteína ATRAP (proteína associada ao
receptor AT
1
). A interação do receptor AT
1
com esta proteína leva a um decréscimo
na produção de IP
3
, de maneira dependente do agonista, e aumento da
internalização do receptor (Daviet et al., 1999, Cui et al., 2000, Wang et al., 2002),
sugerindo que esta proteína possa ser um regulador negativo para a sinalização
desencadeada pelo receptor AT
1
. Mais recentemente, Tsurumi e colaboradores
(2006) demonstraram que a proteína ATRAP colocaliza com o receptor AT
1
nos
túbulos renais de camundongo e sugerem que esta proteína possa desempenhar um
papel no funcionamento do SRA nos túbulos renais. Em relação ao receptor AT
2
, foi
demonstrado que este receptor também pode formar heterodímeros estáveis com o
receptor B
2
da bradicinina (Abdalla et al., 2000a).
Um outro traço encontrado em muitos GPCRs é a sequência consenso para
glicosilação (Asn-X-Ser/Thr, onde X não é Pro). Três destes motivos de glicosilação
são encontrados nas asparaginas que ocupam as posições 4, 176 e 188 da porção
N-terminal e segunda alça extracelular do receptor AT
1A
de rato. A glicosilação tem
_______________________________________________________________________________Introdução
19
um importante papel na maturação estrutural de muitas proteínas de membrana.
Alguns estudos têm sugerido sua implicação na estabilidade conformacional,
enovelamento, reconhecimento célula-célula e mais recentemente na dimerização
(Opdenakker et al., 1995) e associação com chaperonas moleculares (Hebert et al.,
1995).
O papel fisiológico do receptor AT
1
o torna um importante alvo terapêutico e
um grande número de agentes anti-hipertensivos e cardioprotetores tem sido
desenvolvidos (Verheijen et al., 2004). Para elucidar os mecanismos de ligação da
AngII a seu receptor e de ativação do receptor, o receptor AT
1
tem sido alvo de
extensos estudos de estrutura-função e modelagem molecular (Yamano et al., 1992,
Noda et al., 1995, Monnot et al., 1996, Groblewski et al., 1997, Feng et al, 1998,
Costa-Neto et al., 2000, Costa-Neto et al., 2002, Miura et al., 2003, Parnot et al.,
2000, Martin et al., 2004, Santos et al., 2004, Reis et al., 2007, para uma revisão
atual veja Oliveira et al., 2007). Estes estudos têm levado à identificação de resíduos
do receptor AT
1
envolvidos na ligação do ligante, ativação, transdução de sinal,
atividade constitutiva do receptor e internalização.
O Receptor AT
1
: uma visão molecular
Embora os GPCRs exibam um marcado grau de diversidade quanto à sua
estrutura primária e função, todos apresentam uma arquitetura comum: sete hélices
transmembranares (7TM) ligadas por 3 alças intra- (IC1, IC2 e IC3) e 3 alças
extracelulares (EC1, EC2 e EC3). Acredita-se que a ligação do agonista às regiões
extracelulares ou regiões próximas aos domínios transmembranares induza o
_______________________________________________________________________________Introdução
20
receptor a sofrer mudanças conformacionais nas hélices e nas regiões
intracelulares, promovendo a ligação do receptor ativado à proteína G. Os domínios
do receptor envolvidos na interação com a proteína G, bem como as regiões
envolvidas na ligação com agonistas e antagonistas, têm sido analisados em muitos
GPCRs.
O receptor AT
1
é um dos GPCRs melhor analisados e estudados e vários
resíduos importantes na interação com o ligante bem como outros importantes na
ligação à proteína G ou importantes para o desencadeamento de outras vias de
sinalização têm sido identificados. Receptores da AngII de diferentes espécies foram
clonados e seqüenciados, como por exemplo, o receptor para a AngII de rato
(Murphy et al., 1991, Mukoyama et al., 1993, Iwai e Inagami, 1992), de coelho (Burns
et al., 1993), de humano (Furuta et al., 1992), entre outros. Todas estas proteínas
foram mostradas pertencer à família de receptores acoplados à proteína G. Os
receptores AT
1
de mamíferos apresentam identidade na seqüência de aminoácidos
maior que 90% e afinidade similar para peptídeos ligantes como a AngII e análogos.
Análises por mutações sítio-dirigidas e análises por modelagem molecular,
muitas vezes de maneira combinada, têm fornecido informações a respeito de quais
domínios do receptor AT
1
possam ser essenciais para a interação com o agonista ou
para a sua ativação. Estudos de estrutura-função com receptores mutantes e
análogos de AngII têm mostrado que muitos destes eventos têm diferentes
requerimentos estruturais, indicando que o receptor ativado pode iniciar vias
intracelulares paralelas (Thomas, 1999, Hunyady et al., 2000, Oliveira et al., 2007).
A ligação da AngII ao receptor AT
1
é dependente de uma série de resíduos
localizados na parte externa do receptor. Hjorth e colaboradores (1994) realizando
trocas conservativas nos segmentos extracelulares do receptor AT
1
mostraram que
_______________________________________________________________________________Introdução
21
os epítopos importantes para a ligação da AngII estão localizados na extensão N-
terminal, na primeira e na terceira alça EC do receptor. A substituição de alguns
resíduos localizados nestas regiões por Ala mostrou que Tyr
92
e Asp
278
são os
resíduos mais importantes para a ligação da AngII com o receptor AT
1
. Ainda
mapeando regiões importantes para a interação do receptor AT
1
com a AngII,
mutações dos resíduos Thr
88
para His (T88H), Tyr
92
também para His (Y92H) e
Asp
278
para Glu (D278E), reduziram grandemente a afinidade da AngII para os
receptores mutantes, mas o mesmo não ocorreu para o análogo Sar
1
-Leu
8
-AngII
(Costa-Neto et al., 2000). Este achado sugere interações desfavoráveis entre estes
resíduos e a cadeia lateral de Asp
1
, ou com o amino grupo primário da AngII, os
quais estão ausentes em Sar
1
-Leu
8
-AngII. A participação da sarcosina (Sar) na
posição 1 da AngII foi investigada em maiores detalhes mais recentemente. Santos e
colaboradores (2004) sugerem uma possível interação da cadeia lateral de Arg
23
do
receptor AT
1
na interação com a AngII mas não com Sar
1
-AngII, mostrando
diferentes modos de ligação para a AngII e Sar
1
-AngII. No modelo proposto por
estes pesquisadores, a interação de Asp
1
da AngII com Arg
23
do receptor deixaria o
grupo guanidino de Arg
2
da AngII em contato com Asp
278
do receptor. No caso de
análogos com Sar na posição 1 (e.g. Sar
1
-AngII e Sar
1
-Leu
8
-AngII) a ausência do
grupo β-carboxílico permitiria uma interação do resíduo de Arg
2
com Asp
281
do
receptor, podendo assim, explicar os papéis contrastantes para os resíduos Asp
278
e
Asp
281
na interação do ligante com o receptor. Enquanto Hjorth e colaboradores
(1994), utilizando a AngII, mostraram que o resíduo Asp
278
era mais importante para
a interação do ligante com o receptor, Feng et al. (1995), utilizando Sar
1
-Leu
8
-AngII,
demonstraram o oposto, ou seja, para estes pesquisadores o resíduo Asp
281
seria o
mais importante para a interação do ligante com o receptor. Desta maneira, os
_______________________________________________________________________________Introdução
22
resultados obtidos por Santos et al. (2004) indicam haver uma regulação na
interação preferencial da AngII com o Asp
278
ou Asp
281
, dependendo da presença de
Asp ou Sar na posição 1 da AngII, respectivamente. Boucard e colaboradores (2003)
utilizando o método de acessibilidade de cisteína substituída, identificaram os
resíduos na TM VII do receptor AT
1
que contribuem na formação do sítio de ligação
da AngII. Neste método, assume-se que a estrutura do receptor mutante,
especialmente ao redor do sítio de ligação do ligante, é semelhante à do selvagem
se a ligação do ligante no mutante, apresentando o resíduo do aminoácido de
interesse mutado para cisteína, não sofrer alteração quando comparada ao
selvagem. Com isso, através deste método, o grupo sulfidrila de uma cisteína
orientada através do sítio de ligação deveria reagir mais rapidamente com um
reagente sulfidrila carregado positivamente, tal como metanotiossulfonato-etilamônio
(MTSEA), do que um outro grupo sulfidrila localizado mais internamente na proteína
ou na bicamada lipídica. Foram substituídos resíduos da TM VII, de Ile
276
a Tyr
302
,
para cisteína. Estes pesquisadores verificaram que tratamento dos receptores
mutantes A277C, V280C, T282C, A283C, I286C, A291C e F301C com MTSEA
reduzia significativamente a ligação do ligante, sugerindo que estes resíduos de
aminoácidos estariam orientados dentro do sítio de ligação da AngII no receptor AT
1
.
Utilizando este mesmo método, Martin et al. (2004) realizaram uma análise de
resíduos de aminoácidos localizados na TM III e verificaram que os receptores
mutantes A104C, N111C, e L112C após tratamento com MTSEA, apresentaram uma
forte inibição da ligação do ligante, e propuseram que nesta TM, estes seriam os
resíduos de aminoácidos que contribuiriam para a formação do sítio de ligação do
ligante no receptor. O envolvimento das TMs V e VI no processo de ligação da
_______________________________________________________________________________Introdução
23
porção C-terminal da AngII ao receptor AT
1
foi mostrado também por modelagem
molecular (Pignatari et al., 2006).
O estado basal do receptor, isto é, aquele em que o receptor não se encontra
na forma ativada, parece ocorrer por uma interação entre Asn
111
localizada na TM III
e Tyr
292
ou Asn
295
na TM VII (Balmforth et al. 1997, Groblewski et al., 1997). No
processo de ativação via agonistas, existem evidências para a formação de uma
ponte salina entre Lys
199
na TM V do receptor e o grupo carboxila terminal da AngII,
o que seria crucial para o desencadeamento da ativação (Noda et al., 1995, Miura et
al., 1999). Assim, um modelo proposto para a ativação do receptor ocorreria em dois
passos: um passo de pré-ativação, caracterizado pela interação de Tyr
4
da AngII
com Asn
111
o que levaria à destruição da interação intramolecular entre Asn
111
e a
TM VII. No segundo passo, alterações estruturais devido à interação com a AngII
levariam à estabilização do estado ativado do receptor (Noda et al.,1996). O estado
pré-ativado do receptor AT
1
, no qual a interação intramolecular entre Asn
111
e a TM
VII é destruída pode ser mimetizado através da substituição da Asn
111
por
aminoácidos como Gly, Ala e Ser. Estes receptores mutantes são constitutivamente
ativos (Noda et al., 1996, Balmforth et al., 1997, Groblewski et al., 1997, Le et al.,
2003). A interação de Arg
2
da AngII com Asp
281
na TM VII teria um papel crucial para
a transição do estado pré-ativado para o estado ativado do receptor (Feng et al.,
1995), como foi verificado no mutante D281A. Neste mutante a eficácia da AngII foi
significativamente diminuída, porém Le et al. (2002) trabalhando com o duplo
mutante D281A/N111A, verificaram que este efeito foi totalmente superado. Além
disso, estes pesquisadores verificaram também um aumento na afinidade e na
eficácia para o peptídio AngIV no duplo mutante, quando comparado ao receptor
selvagem ou ao receptor mutante D281A. Assim, para estes autores, o estado de
_______________________________________________________________________________Introdução
24
pré-ativação, uma vez superado através da mutação N111A, permite que o peptídio
contendo apenas cinco resíduos C-terminais (i.e. AngIV) possa desencadear a
ativação total do receptor. Dessa maneira, o papel da Arg
2
da AngII seria estabilizar
uma conformação ótima do receptor para a ligação dos cinco resíduos C-terminais
da AngII, e a ligação destes resíduos seria suficiente para desencadear a ativação
plena do receptor. Dados recentes obtidos por Feng e colaboradores (2005)
mostraram que mutações nos resíduos de aminoácidos Asn
295
e Leu
305
na TM VII do
receptor AT
1
propiciam que estes receptores mutantes possuam afinidade não só
pelo peptídeo AngII, mas também para alguns de seus fragmentos, tais como Ang1-
7, AngIV, e Ang5-8, os quais são inativos para o receptor selvagem. Estes autores
verificaram que a expressão dos mutantes N295S e L305Q levam a uma produção
de IP
3
aumentada na ausência de AngII exógena, quando expressos em células
HEK 293T, porém esta atividade constitutiva desaparecia quando estes mutantes
eram expressos em células COS-7. Este dado levou os autores a verificarem se
estas mutações alteravam a capacidade de ligação destes receptores mutantes para
a AngII e seus fragmentos. Surpreendentemente, os autores observaram que a
atividade basal apresentada pelos mutantes N295S e L305Q em células HEK 293T
era causada pela presença de fragmentos de AngII endógena, produzidos pelas
células, isto é, estas mutações induziam uma ativação dos receptores mutantes não
apenas via AngII, mas também por seus fragmentos. A capacidade de ligação não
apenas do agonista, mas também de seus fragmentos, verificado pelos autores os
levou a propor um novo modelo para a ativação de GPCRs, no qual tais receptores
seriam ativados através de uma seleção conformacional mais do que por um
mecanismo de indução.
_______________________________________________________________________________Introdução
25
Para estudar o papel de resíduos alifáticos conservados na hélice VI e na alça
EC3, os aminoácidos Leu
262
, Leu
265
e Leu
268
foram mutados para Asp (Correa et al.,
2002). O triplo mutante e o mutante L265D apresentaram uma diminuição
significativa na via clássica de transdução do sinal, indicando uma possível interação
do resíduo Leu
265
com a bicamada lipídica. Desta forma, este resíduo ajudaria a
estabilizar a estrutura do receptor próxima ao resíduo Lys
199
na hélice V no sítio de
ligação ao agonista. Para Brian e colaboradores (2002), a principal diferença entre
as conformações de agonistas e antagonistas do receptor AT
1
, em um ambiente que
mimetiza a membrana, está no espaço conformacional acessível ao C-terminal do
peptídeo. Como citado anteriormente, a interação da Lys
199
com o C-terminal da
AngII parece ser crucial para o desencadeamento do processo de ativação do
receptor AT
1
. Nikiforovich e colaboradores (2005), estudando os mecanismos
moleculares da ativação constitutiva do receptor AT
1
propuseram que a atividade
constitutiva do receptor na posição Asn
111
envolveria uma cascata de mudanças
conformacionais ao longo da TM III, levando a mudanças conformacionais na TM IV
como um todo. Nikiforovich e colaboradores (2006), demonstraram leves, porém,
importantes diferenças nas rotações das TMs II e VII quando compararam o receptor
AT
1
em seu estado inativo (ausência de AngII) e o mesmo em seu estado pré-
ativado (receptor ligado a AngII). Estes autores sugeriram que uma interação entre o
resíduo conservado de ácido aspártico na TM II (Asp
74
) e o resíduo de asparagina
na seqüência conservada NPX
2-3
Y na TM VII poderia representar uma função geral
na ativação de um GPCR. Entretanto, tais autores ressaltam que no receptor AT
1
esta interação seria mediada pelo balanço de outras interações entre os resíduos na
TM II (Asp
74
) e TM VII (Asn
294
, Asn
295
, e Asn
298
), fato que os levou a sugerir que
quando os resíduos correspondentes a Asn
294
e Asn
295
no receptor AT
1
não são
_______________________________________________________________________________Introdução
26
conservados em outros GPCRs pertencentes à família da rodopsina, os mecanismos
moleculares determinando as interações cruciais entre as TMs II e VII poderiam
diferir significantemente entre os receptores.
A importância da Phe
8
da AngII para a ativação do receptor AT
1
é bem
estabelecida. A substituição do aminoácido Phe
8
da AngII por aminoácidos como
Leu ou Ala levou à obtenção de análogos com alta afinidade, porém com baixa
atividade, os quais atuam como antagonistas competitivos da AngII (Khairallah et al.,
1970, Paiva et al., 1973). Noda e colaboradores (1995) verificaram que mutação no
resíduo His
256
do receptor AT
1
levava a uma diminuição na produção de IP
3
sem
afetar a interação de ligantes com o receptor. Assim, estes autores propuseram
haver uma interação entre o anel imidazólico do resíduo His
256
do receptor com o
anel aromático de Phe
8
da AngII, estabilizando um complexo receptor-ligante
produtivo. Posteriormente, Han et al. (1998) verificaram que os mutantes V254A,
H256A e F259Y apresentaram uma diminuição significativa na produção de IP
3
. Para
estes autores, os resíduos Val
254
, His
256
e Phe
259
, localizados na TM VI, não seriam
importantes para a interação com o ligante, mas estariam envolvidos com a
transdução de sinal. Mais recentemente, Ohyama e colaboradores (2002)
trabalharam com uma seqüência de três aminoácidos (Asp-Arg-Tyr), localizados na
alça IC2, altamente conservada entre os GPCRs. Estes autores verificaram que os
mutantes D125A, D125G, R126A e R126G tiveram uma produção de IP
3
marcadamente reduzida. No entanto, o mutante Y127A comportou-se de modo
semelhante ao receptor selvagem quanto à produção de IP
3
. Assim, estes
pesquisadores sugeriram que os resíduos Asp
125
e Arg
126
poderiam ser sítios de
ligação à proteína G no receptor. Semelhante mecanismo já havia sido proposto por
Oliveira et al. (1994) através de estudos de modelagem molecular. Ainda com
_______________________________________________________________________________Introdução
27
relação à seqüência de aminoácidos Asp-Arg-Tyr, Ohyama e colaboradores (2002)
verificaram que apenas esta seqüência não é suficiente para ativar a proteína G
diretamente. A ativação da proteína G parece requerer, além desta seqüência de
aminoácidos, a participação da alça IC3 e de parte da cauda citoplasmática. O
resíduo Asn
294
também foi mostrado estar associado ao mecanismo de ativação do
receptor AT
1
, uma vez que o mutante N294A não apresentou atividade em ensaios
funcionais com a AngII, embora a afinidade deste peptídeo pelo mutante não tenha
sido afetada (Hunyady et al., 1998). Posteriormente, Pérodin e colaboradores (2002)
tiveram resultados semelhantes trabalhando com o mutante N294M, ou seja, a AngII
também não foi capaz de ativar este receptor mutante, embora o agonista
apresentasse afinidade normal para o mutante.
