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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
Programa Integrado de Pós Graduação em Biologia Tropical e
Recursos Naturais
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE
GENES EM TAMBAQUI (Colossoma macropomum CUVIER, 1818)
ALIMENTADO COM FRUTOS E SEMENTES DA AMAZÔNIA
LUCIANA MELHORANÇA MOREIRA AÑEZ
Manaus – AM
Setembro, 2008
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ii
LUCIANA MELHORANÇA MOREIRA AÑEZ
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE
GENES EM TAMBAQUI (Colossoma macropomum CUVIER, 1818)
ALIMENTADO COM FRUTOS E SEMENTES DA AMAZÔNIA
Orientadora: Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação e Biologia Tropical de
Recursos Naturais do convênio
INPA/UFAM, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor em
Ciências Biológicas, área de
concentração Ecologia
Bolsa de doutorado: CAPES
Financiamento: Edital MCT/CNPq/FAPEAM nº 010/2003 - PRONEX
Manaus – AM
Setembro, 2008
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iii
A579 Añez, Luciana Melhorança Moreira
Identificação e diferenciação da expresão de genes em tambaqui
(Colossoma macropomum CUVIER, 1818) alimentado com frutos
e sementes da Amazônia / Luciana Melhorança Moreira Añez . ---
Manaus : [s.n.], 2008.
xvi, 105 f. : il.
Tese (doutorado)-- INPA/UFAM, Manaus, 2008
Orientador : Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Área de concentração : Ecologia
1. Tambaqui – Alimentação e rações. 2. Nutrição animal.
3. Colossoma macropomum. I. Título.
CDD 19. ed. 597.50443
iv
SINOPSE:
Este trabalho teve como objetivo avaliar em nível molecular os efeitos da incorporação dos frutos
camu-
camu, catoré, embaúba, jauari e da semente munguba na alimentação do tambaqui, na proporção
de 1:1 com a ração comercial. For
am avaliados também os efeitos fisiológicos, bioquímicos e
citogenotóxico
s nos peixes submetidos a alimentação experiemntal por períodos de 1, 15 e 30 dias de
alimentação. As dietas experimentais não provocaram alterações nos parâmetros sanguíneos
desses
a
nimais, porém, produziram transcritos expressos diferencialmente, com similaridade às sequências
das enzimas Superóxido dismutase, Citocromo P450 e da proteína Apolipoproteína.
Sete sequências
não apresentaram similaridade com aquelas depositadas no GenBan
k e duas sequências foram
caracterizadas como produtos de proteína não identificada.
Essas seqüências são candidatas a futuras
investigações para a compreensão de processos específicos do metabolismo dos animais alimentados
com rações suplementadas com frutos e sementes da Amazônia.
v
DEDICO
À minha família.
Aos meus pais, Cirene e Edmir, pelo apoio,
estímulo e amor.
Ao Rogério pelo companheirismo e
dedicação à nossa família.
Ao Lorenzo e à Sophia, pelo carinho
demonstrado em cada abraço e sorriso e
pelos constantes momentos de alegria.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela proteção, por iluminar meus caminhos e por me fazer acreditar que este
sonho seria possível.
À Dra Vera Maria Fonseca de Almeida e Val pela orientação, confiança, amizade,
incentivo e apoio, que foram imprescindíveis para a realização deste trabalho.
Ao Dr. Adalberto Luís Val pelas sugestões, atenção e oportunidade de realizar esta
pesquisa.
Ao Dr. Sérgio Nozawa, por toda ajuda, paciência, incentivo e explicações, durante a
execução deste trabalho.
À Angélica, Nazaré e Raquel pela amizade e por todo auxílio no período de realização
do meu doutorado, à Sylvia e Luiza por toda colaboração. À D. Sônia pelas conversas,
companhia, cafezinhos e bolos.
Às amigas Katherine, Christiane, Nislanha, Alzira e Nívia pelas sugestões, críticas,
ajuda, apoio e, sobretudo, pela amizade e pelos bons momentos compartilhados em todo
o tempo que passei em Manaus.
À equipe do LEEM: Karen, Vivian, Sandra, Ronildo, Daniella, Viviane, Suely e Frank
pela ajuda durante o período experimental e análises hematológicas e enzimáticas. Ao
Marcos, Ramon, Carolina, Roziete e Luciano pelo apoio durante os experimentos de
expressão gênica.
À equipe do Centro Universitário Nilton Lins: Dra Mônica, Frida, Kácio, e toda equipe,
pela recepção e ajuda nos experimentos realizados no Laboratório de Expressão Gênica.
Ao Laboratório de Nutrição de Peixes – CPAQ/INPA pelas análises bromatológica das
rações experimentais.
vii
Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia - INPA, através do Programa de Pós-
Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais e do curso de Ecologia, pela
oportunidade do doutorado.
À CAPES pela concessão da bolsa.
Às Agências de Fomento FAPEAM e CNPq que financiaram o trabalho por meio do
Edital MCT/CNPq/FAPEAM nº 010/2003 – PRONEX.
À Universidade do Estado de Mato Grosso – UNEMAT pelo apoio.
Ao departamento de Ciências Biológicas – UNEMAT/Cáceres, particularmente à Chefe
de departamento MsC. Leila Valderez Gattass pela compreensão e auxilio durante a fase
final do doutorado.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
viii
RESUMO
As frutas desempenham um papel importante nos ecossistemas da planície
inundável da Amazônia Central, especialmente se considerarmos a relação peixes-
plantas. Mais de 110 espécies de plantas foram identificadas como produtoras de frutos
e sementes consumidos pelo tambaqui em seu ambiente natural. O conhecimento do
hábito alimentar desses animais na natureza, possibilitou a inclusão de frutos e sementes
na dieta de peixes criados em cativeiro, visando baratear custos da produção, mantendo
um crescimento satisfatório dos animais. Porém, a presença de fatores antinutricionais
pode limitar a inclusão de certos produtos vegetais na dieta desses peixes. Este trabalho
teve como objetivo avaliar em nível molecular os efeitos da incorporação dos frutos
camu-camu, catoré, embaúba, jauari e da semente munguba na alimentação do
tambaqui, na proporção de 1:1 com a ração comercial. Foram avaliados também os
efeitos fisiológicos, bioquímicos e citogenotóxicos nos peixes submetidos a períodos de
1, 15 e 30 dias de alimentação modificada. Os resultados demonstraram que os frutos e
sementes não provocaram alterações metabólicas, enzimáticas e citogenotóxicas nos
peixes durante os períodos testados. Entretanto, foi possível verificar diferenças
significativas em função do período de alimentação e da privação alimentar a que os
peixes foram submetidos. A expressão diferencial de genes mostrou fragmentos que
apresen
taram similaridade com os genes das enzimas Adenilato Quinase, Superóxido
Dismutase, Apolipoproteína e Citocromo P450. Outros sete transcritos expressos não
demonstraram similaridade com as enzimas depositadas no GenBank, e dois fragmentos
foram caracterizados como produtos de proteína não identificada,
sendo
candidatos a
futura investigação para a compreensão de processos específicos do metabolismo dos
animais alimentados com rações suplementadas com frutos e sementes da Amazônia.
ix
ABSTRACT
Fruits play an important role in the Central Amazonia floodplain ecosystem, especially
when considering the relation fish-plants. More than 110 plants species have been
identified which produc fruits and seeds consumed by tambaqui in its natural
environment. The knowledge of the food habits of these animals in nature, made
possible the inclusion of fruits and seeds in the fish diet created when reared under
captivity, aiming to decrease production costs, and keeping a satisfactory fish growth
rate. However, the presence of antinutritional factors can limit the inclusion of certain
vegetable products in the diet of these fishes. This work aims to evaluate, at a molecular
level, the effect of the incorporation of the fruits ‘camu-camu’, ‘catoré’, ‘embaúba’,
‘jauari’ and ‘munguba’ seeds in tambaqui feeding, in the ratio of 1:1 with a commercial
ration. The physiological, biochemical and cytogenotoxicity parameters were also
evaluated for their effects in the fishes submitted to a period of 1, 15 and 30 days of
modified feeding. The results demonstrated that fruits and seeds did not affect
metabolic, enzymatic and cytogenotoxic alterations in the fishes during the tested
periods. However, it was possible to verify a significant difference in the feeding period
and food deprivation in subbimetted fishes. The gene differential expression showded
fragments that presented similarity with Adenylate Kinase, Superoxide Dismutase,
Apolipoprotein and Cytochrome P450 enziyme genes. Others seven expressed
transcripts did not demonstrated similarity with enzymes deposited in the GenBank, and
two fragments were characterized as products of proteins not identified thefore being
candidates for future studies in order to understand the animals process metabolism
when fed with supplemented rations with Amazonian fruits and seeds.
x
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................
1
Fontes alternativas de alimentos para a criação de peixes......................................... 04
Aspectos da nutrição de peixes.................................................................................. 08
A espécie animal e os frutos......................................................................................
12
OBJETIVO...............................................................................................................
16
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................
17
HIPÓTESE...............................................................................................................
18
CAPÍTULO I
PERFIL HEMATOLÓGICO, BIOQUÍMICO E CITOGENOTÓXICO DE
TAMBAQUIS (Colossoma macropomum Cuvier, 1818) ALIMENTADOS COM
RAÇÃO SUPLEMENTADAS COM FRUTOS E SEMENTES DA AMAZÔNIA
19
RESUMO..................................................................................................................
19
ABSTRACT..............................................................................................................
20
INTRODUÇÃO........................................................................................................
21
MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................
OBTENÇÃO E ACLIMATAÇÃO DOS PEIXES....................................................
COLETA E ARMAZENAMENTO DOS FRUTOS.................................................
ELABORAÇÃO DAS RAÇÕES..............................................................................
DESENHO EXPERIMENTAL.................................................................................
VARIÁVEIS FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA........................................................
ANÁLISE DE CRESCIMENTO...............................................................................
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS.....................................................................
ANÁLISE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES........................................................
EFEITO CITOTÓXICOS E GENOTÓXICOS.........................................................
ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................
23
23
23
24
25
26
26
27
29
30
32
RESULTADOS.........................................................................................................
VARIÁVEIS FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA........................................................
ANÁLISE DE CRESCIMENTO...............................................................................
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS.....................................................................
ANÁLISE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES........................................................
EFEITO CITOTÓXICOS E GENOTÓXICOS.........................................................
32
32
33
34
40
43
DISCUSSÃO.............................................................................................................
VARIÁVEIS FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA........................................................
ANÁLISE DE CRESCIMENTO...............................................................................
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS.....................................................................
ANÁLISE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES........................................................
46
46
47
50
54
xi
EFEITO CITOTÓXICOS E GENOTÓXICOS.........................................................
57
CONCLUSÃO..........................................................................................................
60
CAPÍTULO II
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES EM
TAMBAQUIS (Colossoma macropomum CUVIER, 1818) ALIMENTADOS
COM FRUTOS E SEMENTES DA AMAZÔNIA
62
RESUMO..................................................................................................................
62
ABSTRACT..............................................................................................................
63
INTRODUÇÃO........................................................................................................
64
MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................
MATERIAL BIOLÓGICO........................................................................................
PROTOCOLO EXPERIMENTAL DO DD-PCR......................................................
SEQUENCIAMENTO...............................................................................................
66
66
67
73
RESULTADOS.........................................................................................................
74
DISCUSSÃO.............................................................................................................
82
CONCLUSÃO..........................................................................................................
91
CONSIDERAÇÕES FINAIS..................................................................................
92
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
94
xii
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
PÁGINA
Tabela 1. Composição centesimal (% da MS) e valor energético (EB KJg MS) dos
frutos e sementes consumidos pelo tambaqui (C. macropomum)..............................
24
Tabela 2. Composição centesimal (% da MS) das rações controle e experimentais
utilizadas neste trabalho.............................................................................................
25
Tabela 3. Valores de temperatura, oxigênio dissolvido e pH medidos durante o
período experimental..................................................................................................
33
Tabela 4. Dados dos índices de desempenho de tambaquis (Colossoma
macropomum) alimentados com ração suplementada com frutos e sementes da
Amazônia...................................................................................................................
34
Tabela 5. Valores de Volume corpuscular médio (VCM µm
3
), Hemoglobina
corpuscular média (HCM pg) e Concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM %) de tambaquis (Colossoma macropomum) alimentados com ração
suplementada com frutos e sementes da Amazônia nos períodos de 1 dia, 15 dias e
30 dias........................................................................................................................
38
Tabela 6. Valores de Volume corpuscular médio (VCM µm
3
), Hemoglobina
corpuscular média (HCM pg) e Concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM %) de tambaquis (Colossoma macropomum) alimentados com ração
suplementada com frutos e sementes da Amazônia por um período de 30 dias e
submetidos a posterior privação alimentar.................................................................
39
CAPÍTULO II
Tabela 1. Primers arbitrários utilizados na amplificação do cDNA..........................
70
Tabela 2. Concentração do RNA total (µg/µL) extraído do fígado de tambaqui
(Colossoma macropomum) alimentado com frutos e sementes da Amazônia...........
74
Tabela 3 - Transcritos diferencialmente expressos detectados pela DDRT-PCR e
comparados ao banco de dados do GenBank.............................................................
78
Tabela 4 - Transcritos diferencialmente expressos por tratamento e condição
alimentar.....................................................................................................................
82
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
PÁGINA
Figura 1. Valores de hematócrito de Colossoma macropomum. A. Comparação
entre as médias de hematócrito em função dos dias de alimentação. B.
Comparação entre as médias do período de 30 dias de alimentação e privação de
alimentar.....................................................................................................................
35
Figura 2. Valores de hemoglobina de Colossoma macropomum. A. Comparação
entre as médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as
médias do período de 30 dias de alimentação e privação de alimentar.....................
36
Figura 3. Número de eritrócitos circulantes (RBC) de Colossoma macropomum.
A. Comparação entre as médias em função dos dias de alimentação. B.
Comparação entre as médias do período de 30 dias de alimentação e privação de
alimentar.....................................................................................................................
36
Figura 4. Concentração de glicose de Colossoma macropomum. A. Comparação
entre as médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as
médias do período de 30 dias de alimentação e privação de alimentar.....................
39
Figura 5. Valores médios da atividade da Glutationa S- Transferase (GST) (µmol.
min
-1
.mg de proteína) em Colossoma macropomum. A. Comparação entre as
médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as médias do
período de 30 dias de alimentação e privação de alimentar.......................................
41
Figura 6. Valores médios da atividade da Catalase (µmol. min
-1
.mg de proteína)
em Colossoma macropomum. A. Comparação entre as médias em função dos dias
de alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de
alimentação e privação de alimentar..........................................................................
42
Figura 7. Concentração endógena de produtos celulares oxidados (TBARS) em
Colossoma macropomum. A. Comparação entre as médias em função dos dias de
alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de
alimentação e privação de alimentar..........................................................................
43
Figura 8. Anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE) em Colossoma
macropomum. A. Comparação entre as médias em função dos dias de
alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de
alimentação e privação de alimentar..........................................................................
44
Figura 9. Teste cometa em preparações celulares de Colossoma macropomum. A.
Comparação entre as médias do Índice de Danos em função dos dias de
alimentação. B. Comparação entre as médias da Freqüência de Danos em função
dos dias de alimentação..............................................................................................
45
xiv
CAPÍTULO II
Figura 1. Vetor pGEM
®
-T Easy Vector System - PROMEGA...............................
71
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose desnaturante do RNA total do fígado de
Colossoma macropomum alimentado com ração suplementada com frutos e
sementes da Amazônia...............................................................................................
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% do cDNA sintetizado com oligos dT
ancorados....................................................................................................................
75
75
Figura 4. Perfil da expressão diferencial de genes do fígado de tambaqui,
alimentado com as rações experimentais por 1 dia, usando o primer PAI 2.............
76
Figura 5. Resultado da extração do DNA plasmidial, através de “Mini-Prep”.........
77
Figura 6. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à
enzima Adeninalo Quinase 2 (AK2) no período de privação alimentar....................
79
Figura 7. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à
enzima Superóxido dismutase – Mn (SOD) no período de privação alimentar ........
80
Figura 8. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à
enzima Citocromo P450 (CYP 1A) no período de 15 dias de alimentação ..............
80
Figura 9. Fragmentos de DNA de Colossoma macropomum com similaridade a
proteína Apolipoproteína (APO). A e B no período de 1 dia de alimentação e C no
período de 15 dias de alimentação ............................................................................
81
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
A260 ou ABS (540)- Absorbância em comprimento de onda igual a 260 ou 540
nanômetros
ADP – Adenosina di-fosfato
ATP – Adenosina tri-fosfato
AK – Adenilato quinase
AMP- Adenosina mono-fosfato
APO – Apolipoproteína
BLAST – Basic local alignment search tool
CAT – Catalase
CYP – Citocromo P450
cDNA – DNA complementar
Ct – Threshold cycle – “ciclo de limiar”
DD PCR – Differential display Polymerase chain reaction
DEPC – Dietil pirocarbonato
DNA - Ácido desoxirribonucléico
Dnase – Desoxirribinuclease
dNTP – Desoxirribonucleosídeo trifosfato
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
ERO – Espécie reativa ao oxigênio
GST – Glutationa S – transferase
GTP – Guanina tri-fosfato
IMP – Inosina mono-fosfato
IPTG – Isopropil-β-D-Tiogalactopiranosídeo
LB – Meio de cultura de bactérias – Luria Bertani
mim – Minuto
mL – Mililitro
mM – Milimolar
MMLV-RT – “Moloney Murine Leukemia Vírus Reverse Transcriptase”
MOPS – Ácido 3-N Mofolino Propanosulfônico
µg – Micrograma
µL – Microlitro
ng – Nanograma
xvi
pb – Pares de bases
PCR – “Polymerase chain reaction” – Reação em cadeia da polimerase
Pmol – Picomol
q RT PCR – PCR quantitativo em tempo real
RNA – Ácido ribonucléico
Rnase – ribonuclease
rpm – rotação por minuto
SDS – Duodecil sulfato de sódio
SOD – Superóxido dismutase
TBARS - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
X-Gal – 5 bromo – 4 cloro – 3 indolil - β – D – galactosidase
1
INTRODUÇÃO
A bacia amazônica é a maior área de floresta tropical do mundo, sendo drenada por
rios que são influenciados pela distribuição sazonal de precipitação, bem como pela variação
climática que rege o degelo da Cordilheira dos Andes, que garantem as oscilações no nível
das águas (Sioli, 1984; Val & Almeida-Val, 1995). Em virtude dessa sazonalidade, a várzea
que compõem a paisagem da Floresta Amazônica, é adaptada à submersão total ou parcial
durante um período prolongado de cheias. As plantas que compõem a floresta passam então
a desempenhar importante papel na alimentação de organismos aquáticos, em especial os
peixes (Takahasi et al., 1994).
A relação entre a Floresta Amazônica e o hábito alimentar de muitos peixes é
bastante estreita, pois muitas espécies são dependentes dos alimentos que caem na água,
principalmente folhas, flores, frutos e sementes (Goulding, 1980; Silva et al., 2000; Claro-Jr
et al., 2004). A cada ano 100.000 Km
2
de florestas de várzea são inundados, formando uma
enorme área de forrageamento para grande parte dos peixes amazônicos, que, sendo
oportunistas em sua estratégia alimentar, encontram nos frutos e sementes sua principal
fonte de alimento, aumentando suas reservas de gordura (Salati et al., 1998).
As frutas desempenham um papel importante nos ecossistemas da planície inundável
da Amazônia Central, especialmente se considerarmos a relação peixes-plantas (Claro-Jr et
al., 2004). Estima-se que a produção de frutos nas florestas de várzeas e igapós possa chegar
a mais de um milhão de toneladas por ano (Araújo-Lima & Goulding, 1998) e que essa
grande quantidade de frutos seja capaz de manter uma quantidade equivalentemente alta de
peixes herbívoros (Waldhoff & Maia, 2000).
Goulding (1980) sugere que os frutos e sementes são os maiores mananciais naturais
de nutrientes e energia para aproximadamente 200 espécies de peixes da Amazônia. Os
peixes ligados à floresta de inundação são, em sua maioria, frugívoros, que evoluíram em
2
estreita relação com as árvores e arbustos amazônicos (Araújo-Lima & Goulding, 1998).
Várias espécies, particularmente as da grande ordem dos Characiformes, apresentam
dentições especializadas para o consumo de certos tipos de frutas: o tambaqui (Colossoma
macropomum) é um comedor especialista das frutas da Hevea spruceana, os pacus, dos
gêneros Mylossoma, Myleus e Broco, são também comedores importantes de frutas de
palmeiras, embaúbas e outras árvores (Imperatriz-Fonseca & Por, 2003).
Vários frutos são utilizados como fonte de alimento por peixes da região amazônica,
entre eles: araçá (Eugenia sp.), camu-camu (Myrciaria dubia), catoré (Crateva benthamii),
embaúba (Cecropia sp.), jauari (Astrocaryum jauari), munguba (Pseudobombax munguba),
seringa (Hevea brasiliensis), seringa-barriguda (Hevea spruceana), tarumã-da-várzea (Vitex
cymosa) e ucuúba (Virola surinamensis) (Takahasi et al., 1994; Araújo-Lima & Goulding,
1998; Silva et al., 2000; Maués & Couturier, 2002). Cerca de 110 espécies de frutos e
sementes, distribuídas em 36 famílias de plantas foram identificadas como alimentos para o
tambaqui (Colossoma macropomun). Durante os meses de cheia, o conteúdo estomacal
dessa espécie contém quantidade relativamente alta de frutos e sementes, coincidindo com o
período de frutificação das árvores presentes nas áreas de várzeas e igapós (Silva et al,
2000).
