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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA
GLICERONEOGÊNESE E FONTES DE
GLICEROL-3-FOSFATO PARA A SÍNTESE DE
GLICERÍDEO-GLICEROL NO FÍGADO DE RATOS
EM DIVERSAS SITUAÇÕES EXPERIMENTAIS
MARIA EMILIA SOARES MARTINS DOS SANTOS
RIBEIRÃO PRETO
2008
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Livros Grátis
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MARIA EMILIA SOARES MARTINS DOS SANTOS
GLICERONEOGÊNESE E FONTES DE
GLICEROL-3-FOSFATO PARA A SÍNTESE DE
GLICERÍDEO-GLICEROL NO FÍGADO DE RATOS
EM DIVERSAS SITUAÇÕES EXPERIMENTAIS
Tese de Doutorado apresentada ao
Departamento de Bioquímica e
Imunologia da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo para obtenção do Título de
doutor em Ciências – área de
concentração: Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Renato Hélios Migliorini
RIBEIRÃO PRETO
2008
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
MARTINS-SANTOS, MARIA EMILIA SOARES.
Gliceroneogênese e fontes de glicerol-3-fosfato para a síntese de glicerídeo-
glicerol no fígado de ratos em diversas situações experimentais. Ribeirão Preto, 2008.
85p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado apresentada ao Departamento de Bioquímica e Imunologia
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – área de
concentração: Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Renato Hélios Migliorini
1. Geração de glicerol-3-fosfato, 2. Gliceroneogênese, 3. Sistema nervoso simpático
Dedico este trabalho à minha mãe Maria das Graças
Soares e Silva e ao meu pai Gabriel Roy, por todo
apoio, compreensão, incentivo infindável e orações.
Por terem sonhado meu sonho comigo e apesar de
longe, com um rio grande entre a gente ou até mesmo
um oceano, estavam sempre do lado de dentro.
Agradecimento Especial
Ao Dr. Renato Hélios Migliorini, por me receber e me aceitar em seu laboratório, pela
oportunidade única de ter aprendido tanto sobre metabolismo, ouvido explicações
interessantíssimas e discutido ciência. Indiscutivelmente, um pensador eterno e grande
pesquisador.
Com o exemplo dele, aprendi a valorizar ainda mais virtudes humanas como a
humildade, sabedoria e o amor que se deve ter por tudo que se faz. Além disso, fui contagiada
pela mesma paixão que ele sentia pela ciência.
Tenho certeza que seus ensinamentos perdurarão para sempre e serão levados para
vários lugares, carregados por nós, seus discípulos.
“A mente que se abre para uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho
original”.Albert Einstein.
Obrigada por tudo! Sentirei muito a sua falta!
Agradecimentos
A Deus, por ter me tornado mais sensível aos seus sinais e assim me tornei mais capaz para
fazer as melhores escolhas e ter força e coragem para percorrer os caminhos tortuosos.
Vivendo um dia de cada vez, desfrutando um momento de cada vez, aceitando que as
dificuldades constituem o caminho à paz e à vitória.
A toda minha família, meu irmão, Júnior, minha cunhada Walesca, minha sobrinha Ana
Beatriz, tios, tias e todos os primos, pela torcida e orações para que tudo desse certo.
A minha avó Conceição e meu avô Eurípedes que certamente estiveram comigo todo este
tempo, segurando minha mão quando eu mais precisava, emanando energia positiva de uma
esfera maior.
A Dra. Isis do Carmo Kettelhut, exemplo de amor, sensibilidade, compreensão, apoio e
grande cientista. Sua dedicação às pessoas e ao trabalho é um exemplo a ser seguido.
Obrigada pelas conversas, ensinamentos, amizade, ajuda na correção deste trabalho e por ser
sempre tão disponível.
Ao Dr. Richard W. Hanson pela oportunidade de ter trabalhado com ele e sua equipe,
principalmente Dr. Jianqi Yang e Xiaoying Kong, durante meu período de doutorado
sanduíche. Essa experiência certamente me fez amadurecer ainda mais como pessoa e
pesquisadora.
A Dra. Fátima Silva e sua família, pela acolhida, apoio e conversas de conforto durante minha
estadia em Cleveland-OH.
Ao Dr. Luiz Carlos Carvalho Navegantes, pelo apoio, importantes opiniões e dicas nos
trabalhos de metabolismo.
A Maria Antonieta Rissato Garófalo (Tuca), pela amizade, carinho, conversas e por toda
ajuda na realização dos meus experimentos. Sem sua valiosa colaboração, a realização deste
trabalho certamente não teria sido possível.
A todos os técnicos do laboratório: Neusa Maria Zanon, Elza Maria Filippin, Luiz Adriano de
Abreu Duran e Andrezza Bonifácio pela disponibilidade sempre.
As irmãs científicas e grandes amigas: Danúbia Frasson, Valéria Ernestânia Chaves e Renata
Polessi Boschini. Obrigada por termos sido uma equipe para fazer ciência e uma família para
apoiar umas às outras, ajudar a levantar quando era preciso, pelas conversas “filosóficas”,
cafés e dessa forma ter tornado este tempo aqui tão especial e mais leve.
A todos os amigos do laboratório do “des” controle do metabolismo: Amanda Martins
Baviera, Walter Dias Júnior, Lidiany Góis, Luciana Carvalho, Silvia de Paula, Eduardo
Carvalho Lira, Dawit Albieiro Pinheiro Gonçalves, Thiago de Lorena Fábio. Obrigada por
toda ajuda, conversas, risos e passeios . Este tempo será inesquecível!.
A Nayara Delgado André Bortoleto pela amizade, companheirismo e pelas dicas durante todo
o tempo da pós. Obrigada por entender minha ansiedade, compreender e compartilhar medos
e pelos e-mails de motivação. Esteja certa que você me ajudou muito nesta conquista!
Ao amigo Victor Diaz Galban, pela assessoria no quesito computadores, pela prontidão em
ajudar e pelas explicações de dúvidas bioquímicas.
Ao Alexandre Rodovalho Beschizza e toda sua família; a Ana Carolina Tiveron Juliano Calil,
Gustavo Bernardes Pacheco, Alessandra Carriel Benitez, Tatiana Scandiuzzi. O importante
não era estar perto, mas sim do lado de dentro... e vocês estiveram. Obrigada pela força e
incentivo para eu concluir mais esta etapa.
A Simone Leite, minha grande amiga, especialmente no tempo que estive nos USA. Sua
companhia, as conversas, os ensinamentos e o apoio nas horas difíceis fizeram do meu tempo
lá muito mais agradável. Obrigada também, pela paciência em me ouvir falar de
experimentos, ratos e gliceroneogênese.
Aos sempre amigos Carlos Eduardo Mendes D’Angelis e Marley Garcia Silva, por todo
apoio, amor e carinho no tempo que estive em Ribeirão Preto. Vocês fizeram da minha
caminhada aqui muito mais leve, foram alguns dos anjos que Deus utilizou para me manter no
eixo, lembrar sempre do meu sonho e me manter firme para esta conquista. Amo vocês muito!
A Anna Carolina de Freitas Policarpo, a irmã que escolhi. Dividimos mais que um
apartamento, dividimos dificuldades e assim a vida ficou bem mais fácil. Amiga, confidente,
companheira. A pessoa com quem pude contar quando eu mais precisei. Obrigada pelas
conversas, abraços de consolo, por chorar junto. Além disso, por ler minha tese e escutar
pacientemente todas minhas prévias.
Ao Dr. Antônio Haddad, pela autorização do uso do “tissue chopper” e à técnica Vani Maria
Alves Corrêa, pelos ensinamentos no manuseio do mesmo.
Aos funcionários da secretaria do departamento de Bioquímica, Ivone, Lúcia, Ronaldo e Téia
e também ao bioterista Paulinho por toda ajuda.
A todos que de alguma forma participaram e me ajudaram neste trabalho.
Aos ratos que proporcionaram a realização dos meus experimentos e descobertas inéditas.
A Capes e FAPESP pelo apoio financeiro para a realização deste trabalho.
“A coragem é a primeira das qualidades humanas porque é a
qualidade que garante as demais.” Winston Churchill
Não existe a possibilidade da falha se você acredita em seu
próprio potencial e se você quer atingir seu sonho. Ele é
possível desde que você acredite e insita nele.
ÍNDICE
Índice
Resumo.............................................................................................................. i
Summary........................................................................................................... iv
1. Introdução...................................................................................................
1
2. Objetivos.....................................................................................................
11
3.1 Objetivo geral....................................................................................... 11
3.2 Objetivo específico............................................................................... 11
3. Materiais e métodos...................................................................................
12
3.1 Animais e tratamento ........................................................................... 12
3.2 Desnervação hepática........................................................................... 15
3.3 Conteúdo de noradrenalina no fígado .................................................. 15
3.4 Determinação do conteúdo total de lipídios do fígado......................... 15
3.5 Preparação das fatias de fígado............................................................ 16
3.6 Incorporação de U-
14
C-glicerol, 2-
14
C- piruvato e U-
14
C- glicose
em glicerídeo- glicerol em fatias de fígado in vitro.............................
16
3.6.1 Extração de lipídios totais e isolamento de ácidos graxos e
da fração e glicerol................................................................
16
3.7 Incorporação de U-
14
C-glicerol e 2-
14
C- piruvato em glicose do
meio de incubação.............................................................................
17
3.8 Determinação do fluxo glicolítico..................................................... 19
3.9 Medida da atividade enzimática da gliceroquinase (GK) ................. 19
3.10 Medida da atividade enzimática da fosfoenolpiruvato
carboxiquinase (PEPCK)...................................................................
20
3.11 Medida da concentração plasmática de glicose e ácidos graxos
livres..................................................................................................
22
3.12 Análise estatística.............................................................................. 22
4. Resultados ...................................................................................................
23
NORMALMENTE ALIMENTADOS
4.1 Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina no
fígado....................................................................................................
23
4.2 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose no meio de incubação .......................
24
4.3 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação.......................
25
4.4 Incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol....................... 26
4.5 Medida do fluxo glicolítico.................................................................. 26
JEJUM
4.6 Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado...................................................................................................
27
4.7 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose no meio de incubação no fígado.......
29
4.7.1 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol ................................................
29
4.7.2 Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de
incubação.................................................................................
30
4.8 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação........................
31
4.8.1 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol.....................................................................
31
4.8.2 Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de
incubação..................................................................................
32
4.9 Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e
do fluxo glicolítico................................................................................
33
DIABETES
4.10 Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado................................................................................................
.
34
4.11 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose no meio de incubação no fígado....
.
36
4.11.1 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol............................................
36
4.11.2 Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de
incubação ............................................................................
37
4.12 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação.....................
38
4.12.1
Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicerídeo-glicerol.........................................................
38
4.12.2 Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de
incubação ............................................................................
39
4.13 Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
e do fluxo glicolítico..........................................................................
40
DIETA HP
4.14 Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado................................................................................................
.
41
4.15 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose no meio de incubação no fígado....
.
43
4.15.1 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol............................................
43
4.15.2 Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de
incubação............................................................................
46
4.16 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação.....................
47
4.16.1 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicerídeo-glicerol..........................................................
47
4.16.2 Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de
incubação .............................................................................
49
4.17 Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
e do fluxo glicolítico..........................................................................
50
DIETA CAFETERIA
4.18 Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado................................................................................................
.
52
4.19 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose no meio de incubação no fígado....
.
53
4.19.1 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol...........................................
53
4.19.2 Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de
incubação...........................................................................
54
4.20 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação.....................
55
4.20.1 Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicerídeo-glicerol.........................................................
55
4.20.2 Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de
incubação ...........................................................................
56
4.21 Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
e do fluxo glicolítico..........................................................................
57
5 DISCUSSÃO ..............................................................................................
58
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................
72
ANEXO
RESUMO
Resumo
i
O presente trabalho teve o propósito de investigar em várias situações experimentais
as vias de geração de glicerol-3-fosfato em fatias de fígado. Foi verificado também o efeito da
desnervação hepática prévia sobre estes processos. A geração de glicerol-3-fosfato pelas três
vias foi avaliada: através da via glicolítica, estimada pelo fluxo glicolítico e pela incorporação
de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol; pela medida da atividade da gliceroquinase e da
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol e pela medida da atividade da
fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) e da incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol. Os experimentos foram realizados no fígado de ratos nas seguintes
situações: normalmente alimentados, jejuados (48 horas), diabéticos (72 horas), tratados com
uma dieta hiperproteica (dieta HP) e tratados com uma dieta hiperlipídica e hipercalórica do
tipo cafeteria.
O conteúdo de noradrenalina do tecido hepático, um índice da atividade simpática,
estava aumentado tanto no jejum, diabetes e ratos alimentados com uma dieta cafeteria e
diminuído nos ratos alimentados com a dieta HP. A desnervação hepática causou uma
marcante diminuição no conteúdo de noradrenalina em todas as situações estudadas.
Os animais normalmente alimentados e desnervados apresentaram uma diminuição na
atividade da gliceroquinase e da incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol. A
incorporação deste mesmo substrato em glicose do meio não foi alterada pela desnervação. A
atividade da PEPCK, a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol e em glicose do
meio, a incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico não foram
alterados pela desnervação hepática.
O jejum e o diabetes não alteraram a atividade da gliceroquinase e nem a incorporação
de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol. Entretanto, a incorporação deste substrato em
glicose do meio mostrava-se aumentada nas duas situações. A desnervação hepática não foi
capaz de alterar nenhum destes parâmetros. A PEPCK assim como a incorporação de 2-
14
C-
Resumo
ii
piruvato em glicerídeo-glicerol e em glicose do meio encontravam-se aumentadas nos animais
jejuados e diabéticos sendo que esses achados não sofreram modificações pela desnervação. A
incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico encontravam-se
diminuídos nessas duas situações e a desnervação não afetou estes parâmetros.
Os animais tratados com a dieta HP apresentaram uma diminuição da atividade da
gliceroquinase bem como uma diminuição da incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol sendo que a desnervação reduziu ainda mais a atividade da enzima. A incorporação
deste substrato em glicose do meio encontrava-se aumentada e não se modificou com a
desnervação. A atividade da PEPCK assim como a incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio encontravam-se aumentadas e também não sofreram
alterações com a desnervação. A incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e o
fluxo glicolítico encontravam-se reduzidos nos animais tratados com a dieta HP sendo que a
desnervação não afetou estes parâmetros. Os animais adaptados à dieta N e desnervados
apresentaram uma diminuição na atividade da gliceroquinase e da incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol. A incorporação deste mesmo substrato em glicose do meio
não foi alterada pela desnervação. A atividade da PEPCK, a incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicerídeo-glicerol e em glicose, o fluxo glicolítico e a incorporação de U-
14
C-glicose em
glicerídeo-glicerol também não foram alterados pela desnervação hepática.
Os animais tratados com a dieta cafeteria apresentaram um aumento na atividade da
gliceroquinase que foi reduzida pela desnervação. A incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio encontravam-se diminuídas sendo que a desnervação
só foi capaz de reduzir a incorporação de glicerol em glicerídeo-glicerol. A atividade da
PEPCK e a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol e em glicose encontravam-
se diminuídas e a desnervação não foi capaz de alterar estes parâmetros. O fluxo glicolítico
Resumo
iii
bem como a incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol encontravam-se
aumentados e a desnervação não alterou estes achados.
Nossos resultados sugerem que existe um efeito compensatório na geração de glicerol-
3 fosfato pelo fígado entre a via gliceroneogênica e a via glicolítica em todas as situações
estudadas. Quando uma está aumentada a outra está inibida e vice-versa. Os níveis de insulina
plasmática parecem ser os maiores responsáveis por este padrão de resposta. A regulação
destas vias parece não estar sob o controle do sistema nervoso simpático. Em contra partida, a
fosforilação direta do glicerol pela gliceroquinase parece estar sob o controle do sistema
nervoso simpático já que a desnervação hepática foi capaz de reduzir tanto a atividade
enzimática quanto a incorporação de glicerol em glicerídeo-glicerol. Porém, esta regulação
parece tornar-se mais evidente quando há um somatório de fatores como a presença da
insulina e a alteração do fluxo simpático para o tecido, principalmente nas situações de ratos
adaptados a uma dieta HP e ratos adaptados à dieta cafeteria.
SUMMARY
Summary
iv
The pathways of glycerol-3-phosphate (G3P) for glyceride-glycerol synthesis were
examined in precision cut liver slices of rats fasted for 48 h or diabetic for 3 days, and of rats
submitted for 21-23 days to two types of diet: a high-protein, carbohydrate free (HP) diet or a
hyperlipidic, hypercaloric (“cafeteria”) diet. G3P pathways were also examined in these same
four conditions in slices from livers which had been denervated 7 days before. In all
experimental conditions tissue norrepiphrine (NE) content, an index of sympathetic activity,
was markedly reduced (~90 %) in denervated livers.
In normally fed rats, liver denervation caused decreases in glycerokinase (GyK)
activity and in the incorporation of U-
14
C-glycerol into glyceride-glycerol by liver slices,
parameters that were used to estimate G3P production by direct phosphorylation of glycerol.
The incorporation of labeled glycerol into incubation medium glucose was not altered by
denervation. The activity of PEPCK-C and incorporation of 2-
14
C-pyruvate into glyceride-
glycerol by slices, used to evaluate glyceroneogenesis, as well as the incorporation of
14
C-
glucose into glyceride-glycerol and the glycolytic flux, used to evaluate the generation of
G3P via glycolysis, were not affected by denervation of fed rats.