A importância da porção C-terminal e da alça IC3 de receptores ligados à
proteína G tem sido indicada pela habilidade de mutações em resíduos específicos
nestas regiões causar ativação constitutiva de alguns receptores adrenérgicos
(Cotecchia et al., 1990, Kjelsberg et al., 1992, Scheer et al., 1996). Estudos através
de mutação do receptor AT
1
indicaram que os resíduos ou seqüências da cauda C-
terminal e das regiões citoplasmáticas são críticos para a ativação da proteína G. A
utilização de receptores humanos quiméricos AT
1
e AT
2
demonstrou que os resíduos
de aminoácidos 219-225, localizados na região N-terminal da alça IC3, são
importantes para a ativação da proteína Gq (Wang et al., 1995). Outras mutações na
região N-terminal da alça IC3, resíduos de aminoácidos 215 a 226, também
evidenciaram a importância dessa região para a ativação da proteína G (Hunyady et
al., 1995). Além disso, substituições dos resíduos carregados nesta região
diminuíram marcadamente a produção de IP
3
induzida por AngII (Ohyama et al.,
1992). Mais recentemente, foi demonstrado que os resíduos Ile
238
e Phe
239
,
_______________________________________________________________________________Introdução
28
localizados na região C-terminal da alça IC3, são importantes para o mecanismo de
ativação do receptor AT
1
, com resíduos apolares adjacentes podendo participar em
interações intramoleculares requeridas para a ativação do receptor (Zhang et al.,
2000). Além da região da alça IC3, outros estudos têm demonstrado que as regiões
da IC2 e da cauda citosólica do receptor AT
1
também estão envolvidas na ligação à
proteína G (Ohyama et al., 1992, Sano et al., 1999). Shirai e colaboradores (1995)
mostraram que o peptídeo sintético, representando o fragmento 306-320 do receptor
AT
1
de rato, foi capaz de ativar proteína G. Posteriormente, foi demonstrado que a
região 300-320 da porção C-terminal do receptor AT
1
pode assumir uma estrutura
helicoidal e esta estrutura secundária pode ser modulada por perturbações físicas ou
químicas fisiologicamente relevantes, dando suporte aos modelos nos quais as
interações hélice-hélice seriam o principal mecanismo molecular para a ativação da
proteína G (Franzoni et al., 1997). A existência de uma α-hélice na cauda C-terminal
de GPCRs foi confirmada com a determinação da estrutura do receptor rodopsina
por cristalografia (Palczewiski et al., 2000). Para alguns autores, a cauda C-terminal
do receptor AT
1
também está relacionada ao evento de internalização do receptor
em um processo induzido pela ligação do agonista (Hunyady et al., 1995, Shibata et
al., 1996). A importância da alça IC2 na geração de sinal induzido por AngII tem sido
demonstrada por vários pesquisadores que mostraram que resíduos de aminoácidos
positivamente carregados e Ser
136
(Ohyama et al., 1992), bem como Ile
130
, His
132
,
Pro
133
e Met
134
(Gáborik et al., 2003) na alça IC2 são importantes para a sinalização
por inositol fosfato pelo receptor AT
1
. O papel da IC2 na geração de sinal induzido
pelo agonista é consistente com achados que mostram o papel desta alça
intracelular na produção de inositol fosfato através da ativação do receptor AT
1
e
ativação de quinases ativadas por sinais extracelulares (ERK) (Gáborik et al., 2003).
_______________________________________________________________________________Introdução
29
Estudos semelhantes foram realizados com os receptores muscarínicos M1 e M3,
GnRH, vasopressina V1a e receptores PTH/PTHRP, todos os quais se acoplam à
proteína Gq (Moro et al., 1993, Arora et al., 1995, Liu e Wess, 1996, Iida-Klein et al.,
1997).
Além do envolvimento da via clássica de sinalização através de ativação da
proteína G, há crescentes evidências de que a ativação do receptor AT
1
também
desencadeia eventos intracelulares primariamente atribuídos exclusivamente aos
receptores de fatores de crescimento. A descoberta que receptores AT
1
poderiam
mediar vias de sinalização alternativas, incluindo regulação de atividade tirosinas
quinases e tirosinas fosfatases, bem como aumento na expressão de alguns genes
(por exemplo, c-fos, c-jun e c-myc) (Clark et aI., 1992, Berk e Corson, 1997)
forneceram subsídios relacionados a outros mecanismos celulares, os quais por sua
vez comprovam a participação da AngII em respostas fisiológicas de grande
diversidade. Uma das vias alternativas desencadeadas pelo receptor AT
1
é a
fosforilação dos membros da família de proteínas quinases ativadas por mitógeno
(MAPK), incluindo ERK1 e ERK2. A sinalização via MAPK é importante para o
controle e coordenação de múltiplas respostas celulares, tais como proliferação,
diferenciação e viabilidade celular. Mesmo dentro de uma mesma célula a ativação
de MAPK pode resultar em respostas celulares opostas dependendo do estímulo.
Como as células garantem que a ativação de MAPK levará à resposta desejada?
Diante de uma variedade de possibilidades de sinalização alguns estudos
demonstraram que a ativação de MAPK induzida por AngII poderia ocorrer sem a
ativação prévia da proteína G (Seta et al., 2001, Wei et al., 2004). O mecanismo
exato pelo qual o mesmo receptor AT
1
é capaz de desencadear diferentes vias de
transdução de sinal ainda não é claro, mas presumivelmente envolve uma série
_______________________________________________________________________________Introdução
30
complexa de passos que seletivamente recruta outras proteínas parceiras, ativa e
posteriormente inativa um dado sistema de sinalização de maneira tempo-
dependente.
As MAPKs ERK 1 e ERK 2 são proteínas serina/treonina quinases que
transduzem sinais da membrana celular para o núcleo em resposta a fatores de
crescimento clássicos, GPCRs e estresse celular (Pierce et al., 2001). ERK1 e ERK2
desempenham um papel central no crescimento e diferenciação celular (Pierce et al.,
2001, Ushio-Fukai et al., 1998). Evidências para múltiplos estados de ativação do
receptor AT
1
foram inicialmente sugeridas por dados que mostravam que os
requerimentos estruturais para a ativação do receptor, definidos por ensaios de
níveis de IP
3
poderiam não ser aplicáveis quando se monitorava a sinalização
através de MAPK. Por exemplo, a substituição de Asp
74
na TM II e resíduos chaves
na TM VII (Tyr
292
e Asn
295
) bloqueou a produção de IP
3
induzida por AngII sem afetar
a sinalização de MAPK (Doan et al., 2001, Hines et al., 2003). Hunyady e
colaboradores (2004), através de mutagênese sítio-dirigida, mostraram que os
processos de geração de sinal e internalização do receptor AT
1
apresentam
requerimentos estruturais diferentes, mas que se sobrepõem: enquanto a porção
amino terminal da alça IC3 está envolvida na produção de IP
3
e internalização do
receptor, a alça IC2 está seletivamente envolvida na geração de IP
3
e a cauda
citoplasmática do receptor tem um papel importante na internalização do mesmo.
Além do papel clássico da proteína β-arrestina como terminadores da
sinalização de um GPCR, há evidências crescentes de novas funções desta proteína
como transdutor de sinal (Luttrell e Lefkowitz, 2002). No caso da proteína ERK1/2,
tem sido demonstrado que uma vez ativados os receptores AT
1
(Luttrell et al., 2001),
receptores de neurocinina e receptores ativados por protease (DeFea et al., 2000), a
_______________________________________________________________________________Introdução
31
β-arrestina ancora os componentes Raf-1, MEK1 e ERK1/2 ao complexo,
culminando com a ativação de ERK1/2. Dois importantes mecanismos devem ser
levados em conta para a regulação da ativação das vias das MAPKs, a duração e a
distribuição subcelular das MAPKs ativadas, as quais serão diferentemente
reguladas dependendo do estímulo em questão. Por exemplo, já foi mostrado que a
ativação de ERK1/2 mediada pelo receptor CXCR4 é prolongada em relação a
outros receptores de quimiocinas (Tilton et al., 2000). Diferentes receptores ativados
por protease também apresentam diferentes padrões de localização subcelular e de
cinética para a ativação de ERK1/2. Desta maneira, Ahn e colaboradores (2004)
mostraram que após a ativação do receptor AT
1
, as proteínas ERK1/2 eram
rapidamente, mas transitoriamente ativadas via proteína G. Entretanto, a ativação de
ERK via a proteína β-arrestina 2, era relativamente mais lenta, porém persistente.
Estes pesquisadores também verificaram que a ativação de ERK via proteína G
levava à translocação da proteína ERK para o núcleo, enquanto que a ativação via
β-arrestina levava à localização exclusivamente citoplasmática das proteínas
ERK1/2. Alguns exemplos têm sugerido que os alvos citoplasmáticos de ERK são
proteínas do citoesqueleto e proteínas associadas a microtúbulos, ou seja, proteínas
envolvidas na migração celular e alterações morfológicas (Ray e Sturgill, 1988,
Goedert et al., 1996). De modo semelhante, Sadoshima e colaboradores (2002)
também mostraram que ERK ativada através de mecanismos de sinalização
independentes de proteína G fosforilam alvos citoplasmáticos, mas falham na
translocação ao núcleo, sugerindo que mecanismos de sinalização dependentes e
independentes de proteína G desempenham distintos papéis nas respostas
celulares mediadas por AngII. Também tem sido mostrado que algumas proteínas
importantes no processo de apoptose e viabilidade celular são reguladas através da
_______________________________________________________________________________Introdução
32
fosforilação de ERK (Garcia et al., 2002, Maeckawa et al., 2002). A translocação de
ERK para o núcleo é mediada por fosforilação e subseqüente dimerização da
proteína. Embora a dimerização não afete as atividades quinase desta proteína, a
dimerização é necessária para a translocação nuclear (Khokhlatchev et al., 1998,
Adachi et al., 2000). Alternativamente, ERKs ativadas por um mecanismo
independente de proteína G podem ser compartimentalizadas (DeFea et al., 2000),
podem estar associadas a outras proteínas citoplasmáticas ou podem não ter
acesso à maquinaria que permita o acesso ao núcleo (Adachi et al., 2000).
Além da ativação de ERK via o próprio receptor AT
1
, a AngII leva à sua
fosforilação via a transativação do receptor do fator de crescimento epidermal
(EGFR). Ainda, a transativação de EGFR via AngII também leva à ativação de outras
quinases em células da musculatura vascular lisa, tais como: Akt/proteína quinase B,
quinase p70S6 e a proteína quinase ativada por mitógeno p38 (Eguchi et al., 1999,
Eguchi et al., 2001), sugerindo que a transativação de EGFR poderia ser um dos
principais pontos de convergência pelos quais a AngII induziria algumas funções
patofisiológicas em seus órgãos alvos. Recentemente, a seqüência Tyr-Ile-Pro-Pro
(YIPP) do receptor AT
1
foi demonstrada participar da transativação de EGFR (Seta e
Sadoshima, 2003), e a fosforilação da tirosina deste motivo foi proposta como
mediadora da transativação de EGFR, com a participação da proteína tirosina
fosfatase SH2 servindo como âncora durante o processo. Outros mecanismos de
transativação de EGFR, mediados através da ativação do receptor AT
1
por AngII,
envolvendo metaloproteases responsáveis pela clivagem de ligantes de EGFR
também foram descritos (Eguchi et al., 2005). A Figura 4 mostra a complexidade de
vias intracelulares desencadeadas pela ativação do receptor AT
1
por AngII.
_______________________________________________________________________________Introdução
33
A obtenção de estruturas cristalinas de proteínas transmembranares é muito
difícil. A estrutura cristalina da rodopsina (Palczewski et al., 2000) é a única
disponível até o momento para uma proteína do tipo 7TM, e é largamente utilizada
como parâmetro de comparação estrutural para GPCRs. Uma vez que a elucidação
da estereoquímica da interação receptor-ligante é crucial para a compreensão dos
mecanismos pelos quais os receptores são ativados, a utilização de ferramentas
como a mutagênese sítio-dirigida e a construção de receptores quiméricos se
tornaram extremamente úteis para a identificação dos aminoácidos envolvidos na
interação com os ligantes, bem como aqueles importantes para a ativação do
receptor. Além disso, em contraste à investigação da ativação clássica do receptor
AT
1
, estudos dos requerimentos estruturais das vias alternativas de sinalização tais
como MAPKs ainda são limitados. Considerando a importância crescente da AngII
na participação em diversas patologias, a compreensão e o conhecimento dos
requerimentos estruturais do receptor AT
1
necessários para a ativação das suas
diversas vias de sinalização se tornam cada vez mais relevantes. O conhecimento
dos mecanismos estruturais da ativação dos GPCRs em nível molecular poderia
beneficiar tremendamente os campos da bioquímica e farmacologia molecular e, em
especial o desenho racional de drogas.
_______________________________________________________________________________Introdução
34
Figura 4. Diagrama esquemático mostrando diferentes tirosina quinases
envolvidas na transdução de sinal mediada por AngII. AngII, angiotensina II, AT
1
,
receptor AT
1
, DAG, diacilglicerol, EGFR, receptor do fator de crescimento epidermal,
ERK, quinase regulada por sinal extracelular, FAK, quinase de adesão focal, Gq,
proteína Gq, IP
3
, inositol trisfosfato, Jak, quinase Janus, PKC, proteína quinase C,
PLC, fosfolipase C, PDGFR, receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta,
Pyk2, tirosina quinase rica em prolina, Ras, proteína Ras, ROS, espécies reativas de
oxigênio, Shc, proteína adaptadora de tirosinas fosforiladas, Src, tirosina quinase,
STAT, transdutor de sinal e ativador de transcrição. (Baseado em Yin et al., 2003).
Gq
PLC
IP
3
/ DAG
Ca
2+
/ PKC
ERK
Ras
ERK
EGFR
STAT
JAK2
Ca
2+
/ PKC
Quinase Src
Pyk2 FAK
Migração
celular
c-fos
ROS
Shc
Ras
ERK
Ca
2+
-
independente
AT
1
AngII
PDGFR
Gq
PLCPLC
IP
3
/ DAG
Ca
2+
/ PKC
ERK
Ras
ERK
EGFR
STATSTAT
JAK2JAK2
Ca
2+
/ PKC
Quinase Src
Pyk2 FAK
Migração
celular
c-fos
ROS
Shc
Ras
ERK
Ca
2+
-
independente
AT
1
AngII
PDGFR
______________________________________________________________________Objetivo e Justificativa
35
OBJETIVO E JUSTIFICATIVA
O objetivo geral deste trabalho foi investigar o papel de resíduos incomuns de
serem encontrados nas regiões TM do receptor AT
1
para a funcionalidade do
receptor. Na averiguação de resíduos possivelmente envolvidos com o processo de
transdução de sinal, algumas características estruturais peculiares aos GPCRs ainda
precisam ser investigadas. Uma dessas características é a presença, nas hélices
transmembranares, de aminoácidos polares e de resíduos de prolina, que
sabidamente interferem na estabilização de α-hélices. Resíduos de prolina são
terminadores clássicos de estruturas α-hélices helicoidais em proteínas globulares,
porém um padrão diferente é observado nas hélices transmembranares de alguns
GPCRs, como o receptor AT
1
, onde muitos resíduos de prolina são encontrados
(veja Figura 3). Sob qualquer condição, este aminoácido quando presente em α-
hélices diminui a estabilidade devido à ausência de uma ponte de hidrogênio,
induzindo uma quebra na região onde está localizado. Desta forma, com base em
análises de homologia seqüencial, identificamos os resíduos de prolina das regiões
TM do receptor AT
1
que ainda não foram investigados e que poderiam ter um
importante papel na definição estrutural e funcional do receptor AT
1
.
Quanto à funcionalidade, resolvemos investigar se as mutações introduzidas
teriam efeito prioritário quanto às diferentes vias de sinalização: via clássica, através
de acidificação extracelular e mobilização de cálcio intracelular e de vias alternativas
por meio da ativação de MAPK.
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
36
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Escolha de resíduos de aminoácidos candidatos a serem mutados
Foi realizada uma análise de homologia seqüencial para os receptores AT
1
de
rato, humano, coelho, porco, cachorro, camundongo e de Xenopus laevis, além do
receptor AT
2
de rato. Este último possui uma extensão N-terminal não encontrada
nos receptores AT
1
analisados. Após o alinhamento das seqüências foram
selecionados os resíduos de prolina localizados nas 7TMs para verificar sua possível
participação no processo de transdução do sinal, uma vez que seu grupo imino
secundário é mantido em uma conformação rígida, reduzindo a flexibilidade
estrutural da cadeia protéica no ponto onde se insere. Decidimos também selecionar
os resíduos de aminoácidos polares localizados nestas regiões. Após a seleção dos
resíduos de aminoácidos de interesse, foi realizada uma busca em bancos de dados
sobre mutagênese em GPCRs, para verificar quais deles já haviam sido analisados.
A Tabela 1 contém os resíduos de aminoácidos selecionados, e suas respectivas
localizações nas TMs do receptor AT
1
,
ainda não descritos na literatura.
Tabela 1: Resíduos de aminoácidos do receptor AT
1
candidatos a serem mutados
TMI TMII TMIII TMIV TMV TMVII
Pro
32
Thr
80
Asn
98
Ser
160
Asn
200
Pro
285
Tyr
35
Pro
82
His
99
Pro
162
Pro
207
Pro
299
Ser
36
Tyr
87
Tyr
113
Thr
213
Asn
46
Ser
214
Ser
47
Thr
216
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
37
O alinhamento das seqüências de receptores da AngII (Figura 5) mostra a
conservação dos resíduos apresentados na Tabela 1.
2. Mutações sítio-dirigidas
O vetor pTEJ8 contendo o cDNA do receptor AT
1
de rato (AT
1A
, contendo
somente a região codificadora, cujo fragmento é de 1.1 kb) foi cedido pelo Dr. Thue
W. Schwartz do Laboratório de Farmacologia Molecular, Panum Institute,
Copenhagen, Dinamarca. O cDNA do receptor AT
1
de rato foi subclonado em fusão
com a proteína fluorescente verde (pAT
1
-GFP) pelo Dr. Emer S. Ferro (ICB-USP).
Como pretendíamos também analisar a localização dos mutantes do receptor AT
1
, a
fusão do receptor à proteína GFP foi de grande praticidade. Utilizamos a construção
pAT
1
-GFP para gerar mutantes, usando o plasmídio inteiro, pela técnica de Reação
da Polimerase em Cadeia (PCR). No vetor pAT
1
-GFP, o cDNA codificando para o
receptor AT
1
foi subclonado nos sítios BamHI e EcoRI.
Para obter os mutantes, sintetizamos oligonucleotídeos para as cadeias
complementares contendo a mutação desejada da região codificadora. Os
oligonucleotídeos contendo a mutação, cada um complementar a uma das fitas do
vetor, estão descritos na Tabela 2. Nesta tabela, a região em negrito corresponde ao
códon que foi alterado para dar origem ao aminoácido escolhido, F na seqüência do
oligonuclotídeo indica o oligonucleotídeo sense e R, o oligonucleotídeo anti-sense.
Para a reação de PCR utilizamos 50ng do DNA molde (pAT
1
-GFP), 125ng de cada
oligonucleotídeo, 5µL de tampão da enzima, 2,5µL de MgSO
4
50µM, 0,2µM de
dNTPs e 2,5U da enzima Taq HiFi (Invitrogen).
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
38
Figura 5: Alinhamento das seqüências de aminoácidos de receptores de AngII.
Os resíduos de aminoácidos descritos na Tabela 1 aparecem aqui como branco
sobre preto. Com exceção do receptor AT
2
de rato, as demais seqüências
correspondem aos receptores AT
1
. Por conveniência, a região correspondente à
porção C-terminal de todos os receptores e a porção N-terminal (15 resíduos) do
receptor AT
2
de rato não foram mostradas.
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
39
Tabela 2: Seqüência dos oligonucleotídeos utilizados para mutação sítio-dirigida
Nome Mutação Seqüência dos oligonucleotídeos
Códon
original
CN#025 P82A
F: 5’-GCTTTTTGCTGACTTTGGCCCTGTGGGCA
CCC
CN#026 P82A
R: 5-CTGCCCACAGGGCCAAAGTCAGCAAAAAGC
CN#029 P162A
F: 5´-GGCCAGTTTGGCAGCTGTCATCCACCG
CCA
CN#030 P162A
R: 5´-CGGTGGATGACAGCTGCCAAACTGGCC
CN#031 P207A
F: 5´-GGGCTTCTTGTTCGCTTTCCTTATCATTCTCACC-3´
GCT
CN#032 P207A
R: 5´-GGTGAGAATGATAAGGAAAGCGAACAAGAAGCCC-3´
CN#033 P285A
F: 5´-GTGGACACTGCCATGGCCATCACCATATGC-3´
GCC
CN#034 P285A
R: 5´-GCATATGGTGATGGCCATGGCAGTGTCCAC-3´
A reação de PCR iniciou-se com a desnaturação do DNA molde a 94
o
C por 1
minuto. A seguir, a temperatura de anelamento utilizada foi de 55
o
C por 1minuto,
seguida da temperatura de polimerização, 68
o
C, por 12 minutos. Realizamos um
total de 16 ciclos e um ciclo final extra de 68
o
C por 10 minutos.