Tais informações precisam ser aproveitadas de uma maneira mais eficiente no que se
refere às técnicas de cultivo de peixes. As informações sobre as exigências de vitaminas e
nutrientes para grande parte das espécies de peixes criadas em cativeiro são limitadas, e os
resultados de estudos com salmonideos, ciprinídeos e outros grupos exóticos são geralmente
aplicados comercialmente às demais espécies (Silva & Anderson, 1995), com poucas
chances de sucesso. Este procedimento tem sido adotado principalmente pela falta de
estudos sobre espécies tropicais que apresentam potencial para criação em cativeiro (Chagas
& Val, 2003).
3
A plantação de árvores na várzea do rio Amazonas é confinada principalmente aos
quintais dos ribeirinhos, e muitas dessas árvores produzem frutos que são utilizados como
isca para a pesca. Tais árvores como outras plantas de várzea, estão adaptadas à inundação
anual, frutificando durante a época da enchente (Araújo-Lima & Goulding, 1998). A
utilização desses frutos pela população local na produção artesanal de rações para peixes,
pode significar uma alternativa de uso sustentável dos recursos da floresta, assim como uma
fonte de obtenção de proteína animal por meio da criação de peixes com baixo custo.
Nas últimas três décadas, vasta área de florestas inundáveis tem sido maciçamente
devastada para atividades agropecuárias, o que põe em risco não apenas a diversidade da
flora amazônica, mas também provoca um impacto negativo na fauna, em particular na
ictiofauna, que depende da produtividade da floresta, assim como na população ribeirinha
que tem no peixe sua principal fonte de proteína animal (Waldhoff et al.,1996). Neste
aspecto, Maia (2001) destaca que as espécies descritas como itens alimentares na dieta de
peixes podem ser inseridas nos programas de recuperação ambiental e utilizadas na
regeneração de áreas inundáveis, restaurando a oferta de alimentos para a ictiofauna e
proporcionando o uso sustentável dos recursos das florestas inundáveis da Amazônia.
Estudos sobre conservação biológica têm sido restritos ao inventário e investigação
de ecossistemas utilizando ferramentas genéticas ou apenas à investigação de campo.
Entretanto, detectadas as principais espécies sob pressão antrópica, há que se considerar
alternativas para sua conservação. As atividades de recomposição de populações na natureza
a partir de populações artificiais devem ser acompanhadas de investigações sobre as
melhores práticas de criação dessas espécies para que a reintrodução no ambiente natural
tenha sucesso.
Esse é o caso de peixes super explorados na natureza como o tambaqui, cuja criação
em cativeiro já ultrapassou as barreiras regionais e os métodos convencionais de cultivo,
4
onde já se tem, como primeira preocupação, a queda de variabilidade genética de populações
artificiais (Almeida-Val, comunicação pessoal), assim como a precariedade com que as
mesmas são mantidas em cativeiro. Para fins de conservação, tais populações artificiais são
inviáveis. Assim, é necessário que se reestruturem as práticas de criação dessa espécie,
diversificando as procedências dos reprodutores, para aumentar as diversidades genéticas,
evitando o endocruzamento e todas as suas consequências. Além dessa diversificação é
recomendável o monitoramento com marcadores moleculares que permitam a identificação
das possíveis diversidades genéticas, além de propiciar o rastreamento dos indivíduos
produzidos.
A conservação do meio ambiente, aliada ao desenvolvimento econômico sustentável
vem a ser uma das principais razões que justificam trabalhos considerados periféricos para a
conservação biológica – periféricos, mas fundamentais para que se possa manter o equilíbrio
ecológico de um ecossistema.
Fontes alternativas de alimentos para a criação de peixes
Para a expansão da piscicultura e seu desenvolvimento tecnológico são necessários,
entre outros fatores, a produção de alevinos de qualidade superior e a formulação de
programas de nutrição adequada para as espécies criadas em cativeiro, dentro dos diferentes
sistemas de produção (Lovshin & Cyrino,1998).
Uma das principais dificuldades encontradas pelos criadores de peixes é a
disponibilidade de alimento de boa qualidade e baixo custo. As exigências nutricionais dos
peixes são um dos fatores econômicos mais importantes na pisicultura, uma vez que a
alimentação representa mais de 50% dos custos de produção (Pereira-Filho, 1995; Araújo-
Lima & Goulding, 1998). O custo da alimentação é o principal fator limitante para a
expansão do cultivo de peixes na Amazônia (Araújo-Lima & Goulding, 1998).
5
De acordo com Silva et al. (2003), frutos e sementes das florestas de igapó e várzea
são importantes fontes de alimentos para peixes. A diversidade de espécies vegetais na
floresta amazônica, aliada aos estudos sobre o hábito alimentar e necessidades nutricionais
de espécies de interesse comercial da região (Araújo-Lima & Goulding, 1998; Chagas &
Val, 2003) podem viabilizar a incorporação de frutos e sementes na alimentação de peixes,
barateando os custos da piscicultura.
Algumas tentativas vêm sendo realizadas no sentido de tornar menos onerosos os
gastos de produção, possibilitando que a atividade de pisicultura seja comercialmente mais
atrativa na região amazônica. Silva et al. (2007) destacam a necessidade de substituir os
ingredientes de origem animal da ração pelos de origem vegetal, como um meio de baratear
os custos, e apresentam como alternativa a substituição de ingredientes tradicionalmente
empregados nas rações por produtos regionais.
Roubach (1991) avaliou o uso de frutos e sementes de florestas inundáveis na
alimentação de tambaqui (Colossoma macropomum) e obteve melhor eficiência nutricional
com sementes de munguba (Pseudobombax mumguba) e frutos de arroz silvestre (Oriza
sativa), enquanto os menores índices foram obtidos com seringa (Hevea sp.) e embaúba
(Cecropia latiloba).
Mori-Pinedo (1993), utilizou a farinha de pupunha (Bactris gasipes) com 7,0% de
proteína bruta, em substituição a 55% do fubá de milho na ração para peixes e concluiu que
a pupunha pode substituir o milho, sem prejuízo para o desempenho dos peixes.
Silva et al. (2003) estudaram o efeito da incorporação dos frutos jauari (Astrocaryum
jauari) e embaúba (Cecropia sp.) e das sementes de munguba (Pseudobombax munguba) e
seringa barriguda (Hevea spruceana) em substituição a 55% do fubá de milho da ração
controle, na digestibilidade dos principais nutrientes e no tempo de passagem do alimento
pelo trato gastrointestinal do tambaqui (Colossoma macropomum). Destacaram que esses
6
itens podem ser utilizados como ingredientes alternativos em dietas práticas em substituição
a itens tradicionais de ração, como forma de contribuir para a diminuição de custos de
produção desta espécie em cativeiro.
Oliveira (2005) avaliou, por meio de análises fisiológicas e bioquímicas, o uso dos
frutos camu-camu (Myrciaria dubia), catoré (Crataeva benthami), embaúba (Cecropia
latiloba) e jauari (Astrocaryum jauari) e da semente de munguba (Pseudobombax munguba)
na alimentação de tambaqui (Colossoma macropomum), em substituição de 50% da ração
comercial e concluiu que todas as dietas testadas apresentam potencial para incorporação na
ração para alevinos de tambaqui.
Embora os resultados dessas pesquisas apontem para a perspectiva do uso de frutos e
sementes da região amazônica como meio de suplementar a ração para a criação de peixes, a
qualidade desses produtos deve continuar sendo investigada por metodologias específicas
para esse fim, uma vez que, para muitas espécies vegetais, ainda não foram avaliados os
principais constituintes químicos, tampouco seus efeitos fisiológicos nos animais que delas
se alimentam.
Araújo-Lima & Goulding (1998) destacam que os peixes que comem frutas não se
alimentam de todas as sementes que são abundantes e de tamanho apropriado pra serem
quebradas. Algumas espécies vegetais produzem muitas sementes por ano, mas são
ingeridas apenas ocasionalmente por esses animais.
Sementes de seringa (Hevea sp.) apresentam uma taxa de até 0,09% de ácido
prússico (ácido cianídrico), que pode ser inativado quando as sementes são processadas em
altas temperaturas, ou após armazenagem por um período de seis meses (Roubach, 1991).
Embora alguns autores descrevam o uso de frutos de plantas do gênero Bactris sp, como
item alimentar de várias espécies de peixes (Mori-Pinedo et al., 1999; Maia, 2001), a
pupunha (Bactris gasipaes), fonte alternativa de alimento para inclusão em ração para
7
peixes, apresenta uma enzima que inibe a digestão das proteínas e um ácido (provavelmente
oxálico) que irrita a mucosa bucal quando o fruto é usado “in natura”, necessitando ser
processado antes do uso (Mori-Pinedo et al.,1999).
Pinto et al. (2001) enfatizam que o tanino, polifenol presente em muitos vegetais
como soja, sorgo, canola, girassol, habitualmente usados na confecção de rações comerciais
afetam o valor nutricional dos alimentos, principalmente por se complexar com as proteínas
dietárias, com os carboidratos e com outras macromoléculas alimentares. Tais substâncias
também provocam a inibição da atividade de várias enzimas digestivas, a diminuição da
absorção de outros nutrientes na parede celular, devido à formação de complexos com íons
divalentes de metais, e a erosão de células epiteliais do intestino. Os mesmos autores
demonstraram que em piauçu (Leporinus macrocephalus) a presença de tanino na ração
prejudicou o metabolismo e o desempenho reprodutivo da espécie, diminuindo o valor
biológico dos nutrientes presentes nas rações e recomendaram valores inferiores a 0,46% de
taninos totais presentes na ração para a criação dessa espécie.
Outro aspecto que requer atenção é o fato de que os alimentos de origem vegetal são
menos digeríveis do que os de origem animal, visto que a composição estrutural e química
das paredes celulares das plantas inibe as enzimas hidrolíticas, podendo fazer com que o
metabolismo alimentar aumente, reprimindo o ganho energético dos animais (Araújo-Lima
& Goulding, 1998).
Por outro lado, frutos são fontes alimentares ricas em vitaminas e outros importantes
compostos com capacidades antioxidantes (Alceste & Jory, 2000). As vitaminas são
essenciais ao crescimento e metabolismo e, como normalmente não são sintetizadas em
quantidade suficiente pelos animais, são geralmente exigidas em quantidades variáveis a
partir da dieta, para a manutenção da função fisiológica normal (Almeida, 2003). Alguns
animais são capazes de sintentizar vitamina C ou L-ácido ascórbico a partir da D-glucose.
8
Porém, na grande maioria das espécies de peixes, entre eles o tambaqui (Colossoma
macropomun), a enzima responsável pela catalisação desta última etapa no fígado, a GLO
(L-gulono-1, 4-lactona oxidase) não tem atividade (Fracalossi et al., 1998) sendo, portanto,
necessária a suplementação dietária de vitamina C.
Na tentativa de atender a essa necessidade foram testadas várias rações suplementadas
com diferentes quantidades de vitaminas (Chagas, 2001; Mendes, 2001; Almeida, 2003;
Aride, 2003), que apresentaram boas respostas fisiológicas e de crescimento, mas tornaram
os custos de produção mais onerosos (Oliveira, 2005). Frutos tipicamente amazônicos como
o camu-camu (Myrciaria dubia) apresentam uma grande quantidade de ácido ascórbico,
podendo atingir 3.133 mg de vitamina C em 100 g de polpa integral (Yuyama et al, 2002)
proporcionando excelente potencial de incorporação à ração para peixes.
O uso de ingredientes regionais em ração tem se mostrado uma prática promissora
para os pequenos produtores da região amazônica. As análises dos benefícios dessa prática,
bem como da inserção de novos produtos (frutos, sementes, subprodutos da agroindústria)
devem continuar por meio de metodologias adequadas, buscando destacar seus benefícios,
superar suas deficiências e apresentar as alternativas necessárias para suprir as exigências
nutricionais dos peixes, considerando-se as diferenças entre as espécies cultivadas.
.
Aspectos da nutrição de peixes
Como animais pecilotérmicos, o metabolismo dos peixes é mais eficiente no
aproveitamento da energia dos alimentos para a sua termoregulação corporal. Gastam
menos energia para locomoção na água e economizam energia excreção dos resíduos
nitrogenados que são eliminados pelas brânquias sob a na forma de amônia, quando
comparados à uréia ou ácido úrico, eliminados pelos homeotermos terrestres (Takahashi,
2008)
.
9
As exigências nutricionais dos peixes variam de acordo com a espécie, fase de
desenvolvimento e sistema de criação. O tambaqui (C. macropomum), por exemplo, na
natureza, necessita alimentar-se de itens de composição variada para poder realizar um
balanceamento da sua dieta em termos dos principais nutrientes e energia para satisfazer
suas necessidades metabólicas (Silva et al., 2003). Em condições experimentais, Mori-
Pinedo et al. (1999), comprovaram que os níveis de proteína nas rações que variam entre
27,3 a 30,4% estão dentro dos níveis recomendados por diversos autores para atender as
necessidades fisiológicas do tambaqui. Goulding & Araújo-Lima (1998) estimaram que
tambaquis adultos mantêm uma dieta de 23 kJ/g de matéria seca consumida enquanto que
nos jovens o suprimento é de 19 a 20 kJ/g de matéria seca, e destacam que os adultos
necessitam de alimentos mais energéticos para contrabalancear seus altos custos
metabólicos.
Aspectos nutricionais têm demonstrado que qualquer dieta que vise proporcionar o
crescimento precisa incluir os nutrientes que o animal precisa, tais como proteína,
carboidrato, gorduras, vitaminas e minerais (Pereira-Filho, 1995). A nutrição influencia o
comportamento, a integridade estrutural, a saúde, as funções fisiológicas, a reprodução e o
crescimento dos peixes. Assim, estudos em nutrição se baseiam na capacidade do animal em
aproveitar o alimento e na sua resposta metabólica frente à variação dos nutrientes da dieta
(Suares et al., 1995), além de avaliar a influência de fatores que possam atuar no
aproveitamento desses nutrientes.
Tanto o excesso quanto a deficiência em energia na dieta dos peixes podem reduzir
as taxas de crescimento. Para Lovell (1988), a energia dos alimentos é utilizada
primeiramente para satisfazer as necessidades energéticas de manutenção e atividades
voluntárias (metabolismo basal) e depois é que estas estarão disponíveis para o crescimento.
10
Os peixes regulam o consumo de ração pela ingestão energética. Uma ração
deficiente em energia provocará maior ingestão alimentar, e, na falta de nutrientes
energéticos (carboidratos e lipídeos), a proteína será convertida em energia para
manutenção, antes de ser utilizada para crescimento. Por outro lado, uma ração com excesso
de energia limita a ingestão de alimento e consequentemente diminui a ingestão de proteína
(aminoácidos), vitaminas e minerais (Sperandio, 2008).
Altos níveis de proteínas nos alimentos resultam em um aumento nas concentrações
de aminoácidos livres circulantes, na excreção de amônia, na síntese protéica, na atividade
de enzimas gliconeogênicas e provocam o declínio das atividades das enzimas glicolíticas
(Almeida, 2006). As vitaminas, que são compostos essenciais ao crescimento e metabolismo
animal, não são sintetizadas em quantidades suficientes, sendo exigidas em quantidades
variáveis a partir das dietas para a manutenção das funções fisiológicas normais.
Deficiências de vitaminas podem gerar alterações morfológicas e fisiológicas nos peixes,
geralmente pouco específicas, como a redução de apetite, menor taxa de crescimento,
anemia, letargia, pigmentação anormal e maior suscetibilidade a doenças (Almeida, 2003).
A ausência de vitamina C, em particular, na dieta de peixes pode ocasionar, inclusive, más
formações ósseas, causando danos severos à saúde e bem estar do animal ( Sttefens, 1989).
A avaliação da sanidade pode indicar se as condições nutricionais estão adequadas
ao bom desenvolvimento fisiológico dos animais. A qualidade e a quantidade de alimentos
têm efeitos significantes sobre a fisiologia, interferindo nas variáveis hematológicas, e isso
ocorre principalmente em peixes mantidos em cativeiro (Fagbenro, et al., 2000; Tavares-
Dias & Moraes, 2004).
As características bioquímicas, metabólicas e hematológicas podem ser utilizadas na
avaliação do estresse causado por mudanças ambientais. Desta forma, a análise do quadro
11
hematológico pode ser utilizada como diagnóstico auxiliar para detectar variações
produzidas por agentes estressantes em peixes (Tavares-Dias & Moraes, 2004).
Além dos parâmetros sanguíneos, a determinação de atividades enzimáticas em
outros tecidos pode ser realizada com o propósito de avaliar o estado fisiológico do animal
como um todo, assim como a sua resposta adaptativa em função das variações metabólicas
impostas, quer seja por estresse ambiental e/ou confinamento, ou nutricional, em função do
arraçoamento ou disponibilidade de alimento (Lundsteadt, 2003).
A análise das atividades de enzimas antioxidantes como a catalase (CAT) e a
superóxido dismutase (SOD), que catalisam a redução das espécies reativas do oxigênio
(ERO) no meio intracelular (Scandalios, 2005), pode ser usada como indicador para avaliar
o estresse oxidativo causado por diferentes condições nutricionais (Pascual et al., 2003).
Os efeitos estressantes que algumas substâncias provocam no metabolismo animal
incluem, também, mudanças na expressão gênica e tais mudanças são geralmente produzidas
pela alteração nos níveis normais do RNA mensageiro (mRNA) desses genes. O caminho
tradicional para analisar essas mudanças tem sido o uso de técnicas de hibridização
diferencial para mRNA, que é unicamente expresso ou suprimido nos tratamentos ou
doenças celulares. Entre os métodos mais usados está a técnica da expressão diferencial de
genes (“Differential Display PCR”- DD-PCR) (Rhodes & Van Beneden, 1996).
A técnica do DD-PCR tem sido usada com sucesso para detectar mudanças nos
níveis de mRNA provocadas por diferentes níveis de estresse, tais como os provocados por
agentes tóxicos (Rhodes & Van Beneden, 1996), por exposição crônica ao manejo
estressante (Picard & Schulte, 2003), por aumento de densidade populacional em
piscicultura (Gornati et al., 2004). Também pode ser usada para detectar genes que têm sua
expressão modificada em resposta às alterações nos níveis de componentes básicos da dieta
12
de peixes, assim como a presença de agentes prejudiciais ao metabolismo desses animais nas
rações formuladas com alimentos alternativos.
A espécie animal e os frutos
O peixe
Colossoma macropomum (tambaqui) é uma espécie que pertence à família
Serrasalmidae, encontrada nos rios Amazonas, Orinoco e seus afluentes (Goulding,1980).
No meio natural pode alcançar de 90 a 100 cm de comprimento e peso máximo de
aproximadamente 30 Kg (Araújo-Lima & Goulding, 1998) e, em condições adequadas de
cultivo em climas quentes, podem atingir até 1,4 Kg em um ano (IBAMA, 1989).
É uma espécie rústica e tolera baixos teores de oxigênio dissolvido na água,
apresentando adaptações morfo-anatômicas destinadas a capturar o oxigênio disponível na
camada d’água superficial (Val & Almeida-Val, 1995), porém sua maior limitação consiste
na baixa tolerância ao frio e a mudanças bruscas de temperatura; com a temperatura da água
abaixo de 20°C seu crescimento é irrisório, ocorrendo mortalidade aos 15°C (IBAMA,
1989).
Silva (1996) descreve o tambaqui (C. macropomum) como tipicamente onívoro,
aproveitando-se de nutrientes dos alimentos de origem vegetal e animal. A alimentação
básica da espécie sofre variações sazonais: produtos alóctones no período de inundação da
floresta, principalmente frutos e sementes e produtos de origem autóctone, no período da
seca. O padrão de consumo dos frutos e sementes pelo tambaqui é muito variável, sendo
encontrado no trato digestivo de um mesmo espécime frutos inteiros e/ou triturados, pedaços
de mesocarpo e sementes inteiras e/ou trituradas.
Essa espécie é considerada dispersora de várias espécies vegetais tais como os frutos
de embaúba (Cecropia latiloba) e cachinguba (Ficus sp.) que passam intactos pelo trato
13
gastrointestinal sem, apresentar indícios de aproveitamento dos nutrientes neles contidos
(Silva, 1996).
Embora se alimente de várias espécies de frutos, o tambaqui apresenta característica
oportunista. Silva (1996) demonstrou a ocorrência de grandes quantidades de apenas um
fruto ou semente, principalmente o jauari (Astrocarium jauari) e a seringa-barriguda (Hevea
spruceana) no conteúdo estomacal dos peixes que analisou. Mesquita-Saad (2001) analisou
o conteúdo de vitamina C no músculo de tambaquis coletados em diferentes períodos do ano
e descreveu um aumento de vitamina C em animais cujo conteúdo estomacal era
predominantemente composto por frutos.
É uma espécie com excelente potencial para cultivo, já que apresenta um bom
crescimento, hábito gregário, resistência a baixos níveis de oxigênio dissolvido e excelente
capacidade de aproveitamento de vários tipos de alimentos disponíveis nos viveiros (Saint
Paul, 1986). Tem alto valor comercial e é muito apreciada pelo consumidor da região
amazônica.
A sobre-exploração dos estoques na Amazônia Central levou o IBAMA a colocar o
tambaqui na lista de espécies protegidas durante o período de defeso (período de piracema
ou reprodução natural) para ajudar na recuperação do estoque (Graef, 1995).
