( PDF ) Amplificação dos genes que codificam a Endotelina-1 e seus receptores em valvas mitrais reumáticas

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Edmilson Bastos de Moura

Amplificação dos genes que codificam a

Endotelina-1 e seus receptores

em valvas mitrais reumáticas

Brasília, 2008

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Universidade de Brasília – UnB

Faculdade de Medicina – FM

Pós-Graduação em Ciências Médicas

Amplificação dos genes que codificam a

Endotelina-1 e seus receptores

em valvas mitrais reumáticas

Dissertação Apresentada à Banca Examinadora

do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Médicas da Universidade de Brasília – UnB

como Parte dos Requisitos Exigidos Para

Obtenção do Título de Mestre em Ciências

Médicas.

Mestrando: Edmilson Bastos de Moura

Orientadora: Profa. Dra. Yolanda Galindo Pacheco

Banca examinadora:

Profa. Dra. Yolanda Galindo Pacheco (Presidente)

Prof. Dr. Francisco de Assis Neves

Dr. Fábio Amorim Ferreira

Prof. Dr. Daniel França Vasconcelos

Brasília, 2008

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, irmã e sobrinha,

pelo carinho incondicional.

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente o apoio recebido para a confecção dessa dissertação, de

amigos especiais:

 À Profa. Dra. Yolanda Galindo Pacheco, minha orientadora, pela paciência com

que me fez buscar o caminho correto;

 À amiga Mariana Ribeiro Gomes, companheira de bancada e de pesquisa, pela

convivência saudável e valorosa ajuda;

 Ao Prof. Dr. Luís Simeoni, que gentilmente me acolheu no Laboratório de

Farmacologia Molecular;

 Ao Prof. Dr. Vicente Pérez Carrascosa, pelo auxílio que prestou na confecção do

estudo histológico, e ao Sr. Giuliano, que habilmente confeccionou as lâminas;

 Aos amigos Rosângela Vieira de Andrade e Tomás de Moraes Macedo, pela

participação importante durante todas as fases da pesquisa;

 Aos médicos do InCor-DF, em especial aos cirurgiões Dr. Luiz Fernando

Caneo, Dr. Ricardo Corso, Dr. Cristiano Faber, Dr. Guilherme Succi e Dr.

Fernando Atik, pelas lições aprendidas na busca de uma Medicina de alta

qualidade;

 Aos médicos do Hospital de Base do DF, pela dedicação que tiveram com a

coleta do material de pesquisa.

iii

“Nunca ninguém mensurou, nem

mesmo os poetas, quanto um

coração pode suportar.”

Zelda Fitzgerald

SUMÁRIO

Dedicatória i

Agradecimentos ii

Lista de Figuras v

Lista de Tabelas vi

Resumo vii

Abstract viii

I. Introdução................................................................................................................1

II. Revisão de literatura..............................................................................................3

II. 1. A doença reumática mitral..............................................................................3

II. 2. Endotelinas......................................................................................................6

II. 3. A valva mitral1..............................................................................................14

II. 4. Disfunção valvar mitral................................................................................. 15

III. Objetivos............................................................................................................. 18

IV. Metodologia.........................................................................................................19

IV. 1. Material....................................................................................................... 19

IV. 2. Critérios de inclusão e exclusão.................................................................. 19

IV. 3. Métodos....................................................................................................... 21

IV. 3. 1. Histologia............................................................................................. 21

IV. 3. 2. Extração de RNA total........................................................................21

IV. 3. 3. Quantificação do RNA por espectrofotometria.................................. 21

IV. 3. 4. Obtenção de cDNA.............................................................................. 22

IV. 3. 5. Amplificação do DNA por PCR.......................................................... 22

IV. 3. 6. Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose........................... 23

IV. 4. Análise estatística........................................................................................ 23

V. Resultados............................................................................................................. 24

V. 1. Histologia ...................................................................................................... 29

VI. Discussão............................................................................................................ 36

VII. Conclusão...........................................................................................................39

VIII. Referências bibliográficas................................................................................ 40

IX. Anexos................................................................................................................. 49

LISTA DE FIGURAS

1. A estrutura da endotelina-1...................................................................................8

2. Válvulas mitrais reumáticas ................................................................................ 20

3. Prevalência dos sintomas nos indivíduos.................................................................26

4. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando calcificação,

fibrose e infiltrado mononuclear. HE, 200x............................................................. 31

5. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando calcificação. HE,

400x............................................................................................................................ 31

6. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando área com fibrose.

HE, 100x.................................................................................................................... 32

7. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando infiltrado de

mononucleares. HE, 400x ......................................................................................... 32

8. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando neoformação

vascular. HE, 200x ....................................................................................................33

9. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando ossificação. HE,

200x............................................................................................................................ 33

LISTA DE TABELAS

1. Dados ecocardiográficos dos pacientes................................................................. 25

2. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes com

acometimento valvar unicamente mitral.................................................................. 26

3. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes com

acometimento valvar mitro-aórtico.......................................................................... 27

4. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes submetidos a

reoperação mitral...................................................................................................... 27

5. Dados histológicos individualizados dos pacientes...............................................30

6. Dados do p-valor, faixa etária e sexo x presença dos genes ..................................34

7. Dados do p-valor, sintomas x presença dos genes..................................................34

8. Dados do p-valor, subgrupos x presença dos genes................................................35

vii

RESUMO

Introdução: o estudo da substância vasoconstritora endotelina-1 e de seus receptores A

e B, desde sua descoberta em 1988, tem crescido progressivamente nos últimos anos.

Isso se deve ao seu reconhecimento como elemento crítico na fisiopatologia de diversas

doenças, com destaque para aquelas de acometimento cardiovascular. Sua função na

vasorreatividade já é conhecida, bem como sua ação parácrina e autócrina, o que conduz

à procura de seus sítios de produção nos diversos tecidos. Essa busca objetiva desvendar

a contribuição de cada órgão no processo patológico, e também determinar a

participação de tais peptídeos nas modificações sofridas pelo próprio tecido nesse

processo (como a deposição de colágeno, ou a neovascularização). Nesse contexto, a

valvopatia reumática revela-se uma boa candidata à pesquisa, pelas suas características

mudanças estruturais valvares e pela repercussão que impõe à todo o sistema

cardiovascular e pulmonar. Objetivo: determinar, mediante técnicas moleculares, a

expressão dos genes da endotelina e dos seus receptores em valvas mitrais reumáticas.

Metodologia: 27 pacientes submetidos a troca valvar mitral tiveram seu tecido valvar

analisado para determinação da presença de genes da ET-1 e seus receptores A e B; foi

feita análise histológica e molecular das valvas (divididas em fragmentos M1, M2 e

M3) e colhidos dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Foram divididos em 3

grupos (valvopatia mitral, mitroaórtica, pacientes reoperados). Resultados: O estudo

mostrou a manifestação do gene da endotelina-1 em 40,7% dos espécimes e de seu

receptor A em todas as amostras, com manifestação minoritária do gene do receptor B

(22,2%). Conclusões: todos os pacientes expressaram a presença do gene do receptor

A; não houve diferença estatística quanto a gravidade da doença, expressa em classe

funcional, e os subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes

reoperados), ou quanto a expressão dos genes da ET-1 e seus receptores, entre os

subgrupos estudados (valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes reoperados).

Palavras-chave: endotelina-1; valva mitral; reação de PCR.

viii

ABSTRACT

Introduction: the study of the vasoconstrictor substance endothelin-1 and its receptors

A and B, since its discovery in 1988, has grown gradually in the last years. This is due

to their recognition as a critical element in the pathophysiology of many diseases, with

emphasis on those from cardiovascular involvement. His role in vasorreactivity is

already known, as well as its autocrine and paracrine actions, leading to demand for its

production sites in various tissues. This search aims to unveil the contribuction of each

organ in the pathological process, and also determine the involvement of these peptides

in the modifications made by the tissue in the process (as the deposition of collagen, or

neovascularization). In this context, rheumatic valve disease proves to be a good

candidate to search, due their characteristics valve structural changes and the impact of

the whole cardiovascular and pulmonary sistems. Objective: to determine, through

molecular techniques, the expression of genes of endothelin and its receptors in

rheumatic mitral valves. Methodology: 27 patients undergoing mitral valve

replacement had their valve tissue analyzed for determining the presence of genes of

ET-1 and its receptors A and B; was made histological and molecular analysis of the

valves and collected clinical and epidemiological data of patients. They were divided

into 3 groups (mitral valvophaty, mitroaortic, patients reoperated). Results: the study

showed the gene expression of enothelin-1 in 40,7% of the samples, and its receptor A

in all samples, with minority manifestation of the gene of receptor B (22,2%).

Conclusions: all patients expressed the gene of receptor A; there was no statistical

difference regarding the severity of illness, expressed in functional class, and the

subgroups studied (mitral valvophaty, mitroaortic and reoperated patients), or in the

expression of genes of ET-1 and their receptors, among the subgroups studied.

Key words: endothelin-1; mitral valve; PCR reaction.

I. INTRODUÇÃO

As cardiopatias são doenças de alta prevalência

, tornando seu conhecimento,

diagnóstico e tratamento, objeto de intensa pesquisa em âmbito mundial. Nos países em

desenvolvimento, adquire destaque a cardite reumática, complicação temida da doença

reumática em nações cuja atenção à saúde é deficiente

A valvopatia reumática acomete a valva mitral, promovendo seqüelas que

resultam em regurgitação ou insuficiência valvar

. As alterações em câmaras cardíacas

esquerdas se associam a disfunção endotelial com aumento dos níveis de ET-1, peptídeo

vasoconstritor de grande potência, que também estimula a proliferação de miócitos

vasculares

. Tais modificações tem conseqüências sobre a circulação pulmonar, muitas

vezes determinando a hipertensão pulmonar (HP)

. No entanto, a presença da ET-1 e

seus receptores na própria valva mitral, aumentando a deformação valvar reumática,

ainda é um assunto não abordado na literatura.

As endotelinas e seus receptores são consideradas chave para uma promissora

linha de tratamento de doenças como a HP e insuficiência cardíaca congestiva (ICC)

. A

identificação de sítios produtores desses peptídeos e o bloqueio de seus receptores

tissulares teoricamente mitigariam seus efeitos nefastos sobre a hemodinâmica

colaborando para o reequilíbrio entre substâncias responsáveis pelo tônus vascular,

cerne de doenças como a ICC ou a HP.

No entanto, definir a importância do sistema de endotelinas na doença reumática

mitral e HP a ela associada depende de etapas intermediárias, entre elas determinar a

importância da própria valva mitral acometida como sítio produtor desses peptídeos.