Os produtos obtidos da reação de PCR foram digeridos com 1µL da enzima
DpnI (Invitrogen) durante 18 horas a 37
o
C. Esta enzima é específica para DNAs
metilados e hemi-metilados, portanto apenas o DNA parental sofreria a ação desta
enzima. Após a digestão do DNA parental, 5µL do produto de digestão foram
utilizados para a transformação bacteriana e algumas colônias foram escolhidas
aleatoriamente para a mini-preparação dos seus DNAs plasmidiais. A Figura 6
esquematiza as etapas para a realização das mutações sítio-dirigidas.
Para verificar as colônias contendo o cDNA do receptor AT
1
, 3µL do DNA
plasmidial obtido foram digeridos com 5U das enzimas BamHI e EcoRI, se o
plasmídeo era pAT
1
-GFP, no tampão apropriado em volume final de 10µL, durante 2
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
40
horas a 37
o
C. Os produtos desta digestão foram analisados em gel de agarose 1%
para identificação de colônias positivas para o receptor AT
1
. Algumas colônias que
continham o inserto foram escolhidas para a realização do sequenciamento
automático para a identificação dos DNAs plasmidiais contendo a mutação desejada.
3. Transformação bacteriana
5µL do produto de digestão da reação de PCR foram utilizados para
transformar 40µL de bactérias competentes por eletroporação. Após a
eletroporação, foram adicionados 500µL de meio LB e as bactérias transformadas
foram incubadas durante 1 hora a 37
o
C e 300rpm. As bactérias competentes
transformadas com o vetor de interesse foram então semeadas em placa contendo
20mL de meio LB-ágar e 30µg/mL do antibiótico apropriado (geralmente, canamicina
ou ampicilina) e incubadas a 37
o
C durante 16 horas.
4. Mini preparação plasmidial
Algumas colônias de bactérias transformadas, expressando o gene de
resistência ao antibiótico utilizado, foram escolhidas aleatoriamente, inoculadas em
5mL de meio LB contendo 30µg/mL do referido antibiótico e incubadas a 37
o
C, sob
agitação constante de 300rpm durante 16 horas. Após o crescimento, a suspensão
bacteriana foi centrifugada a 5.000rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi removido e
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
41
Figura 6: Etapas para a realização das mutações.
1. Plasmídeos contendo o gene de interesse e síntese dos oligonucleotídeos
mutagênicos.
2. Cópia do DNA com a enzima Taq HiFi (Invitrogen) para a incorporação da
mutação.
3. Digestão com a enzima DpnI e transformação de bactérias competentes.
Me
Me
Me
Me
x
Colônias
1
2
3
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
42
iniciou-se a mini-preparação do DNA plasmidial por lise alcalina (Sambrook et al.,
1989) ou, caso um grau maior de pureza fosse desejado, o procedimento para a
mini-preparação plasmidial era então realizado através do kit da Promega ou
Eppendorf.
A quantidade de DNA resultante dessas preparações foi dosada em
espectrofotômetro a 260nm e utilizada para digestão e sequenciamento. Após a
confirmação da mutação desejada por sequenciamento, utilizamos o kit para maxi-
preparação de DNA plasmidial (Eppendorf) para a obtenção de uma maior
quantidade do DNA plasmidial de interesse.
5. Sequenciamento
Para o sequenciamento automático, foram preparadas reações de PCR
utilizando de 200 a 500ng de DNA, 10µM de oligonucleotídeo, 8µL de Et Terminator
Ready Reaction Mix e água para um volume final de 20µL. As condições utilizadas
para a reação de PCR foram : 95
o
C durante 3 minutos seguidos de 35 ciclos de
variações consecutivas de temperaturas de 95
o
C durante 20 segundos, 56
o
C
durante 20 segundos e 60
o
C durante 4 minutos em termociclador.
6. Transfecção transiente em células COS-7 ou HEK 293T
24 horas antes da transfecção, as células foram removidas das garrafas
através de incubação por 5min com PBS contendo EDTA 10mM à temperatura
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
43
ambiente, contadas e transferidas para placas de Petri, na quantidade de 2 x 10
6
células por placa, em 10 mL de meio DMEM. 15µg de DNA plasmidial foram
transfectados em células COS-7 ou HEK 293T usando o método de precipitação por
fosfato de cálcio (Gether et al., 1993; Sambrook et al., 1989), com adição de
cloroquina (Sigma) 0,06 mg/mL. Após 5 horas de incubação com o DNA plasmidial
de interesse, as células foram lavadas com 5mL de tampão PBS e então incubadas
por uma noite em 10mL de meio de cultura DMEM (suplementado com 10% de soro
fetal bovino, gentamicina 50µg/mL e glutamina 2mM), a 37
o
C com 5% de CO
2
.
Depois de 24 horas, as células foram removidas, contadas novamente e então
utilizadas para os ensaios de competição ou de ativação celular.
7. Localização celular dos receptores por fluorescência
Células HEK 293T foram transientemente transfectadas com 15µg de DNA
plasmidial do receptor AT
1
selvagem fusionado à proteína fluorescente verde (GFP)
ou dos mutantes gerados, pelo método de precipitação por fosfato de cálcio. Após
18h de transfecção, as células foram transferidas para lamínulas de 13mm de
diâmetro e incubadas por mais 24h adicionais. Posteriormente, as células foram
lavadas 3 vezes (5min cada) com PBS. Em seguida, as células foram incubadas
com paraformol 2%, a 37
o
C por 20min. Após a fixação com paraformol, as células
foram lavadas 3 vezes com PBS (5min cada) e incubadas com glicina 250mM por
5min. Em seguida, as células foram lavadas 10 vezes com PBS (5min cada) e
analisadas microscopicamente após a montagem da lamínula com Fluormount.
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
44
8. Ensaio de “binding” com células inteiras
Os ensaios de “binding” foram realizados com células inteiras, 48 horas após
a transfecção. As células transfectadas foram transferidas para placas de 24 poços,
24 horas após a transfecção na quantidade de 10
5
células por poço. As placas foram
previamente tratadas com uma solução de poli-lisina (0,1mg/mL em PBS), e
enxaguadas com PBS, antes de receberem as células. Após receberem as células,
as placas foram incubadas na estufa até o dia seguinte, e imediatamente antes de
ser iniciado o ensaio de “binding” foram enxaguadas brevemente com tampão de
lavagem (Tris-HCl 25mM, pH 7,4, NaCl 140mM, MgCl
2
5mM, 0,1% albumina de soro
bovino).
Os experimentos de “binding” foram realizados a 4
o
C, e iniciados com a
adição do ligante marcado (
3
H-AngII, GE-Healthcare) na presença de diferentes
concentrações de ligante frio (AngII), em um volume final de reação de 525 µL. O
tampão usado para os ensaios foi Tris-HCl 25mM, pH 7,4, contendo MgCl
2
5mM,
albumina de soro bovino 0,1% (p/v), e bacitracina (Sigma) numa concentração final
de 100 µg/mL. Após a adição do ligante marcado (dissolvido no tampão), as placas
foram deixadas por 24 horas a 4
o
C. Após 24 horas os poços foram lavados duas
vezes com o mesmo tampão, mas sem bacitracina, e adicionou-se a cada um, 1mL
de tampão de lise (uréia 48%, detergente NONIDET P-40 2%, preparados em ácido
acético 3M), para subseqüente contagem radioativa. Após 15 minutos de incubação
com o tampão de lise, 950µL desta solução foram transferidos para tubos plásticos
de cintilação e após a adição de 5mL de líquido de cintilação e agitação vigorosa
dos mesmos, procedeu-se à contagem da radiação em contador β.
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
45
9. Medida da taxa de acidificação extracelular
Células COS-7 ou HEK 293T transfectadas com os receptores AT
1
selvagem
ou mutantes foram removidas do frasco de cultura com PBS contendo EDTA 10 mM
e cultivadas em cápsulas permeáveis estéreis em uma densidade de 3 x 10
5
células/cápsula. As placas foram então colocadas em uma estufa de CO
2
5% a 37
o
C
e as células deixadas para crescer por 24 horas antes do experimento.
Posteriormente, as células foram transferidas para as câmaras sensoras. Para medir
a taxa de acidificação, o fluxo do fluido foi periodicamente parado para a avaliação
da alteração de pH no fluido. O efeito da AngII após a interação com os receptores
AT
1
selvagem ou mutantes foi avaliado pelas variações na acidificação extracelular
(Santos et al., 2004). Para esta avaliação, utilizou-se o microfisiômetro Cytosensor
(Molecular Devices, CA) através de método descrito por McConnel e colaboradores
(1992). Estes experimentos foram realizados no Departamento de Biofísica da
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP, com o Prof. João B. Pesquero.
10. Mobilização de cálcio intrancelular
O íon cálcio é um mensageiro intracelular capaz de controlar diversos
processos e desempenha sua função durante elevações espaço-temporais no
compartimento citoplasmático da célula (Berridge, 1997, Berridge et al., 1998). É
possível observar estas variações de cálcio no citoplasma da célula com o uso de
indicadores fluorescentes específicos que mudam suas características de absorção
e/ou emissão de luz quando se ligam ao cálcio. Há um grande número de
indicadores fluorescentes de cálcio e a maioria é baseada nos quelantes de cálcio
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
46
EGTA ou BAPTA, os quais são modificados para incorporar grupos repórteres
fluorescentes (Grynkiewicz et al., 1985, Minta et al., 1989). Uma vez que estes
indicadores são impermeáveis à membrana plasmática na forma ligante de cálcio,
um grupo acetoxi-metil é ligado a eles, fornecendo um método conveniente de
introduzi-los na célula. Uma vez dentro das células, os grupos acetoxi-metil são
clivados por esterases endógenas, liberando assim a forma ligante de cálcio. Em
conjunto com estes indicadores de cálcio, a aplicação da microscopia confocal
permite a visualização de variações rápidas na concentração deste íon nos
compartimentos subcelulares.
10.1. FURA-2/AM
O FURA-2/AM é um indicador fluorescente dos íons Ca
+2
, excitável na luz
ultra-violeta (UV). O tempo de carregamento das células com FURA-2/AM refere-se
ao período em que esta sonda difunde pela membrana e o grupo aceto-metoxil é
clivado ao entrar no citoplasma. Uma vez no citoplasma, após excitação a 510 nm, a
sonda FURA-2 emite fluorescência no comprimento de onda de 340 nm quando
ligada aos íons Ca
+2
, por outro lado, emite fluorescência no comprimento de onda de
380 nm quando está livre.
Para a realização do experimento, as lamínulas, pré-tratadas com poli-Lisina,
contendo células HEK 293T transfectadas transientemente com os receptores AT
1
ou com os mutantes P82A e P162A foram carregadas com FURA-2/AM (5µM)
durante 50 minutos, a 37
o
C. Posteriormente, as lamínulas foram montadas em
câmara para perfusão e acopladas a um microscópio invertido, Nikon Diaphot,
equipado para epifluorescência. As células foram focalizadas por uma objetiva de
fluorescência e imersão a óleo com aumento de 40X (Nikon Fluor). As células foram
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
47
lavadas durante 10 min com solução tampão (NaCl 135mM, KCl 5mM, HEPES
10mM, MgCl
2
1mM, glicose 2mM, CaCl
2
2mM, pH 7.2) para eliminação do FURA-
2/AM não incorporado. Foram utilizadas células que apresentaram intensidade de
fluorescência acima de 5 X 10
5
contagens.
As células foram excitadas com luz proveniente de uma lâmpada de Xenônio
(75 Watts) em comprimentos de onda alternados em 340 e 380 nm, através de um
conjunto de filtros inseridos em um dispositivo controlado por computador (Delta Ran
- Photon Thechnology internaticonal - PTI). A fluorescência emitida das células foi
detectada por meio de uma fotomultiplicadora após a passagem por um espelho
dicróico para comprimento de onda de 510 nm. Os sinais de emissão foram
captados, armazenados e processados em computador IBM e software Felix (PTI).
O programa de computador, Felix, acoplado ao sistema que mede as
emissões de fluorescência do FURA-2 fornece estes dados na forma de razão
340nm/380nm, permitindo conclusões sobre a alteração da concentração
citoplasmática de Ca
+2
, frente aos estímulos estudados. Desta forma, o aumento da
razão 340nm/380nm, nos indica que há aumento na concentração citoplasmática de
Ca
+2
, enquanto que a redução desta razão nos indica diminuição da concentração
citoplasmática de Ca
+2
.
10.2. Fluo 3
Fluo-3/AM, assim como o FURA-2/AM, também é um indicador de cálcio. O
comprimento de onda de excitação do Fluo-3/AM é de 488nm. Porém,
diferentemente do FURA-2/AM, quando excitada, a sonda Fluo-3/AM emite
fluorescência em apenas um comprimento de onda, 526nm, e isso ocorre quando
está ligado ao íon Ca
2+
. O Fluo-3/AM pode ser excitado com um laser de argônio em
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
48
488nm, onde sua fluorescência aumenta com o aumento da concentração de cálcio.
Realizamos os experimentos para os receptores AT
1
selvagem e para os receptores
mutantes P82A e P162A utilizando a sonda FURA-2/AM. Os ensaios de mobilização
de cálcio através da microscopia confocal, com o uso da sonda Fluo-3/AM, foram
realizados para os receptores mutantes P207A e P285A, além daqueles receptores
já estudados com FURA-2/AM: AT
1
(selvagem) e os mutantes P82A e P162A.
Para a realização do experimento, as lamínulas, pré-tratadas com poli-Llisina,
contendo células HEK 293T transfectadas transientemente com os receptores AT
1
selvagem ou com os mutantes P82A, P162A, P207A e P285A, foram carregadas
com Fluo-3/AM (1µM) durante 30 minutos, a 37
o
C. Posteriormente, as lamínulas
foram montadas em uma câmara onde adicionamos 1mL de solução tampão (NaCl
135mM, KCl 5mM, HEPES 10mM, MgCl
2
1mM, glicose 2mM, CaCl
2
2mM, pH 7.2).
As células foram focalizadas no microscópio confocal com aumento de 63X (água) e
a fluorescência emitida foi monitorada. Após detectada fluorescência constante,
adicionamos a AngII em uma concentração final de 1µM e observamos a variação
da fluorescência. Desta forma, o aumento da intensidade de fluorescência nos
indicou aumento na concentração citoplasmática de Ca
+2
, enquanto que a redução
desta fluorescência nos indicou diminuição da concentração citoplasmática de Ca
+2
.
11. Ensaio de fosforilação de ERK1/2
Para realizar o ensaio de ativação de ERK, 3.0 x 10
5
células (COS-7 ou HEK
293T) foram semeadas em placas de 6 poços e crescidas em DMEM suplementado
com 10% de soro fetal bovino, gentamicina 50µg/mL e glutamina 2mM em ambiente
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
49
com 5% de CO
2
. Após 24h, as células foram transfectadas com 15µg de DNA
plasmidial por poço, utilizando o método de precipitação por cálcio. Quarenta e oito
horas após a transfecção, as células foram incubadas em DMEM suplementado com
gentamicina 50µg/mL e glutamina 2mM por 20h para a realização do ensaio de
ativação de ERK. Para o ensaio de ativação de ERK, as células devem estar
quiescentes, por isto a necessidade do período de incubação das mesmas na
ausência de soro fetal bovino.
Após este período, as células foram lavadas com DMEM sem soro fetal
bovino e realizamos a cinética de ativação para o receptor AT
1
selvagem e para os
mutantes. Em placas de 6 poços, utilizamos dois poços como controle da reação
(ausência de estímulo com a AngII), um poço para o tempo de estímulo com a AngII
durante 10min, outro para o tempo de estímulo de 20min e o terceiro para o tempo
de 30min. O último poço foi utilizado como controle positivo, com a presença de
forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) durante 10min. O ensaio foi realizado a 37
o
C e
a concentração final de AngII e PMA foram de 1µM e 0.3µM, respectivamente.
Após a incubação com AngII e PMA, as placas foram imediatamente
colocadas em gelo e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, foram
acrescentados 100µL de tampão de lise gelado (Tris-HCl 10mM, pH 7,5, NaCl
150mM, EDTA 1mM, EGTA 1mM, SDS 0.1%, Nonidet P-40 1% e os seguintes
inibidores de protease, PMSF 2mM, SBTI 100µg/mL, leupeptina 10µg/mL, aprotinina
100µg/mL, benzamidina 10mM e ortovanadato de sódio 2mM) e o lisado celular foi
recuperado e centrifugado por 15min, a 4
o
C, a 13.000rpm. As proteínas foram
dosadas pelo método de Bradford e 30µg de proteínas totais foram separadas por
eletroforese em gel de poliacrilamida 12% em condições desnaturantes (SDS-
PAGE). Em seguida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de
________________________________________________________________________Materiais e Métodos
50
nitrocelulose (GE Healthcare) e foi realizado western blot utilizando anticorpos contra
ERK total (Santa Cruz) e ERK fosforilada (pERK, Santa Cruz). As bandas foram
reveladas utilizando o kit ECL (Santa Cruz) e o programa ImageJ
(http://rsb.info.nhi.gov/ij/) foi utilizado para a quantificação densitométrica das
bandas. Os valores densitométricos correspondentes às bandas foram plotados
utilizando-se o programa Graph-Pad Prism (GraphPad, San Diego, CA).
_______________________________________________________________________________Resultados
51
RESULTADOS
1. Mutações sítio-dirigidas
Como mencionado anteriormente, os resíduos de prolina propostos a serem
mutados neste trabalho são extremamente conservados entre os receptores
analisados (Figura 5), fato que os torna importantes alvos para o estudo de ativação
do receptor AT
1
.
Conforme descrito em Materiais e Métodos, realizamos as mutações sítio-
dirigidas utilizando a reação de PCR. Para a seleção de alguns prováveis clones
contendo as mutações, realizamos uma digestão com enzimas de restrição. Esta
análise de restrição leva à liberação de um fragmento de 1.100 pb, correspondente
ao cDNA do receptor AT
1
. A Figura 7 mostra a análise de restrição realizada para
receptores possivelmente contendo a mutação P82A. Entre os clones que
apresentaram a banda correspondente à seqüência nucleotídica do cDNA do
receptor AT
1
após a análise de restrição, dois clones foram escolhidos para o
sequenciamento. Em um primeiro momento a mutação P82A foi realizada no vetor
pTEJ8; e posteriormente trocamos o cassete contendo a mutação para o vetor pAT
1
-
GFP, uma vez que queríamos verificar a localização celular do receptor mutante
quando expresso nas linhagens celulares utilizadas.
A análise de restrição com as enzimas BamHI e EcoRI foi realizada para
clones contendo a mutação P162A. Os resultados estão mostrados na Figura 8. Dois
clones possivelmente positivos foram escolhidos para realizar o sequenciamento.
Para os demais mutantes (P207A e P285A) não realizamos análises de restrição e
_______________________________________________________________________________Resultados
52
em torno de 10 clones foram diretamente seqüenciados para a confirmação da
mutação desejada.