14
Os frutos
Os frutos e as sementes utilizados neste trabalho são os mesmos definidos no projeto
“Frutos da Amazônia na Alimentação de Peixes”, Edital MCT/CNPq/SEAP-PR/CT-
Agronegócio 02/2003, coordenado pelo Dr. Adalberto Luís Val, os quais foram selecionados
com base na preferência alimentar e teor de vitamina-C, antioxidante importante na proteção
de animais sob estresse, o que já vem sendo comprovado por diversos estudos realizados
pelo grupo (Chagas, 2001; Mesquita-Saad, 2001).
São eles: camu-camu (Myrciaria dúbia - Myrtaceae), catoré (Crataeva benthamii -
Capparidaceae), embaúba (Cecropia latiloba – Cecropiaceae), jauari (Astrocarium jauari -
Arecaceae) e munguba (Pseudobombax munguba - Bombacacae).
•
Camu-camu (Myrciaria dúbia - Myrtaceae)
O camu-camu é uma espécie de porte arbustivo, que pode ser encontrada nas
margens dos rios e lagos da bacia amazônica (Villachica, 1996). A frutificação tem maior
intensidade nos meses de maio a julho (Maués & Couturier, 2002). O fruto é formado por
uma baga esférica, lisa e brilhante, de coloração vermelho-arroxeada, com alto teor de ácido
ascórbico (Villachica, 1996). A dispersão das sementes é endozoocórica, feita
principalmente por peixes como o tambaqui e pela própria correnteza dos cursos dos rios
(Maués & Couturier, 2002).
É uma árvore com grande produtividade; Myrciaria dubia com stand de 8.714
árvores/ha produz entre 9.500 e 12.600 Kg de frutos por ha/ano (Waldhoff & Maia, 2000).
Os frutos apresentam alto teor de ácido ascórbico, cerca de 2.800 mg. 100g
-1
, o que faz com
que haja um mercado promissor para o camu-camu no país e no exterior (Maués &
Couturier, 2002).
15
•
Catoré (Crataeva benthamii - Capparidaceae)
O fruto, também apreciado pelos tambaquis (Silva, 1977), é uma baga globosa com
semente dura e lenhosa, que contém 12,9% de óleo viscoso e amarelo de aroma fortemente
desagradável (Correa, 1984). É encontrada nas várzeas da região amazônica (Correa, 1984).
O período de frutificação inicia-se em outubro e os frutos amadurecem nos meses de
abril a junho. É uma árvore com alta produtividade de frutos em áreas de várzea, com
produção média de 2.362 Kg/ha (Waldhoff & Maia, 2000).
Seus frutos são consumidos por peixes como o bacu (Lithodoras sp.), matrinxã
(Brycon cepahlus), pacu (Metynnis sp., Mylesinus sp., Myleus sp., Mylossoma sp.),
pirapitinga (Piaractus brachypomus), sardinha (Triportheus elongotus, Triportheus sp.) e
tambaqui (Colossoma macropomum) ( Maia, 2001).
•
Embaúba (Cecropia sp – Cecropiaceae)
A embaúba tem distribuição geográfica ao longo das florestas inundáveis pelos rios
de água-branca na Amazônia brasileira, Peru, Colômbia, Venezuela e Guianas (Parolim,
2002). Floresce no início do período de cheia, de fevereiro a abril. Os frutos estão presentes
de março a julho, porém a maturação ocorre no final do período das águas, em julho e
agosto (Parolim, 2002). Quando maduros, frutos inteiros ou partes de frutos com sementes
que caem nos rios são dispersos pela água e pelos peixes, particularmente por Brycon sp.
(matrinchã), Cichlasoma sp. (cará), Colossoma macropomum (tambaqui), Lithodoras
dorsalis (bacú-pedra), Mylossoma sp (pacu), e Triportheus sp. (sardinha) (Goulding, 1980;
Roubach, 1991).
16
•
Jauari (Astrocarium jauari - Arecaceae)
O jauari é uma palmeira nativa da margem dos grandes rios da Amazônia Ocidental
brasileira (Lorenzi & Mello Filho, 2001). Floresce de julho a dezembro e frutifica de
setembro a julho, sendo o pico de frutificação entre abril e junho (Maia, 2001).
Os frutos são globosos, lisos, de 2,5-3,5 cm de diâmetro, de cor amarela ou
alaranjada quando maduros (Lorenzi, 1996; Lorenzi, & Mello Filho, 2001) e servem de isca
para pescaria, mas não são comestíveis pelo homem (Correa, 1984).
A produção anual de frutos chega a 1,7 toneladas ano/ha nas florestas inundadas da
Amazônia (Waldhoff et al, 1996) e são muito consumidos por tambaquis (Araújo-Lima &
Goulding, 1998; Silva et al, 2000; Waldhoff & Maia, 2000).
•
Munguba (Pseudobombax munguba - Bombacacae)
O fruto conhecido como munguba é formado por uma cápsula de 13cm de
comprimento por 6-8 cm de diâmetro, de formato elíptico, apresentando sementes globosas,
envolvidas por uma paina amarelo-escura. É encontrada nos terrenos argilosos,
periodicamente inundáveis, no estado do Amazonas, sobretudo na região do Baixo
Amazonas, e no Pará (Loureiro & Silva, 1968). Floresce de abril a junho e frutifica entre
maio e agosto (Maia, 2001).
OBJETIVO
Embora estudos realizados nas últimas décadas considerem o potencial de uso dos
frutos e sementes como fonte de alimento na piscicultura intensiva na Amazônia de peixes
como o tambaqui (Pereira-Filho, 1995; Silva, 1996; Araújo-Lima & Goulding, 1998) é
preciso considerar que a presença de fatores anti-nutricionais pode limitar a inclusão de
alguns produtos de origem vegetal em sua dietas (Francis et al., 2001).
17
Desta forma, o objetivo deste trabalho é avaliar, em nível fisiológico e molecular, os
efeitos da incorporação de cinco frutos e sementes encontrados em florestas inundadas da
Amazônia, na alimentação do tambaqui (Colossoma macropomum).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Averiguar as possíveis mudanças fisiológicas e bioquímicas de tambaquis
(Colossoma macropomum) alimentados com ração suplementadas com os cinco
frutos e sementes de florestas inundadas da Amazônia.
Verificar a ocorrência de quebras do material genético presente no núcleo das células
sanguíneas de tambaquis alimentados com as rações suplemantadas com os frutos e
sementes de florestas inundadas da Amazônia.
Verificar as possíveis mudanças na expressão gênica causadas pela incorporação dos
frutos e sementes na alimentação do tambaqui (Colossoma macropomum).
Sequenciar e identificar os genes de tambaqui (Colossoma macropomum) que
tiveram a expressão modificada pela incorporação dos frutos e sementes em sua
alimentação.
18
HIPÓTESE
Este trabalho tem as seguintes hipóteses:
H0 – As mudanças na expressão gênica em peixes alimentados com rações suplementadas
com os frutos e sementes descritos neste trabalho não estão relacionadas a genes de
desintoxicação ou antioxidantes.
H1 - As mudanças na expressão gênica em peixes alimentados com rações suplementadas
com os frutos e sementes descritos neste trabalho estão relacionadas a genes de
desintoxicação ou antioxidantes.
19
CAPÍTULO I
PERFIL HEMATOLÓGICO, BIOQUÍMICO E CITOGENOTÓXICO DE
TAMBAQUIS (Colossoma macropomum Cuvier, 1818) ALIMENTADOS
COM RAÇÃO SUPLEMENTADAS COM FRUTOS E SEMENTES DA
AMAZÔNIA.
RESUMO
A introdução de frutos e sementes regionais na formulação de rações para peixes é
uma alternativa viável para baratear custos da produção, proporcionando um crescimento
satisfatório dos animais. Porém, a presença de fatores antinutricionais pode limitar a
inclusão de certos produtos vegetais na dieta desses peixes. Este trabalho teve como objetivo
analisar o perfil hematológico, enzimático e citogenotóxico de tambaquis (Colossoma
macropomum) alimentados com rações suplementadas com cinco diferentes frutos e
sementes da floresta Amazônica, submetidos a um período posterior de privação alimentar.
Os resultados demonstraram que os frutos camu-camu (Myrciaria dúbia), catoré (Crataeva
benthamii), embaúba (Cecropia latiloba), munguba (Pseudobombax munguba) e jauari
(Astrocarium jauari) não provocaram alterações metabólicas, enzimáticas e citogenotóxicas
nos peixes, durante os períodos de alimentação testados. Entretanto, foi possível verificar
diferenças significativas sobre esses parâmetros em função do período de alimentação e da
privação alimentar a qual os peixes foram submetidos.
20
HEMATOLOGICAL, BIOCHEMICAL AND CYTOGENOTOXIC PROFILE
OF TAMBAQUI (Colossoma macropomum Cuvier, 1818) FED WITH
SUPLEMENTED RATIONS OF AMAZONIAN FRUITS AND SEED.
ABSTRACT
The introduction of regional fruits and seeds in the formulation of rations for fish is a viable
alternative to reduce costs of production providing satisfactory animal growth rate.
However, the presence of non nutritional factors can limit the inclusion of some vegetable
products in fish diets. This work analyzed the hematological, enzymatic and cytogenotoxic
profile of tambaquis (Colossoma macropomum) fed with supplemented rations with five
different Amazonian fruits and seeds, submitted to a posterior periods of food deprivation.
At the end of the experiments we could observe that camu-camu (Myrciaria dubia), catoré
(Crataeva benthamii), embaúba (Cecropia latiloba), munguba (Pseudobombax munguba)
and jauari (Astrocarium jauari) fruits did not affect metabolic, enzymatic and cytogenotoxic
alterations in the fishes, during the tested feeding periods. However, we could detect
significant differences on these parameters in feeding period and food deprivation to which
fishes were submitted.
21
INTRODUÇÃO
O tambaqui (Colossoma macropomum) é o maior peixe characiforme da Bacia
Amazônica, alcançando porte máximo de 100 cm e até 30 Kg de peso, com ampla
distribuição na América do Sul (Araújo-Lima & Goulding, 1998). Na natureza, tem hábito
alimentar onívoro, porém sua alimentação sofre variações sazonais e no período da cheia
passa a se alimentar exclusivamente de frutos e sementes (Silva, 1996). Mais de 100
espécies de árvores produzem frutos e sementes consumidos pelo tambaqui durante a
enchente dos rios (Silva et al., 2003).
É uma das espécies que possui alto valor comercial e grande importância econômica
e social na Amazônia, destacando-se por ser um peixe apropriado para aqüicultura, pois se
adapta ao confinamento e arraçoamento. Entretanto, nos atuais modelos de cultivo adotados,
os custos com alimentação são relativamente altos, representando o maior percentual dos
custos operacionais (Silva et. al, 2007) e o maior obstáculo para sua criação.
Uma das alternativas para baratear custos de criação do tambaqui seria o uso de
ingredientes regionais introduzidos nas formulações das rações (Pereira-Filho, 1995) e para
isso, as dietas artificiais devem ser formuladas com base em estudos sobre a alimentação
natural da espécie, já que estes revelam as exigências nutricionais no ambiente natural,
sugerindo assim quais nutrientes devem ser incorporados em sua dieta na piscicultura
(Goulding, 1993; Pereira-Filho, 1995).
A adição de produtos de origem vegetal em substituição a ingredientes da ração já é
uma prática que vem sendo estudada (Silva, 1996; Mori-Pinedo, 1999), indicando que a
suplementação de frutos regionais na ração de peixes pode apresentar resultados satisfatórios
de crescimento (Roubach, 1991; Mori-Pinedo, 1993; Oliveira, 2005). Porém, a presença de
fatores anti-nutricionais pode limitar a inclusão de alguns produtos vegetais em dietas, além
22
das proteínas de origem vegetal serem geralmente deficientes em determinados aminoácidos
essenciais (Francis et al., 2001).
Em estudo de nutrição não basta apenas o conhecimento dos itens que o animal
consome, nem dos teores de nutrientes e energia, mas é necessário que se tenha a idéia dos
níveis de aproveitamento pela espécie (Silva et al, 2003) e seus efeitos metabólicos, para
que se possa subsidiar com informações mais precisas a elaboração de dietas que
efetivamente proporcionem o máximo aproveitamento nutricional.
O estado nutricional dos peixes é o que determina seu crescimento e sua resposta a
diferentes modificações ambientais (Baldisseroto, 2004) e o estresse é o principal indicador
para se avaliar o bem estar animal (Moberg, 2000), já que demonstra os ajustes fisiológicos
desenvolvido pelos animais quando sua homeostase está ameaçada em função dos aspectos
adversos de manejo, alimentação ou mudanças ambientais. Entre os fatores estressantes mais
estudados para peixes estão a hipóxia, a temperatura, a velocidade crítica de natação e
também a privação alimentar (Carvalho, 1998; Adhan et al., 2000; Chagas, 2001; Oliveira et
al., 2001; Ogata et al., 2002; MacFarlane et al., 2004).
Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo analisar o perfil hematológico,
enzimático e citogenotóxico do tambaqui alimentado com rações suplementadas com cinco
diferentes frutos e sementes da floresta Amazônica, submetidos a posterior período de
privação alimentar.
23
MATERIAL E MÉTODOS
OBTENÇÃO E ACLIMATAÇÃO DOS PEIXES
Alevinos de tambaqui provenientes da piscicultura da fazenda Santo Antônio,
localizada no município de Rio Preto da Eva – AM, foram transportados para o Laboratório
de Ecofisiologia e Evolução Molecular – LEEM do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia - INPA, onde foram aclimatados em tanques com capacidade de 500 L, com
aeração constante e renovação de água até atingirem o tamanho médio de 10 cm . Durante
este período os peixes foram alimentados duas vezes ao dia com ração comercial com 36%
de proteína bruta até a saciedade aparente.
COLETA E ARMAZENAMENTO DOS FRUTOS
Para a realização deste trabalho foram utilizados os frutos camu-camu (Myrciaria
dúbia), catoré (Crataeva benthamii), embaúba (Cecropia latiloba), munguba
(Pseudobombax munguba) e jauari (Astrocarium jauari).
Os frutos catoré, embaúba e jauari foram coletados manualmente no Lago do Catalão
– AM, situado a 3º 09' 47" S e 059º 54' 29" W, pela bolsista de DTI do LEEM/INPA, MSc
Alzira M. de Oliveira, armazenados em sacos plásticos previamente identificados, mantidos
no gelo e transportados para o laboratório. As sementes de munguba, já processadas para a
retirada da paina, foram doadas pelo Laboratório de Nutrição de Peixes da Coordenação de
Pesquisa em Aqüicultura - CPAQ/INPA. Os frutos camu-camu foram adquiridos
comercialmente. Todos os frutos e sementes foram armazenados em sacos plásticos e
mantidos em freezer -20˚C até o momento da elaboração das rações.
24
ELABORAÇÃO DAS RAÇÕES
Os frutos inteiros de embaúba, camu-camu, catoré e a polpa do jauari foram cortados
e moídos em moedor de carne elétrico. As sementes de munguba foram apenas moídas. Em
seguida, cada produto da moagem foi misturado individualmente com ração comercial (36%
de proteína) previamente moída, na proporção de 1:1 (produto de fruto:ração) Cada mistura
foi repeletizada e colocada para secar em estufa a 55˚C durante 12 horas. Após este período
a ração foi armazenada em sacos plásticos, em pequenas porções etiquetadas e mantidas
congeladas em freezer -20˚C. A composição centesimal dos frutos e da semente é mostrada
na Tabela 1.
Para a ração controle, a ração comercial (36% de proteína) foi moída, repeletizada e
seca em estufa nas mesmas condições realizadas para as rações experimentais. A
bromatologia das rações experimentais e da ração controle é mostrada na Tabela 2.
Tabela 1. Composição centesimal (% da MS) e valor energético (EB KJg MS) dos frutos e
sementes consumidos pelo tambaqui (C. macropomum).
Nome vulgar/Espécie Umidade
(%)
PB
(%)
EE
(%)
EEN
(%)
FB
(%)
MM
(%)
EB
(kJ/g)
Camu-camu (Myrciaria dúbia)
91,7 3,9 7,2 55,5 20,4 1,9 16,0
Catoré (Crataeva benthamii)
63,2 8,6 6,1 45,5 31,4 5,3 18,3
Embaúba (Cecropia latloba)
75,0 10,7 10,5 39,6 28,5 4,2 20,4
Jauari (Astrocarium jauari)
46,6 5,1 11,0 45,6 32,5 2,4 20,3
Munguba
(Pseudobombax munguba)
60,0 29,9 34,7 15,8 8,6 5,1 23,0
MS – Materia Seca; PB – Proteína Bruta; EE – Extrato Etéreo; EEN – Extrativo não nitrogenado; FB – Fibra
Bruta; MM – Material Mineral ; EB –Energia Bruta. Fonte: Silva et. al (2000)
25
Tabela 2. Composição centesimal (% da MS) das rações controle e experimentais utilizadas
neste trabalho
Tratamento Umidade(%)
PB (%) EE (%) MM(%) ENN+FB(%)
Controle 8,2 34,1 3 12 42,7
Camu-camu 5,8 36,3 5,6 9,7 42,6
Catoré 10,2 26,9 3,3 10,7 48,9
Embaúba 7,3 27,1 3,5 11,7 50,4
Jauari 7,7 25,9 3,7 10,9 51,8
Munguba 6 29,3 8,5 11,4 44,8
MS – Materia Seca; PB – Proteína Bruta; EE – Extrato Etéreo; EEN – Extrato não nitrogenado; FB – Fibra Bruta; MM –
Material Mineral . Análise realizada pelo Laboratório de Nutrição de Peixes – CPAQ/INPA
DESENHO EXPERIMENTAL
Foram utilizados 240 juvenis de tambaquis com peso médio de 57,1 + 2,8 g e
comprimento padrão médio de 11,9 + 0,2 cm.
Os juvenis de tambaquis foram distribuídos em 24 aquários de 310 L, preenchidos
com 80 L de água, providos de aeração e renovação de água constantes. Foi usado
delineamento experimental inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3 x 6, constituído
por 3 períodos de alimentação (1, 15 e 30 dias) e 6 tratamentos, sendo um controle e cinco
diferentes frutos da Amazônia misturados na proporção de 1:1 a uma ração comercial, com
quatro repetições cada, totalizando 24 unidades experimentais, onde cada unidade
experimental foi composta por um aquário com 10 juvenis. A fase de adaptação durou duas
semanas e nesse período os peixes foram alimentados com a dieta controle, fornecidas duas
vezes ao dia ad libitum .
O experimento teve a duração de 30 dias. Neste período os peixes foram alimentados
com as rações experimentais (grupo tratamentos) e com a ração controle (grupo controle),
duas vezes ao dia ad libitum. Durante o período experimental foi retirado um peixe de cada
26
aquário após o 1˚ dia, 15˚ dia e 30˚ dia de alimentação. Esses animais foram anestesiados,
medidos e pesados e levados para a coleta de sangue e tecido.
A retirada de peixes durante todos os períodos experimentais foram aleatórias. Os
peixes capturados não foram escolhidos e eram retirados ao acaso, independente do
tamanho, peso ou velocidade de natação
Após a realização do experimento, os peixes que permaneceram nas unidades
experimentais, foram submetidos a um período de 21 dias de privação alimentar. Em
seguida, um peixe de cada unidade experimental foi anestesiado, medido e pesado, e levado
para a coleta de sangue e tecido.
De cada animal utilizado nesse experimento, foi retirado sangue, por punção da veia
caudal com seringas heparinizadas e o fígado, que foi acondicionado em tubos eppendorf®
estéreis, colocado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer -80˚C até o momento das
análises.
VARIÁVEIS FISICO-QUÍMICAS DA ÁGUA
Os parâmetros de qualidade de água como temperatura, pH e oxigênio dissolvido
foram monitorados diariamente. Os valores de temperatura e oxigênio dissolvido foram
obtidos com o termo-oximetro YSI modelo 55/12 FT e o pH através de um pHmetro
Micronal B374.
ANÁLISE DE CRESCIMENTO
As medidas de peso e comprimento padrão foram realizadas em todos os exemplares
de tambaqui (C. macropomum) no início do experimento, em balança semi-analítica com
precisão de 0,01g e ictiômetro com precisão de 1 mm . Ao final do período experimental os
peixes retirados das unidades experimentais foram também pesados e medidos.
Com os dados de peso inicial (obtidos no início do experimento) e de peso final
(obtidos após 30 dias de alimentação) foram calculados os seguintes bio-índices:
27
Ganho de Peso (g) = (peso final – peso inicial)
Crescimento Específico= (ln do peso final – ln do peso inicial/tempo de alimentação)x100
Incremento de Peso (%) = 100 x (peso final – peso inicial)/peso inicial
Eficiência de Crescimento= (peso final – peso inicial)/peso seco do alimento consumido
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
Para as análises hematológicas, os peixes foram anestesiados com MS 222 e as
amostras de sangue coletadas por punção da veia caudal com seringas previamente
heparinizadas. Para a separação do plasma, o sangue foi transferido para tubos eppendorf®,
mantidos no gelo e centrifugados a 2500 rpm por 5 minutos.
Para evitar possíveis interferências da luminosidade no sangue utilizado para a
confecção das lâminas do Teste Cometa, todo o processo de coleta de sangue foi realizado
sem iluminação direta.
1. HEMATÓCRITO (Ht)
A porcentagem de células vermelhas do sangue foi determinada pela técnica de
centrifugação do microhematócrito (Collier, 1944). As amostras de sangue foram
transferidas de seringas heparinizadas para os tubos de microhematócritos selados com fogo
e centrifugadas a 12000 rpm por 10 minutos (centrífuga FANEM 211). As leituras dos
valores de hematócrito foram realizadas em cartão de leitura de hematócrito da Sociedade
Brasileira de Análises Clínicas e os valores expressos em %.
2. CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA ([HB])
A concentração de Hemoglobina foi determinada pelo método da
cianometahemoglobina (Kampen & Zijlstra, 1964) que consiste na diluição de 10µl de
sangue em 2ml da solução de Drabkin (KCN 0,5g; KH2PO4 14g; K3[Fe(CN)6] 2,0 g em
1000ml de água destilada). Após a diluição, os tubos permaneceram em repouso por 10
minutos, para a efetivação da hemólise.
28
A absorbância das amostras foi determinada em comprimento de onda de 540nm, em
um espectrofotômetro Genesys 2 (Spectronic Instruments Inc.), utilizando a solução de
Drabkin como “branco”. Os valores da concentração de hemoglobina, expressos em g/dL,
foram obtidos por meio da seguinte fórmula:
[Hb] (g/dL) = ABS (540nm) x 0,146 x diluição da amostra
Onde: ABS (540nm) = valor da leitura na absorbância de 540nm
0,146 = fator de correção
3. CONTAGEM DE ERITRÓCITOS CIRCULANTES (RBC)
Para se determinar o número de células vermelhas (RBC), o sangue foi diluído em
solução de formol citrato (3,8 g de citrato de sódio; 2,0ml de formol 40% e água destilada
q.s.p. 100ml), na proporção de 1:200 (v/v). A contagem de eritrócitos foi realizada na
câmara de Neubauer em objetiva de 40X de um microscópio óptico Motic B5 Professional.
Os resultados estão apresentados em números de eritrócitos/mm
3
.
4. DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CORPUSCULARES
As constantes corpusculares foram calculadas de acordo com as fórmulas
estabelecidas por Brow (1976), que levam em consideração o valor do hematócrito, a
concentração de hemoglobina e o número de eritrócitos circulantes, conforme descrito
abaixo:
a) Volume corpuscular médio (VCM - µm3) = Ht x 10/RBC;
b) Hemoglobina corpuscular média (HCM - µg) = [Hb] x 10/RBC;
c) Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM - %) = [Hb] x 100/Ht.
29
5. CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE
A concentração de glicose foi determinada por meio de medidor eletrônico de
glicose sanguínea (Accu-Chek Advantage II). Onde, 10 µL de sangue foram aplicados na
fita de leitura de glicose, que foi inserida no aparelho. Análise eletroquímica realizada na
amostra forneceu o valor da concentração da glicose em g/dL.
`
ANÁLISE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
1. PREPARAÇÃO DOS HOMOGENADOS
Para a avaliação das atividades enzimáticas foi preparado um homogenado do fígado
com tampão de homogenização (TRIS 20mM, EDTA 1mM, DDT 1mM, Sacarose 0,5 M,
KCl 0,15M e PMSF 0,1mM) numa proporção de 1:4 (tecido: tampão), utilizando um
homogenizador Tissue Tearor (modelo 9985370). O homogeneizado foi centrifugado
durante 20 minutos a 10.000 x g em uma centrífuga refrigerada modelo MPW-350R (MPW
– Med. Instruments a uma temperatura de 4°C. O sobrenadante foi separado para a análise
de atividade enzimática e de proteínas.
2. ATIVIDADE DA CATALASE
Para determinar atividade da catalase, 10 µL do homogenado foi diluído em 990 µL
de tampão TE (TRIS HCl 1M e EDTA mM) com peróxido de hidrogênio 10mM,
homogeneizado por inversão e lido em espectofotômetro Spectronic Gênesis 2, em
comprimento de onda de 240 nm. Como a atividade da catalase é medida por meio da
avaliação contínua do decréscimo da concentração do peróxido de hidrogênio, foram
realizadas leituras nos tempos 0 e 15 segundos e os resultados expressos em µmol.min
-1
.mg
de proteína
-1
.
K
m
= 2,3 ∆t = 15 segundos
30
3. ATIVIDADE DA GLUTATIONA-S-TRANSFERASE
A atividade da glutationa S-transferase (GST) foi determinada de acordo com o
método cinético descrito por Habig et al. (1974), que utiliza tampão fosfato (pH 7,0), 1mM
de GST e 1mM de CDNB (1-cloro-2, 4- dinitrobenzeno). O aumento linear da absorvância a
340 nm foi monitorado e a atividade foi expressa em µmoles de conjugado GSH-CDNB
produzido por minuto por mg de proteína (µmoles.min
-1
mg de proteína
-1
) usando-se o
coeficiente de extinção de 9,6 mmolar/cm. As leituras foram realizadas em um
espectrofotômetro Spectronic Gênesis 2.
4. ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS
A concentração de proteínas totais foi determinada usando o Kit comercial Doles.
Para isso, 2,5 mL do reagente de biureto foram misturados a 50 µL de homogenado. Para a
solução padrão, 2,5mL de reagente de biureto foram misturados a 50µL de padrão (Kit). As
soluções foram homogenadas e deixadas em repouso por 5 minutos. Em seguida, foram
lidas em um espectrofotômetro Spectronic Gênesis 2, em comprimento de onda de 550nm e
os resultados expressos em g/dL.
Cálculo do fator = 4 .
Absorbância do padrão
Concentração de proteínas totais = Absorbância da amostra x fator
EFEITO CITOTÓXICOS E GENOTÓXICOS
1. CONCENTRAÇÃO DOS NÍVEIS ENDÓGENOS DE PRODUTOS CELULARES
OXIDADOS (TBARS)
A concentração dos níveis endógenos de produtos celulares oxidados foi
determinada através do método descrito por Ohkawa (1979), onde 100µL de plasma foram
31
diluídos em 0,89 mL de tampão Tris-HCl 60mM, pH 7,4; 1,0 mL de ácido tricloroacético
(TCA) 30% e 1,0 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,73%. As amostras foram agitadas e
colocadas em banho-maria (100º C) por uma hora, resfriadas, centrifugadas e lidas em um
espectrofotômetro em comprimento de onda de 535nm. A concentração dos produtos
celulares foi expressa em nmoles/mL de plasma.
2. ANORMALIDADES NUCLEARES ERITROCÍTICAS (ANE)
Para a detecção das anormalidades nucleares eritrocíticas foi feito um esfregaço com
sangue e as lâminas foram deixadas para secar por 24 horas. Em seguida, as preparações
foram coradas com solução May-Grünwald por dois minutos e com solução May-Grünwald
e água destilada na proporção 1:1 por 10 minutos. Após esse período, as lâminas foram
coradas com solução de Giemsa e água destilada na proporção de 1:6 durante 10 minutos,
lavadas e secas em temperatura ambiente. Foram contadas 1000 células por lâmina, com
auxílio de um microscópio óptico Motic B5 Professional, sendo consideradas as seguintes
lesões nucleares: micronúcelo (M), núcleo lobado (L), núcleo segmentado (S) e núcleo em
forma de rim (K). Os resultados para a detecção foram dados como uma média (%) das
somas (M+L+S+K) de todas as lesões observadas.
3. TESTE COMETA
Para a análise do teste cometa, aproximadamente 10 µl de sangue foram misturados
em 95µl de agarose “low melting point” (LMP). Essa mistura foi colocada em lâmina de
vidro com cobertura de agarose normal a 1%. Depois da solidificação em geladeira, as
lâminas foram colocadas em tampão de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA e 10 mM Tris, pH
10,0-10,5, com adição na hora do uso de 1% de Triton X – 100 e 10% de DMSO) por no
mínimo 2 horas. As lâminas foram então incubadas em tampão alcalino (300 mM NaOH e 1
32
mM EDTA, pH >13) por 20 minutos. A corrida eletroforética foi realizada por mais 15
minutos a 25 volts e 300 mA e a alcalinidade foi neutralizada com 0,4 M Tris (pH 7,5). As
lâminas foram coradas com solução de nitrato de Prata. Foram analisadas 100 células por
lâmina, onde as células foram classificadas visualmente em cinco classes, de acordo com o
tamanho da cauda: sem danos – classe 0; até danos máximos – classe 4. Assim, o Índice de
Danos de cada grupo estudado variou de zero (100X0; 100 células observadas
completamente sem danos) a 400 (100X4; 100 células observadas com dano máximo).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram expressos em média + erro padrão. Os resultados foram
analisados estatisticamente por Análise de Variância.
As médias de cada tratamento foram comparadas com o controle em cada período
de alimentação testado e na privação alimentar, por Análise de Variância one-way. As
médias entre os três períodos de alimentação foram comparadas por Análise de Variância
two-way, assim como as médias do período de 30 dias de alimentação e da privação
alimentar. Quando ocorreu diferença significativa (5%) entre os tratamentos e o grupo
controle, foi aplicado o teste de Tukey.
A média de cada tratamento do período de 30 dias de alimentação foi comparada
com a média do mesmo tratamento no período de privação alimentar através do Teste T.
RESULTADOS
VARIÁVEIS FÍSICO-QUIMICAS DA ÁGUA
Na Tabela 3 estão descritos os valores médios das variáveis físico-químicas da água
nas unidades experimentais. A temperatura manteve-se em 27,44 + 0,05˚C, o oxigênio
dissolvido em 6,11 + 0,06 mg/L e o pH em 5,79 + 0,02.
33
Tabela 3. Valores de temperatura, oxigênio dissolvido e pH medidos durante o período
experimental.
Variáveis Controle Camu-
Camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Temperatura
(˚C)
27,48+0,12
27,42+0,14
27,41+0,12
27,44+0,14
27,50+0,13
27,40+0,13
Oxigênio
Dissolvido
(mg/L)
6,10 + 0,14
6,11+0,2
6,28+0,10
5,90+0,17
6,30+0,152
5,99+ 0,14
Ph
5,69+0,02
5,87+0,08
5,88+0,06
5,74+0,06
5,62+0,03
5,93+0,08
Os valores estão expressos como média+SEM
ANÁLISE DE CRESCIMENTO
A inclusão de frutos em substituição a 50% da ração comercial na dieta dos
tambaquis não promoveu alterações significativas nos índices de desempenho zootécnico
referidos como ganho de peso, taxa de crescimento específico, incremento de peso e
eficiência de crescimento, conforme demonstrado na Tabela 4.
Numericamente, os melhores índices zootécnicos foram obtidos com a ração
comercial, seguido das rações suplementadas com embaúba e munguba
.
Os altos valores de
erro padrão na ração controle e no tratamento com ração suplementada com jauari mostram
diferenças de ganho de peso e de incremento de peso nas réplicas destes tratamentos.
34
Tabela 4. Dados dos índices de desempenho de tambaquis (Colossoma macropomum)
alimentados com ração suplementada com frutos e sementes da Amazônia.
Índices Controle Camu-
Camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Comprimento
Inicial (cm)
11,4 + 0,2
12,2 + 0,1 11,7 + 0,3 11,8 + 0,2 12,2 +0,2 12,4 + 0,2
Comprimento
final (cm)
13,3 + 0,3
13,0 + 0,1 13,1 + 0,4
13,4 + 0,4 13,0 +0,2
13,0 + 0,7
Peso Inicial
(g)
50,6 +5,51 60,9 +1,8 53,6 +2,0 55,7 +3,7 60,1 +6,0 60,9 +1,8
Peso Final
(g)
72,2 +3,9 72,1 +4,2 62,6 +2,7 69,6 +2,9 70,3 +3,7 71,6 +4,3
Ganho de
Peso (g)
21,6+5,0
8,1 + 3,2 9,7 + 3,0 19,5 + 2,1 10,9 +5,6 15,3 +2,1
Taxa de
Crescimento
Específico
1,3 + 0,3 0,6 + 0,1 0,6 + 0,2 1,1 + 0,1 0,6 + 0,3 0,8 + 0,1
Incremento de
Peso (%)
46,69+14,5 18,41+2,12 18,74+6,50 37,35+4,00 21,23+12,5 24,80+4,10
Eficiência de
crescimento
0,13+0,03 0,07+0,01 0,07+0,02 0,13+0,02 0,11+0,06 0,09+0,01
Os valores estão expressos como média+SEM
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
Os juvenis de tambaquis alimentados com ração suplementada com camu-camu,
catoré, embaúba, jauari e munguba, não apresentaram alterações nos parâmetros sanguíneos
hematócrito, hemoglobina e RBC quando comparados com os peixes alimentados com a
ração controle. Entretanto, os níveis de hemoglobina medidos após o primeiro dia de
alimentação foram significativamente (P<0,05) menores que as médias encontradas nos
períodos de 15 dias e 30 dias de alimentação, para todos os tratamentos (Figura 2A).
Para o período de privação alimentar ocorreu queda significativa (P<0,05) nos níveis
de hematócrito, hemoglobina e RBC dos tambaquis, quando comparados aos animais
alimentados pelo período de 30 dias para todas as dietas testadas (Figuras 1B, 2B e 3B).
Os índices hematimétricos volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina
corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM),
calculados a partir dos índices hematológicos, são apresentados nas Tabelas 5 e 6. Os
35
valores médios de HCM e CHCM após o primeiro dia de alimentação diferiram
significativamente (P<0,05) das médias apresentadas pelos animais alimentados por 15 dias
e 30 dias em todos os tratamentos (Tabela 5).
Figura 1. Valores de hematócrito de Colossoma macropomum. A. Comparação entre
as médias de hematócrito em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as
médias do período de 30 dias de alimentação e privação alimentar.
Médias seguidas pela mesma
letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P< 0,05).
Os animais que receberam ração suplementada com catoré por 30 dias e os
submetidos a posterior privação alimentar apresentaram índices médios de VCM
significativamente (P<0,05) maiores que os animais que receberam ração controle (Tabela
6). Os níveis de VCM, HCM e CHCM não diferiram estatisticamente nos animais
alimentados por 30 dias e submetidos à privação alimentar.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Hematócrito (%)
1 dia
15 dias
30 dias
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Hematócrito
30 dias
Privação Alimentar
A
B
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
b
36
Figura 2. Valores de hemoglobina
de Colossoma macropomum
. A. Comparação entre
as médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30
dias de alimentação e privação de alimentar.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo
Teste de Tukey (P< 0,05).
Figura 3. Número de eritrócitos circulantes (RBC)
de Colossoma macropomum
. A.
Comparação entre as médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as
médias do período de 30 dias de alimentação e privação de alimentar.
Médias seguidas pela mesma
letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P< 0,05).
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
RBC (10
6
/mm
3
)
1 dia
15 dias
30 dias
A
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
RBC (10
6
/mm
3
)
30 dias
Privaçao Alimentar
B
a a a a a
a b b b b b b
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Hemoglobina (mg/L)
30 dias
Privação Alimentar
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Hemoglobina (mg/L)
1 dia
15 dias
30 dias
A
B
a
a
a
a
a
a
b
b b
b
b
b
b b
b
b
b
b
b
b
b b b b a
a a a
a
a
37
Para todos os parâmetros hematológicos testados, não foram encontradas diferenças
estatísticas entre os tratamentos e o grupo controle dentro de cada período de alimentação,
com exceção do índice VCM, onde o grupo tratado com ração suplementada com catoré
apresentou média significativamente maior que os animais que receberam a ração controle
durante 30 dias de alimentação.
Também não foram observadas diferenças significantes entre os animais alimentados
com a ração suplementada com os mesmos frutos durante 30 dias, quando comparados com
aqueles submetidos à privação alimentar.
Não foi detectada diferença entre as médias da concentração de glicose sanguínea
nos juvenis de tambaqui alimentados pelo período de 1 dia, 15 dias e 30 dias, assim como
aqueles submetidos a privação alimentar, em todos os tratamentos testados (Figuras 4 A e
B). A concentração de glicose não apresentou diferenças estatísticas entre os tratamentos e o
grupo controle dentro de cada período de alimentação testado, assim como entre os animais
alimentados com os mesmos frutos no período de 30 dias em comparação àqueles que
passaram por privação alimentar.
38
Tabela 5. Valores de Volume corpuscular médio (VCM µm
3
), Hemoglobina corpuscular
média (HCM pg) e Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM %) de
tambaquis (Colossoma macropomum) alimentados com ração suplementada com frutos e
sementes da Amazônia nos períodos de 1 dia, 15 dias e 30 dias. Os valores estão expressos
como média+SEM.
Parâmetros
Controle Camu-
Camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
1 dia 156,88 +
16,82
152,33 +
8,37
168,70 +
18,41
121,18+
9,18
125,77+
13,83
138,43+
14,89
15 dias 134,80+
4,88
142,90 +
6,73
145,10 +
3,82
136,18 +
3,49
149,80 +
8,67
149,88+
9,73
VCM
(µm
3
)
30 dias 133,88 +
4,52
146,80 +
4,94
172,25 +
11,29
144,38 +
7,87
130,35 +
6,71
127,00 +
8,35
1 dia 7,10 +
2,21ª
9,53 +
1,60 a
5,40 +
1,78 a
8,23 +
1,81 a
10,37 +
1,43 a
10,45 +
1,45 a
15 dias 36,94 +
0,96 b
36,21 +
1,26 b
36,74 +
2,69 b
36,51 +
2,52 b
38,11 +
2,52 b
39,59 +
1,71 b
HCM (pg)
30 dias 37,18 +
2,31 b
37,52 +
1,60 b
88,86 +
1,84 b
37,43 +
0,82 b
37,37 +
2,10 b
36,70 +
2,60 b
1 dia 4,67 +
1,35 a
6,33+
1,77 a
3,40 +
1,31 a
7,22 +
2,12 a
8,02 +
0,62 a
8,03 +
1,58 a
CHCM
(%)
15 dias 27,44 +
0,54 b
25,41 +
0,68 b
25,26 +
1,40 b
26,76 +
1,30 b
25,44 +
0,80 b
26,58 +
1,21 b
30 dias 28,02 +
2,59 b
25,73 +
1,85 b
22,66 +
0,64 b
26,13 +
1,34 b
28,67 +
0,69 b
29,29 +
2,69 b
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P< 0,05).
39
Tabela 6. Valores de Volume corpuscular médio (VCM µm
3
), Hemoglobina corpuscular média
(HCM pg) e Concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM %) de tambaquis (Colossoma
macropomum) alimentados com ração suplementada com frutos e sementes da Amazônia por um
período de 30 dias e submetidos a posterior privação alimentar (P.A.). Os valores estão expressos
como média+SEM
.
Parâmetros Controle Camu-
Camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
30 dias 133,88 +
4,52 a
146,80 +
4,94 a
172,25 +
11,29 b
144,38 +
7,87 a
130,35 +
6,71 a
127,00 +
8,35 a
VCM
(µm
3
)
P.A. 135,35 +
10,31 a
131,80 +
7,59 a
152,63 +
18,31 b
141,35 +
10,31 a
138,03 +
5,97 a
129,98 +
2,98 a
30 dias 37,18 +
2,31
37,52 +
1,60
88,86 +
1,84
37,43 +
0,82
37,37 +
2,10
36,70 +
2,60
HCM (pg)
P. A. 35,15 +
3,08
35,03 +
3,58
40,59 +
5,09
38,61 +
3,05
36,66 +
1,10
35,04 +
1,12
30 dias 28,02 +
2,59
25,73 +
1,85
22,66 +
0,64
26,13 +
1,34
28,67 +
0,69
29,29 +
2,69
CHCM
(%)
P. A. 25,90 +
0,41
26,57 +
2,10
26,59 +
1,07
27,30 +
0,62
26,61 +
0,48
27,01 +
1,14
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P< 0,05).
Figura 4. Concentração de glicose
em Colossoma macropomum
. A. Comparação entre as
médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de
alimentação e privação de alimentar.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Glicose (g/dL)
1 dia
15 dias
30 dias
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Glicose (g/dL)
30 dias
Privação Alimentar
A
B
40
ANÁLISE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES
A atividade enzimática da Glutationa-S-Transferase (GST) nos tambaquis
alimentados com munguba foi significativamente menor que aqueles que receberam ração
controle durante o período de 30 dias. Nos períodos de 1 e 15 dias de alimentação não foram
detectadas diferenças entre as médias da GST nos animais alimentados com ração
suplementada com frutos e os animais que receberam ração controle.
Entretanto, os valores médios da GST nos períodos de 1, 15 e 30 dias de alimentação
foram significativamente (P<0,05) diferentes, para todas as rações testadas (Figuras 5 A).
Para o período de privação alimentar, a atividade da GST foi menor estatisticamente
(P<0,05) que os valores médios encontrados nos peixes que receberam alimentação por 30
dias, independente do tratamento (Figuras 5B).
Os animais que receberam ração controle por 30 dias apresentaram atividade média
de GST estatísticamente maior do que aqueles que foram submetidos à privação alimentar.
Para os grupos que receberam ração suplementada com os frutos, não foi detectada diferença
significativa na atividade da GST, entre o período de 30 dias de alimentação e privação
alimetar, para cada um dos frutos testados.
A atividade da catalase foi menor nos peixes que receberam as rações experimentais
por um dia, diferindo estatisticamente (P<0,05) daqueles que receberam as rações por 15 e
30 dias (Figura 6A). Durante o período de privação alimentar, a atividade da catalase se
manteve constante e não diferiu das médias apresentadas pelos peixes alimentados por 30
dias (Figura 6B).
41
Figura 5. Valores médios da atividade da Glutationa-S- Transferase (GST) (µmol.
min
-1
.mg de proteína) em Colossoma macropomum. A. Comparação entre as médias em
função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de
alimentação e privação de alimentar.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste
de Tukey (P< 0,05).
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
GST
30 dias
Privação Alimentar
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
GST
1 dia
15 dias
30 dias
a a a a a a
b b b b
b
b
c
c
c c
c
c
A
a
a
a a a
a
b
b
b b b
b
B
42
Figura 6. Valores médios da atividade da Catalase (µmol. min
-1
.mg de proteína) em
Colossoma macropomum. A. Comparação entre as médias em função dos dias de
alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de alimentação e
privação de alimentar.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P<
0,05).