Através de técnicas moleculares, é possível avaliar a presença de gene que codificam

tais peptídeos no tecido valvar mitral. Esse seria um passo decisivo na descoberta da

associação entre a ET-1 (e seus receptores) e a valva mitral.

Também é de relevância a determinação da associação entre características

clínicas e epidemiológicas individuais e a presença do gene da ET-1 e seus receptores.

Talvez a existência de algum sintoma específico seja preditor da presença ou não desses

genes, bem como a gravidade em que se manifesta a doença no paciente. Não se sabe se

pessoas submetidas a cirurgia prévia que não a troca valvar (comissurotomia, p. ex.)

apresentam modificações na presença dos genes que codificam esses peptídeos no

tecido valvar mitral.

Como discutido, a pesquisa da presença dos genes correspondentes ao sistema

de endotelinas em valvas mitrais reumáticas podem ser de grande ajuda na terapêutica

e talvez na modificação da história natural da valvopatia reumática e suas complicações.

No entanto, encontra-se em fases iniciais, e carece de inúmeras respostas que podem ter

resposta na análise molecular tecidual.

Considerando-se que a ativação do sistema de endotelinas tem ação tão

abrangente no sistema cardiovascular, além da reconhecida ação parácrina e

autócrina

7,8

, investigamos a presença da ET-1 e seus receptores em valvas mitrais

reumáticas, afim de esclarecer a existência de tais peptídeos no tecido acometido por

essa doença.

II. REVISÃO DE LITERATURA

II. 1. A doença reumática mitral

Febre Reumática (FR) é uma doença reumática, inflamatória, de origem auto-

imune e recidivante, em resposta do organismo a infecções pelo estreptococo

(Streptococcus pyogenes) do grupo A de Lancefield. Tal associação etiológica foi

inicialmente observada por Coburn, em 1930.

A doença acomete cerca de 14 milhões de pessoas em todo o mundo, levando

um número de 3 milhões de pacientes à hospitalizações freqüentes devido a

insuficiência cardíaca congestiva. A doença reumática cardíaca foi responsável por 332

mil óbitos mundialmente, em 2000

, sendo creditados em torno de 233 mil mortes aos

países em desenvolvimento

O impacto da doença também é preocupante para a saúde pública brasileira,

onde registram-se cinco mil casos novos ao ano

. Segundo Terreri et al

, o custo anual

da doença reumática é de US$ 50 milhões, correspondendo à 90% das indicações

cirúrgicas pediátricas do Sistema Único de Saúde (SUS).

Em países desenvolvidos, observa-se queda da prevalência da doença,

certamente graças às melhorias das condições socioeconômicas e culturais e à

abrangência da atenção básica à saúde – com diagnóstico precoce e antibioticoterapia

para infecções respiratórias

. A febre reumática continua prevalente no Brasil, onde

acomete cerca de 3 a 5% de crianças e adolescentes

. Sua epidemiologia assemelha-se

com a da faringite causada pelo Streptococcus ß hemolítico do grupo A, que promove a

ocorrência de surtos de FR (em torno de 3% da população afetada pela faringite).

Existem cepas de estreptococos do grupo A ditas reumatogênicas, ou seja,

responsáveis pelos surtos de febre reumática aguda. Isso se deve a virulência

diferenciada desse subgrupo, representada pela riqueza em proteína M e ácido

hialurônico na sua cápsula, determinando propriedades antifagocíticas

. Aquela é

estruturalmente homóloga à miosina e estende-se da superfície celular como uma α

hélice. A ativação do linfócito T é feita por essa proteína, combinados com HLA-DR7

(a identificação de alguns alelos do sistema HLA sugere a presença de susceptibilidade

genética à FR), que dão origem à receptores de membrana das células apresentadoras de

antígenos (linfócitos B, monócitos, macrófagos e células dendríticas)

. A produção de

anticorpos pelos linfócitos B ativados faz com que aqueles infiltrem o tecido valvar,

aumentando a expressão da molécula de adesão VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion

Molecule-1). O linfócito T adere à tal molécula através do ligante VLA-4 (Very Late

Antigen-4), contribuindo para a lesão reumática

Anticorpos anti-proteína M contribuem para a doença valvar via mimetismo

molecular com a miosina que, apesar de não estar presente na valva, se liga a ela pela

laminina. Anticorpos antimiosina reconhecem a laminina, uma proteína da matriz

extracelular composta predominantemente por α hélice, parte da estrutura da membrana

basal valvar

. No tecido valvar, células inflamatórias novamente são responsáveis pela

liberação local de citocinas e lesão de células intersticiais com neovascularização e

inflamação crônica. Macrófagos são ativados e atraem as células T. A destruição valvar

pode expor mais antígenos, de modo progressivo

A reação inflamatória é chamada exsudativa, em sua fase inicial. Caracteriza-se

pelo edema intersticial, fragmentação de fibras colágenas, infiltração

linfocitária/plasmocitária e degeneração fibrinóide. A fase mais tardia é dita

proliferativa, determinada por lesões contínuas à fase anterior: necrose fibrinóide

perivascular circundada por linfócitos e plasmócitos, além dos característicos miócitos

de Anitschkow (células basofílicas grandes e multinucleadas). Estas lesões são

conhecidas como nódulo de Aschoff

A endocardite é o componente mais importante da pancardite reumática. A

valvulite resultante, associada à dilatação do anel mitral e disfunção papilar, é

determinante na patogênese da regurgitação valvar

. Associam-se outras lesões,

reconhecidas como pertencentes à fase crônica da doença valvar reumática: fibrose com

ou sem calcificação, espessamento com retração cicatricial; fusão de comissuras, com

perda do endotélio e erosão com formação de trombo; as cordoalhas, engrossadas e

retraídas; lesões verrucosas ou vegetações reumáticas, predominantes nas margens

livres das valvas. A cicatrização é importante na evolução da doença valvar e é

acompanhada pela neovascularização de uma estrutura outrora avascular

. O

aparecimento de vasos neoformados é limitado à camada esponjosa, onde encontram-se

também células inflamatórias

Quando submetidas à análise de sua espessura média, as válvulas reumáticas

apresentam medidas superiores (especialmente quando consideradas as suas

extremidades) comparadas às normais ou associadas a outras doenças (carcinóide,

relacionada ao uso de anorexígenos); possuem, ainda, uma quantidade inferior de

glicosaminoglicanos e elastina, mas superior de músculo e colágeno. Esse último,

componente característico de processos tardios de cicatrização, já seria intuitivamente

esperado, por serem os pacientes candidatos à cirurgia normalmente portadores de

doença reumática crônica

. Vale ressaltar que, com o avançar da idade, há o aumento

de espessura, sem alteração significativa da composição valvar

O diagnóstico da FR é baseado no reconhecimento das combinações de alguns

achados clínicos, inicialmente descritos por T. Duckett Jones, em 1944. Os critérios de

Jones (modificados em 1992 por Dajani et al

), utilizados como guia para o diagnóstico

da FR, baseiam-se na divisão dos achados clínicos e laboratoriais da doença em sinais

maiores ou menores, segundo as respectivas importâncias diagnósticas, sem significado

prognóstico por si só. A presença de dois sinais maiores, ou de um sinal maior e dois

menores, indica alta probabilidade diagnóstica, se acompanhados da evidência de

estreptococcia prévia. Os critérios maiores são poliarterite, cardite, coréia, nódulos

subcutâneos e eritema marginado, e os menores são febre, artralgia, aumento do

intervalo PR no eletrocardiograma e aumento nos valores laboratoriais da VHS

(velocidade de hemossedimentação), PCR (proteína C reativa) ou leucocitose

No entanto, o diagnóstico da FR continua sendo desafiante para os médicos,

tornando importante a caracterização clínica e demográfica dos pacientes. Um estudo

nacional avaliou tais características

: a prevalência em mulheres, em crianças de cinco

anos a adolescentes de 15 anos, sendo a cardite a segunda manifestação clínica mais

freqüente (a artrite é a mais comum). Quando o processo inflamatório é mais intenso, a

anemia e a elevação da VHS e α1 glicoproteína podem ocorrer, bem como da

gamaglobulina (ratificando a participação da resposta humoral)

Sendo a valvopatia reumática uma seqüela crônica da febre reumática e a doença

mais frequentemente associada com a valvopatia pós-inflamatória (encontrada em

várias outras doenças

), mesmo em pacientes assintomáticos do ponto de vista

cardiovascular, a realização do ecocardiograma pode ajudar o diagnóstico. Crianças

com cardite reumática subclínica apresentam alterações ecocardiográficas persistentes

em 35% dos casos

A profilaxia primária tem sido muito debatida, mas o tratamento com penicilina

V oral 500.000 unidades normalmente cura a faringite estreptocócica (exceto se for

causada por cepa reumatogênica). Se a FR é muito prevalente na comunidade, ou

estreptococos do grupo A são identificados, a terapêutica deve completar 10 dias. A

imunização de populações em risco através de vacinas multivalentes compostas pela

combinação dos sorotipos M mais encontrados (entre os mais de 90 já identificados), é

promissora; assim também é a imunização oral. A prevenção secundária das

recorrências reumáticas é feita através da administração de 1,2 milhões de unidades de

penicilina G benzatina mensalmente, ou a cada 3 semanas. O tempo pelo qual o

tratamento deve ser mantido dependerá do julgamento clínico do risco, envolvendo

variáveis como a gravidade do acometimento agudo ou a presença de cardite

reumática

O tratamento preventivo dos danos valvares não mudou nas últimas décadas. A

utilização de drogas inibidoras do TNF, baseada na ação citotóxica celular autoimune da

doença, possivelmente pode diminuir a deformidade valvar. O uso de corticóides para o

tratamento da cardite reumática justifica-se pela sua potência antiinflamatória, em casos

graves

II. 2. Endotelinas

A endotelina, peptído com forte potência vasoconstritora (considerada dez vezes

mais potente que a angiotensina II), foi inicialmente descrita por Yanagisawa em

1988

. Isolada e purificada a partir de cultura celular endotelial bovina, rapidamente

estabeleceu-se como de fundamental importância nos processos moleculares

responsáveis pela manutenção do tônus vascular, bem como pela sua expressão

aberrante em determinadas situações patológicas.

A importância das endotelinas e de seus receptores na patogênese de diversas

doenças, em especial aquelas em que a vasoconstrição e a proliferação celular

excessivas estão envolvidas, tem sido objeto de intensa pesquisa desde a sua descoberta.