Após a confirmação das mutações por sequenciamento (Figuras 9, 10, 11 e
12), os plasmídeos contendo os cDNAs codificando para o receptor AT
1
e para os
receptores mutantes foram amplificados e purificados por maxi-preparação
plasmidial (Eppendorf). Os DNAs plasmidiais do receptor AT
1
e dos mutantes foram
utilizados para a transfecção transiente em células COS-7 ou HEK 293T para
posteriores ensaios de “binding” e funcionais dos receptores.
_______________________________________________________________________________Resultados
53
Figura 7: Análise de restrição para possíveis clones para o mutante P82A. As
linhas de 1 a 6 mostram os DNAs plasmidiais digeridos com as enzimas de restrição
HindIII e BamHI. A seta indica a liberação da banda esperada, correspondente ao
cDNA codificando para o receptor AT
1
(1.100pb). Apenas a linha 3 não apresentou a
liberação do fragmento esperado. L (ladder 1kb plus, Invitrogen), padrão de peso
molecular. A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1% em tampão TAE.
Figura 8: Análise de restrição para possíveis clones para o mutante P162A. As
linhas 1 e 2 mostram os DNAs plasmidiais digeridos com as enzimas de restrição
BamHI e EcoRI. A seta indica a liberação da banda esperada, correspondente ao
cDNA codificando para o receptor AT
1
(1.100pb). L (ladder 1kb plus, Invitrogen),
padrão de peso molecular. A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1% em
tampão TAE.
L 1 2 3 4 5 6
L 1 2
_______________________________________________________________________________Resultados
54
Figura 9: Alinhamento das seqüências nucleotídicas do receptor AT
1
selvagem
(AT1) e do mutante P82A após o sequenciamento. A região em destaque indica
onde ocorreu a mutação. O códon original CCC foi mutado para GCC.
Figura 10: Alinhamento das seqüências nucleotídicas do receptor AT
1
selvagem (AT1) e do mutante P162A após o sequenciamento. A região em
destaque indica onde ocorreu a mutação. O códon original CCA foi mutado para
GCA.
_______________________________________________________________________________Resultados
55
Figura 11: Alinhamento das seqüências nucleotídicas do receptor AT
1
selvagem (AT1) e do mutante P207A após o sequenciamento. A região em
destaque indica onde ocorreu a mutação. O códon original CCT foi mutado para
GCT.
_______________________________________________________________________________Resultados
56
Figura 12: Alinhamento das seqüências nucleotídicas do receptor AT
1
selvagem (AT1) e do mutante P285A após o sequenciamento. A região em
destaque indica onde ocorreu a mutação. O códon original CCC foi mutado para
GCC.
_______________________________________________________________________________Resultados
57
Em relação aos mutantes P32A e P299A, realizamos várias tentativas para
obtê-los. Trabalhamos com diferentes oligonucleotídeos mutagênicos, porém não
obtivemos sucesso. Acreditamos que estes resíduos possam estar localizados em
uma região onde o plasmídeo assuma uma conformação não favorável ao acesso
da DNA polimerase. Outra possibilidade, embora menos provável, é que já
tenhamos conseguido, mas não detectado estes mutantes, uma vez que as
seqüências obtidas para os respectivos clones sempre foram duvidosas, fato
caracterizado pela presença de N na seqüência. Na análise do cromatograma não
conseguimos discriminar entre as bases nitrogenadas C ou G. Não conseguimos
solucionar o problema mesmo após a mudança de oligonucleotídeos e dos
reagentes para a realização de novos sequenciamentos.
Uma vez obtidos os receptores mutantes (P82A, P162A, P207A e P285A) do
receptor AT
1
e após a verificação da localização destes mutantes na membrana,
passamos para a realização dos ensaios de competição (“binding”) e funcionais
(medida da taxa de acidificação extracelular, mobilização de cálcio intracelular e
ativação de ERK) dos receptores mutantes.
2. Localização celular dos receptores por fluorescência
Após a transfecção transiente, células HEK 293T expressando o receptor AT
1
e os receptores mutantes fusionados à proteína fluorescente verde (GFP) foram
analisadas microscopicamente para verificarmos os padrões de localização dos
receptores. Na Figura 13A, temos células HEK 293T expressando o receptor AT
1
-
_______________________________________________________________________________Resultados
58
GFP; na Figura 13B, o mutante P82A; na Figura 13C, o mutante P162A; a Figura
13D mostra o mutante P207A e finalmente na Figura 13E, o mutante P285A.
Figura 13: Padrão de localização do receptor AT
1
selvagem e dos receptores
mutantes, fusionados à GFP, expressos em células HEK 293T. Imagens obtidas
através de microscopia confocal mostram a localização do receptor AT
1
selvagem
(A), mutante P82A (B), mutante P162A (C), mutante P207A (D) e mutante P285A
(E).
A B C
D E
_______________________________________________________________________________Resultados
59
3. Ensaio de “binding” com células inteiras
Conforme descrito em Materiais e Métodos, o ensaio de “binding” foi realizado
com células inteiras, 48 horas após a transfecção, período em que a expressão do
receptor AT
1
é máxima. As concentrações de AngII utilizadas variaram de 2x10
-6
M a
2x10
-11
M e cada ponto foi realizado em duplicata. Cada experimento foi realizado em
um mínimo de 3 vezes com células COS-7 e de 5 vezes com células HEK 293T. O
radioligante utilizado foi a
3
H-AngII (GE Healthcare).
A fusão da proteína GFP ao receptor AT
1
foi realizada para que pudéssemos
verificar o padrão de localização celular tanto do receptor AT
1
quanto dos mutantes
por meio de fluorescência. No entanto, esta proteína poderia interferir na afinidade
do ligante pelo receptor ou no processo de ativação celular. Assim, primeiramente
realizamos o ensaio de “binding” do receptor selvagem fusionado à GFP.
Trabalhamos com dois sistemas celulares, primeiramente com células COS-7 e
posteriormente com células HEK 293T. A Figura 14A mostra o perfil de competição
para o receptor selvagem, a Figura 14B, o perfil de competição para o receptor
fusionado a GFP e a Figura 14C, as duas curvas sobrepostas.
O mutante P82A foi subclonado no vetor pTEJ8 e posteriormente no vetor
pAT
1
-GFP. A Figura 15A mostra o perfil de competição para o receptor AT
1
selvagem, a Figura 15B para o mutante P82A e a Figura 15C, as duas curvas
sobrepostas. O mutante P162A foi subclonado no receptor pAT
1
-GFP. Na Figura
16A podemos verificar o perfil de competição para o receptor AT
1
fusionado a GFP.
A Figura 16B mostra o perfil de competição para o receptor mutante P162A e a
Figura 16C, as duas curvas sobrepostas.
_______________________________________________________________________________Resultados
60
Figura 14: Curvas de “binding” em ensaios de competição. A: curva de “binding”
para o receptor AT
1
selvagem, B: curva de “binding” para o receptor AT
1
fusionado a
GFP (AT
1
-GFP), C: as duas curvas sobrepostas. O rádio-ligante usado foi a
3
H-
AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. Este experimento foi realizado em células
COS-7. N= 3 experimentos independentes.
C
A
B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
AT
1
-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% do máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
log [AngII] M
3
H-AngII
% do máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
61
Figura 15: Curvas de “binding” em ensaios de competição. A: curva de “binding”
para o receptor AT
1
selvagem, B: curva de “binding” para o receptor mutante P82A,
C: as duas curvas sobrepostas. O rádio-ligante usado foi a
3
H-AngII, e o ligante frio
usado foi a AngII. Este experimento foi realizado em células COS-7. N= 3
experimentos independentes.
C
A B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P82A
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
P82A
log [AngII] M
3
H-AngII
Percentage max. binding
_______________________________________________________________________________Resultados
62
Figura 16: Curvas de “binding” em ensaios de competição. A: curva de “binding”
para o receptor AT
1
selvagem fusionado a GFP (AT
1
-GFP), B: curva de “binding”
para o receptor mutante P162A, C: as duas curvas sobrepostas. O rádio-ligante
usado foi a
3
H-AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. Este experimento foi realizado
em células COS-7. N= 3 experimentos independentes.
A B
C
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P162A
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P162A
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
63
Realizamos também o ensaio de fosforilação da proteína ERK1/2 para
verificar a ativação da cascata MAPK no receptor selvagem e nos mutantes.
Entretanto, não conseguíamos resultados sempre reprodutíveis utilizando células
COS-7, além disso, em nossos experimentos, o nível de fosforilação desta proteína
nos controles foi muito alto. Por estas razões, resolvemos realizar este ensaio com
células HEK 293T. Porém, para que pudéssemos melhor interpretar os parâmetros
de análise funcional e de ativação do receptor selvagem e dos mutantes, resolvemos
realizar os demais ensaios também neste sistema celular. A Figura 17 mostra o
ensaio de binding para o receptor AT
1
fusionado à GFP. As Figuras 18, 19, 20 e 21
mostram os ensaios de binding para os mutantes P82A, P162A, P207A e P285A,
respectivamente. Para melhor visualização e comparação, as curvas do receptor
AT
1
-GFP e de cada um dos receptores mutantes foram sobrepostas. A Tabela 3
resume os resultados das curvas de competição da AngII para o receptor AT
1
-GFP e
para os mutantes nos dois sistemas celulares que utilizamos.
Figura 17: Curva de binding em ensaios de competição. Curva de binding para o
receptor AT
1
fusionado à GFP (AT
1
-GFP). O rádio-ligante usado foi a H
3
-AngII, e o
ligante frio usado foi a AngII. O experimento foi realizado com células HEK 293T. N=
5 experimentos independentes realizados em duplicata.
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
64
Figura 18: Curvas de binding em ensaios de competição. A: curva de binding
para o mutante P82A. B: curvas do receptor AT
1
-GFP e do mutante sobrepostas. O
rádio-ligante usado foi a H
3
-AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. O experimento foi
realizado com células HEK 293T. N= 5 experimentos independentes realizados em
duplicata.
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P82A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
A
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P82A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
B
_______________________________________________________________________________Resultados
65
Figura 19: Curvas de binding em ensaios de competição. A: curva de binding
para o mutante P162A. B: curvas do receptor AT
1
-GFP e do mutante sobrepostas. O
rádio-ligante usado foi a H
3
-AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. O experimento foi
realizado com células HEK 293T. N= 4 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT1-GFP
P162A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P162A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
66
Figura 20: Curvas de binding em ensaios de competição. A: curva de binding
para o mutante P207A. B: curvas do receptor AT
1
-GFP e do mutante sobrepostas. O
rádio-ligante usado foi a H
3
-AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. O experimento foi
realizado com células HEK 293T. N= 4 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT1-GFP
P207A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P207A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
67
Figura 21: Curvas de binding em ensaios de competição. A: curva de binding
para o mutante P285A. B: curvas do receptor AT
1
-GFP e do mutante sobrepostas. O
rádio-ligante usado foi a H
3
-AngII, e o ligante frio usado foi a AngII. O experimento foi
realizado com células HEK 293T. N= 4 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
AT1-GFP
P285A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
125
P285A-GFP
log [AngII] M
3
H-AngII
% máximo de ligação
_______________________________________________________________________________Resultados
68
Tabela 3. Ensaios de “binding” por competição para o receptor AT
1
-GFP e mutantes
Receptor
AT
1
-GFP 0.8±0.13 ---- 3.1 35±3.4 ---- 130
P82A-GFP 1.8±0.16 2.3 5.1 195±36 5.6 220
P162A-GFP 1.13±0.15 1.4 0.6 17±2.9 0.49 30
P207A-GFP NR NR NR 244±35 6.97 460
P285A-GFP NR NR NR 3.5±0.15 0.1 10
Os valores, as médias±erro padrão, são mostrados. F
mut
é a razão dos valores de
IC
50
para os mutantes em relação ao valor de IC
50
obtido para o receptor AT
1
-GFP.
B
max
é o número de receptores expressos na célula. Em células COS-7 realizamos 3
experimentos independentes, em duplicata e em células HEK 293T realizamos 4
experimentos independentes, em duplicata. NR, não realizado.
4. Medida da taxa de acidificação extracelular
O efeito da AngII após a interação com os receptores AT
1
selvagem ou
mutantes leva a variações na acidificação celular. Para este ensaio de ativação
funcional, utilizou-se o microfisiômetro Cytosensor (Molecular Devices, CA) através
de método descrito por McConnel e colaboradores (1992), como mencionado em
Materiais e Métodos.
Como mostra a Figura 22, a fusão da proteína GFP ao receptor AT
1
não
interfere na transdução do sinal, uma vez que as curvas de ativação para os dois
receptores, mediante estímulo com diferentes concentrações de AngII, são muito
HEK 293T
AngII
IC
50
(nM) IC
50
(nM) F
mut
F
mut
B
max
(fmol/10
5
cels)
B
max
(fmol/10
5
cels)
COS-7
_______________________________________________________________________________Resultados
69
similares. Entretanto, a mutação P82A reduziu severamente a transdução do sinal,
como podemos ver na Figura 23. Em relação ao mutante P162A a transdução do
sinal foi similar à curva de acidificação extracelular do receptor AT
1
fusionado à GFP
(Figura 24). Os ensaios comentados acima foram realizados em células COS-7.
Figura 22: Efeito da AngII em ensaios de acidificação extracelular. A ativação é
expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação obtidos para cada
receptor. O ensaio de acidificação celular foi realizado com células COS-7,
transfectadas transitoriamente, expressando os receptores AT
1
selvagem (AT
1
) e
AT
1
fusionado à GFP (AT
1
-GFP).
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
AT
1
AT
1
-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
70
Figura 23: Efeito da AngII em ensaios de acidificação extracelular. A ativação é
expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação obtido para o
receptor AT
1
-GFP. Os ensaios de acidificação celular foram realizados com células
COS-7, transfectadas transitoriamente, expressando o receptor AT
1
-GFP e o
mutante P82A.
Figura 24: Efeito da AngII em ensaios de acidificação extracelular. A ativação é
expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação obtidos para o
receptor AT
1
-GFP. Os ensaios de acidificação celular foram realizados com células
COS-7, transfectadas transitoriamente, expressando o receptor AT
1
-GFP e o
mutante P162A.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P82A
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P162A
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
71
Ensaios de acidificação extracelular também foram realizados com células
HEK 293T. A Figura 25 mostra a curva de acidificação extracelular obtida para o
receptor AT
1
-GFP. As Figuras 26, 27, 28 e 29 mostram as curvas de acidificação
extracelular obtidas para os mutantes P82A, P162A, P207A e P285A
respectivamente. Para melhor podermos comparar os resultados obtidos, as curvas
para os mutantes foram sobrepostas ao receptor AT
1
-GFP.
Figura 25: Efeito da AngII em ensaios de acidificação celular. A ativação é
expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação obtidos o receptor
AT
1
-GFP. O ensaio de acidificação celular foi realizado com células HEK 293T,
transfectadas transientemente, expressando o receptor AT
1
-GFP. N= 4
experimentos independentes.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
-50
-25
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
72
Figura 26: Efeito da AngII em ensaios de acidificação celular. A: ativação para o
mutante P82A expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação
obtidos para o receptor AT
1
fusionado à GFP. B: as duas curvas sobrepostas. Os
ensaios de acidificação celular foram realizados com células HEK 293T
transientemente transfectadas. N= 2 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P82A-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
73
Figura 27: Efeito da AngII em ensaios de acidificação celular. A: ativação para o
mutante P162A expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação
obtidos para o receptor AT
1
fusionado à GFP. B: as duas curvas sobrepostas. Os
ensaios de acidificação celular foram realizados com células HEK 293T
transientemente transfectadas. N= 2 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P162A-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
P162A-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
74
Figura 28: Efeito da AngII em ensaios de acidificação celular. A: ativação para o
mutante P207A expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação
obtidos para o receptor AT
1
fusionado à GFP. B: as duas curvas sobrepostas. Os
ensaios de acidificação celular foram realizados com células HEK 293T
transientemente transfectadas. N= 2 experimentos independentes realizados em
duplicata.
A
B
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P207A
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
P207A
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
75
Figura 29: Efeito da AngII em ensaios de acidificação celular. A: ativação para o
mutante P285A expressa como porcentagem dos valores máximos de ativação
obtidos para o receptor AT
1
fusionado à GFP. B: as duas curvas sobrepostas. Os
ensaios de acidificação celular foram realizados com células HEK 293T
transientemente transfectadas. N= 2 experimentos independentes realizados em
duplicata.
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4
-50
-25
0
25
50
75
100
125
log [angII] M
Taxa de acidificação, %
A
B
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
-50
-25
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P285A-GFP
log [AngII] M
Taxa de acidificação, %
_______________________________________________________________________________Resultados
76
A Tabela 4 resume os dados encontrados para o receptor AT
1
-GFP e para os
mutantes P82A e P162A ao trabalharmos com células COS-7 e HEK 293T.
Tabela 4: Análise funcional por acidificação extracelular do receptor AT
1
-GFP e
mutantes estimulados com AngII
Receptor
AT
1
-GFP 110±12 ----- 100 36±3.3 ----- 100
P82A-GFP 1698±220 15.4 27.6 1975±387 54.8 69.3
P162A-GFP 116±15 1.1 122 45±3.7 1.25 76.2
P207A-GFP NR NR NR 129±7.3 3.6 4.1
P285A-GFP NR NR NR 96±2 2.7 60
Os valores são as médias±erro padrão. F
mut
é a razão dos valores de EC
50
para os
mutantes em relação ao valor de EC
50
obtido para o receptor AT
1
-GFP. Em células
COS-7 foram realizados 3 experimentos independentes realizados em duplicata e
em células HEK 293T foram realizados 2 experimentos independentes realizados em
duplicata. NR, não realizado.
5. Mobilização de cálcio intracelular
Um outro ensaio funcional que realizamoas foi a mobilização de cálcio
intracelular. A Figura 30 mostra os resultados de mobilização de cálcio intracelular,
obtidos após a realização de um experimento piloto, onde as condições ótimas para
a realização do experimento foram determinadas. Nesta Figura, o gráfico em barras
representa a razão (F340 nm/F380 nm) da fluorescência da sonda FURA-2 (5
µM)
HEK 293T
COS-7
AngII
EC
50
(nM) EC
50
(nM) F
mut
E
max
F
mut
E
max
AngII
_______________________________________________________________________________Resultados
77
em função da variação da razão F340nm/F380nm máxima (100%) induzida com
AngII 1
µM. Podemos verificar que o receptor AT
1
-GFP é capaz de induzir o aumento
de cálcio intracelular após estímulo com a AngII, o mesmo ocorrendo com o mutante
P162A. Entretanto, o mutante P82A não foi capaz de provocar o aumento de cálcio
intracelular.
Os demais ensaios para a verificação de mobilização de cálcio intracelular
foram realizados no microscópio confocal, utilizando a sonda Fluo 3. A Figura 31A
mostra a variação de fluorescência quando adicionamos AngII 1
µM em células HEK
293T transfectadas com o receptor AT
1
-GFP em comparação com células não
transfectadas. A Figura 31B, mostra os resultados obtidos para o receptor AT
1
-GFP
plotados em gráfico.
Em relação ao mutante P82A, como podemos observar pela Figura 32, não
houve variação no sinal de fluorescência quando as células foram estimuladas com
a AngII. Como verificado também utilizando a sonda FURA-2, o mutante P82A não
foi capaz de mobilizar cálcio intracelular.