Os animais que receberam rações suplementadas com camu-camu e munguba
apresentaram menor atividade da GST após 30 dias de alimentação e privação alimentar.
Porém estes animais apresentaram maior atividade da enzima catalase após 30 dias de
alimentação, apesar destas diferenças não serem significativas.
Os peixes que foram alimentados com rações suplementadas com catoré, embaúba e
jauari, e submetidos à posterior privação alimentar, apresentaram atividade da catalase
quantitativamente maior que os animais alimentados com as rações suplementadas pelos
mesmos frutos por 30 dias.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Catalase
1 dia
15 dias
30 dias
a
a
a
a
a a
b
b
b
b
b
b
B
A
b
b
b
b
b
b
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Catalase
30 dias
Privação Alimentar
43
EFEITOS CITOTÓXICO E GENOTÓXICO
Neste experimento, as rações suplementadas com frutos e sementes não
influenciaram a concentração de produtos celulares oxidados no plasma sanguíneos dos
peixes (Figuras 7 A e B). Não foram observadas diferenças significativas entre o controle e
os tratamentos em todos os períodos de alimentação testados. Porém, foi possível observar
diferenças estatísticas (P<0,05) entre os períodos de alimentação de 1, 15 e 30 dias, para
todos os tratamentos (Figuras 7A).
Figura 7. Concentração endógena de produtos celulares oxidados (TBARS) em
Colossoma macropomum. A. Comparação entre as médias em função dos dias de
alimentação. B. Comparação entre as médias do período de 30 dias de alimentação e
privação de alimentar.
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo Teste de Tukey (P<
0,05).
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
TBARS (nmoles/ml de plasma)
1 dia
15 dias
30 dias
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
180,0
200,0
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
TBARS (nmoles/ ml de plasma)
30 dias
Privação Alimentar
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
b
b b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
B
A
44
Nos peixes submetidos à privação alimentar, a concentração de produtos celulares
oxidados foi significativamente (P<0,05) maior que nos peixes alimentados por 30 dias para
todas as rações experimentais (Figuras7B). Porém, para cada uma das rações testadas não
houve diferença estatística significativa entre as médias, quando comparadas por
tratamentos, entre os períodos de 30 dias e privação alimentar.
Figura 8. Anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE) de Colossoma macropomum.
A. Comparação entre as médias em função dos dias de alimentação. B. Comparação entre as
médias do período de 30 dias de alimentação e privação de alimentar.
Os resultados das análises de anormalidades nucleares eritrocíticas (ANE) podem ser
observados nas Figuras 8A e B. As porcentagens de ANE se mantiveram homogêneas em
todos os tratamentos e também entre os períodos de alimentação testados. Não foram
observadas diferenças estatísticas entre os tratamentos, entre os períodos de alimentação e
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Anormalidades nucleares eritrocíticas (%)
1 dia
15 dias
30 dias
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
Controle Camu-
camu
Catoré Embaúba Jauari Munguba
Anormalidades Nucleares Eritrocíticas (%)
30 dias
Privação Alimentar
A
B
45
também na comparação entre os peixes alimentados por 30 dias e aqueles submetidos à
privação alimentar.
Figura 9. Teste cometa em preparações celulares de Colossoma macropomum. A.
Comparação entre as médias do Índice de Danos em função dos dias de alimentação. B.
Comparação entre as médias da Freqüência de Danos em função dos dias de alimentação.
A variação do índice de danos em função das rações experimentais e tempo de
alimentação (1, 15 e 30 dias) é apresentada na Figura 9A. Não foram encontradas diferenças
estatísticas entre índices de danos dos grupos experimentais quando comparados com o
controle. A diferença estatística foi notada entre os períodos de alimentação, onde os peixes
alimentados durante um dia apresentaram resultados significativamente menores (P<0,05)
do que aqueles que receberam a alimentação por 15 e 30 dias, para todos os tratamentos.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Frequência de Danos
1 dia
15 dias
30 dias
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
Controle Camu-camu Catoré Embaúba Jauari Munguba
Indíce de Danos
1 dia
15 dias
30 dias
a a a a
a
a
a
a
a a
a a
b
b
b b b b
b
b
b b b b
A
b
b
b b b b b
b
b
b
b b
B
46
O mesmo comportamento foi observado para as médias de freqüência de danos
celular identificadas pelo Teste Cometa (Figua 8B), onde não foram observadas diferenças
significativas entre os tratamentos, havendo, porém influência do período de alimentação.
Os resultados quantitativamente menores foram observados no primeiro dia de alimentação
quando comparados com 15 e 30 dias. Esses dados sugerem que se ocorreram danos
nucleares, estes resultaram da permanência dos peixes no aquário e da alimentação
oferecida, independente do fruto utilizado.
As preparações contendo material dos animais submetidos à privação alimentar
tiveram problemas na migração dos fragmentos de DNA durante a eletroforese, em função
de erros metodológicos. Nenhum núcleo formou cauda em todas as lâminas confeccionadas,
e desta forma não foi possível avaliar os danos causados pelos tratamentos durante essa fase
do experimento.
DISCUSSÃO
VARIÁVEIS FÍSICO-QUÍMICAS DA ÁGUA
O monitoramento destes parâmetros teve por objetivo garantir que as condições
ambientais dos tanques se mantivessem adequadas ao bem estar dos peixes durante o
experimento, sem variações inesperadas que viessem a provocar estresse nos animais
(Pereira-Filho et al., 2008).
O oxigênio é essencial para o processamento adequado do alimento ingerido pelas
vias metabólicas durante o processo de assimilação dos nutrientes (Castagnolli, 2000). Para
cultivos comerciais, a concentração de oxigênio deve ser mantida acima de 4mg/L (Kubtiza,
1998). O tambaqui tolera níveis mais baixos de oxigênio dissolvido, chegando até a 0,5
mg/L (Saint-Paul, 1986), porém níveis muito baixos de oxigênio dissolvido na água podem
causar estresse no animal e também provocar a morte por hipóxia. A temperatura e pH são
47
também considerados fatores limitantes para muitos processos biológicos. A temperatura
apresenta efeito sobre o crescimento, consumo de ração e metabolismo dos peixes (Cuenco
et al., 1999). Para o tambaqui a temperatura média de conforto está entre 25 e 32˚C (Cyrino
& Kubitza, 1998). Por ser uma espécie que habita naturalmente rios com pH ácido, o
tambaqui é tolerante a níveis baixos de pH na água (Araújo-Lima & Goulding, 1998).
Neste experimento, os parâmetros físico-químicos monitorados não apresentaram
variações que pudessem interferir no desempenho dos peixes e estão de acordo com os
valores recomendados para esta espécie (Araújo-Lima & Goulding, 1998).
ANÁLISE DE CRESCIMENTO
O ganho de massa corporal dos peixes pode ser observado através das informações
geradas a partir do ganho de peso desses animais. Neste experimento, não foram encontradas
diferenças significantes entre os parâmetros analisados. Porém, os peixes que receberam
ração controle e ração suplementada com jauari apresentaram altos valores de erro padrão,
indicando que ocorrem diferenças de ganho e incremento de peso entre as réplicas desses
tratamentos.
Oishi (2007) encontrou altos valores de desvio padrão no ganho de peso de peixes
alimentados com ração suplementada com 10% e 30% de farinha de resíduo de castanha da
Amazônia e atribui este fato à provável dominância de alguns peixes maiores dentro das
unidades experimentais em relação ao consumo de alimento.
O balanço entre proteína e energia é o ponto central para o crescimento de peixes
(Carter et al. 2001) e a proteína bruta é o principal nutriente, pois dela são extraídos os
aminoácidos para a formação das proteínas musculares, sendo o ingrediente usado em maior
quantidade e de maior custo na dieta de peixes (Piedras et al., 2006)
48
A quantidade de proteína consumida pelos peixes através da dieta afeta diretamente
seu estado metabólico. Sendo assim, baixos níveis de proteínas na ração ou ração com
composição inadequada em aminoácidos podem causar redução no crescimento, diminuição
da eficiência alimentar, imunodepressão e perda de peso nos peixes, em função da
mobilização da proteína de alguns tecidos para manter as funções vitais. Por outro lado, se
proteína em excesso é fornecida a esses animais, somente uma parte será usada para a
formação de tecido muscular e crescimento, o restante será convertido em depósito de
energia, em geral na forma de gordura (de La Higuera, 1987; Millward, 1989; Wilson,
1989).
Saint-Paul (1986) destacou que juvenis de tambaquis alimentados com níveis de
27,5% e 42,1% de proteína bruta (PB) apresentaram ganho de peso de 0,85 g/dia e 1,3 g/dia
respectivamente.
Almeida (2006) encontrou diferenças significativas no ganho de peso dos tambaquis
alimentados pelo período de 48 dias, em função de diferentes teores de lipídios e proteínas
das rações. Os maiores aumentos de peso foram apresentados pelos animais alimentados
com ração com 35% de PB e 4% de lipídios e 30% de PB e 8% de lipídios.
Roubach (1991), em experimento utilizando apenas frutos/sementes na alimentação
de tambaqui observou que a semente de Pseudobombax munguba, que apresentava maior
nível protéico (21,31%) e energético (31,9%), proporcionou o melhor desempenho de
crescimento e ganho de peso quando comparada com sementes de Hevea sp, Oriza sativa e
fruto de Cecropia sp. O autor destacou entretanto que os tratamentos experimentais
utilizados não produziram um desempenho em ganho de peso e crescimento equivalentes ao
tratamento controle com ração balanceada, atribuindo este resultado à um balanço de
macronutrientes inadequados às necessidades dietárias para o desenvolvimento da espécie, à
49
ausência de determinados micronutrientes essenciais ao metabolismo e aos possíveis
elementos antinutricionais presentes nas sementes e no fruto in natura.
Neste experimento os níveis de proteína das rações variaram de 25,9% (ração com
jauari) a 36,3% (ração com camu-camu) (Tabela 2), estando dentro dos níveis recomendados
para a espécie, cujos valores estão entre 17 a 30% (Carneiro, 1981; Mérola e Cantelmo,
1987; Saldaña e Lopez, 1988). Apesar de não ocorrer diferença estatística no desempenho
dos tambaquis alimentados com as rações experimentais em relação à ração controle,
numericamente, os melhores índices zootécnicos foram encontrados com a ração controle,
ração suplementada com embaúba e ração suplementada com munguba, que apresentaram
níveis de 34,1%, 27,1% e 29,3% de proteína bruta, respectivamente.
A ração experimental suplementada com camu-camu (fruto e semente) foi a que
apresentou maior nível de proteína bruta (36,3%), porém com índices zootécnicos
numericamente menores que aquelas que receberam embaúba e munguba. Esses resultados
diferem dos encontrados por Oliveira (2005) que, usando apenas polpa e casca de camu-
camu na proporção de 1:1 com ração comercial, observou melhor ganho de peso neste
tratamento quando comparado às outras rações experimentais.
Silva et al.(2003) observaram em estudos de conteúdo estomacal do tambaqui a
presença de sementes inteiras de camu-camu, indicando que estas sementes passam intactas
pelo trato digestivo do animal. Os resultados da avaliação química do camu-camu são
referentes à análise da polpa e casca (Waldhoff & Alencar, 2000; Yuyama et al., 2002; Silva
et al., 2003), não fazendo referencia à composição química de suas sementes.
Os ingredientes de origem vegetal utilizados na alimentação dos peixes como
sementes de leguminosas, tortas de sementes de oleaginosas e tubérculos, são limitados pela
presença de substâncias antinutricionais (Francis et al, 2001). Deve-se considerar também
que as diferenças entre desempenho de animais alimentados com rações com diferentes
50
quantidades de nutrientes podem ser reflexos da variação da digestibilidade desses nutrientes
(Hepher, 1993).
O uso das sementes de camu-camu na ração experimental pode justificar as
diferenças numéricas encontradas nos índices zootécnicos dos peixes alimentados com esta
ração e as demais rações deste experimento e também as diferenças dos mesmos índices em
comparação ao trabalho de Oliveira (2005).
Entretanto, a ausência de mudanças significativas nos índices de desempenho do
tambaqui indica que as rações suplementadas com munguba, embaúba, jauari, catoré e
camu-camu suprem as necessidades metabólicas dos animais, proporcionando índices
zootécnicos semelhantes àqueles observados em peixes alimentados com a ração comercial.
PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
O estudo dos parâmetros sanguíneos em peixes contribui para a determinação dos
fatores relacionados com sua capacidade fisiológica (Wells et al, 2005). Alterações na
concentração de hemoglobina, RBC ou hematócrito em determinadas condições estressantes
pode indicar a ocorrência de hemoconcentração ou hemodiluição, em função de distúrbios
osmorregulatórios causados pelo estresse.
A qualidade e a quantidade de alimento têm efeitos significantes na fisiologia dos
peixes, interferindo nas variáveis hematológicas, principalmente nos peixes mantidos em
cativeiro (Tavares-Dias & Moraes, 2004).
Lundstead (2003) observou uma constância nos parâmetros hematológicos de juvenis
de pintados (Pseudoplasyistoma corruscans) alimentados com diferentes níveis de proteína
bruta (20, 30, 40 e 50% PB) durante períodos de 28 e 90 dias. Resultados semelhantes foram
encontrados por Almeida (2006) que também não encontrou diferenças significativas nos
parâmetros sanguíneos hematócrito e concentração de hemoglobina em tambaquis
51
alimentados com diferentes níveis de proteína e lipídios na ração (35% de PB e 4% de
lipídio; 30% de PB e 8% de lipídio; 25% de PB e 11% de lipídio e 20% de PB e 14% de
lipídio). Porém, Melo et al. (2006) observaram redução no número de eritrócitos, na
concentração de hemoglobia e de hematócrito em Rhamdia quelem, com o aumento dos
níveis de proteínas na dieta desses peixes. Os autores destacam que a redução no
eridrograma pode ter sido causada por inibição de eritropoiése, já que foi observada anemia
normocítica-normocrômica nesses animais. Os autores destacam ainda que o excesso de
proteína na dieta resulta no aumento da excreção de amônia, que pode ser altamente tóxica e
causar leucopenia nos peixes.
Oliveira (2005) não encontrou diferenças estatísticas nos valores de hematócrito,
hemoglobina e RBC e nos índices hematimétricos VCM, HCM e CHCM em juvenis de
tambaquis alimentados com rações suplementadas com frutos e sementes da Amazônia no
período de 30 dias. A autora atribuiu esses resultados à boa condição nutricional dos peixes
em função das dietas testadas.
No presente trabalho, os parâmetros sanguíneos hematócrito, hemoglobina e RBC, e
os valores hematimétricos VCM e CHCM permaneceram dentro dos limites indicados por
Tavares-Dias & Moraes (2004) para todos os tratamentos testados nos peixes que receberam
alimentação durante 15 e 30 dias e aqueles que foram submetidos à privação alimentar. Os
autores encontraram como valores normais para tambaquis em cativeiros, os seguintes
números: número de eritrócitos 1,31 - 2,83 10
6
µL; concentração de hemoglobina 5,6 – 11,3
g/dL; hematócrito 22,2- 41,6%; VCM 135,5 – 292,9 fL e CHCM 26,2 - 37,2 g/dL.
Após o primeiro dia de alimentação, os valores de hemoglobina, HCM e CHCM
estavam bem abaixo dos valores médios de conforto para o tambaqui, diferindo
significativamente (P<0,05) dos resultados encontrados para os mesmos índices nos
períodos de 15 e 30 dias de alimentação. Esses valores encontravam-se reduzidos em todos
52
os tratamentos testados no período, não havendo diferença estatística entre os mesmos.
Portanto, a redução desses índices no período de um dia de alimentação pode estar mais
ligada a algum fator estressante relacionado ao manejo, do que ao efeito das rações
experimentais. Mudanças na dieta pode ser um fator estressante para peixes (Barcellos et. al,
2004).
Em C. macropomum estresse agudo reduz os valores de hemoglobina, número de
eritrócitos e hematócrito, podendo aumentar o VCM (Tavares-Dias et al., 2001). O aumento
do volume de eritrócito sugere hidratação da célula, pois a adrenalina, uma das
catecolaminas produzidas durante o estresse, parece provocar a retenção de sódio e cloreto
no meio intracelular, aumentando sua concentração e consequentemente provocando ganho
de água e aumento no volume eritrocitário (Tavares-Dias & Moraes 2004).
Melo et al. (2006) destacam que a deficiência nutricional e a privação alimentar
podem também afetar as características sanguíneas dos peixes. Ituassú et al. (2006),
verificando o crescimento compensatório de tambaquis submetidos à privação alimentar e
posterior re-alimentação, observaram que, embora essa espécie apresente crescimento
compensatório após 14 dias de privação, períodos superiores a 21 dias de restrição de
alimentos pode acarretar danos irrecuperáveis aos juvenis de tambaqui com massa corporal
em torno de 75 g.
Nos peixes submetidos à 21 dias de privação alimentar, no presente trabalho, as
concentrações de hemoglobina, os níveis de hematócrito e RBC foram significativamente
(P<0,05) menores que nos peixes alimentados durante 30 dias. Porém, não foi observado o
efeito das rações testadas e os valores médios dos parâmetros sanguíneos dos animais
estavam dentro dos limites normais indicados por Tavares-Dias & Moraes (2004).
O consumo de alimento tem por finalidade fornecer energia para o metabolismo
animal (Love & Black, 1994) e a glicose é a principal fonte de energia, sendo sintetizada a
53
partir dos carboidratos armazenados no fígado, na forma de glicogênio. A distribuição da
glicose para os tecidos dos animais é feita através do sangue, sendo que alterações nos níveis
de glicose sanguínea ocorrem em função da regulação da utilização desta, para produção de
energia (Kalyane et al., 1993), estímulo da glicogenólise por indução hormonal (Vijayan &
Moon, 1992) ou ainda situação estressante (Hochachka & Somero, 1984).
O nível de homeostase da glicose durante privação alimentar varia com a espécie
animal. Figueiredo-Garrutti et al. (2002) apresentam uma revisão onde destacam que
nenhuma mudança da glicose plasmática foi observada após algumas semanas de privação
alimentar em Myxine glutinosa, ou meses de privação em espécies como peixes onívoros
Anguilla rostrata e Clarias lazera. Porém, Machado et al. (1988) observaram queda
significativa nos níveis de glicose de cat fish (Rhamdia hilarii) após 30 dias de privação
alimentar.
Em juvenis de Brycon cephalus submetidos a períodos de 0, 12, 24, 48, 72, 120, 168
e 336 h de privação alimentar, foi possível observar que peixes onívoros apresentam maior
flexibilidade no metabolismo da glicose que peixes carnívoros, apresentando habilidades
para modular o metabolismo em função de mudanças no estado nutricional (Figueiredo-
Garrutti et al., 2002). Essa flexibilidade no metabolismo da glicose é relatada pelos autores
como uma mudança nos hormônios pancreáticos que permite um gradual ajuste metabólico
que ocorre durante a transição entre o período pós-alimentação e privação alimentar.
A constância observada nos parâmetros sanguíneos e nos níveis de glicose
plasmática dos peixes alimentados com as rações suplementadas com frutos e sementes da
Amazônia indica que essas rações não provocaram hemodiluição, nem hemoconcentração
ou qualquer outro tipo de alteração metabólica que comprometesse o quadro hematológico
ou alterasse os níveis de glicose desses animais.
54
ANÁLISE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
O estresse oxidativo ocorre quando espécies reativas ao oxigênio (ERO) como os
íons superóxido (O
2
٠
−
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), radical hidroxila (OH٠) e oxigênio
átomo (O
1
) se complexam com lipídios, proteínas ou ácidos nucléicos causando grandes
danos aos componentes da célula, podendo levar à morte celular (Valvanidis et al., 2006 ).
Sendo assim, a desintoxicação das espécies reativas ao oxigênio é um pré-requisito para a
vida aeróbica (McCord, 2000).
Para se proteger desses reativos intermediários, o organismo apresenta mecanismos
de defesa, conhecidos como agentes antioxidantes. Estes mecanismos podem ser
enzimáticos, que estão presentes naturalmente nos organismos, e não enzimáticos, que
podem ser adquiridos por meio de dietas balanceadas, principalmente aquelas elaboradas a
partir de vegetais (Fang et al., 2002; Morales et al., 2004). Entre as enzimas antioxidantes,
destacam-se a superóxido dismutase, a glutationa peroxidase, a glutationa redutase, a
glutationa s - transferase e a catalase. E entre os agentes não-enzimaticos, estão o ácido
ascórbico (vitamina C), o alfa-tacoferol (vitamina E) e o beta caroteno (precursor da
vitamina A).
Animais bem nutridos ou ainda alimentados com dietas contendo antioxidantes
endógenos podem apresentar uma melhor resposta ao estresse (Bianchi & Antunes, 1999).
São poucas as informações sobre o modo com que os níveis e tipos de fontes de
energia das rações afetam o status oxidativo dos peixes. A nutrição influencia a oxidação e
os mecanismos de defesas antioxidantes. Então, a composição da dieta deve ser avaliada
também em termos de seu efeito sobre o balanço entre a produção de espécies reativas ao
oxigênio (ERO) e sua quebra (Rueda-Jasso et al., 2004). Um desbalanço entre a produção e
a remoção do ERO pode produzir estresse oxidativo.
55
Oliveira (2005) observou níveis bastante variáveis de GST e catalase no fígado de
tambaquis alimentados com frutos e sementes da Amazônia, onde apenas os frutos munguba
e embaúba apresentaram níveis de GST estatisticamente diferentes do controle, indicando
que esses frutos parecem não proteger os animais contra o estresse oxidativo, favorecendo
um aumento na atividade das enzimas de desintoxicação.