Além disso, são importantes reguladoras da deposição de colágeno e matriz

extracelular

. Exercem múltiplos efeitos biológicos, através de seus receptores A e B, e

suas concentrações tissulares refletem com maior precisão a ativação do sistema das

endotelinas

Reconhecidamente a mais importante para a espécie humana, a ET-1 tem sido o

isopeptídeo mais estudado em sua família (composta pelas endotelinas 1, 2 e 3 – ET-1,

ET-2 e ET-3). De incontestável relevância no sistema cardiovascular

5,4

, a ET-1 é

codificada por genes localizados no cromossomo 6

e são abundantes no endotélio, o

que motivou sua denominação. No entanto, podem ser produzidas em outros tipos

celulares: células tubulares renais, neurônios do sistema nervoso central, neurônios

simpáticos pós-ganglionares, monócitos e macrófagos. Sob condições pró-inflamatórias,

também é produzida pelas células musculares lisas vasculares

A produção intracelular da ET-1 ocorre através de uma reação proteolítica

bifásica, pois seus dois precursores (preproET-1 e bigET-1) são processados por duas

proteases para a obtenção da forma biologicamente ativa. A preproET-1, peptídeo com

aproximadamente 200 aminoácidos, é clivada por endopeptidases neutras dependentes

de cálcio semelhantes à furina – enzima pertencente a família das subtilisinas

. É

formado um composto intermediário, biologicamente inativo, chamado big ET-1,

transformado no produto final (ET-1) por metaloproteases ligadas à membrana celular

que rompem o peptídeo precisamente na posição Trp-Val

. A importância dessa

conversão justifica-se pela potência vasoconstritora 140 vezes maior da ET-1 em

relação ao seu antecessor

. Essa família de metaloproteases (pertencentes à

superfamília das neprilisinas

) é chamada de enzima conversora de endotelina (ECE).

Suas variadas posições subcelulares, dependentes da isoforma de ECE em questão,

permitem que a conversão a ET madura se dê tanto na superfície celular quanto em seu

interior

. A ET-1, resultante do processo acima descrito, é um peptídeo de 21

aminoácidos formando uma alça fechada por duas pontes dissulfeto.

Figura 1. A estrutura da endotelina-1 (Masaki, 2004)

Foram identificadas duas variantes de ECE, denominadas 1 e 2: a primeira,

encontrada em várias células (inclusive endoteliais), é capaz de converter a big ET-1 em

ET-1 tanto na superfície celular quanto no interior desta, graças ao seu pico de ação em

pH neutro; a segunda, presente em outros tipos celulares, como neurônios, tem boa ação

intracelular, devido a sua afinidade pelo pH ácido

4,25

Além da própria ET-1, a angiotensina II, catecolaminas, cardiotrofina-1,

trombina, fatores de crescimento, citocinas, radicais livres, insulina, hipóxia, e distensão

dos vasos, são responsáveis pela liberação da ET-1 pelo endotélio

26,27,28,29,30

. Já a sua

síntese é inibida pelo óxido nítrico, peptídeos natriuréticos, heparina, prostaglandinas,

homocisteína e estrógeno

31,32,33,34,35

Liberada na luz dos vasos a partir do endotélio, a ET-1 age de maneira autócrina

e parácrina, e não como um hormônio

. É uma molécula de clearence rápido,

principalmente pulmonar (circulação onde 50% da ET-1 é depurada numa só

passagem

36,37

) com uma meia-vida de 1 minuto e efeitos pressóricos mantidos por 1

hora

38,39

. Normalmente, detecta-se pequena quantidade no plasma, níveis que não se

correlacionam com sua atividade, pois representam o excesso das moléculas que não se

ligaram aos receptores teciduais

A existência dos receptores A e B (ETRA e ETRB), responsáveis por mediar os

efeitos das ET em mamíferos, classificados com base em sua potência em resposta às

ET’s, sendo ET-1 = ET-2 >> ET-3 para o ETRA e ET-1 = ET-2 = ET-3 para a ETRB

São muitas as formas através das quais a ET-1 age, mediando alguns

mecanismos em diversas doenças cardiovasculares. Promove a formação de ânion

superóxido, que ativa a família do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB); esse inicia a

expressão de genes que codificam moléculas proaterogênicas e pró-inflamatórias

(adesinas: VCAM-1, ICAM-1, E-selectin; citocinas inflamatórias: IL-6 e 8). Essas

reações são co-responsáveis pela indução e progressão da aterosclerose, além da

desestabilização da placa aterosclerótica

. Além disso, o NF-κB modula a apoptose

feita pelo TNF, garantindo a sobrevivência do cardiomiócito e a manutenção da função

e do remodelamento cardíacos em situações de stress.

A ET-1 também exerce importante papel no remodelamento de artérias de baixa

resistência e na hipertrofia ventricular esquerda. Isso se deve a sua ação estimuladora na

atividade do gene do colágeno I, na deposição de proteínas da matriz extracelular, na

expressão de fibronectina e na potencialização dos efeitos do fator de crescimento

transformador β (TGF-β) e do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)

A ET-1 necessita de concentrações picomolares no plasma para atingir seus

efeitos fisiológicos

, insuficientes para exercer tais ações nos receptores, sugerindo que

a ET-1 age de modo parácrino ou autócrino no coração

42, 8

. Tais níveis séricos não se

correlacionam com sua atividade, já que representam apenas as moléculas que não se

ligaram aos receptores teciduais

Ambos os receptores de endotelina são membros de uma superfamília de

receptores acoplados a proteína G de hepta hélice, com uma média de tamanho de 45 a

50 kDa e codificados por gene localizados no cromossomo 4 e 13, respectivamente

. O

receptor A possui uma cadeia de 427 aminoácidos, e apresenta uma similaridade de

64% com a molécula de 442 aminoácidos do receptor B

. Consistem em moléculas

com extremidade amino extracelular e outra carboxi intracelular (esta última com sítio

de fosforilação). Mesmo antes de serem assim denominados, os receptores de ET já

podiam ser diferenciados pela sua afinidade preferencial por moléculas de ET-1, 2 e 3; o

ETRA, como já comentado, tem uma enorme afinidade para ligação com ET-1 e 2,

quatro à oito vezes maior em relação a ET-3

A análise de tecidos humanos por técnicas moleculares revela a presença de

ETRA numa grande variedade deles, principalmente em células da musculatura lisa

vascular pulmonares e sistêmicas

. Através desse receptor ocorre a contração dessa

musculatura em modelos experimentais

, muitas vezes simultaneamente à ação de

ETRB coexistente

. Seu mapeamento in vivo mostra sua presença em diversos tecidos:

pulmões, coração, rins, intestino, adrenais, olhos e cérebro. Sua densidade é

especialmente alta nos dois primeiros sítios; nos pulmões, uma distribuição abrangente,

principalmente nos brônquios, e no coração, no sistema condutor, átrios, ventrículos e

artérias coronárias

Foram descritos dois padrões de ligação da ET-1 aos receptores A e B. Tais

padrões produzem aumento do cálcio intracelular: num deles o aumento é fugaz (2-5

segundos), no outro é mantido por 20 minutos. Tal comportamento é dito bifásico

50,51

O mecanismo de ação atualmente aceito dos canais iônicos e mensageiros ocorre através

de liagação da ET-1 ao receptor, estimulando a fosfolipase C, que hidrolisa o

fosfatidilinositol 4,5 bifosfato para formar o trifosfato de inositol (IP 3), hidrossolúvel, e

o diacilglicerol (DAG), neutro. IP3 induz a mobilização do Ca

do retículo

sarcoplasmático com os receptores IP3 promovendo o primeiro aumento transitório de

[Ca

. A abertura de canais de Ca

pode ser direta ou indiretamente acionada pela

depleção dos estoques de Ca

citosólicos. O DAG abre canais de Ca

operados por

receptores (ROC – receptor-operated Ca

channels).

A elevação do [Ca

]i ativa vários canais iônicos resultando na entrada de Ca

através da membrana citoplasmática

. Ativa canais de cloreto, promovendo o efluxo

destes íons, despolarização celular, ativação de canais de Ca

voltagem-dependente e

influxo de Ca

51,54

. Os canais de K

voltagem-dependentes também promovem influxo

de Ca

através dos canais de Ca

voltagem-dependentes

. A ativação do trocador de

/Ca

resulta em alcalinização das células e promove o influxo de Ca

. O

aumento de [Ca

]i também pode disparar a liberação de Ca

do retículo

sarcoplasmático, ativando os canais de K

ativados-por-Ca

++ 57

Como observado, a ET-1 medeia os sinais para mobilização do cálcio, através de

vários canais iônicos. Portanto, a expressão relativa e distribuição desses canais iônicos

determinam a resposta celular à ativação pela ET-1. O sinal de feedback negativo,

responsável pela interrupção da mobilização de íons cálcio, é dado pela cinase C

protéica, ativada pelo DAG e pelo próprio Ca

. A cascata de sinalização intracelular

quando da ativação do ETRB é semelhante àquela descrita para o receptor A; além

desse mecanismo, o receptor B ativa a fosfolipase A

, liberando tromboxano A

prostaglandinas E

e I

, importantes na reação inflamatória e vasorreatividade

. Há uma

mudança fenotípica de um subtipo de receptor de ET para outro de acordo com

condições encontradas in vitro nas culturas de células musculares lisas vasculares e, se

essas expressarem ETRB, a ET-1 torna-se um mitógeno mais potente em tais células

O efeito dos receptores de endotelina na rede vascular se faz sentir de diferentes

maneiras. O ETRB tem um duplo efeito no tônus vascular: vasodilatador, quando

receptores localizados no endotélio são ativados, produzindo óxido nítrico e metabólitos

vasodilatadores da ciclooxigenase; vasoconstritor, quando acionados ETRB no músculo

liso vascular. O ETRA tem mecanismo de ação vasoconstritor semelhante na

musculatura lisa vascular

Não é inteiramente conhecida a ação hemodinâmica basal das endotelinas

endógenas, bem como a suposta proteção exercida pelo ETRA ao organismo contra tais

ações. Supõem-se que o papel desse último no tônus vascular basal de indivíduos

normais seja pouco relevante, já que o bloqueio desse receptor pode não modificar a

pressão arterial

Os receptores são expressos de forma heterogênea no tecido cardíaco, com

ETRA predominando nos miócitos. Sua estimulação tem efeitos inotrópico e, menos

freqüentemente, cronotrópico positivos

. Além disso, estimula a hipertrofia cardíaca,

uma importante resposta adaptativa, é induzida pela ET-1 em culturas de miócitos

cardíacos, provavelmente pela ativação da família MAPK (cinases protéicas ativadas