Although the concentration of NE was increased in livers from both fasted and
diabetic rats, neither GyK activity nor the incorporation of U-
14
C-glycerol into glyceride-
glycerol by liver slices were affected by liver denervation. On the other hand, the
incorporation of this substrate into medium glucose was increased in those two conditions and
was not altered by denervation. PEPCK-C activity and glyceride-glycerol synthesis from 2-
14
C-pyruvate, as well as the incorporation of this substrate into medium glucose were
increased in fasted and diabetic rats, while glycolytic flux and incorporation of
14
C-glucose
into glyceride-glycerol were decreased in the two conditions. None of the above parameters
were affected by previous hepatic denervation.
Summary
v
NE content GyK activity, and incorporation of U-
14
C-glycerol into glyceride-glycerol
by liver slices were reduced in livers from rats fed the HP diet. The activity of the enzyme
was further reduced by denervation. The incorporation of labeled glycerol into incubation
medium glucose increased in HP rats and was not altered by denervation. Similarly to what
occurred in fasted an diabetic rats, the parameters used to evaluate liver slices
glyceroneogenesis were increased and those used to estimate G3P formation via glycolysis
were decreased. These parameters were not affected by denervation.
The increased NE content in livers from rats fed the “cafeteria” diet was accompanied
by an increase in GyK activity that was reduced by denervation. However, the incorporation
of U-
14
C-glycerol into glyceride-glycerol by liver slices was decreased and further reduced by
denervation. The decreased incorporation of U-
14
C-glycerol and 2-
14
C-pyruvate into medium
glucose were not affected by denervation. PEPCK-C activity and glyceride-glycerol synthesis
from 2-
14
Cpyruvate were reduced in liver from “cafeteria” diet rats, while glycolytic flux and
incorporation of U-
14
C-glucose into glyceride-glycerol were increased. Previous liver
denervation had no effect on these parameters.
The data of the present work indicate that glyceroneogenesis has a significant
participation in the generation of G3P needed for liver glyceride-glycerol synthesis. The data
also suggest that the supply of G3P in liver can be adjusted by reciprocal changes in
glyceroneogenesis and glycolysis, independently of the sympathetic nervous system.
INTRODUÇÃO
Introdução
1
1. Introdução
O fígado é um órgão bastante complexo e capaz de realizar inúmeras funções, dentre
elas: armazenamento e metabolização de vitaminas, síntese de proteínas plasmáticas,
desintoxicação de toxinas químicas, filtração mecânica de bactérias, secreção da bile e
juntamente com o baço e a medula óssea são os órgãos responsáveis pela hematopoiese
durante o desenvolvimento embrionário.
O fígado exerce ainda, além de todas as funções mencionadas anteriormente, um
importante papel na integração do metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas. Esta
integração tem como principal finalidade a manutenção da homeostase glicídica no
organismo. A manutenção de níveis adequados de glicose ocorre, pois o fígado tem a
reconhecida capacidade de sintetizar glicose a partir de moléculas menores, principalmente
aminoácidos, lactato, piruvato e glicerol, processo conhecido como neoglicogênese que
consiste de uma reversão parcial da via glicolítica, sendo uma das enzimas chaves deste
processo a fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). A neoglicogênese é controlada por
diversos fatores, dentre eles, nutricionais, hormonais e neurais. Em situações de abundância
de nutrientes, como por exemplo, no estado pós-absortivo ou durante a ingestão de uma dieta
tipo “cafeteria” (dieta hiperlipídica e hipercalórica), os níveis plasmáticos de insulina
encontram-se aumentados e os de glucagon diminuídos. Nestas situações, onde o organismo
não precisa produzir mais glicose, o padrão hormonal anteriormente mencionado leva a uma
inibição da neoglicogênese e uma ativação da glicogênese, ou seja, síntese do glicogênio
(forma de estoque de energia). O glicogênio por sua vez poderá ser armazenado no fígado ou
sofrer glicogenólise liberando glicose que poderá ser exportada para o músculo, para que em
situações de baixa demanda energética ela seja utilizada. Em contrapartida, situações onde o
como o jejum, diabetes ou alimentação rica em proteínas, a diminuição ou ausência de
Introdução
2
insulina e o aumento do glucagon, são capazes de ativar esta via alternativa de produção de
glicose (neoglicogênese) assim como a glicogenólise. O fornecimento adequado de glicose
para o organismo é de extrema importância, pois sabe-se que o sistema nervoso central (SNC)
usa preferencialmente esta fonte energética para coordenar todas as funções vitais. O SNC
consome diariamente, para fins energéticos, cerca de 50% da glicose presente no organismo.
Estudos de WAGLE et al., (1975), mostraram que a neoglicogênese a partir de alanina,
piruvato e frutose está aumentada, cerca de 2-5 vezes, em hepatócitos isolados de ratos
jejuados e diabéticos. TEPPERMAN et al., (1978), mostraram que em hepatócitos isolados de
ratos alimentados com uma dieta rica em glicose o conteúdo de glicogênio encontra-se
aumentado e a neoglicogênese basal bastante diminuída. Da mesma forma, simulando um
estado pós-absortivo, CLAUS et al., (1976), demonstraram em hepatócitos isolados, que a
insulina em altas concentrações (10nM) é capaz de suprimir completamente a estimulação da
neoglicogênese a partir de lactato (2mM). Como mencionado previamente, existem ainda
alguns mecanismos não hormonais que também podem regular esta via. Um exemplo disso é
a participação do sistema nervoso central, capaz de estimular a neoglicogênese. ALTUNA et
al., (2006), viram que em situações como o estresse induzido por acidose, ocorre um aumento
da 11-beta-hidroxiesteróide desidrogenase 1 (HSD1), que é a enzima responsável pela
estimulação da conversão de 11-dehidrocorticosterona para corticosterona, aumentando a
atividade dos glicocorticóides no tecido hepático. Este evento culmina com o aumento da
neoglicogênese e aumento da glicemia.
Além da importante função do fígado no metabolismo de carboidratos este órgão
também exerce um papel fundamental no metabolismo lipídico. A manutenção adequada das
reservas intracelulares de triacilglicerol (TAG) é essencial para o funcionamento normal dos
tecidos adiposos branco (TAB) e marrom (TAM), bem como para o tecido hepático. No TAB,
a produção contínua de glicerol-3-fosfato (G3P) é fundamental para que o tecido mantenha ou
Introdução
3
reponha os seus estoques de TAG, que são utilizados de acordo com a variação da demanda
energética de outros tecidos através da mobilização de ácidos graxos (AG). No TAM, os AG
produzidos pela hidrólise dos TAG endógenos são ao mesmo tempo substratos e mensageiros
para ativação do processo de desacoplamento mitocondrial (geração de calor). No fígado, a
produção de TAG torna-se de extrema importância para a manutenção das reservas
energéticas do TAB e do TAM propiciando a manutenção da homeostase calórica no
organismo. Os mecanismos envolvidos nesta manutenção serão discutidos a seguir.
A célula hepática tem a capacidade de sintetizar AG de novo a partir de acetil-CoA
(oriundo da glicose e aminoácidos cetogênicos, por exemplo), ou de captar da circulação
ácidos graxos pré-formados advindos da dieta ou de lipólise prévia. A intensidade destes
processos depende da condição fisiológica do organismo. Por exemplo, no estado alimentado,
a lipogênese de novo encontra-se ativada. MORRIS et al., (2003), mostraram que a adição de
10% de sacarose à dieta leva a um aumento de 51% na ácido graxo sintase (AGS) no fígado,
com conseqüente aumento na atividade desta enzima e da lipogênese. Por outro lado, em
situações como o jejum, diabetes ou alimentação rica em proteínas a lipogênese de novo
encontra-se diminuída. SCHMID et al., (1984), demonstraram que a taxa de lipogênese de
novo, in vivo, medida pela incorporação de trício oriundo de
3
H
2
O em AG, está marcadamente
reduzida na carcaça, fígado e tecido adiposo de ratos tratados com uma dieta hiperprotéica
(dieta HP).
Na célula hepática, os AG sintetizados de novo ou captados da circulação podem ser
metabolizados para produção de energia e corpos cetônicos (β-hidroxibutirato e acetoacetato)
ou podem ser esterificados com glicerol-3-fosfato, formando fosfolípides e principalmente
TAG. Os TAGs assim produzidos podem ser armazenados na célula hepática ou secretados
para a circulação incorporados em lipoproteínas que podem ser sintetizadas previamente nos
hepatócitos. As lipoproteínas plasmáticas têm como função básica transportar lipídios (TAG)
Introdução
4
para os tecidos periféricos onde estes serão metabolizados. As principais lipoproteínas são:
HDL, LDL e VLDL. Estas lipoproteínas diferem especialmente na composição de sua parte
protéica e na quantidade de lipídios que elas carregam. A VLDL, entretanto, é a mais
importante dessas lipoproteínas, contendo praticamente todo o TAG secretado pelo fígado.
KEMPEN et al., (1980), mostraram que a secreção de VLDL encontra-se marcadamente
aumentada em hepatócitos isolados incubados com palmitato por uma hora em comparação
com as outras lipoproteínas. Além disso, eles viram que esta secreção é inibida pela adição de
glucagon ou de dibutiril AMP cíclico (AMPc). Ainda neste trabalho, quando o meio de
incubação era submetido a um gradiente de centrifugação, os TAGs eram encontrados em
frações com densidades muito próximas à da região onde se localizam as partículas de VLDL
mostrando assim que os TAGs estão predominantemente incorporados nesta lipoproteína.
A utilização de AG de VLDL pelos tecidos periféricos ou encaminhamento dos
remanescentes para o fígado faz-se após hidrólise dos TAGs incorporados nesta lipoproteína
pela lipase lipoprotéica (LPL). A LPL é uma enzima produzida pelos adipócitos e encontra-se
localizada no endotélio capilar. A atividade total desta enzima é estimulada pela insulina e
pelos glicocorticóides e inibida pelas catecolaminas, hormônio do crescimento e testosterona.
Existem ainda enzimas importantes para a lipólise como a lipase hormônio sensível
(HSL) e a lipase dos ácidos graxos dos triglicerídeos (ATGL), esta última, descoberta mais
recentemente (ZIMMERMANN et al., 2004). Juntas estas duas enzimas são responsáveis por
mais de 95% da hidrólise de TAG no tecido adiposo. O fluxo de ácido graxo iniciado pela
lipólise do tecido adiposo é caracterizado pela reesterificação de 57% de ácidos graxos em
TAG (KALDERON et al., 2000). Aproximadamente dois-terços destes AG são
reesterificados antes mesmo de serem liberados do tecido adiposo para a corrente sanguínea.
Ocorre portanto uma reciclagem intracelular de AG no adipócito. Por outro lado, parte dos
AG mobilizados do tecido adiposo é encaminhada para o fígado e lá será novamente
Introdução
5
esterificada para a formação de TAG. Esses TAGs serão incorporados em VLDL e secretados
para a circulação. Dentre os tecidos que utilizarão os AG incorporados em TAG de VLDL
encontra-se o próprio tecido adiposo. Portanto além da reciclagem intracelular de AG acima
referida, existe ainda uma reciclagem sistêmica de AG.
De acordo com o mencionado acima, fica claro, portanto, que o processo de
esterificação de AG para a formação de TAG no fígado é bastante intenso, havendo então
uma necessidade contínua e grande de geração de glicerol-3-fosfato (G3P).
Independentemente da origem dos ácidos graxos, sua deposição como triacilglicerol requer
um suprimento adequado de glicerol-3-fosfato. Atualmente, sabe-se que existem três vias de
geração de G3P no fígado (figura 1). A via clássica de obtenção deste composto pelo fígado é
a sua síntese a partir de carbonos de glicose, pela conversão de diidroxiacetona a glicerol-3-
fosfato catalisada pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Além da conversão da glicose
pela via glicolítica, o fígado ainda possui uma outra via de geração de G3P, que se dá através
da fosforilação do glicerol pela gliceroquinase (GK). A gliceroquinase é uma enzima
citosólica que fosforila o glicerol reciclado oriundo da lipólise dos estoques intracelulares de
triacilglicerol ou o glicerol captado da circulação. Esta enzima está presente em grandes
concentrações no fígado e a atividade da GK neste órgão mostra-se 10 vezes maior do que no
TAM e cerca de 20 vezes maior do que no TAB. Trabalhos deste laboratório mostram ser a
atividade da gliceroquinase (por mg de proteína) cerca de 10 vezes menor no TAB que no
TAM (BRITO et al., 1994). A gliceroquinase no fígado é regulada por vários fatores dentre
eles estado nutricional, hormonal e neural. Entretanto, alguns pontos desta regulação
permanecem controversos e obscuros. Um exemplo da controversa sobre a regulação desta
enzima pode ser observada em estudos que verificavam situações de jejum e diabetes. Dados
prévios da literatura mostraram que animais jejuados por 48 horas ou diabéticos apresentam a
atividade desta enzima diminuída. Esses mesmos animais quando, respectivamente,
Introdução
6
realimentados ou tratados com insulina apresentaram um aumento na atividade da
gliceroquinase. Os autores sugeriram então que a atividade desta enzima poderia ser
modulada por este hormônio (KAMPF et al., 1968). Por outro lado, SEITZ et al., (1976), não
observaram nenhuma mudança significativa na atividade da enzima por g de tecido no fígado
de ratos jejuados e diabéticos por aloxana. PITNER et al., (1985), incubaram hepatócitos
isolados com insulina, dexametasona ou com um análogo do AMP cíclico e também não
observaram alterações significativas na atividade da gliceroquinase em nenhuma das
situações.
Uma outra questão que deve ser considerada é que a utilização de glicerol
parece ser limitada por um passo de permeação do mesmo para o interior celular. LI et al.,
(1983), propuseram que o transporte de glicerol no fígado seria catalizado por um carreador
específico que facilitaria a entrada do glicerol para a célula mesmo este estando em
concentrações fisiológicas de 0,1 mM. Estas especulações foram posteriormente confirmadas
e atualmente, já se sabe que existem facilitadores da entrada de glicerol nas células e eles são
conhecidos como aquaporinas ou aquagliceroporinas (AQP). KURIYAMA et al., (2002),
demonstraram que animais jejuados e posteriormente realimentados apresentam
respectivamente um aumento e uma diminuição nos níveis hepáticos de RNAm de aquaporina
9 (AQP 9), um canal específico para o glicerol no fígado. A deficiência insulínica induzida
pela administração de estreptozotocina resulta num aumento de RNAm de AQP 9.
Além de regulação nutricional e hormonal a atividade da GK no fígado pode também
estar sob o controle do sistema nervoso simpático (SNS). A mais tradicional e amplamente
conhecida função da inervação simpática no organismo, diz respeito principalmente ao
controle da lipólise especialmente no TAB e no TAM. Poucos trabalhos na literatura
demonstram a participação do SNS no metabolismo lipídico no fígado. O fígado é inervado
por nervos simpáticos e parassimpáticos. Entretanto, sabe-se que através de estímulos
Introdução
7
elétricos no plexo arterial (artéria hepática comum e plexo portal) são os efeitos
desencadeados pelo sistema nervoso simpático que predominam (JUNGERMANN et al.,
1987). Dados anteriores do nosso laboratório sugerem fortemente que a atividade da
gliceroquinase no TAM é controlada pelo SNS. A adaptação à dieta hiperproteica, livre de
carboidratos dieta que diminui a estimulação simpática para o tecido, culmina com uma
redução significativa na atividade desta enzima no TAM quando comparado a ratos mantidos
sob dieta balanceada (BRITO, et al., 1998). Da mesma forma que a adaptação à dieta
hiperproteica, a hemidesnervação simpática também provocou uma redução significativa na
atividade da gliceroquinase (KAWASHITA et al., 2000). Reforçando esta hipótese estão os
achados de KAWASHITA et al., 2002 e BERTIN et al., 1984, que demonstraram que a
exposição ao frio (situação fisiológica onde ocorre um aumento no fluxo simpático para o
TAM) por 10 e 30 dias, respectivamente, induzem um aumento significativo na atividade da
gliceroquinase. Tornando esses achados ainda mais evidentes o trabalho de FESTUCCIA et
al., (2003) demonstraram no TAM, que ratos submetidos ao frio por 12 ou 24 horas
apresentam um aumento de 30% e 100% na atividade da GK e de 2 vezes e 4 vezes
respectivamente nos níveis de RNAm desta enzima. Além disso, quando estes mesmos
animais eram submetidos a hemidesnervação encontrava-se uma redução de 50% e 30% na
atividade e no RNAm da GK. Estudos recentes do nosso laboratório relacionados com a
desnervação simpática cirúgica unilateral do TAB (FRASSON et al., (2005) [dados ainda não
publicados]) mostraram que a atividade da gliceroquinase neste tecido encontra-se reduzida
com a desnervação, inclusive em situações onde ocorre aumento da atividade simpática como
o jejum, diabetes e exposição ao frio agudo. Apesar de todas as evidências de um controle
simpático na atividade e na expressão da GK tanto no TAB quanto no TAM, ainda nada se
sabe sobre esta possível regulação do SNS na atividade e expressão da GK hepática.
Introdução
8
As duas vias de geração de G3P no fígado anteriormente mencionadas (via glicolítica
e via GK) eram consideradas suficientes para a produção de G3P necessário para a
esterificação de AG pelo fígado. Desta forma, não havia a necessidade da presença de uma
terceira via para a produção deste substrato. No entanto, estudos prévios deste laboratório,
BOTION et al., (1998), mostraram que o fígado é ainda capaz de produzir G3P por uma outra
via, denominada via gliceroneogênica. A presença desta via no fígado foi posteriormente
confirmada pelo trabalho de KALHAN et al., (2003), em humanos mostrando que a
gliceroneogênese era responsável por cerca de 10-60% da formação de G3P. Entretanto, a
ativação desta via em algumas situações fisiológicas bem como sua regulação permanecem
ainda não esclarecidas. A via gliceroneogênica, que tem como enzima chave a PEPCK, trata-
se de uma reversão parcial da via glicolítica envolvendo a carboxilação do piruvato a
oxalacetato, descarboxilação do oxalacetato a fosfoenolpiruvato e a formação de glicerol-3-
fosfato. A gliceroneogênese utiliza como doadores de carbonos para síntese de glicerol-3-
fosfato substratos de três carbonos como piruvato, lactato e alanina.