A Figura 33A mostra a variação no sinal de fluorescência quando células
transfectadas transientemente com o receptor mutante P162A foram estimuladas
com a AngII. A Figura 33B, mostra o resultado plotado em gráfico comparado aos
valores obtidos para o receptor AT
1
-GFP.
Um resultado extremamente interessante foi a verificação de ativação
constitutiva do mutante P207A, o qual apresentou uma variação na mobilização de
cálcio na ausência de estímulo com a AngII (Figura 34A). Além disso, o mesmo
mutante não apresentou nenhuma resposta ao ser estimulado com o agonista como
podemos verificar na Figura 34A. Para verificarmos se haveria alguma modificação
na dinâmica de mobilização de cálcio intracelular, este mutante foi incubado com
_______________________________________________________________________________Resultados
78
Losartan durante 20min e estimulado posteriormente com a AngII. Podemos verificar
através da Figura 34B que este mutante não mais exibe atividade constitutiva e
também não responde ao estímulo com o agonista. A Figura 34C mostra a ativação
constitutiva do mutante P207A comparada ao receptor AT
1
-GFP quando este último
foi estimulado com AngII 1
µM.
A Figura 35A mostra a variação no sinal de fluorescência quando células HEK
293T foram transfectadas transientemente com o receptor mutante P285A e a Figura
35B mostra os valores obtidos para a mobilização de cálcio, comparados aos valores
do receptor AT
1
-GFP, quando houve o estímulo com a AngII.
Figura 30. Efeito de AngII sobre a razão de fluorescência emitida por FURA-2
(F340nm/F380nm). As células foram estimuladas com 1
µM de AngII. O gráfico em
barras representa a razão (F340 nm/F380 nm) da fluorescência da sonda FURA-2
(5
µM) em função da variação da razão F340 nm/F380 nm máxima (100%) induzida
com AngII (1
µM). N=3 experimentos realizados em duplicata.
A
T1-G
F
P
P
8
2A
-G
F
P
P16
2A
-G
F
P
0
25
50
75
100
125
AngII 1µM
Razão Fluorescência
F340/F380 (%)
_______________________________________________________________________________Resultados
79
Figura 31. Efeito de AngII sobre a fluorescência emitida por Fluo-3. A: Células
não transfectadas (Controle) e células HEK 293T transfectadas com o receptor AT
1
-
GFP foram estimuladas com 1
µM de AngII. B: Gráfico em barras representando a
fluorescência da sonda Fluo-3 (1
µM) quando as células foram estimuladas com
AngII 1
µM. N= 4 experimentos realizados em duplicata.
Controle AT1-GFP
0
25
50
75
100
125
Controle
AT
1
-GFP
AngII 1µM
∆
Fluorescência, %
A
B
_______________________________________________________________________________Resultados
80
Figura 32. Efeito de AngII sobre a fluorescência emitida por Fluo-3. A: Células
transfectadas com o receptor mutante P82A-GFP foram estimuladas com 1
µM de
AngII. B: Gráfico em barras representando a fluorescência para o mutante P82A-
GFP comparado ao valor obtido para o receptor AT
1
-GFP, após estímulo com AngII
1
µM. N= 4 experimentos realizados em duplicata.
AT1-GFP P82A
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P82A
AngII 1µM
∆
Fluorescência, %
A
B
_______________________________________________________________________________Resultados
81
Figura 33. Efeito de AngII sobre a fluorescência emitida por Fluo 3. A: Células
transfectadas com o receptor mutante P162A-GFP foram estimuladas com 1
µM de
AngII. B: gráfico em barras representando a fluorescência para o mutante P162A-
GFP comparado ao valor obtido para o receptor AT
1
-GFP, após estímulo com AngII
1
µM. N= 4 experimentos realizados em duplicata.
AT1-GFP P162A-GFP
0
25
50
75
100
125
AT1-GFP
P162A-GFP
AngII 1µM
∆
Fluorescência, %
A
B
_______________________________________________________________________________Resultados
82
Figura 34. Efeito de AngII 1
µM sobre a fluorescência emitida por Flu-3. A:
Células transfectadas com o receptor mutante P207A-GFP mostrando ativação
constitutiva antes do estímulo com 1
µM de AngII. B: Células transfectadas com o
receptor mutante P207A-GFP foram incubadas previamente com Losartan antes do
estímulo com 1
µM de AngII. C: gráfico em barras representando a fluorescência
para o mutante P207A-GFP comparado ao valor obtido para o receptor AT
1
-GFP,
após este último ser estimulado com AngII 1
µM. N= 4 experimentos realizados em
duplicata.
AT1-GFP P207A-GFP
0
25
50
75
100
125
AT1-GFP
P207A-GFP
AngII 1µM
∆
Fluorescência, %
A
B
C
_______________________________________________________________________________Resultados
83
Figura 35. Efeito de AngII sobre a fluorescência emitida por Fluo-3. A: Células
transfectadas com o receptor mutante P285A-GFP foram estimuladas com 1
µM de
AngII. B: gráfico em barras representando a fluorescência para o mutante P285A-
GFP comparado ao valor obtido para o receptor AT
1
-GFP, após estímulo com AngII
1
µM. N= 4 experimentos realizados em duplicata.
AT1-GFP P285A-GFP
0
25
50
75
100
125
AT
1
-GFP
P285A-GFP
AngII 1µM
∆
Fluorescência, %
A
B
_______________________________________________________________________________Resultados
84
6. Ensaio de fosforilação de ERK1/2
A nossa proposta inicial foi a análise da participação de resíduos de prolina do
receptor AT
1
localizados nas regiões de α-hélices transmembranares no processo
clássico de transdução do sinal via a ativação da proteína G. Com as evidências
crescentes da participação da AngII no desenvolvimento de diversas patologias,
sendo que grande parte destas patologias envolve a participação de cascatas
MAPK, decidimos analisar nossos mutantes também em relação ao processo de
ativação de ERK, com o objetivo de enriquecer nossa proposta inicial. Esta
metodologia foi padronizada e por mim desenvolvida durante o estágio realizado na
cidade de Toulouse, França, sob a supervisão dos Drs. Jean Loup Bascands e Joost
P. Schanstra.
Para o ensaio de ativação de ERK vários parâmetros tiveram que ser
ajustados no laboratório em Toulouse. Primeiramente, tivemos que ajustar o número
de células necessárias para o ensaio. Posteriormente, realizamos transfecção de
células COS-7 com fosfato de cálcio, como era realizado em nosso laboratório no
Brasil. Entretanto, a eficiência de transfecção foi baixa tornando inviável a realização
do ensaio, pois para verificar fosforilação de ERK através de western blot, a
eficiência de transfecção deve ser no mínimo 30%. Desta forma, passamos a utilizar
o reagente jetPEI (Polyplus transfection) para a transfecção. No primeiro
experimento as células foram deixadas em contato com este reagente durante 44h e
ao final deste período foram deprivadas de soro fetal bovino durante mais 20h
adicionais. Apesar da melhora substancial da eficiência de transfecção com a
utilização deste reagente, ao realizarmos o western blot verificamos que o controle
positivo do experimento (PMA) não levava à fosforilação de ERK, indicando que as
_______________________________________________________________________________Resultados
85
células não estavam funcionalmente adequadas. Passamos então a deixar as
células em contato com o reagente de transfecção por 6h, sendo que ao final deste
período o reagente era retirado e novo meio de cultura era adicionado às células.
Depois de 48h, as células eram incubadas em DMEM contendo 0,5% de soro fetal
bovino por 20h. Houve a necessidade de deprivar as células deixando o mínimo de
soro fetal bovino porque com a deprivação total de soro muitas células morriam e
não conseguíamos o número suficiente de células para a realização do ensaio.
Finalmente, após estes ajustes conseguimos estabelecer os parâmetros necessários
para a realização do ensaio de ativação de ERK.
Na Figura 36 temos o resultado do western blot contra ERK total e contra
pERK para o receptor AT
1
-GFP, juntamente com o gráfico mostrando a razão de
número de vezes de aumento da pERK comparada com o controle (ausência de
estímulo com AngII). Para este gráfico, a normalização foi realizada dividindo-se os
valores densitométricos de pERK por aqueles de ERK total.
Uma vez que os ensaios de acidificação extracelular e mobilização de cálcio
intracelular realizados para o mutante P82A mostraram uma severa redução na
transdução do sinal via a ativação da via clássica, isto é, a ativação da proteína G
q
,
quando estimulado com a AngII, resolvemos verificar se os requerimentos estruturais
para a ativação da cascata MAPK, via a fosforilação de ERK através de estímulo
com AngII, poderiam ser atingidas por este mutante. A Figura 37 mostra o western
blot para ERK total e para pERK para o mutante P82A, quando as células foram
transfectadas com o referido mutante. No gráfico, temos a razão do número de
vezes de aumento da pERK quando comparada ao controle. Da mesma forma, o
ensaio de ativação de ERK também foi realizado para o mutante P162A. A Figura 38
mostra o western blot para ERK total e para pERK após estímulo com AngII para o
_______________________________________________________________________________Resultados
86
referido mutante. No gráfico, temos o número de vezes de aumento da pERK
quando comparada ao controle.
Figura 36: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células COS-7 transientemente transfectadas com o receptor AT
1
-GFP. Os
resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 4 experimentos independentes.
C102030
0
100
200
300
Tempo (min)
pERK (% em rel. ao
controle)
p
ERK
ERK total
A
n
g
II 1
µ
M
- + + +
_______________________________________________________________________________Resultados
87
Figura 37: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células COS-7 transfectadas com o mutante P82A. Os resultados são
mostrados como a razão dos valores densitométricos de pERK/ERK1/2 em relação
ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são apenas ilustrativos, dentro
de um N= 3 experimentos independentes.
ERK total
C 102030
0
100
200
300
Tempo (min)
pERK (% em rel. ao
controle)
p
ERK
A
n
g
II 1
µ
M
- + + +
_______________________________________________________________________________Resultados
88
Figura 38: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células COS-7 transfectadas com o mutante P162A-GFP. Os resultados são
mostrados como a razão dos valores densitométricos de pERK/ERK1/2 em relação
ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são apenas ilustrativos, dentro
de um N= 3 experimentos independentes.
pERK
C102030
0
100
200
300
Tempo (min)
pERK (% em rel/ ao
controle)
A
n
g
II 1
µ
M
ERK total
- + + +
_______________________________________________________________________________Resultados
89
Para os ensaios de ativação de ERK, trabalhamos também com células HEK
293T por ser se tratar de um sistema onde se obtém uma melhor eficiência de
transfecção, além do nível de fosforilação dos controles ser menor neste sistema
celular em nossos experimentos. As Figuras 39, 40, 41, 42 e 43 mostram os
resultados para ativação de ERK para o receptor AT
1
-GFP e para os mutantes
P82A, P162A, P207A e P285A, respectivamente.
Todos os experimentos de fosforilação de ERK1/2 com células HEK 293T
foram realizados no Brasil.
_______________________________________________________________________________Resultados
90
Figura 39: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células HEK 293T transientemente transfectadas com o receptor AT
1
-GFP.
Os resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 3 experimentos independentes.
(*) p<0.05 comparado ao controle.
30 10 20 30
0
100
200
300
Tempo (min)
Fosforilaão de ERK
(% em rel. ao controle)
pERK
ERK total
AngII 1µM
- + + +
*
*
C
_______________________________________________________________________________Resultados
91
Figura 40: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células HEK 293T transientemente transfectadas com o receptor P82A-GFP.
Os resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 3 experimentos independentes.
(*) p<0.05 comparado ao controle.
30 10 20 30
0
100
200
300
Tempo (min)
% Fosforilação ERK
(em rel. ao controle)
pERK
ERK total
- + + +
AngII 1
µ
M
*
*
C
_______________________________________________________________________________Resultados
92
Figura 41: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células HEK 293T transientemente transfectadas com o receptor P162A-
GFP. Os resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 3 experimentos independentes.
(*) p<0.05 comparado ao controle.
30 10 20 30
0
100
200
300
Tempo (min)
% Fosforilação ERK
(em re. ao controle)
pERK
ERK total
AngII 1
µ
M
- + + +
*
C
_______________________________________________________________________________Resultados
93
Figura 42: Efeito tempo-dependente de AngII 1µM na fosforilação de ERK1/2
em células HEK 293T transientemente transfectadas com o receptor P207A-
GFP. Os resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 3 experimentos independentes.
(*) p<0.05 comparado ao controle.
30 10 20 30
0
100
200
300
Tempo (min)
% Fosforilação ERK
(em rel. ao controle)
pERK
ERK total
AngII 1µM
- + + +
*
C
_______________________________________________________________________________Resultados
94
Figura 43: Efeito tempo-dependente de AngII 1
µM na fosforilação de ERK1/2
em células HEK 293T transientemente transfectadas com o receptor P285A-
GFP. Os resultados são mostrados como a razão dos valores densitométricos de
pERK/ERK1/2 em relação ao controle. Os westerns blots para ERK total e pERK são
apenas ilustrativos, dentro de um N= 3 experimentos independentes.
30 10 20 30
0
100
200
300
400
500
Tempo (min)
% Fosforilação ERK
(em rel. ao controle)
ERK total
pERK
AngII 1µM
- + + +
C
________________________________________________________________________________Discussão
95
DISCUSSÃO
O SRA tem ganhado ênfase na participação em diversas patologias, além de
seu papel clássico no controle da pressão sanguínea e equilíbrio hidroeletrolítico
como apresentado na Introdução. Dentro deste sistema, a AngII parece ser a
principal molécula efetora, desempenhando seu papel principalmente através da
ativação do receptor AT
1
.
O receptor AT
1
tem sido intensamente estudado em relação aos resíduos de
aminoácidos importantes para a ligação do ligante, para a transdução de sinal e
também aqueles relacionados à ativação da proteína G. O receptor AT
1
é um GPCR,
e como tal, os resíduos de aminoácidos implicados na transdução de sinal são
aqueles localizados nas regiões das 7TMs.
Com o objetivo de estudar a transdução de sinal desencadeada pelo receptor
AT
1
e observando as 7TMs, notamos que nestas regiões, resíduos de prolina
aparecem em grande número, padrão diferente das regiões em
α-hélice da maioria
das proteínas, uma vez que este aminoácido é um terminador clássico de
α-hélices.
Ainda, realizando o alinhamento entre seqüências do receptor AT
1
de algumas
espécies, observamos que estes resíduos são extremamente conservados (Figura
5), o que reforçou nossa hipótese de que estes resíduos pudessem participar da
transdução de sinal desencadeada pelo receptor AT
1
mediante a ligação da AngII.
Para a investigação das propriedades bioquímicas e farmacológicas do
receptor AT
1
, é necessário que sua expressão seja realizada em um sistema celular
compatível que propicie desde sua expressão até o posicionamento tridimensional
correto na membrana plasmática. Para a expressão de genes eucarióticos, a
________________________________________________________________________________Discussão
96
escolha preferencial é de uma linhagem de células de mamíferos, com maquinaria
celular completa, mas que não possua os genes da proteína em estudo.
Trabalhamos com dois sistemas celulares, COS-7 e HEK 293T, como já
comentamos. Células COS-7 são derivadas de células CV-1, que por sua vez são
originárias de células de rim de macaco verde africano. As células CV-1 foram
transformadas com uma região “ori” SV40 defeituosa, a qual está integrada ao
sistema genômico da célula. Uma vez transformadas com um vetor que contenha
essa região “ori” intacta, essas células passam a sintetizar a proteína normalmente.
Para este estudo foram usadas células COS-7 com expressão transiente dos
receptores selvagem e mutantes estudados.
O outro sistema celular que utilizamos foram células HEK 293T. Estas células
são de uma linhagem de células epiteliais originariamente derivadas de rim
embrionário humano e também são conhecidas como células HEK, HEK 293 ou
simplesmente 293. O amplo uso desta linhagem é devido à facilidade de transfecção
pelo método de fosfato de cálcio, que alcança uma eficiência próxima de 100%
quando se utiliza tampão PBS e uma eficiência um pouco menor quando se utiliza
tampão HBS. Exatamente por este motivo passamos a trabalhar com esta linhagem,
uma vez que o ensaio funcional de fosforilação de ERK exige uma eficiência de
transfecção de no mínimo 30%, o que não estávamos conseguindo alcançar com as
células COS-7.
Definidos os sistemas celulares, nosso primeiro passo foi verificar se os
receptores mutantes apresentavam localização membranar, pois como mencionado
na Introdução, um dos controles de qualidade celular é a retenção de receptores mal
enovelados no retículo endoplasmático (Santos et al., 2007). Tanto o receptor AT
1
selvagem quanto os receptores mutantes foram produzidos fusionados à proteína
________________________________________________________________________________Discussão
97
GFP. Após a análise microscópica, observamos que tanto o receptor selvagem
quanto os receptores mutantes apresentaram localização na membrana celular com
presença também de sinal nuclear, como pode ser observado na Figura 13.
Semelhantemente, Lee e colaboradores (2004) também encontraram uma
distribuição nuclear para o receptor AT
1
trabalhando com células HEK 293T.
Trabalhando com células HEK 293T, Hunyady e colaboradores (2002) também
verificaram a localização intracelular do receptor AT
1
fusionado à GFP,
especialmente em células apresentando altos níveis de expressão do receptor. Uma
hipótese para o sinal nuclear poderia estar relacionada ao sistema de degradação
de proteínas via ubiquitina-proteassoma (o qual apresenta localização nuclear), pois
como podemos observar os receptores apresentaram alto nível de expressão.
Uma vez verificado o padrão de localização dos receptores, podemos inferir
que os receptores estão corretamente enovelados, pois foram capazes de alcançar a
membrana celular. Após verificarmos que todos os mutantes estavam localizados na
membrana celular, passamos a realizar os ensaios de “binding” e funcionais dos
mesmos.
Os ensaios de “binding” por competição utilizando a
3
H-AngII e AngII
mostraram que a fusão da proteína GFP ao receptor praticamente não interfere na
ligação do peptídeo ao receptor (Figura 14, Tabela 3). Em relação aos mutantes
P82A e P207A (Figuras 15 e 18, para o mutante P82A e Figura 20 para o mutante
P207A, Tabela 3), podemos verificar uma pequena diminuição na afinidade do
peptídeo AngII pelos mutantes quando comparados ao receptor selvagem. Para o
mutante P162A, o padrão de ligação do peptídeo AngII é semelhante à ligação que
este peptídeo apresenta ao receptor selvagem fusionado à GFP (Figuras 16 e 19,
Tabela 3) e um leve aumento na afinidade do peptídeo AngII ao mutante P285A
________________________________________________________________________________Discussão
98
pode ser observado (veja Figura 21, Tabela 3). Entretanto, a magnitude da
diminuição da afinidade da AngII aos mutantes P82A e P207A, e a magnitude do
aumento da afinidade deste peptídeo aos mutantes P162A e P285A não são
significativas (veja
F
mut
, Tabela 3).
Uma vez caracterizados os mutantes em termos da afinidade da ligação da
AngII, passamos a realizar os ensaios funcionais de acidificação extracelular,
mobilização de cálcio intracelular e fosforilação de ERK.
A fusão da proteína GFP ao receptor AT
1
não interfere com a acidificação
extracelular (Figuras 22 e 25) e nem com a mobilização de cálcio intracelular
(Figuras 30 e 31). Em relação ao mutante P162A, os valores de acidificação
extracelular em células COS-7 foram semelhantes aos valores obtidos para o
receptor AT
1
(Figura 24, Tabela 4). Quando trabalhamos com células HEK 293T, os
valores obtidos para o mutante P162A se mostraram um pouco alterados quando
comparados aos obtidos utilizando-se células COS-7. Para este mutante, o máximo
de ativação foi ao redor 76% em células HEK 293T, com perfil de ativação
semelhante ao receptor selvagem. Este comportamento também é evidenciado
pelos valores de
F
mut
para EC
50
(ver Tabela 4).