por mitogênese) que estimula a produção do protooncogene c-jun e seus efeitos

promotores do crescimento

Os receptores A também tem função de estimular o stress oxidativo vascular, já

que a geração de espécies (ou ânions) reativas do oxigênio (ROS, em inglês) levam ao

crescimento da musculatura lisa vascular, hipertrofia cardíaca, e deficiência do

relaxamento dependente do endotélio, todas essas ações características da ET-1 e de

relevância na hipertensão arterial

. Além disso, promovem o crescimento e proliferação

das células musculares lisas vasculares

Apesar das conhecidas interações entre as endotelinas e seus receptores, algumas

vezes estas podem ser inesperadas e paradoxais. Isso pode ser explicado pela hetero e

homodimerização desses receptores, que dão origem a moléculas semelhantes aos

receptores originalmente conhecidos, mas com algumas características próprias

A intensa pesquisa laboratorial envolvendo as ET’s e seus receptores, bem como

dos antagonistas desses, justifica-se pela sua resposta farmacológica única e sua

possível correlação com doenças cardiovasculares

. As ações das ET’s no sistema

cardiovascular e sua atividade pró-inflamatória despertam grande interesse na

determinação de sua participação nos mecanismos fisiopatológicos daquelas

enfermidades. Dentre elas, destaca-se a hipertensão pulmonar, ora como via final de

várias cardiopatias, ora como perpetuadora dessas condições mórbidas

Na insuficiência cardíaca sua concentração sanguínea está aumentada, talvez por

uma expressão majorada do mRNA da ET-1

. Disso resulta a importância do

mapeamento do sistema de endotelinas no tecido cardíaco, em situação de homeostase

ou patológica, visando definir sua relevância em cada um dos contextos.

Sua localização nos diversos tecidos cardíacos revela importantes informações,

como a de que os miócitos cardíacos não são produtores de ET-1 na espécie humana

Aparentemente, as células endoteliais endocárdicas são as maiores responsáveis pela

liberação de endotelinas, modulando a ação de células vizinhas: inotropismo positivo

nas câmaras cardíacas e, possivelmente, contribuindo para a fibrilação atrial

A participação do sistema de endotelinas na fisiopatologia e nas alterações

morfológicas da valva mitral na doença reumática é desconhecida. Sabe-se que existe

associação entre portadores de determinados HLA (DR7 e DRw53 entre os

brasileiros

) com o desenvolvimento de febre reumática ou cardiopatia reumática. Isso

demonstra o envolvimento de mecanismos imunológicos celulares e humorais, e

inflamatórios, representados por substâncias responsáveis pela síntese de citocinas pró-

inflamatórias, através da transcrição de seus genes. Entre eles, identificam-se o FNTα,

IL-1α e β, entre outros; contudo, o papel do sistema de endotelinas como marcador

genético da cardiopatia reumática é obscuro

Estudos conduzidos em animais, utilizando valvas mitrais, buscaram mostrar os

níveis de expressão da ET-1 e seus receptores nesse tecido, sugerindo uma correlação

entre os peptídeos e a mudança na composição dos folhetos com a idade

. Apesar de

terem sido utilizadas valvas mitrais mixomatosas, é possível fazer uma transposição dos

resultados para as valvas reumáticas, igualmente ricas em colágeno e fibroblastos.

Por outro lado, a ET-1 pode representar a ligação entre alterações vasculares e o

metabolismo acelerado do colágeno associado ao processo fibrótico em algumas

doenças

. Estimulada por forças de fricção, a síntese e a expressão de ET-1 ficam

aumentadas. Esse fator físico, encontrado em disfunções valvares onde a coaptação

entre os folhetos é deficiente – e pode se fazer mediante maior atrito – associa-se a

outros fatores, químicos e endógenos, determinando alterações na composição tecidual.

No entanto, estudos continuam a ser conduzidos no sentido de demonstrar essa

correlação entre os efeitos vasoconstritores e a fibrose tissular

. É possível que esse

mecanismo patológico venha a se mostrar relevante na valvopatia reumática, associando

níveis aumentados de ET-1 encontrados na doença às deformidades valvares.

A ET-1 tem efeitos pró-fibróticos, agindo através de seus receptores A e B,

encontrados nos fibroblastos. Neles, provoca aceleração da produção de matriz

extracelular

. Em tecidos onde essas células se encontram em quantidade, como na

doença valvar reumática, e onde podem ser encontrados níveis aumentados de ET-1,

pode-se esperar a progressiva alteração tecidual valvar como resultado.

Uma variedade de doenças cardiovasculares tem a participação de ET-1 em sua

patogênese. Considerando-se tudo o que foi discutido nos trechos acima, podemos

esperar aplicações terapêuticas dos antagonistas dos receptores de ET-1

. Através deles,

as ações do sistema de endotelinas podem ser revertidas, traduzindo-se em benefício

clínico para muitos pacientes. Além do alívio sintomático produzido, existem situações

outras em que tais medicações se mostraram igualmente benéficas, permanecendo

especulativa sua utilização em outras condições patológicas

. Nesse sentido, sua

indicação terapêutica em situações incomuns, como em pacientes com comorbidades do

tecido conjuntivo, como tratamento a longo prazo, ou mesmo em estágios mais

precoces, dependem do profundo conhecimento de suas ações, na saúde e na doença.

II. 3. A valva mitral

A valva mitral posiciona-se na transição atrioventricular esquerda, separando as

cavidades atrial e ventricular. Possui dois folhetos: o anterior, bem maior e o posterior,

menor. Ambos são divididos em zonas rugosa e lisa (a última na borda livre da valva).

São separados no anel mitral pelas comissuras posteromedial e anterolateral. O anel

fibroso mitral é formado por duas estruturas colagenosas: o trígono fibroso direito,

localizado entre o septo membranoso atrioventricular, as valvas mitral e tricúspide, e a

raiz aórtica; e o trígono fibroso esquerdo, na junção da valva mitral com a cúspide

coronariana esquerda da valva aórtica

. O anel posterior corresponde a 2/3 de todo o

anel mitral

Comunicando a valva mitral ao miocárdio ventricular encontram-se as

cordoalhas tendíneas e músculos papilares. Esses últimos são divididos em anterolateral

e posteromedial, e deles surgem as primeiras, classificadas em cordoalhas de primeira

ordem (que se fixam às bordas das válvulas), segunda ordem (mais espessas e menos

numerosas, unidas às válvulas entre as zonas lisa e rugosa, e mais proeminentes para a

válvula anterior) e terceira ordem (originadas na parede ventricular, fixam-se ao anel

mitral posterior). Totalizam em torno de 25 feixes tendinosos

A análise histológica do tecido valvar revela 3 camadas: a fibrosa, rica em

colágeno e contínua com a cordoalha tendínea; a camada esponjosa, que cobre a face

atrial e forma a borda da válvula (possui proteoglicanas, elastina e tecido conectivo em

abundância, e pouco colágeno); uma cobertura fibroelástica, fina na face atrial e espessa

na ventricular, chamada ventricularis

. Essa última camada produz mais elastina e

colágeno com o avançar da idade, tornando-se espessada. Existem, ainda, outras

estruturas musculares e neurais, importantes na coaptação valvar

II. 4. Disfunção valvar mitral

Existem duas disfunções valvares, conhecidas como estenose e insuficiência,

que não são mutuamente exclusivas, podendo coexistir. Definida como uma obstrução

ao influxo de sangue no ventrículo esquerdo em nível da valva mitral - resultante de

uma anormalidade estrutural - impedindo sua abertura durante a fase de enchimento

diastólico daquele, a estenose mitral tem diferentes etiologias. A predominante é a

cardite reumática, chegando a somar 99% das estenoses em algumas séries

. Causas

ditas não-reumáticas, como a calcificação anular ou valvar, deformidades congênitas,

síndrome carcinóide, trombo atrial esquerdo, endocardite, pós comissurotomias ou

implantes valvares protéticos, são menos comuns

Quando não tratada, a EM evolui de maneira insidiosa e estável nos primeiros

anos. Contudo, é uma doença contínua e pode progredir aceleradamente. Isso ocorre

principalmente se a infecção reumática for grave ou os episódios de cardite forem

recorrentes. O aparecimento de sintomas pode surgir após um período de latência de 20

até 40 anos, tornando-se debilitantes uma década depois. A sobrevida em dez anos dos

pacientes que atingem esse estágio da doença é de 80%, 50% ou 15%, se a

sintomatologia for mínima, moderada ou limitante, respectivamente. A mortalidade em

65% dos casos se deve a congestão sistêmica e pulmonar, embolia sistêmica em 25%,

embolia pulmonar em 10% e infecção em 1-5%

O achado macroscópico de espessamento e calcificação valvar e fusão

comissural e de cordoalhas assemelha o aparato mitral a um funil. Isso provoca

estreitamento do orifício valvar mitral e diminuição da área valvar correspondente,

normalmente em torno de 4-5 cm

, determinando o gradiente transmitral diastólico, que

resulta na elevação da pressão atrial esquerda, com reflexos sobre a circulação venosa

pulmonar. Mudanças iniciais sobre o leito venoso pulmonar são considerados

protetores, evitando pressões excessivamente altas.

O paciente com estenose mitral pode permanecer assintomático por longos

períodos de tempo

, apesar do débito cardíaco decrescente e resistência venosa e

arteriolar pulmonar aumentadas, e, eventualmente, alterações morfofuncionais da

vasculatura pulmonar

. A gravidade da vasculopatia pulmonar é determinante no

surgimento e agravamento dos sintomas nos pacientes com estenose mitral.