Em Sparus aurata, Pascual et al. (2003) observaram um aumento significativo da
atividade da GST nos peixes submetidos à privação alimentar, quando comparados àqueles
que receberam níveis de ração referentes a 2, 1 e 0,5% da biomassa. Porém, após o período
de 21 dias de restrição ou de privação alimentar os níveis da GST reduziram-se
significativamente, principalmente nos animais que não receberam a ração. Os autores
destacam que a restrição alimentar a qual os peixes foram submetidos, deve ter afetado o
suprimento de aminoácido sulfurado e consequentemente os níveis da glutationa e das
enzimas glutationa-dependentes.
Neste experimento foi possível observar um aumento na atividade da GST em
decorrência do período de alimentação, com posterior queda desses níveis quando o peixe
foi submetido à privação alimentar. Porém não foi possível observar diferenças
significativas entre os níveis de GST no fígado dos animais alimentados com a ração
suplementada com os frutos quando comparado aos animais que receberam a ração controle.
Em relação à catalase, observou-se um comportamento semelhante, com o aumento da
atividade da enzima em função da duração do período alimentar. Mas a atividade da catalase
no período de privação alimentar não apresentou um comportamento constante, quando
comparado com os animais alimentados por 30 dias.
Rueda-Jasso et al., (2004) observaram que a atividade da catalase no fígado de
juvenis de Solea senegalensis foi afetada significativamente pelos níveis de lipídios da dieta.
56
Os peixes que foram mantidos em dietas contendo altos níveis de lipídios apresentaram uma
tendência de aumentar a atividade da catalase.
Morales et al. (2004) encontraram um decréscimo na atividade da catalase no fígado
de Dentex dentex submetido a 5 semanas de privação alimentar. Do mesmo modo Pascual et
al. (2003) também relataram queda na atividade da catalase em Sparus aurata submetidos à
restrição e privação alimentar. Nestas espécies, prolongados períodos de privação alimentar
induz a oxidação e o estresse, desencadeando a ativação de alguns mecanismos de defesa
antioxidante.
Em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), a restrição alimentar não induziu
mudanças na atividade da catalase (Hidalgo, et al., 2002).
Neste trabalho as rações suplementadas com camu-camu, catoré, embaúba, jauari e
munguba, não afetaram o balanço entre a produção e a remoção dos ERO nos peixes,
mantendo valores médios de atividade das enzimas antioxidantes muito próximos aqueles
mantidos pela ração controle. Porém, foi possível observar um aumento da atividade das
enzimas antioxidantes GST e Catalase durante todo o período de alimentação, independente
do tipo de fruto usado para suplementar a ração, assim como para os peixes que receberam
apenas ração.
Os frutos, de uma maneira geral, são fontes alimentares ricas em vitaminas e outros
compostos com atividades antioxidantes (Alceste & Jory, 2000). Esperávamos que a
inclusão destes frutos na ração comercial pudesse oferecer uma maior proteção ao estresse
oxidativo e consequentemente, uma menor produção de ERO. Este fato não foi observado
neste experimento, onde, provavelmente o processamento realizado para a elaboração das
rações experimentais, como a secagem em estufa a 55˚C durante 12 horas, pode ter afetado a
concentração das vitaminas e compostos antioxidantes presentes nesses frutos.
57
EFEITOS CITOTÓXICO E GENOTÓXICO
Em peixes, a peroxidação lipídica causada pelas espécies reativas ao oxigênio (ERO)
é a principal causa de muitas doenças (Sakai et al., 1998). Decorre da ação do ERO que
ativa as fosfolipases causando a desintegração dos ácidos graxos polinsaturados e
fosfolipídios da membrana celular (Haliwell & Gutteridge, 1999). Entretanto, todos os
animais apresentam um sistema para combater a oxidação e evitar as lesões induzidas pela
ação desse processo (Jacob, 1995). Desta forma, o metabolismo normal depende,
primordialmente, da relação entre a produção do radical livre e a atividade dos fatores de
proteção da peroxidação dos lipídios (Mourente et al., 2002). A ação desses fatores de
proteção pode ser medida pela concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) no sangue, plasma e principalmente fígado dos animais (Ohkawa, 1979).
Marcon & Wilhelm-Filho (1999) observaram que o status das defesas oxidativas no
fígado, no sangue e no plasma do tambaqui em seu habitat natural é eficaz em impedir ou
em atenuar o estresse oxidativo. A manutenção das defesas oxidativas em níveis elevados no
tambaqui em ambiente natural é, possivelmente, um resultado das mudanças na
disponibilidade do oxigênio, na oscilação da temperatura e no pH que são observados
freqüentemente em águas da bacia de Amazônica, especialmente durante os períodos da
transição de hipóxia para hiperóxia.
Sobre os efeitos da alimentação, Rueda-Jasso et al. (2004) destacam que já foi
demonstrado que a fonte de energia da dieta (proteína, lipidio ou carboidrato digerível) pode
modular a oxidação do lipídio em homogenado de músculo da truta de arco-íris. Em
experimento usando diferentes níveis de energia não protéica na alimentação de Solea
senegalensis, os autores encontraram taxas significativamente maior de TBARS nos animais
que receberam a dieta com maior concentração de lipídios, e concluíram que a sensibilidade
58
e os índices de peroxidação de lipídios estão correlacionados com o grau de insaturação das
dietas.
As rações suplementadas com agentes oxidantes podem minimizar o efeito da
peroxidação lipídica decorrente dos altos níveis de energia na dieta de peixes. Lin & Shiau
(2005) testando sete níveis de concentração de DL-α-tocoferol (0, 25, 50, 100, 200, 400 e
800 mg/kg de ração) em rações com 4 e 8% de lipídios, observaram queda nos níveis de
TBARS em Epinephelus malabaricus em decorrência do aumento das concentrações de DL-
α-tocoferol nas dietas testadas.
Frutos e sementes são fontes importantes de vitaminas e outros compostos
antioxidantes para os peixes (Alcestes & Jory, 2000). Oliveira (2005) observou em
tambaquis alimentados com frutos da Amazônia níveis de peroxidação lipídica bastante
variáveis, não encontrando diferenças significativas entre as dietas testadas, mas destaca que
os animais que receberam a dieta suplementada com munguba e catoré e que foram
submetidos ao túnel de natação, apresentaram níveis numericamente maiores de TBARS.
Os dados de Oliveira (2005) corroboram aqueles vistos neste trabalho, pois os níveis
de TBARS parecem não terem sido influenciados pela dieta dos peixes. Porém, foram
observadas diferenças significativas entre os períodos de alimentação, assim como o efeito
da privação alimentar, mas os resultados encontrados em função dos tratamentos não foram
diferentes dos apresentados pela ração controle.
As respostas biológicas a agentes estressantes podem se manifestar em vários níveis
do organismo, modificando padrões normais da fisiologia e bioquímica do animal, até
mudanças moleculares, na qual a integridade gênica e processos celulares podem ser
afetados. A formação de alterações morfológicas no envoltório nuclear foi descrita por
Carrasco et al.,1990, como núcleo que apresenta uma pequena evaginação do envelope
nuclear, o qual contém eucromatina (reiniforme), núcleo apresentando evaginações maiores
59
que o núcleo em forma de rim (lobado) e núcleo apresenta um corte notável no conteúdo do
material nuclear (segmentado), que também são relatados em eritrócitos de peixes como
uma das conseqüências da exposição destes animais à contaminantes químicos tóxicos,
genotóxicos, mutagênicos ou carcinogênicos no meio ambiente. Porém, os mecanismos
moleculares que levam a tais alterações nucleares ainda não foram descritos (Palhares &
Grisolia, 2002) e os animais podem produzir essas anormalidades naturalmente, por um erro
no processo de divisão celular (Heddler et al., 1991).
Além da análise das anormalidades nucleares eritrocitárias (ANE), o teste cometa é
utilizado para detectar lesões no DNA. Estas lesões, após serem processadas, podem resultar
em mutação. Entretanto, diferente das mutações, as lesões detectadas pelo teste do cometa
são passíveis de correção pelos próprios mecanismos de reparo do DNA (Tice, 1995)
.
A sensibilidade destes testes aos efeitos de agentes contaminantes tem sido descrita
para algumas espécies de peixes tropicais. Pretti et al. (2007) descrevem o aumento das
anormalidades nucleares eritrocíticas e de índices de danos observados pelo teste cometa em
Prochilodus lineatus expostos à fração solúvel da gasolina. Bucker et al., 2006 observaram
um aumento gradual no índice de danos em teste cometa de Eigenmannia virescens em
diferentes tempos de exposição ao benzeno.
Os valores de ANE detectados neste experimento não apresentaram diferenças entre
os tratamentos e o grupo controle nos períodos de alimentação testados. Já o índice e a
freqüência de danos resultantes do teste cometa apresentaram diferenças significativas
(P<0,05) entre os períodos de alimentação (1, 15 e 30 dias de alimentação), sendo menores
nos animais que receberam alimentos por um dia. Porém, essa diferença parece não estar
ligada à presença de frutos na ração, já que, para todos os períodos testados, os tratamentos
apresentaram médias semelhantes ao controle.
60
Diante disso, podemos afirmar que as anormalidades nucleares eritrocíticas e os
índices de danos do DNA não foram causados pela presença de agentes tóxicos contido nos
frutos, já que esses índices não diferiram significativamente daqueles encontrados no
controle.
CONCLUSÃO
A inclusão dos frutos e sementes utilizados neste experimento, em substituição a
50% da ração comercial na dieta dos tambaquis não comprometeu os índices de desempenho
zootécnico desses animais, quando comparados aos animais alimentados com a ração
controle.
Essas rações não promoveram alterações nos níveis normais dos parâmetros
hematológicos e nos índices hematimétricos, não causaram diferenças significativas na
atividades das enzimas GST e Catalase e nem danos nucleares ou fragmentos de DNA, nos
tambaquis quando comparados aqueles que receberam apenas a ração controle.
Embora as rações suplementadas com camu-camu, catoré, embaúba, jauari e
munguba não tenham provocado alterações nos parâmetros hematológicos, enzimáticos e
citogenotóxicos, foram encontradas diferenças significativas nessas respostas em função dos
períodos de alimentação testados (1, 15 e 30 dias), indicando que os peixes passaram por
períodos de estresse durante a realização do experimento, que refletiram nos parâmetros
hematológicos, mecanismos oxidantes e danos celulares.
Não foi possível observar benefícios relacionados a uma melhor resistência ao
estresse oxidativo provavelmente pelo tipo de processamento que foi realizado no preparo
das rações experimentais, que pode ter causado perda de vitaminas e de compostos
antioxidantes presentes nos frutos utilizados nessas rações.
61
As respostas das análises realizadas na condição estressante de privação alimentar
parecem não terem sido influenciadas pelo tipo de dieta que os peixes receberam, mantendo
as médias dos parâmetros analisados próximas àquelas encontradas nos peixes do grupo
controle.
Os frutos e sementes testados neste trabalho apresentam potencial para a
incorporação na ração do tambaqui, visto que não provocaram alterações no metabolismo
dos animais, podendo diminuir os custos da produção de peixes para pequenos produtores.
62
CAPÍTULO II
IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES
EM TAMBAQUI (Colossoma macropomum CUVIER, 1818)
ALIMENTADO COM FRUTOS E SEMENTES DA AMAZÔNIA
RESUMO
Os peixes amazônicos têm ao seu alcance uma grande disponibilidade de itens
alimentares que fazem parte de sua dieta natural, e, para aproximadamente 200 espécies de
peixes dessa região, entre eles o tambaqui, frutos e sementes constituem a maior fonte de
nutrientes e energia. O conhecimento do hábito alimentar desses animais na natureza
possibilitou a inclusão de frutos e sementes na dieta de peixes criados em cativeiro.
Entretanto, a qualidade dos frutos e sementes e seus efeitos metabólicos devem ser
investigados por metodologias específicas, uma vez que, para muitas espécies vegetais,
ainda não foram avaliados os principais constituintes químicos, tampouco seus efeitos
fisiológicos nos animais que delas se alimentam. Este trabalho teve como objetivo
identificar, através da técnica de DD-PCR, transcritos diferencialmente expressos em
tambaqui alimentado com ração suplementada com os frutos camu-camu, catoré, embaúba,
jauari e com a semente de munguba. A expressão diferencial de genes gerou fragmentos que
demonstraram similaridade com os genes das enzimas Adenilato Quinase (AK), Superóxido
Dismutase (SOD), Apolipoproteína (APO) e Citocromo P450 (CYP 20A1), indicando
necessidade de um melhor monitoramento nos níveis de agentes antioxidantes das rações
após a inclusão de frutos que atendam à demanda necessária para melhorar o “status”
oxidativo celular da espécie. Outros sete transcritos expressos não apresentaram similaridade
com as enzimas depositadas no GenBank, sendo candidatos a futura investigação para a
compreensão de processos específicos do metabolismo dos animais alimentados com rações
suplementadas com frutos e sementes da Amazônia.
63
IDENTIFICATION AND GENE DIFFERENTIAL EXPRESSION IN
TAMBAQUI (Colossoma macropomum CUVIER, 1818) FED WITH
AMAZONIAN FRUITS AND SEEDS
ABSTRACT
Amazonian fishes have a acess to a large number of feed itens which are part of their natural
diet, and for approximettly 200 fish species in the region, including the “tambaqui”, fruits
and seeds are their main sources for nutrients and energy. The knowledge of the food habits
of these animals in nature, made possible the inclusion of fruits and seeds in fish diet reised
in captivity. However the quality of fruits and seeds, as well as their metabolic effects on
fish must be investigated through specific methodologies, since there are several vegetable
species, that have not yet been evaluated on their chemical constituents, neither their
physiological effects on animals fed with them. This work aims to identify, through,
differential display-PCR (DD-PCR) methodology for the main differentially expressed
transcripts in tambaquis fed with supplemented formulated feed with the fruits camu-camu,
catoré, embaúba, jauari and seeds of munguba. The differentially expressed genes generated
fragments that showed similarity with Adenylate Kinases (AK), Superoxide Dismutase
(SOD), Apolipoprotein (APO) and Cytochrome P450 (CYP 20A1) enzymes encoding genes,
indicating that there is a need for a better monitoring of oxidative processes levels in the
cells of this fish species fed with supplemented formulated. Seven other transcripts
expressed in the same experiment did not show similarity with any genes deposited in the
GenBank, being candidates for future research that will allow the understanding of these
animals specific metabolism process when fed with commercial rations supplemented with
Amazonian fruits and seeds.
64
INTRODUÇÃO
Os peixes amazônicos têm à sua disponibilidade uma grande diversidade de itens que
fazem parte de sua dieta natural. Para aproximadamente 200 espécies de peixes da região, os
frutos e sementes são os grandes mananciais naturais de nutrientes e energia (Goulding,
1980).
Os peixes ligados à floresta de inundação são, em sua maioria, frugívoros, que
evoluíram em estreita relação com as árvores e arbustos amazônicos (Araújo-Lima &
Goulding, 1998). Entre essas espécies está o tambaqui (Colossoma macropomum), que é um
frugívoro especialista de frutos como Hevea spruceana (seringa-barriguda) e Astrocarium
jauari (jauari) (Araújo-Lima & Goulding, 1998; Imperatriz-Fonseca & Por, 2003).
Silva et al. (2003) destacaram mais de 130 espécies de frutos e sementes,
distribuídos em 36 famílias de plantas identificados como alimentos do tambaqui. Durante
os meses de cheia, o conteúdo estomacal dos peixes contém quantidade relativamente alta
destes itens, coincidindo com o período de frutificação das árvores presentes nas áreas de
várzeas e igapós. A grande variedade e disponibilidade de itens provenientes das florestas
inundadas levam a espécie a incluir em sua dieta uma mistura de frutos e sementes para
conseguir melhor equilíbrio de proteína, carboidratos, gorduras e vitaminas (Araujo-Lima &
Goulding, 1998).
Com base no conhecimento do hábito alimentar natural do tambaqui, alguns autores
sugeriram a possibilidade do uso de frutos e sementes como uma fonte alternativa de
alimentos na piscicultura intensiva desses peixes na Amazônia (Pereira-Filho, 1995; Silva,
1996; Araujo-Lima & Goulding, 1998).
Estudos sobre o valor nutricional (Waldhoff et al., 1996), a eficiência alimentar
(Roubach, 1991), digestibilidade (Silva et al., 2003) e aspectos fisiológicos e bioquímicos
(Oliveira, 2005) desses animais alimentados com algumas espécies de frutos e sementes da
65
Amazônia foram realizados no intuito de avaliar a eficiência do mesmo e a possibilidade de
inclusão desses itens na dieta de peixes em cativeiro, visando a diminuição dos custos de
produção.
A qualidade dos frutos e sementes e seus efeitos metabólicos devem ser investigados
por metodologias específicas, uma vez que, para muitas espécies vegetais, ainda não foram
avaliados os principais constituintes químicos, tampouco seus efeitos fisiológicos nos
animais que delas se alimentam. Os peixes frugívoros não se alimentam de todas as
sementes que estão disponíveis e de tamanho apropriado pra serem quebradas, algumas
espécies vegetais produzem muitas sementes por ano, mas são ingeridas apenas
ocasionalmente pelos animais (Araujo-Lima & Goulding, 1998).
O estudo da expressão diferencial de genes é um dos mais promissores caminhos
para entender os mecanismos de desenvolvimento (Kozian & Kirschbaum, 1999) e respostas
às mais diferentes condições nos quais os organismos são submetidos, incluindo as
mudanças ocorridas em função dos tipos de dietas fornecidas aos peixes (Sánchez-Vázquez
et al., 2001
;
Lilleeng et al., 2007).
Uma série de metodologias pode ser usada para identificação e isolamento de
transcritos diferencialmente expressos em peixes. Entre as metodologias de maior destaque
atualmente estão a Hibridização Subtrativa Supressiva (HSS); o cDNA AFLP, o DD-PCR
(Differential Display – PCR) e micro arranjos de DNA (Freeman et al., 2000). Os micro
arranjos de DNA, apesar de gerar um grande volume de informações, é uma técnica bastante
cara, limitando seu uso em muitos laboratórios. Assim, a técnica do DD-PCR, apesar de
gerar menor volume de informações que os micro arranjos, torna-se uma alternativa viável,
pois apresenta custo relativamente menor e maior facilidade de implementação.
66
Este trabalho teve como objetivo identificar, através da técnica de DD-PCR,
transcritos diferencialmente expressos em tambaqui alimentado com ração suplementada
com frutos e sementes da Amazônia.
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL BIOLÓGICO
Para o estudo da expressão diferencial de genes foi utilizado o fígado de juvenis de
tambaqui (Colossoma macropomun) alimentados com rações suplementadas com frutos e
sementes da Amazônia.
As rações que compuseram os tratamentos deste experimento foram constituídas de
uma mistura composta de 50% de ração comercial (36% de proteína) moída e 50% de fruto
moído, que posteriormente à mistura, foram repeletizadas em moedor de carne elétrico e
secas em estufa a 55˚C por 12 horas. A ração controle foi constituída apenas de ração
comercial (36% de proteína) moída, repeletizada e seca em estufa nas mesmas condições das
rações tratamentos.
Os frutos escolhidos para compor as rações experimentais foram: camu-camu
(Myrciaria dúbia), catoré (Crataeva benthamii), embaúba (Cecropia latiloba), munguba
(Pseudobombax munguba) e jauari (Astrocarium jauari). Para a confecção da ração
suplementada com munguba, foi utilizada apenas a semente do fruto, para a ração
suplementada com jauari, somente a polpa foi utilizada e para as demais rações foram
utilizados os frutos inteiros de camu-camu, de catoré e de embaúba.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x
6. Constituído por três períodos de alimentação (1, 15 e 30 dias) e 6 tratamentos (um
controle e cinco rações suplementadas com frutos), com quatro repetições cada, totalizando
24 unidades experimentais. Cada unidade experimental foi composta de um aquário com
67
capacidade de 310L, preenchidos com 80L de água, providos de aeração e renovação de
água constantes, contendo 10 juvenis de tambaquis com peso médio de 57,1 + 2,8 g e
comprimento padrão médio de 11,9 + 0,2 cm. O período de aclimatação dos peixes foi de
duas semanas, onde todos os animais foram alimentados com a ração controle duas vezes ao
dia ad libitum.
Os peixes foram alimentados por um período de 30 dias e submetidos a posterior
período de privação alimentar por 21 dias. Durante o período experimental, foi retirado um
peixe de cada aquário após o 1˚ dia, 15˚ dia e 30˚ dia de alimentação. Esses animais foram
anestesiados com MS 222, sacrificados e levados para a coleta de tecido, o mesmo
ocorrendo com os peixes submetidos à privação alimentar.
De cada animal foi retirado o fígado, que foi acondicionado em tubos eppendorf®
estéreis, colocado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer -80˚C até o momento das
análises.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL DO DD-PCR
A expressão diferencial de genes de tambaqui foi obtida por meio da técnica
“Differential display polymerase chain reaction – DD-PCR” proposta por Liang & Pardee,
(1997).
O protocolo do DD-PCR foi organizado em cinco etapas:
1. Isolamento do RNA total, quantificação e verificação da integridade do RNA;
2. Tratamento do RNA;
3. Síntese de cDNA por transcriptase reversa;
4. Amplificação do DNA por PCR - DD-PCR;
5. Isolamento e clonagem dos amplicons selecionados.
68
1. ISOLAMENTO DO RNA TOTAL, QUANTIFICAÇÃO E VERIFICAÇÃO DA
INTEGRIDADE DO RNA
A amostra de fígado (50 – 100 mg) foi homogeneizada com 1000 µL de reagente
Trizol; para a separação das fases foram adicionados 300 µL de clorofórmio, em seguida,
a amostra foi misturada em vortex e centrifugada a 12000 rpm por 15 minutos a 4°C.