Os primeiros relatos da existência desta via foram obtidos por BALLARD et al.,
(1967) no TAB. Posteriormente, RESHEF et al., (1970), demonstraram que em situações
catabólicas como jejum e diabetes ocorre, no TAB, um aumento significativo da síntese de
glicerol-3-fosfato pela gliceroneogênese, bem como um aumento na atividade da enzima
chave da via, a PEPCK. Baseados nestes trabalhos, RESHEF et al., (2003), sugeriram que o
aumento da gliceroneogênese no jejum e diabetes seria uma tentativa do TAB de inibir a
liberação excessiva de ácidos graxos para a circulação, evitando assim um aumento na
produção hepática de corpos cetônicos e cetoacidose.
Apesar deste último trabalho, a gliceroneogênese ficou aproximadamente 40
anos esquecida na literatura, até recentemente quando sua verdadeira contribuição para síntese
de glicerol de triacilglicerol no TAB foi demonstrada. Em estudos do nosso laboratório,
Introdução
9
BOTION et al., (1998), verificaram em experimentos realizados com dupla marcação
(administração simultânea de
3
H
2
O e de U-
14
C-glicose) em ratos alimentados com dietas
balanceadas, que a via gliceroneogênica é responsável por aproximadamente 60% do total de
glicerol-3-fosfato incorporado em triacilglicerol no TAB. Em ratos adaptados à dieta
hiperproteica e livre de carboidratos, a contribuição da gliceroneogênese para a síntese de
glicerol-triacilglicerol sobe para 80% do total. Este trabalho, como mencionado anteriormente
foi também o primeiro na literatura a demonstrar que a gliceroneogênese também ocorria no
fígado. Posteriormente, a importância da gliceroneogênese foi confirmada em experimentos
com animais transgênicos. OLSWANG et al., (2002), produziram uma linhagem de
camundongos mutantes que não expressavam PEPCK, enzima chave da gliceroneogênese, no
TAB, sendo a expressão desta enzima normal nos outros tecidos como fígado e rins. Estes
camundongos mutantes apresentavam depósitos reduzidos de lipídios, sendo que 25% deles
apresentavam-se lipodistróficos (reduzido conteúdo de gordura corporal). Maior elicitação da
importância da gliceroneogênese para a síntese de glicerol de triacilglicerol foi obtido por
FRANCKHAUSER et al., (2002), que produziram uma linhagem de camundongos que
apresentava super expressão da PEPCK no TAB. Estes camundongos eram obesos e
apresentavam uma elevada taxa de reesterificação de ácidos graxos e gliceroneogênese.
Contudo, como a descoberta da capacidade do figado em produzir G3P via
gliceroneogênese é relativamente nova e são raros os trabalhos na literatura sobre este
assunto, tornou-se extremamente necessário e interessante tentar elucidar os mecanismos de
regulação da geração de glicerol-3-fosfato por este órgão.
Introdução
10
Figura 1: Vias de geração de glicerol-3-fosfato no fígado. PEPCK- fosfoenolpiruvato
carboxiquinase; AG- ácidos graxos; GK- gliceroquinase; TAG- triacilglicerol.
OBJETIVOS
Objetivos
11
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Com base nos dados apresentados, este trabalho teve como objetivo geral investigar o
controle hepático em diversas condições que apresentam alterações ou ajustes do metabolismo
lipídico nas três vias de geração de glicerol-3-fosfato: via gliceroneogênica, via glicolítica e
fosforilação direta do glicerol pela gliceroquinase.
2.2. Objetivos específicos
• Verificar o efeito do jejum, do diabete, de uma dieta hiperproteica livre de
carboidratos e de uma dieta hiperlipídica e hipercalórica (tipo “cafeteria”) na
gliceroneogênese, através da medida da atividade da PEPCK e da incorporação de 2-
14
C-Piruvato em glicerídeo-glicerol; na via glicolítica através da medida do fluxo
glicolítico utilizando
3
H-5-Glicose e da incorporação de U-
14
C-Glicose em glicerídeo-
glicerol e na fosforilação direta do glicerol através da medida da atividade da
gliceroquinase e da incorporação de U-
14
C-Glicerol em glicerídeo-glicerol.
• Verificar o efeito da desnervação hepática nos mesmos processos e nas mesmas
condições experimentais acima.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
12
3. Materiais e Métodos
3.1. Animais e Tratamento
Foram utilizados ratos machos Wistar com peso inicial variando de 90 a 100 gramas,
provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP,
mantidos individualmente ou aos pares em gaiolas no Biotério do Departamento de
Bioquímica e Imunologia com ciclo claro-escuro de 12 horas, temperatura de 25 + 2°C, dieta
balanceada (NUVLAB CR1-NUVITAL) para roedores contendo 54% de carboidratos, 5% de
lipídios e 19% de proteínas e água ad libitum. O grupo de animais jejuados recebeu apenas
água ad libitum durante 48 horas que precederam os experimentos. O diabetes foi induzido
em ratos mantidos em jejum prévio por 12 horas, através da injeção na jugular de
estreptozotocina dissolvida em tampão citrato pH 4,5 na dose de 45 mg/ kg. Após a injeção de
estreptozotocina, os animais foram mantidos em jejum por 2 horas. Foram considerados
diabéticos e utilizados nos experimentos após 72 horas da indução, ratos que apresentavam
glicemia acima de 350 mg/ dL. Nos experimentos com a dieta hiperproteica, livre de
carboidratos (dieta HP) ratos com peso inicial de 75-85 g e ratos controles com peso inicial de
55-65 g foram alimentados por 21 dias com dietas elaboradas no laboratório. Os componentes
das duas dietas estão descritos na tabela 1. As dietas N e HP são aproximadamente
isocalóricas. Depois de 7 dias de adaptação à dieta, a ingestão de alimento e o ganho de peso
corporal dos ratos HP não diferem dos controles.
Materiais e Métodos
13
Tabela 1: Composição básica das dietas
Componentes (em gramas) N HP
Caseína* 20 86
Sacarose 33 ---
Amido 33 ---
Óleo de milho 8 8
Mistura salina 5 5
Mistura de vitaminas 1 1
*82% de proteínas e 8% de umidade
Nos experimentos com a dieta hiperlipídica e hipercalórica os animais permaneceram
durante 23 dias sob um regime alimentar de dieta tipo “cafeteria”. Para esta dieta eram
oferecidos, além da ração comercial (dos animais controles) diversos ingredientes palatáveis,
abaixo descritos. Foi verificado que nessas condições os ratos ingerem 30-40% a mais de
calorias. A cada dia, quatro ingredientes diferentes, entre doze itens previamente
selecionados, eram oferecidos aos animais, sendo que todos os itens apresentavam densidade
calórica superior à da dieta comercial (ROTHWELL et al., 1982). A água foi acrescida de
20% de sacarose. Os ratos controles receberam a dieta comercial e água ad libitum. Os
componentes da dieta “cafeteria” estão descritos na tabela 2.
Materiais e Métodos
14
Tabela 2: Composição da dieta hiperlipídica e hipercalórica
Carboidrato
(g/100g)
Lipídio
(g/100g)
Proteína
(g/100g)
Densidade
Calórica
(g/100g)
Bala de
Caramelo
72,7 9,0 18,1 4,4
Bacon
- 58,0 9,0 5,6
Batata
Frita
45,0 35,0 5,0 5,1
Bis
®
63,1 23,3 8,1 4,9
Bolacha de
Maisena
62,5 12,5 7,5 4,0
Castanha-
do-Pará
7,0 67,0 17,0 6,9
Chocolate
50,0 33,3 10,0 5,4
Chocooky
®
63,3 23,3 3,3 5,0
Pé de
Moleque
58,8 26,47 11,7 5,2
Snacks
®
65,0 17,5 7,5 4,5
Torrada
73,3 6,6 13,3 4,0
Torrone
80,0 7,5 10 3,8
Ração
Nuvital
®
53,7 5,12 19,6 3,1
Valores
Médios
53,4 24,98 10,79 4,80
Ratos experimentais receberam água doce (20% de sacarose)
Materiais e Métodos
15
Todos os experimentos foram realizados pela manhã entre 8 e 10 horas. Todos os
ratos utilizados encontravam-se no estado alimentado (exceto experimentos em jejum), e
pesavam entre 200-220 g.
3.2. Desnervação hepática
Um método similar ao descrito por LAUTT et al., (1973), foi adotado. Os animais
foram anestesiados com éter e foi feita uma laparotomia de 5-7 cm ao longo da linha mediana.
Os intestinos foram colocados para fora da cavidade abdominal (lado esquerdo do animal)
sobre uma gaze embebida em salina 0,9%. A artéria hepática, a veia porta e o ducto biliar
eram visualizados e dissecados. Uma solução aquosa de fenol 85% foi cuidadosamente
aplicada com algodão sobre estas estruturas. Os animais controles (operação fictícia) foram
submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, porém foi aplicada salina 0,9% ao invés do
fenol. Os ratos foram utilizados nos experimentos 7 dias após a cirurgia.
3.3. Conteúdo de Noradrenalina do Fígado
A determinação do conteúdo de noradrenalina no fígado foi realizada segundo método
descrito por GARÓFALO et al., (1996). A noradrenalina foi isolada do eluato em HPLC (LC-
7A, Shimadzu) em coluna de fase reversa (Spherisorb ODS-2). A noradrenalina e o padrão
interno foram quantificados com o auxílio de um detector eletroquímico (LC-ECD-6A,
Shimadzu). O resultado foi expresso em ng. g tecido
-1
.
3.4. Determinação do conteúdo total lipídico do fígado
A extração dos lipídios totais foi realizada pelo método de FOLCH et al., 1957. Uma
porção de fígado (1g) era retirada, pesada e colocada em clorofórmio:metanol (2:1), sendo
posteriormente homogeneizada e o volume completado para 10 mL. Em seguida, o material
Materiais e Métodos
16
foi filtrado utilizando papel Whatman nº 1 e a 8 ml do filtrado foram adicionados 1,6 ml de
água Milli-Q. Após separação da fase clorofórmica e aquosa, o material foi centrifugado a
2500 rpm durante 5 minutos e uma alíquota da fase clorofórmica foi transferida para tubos
previamente pesados para evaporação a 50˚ C. A quantificação da gordura foi realizada por
método gravimétrico.
3.5. Preparação das fatias de fígado
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, o fígado era retirado e
colocado em tampão Krebs-Henseleit mantido em gelo. Fatias de aproximadamente 500 µm
de espessura de tecido hepático eram preparadas utilizando-se um fatiador “ McIlwain Tissue
Chopper ”.
3.6. Incorporação de U-
14
C-glicerol, 2-
14
C-piruvato e U-
14
C-glicose na fração
glicerol de glicerídeo-glicerol em fatias de fígado, in vitro
As fatias de fígado (200 mg) eram incubadas em tampão Krebs-Henseleit contendo ou
1 µCi de U-
14
C-glicerol e 1mM de glicerol , ou 1 µCi de 2-
14
C-piruvato e 1mM de piruvato ou
1µCi de U-
14
C-glicose e 5mM de glicose, por 1 hora com agitação orbital contínua e aeração
prévia (95% O
2
e 5% CO
2
). A reação foi interrompida colocando-se os frascos no gelo. As
fatias de fígado foram lavadas com salina 0,9% e destinadas para a extração de lipídios totais
como descrito a seguir. Todos os materiais radioativos foram provenientes da Armersham
Biosciences
3.6.1. Extração dos lipídios totais e isolamento dos ácidos graxos e fração glicerol
Para a extração dos lipídios totais foi utilizado o método de FOLCH et al. (1957),
onde as fatias de fígado foram homogeneizadas em 10 mL de clorofórmio:metanol (proporção
Materiais e Métodos
17
de 2:1). Este material foi filtrado e a 10 mL do filtrado foi adicionado 2mL de água milli-Q.
Após 12 horas em repouso, a fase superior (aquosa) foi aspirada e a fase inferior
(clorofórmica) lavada 3 vezes com a mistura da fase superior, preparada com clorofórmio,
metanol e mistura salina na proporção 21,1:337:330 (mL). A mistura salina foi preparada com
0,528g de CaCl
2
. H
2
O; 0,732g de MgCl
2
. 6H
2
O; 5,8g de NaCl e 940 mL de H
2
O. Para o
isolamento dos ácidos graxos uma alíquota de 4 ml do extrato clorofórmico foi evaporado e os
lipídios saponificados com 2mL de KOH etanólico (1 mL de KOH saturado 14,5M para 20
mL de etanol). Os tubos foram fechados com bolas de vidro e submetidos a aquecimento em
banho-maria à temperatura de 70-80 ºC por uma hora. Foram adicionados 5 mL de água milli-
Q e os tubos mantidos à temperatura de 40-50 ºC até evaporação de todo o álcool. O material
saponificado foi então lavado três vezes com 12 mL de éter de petróleo para remoção dos
lipídios não saponificáveis. Posteriormente o material foi acidificado com ácido perclórico
6% e os ácidos graxos extraídos com éter de petróleo. Todo o material etéreo foi evaporado e
o resíduo dissolvido em 8mL de líquido de cintilação SX20-5 (FISHER SCIENTIFIC) para
contagem da radioatividade. 2 ml da fase aquosa inferior, que resultava do processo de
acidificação com H
2
ClO
4
, era recolhida para a contagem de
14
C-glicerol. Este volume era
dissolvida em 8,0 mL de líquido de cintilação SX20-5 (FISHER SCIENTIFIC) para contagem
da radioatividade. A radioatividade incorporada foi medida em cintilador Beckman LS
7600.O resultado foi expresso em nmol.g de fígado
-1
.h
-1
.
3.7. Incorporação de U-
14
C-glicerol e 2-
14
C-piruvato em glicose medida no meio
de incubação
As fatias de fígado (200 mg) foram incubadas em tampão Krebs-Henseleit contendo
ou U-
14
C-glicerol (1mM, 1 µCi) ou 2-
14
C-piruvato (1mM, 1 µCi) por 1 hora com agitação
orbital contínua e aeração prévia (95% O
2
e 5% CO
2
). A reação foi interrompida colocando-se
Materiais e Métodos
18
os frascos no gelo. A fatias de fígado eram lavadas com salina e colocadas em um frasco
contendo clorofórmio-metanol 2:1 para posterior processamento. O meio de incubação era
então desproteinizado pelo método de SOMOGGI et al., (1945), adicionando 0,250 ml de
Ba(OH)
2
e 0,250 ml de ZnSO
4.
As amostras eram agitadas e centrifugadas a 3000 rpm por 10
minutos. As proteínas se precipitavam e 1 mL do sobrenadante era pipetado para
determinação da
14
C-Glicose pelo método de JONES et al., (1968). Eram pesadas 100 mg de
glicose anidra em um tubo de vidro, acrescentava-se 1 ml da amostra previamente
desproteinizada e 2 gotas de ácido acético glacial. Estes frascos eram colocados em banho-
maria fervente (100º C) com ventilação até evaporar e ficar um xarope grosso. Completada a
evaporação eram adicionadas 60-70 mg de acetato de sódio anidro e 1 ml de acído acético
anidro. Os frascos eram cobertos com bola de vidro e aquecidos a 105-110 ºC (estufa ou
banho de glicerina) por 1 hora e 30 minutos. Após este tempo, o tubo de vidro era resfriado e
acrescentados 10mL de água destilada. Para hidrolisar o anidrido acético a solução foi fervida
por 1 minuto ou até o desaparecimento dos glóbulos oleosos. O GPA (glicose pentacetato)
formado era completamente solúvel naquele volume de água fervente. Os frascos foram
colocados em banho de gelo com agitação ocasional até o GPA cristalizar. O GPA foi então
filtrado em papel de filtro, lavando o tubo de vidro e os cristais, 2 vezes, com pequenas
porções de 3 ml de solução saturada de GPA previamente preparada. Os cristais eram
transferidos de volta para o tubo e 10 ml de água destilada acrescentados e aquecidos a 100ºC
até serem dissolvidos. Se a solução estivesse escurecida acrescentava-se uma porção de
carvão ativado e filtrava com papel de filtro. Deixava-se a solução resfriar como antes e o
GPA cristalizar. Filtrava-se novamente os cristais de GPA utilizando um papel de filtro e
removia-se a maior quantidade possível de umidade por sucção. Transferia-se o GPA
recristalizado para o tubo de vidro e deixava secar por 2 horas a 105-110ºC. Pesava-se uma
quantidade conveniente (10-20 mg) de GPA e transferia para um frasco de cintilação.O
Materiais e Métodos
19
líquido de cintilação SX20-5 (FISHER SCIENTIFIC) era acrescentado para contagem da
radioatividade. A radioatividade incorporada foi medida em cintilador Beckman LS 7600. O
resultado foi expresso em µmol.g de fígado
-1
.h
-1
ou nmol. g de fígado
-1
.h
-1
.