A sintomatologia associa-se com a área valvar encontrada, ainda que tal

correlação não seja sempre confiável. Anteriormente precipitados pelo exercício, stress

emocional, infecção, gravidez ou fibrilação atrial com alta resposta ventricular, os

sintomas resultam da atividade cotidiana quando a área valvar é inferior a 2,5 cm

Surgem sintomas em repouso quando essa área é inferior a 1,5 cm

. De acordo com

dados como o gradiente médio, pressão sistólica de artéria pulmonar e área valvar, a

gravidade da estenose mitral é avaliada, embora ainda não haja valor que a defina. Em

pacientes com área valvar maior que 1,5 cm

, gradiente médio menor que 5mmHg e

pressão sistólica da artéria pulmonar menor que 30mmHg, classifica-se a estenose

mitral como leve; aqueles com área valvar entre 1-1,5 cm

, gradiente médio entre 5-

10mmHg e pressão sistólica da artéria pulmonar entre 30-50mmHg, encontram-se

classificados como portadores de EM moderada. Finalmente, dados de área valvar

menor que 1cm

, gradiente médio maior que 10mmHg e pressão sistólica da artéria

pulmonar maior que 50mmHg, definem a EM como grave

A regurgitação ou insuficiência mitral é resultado do mau funcionamento ou

interação dos componentes valvares, subvalvares ou das câmaras cardíacas esquerdas. A

etiologia mais comum dessa disfunção valvar é a degeneração mixomatosa (prolapso

mitral), em 29-70% dos casos. Outras causas comuns são a insuficiência mitral

isquêmica (resultante de isquemia ou ruptura de músculo papilar após insulto

miocárdico isquêmico), insuficiência funcional (secundária a cardiomiopatia dilatada),

doença reumática, calcificação do anel mitral, endocardite infecciosa, entre outras

O átrio esquerdo dilata-se progressivamente, acompanhando a regurgitação

valvar crônica. Gradualmente, a pressão atrial esquerda pode elevar-se. Contudo,

aumentos pronunciados da resistência vascular pulmonar não são comuns, ao contrário

do que acontece com a estenose valvar

. A sintomatologia em pacientes portadores de

insuficiência mitral moderada pode ser inexpressiva, permanecendo esse assintomático

durante anos. Isso acontece devido a adaptação do ventrículo esquerdo ao aumento do

trabalho. O desenvolvimento de baixo débito cardíaco ou congestão pulmonar

acompanha-se de fadiga, fraqueza, dispnéia aos esforços e palpitações

A regurgitação mitral pode ser classificada ecocardiograficamente, de acordo

com critérios qualitativos e quantitativos. Entre os primeiros, encontramos a área do jato

central e a medida da vena contracta; já os critérios quantitativos são o volume

regurgitante, a fração regurgitante e a área do orifício regurgitante. Objetivamente, a

insuficiência é considerada leve quando o jato central é menor que 4cm

ou menor que

20% da área do átrio esquerdo, a vena contracta é inferior a 0,3cm, o volume

regurgitante é menor que 30ml, a fração regurgitante é menor que 30% e a área do

orifício regurgitante é inferior a 0,20cm

. É considerada moderada quando o jato central

tem características intermediárias entre leve e grave, a vena contracta tem medida entre

0,3 a 0,69cm, o volume regurgitante encontra-se entre 30 e 59ml, a fração regurgitante

está entre 30 e 49% e a área do orifício regurgitante tem valores entre 0,20 e 0,39cm

Finalmente, quando o jato central é grande ou superior a 40% da área do átrio esquerdo,

a vena contracta é superior ou igual a 0,7cm, o volume regurgitante é maior que 60ml, a

fração regurgitante é menor que 50% e a área do orifício regurgitante é superior a

0,40cm

. Além desses parâmetros, a função ventricular, determinada pela fração de

ejeção e pelo diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo, auxiliam na orientação

terapêutica

Em ambas as disfunções valvares mitrais, a utilização da ecocardiografia

transtorácica ou transesofágica tem se tornado importante, não só para o diagnóstico,

mas para o acompanhamento da dilatação de câmaras e magnitude do fluxo ou refluxo

transvalvar. Através do Doppler de fluxo colorido, tal fluxo pode ser quantificado pelo

seu padrão, direção, velocidade, duração e intensidade. Pode-se avaliar as condições e

características do aparelho subvalvar, morfologia das cordoalhas, mobilidade dos

folhetos. Além disso, cálculos indiretos da área valvar podem ser feitos, auxiliando a

classificação da disfunção valvar.

III. OBJETIVOS

III. 1. Objetivos Gerais

O objetivo geral deste projeto é determinar, mediante técnicas moleculares, a

expressão dos genes da endotelina e dos seus receptores em valvas mitrais reumáticas.

III. 2. Objetivos Finais

1. Desenvolver rotinas de técnicas moleculares na identificação de genes da ET-1 e

de seus receptores em tecido valvar;

2. Investigar se existe correlação entre a presença dos genes de ET-1, ETRA e

ETRB nas valvas e:

 os diferentes subgrupos pesquisados (valvopatia mitral pura, doença

mitro-aórtica e submetidos a reoperação);

 o sexo dos pacientes, e a faixa etária na qual se encontram (inferior ou

superior a 50 anos);

 e os sintomas apresentados.

IV. METODOLOGIA

IV. 1. Material

Foram coletadas 27 amostras de válvulas junto a serviços de Cirurgia

Cardiovascular (Instituto do Coração InCor-DF e Hospital de Base do DF),

posteriormente submetidas a análise histológica e molecular. Os pacientes, adultos e de

ambos os sexos, foram escolhidos dentre aqueles admitidos com doença mitral

reumática e indicação para substituição cirúrgica da válvula nativa por prótese.

IV. 2. Critérios de inclusão e exclusão

O procedimento cirúrgico foi realizado após coleta de exames laboratoriais

sumários (bioquímica sanguínea e hemograma; ecocardiograma transtorácico;

cineangiocoronariografia para aqueles com idade superior a 40 anos ou com

necessidade de estudo mais aprofundado de pressões intracardíacas).

Foram incluídos no estudo portadores de valvopatia mitral de características

reumáticas ao ecocardiograma, isolada ou em associação à outra valvopatia (aórtica,

tricúspide), com indicação classe I de intervenção cirúrgica por critérios pré

estabelecidos nas Unidades de Cirurgia Cardiovascular escolhidas, sem indicação de

valvotomia percutânea ou reparo valvar (comissurotomia/valvoplastia mitral). Era

considerada indicaçào pacientes com estenose mitral moderada ou grave (área valvar

mitral ≤ 1,5cm

) e classificação funcional III ou IV (NYHA). Pacientes com

insuficiência, sintomáticos (NYHA II, III e IV) com função ventricular esquerda normal

(fração de ejeção > 60% e diâmetro endossistólico de ventrículo esquerdo < 45mm), ou

com disfunção leve de ventrículo esquerdo (fração de ejeção 50-60% e diâmetro

endossistólico de ventrículo esquerdo 45-50mm) ou moderada (fração de ejeção 30-50%

e diâmetro endossistólico de ventrículo esquerdo 50-55mm). Foram incluídos pacientes

já submetidos a cirurgia de comissurotomia mitral, e que concordasse em participar do

estudo (através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE).

Foram excluídos do estudo pacientes candidatos a valvotomia percutânea ou

cirurgia para reparo valvar; portadores de outras doenças cardiovasculares que tivessem

indicação cirúrgica (doença coronariana obstrutiva, aneurismas de ventrículo esquerdo,

anomalias cardíacas congênitas cianóticas ou acianóticas); já operados com troca valvar

mitral (ausência de tecido valvar mitral nativo); não concordância em participar do

estudo.

Esses foram internados e submetidos aos exames pré-operatórios de rotina em

cada instituição. Previamente informados e consultados a respeito de seu consentimento

em participar do estudo, preencheram e concordaram com o Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido - TCLE (Anexo I). Dados pessoais e epidemiológicos dos pacientes

foram colhidos, bem como algumas informações a respeito da sintomatologia e

classificação funcional (NYHA) ecocardiográficas (valvopatia mitral predominante,

estimativa de área valvar, estimativa de pressão sistólica pulmonar, área do orifício

regurgitante efetivo, volume regurgitante).

Imediatamente após a sua retirada, o segmento da válvula obtido era

fragmentado obedecendo o seguinte: considerando toda a extensão do fragmento

retirado, esse sempre tinha tecido valvar da extremidade livre até próximo ao anel

mitral; esse tecido valvar era, então, separado em 3 segmentos grosseiramente iguais em

tamanho, nomeados M1, M2 e M3 (Figura 1): o primeiro próximo do anel mitral, o

terceiro na extremidade, em contato com a cordoalha tendínea, e o segundo na região

intermediaria. Tal divisão pretendia a diferenciação em regiões que são,

macroscopicamente, distintas quanto ao seu acometimento pela doença reumática,

unicamente para análise histológica.

Figura 2

. Válvulas Mitrais

Reumáticas. Fragmento retirado em

cirurgia do paciente 9. Encontraram-

se músculos papilares

macroscopicamente fibrosados e

calcificados, além de calcificação e

retração dos folhetos anterior (à

direita na foto) e posterior (à

esquerda). Autor: Edmilson B. de

Moura, 2006.

IV. 3. Métodos

IV. 3. 1. Histologia

Todas as válvulas retiradas e fragmentadas foram fixadas em solução de

formalina neutra 10% (pH 7,0), sendo posteriormente submetidas a descalcificação,

inclusão em parafina e corte ao Micrótomo, a uma espessura de 4µc. A coloração foi

feita pela técnica de hematoxilina e eosina. Cada segmento foi analisado quanto à

presença de fibrose, calcificação, ossificação, neoformação vascular e infiltrado

mononuclear.

IV. 3. 2. Extração RNA total

A extração do RNA total das 27 amostras foi realizada por meio da utilização do

reagente Trizol® (Total RNA isolation Reagent - Invitrogen®). O RNA total de três

diferentes fragmentos das três regiões da válvula mitral (M1, M2 e M3) foi extraído

separadamente usando 100µL do reagente TRIZOL.

Esse método consiste na maceração de aproximadamente 100µg de tecido valvar

(previamente congelado a -80ºC), com motor manual (Motor Cordless - Kontes) em

capela de fluxo laminar. Uma vez homogeneizado, o tecido foi submetido à repetidas

centrifugações, purificação com clorofórmio, precipitação com isopropanol e limpeza

com etanol 75%.

IV. 3. 3. Quantificação do RNA por espectrofotometria

Foi realizada a diluição de 4µL RNA em 196µL de água milliQ, totalizando

200µL de solução. Essas amostras foram colocadas em cubeta específica e analisadas no

Espectrofotômetro (UV-1601 - UV Visible Spectrophotometer – Shimadzu

Corporation). Os valores de absorbância encontrados foram analisados de acordo com a

fórmula: [RNA (µg/mL)] = 40 x A260 x diluição / 1000 (Maniattis). A avaliação de

pureza foi feita por meio da razão entre os valores de absorbância obtidos à 260nm e

280nm (A260 / A280), sendo consideradas viáveis as amostras com valores entre 1,6 e

2,6.

IV. 3. 4. Obtenção de cDNA

Pela reação de transcriptase reversa (RT) foi obtido o cDNA total dos 27

pacientes analisados. Para essa reação foi utilizado o RNA, extraído pelo método do

Trizol, e ajustado para uma concentração final de 1µg/µl por regra de três simples. Foi

seguido o procedimento recomendado para o kit ImProm-II™ Reverse Transcriptase, da

Promega. O oligonucleotídeo oligodT (dT

) estava concentrado à 0,5 µg.