A primeira fase do sobrenadante foi transferida para outro tubo eppendorf estéril e a
precipitação do RNA foi feita com 500 µL de isopropanol 100% e centrifugação de 12000
rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento formado foi lavado
com etanol a 75%, centrifugado a 8000 rpm por 5 minutos a 4°C e posteriormente eluído em
água com DEPC.
A concentração do RNA foi determinada em espectrofotômetro (SHIMATZU – UV
240 – Graphicord) em absorbância de 260nm (A
260
), onde A
260
equivale a uma concentração
de 40 µg.mL
-1
de RNA. Para o cálculo da concentração foi utilizada a fórmula [RNA em
µg.mL
-1
] = A
260
x D x 40 µg.mL
-1
, onde D e o valor da diluição da amostra.
A integridade da amostra foi verificada usando gel desnaturante de agarose (1,5%)
contendo 1,5 g de agarose dissolvida em 60 mL de água, 20 mL de MOPS 5X (0,4 M de
MOPS, 0,1 M de acetato de sódio, 0,01M EDTA) e 20 mL de formaldeído. As amostras
foram coradas com “front” (930 µL de H
2
O com DEPC, 150 µL de MOPS (10X), 240 µL de
formamida, 100 µL de glicerol, 50 µL de azul de bromofenol, 5 µL de Brometo de etídeo
10mg/mL) e aplicadas no gel. O gel foi fotografado e analisado no aparelho Image master
VDS – Pharmacia Biotec.
69
2. TRATAMENTO DO RNA
Amostras de 5µg de RNA foram tratadas com 1µL de tampão 10X da Dnase; 1 µL de
Dnase e água mili Q estéril com DEPC em quantidade suficiente para completar o volume
final de 10 µL. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos e a
DNAse foi inativada com aquecimento a 65˚C por 10 minutos.
3. SÍNTESE DE cDNA POR TRANSCRIPTASE REVERSA
Para a síntese do cDNA, foram utilizados três primers oligo dT ancorados
(AAGCT
11
M, onde M pode ser G, A ou C). O RNA total de cada amostra foi dividido em
três grupos, onde, para cada grupo foi utilizado um dos três primers.
Cada reação foi realizada com 5µg de RNA tratado com Dnase, 1µL de dNTP mix
10mM, 1µL de um dos Oligo dT ancorado, 1µL de Transcriptase Reversa (MMLV-RT), 4
µL de tampão 5X da transcriptase e água Mili Q autoclavada em quantidade suficiente para
completar um volume final de 20 µL.
As amostras foram incubadas em termociclador (PCR ATC 401 – Apollo
Instrumentation) para um ciclo nas seguintes temperaturas: 25˚C por 10 minutos, 42˚C por
60 minutos e 70˚C por 15 minutos.
O cDNA foi quantificado em espectrofotômetro (SHIMATZU – UV 240 -
Graphicord) em absorbância de 260 nm (A
260
), onde A
260
equivale à uma concentração de 33
µg.mL
-1
de DNA fita simples. Para o cálculo da concentração foi utilizada a fórmula [DNA
em µg.mL
-1
] = A
260
x D x 33 µg.mL
-1
. Onde D é o valor da diluição da amostra.
A qualidade do cDNA foi observada em gel de agarose 1% contendo 100 mL de
TAE 1X ( 242 g de Tris-base, 57,1 mL de ácido acético glacial, 100mL de EDTA 50mM pH
8,0, água destilada para completar um volume final de 1000mL) , 1 g de agarose, corado
com 5 µL de Brometo de Etídio. O gel foi fotografado em aparelho Image master VDS –
Pharmacia biotec.
70
4. AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR - ddPCR
Para todas as amostras de cDNA foram realizadas 3 reações de amplificações,
utilizando cada um dos 3 primers arbitrários (Tabela 1), separadamente. Todas as
amplificações foram realizadas com uma réplica.
As amostras foram amplificadas seguindo o seguinte protocolo: 500 ng de cDNA, 1
µL de dNTP mix 10mM, 1 µL de um dos 3 primers arbitrários, 1,5 µL de MgCl
2
, 1µL de
Taq polimerase, 5 µL de tampão 5X da Taq polimerase e água Mili Q estéril em quantidade
suficiente para um volume final de 25 µL.
Tabela 1. Primers arbitrários utilizados amplificação do cDNA.
PRIMER ARBITRÁRIO SEQUÊNCIA
MOB 1 AAGGTTGCACTGT
MOB 5 AAGGTTGATTGCC
PAI 2 AAGGTTGCACCAT
As amostras foram incubadas em termociclador para ciclagem de PCR “touchdown”,
nas seguintes condições: 6 ciclos de 94˚C por 15 segundos, 43˚C por 30 segundos e 72˚C
por 60 segundo; 6 ciclos de 94˚C por 15 segundos, 40˚C por 30 segundos e 72˚C por 60
segundo e 35 ciclos de 94˚C por 15 segundos, 38˚C por 30 segundos e 72˚C por 60 segundo,
com uma extensão final de 72˚C por 60 segundos e hold de 4˚C.
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%,
constituído por 100 mL de TAE 1X e 2 g de agarose, corado com 10 µL de Brometo de
Etídio. Para a visualização dos fragmentos expressos diferencialmente, o gel foi fotografado
em equipamento Image Master VDS – Pharmacia biotec. Os marcadores de peso molecular
utilizados foram de 100 e 200 pb.
71
5. ISOLAMENTO E CLONAGEM DOS AMPLICONS SELECIONADOS
Após a análise dos géis com os produtos do DD-PCR, os fragmentos selecionados
foram excisados do gel de agarose e purificados com o Kit Wizard
SV Gel and PCR Clean-
UP System - PROMEGA, seguindo o protocolo do fabricante.
Em seguida, os fragmentos purificados foram ligados em vetor pGEM
®
-T Easy
Vector System - PROMEGA (Figura 1), usando 10 µL do fragmento purificado, 10 µL de
tampão 2X, 1 µL do vetor pGEM
®
, 1 µL de T4 DNA ligase. A reação foi mantida a 16 ˚C
por, no mínimo, 3 horas.
Figura 1. Vetor pGEM
®
-T Easy Vector System - PROMEGA
Os fragmentos ligados ao vetor foram inseridos em Escherichia coli, linhagem Mos
Blue competentes, por choque térmico (gelo por 30 minutos, 42˚C por 40 segundos e gelo
por 2 minutos). As células foram incubadas em 800 µL de meio LB sem antibiótico, sob
agitação (150 rpm) a 37˚C por uma hora. Posteriormente, a cultura foi semeada em meio LB
sólido previamente tratado com X-gal (sistema galactosidase para seleção de colônias com
inserto) e IPTG (15mg/mL), com ampicilina (50 mg/ml) e tetraciclina (15 mg/mL), e
72
mantida a 37ºC pelo período de 14 -18 horas. Foram selecionadas três colônias brancas de
cada fragmento clonado, que foram novamente semeadas em meio de cultura LB líquido
com ampicilina e tetraciclina e mantidas a 37ºC por 16 a 18 horas, sob agitação (150 rpm).
O DNA plasmidial das bactérias, contendo os fragmentos clonados, foi extraído por
mini-preparação de plasmídio (Mini-Prep), seguindo o protocolo adaptado de Sambrook et
al. (1989). Após o crescimento, 500 µL de cada cultura foi transferida para um tubo
eppendorf com 100 µL de glicerol 70% e armazenada em freezer -80 ºC, para a solução
estoque.
O restante das culturas foi transferido para tubos eppendorf que foram centrifugados
a 14.000 rpm por 1 minuto, os sobrenadantes foram removidos e os sedimentos bacterianos
eluídos em 100 µl de Solução I (23 mL de Glicose 20%; 10 mL de EDTA 0,5M – pH 8,0; 13
mL de Tris HCL 1M – pH 7,4; água destilada para completar o volume final de 500 mL).
Em seguida procedeu-se a lise alcalina das células com 200 µL de Solução II (0,2 N de
NAOH e 1% de SDS) e após a homogeneização por inversão, as amostras foram incubadas
em gelo por 5 minutos. Posteriormente, cada tubo recebeu 150 µL de Solução III (60 mL de
Acetato de potássio 5M; 11,5 mL de Ácido acético glacial e 28,5 mL de água destilada),
foram agitados cuidadosamente e centrifugados por 5 minutos a 14.000 rpm, para separação
do DNA celular dos restos bacterianos. Os sobrenadantes de cada tubo foram transferidos
para outros tubos contendo 5 µL de Rnase e incubados por 60 minutos a 65ºC e 5 minutos a
85ºC. A separação das fases foi realizada com a adição de igual volume de uma solução de
fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (1:1:1) e posterior centrifugação a 14.000 rpm por 2
minutos a 4 ºC. A primeira fase do sobrenadante foi transferida para um tubo e o DNA
plasmidial foi precipitado com dois volumes de etanol 100%, a reação foi incubada no gelo
por 5 minutos e centrifugada a 14.000 rpm por 5 minutos a 4 ºC. Os sedimentos foram
lavados com 200 µL etanol 70%, incubados no gelo por 5 minutos e centrifugados a 14.000
73
rpm por 5 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o DNA foi deixado secar a
temperatura ambiente, por no mínimo 30 minutos e reidratado com 20 µL de água Mili Q
estéril.
Para verificar a eficiência da extração do DNA plasmidial, os produtos da extração
foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1%.
SEQUENCIAMENTO
O sequenciamento dos fragmentos clonados foi realizado com o kit DNA
Sequencing Kit Big DyeTM Terminator Cycle v. 3.1 e o equipamento ABI PRISM ,
Applied Biosystems. A reação de sequenciamento foi realizada com 2 µL de cada
fragmento, 1 µL de Big Dye, 1 µL de primer M13 (5 pmol/µL) (reverse), 1,5 µL de tampão
do Big Day e água Mili Q estéril em quantidade suficiente para completar um volume final
de 10 µL. As condições de amplificação foram: 39 ciclos de 96 ºC por 15 minutos, 50 ºC por
1 minuto e 60ºC por 4 minutos.
As amostras foram precipitadas com 40 µL de Isopropanol 65%, mantidas no escuro,
em temperatura ambiente por 30 minutos e centrifugada a 4000 rpm por 30 minutos. O
isopropanol foi removido invertendo-se a placa com movimento brusco e os sedimentos
foram lavados com 400 µL de etanol 60% e centrifugados a 4000 rpm por 5 minutos. O
etanol foi removido por movimento brusco e com um “spin” da placa invertida em uma
centrifugação em 800 rpm por 30 segundos. As amostras foram secas a 37 ºC por 15-30
minutos e posteriormente foram ressuspensas em 10 µL de formamida Hi-Di, desnaturada a
93ºC por 3 minutos, colocadas no gelo e encaminhadas ao seqüenciador.
As seqüências geradas foram submetidas ao Blast (Basic Local Alignment Search
Tool) para nucleotídeos (BlastN) e proteínas (Blastx) e comparados com as seqüências
depositadas no National Center for Biotecnology Information - NCBI (GenBank)
74
(htt://www.ncbi.nlm.nih.gov) e ao Banco de dados do Centro Universitário Nilton Lins, para
confirmação da identidade do transcrito selecionado.
RESULTADOS
A concentração do RNA total extraído do fígado de tambaqui alimentado com rações
suplementadas com frutos e sementes da Amazônia foi bastante variada, apresentando
valores médios entre 0,58 + 0,01 até 1,61 + 0,36 (Tabela 2). Todas as amostras utilizadas
para a síntese de cDNA apresentaram dois fragmentos visíveis em gel de agarose
desnaturante (Figura 2), com poucos sinais de degradação. Em caso de amostras degradadas,
nova extração de RNA total era realizada, até que o padrão de um bom RNA fosse
visualizado no gel.
Tabela 2. Concentração do RNA total (µg/µL), extraído do fígado de tambaqui (Colossoma
macropomum) alimentado com rações suplementadas com frutos e sementes da Amazônia.
Período de
Alimentação
Ração
Controle
Ração +
Munguba
Ração +
Catoré
Ração +
Embaúba
Ração +
Jauari
Ração +
Camu-
Camu
1 dia
0,660 +
0,05
0,610 +
0,16
0,685 +
0,015
0,580 +
0,01
0,660 +
0,21
0,760 +
0,16
15dias
0,850 +
0,25
0,790 +
0,11
0,920 +
0,18
0,880 +
0,28
0,600 +
0,00
0,710 +
0,11
30 dias
1,610 +
0,36
0,850 +
0,25
1,050 +
0,05
1,425 +
0,02
0,950 +
0,05
1,400 +
0,40
Privação
Alimentar
1,145 +
0,25
1,325 +
0,12
1,270 +
0,07
1,160 +
0,23
1,245 +
0,05
1,055 +
0,13
Os valores estão expressos como média das réplicas de cada tratamento + SEM.
Os 3 tipos de oligonucleotídeos dT ancorados (AAGCT
11
A, AAGCT
11
C e
AAGCT
11
G) foram eficientes para a síntese dos cDNA, que foram avaliados em gel de
agarose 1% ( Figura 3).
75
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose desnaturante do RNA total do fígado de Colossoma
macropomum alimentado com ração suplementada com frutos e sementes da Amazônia.
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 1% do cDNA de Colossoma macropomum
sintetizado com os oligos dT ancorados.
origem
origem
origem
origem
76
A combinação dos 3 tipos de oligo dT usados na síntese de cDNA, em conjunto com
os 3 primers arbitrários (MOB1, MOB 5 e PAI 2), geraram diferentes géis para cada período
de alimentação (1, 15 e 30 dias) e para a privação alimentar.
A Figura 4 mostra o perfil em gel de agarose 2% da amplificação do cDNA de
fígado de tambaqui alimentado com as rações experimentais por 1 dia, usando o primer
arbitrário PAI 2.
Figura 4. Perfil da expressão diferencial de genes do fígado de Colossoma macropomum,
alimentado com as rações experimentais por 1 dia, usando o primer PAI 2. As setas indicam
aos transcritos diferencialmente expressos.
Os fragmentos observados nos géis apresentaram tamanhos entre 600 a 200 pares de
bases e a corrida em gel de agarose permitiu que esses fragmentos fossem separados,
possibilitando o isolamento dos transcritos selecionados.
Dos fragmentos observados, 57 foram selecionados, ligados em Vetor pGEM
®
-T e
clonados em bactéria E. coli, linhagem Mos Blue. O resultado da transformação das
bactérias foi verificado através da cultura dessas células em meio LB sólido contendo IPTG
e substrato cromogênico X-GAL. Somente as colônias brancas indicavam aquelas que
receberam o Vetor pGEM
®
-T contendo o fragmento selecionado. Dos 57 fragmentos
selecionados, apenas 34 foram clonados com sucesso.
origem
Peso
molecular
77
Os DNAs plasmidiais das bactérias clonadas com sucesso, foram extraídos por
“Mini-Prep” e os resultado das extrações foram observados em gel de agarose 1% (Figura
5). As bandas que apareceram no gel referem-se às três formas do DNA plasmidial que
podem ser encontrados após sua extração das bactérias clonadas: a forma circular, a forma
linear e a forma torcida. Os DNAs plasmidiais que apresentaram integridade e ausência de
contaminação de RNA foram submetidos ao sequenciamento.
Figura 5. Resultado da extração do DNA plasmidial, através de “Mini-Prep”.
Os fragmentos clonados foram seqüenciados e analisados no programa VecScrem
(NCBI - National Center for Biotechnology Information) para a retirada da seqüência do
vetor. Esta análise gerou 26 seqüências que foram submetidas ao BLAST
(Basic Local
Alignment Search Tool)
, os resultados de 23 seqüências são mostrados na Tabela 3, já que 03
seqüências submetidas ao BLAST só apresentaram similaridade com o Vetor pGEM
®
-T.
Nem todos os fragmentos clonados resultaram em seqüências com similaridade a
proteínas conhecidas. De acordo com a análise realizada, 07 seqüências não apresentaram
similaridades com aquelas depositadas no GenBank e 02 seqüências foram proteínas não
identificadas.
origem
78
Tabela 3 - Transcritos diferencialmente expressos detectados pela DDRT-PCR e
comparados ao banco de dados do GenBank.
Número do
Fragmento
Condição de
alimentação
Combinação entre
Oligo dT e Primer
arbitrário
Similiraridade encontrada no
BLAST
e – value
01 30 dias dT – G, MOB-1 Nenhuma similaridade
--------
02 30 dias dT – G, MOB-1 Nenhuma similaridade
--------
11 30 dias dT – G. MOB-5 Nenhuma similaridade
--------
47 01 dia dT – C, PAI–2 Nenhuma similaridade
--------
48 01 dia dT – C, PAI–2 Nenhuma similaridade
--------
53 Privação alimentar dT – C, PAI-2 Nenhuma similaridade
--------
54 Privação alimentar dT – C, PAI-2 Nenhuma similaridade
--------
56 Privação alimentar dT-G, PAI–2 Produto de proteína não-
identificado
3e- 35
57 Privação alimentar dT-G, PAI-2 Produto de proteína não-
identificado
7e- 21
50 15 dias dT-G, MOB-5 Microssatélite de salmão
7e- 6
09 30 dias dT-G, MOB-5 Microssatélite de salmão
3e- 9
38 15 dias dT-C, PAI-2 Proteína hipotética (DNA humano)
0,64
03 Privação Alimentar dT-G, MOB-1 Adenilato Quinase 2 de Danio
rerio
3e- 3
52 Privação alimentar dT-C, MOB-1 Proteína hipotética TVAG_
369910
3e -32
43
1 dia dT-A, PAI-2 Proteína Titin 7e-101
46 1 Dia dT – C, PAI-2 Proteína Titin 7e-101
49 Privação alimentar dT-A-PAI-2 Proteína Titin 7e-101
41 15 dias dT-A, MOB-5 Superóxido Dismutase –Mn
2e-11
55 Privação alimentar dT-C, PAI-2 Superóxido Dismutase –Mn 2e-11
40
15 dias dT-C, PAI-2 Apolipoproteína 3e- 6
42
1 dia dT-A, PAI-2 Apolipoproteína 3e- 6
46 1 dia dT-C, PAI-2 Apolipoproteína M
3e- 3
34 15 dias dT-C, MOB-5 Citocromo P 450 (20A1) 4e -34
A Tabela 3 apresenta os dados do BLAST realizado no banco de dados GenBank do
NCBI, em função do período de alimentação e da combinação do tipo de Oligo dT e primers
arbritários. É apresentando também o valor do e-value, que é a probabilidade de um dos
resultados de uma busca ter acontecido ao acaso. Portanto, quanto menor o valor, melhor é o
79
resultado.
Valores de e-values menores que zero são expressos como potência de 10; por
exemplo, 10
–30
é o mesmo que e-30.
Uma similaridade é relevante quando o e-value for
menor que 1e -4.
Dentre as proteínas identificadas, destacamos aquelas cuja expressão parece estar
ligada à alimentação experimental, são elas: Adenilato quinase (AK), Superóxido dismutase-
Mn (SOD); Citocromo P450 (CYP 20A1) e Apolipoproteína (APO). As Figuras 6, 7, 8 e 9
mostram os fragmentos que apresentaram similaridade com essas proteínas.
As seqüências da Superoxido dismutase Mn (SOD), do Citocromo P450 e da
Apolipoproteína (APO) foram formadas através de contigs, a sequência da Adenilato
quinase foi obtidas através da comparação de uma seqüência singlet.
Figura 6. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à enzima
Adenilato Quinase 2 (AK2) no período de privação alimentar.
Peso
Molecular
Controle Munguba Catoré Embaúba Jauarí Camu-
camu
origem
600 pb
80
Figura 7. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à
enzima Superóxido dismutase – Mn (SOD) no período de privação alimentar
Figura 8. Fragmento de DNA de Colossoma macropomum com similaridade à enzima
Citocromo P450 (CYP 20A1) no período de 15 dias de alimentação.
origem
Peso
molecular
origem
Peso
molecular
81
Figura 9. Fragmentos de DNA de Colossoma macropomum com similaridade a proteína
Apolipoproteína (APO). A e B no período de 1 dia de alimentação e C no período de 15
dias de alimentação.
A
B
C
origem
origem
origem
Peso
molecular
Peso
molecular
Peso
molecular
82
Tabela 4 - Transcritos diferencialmente expressos por tratamento e condição alimentar
Número do
fragmento
Condição de
alimentação
Fruto Similaridade no Blast
03 Privação alimentar Embaúba Adenilato Quinase 2
34 15 dias de alimentação Catoré Citocromo P450 (20A1)
41 e 55 15 dias de alimentação
Privação alimentar
Munguba
Jauari
Superóxido Dismutase – Mn
40, 42 e 46 15 dias de alimentação
1 dia de alimentação
1 dia de alimentação
Jauari
Munguba
Catoré
Apolipoproteína
Dois fragmentos encontrados nos peixes que receberam ração com munguba durante
15 dias e nos peixes que foram submetidos à privação alimentar após receber ração com
jauari, apresentaram similaridade com a enzima anti-oxidante Superóxido dismutase-Mn. Os
peixes que receberam ração suplementada com munguba e posteriormente foram submetidos
à privação alimentar, apresentaram um framento com similaridade à enzima Adenilato
quinase 2. O fragmento que apresentou similaridade com a enzima de desintoxicação
Citocromo P450 foi encontrado nos peixes que receberam ração suplementada com catoré
por 15 dias. Três fragmentos expressos em peixes que receberam ração suplementada com
munguba e catoré por 1 dia e com jauari por 15 dias (Tabela 4), apresentaram similaridade
com a Apolipoproteína, principal constituinte da Lipoproteína de alta densidade (HDL).