3.8. Determinação do Fluxo glicolítico
O fluxo glicolítico foi medido seguindo recomendações de MALAISSE et al.,
(1992), que diz que o fluxo glicolítico pode ser medido pela taxa de metabolização da
3
H-5-
glicose em
3
H
2
O. As fatias de fígado foram incubadas em tampão Krebs-Henseleit contendo
3
H-5-Glicose (5mM, 1 µCi ) por 1 hora com agitação orbital contínua e aeração prévia (95%
O
2
e 5% CO
2
) . A reação foi interrompida adicionando-se 200 µl H
2
ClO
4
6N
.
As fatias de
fígado eram desprezadas e o meio de incubação era recolhido. O pH do meio era ajustado para
8 utilizando-se NaOH 0,5 mM e a separação da
3
H-5-Glicose não metabolizada da
3
H
2
O era
feita utilizando resina DOWEX 1X8 previamente tratada com tetraborato de sódio 0,8M. A
glicose não metabolizada ficava retida na resina e a
3
H
2
O era eluída com água. Três frascos
eram recolhidos contendo a
3
H
2
O eluída. O líquido de cintilação SX20-5 (FISHER
SCIENTIFIC) era acrescentado para contagem da radioatividade. A radioatividade
incorporada foi medida em cintilador Beckman LS 7600. O resultado foi expresso em µmol
de
3
H
2
O.g de fígado
-1
.h
-1
.
3.9. Medida da atividade enzimática da gliceroquinase (GK)
Para a medida da atividade da GK, o fígado foi homogenizado em 5 ml de tampão
KCL 1% e EDTA 1mM para 250 mg de tecido. Os homogenizados foram centrifugados por
10 min a 3000 g a 4°C e a atividade da enzima foi determinada no sobrenadante, segundo o
método descrito por NEWSHOLME et al., (1967) com algumas modificações. Os
homogenados e o meio de reação (100µL/ tubo) foram pré-incubados separadamente, durante
Materiais e Métodos
20
5 minutos a 37°C. O meio de reação continha Tris 100 mM (pH 7,5); ATP 6 mM; MgCl
2
4
mM, EDTA 1mM; NaF 25 mM; 2-β-mercaptoetanol 20 mM; glicerol-U-
14
C (10 µCi/ ml);
glicerol 1mM; fosfocreatina 10 mM, creatina quinase (26,4 U/ mL) e albumina 1%. Aos tubos
contendo 100 µL do meio de reação foram adicionados 20 µL do homogenado, e, após 30
minutos de incubação a 37°C a reação foi interrompida com 100 µL de etanol 98%. A cada
ensaio corriam-se dois brancos, nos quais etanol 98% foi colocado antes do homogenado para
inativação da enzima. A separação do glicerol-
14
C do glicerol-3-fosfato-
14
C foi feita através
de cromatografia ascendente aplicando-se 20 µL da amostra em papel Whatman n°1,
utilizando como solvente etanol:NH
3
:H
2
O (80:4:16 mL). Neste sistema, o glicerol não
fosforilado move-se com a frente do solvente e o glicerol-3-fosfato permanece entre a origem
e 5 cm ascendente, sendo que após 8 horas de corrida a frente do solvente se encontra a
aproximadamente 30 cm da origem. Após secar o papel, cada amostra foi cortada em tiras de
cinco cm a partir da origem (corresponde ao glicerol fosforilado) e colocada em líquido de
cintilação para a contagem da radioatividade em contador Beckman LS 7600. O conteúdo de
proteínas do homogenado foi estimado pelo método de LOWRY et al., (1951).
3.10. Medida da atividade enzimática da Fosfoenolpiruvato Carboxiquinase
(PEPCK)
Para a medida da atividade da PEPCK, 250 mg de fígado foram homogeneizadas em 5
ml de tampão, contendo 0,2 M de sacarose, 20 mM de trietanolamina, 5 mM de 2-β-
mercaptoetanol, 1mM de EDTA, pH 7,5. O homogenado foi centrifugado a 10.000 rpm a 4º C
durante 15 minutos. A camada lipídica superior foi descartada e o sobrenadante novamente
centrifugado a 100.000 g a 4º C durante 30 minutos para obtenção da fração citosólica. A
atividade da enzima foi determinada pela formação do malato, conforme descrito por
BALLARD et al., 1967:
Materiais e Métodos
21
+ NaH
14
CO
3
+IDP
onde:
PEP: fosfoenol piruvato
PEPCK: fosfoenol piruvato carboxiquinase
H
14
CO
3
: bicarbonato de sódio marcado
IDP: inosina-5-difosfato
MDH: malato desidrogenase
Os homogenados e o meio de reação (800µL/tubo) foram pré-incubados
separadamente, durante 5 minutos a 37ºC. O meio de reação de pH final entre 6,9 – 7,1
continha em cada tubo: tampão imidazol pH 6,6 (333,3 M), 40mM de MnCl
2,
20 mM de
GSH, 50mM NADH, 15 mM de PEP, 6U/tubo MDH, 1 mM de KHCO
3
e 2 µCi/tubo de
NaH
14
CO
3
. Para ativação da PEPCK eram acrescentados 12,5 mM IDP (100µL) . Aos tubos
contendo 800µL do meio de reação mais 100µL do IDP eram adicionados 100µL da fração
citosólica para um volume final de 1,0mL no ensaio. Os brancos da reação continham todos
os componentes da mistura com exceção do IDP, onde este foi substituído por H
2
O Mili Q. A
mistura era incubada em banho-maria à 37º C durante 10 minutos e a reação era interrompida
pela adição de 0,5 mL de ácido tricloroacético 10%. As amostras eram centrifugadas durante
10 minutos a 1.000 g e uma alíquota de 1mL foi transferida para tubos de cintilação, aos quais
eram adicionados 0,2 mL de HCl 2N. Em seguida, os tubos eram colocados em dessecador a
vácuo para remoção do NaH
14
CO
3
não incorporado em malato. Após completa evaporação o
precipitado contendo o malato era ressuspenso em 1,0 mL de H
2
O e adicionados 8mL de
líquido de cintilação SX20-5 (FISHER SCIENTIFIC) para contagem da radioatividade em
cintilador Beckman LS 7600. O resultado foi expresso por nmol de malato.mg de proteína
-
1
.min
-1
, sendo a dosagem protéica realizada pelo método BCA – Bicinchoninic acid-Pierce,
USA (SMITH et al., 1985).
Materiais e Métodos
22
3.11. Medida da concentração plasmática de glicose e ácidos graxos livres
A concentração plasmática de glicose foi medida pelo método da glicose oxidase (Kit
Dolles) e a concentração plasmática de ácidos graxos livres foi medida por titulação segundo
o método de DOLE & MEINERTZ, (1960).
3.12. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e as diferenças entre grupos
foram analisadas utilizando o test t de Student, com P < 0,05, como nível de significância.
RESULTADOS
Resultados
23
4. Resultados
Serão apresentados separadamente os resultados obtidos em cada uma das situações
fisiológicas estudadas: ratos normalmente alimentados, jejuados por 48 horas, diabéticos por
72 horas, alimentados com dieta hiperproteica e alimentados com dieta cafeteria.
Normalmente Alimentados
4.1. Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado
A eficiência da desnervação hepática no fígado foi avaliada pela medida do conteúdo
de noradrenalina do tecido, o qual foi significativamente menor (~ 91%) no fígado do animal
desnervado em comparação com o fígado do animal submetido à operação fictícia (Tabela 3).
Tabela 3: Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina (ng. g tecido
-1
) do
fígado de ratos normalmente alimentados.
Intacto Operação Fictícia Desnervado
Alimentado 65,7± 5,9 (7) 63,5 ± 4,1 (8) 5,9 ± 2,0 (11) *
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam o
total de animais utilizados. *P< 0.05 em relação ao grupo operação fictícia.
Resultados
24
4.2. Atividade da Gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
A atividade da gliceroquinase encontrava-se aproximadamente 27% diminuída no
fígado de animais desnervados alimentados em comparação aos animais submetidos à
operação fictícia. A incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol nesta mesma
situação encontrava-se aproximadamente 10% menor nos animais desnervados sendo que a
desnervação hepática não alterou a produção de glicose a partir de U-
14
C-glicerol (Tabela 4).
Tabela 4: Efeito da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase (GK), na
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação no
fígado de ratos normalmente alimentados.
Operação Fictícia Desnervado
Atividade da GK 22,0 ± 0,8 (9) 16,1 ± 0,8 (9) *
( nmol.mg proteína
-1
.min
-1
)
U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol 0,64 ± 0,01 (6) 0,57 ± 0,01 (11) *
(µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
U-
14
C-glicerol em glicose 3,9 ± 0,1(8) 3,6 ± 0,2 (8)
(µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam
o total de animais utilizados. *P< 0,05 em relação ao grupo operação fictícia.
Resultados
25
4.3. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
e em glicose do meio de incubação no fígado
A atividade da PEPCK e a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol não
sofreram nenhuma alteração com a desnervação hepática. A desnervação também não causou
nenhuma alteração na produção de glicose a partir de 2-
14
C-piruvato (Tabela 5).
Tabela 5: Efeito da desnervação hepática na atividade da fosfoenolpiruvato carboxiquinase
(PEPCK) e na incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de
incubação no fígado:
Operação fictícia Desnervado
Atividade da PEPCK 27,5 ± 2,5 (10) 28,1 ± 2,6 (11)
(nmol. mg proteína
-1
.min
-1
)
2-
14
C-piruvato em 29,2 ± 0,8 (7) 29,3 ± 1,7 (9)
glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
2-
14
C-piruvato em glicose 474,5 ± 12,8 (9) 497,8 ± 11,0 (10)
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam
o total de animais utilizados.
Resultados
26
4.4. Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
A incorporação de
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol nos animais normalmente
alimentados não se alterou com a desnervação hepática (Tabela 6).
Tabela 6: Efeito da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-
glicerol (nmol.g tecido
-1
.h
-1
) no fígado de ratos normalmente alimentados.
Operação fictícia Desnervado
Alimentado 109,1 ± 5,1 (5) 103,2 ± 2,8 (6)
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam o
total de animais utilizados.
4.5 Medida do fluxo glicolítico
O fluxo glicolítico nos animais normalmente alimentados não sofreu nenhuma
alteração com a desnervação hepática (Tabela 7).
Tabela 7: Efeito da desnervação hepática no fluxo glicolítico (µmol. g
-1
.h
-1
) no fígado de
ratos normalmente alimentados.
Operação fictícia Desnervado
Alimentado 2,0 ± 0,06 (7) 2,1 ± 0,06 (8)
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam o
total de animais utilizados.
Resultados
27
Jejum
Os animais utilizados nestes experimentos foram submetidos ao jejum por 48 horas
com água ad libitum e apresentaram valores de ácidos graxos livres de 0,91 ± 0,04 enquanto
os alimentados apresentavam 0,33 ± 0,01 (µmol/mL de plasma).
4.6. Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado
O conteúdo de noradrenalina no fígado de ratos jejuados encontrava-se
aproximadamente 2,5 vezes maior que no fígado dos ratos alimentados. A desnervação
hepática , por sua vez, reduziu o conteúdo de noradrenalina à aproximadamente 3% do valor
encontrado no rato submetido à operação fictícia jejuado (Figura 2).
Resultados
28
Figura 2: Efeito do jejum e da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado.
Os valores representam a média e erro padrão de 6 ratos. *P< 0,05 em relação ao alimentado.
# P< 0,05 em relação ao grupo operação fictícia .
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Desnervado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Jejuado
Alimentado
#
*
Conteúdo de Noradrenalina
(ng.g tecido
-1
)
Resultados
29
0
100
200
300
400
500
600
Desnervado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Jejuado
Alimentado
Incorporação de
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
0
5
10
15
20
25
30
Desnervado
Jejum
Operação
Fictícia
Jejum
Jejum
Ali mentado
Atividade da GK
(nmol.mg proteína
-1
.min
-1
)
4.7. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.7.1. Atividade da gliceroquinase e Incorporação de U-
14
C- glicerol em
glicerídeo-glicerol
Nenhuma alteração foi observada na atividade da gliceroquinase nem nos ratos
jejuados nem nos ratos jejuados desnervados. Da mesma forma, a incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol também não se alterou nem com o jejum e nem com a
desnervação (Figura 3).
Figura 3: Efeito do jejum e da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase (GK) (A)
e na incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol (B) no fígado. Os valores
representam a média e erro padrão de 6-12 ratos.
A B
Resultados
30
4.7.2. Incorporação de U-
14
C- glicerol em glicose do meio de incubação
A incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de incubação aumentou 15%
nos ratos jejuados em comparação com os ratos alimentados. A desnervação hepática não
causou nenhuma alteração neste parâmetro (Figura 4).
Figura 4: Efeito do jejum e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicose do meio de incubação. Os valores representam a média e erro padrão de 6-12 ratos.
*P< 0,05 em relação ao alimentado.
0
1
2
3
4
5
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose
(
µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
*
Alimentado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Desnervado
Jejuado
Resultados
31
0
10
20
30
40
50
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerideo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Alimentado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Desnervado
Jejuado
*
0
10
20
30
40
50
60
70
Desnervado
Jejuado
Operação
Fictícia
Je
j
uad
o
Jejuado
Alimentado
Atividade da PEPCK
(nmol.mg proteina
-1
.min
-1
)
*
4.8. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
e em glicose do meio de incubação no fígado
4.8.1. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol
A atividade da PEPCK no fígado de ratos jejuados aumentou 84% em relação aos
ratos alimentados. A desnervação hepática não afetou este parâmetro. Da mesma forma, a
incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol aumentou 51% nos ratos jejuados em
comparação com os ratos alimentados. A desnervação hepática também não causou nenhum
efeito neste parâmetro (Figura 5).
Figura 5: Efeito do jejum e da desnervação hepática na atividade da fosfoenolpiruvato
carboxiquinase (PEPCK) (A) e na incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol (B)
no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-12 ratos. *P< 0,05 em relação
ao alimentado.
A B
Resultados
32
4.8.2. Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação
A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação encontrava-se
aproximadamente 2,5 vezes maior nos ratos jejuados em comparação com os ratos
alimentados. A desnervação hepática não causou nenhuma alteração neste parâmetro (Figura
6).
Figura 6: Efeito do jejum e da desnervação hepática na incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicose do meio no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6 ratos.* P<0,05
em relação ao alimentado.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose
(
µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Alimentado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Desnervado
Jejuado
*
Resultados
33
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
*
Desnervado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Jejuado
Alimentado
Fluxo Glicolítico
(
µ
mol.g tecido
-1
.h
-1
)
0
20
40
60
80
100
120
Incoporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Alimentado
Jejuado
Operação
Fictícia
Jejuado
Desnervado
Jejuado
*
4.9. Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e do fluxo
glicolítico
A incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol encontrava-se 27% menor no
fígado de ratos jejuados em comparação com os ratos alimentados. A desnervação hepática
não alterou este parâmetro. O fluxo glicolítico mostrou-se 58% diminuído nos ratos jejuados
em comparação aos alimentados e a desnervação também não alterou este parâmetro (Figura
7).
Figura 7: Efeito do jejum e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicose em
glicerídeo-glicerol (A) e no fluxo glicolítico (B) no fígado. Os valores representam a média e
erro padrão de 6-12 ratos. * P< 0,05 em relação ao alimentado.
A B
Resultados
34
Diabetes
Os animais utilizados nestes experimentos possuíam glicemia maior que 350 mg/dL e
apresentavam valores de ácidos graxos livres de 0,63 ± 0,09 enquanto os controles
apresentavam 0,37 ± 0,01 (µmol/mL de plasma).
4.10. Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado
O conteúdo de noradrenalina no fígado de ratos diabéticos encontrava-se 100% maior
que no fígado dos ratos controles. A desnervação hepática no fígado de ratos diabéticos
reduziu o conteúdo de noradrenalina a aproximadamente 3% do valor encontrado no rato
submetido a operação fictícia diabético. (Figura 8).
Resultados
35
Figura 8: Efeito do diabetes e da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-8 ratos. *P< 0,05 em relação ao
controle. # P< 0,05 em relação ao grupo operação fictícia.
0
20
40
60
80
100
120
#
*
Desnervado
Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Diabético
Controle
Conteúdo de Noradrenalina
(ng.g tecido
-1
)
Resultados
36
4.11. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.11.1. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol
Nenhuma alteração foi observada na atividade da gliceroquinase e na incorporação de
U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol no fígado de animais diabéticos e de animais diabéticos
desnervados em relação aos seus controles (Figura 9).
Figura 9: Efeito do diabetes e da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase (GK)
(A) e na incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol (B) no fígado. Os valores
representam a média e erro padrão de 6 -11 ratos.
A
B
0
100
200
300
400
500
600
700
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle
Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervado
Diabético
0
5
10
15
20
25
30
Atividade da GK
(nmol. mg de proteína
-1
.min
-1
)
Controle Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervados
Diabético
Resultados
37
4.11.2. Incorporação de U-
14
C- glicerol em glicose do meio de incubação
A incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de incubação encontrava-se
13% aumentada nos ratos diabéticos em comparação com os ratos controles. A desnervação
hepática não causou nenhuma alteração neste parâmetro (Figura 10).
Figura 10: Efeito do diabetes e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicerol
em glicose no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 12 ratos. *P< 0,05 em
relação ao controle.
0
1
2
3
4
5
6
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose
(
µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervado
Diabético
*
Resultados
38
0
10
20
30
40
50
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle
Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervado
Diabético
*
0
10
20
30
40
50
60
70
*
Desnervado
Diabético
Diabético
Controle
Atividade da PEPCK
(nmol.mg proteína
-1
.min
-1
)
Operação
Fictícia
Diabético
4.12. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.12..1. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol
A atividade da PEPCK encontrava-se aproximadamente 100% maior nos ratos
diabéticos do que nos ratos controles. A desnervação hepática não afetou este parâmetro. A
incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol encontrava-se aumentada de 36% nos
ratos diabéticos em comparação com os ratos controles. A desnervação hepática também não
alterou este parâmetro (Figura 11).