Como se trata de sistemas celulares diferentes, estes resultados distintos,
porém não conflitantes, não foram surpresa um resultado diferente, porém não
conflitante, não foi surpresa. Feng e colaboradores (2005) mostraram que mutações
nos resíduos de aminoácidos Asn
295
e Leu
305
na TM VII do receptor AT
1
propiciavam
que estes receptores mutantes possuissem afinidade não só pelo peptídeo AngII,
mas também para alguns de seus fragmentos, tais como Ang1-7, AngIV, e Ang5-8,
os quais eram inativos para o receptor selvagem. Estes autores verificaram que a
expressão dos mutantes N295S e L305Q levava a uma produção de IP
3
aumentada
________________________________________________________________________________Discussão
99
na ausência de AngII exógena, quando expressos em células HEK 293T, porém esta
atividade constitutiva desaparecia quando estes mutantes eram expressos em
células COS-7, demonstrando que diferentes respostas podem ser obtidas,
dependendo do sistema celular utilizado. Em relação aos nossos dados, devemos
observar que mesmo com valores de EC
50
diferentes, o perfil de ativação para o
mutante P162A foi o mesmo nos dois sistemas celulares utilizados (Figuras 24 e 27).
Em relação ao ensaio de mobilização de cálcio intracelular realizado em
células HEK 293T, verificamos uma variação menor na mobilização deste íon em
células transfectadas com o receptor mutante P162A quando comparada ao receptor
selvagem (Figuras 30 e 33), corroborando com os dados de acidificação extracelular.
O mutante P285A apresentou ligeira diminuição tanto do valor máximo de
acidificação extracelular (Figura 29, Tabela 4) quanto da mobilização de cálcio
intracelular (Figura 35) quando comparado ao receptor selvagem. Para este
mutante, o máximo de acidificação extracelular foi de 60%, sendo capaz de mobilizar
50% do cálcio intraceluar, quando comparado ao receptor selvagem.
Com relação ao mutante P82A, o ensaio de acidificação extracelular realizado
em células COS-7 mostra uma drástica diminuição na transdução de sinal quando
este receptor mutante foi estimulado com diferentes concentrações de AngII (Figura
23, Tabela 4). Poderia-se questionar se a diminuição na transdução do sinal neste
mutante não seria conseqüência da diminuição da afinidade da AngII pelo referido
mutante. Apesar de verificarmos uma diminuição na afinidade de AngII por este
mutante, o grau de diminuição da afinidade do agonista pelo receptor, que foi muito
pequeno, não explica a grande redução de funcionalidade observada no ensaio de
acidificação extracelular, extrapolado aqui para o processo de ativação clássica do
receptor.
________________________________________________________________________________Discussão
100
Como descrito na Introdução, os resíduos envolvidos com a transdução do
sinal são aqueles localizados nas 7TMs e o processo de ativação tem sido
associado com a transição da estrutura do receptor de uma forma inativa com
restrições estruturais para um estado ativo mais expandido (Leff, 1995, Lew e
Ziogas, 2004) onde ocorre o rompimento destas restrições. A mutação P82A reduziu
severamente a transdução do sinal, sugerindo um papel relevante deste resíduo de
prolina nesse processo. O resíduo Pro
82
está localizado na TM II, que tem sido
mostrado por alguns grupos de pesquisadores participar no processo de ativação do
receptor AT
1
. Miura et al. (2003) evidenciaram que o movimento desta TM tem um
papel em regular o estado ativado do receptor AT
1
. De modo semelhante, Boucard
et al. (2003) registraram que a TM VII apresenta um padrão de movimento
necessário para a ativação do receptor, e sugerem ocorrer interações entre as TM
III, TM II e TM VII, envolvendo os resíduos de aminoácidos Asn
111
-Asp
74
-Asn
298
.
Com base em nossos resultados, acreditamos que o resíduo de prolina 82 possa
estar diretamente envolvido no processo de transdução de sinal por gerar uma
“dobra” na TM II que seria responsável pelo arranjo correto dos resíduos de ligação.
Além disso, devido à presença deste resíduo, o grupo carbonila da cadeia principal
da Phe
77
não está fazendo a ponte de hidrogênio correspondente na estrutura em α-
hélice da TM II do receptor AT
1
, sendo então capaz de participar do mecanismo de
ativação do receptor possivelmente através da interação com os resíduos Asn
111
ou
Ser
107
da TM III. A mutação P82A aparentemente abole estes efeitos. A Figura 44
mostra uma representação por modelagem molecular, indicando estas interações.
Tal requerimento estrutural para sinalização pode ser extrapolado para outros
GPCRs uma vez que este resíduo de prolina é altamente conservado entre os
GPCRs (Reis et al., 2007).
________________________________________________________________________________Discussão
101
Ao trabalharmos com células HEK 293T no ensaio de acidificação
extracelular, observamos que também houve diminuição na transdução de sinal,
entretanto o valor máximo de ativação obtido neste ensaio para o mutante P82A foi
mais elevado. Enquanto em COS-7 conseguimos uma ativação máxima ao redor de
27% (Figura 23, Tabela 4), em células HEK 293T, essa ativação alcançou 69%
(Figura 26, Tabela 4). Entretanto, embora um nível maior de ativação tenha ocorrido
em células HEK 293T, a razão dos valores de EC
50
do mutante P82A em relação ao
receptor selvagem foi de 54 vezes (
F
mut
, ver Tabela 4), enquanto que em células
COS-7 essa razão foi de 15 vezes (Reis et al., 2007). Esses dados confirmam a
deficiência deste mutante em desencadear eficientemente a transdução da via
clássica de sinalização em ensaios de acidificação extracelular. Além disso, os
ensaios de mobilização de cálcio intracelular também confirmam a deficiência da
ativação da via clássica de sinalização, uma vez que este mutante foi incapaz de
mobilizar este íon (Figuras 30 e 32) quando estimulado com AngII.
Em relação ao mutante P207A, como mostram as Figuras 28 e 34,
verificamos que este mutante foi incapaz de evocar a ativação da via clássica de
sinalização, evidenciado pelo ensaio de acidificação extracelular e mobilização de
cálcio intracelular, quando estimulado com a AngII. Entretanto, um dado
extremamente surpreendente foi a verificação de respostas espontâneas deste
mutante nestes dois ensaios funcionais na ausência de estímulo com o agonista,
indicando uma possível atividade constitutiva do mesmo (Figura 34A).
________________________________________________________________________________Discussão
102
Figura 44. Modelagem molecular de parte das regiões TM do receptor AT
1
. A
presença da Pro
82
propicia um enfraquecimento estrutural que tende a favorecer
uma “dobra” na hélice. São mostrados os grupos carbonila da Phe
77
e possíveis
resíduos (Ser
107
e Asn
111
) que podem participar da interação (Reis et al., 2007).
________________________________________________________________________________Discussão
103
A ativação fisiológica do receptor é desencadeada pela ligação do agonista,
mas a ativação constitutiva do receptor ocorre na ausência do estímulo do agonista
devido a mutações na cadeia lateral e outras modificações da estrutura de GPCRs
(Pauwels e Wurch, 1998). Enquanto a ativação fisiológica do receptor devido à
ligação do agonista leva a uma grande expansão do receptor, a ativação
constitutiva, devido a mutações de determinados resíduos em diferentes sítios das
7TMs, leva a diferentes graus de expansão (Oliveira et al., 2007). Por exemplo, a
mutação N111G permite ao receptor AT
1
superar a barreira normalmente imposta
pela cadeia lateral deste resíduo de aminoácido (Fermandjian et al., 1972, Martin et
al., 2004, Noda et al., 1996).
O primeiro e segundo passo da ativação da AngII pode ser mimetizado pela
ativação constitutiva devido à mutação N111G (Feng et al., 1998, Groblewski et al.,
1997, Hunyady et al., 2003, Martin et al., 2004, Noda et al., 1996). A ativação é
propagada para o meio e extremidades citosólicas das 7TMs do receptor, onde
poderia modificar os arranjos de interações entre os resíduos de aminoácidos e
assim, propagar a transdução do sinal. As mutações nos resíduos Tyr
302
e Phe
309
,
destruindo as ligações entre os mesmos e no resíduo Leu
305
, levando à ativação
constitutiva do receptor (Feng et al., 2005, Miserey-Lenkei, 2002, Parnot et al., 2000)
podem ser interpretadas como facilitadoras da dissociação das extremidades
citosólicas das 7TMs (Oliveira et al., 2007).
Com relação ao mutante P207A, apesar da AngII não ter sido capaz de
provocar um aumento na concentração de cálcio intracelular neste mutante, a
incubação prévia com Losartan inibiu a sua provável ativação constitutiva (Figura
34B). Adicionalmente, a administração de AngII após o período de incubação com
este antagonista também não foi capaz de provocar uma resposta (Figura 34B).
________________________________________________________________________________Discussão
104
A mobilização de cálcio tem sido associada com a geração de IP
3
via a
ativação da PLCβ (Capponi, 1996, Griendling et al., 1997, Dinh et al., 2001),
entretanto, em um recente trabalho, Yu e colaboradores (2007), trabalhando com um
mutante que não acopla a proteína Gq, mostraram que este mutante foi capaz de
mobilizar cálcio intracelular mesmo na ausência de geração de IP
3
, e sugerem que
a produção deste metabólito pode não ser o único mecanismo através do qual a
AngII efetua a mobilização de cálcio.
Acreditamos que a mutação P207A leva o receptor a assumir uma conformação
que permite um mínimo de ativação da via clássica de sinalização na ausência de
estímulo com o agonista, mas este mutante é incapaz de desencadear uma resposta
quando estimulado com a AngII. Lee e colaboradores (2007) mostraram que a
conformação do receptor AT
1
selvagem e do mutante N111A induzida pela AngII são
diferentes, resultando na diferença de ligação a proteínas intracelulares. Corroborando
com estes dados, o mutante P207A é ativo na ausênica de AngII (Figura 34) e incapaz
de ativar a via clássica de sinalização mediante estímulo com a AngII (Figuras 28 e 34),
porém é capaz de provocar ativação de ERK de modo semelhante ao receptor
selvagem (Figura 42), mostrando mais uma vez que o receptor AT
1
apresenta
diferentes pré-requisitos estruturais para desencadear diferentes vias de sinalização. De
modo semelhante, Szidonya e colaboradores (2007) combinaram a mutação S109Y
com a mutação DRY/AAY para estudar a via de ativação de ERK em células C9
independente de proteína G. Acreditamos que o mutante P207A também possa ser
utilizado para o estudo de ativação de ERK independente da ativação da proteína G, o
que deverá ser assunto de estudos futuros.
Em relação à ativação de MAPK induzida por AngII, além da participação de
PKC nesta via, está se tornando cada vez mais claro que o receptor AT
1
também
________________________________________________________________________________Discussão
105
pode iniciar a sinalização da cascata MAPK através de outras vias. Muitas mutações
do receptor AT
1
que impedem a sinalização G
q
/PLC/PKC não afetam a habilidade do
receptor em ativar MAPK (Doan et al., 2001, Seta et al., 2001, Hines et al., 2003). De
fato, pesquisas têm identificado os aminoácidos importantes na participação e
controle das mudanças conformacionais do receptor AT
1
do estado inativo para o
estado ativado definido pela via G
q
/PLC/PKC. Por exemplo, resíduos chaves
identificados por mutagêse incluem Asp
74
na TM II e Asn
111
na TM III (Balmforth et
al., 1997, Growblewisk et al., 1997, Feng et al., 1995), bem como Tyr
292
(Marie et al.
1994), Asn
294
(Pérodin et al, 2002, Clément et al., 2005) e Asn
295
(Hines et al, 2001,
Perlman et al., 1997) na TM VII. Substituições destes resíduos ou significantemente
inibiram ou aboliram a habilidade da AngII em estimular a liberação de IP
3
sem no
entanto afetar a afinidade do receptor pela AngII ou acoplamento à proteína G.
Interessantemente, substituições do resíduo Asp
74
e dos resíduos Tyr
292
e Asn
295
não afetaram a sinalização da via MAPK (Doan et al., 200, Hines et al., 2003),
fornecendo evidências que poderiam existir múltiplos requisitos estruturais do
receptor, por sua vez correlacionados a diferentes estados de ativação.
O receptor AT
1
também tem sido ligado ao processo de transativação de
EGFR. Um mecanismo proposto envolve metaloproteases específicas como alvo da
ativação de PKC. O estímulo do receptor AT
1
levaria à liberação de ligantes de
EGFR pré-formados, os quais então estimulariam o referido receptor e ativariam a
cascata MAPK (Thomas et al., 1999, Smith et al., 2004). A transativação de EGFR
também pode vir de complexos funcionais entre o receptor AT
1
e EGFR. Seta e
Sadoshima (2003) mostraram que a mutação do resíduo Tyr
319
dentro da região
YIPP altamente conservada, bloqueia a transativação de EGFR.
________________________________________________________________________________Discussão
106
A sinalização por GPCR através de MAPK também pode ser ativada através
de interações com
β-arrestina (Lutrell, 2002). Estudos de receptores β2-adrenérgicos
têm mostrado que complexos
β-arrestina-Src medeiam a ativação da cascata MAPK
(Pierce et al., 2001). Em relação ao receptor AT
1
, não apenas a ligação à β-arrestina
e ativação da cascata MAPK tem sido estabelecida, como também esta ligação tem
sido mostrada ser independente da sinalização G
q
/PLC/PKC.
Em resumo, todos os mutantes de prolina gerados foram capazes de ativar
ERK de maneira semelhante ao receptor selvagem, inclusive os mutantes P82A e
P207A tanto em células COS-7 quanto em células HEK 293T (Figuras 36 a 43).
Pelos nossos resultados, acreditamos que os resíduos Pro
82
e Pro
207
estejam
diretamente envolvidos no processo de ativação da via clássica desencadeada
mediante a ativação do receptor AT
1
. Corroborando esta hipótese, os dados de
mobilização de cálcio intracelular, mostram a deficiência destes mutantes em
mobilizar este íon (Figuras 33, 32 e 34). No entanto, a mutação destes resíduos não
interfere na ativação de ERK como podemos verificar pela resposta semelhante ao
receptor selvagem mediante estímulo com AngII (Figura 37, 40 e 42). Nossos dados
fornecem mais uma evidência de que os requerimentos estruturais do receptor AT
1
não são os mesmos quanto às diferentes vias de sinalização desencadeadas por
este receptor quando estimulado por AngII. Nós acreditamos que uma boa
compreensão em nível molecular sobre estrutura-função de GPCRs possa culminar
com a descoberta de agentes farmacológicos com especificidade de ativação para
diferentes vias. Além disso, a utilização de mutantes do receptor AT
1
, principal
mediador da AngII, se torna uma ferramenta essencial para a elucidação de vias de
transdução de sinal e melhor compreensão da participação da AngII nos diferentes
processos patológicos em que está envolvida.
____________________________________________________________________Referências Bibliográficas
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Participation of transmembrane proline 82 in angiotensin II AT
1
receptor
signal transduction
Rosana I. Reis
a
, Edson L. Santos
b
, João B. Pesquero
b
, Laerte Oliveira
b
, Joost P. Schanstra
c,d
,
Jean-Loup Bascands
c,d
, Christiane Pecher
c,d
, Antonio C.M. Paiva
b,1
, Claudio M. Costa-Neto
a,
⁎
a
Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 14049-900 Ribeirão Preto, Brazil
b
Department of Biophysics, Escola Paulista de Medicina, UNIFESP, 04023-062 São Paulo, Brazil
c
Inserm, U388, F-31432 Toulouse, France
d
Université Toulouse III Paul Sabatier, IFR31, Institut Louis Bugnard, F-31432 Toulouse, France
Received 31 March 2006; received in revised form 7 June 2006; accepted 10 November 2006
Available online 18 January 2007
Abstract
Most of the classical physiological effects of the octapeptide angiotensin II (AngII) are produced by activating the AT
1
receptor which belongs
to the G-protein coupled receptor family (GPCR). Peptidic GPCRs may be functionally divided in three regions: (i) extracellular domains involved
in ligand binding; (ii) intracellular domains implicated in agonist-induced coupling to G protein and (iii) seven transmembrane domains (TM)
involved in signal transduction. The TM regions of such receptors have peculiar characteristics such as the presence of proline residues. In this
project we aimed to investigate the participation of two highly conserved proline residues (Pro82 and Pro162), located in TM II and TM IV,
respectively, in AT1 receptor signal transduction. Both mutations did not cause major alterations in AngII affinity. Functional assays indicated that
the P162A mutant did not influence the signal transduction. On the other hand, a potent deleterious effect of P82A mutation on signal transduction
was observed. We believe that the Pro82 residue is crucial to signal transduction, although it is not possible to say yet if this is due to a direct
participation or if due to a structural rearrangement of TM II. In this last hypothesis, the removal of proline residue might be correlated to a
removal of a kink, which in turn can be involved in the correct positioning of residues involved in signal transduction.
© 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Site-directed mutagenesis; Signal transduction; G-protein coupled receptors; Agonist
1. Introduction
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) is the main
effector of the renin–angiotensin system. The actions of AngII
are mainly mediated by two receptors: AT
1
and AT
2
. The AT
1
receptor is responsible for most of the classical physiological
effects of AngII. The AT
1
receptor is a member of the G-protein
coupled receptor (GPCR) family, and therefore, shows a
common architecture with seven transmembrane (7TM) helices,
three extracellular loops (EC) and three intracellular loops (IC).
Binding of AngII to AT
1
receptor leads to G-protein coupling.
Subsequently, phospholipase C is activated leading to diacyl-
glycerol and inositol phosphate production. This event results in
an increase of intracellular calcium, acti vation of different ki-
nases and transcription activation [1,2].
It is currently accepted that binding of AngI I to AT
1
is more
dependent on inte ractions to residues located at the EC regio n of
the receptor, such as the N-term inal domain and the third EC
loop [3–6]. Activation of GPCRs by ligand binding involves a
rearrangement of TM regions and this conformational change
leads to activation of intracellular signaling pathways. Con-
cerning the TM regions, there is strong evidence for the for-
mation of a salt bridge between the residue Lys
199
, located in
the TM V and the carboxylic terminal of AngII's Phe
8
. This
interaction would be also responsible for triggering the ac-
tivation process [7,8]. Miura et al. [9] provided evidence that
Regulatory Peptides 140 (2007) 32 – 36
www.elsevier.com/locate/regpep
Abbreviations: GPCR, G-protein coupled receptor; DMEM, Dulbecco's
modified Eagle's medium; BSA, bovine serum albumine.
⁎
Corresponding author. Tel.: +55 16 3602 3261; fax: +55 16 3633 6840.
1
In honor of A.C.M. Paiva.