DISCUSSÃO
Neste experimento, o fígado foi o tecido utilizado para a análise da expressão
diferencial de genes em tambaqui alimentado com ração suplementada com frutos e
sementes da Amazônia. O fígado desempenha um papel fundamental no metabolismo dos
nutrientes absorvidos no trato digestivo e é igualmente importante para o metabolismo e
desintxicação de agentes que podem acompanhar os itens alimentares (Olsivik et al., 2007).
A padronização da extração do RNA do fígado apresentou dificuldades, uma vez que
as amostras de RNA, em muitos momentos, se apresentavam degradadas quando observada
83
em gel desnaturante. Este problema foi solucionado reduzindo o tempo de armazenamento
do tecido (Freezer -80˚C) procedendo a extração do RNA logo após a dissecação do órgão,
ou quando isso não era possível, armazenando o tecido em períodos curtos de até 15 dias.
A integridade do RNA é essencial ao se trabalhar com expressão gênica. Cuidados
especiais devem ser tomados durante o isolamento das amostras de RNA para que estejam
livres da presença de contaminantes (Malhotra et al., 1998). A qualidade e integridade do
RNA são fundamentais para assegurar uma quantificação válida da concentração do RNA
nas amostras (Gilsbach et al., 2006) e esta etapa é importante para a síntese de cDNA e
consequentemente para a comparação entre os padrões da expressão de genes das amostras.
O estudo das diferenças nos modelos de expressão gênica é um dos mais promissores
processos para o entendimento dos mecanismos de diferenciação e desenvolvimento. E,
entre as técnicas, o DD-PCR tem sido aplicado com sucesso em várias áreas, pois sua maior
vantagem está na simplicidade e possibilidade de detectar virtualmente todo o mRNA
expresso quando usadas combinações de primers suficientes (Kazian & Kirsch, 1999).
Embora esta técnica tenha facilitado a identificação dos genes diferencialmente
expressos, o DD-PCR é limitado por apresentar uma reprodutibilidade variada, redundância
dos transcritos de mRNA e um significativo índice de falso positivo (fragmentos que não
representam genes diferencialmente expressos) (Mahadeva et al.,1998). Porém, com o
avanço da técnica, a porcentagem de falsos positivos fica entre 25 – 30% (Malhotra et al.,
1998).
Apesar dessas desvantagens, neste experimento foi possível identificar seqüências de
transcritos que apresentaram similaridade com os genes que expressam as proteínas titin,
apolipoproteína e citocromo P450 e as enzimas adenilato quinase e superóxido dimutase-
Mn.
84
A proteína Titin, também denominada TTN ou “Conectin”, é uma proteína gigante,
contituída por um filamento único, longo, de aproximadamente 30.000 amino-ácidos (Labeit
et al., 1997), expressa principalmente em tecido muscular. Sua função está relacionada à
contração e elasticidade muscular, através da transmissão de força na linha Z e na
manutenção da tensão de descanso na região da banda I (Itoh-Satoh et al., 2002).
A expressão desta proteína no fígado de peixes alimentados com frutos e sementes
da Amazônia, detectada neste trabalho, provavelmente está relacionada à musculatura lisa
presente no fígado que contaminou a amostra durante a extração de RNA, não estando
relacionada às condições experimetais às quais os peixes foram submetidos. Portanto,
tornam-se necessários outros estudos para determinar se a sua expressão está sendo
influenciada pelos tipos de dietas experimentais.
A Adenilato Quinase (AK) faz parte de uma família de enzimas fortemente
conservada, que catalisa a reação reversível de transferência de fósforo do ATP (adenosina
tri-fosfato) para o AMP (adenosina mono-fosfato), formando duas moléculas de ADP
(adenosina di-fosfato) (Bruin et al., 2004). Está reação é regulada pela disponibilidade de
AMP ou ADP (Stanojevic et al., 2008). Atualmente, três isozimas principais de Adenilato
Quinase (AK1, AK2 e AK3) são descritas em vertebrados. Cada isozima tem uma
distribuição celular distinta e um substrato preferencial, onde a AK1 está localizada no
citoplasma e o ATP é o substrato; a AK2 catalisa a mesma reação que a AK1, mas está
localizada no espaço intra-membrana das mitocôndrias e a AK3, que está presente na matriz
mitocondrial e tem como substrato preferencial a GTP, em detrimento à ATP (Yoneda et al.,
1998).
A AK1 citoplasmática participa do metabolismo energético quando níveis locais do
fosfato de alta energia são baixos, sustentando os níveis do ATP celular à custa do ADP
(Yoneda et al., 1998). Segundo Souza-Júnior et al. (2005) a atividade da AK1 em células
85
musculares pode sofrer influência das espécies reativas de oxigênio (ERO). Os autores
destacam que durante o esforço físico, o metabolismo muscular produz precursores de ERO.
Esses precursores acumulam-se nos tecidos e órgãos e o primeiro efeito de tamponação do
conteúdo de ATP muscular é a e a hidrólise da fosfocreatina. A subseqüente diminuição do
fornecimento de ATP pode levar a um transitório acúmulo de ADP, a qual estimula a reação
catalisada pela AK formando AMP, que rapidamente é desaminado formando IMP e amônia
pela ação da enzima AMP desaminase. O IMP (inosina mono-fosfato) é transformado em
hipoxantina.
Filler & Criss (1971) estudando o desenvolvimento da enzima Adenilato Quinase no
fígado de rato, observaram que quando um tecido está sob um abastecimento de energia
razoavelmente constate, uma atividade (ou a habilidade de manter a homeostase de energia)
muito pequena da AK é esperada; mas, quando o abastecimento de energia muda
repentinamente, a atividade da AK do fígado aumenta.
Estas informações são confirmadas neste experimento, onde o fragmento que
apresentou similaridade no BLAST com a enzima Adenilato Quinase foi isolado de
tambaqui que recebeu a ração suplementada com embaúba, submetido a posterior período de
privação alimentar, indicando que este fruto não foi capaz de suprir a demanda energética
após o peixe ser submetido à condição estressante de privação alimentar.
A enzima Superóxido dismutase (SOD) faz parte do sistema de defesa antioxidante
dos animais, minimizando o estresse oxidativo gerado pelas espécies reativas ao oxigênio
(ERO). A geração de ERO é uma condição inevitável do metabolismo do oxigênio em
organismos aeróbicos (Johnson et al., 2002), e os peixes, como todos os animais aeróbicos,
são suscetíveis aos efeitos da ERO e por isso apresentam um inerente e efetivo sistema de
defesa aos agentes oxidativos (Martínez-Álvarez et al., 2005). Este sistema envolve enzimas
como superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GSH-Px), que
86
agem diretamente nos radicais superóxido e peróxido de hidrogênio, convertendo-os em
espécies menos reativas (Scandalios, 2005).
A SOD desempenha um papel importante na via antioxidante como a 1ª linha de
defesa contra o estresse oxidativo por catalisar a molécula reativa do oxigênio (O٠
−
) à
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) que é posteriormente reduzido à água pela catalase (Mruk et
al., 2002; Hartog et al.,2003).
Em animais aquáticos várias condições são relatadas como indutoras de estresse
oxidativo, principalmente os efeitos de poluentes (Yin, et al., 2007; Cho et al, 2006) e
hipóxia (Sampaio et al., 2008).
Além dos estudos realizados com as condições indutoras de estresse oxidativo,
alguns autores têm apresentado resultados sobre os efeitos da alimentação nas respostas a
esse tipo de estresse. Rueda-Jasso et al. (2004) mostraram que a espécie de peixe Solea
senegalensis apresenta aumento significativo da atividade da SOD quando alimentadas com
dietas com alto nível de energia não-protéica. Pascual et al. (2003) observaram aumento na
atividade da SOD em Sparus aurata submetidos a períodos de restrição e privação
alimentar. Este mesmo comportamento foi observado por Morales et al.(2004) em Dentex
dentex submetidos à privação alimentar; porém, a atividade da SOD voltou ao nível normal
quando foram re-alimentados.
Para manter o equilíbrio entre a produção e a eliminação da ERO, alguns autores
sugerem o uso de agentes antioxidantes não enzimáticos como o ácido ascórbico (vitamina
C), o alfa-tocoferol (vitamina E) e o beta caroteno (precursor da vitamina A) (Lee et
al.,1998). Nesse sentido, as vitaminas e flavonóides presentes nos frutos mostram efeitos
antioxidantes, atuando no controle das concentrações de O
2
−
e H
2
O
2
(Bianchi & Antunes,
1999). Neste experimento não foi possível observar o efeito protetor das vitaminas e agentes
antioxidantes presentes nos frutos utilizados na suplementação das rações. Isto pode ter
87
acontecido em virtude do tipo de processamento realizado durante a confecção dessas
rações, que após a mistura com os frutos e repeletização, foram submetidas à secagem em
estufa a 55 ˚C por um período de 12 horas. Este processo pode ter ocasionado a perda ou
inativação das vitaminas e outros agentes antioxidantes.
Cho et al., (2006) destacaram que mudanças na atividade da enzima SOD em tecidos
de peixes têm sido observadas como respostas comuns e extensivamente usadas como
importantes bioindicadores de estresse oxidativo. Porém, estes estudos têm se baseado
apenas em métodos bioquímicos, como medidas de atividades da enzima em extratos de
tecidos. Os autores enfatizam que apesar da importante contribuição dessas metodologias, a
regulação transcricional dos níveis de mRNA da SOD em peixes tem sido pouco estudada.
A expressão da enzima Superóxido Dismutase foi verificada neste experimento em
peixes submetidos à privação alimentar. Esse resultado condiz com os encontrados por
Pascual et al. (2003) que observaram um aumento na atividade da SOD em exemplares de
Sparus aurata que receberam níveis de ração referentes a 1, 0,5% e 0% da biomassa,
quando comparados com os que receberam 2%. Observaram também, por análise de
isozimas, mudanças no padrão da SOD, onde os peixes controle (2%) apresentaram duas
bandas referentes à enzima SOD-Mn e três bandas referentes a SOD-Cu e Zn. Os peixes
submetidos à privação alimentar apresentaram duas bandas de tamanho intermediário a dos
peixes controle, caracterizando uma nova isoforma da SOD, que desapareceu após a
retomada da alimentação dos peixes com níveis de 2% da biomassa.
Esses resultados indicam que a enzima SOD comporta-se como indicador do estresse
oxidativo em conseqüência de uma dieta imprópria nos peixes. A análise da atividade das
enzimas GST e Catalase (Figuras 5 e 6 – Capítulo I), realizadas em tambaquis alimentados
com rações suplementadas com frutos e sementes da Amazônia demonstraram que a
atividade destas enzimas aumentou no decorrer do período experimental,
88
independentemente do fruto utilizado, indicando que a mudança na expressão da SOD, que é
uma das enzimas do sistema de defesa antioxidante, pode ter ocorrido em função do
acúmulo de ERO nos tecidos desses animais.
A outra proteína que apresentou similaridade com fragmentos gerados pela técnica
do DD-PCR no tambaqui foi a Apolipoproteína M (Apo M). As apolipoproteínas são os
principais componentes protéicos das lipoproteínas e são classificadas em apo A (apoA-I,
apoA-II e apoA-IV), apo B (apoB-100 e apoB-48), apo C (apoC-I, apoC-II, apoC-III), apo E
(Novak & Bydlowski, 1996) e apo M (Xu & Dahlbäck, 1999). A apolipoproteína M (apo M)
é uma proteína recentemente descoberta, bastante expressa no fígado e no rim dos
vertebrados (Zhang et al., 2007; Feingold et al., 2008). É encontrada em todas as classes
principais das lipoproteínas. Porém, a maior parte da apo M é encontrada nas lipoproteínas
de alta-densidade (HDL) (Faber et al., 2004).
Recentemente experimentos indicaram que a apo M é necessária para a formação do
pré β - HDL e efluxo do colesterol para o HDL, sugerindo efeito protetor contra
arteriosclerose. Zhang et al., (2007) demonstraram que hiperglicemia em ratos provoca
queda nos níveis de apo M e que a concentração de glicose de 30mM inibe
significativamente a expressão dessa proteína em cultura de hepatoblastoma linhagem Hepg
2. Em humanos o nível de apo M está correlacionado principalmente ao colesterol total do
plasma, onde a produção de apo M conduz a uma diminuição nos níveis de colesterol
(Feingold et al., 2008), mas esse mecanismo ainda não é muito bem conhecido (Faber et al,
2004).
Feingold et al. (2008) demonstraram que os níveis de mRNA heático e dos rins de
ratos de laboratório e os níveis de circulação da apo M no plasma diminuem durante
processos de inflamação e infecção, concluindo que a apo M apresenta uma reposta aguda
negativa, que decresce durante estes processos. As implicações fisiológicas e patológicas da
89
queda dos níveis da apo M ainda não estão claras e os autores sugerem que, assim como a
alta expressão da apo M reduz a arterioesclerose, a diminuição dos níveis dessa proteína
pode acelerar o desenvolvimento de doenças.
Além do papel no transporte reverso do colesterol e das propriedades anti-
arteriogênicas, muitas outras funções são atribuídas ao HDL e as apolipoproteínas em
mamíferos. Porém, para os outros grupos animais, como os peixes, as informações são
limitadas e a relevância fisiológica da expressão das diferentes apolipoproteínas nos tecidos
está provavelmente subestimada (Concha et al., 2003). Estes autores mostraram que a
presença da apolipoproteína A-I, presente na pele da carpa (Cyprinus carpio) pode estar
ligada à atividade antimicrobiana e destacam que é improvável que a HDL e suas
apolipoproteínas sintetizadas e segregadas na epiderme deste peixe participem somente da
homeostase do colesterol, especialmente em se tratando do local, onde uma quantidade
importante de proteína estaria sendo constantemente perdida do revestimento do muco para
o meio aquático. Os autores sugerem que esta proteína poderia desenvolver importante papel
na proteção da pele da carpa, assim como em outros teleósteos.
Estas informações são corroboradas por Villarroel et al. (2007) que demosntraram a
atividade antimicrobiana da apo A-I em truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) e por
Johnston et al. (2008) que purificaram a apo A I do plasma de peixes Morone saxatilis,
examinando in vitro sua atividade antibacteriana contra Streptococus sp., Escherichia coli e
Mycobacterium marinum. Seus resultados indicaram que esta proteína é um agente
antibacteriano eficaz em concentrações abaixo dos níveis fisiológicos do plasma.
Neste experimento, os peixes alimentados com dietas suplementadas com frutos e
sementes não apresentaram sinais visíveis de infecções ou inflamações que pudessem
sugerir mudanças nos níveis de expressão da apolipoproteína em função destes fatores. As
informações geradas até agora sobre o papel biológico da apo M em peixes torna este gene
90
um candidato a futuras investigações sobre as funções metabólicas e sua regulação em
função da dieta alimentar desses animais.
A enzima citocromo P450 (CYP) compreende uma superfamília de hemoproteínas
que catalisa a oxidação de uma variedade de produtos químicos exógenos, bem como
substratos endógenos tais como esteróides e ácidos graxos, vitaminas e prostaglandinas
(Nelson et al., 1996). Este sistema está presente em diferentes tecidos como rim, pulmão,
pele, intestino, córtex adrenal, testículo, placenta e outros, mas é particularmente ativo no
fígado (Orellana & Guajardo, 2004).
Sua expressão e atividade são influenciadas por diversos fatores como a idade, sexo,
dieta, espécie, tecido e estado hormonal (Coon et al., 1992). Olsvik et al. (2007),
demonstraram que a CYP é transcrita desigualmente em diferentes partes do fígado de
salmão (Salmo salar), expostos por sete dias a β - naftoflavona. Estes autores observaram
que a transcrição desta enzima foi mais elevada na seção média do fígado, quando
comparada com as partes proximais e distais do órgão, sugerindo que a transcrição aconteça
principalmente nos hepatócitos e que aqueles que estão mais próximos dos vasos sanguíneos
que chegam ao fígado, respondem mais fortemente à ação do xenobiótico.
Considerando as funções metabólicas do Citocromo P450 e todos os fatores que
influenciam na sua expressão, tornam-se indispensáveis
estudos mais aprofundados para
determinar o envolvimento desta enzima nas respostas à introdução de frutos e sementes na dieta
de tambaqui.
91
CONCLUSÃO
Os dados deste trabalho constituem o primeiro estudo sobre expressão gênica diferencial
em peixes alimentados com adição de frutos e sementes da Amazônia em suas rações.
A técnica do DD-PCR possibilitou a análise da expressão dos genes regulados pela
alimentação de tambaqui com dietas suplementadas com frutos e sementes da Amazônia, em
diferentes períodos de alimentação (1, 15 e 30 dias) e submissão a privação alimentar.
Os fragmentos de DNA isolados demonstraram similaridade com os genes das enzimas
Adenilato quinase, Superóxido dismutase, Apolipoproteína e Citocromo P450.
A presença da enzima antioxidante sugere a necessidade de um melhor monitoramento
nos níveis de vitaminas das rações, com a inclusão de frutos que atendam à demanda necessária
para melhorar o status da defesa oxidativa da espécie e no tipo de processamento utilizado para a
confecção das rações experimentais, para que não haja influência na concentração ou atividade
dos agentes antioxidantes presentes nos frutos.
Sete transcritos selecionados neste experimento não apresentaram similaridades com
seqüências depositadas no GenBanK e 2 transcritos foram considerados produtos de
proteínas não identificados. Essas seqüências são candidatas a futuras investigações para a
compreensão de processos específicos do metabolismo dos animais alimentados com rações
suplementadas com frutos e sementes Amazônia.
92
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A utilização de frutos e sementes na suplementação de rações para peixes criados em
cativeiro na Amazônia é uma prática viável para a região. Alguns estudos têm se dedicado a
investigar o efeito da introdução de frutos, sementes e subprodutos vegetais na ração de
peixes, através de análises de dados biométricos, de digestiblidade, efeitos hematológicos,
enzimáticos e citogenotóxicos. Neste trabalho foram utilizadas respostas fisiológicas e
citogenotóxicas para se avaliar o efeito da inclusão de frutos na ração de tambaqui.
Porém, para colaborar com a busca de novas informações sobre os efeitos causados
pela suplementação das rações comerciais com frutos e semente, propusemos também
avaliar estas respostas através da expressão diferencial de genes. Análise de expressão
gênica ainda não é uma ferramenta utilizada com muita freqüência em trabalhos com
alimentação de peixes. Entretanto, pode oferecer informações sobre mudanças que ocorrem
em grupos de muitas enzimas ou proteínas ao mesmo tempo, cuja atividade seria difícil de
avaliar, necessitando de análises específicas para cada uma destas enzimas/proteínas em
particular.
Embora a técnica do “Differential Display PCR”, utilizada neste trabalho para
identificar genes diferencialmente expressos, apresente algumas limitações, com índices de
falso positivo entre 25 a 30%, necessitando do auxílio de outras técnicas para a validação de
seus resultados a confiabilidade dos dados foi sustentada pela identificação dos genes
responsáveis por enzimas e proteínas descritas na literatura como indicadoras do estado
nutricional de peixes e também por medidas paralelas, como os resultados bioquímicos e
fisiológicos, que indicaram que os frutos adicionados à ração não preveniram as EROS,
provavelmente em função do tipo de processamento realizado na confecção dessas rações.
Os dados encontrados por Pascual et al. (2003) indicam que a enzima SOD
comporta-se como indicador do estresse oxidativo em conseqüência de uma dieta
93
inadequada nos peixes. Mudanças nos níveis da expressão do gene da Apolipoproteína M
estão correlacionadas com alterações nos níveis de colesterol do plasma (Feingold et al.,
2008), embora este mecanismo ainda não esteja totalmente descrito, e a atividade da
Adenilato Quinase esteja relacionada ao requerimento energético do organismo.
As perspectivas desta pesquisa relacionam-se à validação dos transcritos
diferencialmente expressos, através da PCR em tempo real, que é uma metodologia
confiável, capaz de quantificar a concentração do produto de PCR gerado durante cada ciclo
de amplificação. Porém, será necessário repetir os experimentos de alimentação de tambaqui
com as rações suplementadas com frutos, para garantir o isolamento de RNA de alta
qualidade, que não interfira na precisão dos resultados da PCR em tempo real. A integridade
do RNA é essencial para a validade da quantificação dos genes expressos, uma vez que
estudos recentes demonstraram que a degradação da amostra altera significativamente a
estabilidade do gene de referência (Gilsbach et al, 2006).
Serão desenhados primers com base nas seqüências obtidas dos fragmentos
diferencialmente expressos e testados nas amostras. A partir daí obteremos quantidade
apropriada de ácido nucléico alvo durante cada ciclo de amplificação da PCR.
Com estes procedimentos será possível observar se ocorrem diferenças significativas
na expressão dos genes da Apolipoproteína, Adenilato Quiase, Superóxido Dismutase e
Citocromo P450 em tambaqui alimentado com rações suplementadas com diferentes frutos e
sementes da Amazônia.
Aliado a isto, estaremos analisando também os níveis de vitaminas B, caroteno (pro-
vitamina A), ácido ascórbico (Vitamina C) e alfa-tocoferol (provitamina E) das rações
contendo frutos e sementes da Amazônia para verificar a presença desses agentes anti-
oxidantes após as etapas de preparo e processamento das rações.
94
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