Figura 11: Efeito do diabetes e da desnervação hepática na atividade da fosfoenolpiruvato
carboxiquinase (PEPCK) (A) e da incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol (B)
no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-12 ratos. * P< 0,05 em relação
ao controle.
A
B
Resultados
39
4.12.2. Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação
A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação encontrava-se
aproximadamente 2,5 vezes maior nos ratos diabéticos do que nos os ratos controles. A
desnervação hepática não alterou este parâmetro (Figura 12).
Figura 12: Efeito do diabetes e da desenervação hepática na incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicose do meio no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6 ratos.*
P<0,05 em relação ao controle.
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose
(
µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
*
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervado
Diabético
Controle Diabético
Resultados
40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
*
Desnervado
Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Diabético
Controle
Fluxo Glicolítico
(
µ
mol.g tecido
-1
.h
-1
)
0
20
40
60
80
100
120
Incorporação de U-
14
C-Glicose em Glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle Diabético
Operação
Fictícia
Diabético
Desnervado
Diabético
*
4.13. Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e do fluxo
glicolítico
A incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol encontrava-se 36% diminuída
nos ratos diabéticos em comparação com os ratos controles. A desnervação hepática não
alterou este parâmetro. O fluxo glicolítico encontrava-se 61% menor nos ratos diabéticos do
que nos ratos controles. A desnervação hepática também não causou nenhuma alteração neste
parâmetro (Figura 13).
Figura 13: Efeito do diabetes e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicose em
glicerídeo-glicerol (A) e no fluxo glicolítico (B) no fígado. Os valores representam a média e
erro padrão de 7-8 ratos. * P<0,05 em relação ao controle.
A
B
Resultados
41
N e HP
4.14. Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado
O conteúdo de noradrenalina no fígado de ratos adaptados à dieta HP encontrava-se
35% diminuído em relação ao fígado de ratos adaptados à dieta N. A desnervação hepática no
fígado de ratos adaptados à dieta HP reduziu o conteúdo de noradrenalina à aproximadamente
6% do valor encontrado no rato operação fictícia HP. Os animais adaptados à dieta N e
desnervados apresentaram um conteúdo de noradrenalina reduzido à aproximadamente 6% do
valor encontrado no rato operação fictícia N (Tabela 8, Figura 14).
Tabela 8: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina (ng. g
tecido
-1
) no fígado.
Intacto Operação Fictícia Desnervado
N 87,53 ± 7,61 (6) 84,41±11,40 (6) 5,01 ± 1,02 (6) +
HP 56,35 ± 3,52 (8)* 64,63± 3,71 (6) 3,96 ± 0,49 (8)#
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam o
total de animais utilizados.* P< 0.05 em relação ao N. # P< 0.05 em relação ao operação
fictícia HP.+ P <0.05 em relação ao operação fictícia N.
Resultados
42
0
20
40
60
80
100
Conteúdo de Noradrenalina
(ng. g tecido
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
**
#
0
20
40
60
80
100
Conteúdo de Noradrenalina
(ng. g tecido
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
*
Figura 14: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do
fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-8 ratos. *P< 0,05 em relação ao
grupo operação fictícia N. ** P< 0,05 em relação ao intacto N. # P<0,05 em relação ao grupo
operação fictícia HP.
Dieta N Dieta HP
Resultados
43
4.15. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.15.1. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol
A atividade da gliceroquinase encontrava-se 19% diminuída nos ratos adaptados à
dieta HP em comparação com os ratos adaptados à dieta N. A desnervação hepática foi capaz
de reduzir ainda mais a atividade desta enzima, cerca de 17%, nos animais adaptados à dieta
HP e desnervados. De maneira similar à atividade da gliceroquinase, a incorporação de
glicerol em glicerídeo-glicerol no fígado de animais HP encontrava-se 18% diminuída em
comparação com os animais N. Não foi observada nenhuma alteração neste mesmo parâmetro
nos animais HP desnervados apesar da redução enzimática com a desnervação. A atividade da
gliceroquinase encontrava-se cerca de 10% diminuída nos animais N desnervados e a
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol também encontrava-se 14% diminuída
nestes mesmos animais. (Tabela 9, Figura 15).
Resultados
44
Tabela 9: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase e na
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol no fígado.
Intacto Operação Fictícia Desnervado
Atividade da gliceroquinase (nmol. mg proteína
-1
. min
-1
)
N 26,3 ± 0,61 (8) 27,3±0,76 (8) 24,7 ± 0,3 (9) +
HP 21,3 ± 0,68 (12)* 22,0± 0,54 (9) 18,3 ± 0,38 (12)#
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol (nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
N 521,4 ± 17,8 (7) 564,2±14,0 (10) 483,0 ± 20,4 (13) +
HP 428,0 ± 29,0 (8)* 459,80± 47,3 (5) 433,4 ± 43,0 (8)
Os valores representam a média ± erro padrão. Os números entre parênteses representam
o total de animais utilizados.* P< 0,05 em relação ao N intacto. # P< 0,05 em relação ao
grupo operação fictícia HP.+ P <0,05 em relação ao grupo operação fictícia N.
Resultados
45
0
100
200
300
400
500
600
700
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
*
0
5
10
15
20
25
30
Atividade da GK
(nmol.mg proteína
-1
.min
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
*
0
100
200
300
400
500
600
700
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol
(nmol. g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
**
0
5
10
15
20
25
30
Atividade da GK
(nmol. mg proteína
-1
.min
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
**
#
Figura 15: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase (GK)
(A,C) e na incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol (B,D). Os valores
representam a média e erro padrão de 8-12 ratos. *P< 0,05 em relação ao operação fictícia N.
** P<0,05 em relação ao N intacto. # P<0,05 em relação ao operação fictícia HP.
C
B
A
D
Dieta HP
Dieta N
Resultados
46
0
1
2
3
4
5
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio
(
µ
mol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
0
1
2
3
4
5
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio
(
µ
mol.g tecido
-1
.h
-1
)
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
4.15.2. Incorporação de U-
14
C- glicerol em glicose do meio de incubação
Os ratos adaptados à dieta HP mostraram um aumento de 14% na incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de incubação em comparação com os ratos adaptados à dieta
N. A desnervação hepática não afetou este parâmetro nem nos animais N nem nos animais HP
(Figura 16).
Figura 16: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-glicerol
em glicose do meio de incubação no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de
6-12 ratos. *P< 0,05 em relação ao intacto N.
Dieta N
Dieta HP
Resultados
47
4.16. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol e em glicose no fígado
4.16.1. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol
A atividade da PEPCK encontrava-se aproximadamente 3 vezes maior no fígado de
ratos adaptados à dieta HP do que nos ratos adaptados à dieta N. A desnervação não alterou
este parâmetro. A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol assim como a
atividade da PEPCK encontrava-se 73 % aumentada nos ratos adaptados à dieta HP em
comparação aos N. A desnervação hepática não alterou este parâmetro. Nos ratos adaptados à
dieta N a desnervação não afetou nem a atividade da PEPCK nem a incorporação de 2-
14
C-
piruvato em glicerídeo-glicerol (Figura 17).
Resultados
48
0
10
20
30
40
50
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
0
10
20
30
40
50
Atividade da PEPCK
(nmol. mg proteína
-1
.min
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
0
10
20
30
40
50
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Atividade da PEPCK
(nmol. mg proteína
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
Figura 17: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática na atividade da fosfoenolpiruvato
carboxiquinase (PEPCK) (A,C) e na incorporação 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol (B,D)
no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 9-12 ratos. *P< 0,05 em relação
ao N intacto.
A
C
D
B
Dieta N
Dieta HP
Resultados
49
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
N
Intacto
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
4.16.2. Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação
A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação encontrava-se
53% aumentada nos ratos adaptados à dieta HP em comparação com os ratos adaptados à
dieta N. A desnervação hepática não causou nenhuma alteração neste parâmetro tanto nos
ratos HP quanto nos animais N (Figura 18).
Figura 18: Efeito da dieta HP e da desnervação hepática na incorporação de 2-
14
C-piruvato
em glicose do meio no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-8 ratos. *P<
0,05 em relação ao N intacto.
Dieta N
Dieta HP
Resultados
50
4.17. Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e do fluxo
glicolítico
A incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol encontrava-se 39% diminuída
nos ratos adaptados à dieta HP em comparação com os ratos adaptados à dieta N. A
desnervação hepática não causou nenhuma alteração neste parâmetro em ambas as dietas. O
fluxo glicolítico encontrava-se 42% diminuído nos animais adaptados à dieta HP em
comparação aos adaptados à dieta N. A desnervação hepática também não alterou este
parâmetro nos ratos submetidos aos dois tipos de dieta (Figura 19).
Resultados
51
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Fluxo Glicolítico
(
µ
mol. g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
0
20
40
60
80
100
120
Incorporação de U-
14
C-Glicose em Glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
N
Operação
Fictícia
N
Desnervado
N
0
20
40
60
80
100
120
Incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Fluxo Glicolítico
(
µ
mol .g
-1
.h
-1
)
Intacto
HP
Operação
Fictícia
HP
Desnervado
HP
*
Figura 19: Efeito da dieta HP e da desnervação simpática na incorporação de U-
14
C-glicose
em glicerídeo-glicerol (A,C) e no fluxo glicolítico (B,D) no fígado. Os valores representam a
média e erro padrão de 6-12 ratos. *P< 0,05 em relação ao intacto N.
A
C
B
D
Dieta N
Dieta HP
Resultados
52
Cafeteria
4.18. Efeito da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina do fígado
O conteúdo de noradrenalina no fígado de ratos adaptados à dieta cafeteria
encontrava-se 66% aumentado em relação ao fígado dos ratos controles. A desnervação
hepática reduziu o conteúdo de noradrenalina à aproximadamente 6% do valor encontrado nos
ratos cafeteria com operação fictícia (Figura 20).
Figura 20: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática no conteúdo de noradrenalina
do fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6-8 ratos. *P< 0,05 em relação ao
controle. # P< 0,05 em relação ao grupo operação fictícia cafeteria.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Desnervado
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
Cafeteria
Controle
#
*
Conteúdo de Noradrenalina
(ng.g tecido
-1
)
Resultados
53
4.19 Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.19.1. Atividade da gliceroquinase e incorporação de U-
14
C-glicerol em
glicerídeo-glicerol
A atividade da gliceroquinase encontrava-se aproximadamente 20% aumentada nos
ratos cafeteria em comparação com os ratos controles. A desnervação hepática causou uma
redução de 19% na atividade desta enzima nos animais cafeteria. A incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicerídeo-glicerol no fígado de ratos adaptados a esta dieta encontrava-se 30%
reduzido em comparação aos controles. A desenervação hepática reduziu ainda mais esta
incorporação, cerca de 15% em relação aos animais cafeteria com operação fictícia. (Figura
21).
Figura 21: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática na atividade da gliceroquinase
(GK) (A) e na incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol (B) no fígado. Os
valores representam a média e erro padrão de 12 ratos.* P< 0,05 em relação ao controle. #
P<0,05 em relação ao grupo operação fictícia cafeteria.
A B
0
100
200
300
400
500
600
#
Desnervado
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
CafeteriaControle
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido.
-1
h
-1
)
*
0
5
10
15
20
25
30
35
#
*
Desnervado
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
CafeteriaControle
Atividade da GK
(nmol.mg proteína
-1
mi n
-1
)
Resultados
54
4.19.2. Incorporação de U-
14
C- glicerol em glicose do meio de incubação
A incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio de incubação nos animais
cafeteria encontrava-se 23% diminuída em comparação com os animais controles. A
desnervação hepática, entretanto, não alterou este parâmetro (Figura 22).
Figura 22: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-
glicerol em glicose no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 12 ratos. *P<
0,05 em relação ao controle.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose
(
µmol.g tecido
-1
.h
-1
)
*
Controle
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
Desnervado
Cafeteria
Resultados
55
4.20. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol e em glicose do meio de incubação no fígado
4.20.1. Atividade da PEPCK e incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol
A atividade da PEPCK encontrava-se 42% reduzida no fígado dos animais adaptados à
dieta cafeteria em comparação com os animais controles. A desnervação hepática não afetou
este parâmetro. A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol encontrava-se 26%
reduzida nestes animais em comparação aos animais controles e a desnervação também não
causou nenhuma alteração neste parâmetro (Figura 23).
Figura 23: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática na atividade da
fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK) (A) e na incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol (B) no fígado. Os valores representam a média e erro padrão de 6 ratos.
*P<0,05 em relação ao controle.
A
B
0
5
10
15
20
25
30
35
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle
Cafeteria Sham
Cafeteria
Desnervado
Cafeteria
*
0
5
10
15
20
25
30
*
Desnervado
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
CafeteriaControle
Atividade da PEPCK
(nmol.mg proteína
-1
.min
-1
)
Resultados
56
4.20.2. Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação
A incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio de incubação encontrava-se
aproximadamente 34% diminuída nos ratos adaptados à dieta cafeteria em comparação com
os ratos controles. A desnervação hepática não foi capaz de causar nenhuma alteração neste
parâmetro (Figura 24).
Figura 24: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática na incorporação de 2-
14
C-
piruvato em glicose do meio de incubação no fígado. Os valores representam a média e erro
padrão de 6 ratos. * P < 0,05 em relação ao controle.
0
100
200
300
400
500
Incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose
(nmol.g tecido
-1
h
-1
)
*
Controle
Cafeteria Operação
Fictícia
Cafeteria
Desnervado
Cafeteria
Resultados
57
4.21. Medida da incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e do fluxo
glicolítico
A incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol encontra-se 28% aumentada
nos ratos adaptados à dieta cafeteria em comparação com os ratos controles. A desnervação
hepática não alterou este parâmetro . O fluxo glicolítico encontrava-se 14 % aumentado nos
ratos adaptados à dieta cafeteria em comparação aos controles e a desnervação hepática, por
sua vez, não causou nenhuma alteração neste parâmetro (Figura 25).
Figura 25: Efeito da dieta cafeteria e da desnervação hepática na incorporação de U-
14
C-
glicose em glicerídeo-glicerol (A) e no fluxo glicolítico (B) no fígado. Os valores representam
a média e erro padrão de 6 ratos. * P < 0,05 em relação ao controle.
A B
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Fluxo Glicolítico
(
µ
mol.g tecido
-1
.h
-1
)
Controle
Cafeteria
Operação
Fictícia
Cafeteria
Desnervado
Cafeteria
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Incorporação de U-
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol
(nmol.g tecido
-1
.h
-1
)
Cont role
Cafeteria Operação
Fictícia
Cafeteri
a
Desnervado
Cafeteria
*
DISCUSSÃO
Discussão
58
5. Discussão
O fígado é um órgão bastante complexo e capaz de realizar inúmeras funções dentre as
quais podemos destacar principalmente a manutenção da homeostase glicídica pela via
neoglicogênica. Além deste importantíssimo papel no controle e regulação do metabolismo de
carboidratos, o fígado colabora ainda na manutenção da homeostase lipídica. Em situações
fisiológicas que culminam com um aumento do fluxo simpático e liberação de noradrenalina
no TAB (FLIERS et al., 2003) levando a um aumento da lipólise, AG estocados como TAG
nesse tecido serão mobilizados. Estes cairão na corrente sanguínea e poderão chegar até o
fígado para serem oxidados ou esterificados novamente para TAG. Cerca de um terço dos AG
livres que são removidos da circulação, mesmo em condições de repouso, são captados pelo
fígado e ao redor de 50% desses AGs são esterificados com moléculas de glicerol-3-fosfato
(G3P) a triacilglicerol (TAG) e assim podem ficar momentaneamente estocados no próprio
órgão ou serem secretados para tecidos periféricos incorporados em lipoproteínas
principalmente a VLDL. Além dos AG captados da circulação, os AGs sintetizados de novo
pelo fígado em situações de abundância de carboidratos, são também esterificados e
depositados ou secretados em VLDL.
Fica claro portanto, a necessidade da existência de quantidades adequadas de G3P para
esterificação de AG e formação de TAG e fosfolípides pelo fígado. Esta síntese de G3P nas
diversas situações fisiológicas vai depender de fatores nutricionais, hormonais e da atividade
do sistema nervoso simpático.
Uma das mais tradicionais e amplamente conhecida função da inervação simpática no
organismo, diz respeito principalmente ao controle da lipólise no TAB. Poucos trabalhos na
literatura investigam a participação do sistema nervoso simpático (SNS) no metabolismo
lipídico no fígado. Uma medida da atividade do sistema nervoso simpático em determinada
Discussão
59
situação fisiológica é a dosagem do conteúdo de noradrenalina do tecido. No presente
trabalho, o conteúdo de noradrenalina no fígado dos animais jejuados e diabéticos aumentou,
respectivamente, 2,5 e 2 vezes em relação aos seus controles. Estes achados corroboram com
os já bem estabelecidos dados na literatura de que nas duas situações acima mencionadas a
atividade simpática encontra-se aumentada no tecido hepático. Nos animais adaptados à dieta
cafeteria, o conteúdo de noradrenalina encontrava-se 66% maior em comparação com os
animais controles. É sabido que o consumo de uma dieta cafeteria leva a um aumento da
atividade simpática para os tecidos adiposos branco e marrom e também para o fígado
(ROTHWELL et al, 1985). Em contrapartida, os animais adaptados a uma dieta HP, dieta que
reduz o fluxo simpático para o tecido, apresentaram um conteúdo de noradrenalina 35 %
menor em relação aos animais adaptados à dieta N.