0167-0115/$ - see front matter © 2006 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.regpep.2006.11.028
TM II plays a role in regulatin g the activation of AT
1
receptor
and this role would be sustained by interactions between this
TM and TM VII. The involvement of other TMs, such as TM
VII [10] and TM III [11] in the process of signal transduction of
the AT
1
receptor following agonist binding has also been
studied. Mutagenesis of conserved leucine residues located on
the top of TM VI and in the third EC loop showed a significant
decrease in the signal transduction [12]. Noda et al. [7] verified
that the mutation of His
256
residue located at the TM VI caused
a decrease in inositol phosphate production without interfering
in the interaction of ligands. Similarly, the mutants V254A,
H256A and F259Y at the TM VI showed a significant decrease
in inositol phosphate production without affecting AngII's
binding [13]. The residue Asn
294
at the TM VII is also asso-
ciated to the AT
1
receptor activation process [14,15]. More
recently, Ohyama et al. [16] studied a high conserved sequence
of amino acids at the C-terminal of TM III (Asp
125
-Arg
126
-
Tyr
127
) and observed that the mutants D125A, D125G, R126A
and R126G produced significantly less inositol phosphate upon
AngII stimulation.
Proline residues are classical terminators of α-helicoidal
structures in globular proteins but a different pattern is observed
in transmembrane helices as those of AT
1
receptor, where many
conserved proline residues are found. Under any condition, this
amino acid when present in α-helices decreases the stability due
to the lack of hydrogen bonding, thus inducing a kink in the
Fig. 2. Competition binding profiles for AngII in COS-7 cells transiently
transfected with the WT, P82A (A) and P162A (B) mutants of the rat AT
1
receptor. Data are expressed as percentages of the maximum specific binding of
the radioligand
3
H-AngII. ns = non-significant. Statistical analysis (t test)
resulted in non-significant differences in IC
50
values, p N 0.05.
Table 1
Binding affinity of AngII for the WT and mutants of the rat AT
1
receptor
Receptor AngII
IC
50
(nM) nF
mut
WT 0.8±0.13 3 –
P82A 1.8±0.16 3 2.3
P162A 1.13±0.15 3 1.4
Values are means ± S.E. and the number of independent experiments done in
duplicate is shown. F
mut
is the ratio of the IC
50
values for the mutant and the
wild type receptors.
Fig. 1. Schematic representation of the AT
1
receptor. The proline residues changed to alanine are shown as white on black. The extracellular domain (EC), the
transmembrane domains (TM) and the intracellular domain (IC) are indicated.
33R.I. Reis et al. / Regulatory Peptides 140 (2007) 32–36
region where it is located. As presented above, most of the
residues participating in signal transduction of the AT
1
receptor
are located at TMs, wherein the conserved prolines are also
located (Fig. 1). Thus, our objective was to undertake site-
directed mutagenesis to individually change conserved prolines
(Pro
82
at TM II and Pro
162
at TM IV) to alanine aiming to
evaluate the participation of such residues in signal transduction
of the AT
1
receptor.
2. Materials and methods
2.1. Receptor mutagenesis
The wild type (WT) rat AT
1
receptor subcloned into the
pTEJ8 vector was obtained from Dr. Thue W. Schwartz
(University of Copenhagen, Denmark). The WT receptor was
used to generate mutants by whole plasmid PCR technique.
Briefly, oligonucle otide primers containing the desired mutation
were designed, each complementing the opposite strands of the
plasmid and they were extended using DNA polymerase (Taq
HiFi, Invitrogen). The DpnI endonuclease, which is specific for
methylated and hemimetylated DNA, was used to digest the
parental DNA template and to select for mutation-containing
synthesized DNA. The DNA sequences corresponding to mu-
tant AT
1
receptors were sequenced with “Big DyeTM Ter-
minator Cycle Sequencing Ready Reaction” Kit (Perkin Elmer).
2.2. Cell culture and transfections
COS-7 cells were cult ivated in DMEM with 10% of fetal
bovine serum, Gentamycin sulfate (50 μg/mL) and glutamine
(2 mM) in a 5% CO
2
environment. Expression plasmids
containing WT or mutated AT
1
receptors were transiently
transfected into COS-7 cells by a calcium phosphate method
[5].
2.3. Binding assays
The COS-7 cells (1 × 10
5
cells/well) transfected with the
expression plasmids were transferred to 24-well culture plates
24 h before binding assays. One day after plating, the cells were
washed briefly in 25 mM Tris– HCl buffer, pH 7.4 containing
140 mM NaCl, 5 mM MgCl
2
and 0.1% bovine serum albumine
(BSA). Binding experiments were performed at 4 °C and
initiated by the addition of 4 pM
3
H-AngII and increasing
concentrations (10
− 12
to 10
− 6
M) of non-radioactive AngII as a
competitor in a 0.5 mL assay. The binding buffer consisted of
25 mM Tris–HCl, pH 7.4, including 5 mM MgCl
2
, 0.1% BSA
and 100 μg/mL bacitracin (Sigma).
Table 2
Functional analysis of the WT and mutants of the rat AT
1
receptor stimulated
with AngII
Receptor AngII
EC
50
(nM) nF
mut
E
max
(% of WT value)
WT 110± 12 2 – 100
P82A 1698±220 2 15.4 27.6
P162A 116±15 2 1.1 122
Values are means ± S.E. and the number of independent experiments done in
duplicate is shown. F
mut
is the ratio of the EC
50
values for the mutant and the
wild type receptors.
Fig. 4. Molecular modeling of part of TM regions of AT
1
receptor. It is shown
that due to the presence of Pro
82
a structural weakness would trend to favor helix
bending. The free Phe
77
carbonyl group is shown and possible interacting
residues (Asn
111
and Ser
107
).
Fig. 3. The effect of AngII acidification rate assays in transiently transfected
COS-7 cells expressing the WT, P82A (A) and the P162A mutants (B) of the rat
AT
1
receptor. The acidification rate is expressed as a percentage of the maximum
values obtained for the WT receptor.
⁎
Statistical analysis (two-way ANOVA)
resulted in significant differences for E
max
values, p b 0.001.
34 R.I. Reis et al. / Regulatory Peptides 140 (2007) 32–36
2.4. Microphysiometer functional assay
Twenty-four hours prior to the assays, cells expressing the
WT or mutated AT
1
receptors were transferred to transwells
made out of polycarbonate membranes with 3 μm pores
(5 × 10
5
cells/well). The Cytosensor microphysiom eter (Molec-
ular Devi ces, Sunnyvale, CA, USA) was used to measure the
acidification rate in the extracellular microenvironment due to
cellular metabolic activity. Cells in the transwells were perfused
with DMEM, pH 7.4, containing 0.1% BSA and 44.4 mM NaCl
with a peristaltic pump, altering cycles of perfusion at 100 μL/
min (1 min:40 s) and pauses (20 s). During stimulation the
medium was replaced by DM EM containing AngII in con-
centrations varying from 10
− 10
to 10
− 5
M. Acidification mea-
surements wer e done in duplicate and the dose–response curves
were analyzed by nonlinear regression using the software
Graph-Pad (Graph-Pad, San Diego, CA).
2.5. Statistical analyses
All data are shown as mean ± S.E. Statistical analyses were
performed using unpaired t test (binding assays) and two-way
ANOVA (functional assays) using the software Graph-Pad
(Graph-Pad, San Diego, CA).
3. Results
3.1. Binding assays
Competition binding experiments showed, using
3
H-AngII
as the radioligand and AngII as the competitor, that there was no
significant difference in affinity for AngII for both mutants
(p N 0.05; Table 1 and Fig. 2), although the competition profile
for the P82A mutant was tenuously altered.
3.2. Functional assays
Results from functional assays resulted in dose–response
curves for AngII (Fig. 3) from where it was possible to conclude
that the P162A mutation did not alter signa l transduction, as
compared to the WT receptor. For this mutant neither the EC
50
nor the E
max
values were altered (Table 2 and Fig. 3). On the
other hand, the P82A mutation evoked a drastic reduction in the
E
max
value (p b 0.001) and a moderate alteration in the EC
50
,as
compared to the WT receptor.
4. Discussion
The results obtained from binding (Table 1 and Fig. 2)and
functional assays (Table 2 and Fig. 3) showed that the mutation of
Pro
162
to Ala did not affect AngII's affinity nor its capacity of
triggering signal transduction. On the other hand, the mutation of
Pro
82
to Ala showed a clear decrease in the signal transduction,
despite of a tenuous alteration in competition binding profile
(Table 2 and Fig. 3). The involvement of TM III, V, VI and VII in
the activation process of AT
1
receptor was proposed by Inoue et
al. [17]. According to these authors, these TMs could provide a
net of interactions which would undergo changes after agonist
binding, then resulting in a rearrangement of TMs interactions.
As the decrease in affinity was not pronounced for the P82A
mutant, we can infer that this mutation is mostly involved in
signal transduction. The residue Pro
82
is located in TM II which
has been shown by some research groups to participate in the
activation process of the AT
1
receptor. Miura et al. [9] showed
evidence that TM II has an important role in the regulation of the
activated form of the AT
1
receptor. Similarly, Boucard et al. [10]
evidenced a movement of TM VII when the receptor is activated.
According to these authors, there are interactions between TM II,
III and VII involving the residues Asn
111
-Asp
74
-Asn
298
.Besides
that, mutation of residues located at the top of TM II has been
shown to impair AngII binding and receptor activation [3,5].In
this way, our results strongly suggest that, despite the possibility
of a direct participation, it is more likely that Pro
82
participates in
signal transduction by generation of a kink in TM II, which is
structurally responsible for the correct arrangement of linking
residues. Also, due to the presence of Pro
82
, the main chain
carbonyl group of Phe
77
is not making a hydrogen bond in the
alpha-helix structure of AT
1
receptor TM II, and then is able to
participate in the mechanism of receptor activation, possibly by
binding TM III Asn
111
or Ser
107
(Fig. 4). The P82A mutation is
likely to abolish these effects. Such structural requisite for
signaling might be extrapolated to other GPCRs, as the proline
residue in the corresponding position is highly conserved in
GPCRs.
Acknowledgements
This study was supported by the São Paulo State Research
Foundation (FAPESP), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) and Coo rdenação de Aperfei-
çoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
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36 R.I. Reis et al. / Regulatory Peptides 140 (2007) 32–36
Functional rescue of a defective angiotensin II AT
1
receptor mutant by the
Mas protooncogene
Edson L. Santos
a
, Rosana I. Reis
b
, Ronaldo G. Silva
c
, Suma I. Shimuta
a
, Christiane Pecher
d
,
Jean-Loup Bascands
d
, Joost P. Schanstra
d
, Laerte Oliveira
a
, Michael Bader
e
,
Antonio C.M. Paiva
a,✠
, Claudio M. Costa-Neto
b
, João B. Pesquero
a,
⁎
a
Department of Biophysics, Escola Paulista de Medicina, Federal University of São Paulo, 04023-062 São Paulo, SP, Brazil
b
Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 14049-900, Ribeirão Preto, Brazil
c
Department of Medicine, Federal University of São Paulo, Brazil
d
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM U 388, Institut Louis Bugnard, BP84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France
e
Molecular Biology of Peptide Hormone Group, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine (MDC), Berlin, Germany
Received 11 November 2006; received in revised form 23 December 2006; accepted 23 December 2006
Available online 20 January 2007
Abstract
Earlier studies with Mas protooncogene, a member of the G-protein-coupled receptor family, have proposed this gene to code for a functional
AngII receptor, however further results did not confirm this assumption. In this work we investigated the hypothesis that a heterodimeration AT
1
/
Mas could result in a functional interaction between both receptors. For this purpose, CHO or COS-7 cells were transfected with the wild-type AT
1
receptor, a non-functional AT
1
receptor double mutant (C18F-K20A) and Mas or with WT/Mas and C18F-K20A/Mas. Cells single-expressing
Mas or C18F/K20A did not show any binding for AngII. The co-expression of the wild-type AT
1
receptor and Mas showed a binding profile
similar to that observed for the wild-type AT
1
expressed alone. Surprisingly, the co-expression of the double mutant C18F/K20A and Mas evoked
a total recovery of the binding affinity for AngII to a level similar to that obtained for the wild-type AT
1
. Functional measurements using inositol
phosphate and extracellular acidification rate assays also showed a clear recovery of activity for AngII on cells co-expressing the mutant C18F/
K20A and Mas. In addition, immunofluorescence analysis localized the AT
1
receptor mainly at the plasma membrane and the mutant C18F-K20A
exclusively inside the cells. However, the co-expression of C18F-K20A mutant with the Mas changed the distribution pattern of the mutant, with
intense signals at the plasma membrane, comparable to those observed in cells expressing the wild-type AT
1
receptor. These results support the
hypothesis that Mas is able to rescue binding and functionality of the defective C18F-K20A mutant by dimerization.
© 2007 Published by Elsevier B.V.
Keywords: Angiotensin II; AT
1
receptor; Mas protooncogene; Dimerization; G-protein-coupled receptor
1. Introduction
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) is the major
effector of the renin–angiotensin system (RAS). Two distinct
subtypes of AngII receptors, AT
1
and AT
2
, have been identified
and both have been shown to belong to the family of G-protein-
coupled receptors (GPCRs). Most physiological effects of
AngII are mediated by the AT
1
receptor. Activation of the AT
1
receptor by AngII triggers the G-protein pathway mainly by
activation of G- protei ns q/11, and therefore leadin g to
generation of diacylglycerol and inositol phosphate, phosphor-
ylation and internalization of the receptor [1,2].AT
1
receptor
function has been pharmacologically investigated with different
approaches including site-direct mutagenesis as the main
method used for determination of residues involved in binding
[3–5], signal transduction [6–9] and G-protein coupling
[10,11] . In addit ion, non -peptide agonistic compounds have
Regulatory Peptides 141 (2007) 159 – 167
www.elsevier.com/locate/regpep
Abbreviations: AngII, angiotensin II; RAS, renin–angiotensin system;
GPCRs, G-protein-coupled receptors; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's
medium; BSA, bovine serum albumin; CHO, Chinese hamster ovary; COS-7,
African Green Monkey Kidney cells; IP, inositol phosphate; GFP, green
fluorescent protein; DAPI, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride.
⁎
Corresponding author. Tel.: +55 11 5549 7435; fax: +55 11 5571 5780.
✠
Deceased.
0167-0115/$ - see front matter © 2007 Published by Elsevier B.V.
doi:10.1016/j.regpep.2006.12.030
also been used as pharmacological tools to elucidate the
mechanism of AT
1
receptor activation [12,13].
Recently, some evidence have suggested that AngII is not
the only active peptide of the RAS. Many novel biologically
active components of the system were described, such as Ang-
(1-7), AngIII and AngIV [14–16]. Among these new
members, Ang-(1-7), a peptide metabolite with different bio-
logical functions, generated mainly from angiotensin I, is now
considered an important component of the RAS. Santos et al.
[17] have identified the Mas protooncogene product as the
receptor for Ang-(1-7) and showed that the non-peptide
compound AVE 0991 is also an agonist for the Mas receptor
[18].
The Mas protooncogene was initially described by its in vivo
tumorigenic properties [19,20], later characterized as a prote in
with seven hydrophobic transmembrane domains and consid-
ered to be an orphan GPCR [21]. Earlier studies have proposed
this oncogene to code for a functional AngII receptor [22],
however, further results did not corroborate these findings
[23,24]. Despite no evidence for a direc t binding of AngII to
Mas, recent data have demonstrated a physiological role for
Mas in modulating the functions of AngII in vivo [25,26].
Furthermore, the co-expression of Mas in transfected mamma-
lian cells decreased AngII-induced production of inositol
phosphates and mobilization of intracellula r Ca
2+
and concom-
itantly increased the AngII binding capacity [26].The
mechanism by which Mas increases AngII binding capacity
was shown to be dependent on the activation of Gα
q
/Gα
11
and
hence on stimulation of protein kinase C-dependent phosphor-
ylation of the AT
1
receptor [27]. Furthermore Castro et al. [28]
reported evidence that the Mas receptor might functionally
interact with both the AT
1
and AT
2
receptors.
In a number of situations, it has been shown that AT
1
receptor activation is modulated by other co-expressed GPCRs.
In this sense, desensitization and dimerization have been
described to be involved on the regulation of AT
1
activity and
receptor oligomerization has recently gained importance in the
field of GPCRs. Dimerization has been described in different
families of GPCR including δ-opioid [29], dopamine [30],
muscarinic [31], α-adrenergic [32], β-adrenergic [33], kinin B2
[34] and AT
1
receptor [35–38].
A decade ago Monnot et al. [35] described the first evidence
that AT
1
receptors could undergo dimerization. By co-
expressing two different AT
1
receptor mut ants, the authors
could partially reconstitute the ability of the mutants to bind
peptide and non-peptide ligands. Despite the observation that
the mutants could recover AngII binding affinity to a similar
level to the wild-type receptor, the co-expression did not restore
inositol phosphate production capacity. Corroborating these
results, more recently Kosteni s et al. [26] demonstrated that the
Mas is a physiological antagonist of the AngII AT
1
receptor,
acting by heteroligomerization with the AT
1
receptor and
inhibiting its actions.
In this report we present new evidence for the interaction
between the Mas and the AngII AT
1
receptor. Moreover, we
also show that Mas is able to recover binding and functionality
for AngII to a defective mutant AT
1
receptor.
2. Expe rimental procedures
2.1. Receptor cloning and site-directed mutagenesis
The wild-type AT
1
and Mas cDNAs were cloned as
HindIIII–BamHI inserts into the expression vector pTEJ8 [39].
The double mutation (C18F-K20A) was introduced by the PCR
overlap extension technique. Oligonucleotides were designed to
include a silent restriction site, thus facilitating the subsequent
identification of mutant receptor cDNA. PCR analyses were
performed as previously described [4]. The wild-type AT
1
receptor and the AT
1
mutant receptor C1 8F-K20A were
subcloned into the pEGFP-N1 vector (Clontech), aiming at its
expression in fusion with green fluorescent protein. The receptor
Mas was subcloned in fusion with a Myc tag (Clontech). All
constructs were confirmed by DNA sequencing (ABI-Prism 377-
18, Perkin-Elmer, Foster City, CA).
2.2. Cell culture and cell transfection
CHO and COS-7 cells were maintained in Dulbecco's
modified Eagle's medium — DMEM (Invitrogen) supplemen-
ted with 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/
mL streptomycin, and 2 mM
L-glutamine (all from Invitrogen)
at 37 °C in a humidified 5% CO
2
atmosphere. Permanent
transfections and co-transfections were performed in CHO cells
by lipofectin (Invitrogen) me thod as desc ribed by the
manufacturer using 5 μg of the plasmid DNA. For the
establishment of stable expressing cell lines, transfected and
co-transfected cells were maintained in a culture medium
supplemented with 500 μg of G-418 (Geneticin; Invitrogen).
Transient transfections and co-transfections were also per-
formed in COS-7 cell s by a calcium phosphate precipitation
method as described before [40] using 15 μg of the plasmid
DNA.
2.3. PCR analysis
Total DNA was isolated from CHO cells using the Trizol
reagent according to the manufacturer (Invitrogen). The extracted
DNA was used in PCR analyses in order to demonstrate the
presence of the specific cDNAs for the AT
1
receptor and mutants
(primers 5′ -GACTAGTAAATTGTCCGC-3′ and 5′ -
GAGCTGCGAATTCCGAGACTC-3′)andMas (primers 5′-
CTGGTTCCTTTGCTTCCGGATG-3′ and 5′-CG AAAGC-
CACCCACATTCAG-3′). The PCR products were analyzed by
electrophoresis on agarose gels and subsequently isolated and
confirmed by automated DNA sequencing (ABI-Prism 377-18,
Perkin-Elmer, Foster City, CA).