IV. 3. 5. Amplificação do DNA por PCR

A partir dos cDNAs produzidos, foram realizadas reações de PCR para detecção

da expressão dos genes de interesse nos fragmentos valvares dos pacientes analisados.

Dessa forma, foram construídos primers específicos para a ET-1 (seqüência NM 001955

gi110624717 - NCBI), ET

(seqüência NM 001957 gi4503464 - NCBI) e ET

(seqüência NM 000115 gi4557546 - NCBI). Como controle constitutivo das amostras

foi utilizado o gene GAPDH (BC029640). Todos os primers foram diluídos para

concentração de 10mM. Foram utilizados os reagentes da Invitrogen para a reação, na

qual usou-se 1,25U de Taq DNA polimerase (5U/µl), 0,25µM de cada primer e dNTPs

concentrados à 0,1mM cada. Os programas para amplificação utilizados foram definidos

de acordo com o Certificado de Análise da empresa fabricante dos primers (Invitrogen

Brasil LTDA.). O volume final da reação foi de 10µL, sendo essas realizadas em

triplicata. Todas as amostras analisadas foram verificadas em gel de agarose 1%.

Para as reações de PCR com o gene GAPDH, foram utilizadas 23 amostras; para

os genes ETRB e ETRA foram analisadas 20 amostras, enquanto para a ET-1, 19

amostras foram verificadas. A quantidade de amostras utilizadas nas reações de PCR,

para cada gene específico, variou tendo em vista que determinados pacientes

apresentavam uma concentração reduzida de material biológico – limitante para as

análises moleculares – além de alguns estarem comprometidos com pesquisas mais

complexas envolvendo PCR em tempo real – daí a necessidade de se poupar esse

material biológico.

IV. 3. 6. Análise de DNA por eletroforese em gel de agarose

Após as amplificações, o volume 5µL de cada amostra foi analisado através de

eletroforese em gel de agarose 1%, acrescidos de brometo de etídio 5mg/ml e tampão de

amostra (azul de bromofenol) 6x.

IV. 4. Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada através do teste exato de Fisher. É

um teste da classe dos testes exatos, onde o p-valor é calculado como se os totais

marginais fossem fixos, e é considerado significativo se inferior a 0,05. Foi examinada a

correlação entre a presença do gene da ET-1 e seus receptores A e B e o sexo dos

pacientes, as faixas etárias inferior e superior a 50 anos, os diversos sintomas

apresentados.

Foi feita, também, uma análise comparativa entre os grupos de pacientes

valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes reoperados, no tocante a presença dos

mencionados genes, utilizando-se o teste do χ

V. RESULTADOS

A amostra final foi de 27 pacientes, submetidos a tratamento cirúrgico entre os

meses de março de 2006 e setembro de 2007, de acordo com os critérios de inclusão e

exclusão definidos previamente. Dois deles foram operados no Hospital de Base do DF

e 25 no Instituto do Coração do DF. Todos os pacientes consentiram em participar do

trabalho. Quinze pacientes foram do sexo feminino e 12 do masculino, com uma média

de idade de 46,2 anos (16-67 anos; DP: 12,6 – tabela 1). Do total da amostra, apenas 10

pacientes (3, 4, 7, 9, 11, 18, 20, 22, 24, 25 - 37% dos pacientes) conseguiram determinar

o tempo de sua doença, que variou entre 4 meses e 45 anos (tempo médio de 12 anos).

Não houve óbito transoperatório, pós-operatório ou hospitalar.

Dos dados individuais colhidos, observou-se pacientes nas quatro classificações

funcionais (NYHA), assim distribuídos: um paciente na CF I (paciente 21 - 3,7% da

população); quatorze pacientes na CF II (pacientes 1, 2, 3, 7, 9, 10, 11, 16, 17, 18, 19,

20, 24 e 26 – 51,8%); onze na CF III (pacientes 4, 5, 6, 8, 13, 14, 15, 22, 23, 25 e 27 -

40,7%) e um paciente na CF IV (paciente 12 - 3,7%). Em termos de prevalência de

lesão valvar, observamos dupla lesão em 19 pacientes (70,3%), cinco pacientes com

insuficiência valvar pura (18,5%) e os três restantes (11,2%) com estenose valvar pura

(tabela 1).

Os dados ecocardiográficos obtidos foram a área valvar, o gradiente transvalvar

mitral e a pressão sistólica da artéria pulmonar (nos casos de estenose mitral), e volume

regurgitante e orifício regurgitante efetivo (na insuficiência mitral). Os achados

revelaram uma área valvar média de 1,1cm

(DP: 5,3; 0,6-1,9 cm

– dados de todos os

22 pacientes), o gradiente transvalvar médio de 14,8mmHg (DP: 6,9; 6-32mmHg –

dados de 20 dos 22 pacientes, 90,9%), pressão sistólica média da artéria pulmonar

55,9mmHg (DP: 16,4; 21-100mmHg – dados de 21 dos 22 pacientes, 95,4%), volume

regurgitante médio de 88,3ml (DP: 61,3; 58-209ml – dados de 6 dos 24 pacientes, 25%)

e orifício regurgitante efetivo médio de 0,47 cm

(DP: 0,26; 0,27-1 cm

– dados de 6

dos 24 pacientes, 25% - tabela 1).

Tabela 1. Dados ecocardiográficos dos pacientes.

Paciente

Sexo Idade

(NYHA)

Disfunção

valvar

Área

valvar

(PHT)

G.T.M. PSAP V.R. O.R.E.

1 M 43 2 D 1 17 55 - -

2 F 54 2 I 1,9 7 56 83 0,5

3 M 16 2 I - - - - 0,27

4 F 51 3 D 1,1 10 40 - -

5 F 49 3 D 1,9 8 51 58 -

6 F 22 3 D 0,6 13 60 - -

7 M 35 2 D 1,4 12 - - -

8 F 67 3 D 1 14 56 209 1

9 M 62 2 D - 9 70 - -

10 F 50 2 D 0,9 19 - - -

11 F 47 2 D 1 - 51 - -

12 M 62 4 I - - 63 - -

13 F 63 3 D 0,9 17 71 - -

14 F 44 3 D 0,9 14 40 - -

15 M 39 3 D 1,1 9 21 - -

16 F 51 2 D 1 18 55 76 0,4

17 F 59 2 D 1 32 75 - -

18 M 46 2 D 1,4 12 100 - -

19 F 50 2 E 0,8 22 74 - -

20 M 38 2 I - - 35 68 0,4

21 M 52 1 I 3,1 5 49 36 0,3

22 F 26 3 D 1,4 - 46 - -

23 M 49 3 D 1 11 55 - -

24 F 52 2 E 0,9 12 44 - -

25 F 39 3 D 0,8 28 64 - -

26 M 54 2 D - - - - -

27 M 30 3 E 1 23 - - -

Média 1,1 14,8 55,9 88,3 0,47

Desvio padrão 5,3 6,9 16,4 61,3 0,26

CF (NYHA): classe funcional (New York Heart Association); I/E/D: insuficiência valvar/estenose

valvar/dupla lesão valvar; PHT: pressure half-time; G.T.M.: gradiente transvalvar médio; PSAP:

pressão sistólica da artéria pulmonar; V.R.: volume regurgitante; O.R.E.: orifício regurgitante

efetivo.

As manifestações clínicas mais comuns foram a dispnéia (25 dos 27 pacientes,

92,5%), a dor torácica (9 pacientes, 33,3%), a dispnéia paroxística noturna (7 pacientes,

25,9%), o edema de MMII (3 pacientes, 11,1%) e a ortopnéia (em 3 pacientes, 11,1%).

As palpitações apresentaram-se em 2 pacientes (7,4%) e a taquipnéia e os escarros

hemoptóicos manifestaram-se cada qual em apenas 1 paciente (3,7%). Um paciente se

dizia assintomático durante a internação (tabelas 2, 3 e 4; figura 3).

Figura 3. Prevalência dos sintomas nos indivíduos.

Tabela 2. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes com

acometimento valvar unicamente mitral.

Paciente CF (NYHA) Gravidade Sintomatologia ET-1 ETRA ETRB

1 2 Moderado 1 + + +

5 3 Grave 1,2,3 + +

6 3 Grave 1,3,5 +

9 2 Grave 1,2,3,5,6 + + +

10 2 Grave 1

12 4 Grave 1,3,5 + + +

13 3 Grave 1 + +

15 3 Grave 1,2 +

16 2 Grave 1,2 +

17 2 Moderado 1

18 2 Grave 1,8 +

19 2 Grave 1,7

24 2 Grave 1,3 +

25 3 Grave 1

26 2 Moderado 1 + +

CF (NYHA): classe funcional (New York Heart Association); gravidade: classificação

ecocardiográfica; sintomatologia: dispnéia (1); dor torácica (2); dispnéia paroxística noturna (3);

edema MMII (4); ortopnéia (5); hemoptóicos (6); palpitações (7); taquipnéia (8). ET-1 (+): presença

do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina; ETRB (+):

presença do gene do receptor B da endotelina.

0 5 10 15 20 25 30

Dispnéia

Dor torácica

DPN

Edema MMII

Ortopnéia

Palpitações

Taquipnéia

Hemoptóicos

Tabela 3. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes com

acometimento valvar mitro-aórtico.

Paciente

(NYHA)

Gravidade Sintomatologia

ET-

ETRA ETRB

3 2 Moderado 2 + +

7 2 Grave 1 +

11 2 Grave 1,2

14 3 Grave 1,2,4 + +

20 2 Grave 1,2,7 +

21 1 Grave - + +

27 3 Grave 1

CF (NYHA): classe funcional (New York Heart Association); gravidade: classificação

ecocardiográfica; sintomatologia: dispnéia (1); dor torácica (2); dispnéia paroxística noturna (3);

edema MMII (4); ortopnéia (5); hemoptóicos (6); palpitações (7); taquipnéia (8). ET-1 (+): presença

do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina; ETRB (+):

presença do gene do receptor B da endotelina.

Tabela 4. Dados clínicos e análise molecular individualizada dos pacientes submetidos

a reoperação mitral

Paciente

(NYHA)

Gravidade Sintomatologia

ET-

ETRA ETRB

2 2 Grave 1,3,4 + +

4 3 Moderado 1

8 3 Grave 1 + +

22 3 Grave 1,2 + + +

23 3 Grave 1,3,4 + +

CF (NYHA): classe funcional (New York Heart Association); gravidade: classificação

ecocardiográfica; sintomatologia: dispnéia (1); dor torácica (2); dispnéia paroxística noturna (3);

edema MMII (4); ortopnéia (5); hemoptóicos (6); palpitações (7); taquipnéia (8). ET-1 (+): presença

do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina; ETRB (+):

presença do gene do receptor B da endotelina.