Para melhor estudarmos a importância do sistema nervoso simpático no metabolismo
do fígado retiramos a inervação através da utilização do ácido fênico (85%). O fenol é capaz
de necrosar os nervos simpáticos, reduzindo o fluxo simpático que chegaria normalmente ao
tecido. Utilizando uma técnica padronizada por LAUTT et al (1973), a eficiência da
desnervação foi avaliada pela dosagem de noradrenalina do tecido hepático.
O conteúdo de noradrenalina nos ratos normalmente alimentados diminuiu 90% no
fígado desnervado em comparação com o grupo operação fictícia. Tanto nos animais jejuados
por 48 horas quanto nos animais diabéticos, a desnervação reduziu o conteúdo de
noradrenalina para 3% do valor encontrado nos ratos submetidos à operação fictícia. No
grupo adaptado à dieta HP e também no grupo adaptado à dieta cafeteria a desnervação
promoveu uma redução no conteúdo de noradrenalina para 6% do valor encontrado nos seus
respectivos ratos controles. Com os resultados obtidos, podemos comprovar a eficácia da
desnervação hepática química utilizando o fenol já que uma redução em torno de 80% no
Discussão
60
conteúdo de noradrenalina tem sido aceita como suficiente para o estudo da influência do
sistema nervoso simpático no órgão (LINDFELDT et al., 1987 e HOLMIN et al., 1984).
Avaliamos então, em determinadas situações fisiológicas (normalmente alimentados,
jejum, diabetes, dieta HP, e dieta cafeteria) que sabidamente alteram a atividade simpática,
como estaria a geração de G3P pelo fígado. Nessas diferentes situações estimulantes ou
redutoras do fluxo simpático, investigamos o efeito da desnervação hepática na geração de
G3P. Para isso, verificamos as três vias possíveis de geração de glicerol-3-fosfato (ver figura
1): via glicolítica, através da medida do fluxo glicolítico e da incorporação de
14
C-glicose em
glicerídeo-glicerol; fosforilação direta do glicerol pela medida da atividade da gliceroquinase
e da incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol e via gliceroneogênica através da
medida da atividade enzimática da PEPCK e da incorporação de 2-
14
C-piruvato em
glicerídeo-glicerol. Em todas as situações estudadas, a formação da glicose a partir de glicerol
e de piruvato também foi avaliada. Isso foi necessário, já que o fígado é um órgão capaz de
produzir tanto glicerídeo-glicerol (via gliceroneogênese) quanto glicose (via neoglicogênese)
sendo a PEPCK uma enzima chave para os dois processos. Logo, o aumento ou a diminuição
da atividade desta enzima poderia estar relacionado tanto com a neoglicogênese quanto com a
gliceroneogênese ou com ambos os processos.
Os ratos normalmente alimentados e desnervados apresentaram uma diminuição de
27% na atividade da gliceroquinase em relação aos ratos com operação fictícia.
Acompanhando esta redução enzimática, a incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol também se mostrou reduzida em 10% nos animais alimentados desnervados.
Entretanto, a incorporação deste mesmo substrato em glicose não foi alterada com a
desnervação. A atividade da PEPCK, a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol
e em glicose, a incorporação de
14
C-glicose em glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico
também não apresentaram nenhuma alteração com a desnervação hepática. Esses dados
Discussão
61
mostram que o SNS não interfere nem na neoglicogênese e nem na gliceroneogênese nos
ratos normalmente alimentados. Este mesmo padrão de resposta, ou seja, diminuição da
atividade da gliceroquinase e da incorporação de glicerol em glicerídeo-glicerol no fígado de
animais desnervados normalmente alimentados também foi encontrado no tecido adiposo
marrom (KAWASHITA et al., 2002).
Posteriormente, verificamos como estaria a geração de G3P nos animais submetidos
ao jejum bem como nos animais submetidos ao jejum e desnervados. O jejum de 48 horas não
afetou nem a atividade da gliceroquinase nem a incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-
glicerol. A desnervação hepática também não afetou nenhum destes parâmetros. Por outro
lado, a incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do meio encontrava-se aproximadamente
16 % maior nos animais jejuados sendo que a desnervação hepática não alterou este achado.
Este resultado mostra-se fisiologicamente pertinente visto que em situações de baixa demanda
energética de glicose, o fígado deve preferencialmente manter a homeostase glicídica,
produzindo glicose via neoglicogênese para órgãos periféricos como o SNC, ao invés de
manter a homeostase lipídica fosforilando glicerol para TAG. A atividade da PEPCK
encontrava-se 2 vezes maior nos ratos jejuados enquanto que a incorporação de 2-
14
C-
piruvato em glicerídeo-glicerol encontrava-se 52% aumentada nestes mesmos animais sendo
que a desnervação hepática não alterou nenhum destes parâmetros. A incorporação de 2-
14
C-
piruvato em glicose mostrava-se 2,5 vezes maior nos animais jejuados e a desnervação
também não afetou este achado. Nesta situação específica, parece que o grande aumento da
atividade da PEPCK relaciona-se tanto com o aumento da produção de glicose via
neoglicogênese quanto com o aumento da produção de glicerol para glicerídeo-glicerol via
gliceroneogênese. A incorporação de
14
C-Glicose em glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico
encontravam-se respectivamente, 27% e 58% diminuídos nos animais jejuados. A
desnervação hepática, por sua vez, não foi capaz de alterar estes parâmetros.
Discussão
62
O próximo passo foi verificar nos animais diabéticos bem como nos animais
diabéticos e desnervados como se encontravam as vias de geração de G3P. Interessante
ressaltar que os resultados obtidos nesta situação foram bastante semelhantes àqueles
encontrados no jejum; desta forma, ficamos ainda mais seguros quanto ao uso da nossa
preparação com fatias de fígado para o estudo da gliceroneogênese hepática in vitro. A
atividade da gliceroquinase e a incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol não
sofreram alterações do diabetes e da desnervação. Por outro lado, a incorporação deste
substrato em glicose mostra-se 14% maior nos animais diabéticos e este resultado permanece
inalterado com a desnervação. A atividade da PEPCK encontra-se 2 vezes maior nos animais
diabéticos sendo que a desnervação hepática não foi capaz de alterar este parâmetro.
Acompanhando o aumento da enzima, a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-
glicerol encontrava-se 36% maior nos animais diabéticos e a desnervação também não afetou
este achado. Da mesma forma, a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose mostra-se 2,5
vezes aumentada nos animais diabéticos sem efeitos da desnervação. Como aconteceu no
jejum, o grande aumento da atividade da PEPCK parece relacionar-se tanto com o aumento da
produção de glicerídeo-glicerol via gliceroneogênese quanto com o aumento da produção de
glicose via neoglicogênese. BUETTNER et al., (2005), utilizando fatias de fígado observaram
que a produção de glicose mostrava-se 82% aumentada em fatias de fígado incubadas com
catecolaminas, simulando uma ativação do sistema nervoso simpático como acontece no
jejum e no diabetes. Nossos dados ainda mostraram que a incorporação de
14
C-glicose em
glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico encontravam-se respectivamente, 36% e 62 %,
diminuídos nos animais diabéticos sendo que a desnervação hepática não alterou estes
parâmetros.
Considerando ser a atividade da gliceroquinase no fígado cerca de 10 vezes maior do
que no TAM e 20 vezes maior do que no TAB seria de ser esperar que a atividade desta
Discussão
63
enzima estivesse aumentada em situações de alta necessidade de produção de G3P como o
jejum e o diabetes. Entretanto isto não foi verificado nos presentes experimentos. SEITZ et
al., (1976), também não encontraram diferença na atividade da enzima por grama de fígado
em animais jejuados, diabéticos por aloxana ou submetidos a adrenalectomia. Acreditamos
então, que o esperado aumento da GK não ocorreu por conta de um efeito compensatório de
geração de G3P por uma outra via, no caso, pela gliceroneogênese.
Dados já bem estabelecidos na literatura mostram que as baixas concentrações de
insulina são capazes de estimular a PEPCK. Nossos achados neste trabalho tanto no jejum
quanto no diabetes (situações que apresentam baixa ou ausência de insulina, respectivamente)
culminam com uma alta atividade da PEPCK e alta incorporação de piruvato em glicerídeo-
glicerol (medida da via gliceroneogênica) sugerindo que esta via de produção de G3P está
ativada e é regulada pela insulina. Corroborando com os nossos dados, KALHAN et al.,
(2001) mostraram em humanos que após 16 horas de jejum 6,1% do glicerol incorporado em
TAG de VLDL no fígado era derivado do glicerol plasmático enquanto que 10-60% era
derivado do piruvato plasmático.
Na literatura é amplamente conhecido que a insulina estimula a glicoquinase e
conseqüentemente aumenta a utilização de glicose pelo fígado. Com base nessas informações
os achados de uma baixa incorporação de
14
C-Glicose em glicerídeo-glicerol assim como de
um baixo fluxo glicolítico tanto no jejum quanto no diabetes, situações de baixo nível ou
ausência de insulina, vão de encontro com a irrisória contribuição da via glicolítica para a
formação de G3P.
Posteriormente, estudamos o efeito da dieta HP na produção de glicerol-3-fosfato pelo
fígado. Animais tratados com a dieta HP por 30 dias apresentam um aumento de cerca de 20%
na gordura total do fígado medida de forma gravimétrica (SCHIMD et al, 1985) e portanto
parece ser necessária uma grande produção de G3P para esterificar AG e estocá-lo como TAG
Discussão
64
nesta situação. Animais adaptados à dieta N e desnervados mostraram o mesmo padrão dos
animais normalmente alimentados desnervados. Tanto a atividade da gliceroquinase quanto a
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol mostravam-se respectivamente, 16% e
14% menores em relação aos seus controles. Nos animais HP, a atividade da gliceroquinase
encontrava-se 19% diminuída sendo que esta atividade enzimática diminui ainda mais, cerca
de 17%, nos animais HP desnervados em comparação com os animais operação fictícia. A
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol também mostrou-se 16% menor nestes
animais e a desnervação hepática não alterou ainda mais este parâmetro. A incorporação de
U-
14
C-Glicerol em glicose do meio, que reflete a neoglicogênese mostrou-se 14% maior nos
animais HP sendo que a desnervação não alterou este parâmetro nem nos animais HP
desnervados nem nos animais N desnervados. Este achado de uma neoglicogênese aumentada
nos ratos HP faz sentido fisiológico em animais que se alimentam com dietas sem
carboidratos, tornando essencial a síntese de novo da glicose. A atividade da PEPCK
encontrava-se 3 vezes maior nos animais HP e a desnervação hepática não alterou este
parâmetro nem nos animais HP desnervados nem nos animais N desnervados. Acompanhando
o aumento da enzima, a incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicerídeo-glicerol encontra-se
74% maior nos animais HP e a desnervação não afetou este parâmetro. Da mesma forma, a
incorporação de 2-
14
C-piruvato em glicose do meio mostrava-se 54 % maior nos animais HP
sem efeitos da desenervação tanto nos animais HP quanto nos N. Como aconteceu no jejum e
no diabetes, o grande aumento da PEPCK parece relacionar-se tanto com o aumento da
produção de glicerídeo-glicerol via gliceroneogênese quanto com o aumento da produção de
glicose via neoglicogênese. Nesta situação também, onde há baixos níveis de insulina este
hormônio não estimula a glicoquinase, logo a utilização de glicose pelo fígado está diminuída.
Nossos dados mostraram que tanto a incorporação de
14
C-Glicose em glicerídeo-glicerol
quanto o fluxo glicolítico encontravam-se respectivamente, 39% e 42 %, menores nos animais
Discussão
65
HP em comparação com os animais N, sendo que a desnervação hepática não alterou estes
parâmetros em nenhum dos dois grupos. Estes achados também comprovam que a via
glicolítica não contribui significativamente para a geração de G3P nos animais adaptados a
uma dieta hiperproteica.
Nossos achados vão de encontro aos achados de BOTION et al., (1998) que
demonstraram pela primeira vez e in vivo a presença da gliceroneogênese tanto nos ratos
controles quanto nos ratos HP. Entretanto neste trabalho, a autora não encontrou aumento
significativo desta via nos animais tratados com a dieta hiperproteica. Contudo, parece que
nesta situação específica a gliceroneogênese parece estar bastante ativada para compensar a
produção de G3P , que se encontra diminuída, pelas duas outras vias.
Em todas estas situações fisiológicas estudadas (jejum, diabetes, e dieta HP) um
achado comum foram os baixos níveis plasmáticos de insulina e esse fator parece ser o
principal responsável pelo efeito compensatório nas vias de geração de G3P como o aumento
da gliceroneogênese e diminuição da produção de G3P pela via glicolítica.
O próximo passo foi verificar se a presença da insulina era capaz de exercer o efeito
oposto na regulação da geração de G3P. Chaves et a.l, (2006) mostraram que animais tratados
com uma dieta hiperlipídica e hipercalórica possuem altos níveis de insulina plasmática,
apresentam elevado turnover de noradrenalina e maior captação de glicose no TAB
retroperitoneal. A atividade da gliceroquinase e a síntese de TAG-glicerol a partir de glicerol
também estavam aumentadas enquanto que a gliceroneogênese estava reduzida. Desta forma,
comprovou-se a ação inibitória da insulina na atividade da PEPCK e na via gliceroneogênica
no TAB. Neste mesmo trabalho, os autores demostraram que a desnervação simpática do
tecido adiposo branco retroperitoneal reduz a atividade da GK mas não afeta a captação de
glicose nem a atividade da PEPCK ou a síntese de TAG-glicerol a partir de piruvato.
Discussão
66
Resultados semelhantes foram obtidos no TAM de animais tratados com a dieta cafeteria
(dados ainda não publicados).
Investigamos então como estava a geração de glicerol no fígado de animais adaptados
a uma dieta hiperlipídica e hipercalórica, dieta cafeteria. A atividade da gliceroquinase
mostrou-se 20% maior nos animais cafeteria sendo que a desnervação hepática diminuiu esta
atividade em 19% em relação grupo operação fictícia. Contrariamente aos achados que
mostravam uma correlação entre atividade enzimática e incorporação, nestes experimentos a
incorporação de U-
14
C-glicerol em glicerídeo-glicerol mostra-se 30% diminuída nos animais
cafeteria e cerca de 15% reduzida nos animais cafeteria desnervados. Uma possível
explicação para que isto tenha ocorrido é a hipótese de que tenha havido uma diluição do
glicerol marcado ao nível do pool das trioses (gliceraldeído-3-fosfato↔diidroxiacetona
fosfato). Nesta situação de alimentação com dieta hiperlipídica e hipercalórica do tipo
cafeteria ocorre uma grande oferta de carboidratos especialmente glicose, aumentando assim
o pool de gliceraldeído-3-fosfato e de diidroxiacetona fosfato podendo levar a uma menor
incorporação da marca em glicerídeo-glicerol. Mais experimentos devem ser realizados para
confirmar esta hipótese, como por exemplo a medida da atividade específica da
diidroxiacetona fosfato no pool das trioses. A incorporação de U-
14
C-glicerol em glicose do
meio mostrou-se 23% diminuída nos animais cafeteria sendo que a desnervação hepática não
alterou este parâmetro. Este resultado de uma neoglicogênese reduzida é fisiologicamente
entendível já que com o grande consumo de carboidratos desta dieta, deve haver um grande
estoque de glicogênio, quantidades normais de glicose circulante capazes de suprir
adequadamente as necessidades energéticas do organismo não havendo pois, a necessidade da
ativação da neoglicogênese. A atividade da PEPCK por sua vez, encontrava-se 42% menor
nos animais cafeteria sendo que a desnervação hepática não foi capaz de afetar este achado.
Acompanhando a redução da enzima a incorporação de 2-
14
C-Piruvato em glicerídeo-glicerol
Discussão
67
e em glicose encontravam-se, respectivamente, 26% e 34% diminuídas nos ratos cafeteria. A
desnervação não afetou estes parâmetros. BUETTNER et al, 2005, utilizando fatias de fígado
também mediu a produção de glicose. Eles observaram que a adição de 600pmol/l de insulina
diminui a liberação de glicose em 80% em comparação aos ratos controles. A incorporação
de
14
C-Glicose em glicerídeo-glicerol e o fluxo glicolítico encontravam-se respectivamente,
28% e 14 % , aumentados nos animais cafeteria sendo que a desnervação hepática não alterou
estes parâmetros. Esses dados nos sugerem que em uma situação com grande quantidade de
insulina, tanto a gliceroquinase quanto a via glicolítica sejam as principais vias de geração de
G3P já que a via gliceroneogênica parece estar inibida.
Os resultados obtidos nas situações fisiológicas aqui estudadas mostram que as
alterações encontradas na atividade gliceroneogênica no fígado ( aumento no jejum, diabetes e
dieta HP e redução na dieta cafeteria) seria devido às alterações dos níveis plasmáticos de
insulina (redução nas três primeiras situações e aumento na última) hormônio que tem um
potente efeito inibitório sobre a expressão e a atividade da PEPCK.