2.4. Binding assay
The CHO cells transfected and co-transfected with the
expression plasmids were transferred to 6-well culture plates
24 h before binding assays at 2× 10
6
cells/well. One day after
plating, the cells were washed briefly in 25 mM Tris–HCl buffer,
pH 7.4 containing 140 mM NaCl, 5 mM MgCl
2
and 0.1% bovine
160 E.L. Santos et al. / Regulatory Peptides 141 (2007) 159–167
serum albumin (BSA). Binding experiments were performed at
4 °C and initiated by the addition of 50 pM
125
I-AngII and
increasing concentrations (10
− 12
to 10
− 6
M) of non-radioactive
AngII as a competitor in a 1 mL assay volume. The binding buffer
consisted of 25 mM Tris–HCl, pH 7.4, including 5 mM MgCl
2
,
0.1% BSA and 100 μg/mL bacitracin (Sigma).
2.5. Extracellular acidification rate assay
Cells expressing the receptors were plated into capsule
polycarbonate cups at a density of 5 × 10
5
cells/cup in DMEM
medium, approximately 12–16 h before the experiment. The
capsule cup insert assembly was placed into the sensor chamber
on the Cytosensor system (Molecular Devices, Sunny Valley,
CA), which contained the pH-sensitive sensor system. A DMEM
medium not supplemented was pumped through the chambers
bathing the cells at a rate of 100 μL/min. This running medium
was devoid of sodium bicarbonate and had a buffering capacity of
1 mM supplied by phosphate. Physiological osmolarity was
achieved by the addition of NaCl. The assembled cup was then
transferred to sensor chambers containing 1 mL of low buffered
DMEM with 0.1% BSA and without bicarbonate but containing
2 mM glutamine and additional 44.4 mM NaCl to replace
bicarbonate and adjust osmolarity. The sensor chambers were
placed on the Cytosensor microphysiometer and allowed to
equilibrate for more than 60 min before the beginning of the
experiment [5]. The medium was run through the chambers at a
rate of 100 μL/min and pump cycle was 90 s on, 30 s off at 37 °C.
To assess shifts in the extracellular acidification rate, cells were
stimulated (over a period of 30 s) with AngII in submaximal
concentrations (10
− 7
M). AngII measurements were done in
quadruplicate and the data were analyzed by nonlinear regression
analysis using Graph-Pad Software (Graph-Pad, San Diego, CA).
2.6. Inositol phosphate measurement
Transfected CHO cells (10
6
cells) expressing the wild-type
rat AT
1
receptor or mutants were cultivated for 20 h in inositol-
free medium (Dulbecco 199 supplemented with 10% fetal
bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin,
and 2 mM glutamine) in 3.5-cm culture plates containing
10 μCi
3
H-myoinositol. The cells were washed twice with
Tyrode solution (137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 1.36 mM
CaCl
2
, 0.49 mM MgCl
2
, 12 mM NaHCO
3
, 0.36 mM NaH
2
PO
4
,
5.6 mM glucose) and subsequently incubated for 30 min with
the same solution containing 10 mM LiCl, in the presence or
absence of agonist, as described by Kanashiro et al. [41]. The
amount of the
3
H-inositol-phosphates eluted from a tube
containing AG1-X8 resin was counted and concentration–
response curve generated using nonlinear regression analys is.
Graph-Pad Prism Software (Graph-Pad, San Diego, CA) was
used to determine EC
50
and E
max
values.
2.7. Immuno and GFP fluorescence
COS-7 cells were transiently transfected with 15 μg plasmid
DNA by a calcium phosphate precipitation method [40] . After
18 h following transfection, cells were transferred to glass
coverslips (13 mm diameter) and incubated for 24 h. Cells were
washed three times for 10 min with PBS, incubated with
paraformaldehyde 2%, 37 °C for 20 min, washed two times for
5 min with PBS and incubated with glycine 250 mM for 5 min.
Then, cells were washed for five times with PBS for 5 min and
incubated in PBS supplemented with 3% BSA for 1 h. Cells
were incubated with anti-Myc monoclonal antibody (1:40,
Invitrogen) for 3 h at room temperature, washed 5 times with
PBS (5 min each) and incubated with anti-mouse fluorescein-
conjugated antibody (1:300, Invitrogen) and DAPI (1:500,
Invitrogen) at room temperature for 1 h. Cells were washed 10
times with PBS (5 min each) and analyzed microscopically in a
drop of mounting medium (Fluormount; Southern Biotechnol-
ogy Associates).
2.8. Calculations and statistical analysis
Binding and f unc tiona l data were analyzed; IC
50
,EC
50
and
E
max
values were determined by nonlinear regression analysis
using the Graph-Pad Prism Software (Graph-Pad, San Diego,
CA). Results were exp ress ed as mean ± sta nda rd error of the
mean (SEM). Statistical significance was evaluated with the
Student's t-test for unpaired sa mples. Differences were
considered to be significant when p was b 0.05.
3. Results
3.1. Exp ression and co-expression of receptors
The wild-type AngII AT
1
receptor and the C18F-K20A
mutant (Fig. 1) were stably expressed alone or co-expressed
with the Mas in CHO cells. Genomic DNA extraction was
performed from all cell clones and the respective receptor
sequences were amplified by PCR in order to confirm the
corresponding stable integration (data not shown). Each
amplified fragment was subsequently confirmed by DNA
sequencing.
3.2. Binding assays
Binding assays were performed using CHO cells stably
single-expre ssing the wild-type AT
1
receptor, C18F-K20A
mutant or Mas; and co-expressing the wild-type AT
1
receptor
with Mas; or the C18F-K20A mutant with Mas. Cells single-
expressing the wild-type AT
1
receptor or co-expressing the
wild-type wi th Mas produced a characteristic profile for
competition binding assays using
125
I-AngII as the radioligand
(Fig. 2A). On the other hand, cells single-expressing the Mas or
the C18F-K20A mutant yielded no specific binding to
125
I-
AngII, and therefore no competition binding curve was obtained
from the assays (Table 1, Fig. 2A and B). Surprisingly, when
Mas and the C18F-K20A mutant receptor were co-expressed
there was a clear rescue of the binding affinity for AngII and a
generation of a characteristic competition profile comparable to
that obtained for the wild-type AT
1
receptor (Fig. 2B and
Table 1).
161E.L. Santos et al. / Regulatory Peptides 141 (2007) 159–167
3.3. Functional assays
Taking into account the evidenced interaction among AT
1
wild-type and mutant receptors with Mas,wereasonedwhether
this phenomenon could modulate or rescue receptor functionality.
The results revealed that wild-type AT
1
receptor activation by
AngII in the presence of Mas decreased 22% ( p b 0.05) in the
microphysiometer assay (Fig. 3)and38%(p b 0.05) in the E
max
Fig. 1. Serpentine diagram of the rat AT
1
receptor. Shown are the N-terminal region (N), the extra cellular loops (EC), the seven transmembrane segments (TM), the
intracellular loops (IC) and the C-terminal (C) tail. The mutated amino acid residues in the N-terminal region (Cys to Phe and Lys to Arg) are indicated by arrows.
Fig. 2. Binding assays. Competition binding curves for AngII in CHO cells single-transfected with the wild-type rat AT
1
receptor (WT) or Mas (Mas) and co-
transfected with the wild-type and Mas (WT/Mas) (A) or single-transfected with WT or C18F-K20A mutant and co-transfected with C18F-K20A/Mas (B). Data are
expressed as percentages of the maximum specific binding of the radioligand
125
I-AngII (mean ± SEM, n =3–5).
162 E.L. Santos et al. / Regulatory Peptides 141 (2007) 159–167
values in the inositol phosphate assay (Fig. 4). Conversely, the
interaction between Mas and the mutant AT
1
receptor rescued the
functionality of the defective receptor, resulting in an increased
activation for AngII in both functional assays to a level similar to
that of wild-type receptor (Figs. 3 and 4). The acidification rate
effect produced by AngII in the cells expressing AT
1
receptor was
blocked by the AT
1
antagonist losartan (data not shown).
3.4. Localization and co-localization of AT
1
and Mas receptors
In order to study a possible modulation in trafficking in the
AT
1
receptor produced by Mas interaction which could explain
alteration in binding and functionality of this receptor, we
transiently transfected and co-transfected COS-7 cells with the
wild-type AT
1
receptor, the Mas receptor and the AT
1
C18F-
K20A mutant. Di rect GFP fluorescence analysis localized the
AT
1
receptor at the plasma membrane, but also diffusely spread
to the cytoplasm (Fig. 5). The co-expression of Mas with the
wild-type AT
1
receptor produced no remarkable alteration on the
cell localization of the AT
1
receptor. On the other hand, when the
mutant C18F-K20A was expressed in fusion with the GFP it was
localized exclusively insi de the cells (Fig. 5). However, the co-
expression of C18F-K20A mutant with the Mas produced an
alteration in the distribution pattern of the mutant, with intense
signals at the plasma membrane, comparable to those observed
in cells expressing the wild-type AT
1
receptor. More importantly,
a combined analysis of direct GFP fluorescence and immuno-
fluorescence for C18F-K20A and Mas receptors resulted in
observation of co-localization for such receptors in these cells
(Fig. 5).
4. Discussion
It is generally accepted today that GPCRs can exist as dimers
and that this phenomenon is essential for receptor function [42].
In the present study, we aimed to investigate the hypothesis that
the Mas was able to heterodimerize with the AT
1
receptor to
modulate AngII binding and alter receptor functionality. This
issue was accessed using in vitro assays with stably transfected
CHO and transiently transfected COS-7 cells expressing the
wild-type AT
1
receptor and an AT
1
receptor mutant severely
defective for binding and activation (C18F-K20A), which were
co-transfected with the Mas.
The response obtained for AngII binding and stimulation on
the wild-type AT
1
receptor present on transfected CHO cells was
specific, whereas cells expressing only the Mas or C18F-K20A
mutant did not elicit specific binding affinity or functional
responses. These results corroborate previous work showing
lack of binding and activation for AngII in CHO-K1 cells
transfected only with the Mas [43]. In addition, functional
analysis revealed that the Mas as well as the C18F-K20A mutant
had a null respon se to AngII. These results are in agreement with
the data of Kostenis et al. [26], showing no activity for AngII in
Fig. 3. Microphysiometer functional assays. Effect of AngII on extracellular
acidification rate assays in permanently transfected CHO cells single-expressing
AT
1
receptor (WT), C18F-K20A mutant and Mas or co-expressing WT/Mas and
C18F-K20A/Mas. The activation is expressed as a percentage of the maximum
values obtained for the wild-type AT
1
receptor (mean ± SEM, n =4–18). The
acidification rate effect produced by AngII in the cells expressing AT
1
receptor
was blocked by the AT
1
antagonist losartan (data not shown). super
▪
,
⁎
p b 0.0001 in comparison to the WT and
#,♦
p b 0.0001 in comparison to the
C18F-K20A/Mas.
Fig. 4. Inositol phosphate functional assays. Concentration–response curves for
the effect of AngII on inositol phosphate (IP) turnover in CHO cells single-
transfected with wild-type AT
1
(WT), C18F-K20A mutant and Mas or co-
transfected with WT/Mas and C18F-K20A/Mas. The IP generation is expressed
as percentage of the maximum response obtained by stimulation with AngII for
30 min (mean ± SEM). The results are expressed as percentage of the maximal
response for WT.
Table 1
IC
50
and B
max
values for AngII binding to cells transfected with the wild-type
AT
1
receptor (WT), Mas and C18F-K20A mutant alone or co-transfected with
WT/Mas and C18F-K20A/Mas
Transfected cDNA IC
50
(nM) (n) F
mut
B
max
(fmol/10
6
cells)
WT 8.1±0.7 (5) – 100±12
Mas NB (3) ––
WT/Mas 6.4±0.5 (3) 0.8 57 ±4
⁎
C18F-K20A NB (3) ––
C18F-K20A/Mas 8.5± 0.7 (3) 1.0 157±8
⁎
125
I-AngII was used as radioligand. Values are means ± SE and the number of
experiments done in duplicate is shown in parentheses. F
mut
is the ratio of the
IC
50
values for Mas or mutants and wild-type receptors. NB, no binding.
⁎
p b 0.05 in comparison to the WT.
163E.L. Santos et al. / Regulatory Peptides 141 (2007) 159–167
Ca
2+
mobilization and inositol phosphate generation assays in
cells expressing Mas.
The co-expression of AT
1
and Mas did not affect the AngII
affinity but in the functional assays it was possible to observe an
alteration in the activation profile, with a decrease in E
max
value in
the inositol phosphate turnover assay (Fig. 4). Kostenis et al. [26]
also reported a similar pattern of decrease in functional activation
by AngII when the wild-type AT
1
receptor was co-expressed with
the Mas. According to those authors, Mas could heterooligomer-
ize with the AT
1
receptor and inhibit the actions of AngII.
However, in contrast to the data of Kostenis et al. [26] which
found a significant enhancement in B
max
for AT
1
receptor in the
co-transfected cells, we observed a significant decrease in this
parameter in our cells without any alteration in the binding affinity
for the agonist. One possible explanation for this discrepancy
between both works could be the fact that Kostenis et al. [26] used
transiently transfected cells whereas we used stably transfected
CHO cells. In accordance to this hypothesis, similar results have
also been obtained by Le et al. [44] in studies of ligand binding
and functional properties of angiotensin AT
1
receptors in
transiently and stably expressed CHO-K1 cells. These authors
have shown different pharmacological and signaling properties
for both groups of cells, with the presence of a significant receptor
reserve in the transient but not in stable cells, responsible for a
higher potency of AngII in the transient cells.
Taking into account these results, in both works we could
evidence an interaction between receptors, which was observed
by the modulation in binding and activation parameters for the
receptors. Similar to the cells transfected only with the Mas,the
mutant AT
1
receptor C18F-K20A did not bind AngII and did not
produce competition binding profiles as well as second messenger
activation (Table 1). However, the presence of Mas was able to
elicit a clear rescue of the binding affinity for the mutant (Fig. 2,
Table 1) to a level similar to that obtained for the wild-type AT
1
Fig. 5. Immunofluorescence assays. Localization by fluorescence micrographs of AT
1
receptor and C18-K20A mutant tagged with enhanced green fluorescent protein
(GFP) or Mas tagged with Myc transiently transfected in COS-7 cells. A, Wild-type AT
1
receptor (WT); B, Mas; C, WT/Mas; D, C18F/K20A; E, C18F/K20A/Mas.
The shown micrographs are representative of at least four independent experiments of transfection.
164 E.L. Santos et al. / Regulatory Peptides 141 (2007) 159–167
receptor. More interestingly, the co-expression of Mas and C18F-
K20A also yielded a fully active pattern of functionality response
(Figs. 3, 4 and Table 2), with EC
50
and E
max
values comparable to
those from the wild-type AT
1
receptor.
The GPCRs functional dimerization is generally accepted, but
regarding the renin–angiotensin system, it has also been
described as a negative crosstalk between endogenous AT
1
and
AT
2
receptors in vascular smooth muscle cells, with AT
2
receptors
inhibiting AT
1
-mediated cell growth [45,46]. In other situations,
AT
1
receptors can also exhibit positive crosstalk in vivo as a result
of heterodimerization with kinin B
2
receptors. Heterodimeriza-
tion between AT
1
and B
2
receptors potentiates AT
1
receptor
signaling and sequestration after activation [36]. The enhance-
ment of AT
1
signaling within the heterodimer does not require
activation of the B
2
receptor, but does require the ability of the B
2
receptor to couple to G-proteins [36].AT
1
and B
2
receptors are co-
expressed in the smooth muscle [47],kidney[48], platelets, and
omental vessels [37] and thus heterodimers between AT
1
and B
2
may contribute to the normal functioning of the renin–angiotensin
system, as suggested by observed alterations in preeclampsia [49].
The lack of binding and activation of AngII in the C18F-K20A
mutant could be explained by different reasons, which vary from a
decreased binding affinity to total absence of the receptor due to
impaired cell surface expression. The presence or absence of the
receptor at the cell membrane can be determined by defective
trafficking. It has been reported that in cells expressing the growth
hormone receptor with mutations in the extracellular domains the
intracellular trafficking and binding affinity for the receptor was
affected [50]. Furthermore, individual subunits of many multi-
meric protein complexes are retained in the endoplasm ic
reticulum, and for some membrane proteins this serves as a
quality control mechanism preventing cell surface expression of
partially assembled or misfolded complexes [51].
In order to analyze the possible correlation between protein
trafficking alteration and lack of binding and activation in the AT
1
receptor mutant direct GFP fluorescence and immunofluores-
cence experiments were performed. The results showed a
different profile of cellular distribution for the AT
1
wild-type
and C18F-K20A receptors, with the wild-type localized at the cell
membrane and the C18F-K20A mutant inside the cell (Fig. 5). In
this sense, Hermosilla et al. [52] showed that disease-causing
mutants of the V2 vasopressin receptor may be retained in
different compartments of the early secretory pathway and that
different folding states of the receptors determine retention or not.
It has also been reported that unfolded or unassembled membrane
proteins may accumulate in the endoplasmic reticulum [53],and/
or be degraded via the ubiquitin–proteasome pathway [54–56].
They may also accumulate and aggregate in the cytoplasm [57].
Concerning the double mutant C18F-K20A, it has been
previously described that the C18G mutation caused an 11-fold
loss of affinity for AngII [58]. On the other hand, the mutation
of Lys
20
to Ala did not significantly modify the affinity for
AngII, although it has flimsy altered the agonist-induced ac-
tivation [5]. Therefore, we can infer that the combined mu-
tations (i.e. C18F-K20A) have increased the deleterious effect
for binding as well for functional responses. According to this,
one can hypothesize that the incorrectly folded C18F-K20A
mutant could be retained inside the cell by not passing through a
quality control. Such quality control system has been proposed
to involve dimerization of GPCRs [59]. In fact, cells co-ex-
pressing the C18F-K20A mutant and the Mas show a dis-
tribution profile similar to the single-expressing AT
1
wild-type
receptor (i.e. at the membrane, Fig. 5). Besides that, the immu-
nofluorescence assays showed a co-localization of the C18F-
K20A mutant and the Mas receptor (Fig. 5).
Therefore, our interpretation for the fully functional recovery
of the defective C18F-K20A mutant when it is co-expressed with
the Mas is that they undergo dimerization, and that once the dimer
is formed, the mutant recovers its correct folding state, allowing it
to reach the plasma membrane and then to play its functional role.
Acknowledgments
We thank Nelson Alves Mora, Elton Dias da Silva and Ana
Camila Pimenta for technical assistance and Dr. Edgar Julian
Paredes Gamero for the assistance in fluorescence micrographs.
This work was supported by grants from the São Paulo State
Research Foundation (FAPESP, 02/00807-7) and research
fellows from the Brazilian National Research Council (CNPq,
520012/02-0). Edson Lucas dos Santos is supported by a post-
doctoral fellowship from FAPESP (04/07715-6).
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Table 2
EC
50
and E
max
values obtained in IP assays determined by stimulating cells
transfected with wild-type AT
1
receptor (WT), Mas and C18F-K20A mutant and
co-transfected with WT/Mas and C18F-K20A/Mas with increasing concentrations
of AngII for 30 min
Transfected cDNA EC
50
(nM) F
mut
E
max
(% of max. WT activity)
WT 2.5 ±0.4 – 100±4
Mas ND ––
WT/Mas 2.7 ±0.6 1.1 62 ±9
⁎
C18F-K20A ND ––
C18F-K20A/Mas 7.0 ± 1.0 2.8 116 ± 4
The results are expressed as percentage of the maximal response. Values are
means ±SE mean. F
mut
is the ratio of the EC
50
values for Mas or mutants and
wild-type receptors. ND, no detectable activation curve obtained.
⁎
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