No tocante a abordagem cirúrgica, foram submetidos a reoperação cinco

pacientes (18,5% - pacientes 2, 4, 8, 22 e 23), enquanto os demais (22 pacientes, 81,5%)

foram abordados cirurgicamente pela primeira vez. Daqueles reoperados, o tempo

médio desde a primeira cirurgia foi de 12,2 anos (DP: 6,3; paciente 22: 5 anos, paciente

2: 9 anos; paciente 23: 10 anos; paciente 8: 16 anos; paciente 4: 21 anos).

A quantificação de RNA (tabela 1 - anexo) mostrou uma razão entre

absorbâncias dentro do intervalo considerado adequado. Vinte e três amostras foram

submetidas a realização de cDNA.

A qualidade do cDNA sintetizado bem como a reação de PCR desenvolvida

foram analisadas por meio da amplificação do gene constitutivo GAPDH, em 23 das 27

amostras estudadas. Verificou-se uma amplificação positiva, por meio de análise em gel

de agarose 1%, para esse gene em todos os cDNA sintetizados.

As análises referentes ao receptor A da endotelina revelaram a expressão desse

gene em 20 pacientes analisados por meio da técnica de PCR – 74% do total de

pacientes utilizados no estudo e 100% das amostras analisadas molecularmente.

A expressão do receptor B da endotelina foi detectada em 7 amostras (35% dos

20 pacientes analisados), como demonstrado nas Tabelas 2, 3 e 4. A endotelina 1

apresentou amplificação positiva em 12, das 19 amostras analisadas (63,15%).

V. 1. Histologia

Após a coleta dos fragmentos valvares, doze deles foram submetidos a inclusão

em parafina e coloração pela técnica de hematoxilina e eosina. Posteriormente,

analisadas quanto a presença de fibrose, calcificação, ossificação, neoformação

vascular, infiltrado mononuclear. Foram feitas lâminas, identificadas como M1, M2 e

M3, dependendo da disponibilidade de material, priorizando a utilização do material

para as etapas de extração de RNA e subsequentes.

Observou-se uma grande quantidade de fibrócitos, tecido conjuntivo denso,

fibras colágenas do tipo I (eosinofílicas) e substância fundamental extracelular. O tecido

é grosseiramente avascular. Não foram encontrados miócitos de Anitschkow ou os

característicos nódulos de Aschoff.

Nos fragmentos M3 foi visualizado processo inflamatório com celularidade alta

(Figura 6), vascularização do tecido, com capilares permeando-o (destacando-se a maior

vascularização tecidual relativamente às demais áreas – Figura 8), colágeno

transformado ou neoformado (hialinização do colágeno). Observou-se fibroblastos,

linfócitos, e áreas de calcificação distrófica (necrose do tecido com depósito). Nas

lâminas de segmento M2 os achados foram semelhantes, com zonas de cicatrização,

pequenos focos de inflamação e células mais afastadas entre si; também foi visualizada

ossificação (Figura 9). Na análise histológica do segmento M1, foram encontrados as

mesmas características já citadas anteriormente, exceto pela ausência de calcificação ou

ossificação. Em termos de achados histológicos individuais, foi encontrada (Tabela 5):

Tabela 5. Dados histológicos individualizados dos pacientes.

Histologia

Fibrose Neoformação Vascular

Infiltrado de Mononucleares

Calcificação

Ossificação

Paciente

M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1

2 x x x x x

5 x x x x x

6 x X x

8 x x x X x

9 x x x x x x x

10 x x x

11 x x x x X

12 x x x

13 x x

14 x x x X

15 x x x x X

22 x x x x x x

M!/M2/M3: fragmentos extraídos em regiões próximas ao anel mitral,

intermediária e próxima à borda livre valvar, respectivamente; “X”: presença do

achado histológico.

 Fibrose em todos os pacientes nas amostras M3 (2, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16,

25, 26); em 10 pacientes nas amostras M2 e M1 (2, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 25,

26), 83,3% do total de pacientes analisados (figuras 3 e 5).

 Neoformação vascular em 9 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 11, 14, 15, 22), 75% do

total de pacientes analisados; encontrada em duas amostras M1 (22,2%), quatro

amostras M2 (44,4%), cinco amostras M3 (55,5%) e em dois pacientes (11 e 15

– 22,2%), foi encontrada em dois fragmentos simultaneamente (M1/M3 e

M2/M3, respectivamente – figura 7).

 Infiltrado de mononucleares em 6 pacientes (2, 5, 6, 8, 9, 22), 50% do total de

pacientes analisados; encontrado em uma amostra M1 (16,6%), três amostras

M2 (50%), duas amostras M3 (33,3%) e em nenhum paciente foi encontrado em

dois ou mais fragmentos simultaneamente (figuras 3 e 6).

 Calcificação em 3 pacientes (9, 13, 22), 25% do total de pacientes analisados;

não foi encontrada em amostra M1, encontrada em uma amostra M2 (33,3%),

duas amostras M3 (66,6%) e em nenhum paciente foi encontrado em dois ou

mais fragmentos simultaneamente (figuras 3 e 4).

 Ossificação em apenas uma amostra (M2) do paciente 9, 8,3% do total de

pacientes analisados (figura 8).

Figura 4. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando calcificação,

fibrose e infiltrado mononuclear. HE, 200x. Paciente 9, segmento M2. UnB-FM, 2006.

Figura 5. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando calcificação.

HE, 400x. Paciente 9, segmento M2. UnB-FM, 2006.

Figura 6. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando fibrose. HE,

100x. Paciente 8, segmento M3. UnB-FM, 2006.

Figura 7. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando infiltrado de

mononucleares. HE, 400x. Paciente 9, segmento M2. UnB-FM, 2006.

Figura 8. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando neoformação

vascular. HE, 200x. Paciente 8, segmento M3. UnB-FM, 2006.

Figura 9. Corte histológico do folheto valvar mitral anterior, mostrando ossificação. HE,

200x. Paciente 9, segmento M2. UnB-FM, 2006.

A análise estatística dos dados obtidos não mostrou correlação, dentro da

população analisada, entre a presença dos genes de ET-1, ETRA e ETRB com a faixa

etária superior ou inferior a 50 anos, ou com o sexo dos pacientes (tabela 6).

Tabela 6. Dados do p-valor, faixa etária e sexo x presença dos genes (teste exato de

Fisher).

ET-1 ETRA ETRB

Faixa etária

(<50,≥50 anos)

0,69 0,67 0,20

Sexo

0,70 0,09 0,18

ET-1: presença do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina;

ETRB: presença do gene do receptor B da endotelina.

A relação entre os diversos sintomas e a presença do gene da ET-1 não foi

estatisticamente significativa, como também não foi a presença do ETRB (tabela 7).

Tabela 7. Dados do p-valor, sintomas x presença dos genes (teste exato de Fisher).

Sintomas ET-1 ETRA ETRB

Dispnéia 0,65 0,06 0,42

Dor torácica 0,55 0,69

DPN 0,08 0,49

Edema MMII 0,05 0,45

Ortopnéia 0,54 0,54

Hemoptóicos 0,40 0,22

Palpitações 0,49 0,59

Taquipnéia 0,59 0,77

ET-1: presença do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina;

ETRB: presença do gene do receptor B da endotelina.

Também não houve associação estatística entre a presença ou não dos genes da

ET-1, ETRA e ETRB entre os subgrupos de pacientes (valvopatas mitrais, mitro-

aórticos e pacientes reoperados -tabela 8).

Tabela 8. Dados do p-valor, subgrupos x presença / ausência dos genes (teste χ²).

ET-1 ETRA ETRB Subgrupo

Mitral

Mitro-aórtico

Reoperado

0,08

0,94

0,60

ET-1: presença do gene da endotelina-1; ETRA: presença do gene do receptor A da endotelina;

ETRB: presença do gene do receptor B da endotelina.

VI. DISCUSSÃO

O estudo mostrou a expressão do gene da endotelina-1 em 12 das 19 amostras

analisadas (63,15%) e de seu receptor A em 20 pacientes analisados por meio da técnica

de PCR – 74% do total de pacientes utilizados no estudo e 100% das amostras

analisadas pela técnica mencionada. A expressão do gene do receptor B foi mais

modesta (sete das 20 amostras analisadas – 35%).

As valvas extraídas encontravam-se, invariavelmente, com os clássicos achados

de fibrose com ou calcificação, espessamento, retração, bem como fusão de comissuras

e cordoalhas tendíneas

. Foi possível observar a heterogeneidade nos segmentos

valvares, no tocante a presença de achados histológicos típicos da doença reumática.

Estudo semelhante já abordou tal aspecto na literatura, considerando, no entanto, a

composição de diferentes segmentos em sua secção longitudinal (extremidade livre até

sua inserção no anel mitral

). Sabe-se que a ET-1 tem importante função reguladora na

deposição de colágeno nos tecidos

; resta-nos definir se o aumento da composição

tecidual de colágeno tem algum tipo de efeito sobre a presença ou aumento da

concentração da ET-1 e seus receptores.

A etapa de extração do RNA das amostras demonstrou a expressão desses vários

genes nas valvas mitrais. Não existe protocolo para a maceração de tecido biológico tão

endurecido, pela abundância de fibrose tecidual (resultante da própria degeneração

característica da doença). O processo requeria perda e degradação mínimas do

fragmento (muitas vezes exíguo). Alguns métodos tem sido indicados na literatura

recente, mas em valvas não-reumáticas

. O tecido estudado era pouco celularizado,

contendo grande quantidade de colágenos e elastina, e células mesenquimais (como

miofibroblastos e miócitos cardíacos) em pequena quantidade. Isso influenciou

decisivamente na obtenção do RNA, já que esse é oriundo dessas últimas. A amostra de

RNA resultante, invariavelmente, foi escassa.