O tecido mais bem estudado no que se diz respeito a gliceroneogênese é o TAB. Tem
sido amplamente comprovado que a insulina tem um papel fundamental nas alterações da
gliceroneogênese observadas neste tecido. Dados da literatura estão de acordo com a possível
relação positiva entre lipólise e gliceroneogênese neste tecido. RESHEF et al., (1970)
observaram que animais diabéticos e jejuados, que mostram uma atividade lipolítica
aumentada, apresentavam uma gliceroneogênese elevada no TAB. Por outro lado,
camundongos deficientes (“Knock out”) para lipase hormônio sensível, enzima responsável
pela hidrólise do TAG, apresentam atividade lipolítica reduzida concomitantemente com uma
baixa atividade da PEPCK (ZIMMERMANN et al., 2003). Por estes motivos, tem sido
proposto que ácidos graxos de cadeia longa (TONTONOZ et al,1995) e o AMPc
Discussão
68
(FRANKHAUSER et al, 1995) podem aumentar durante a lipólise no TAB e assim estimular
a expressão e a atividade da PEPCK neste mesmo tecido.
No entanto, estudos do nosso laboratório conflitam com a hipótese de que a lipólise e a
gliceroneogênese estejam obrigatoriamente relacionadas. Animais submetidos à dieta
hiperproteica (HP) mostram um aumento da gliceroneogênese no TAB (BOTION, et al.
1995), redução da captação de glicose (BRITO, S.R.C et al., 2001) e da gliceroquinase.
Interessante ressaltar que apesar da gliceroneogênese marcadamente elevada, a atividade
simpática do TAB destes animais mostra-se reduzida bem como sua lipólise basal
(KETTELHUT et al.,1985 e MARTINS-AFÉRRI et al, 2004).
Não há evidências da participação destes fatores (ácidos graxos de cadeia longa e
AMPc) no que se refere à modulação da gliceroneogênese hepática.
Um achado importante neste trabalho foi a preferencial colaboração do glicerol como
substrato para a neoglicogênese do que para a formação de glicerídeo-glicerol em todas as
situações estudadas. Além disso, com base nos resultados deste trabalho podemos sugerir que
existe um efeito compensatório na geração de glicerol-3-fosfato entre a via gliceroneogênica e
a via glicolítica. Quando uma está aumentada a outra via está inibida e vice-versa. No jejum,
diabetes e dieta HP a via gliceroneogênica está aumentada e a via glicolítica está reduzida.
Em contrapartida, na dieta cafeteria a via gliceroneogênica encontra-se inibida e a via
glicolítica aumentada. Parece então que a regulação destas duas vias ocorre de forma
independente de um controle do SNS já que a desnervação não afetou nenhum dos parâmetros
utilizados para a avaliação destas vias.
Por outro lado, a atividade da gliceroquinase hepática parece sofrer alguma regulação
do SNS. No jejum (48 horas) e no diabetes (72 horas), independentemente da baixa ou
ausente concentração de insulina não há alteração da GK. Nestas situações, o fluxo simpático
para o tecido apesar de alto, poderia ser considerado mais agudo (48 e 72 horas
Discussão
69
respectivamente) e isto pode não ser suficiente para alterar a atividade desta enzima. Já na
dieta HP, com o fluxo simpático sabidamente diminuído e mais prolongado (21 dias) bem
como a presença de baixo nível de insulina, porém não tão reduzido quanto os níveis
encontrado no jejum, observamos uma diminuição da atividade enzimática da GK e após a
desnervação hepática, a atividade reduz ainda mais. Por outro lado, a dieta cafeteria que é
capaz de estimular o fluxo simpático também de forma mais prolongada (23 dias de dieta) e
possuir altos níveis plasmáticos de insulina apresenta uma atividade da GK aumentada e após
a desnervação esta atividade reduz. Resumidamente, parece que o SNS é capaz de alterar a
produção de G3P modulando a atividade da gliceroquinase no fígado especialmente em
situações que ocorre uma somatória de fatores, ou seja, presença de insulina e alteração no
fluxo simpático.
Discussão
70
Jejum Diabetes
Dieta HP
Dieta Cafeteria
Figura 26: Resumo dos efeitos das situações experimentais na ativação ou inibição das vias de
geração de glicerol-3-fosfato (G3P). ( ) ativação; ( ) inibição e ( ) sem alteração. A: Efeito do
jejum em relação ao alimentado; B: Efeito do diabete em relação ao controle; C: Efeito da dieta HP
em relação a dieta N; D: Efeito da dieta cafeteria em relação ao alimentadocom dieta Nuvital.
A
D
C
B
Discussão
71
Jejum Diabetes
Dieta HP
Dieta Cafeteria
Figura 27: Resumo dos efeitos da desnervação hepática e das situações experimentais na ativação ou
inibição das vias de produção de glicerol-3-fosfato. ( ) ativação; ( ) inibição; ( ) inibição
aditiva pela desnervação e ( ) sem alteração: A: Efeito da desnervação e do jejum em relação ao
operação fictícia jejuado; B: Efeito da desnervação e do diabetes em relação ao operação fictícia
diabético; C: Efeito da desnervação e da dieta HP em relação ao operação fictícia HP; D: Efeito da
desnervação e da dieta cafeteria em relação ao operação fictícia cafeteria.
C
B
D
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ANEXO
Glyceroneogenesis and the supply of glycerol-3-phosphate
for glyceride-glycerol synthesis in liver slices of fasted and diabetic rats
Maria Emilia Soares Martins-Santos, Vale´ria Ernestaˆnia Chaves, Danu´bia Frasson,
Renata Polessi Boschini, Maria Antonieta Rissato Garo´falo, Isis do Carmo Kettelhut,
and Renato He´lios Migliorini
Departments of Biochemistry-Immunology and Physiology, School of Medicine, University of Sa˜o Paulo, Ribeira˜o Preto,
Sa˜o Paulo, Brazil
Submitted 21 June 2007; accepted in final form 24 August 2007
Martins-Santos ME, Chaves VE, Frasson D, Boschini RP,
Garo´falo MA, Kettelhut IC, Migliorini RH. Glyceroneogenesis and
the supply of glycerol-3-phosphate for glyceride-glycerol synthesis in
liver slices of fasted and diabetic rats. Am J Physiol Endocrinol Metab
293: E1352–E1357, 2007. First published August 28, 2007;
doi:10.1152/ajpendo.00394.2007.—The pathways of glycerol-3-phos-
phate (G3P) generation for glyceride synthesis were examined in
precision-cut liver slices of fasted and diabetic rats. The incorporation
of 5 mM [U-
14
C]glucose into glyceride-glycerol, used to evaluate
G3P generation via glycolysis, was reduced by ϳ26 –36% in liver
slices of fasted and diabetic rats. The glycolytic flux was reduced by
ϳ60% in both groups. The incorporation of 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate
into glyceride-glycerol (glyceroneogenesis) increased ϳ50% and ϳ36%
in slices of fasted and diabetic rats, respectively, which also showed
a two-fold increase in the activity phosphoenolpyruvate carboxyki-
nase. The increased incorporation of 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate into
glyceride-glycerol by slices of fasted rats was not affected by the
addition of 5 mM glucose to the incubation medium. The activity of
glycerokinase and the incorporation of 1 mM [U-
14
C]glycerol into
glyceride-glycerol, evaluators of G3P formation by direct glycerol
phosphorylation, did not differ significantly from controls in slices
of the two experimental groups. Rates of incorporation of 1 mM
[2-
14
C]pyruvate and [U-
14
C]glycerol into glucose of incubation me-
dium (gluconeogenesis) were ϳ140 and ϳ20% higher in fasted and
diabetic slices than in control slices. It could be estimated that
glyceroneogenesis by liver slices of fasted rats contributed with
ϳ20% of G3P generated for glyceride-glycerol synthesis, the glyco-
lytic pathway with ϳ5%, and direct phosphorylation of glycerol by
glycerokinase with ϳ75%. Pyruvate contributed with 54% and glyc-
erol with 46% of gluconeogenesis. The present data indicate that
glyceroneogenesis has a significant participation in the generation of
G3P needed for the increased glyceride-glycerol synthesis in liver
during fasting and diabetes.
phosphoenolpyruvate carboxykinase; glycerokinase; [U-
14
C]glucose;
[2-
14
C]pyruvate; [U-
14
C]glycerol; gluconeogenesis
THE SYNTHESIS OF TRIACYLGLYCEROL (TAG) in the liver is an
important metabolic pathway for the control of lipid metabo-
lism and maintenance of energy homeostasis in all mammals.
It has been estimated that about one-third of the free fatty acid
(FFA) removed from the bloodstream in nonexercising animals
is taken up by the liver (1, 4, 19). A major fraction of the
removed FFA is converted to TAGs, which are either stored in
the hepatocyte or released from the liver into the circulation as
VLDL. Nonadipose (primarily hepatic) fatty acid esterification
appears to account for ϳ50% of reesterification of fatty acids
in human adults after an overnight fast (21). Because glycerol-
3-phosphate (G3P) is an obligatory intermediary in the process
of TAG synthesis, the participation of the liver in the control of
lipid metabolism requires a continuous and adequate genera-
tion of G3P by the hepatocyte.
Until relatively recently, only two pathways of G3P gener-
ation in liver were known: direct phosphorylation of glycerol
by glycerokinase (GyK), an enzyme that has considerable
activity in liver (16), and conversion of the dihydroxyacetone
produced during glycolysis to G3P by G3P-dehydrogenase. In
in vivo experiments, performed in freely moving rats in the fed
state, our group (3) several years ago showed, by determining
simultaneously in the same animal the rate of incorporation of
3
H
2
O and [
14
C]glucose into the two moieties of liver TAG, that
this organ can also generate G3P from three-carbon interme-
diates, such as pyruvate, lactate, or glucogenic amino acids, via
glyceroneogenesis. This pathway was shown many years ago
(2, 9, 20, 21) to be present in adipose tissue; this pathway
involves the carboxylation of pyruvate to oxaloacetate, decar-
boxylation of oxaloacetate to phosphoenolpyruvate (PEP) by
cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), and
subsequently the production of G3P through a partial reversal
of glycolysis.
From the data of the above study (3), it could be estimated,
with the use of calculations described previously (5), that, in
livers from rats adapted to a high-protein, carbohydrate-free
diet, rates of glyceride-glycerol synthesis via glyceroneo-
genesis were five times higher and via glycolysis 50% lower
than in livers from control animals fed a balanced, carbo-
hydrate-rich diet. The contribution of glyceroneogenesis to
total liver TAG-glycerol synthesis could not be estimated
because the technique used does not allow the measurement
of TAG-glycerol formed via direct phosphorylation of glyc-
erol, a process presumably very active in liver, considering
the high levels of GyK in this organ. The contribution of
glyceroneogenesis to the in vivo synthesis of hepatic glyc-
eride-glycerol has been confirmed by Kalhan et al. (12) in
humans, using a deuterium labeling of body water method to
quantify the contribution of pyruvate to hepatic TAG. It was
found that, after a 16-h fast, 10 –60% of the plasma TAG
pool was derived from pyruvate in pregnant and nonpreg-
nant women, suggesting that glyceroneogenesis may be
important for the regulation of VLDL TAG production in
humans (12).
Address for reprint requests and other correspondence: R. H. Migliorini,
Dept. of Biochemistry and Immunology, School of Medicine, USP. 14049-900
Ribeira˜o Preto, Sa˜o Paulo, Brazil (e-mail: [email protected]).
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement”
in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
Am J Physiol Endocrinol Metab 293: E1352–E1357, 2007.
First published August 28, 2007; doi:10.1152/ajpendo.00394.2007.
0193-1849/07 $8.00 Copyright
©
2007 the American Physiological Society http://www.ajpendo.orgE1352
on January 21, 2008 ajpendo.physiology.orgDownloaded from
To our knowledge, no further studies on liver glyceroneo-
genesis have been so far reported in the literature. To obtain
more information about the control of G3P supply for glycer-
ide-glycerol synthesis in liver, in the present work we investi-
gated the state of the pathways of G3P production in precision-
cut liver slices of food-deprived and diabetic rats, two situa-
tions in which adipose tissue lipolysis and the uptake of
fatty acids by the liver are increased. The generation of G3P
via glycolysis, by direct phosphorylation of glycerol, and via
glyceroneogenesis was evaluated by measuring the rates of
incorporation of [
14
C]glucose, [
14
C]glycerol, and [
14
C]pyru-
vate, respectively, into TAG-glycerol. The activities of GyK
and of cytosolic PEPCK, a key enzyme of both gluconeogen-
esis and glyceroneogenesis, were also determined. Parallel
evaluations of gluconeogenic activity were made in experi-
ments with [
14
C]glycerol and [
14
C]pyruvate. Gluconeogenesis
has in common with glyceroneogenesis the steps of the dicar-
boxylic cycle and is markedly stimulated by food deprivation
and diabetes, thus a good test of the metabolic effectiveness of
the liver slices.
MATERIALS AND METHODS
Male Wistar rats weighing 180 –220 g were obtained from our
faculty colony, which has remained closed for ϳ50 yr. Rats were
housed in suspended wire-bottom cages in a room kept at 25 Ϯ 2°C
with a 12:12-h light-dark cycle and fed a commercial nutritionally
standard balanced diet [Nuvilab CR1, Nuvital (22% protein, 55%
carbohydrate, and 4.5% lipid)] and water ad libitum. For the fasting
experiments, rats were left without food but had free access to water
for 48 h. For diabetes induction, streptozotocin (45 mg/kg body wt,
dissolved in citrate buffer, pH 4.5) was injected under ether anesthesia
into the jugular vein of rats previously fasted overnight. When used
for the experiments, 3 days after streptozotocin injection, the rats had
plasma glucose levels that were between 350 and 450 mg/dl. All
experiments were performed between 0800 and 1000. For tissue
removal, the rats were killed by cervical dislocation.
The care of rats and experimental treatment of rats were approved
by the Ethical Committee of the University of Sa˜o Paulo.
Preparation of Precision-Cut Liver Slices
The rats were killed, and livers were quickly removed. The left lobe
was separated, and precision-cut liver slices (500 ␮m thick) were
prepared with a tissue chopper (7). Only the most uniform-shaped
slices were selected for experiments. All slice manipulations were
done in ice-cold Krebs-Henseleit buffer.
Incorporation of [
14
C]Pyruvate or [U-
14
C]Glycerol into
TAG-Glycerol or Glucose of Medium
Liver slices (200 mg) were incubated for1hat37°C with constant
orbital shaking in 2 ml of Krebs-Henseleit buffer, pH 7.4, containing
1 ␮Ci of [1-
14
C]pyruvate (1.0 mmol/l), [2-
14
C]pyruvate (0.5, 1.0, or
5.0 mmol/l), or [U-
14
C]glycerol (1.0 mmol/l). The procedures used for
lipid extraction, isolation, and counting of TAG-glycerol were as
previously described (5). The incubation medium was deproteinized
by the method of Somogyi (24), and the glucose was isolated for
14
C
counting by the glucose pentacetate method (11).
Glycolytic Flux
Liver slices (200 mg) were incubated for1hat37°C with constant
orbital shaking in 2 ml of Krebs-Henseleit buffer, pH 7.4, containing
D-[5-
3
H-glucose] (5 mmol, 1 ␮Ci). After the reaction was stopped
with 6% H
2
ClO
4
, the medium was centrifuged and neutralized and the
glycolytic flux was calculated from the
3
H recovered in water as
described in previously (15).
Measurement of Enzyme Activity
Cytosolic PEPCK activity was assayed by the method of Chang
and Lane (6) in 100,000-g supernatants after homogenization of liver
in 20 mmol/l triethanolamine buffer, pH 7.5, containing 0.2 mol/l
sucrose, 5 mmol/l mercaptoethanol, and l mmol/l EDTA. The incor-
poration of [
14
C]bicarbonate (2 ␮Ci) into acid-stable product was
determined in an assay mixture of composition identical to that used
in a previous study (5). The protein content of homogenates was
determined by the bicinchoninic acid method (23).
GyK activity was measured following the recommendations of
Newsholme et al. (18) in 2,000-g supernatants obtained after homog-
enization of the tissue in ice-cold 1% KCl in 1 mM EDTA. The
composition of the assay mixture, which contained U-[
14
C]glycerol,
and the isolation of labeled glycerol phosphate were previously
described in detail (14). The protein content of the homogenates used
in GyK was determined by the method of Lowry et al. (17).
Other Methods of Chemical Analysis
Plasma glucose and liver ATP were determined with the use of
commercial kits from Labtest (Lagoa Santa, Brazil) and from Bio-
Orbit Oy (Turku, Finland), respectively.
Statistical Methods
Data are expressed as means Ϯ SE, and differences between groups
were analyzed by Student’s t-test, with P Ͻ 0.05 as the criterion of
significance.
RESULTS AND DISCUSSION
Adequacy of the Preparation
The concentrations of ATP in the liver slices (means Ϯ SE:
4.3 Ϯ 0.9 ␮mol/g; n ϭ 8) did not change after1hofincubation
(4.4 Ϯ 0.1 ␮mol/g). The slices reproduced efficiently in vitro
the qualitative changes in liver carbohydrate and lipid metab-
olism, which are well known to be induced by fasting and
diabetes in intact animals. Thus lipogenic activity, assessed by
the rate of incorporation of
14
C from glucose into fatty acids,
was reduced to ϳ12% of normal controls in liver slices of
fasted and diabetic rats (Fig. 1A), which also showed an ϳ60%
reduction of the glycolytic flux, estimated with [5-
3
H]glucose
(Fig. 1B). Also, as expected from changes observed in vivo,
gluconeogenic activity, assessed by the rates of incorporation
of
14
C from pyruvate and glycerol into glucose of incubation
medium, increased markedly in slices of fasted and diabetic
rats (Table 3 and 4, see below for details). The above data show
that, at least for 1 h (period of incubation), the slices maintain
the pattern of metabolic pathways activities present in liver in
different physiological conditions and are therefore useful for
investigating features of these pathways not obtainable in
studies in vivo.