O achado mais importante desse estudo foi a presença de ETRA em todas as

amostras submetidas à análise molecular. Tal resultado talvez se justifique por ser esse

o receptor predominante nos miócitos cardíacos

; além disso, justificaria transformações

típicas da doença, sendo esse receptor correlacionado com processos inflamatórios,

exuberantes na doença reumática em sua fase exsudativa, e também presentes na fase

proliferativa

Os receptores B foram encontrados em poucas amostras da série, conforme

podemos observar nas tabelas 2, 3 e 4. Como já discutido, a manifestação de tais

peptídeos ocorre em células endoteliais e epiteliais responsáveis pela modulação da

resistência vascular e natriurese, entre outros

. Além disso, tais receptores

caracterizam-se pela rápida dessensibilização e internalização, cujos resultados na

concentração tissular são pouco estudados

. O tempo de convívio com a doença valvar

reumática, associado a outras características individuais, podem ser possíveis

determinantes da manifestação de gene do ETRB no tecido valvar mitral. Essa

afirmação demandará pesquisa específica nesse sentido, e não foi enfoque de nosso

trabalho. Além disso, dependerá da coleta fidedigna de dados epidemiológicos, como o

tempo de doença. Essa informação, todavia, foi de difícil obtenção, já que muitos

pacientes não sabem relatar com precisão quando adquiriram a doença, diferentemente

do que se observa em outros estudos

. Muitos definem tempo de doença como tempo do

diagnóstico dessa, ou do início dos sintomas, não sabendo determinar precisamente o

episódio inicial ou mesmo a presença de surtos no período.

Conforme avaliado na tabela 5, os pacientes reoperados nessa série foram, em

sua maioria, mulheres. Dentre elas (80%, quatro dentre cinco pacientes), setenta e cinco

por cento (três entre as quatro mulheres) encontravam-se na menopausa (pacientes 2, 4 e

8). Não obstante tratarem-se de números inexpressivos, a condição hormonal

diferenciada dessas pessoas pode ser a responsável pelas mudanças na expressão dos

genes codificadores dos peptídeos do sistema de endotelinas. Sabe-se que o estrógeno,

cujos níveis se reduzem na menopausa, inibe a síntese da ET-1 pelo endotélio

;

consequentemente, a produção de ET-1 estaria, teoricamente, aumentada.

Conforme já destacado anteriormente, pode ocorrer mudança fenotípica de um

subtipo de receptor de ET para outro de acordo com condições encontradas in vitro nas

culturas de células musculares lisas vasculares e, se essas expressarem ETRB, a ET-1

torna-se um mitógeno mais potente em tais células

. Não sabemos se isso se repete in

vivo ou em outros tecidos (como o valvar), nem qual é seu real impacto sobre a

produção desses receptores. Entretanto, pode existir uma conexão entre o

remodelamento arterial e hipertrofia ventricular

e o predomínio de um subtipo de

receptor sobre o outro. Tal afirmação depende, ainda, de novas pesquisas, que abordem

a busca desses peptídeos em tecido mitral.

Devido a ausência de estudos identificando a ET-1 e seus receptores alvo em

tecido mitral, desconhece-se se a presença daquela inibe a formação desses, conforme já

identificado em valvas aórticas

. Esse comportamento poderia justificar, em parte, os

resultados encontrados no atual estudo, onde a presença da ET-1 promoveria um

feedback negativo na produção do ETRB. No entanto, por ser o presente estudo apenas

de quantificação de genes dos citados peptídeos, essa observação necessita de

comprovação.

Dentro da população estudada, não observamos associação estatística entre as

variáveis destacadas e a presença dos genes em questão. Os testes mostraram uma forte

tendência de que haja associação entre a presença desse gene e as variáveis edema de

MMII (p=0,056) e dispnéia paroxística noturna (p=0,084). No entanto, seja pela

pequena amostra, seja pelo valor de p, não podemos afirmar tal correlação.

A busca da cura da cardiopatia valvar reumática por intermédio de agentes

farmacológicos, em substituição à troca valvar ou valvoplastia cirúrgicas, ainda carece

de pesquisa e permeia diversos setores da saúde pública. O controle dos surtos de

estreptococcia, através de medidas sanitárias, seria um bom começo. O diagnóstico

precoce, determinando menor ou nenhum comprometimento da valva e de seu aparelho

subvalvar, permitiria o tratamento de inúmeros indivíduos de maneira menos onerosa. A

identificação de valvopatas em risco, por um acompanhamento ambulatorial regular,

encaminharia-os ao tratamento invasivo, antes do surgimento de complicações.

Talvez a união de estratégias adequadas nas políticas de saúde às pesquisas

médicas em áreas básicas e clínicas permitam encontrar opções às terapêuticas atuais.

Nesse contexto, possivelmente o sistema de endotelinas e seus antagonistas venham

colaborar, limitando a reação inflamatória valvar, modulando a vasorreatividade e

modificando o curso fisiopatológico e clínico da valvopatia reumática.

VII. CONCLUSÃO

Em resumo, o presente estudo mostrou que todos os pacientes (submetidos a

análise molecular), independentemente das características individuais (sexo, idade,

classe funcional, alteração valvar mitral), expressaram a presença do gene do receptor

A. Daqueles pacientes reoperados, quatro são mulheres e menopausadas; uma delas

encontrava-se em idade fértil e expressou os três genes estudados. Não houve diferença

estatística quanto a expressão dos genes da ET-1 e seus receptores, entre os subgrupos

estudados (valvopatas mitrais, mitro-aórticos e pacientes reoperados). Observa-se que

houve uma tendência à maior presença de ET-1, na população estudada, naqueles

pacientes com edema de membros inferiores e dispnéia paroxística noturna. Entre eles,

houve um maior número de mulheres.

A busca de resultados que confirmem a participação da valva mitral reumática

como sítio produtor de ET-1 e receptores A e B, provando ou negando também a

contribuição do sistema de endotelinas como auxiliar no processo inflamatório que

danifica a valva, suprirá importante lacuna no conhecimento da história natural da

doença reumática. Essas informações contribuirão decisivamente para apontar novas

abordagens e terapêuticas, talvez utilizando antagonistas dos receptores das endotelinas

como adjuvantes no tratamento, trazendo novas expectativas para a doença reumática.

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IX. ANEXOS

IX. 1. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

IX. 2. Tabela 1

Dados da extração de RNA total das amostras. UnB-FM, 2006-2008.

M1 M2 M3

Pacientes

Quantific. 260 280 Razão

[ ] µg/µl p/ [ ] 1µg/µl Quantific. 260 280 Razão

[ ] µg/µl p/ [ ] 1µg/µl

1 SIM 0,047 0,014 3,3 0,094 10,6 SIM 0,074 0,033 2,2 0,148 6,8 SIM 0,231 0,130 1,8 0,462 2,2

2 SIM 0,066 0,041 1,6 0,132 7,6 SIM 0,002 -0,010 -0,2 0,004 250,0 SIM 0,139 0,068 2,0 0,278 3,6

3 SIM 0,037 0,026 1,4 0,074 13,5 SIM 0,199 0,116 1,7 0,398 2,5 SIM 0,104 0,045 2,3 0,208 4,8

4 SIM 0,105 0,048 2,2 0,210 4,8 SIM 0,082 0,041 2,0 0,164 6,1 SIM (-) 0,028 0,008 3,5 0,056 17,9

5 SIM 0,034 0,02 1,7 0,068 14,7 SIM 0,105 0,066 1,6 0,210 4,8 SIM 0,097 0,059 1,6 0,194 5,2

6 SIM 0,072 0,036 2,0 0,144 6,9 SIM 0,055 0,025 2,2 0,110 9,1 SIM 0,087 0,038 2,3 0,174 5,7

7 SIM 0,135 0,066 2,0 0,270 3,7 SIM 0,017 0,006 2,8 0,034 29,4 SIM 0,136 0,079 1,7 0,272 3,7

8 SIM 0,077 0,040 1,9 0,154 6,5 SIM 0,038 0,016 2,4 0,076 13,2 SIM 0,131 0,070 1,9 0,262 3,8

9 SIM 0,131 0,076 1,7 0,262 3,8 SIM 0,052 0,020 2,6 0,104 9,6 SIM 0,058 0,027 2,0 0,116 8,6

10 SIM 0,116 0,051 2,3 0,232 4,3 SIM 0,134 0,074 1,8 0,268 3,7 SIM 0,114 0,051 2,2 0,228 4,4

11 SIM 0,271 0,161 1,7 0,542 1,8 SIM 0,503 0,289 1,7 1,006 1,0 SIM 0,101 0,042 2,4 0,202 5,0

12 SIM 0,378 0,199 1,9 0,756 1,3 SIM 0,074 0,022 3,4 0,148 6,8 SIM 0,101 0,040 2,5 0,202 5,0

13 SIM 0,401 0,212 1,9 0,802 1,2 SIM 0,266 0,151 1,8 0,532 1,9 SIM 0,281 0,140 2,0 0,562 1,8

14 SIM 0,081 0,040 2,0 0,162 6,2 SIM 0,088 0,040 2,2 0,176 5,7 SIM 0,113 0,071 1,6 0,226 4,4

15 SIM 0,048 0,027 1,8 0,096 10,4 SIM 0,137 0,072 1,9 0,274 3,6 SIM 0,078 0,042 1,9 0,156 6,4

16 SIM 0,079 0,039 2,0 0,158 6,3 SIM 0,236 0,137 1,7 0,472 2,1 SIM 0,109 0,061 1,8 0,218 4,6

17 SIM 0,103 0,056 1,8 0,206 4,9 SIM 0,227 0,131 1,7 0,454 2,2 SIM 0,165 0,099 1,7 0,330 3,0

18 SIM 0,113 0,061 1,9 0,226 4,4 SIM 0,079 0,044 1,8 0,158 6,3 SIM 0,287 0,155 1,9 0,574 1,7

19 SIM - - - - - SIM - - - - - SIM 0,090 0,049 1,8 0,180 5,6

20 SIM 0,206 0,121 1,7 0,412 2,4 SIM 0,135 0,082 1,6 0,270 3,7 SIM 0,313 0,191 1,6 0,626 1,6

21 SIM 0,025 0,004 6,25 0,050 20,0 SIM 0,120 0,056 2,1 0,240 4,2 SIM 0,030 0,001 30 0,06 16,7

22 SIM - - - - - SIM - - - - - SIM 0,080 0,037 2,2 0,160 6,3

23 SIM 0,299 0,158 1,9 0,598 1,7 SIM 0,031 0,016 1,9 0,062 16,1 SIM 0,087 0,064 1,4 0,174 5,7

24 SIM 0,488 0,297 1,6 0,976 1,0 SIM 0,06 0,029 2,0 0,120 8,3 SIM 0,156 0,081 1,9 0,300 3,3

25 SIM 0,269 0,156 1,7 0,538 1,9 SIM 0,04 0,028 1,4 0,080 12,5 SIM 0,059 0,037 1,6 0,118 8,5

26 SIM 0,062 0,024 2,6 0,124 8,1 SIM 0,042 0,016 2,6 0,084 11,9 SIM 0,074 0,037 2,0 0,148 6,8

27 SIM 0,328 0,168 2,0 0,656 1,5 SIM 0,419 0,236 1,8 0,838 1,2 SIM 0,302 0,172 1,8 0,604 1,7

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