Pathways of G3P Generation for Glyceride-Glycerol
Synthesis
It should be pointed out initially that rates of incorporation
of labeled substrates into final products presented in all tables
and Fig. 1 were calculated directly from the specific activity of
the substrate in the incubation medium, disregarding any even-
tual intracellular dilution.
E1353GLYCERONEOGENESIS IN LIVER OF FASTED AND DIABETIC RATS
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on January 21, 2008 ajpendo.physiology.orgDownloaded from
Experiments in fasted rats. The generation of G3P via
glycolysis was markedly reduced in liver slices from fasted
rats, as shown by the 23% reduction in the incorporation of
[U-
14
C]glucose (5 mM; the physiological plasma concentration
of the hexose) into glyceride-glycerol, compared with rates in
slices from fed rats (Table 1).
For generation of G3P via glyceroneogenesis, we confirmed
the good performance of the liver slices by the rate of incor-
poration of [2-
14
C]pyruvate into glyceride-glycerol, which in-
creased in parallel to the increase in its concentration in the
incubation medium in both fed and fasted rats (Table 1). The
production of G3P via glyceroneogenesis was increased in
slices of fasted rats, as indicated by the increases in the rates of
glycerol synthesis from 0.25 mM [2-
14
C]pyruvate (ϳ75%) and
from 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate, concentrations of pyruvate
prevailing in plasma of fed and fasted rats, respectively. With
5.0 mM [2-
14
C]pyruvate, these rates did not differ significantly
in slices from the two experimental groups, an indication that
this was a saturating concentration of the substrate. Interest-
ingly, the increased incorporation of 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate
in glyceride-glycerol by slices of fasted rats (42.9 Ϯ 1.26
nmol⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
) was not affected by the addition of 5 mM glucose
to the incubation medium (44.2 Ϯ 0.93 nmol⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
), in con-
trast to the marked inhibition induced by the hexose in the
synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate by incubation
with white (22) and brown (Chaves VE, unpublished observa-
tions) adipose tissue. It has been previously found (8) that high
levels of glucose also failed to inhibit the increased gluconeo-
genesis from lactate in perfused liver from fasted rats. It would
thus appear that, in ex vivo conditions, the hexose does not
affect the rate-limiting steps common to liver glyceroneogen-
esis and gluconeogenesis below the triose-P level.
The effect of fasting on G3P generation by direct glycerol
phosphorylation was less evident, with a relatively small
(ϳ25%) increase in the incorporation of [U-
14
C]glycerol into
glyceride-glycerol being observed only at the substrate con-
centration of 0.25 mM (Table 1).
Experiments in diabetic rats. Table 2 shows that the results
obtained were similar to those observed in liver slices of
fasted rats incubated with the same concentration of sub-
strates (Table 1). Thus the incorporation of 5 mM [U-
14
C]glu-
cose into glyceride-glycerol was ϳ36% lower and that of 1
mM [2-
14
C]pyruvate was ϳ36% higher in liver slices of
diabetic rats than in normal controls. The incorporation of
[U-
14
C]glycerol did not differ significantly in the two experi-
mental groups (Table 2).
Gluconeogenesis From Pyruvate and Glycerol
Experiments in fasted rats. These experiments were per-
formed in the same rats utilized for the experiments of Table 1.
The incorporations of labeled glycerol and pyruvate into liver
glycogen were Ͻ0.01% of those in glucose of medium (data
not shown). Table 3 shows that the rates of incorporation of
[2-
14
C]pyruvate and [U-
14
C]glycerol into the glucose of incu-
bation medium also increased in parallel to the increase in the
initial concentration of the two substrates in the medium for
both fed and starved rats. Rates of incorporation into medium
glucose were ϳ140% higher in fasted than in fed controls in
slices incubated with 0.25 and 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate; with
5.0 mM [2-
14
C]pyruvate, the increase was ϳ90%. The effect of
fasting on the rates of incorporation of [U-
14
C]glycerol into
glucose of the medium was relatively small, with increases of
ϳ20% being observed with the three concentrations of
[U-
14
C]glycerol (Table 3).
Experiments in diabetic rats. Table 4 data were obtained
from the same rats of experiments shown in Table 2. Table 4
shows that rates of incorporation into medium glucose were
ϳ145% higher in diabetic than in normal controls in slices
incubated with 1.0 mM [2-
14
C]pyruvate, an effect similar to
Table 2. Incorporation of
14
C from glucose, pyruvate, or
glycerol into glyceride-glycerol of liver slices of control or
diabetic rats
Incorporation, nmol ⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
Substrate Concentration Control Rats Diabetic Rats
͓U-
14
C͔glucose 5.0 mM 100.4Ϯ5.1 64.0Ϯ2.9*
͓2-
14
C͔pyruvate 1.0 mM 29.5Ϯ1.1 40.2Ϯ2.8*
͓U-
14
C͔glycerol 1.0 mM 544.9Ϯ25.3 551.6Ϯ57.2
Values are means Ϯ SE from 6 rats. *P Ͻ 0.05 vs. control rats.
Fig. 1. Effect of fasting and diabetes on the synthesis of fatty acids from
[
14
C]glucose (A) and glycolytic flux (B) of rat liver slices. Bars are means Ϯ
SE from 4 and 12 rats, respectively. *P Ͻ 0.05 vs. control.
Table 1. Incorporation of
14
C from glucose, pyruvate, or
glycerol into glyceride-glycerol of liver slices of fed or
fasted rats
Incorporation, nmol ⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
Substrate Concentration Fed Rats Fasted Rats
͓U-
14
C͔glucose 5.0 mM 101.0 Ϯ3.2 74.1Ϯ3.8*
͓2-
14
C͔pyruvate 0.25 mM 6.4Ϯ0.6 11.2Ϯ0.5*
͓2-
14
C͔pyruvate 1.0 mM 28.3Ϯ1.0 42.9Ϯ0.9*
͓2-
14
C͔pyruvate 5.0 mM 140.3Ϯ3.9 134.3Ϯ5.5
͓U-
14
C͔glycerol 0.25 mM 198Ϯ14 256Ϯ14*
͓U-
14
C͔glycerol 1.0 mM 513Ϯ22 481Ϯ12
͓U-
14
C͔glycerol 5.0 mM 1,345Ϯ123 1,116Ϯ44
Values are means Ϯ SE from 5 or 6 rats. *P Ͻ 0.05 vs. fed rats.
E1354 GLYCERONEOGENESIS IN LIVER OF FASTED AND DIABETIC RATS
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that observed in fasted rats (Table 3). As in the experiments
with fasted rats, the effect of diabetes was relatively small, with
the incorporation of [U-
14
C]glycerol into medium glucose
increasing only ϳ14% in liver slices of diabetic rats (Table 4).
GyK and Cytosolic PEPCK Activities
In agreement with the results of the experiments of incor-
poration of [U-
14
C]glycerol into glyceride-glycerol (Tables 1
and 3), the activity of GyK in liver slices was not affected by
food deprivation or diabetes (Fig. 2). In contrast, the activity of
cytosolic PEPCK was markedly increased (by 84%) in slices of
both fasted and diabetic rats (Fig. 2), in consonance with the
observed increases in gluconeogenesis (Tables 2 and 4) and
glyceroneogenesis (Tables 1 and 3) activities in these slices.
Contribution of Glyceroneogenesis to Glyceride-Glycerol
Synthesis in Liver Slices of Fasted Rats
With the assumption that there was no intracellular dilution
of the label, the rates of [U-
14
C]glucose and of [U-
14
C]glycerol
incorporation into glyceride-glycerol, calculated from the in-
cubation medium-specific activity in liver slices from fasted
rats (Table 1), correspond to the glyceride synthesis from these
two substrates via glycolysis and by direct phosphorylation of
glycerol, respectively. They can, therefore, be used to estimate
the relative contribution of these two pathways to the genera-
tion of G3P for glyceride-glycerol synthesis. The same as-
sumption, however, cannot be made for rates of incorporation
of [2-
14
C]pyruvate calculated from the medium-specific activ-
ity. These rates, although useful for comparisons of glycero-
neogenic activity in different conditions, as done above, do not
correspond to the actual rate of glyceride-glycerol synthesis
from pyruvate via glyceroneogenesis in a given condition. It
has been known for many years (25) that, in the conversion of
pyruvate to PEP, the carbons of PEP are diluted by carbons
derived from acetyl-CoA and CO
2
. This occurs because the
first intermediate in the synthesis of PEP from pyruvate is
oxaloacetate, which is also an intermediate in tricarboxylic
cycle, after decarboxylation of pyruvate to acetyl-CoA by
pyruvate dehydrogenase (Fig. 3). Carbon-2 from pyruvate
entering the mitochondria can be incorporated into oxaloac-
etate directly through the reaction catalyzed by pyruvate car-
boxylase or indirectly via the citric acid cycle, after being
incorporated into acetyl-CoA produced by decarboxylation of
pyruvate by pyruvate dehydrogenase. Carbon-1 from pyruvate
is also incorporated into oxaloacetate by direct carboxylation
Fig. 2. Effect of fasting and diabetes on the phosphoenolpyruvate carboxyki-
nase (PEPCK) activity (A) and glycerokinase (GyK) activity (B) in rat liver.
Bars are means Ϯ SE from 6 rats. *P Ͻ 0.05 vs. control.
Fig. 3. Oxaloacetate is a component of the citric acid cycle and also the
substrate of PEPCK in the limiting step of glyceroneogenesis, which in the rat
occurs in the cytosol. After entering the mitochondria, carbons from pyruvate
derived from glyceroneogenic substrates can incorporate into oxaloacetate in
the reaction catalyzed by pyruvate carboxylase (PC) or through a recycle of the
acetyl-CoA produced in the reaction catalyzed by the pyruvate dehydrogenase
complex (PDH).
Table 3. Incorporation of
14
C from pyruvate or glycerol into
glucose of incubation medium of liver slices of fed or
fasted rats
Incorporation, nmol ⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
Substrate Concentration Fed Rats Fasted Rats
͓2-
14
C͔pyruvate 0.25 mM 110Ϯ11 261Ϯ15*
͓2-
14
C͔pyruvate 1.0 mM 428Ϯ15 1,044Ϯ16*
͓2-
14
C͔pyruvate 5.0 mM 3,088Ϯ83 5,922Ϯ55*
͓U-
14
C͔glycerol 0.25 mM 822Ϯ82 1,055Ϯ97*
͓U-
14
C͔glycerol 1.0 mM 3,276Ϯ156 3,789Ϯ90*
͓U-
14
C͔glycerol 5.0 mM 8,637Ϯ438 10,543Ϯ496*
Values are means Ϯ SE from 5 or 6 rats. *P Ͻ 0.05 vs. fed rats.
Table 4. Incorporation of
14
C from pyruvate or glycerol into
glucose of incubation medium of liver slices of control or
diabetic rats
Incorporation, nmol ⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
Substrate Concentration Control Rats Diabetic Rats
͓2-
14
C͔pyruvate 1.0 mM 476Ϯ21 1,166Ϯ97*
͓U-
14
C͔glycerol 1.0 mM 3,981Ϯ123 4,536Ϯ159*
Values are means Ϯ SE from 6 rats. *P Ͻ 0.05 vs. control.
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of pyruvate but is removed in the CO
2
and excluded from
acetyl-CoA in the reaction catalyzed by pyruvate dehydroge-
nase, incorporating into PEP only after recycling of oxaloac-
etate in the citric acid cycle. Exton and Park (8) computed,
from the results obtained in experiments in which they mea-
sured the incorporation of [1-
14
C]pyruvate and [2-
14
C]pyruvate
into glucose, glycogen, and CO
2
, the ratio of pyruvate carbox-
ylated to oxaloacetate to that decarboxylated to acetyl-CoA in
perfused livers of fasted rats. Table 5 shows the results of
experiments in which liver slices of fasted rats were incubated
with [1-
14
C]pyruvate or [2-
14
C]pyruvate to measure the incor-
poration of these substrates into medium glucose (the incorpo-
ration into liver glycogen was negligible), CO
2
, and also into
glyceride-glycerol, since glyceroneogenesis is an abbreviated
form of gluconeogenesis. With the same assumptions and
calculations of the experiments with perfused livers (8), it was
found that in liver slices pyruvate carboxylation was practically
the same as decarboxylation (ratio of carboxylation to decar-
boxylation ϭ 0.94). On the basis of a model that considered all
the pathways of pyruvate metabolism in the liver, Katz (13)
deduced a formula to calculate the relative specific activity of
liver PEP after administration of [1-
14
C]pyruvate that required
only a knowledge of the ratio between carboxylation and
decarboxylation of pyruvate (13). From the relative specific
activity of PEP obtained with the above ratio (0.94), it was
calculated that rates of incorporation of [1-
14
C]pyruvate into
TAG should be multiplied by 4.2 and rates of [2-
14
C]pyruvate
by ϳ2.1 to obtain a value of glyceride-glycerol synthesis from
pyruvate independent of intracellular dilution of pyruvate car-
bons. Because during fasting there is, in addition to circulating
pyruvate, a large liver influx of other pyruvate-producing metab-
olites, such as lactate and amino acids and especially alanine,
the contribution of glyceroneogenesis to G3P production in
liver slices of fasted rats was estimated with the use of rates
obtained with saturating amounts of substrate (5 mM) in Table
1. After correction of rates of pyruvate incorporation, it could
be calculated that glyceroneogenesis contributed with ϳ20%
of G3P for glyceride-glycerol synthesis in slices of fasted rats,
the glycolytic pathway with ϳ5%, and direct phosphorylation
of glycerol by GyK with ϳ75%.
In a previous in vivo study from our group (3), the only
available for comparisons in rats, the relative contribution of
the three pathways could not be estimated because the tech-
nique used in that study did not allow the measurement of
glyceride-glycerol formed via GyK. The present estimative can
be compared, with the necessary caution, to the findings by
Kalhan et al. (12) in fasted pregnant and nonpregnant women.
With the use of a deuterium labeling of body water method to
quantify the contribution of pyruvate to hepatic TAG, they
found that 10 – 60% of the plasma TAG was derived from
pyruvate (glyceroneogenesis). They commented that the large
variance observed was most likely because of a lack of isotopic
steady state in the TAG pool because the plasma samples were
obtained after a relatively short period following tracer admin-
istration (12). In contrast to the ϳ75% contribution of glycerol
to glyceride-glycerol synthesis in liver slices, Kalhan et al.,
who administered [
13
C
3
]glycerol tracer as prime constant rate
infusion to fasted nonpregnant women, found that 6.1% of
glycerol in TAG was derived from plasma glycerol, suggesting
that only a small fraction of the glyceride-glycerol made by the
liver during fasting is synthesized from glycerol. Species
differences apart, this apparent disaccord could be partly at-
tributed to the period during which newly formed TAGs are
passing through the various stages of transport to the exterior
of the hepatocyte, which precedes their appearance in plasma
VLDL. Previous studies (10, 26) have shown that, after intra-
venous injection of radioactive FFAs, fatty acids are rapidly
esterified to TAG in liver, but peak specific activities of TAG
fatty acids in plasma are not reached for 1–3 h in humans.
Contribution of Pyruvate and Glycerol to Gluconeogenesis
in Fasted Rats
After we corrected for the rate of incorporation of pyruvate
into medium glucose, we could estimate from the results
obtained with saturating amounts (5 mM) of substrates in Table
3 that pyruvate contributed 54% and glycerol 46% of the
gluconeogenesis in liver slices of fasted rats. Kalhan et al. (12),
in their studies with [
13
C
3
]glycerol, found that a similar large
fraction (50%) of the glycerol is converted to glucose in pregnant
and nonpregnant fasted women.
Because in the fed state glucose is the main source of
TAG-glycerol in adipose tissue, which has a low GyK activity,
the glycerol released during fasting is sometimes compared
with lactate, which only recycles glucose carbon, with no
“new” glucose production. During fasting and diabetes, how-
ever, G3P synthesis from glucose is markedly reduced and
glyceroneogenesis is very active in adipose tissue. Thus the
glycerol released in large amounts from the liver in those two
conditions derives mainly from three carbon substrates of
glyceroneogenesis, contributing therefore to de novo synthesis
of glucose.
In summary, the present study demonstrates that during
fasting and diabetes, conditions in which the synthesis of
triglycerides is markedly increased in the liver, the reduced
generation of G3P in liver slices via glycolysis is accompanied
by a significant activation of glyceroneogenesis that contrib-
utes to maintain an adequate supply of the G3P needed for
triglyceride formation. Our study also shows that glycerol
phosphorylation by GyK, the main generator of G3P in liver, is
little affected by fasting or diabetes.
ACKNOWLEDGMENTS
We are indebted to Elza Aparecida Filippin, Neusa Maria Zanon, and Victor
Diaz Galban for technical assistance.
GRANTS
This work was supported by grants from the Fundac¸a˜o de Amparo a`
Pesquisa do Estado de Sa˜o Paulo (FAPESP 2006/00448-8) and from the
Conselho Nacional de Pesquisa (CNPQ 513296/96).
Table 5. Incorporation of 1 mM
͓
1-
14
C
͔
pyruvate or
͓
2-
14
C
͔
pyruvate into glyceride-glycerol, glucose of
incubation glucose, or CO
2
in liver slices of fasted rats
Incorporation, nmol ⅐ g
Ϫ1
⅐ h
Ϫ1
Substrate Glyceride-glycerol Glucose CO
2
͓1-
14
C͔pyruvate 20.3Ϯ1.0 685Ϯ22 3,110Ϯ257
͓2-
14
C͔pyruvate 44.0Ϯ1.1 1,061Ϯ18 788Ϯ30
Values are means Ϯ SE from 6 – 8 rats.
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E1357GLYCERONEOGENESIS IN LIVER OF FASTED AND DIABETIC RATS
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